KR20100122491A - 세포주 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

세포주 및 이의 제조 및 사용 방법

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KR20100122491A
KR20100122491A KR1020107019284A KR20107019284A KR20100122491A KR 20100122491 A KR20100122491 A KR 20100122491A KR 1020107019284 A KR1020107019284 A KR 1020107019284A KR 20107019284 A KR20107019284 A KR 20107019284A KR 20100122491 A KR20100122491 A KR 20100122491A
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cells
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KR1020107019284A
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캄비즈 쉐크다르
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크로모셀 코포레이션
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Abstract

본 발명은 신규한 세포 및 세포주, 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

세포주 및 이의 제조 및 사용 방법{CELL LINES AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM}
본 발명은 신규 세포 및 세포주와 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
현재, 제약 회사의 신약 개발 프로그램의 산업 평균 실패율은 약 98%인 것으로 보고되고 있다. 이것은 공정의 모든 단계에 있어서의 실패율을 포함하긴 하지만, 높은 실패율은 공정의 효율에 있어서의 임의의 개선에 대한 절실한 필요성을 지적하고 있다.
높은 실패율의 원인이 되는 1 가지 요인은 신약 개발 과정에서 세포 기반 기능성 분석에 사용되는 치료 표적을 발현하는 세포주의 부족이다. 세포 기반 분석을 이용한 연구, 특히 신약 개발 연구가 세포 기반 분석에 사용되는 세포 및 세포주로부터 이익을 얻을 것이라는 것은 분명하다.
따라서, 새로운 개선된 약물을 보다 신속하게 개발하기 위해, 세포 기반 분석을 신속하고 효과적으로 확립해야 할 필요성이 크다. 바람직하게는, 보다 효과적인 신약 개발을 위해서는, 분석 시스템이 생체내에서의 조절인자 효과에 대한 생리학적으로 보다 적절한 예측변수를 제공해야 한다.
세포 기반 분석에 대한 필요성 이상으로, 단백질 생산, 세포 기반 치료 및 다양한 다른 용도를 위해 개선된 세포가 요구되고 있다.
따라서, 목적하는 기능성 단백질 또는 RNA를 발현하는 세포 및 세포주가 시급히 요구되고 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 목적하는 이종이량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된, 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 목적하는 이종이량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하고, 이때 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된, 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하고, 이때 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질의 제2 서브유닛을 코딩하는 핵산은 내생성이다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질의 제2 서브유닛을 코딩하는 핵산이 도입된다. 또 다른 구체예에서, 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질은 이온 통로, G 단백질 결합 수용체(GPCR), 타이로신 수용체 키나제, 사이토카인 수용체, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질은 단맛 수용체 및 감칠맛 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질은 공지된 리간드를 갖고 있지 않다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질은 동일 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 상기 세포는, 추가로, 시간 경과에 따라 안정한 1보다 큰 신호 대 노이즈 비, 발현 상실이 없는 선택적 압력 부재 하에서의 증식, 생리적 EC50 값 및 생리적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가적인 원하는 특성을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종이량체 단백질은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상 및 9개월 이상 중에서 선택되는 기간 동안 일관적이며 재생가능하게 임의의 형태로 생산된다. 일부 구체예에서, 상기 기능성 분석은 세포 기반 분석, 형광 세포 기반 분석, 고속 스크리닝 분석(high throughput screening assay), 리포터 세포 기반 분석, G 단백질 매개 세포 기반 분석 및 칼슘 흐름 세포 기반 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 세포 기반 고속 스크리닝에 이용하기에 적합하다.
일부 구체예에서, 상기 선택적 압력은 항생제이다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일 또는 150일 동안 선택적 압력 부재 하에 이종이량체 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 3 이상의 서브유닛을 포함하고, 1 이상의 서브유닛은 도입 핵산에 의해 코딩되는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 목적하는 이종다량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 3 이상의 서브유닛을 포함하는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하고, 목적하는 이종다량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 목적하는 이종다량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관되고 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 3 이상의 서브유닛을 포함하고, 1 이상의 서브유닛은 도입 핵산에 의해 코딩되는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 3 이상의 서브유닛을 포함하는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하고, 목적하는 이종다량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상은 내생성이다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 핵산이 도입된다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질은 이온 통로, G 단백질 결합 수용체(GPCR), 타이로신 수용체 키나제, 사이토카인 수용체, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질은 GABA, ENaC 및 NaV로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질은 공지된 리간드를 갖고 있지 않다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질은 동일 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 상기 세포는, 추가로, 시간 경과에 따라 안정한 1보다 큰 신호 대 노이즈 비, 발현 상실이 없는 선택적 압력 부재 하에서의 증식, 생리적 EC50 값 및 생리적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가적인 원하는 특성을 갖는 것을 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 이종다량체 단백질은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상 및 9개월 이상 중에서 선택되는 기간 동안 일관되게 재현 가능하게 임의의 형태로 생산된다.
일부 구체예에서, 상기 기능성 분석은 세포 기반 분석, 형광 세포 기반 분석, 고속 스크리닝 분석, 리포터 세포 기반 분석, G 단백질 매개 세포 기반 분석 및 칼슘 흐름 세포 기반 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 이종다량체 단백질을 발현하는 세포는 세포 기반 고속 스크리닝에 이용하기에 적합하다.
일부 구체예에서, 상기 이종다량체 단백질을 발현하는 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양된다. 일부 구체예에서, 상기 선택적 압력은 항생제이다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일 또는 150일 동안 선택적 압력 부재 하에 이종다량체 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 목적하는 이종다량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관되고 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하고, 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 목적하는 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관되고 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하고, 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 2 이상의 목적하는 단백질 중 1 이상은 이량체 단백질이다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 이량체 단백질은 동종이량체 단백질이다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 이량체 단백질은 이종이량체 단백질이다. 일부 구체예에서, 상기 2 이상의 목적하는 단백질 중 1 이상은 다량체 단백질이다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 다량체 단백질은 동종다량체 단백질이다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 다량체 단백질은 이종다량체 단백질이다.
일부 구체예에서, 상기 2 이상의 목적하는 단백질 중 1종은 내생성 핵산에 의해 코딩된다. 다른 구체예에서, 상기 2 이상의 목적하는 단백질 중 1종은 도입 핵산에 의해 코딩된다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 상기 2 이상의 목적하는 단백질 중 1종은 이온 통로, G 단백질 결합 수용체(GPCR), 타이로신 수용체 키나제, 사이토카인 수용체, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 단백질 중 1종은 공지된 리간드를 갖고 있지 않다.
일부 구체예에서, 상기 2 이상의 목적하는 단백질 중 1종은 동일 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 2 이상의 단백질을 발현하는 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 상기 2 이상의 단백질을 발현하는 세포는, 추가로, 시간 경과에 따라 안정한 1보다 큰 신호 대 노이즈 비, 발현 상실이 없는 선택적 압력 부재 하에서의 증식, 생리적 EC50 값 및 생리적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가적인 원하는 특성을 갖는 것을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 2 이상의 단백질은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상 및 9개월 이상 중에서 선택되는 기간 동안 일관되게 재생가능하게 임의의 형태로 생산된다.
일부 구체예에서, 상기 기능성 분석은 세포 기반 분석, 형광 세포 기반 분석, 고속 스크리닝 분석, 리포터 세포 기반 분석, G 단백질 매개 세포 기반 분석 및 칼슘 흐름 세포 기반 분석으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 2 이상의 단백질을 발현하는 세포는 세포 기반 고속 스크리닝에 이용하기에 적합하다.
일부 구체예에서, 상기 2 이상의 단백질을 발현하는 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양된다. 일부 구체예에서, 상기 선택적 압력은 항생제이다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 적어도 15일, 30일, 45일, 60일, 75일, 100일, 120일 또는 150일 동안 선택적 압력 부재 하에 상기 2 이상의 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 도입 핵산에 의해 코딩되는 1 이상의 목적하는 RNA를 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 1 이상의 목적하는 RNA를 생산하며, 이때 상기 목적하는 RNA는 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 RNA는 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관되고 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 1 이상의 목적하는 RNA를 발현하고, 1 이상의 목적하는 RNA를 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화하도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기에 적합한 형태로 1 이상의 목적하는 RNA를 생산하며, 이때 상기 목적하는 RNA는 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 RNA는 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관되고 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 2 이상의 목적하는 RNA를 발현한다. 다른 구체예에서, 상기 세포는 3 이상의 목적하는 RNA를 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 도입 핵산에 의해 코딩된 RNA를 추가로 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 RNA는 이온 통로를 코딩하는 RNA, G 단백질 결합 수용체(GPCR)를 코딩하는 RNA, 타이로신 수용체 키나제를 코딩하는 RNA, 사이토카인 수용체를 코딩하는 RNA, 스테로이드 호르몬 핵 수용체를 코딩하는 RNA 및 면역학적 수용체를 코딩하는 RNA로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 RNA는 동일 유형의 세포에서 발현되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 RNA를 발현하는 세포는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 RNA를 발현하는 세포는, 추가로, 시간 경과에 따라 안정한 1보다 큰 신호 대 노이즈 비, 발현 상실이 없는 선택적 압력 부재 하에서의 증식, 생리적 EC50 값 및 생리적 IC50 값으로 구성된 군에서 선택되는 추가적인 원하는 특성을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 RNA는 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상 및 9개월 이상 중에서 선택되는 기간 동안 일관적이며 재생가능하게 임의의 형태로 생산된다.
일부 구체예에서, 상기 기능성 분석은 세포 기반 분석, 형광 세포 기반 분석, 고속 스크리닝 분석, 리포터 세포 기반 분석, G 단백질 매개 세포 기반 분석 및 칼슘 흐름 세포 기반 분석으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 목적하는 RNA를 발현하는 세포는 세포 기반 고속 스크리닝에 이용하기에 적합하다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포로부터 제조된 세포주를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 시간 경과에 따라 일관된 1 이상의 원하는 특성을 갖는, 목적하는 단백질을 발현하는 세포의 제조 방법으로서,
a) 목적하는 단백질을 코딩하는 mRNA를 발현하는 다수의 세포를 제공하는 단계;
b) 개개의 배양 용기에 개별적으로 세포를 분산시켜 다수의 개별 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 배양 조건이 각각의 개별 세포 배양물에 대해 실질적으로 동일하고, 배양 동안 개별 세포 배양물 당 세포 수를 정규화시키며, 개별 배양물들은 동일 스케쥴로 계대되는 것을 특징으로 하는 자동화 세포 배양법을 사용하여 원하는 배양 조건 세트 하에서 상기 세포를 배양하는 단계;
d) 목적하는 단백질의 1 이상의 원하는 특징에 대해 상기 개별 세포 배양물을 2회 이상 분석하는 단계; 및
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 개별 세포 배양물을 동정하는 단계
를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법의 단계 a)의 다수의 세포를 단계 b)에서의 분산 전에 일정 기간 동안 배양한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 개개의 배양 용기는 멀티웰 플레이트의 개개의 웰 및 바이알로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 다수의 개별 세포 배양물의 증식 속도를 측정하는 단계 및 임의의 그룹에서의 최고 증식 속도와 최저 증식 속도 간의 차이가 단계 b)와 단계 c) 사이에 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간 또는 5 시간 이하가 되도록 상기 개별 세포 배양물을 그 증식 속도에 따라 그룹으로 그룹핑하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 개별 배양물 중 1 이상의 저장물을 제조하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 개별 세포 배양물의 1 이상의 중복 세트를 제조하는 단계 및 공급원 개별 세포 배양물로부터 독립적으로 1 이상의 중복 세트를 배양하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명 방법의 단계 d)에서의 분석은 단백질에 대한 기능성 분석이다.
일부 구체예에서, 단계 e)에서 일정하게 유지되는 1 이상의 특징은 단백질 기능이다.
일부 구체예에서, 본 발명 방법의 단계 c)에서의 배양은 로봇 세포 배양 장치에서 수행한다. 일부 구체예에서, 상기 로봇 세포 배양 장치는 다채널 로봇 피펫터를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 다채널 로봇 피펫터는 96개 이상의 채널을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 로봇 세포 배양 장치는 체리 피킹 암(cherry-picking arm)을 더 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 자동화 방법은 배지 제거, 배지 교환, 세포 세척, 시약 첨가, 세포 제거, 세포 분산 및 세포 계대 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 다수의 개별 세포 배양물은 50개 이상의 배양물이다. 다른 구체예에서, 다수의 개별 세포 배양물은 100개 이상의 배양물이다. 다른 구체예에서, 다수의 개별 세포 배양물은 500개 이상의 배양물이다. 또 다른 구체예에서, 다수의 개별 세포 배양물은 1000개 이상의 배양물이다.
일부 구체예에서, 증식 속도는 ATP의 측정, 세포 포화도(cell confluency)의 측정, 광 산란 측정, 흡광도 측정으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 측정된다. 일부 구체예에서, 그룹 내의 최고 증식 속도와 최저 증식 속도 간의 차이는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 또는 5시간 이하이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서의 배양은 2일 이상 동안 수행한다.
일부 구체예에서, 상기 다수의 개별 세포 배양물의 증식 속도는 세포를 분산시키는 단계 및 세포 포화도를 측정하는 단계에 의해 측정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법의 각각의 개별 세포 배양물 중의 세포는 세포 포화도를 측정하기 전에 분산시킨다. 일부 구체예에서, 상기 분산 단계는 웰에 트립신을 첨가하여 덩어리를 제거하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 다수의 개별 세포 배양물의 세포 포화도는 자동화 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정한다.
일부 구체예에서, 증식 속도를 계산하기 전에 2회 이상의 포화도 측정을 실시한다. 일부 구체예에서, 상기 세포 포화도는 자동화 플레이트 판독기로 측정하며, 포화도 값은 증식 속도를 계산하는 소프트웨어 프로그램에 이용한다.
일부 구체예에서, 단계 d)의 개별 세포 배양물의 분석은 취약성(fragility), 형태(morphology), 고체 표면에 대한 부착성, 고체 표면에 대한 부착성 결여 및 단백질 기능 중 하나 이상으로부터 선택되는 원하는 특성에 대한 특징 규명이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 진핵생물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 포유동물 세포주는 NS0 세포, CHO 세포, COS 세포, HEK-293 세포, HUVEC, 3T3 세포 및 HeLa 세포로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에서 발현되는 목적하는 단백질은 인간 단백질이다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 단백질은 이종다량체이다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 단백질은 G 단백질 결합 수용체이다. 다른 구체예에서, 상기 단백질은 공지된 리간드를 갖고 있지 않다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은, 상기 동정 단계 후,
a) 원하는 배양 조건 하에 단계 e)에서 동정된 세포 배양물의 저장 분액을 증폭시키는 단계;
b) a)의 증폭된 세포 배양물이 원하는 특징을 갖는지를 확인하는 단계
를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 클론 세포주의 매칭된(matched) 패널을 제공하며, 이때 상기 클론 세포주는 세포 유형이 동일한 것이고, 상기 패널 내의 각각의 세포주는 목적하는 단백질을 발현하며, 상기 패널 내의 클론 세포주는 대등한 프로세싱(parallel processing)이 가능하게 동일한 생리적 특성을 공유하도록 매칭된다. 일부 구체예에서, 상기 생리적 특성은 증식 속도이다. 다른 구체예에서, 상기 생리적 특성은 조직 배양 표면에 대한 부착성이다. 다른 구체예에서, 상기 생리적 특성은 Z' 계수이다. 다른 구체예에서, 상기 생리적 특성은 목적하는 단백질을 코딩하는 RNA의 발현 수준이다. 또 다른 구체예에서, 상기 생리적 특성은 목적하는 단백질의 발현 수준이다.
일부 구체예에서, 상기 패널 내의 클론 세포주의 증식 속도는 서로 간에 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 또는 5시간 이내이다. 다른 구체예에서, 상기 매칭된 패널에 사용되는 배양 조건은 패널 내의 모든 클론 세포주에 대해 동일하다.
일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에 사용되는 클론 세포주는 진핵생물 세포주이다. 일부 구체예에서, 상기 진핵생물 세포주는 포유동물 세포주이다. 일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에 사용되는 세포주 세포는 1차 세포 및 불멸화 세포로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에 사용되는 세포주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에 사용되는 세포주 세포는 진핵생물 세포이고, 진균류 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 효모 세포, 조류(algae) 세포, 갑각류 세포, 절지동물 세포, 조류(avian) 세포, 파충류 세포, 양서류 세포 및 식물 세포로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에 사용되는 세포주 세포는 포유동물 세포이고, 인간, 인간이 아닌 영장류, 소, 돼지, 고양이, 랫트, 유대류, 쥐과동물, 개과동물, 양, 염소, 토끼, 기니 피그, 햄스터로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널의 세포주의 세포는 목적하는 단백질을 발현하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널의 세포주의 세포는 목적하는 단백질을 코딩하거나, 또는 다량체 단백질의 경우 그 단백질의 서브유닛을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 단백질을 발현한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 내생성 핵산으로부터 목적하는 단백질을 발현하며, 이때 상기 세포는 상기 내생성 단백질의 전사를 활성화하거나, 또는 다량체 단백질의 경우, 그 단백질의 서브유닛의 전사를 활성화하도록 조작된다.
일부 구체예에서, 상기 패널은 4개 이상의 클론 세포주를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 패널은 6개 이상의 클론 세포주를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 패널은 25개 이상의 클론 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 패널 내의 클론 세포주 중 2개 이상은 동일한 목적하는 단백질을 발현한다. 다른 구체예에서, 상기 패널 내의 클론 세포주 중 2개 이상은 상이한 목적하는 단백질을 발현한다.
일부 구체예에서, 상기 패널 내의 세포주는 상이한 형태의 목적하는 단백질을 발현하며, 이때 상기 형태는 동형체, 아미노산 서열 변이체, 스플라이스 변이체, 절단 형태, 융합 단백질, 키메라 또는 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다
일부 구체예에서, 상기 패널 내의 세포주는 목적하는 단백질 그룹의 상이한 단백질을 발현하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 동일한 신호전달 경로, 유사한 단백질의 발현 라이브러리, 단일클론 항체 중쇄 라이브러리, 단일클론 항체 경쇄 라이브러리 및 SNP로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 패널에서 발현되는 목적하는 단백질은 단일쇄 단백질이다. 일부 구체예에서, 상기 단일쇄 단백질은 G 단백질 결합 수용체이다. 일부 구체예에서, 상기 G 단백질 결합 수용체는 미각 수용체이다. 일부 구체예에서, 상기 미각 수용체는 쓴맛 미각 수용체, 단맛 수용체, 짠맛 수용체 및 감칠맛 수용체로 구성된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 상기 패널에서 발현되는 목적하는 단백질은 다량체 단백질이다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 이종이량체 또는 이종다량체이다.
일부 구체예에서, 상기 패널에서 발현되는 목적하는 단백질은 이온 통로, 이온 통로, G 단백질 결합 수용체(GPCR), 타이로신 수용체 키나제, 사이토카인 수용체, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 및 면역학적 수용체로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에서 발현되는 단백질은 상피세포 나트륨 통로(ENaC)이다. 일부 구체예에서, 상기 ENaC는 알파 서브유닛, 베타 서브유닛 및 감마 서브유닛을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 패널 내의 세포주는 상이한 ENaC 동형체를 발현한다. 다른 구체예에서, 상기 패널 내의 세포주는 ENaC의 단백질 분해된 상이한 동형체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 ENaC는 인간 ENaC이다. 일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에서 발현되는 단백질은 전압 개폐 나트륨 통로(NaV)이다. 일부 구체예에서, 상기 NaV는 알파 서브유닛 및 2개의 베타 서브유닛을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 NaV는 인간 NaV이다.
일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널에서 발현되는 단백질은 감마-아미노부티르산 A 수용체(GABAA 수용체), 감마-아미노부티르산 B 수용체(GABAB 수용체) 및 감마-아미노부티르산 C 수용체(GABAC 수용체)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 GABAA 수용체이다. 일부 구체예에서, 상기 GABAA 수용체는 2개의 알파 서브유닛, 2개의 베타 서브유닛 및 감마 또는 델타 서브유닛을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 패널 내의 클론 세포주는 동시에, 또는 서로 간에 4주 이하 내에 제조된다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 단량체 단백질을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 단량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 생물학적 활성 상태가 될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하고, 이때 상기 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되고, 상기 단백질의 발현율은 3개월 동안 5%가 넘게 변화되지 않는 것을 특징으로 하는 것인 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 단백질의 발현율은 6개월 동안 5%가 넘게 변화되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 목적하는 단량체 단백질은 공지된 리간드를 갖고 있지 않다.
