KR20100130677A - Process for enhancing mouse embryonic stem cell proliferation - Google Patents

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한호재
이민영
이상훈
박재홍
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전남대학교산학협력단
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Abstract

PURPOSE: A method for enhancing proliferation of mouse embryo stem cells is provided to identify path of enhancing proliferation of the stem cells. CONSTITUTION: A sarcoma(Src) and caveolin-1 are actively phosphorylated by enhancing the galectin-1 concentration at outside of membrane. The phosphorylated caveolin-1 activates protein kinase(Akt) and induces phosphorylation of mammal target of rapamycin, thus proliferates mouse embryo stem cells.

Description

마우스 배아 줄기세포의 증식을 촉진시키는 방법{Process for enhancing mouse embryonic stem cell proliferation}Process for enhancing mouse embryonic stem cell proliferation

본 발명은 갈렉틴-1의 원형질막 밖의 농도를 증가시키면 상기 증가된 갈렉틴-1이 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키는 갈렉틴-1에 있어서, 상기 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시킴을 특징으로 하는 갈렉틴-1에 관한 것이다.According to the present invention, when the concentration of galectin-1 is increased outside the plasma membrane, the increased galectin-1 enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and caveolin-1, and the phosphorylated carveolin-1 is a protein kinase B (Akt). ) To promote the proliferation of mouse embryonic stem cells by inducing phosphorylation of mammalian rapamycin target protein (mTOR). In addition, the present invention is galectin-1 to enhance the phosphorylation of sarcoma (Src) and carveol-1, the phosphorylated carveol-1 is activated by the protein kinase B (Akt) mammalian rapamycin target protein (mTOR) Galectin-1, characterized in that it enhances the proliferation of mouse embryonic stem cells by inducing phosphorylation.

재생의학에 관한 배아 줄기세포(ES 세포)의 잠재성을 개선시키기 위해 시험 관 내 배양 조건에서 배아 줄기세포를 증식시키고자 하는 필요성이 주요한 쟁점이다. 그러나 이러한 분야에서 유의적인 진보가 이루어지고 있으나 배아 줄기세포 배양을 위한 유용한 배지는 그의 명료한 조성이 알려지지 않았고 배지의 조성이 알려진 경우에도 그의 최적 조건이 확립되지 않았다. 갈렉틴(galectin)은 β-갈락토사이드를 포함하는 당결합체(glycoconjugate)에 대한 친화성을 지닌 탄수화물-결합 단백질류이다. 현재 15종의 갈렉틴이 확인되었고, 이들 모두는 그의 탄수화물 인식 도메인에 따라 분류될 수 있다. 갈렉틴-1은 글리칸 내 락토사민 구조에 우선적으로 결합하는 렉틴이다. 갈렉틴-1은 배아, 조혈모 및 각질 줄기세포를 포함한 다양한 줄기세포에 의해 발현된다. 현재까지 배아 줄기세포에서 렉틴 기능에 대한 연구는 거의 수행되지 않고 있다. A major issue is the need to proliferate embryonic stem cells under in vitro culture conditions to improve the potential of embryonic stem cells (ES cells) for regenerative medicine. However, although significant advances have been made in this field, a useful medium for culturing embryonic stem cells has not been known for its clear composition and its optimum conditions have not been established even if the composition of the medium is known. Galectins are carbohydrate-binding proteins that have affinity for glycoconjugates comprising β-galactoside. Currently 15 galectins have been identified, all of which can be classified according to their carbohydrate recognition domains. Galectin-1 is a lectin that preferentially binds lactosamine structures in glycans. Galectin-1 is expressed by various stem cells, including embryonic, hematopoietic stem and keratin stem cells. To date, little work has been done on lectin function in embryonic stem cells.

최근 Yanagisawa, M. 등의 Glycobiology 17:57-74, 2007에서는 갈렉틴-1이 성체 신경 줄기세포 상에서 발현되고 그의 탄수화물 결합 친화성을 통해 그의 증식을 증진시킴이 보고되었다. 또한 갈렉틴은 자가-재생, 증식 및 분화와 같은 세포 운명 결정에 기능적으로 중요한 역할을 한다. 최근의 연구는 신호 변환, 세포-세포 상호작용 및 접합 등의 매개를 통한 배아 줄기세포 내 당결합체의 기능적 관련성을 규명하고 있다. 이러한 증거는 갈렉틴이 배아 줄기세포에서 기능적 역할을 수행한다는 가능성을 야기하였다. 따라서 갈렉틴은 그 메커니즘이 상세하게 확인되지 않았지만 배아 줄기세포 자가-재생의 기전을 규명하기 위한 유망한 대안으로 제안되고 있다.Glycobiology 17: 57-74, 2007 by Yanagisawa, M. et al. Reported that galectin-1 is expressed on adult neural stem cells and enhances its proliferation through its carbohydrate binding affinity. Galectins also play a functionally important role in determining cell fate, such as self-renewal, proliferation and differentiation. Recent studies have identified the functional relevance of glycoconjugates in embryonic stem cells through mediation of signal transduction, cell-cell interactions and conjugation. This evidence raised the possibility that galectins play a functional role in embryonic stem cells. Therefore, galectins have been proposed as promising alternatives to elucidate the mechanism of embryonic stem cell self-renewal although their mechanisms have not been identified in detail.

다양한 세포 시스템에서 갈렉틴은 카베올린-1과 상호작용한다. 카베올린은 기능적 및 구조적으로 높게 보존되어 있고 래프트(raft)-유래 구성성분으로부터의 카베올레(caveloae) 형성을 개시한다. 카베올레는 원형질막 내 50 내지 100nm 크기 플라스크-형태 함입을 형성하는 특화된 지질 래프트 마이크로 도메인이다. 카베올레는 카베올린 단백질과 상호 작용하는 구획화-신호전달 분자를 통해 신호전달 이벤트에서 기능하는 것으로 제안되었다. 따라서 카베올레 형성시 카베올린의 구조적 역할 이외에 세포 신호전달의 조절과 관련된 상당한 증거가 존재한다. 이들은 다양한 형태로 발견되었고 세포 신호 전달을 포함한 다양한 기능에 관련된다. 최근, 다양한 신호전달 분자 및 그의 카베올린과의 상호작용은 카베올린이 세포외부와 세포간의 신호전달에 관여함을 규명하였다. 실제로 카베올린-1과 상호작용하는 많은 신호전달 분자는 충분히 규명되지 않았다. 또한 배아줄기세포의 세포 주기 조절 역시 규명되지 않고 있다. Galectin interacts with carveolin-1 in various cellular systems. Caberoline is highly conserved functionally and structurally and initiates the formation of caveloae from raft-derived components. Cabeolle is a specialized lipid raft microdomain that forms a 50-100 nm size flask-shaped inclusion in the plasma membrane. Cabeooles have been proposed to function in signaling events through compartmentalization-signaling molecules that interact with the Caberoline protein. Therefore, there is considerable evidence related to the regulation of cellular signaling in addition to the structural role of caveolin in caveol formation. They have been found in various forms and are involved in a variety of functions, including cell signal transduction. Recently, various signaling molecules and their interaction with caveolin have revealed that caveolin is involved in extracellular and intercellular signaling. Indeed, many signaling molecules that interact with carveolin-1 have not been fully identified. In addition, cell cycle regulation of embryonic stem cells has not been identified.

마우스 포배(blastocyst)의 ICM에서 유래된 마우스 배아 줄기세포는 영구적 세포주로 수립되었고 생체 내 및 시험관 내 자가-재생 능력에 의해 특성화되었다. 배아 줄기세포는 3개 배엽으로 분화될 수 있고 특정 조건 하에서 비제한적 생장 잠재성을 지닌다. 본 발명에서 배아 줄기세포는 미분화 상태로 유지시키고 배아 줄기세포의 유도 및 확장을 지지하기 위해 백혈병 저해 인자(LIF)가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM) 내에서 배양되었다. 이들 세포는 생체 내 에서의 특성과 매우 유사하고 배아 성장 및 발달의 안정적인 시험관 내 모델을 제공한다. 더욱이 이들은 특정한 신호전달 시스템이 조사될 수 있는 도구를 제공한다. 본 발명은 배아 줄기세포 증식 상의 갈렉틴-1 효과를 조사하였고 마우스 배아 줄기세포 내 성장 조절 활성에 대한 기본 메커니즘을 분석하였다.Mouse embryonic stem cells derived from ICMs of mouse blastocysts were established as permanent cell lines and characterized by their in vivo and in vitro self-renewal ability. Embryonic stem cells can differentiate into three germ layers and have unlimited growth potential under certain conditions. In the present invention, embryonic stem cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) to which leukemia inhibitory factor (LIF) was added in order to maintain undifferentiated state and support the induction and expansion of embryonic stem cells. These cells are very similar in character to in vivo and provide a stable in vitro model of embryo growth and development. Moreover, they provide a tool by which specific signaling systems can be investigated. The present invention investigated the effect of galectin-1 on embryonic stem cell proliferation and analyzed the basic mechanism for growth regulation activity in mouse embryonic stem cells.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 갈렉틴-1의 세포막 외부의 농도를 증가시킴에 따라 마우스 배아 줄기세포의 증식이 어떻게 변화하는지를 규명코자 한 것이다. 즉, 본 발명은 상기 증가된 갈렉틴-1이 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 경로를 규명코자 한 것이다.The problem to be solved by the present invention is to determine how the proliferation of mouse embryonic stem cells changes as the concentration of galectin-1 increases outside the cell membrane. That is, the present invention is the increased galectin-1 enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and Cabolin-1, phosphorylated Cabolin-1 activates protein kinase B (Akt) to mammalian rapamycin target protein The aim of this study was to identify pathways that promote the proliferation of mouse embryonic stem cells by inducing phosphorylation of (mTOR).

본 발명의 목적은 갈렉틴-1의 원형질막 밖의 농도를 증가시키면 상기 증가된 갈렉틴-1이 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to increase the concentration of galectin-1 outside the plasma membrane, and the increased galectin-1 enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and caveolin-1, and phosphorylated caveolin-1 is a protein kinase B. It provides a method of promoting the proliferation of mouse embryonic stem cells by activating (Akt) to induce phosphorylation of mammalian rapamycin target protein (mTOR).

또한 상기 갈렉틴-1은 갈렉틴-1 수용체의 매개를 통해 원형질막(plasma membrane) 내의 사르코마 및 카베올린-1의 인산화를 증진시킴을 특징으로 한다.In addition, the galectin-1 is characterized by enhancing the phosphorylation of sarcoma and carveolin-1 in the plasma membrane through the mediation of the galectin-1 receptor.

한편 상기 사르코마는 단백질 포스파타제 (PP2)에 의해 저해되고, 상기 카베올린-1은 메틸-β-시클로덱스트린(Mβ-CD)에 의해 저해됨을 특징으로 한다.Meanwhile, sarcoma is inhibited by protein phosphatase (PP2), and the carveolin-1 is inhibited by methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD).

본 발명의 또다른 목적은 갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하는 마우스 배아 줄기세포 증식용 배지에 있어서, 상기 갈렉틴-1은 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포 내의 DNA 합성을 촉진시킴을 특징으로 하는 마우스 배아 줄기세포 증식용 배지를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is a mouse embryonic stem cell proliferation medium containing galectin-1 as an active ingredient, wherein the galectin-1 enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and caveolin-1, and phosphorylation Caveolin-1 activates protein kinase B (Akt) to induce phosphorylation of mammalian rapamycin target protein (mTOR) to promote DNA synthesis in mouse embryonic stem cells. To provide.

본 발명의 또다른 목적은 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키는 갈렉틴-1에 있어서, 상기 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시킴을 특징으로 하는 갈렉틴-1을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is galectin-1, which enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and carveolin-1, wherein the phosphorylated carveolin-1 activates protein kinase B (Akt) to target mammalian rapamycin. By providing phosphorylation of the protein (mTOR) to provide a galectin-1 characterized by promoting the proliferation of mouse embryonic stem cells.

본 발명의 효과는 갈렉틴-1의 원형질막 밖의 농도를 증가시킴에 따라 마우스 배아 줄기세포의 증식이 어떻게 변화하는지를 규명한 것이다. 즉, 본 발명은 상 기 증가된 갈렉틴-1이 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 경로를 규명한 것이다.The effect of the present invention is to determine how proliferation of mouse embryonic stem cells changes as the concentration of galectin-1 increases outside the plasma membrane. That is, the present invention, the increased galectin-1 promotes phosphorylation of sarcoma (Src) and Cabolin-1, and phosphorylated Cabolin-1 activates protein kinase B (Akt) to target mammalian rapamycin. By inducing phosphorylation of protein (mTOR), we have identified pathways that promote the proliferation of mouse embryonic stem cells.

갈렉틴이 배아 줄기세포 자가-재생을 유지시키는 메커니즘은 아직 규명되지 않았으나 갈렉틴은 배아 줄기세포 자가-재생의 복잡성을 규명하기 위한 유망한 대안을 제공할 수 있는 가능성을 지닌다. 갈렉틴-1은 사이클린 발현뿐만 아니라 [3H]-티미딘 결합을 증가시키고 p27kip1 발현을 감소시켰다. 사르코마(Src) 및 카베올린-1 인산화는 갈렉틴-1에 의해 증가되었고, 인산-카베올린-1은 단백질 포스파타제(PP2)에 의해 저해되었다. 더욱이 간섭 RNA 및 메틸-β-사이클로덱스트린(Mβ-CD)에 의한 카베올린-1의 저해는 갈렉틴-1-유도된 사이클린 발현 및 [3H]-티미딘 결합을 감소시켰다. 갈렉틴-1은 사이클린 발현과 관련된 단백질 키나제 B(Akt) 및 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR) 인산화를 유발하였다. Although the mechanism by which galectin maintains embryonic stem cell self-renewal has not yet been identified, galectin has the potential to provide a promising alternative for determining the complexity of embryonic stem cell self-renewal. Galectin -1 increased cyclin expression as well as [ 3 H] -thymidine binding and decreased p27 kip1 expression. Sarcoma (Src) and carveolin-1 phosphorylation was increased by galectin-1 and phosphate-cabolinol-1 was inhibited by protein phosphatase (PP2). Moreover, inhibition of carveolin-1 by interfering RNA and methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD) reduced galectin-1-induced cyclin expression and [ 3 H] -thymidine binding. Galectin-1 caused protein kinase B (Akt) and mammalian rapamycin target protein (mTOR) phosphorylation associated with cyclin expression.

갈렉틴-1-유도된 인산-Akt 및 mTOR은 단백질 포스파타제(PP2), 배아줄기세포 유래 Ras 간섭 RNA(ERas siRNA), 카베올린-1 siRNA 및 Mβ-CD에 의해 저해되었다. 더욱이 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR) 인산화는 LY294002 및 단백질 키나제B(Akt) 억제제에 의해 감소되었다. 사이클린 발현의 갈렉틴-1-유도 증가 및 p27kip1 감소는 단백질 키나제 B(Akt) 억제제 및 라파마이신(rapamycin)에 의해 차단되었다. 결론적으로 갈렉틴-1은 사르코마(Src), 카베올린-1, 단백질 키나제 B(Akt) 및 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR) 신호전달 경로를 통해 마우스 배아 줄기세포 내에서 DNA 합성을 증가시켰다.Galectin-1-induced phosphate-Akt and mTOR were inhibited by protein phosphatase (PP2), embryonic stem cell derived Ras interfering RNA (ERas siRNA), caveolin-1 siRNA and Mβ-CD. Moreover, mammalian rapamycin target protein (mTOR) phosphorylation was reduced by LY294002 and protein kinase B (Akt) inhibitors. Increasing galectin-1-induced cyclin expression and decreasing p27 kip1 were blocked by protein kinase B (Akt) inhibitors and rapamycin. In conclusion, galectin-1 increased DNA synthesis in mouse embryonic stem cells through sarcoma (Src), carveolin-1, protein kinase B (Akt) and mammalian rapamycin target protein (mTOR) signaling pathways.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.The present invention is described in more detail below.

본 발명에서 마우스 배아 줄기세포에서 갈렉틴-1은 DNA 합성과 세포 주기 조절 단백질의 발현을 유발하였으며, 락토오스는 세포 외적으로 갈렉틴-1에 의해 유발된 [3H]-티미딘 결합을 크게 하향 조절을 하였다. 또한 배아 줄기세포가 내인적으로 갈렉틴-1을 발현시킴에도 불구하고 배양 배지에서 갈렉틴-1은 검출되지 않았다. 따라서 이러한 결과는 갈렉틴-1이 탄수화물-의존적 메커니즘으로 배아 줄기세포 증식을 자극한다는 것과, 본질적 갈렉틴-1은 배아 줄기세포 생장에 있어 본 실험 조건 하에서 그 역할을 나타낼 수 있을 만큼 충분하지 않거나 그 농도가 너무 낮음을 의미한다. In the present invention, galectin-1 induced DNA synthesis and expression of cell cycle regulatory proteins in mouse embryonic stem cells, and lactose significantly lowered [ 3 H] -thymidine binding induced by galectin-1 extracellularly. Adjustment was made. In addition, although embryonic stem cells expressed galectin-1 endogenously, galectin-1 was not detected in the culture medium. Thus, these results indicate that galectin-1 stimulates embryonic stem cell proliferation by a carbohydrate-dependent mechanism, and that intrinsically galectin-1 is not sufficient or sufficient to demonstrate its role under this experimental condition in embryonic stem cell growth. It means that the concentration is too low.

본 발명에서는 갈렉틴-1 처리에 반응하여 카베올린-1이 인산화되었다. 이 러한 결과는 갈렉틴-1이 매개하는 카베올린-1의 관련이 마우스 배아 줄기세포 증식에 중요한 역할을 함을 증명한다. 본 발명의 결과로서 마우스 배아 줄기세포(ES 세포) 생장에 있어 갈렉틴-1의 생물학적 기능으로 이해의 범위를 확장하였다. 현재까지 마우스 배아 줄기세포에 있어 카베올린-1과의 전반적인 기능적 상호작용에 대한 갈렉틴-1의 이러한 효과는 앞서 보고되지 않았다. In the present invention, carveolin-1 was phosphorylated in response to galectin-1 treatment. These results demonstrate that galectin-1 mediated carveolin-1 plays an important role in mouse embryonic stem cell proliferation. As a result of the present invention, the scope of understanding has been extended to the biological function of galectin-1 in mouse embryonic stem cell (ES cell) growth. To date, this effect of galectin-1 on overall functional interaction with carveolin-1 in mouse embryonic stem cells has not been reported previously.

카베올린-1은 콜레스테롤에 직접적으로 결합하며 카베올레 발생에 있어 가장 중요한 보조인자이다. 본 발명에서 카베올린-1은 갈렉틴-1을 처리함으로써 인산화되었다. 또한 갈렉틴-1에 의해 유발된 사이클린 D1, E의 발현과 [3H]-티미딘 결합의 증가가 메틸-β-시클로덱스트린(Mβ-CD)의 카베올린 유사 구조의 붕괴와 카베올린-1 siRNA로 인해 감소하였다. 이러한 결과는 카베올린-1 단백질 발현뿐만 아니라 구조적으로 기능하는 카베올레가 갈렉틴-1에 의해 유발된 배아 줄기세포 증식의 신호 전달에 관여함을 의미한다. 즉, 카베올린-1의 인산화가 하위 신호 전달 경로의 중간단계라는 가설을 세울 수 있다. Cabolin-1 binds directly to cholesterol and is the most important cofactor in caveologenesis. Cabolin-1 in the present invention was phosphorylated by treating galectin-1. In addition, the expression of cyclins D1 and E induced by galectin-1 and an increase in [ 3 H] -thymidine binding resulted in the breakdown of the carboline-like structure of methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD) and carveolin-1. decreased due to siRNA. These results indicate that not only the caveolin-1 protein expression but also structurally functioning caveole are involved in the signaling of embryonic stem cell proliferation induced by galectin-1. In other words, it can be hypothesized that phosphorylation of carveolin-1 is an intermediate step in the lower signaling pathway.

최근 카베올린-1이 신호 전달에 있어 중요한 분자로서 알려졌다. 카베올린과 카베올레에 의해 행해지는 복합적이고 상충되는 역할로부터 카베올린의 효과에 관한 논쟁이 발생되고 있다. 앞서 카베올린-1은 EGF와 같은 생장인자나 인슐린에 반응하여 인산화되는 것으로 관찰되었다. 그러나 카베올린-1 인산화는 세포 및 자극 특이적인 것으로 보인다. 카베올린의 타이로신 인산화의 기능적 중요성은 아직까지 완벽하게 이해되지 않았다. 잔기 14에서의 카베올린-1 인산화가 암유발 및 암세포의 생장 자극을 유도하는 것으로 간주되었다. Recently, kaveolin-1 has been known as an important molecule in signal transduction. Controversy arises over the effects of caveolin from the complex and conflicting roles played by caveolin and caveole. Previously, caveolin-1 was observed to be phosphorylated in response to growth factors such as EGF or insulin. However, caveolin-1 phosphorylation appears to be cell and stimulus specific. The functional importance of tyrosine phosphorylation of caveolin is not yet fully understood. Caberoline-1 phosphorylation at residue 14 was considered to induce cancer stimulation and growth stimulation of cancer cells.