일부 구체예에서, 본 발명은, 목적하는 단백질의 조절인자를 동정하는 방법으로서,
a) 상기에 기재된 세포 구체예 중 어느 하나에 따른 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
b) 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포에서의 목적하는 단백질의 활성과 비교하여 시험 화합물과 접촉한 세포에서의 목적하는 단백질의 활성 변화를 검출하는 단계
를 포함하며, 부재시와 비교하여 존재시 활성 변화를 일으키는 화합물이 목적하는 단백질의 조절인자인 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 선행 단락의 방법에 의해 동정된 조절인자를 제공한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 재료를 이하에 기재하였으나, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 상충이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서의 내용은 조절될 것이다.
본원에서 인용된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본원에서 다수의 문헌이 인용되었지만, 그 인용이, 이러한 문헌 중 어느 것이 당업계의 공통된 일반적 지식의 일부를 형성한다는 것을 용인하는 것은 아니다.
본 명세서 및 특허청구범위 전반에 있어서, "포함한다"라는 어구, 또는 "포함하고" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 완전체 또는 완전체의 그룹을 포함하는 것을 의미하나, 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 그룹을 배제하는 것을 의미하지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수 용어를 포함하며, 복수 용어는 단수 용어를 포함한다. 재료, 방법 및 예는 단지 예시를 위한 것으로 한정적임을 의도한 것이 아니다.
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 먼저 특정 용어들을 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 개시된다.
"안정한" 또는 "안정하게 발현하는"이란 용어는, 당업자가 "안정한 발현"과 "일시적 발현"이라는 용어를 이해하고 있기 때문에, 단백질을 일시적으로 발현하는 세포로부터 본 발명의 세포 및 세포주를 구별하기 위한 의미로 사용된다.
본원에서 사용될 때, 목적하는 "기능성" RNA 또는 단백질은 세포 기반 분석에서 신호 대 노이즈의 비가 1:1보다 큰 것이다. 일부 구체예에서, 목적하는 기능성 단백질 또는 RNA는 자연 발생 또는 내생적으로 발현되는 단백질 또는 RNA의 생물학적 활성 중 하나 이상을 갖는다.
"세포주" 또는 "클론 세포주"란 용어는 단일 기원 세포의 자손인 세포의 집단을 의미한다. 본원에서 사용될 때, 세포주는 시험관내에서 세포 배양물 중에 유지되며, 클론 세포 은행을 수립하기 위해 분액으로 동결될 수 있다.
"엄격한 조건" 또는 "엄격한 하이브리드화 조건"이란 용어는 핵산 샘플에 1 이상의 핵산 프로브를 하이브리드화하고 샘플 중의 표적 핵산에 특이적으로 결합하지 않은 프로브를 세척하기 위한 온도 및 염 조건을 말한다. 엄격한 조건은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]으로부터 참조할 수 있다. 수성 방법 및 비수성 방법이 상기 문헌의 프로토콜에 기재되어 있으며, 어느 것이나 이용될 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 일례는 약 45℃, 6× SSC 중에서의 하이브리드화에 이어, 60℃, 0.2× SSC, 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 하이브리드화 조건의 또 다른 예는 약 45℃, 6× SSC에서의 하이브리드화에 이어, 65℃, 0.2× SSC, 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척이다. 엄격한 하이브리드화 조건은 또한 65℃, 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS에서의 하이브리드화에 이어, 65℃, 0.2× SSC, 1% SDS에서의 1회 이상의 세척을 포함한다.
아미노산 및/또는 핵산 서열과 관련하여 "동일성 퍼센트" 또는 "동일성(%)"이란 어구는 2개 이상의 상이한 서열 간의 유사성을 의미한다. 동일성(%)은, 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, 문헌[Altshul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410]에 기재된 BLAST(Basic Local Alignment Tool); 문헌[Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol., 48:444-453]의 알고리즘; 또는 문헌[Meyers et al., (1988) Comput. Appl. Biosci., 4:11-17]의 알고리즘에 의해 측정할 수 있다. 파라미터 세트는 갭 패널티 12, 갭 연장 페널티 4 및 프레임쉬프트 갭 패널티 5를 갖는 Blosum 62 측정 행렬일 수 있다. 2개 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 간의 동일성(%)은 또한, PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)으로 도입된, 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS, 4:11-17]의 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다. 동일성(%)은 일반적으로 유사한 길이의 서열을 비교함으로써 계산한다.
단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 비롯한 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 배정된 유사성 척도를 이용하여 유사한 아미노산 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG 위스콘신 패키지(Accelrys, Inc.)는 상이한 종 유래의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩티드 사이, 또는 야생형 단백질과 그 뮤테인 사이의 서열 동일성을 측정하기 위한 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 "갭(Gap)" 및 "베스트피트(Bestfit)"와 같은 프로그램을 포함한다(예를 들어, GCG 버전 6.1 참조). 폴리펩티드 서열 역시 디폴트 또는 권장 파라미터를 이용하는 FASTA를 이용하여 비교할 수 있다. GCG 버전 6.1. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)의 프로그램은 질의 서열과 검색 서열 사이의 최대 중복 영역의 정렬 및 서열 동일성(%)을 제공한다[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)].
동일성에 대해 비교되는 폴리펩티드 서열의 길이는 일반적으로 약 16개 아미노산 잔기 이상, 통상적으로 약 20개 잔기 이상, 더 통상적으로 약 24개 잔기 이상, 전형적으로 약 28개 잔기 이상, 바람직하게는 약 35개 잔기 초과이다. 동일성에 대해 비교되는 DNA 서열의 길이는 일반적으로 약 48개 핵산 잔기 이상, 통상적으로 약 60개 핵산 잔기 이상, 더 통상적으로 약 72개 핵산 잔기 이상, 전형적으로 약 84개 핵산 잔기 이상, 바람직하게는 약 105개 핵산 잔기 초과이다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "실질적으로 기재된 바와 같은", "실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 상동성인"이란 어구는, 관련 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 비교 서열과 비교하여 동일하거나 작은 차이(예를 들어, 보존된 아미노산 치환 또는 이러한 치환을 코딩하는 핵산)를 갖는다는 것을 의미한다. 작은 차이는 특정 영역의 50개 아미노산 서열 및 그러한 서열을 코딩하는 핵산에 있어서의 1개 또는 2개 치환과 같은 미미한 아미노산 변경을 포함한다.
조절인자는 목적하는 단백질의 활성을 변경하는 임의의 물질 또는 화합물을 포함한다. 조절인자는 부분 작동제 또는 길항제, 선택적 작동제 또는 길항제 및 역 작동제를 비롯한 작동제(증강제 또는 활성제) 또는 길항제(억제제 또는 차단제)일 수 있으며, 또한 알로스테릭 조절인자일 수 있다. 물질 또는 화합물은, 그 조절 활성이 상이한 조건 또는 농도에서 또는 상이한 형태의 목적하는 단백질에 대해 달라진다 하더라도 조절인자이다. 다른 측면에서, 조절인자는 목적하는 단백질의 기능에 영향을 주는 다른 조절인자의 능력을 변화시킬 수 있다.
"증강제", "작동제" 또는 "활성제"란 용어는 목적하는 단백질의 1 이상의 활성을 증가시키는 화합물 또는 물질을 의미한다.
"억제제", "길항제" 또는 "차단제"란 용어는 목적하는 단백질의 1 이상의 활성을 감소 또는 차단하는 화합물 또는 물질을 의미한다.
본 발명은, 리간드가 알려져 있지 않은 단백질 및 이종다량체 단백질과 같은 복합 단백질을 포함하여 목적하는 기능성 RNA 또는 목적하는 기능성 단백질을 안정하게 발현하는 세포에 대한 시급한 요구를 충족시키는 신규 세포 및 이 세포로부터 제조된 세포주를 최초로 제공한다. 본 발명의 세포 및 세포주는 목적하는 RNA 또는 단백질의 일관된 기능적 발현이 바람직한 임의의 용도에 적합하다. 본 출원인은 막 단백질, 세포질 단백질 및 분비 단백질을 포함한 단일 서브유닛 단백질 및 헤테로다량체 단백질(이종이량체 단백질 및 2종보다 많은 상이한 서브유닛을 갖는 단백질을 포함함) 양자뿐만 아니라 이들의 다양한 조합을 비롯한 다양한 단백질에 대해 상기 설명을 충족시키는 세포주를 제조하였다.
일 측면에서, 본 발명의 세포 및 세포주는 세포 기반 분석에 사용하기에 적합하다. 이러한 세포 및 세포주는 시간 경과에 따라 목적하는 단백질을 일관적이며 재생가능하게 발현하기 때문에, 이같은 분석에 특히 유익하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 분자의 생산에 적합한 세포 및 세포주를 제공한다. 이같은 용도를 위한 세포 및 세포주는, 예를 들어, 기능성이거나 기능성이 될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 일관된 발현을 특징으로 한다.
본 발명은 목적하는 RNA 또는 단백질을 안정하게 발현하는 세포 및 세포주를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 다량체 단백질(예를 들어, 이종다량체 단백질) 및 세포 독성 단백질과 같은 복합 단백질을 비롯한 기능성 형태의 임의의 원하는 단백질을 발현하는 세포 및 세포주를 제조할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 본 발명 이전에는 종래에 제조되지 않았던 기능성 단백질을 안정하게 발현하는 조작된 세포 및 세포주의 제조를 가능하게 한다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 이 방법에 의하면 임의의 원하는 조건 세트 하에 수많은 세포 또는 세포주를 조사할 수 있기 때문에, 더 작은 집단으로 제조되지 못했거나 달리 찾아낼 수 없었고, 원하는 조건 하에 기능성 형태로 원하는 단백질을 발현하도록 최적화된 희소 세포를 동정하는 것이 가능해진다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 세포주의 매칭된 패널, 즉, 1 이상의 생리적 특성에 대해 매칭된 클론 세포주의 집합체를 제공한다. 본 발명의 방법은 동일한 조건 하에서의 다수의 세포주의 유지 및 특징 규명을 가능하게 하기 때문에, 유사한 생리적 특성을 갖는 많은 수의 세포주를 동정할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하면, 임의의 원하는 수의 세포주 또는 구성을 포함하는 매칭된 패널을 제조할 수 있다. 이같은 매칭된 패널은 세포 밀도를 비롯하여 동일한 조건 하에 유지될 수 있으며, 따라서 고속 스크리닝 및 세포주 간의 차이를 비교 및 확인하는 것이 필요한 다른 용도에 유용하다. 또한, 본 발명의 범위 내에는 증식 속도에 대해 매칭된 세포주의 매칭된 패널도 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종래에 기능이 알려지지 않았고/않았거나 종래에 리간드가 동정된 바 없는 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 단백질은 공지된 천연 단백질, 종래에 알려지지 않은 천연 단백질, 공지된 천연 단백질의 종래에 알려지지 않은 형태 또는 이들 중 어느 것의 변형 형태일 수 있다.
임의의 원하는 세포 유형이 본 발명의 세포에 사용될 수 있다. 상기 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 상기 세포는 목적하는 단백질을 그 본래의 상태로 발현할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 사용될 수 있는 원핵생물 세포로는 효모 세포와 같은 진균류 세포, 식물 세포 및 동물 세포를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 동물 세포로는 포유동물 세포 및 곤충 세포를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 1차 또는 불멸화 세포는 진핵생물 유기체의 중배엽층, 외배엽층 또는 내배엽층으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포는 내피 세포, 상피 세포, 중간엽 세포, 신경 세포, 신세포, 간세포, 조혈 세포 또는 면역 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 장 음와 또는 융모 세포, 클라라 세포, 결장 세포, 장 세포, 배상 세포(goblet cell), 장크롬 친화성 세포, 장내분비 세포일 수 있다. 상기 방법에 유용한 포유동물 세포로는 인간, 인간 이외의 영장류, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 설치류(랫트, 마우스, 햄스터, 기니 피그를 포함함), 유대류, 토끼, 개 및 고양이를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 상기 세포는 배아 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포 또는 분화 세포일 수 있다.
본 발명의 세포는 1차 세포, 형질전환 세포, 암성 변환 세포, 바이러스 형질전환 세포, 불멸화 세포, 조건적 형질전환 세포, 외식편, 조직 절편 세포, 동물, 식물, 진균류, 원생생물, 고세균 및 진정세균, 포유동물, 새(bird), 어류, 파충류, 양서류 및 절지동물, 조류(avian), 닭, 파충류, 양서류, 개구리, 도마뱀, 뱀, 어류, 벌레, 오징어, 바닷가재, 성게, 나새류, 멍게류, 파리, 오징어, 히드라, 절지동물, 딱정벌레, 닭, 칠성장어, 송사리, 금화조, 복어 및 제브라피쉬 세포일 수 있다.
또한, 혈액/면역 세포, 내분비계(갑상선, 부갑상선, 부신) 세포, GI(구강, 위, 장) 세포, 간 세포, 췌장 세포, 담낭 세포, 호흡기(폐, 기관, 인두) 세포, 연골 세포, 뼈 세포, 근육 세포, 피부 세포, 모발 세포, 비뇨기(신장, 방광) 세포, 생식기(정자, 난자, 고환, 자궁, 난소, 음경, 질) 세포, 감각기관(눈, 귀, 코, 입, 혀, 감각 뉴런) 세포, 혈액/면역 세포, 예컨대 B 세포, T 세포(세포 독성 T 세포, 자연 킬러 T 세포, 조절성 T 세포, T 헬퍼 세포, T 세포, 자연 킬러 세포); 과립구(호염성 과립구, 호산성(eosinophil) 과립구, 호중성 과립구/과분엽 호중구), 단핵구/대식 세포, 적혈구(망상 적혈구), 비만 세포, 혈소판/거핵구, 수지상 세포; 내분비계 세포, 예컨대 갑상선 세포(갑상선 상피 세포, 여포방 세포), 부갑상선 세포(부갑상선 주세포, 호산성(oxyphil) 세포), 부신 세포(크롬 친화성 세포), 신경계 세포, 예컨대 신경교 세포(성상 교세포, 소신경교 세포), 대세포성 신경분비 세포, 성상 세포, 핵 사슬 세포, 뵈트처(boettcher) 세포, 뇌하수체 세포(성선 자극 세포, 부신피질 자극 세포, 갑상선 자극 세포, 성장 자극 세포, 프로락틴 분비 세포), 호흡계 세포, 예컨대 폐세포(I형 폐세포, II형 폐세포), 클라라 세포, 배상 세포; 순환계 세포, 예컨대 심근 세포, 혈관 주위 세포; 소화계 세포, 위 세포(위 주세포, 벽세포), 배상 세포, 파네스 세포, G 세포, D 세포, ECL 세포, I 세포, K 세포, 장내분비 세포, 장크롬 친화성 세포, APUD 세포, 간세포(liver cell)[간세포(hepatocyte), 쿠퍼 세포], 췌장 세포(베타 세포, 알파 세포), 담낭 세포; 연골/뼈/근육/피부계 세포, 예컨대 조골세포, 골세포, 파골세포, 치아 세포(시멘트 아세포, 에나멜 아세포), 연골 세포(cartilage cell): 조연골 세포, 연골 세포(chondrocyte), 피부/모발 세포: 트리코사이트, 케라티노사이트, 멜라노사이트, 근육 세포: 근세포, 지방 세포, 섬유아세포, 비뇨계 세포, 예컨대 족세포, 사구체 근접 세포, 사구체내 메산지움 세포/사구체외 메산지움 세포, 신장 근위요세관 솔 가장자리 세포, 치밀반 세포; 생식계 세포, 예컨대 정자, 세르톨리 세포, 라이디히 세포, 난자, 난포 세포; 감각기관 세포, 예컨대 고르티 기관 세포, 후각 상피, 온도 민감성 감각 뉴런, 메르켈 세포, 후각 수용체 뉴런, 통증 민감성 뉴런, 광수용체 세포, 미뢰 세포, 전정 기관의 털 세포, 경동맥 소체 세포는 본 발명의 세포 또는 세포주를 제조하는 데 유용하다.
유용한 식물 세포는 뿌리, 줄기 및 잎을 포함하고, 식물 조직은 분열 조직, 유조직, 후각조직, 후벽조직, 분비조직, 목질부, 체관부, 표피, 주피(수피)를 포함한다.
본 발명의 세포 및 세포주에 유용한 세포로는 또한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 확립된 뉴런 세포주, 크롬 친화성 세포종, 신경아세포종, 섬유아세포, 횡문근육종, 후근 신경절 세포, NS0 세포, CV-1(ATCC CCL 70), COS-1(ATCC CRL 1650), COS-7(ATCC CRL 1651), CHO-K1(ATCC CCL 61), 3T3(ATCC CCL 92), NIH/3T3(ATCC CRL 1658), HeLa(ATCC CCL 2), C127I(ATCC CRL 1616), BS-C-1(ATCC CCL 26), MRC-5(ATCC CCL 171), L-세포, HEK-293(ATCC CRL 1573) 및 PC12(ATCC CRL-1721), HEK293T(ATCC CRL-11268), RBL(ATCC CRL-1378), SH-SY5Y(ATCC CRL-2266), MDCK(ATCC CCL-34), SJ-RH30(ATCC CRL-2061), HepG2(ATCC HB-8065), ND7/23(ECACC 92090903), CHO(ECACC 85050302), Vero(ATCC CCL 81), Caco-2(ATCC HTB 37), K562(ATCC CCL 243), Jurkat(ATCC TIB-152), Per.C6(Crucell, 네덜란드 라이덴 소재), Huvec(ATCC 인간 1차 PCS 100-010, 마우스 CRL 2514, CRL 2515, CRL 2516), HuH-7D12(ECACC 01042712), 293(ATCC CRL 10852), A549(ATCC CCL 185), IMR-90(ATCC CCL 186), MCF-7(ATC HTB-22), U-2 OS(ATCC HTB-96), T84(ATCC CCL 248) 또는 미국 균주 보존 기관(ATCC, 미국 버지니아주 20110-2209 매너사스 유니버시티 불러바드 10801 소재) 또는 유럽 균주 보존 기관(ECACC, 영국 SP4 0JG 샐리스버리 윌트셔 소재) 등의 보존 기관으로부터 입수할 수 있는 임의의 세포주 또는 임의의 확립된 세포주(분극성 또는 비분극성)를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에 유용한 세포는 혈청 함유 배지, 무혈청 배지, 임의의 동물 유래의 산물을 포함하지 않는 완전 규정 배지에서의 증식이 가능한 포유동물 세포 및 상기 조건 중 하나가 다른 것으로 변경될 수 있는 세포이다.
본 발명의 세포는 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산(또는 이종다량체 단백질의 경우, 이 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 핵산)이 도입된 세포를 포함한다. 조작된 세포는 또한 목적하는 단백질을 코딩하는 내생성 서열의 전사 활성화를 위한 핵산(또는 이종다량체 단백질의 1 이상의 서브유닛을 코딩하는 내생성 서열의 전사 활성화를 위한 핵산)이 도입된 세포를 포함한다. 조작된 세포는 또한 활성화 화합물과의 접촉에 의해 활성화되는 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 포함한다. 조작된 세포는, 전술한 것의 조합, 즉 이종다량체 단백질을 코딩하는 도입 핵산으로부터 이 단백질의 1 이상의 서브유닛을 발현하고 유전자 활성화에 의해 이 단백질의 1 이상의 서브유닛을 발현하는 세포를 추가로 포함한다.