본 발명에서는 갈렉틴-1에 의해 유발된 카베올린-1의 타이로신 인산화가 c-Src 저해제인 PP2에 민감하였다. 더욱이 PP2의 전처리는 세포 주기 조절 단백질의 발현과 [3H]-티미딘 결합에 있어서 갈렉틴-1에 의해 유발된 증가를 약화시켰다. 이전의 연구는 타이로신 14에서의 카베올린의 구조적인 인산화가 활성화된 사르코마(Src)에 의해 유발됨을 나타내었다. c-Src는 원형질막에 국한되었으며 지질 래프트와 세포 증식에 관련이 있다. 즉, 기타 세포 형태에서 Ret-매개하는 유사분열생식이 사르코마(Src) 키나아제 활성을 필요로 한다. 또한 사르코마(Src)는 배아줄기세포의 자가 재생에 있어 중요하다. 이러한 결과는 갈렉틴-1에 의해 유발된 카베올린-1의 인산화가 c-Src에 의하며 활성화된 사르코마(Src)가 갈렉틴-1에 의해 유발된 배아 줄기세포 증식에 중요한 역할을 함을 의미한다. In the present invention, tyrosine phosphorylation of caveolin-1 induced by galectin-1 was sensitive to PP2, a c-Src inhibitor. Moreover, pretreatment of PP2 attenuated the increase in galectin-1 induced expression of cell cycle regulatory proteins and [ 3 H] -thymidine binding. Previous studies have shown that the structural phosphorylation of carveolin in tyrosine 14 is caused by activated sarcoma (Src). c-Src is localized to the plasma membrane and is involved in lipid rafting and cell proliferation. That is, Ret-mediated mitotic reproduction in other cell types requires Sarcoma (Src) kinase activity. Sarcoma (Src) is also important for the self-renewal of embryonic stem cells. These results indicate that phosphorylation of caveolin-1 induced by galectin-1 is due to c-Src and activated sarcoma (Src) plays an important role in the growth of galectin-1 induced embryonic stem cells. do.

본 발명에서 갈렉틴-1은 Akt의 인산화를 증가시켰다. 활성화된 Akt는 세포 증식과 생존에 있어서 중요한데 이는 다양한 기질을 인산화하기 때문이다. 이전의 연구들은 Akt 신호 경로가 카베올린-1의 하위 경로임을 나타내었다. 즉, Mβ-CD에 의한 감소된 콜레스테롤이 인산-카베올린-1의 발현 정도를 낮출 뿐만 아니라 Akt의 인산화를 억제함을 관찰하였다. siRNA에 의한 카베올린-1의 억제에 의해 Akt 인산화가 감소되었다. 일부 연구는 카베올린-1이 포스포이노시타이드 3-키나아제(PI3K)/Akt 경로의 유력한 활성제임을 보고하였다. 따라서 이러한 결과는 카베올린-1과 Akt 활성간의 분자적 관련성을 수립한다. 이전의 연구들은 HRas는 세포 외적인 자극과 세포 내 갈렉틴-1 사이의 상호작용에 의해 활성화됨과 HRas가 활성 PI3K/Akt 경로에서 PI3K의 촉매 서브유니트와 직접적으로 상호작용 함을 보고하였다. 그 결과로서 갈렉틴-1에 의해 유발된 Akt 활성에 ERas가 연관되어 있는지를 관찰하였다. In the present invention, galectin-1 increased the phosphorylation of Akt. Activated Akt is important for cell proliferation and survival because it phosphorylates various substrates. Previous studies have shown that the Akt signaling pathway is a subpath of caveolin-1. That is, it was observed that the reduced cholesterol by Mβ-CD not only lowered the expression level of phosphate-caberoline-1 but also inhibited phosphorylation of Akt. Inhibition of Cabolin-1 by siRNA reduced Akt phosphorylation. Some studies have reported that caveolin-1 is a potent activator of the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) / Akt pathway. These results thus establish a molecular relationship between carveolin-1 and Akt activity. Previous studies have reported that HRas is activated by the interaction between extracellular stimuli and intracellular galectin-1 and HRas interacts directly with the catalytic subunit of PI3K in the active PI3K / Akt pathway. As a result, it was observed whether ERas is related to Akt activity induced by galectin-1.

본 발명의 결과는 ERas (HRas2) siRNA가 Akt 인산화 정도를 용량 의존적으로 크게 하향 조절함을 보여준다. 또한 ERas siRNA가 갈렉틴-1에 의해 유발된 Akt 인산화를 차단하였는지도 관찰하였다. 그 결과로서 Ras를 활성화시켜서 Akt 신호를 활성화시키는 세포 내 갈렉틴-1 활성에 세포 외적인 갈렉틴-1이 영향을 미친다는 것을 제시하였다. The results of the present invention show that ERas (HRas2) siRNA significantly downregulates the degree of Akt phosphorylation. We also observed that ERas siRNA blocked Akt phosphorylation induced by galectin-1. The results suggest that extracellular galectin-1 influences intracellular galectin-1 activity, which activates Ras to activate Akt signaling.

mTOR은 배아 줄기세포 내 PI3K의 다운스트림의 타겟에 있어 유력한 후보군이다. 인슐린을 포함한 많은 생장인자는 PI3K를 활성화시켜 3' 위치에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트[PtdIns-(4,5)P2]를 활성화하여 PtdIns(3,4,5)P3를 생성하고 Akt를 활성화시킨다. 이러한 연구결과와 일치하여 Akt 저해제는 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR) 인산화의 증가를 차단하였다. 또한 본 발명에서 Mβ-CD와 카베올린-1 siRNA는 갈렉틴-1에 의해 유발된 mTOR 인산화를 저해하였다. 이러한 점은 PI3K 신호가 mTOR 인산화의 조절에 관련되어 있으며, 그 두 신호 모두가 마우스 배아 줄기세포 내에서 카베올린-1에 의해 매개됨을 의미한다. mTOR is a potent candidate for targets downstream of PI3K in embryonic stem cells. Many growth factors, including insulin, activate PI3K to activate phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns- (4,5) P 2 ] at the 3 'position to produce PtdIns (3,4,5) P 3 And activate Akt. Consistent with these findings, Akt inhibitors blocked the increase in mammalian rapamycin target protein (mTOR) phosphorylation. In the present invention, Mβ-CD and carveolin-1 siRNA inhibited mTOR phosphorylation induced by galectin-1. This means that PI3K signals are involved in the regulation of mTOR phosphorylation, both of which are mediated by carveolin-1 in mouse embryonic stem cells.

본 발명에서 Akt 저해제와 라파마이신이 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 과정을 저해하였는지를 관찰하였다. PI3K/Akt 신호는 배아 줄기세포 내에서 크게 활성화되며 세포의 증식, 배아 줄기세포의 다능성(pluripotency) 유지에 연관된 것으로 알려져 있다. 즉, Jirmanova et al., (2002) Oncogene 21: 5515-5528, 2002는 배아 줄기세포의 세포 주기 제어에 있어서 PI3K의 역할을 제시하였다. 그들은 PI3K의 억제가 G0/G1기에서 배아 줄기세포의 개체를 크게 증가시킴을 보였다. PI3K 의존적 신호는 G1 CDKs 의 주된 저해제인 p27kip1의 정도를 조절하는 것으로도 알려져 있다. PI3K는 mTOR를 인산화 함으로써 리보솜 S6 단백질의 인산화를 통한 사이클린 D1의 번역을 상향 조절한다. 더욱이 이전의 연구는 mTOR이 마우스 배아 줄기세포 증식에 필수적임을 보였다. 즉, Akt와 mTOR 신호 경로는 세포 주기 공정을 촉진하기 위해 미토겐 자극에 반응한다. In the present invention, it was observed whether the Akt inhibitor and rapamycin inhibited the cell cycle process induced by galectin-1. PI3K / Akt signaling is highly activated in embryonic stem cells and is known to be involved in cell proliferation and maintaining pluripotency of embryonic stem cells. Jirmanova et al., (2002) Oncogene 21: 5515-5528, 2002, suggest a role of PI3K in cell cycle control of embryonic stem cells. They showed that inhibition of PI3K significantly increased the population of embryonic stem cells in the G0 / G1 phase. PI3K-dependent signaling is also known to regulate the degree of p27 kip1 , the major inhibitor of G1 CDKs. PI3K upregulates translation of cyclin D1 through phosphorylation of ribosomal S6 protein by phosphorylating mTOR. Moreover, previous studies have shown that mTOR is essential for mouse embryonic stem cell proliferation. That is, the Akt and mTOR signaling pathways respond to mitogen stimulation to promote cell cycle processes.

결론적으로 갈렉틴-1에 의해 유발된 카베올린-1의 활성은 Akt와 mTOR 신호 경로를 조절하며 이는 배아 줄기세포 증식과 관련 있다. 결론적으로 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 공정은 카베올린-1 인산화와 Ras를 유발하는 사르코마(Src)의 활성에 의해 조정되며, 그 결과로서 mTOR 인산화와 관련된 Akt 활성을 유발한다(도 7). 본 발명에서 나타난 기타 결과들과 더불어 배아 줄기세포 자기 재생 자극에 있어 갈렉틴-1에 의해 행해지는 역할의 발견은 배아 줄기세포 다능성이 어떻게 세포 외적인 요인들에 의해 유지되는 지에 대한 이해 정도를 크게 진보시킴을 나타내고, 다른 작은 분자들과 결합하여 세포대치요법을 겨냥한 배아 줄기세포 배양 시스템의 발전에 적용될 수 있다. In conclusion, gavetin-1-induced carveolin-1 activity regulates Akt and mTOR signaling pathways, which are associated with embryonic stem cell proliferation. In conclusion, the cell cycle process induced by galectin-1 is modulated by carveolin-1 phosphorylation and the activity of sarcoma (Src) that induces Ras, resulting in Akt activity associated with mTOR phosphorylation (FIG. 7). The discovery of the role played by galectin-1 in stimulating embryonic stem cell self-renewal, along with other results presented in the present invention, greatly enhances the understanding of how embryonic stem cell pluripotency is maintained by extracellular factors. Advances in combination with other small molecules can be applied to the development of embryonic stem cell culture systems aimed at cell replacement therapy.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. The present invention is described in more detail below.