공지된 수단을 이용하여 임의의 핵산을 세포로 도입할 수 있다. 핵산을 세포로 도입하는 기법은 주지된 것으로, 당업자가 쉽게 이해할 수 있다. 이 방법은 형질감염, 바이러스 전달, 단백질 또는 펩티드 매개 삽입, 동시침전법, 지질에 기초한 전달제(리포펙틴), 사이토펙션, 리포폴리아민 전달, 덴드리머 전달제, 전기천공 또는 기계적 전달을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 형질감염제의 예로는 GENEPORTER, GENEPORTER2, LIPOFECTAMINE, LIPOFECTAMINE 2000, FUGENE 6, FUGENE HD, TFX-10, TFX-20, TFX-50, OLIGOFECTAMINE, TRANSFAST, TRANSFECTAM, GENESHUTTLE, TROJENE, GENESILENCER, X-TREMEGENE, PERFECTIN, CYTOFECTIN, SIPORT, UNIFECTOR, SIFECTOR, TRANSIT-LT1, TRANSIT-LT2, TRANSIT-EXPRESS, IFECT, RNAI SHUTTLE, METAFECTENE, LYOVEC, LIPOTAXI, GENEERASER, GENEJUICE, CYTOPURE, JETSI, JETPEI, MEGAFECTIN, POLYFECT, TRANSMESSANGER, RNAiFECT, SUPERFECT, EFFECTENE, TF-PEI-KIT, CLONFECTIN 및 METAFECTINE이 있다.
이종다량체 단백질의 2개 이상의 서브유닛을 코딩하는 서열 또는 2종 이상의 상이한 목적하는 단백질을 코딩하는 서열과 같은 2개 이상의 뉴클레오티드 서열이 도입되는 경우, 이 서열은 동일한 벡터 상에, 또는 바람직하게는 별개의 벡터 상에 도입될 수 있다. 이 DNA는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 구체예에서, 목적하는 단백질 또는 목적하는 부분 단백질을 코딩하는 핵산은, 목적하는 단백질이 이 단백질의 생리적 기능과 비교하여 세포의 기능을 변경할 수 있는 추가적인 아미노산을 갖도록 발현되게 하는 추가적인 서열을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 단백질을 코딩하는 핵산과 비교하여 1 이상의 치환, 삽입, 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 돌연변이를 포함하는 핵산을 포함하는 구체예에서, 상기 돌연변이는 무작위 돌연변이 또는 부위 특이적 돌연변이일 수 있다. 이러한 핵산 변경은 아미노산 치환으로 이어질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 일부 구체예에서, 상기 핵산은 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산의 단편이다. 단편이거나 그러한 변형을 갖는 핵산은 목적하는 단백질의 1 이상의 생물학적 특성을 유지하는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명은 또한 그 서열이 목적하는 단백질을 코딩하는 "야생형" 서열과 약 85% 이상 동일한 핵산, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 또는 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 안정하게 발현하는 세포 및 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 서열과 비교할 때 서열 동일성은 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이다. 본 발명은 또한 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산이 엄격한 조건 하에 야생형 서열에 하이브리드화하는 핵산, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 또는 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 발현하는 세포 및 세포주를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 세포 또는 세포주는 야생형 서열과 비교하여 1 이상의 치환을 포함하는 단백질 코딩 핵산 서열, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다. 상기 치환은 10개, 20개, 30개 또는 40개 뉴클레오티드 미만, 또는 뉴클레오티드 서열의 1%, 5%, 10% 또는 20% 또는 그 이하를 차지할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 치환된 서열은 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산과 실질적으로 동일할 수 있거나,(예를 들어, 상기 핵산과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열) 또는 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 또는 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 세포 또는 세포주는 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 또는 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로의 삽입 또는 그로부터의 결실을 포함하는 단백질 코딩 핵산 서열을 포함한다. 상기 삽입 또는 결실은 10개, 20개, 30개 또는 40개 뉴클레오티드 미만, 또는 뉴클레오티드 서열의 1%, 5%, 10% 또는 20% 또는 그 이하일 수 있다. 일부 구체예에서, 삽입 또는 결실 서열은 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 또는 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산과 실질적으로 동일할 수 있거나(예를 들어, 상기 핵산과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열), 또는 야생형 서열, 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 핵산, 또는 이러한 핵산 중 어느 하나와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 핵산 치환 또는 변형은 아미노산 치환과 같은 아미노산 변경으로 이어진다. 예를 들어, 목적하는 야생형 단백질의 아미노산 잔기 또는 인간 이외의 종 유래의 대응 아미노산은 보존적 또는 비보존적 치환에 의해 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 본래의 아미노산 서열과 변형된 아미노산 서열 간의 서열 동일성은 약 1%, 5%, 10% 또는 20%의 차이이거나, 또는 서로 실질적으로 동일한 서열(예를 들어, 서로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열)일 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 모 아미노산 잔기와 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이할 경우, 서열 동일성(%) 또는 유사성 정도는 치환의 보존적 성질에 대해 보정이 되도록 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 행하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)]을 참조할 수 있다.
유사한 화학적 특성을 보유하는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는 다음을 들 수 있다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 다음과 같다: 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민. 대안으로, 보존적 아미노산 치환은 문헌[Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)]에 개시된 PAM250 대수 가능도 행렬(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변경이다. "중간 보존적" 치환은 PAM250 대수 가능도 행렬에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변경이다.
목적하는 단백질에서의 보존적 변형은 기능적 특징과 화학적 특징이 비변형 단백질의 것과 유사한(즉, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한) 단백질을 생산한다.
일 구체예에서, 상기 숙주 세포는, 후에 목적하는 단백질을 생산하는 트랜스제닉 동물의 생성을 위한 초석으로서 이용되는 배아 줄기 세포이다. 목적하는 기능성 단백질을 안정하게 발현하는 배아 줄기 세포는 유기체에 직접 이식될 수도 있고, 또는 그 핵을 다른 수용체 세포로 이전하고, 그 후 이것을 이식하거나, 또는 배아 줄기 세포를 트랜스제닉 동물을 생산하는 데 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 단백질은 원하는 일시적 및/또는 조직 특이적 발현이 이루어지도록 동물에서 발현시킬 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 선택된 숙주 세포에 사용하기에 적합한 임의의 벡터를, 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포로 도입하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어 2 이상의 상이한 서브유닛 또는 2 이상의 목적하는 단백질을 도입하기 위해 1 이상의 벡터가 사용될 경우, 이들 벡터는 동일 유형일 수도 있고 상이한 유형일 수도 있다.
핵산을 숙주 세포로 도입하는 데 사용될 수 있는 벡터의 예로는 플라스미드, 바이러스(레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함함), 코스미드, 인공 염색체를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않으며, 예를 들어, pCMVScript, pcDNA3.1 Hygro, pcDNA3.1neo, pcDNA3.1puro, pSV2neo, pIRESpuro, pSV2zeo를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포 및 세포주를 제조하는 데 유용한 예시적인 포유동물 발현 벡터로는 pFN11A(BIND) Flexi®, pGL4.31, pFC14A(HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFC14K(HaloTag® 7) CMV Flexi®, pFN24A(HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, pFN24K(HaloTag® 7) CMVd3 Flexi®, HaloTagTM, pHT2, pACT, pAdVAntageTM, pALTER®-MAX, pBIND, pCAT®3-Basic, pCAT®3-Control, pCAT®3-Enhancer, pCAT®3-Promoter, pCI, pCMVTNTTM, pG5luc, pSI, pTARGETTM, pTNTTM, pF12A RM Flexi®, pF12K RM Flexi®, pReg neo, pYES2/GS, pAd/CMV/V5-DEST Gateway® Vector, pAd/PL-DESTTM Gateway® Vector, Gateway® pDESTTM 27 Vector, Gateway® pEF-DEST51 Vector, Gateway® pcDNATM-DEST47 Vector, pCMV/Bsd Vector, pEF6/His A, B & C, pcDNATM 6.2-DEST, pLenti6/TR, pLP-AcGFP1-C, pLPS-AcGFP1-N, pLP-IRESneo, pLP-TRE2, pLP-RevTRE, pLP-LNCX, pLP-CMV-HA, pLP-CMV-Myc, pLP-RetroQ 및 pLP-CMVneo를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 벡터는 항상성 프로모터 또는 조건부 프로모터와 같은 발현 조절 서열을 포함하며, 바람직하게는 항상성 프로모터가 사용된다. 당업자라면 이러한 서열을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 적절한 프로모터로는 CMV, TK, SV40 및 EF-1α를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터, 온도 조절성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 억제성 프로모터, 열 충격 프로모터, 발생 단계 프로모터, 세포 계통 특이적 프로모터, 진핵생물 프로모터, 원핵생물 프로모터 또는 일시적 프로모터, 또는 상기한 것 중 어느 하나 이상의 비변형 또는 돌연변이 유발, 무작위화, 셔플링 서열의 조합 또는 재조합이다. 다른 구체예에서, 상기 목적하는 단백질은 유전자 활성화에 의해 또는 에피솜에 의해 발현된다.
일부 구체예에서, 상기 벡터는 선별 마커 또는 약물 내성 유전자가 결여되어 있다. 다른 구체예에서, 상기 벡터는 경우에 따라 선별 마커, 예컨대 약물 또는 항생제 내성을 부여하는 단백질, 또는 더 일반적으로는 세포에 선택적 압력을 부여하는 임의의 생성물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 하나 이상의 벡터가 사용될 경우, 각각의 벡터가 동일하거나 상이한 약물 내성 또는 다른 선택적 압력 마커를 가질 수 있다. 약물 내성 또는 선택적 압력 마커 중 하나 이상이 동일할 경우, 약물 농도를 증가시킴으로써 동시 선별을 행할 수 있다. 적절한 마커는 당업자에게 주지되어 있으며, 네오마이신/G418, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 제오신, 메토트렉세이트 및 블라스티시딘 중 어느 하나에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드 생성물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 약물 선별(또는 임의의 다른 적절한 선별 마커를 이용한 선별)이 본 발명의 세포 및 세포주의 제조에 있어서 필수 단계는 아니지만, 이것은 형질감염된 세포 집단을 안정하게 형질감염된 세포로 농축시키는 데 사용될 수 있으며, 단, 형질감염된 구성체는 약물 내성을 부여하도록 설계된 것이어야 한다. 목적하는 단백질을 발현하는 세포의 후속 선별을 신호 전달 프로브를 사용하여 수행할 경우, 형질감염 바로 직후의 선별에 의하면, 단지 일시적으로 안정하지 않게 형질감염될 수 있는 일부 양성 세포가 얻어질 수 있다. 그러나, 이러한 효과는 형질감염된 세포에서의 일시적 발현이 희석되도록 충분한 세포 계대를 행함으로써 최소화할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 단백질 코딩 핵산 서열은 태그를 추가로 포함한다. 이러한 태그는, 예를 들어, HIS 태그, myc 태그, 헤마글루티닌(HA) 태그, 단백질 C, VSV-G, FLU, 황색 형광 단백질(YFP), 녹색 형광 단백질, FLAG, BCCP, 말토스 결합 단백질 태그, Nus-태그, 소프태그(Softag)-1, 소프태그-2, 스트렙(Strep)-태그, S-태그, 티오레독신, GST, V5, TAP 또는 CBP를 코딩할 수 있다. 태그는 단백질 발현 수준, 세포 내 국재화, 단백질-단백질 상호작용, 목적하는 단백질의 조절 또는 단백질 기능을 측정하기 위해 마커로서 사용될 수 있다. 태그는 또한 단백질의 정제 또는 분별에 사용될 수 있다.
목적하는 RNA를 발현하는 세포 및 세포주의 경우, RNA가 안티센스 RNA, 단쇄 간섭 RNA(siRNA), 운반 RNA(tRNA), 구조 RNA, 리보솜 RNA, 불균질 핵 RNA(hnRNA) 및 핵내 저분자 RNA(snRNA)를 비롯한 임의의 유형일 수 있다.
본 발명의 세포 및 세포주가 목적하는 기능성 단백질을 발현하는 구체예에서, 상기 단백질은 단일쇄 단백질, 다중쇄 단백질, 이종다량체 단백질을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 단백질일 수 있다. 다량체 단백질의 경우, 일부 구체예에서, 세포가 본래의 단백질을 구성하는 모든 서브유닛을 발현한다. 상기 단백질은 "야생형" 서열을 가지거나 또는 변이체일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 절단 형태, 동형체, 키메라 서브유닛 및 아미노산 치환(보존적 또는 비보존적), 화학적으로 변형된 아미노산을 비롯한 변형된 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함하는 돌연변이 형태를 비롯한 서브유닛 중 1 이상의 변이체를 포함하는 단백질을 발현한다. 본 발명의 세포 또는 세포주에 의해 발현되는 이종다량체 단백질은 목적하는 단백질의 종 동족체로부터 유래되는 것과 같은 2종 이상의 종 유래의 서브유닛을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포는 2 이상의 목적하는 기능성 단백질을 발현한다. 본 발명에 따르면, 이러한 발현은 목적하는 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산의 도입으로부터, 내생성 서열로부터 목적하는 단백질의 전부 또는 일부의 전사를 활성화하는 핵산의 도입의 도입으로부터, 또는 이의 임의의 조합으로부터 이루어질 수 있다. 상기 세포는 임의의 원하는 수의 목적하는 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 세포는 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 이상의 목적하는 단백질을 발현한다. 예를 들어, 본 발명은 목적하는 경로의 기능성 단백질, 효소 경로, 신호 전달 경로, 조절 경로 등을 포함하는 교차 경로의 단백질을 안정하게 발현하는 세포 및 세포주를 고려한다.
특히, 본 방법에서 사용되는 세포 또는 세포주에 의해 발현되는 단백질은 안정한 기능성 세포주가 종래에 이용될 수 없었던 단백질이다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 지금까지 이러한 세포주가 불가능했던 몇 가지 이유로는 단백질이 매우 복잡하다는 점, 단백질을 발현하는 다수의 세포를 준비하지 않고서는 단백질이 적절히 조립되는 세포를 동정하는 것이 불가능하였다는 점; 또는 단백질을 기능성 형태로 발현하는 세포 또는 세포주를 동정하는 데 사용하기 위한 단백질의 리간드 또는 조절인자가 알려져 있지 않는다는 점; 또는 단백질이, 이것을 자연적으로 발현하지 않는 환경에서와 같이 그 천연 환경 밖에서 발현될 경우 세포 독성을 나타낸다는 점을 들 수 있다고 생각된다.
본 발명의 세포 및 세포주는 임의의 목적하는 단백질을 세포 내에서 또는 표면에서, 또는 분비 형태로 일관되게 발현하도록 제조할 수 있다. 이러한 단백질로는 이종다량체 이온 통로, 리간드 개폐 이온 통로(예컨대, GABAA 수용체), 이온 통로(예컨대, CFTR), 이종다량체 이온 통로, 전압 개폐 이온 통로(예컨대 NaV), 이종다량체 이온 통로, 비리간드 개폐 이온 통로(상피세포 나트륨 통로, ENaC), 이종이량체 GPCR(예컨대, 오피오이드 수용체, 단맛, 감칠맛 및 쓴맛 수용체를 비롯한 미각 수용체), 다른 GPCR, Orphan GPCR, GCC, 오피오이드 수용체, 성장 호르몬 수용체, 에스테로겐/hgh, 핵 또는 막 결합형, TGF 수용체, PPAR 핵 호르몬 수용체, 니코틴/Ach 및 면역 수용체, 예컨대 B 세포/T 세포 수용체를 들 수 있다.
본 발명의 세포 및 세포주는 표 2∼13에 열거된 임의의 단백질 또는 단백질의 조합을 비롯한 기능성 단백질(포유동물 G 단백질, 인간 orphan GPCR, 인간 오피오이드 수용체, 인간 후각 수용체, 개 후각 수용체, 모기 후각 수용체, 다른 이종다량체 수용체 및 GABA 수용체)를 발현할 수 있다.
본 발명의 세포 및 세포주는 세포가 시간 경과에 따라 목적하는 기능성 단백질을 일관되게 발현하는 것이 요구되는 임의의 용도에 특히 유익하게 하는 다수의 특징을 갖고 있다. "안정한 발현" 및 "일시적 발현"이란 용어는 당업자가 이해하고 있기 때문에, 단백질의 발현 및 단백질의 기능에 적용되는 "안정한" 또는 "일관된"이란 용어는, 일시적 발현 또는 가변 기능을 갖는 세포로부터 본 발명의 세포 및 세포주를 구별하기 위한 것이다. 본 발명의 세포 및 세포주는 적어도 2∼4일 동안 10% 미만의 변동성으로 기능성 단백질을 안정하게 또는 일관되게 발현한다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 세포 및 세포주는, 적어도 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 95일, 100일, 110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일, 190일, 200일 또는 200일 이상 동안 증식 후, 목적하는 기능성 RNA 또는 단백질을 발현하며, 즉, 세포가 일관되게 기능성을 나타내며, 이때 "일관된 발현" 또는 "일관되게 기능성을 나타내는"이란 발현 수준이 2∼4일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 9% 또는 10%보다 크게 변화되지 않는 것; 5∼15일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 또는 12%보다 크게 변화되지 않는 것; 16∼20일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% 또는 20%보다 크게 변화되지 않는 것; 21∼30일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%보다 크게 변화되지 않는 것; 30∼40일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30%보다 크게 변화되지 않는 것; 41∼45일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30%보다 크게 변화되지 않는 것; 45∼50일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30%보다 크게 변화되지 않는 것; 45∼50일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35%보다 크게 변화되지 않는 것; 50∼55일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28% 또는 30% 또는 35%보다 크게 변화되지 않는 것; 50∼55일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30% 또는 35%보다 크게 변화되지 않는 것; 55∼75일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%보다 크게 변화되지 않는 것; 75∼100일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45%보다 크게 변화되지 않는 것; 101∼125일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45%보다 크게 변화되지 않는 것; 126∼150일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45%보다 크게 변화되지 않는 것; 151∼175일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45%보다 크게 변화되지 않는 것; 176∼200일의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45%보다 크게 변화되지 않는 것; 200일 이상의 연속 세포 배양 기간 동안 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 45%보다 크게 변화되지 않는 것을 의미한다.
기능성 단백질의 안정한 발현에 더하여 바람직한 특성을 갖는 세포를 선택할 수 있다. 검출이 가능한 임의의 원하는 특성을 갖는 것을 선택할 수 있다. 당업자라면 이러한 특성을 알고 있을 것이다. 비한정적인 예로서 이러한 특성은 취약성, 형태 및 고체 표면에 대한 부착성, 트립신 또는 세포 해리제에 의한 단분산성(monodispersion), 자동화 배양 조건에의 적합성, 혈청 함유 조건 하에서의 성능, 무혈청 조건에서의 성능, 무혈청 현탁 조건으로의 전환성, 덩어리를 형성하는 성향, 계대 후 단분산 세포층을 형성하는 성향, 복원력(resilience), 상이한 힘의 유체 첨가 단계에서 증식 챔버 표면에 부착된 채로 남아있는 성향, 비단편화 핵, 세포 내 액포의 부재, 미생물 오염의 부재, 마이코플라즈마의 부재, 바이러스 오염의 부재, 클론 형성능, 웰 내 세포의 전체 물성의 일관성, 실온 아래/실온/실온 이상에서의 증식 성향, 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 견디는 성향, 세포가 플라스미드/올리고뉴클레오티드/형광 발생 프로브/펩티드/단백질/화합물을 균일하게 흡수하는 성향, 세포가 DMSO/EtOH/MeOH, 유기 용매/계면활성제와의 인큐베이션을 견디는 성향, 세포가 지속되는 UPR 유도를 견디는 성향, 세포가 DTT에의 노출을 견디는 성향, 세포가 바이러스/렌티바이러스/코스미드 벡터에 감염되는 성향, 원하는 RNA(들)/단백질(들)의 내생적 발현 또는 그 부재, 염색체 수, 염색체 이상, pH 5/6/7/8/9에서 증식할 수 있는 성향, UV/돌연변이원/방사선에 대한 내성, 변경/수작업/규모 확장 증식 조건(즉, 반응기를 포함함)에서 상기 특성을 유지하는 능력을 포함한다.
본 발명의 세포 및 세포주는 통상적인 방법에 의해 제조된 세포 및 세포주에 비해 향상된 특성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 세포 및 세포주는 (예를 들어, 항생제 및 다른 약물을 비롯한 선택적 압력 부재 하에서의 배양에서 유지되는 경우에도) 향상된 발현 안정성 및/또는 발현 수준을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 및 세포주는 각종 분석에서 높은 Z' 값을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 및 세포주는 보다 통상적으로 조작된 세포에 비해 생리적으로 관련된 단백질 활성의 발현에 있어서 개선되어 있다. 이러한 특성은, 본 발명의 세포 및 세포주가 세포 치료, 단백질 제조, 또는 임의의 다른 용도를 위해 조절인자를 동정하기 위한 분석 및 동정된 조절인자의 기능적 특성을 개선하기 위한 분석 등의 임의의 용도에 사용될 수 있는 능력을 개선한다.
본 발명의 세포 및 세포주의 그 밖의 이점은, 이들이 약물 및 다른 선택적 압력이 없어도 목적하는 단백질을 안정하게 발현한다는 것이다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포 및 세포주는 임의의 선택적 압력 부재 하에서 배양이 유지된다. 추가적인 구체예에서, 세포 및 세포주는 임의의 약물 또는 항생제 없이도 유지된다. 본원에서 사용될 때, 세포 유지란, 단백질 발현에 대해 기재된 것과 같이 세포를 선택한 후 세포를 배양하는 것을 의미한다. 유지는, 세포로 도입된 마커(들)에 의해 혼합 집단 중의 안정한 형질감염체가 농축되는 세포 분류 전에 선택적 압력(예를 들어, 항생제) 하에서 세포를 증식시키는 임의적인 단계는 지칭하지 않는다.
본 발명의 세포 및 세포주의 약물 부재 및 선택적 압력 부재 세포 유지는 수많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 약물 내성 세포는 목적하는 동시 형질감염 이식 유전자를 적정 수준으로 발현할 수 없는데, 그 이유는, 선별은, 이식 유전자가 있건 없건 간에 약물 내성 유전자를 흡수한 세포의 생존에 달려있기 때문이다. 게다가, 선택 약물 및 다른 선택적 압력 인자는 종종 돌연변이 유발성이거나 또는 다른 방식으로 세포의 생리에 간섭하여, 세포 기반 분석에서 왜곡된 결과를 초래한다. 예를 들어, 선택 약물은 아폽토시스에 대한 감수성을 감소시키고[Robinson et al., Biochemistry, 36(37):11169-11178 (1997)], DNA 수복 및 약물 대사를 증가시키고[Deffie et al., Cancer Res. 48(13):3595-3602 (1988)], 세포 내 pH를 증가시키고[Thiebaut et al., J Histochem Cytochem. 38(5):685-690 (1990); Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993); Simon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 91(3):1128-1132 (1994)], 라이소솜 및 엔도솜 pH를 감소시키고[Schindler et al., Biochemistry. 35(9):2811-2817 (1996); Altan et al., J Exp Med. 187(10):1583-1598 (1998)], 원형질막 전위를 감소시키고[Roepe et al., Biochemistry. 32(41):11042-11056 (1993)], 클로라이드에 대한 원형질막 전도성[Gill et al., Cell. 71(1):23-32 (1992)) 및 ATP에 대한 원형질막 전도성을 증가시키고[Abraham et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 90(1):312-316 (1993)], 소낭 수송률을 증가시킬 수 있다[Altan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96(8):4432-4437 (1999)]. 따라서, 본 발명의 세포 및 세포주에 의하면, 선택적 압력에 기인하는 인위적 결과로부터 영향을 받지 않는 스크리닝 분석이 가능하다. 바람직한 일부 구체예에서, 본 발명의 세포 및 세포주를, 세포 분류 전 또는 후에는 항생제 등의 선택적 압력 인자와 함께 배양하지 않음으로써, 농축 세포 집단으로부터 출발하지 않더라도, 원하는 특성을 갖는 세포 및 세포주가 분류에 의해 단리될 수 있게 한다.
본 발명의 세포 및 세포주는 발현 및 발현 수준(RNA 또는 단백질)에 있어서 종래의 방법에 의해 제조된 세포 및 세포주에 비해 향상된 안정성을 갖는다. 이러한 안정한 발현을 특징으로 하는 세포 및 세포주를 동정하기 위해, 목적하는 단백질의 세포 또는 세포주 발현을 시간 경과에 따라 측정하고, 그 발현 수준을 비교한다. 안정한 세포주는 시간이 경과해도 (RNA 또는 단백질) 발현을 지속한다. 본 발명의 일부 측면에서, 시간 경과는 적어도 1주일, 2주일, 3주일 등, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월 또는 9개월, 또는 그 사이의 임의의 기간일 수 있다.
단리된 세포 및 세포주는, 발현되는 (RNA의) 절대량과 상대량(목적하는 다중 서브유닛 단백질 또는 다중 단백질의 경우)을 측정하기 위해 PCR, RT-PCR, qRT-PCR 및 싱글 엔드 포인트(single end-point) RT-PCR 등으로 추가로 특징 규명할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 세포 및 세포주에서 다중 서브유닛 단백질의 서브유닛들의 발현 수준은 실질적으로 동일하다.
다른 구체예에서, 목적하는 기능성 단백질의 발현을 시간 경과에 따라 분석한다. 이러한 구체예에서, 안정한 발현은 시간 경과에 따른 기능성 분석의 결과를 비교함으로써 측정한다. 기능성 분석에 기초한 세포 및 세포주 안정성의 분석은 단백질(RNA 또는 단백질)을 안정하게 발현할 뿐만 아니라 기능성 단백질이 생성되도록 단백질을 안정하게 생산하여 적절히 프로세싱(예를 들어, 번역 후 변형, 서브유닛 조립 및 세포 내에서의 국재화)하는 세포 및 세포주를 동정할 수 있는 이익을 제공한다.
본 발명의 세포 및 세포주는 그 Z' 계수에 의해 입증되는 높은 재현율로 분석이 가능하게 하는 추가적인 유익한 특성을 갖는다. 예를 들어, 본원에서 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR, "A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays." J. Biomol . Screen . 1999; 4(2):67-73]을 참조할 수 있다. Z' 값은 세포 또는 세포주의 양과 관련이 있는데, 그 이유는 이것이 세포 또는 세포주가 조절인자에 일관되게 반응하는 정도를 반영하기 때문이다. Z'은, 멀티웰 플레이트 전반에 대한, 참조 화합물에 대한 기능적 반응의 신호 변동성(즉, 웰 간의) 및 신호 대 노이즈 범위를 고려하는 통계적 계산값이다. Z'은 양성 대조군을 갖는 다수의 웰과 음성 대조군을 갖는 다수의 웰로부터 얻은 Z' 데이터를 이용하여 계산한다. 하기 식에 따라, 이들의 표준 편차에 3을 곱한 것의 합 대 계수 차이의 평균 값의 비를 1에서 빼서 Z'을 얻는다.
Z' 계수 = 1 - ((3σ양성 대조군 + 3σ음성 대조군)/(μ양성 대조군 - μ음성 대조군))
상기 계수가 1.0인 경우, 이것은 이론적 최대값 Z', 변동성 없음 및 무한 동적 범위를 갖는 이상적인 분석임을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, "높은 Z'"은 Z' 계수가 0.6 이상, 0.7 이상, 0.75 이상 또는 0.8 이상, 또는 0.6∼1.0 사이의 임의의 소수임을 의미한다. 복잡한 표적의 경우, 높은 Z'은, Z'이 적어도 0.4 또는 그 이상임을 의미한다. 0에 가까운 스코어는, 양성 대조군과 음성 대조군 사이에 중복이 있음을 나타내기 때문에 바람직하지 않다. 산업에서는, 단순한 세포 기반 분석의 경우, 0.3 이하의 Z' 스코어가 한계 스코어로 간주되고, 0.3∼0.5의 Z' 스코어는 허용 가능한 것으로 간주되며, 0.5보다 큰 Z' 스코어는 우수한 것으로 간주된다. 무세포 또는 생화학적 분석은 세포 기반 시스템보다 스코어가 더 낮은 경향이 있는데, 그 이유는 Z' 스코어가 클수록 세포 기반 시스템이 복잡해지기 때문이다.
당업자라면 단일쇄 단백질을 발현하는 통상적인 세포를 이용하는 세포 기반 분석으로도 일반적으로 0.5∼0.6보다 큰 Z'을 얻지 못한다는 것을 알 것이다. 당업계에 보고되어 있긴 하지만, 다중 서브유닛 단백질이 (도입된 코딩 서열 또는 유전자 활성화로부터) 발현되도록 조작된 세포는 그 추가된 복잡성으로 인해 더 낮아질 것이다. 이러한 세포는, 그 결과가 재현성이 없기 때문에, 분석에 사용할 수 있는 신뢰성을 갖지 못한다. 반면에, 본 발명의 세포 및 세포주는 더 높은 Z' 값을 가지며, 유익하게 분석에서 일관된 결과를 산출한다. 실제로, 본 발명의 세포 및 세포주는, 이들이 종래의 방식으로 제조된 세포보다 대체로 더 높은 값을 갖기 때문에, 고속 스크리닝(HTS) 상용 분석의 기반을 제공한다. 본 발명의 일부 측면에서, 세포 및 세포주는 0.3 이상, 0.4 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 또는 0.8 이상의 Z'을 산출한다. 본 발명의 세포 및 세포주에 대해 0.3∼0.4의 Z' 값도 유익한데, 그 이유는 목적하는 단백질이 다유전자 표적이기 때문이다. 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 세포 및 세포주는 세포가 다수의 계대배양, 예를 들어 5∼20회(5와 20 사이의 임의의 정수를 포함함) 계대배양 동안 유지된 후에도 0.7 이상, 0.75 이상 또는 0.8 이상의 Z'을 산출한다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 세포 및 세포주는, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 5주 동안, 또는 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월 또는 9개월(그 사이의 임의의 기간을 포함함) 동안 유지된 세포 및 세포주에서도 0.7 이상, 0.75 이상 또는 0.8 이상의 Z'을 산출한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세포 및 세포주의 제조 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은
a) 목적하는 단백질을 코딩하는 mRNA를 발현하는 다수의 세포를 제공하는 단계;
b) 개별 배양 용기에 개별적으로 세포를 분산시켜, 다수의 개별 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 배양 조건이 각각의 개별 세포 배양물에 대해 실질적으로 동일하고, 배양 동안 각각의 개별 세포 배양물의 세포 수를 정규화시키며, 개별 배양물들은 동일 스케쥴로 계대되는 것을 특징으로 하는 자동화 세포 배양법을 사용하여 원하는 배양 조건 세트 하에서 세포를 배양하는 단계;
d) 목적하는 단백질의 1 이상의 원하는 특징에 대해 개별 세포 배양물을 2회 이상 분석하는 단계; 및
e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 개별 세포 배양물을 동정하는 단계
를 포함한다.
본 발명에 따르면, 세포를 원하는 배양 조건 세트 하에 배양한다. 상기 조건은 임의의 원하는 조건일 수 있다. 당업자라면 어떠한 파라미터가 배양 조건 세트에 포함되는지를 알 것이다. 예를 들어, 배양 조건으로는 배지(기본 배지(DMEM, MEM, RPMI, 무혈청 배지, 혈청 함유 배지, 완전 화학 규정 배지, 동물 유래 성분이 없는 배지), 1가 및 2가 이온(나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘) 농도, 첨가된 추가적인 성분(아미노산, 항생제, 글루타민, 글루코스 또는 다른 탄소 공급원, HEPES, 통로 차단제, 다른 표적의 조절인자, 비타민, 미량 원소, 중금속, 보조 인자, 성장 인자, 아폽토시스 방지제), 새로운 배지 또는 조건(conditioned) 배지, HEPES 존재, pH, 특정 영양소 또는 제한 성분(아미노산, 탄소원)의 고갈), 세포가 분열/계대 전에 도달되는 포화도, 세포의 영양 공급층, 또는 감마 방사선 조사 세포, CO2, 3종 가스 시스템(산소, 질소, 이산화탄소), 습도, 온도, 정치 배양 또는 진탕기 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않으며, 이것들은 당업자에게 주지되어 있다.
세포 배양 조건은 편의에 따라 또는 세포에 대해 원하는 특정 용도에 따라 선택할 수 있다. 본 발명은 유익하게도 원하는 특정 용도에 최적으로 알맞은 세포 및 세포주를 제공한다. 즉, 세포가 원하는 특정 용도를 위한 배양 조건 하에 배양되는 본 발명의 구체예에서, 원하는 용도를 위한 조건 하에 원하는 특징을 갖는 세포를 선택한다. 예를 들어, 세포가 부착성일 것이 요망되는 플레이트에서의 분석에 세포가 사용될 경우, 분석 조건 하에 부착성을 나타내는 세포를 선택할 수 있다. 마찬가지로, 세포가 단백질 제조에 사용될 경우, 세포를 단백질 제조에 적합한 조건 하에 배양하여 이 용도를 위한 유익한 특성을 갖는 것을 선택할 수 있다.
일부 구체예에서, 이 방법은 개별 세포 배양물의 증식 속도를 측정하는 추가적인 단계를 포함한다. 증식 속도는 당업자에게 주지되어 있는 각종 기술적 수단 중 어느 것을 이용하여 측정할 수 있다. 이러한 기법으로는 ATP, 세포 포화도, 광 산란, 흡광도(예를 들어, DNA의 경우 OD260)를 측정하는 것을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 증식 속도를, 배양물이 선택된 배양 조건 바깥에서 보내는 시간의 양을 최소화하는 수단을 사용하여 측정한다.
일부 구체예에서, 세포 포화도를 측정하여 이 포화도 값으로부터 증식 속도를 계산한다. 일부 구체예에서, 세포를 분산시키고, 정확도 향상을 위해 세포 포화도 측정 전에 덩어리를 제거한다. 세포의 단분산 방법은 주지되어 있고, 예를 들어, 측정하고자 하는 배양물에 분산제를 첨가함으로써 수행할 수 있다. 분산제는 주지되어 있고 입수가 용이하며, 트립신과 같은 효소 분산제 및 EDTA계 분산제를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 증식 속도는, HAMILTON VECTOR 등의 이 목적을 위한 상업적으로 입수가 가능한 소프트웨어를 사용하여 포화도 데이터로부터 계산할 수 있다. 자동화 현미경 플레이트 판독기를 사용하는 등의 자동화 포화도 측정이 특히 유용하다. 포화도를 측정하는 플레이트 판독기는 상업적 입수가 가능하며, CLONE SELECT IMAGER(Genetix)를 들 수 있으나 이것에 한정되지 않는다. 일반적으로, 증식 속도 계산 전에 세포 포화도를 2회 이상 측정한다. 증식 속도를 측정하는 데 사용되는 포화도 값의 수는 배양에 편리하거나 적합한 임의의 수일 수 있다. 예를 들어, 포화도는, 예를 들어, 1주, 2주, 3주 또는 임의의 기간에 걸쳐 임의의 원하는 빈도로 여러 차례 측정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 증식 속도를 알 경우, 다수의 개별 세포 배양물을 증식 속도 유사성에 따라 그룹으로 나눈다. 배양물을 증식 속도 빈(bin)으로 그룹핑함으로써, 그룹 내의 배양물을 함께 조작하는 것이 가능하여, 배양물 간의 변동성을 감소시키는 또 다른 표준화도가 제공된다. 예를 들어, 빈 내의 배양물을 동시에 계대하고, 동시에 원하는 시약으로 처리할 수 있는 것 등이다. 또한, 기능성 분석 결과는 일반적으로 분석 웰 내 세포 밀도에 따라 달라진다. 개개의 클론의 정확한 비교는 이것들을 동일한 밀도로 플레이팅하여 분석하는 경우에만 이루어진다. 특정 증식 속도 코호트로의 그룹핑은 클론을 특정 밀도로 플레이팅할 수 있게 하여, 고속 방식으로 클론의 기능성 분석이 가능하다.
각 그룹 내의 증식 속도의 범위는 임의의 편리한 범위일 수 있다. 세포를 동시에 계대할 수 있도록 하는 다양한 증식 속도를 선택하여 세포 수의 빈번한 재정규화를 방지하는 것이 특이 유익하다. 증식 속도 그룹은 엄격한 그룹핑을 위해 매우 좁은 범위(예를 들어, 평균 배가 시간이 서로 1시간 이내)를 포함할 수 있다. 이 방법에 따르면, 상기 범위는 서로 간에 2시간 이하, 3시간 이하, 4시간 이하, 5시간 이하 또는 10시간 이하 또는 더 넓은 범위일 수 있다. 재정규화에 대한 필요성은 빈 내 증식 속도가 동일하지 않아 일부 배양물 중의 세포 수가 다른 것보다 더 빨리 증가하는 경우에 발생한다. 빈 내 모든 배양물에 대해 실질적으로 동일한 조건을 유지하기 위해서는, 세포를 주기적으로 제거하여 빈 전체에 대해 그 수를 재정규화하는 것이 필요하다. 증식 속도가 더 많이 다를수록, 재정규화가 더 빈번하게 요구된다.
단계 d)에서는, 세포 및 세포주를, 게놈에 의해 코딩되는 세포 내 과정에 있어서의 변화; 게놈에 의해 조절되는 세포 내 과정에 있어서의 변화; 염색체 활성의 패턴에 있어서의 변화; 염색체 침묵의 패턴에 있어서의 변화; 유전자 침묵의 패턴에 있어서의 변화; 유전화 활성화의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 유전자 발현의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; RNA 발현의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; RNAi 발현의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; RNA 프로세싱의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; RNA 수송의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 단백질 번역의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 단백질 폴딩의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 단백질 조립의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 단백질 변형의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 단백질 수송의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 세포 표면으로의 막 단백질 수송의 패턴 또는 효율에 있어서의 변화; 증식 속도에 있어서의 변화; 세포 크기에 있어서의 변화; 세포 형상에 있어서의 변화; 세포 형태에 있어서의 변화; RNA 함량(%)에 있어서의 변화; 단백질 함량(%)에 있어서의 변화; 함수량(%)에 있어서의 변화; 지질 함량(%)에 있어서의 변화; 리보솜 함량에 있어서의 변화; 미토콘드리아 함량에 있어서의 변화; ER 질량에 있어서의 변화; 원형질막 표면적에 있어서의 변화; 세포 용적에 있어서의 변화; 원형질막의 지질 조성에 있어서의 변화; 핵막의 지질 조성에 있어서의 변화; 원형질막의 단백질 조성에 있어서의 변화; 핵막의 단백질 조성에 있어서의 변화; 분비 소낭의 수에 있어서의 변화; 라이소솜의 수에 있어서의 변화; 액포의 수에 있어서의 변화; 단백질 생산, 단백질 분비, 단백질 폴딩, 단백질 조립, 단백질 변형, 단백질의 효소적 변형, 단백질 글리코실화, 단백질 인산화, 단백질 탈인산화, 대사물질 생합성, 지질 생합성, DNA 합성, RNA 합성, 단백질 합성, 영양소 흡수, 세포 증식, 유사분열, 감수분열, 세포분열, 줄기 세포로의 역분화, 전환, 전능 세포(pluripotent cell)로의 전환, 만능 세포(omnipotent cell)로의 전환, 임의의 장기(즉, 간, 폐, 피부, 근육, 췌장, 뇌, 고환, 난소, 혈액, 면역계, 신경계, 뼈, 심혈관계, 중추신경계, 위장관계, 위, 갑상선, 혀, 담낭, 신장, 코, 눈, 손발톱, 모발, 미뢰)의 줄기 세포 유형으로의 전환, 분화된 임의의 세포 유형[즉, 근육 세포, 심근 세포, 뉴런, 피부 세포, 췌장 세포, 혈액 세포, 면역 세포, 적혈구, 백혈구, 살해 T 세포, 장내분비 세포, 미각 세포, 분비 세포, 신장 세포, 상피 세포, 내피 세포(또한, 핵산 서열의 도입에 이용될 수 있는 상기에 열거된 동물 또는 인간 세포 유형 중 임의의 것을 포함함)]으로의 전환, DNA 흡수, 소분자 흡수, 형광 발생 프로브 흡수, RNA 흡수, 고체 표면에의 부착, 무혈청 조건에의 적응, 무혈청 현탁 조건에의 적응, 규모 확장 세포 배양에의 적응, 대규모 세포 배양을 위한 사용, 신약 개발에서의 사용, 고속 스크리닝에서의 사용, 세포 기반 기능성 분석에서의 사용, 막 전위 분석에서의 사용, 칼슘 흐름 분석에서의 사용, G-단백질 리포터 분석에서의 사용, 리포터 세포 기반 분석에서의 사용, ELISA 분석에서의 사용, 시험관내 분석에서의 사용, 생체내 적용에서의 사용, 2차 시험에서의 사용, 화합물 시험에서의 사용, 결합 분석에서의 사용, 패닝 분석에서의 사용, 항체 패닝 분석에서의 사용, 이미지화 분석에서의 사용, 현미경 이미지화 분석에서의 사용, 멀티웰 플레이트에서의 사용, 자동화 세포 배양에의 적응, 소형 자동화 세포 배양에의 적응, 대규모 자동화 세포 배양에의 적응, 멀티웰 플레이트(6웰, 12웰, 24웰, 48웰, 96웰, 384웰, 1536웰 또는 그 이상의 밀도)에서의 세포 배양에의 적응, 세포 칩에서의 사용, 슬라이드 상에서의 사용, 유리 슬라이드 상에서의 사용, 슬라이드 또는 유리 슬라이드 상에서의 미세배열, 면역형광 분석, 단백질 정제에서의 사용, 생물학적 물질 제조에서의 사용, 산업용 효소 제조에서의 사용, 연구용 시약의 제조에서의 사용, 백신 개발에서의 사용, 세포 치료에서의 사용, 동물 또는 인간으로의 이식에서의 사용, 세포가 분비하는 인자의 단리에서의 사용, cDNA 라이브러리의 제조, RNA의 정제, DNA의 정제, 병원체, 바이러스 또는 기타 물질에 의한 감염, 병원체, 바이러스 또는 기타 물질에 의한 감염에 대한 내성, 약물 내성, 소형 자동화 세포 배양 조건 하에서 유지될 수 있는 적합성, 단백질 결정학적 분석을 비롯한 특징 규명을 위한 단백질의 제조에서의 사용, 백신 개발, 면역계의 자극, 항체 제조 또는 항체의 생성 또는 시험에 대한 세포의 능력 또는 잠재력에 있어서의 변화를 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 생리적 특성에 대해 시험하고 선택할 수 있다. 당업자는 상기에 열거된 특성들 중 임의의 것에 대한 적절한 시험을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명의 세포 및 세포주 및/또는 본 발명의 매칭된 패널의 특징을 규명하는 데 사용될 수 있는 시험으로는 아미노산 분석, DNA 서열결정, 단백질 서열결정, NMR, 단백질 수송에 대한 시험, 핵-세포질 수송에 대한 시험, 단백질의 세포 내 국재화에 대한 시험, 핵산의 세포 내 국재화에 대한 시험, 현미경 분석, 초현미경 분석, 형광 현미경 분석, 전자 현미경 분석, 공초점 현미경 분석, 레이저 삭마 기술, 세포 수 계측 및 투석을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 상기에 열거된 시험 중 임의의 것의 이용 방법을 알고 있다.