DNA 합성 및 사이클린 발현시 갈렉틴-1의 효과Effect of Galectin-1 on DNA Synthesis and Cyclin Expression

갈렉틴-1의 시간적 추이에 따른 영향을 처리 시간에 따라 측정하였다. 도 1A에 나타난 바와 같이, 마우스 배아 줄기세포를 갈렉틴-1과 배양할 때 8시간 이후부터 [3H]-티미딘 결합이 크게 증가하였다. 이후 [3H]-티미딘 결합에 대한 갈렉틴-1의 투여량-반응 효과를 측정하였다. 다양한 갈렉틴-1 농도(0∼100 ng/ml)로 24시간 동안 마우스 배아 줄기세포를 배양하였다. 0.1ng/ml 이상의 갈렉틴-1 농도에서 [3H]-티미딘의 결합이 급격히 증가하였다. 최대 증가가 100 ng/ml의 갈렉틴-1에서 관찰되었다(도 1B). 사이클린 발현 정도를 조사하는 실험에서 갈렉틴-1은 시간 의존적으로 사이클린 D1과 사이클린 E 발현 또한 크게 증가시켰다. The effect of galectin-1 over time was measured with treatment time. As shown in FIG. 1A, [ 3 H] -thymidine binding increased significantly after 8 hours when mouse embryonic stem cells were incubated with galectin-1. The dose-response effect of galectin-1 on [ 3 H] -thymidine binding was then measured. Mouse embryonic stem cells were incubated for 24 hours at various galectin-1 concentrations (0-100 ng / ml). The binding of [ 3 H] -thymidine increased dramatically at galectin-1 concentrations of 0.1 ng / ml or more. Maximum increase was observed at 100 ng / ml galectin-1 (FIG. 1B). Galectin-1 also increased cyclin D1 and cyclin E expression in a time-dependent manner.

또한 갈렉틴-1은 사이클린 의존성 단백질 키나아제(CDK) 저해제인 p27kip1 단백질을 감소시켰다(도 1C). 세포증식에 대한 갈렉틴-1의 효과를 조사하기 위한 계속된 실험에서, 세포의 개체에 있어 급격한 증가가 관찰되었다(도 1D). 갈렉틴-1의 탄수화물-결합 활성의 연관성을 측정하기 위해 세포는 24시간 동안 락토오스(10 mM) 또는 슈크로스(10 mM)를 첨가하거나 첨가하지 않고 처리하였다(10mM : 오스몰 농도 표준으로 사용됨). 본 발명에서 갈렉틴-1에 의해 유발된 [3H]-티미딘 결합이 락토오스로 인해 감소하였다(도 1E). 더욱이 배아 줄기세포 증식에 대한 내재 갈렉틴-1 효과 또한 관찰하였다. Galectin- 1 also reduced p27 kip1 protein, a cyclin dependent protein kinase (CDK) inhibitor (FIG. 1C). In subsequent experiments to investigate the effect of galectin-1 on cell proliferation, a sharp increase in the population of cells was observed (FIG. 1D). Cells were treated with or without lactose (10 mM) or sucrose (10 mM) for 24 hours (10 mM: used as osmolality standard) to determine the association of caractin-binding activity of galectin-1. . Caused by the lectin -1 to go in the invention [3 H] - thymidine was reduced due to the combination of lactose (Fig. 1E). Furthermore, the effect of endogenous galectin-1 on embryonic stem cell proliferation was also observed.

도 1F와 G에서 나타난 바와 같이 갈렉틴-1이 마우스 배아 줄기세포에서 발현되고 배양 배지에서는 검출되지 않음을 관찰하였으며, [3H]-티미딘 결합은 대조군 조건 하에서 락토오스 처리에 의해 감소하지 않았다. It was observed that galectin-1 was expressed in mouse embryonic stem cells and not detected in culture medium as shown in FIGS. 1F and G, and [ 3 H] -thymidine binding was not reduced by lactose treatment under control conditions.

갈렉틴-1 유발 DNA 합성 증가에 있어서 사르코마(Src)와 카베올린-1의 관련성Relationship between Sarcoma (Src) and Cabolin-1 in Increased Galectin-1 Induced DNA Synthesis

본 발명에서 갈렉틴-1은 사르코마(Src)와 카베올린-1 인산화 정도를 증가시 켰다(도 2A). 더욱이 갈렉틴-1에 의해 유발된 카베올린-1의 타이로신 인산화가 마우스 배아 줄기세포 내에서 사르코마(Src)와 관련 있는지 여부를 조사하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이 PP2(Src 저해제, 5ㅧ10-6 M)에 의한 사르코마(Src) 저해가 갈렉틴-1에 의해 유발된 카베올린-1 인산화를 억제하였으며, 이는 사르코마(Src)가 카베올린-1 관련된 신호에 기여함을 시사한다. 또한 이러한 결과는 갈렉틴-1이 마우스 배아 줄기세포 내 카베올린-1 인산화의 유도인자임을 입증한다. In the present invention, galectin-1 increased the degree of sarcoma (Src) and carveolin-1 phosphorylation (FIG. 2A). Furthermore, we examined whether tyrosine phosphorylation of caveolin-1 induced by galectin-1 is related to sarcoma (Src) in mouse embryonic stem cells. As shown in FIG. 2B, the inhibition of sarcoma (Src) by PP2 (Src inhibitor, 5 ㅧ 10 −6 M) inhibited caveolin-1 phosphorylation induced by galectin-1, which was sarcoma (Src) Suggests a contribution to caveolin-1 related signals. These results also demonstrate that galectin-1 is an inducer of carveolin-1 phosphorylation in mouse embryonic stem cells.

카베올린-1은 콜레스테롤에 직접적으로 결합하며, 카베올레 발생에 있어 가장 중요한 보조인자이다. 카베올린-1 의존적인 신호에 있어 막 래프트(membrane raft)의 구조적 중요성을 입증하기 위해 우선 카베올레 구조에 대한 메틸-β-시클로덱스트린(Mβ-CD)의 영향을 조사하였다. 불연속적인 슈크로스 농도 변화 분획에서 카베올린이 풍부한 막 분획(도 2C, 분획 5)이 1시간 동안 10 mM의 Mβ-CD 처리 후 감소함을 확인하였다(도 2C). 공초점 현미경으로 카베올린-1의 조직을 조사하였다. 도 2D에 나타난 바와 같이 세포막에서 Mβ-CD에 의해 콜레스테롤이 고갈될 때 카베올레 조직이 파괴된다. Cabolin-1 binds directly to cholesterol and is the most important cofactor in caveol development. In order to demonstrate the structural significance of membrane rafts in caveolin-1 dependent signals, the effects of methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD) on caveole structure were first investigated. In the discontinuous sucrose concentration fraction, it was confirmed that the kaveolin-rich membrane fraction (FIG. 2C, fraction 5) decreased after 10 mM Mβ-CD treatment for 1 hour (FIG. 2C). The tissue of Cabolin-1 was examined under confocal microscopy. As shown in FIG. 2D, the Caberole tissue is destroyed when cholesterol is depleted by Mβ-CD in the cell membrane.

이후 사르코마(Src)와 카베올린-1이 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 조절 단백질 발현과 DNA 합성에 관련되었는가를 조사하였다. 도 3A는 단백질 포스파타제(PP2)가 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 조절 단백질(사이클린 D1, 사이클린 E와 p27kip1) 발현을 감소시킴을 나타낸다. 카베올린-1 발현에서 카베올린-1 siRNA가 미치는 효과를 확인하기 위해 표준 배아 줄기세포 배양 조건 하에서 카베올린-1 siRNA를 처리하였다. We then investigated whether sarcoma (Src) and carveolin-1 were involved in cell cycle regulatory protein expression and DNA synthesis induced by galectin-1. 3A shows that protein phosphatase (PP2) reduces cell cycle regulatory proteins (cyclin D1, cyclin E and p27 kip1 ) expression induced by galectin-1. To examine the effect of caveolin-1 siRNA on caveolin-1 expression, caveolin-1 siRNA was treated under standard embryonic stem cell culture conditions.

도 3C에 나타난 바와 같이 카베올린-1 siRNA는 용량 의존적으로 카베올린-1의 발현 정도를 크게 하향조절 하였다. 더욱이 Mβ-CD와 카베올린-1 siRNA는 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 조절 단백질의 발현을 저해하였다(도 3C, 3D). 이러한 결과는 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 공정에 카베올린-1 발현뿐만 아니라 카베올레의 구조적 기능이 필요함을 시사한다. 더욱이 도 3E는 갈렉틴-1에 의해 유발된 [3H]-티미딘 결합이 단백질 포스파타제(PP2), Mβ-CD와 카베올린-1 siRNA에 의해 차단됨을 나타내며, 이는 도 3A에서 3D에 나타난 결과와 일치한다. As shown in FIG. 3C, caveolin-1 siRNA significantly downregulated the expression of caveolin-1 in a dose-dependent manner. Moreover, Mβ-CD and carveolin-1 siRNA inhibited the expression of cell cycle regulatory proteins induced by galectin-1 (FIGS. 3C, 3D). These results suggest that the cell cycle process induced by galectin-1 requires the structural function of caveole as well as caveolin-1 expression. Furthermore, FIG. 3E shows that [ 3 H] -thymidine binding induced by galectin-1 is blocked by protein phosphatase (PP2), Mβ-CD and caveolin-1 siRNA, which results in 3D in FIG. 3A. Matches

갈렉틴-1에 의해 유발된 단백질 키나제(Akt) 인산화에 대한 사르코마(Src), 카베올린-1과 ERas의 연관성Association of Sarcoma (Src), Caberoline-1 and ERas on Protein Kinase (Akt) Phosphorylation Induced by Galectin-1

이후 갈렉틴-1 신호체계 내 즉각적인 하위 신호전달 물질의 활성화에 있어서 사르코마(Src)와 카베올린-1의 역할을 정의하였다. 갈렉틴-1은 갈렉틴-1에 의한 자극 후 이미 10분 후에 시간 의존적(0∼240분)으로 Akt의 인산화를 유발하였다(도 4A). 사르코마(Src) 활성화가 갈렉틴-1에 의해 유발된 Akt 인산화와 관련 있는지 를 측정하기 위해 갈렉틴-1을 처리하기에 앞서 마우스 배아 줄기세포를 PP2로 30분 동안 처리하였다. We then defined the role of sarcoma (Src) and caveolin-1 in the activation of immediate downstream signaling agents in the galectin-1 signaling system. Galectin-1 induced Akt phosphorylation time-dependently (0-240 minutes) 10 minutes after stimulation by galectin-1 (FIG. 4A). Mouse embryonic stem cells were treated with PP2 for 30 minutes prior to treatment with galectin-1 to determine if sarcoma (Src) activation was associated with Akt phosphorylation induced by galectin-1.