세포 또는 세포주의 집합체 또는 패널을, 예를 들어 약물 스크리닝을 위해 제조할 경우, 집합체 또는 패널 내의 세포 또는 세포주를 이들이 1 이상의 선택적인 생리적 특성에 대해 동일하도록(실질적으로 동일한 것을 포함함) 매칭시킬 수 있다. 이와 관련하여 "동일한 생리적 특성"이란, 선택된 생리적 특성이, 세포 집합체 또는 패널이 약물 스크리닝 분석에서 신뢰할 만한 결과를 산출할 수 있도록 집합체 또는 패널 내 구성원 사이에서 충분히 유사한 것을 의미하며; 예를 들어, 약물 스크리닝 분석에서의 판독 결과의 변동성은 세포 고유의 변동성이라기 보다는, 예를 들어, 상이한 형태의 단백질을 발현하는 세포에 대한 시험 화합물의 상이한 생물학적 활성에 기인한 것이다. 예를 들어, 세포 또는 세포주를 동일한 증식 속도를 갖도록, 즉, 세포 집합체 또는 패널의 구성원 간의 차이가 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 또는 5시간 이하인 증식 속도를 갖도록 매칭시킬 수 있다. 이것은, 예를 들어, 세포를 그 증식 속도에 따라 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 그룹으로 비닝(binning)하고, 동일한 비닝 그룹으로부터의 세포를 이용하여 패널을 생성함으로써 수행할 수 있다. 세포 증식 속도를 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 또한, 패널 내의 세포 또는 세포주는 동일한 Z' 계수(예를 들어, 차이가 0.1보다 크지 않은 Z' 계수), 단백질 발현 수준(예를 들어, 차이가 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30%보다 크지 않은 CFTR 발현 수준), RNA 발현 수준, 조직 배양 표면에의 부착성 등을 갖도록 매칭시킬 수 있다. 매칭된 세포 및 세포주는, 선택된 생리적 특징이 유지되도록, 예를 들어 자동화된 대등한 프로세싱에 의해 성립된, 동일한 조건 하에 증식시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 패널을, 동일한 조건 세트 하에 증식 속도에 대해 매칭시킨다. 본원에서 매칭된 패널이라고도 칭하는 이러한 패널은, 2종 이상의 세포주에 대한 실험 변수의 영향을 비교하는 것이 바람직한 다양한 세포 기반 연구에 사용하기에 매우 바람직하다. 증식 속도에 대해 매칭된 세포주는 시간이 경과해도 웰당 대체로 동일한 세포 수를 유지하여, 패널 내 세포주 간의 영양소 함량 등의 증식 조건에 있어서의 변동성을 감소시킨다.
본 발명에 따르면, 매칭된 패널은, 세포의 특징, 패널의 의도된 용도, 패널의 크기, 배양 조건 등을 포함하는 다수의 인자에 따라, 임의의 원하는 범위 내의 증식 속도를 가질 수 있다. 이러한 인자들은 당업자가 쉽게 이해할 것이다.
증식 속도는 임의의 적합하고 편리한 수단으로 측정할 수 있으나, 다만, 매칭된 패널에 대해 세포 및 세포주의 증식 속도가 동일한 수단에 의해 측정되어야 한다. 다수의 증식 속도 측정 방법이 본원에 기재된 바와 같이 공지되어 있다.
본 발명의 매칭된 패널은 다수의 클론 세포주를 포함할 수 있다. 패널 내의 클론 세포주의 최대수는 각각의 용도와 사용자에 따라 달라지며, 유지될 수 있는 한 많을 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 패널은 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종, 10종 또는 그 이상의 클론 세포주, 예를 들어, 적어도 12종, 적어도 15종, 적어도 20종, 적어도 24종, 적어도 25종, 적어도 30종, 적어도 35, 적어도 40종, 적어도 45종, 적어도 48종, 적어도 50종, 적어도 75종, 적어도 96종, 적어도 100종, 적어도 200종, 적어도 300종, 적어도 384종, 적어도 400종 또는 그 이상의 클론 세포주를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 패널은 다수의 클론 세포주, 즉, 상이한 단일 모 세포로부터 생성된 다수의 세포주를 포함한다. 임의의 원하는 세포 유형이 매칭된 패널의 제조에 사용될 수 있다. 상기 패널은 모두 동일한 세포 유형의 세포주 또는 상이한 세포 유형의 세포주를 포함할 수 있다.
패널 내의 클론 세포주는 1 이상의 목적하는 단백질을 안정하게 발현한다. 안정한 발현은 패널의 원하는 용도에 적합한 임의의 기간 동안일 수 있으나, 최소한, 선택이 가능하고 매칭된 패널에 사용될 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다.
상기 매칭된 패널 내의 클론 세포주가 모두 동일한 1 이상의 목적하는 단백질을 발현할 수도 있고, 또는 상기 패널 내의 일부 클론 세포주가 상이한 목적하는 단백질을 발현할 수도 있다.
일부 구체예에서, 상기 매칭된 패널은 상이한 목적하는 단백질을 발현하는 1 이상의 클론 세포주를 포함한다. 즉, 다수의 상이한 목적하는 단백질이 요구되는 경우, 패널 내의 제1 클론 세포주는 제1의 목적하는 단백질을 발현할 수 있고, 패널 내의 제2 클론 세포주는 제2의 목적하는 단백질을 발현할 수 있으며, 제3의 세포주는 제3의 목적하는 단백질을 발현할 수 있는 것 등이다. 상이한 목적하는 단백질은 목적하는 단백질의 상이한 동형체, 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 또는 돌연변이 형태(서열 돌연변이 형태 또는 절단 형태를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않음), 키메라 형태 또는 효소적 변형 형태를 비롯한 화학적 변형 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 단백질은 기능적으로 규정된 단백질 그룹, 예컨대 쓴맛 수용체 패널 또는 키나제 패널의 구성원일 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 단백질은 동일한 또는 상호 관련된 신호전달 경로의 일부일 수 있다. 이종다량체 단백질(이종이량체를 포함함)을 포함하는 또 다른 패널의 경우, 이 패널은 2종 이상의 상이한 서브유닛의 조합에서부터 가능한 모든 서브유닛의 조합까지 포함할 수 있다. 이 조합은 서브유닛 서열 변이체, 서브유닛 동형체 조합, 종간 서브유닛 조합 및 서브유닛 유형의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 감마-아미노부티르산(GABA)A 수용체는 일반적으로 2개의 알파 서브유닛, 2개의 베타 서브유닛 및 감마 서브유닛을 포함한다. 6개의 알파 동형체, 5개의 베타 동형체, 4개의 감마 동형체 및 델타, 파이, 세타 및 엡실론 서브유닛이 있다. 본 발명은 알파, 베타, 감마, 델타, 파이, 엡실론 및 세타 서브유닛의 모든 가능한 조합을 포함하는 패널을 비롯한 이들 서브유닛 중 임의의 것의 2종 이상의 조합을 포함하는 패널을 고려한다. 또한, GABA 수용체 패밀리는 GABAB 수용체 및 GABAC 수용체를 포함한다. 본 발명은 또한 GABAA 서브유닛, GABAB 서브유닛 및 GABAC 서브유닛의 임의의 조합을 포함하는 패널을 고려한다. 일부 구체예에서, 이러한 패널은 인간 GABA 서브유닛, 인간 이외의 영장류(예를 들어, 사이노몰거스) GABA 수용체와 같은 포유동물 GABA 수용체 패널, 마우스, 랫트 또는 인간 GABA 수용체 패널 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
추가의 예에서, 본 발명은 임의의 포유동물 상피세포 나트륨 채널(ENaC) 패널, 예컨대 인간 이외의 영장류(예, 사이노몰거스) ENaC, 마우스, 래트 또는 인간 ENaC 패널 또는 이의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 상피세포 나트륨 채널(ENaC) 패널을 포함한다. GABA 수용체와 같이, 온전한 ENaC는 복수의 서브유닛을 포함한다: 알파 또는 델타, 베타 및 감마. 본 발명은 ENaC 서브유닛의 2 이상의 상이한 조합을 가지는 패널을 포함하며, 또한 상이한 종으로부터의 서브유닛의 조합, 이소폼의 조합, 대립유전자 변이체, SNP, 키메라 서브유닛, 변형 및/또는 비천연 아미노산을 포함하는 형태 및 화학적으로 변형된, 예컨대 효소적으로 변형된 서브유닛을 포함하는 모든 가능한 ENaC 서브유닛의 조합을 포함한다. 또한, 본 발명은 그 전문이 참고로 포함된 국제 출원 PCT/US09/31936에 설명된 임의의 ENaC 형태를 포함하는 패널도 포함한다.
추가의 특정 구체예에서, 25종의 쓴맛 수용체의 매칭 패널은 표 10에 제시된 천연(태그 불포함) 작용성 쓴맛 수용체를 발현하는 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 패널은 성장 속도가 매칭된다. 일부 구체예에서, 패널은 성장 속도와 목적하는 추가의 생리적 특성이 매칭된다. 일부 구체예에서, 패널의 세포주는 동시에 생성되고 및/또는 동시에 스크리닝된다.
패널 및 그의 용도에 대한 추가적이지만 비제한적인 예는 다음과 같다: 예컨대 향기의 프로파일링 또는 조절인자의 발견을 위한, 후각 수용체(곤충, 개, 인간, 빈대) 패널; 테스트 펩티드에 융합된 유전자 발현 세포의 패널, 즉 모노클로날 항체 또는 비-단백질 약물을 포함한 단백질과 같은 적재물을 세포내로 내면화시키는 펩티드의 발견을 위한 패널(상기 적재물은 GFP 또는 AP와 같은 수용체일 수 있음). 이 구체예와 관련하여, 이 패널의 세포로부터 얻은 상청액을 내면화 평가를 위한 다른 세포에 첨가한다. 그러한 구체예에서, 패널은 세포형 특이적 전달을 평가하기 위해 상이한 세포형을 포함할 수 있다. 상이한 모노클로날 항체 중쇄/경쇄 조합을 발현하는 세포주 패널은 활성 mAb를 확인하기 위한 것이다. 항체 패널은 또한 혈청에서의 안정성, 결합 친화도 등과 같은 특성이 개선된 것을 확인하기 위해 일련의 유도체화된 형태의 모노클로날 항체를 제공할 수 있다. 또 다른 패널은 상이한 G-단백질과 같은 각종 신호전달 분자의 존재 하에 표적 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 종류의 패널은 표적 단백질의 변이체를 개선된 활성/안정성에 대해 시험하기 위해 사용될 수 있다. 패널은 여러가지 또는 모든 형태의 서브세트에 작용하는 조절인자를 선택하기 위한 단일 염기 다형성(SNP) 또는 다른 돌연변이된 형태를 포함할 수 있다. 다른 패널을 사용하여 단백질 패밀리 또는 단백질 이소폼(예, GABAA 또는 다른 CNS 이온 채널)에 대한 테스트 화합물의 활성 패턴을 규명할 수 있다. 생체내 상응하는 서브유닛 조합의 기능/역할/국재화를 결정하기 위한 추가 연구에 차등 작용 화합물을 이용할 수 있다. 테스트 화합물은 임상에서 실패한 기존의 조절인자 또는 불리한 오프타겟 효과를 가지는 것들로서, 그러한 효과와 상관관계가 있을 수 있는 서브유닛 조합을 결정하기 위한 것이다. 오프타겟 효과가 최소이고 목적하는 표적에서 활성인 화합물의 발견을 보조하기 위해 복수의 표적 서브타입에서의 화합물들의 활성을 신뢰성 있게 평가하는 병행 스크리닝을 위한 HTS에 다른 패널을 사용할 수 있다.
패널은 임의의 목적하는 단백질 그룹을 포함할 수 있으며, 그러한 모든 패널은 본 발명에 포함된다.
패널에 대해 상이한 세포주를 연속적으로, 동시에 또는 이둘의 조합으로 형성함으로써 본 발명의 매칭 패널을 생성할 수 있다. 예를 들어, 각 세포주를 개별적으로 제조한 다음 이들을 매칭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포주 사이의 차이를 최소화하기 위해서 연속 형성된 세포주를 동일 단계 또는 계대수에서 동결시키고 동시에 해동시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포주를 동시에 만든다.
바람직한 구체예에서, 패널의 세포주를 동시에 스크리닝하고 분석한다.
본 발명에 따르면, 동일한 배양 배지, 온도 등에 한정되지 않는 조건을 포함하는 동일한 세포 배양 조건에서 매칭 패널의 세포주를 유지한다. 패널의 모든 세포주를 동일한 주파수에서 계대배양하며, 상기 주파수는 세포형, 성장 속도를 포함하는 여러 인자에 따라서 임의의 목적하는 주파수일 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, 패널의 세포주별로 대략 동일한 수의 세포를 유지하기 위해서 세포수를 주기적으로 정규화해야 한다.
이 방법에 따르면, 성장 속도를 측정하는 단계 이전에 각 배양물에 세포 또는 세포주가 분산되어 있는 한, 세포를 임의의 세포 배양물 형태로 배양할 수 있다. 예를 들어, 편의상, 세포를 원하는 조건 하에서 배양하기 위해서 초기에 모은 다음 각 세포를 웰 또는 용기당 하나의 세포로 분리할 수 있다.
임의의 편리한 수의 웰을 포함하는 멀티웰 조직 배양 플레이트에서 세포를 배양할 수 있다. 상기 플레이트는 상업적으로 용이하게 입수할 수 있으며, 당업자들에게 잘 알려져 있다. 일부 경우에, 세포는 바람직하게는 바이알에서 배양하거나, 또는 임의의 다른 편리한 형태로 배양할 수 있으며, 각종 형태는 당업자들에게 알려져 있으며 상업적으로 용이하게 입수할 수 있다.
성장 속도를 측정하는 단계를 포함하는 구체예에서, 성장 속도 측정 이전에, 배양 조건에 적응시키기 위해서 충분한 시간 동안 세포를 배양한다. 당업자들이 이해하는 바와 같이, 시간은 여러가지 인자, 예컨대 세포형, 선택된 조건, 배양 형태에 따라 달라지며, 1일 내지 수일, 1주 또는 그 이상의 임의의 양의 시간일 수 있다.
바람직하게는, 복수의 별도 세포 배양물 중의 각각의 개별 배양물을, 표준화된 유지 스케줄을 포함하는 하기 논의된 실질적으로 동일한 조건 하에 유지한다. 이 방법의 또 다른 유리한 특징은 다수의 개별 배양물을 동시에 유지할 수 있어서, 원하는 형질 세트를 가지는 세포를 매우 희귀하더라도 동정할 수 있다는 것이다. 이들 및 다른 이유로, 본 발명에 따라서, 각 웰에 대한 조건이 실질적으로 동일하도록 자동화된 세포 배양법을 이용하여 복수의 별도 세포 배양물을 배양한다. 자동식 세포 배양은 수동식 세포 배양에 특징적인 피할 수 없는 편차를 막을 수 있다.
임의의 자동화된 세포 배양 시스템을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 다수의 자동화된 세포 배양 시스템은 시판되며, 당업자들이 잘 알 것이다. 일부 구체예에서, 자동화 시스템은 로봇 시스템이다. 바람직하게는, 상기 시스템은 독립적으로 가동되는 채널, 다채널 헤드(예, 96-팁 헤드) 및 그립퍼 또는 체리-픽킹 암 및 과정 중에 무균성을 유지하기 위한 HEPA 여과 장치를 포함한다. 피펫터의 채널수는 배양 형태에 대해 적절해야 한다. 편리한 피펫터는 예컨대 채널이 96개 또는 384개이다. 그러한 시스템은 공지되어 있으며, 시판된다. 예를 들어, MICROLAB STAR™ 기기(Hamilton)를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 자동화 시스템은 원하는 각종 세포 배양 업무를 수행할 수 있어야 한다. 그러한 업무는 당업자들이 알 것이다. 이들은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 배지 제거, 배지 교체, 시약 첨가, 세포 세척, 세척액 제거, 분산제 첨가, 배양 용기로부터 세포 제거, 배양 용기로의 세포 첨가 등.
본 발명의 세포 또는 세포주의 생성은 많은 수의 별도 세포 배양물을 포함할 수 있다. 그런데, 상기 방법에 의해 제공되는 장점은 세포수가 증가함에 따라 증가한다. 이 방법에 이용될 수 있는 개별 세포 배양물 또는 세포의 수에 대한 이론적인 상한값은 없다. 본 발명에 따르면, 개별 세포 배양물의 수는 2 이상일 수 있지만, 더욱 유리하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 개별 세포 배양물, 예컨대 12 이상, 15 이상, 20 이상, 24 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 48 이상, 50 이상, 75 이상, 96 이상, 100 이상, 200 이상, 300 이상, 384 이상, 400 이상, 500 이상, 1000 이상, 10,000 이상, 100,000 이상, 500,000 이상일 수 있다.
일부 구체예에서, 개시된 바와 같이 배양된 본 발명의 세포 및 세포주는 목적하는 핵산에 대해 양성인 것으로 이전에 선택된 세포로서, 상기 핵산은 목적 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 도입 핵산 또는 목적 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열의 전사를 활성화시키는 도입 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 배양되는 세포는 목적 단백질을 코딩하는 mRNA에 대해 양성인 것으로 선택된 세포이다.