도 4C 및 4D에 나타난 바와 같이 Mβ-CD와 카베올린-1 si-RNA에 의해 갈렉틴-1에 의한 Akt의 인산화가 저해되었다. 이러한 결과는 카베올린-1의 정상적인 단백질 발현과 손상되지 않은 카베올레 구조가 Akt 인산화에 필수적임을 나타낸다. 또한 갈렉틴-1에 의해 유발된 Akt 인산화에 대한 ERas의 연관성을 정하기 위해 실험을 진행하였다. 본 실험에서 용량 의존적으로 ERas siRNA에 의해 Akt 인산화가 감소하였으며, 갈렉틴-1에 의해 유발된 Akt 인산화의 증가 또한 ERas siRNA에 의해 저해되었다(도 4E, 4F).As shown in FIGS. 4C and 4D, phosphorylation of Akt by galectin-1 was inhibited by Mβ-CD and caveolin-1 si-RNA. These results indicate that normal protein expression of caveolin-1 and its intact caveoli structure are essential for Akt phosphorylation. In addition, experiments were conducted to determine the association of ERas to Akt phosphorylation induced by galectin-1. In this experiment, Akt phosphorylation was reduced by ERas siRNA in a dose-dependent manner, and the increase in Akt phosphorylation induced by galectin-1 was also inhibited by ERas siRNA (FIGS. 4E and 4F).

갈렉틴-1에 의해 유발된 mTOR 신호에 사르코마(Src)와 카베올린-1의 연관성Association of Sarcoma (Src) with Caberoline-1 on mTOR Signaling Induced by Galectin-1

mTOR/p70S6K/4E-BP1 인산화 정도를 측정하였다. 도 5A에 나타난 바와 같이 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mammalian target of rapamycin, mTOR), p70S6K와 4E-결합 단백질 1(4E-BP1)의 인산화가 시간 의존적(0∼240분)으로 저해되었다. 또한 LY294002 또는 Akt 저해제의 전처리에 의해 mTOR의 인산화가 감소하였다(도 5B). 이러한 결과는 포스포이노시타이드-3-키나제 (PI3K)/Akt 신호 과정이 mTOR 인산화와 관련 있음을 의미한다. 따라서 갈렉틴-1에 의해 유발되는 마우스 배아 줄기세포 내 mTOR의 인산화에 사르코마(Src)와 카베올린-1이 관련 있는지를 조사하였 다. 도 5C에 나타난 바와 같이 갈렉틴-1에 의해 유발된 mTOR의 인산화는 PP2 전처리에 의해 저해되었다. 또한 Mβ-CD와 카베올린-1 siRNA의 처리는 갈렉틴-1에 의해 유발된 mTOR의 활성화를 막았으며 이는 mTOR이 매개하는 신호에 카베올린-1이 필요함을 확인하는 것이다(도 5D, 5E). The degree of mTOR / p70S6K / 4E-BP1 phosphorylation was measured. As shown in FIG. 5A, phosphorylation of the mammalian rapamycin target protein (mTOR), p70S6K, and 4E-binding protein 1 (4E-BP1) was inhibited time-dependent (0-240 min). In addition, the phosphorylation of mTOR was reduced by pretreatment with LY294002 or Akt inhibitors (FIG. 5B). These results indicate that the phosphinositide-3-kinase (PI3K) / Akt signaling process is associated with mTOR phosphorylation. Therefore, we investigated whether sarcoma (Src) and caveolin-1 are related to the phosphorylation of mTOR in mouse embryonic stem cells induced by galectin-1. As shown in FIG. 5C, phosphorylation of mTOR induced by galectin-1 was inhibited by PP2 pretreatment. Treatment of Mβ-CD with caveolin-1 siRNA prevented the activation of galectin-1-induced mTOR, confirming the need for caveolin-1 for mTOR-mediated signals (Figures 5D, 5E). .

갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 조절에 대한 Akt와 mTOR의 연관성Association of Akt with mTOR on Cell Cycle Regulation Induced by Galectin-1

갈렉틴-1에 의해 유발된 DNA 합성에 Akt와 mTOR 경로가 관련 있는지 여부를 측정하기 위해 세포 주기 조절 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 도 6A에 나타난 바와 같이 갈렉틴-1에 의해 유발된 사이클린 D1과 사이클린 E의 증가와 p27kip1의 감소가 Akt 저해제 또는 라파마이신(mTOR 저해제, 10-5 M)에 의해 차단되었다. 또한 Akt 저해제 또는 라파마이신이 세포 주기를 유사하게 조절하였는지 여부를 조사하였다. 갈렉틴-1은 대조군에 비해 S기에 있는 세포 집단의 비율을 증가시켰다. 그러나 Akt 저해제나 라파마이신의 전처리는 갈렉틴-1에 의해 유발된 S기의 축적을 감소시켰다(도 6B, C). The expression level of cell cycle regulatory proteins was measured to determine whether Akt and mTOR pathways were involved in DNA synthesis induced by galectin-1. The increase and decrease of p27 kip1 of Figure 6A lectin -1 of cyclin D1 and cyclin E caused by the go, as shown in Akt was blocked by an inhibitor or a rapamycin (mTOR inhibitor, 10 -5 M). We also examined whether Akt inhibitors or rapamycin regulated the cell cycle similarly. Galectin-1 increased the proportion of cell populations in S phase compared to control. However, pretreatment with Akt inhibitors or rapamycin reduced the accumulation of S phase induced by galectin-1 (Figure 6B, C).

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples do not limit the scope of the present invention.

재료material

마우스 배아 줄기세포(ES-E14TG2a)는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)으로부터 수득되었다. 우태아혈청은 Biowhittaker(Walkersville, MD)에서 구입하였다. 재조합 마우스 갈렉틴-1은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)으로부터 수득되었다. 메틸-β-사이클로덱스트린, β-락토오스, 슈크로스, LY 294002, Akt 저해제, 라파마이신, 형광 이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이트된 염소-항토끼 IgM 및 β-액틴은 Sigma Chemical Company(St. Louis, MO, USA)로부터 획득되었다. [3H]-티미딘은 NEN(Boston, MA, USA)에서 구입하였다. 항-인산-사르코마(Src), 인산-카베올린-1 및 카베올린-1 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Delaware, CA, USA)로부터 획득되었다. 인산-Akt 308, 인산-Akt 473, 인산-mTOR, 인산-p70S6K 및 인산-4E-BP1 항체는 New England Biolabs(Herts, UK)에 의해 공급되었다. 염소 항-토끼 IgG은 Jackson Immunoresearch(West Grove, PA, USA)에서 구입하였다. 그 밖의 모든 시약은 상업적으로 구입되었으며, 최상의 순도에 해당된다.Mouse embryonic stem cells (ES-E14TG2a) were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Fetal bovine serum was purchased from Biowhittaker (Walkersville, MD). Recombinant mouse galectin-1 was obtained from R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Methyl-β-cyclodextrin, β-lactose, sucrose, LY 294002, Akt inhibitor, rapamycin, fluorescent isothiocyanate (FITC) -conjugated goat-anti-rabbit IgM and β-actin are available from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). [ 3 H] -thymidine was purchased from NEN (Boston, Mass., USA). Anti-phosphate-sarcoma (Src), phosphate-cabolin-1 and caveolin-1 antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA, USA). Phosphate-Akt 308, phosphate-Akt 473, phosphate-mTOR, phosphate-p70S6K and phosphate-4E-BP1 antibodies were supplied by New England Biolabs (Herts, UK). Goat anti-rabbit IgG was purchased from Jackson Immunoresearch (West Grove, PA, USA). All other reagents were purchased commercially and are of the highest purity.

(실시예 1) 배아 줄기세포 배양Example 1 Embryonic Stem Cell Culture

마우스 배아 줄기세포는 영양세포층 없이 중탄산염나트륨 1% 페니실린 및 스 트렙토마이신 3.7 g/l, 1.7 mM L-글루타민, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 5 ng/ml 마우스 백혈병 저해 인자(LIF) 및 15% 우태아혈청(FBS)로 보충된 Dulbecco's modified Eagle(DMEM)(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) 배지 내에서 5일 동안 배양되었다. 세포는 5% CO2를 포함한 대기에서 37℃로 유지된 배양기에서 12-well 플레이트 또는 60-mm 배양 접시 상에서 배양된다. 배지는 실험 전 24시간 동안 LIF를 포함한 무-혈청 DMEM에서 배양되었다. Mouse embryonic stem cells contained 3.7 g / l sodium bicarbonate and streptomycin 3.7 g / l, 1.7 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 5 ng / ml mouse leukemia inhibitory factor (LIF), and 15 without the feeder cell layer. Cultured for 5 days in Dulbecco's modified Eagle (DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) medium supplemented with% fetal bovine serum (FBS). Cells are cultured on 12-well plates or 60-mm culture dishes in an incubator maintained at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% CO 2 . Media was incubated in serum-free DMEM with LIF for 24 hours before the experiment.

(실시예 2) 카베올린-1 siRNA 트랜스펙션Example 2 Cabolin-1 siRNA Transfection

세포는 각각의 접시 내에서 75% 합류되어 성장되었으며, 제조사 지침서에 따라 Dharmafect(Dharmacon, Inc., Lafayette, CO, USA)를 사용하여 카베올린-1 및 ERas에 특이적인 작은 간섭 RNAs(siRNAs)의 SMARTpool 또는 비-타겟 siRNA(asnegative control; 200 pmol/l; Dharmacon, Inc., Lafayette,CO, USA)로 48시간 동안 트랜스펙트되었다. Cells were grown 75% confluent in each dish, using Dharmafect (Dharmacon, Inc., Lafayette, Co., USA) to grow small interfering RNAs (siRNAs) specific for caveolin-1 and ERas according to manufacturer's instructions. Transfected with SMARTpool or non-target siRNA (asnegative control; 200 pmol / l; Dharmacon, Inc., Lafayette, CO, USA) for 48 hours.