본 발명의 세포 및 세포주를 만들기 위해서, 예를 들어 U.S. 특허 6,692,965호 및 WO/2005/079462호에 개시된 방법을 이용할 수 있다. 이들 문헌 둘다는 그 전문이 참고로 본 명세서 중에 포함된다. 이 방법은 수백만 세포를 실시간 평가하여 임의의 원하는 수의 클론(수백 내지 수천 클론)을 제공한다. 세포 분류 기술, 예컨대 유세포분석 세포 분류법(예, FACS 기기 이용) 또는 자기 세포 분류법(예, MACS 기기 이용)을 이용하면, 높은 통계학적 신뢰 수준으로 배양 용기(예, 96웰 배양 플레이트)에서 웰당 하나의 세포가 자동적으로 부착된다. 상기 기술의 속도 및 자동화로 다중유전자 재조합 세포주를 쉽게 분리할 수 있다.
이 기술을 사용하면, 분자 비콘 또는 형광 프로브라고도 언급되는, 신호전달 프로브를 이용하여 목적 단백질에 대한 RNA 서열을 검출할 수 있다. 일부 구체예에서, 코딩 서열을 포함하는 벡터는 RNA 태그 서열을 코딩하는 추가 서열을 가진다. "태그 서열"은 신호전달 프로브에 의해 검출하고자 하는 RNA의 일부 또는 발현된 RNA인 핵산 서열을 의미한다. 신호전달 프로브는 각종 RNA 서열을 검출할 수 있으며, 상기 개시된 펩티드 및 단백질 태그를 코딩하는 것들을 포함하여, 이중 임의의 것을 태그로서 사용할 수 있다. 태그 서열에 상보적인 부분을 포함하도록 프로브를 디자인하여 태그에 대한 신호전달 프로브를 유도할 수 있다. 태그 서열은 목적 단백질의 전사체와 함께 공동전사되고 신호전달 프로브 결합을 위한 표적 서열을 포함하는 플라스미드의 3' 비번역 영역일 수 있다. 태그 서열은, 생성된 단백질을 태그하기를 원하는지에 따라서, 유전자 메시지의 단백질 코딩 부분과 틀 내에 또는 틀 밖에 존재할 수 있다. 따라서, 태그 서열은 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 번역되어야 하는 것은 아니다. 태그 서열은 동일하거나 상이한 복수의 표적 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 신호전달 프로브는 각 표적 서열에 하이브리드화한다. 태그 서열은 목적 유전자를 코딩하는 RNA내에 위치하거나, 또는 태그 서열은 5'- 또는 3'-비번역 영역 내에 위치할 수 있다. 태그 서열은 2차 구조를 가지는 RNA일 수 있다. 이 구조는 3-아암 접합 구조일 수 있다. 일부 구체예에서, 신호전달 프로브는 목적 단백질에 대한 코딩 서열 내의 서열을 검출한다.
DNA 구성체의 세포로의 형질감염과 후속 약물 선별(사용된 경우) 후에, 또는 유전자 활성화 후에, 각각이 상이한 태그 서열로 표적화되고 차등 표지되는 분자 비콘(예, 형광 프로브)을 세포에 도입할 수 있으며, 유세포분석 세포 분류기를 사용하여 그 신호에 대해 양성인 세포를 단리한다(복수회의 분류를 실시할 수 있음). 일 구체예에서, 유세포분석 세포 분류기는 FACS 기기이다. 레이저 작동 분석 및 처리를 이용한 음성 세포의 레이저 삭마 또는 MACS(자기 세포 분류)를 또한 사용할 수 있다. 고처리량 스크리닝에 적합한 것들을 포함하는 다른 형광 플레이트 리더를 또한 사용할 수 있다. 신호 양성 세포를 취하여 이들의 게놈 내에 도입된 서열(들)의 하나 이상의 카피를 통합시킬 수 있다. 이어서, 목적 단백질에 대한 메시지가 도입된 세포를 동정한다. 예로서, 코딩 서열을 세포의 게놈 내의 상이한 위치에서 통합시킬 수 있다. 도입 서열의 발현 수준은 카피의 수 또는 통합 부위에 따라서 달라질 수 있다. 또한, 목적 단백질을 포함하는 세포를 얻을 수 있으며, 이 때 도입된 핵산 중 하나 이상은 에피솜이거나 또는 유전자 활성화로부터 얻어진다.
본 발명에 유용한 신호전달 프로브는 당업자에게 알려져 있으며, 일반적으로 프로브가 표적 서열에 결합하지 않으면 신호가 방출되지 않고 프로브가 표적 서열에 결합하면 신호가 방출되도록 배열된 신호 방출 시스템과 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 신호전달 프로브는 소광기 및 형광단이 함께 미결합 프로브에 있도록 프로브내 배치된 소광기 및 형광단을 포함할 수 있다. 프로브와 표적 서열의 결합시, 소광기와 형광단이 분리되어 신호가 방출된다. 예를 들어, 국제 공개공보 WO/2005/079462호는 본 세포와 세포주의 생성시 사용될 수 있는 다수의 신호전달 프로브를 개시한다. 핵산을 세포 내로 도입하기 위해 상기 개시된 방법을 이용하여 신호전달 프로브를 도입할 수 있다.
태그 서열이 사용되는 경우, 각 벡터(복수의 벡터가 사용된 경우)는 동일하거나 또는 상이한 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열이 동일하든 또는 상이하든, 신호전달 프로브는 각 서브유닛의 발현이 별도로 검출될 수 있도록 상이한 신호 방출자, 예컨대 상이한 색상의 형광단 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1의 목적 mRNA를 특이적으로 검출하는 신호전달 프로브는 적색 형광단을 포함할 수 있고, 제2의 목적 mRNA를 검출하는 신호전달 프로브는 녹색 형광단을 포함할 수 있으며, 제3의 목적 mRNA를 검출하는 신호전달 프로브는 청색 형광단을 포함할 수 있다. 당업자는 삼중으로 형질감염된 세포에서 신호전달 프로브로 3개의 서브유닛의 발현을 차별적으로 검출하기 위한 다른 수단을 알 것이다.
일 구체예에서, 목적 단백질을 코딩하는 RNA의 부분 또는 5' 또는 3' 비번역 영역의 부분에 상보적이 되도록 신호전달 프로브를 디자인한다. 목적하는 메신저 RNA를 인식하도록 디자인된 신호전달 프로브가 가짜로 내생성 발현 표적 서열을 검출할 수 있다고 하더라도, 형질감염된 세포가 생성하는 목적 서열의 비율과 비교하여 이들의 비율은, 분류기가 2종의 세포형을 구별할 수 있게 한다.
목적 단백질의 발현 수준은 세포마다 또는 세포주마다 다를 수 있다. 세포 또는 세포주의 발현 수준은 또한 DNA 메틸화 및 유전자 침묵 및 이식유전자 카피의 손실과 같은 후성유전(epigenetic) 사건으로 인해 경시적으로 감소할 수 있다. 이들 변화는 각종 인자, 예컨대 세포에 의해 취해진 이식유전자의 카피수, 이식유전자의 게놈 통합 부위, 및 게놈 통합후 이식유전자의 보존성에 기인할 수 있다. FACS 또는 다른 세포 분류법(즉, MACS)를 사용하여 발현 수준을 평가할 수 있다. 신호전달 프로브를 도입하는 추가의 라운드를 사용하여, 예를 들어 본래 분리되었던 하나 이상의 RNA에 대해 세포가 경시적으로 양성인지 여부와 그 범위를 측정할 수 있다.
경우에 따라서, 성장 속도 그룹 중 하나 이상의 그룹에 대해 배양물의 하나 이상의 복제물 세트를 준비할 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어 동결 스톡으로서 기능하는 하나 이상의 성장 빈(bin)의 복제물 세트를 동결시키는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 상기 방법에 따르면 제조 과정 중 여러 지점에서 원하는 횟수로 임의의 시점에서 동결된 세포 스톡을 제조할 수 있다. 세포 배양물을 동결시키는 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 복제물 세트를 임의의 온도, 예를 들어 -70℃ 내지 -80℃에서 동결시킬 수 있다. 일 구체예에서, 70-100% 세포포화도에 도달할 때까지 세포를 배양하였다. 이어서, 배지를 흡인하고 90% FBS 및 10% 배지 용액을 플레이트에 첨가하고, 격리하고 동결시켰다.
본 발명은 상이한 배양 조건을 이용하여 많은 수의 복제물 세트로 본 방법을 수행하는 것을 포함한다. 즉, 제1 세트의 배양 조건 하에서 제1의 복수(세트)의 개별 세포 배양물, 및 제1 조건과 상이한 제2 세트의 조건 하에서 배양된 제2 세트의 개별 세포 배양물 등, 임의의 목적하는 수의 조건 세트에 대해 본 방법을 실시할 수 있다. 상이한 세트의 조건을 사용한 방법을 동시에 또는 순차적으로 또는 이둘을 조합하여(예, 2 세트를 동시에 실시한 후 2 이상의 세트는 후속 실시하는 등) 실시할 수 있다.
목적 단백질의 일관된 기능적 발현 세포를 선택하기 위해 본 명세서 중에 개시된 방법의 한 장점은, 세포내 특정 핵산의 존재에 의해서가 아니라 기능에 의해서 세포가 선택된다는 것이다. 목적 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포는 이를 발현하지 않을 수 있거나, 또는 단백질이 생성되더라도, 여러 가지 이유로 단백질이 기능적이지 않거나 또는 "천연" 기능, 즉 단백질을 자연적으로 발현하는 정상 상황에서 세포 내에서의 기능과 비교하여 기능이 변경될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 기능에 기초하여 세포를 선택함으로써, 신규 기능성 형태를 확인할 수 있게 한다. 예를 들어, 동일한 테스트 화합물 또는 일련의 화합물들을 사용하는 것과 같이, 동일한 분석에서 다양한 정도의 기능을 가지는 복수의 세포를 확인할 수 있다. 상이한 기능은 일련의 기능적 "프로파일"을 제공한다. 그러한 프로파일은, 예를 들어 단백질의 상이한 기능적 형태에 차등적으로 영향을 미치는 화합물들을 확인하는데 유용하다. 그러한 화합물들은 특정 조직 또는 질병 상태에서 단백질의 기능적 형태 등을 확인하는데 유용하다.
목적하는 복수의 단백질 또는 복합 단백질을 발현하는 세포를 포함하여 본 발명의 세포 및 세포주를 제조하는 방법의 추가 장점은, 통상의 방법에 의한 것보다 유의적으로 짧은 시간 내에 세포를 생성할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 기능적 분석에 필요한 세포의 수를 포함하여 여러 인자, 성장 속도 비닝이 실시되는지 여부, 및 다른 인자에 따라서, 명백하게 기능적 단백질을 발현하는 세포를 2일내 또는 1주일 내에 생성할 수 있지만, 심지어 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 또는 심지어 6개월의 생성 시간도 복합 또는 다중 단백질에 대해서는 통상적인 방법으로 가능한 것보다 유의적으로 빠른 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세포 및 세포주를 사용하는 방법을 제공한다. 목적하는 기능성 단백질이 필요한 임의의 용도에서 본 발명의 세포 및 세포주를 사용할 수 있다. 세포 및 세포주는, 예를 들어 시험관내 세포계 분석 또는 세포가 동물(예, 인간 이외의 포유동물)에게 이식된 생체내 분석에서, 예를 들어 조절인자의 스크리닝; 결정학 및 결합 연구용 단백질 생성; 및 화합물 선택성 및 투약, 수용체/화합물 결합 역학 및 안정성과, 세포 생리학(예, 전기생리학, 단백질 트래픽킹, 단백질 폴딩 및 단백질 조절)에 대한 수용체 발현의 효과 조사를 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 세포 및 세포주를 넉다운 연구에 사용하여 목적 단백질의 역할을 조사할 수 있다.
또한 본 발명의 세포 및 세포주는 가용성 생물학적 경쟁자 확인, 기능성 분석, 바이오 패닝(예, 파지 디스플레이 라이브러리 사용), 유전자 발현에서의 결과적 변화를 평가하기 위한 유전자 칩 연구, 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 2-하이브리드 연구, 그 역할을 평가하기 위한 세포주에서의 특정 서브유닛의 넉다운, 전기생리학, 단백질 트래픽킹 연구, 단백질 폴딩 연구, 단백질 조절 연구, 단백질에 대한 항체 생성, 단백질에 대한 프로브 단리, 단백질에 대한 형광 프로브 단리, 전체 유전자 발현/프로세싱에 대한 단백질 발현의 효과 연구, 전체 단백질 발현 및 프로세싱에 대한 단백질 발현의 효과 연구, 및 세포 구조, 성질, 특성에 대한 단백질 발현의 효과 연구를 위해 사용될 수 있다.
나아가 본 발명의 세포 및 세포주는 DNA, RNA 또는 단백질 화학양론, 단백질 폴딩, 어셈블리, 막 통합 또는 표면 제시, 형태, 활성 상태, 활성화 퍼텐셜, 반응, 기능 및 세포계 분석 기능을 비롯하여 목적 단백질(DNA, RNA 또는 단백질)을 특성화하는데 유용하며, 상기 목적 단백질은 다중유전자 시스템, 복합체, 또는 경로를 포함하며, 이는 이들의 모든 성분이 세포로 도입된 하나 이상의 표적 유전자 또는 도입되고 내생성으로 발현되는 서열의 임의의 조합에 의해서 제공되는지 여부와 무관하다.
본 발명으로 목적 단백질을 발현하는 다중 세포주를 제조할 수 있다. 본 발명의 클로날 세포주는 절대적 및 상대적 발현 수준이 다를 것이다. 그러한 클론의 거대 패널을 다수의 공지된 기준 화합물을 이용하여 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 방식으로, 각각의 단리된 세포주는 단백질의 차등 기능적 발현의 활성을 나타내는 시험 화합물에 대한 반응의 "핑거프린트"를 가질 것이다. 그 다음 화합물에 대한 그러한 반응의 유사성에 기초하여 세포주를 그룹핑할 수 있다. 각각 기능적으로 구별되는 발현 프로파일을 나타내는 하나 이상의 세포주를 추가 연구를 위해 선택할 수 있다. 그 다음 이들 세포주의 컬렉션을 사용하여 다수의 화합물을 스크리닝할 수 있다. 이렇게 하여, 단백질의 상응하는 다른 기능적 형태 중 하나 이상을 선택적으로 조절하는 화합물을 동정할 수 있다. 이후 이들 조절인자를 2차 분석 또는 생체내 모델에서 테스트하여 어떤 것이 이들 분석 또는 모델에서 활성을 나타내는 지를 정할 수 있다. 이와 관련하여, 단백질의 상응하는 기능적 형태가 존재하거나 또는 사용된 2차 분석 또는 모델 시스템에서 역할을 할 수 있는지를 확인하기 위해서 기준 화합물로서 조절인자를 사용한다. 그러한 테스트를 이용하여 생리적으로 관련될 수 있는 것뿐 아니라 생체 내에 존재할 수 있는 단백질의 기능적 형태를 결정할 수 있다. 이들 조절인자는, 기능적으로 다른 형태 중 어떤 것이 질병과 같은 특정 표현형 또는 생리적 기능에 연관되는지를 구별하기 위해 사용될 수 있다.
이 방법은 잘 특성규명되지 않은 단백질에 대한 세포주를 형성할 때 또한 유용하다. 그러한 단백질의 경우, 기존 화합물에 대한 기능적 반응의 성질에 관한 정보는 거의 없다. 클론의 활성을 평가하기 위한 확립된 기능적 벤치마크가 없다는 것은 생리적으로 적절한 세포주를 생성하는데 있어서 하나의 문제가 될 수 있다. 상기 개시된 방법은 그러한 정보가 결여되어 있는 잘 특성규명되지 않은 단백질에 대해서도 생리적으로 적절한 세포주를 얻는 방법을 제공한다. 생리적으로 적절한 형태의 단백질을 포함하는 세포주는, 단백질을 포함하는 유전자 발현으로부터 생길 수 있는 다수의 또는 모든 기능적 형태를 나타내는 클론을 추구함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 세포 및 세포주를 사용하여 단백질의 생체내 형태의 정체와 각종 조절인자에 대한 반응에 기초한 단백질의 알려진 형태의 정체를 관련지어서 상이한 병리에서의 상이한 형태의 목적 단백질의 역할을 확인할 수 있다. 이로 인해서, 단백질과 관련된 병리의 고도의 표적 치료를 위해 질병 특이적 또는 조직 특이적 조절인자를 선별할 수 있다.
조절인자를 확인하기 위해서, 본 발명의 세포 또는 세포주를 단백질이 기능성일 것으로 예상되는 조건 하에 테스트 화합물에 노출시킨 다음, 적절한 대조군, 예컨대 테스트 화합물에 노출되지 않은 세포와 비교한 단백질 활성의 통계적으로 유의적인 변화(예, p<0.05)를 검측한다. 기존의 작동제 또는 길항제 및/또는 목적 단백질을 발현하는 세포를 이용한 양성 및/또는 음성 대조군도 사용할 수 있다. 당업자는 각종 분석 매개변수, 예컨대 신호 대 노이즈 비율이 최적화될 수 있음을 알 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주를 복수의 테스트 화합물, 예컨대 테스트 화합물의 라이브러리에 노출시킨다. 목적 단백질의 하나 이상의 조절인자를 확인하기 위해서 본 발명의 세포주를 사용하여 테스트 화합물의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 상기 테스트 화합물은 소형 분자, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드 모방체, 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 천연 화합물, 합성 화합물, 추출물, 지질, 계면활성제 등을 포함하는 화학적 부분일 수 있다. 항체의 경우, 비인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 항체는, 항체 단편(예, Fab 및 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 등), 단일쇄 항체(scFV), 단일 도메인 항체, 중쇄 또는 경쇄 가변부 전부 또는 항원 결합 부분을 포함하여, 임의의 항체의 중쇄 및 경쇄의 전체 보체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 온전한 항체일 수 있다.
일부 구체예에서, 테스트 화합물에의 노출 이전에, 본 발명의 세포 또는 세포주를, 포유동물 또는 기타 동물 효소, 식물 효소, 박테리아 효소, 단백질 변형 효소 및 지질 변형 효소를 포함하는 효소로 전처리하여 변형시킬 수 있다. 그러한 효소는, 예를 들어 키나아제, 프로테아제, 포스파타제, 글리코시다제, 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 리가제 박테리아 프로테아제, 위장 유래의 프로테아제, GI관 유래의 프로테아제, 타액의 프로테아제, 구강의 프로테아제, 라이솔 세포/박테리아 유래의 프로테아제 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포 및 세포주를 먼저 테스트 화합물에 노출시킨 다음 효소 처리하여 상기 처리에 의해 단백질의 변형을 변경하는 화합물을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포계, 기능적, 고처리량 스크린(HTS)에서, 예컨대 96웰, 384웰, 1536웰 또는 더 높은 밀도의 형태를 이용하여 거대 화합물 컬렉션을 단백질 조절 활성에 대해 테스트한다. 일부 구체예에서, 테스트 화합물의 라이브러리를 포함하는 테스트 화합물 또는 복수의 테스트 화합물을, 본 발명의 하나 이상의 세포 또는 세포주를 이용하여 스크리닝할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 세포 및 세포주는 목적 단백질의 조절인자에 대한 감도를 증가시킨다. 본 발명의 세포 및 세포주는 또한 단백질에 대해 생리학적 EC50 또는 IC50 범위 값으로 조절인자에 반응한다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, EC50은 세포 또는 세포주에서 최대 값의 1/2 활성화 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 나타낸다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, IC50은 세포 또는 세포주에서 최대 값의 1/2 억제 반응을 유도하는데 필요한 화합물 또는 물질의 농도를 나타낸다. EC50 및 IC50 값은 당업계에 잘 알려진 기술, 예컨대 화합물 또는 물질의 농도를 단백질 발현 세포주의 반응에 관련짓는 용량-반응 곡선을 이용하여 정할 수 있다.