(실시예 3) [3H]-티미딘 도입Example 3 Incorporation of [ 3 H] -thymidine

[3H]-티미딘 도입 실험은 Bretteet et al.에 기술된 방법론을 사용하여 수행되었다. 세포는 갈렉틴-1이 존재하거나 존재하지 않거나 배지에서 배양되었으며, 그 다음에 세포는 37℃에서 1시간 동안 [메틸-3H]-티미딘 1 μCi로 펄스되었다. 배아 줄기세포는 인산염완충식염수(PBS)로 2번 세척되었으며, 23℃에서 15분 동안 10% 삼염화아세트산(TCA)에서 고정되었으며, 그 다음에 5% TCA로 2번 세척되었다. 산-불용성 물질은 23℃에서 12시간 동안 2N NaOH에서 용해되었다. 분취액(Aliquot)은 액체섬광계수기(LS 6500, Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 방사능 수준이 측정되었다. 모든 수치들은 평균값으로 작성되었다.[ 3 H] -thymidine transduction experiments were performed using the methodology described in Bretteet et al. The cells were with or without galectin-1 or were cultured in medium, and the cells were then pulsed with 1 μCi of [methyl- 3 H] -thymidine at 37 ° C. for 1 hour. Embryonic stem cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS), fixed in 10% trichloroacetic acid (TCA) for 15 minutes at 23 ° C., then washed twice with 5% TCA. The acid-insoluble material was dissolved in 2N NaOH at 23 ° C. for 12 hours. Aliquots were measured for radioactivity using a liquid scintillation counter (LS 6500, Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). All figures are averaged.

(실시예 4) 세포-증식 에세이Example 4 Cell-Proliferation Essay

세포의 수를 측정하기 위해서, 세포는 PBS로 2번 세척되었고, 배양 접시로부터 트립신화되었다. 세포 서스펜션은 0.4%(w/v) 트리판 블루 용액과 혼합되었으며, 생존 세포 수는 혈구계를 사용하여 측정되었다. 염료차단에 실패한 세포는 사멸세포로 간주된다.To determine the number of cells, cells were washed twice with PBS and trypsinized from the culture dish. Cell suspension was mixed with 0.4% (w / v) trypan blue solution and viable cell numbers were measured using a hemocytometer. Cells that fail to block dye are considered dead cells.

(실시예 5) 카베올린-1 풍부 막 분획의 세제-프리 정제Example 5 Detergent-Free Purification of Cabolin-1 Rich Membrane Fraction

카베올린-풍부한 막 분획이 상술한 바와 같이 제조되었다. 세포는 차가운 PBS로 2회 세척되었으며, 500 mM 탄산나트륨(pH 11.0) 2ml로 회수하여, 플라스틱 튜브로 옮긴 후, 초음파발생장치(three 20-sbursts; Branson Sonicator 250, Branson UltrasonicCorp., Danbury,CT,USA)로 균질화되었다. 이후 균질화물은 MES-완충용액[MBS:25mM MES (pH 6.5), 0.15M NaCl]에서 제조된 90% 슈크로스 2 ml을 첨가하여 45%로 조절되고, 초원심분리기 튜브 바닥에 놓여진다. A 5-35% 불연속 슈크로스는 상기와 같이(탄산나트륨 250 mM을 포함하는 MBS에 4 ml 5% 슈크로스, 4 ml 35% 슈크로스) 형성되며, SW 41 로터(Beckman Instruments)에서 20시간 동안 40,000 rpm으로 원심분리된다. 12 ml 분획이 수집되고 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분석된다.Cabolin-rich membrane fractions were prepared as described above. Cells were washed twice with cold PBS, recovered with 2 ml of 500 mM sodium carbonate (pH 11.0), transferred to plastic tubes, and then placed into ultrasonic tubes (three 20-sbursts; Branson Sonicator 250, Branson Ultrasonic Corp., Danbury, CT, USA). Homogenized). The homogenate is then adjusted to 45% by addition of 2 ml of 90% sucrose prepared in MES-buffer [MBS: 25mM MES (pH 6.5), 0.15M NaCl] and placed on the bottom of the ultracentrifuge tube. A 5-35% discontinuous sucrose is formed as above (4 ml 5% sucrose, 4 ml 35% sucrose in MBS containing 250 mM sodium carbonate) and 40,000 for 20 hours in SW 41 rotor (Beckman Instruments) Centrifuge at rpm. 12 ml fractions are collected and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).

(실시예 6) 면역형광 염색Example 6 Immunofluorescence Staining

세포는 고정되고 0.1 % (v/v) 트리톤 X-100에 10분 동안 방치되고, 세척된다. 항체의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서, 세포는 20분 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 전-배양된다. 그 다음에 세포는 1%(v/v) BSA를 포함하는 PBS 용액에서 일차 항체와 함께 60분 동안 배양된다. PBS로 3회 세척하고, 1% (v/v) BSA에 5분간 방치 후에, 세포는 1% (v/v) BSA를 지닌 PBS에서 FITC-컨쥬게이트된 이차 항체와 함께 60분 동안 배양된다. 세척 후 표본들은 슬라이드 상에 고정되고, 공초점 현미경(Fluoview 300, Olympus)을 사용하여 400ㅧ배율로 가시화되었다.Cells are fixed and left in 0.1% (v / v) Triton X-100 for 10 minutes and washed. To reduce non-specific binding of the antibodies, cells are pre-cultured with 1% bovine serum albumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) for 20 minutes. The cells are then incubated with the primary antibody for 60 minutes in PBS solution containing 1% (v / v) BSA. After washing three times with PBS and standing for 5 minutes in 1% (v / v) BSA, cells are incubated with FITC-conjugated secondary antibody for 60 minutes in PBS with 1% (v / v) BSA. After washing, the samples were fixed on slides and visualized at 400 Hz magnification using confocal microscope (Fluoview 300, Olympus).

(실시예 7) 웨스턴 블럿 분석Example 7 Western Blot Analysis

세포 균질화물(30 mg 단백질)은 10% SDS-PAGE에 의해 분리되고, 니트로셀룰로스 막으로 이동된다. 블럿은 TBST[10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20]으로 세척되고, 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹된다. 이후 블럿은 적절한 일차 항체와 함께 배양된다. 막은 세척되고, 일차 항체는 산화효소와 포합된 염소 항-토끼 IgG 또는 염소 항-마우스 IgG으로 검출된다. 밴드는 ECL 용액(Amersham Pharmacia Biotech, England, UK)으로 가시화된다.Cell homogenate (30 mg protein) is separated by 10% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane. Blots are washed with TBST [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20] and blocked with 5% skim milk powder for 1 hour. The blot is then incubated with the appropriate primary antibody. The membrane is washed and the primary antibody is detected with goat anti-rabbit IgG or goat anti-mouse IgG conjugated with oxidase. The band is visualized with ECL solution (Amersham Pharmacia Biotech, England, UK).

통계 분석(Statistical analysis)Statistical analysis

결과는 평균 ㅁ표준오차(S.E.M.)으로 보고된다. 모든 실험은 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석된다. 몇몇 실험에서 이 분석은 Bonferroni-Dunn 테스트를 이용하여 대조군과 처리군 평균 비교에 의해 수행된다. 0.05 이하의 P 값이 유효 한 것으로 간주된다.Results are reported as mean W standard error (S.E.M.). All experiments are analyzed by analysis of variance (ANOVA). In some experiments this analysis is performed by comparison of control and treatment mean using the Bonferroni-Dunn test. P values less than 0.05 are considered valid.

도 1은 [3H]-티미딘 결합과 세포주기 조절 단백질 발현에 대한 갈렉틴-1의 영향을 나타낸 것이다. 도 1(A)는 [3H]-티미딘 결합에 대한 갈렉틴-1 효과의 시간에 따른 반응을 나타내고 도 1(B)는 [3H]-티미딘 결합에 대한 갈렉틴-1 효과의 용량에 따른 반응을 나타낸다. 0∼24시간 등으로 시간에 변화를 주거나, 24시간 동안 0∼100 ng/ml의 다양한 용량으로 마우스 배아 줄기세포를 갈렉틴-1(10 ng/ml)로 처리하고 측정 한시간 전에 [3H]-티미딘 1μCi로 펄스를 가하였다. 도 1(C)는 실시예에 기재된 웨스턴 블럿법으로 측정된 사이클린 D1, 사이클린 E와 p27kip1 단백질 발현의 시간의 추이에 따른 변화를 나타낸다. 세포들은 다양한 시간 (0-24시간) 동안 갈렉틴-1 (10 ng/ml)을 처리하거나 처리하지 않았다. 각 표본은 3회의 실험 중 대표적인 값을 나타낸다. 그래프는 β-액틴에 비례하여 밀도계로 정한 각 조건에 대한 3회에 걸친 실험의 평균ㅁS.E.M.을 나타낸다. *, P<0.05 vs. control. 도 1(D)는 세포들이 다양한 시간 (0-24 시간)동안 갈렉틴-1 (10ng/ml)을 처리하거나 처리되지 않았으며 세포의 수는 혈구계산기로 측정되었음을 나타낸다. 도 1(E)는 세포는 24시간 동안 락토스(10 mM) 또는 슈크로스(10mM : 오스몰 농도 표준으로 사용됨)를 첨가하거나 첨가하지 않고 갈렉틴-1로 처리하였으며 측정 1시간 전 1μCi의 [3H]-티미딘으로 펄스를 가하였음을 나타낸다. 도 1(F)는 24시간 동안 무혈청 배양기에서 세포를 배양하였으며, 실시예에 기재된 웨스턴 블럿법에 의해 전체 세포의 용해물 또는 배아 줄기세포 배양 배지에서 갈렉틴-1이 검출되었음을 나타낸다. 각 표본은 3회의 실험 중 대표적인 값을 나타낸다. 도 1(G)는 세포는 24시간동안 락토스 또는 슈크로스를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였으며 측정 한시간 전 1μCi의 [3H]-티미딘으로 펄스를 가하였음을 나타낸다. [3H]-티미딘 수치는 각각 3회씩 수행된 독립적인 실험의 평균ㅁS.E.M.으로 표시하였다. * P<0.05 vs. vehicel ; **, P<0.05 vs. 갈렉틴-1 단독.1 shows the effect of galectin-1 on [ 3 H] -thymidine binding and cell cycle regulatory protein expression. 1 (A) shows the time-dependent response of the galectin-1 effect on [ 3 H] -thymidine binding and FIG. 1 (B) shows the effect of galectin-1 on [ 3 H] -thymidine binding The response according to the dose is shown. 0-24 hours such as jugeona a difference in time, treated with lectin -1 (10 ng / ml) going to the mouse embryonic stem cells with varying capacities of 0~100 ng / ml for 24 hours before measuring one hours [3 H] Pulsed with thymidine 1 μCi. 1 (C) shows the change over time of cyclin D1, cyclin E and p27 kip1 protein expression measured by Western blot method described in the Examples. Cells were treated with or without galectin-1 (10 ng / ml) for various times (0-24 hours). Each sample represents a representative value of three experiments. The graph shows the mean W SEM of three experiments for each condition defined by the density meter in proportion to β-actin. *, P <0.05 vs. control. 1 (D) shows that cells were treated with or without galectin-1 (10 ng / ml) for various times (0-24 hours) and the number of cells was measured with a hemocytometer. Figure 1 (E) is a cell 24hr lactose (10 mM) or sucrose for (10mM: osmolarity standard used) were added to or processed by lectin -1 go without addition 1 hour before measurement 1μCi of [3 H] -thymidine indicates a pulse was applied. FIG. 1 (F) shows that the cells were cultured in a serum-free incubator for 24 hours and that galectin-1 was detected in lysate or embryonic stem cell culture medium of whole cells by Western blot method described in the Examples. Each sample represents a representative value of three experiments. 1 (G) shows that the cells were incubated with or without lactose or sucrose for 24 hours and pulsed with 1 μCi [ 3 H] -thymidine one hour before measurement. [ 3 H] -thymidine levels are expressed as mean W SEM of independent experiments performed three times each. * P <0.05 vs. vehicel; **, P <0.05 vs. Galectin-1 alone.