본 발명의 세포 및 세포주의 추가의 유리한 성질은, 이들 세포 및 세포주를 사용한 초기 스크리닝에서 확인된 조절인자가 2차 기능적 분석에서도 기능적이라는 것이다. 당업자들이 이해하는 바와 같이, 통상적으로 초기 스크리닝 분석에서 확인된 화합물은, 예컨대 조합 화학, 의약 화학 또는 합성 화학에 의해서, 2차 기능적 분석에서 유도체 또는 유사체가 기능적이 되기 위해서 변형되어야 한다. 그러나, 본 발명의 세포 및 세포주의 높은 생리적 적절성으로 인하여, 이들 세포 및 세포주를 이용하여 확인된 여러 화합물들은 추가의 변형없이도 기능적이다. 일부 구체예에서, 초기 분석에서 확인된 조절인자 중 적어도 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상이 2차 분석에서 기능적이다. 또한, 본 발명의 세포주는 "골드 스탠다드" 분석과 같은 수준의 기능적 분석에서 작용한다. 예를 들어, GABA A 수용체를 발현하는 본 발명의 세포주는 막 전위(membrane potential) 분석 및 전기생리학에서 실질적으로 동일하게 작동한다.
본 발명의 이들 및 기타 구체예들은 하기 비제한적인 실시예에 추가로 예시될 것이다.
실시예
실시예 1: 안정한 GABA A - 발현 세포주의 형성
발현 벡터 형성
스트림라인 클로닝이 가능한 플라스미드 발현 벡터는 pCMV-SCRIPT (Stratagene)에 기초하여 형성하였으며, 하기를 포함하여 목적 유전자의 전사 및 번역을 위해 필요한 각종 필수 성분을 포함하였다: CMV 및 SV40 진핵 프로모터; SV40 및 HSV-TK 폴리아데닐화 서열; 다중 클로닝 부위; 코자크 서열; 및 네오마이신/카나마이신 내성 카세트.
단계 1 - 형질감염
본 발명자들은 293T 및 CHO 세포를 모두 형질감염시켰다. 이 실시예는 CHO 세포에 중점을 두었으며, CHO 세포를 하기의 조합으로 3개의 별도 플라스미드로 동시형질감염시켰는데, 플라스미드 중 하나는 인간 GABA 알파 서브유닛을 코딩하고(서열 번호 GABA1-GABA4), 하나는 인간 GABA 베타 3 서브유닛을 코딩하고(서열 번호 GABA5), 다른 하나는 인간 GABA 감마 2 서브유닛을 코딩한다(서열 번호 GABA6): α1β3γ2s (α1), α2β3γ2s (α2), α3β3γ2s (α3) 및 α5β3γ2s (α5). 당업자가 이해하는 바와 같이, 선택된 숙주 세포와 함께 사용하기 적절한 임의의 시약을 이용하여 핵산, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 표지된 올리고뉴클레오티드를 적절히 최적화한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 리포펙타민, 리포펙타민 2000, 올리고펙타민, TFX 시약, 푸젠 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 펙투린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 약물 선별은 선택사항이지만, 플라스미드당 하나의 약물 내성 마커를 포함시켰다. 이 서열은 CMV 프로모터의 조절 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 태그를 코딩하는 비번역 서열이 또한 약물 내성 마커를 코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 GABA 표적 서열 1(서열 번호 GABA7), GABA 표적 서열 2(서열 번호 GABA8) 및 GABA 표적 서열 3(서열 번호 GABA9)이었다. 이들 실시예에서, GABA 알파 서브유닛 유전자 함유 벡터는 GABA 표적 서열 1을 포함하고, GABA 베타 서브유닛 유전자 함유 벡터는 GABA 표적 서열 2를 포함하며, GABA 감마 서브유닛 유전자 함유 벡터는 GABA 표적 서열 3을 포함하였다.
단계 2 - 선별 단계
형질감염된 세포를 HAMF12-FBS에서 2일간 증식시킨 후 항생제 함유 HAMF12-FBS에서 14일간 증식시켰다. 항생제 함유 기간에는 다음과 같이 배지에 첨가된 항생제가 있었다: 푸로마이신(3.5 ug/ml), 하이그로마이신(150 ug/ml) 및 G418/네오마이신(300 ug/ml)
단계 3 - 세포 계대배양
항생제 선별 후에 그리고 형광 프로브의 도입 전에, 침강을 위해 선택된 시간 동안 안정하지 않은 발현 시간을 허용하도록 항생제의 부재 하에 세포를 6회 내지 28회 계대배양하였다.
단계 4 - 형광 프로브에의 세포 노출
세포를 수거하고 GABA 신호전달 프로브(서열 번호 GABA10- GABA12)로 형질감염시켰다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 선택된 숙주 세포와 함께 사용하기 적절한 임의의 시약을 이용하여 핵산, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 표지된 올리고뉴클레오티드를 적절히 최적화한 숙주 세포에 도입할 수 있다. 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 리포펙타민, 리포펙타민 2000, 올리고펙타민, TFX 시약, 푸젠 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 펙투린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
GABA 신호전달 프로브 1은 GABA 표적 서열 1에 결합하고, GABA 신호전달 프로브 2는 GABA 표적 서열 2에 결합하며, GABA 신호전달 프로브 3은 GABA 표적 서열 3에 결합한다. 그 다음 분석을 위해 세포를 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기(하기)를 사용하여 분류하였다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
GABA 표적 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 GABA7 ) (알파 서브유닛)
GABA 표적 2
5'-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3' (서열 번호 GABA8 ) (베타 서브유닛)
GABA 표적 3
5'-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3' (서열 번호 GABA9 ) (감마 서브유닛)
신호전달 프로브
100 μM 스톡으로서 제공
Cy5와 스펙트럼 성질이 유사한 Quasar Dye (BioSearch)를 사용한 유사한 프로브를 특정 실험에 사용하였다. DNA 프로브보다는 5-MedC 및 2-아미노dA 믹스머(mixmer) 프로브를 일부 예에서 사용하였음에 주의한다.
GABA 신호전달 프로브 1 - ( GABA 표적 1) 결합
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 GABA10 )
GABA 신호전달 프로브 2 - ( GABA 표적 2) 결합
5'- Cy5 .5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 GABA11 )
BHQ3은 프로브 1 또는 프로브 2의 금 입자 또는 HBQ2로 치환될 수 있다.
GABA 신호전달 프로브 3 - ( GABA 표적 3) 결합
5'- Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 소광기 -3'' (서열 번호 GABA12 )
BHQ1은 프로브 3의 Dabcyl 또는 BHQ2로 치환될 수 있다.
단계 5 - 양성 세포의 단리
세포를 해리시키고 분석을 위해 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 분류하였다. 표준 분석적 방법을 이용하여 배경 위의 세포 형광을 게이팅하고 게이트 내에 속하는 각 세포를 바코드 96웰 플레이트로 분리하였다. 게이팅 분류 체계는 다음과 같다: 게이팅 분류 체계: 동시 게이트 > 싱글렛 게이트 > 라이브 게이트 > 분류 게이트. 게이팅 방법을 이용하면, 삼중 양성 세포의 윗쪽 0.04 내지 0.4%가 바코드 96웰 플레이트로의 분류를 위해 표시되었다.
단계 6 - 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
단계 1 내지 5 및/또는 3-5를 반복하여 더 많은 수의 세포를 얻었다. 단계 1-5의 2회 독립적인 라운드를 완료하고, 이들 사이클 각각에 대해서 단계 3-5의 3 이상의 내부 사이클을 전체 독립적인 라운드에 대해 실시하였다.
단계 7 - 세포군에 대한 성장 속도 평가
상기 플레이트를 Hamilton Microlabstar 자동화 액체 조작기로 옮겼다. 세포를 2-3일 조정한 성장 배지: 100 단위 페니실린/ml + 0.1 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 새로운 성장 배지(성장 배지는 Ham의 F12/10%FBS임)의 1:1 혼합물에서 5-7일 동안 항온처리한 다음, 덩어리를 최소화하기 위해서 0.25% 트립신으로 트립신처리하여 분산시키고 새로운 96웰 플레이트에 옮겼다. 클론을 분산시킨 후에, 플레이트를 이미지화하여 웰의 세포포화도를 측정하였다(Genetix). 플레이트의 신뢰성 있는 이미지 획득을 위해 각 플레이트에 초점을 맞추었다. 70% 이상의 보고된 세포포화도는 신뢰하지 않았다. 9일(분산후 1일 내지 10일) 동안 매 3회 세포포화도 측정값을 얻었으며, 이를 사용하여 성장 속도를 계산하였다.
단계 8 - 성장 속도 추정값에 따른 세포군의 비닝
단계 7의 분산 단계 후에 10-11일 동안 성장 속도에 따라서 세포를 비닝하였다(독립적으로 코호트로서 그룹핑 및 플레이팅하였다). 빈을 독립적으로 수거하고 후속 취급을 위해서 각 96웰 플레이트에 플레이팅하였으며, 특정 빈당 하나 이상의 표적 플레이트가 있을 수 있다. 성장 속도의 분포를 고려하고 세포군의 총수의 고비율(%)을 포괄하는 범위를 묶어서 빈을 계산하였다. 분류 반복(단계 5 참조)에 따라서, 1-4일 간격으로 5-6 성장 빈을 사용하였다. 따라서, 각 빈은 반복에 따라서 12 내지 14.4 시간의 군 배가 시간 또는 성장 속도에 해당하였다.
단계 9 - 대등한 프로세싱 속도 및 엄격한 QC 를 위한 레플리카 플레이팅
플레이트를 항생제 없이 Ham의 F12 배지/10% FBS에서 표준 및 고정 조건(가습 37℃, 5% CO2/95% 공기) 하에 항온처리하였다. 세포 플레이트를 나누어 표적 플레이트 4개의 세트(각 세트는 모든 성장 빈을 포함하는 모든 플레이트로 이루어지며 - 이들 단계는 초기 세트의 4 복제물이 존재하도록 함)를 생성하였다. 최대 2 표적 플레이트 세트를 냉동보존시키고(하기 참조), 남은 세트를 스케일에 따라 분류하고 계대배양 및 추가 분석 실험을 위해서 추가 레플리카 플레이팅하였다. 구별되는 독립적인 조직 배양 시약, 인큐베이터, 총원 및 이산화탄소 공급원을 각각 독립적으로 실시되는 플레이트 세트를 위해 사용하였다. 품질 관리 단계는 모든 조직 배양 시약의 품질 및 적당한 생산을 위해 실시되었다. 사용을 위해 준비된 각 배지병에 첨가된 각 성분을 지정 후드 내에서 지정된 사람이 상기 후드 내에서 그 시약만을 이용하여 첨가하는 동안, 제2의 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하였다. 액체 취급 조건을 정하여 벽을 통한 교차 오염을 제거하였다. 모든 단계를 위해 새로운 팁을 사용하거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜을 사용하였다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도 및 배치, 모든 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클 수 및 플레이트에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건을 정하였다.
단계 10 - 세포군의 조기 계대배양 스톡의 동결
2 이상의 플레이트 세트를 -70℃ 내지 -80℃에서 동결시켰다. 각 세트의 플레이트를 먼저 70 내지 100%의 세포 포화도(confluency)가 되도록 하였다. 배지를 흡인하고 90% FBS 및 10% DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉한 다음, 각각 1 내지 5 cm 발포체로 둘러쌓고, -80℃ 동결기에 넣었다.
단계 11 - VSF 를 생성하기 위한 초기 형질전환 단계를 위한 방법 및 조건
남은 플레이트 세트를 단계 9(상기)에 개시된 바와 같이 유지하였다. 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가 및 항온처리, 소광 및 세포 분산 단계를 포함하는 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 모든 세포 스플리팅을 실시하였다.
단계 12 - 임의의 남아있는 성장 속도의 편차를 보정하기 위한 정규화 방법
모든 세포군에 대해 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화를 조절하였다. 약간의 성장 속도차로 인한 플레이트 상의 임의의 차이는 플레이트 상의 세포 수의 주기적 정규화에 의해 조절할 수 있다.
단계 13 - 세포군의 특성화
세포를 세포 배양 6 내지 8주 동안 유지하여 이들 조건 하에서 시험관내 진화가 일어나도록 하였다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 취성, 트립신처리에 대한 반응 또는 해리, 해리 후 둥글기/평균 원형도, 생존율(%), 미세 세포포화도(microconfluency) 경향, 또는 세포 유지의 다른 측면, 예컨대 배양 플레이트 표면에의 부착성을 관찰하였다.
단계 14 - VSF 조건 하에서 세포군의 잠재적 기능성 평가
기능적 기준을 이용하여 세포군을 테스트하였다. 막 전위 분석 키트(Molecular Devices/MDS)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 96웰 또는 384 웰 플레이트에서 여러가지 다른 밀도로 세포를 테스트하고, 반응을 분석하였다. 플레이팅후 각종 시점, 예컨대 플레이팅후 12-48 시간을 사용하였다. 분석 반응 차이에 대해서 다른 플레이팅 밀도도 테스트하였다.
단계 15
낮은 및 더 높은 계대배양 수에서 실시한 실험으로부터 얻은 기능적 반응을 비교하여 3 내지 9주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 가지는 세포를 확인하였다. 형태, 미세 세포포화도 경향, 및 플레이팅후 배양 매트릭스에 부착하는 시간을 포함하여 경시적으로 변화된 세포의 다른 특징들도 주목된다.
단계 16
기능적 및 다른 기준을 만족하는 세포군은, 생존 가능하고, 안정하며 기능적인 세포주를 생성하기에 가장 좋은 것을 결정하기 위해서 추가로 평가하였다. 거대 조직 배양 용기에서 선택된 세포군을 증식시키고, 상기 개시된 특성화 단계를 이들 조건하에서 지속 또는 반복하였다. 이 시점에서, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해서 추가의 표준화 단계를 도입하였다. 이들은 상이한 플레이팅 세포 밀도, 계대배양 시간, 배양 접시 크기/형태 및 코팅, 유체공학 최적화, 세포 해리 최적화(유형, 사용된 부피 및 시간), 및 세척 단계를 포함하였다. 분석 Z' 스코어는 4주의 배양 기간 동안 매 수일마다 테스트할 때 안정하였다.
또한, 각 계대배양의 세포의 생존율을 측정하였다. 수동 개입을 증가시키고 세포를 면밀히 관찰하고 모니터링하였다. 이 정보는 목적하는 성질을 보유한 최종 세포주를 확인 및 선택하는데 도움이 되었다. 일관된 성장, 적절한 부착성 및 기능적 반응을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주를 선별하였다.
단계 17 - 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 저 계대배양 냉동 플레이트(상기 참조)를 37℃에서 해동하고, Ham의 F12/10% FBS로 2회 세척하고, 가습 37℃ /5% CO2 조건에서 항온처리하였다. 그 다음 2-3주 동안 세포를 증식시켰다. 각각 천만 세포를 포함하는 25 바이알로 이루어진 각각의 최종 및 백업 세포주에 대한 세포 은행을 확립하였다.
단계 18
세포 은행으로부터 얻은 하나 이상의 바이알을 해동하고 배양물에서 증식시켰다. 생성되는 세포를 테스트하여, 이들 세포가 처음 선택된 특성과 동일한 특성을 만족하는지를 확인하였다.
실시예 2: GABA 리간드에 대한 GABA A 세포주 반응의 검증
GABAA(α1β3γ2s (α1), α2β3γ2s (α2), α3β3γ2s (α3) 및 α5β3γ2s (α5)의 서브유닛 조합)를 발현하는 CHO 세포주의 내생성 GABAA 리간드인 GABA에 대한 반응을 평가하였다. GABA와 세포주의 상호작용은, 하기 프로토콜을 이용하여 GABA에 반응하는, GABAA의 막 전위를 측정하여 평가하였다.
세포를 24 시간 동안 플레이팅한 다음 성장 배지(Ham F-12 배지 + FBS 및 글루타민) 중에서 384웰 플레이트에서 웰당 10-25,000 세포로 분석하였다. 배지 제거 후에 로딩 완충액(137mM NaCl, 5mMKCl,1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코스)에 희석된 막 전위 염료를 첨가하였다. 1 시간 동안 항온처리한 후에, 고처리량 형광 플레이트 리더에 플레이트 로딩하였다(Hamamastu FDSS). GABA 리간드를 목적하는 농도로 MP 분석 완충액(137mM NaCl, 5mM KGluconate, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코스)에서 희석하여(필요에 따라 GABA 일련의 희석물을 형성하였으며, 사용된 농도는 다음과 같다: 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1uM, 3uM, 10uM), 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 90초간 판독하였다.
표 GABA1(하기)은 생성된 각 세포주가 GABA 리간드에 반응함을 입증한다. 이들 결과는, 예측한 바와 같이 내생성 리간드에 반응하는, 생성된 GABAA 세포주가 고처리량 스크리닝 분석에 사용하기에 생리적으로 적절하다는 것을 보여준다. 또한, 복제물 웰은 웰별로 정확한 EC50 값을 생성하는데, 이는 GABAA 세포주의 높은 재현성을 나타내는 것이다. 막 전위 분석을 사용하여 형성된 Z' 값은 α1β3γ2s 0.58, α2β3γ2s 0.67, α3β3γ2s 0.69 및 α5β3γ2s 0.62였다.
실시예 3: 기지의 GABA A 조절인자를 사용하는 GABA A 세포주의 추가의 검증
GABAA 세포주 및 막 전위 분석은 30uM, 10uM, 3uM, 1uM, 300nM, 100nM 및 30nM에서 비쿠쿨린(공지의 길항제)의 분석 완충액 중 일련의 희석물을 사용하여 실시예 2에 개시된 방법으로 검증하였다.
비쿠쿨린은 GABA의 EC50 농도의 존재 하에 모두 4종의 GABAA 세포주와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는, 예측한 바와 같이 기존의 GABAA 조절인자에 반응하는, 생성된 GABAA 세포주가 고처리량 스크리닝 분석에 사용하기에 생리적으로 그리고 약리학적으로 적절하다는 것을 보여준다.
실시예 4: 막 전위 분석을 이용한 천연 GABA A 기능을 위한 GABA A 를 발현하는 세포주의 특성화
LOPAC 1280(약리학적으로 활성인 화합물의 라이브러리)으로부터 입수한 1280 화합물과 GABAA(α1β3γ2s (α1), α2β3γ2s (α2), α3β3γ2s (α3) 및 α5β3γ2s (α5)의 서브유닛 조합)를 발현하는 CHO 세포주의 상호작용을 평가하였다(Sigma-RBI Prod. No. LO1280). LOPAC 1280 라이브러리는 문서에 의해 충분히 입증된 약리학적 활성을 가지는 고순도의 소형 유기 리간드를 포함하였다. 시험 화합물과 세포주의 상호작용은, 하기 프로토콜을 이용하여 시험 화합물에 반응하는, GABAA의 막 전위를 측정하여 평가하였다.
세포를 24 시간 동안 플레이팅한 다음 384웰 플레이트에서 성장 배지(Ham F-12 배지 + FBS 및 글루타민) 중에서 웰당 10-25,000 세포로 분석하였다. 배지 제거 후에 로딩 완충액(137mM NaCl, 5mMKCl, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코스)에 희석된 막 전위 염료를 첨가하였다. 1 시간 동안 항온처리한 후에, 고처리량 형광 플레이트 리더(Hamamastu FDSS)에 플레이트 로딩하였다. 시험 화합물을 목적하는 농도로 MP 분석 완충액(137mM NaCl, 5mM KGluconate, 1.25mM CaCl, 25mM HEPES, 10mM 글루코스)에서 희석하여(필요에 따라 각 시험 화합물의 일련의 희석물을 형성하였으며, 사용된 농도는 다음과 같다: 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1uM, 3uM, 10uM), 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 90초간 판독하였다.
결과
생성된 GABAA 세포주에 대한 각 화합물의 활성을 측정하고, GABA(내생성 리간드)와 유사하거나 또는 더 큰 활성을 나타내는 화합물을 양성 히트로서 기록하였다. 스크리닝한 1280종 화합물 중에서, 34종은 GABA보다 더 좋지는 않을 지라도, 또한 하나 이상의 세포주(즉, α1, α2, α3 및 α5)를 활성화시켰다. 생성된 GABAA 세포주와 이들 화합물 중 17종의 화합물의 상호작용이 하기 용량 반응 연구에서 확인되었다. GABA가 존재해야 하는 조절인자, 부분 작동제 및 저 효능 화합물은 리스트에 포함되지 않았다.