도 2는 갈렉틴-1 효과에 대한 사르코마(Src)와 카베올린-1의 관련성을 나타낸 것이다. 도 2(A)는 마우스 배아 줄기세포를 다양한 시간(0∼240분)동안 갈렉틴-1 (10 ng/ml)으로 처리하고 웨스턴 블럿법으로 사르코마(Src)와 카베올린-1의 인산화 정도를 측정한 결과이다. 도 2(B)는 세포들은 갈렉틴-1 처리 전 30분 동안 PP2(Src 저해제, 5ㅧ10-6M)로 전처리 하였으며, 사르코마(Src)와 카베올린-1의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 각 표본은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 그래프는 β-액틴에 비례하여 밀도계로 정한 각 조건에 대한 3회에 걸친 실험의 평균ㅁS.E.M.을 나타낸다. *, P<0.05 vs. 대조군. 도 2(C)는 아무것도 처리하지 않은 세포(대조군) 또는 10mM의 메틸-β-시클로덱스트린(Mβ-CD)을 처리한 세포의 용해물은 슈크로스 밀도 분획을 나타낸다. 각 부분은 웨스턴 블럿법으로 분석하 였다. 도 2(D)는 대조군과 10mM Mβ-CD를 처리한 세포는 카베올린-1 (녹색) 검출을 위해 면역 염색하였으며, 핵은 프로피디움 아이오다이드(적색)로 염색하였음을 나타낸다. 각 표본은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. Figure 2 shows the relationship between sarcoma (Src) and Cabolin-1 on the galectin-1 effect. FIG. 2 (A) shows that mouse embryonic stem cells were treated with galectin-1 (10 ng / ml) for various times (0 to 240 minutes) and phosphorylation of sarcoma (Src) and caveolin-1 by Western blotting. Is the result of measurement. Figure 2 (B) are the cells go hayeoteum lectin -1-treated were pre-treated with PP2 (Src inhibitor, 5 ㅧ 10 -6 M) for 30 minutes and measuring the phosphorylation level of burn coma (Src) and the Added carbenium -1 Indicates. Each sample represents three independent experiments. The graph shows the mean W SEM of three experiments for each condition defined by the density meter in proportion to β-actin. *, P <0.05 vs. Control. 2 (C) shows the sucrose density fractions of cells treated with nothing (control) or cells treated with 10 mM methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD). Each part was analyzed by Western blot method. FIG. 2 (D) shows that cells treated with the control and 10 mM Mβ-CD were immunostained for caveolin-1 (green) detection and nuclei were stained with propidium iodide (red). Each sample represents three independent experiments.

도 3은 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 조절 단백질 발현과 DNA 합성에 대한 사르코마(Src)와 카베올린-1의 연관성을 나타낸 것이다. 도 3(A)는 마우스 배아 줄기세포는 24시간의 갈렉틴-1(10 ng/ml) 처리에 앞서 30분 동안 PP2로 전처리 하였으며 웨스턴 블럿법으로 사이클린 D1, 사이클린 E와 p27kip1을 검출하였음을 나타낸다. 도 3(B)는 카베올린-1 siRNA (0-50 nM)의 SMARTpool 상이한 용량으로 36시간동안 세포를 트랜스펙트시켰으며 웨스턴 블럿법으로 카베올린-1의 발현을 검출하였음을 나타낸다. 도 3(C)는 세포는 24시간의 갈렉틴-1 처리에 앞서 1시간 동안 10 nM의 Mβ-CD로 전처리를 하였으며 웨스턴 블럿법에 의해 사이클린 D1, 사이클린 E와 p27kip1의 발현이 검출되었음을 나타낸다. 도 3(D)는 세포는 24시간의 갈렉틴-1 처리에 앞서 카베올린 siRNA의 SMARTpool 또는 대조군 siRNA으로 36시간동안 트랜스펙트시켰으며, 웨스턴 블럿법에 의해 사이클린 D1, 사이클린 E와 p27kip1의 발현이 검출되었음을 나타낸다. 각 표본은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 그래프는 β-액틴에 비례하여 밀도계로 정한 각 조건에 대한 3회에 걸친 실험의 평균ㅁS.E.M.을 나타낸다. 도 3(E)는 세포는 30분 동안 PP2를 처리하거나 한시간 동안 10mM의 Mβ-CD를 전처리 하였으며, 24시간의 갈렉틴-1 처리에 앞서 카베올린 siRNA의 SMARTpool 또는 대조군 siRNA으로 36시간동안 트랜스팩트시키고 측정 한시간 전 1μCi의 [3H]-티미딘으로 펄스를 가하였음을 나타낸다. 데이터는 각각 3회의 독립적인 실험의 평균ㅁS.E.M.으로 표시하였다. *, P<0.05 vs. 대조군; **, P<0.05 vs. 갈렉틴-1 단독.Figure 3 shows the association of sarcoma (Src) and carveolin-1 on cell cycle regulatory protein expression induced by galectin-1 and DNA synthesis. FIG. 3 (A) shows that mouse embryonic stem cells were pretreated with PP2 for 30 minutes prior to 24 hours galectin-1 (10 ng / ml) treatment and detected cyclin D1, cyclin E and p27 kip1 by Western blotting. Indicates. 3 (B) shows that cells were transfected for 36 hours at different SMARTpool doses of caveolin-1 siRNA (0-50 nM) and detected expression of caveolin-1 by Western blot. 3 (C) shows that the cells were pretreated with 10 nM of Mβ-CD for 1 hour prior to 24 hours of galectin-1 treatment and expression of cyclin D1, cyclin E and p27 kip1 was detected by Western blotting. . 3 (D) cells were transfected with SMARTpool or control siRNA of carveolin siRNA for 36 hours prior to 24 hours of galectin-1 treatment, and expressed by cyclin D1, cyclin E and p27 kip1 by Western blot. Indicates that it was detected. Each sample represents three independent experiments. The graph shows the mean W SEM of three experiments for each condition defined by the density meter in proportion to β-actin. Figure 3 (E) cells were treated with PP2 for 30 minutes or pretreated with 10 mM Mβ-CD for one hour, and transfected for 36 hours with SMARTpool or control siRNA of caveolin siRNA prior to 24 hours galectin-1 treatment. And pulsed with 1 μCi [ 3 H] -thymidine one hour before measurement. Data are expressed as mean W SEM of 3 independent experiments each. *, P <0.05 vs. Control group; **, P <0.05 vs. Galectin-1 alone.

도 4는 갈렉틴-1에 의해 유발된 Akt 인산화에 대해 사르코마(Src)와 카베올린-1의 연관성을 나타낸 것이다. 도 4(A)는 마우스 배아 줄기세포를 다양한 시간(0∼240분)동안 갈렉틴-1 (10 ng/ml)으로 처리하였으며 웨스턴 블럿법으로 Akt (Ser473, Thr308)의 인산화 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 4(B)는 세포들은 24시간의 갈렉틴-1 처리 전 30분 동안 PP2(Src 저해제, 5ㅧ10-6M)로 전처리 하였으며, 웨스턴 블럿법으로 Akt의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 도 4(C)는 세포들은 갈렉틴-1 처리 전 1시간 동안 10 mM의 Mβ-CD로 전처리 하였으며 웨스턴 블럿법으로 Akt의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 도 4(E)는 세포는 갈렉틴-1 처리에 앞서 카베올린 siRNA의 SMARTpool 또는 대조군 siRNA으로 36시간동안 트랜스펙트시키고 웨스턴 블럿법으로 Akt의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 도 4(E)는 세포는 36시간 동안 다양한 용량(0-50 nM)의 카베올린 siRNA의 SMARTpool로 트랜스펙트시켰으며 웨스턴 블럿법으로 Akt의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 도 4(F)는 세포는 갈렉틴-1 처리에 앞서 ERas siRNA의 SMARTpool 또는 대조군 siRNA으로 36시간 동안 트랜스펙트시키고 웨스턴 블럿법으로 Akt의 인 산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 각 표본은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 그래프는 β-액틴에 비례하여 밀도계로 정한 각 조건에 대한 3회에 걸친 실험의 평균ㅁS.E.M.을 나타낸다. *, P<0.05 vs. 대조군; **, P<0.05 vs. 갈렉틴-1 단독.FIG. 4 shows the association of sarcoma (Src) with caveolin-1 on Akt phosphorylation induced by galectin-1. FIG. 4 (A) shows that mouse embryonic stem cells were treated with galectin-1 (10 ng / ml) for various times (0 to 240 minutes), and the degree of phosphorylation of Akt (Ser 473 , Thr 308 ) was measured by Western blotting. One result is shown. Figure 4 (B) cells were pretreated with PP2 (Src inhibitor, 5 ㅧ 10 -6 M) for 30 minutes before 24 hours galectin-1 treatment, indicating that the degree of phosphorylation of Akt by Western blot method. 4 (C) shows that the cells were pretreated with 10 mM Mβ-CD for 1 hour before galectin-1 treatment, and the degree of phosphorylation of Akt was measured by Western blot. FIG. 4 (E) shows that cells were transfected with SMARTpool or control siRNA of carveolin siRNA for 36 hours prior to galectin-1 treatment and measured the degree of phosphorylation of Akt by Western blot. FIG. 4 (E) shows that cells were transfected with SMARTpool of various doses (0-50 nM) of caveolin siRNA for 36 hours and the degree of phosphorylation of Akt was measured by western blot. FIG. 4 (F) shows that cells were transfected with SMARTpool or control siRNA of ERas siRNA for 36 hours prior to galectin-1 treatment and measured the degree of phosphorylation of Akt by Western blot. Each sample represents three independent experiments. The graph shows the mean W SEM of three experiments for each condition defined by the density meter in proportion to β-actin. *, P <0.05 vs. Control group; **, P <0.05 vs. Galectin-1 alone.

도 5는 갈렉틴-1에 의해 유발된 mTOR 신호에 대한 사르코마(Src)와 카베올린-1의 연관성을 나타낸 것이다. 도 5(A)는 마우스 배아 줄기세포를 다양한 시간(0∼240분) 동안 갈렉틴-1(10 ng/ml)로 처리하였으며 웨스턴 블럿법으로 mTOR, p70S6K와 4EBP1의 인산화 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 5(B)는 세포는 갈렉틴-1로 배양 전에 LY 294002(PI3K 저해제, 10-6M) 또는 Akt 저해제(10-5 M)를 30분 동안 처리하였으며, 웨스턴 블럿법으로 mTOR의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 도 5(C)는 세포들은 24시간의 갈렉틴-1 처리 전 30분 동안 PP2(Src 저해제, 5ㅧ10-6M)로 전처리 하였으며, 웨스턴 블럿법으로 mTOR의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 세포들은 갈렉틴-1 처리 전에 1시간 동안 Mβ-CD로 전처리 하였으며 웨스턴 블럿법으로 Akt의 인산화 정도를 측정하였다. 도 5(E)는 세포는 24시간의 갈렉틴-1 처리에 앞서 카베올린-1 siRNA의 SMARTpool 또는 대조군 siRNA으로 36시간동안 트랜스펙트시키고 웨스턴 블럿법으로 mTOR의 인산화 정도를 측정하였음을 나타낸다. 각 표본은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 그래프는 β-액틴에 비례하여 밀도계로 정한 각 조건에 대한 3회에 걸친 실험의 평균ㅁS.E.M.을 나타낸 다. *, P<0.05 vs. 대조군; **, P<0.05 vs. 갈렉틴-1 단독.5 shows the association of sarcoma (Src) with caveolin-1 on mTOR signal induced by galectin-1. FIG. 5 (A) shows that the mouse embryonic stem cells were treated with galectin-1 (10 ng / ml) for various time periods (0 to 240 minutes) and measured the phosphorylation of mTOR, p70S6K and 4EBP1 by Western blotting. Indicates. Figure 5 (B) cells were treated with LY 294002 (PI3K inhibitor, 10 -6 M) or Akt inhibitor (10 -5 M) for 30 minutes before incubation with galectin-1, the degree of phosphorylation of mTOR by Western blot method Indicates that was measured. Figure 5 (C) cells were pretreated with PP2 (Src inhibitor, 5 ㅧ 10 -6 M) for 30 minutes before 24 hours galectin-1 treatment, indicating that the degree of phosphorylation of mTOR was measured by Western blot method. Cells were pretreated with Mβ-CD for 1 hour before galectin-1 treatment, and the degree of phosphorylation of Akt was measured by Western blotting. FIG. 5 (E) shows that cells were transfected with SMARTpool or control siRNA of carveolin-1 siRNA for 36 hours prior to 24 hours of galectin-1 treatment and the phosphorylation of mTOR was measured by Western blot. Each sample represents three independent experiments. The graph shows the mean W SEM of three experiments for each condition determined by the density meter in proportion to β-actin. *, P <0.05 vs. Control group; **, P <0.05 vs. Galectin-1 alone.

도 6은 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 주기 조절에 대한 Akt와 mTOR의 연관성을 나타낸 것이다. 도 6(A)는 마우스 배아 줄기세포가 24시간의 갈렉틴-1(10ng/ml) 처리에 앞서 Akt 저해제 (10-5 M)와 라파마이신(mTOR 저해제, 10-9 M)으로 전처리를 하였음을 나타낸다. 웨스턴 블럿법에 의해 사이클린 D1, 사이클린 E와 p27kip1의 정도를 측정하였다. 각 표본은 3회의 독립적인 실험을 대표한다. 그래프는 β-액틴에 비례하여 밀도계로 정한 각 조건에 대한 3회에 걸친 실험의 평균ㅁS.E.M.을 나타낸다. 도 6(B, C)는 24시간의 갈렉틴-1 처리에 앞서 Akt 저해제와 라파마이신을 전처리한 마우스 배아 줄기세포의 대표적인 FACS 데이터와 상응하는 막대그래프이다. 세포는 PBS로 세척 후 고정하였으며 염색 후 유세포 분석기로 분석하였다. 전체 DNA 함량 대비 S기에 있는 세포 수의 비율을 확인하기 위해 게이트는 수동으로 정렬(configured manually)하였다. *, P<0.05 vs. 대조군; **, P<0.05 vs. 갈렉틴-1 단독.Figure 6 shows the association of Akt and mTOR on cell cycle regulation induced by galectin-1. FIG. 6 (A) shows that mouse embryonic stem cells were pretreated with an Akt inhibitor (10 -5 M) and rapamycin (mTOR inhibitor, 10 -9 M) prior to 24 hours of galectin-1 (10 ng / ml) treatment. Indicates. The degree of cyclin D1, cyclin E, and p27 kip1 was measured by the Western blot method. Each sample represents three independent experiments. The graph shows the mean W SEM of three experiments for each condition defined by the density meter in proportion to β-actin. 6 (B, C) are histograms corresponding to representative FACS data of mouse embryonic stem cells pretreated with Akt inhibitor and rapamycin prior to 24 hours galectin-1 treatment. Cells were fixed after washing with PBS and analyzed by flow cytometry after staining. Gates were configured manually to determine the ratio of cell numbers in S phase to total DNA content. *, P <0.05 vs. Control group; **, P <0.05 vs. Galectin-1 alone.

도 7은 갈렉틴-1에 의해 유발된 세포 증식에 관련된 신호 경로의 가설적 모형을 나타낸 것이다. 갈렉틴-1은 활성화된 사르코마(Src)에 의해 유발된 카베올린-1을 활성화한다. 또한 갈렉틴-1에 의해 활성화된 카베올린-1은 Akt를 자극하여 mTOR 활성을 유도시킨다. 즉, 활성화된 mTOR이 세포 증식을 조절한다. Gal- 1, 갈렉틴-1; Gal-1 R, 갈렉틴-1 수용체; cav-1, 카베올린-1; mTOR, 라파마이신의 포유류 타겟. 실선은 제안된 경로를 나타낸다. 7 shows a hypothetical model of signal pathways involved in cell proliferation induced by galectin-1. Galectin-1 activates carveolin-1 induced by activated sarcoma (Src). Cabolin-1 activated by galectin-1 also stimulates Akt to induce mTOR activity. That is, activated mTOR regulates cell proliferation. Gal-1, galectin-1; Gal-1 R, galectin-1 receptor; cav-1, carveolin-1; mTOR, mammalian target of rapamycin. The solid line represents the proposed route.

Claims (5)

갈렉틴-1의 원형질막 밖의 농도를 증가시키면 상기 증가된 갈렉틴-1이 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제(Akt)를 활성화시켜 라파마이신의 포유류 타겟(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 방법. Increasing the concentration outside the plasma membrane of galectin-1 promotes phosphorylation of sarcoma (Src) and carveolin-1 by increasing the concentration of galectin-1, and phosphorylated carveolin-1 activates protein kinase (Akt) A method of promoting the proliferation of mouse embryonic stem cells by inducing phosphorylation of a mammalian target of rapamycin (mTOR). 제 1항에 있어서, 상기 갈렉틴-1은 갈렉틴-1 수용체의 매개를 통해 원형질막(plasma membrane) 내의 사르코마 및 카베올린-1의 인산화를 증진시킴을 특징으로 하는 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 방법. The method of claim 1, wherein the galectin-1 promotes the growth of mouse embryonic stem cells, characterized in that by the mediation of the galectin-1 receptor promotes phosphorylation of sarcoma and kaveolin-1 in the plasma membrane How to promote. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사르코마는 단백질 포스파타제 (PP2)에 의해 저해되고, 상기 카베올린-1은 메틸-β-시클로덱스트린(Mβ-CD)에 의해 저해됨을 특징으로 하는 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시키는 방법. The mouse embryonic stem according to claim 1 or 2, wherein the sarcoma is inhibited by protein phosphatase (PP2) and the carveolin-1 is inhibited by methyl-β-cyclodextrin (Mβ-CD). How to promote cell proliferation. 갈렉틴-1을 유효성분으로 포함하는 마우스 배아 줄기세포 증식용 배지에 있어서, 상기 갈렉틴-1은 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키고, 인산 화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포 내의 DNA 합성을 증진시킴을 특징으로 하는 마우스 배아 줄기세포 증식용 배지.In the mouse embryonic stem cell proliferation medium containing galectin-1 as an active ingredient, the galectin-1 enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and caveolin-1, and phosphorylated caveolin-1 is a protein A medium for mouse embryonic stem cell proliferation characterized by activating kinase B (Akt) to induce phosphorylation of mammalian rapamycin target protein (mTOR) to promote DNA synthesis in mouse embryonic stem cells. 사르코마(Src) 및 카베올린-1의 인산화를 증진시키는 갈렉틴-1에 있어서, 상기 인산화된 카베올린-1은 단백질 키나제 B(Akt)를 활성화시켜 포유류 라파마이신 타겟 단백질(mTOR)의 인산화를 유발함으로써 마우스 배아 줄기세포의 증식을 증진시킴을 특징으로 하는 갈렉틴-1.In galectin-1, which enhances phosphorylation of sarcoma (Src) and carveolin-1, the phosphorylated carveolin-1 activates protein kinase B (Akt) to inhibit phosphorylation of mammalian rapamycin target protein (mTOR). Galectin-1 characterized by promoting the proliferation of mouse embryonic stem cells.
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