스크리닝 분석에서는 LOPAC 라이브러리의 GABAA 작동제 각각을 확인하였다: GABA(내생성 리간드), 프로포폴, 이소구바신 하이드로클로라이드, 뮤시몰 하이드로브로마이드, 피페리딘-4-설폰산, 3-알파,21-디하이드록시-5-알파-프레그난-20-온(뉴로스테로이드), 5-알파-프레그난-3알파-올-11,20-디온(뉴로스테로이드), 5-알파-프레그난-3알파-올-20-온(뉴로스테로이드) 및 트라카졸레이트. 그 결과는 생성된 GABAA 세포주가 생리적으로 적절한 방식으로 반응한다(예컨대 이들 세포주가 내생성 수용체의 길항제에 반응한다)는 것을 나타낸다. 이들 8종의 작동제에 대한 EC50 값을 측정하였으며, 표 GABA1(하기)에 포함되어 있다.
스크리닝 분석은 또한 본 발명자들이 주목한, GABA 작동제로서 개시되어 있지 않지만 GABAA와 관련된 다른 활성을 가지는 것으로 알려진 LOPAC 라이브러리의 4종의 화합물을 확인하였다: 에타졸레이트(포스포디에스터라제 억제제), 안드로스테론(스테로이드 호르몬), 클로르메자논(근이완제), 및 이베르멕틴(효과적인 염소 채널로 알려진 항기생충제). 이들 4종의 화합물에 대한 EC50 값을 측정하였으며, 표 GABA1(하기)에 요약하였다.
스크리닝 분석 결과, 지금까지 GABAA와 상호작용하는 것으로 알려지지 않은 LOPAC 라이브러리의 4종의 화합물을 추가로 확인하였다. 신규 화합물은 하기를 포함한다: 디피리미돌(아데노신 데아미나제 억제제), 니클로사미드(항기생충제), 타이르포신 A9(PDGFR 억제제), 및 1-오메-타이르포신 AG 538(IGF PTK 억제제). 이들 4종의 화합물에 대한 EC50 값을 측정하였으며, 표 GABA1(하기)에 요약하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 5: 전기생리학 분석을 사용한 천연 GABA A 기능에 대한 GABA A - CHO 세포의 특성화
하기 전압-클램프 프로토콜을 사용하였다: 막 전위를 -60 mV의 기본 전위로 고정하였다. 완충액으로 중간 세척하면서 GABA(0.10-100 μM) 농도 증가를 2초 적용하여 전류를 유발하였다.
100 μM GABA에 반응하는 α2, α3, 및 α5 GABAA 세포주와, GABA 농도 증가(0.10∼100 μM 로그 증분)에 반응하는 α1 GABAA 세포주에 대한 전체 세포 수용체 전류 트레이스는, 상기 개시된 고처리량 스크리닝 분석 외에 전통적인 전기생리학 분석에 GABAA 세포주를 사용할 수 있음을 확인시켜준다. 실시예 2의 막 전위 분석과 함께, 이들 전기생리적 분석 결과는, 생성된 GABAA 세포주가 생리적 및 약리학적으로 적절하다는 것을 확인시켜 준다. 전기생리학은 GABAA 수용체의 조절인자를 검출하는 신뢰성 있는 방법으로서 받아들여진다. 본 발명자들의 데이터는 본 발명의 세포주가 막 전위 분석을 이용하여 유사하게 신뢰성 있는 결과를 산출할 수 있다는 것을 제시한다. 종래 기술의 세포주는, 전기생리학보다 비용이 저렴하고 신속한 막 전위 분석을 효과적으로 이용하기에 충분히 신뢰성있거나 민감하지 않았다. 따라서, 본 발명의 세포주는 전기생리학을 이용하여 입수할 수 있는 것보다 휠씬 거대한 규모로 스크리닝을 할 수 있다(막 전위 분석을 이용하면 1일 10,000 분석이 가능한 반면, 전기생리학을 이용하면 1일 100 미만의 분석이 가능하다).
실시예 6: 할라이드 -민감성 meYFP 를 사용한 천연 GABA A 기능에 대한 세포내 판독 분석의 특성화
본 발명의 GABAA(α1β3γ2s (A1), α2β3γ2s (A2), α3β3γ2s (A3) 및 α5β3γ2s (A5) 서브유닛의 조합) 발현 CHO 세포의 테스트 화합물에 대한 반응은, 세포내 판독 분석에 대한 하기 프로토콜을 이용하여 평가하였다.
세포를 24 시간 동안 플레이팅한 다음 성장 배지(Ham F-12 배지 + FBS 및 글루타민) 중에서 384웰 플레이트에서 웰당 10-25,000 세포로 분석하였다. 배지를 제거한 후에 로딩 완충액(135mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10mM HEPES, 10mM 글루코스)을 첨가하고 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 이 분석 플레이트를 FDSS(Hamamatsu Corporation) 상에 로딩하였다. 시험 화합물(예, GABA 리간드)을 목적하는 농도로 분석 완충액(150mM NaI, 5mM KCl, 1.25mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25mM HEPES, 10mM 글루코스)에서 희석하여(필요에 따라 각 시험 화합물의 일련의 희석물을 형성하였으며, 사용된 유효 농도는 다음과 같다: 3nM, 10nM, 30nM, 100nM, 300nM, 1uM, 3uM, 10uM), 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 90초간 판독하였다.
GABA 리간드의 농도 증가에 반응하여, GABAA-meYFP-CHO 세포는 meYFP 신호의 소광 증가를 나타내었다. 이 소광을 이용하여 GABAA 활성화에 대한 용량 반응 곡선을 계산할 수 있다. 세포내 판독 분석에 의해 형성된 GABA 용량 반응 곡선은 실시예 3에 개시된 막 전위 블루 분석에 의해 형성된 곡선과 유사하다. 이들 데이터는 본 발명의 세포가 GABA의 조절인자를 결정하기 위해 세포내 판독 분석에서 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 8: 안정한 GC -C-발현 세포주의 형성
표준 기술을 이용하여 인간 GC-C 유전자(서열 번호 GCC3)를 코딩하는 플라스미드로 293T 세포를 형질감염시켰다. (핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.)
본 발명의 방법에서 약물 선별은 선택사항이지만, 인간 GC-C 유전자를 코딩하는 플라스미드에 하나의 약물 선별 마커를 포함시켰다. 이 GC-C 서열은 CMV 프로모터의 조절 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 태그를 코딩하는 비번역 서열이 또한 약물 선별 마커를 코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 GC-C 표적 서열 1(서열 번호 GCC1)이었다. 이 실시예에서, GC-C 유전자 함유 벡터는 GC-C 표적 서열 1을 포함하였다.
형질감염된 세포를 DMEM-FBS 중에서 2일간 증식시킨 후, 500 ㎍/ml 하이그로마이신 함유 DMEM-FBS 중에서 10일간, 남은 시간 동안 DMEM-FBS 중에서, (독립적인 단리에 따라서) 총 4-5주 동안 DMEM/10% FBS에서 증식시킨 다음, 신호전달 프로브를 첨가하였다.
항생제 농축 후에, 침강을 위해 선택된 시간 동안 안정하지 않은 발현 시간을 허용하도록 항생제의 부재 하에 세포를 8회 내지 10회 계대배양하였다.
표준 기법을 이용하여 세포를 수거하고 GC-C 신호전달 프로브 1(서열 번호 GCC2)로 형질감염시켰다. (핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.) 그 다음 세포를 해리시키고 분석을 위해 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
GC -C 신호전달 프로브 1에 의해 검출되는 GC -C 표적 서열 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 GCC 1)
GC -C 신호전달 프로브 1
(100 μM 스톡으로서 제공)
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2 -3' (서열 번호 GCC 2)
또한, Cy5와 스펙트럼 성질이 유사한 QUASAR® Dye (BioSearch)를 사용한 유사한 프로브를 특정 실험에 사용하였다. 일부 실험에서, DNA 프로브보다는 5-MedC 및 2-아미노 dA 믹스머를 사용하였다.
세포를 해리시키고 분석을 위해 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 분류하였다. 표준 분석적 방법을 이용하여 배경 위의 세포 형광을 게이팅하고 게이트 내에 속하는 각 세포를 바코드 96웰 플레이트로 단리시켰다. 하기 게이팅 분류 체계를 사용하였다:
플롯 FAM 대비 Cy5에서 동시 게이트 -> 싱글렛 게이트 -> 라이브 게이트 -> 분류 게이트: 생세포의 0.3%
상기 단계를 반복하여 다수의 세포를 얻었다. 상기 모든 단계를 2 라운드 실시하였다. 또한, 세포 계대배양, 신호전달 프로브에의 노출 및 형광 활성화된 세포 분류기에 의한 양성 세포의 단리 순서의 단계들을, 하나의 독립적인 형질감염 라운드에 대해 총 2회 실시하였다.
상기 플레이트를 MICROLAB STAR™ (Hamilton Robotics)로 옮겼다. 100 U 페니실린과 0.1 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된, 2-일-조정 성장 배지와 새로운 완전 성장 배지의 1:1 혼합물 100 ㎕에서 9일간 세포를 항온처리하고, 2회 트립신처리하여 덩어리를 최소화하도록 분산시키고, 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 이미지화하여 웰의 세포포화도를 결정하였다(Genetix). 플레이트의 신뢰성 있는 이미지 획득을 위해 각 플레이트에 초점을 맞추었다. 70% 이상의 보고된 세포포화도는 신뢰하지 않았다. 연속 3일 동안 세포포화도 측정값을 얻고, 이를 성장 속도를 계산하는데 사용하였다.
분산 단계 후에 3일 동안 성장 속도에 따라서 세포를 비닝하였다(독립적으로 코호트로서 그룹핑 및 플레이팅하였다). 4개의 성장 빈 각각을 개별 96웰 플레이트로 분리하였으며; 일부 성장 빈은 하나 이상의 96웰 플레이트를 형성하였다. 성장 속도의 분포를 고려하고 세포군의 총수의 고비율(%)을 포괄하는 범위를 묶어서 빈을 계산하였다. 성장 속도에서 12 시간차가 나도록 빈을 계산하였다.
세포는 배가 시간이 1일 미만 내지 2주 이상일 수 있다. 동시에 성장 속도에 따라서 적당하게 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위해서, 빈당 배가 시간이 0.25 내지 7일인 3-9개 빈을 사용하는 것이 바람직하다. 당업자는 특정 상황에 대해서 빈의 치밀성 및 빈의 수를 조정할 수 있고, 빈의 치밀성 및 수는, 세포가 세포 주기에 대해 동시에 진행된다면 추가로 조정될 수 있음을 알 것이다.
항생제 없이 표준화되고 고정된 조건(DMEM/FBS, 37℃, 5% CO2) 하에 플레이트를 항온처리하였다. 세포 플레이트를 스플리팅하여 5개 세트의 96웰 플레이트(동결을 위해 3세트, 분석을 위해 1 세트 및 계대배양을 위해 1세트)를 생성하였다. 구별되는 독립적인 조직 배양 시약, 인큐베이터, 총원 및 이산화탄소 공급원을 각 세트의 플레이트에 대해 작업 과정 중에 사용하였다. 품질 관리 단계는 모든 조직 배양 시약의 품질 및 적당한 생산을 위해 실시되었다: 사용을 위해 준비된 각 배지병에 첨가된 각 성분은 지정 후드 내에서 지정된 사람이 상기 후드 내에서 그 시약만을 이용하여 첨가하는 동안, 제2의 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하였다. 액체 취급 조건을 정하여 벽을 통한 교차 오염을 제거하였다. 모든 단계를 위해 새로운 팁을 사용하거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜을 사용하였다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도 및 배치, 모든 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클 수 및 플레이트에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건을 정하였다.
한 세트의 플레이트는 -70 내지 -80℃에서 냉동시켰다. 세트의 플레이트를 먼저 70 내지 100%의 세포 포화도가 되도록 하였다. 배지를 흡인하고 90% FBS 및 10% DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 파라필름으로 각각 밀봉한 다음, 각각 1 내지 5 cm 발포체로 둘러쌓고, -80℃ 동결기에 넣었다.
남은 2 세트의 플레이트를 상기 개시된 바와 같은 표준화되고 고정된 조건 하에 유지하였다. 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가 및 항온처리, 소광 및 세포 분산 단계를 포함하는 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 모든 세포 스플리팅을 실시하였다.
모든 세포군에 대해 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화를 조절하였다. 성장 속도의 약간의 차이로 인한 플레이트간의 차이는 플레이트의 세포주의 정규화에 의해 조절하고, 재배열 후에 3회 계대배양을 실시하였다. 범위밖 세포군을 검측하여 제거하였다.
세포를 3 내지 6주 동안 유지하여 이들 조건 하에서 시험관내 진화가 일어나도록 하였다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 미세 세포포화도 경향, 취성, 트립신처리에 대한 반응 및 트립신처리후 평균 원형도, 또는 배양 플레이트 표면에의 부착성 및 유체 첨가시 급등에 대한 내성과 같은 세포 유지의 다른 측면을 관찰하였다.
기능적 기준을 이용하여 세포군을 테스트하였다. 제조자의 지시에 따라서 Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트(카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 사용하였다. (http://www.assaydesigns.com/objects/catalog//product/extras/900-014.pdf). 96 또는 384 웰 플레이트에서 4가지 다른 밀도로 세포를 테스트하고, 반응을 분석하였다. 본 발명의 GC-C 발현 세포주에 대해 하기 조건을 사용하였다:
- 클론 스크리닝: 분석 48시간 전에 컨플루언트 96웰 플레이트의 1:2 및 1:3 스플리트, 30분 구아닐린 처리.
- 용량-반응 연구: 웰당 20,000, 40,000, 60,000, 80,000, 120,000 및 160,000의 밀도, 30분 구아닐린 처리(실시예 9 참조).
- Z' 연구: 웰당 160,000 및 200,000의 밀도를 이용하여, 30분 구아닐린 처리(실시예 10 참조).
낮은 및 더 높은 계대배양 수에서 실시한 실험으로부터 얻은 기능적 반응을 비교하여 4 내지 10주 범위의 지정된 기간 동안 가장 일관된 반응을 가지는 세포를 동정하였다. 경시적으로 변한 세포의 다른 특성도 주목하였다.
기능적 및 다른 기준을 만족하는 세포군을, 생존가능하고, 안정하며, 기능적인 세포주를 생성하기에 가장 좋은 것을 결정하기 위해서 추가로 평가하였다. 거대 조직 배양 용기에서 선택된 세포군을 증식시키고, 상기 개시된 특성화 단계를 이들 조건하에서 지속 또는 반복하였다. 이 지점에서, 추가의 표준화 단계, 예컨대 상이한 세포 밀도; 플레이팅 시간, 세포 배양 계대 길이; 세포 배양 접시 형태 및 코팅; 유체학 최적화, 예컨대 속도 및 전단력; 계대배양 시간; 및 세척 단계가, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해 도입되었다. 또한, 각 계대배양의 생존율을 측정하였다. 수동 개입을 증가시키고 세포를 면밀히 관찰하고 모니터링하였다. 이 정보를 사용하여 목적하는 성질을 보유하는 최종 세포주의 확인 및 선택을 보조할 수 있다. 이들 조건 하에서 이 과정 후에 생성된 경우 고른 프레이팅(미세 세포포화도 결여)과 적당한 부착성/점착성을 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주(총 20 클론)를 선별하였다.
DMEM/10%FBS/HEPES/L-Glu에서 24웰, 6웰 및 10 cm 접시를 통해 재배열된 96웰 플레이트로부터 비동결된 군을 증식시켜 선별된 20 클론 각각에 대한 3 바이알의 초기 동결 스톡을 형성하였다. 최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 저 계대배양 동결 스톡을 37℃에서 해동하고, FBS 함유 DMEM으로 2회 세척하고, 동일한 방식으로 항온처리하였다. 그 다음 2 내지 4주 동안 세포를 증식시켰다. 2개의 최종 클론을 선별하였다.
초기에 동결된 하나의 클론 유래의 하나의 바이알을 해동시키고 배양물에서 증식시켰다. 생성되는 세포를 테스트하여, 이들 세포가 처음 선택된 특성과 동일한 특성을 만족하는지를 확인하였다. 20 내지 100 바이알 이상으로 이루어진 각 세포주에 대한 세포 은행을 확립할 수 있다.
또한, 세포주가 생존 가능하고, 안정하며, 기능성인 것을 확인하기 위해 하기 단계를 실시할 수 있다: 세포 은행으로부터 얻은 하나 이상의 바이알을 해동시키고 배양물에서 증식시켰으며; 생성된 세포를 테스트하여, 이들 세포가 처음 선택된 특성과 동일한 특성을 만족하는지를 확인하였다.
실시예 9: 천연 GC -C 기능에 대한 세포주의 특성화
cGMP의 검출을 위해 경쟁적 ELISA를 이용하여 생성된 GC-C 발현 세포주에서의 천연 GC-C 기능을 특성화하였다. 10% 태아 소 혈청, 글루타민 및 HEPES로 보충된 듈베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 표준 세포 배양 조건 하에서 GC-C 발현 세포를 유지하고 T175cm 플라스크에서 증식시켰다. ELISA에 대해서, 세포를 코팅된 96웰 평판(폴리-D-리신)으로 플레이팅하였다.
세포 처리 및 세포 용해 프로토콜
세포를 무혈청 배지로 2회 세척하고 30분 동안 1 Mm IBMX로 항온처리하였다. 그 다음 원하는 활성화인자(즉, 구아닐린, 0.001-40 μM)를 세포에 첨가하고 30 내지 40분 동안 항온처리하였다. 상청액을 제거하고, TBS 완충액으로 세포를 세척하였다. 0.1 N HCl로 세포를 용해시켰다. 이 후 0.1N HCl 및 -20℃/실온의 냉동/해동 사이클로 세포용해시켰다. 냉동한 세포용해물(샘플을 10,000rpm으로 에펜도르프 튜브 중에서 회전시킴)을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화하였다. 그 다음 투명한 상청액 세포용해물을 ELISA 플레이트로 옮겼다.
ELISA 프로토콜
달리 언급된 바 없다면, 하기 모든 단계를 실온에서 실시하였다. ELISA 플레이트를 코팅액(Na-탄산염/중탄산염 완충액, 0.1M 최종, pH 9.6) 중에서 4℃에서 밤새 항-IgG 항체로 코팅하였다. 그 다음 플레이트를 세척액(TBS-트윈 20, 0.05%)으로 세척한 후, 블록킹 시약을 첨가하였다. 37℃에서 블록킹 시약과 함게 1시간 동안 항온처리한 후 세척 완충액으로 플레이트를 세척하였다. 그 다음 토끼 항-cGMP 폴리클로날 항체(Chemicon)를 첨가한 후, 1 시간 동안 항온처리하고, 세척 완충액으로 후속 세척하였다. 이어서, 세포 용해물을 첨가하고, cGMP-비오틴 접합체(1 내지 10 nM의 8-비오틴-AET-cGMP (Biolog))의 후속 첨가 전에 1 시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 2 시간 동안 항온처리한 다음 세척 완충액으로 세척하였다. 이어서, 스트렙타비딘-알칼리 포스페이트를 첨가하고, 1 시간 동안 항온처리한 다음, 세척 완충액으로 세척하였다. PNPP 기질(Sigma)과 함께 1시간 이상(바람직하게는 2 내지 5 시간) 동안 플레이트를 항온처리하였다. 그 다음 흡광도를 SAFIRE2 ™ 플레이트 판독기(Tecan)에서 405 nm에서 판독하였다.
ELISA에서 세포 용해물이 사용되지 않은 경우에는 최대 흡광도가 관찰되었다(대조군). 100 nM 구아닐린(Clone)으로 처리한 생성된 GC-C 발현 세포주로부터의 세포 용해물을 이용하면 (증가된 cGMP 수준에 상응하는) 흡광도 감소가 관찰되었다.
100 nM 구아닐린으로 처리한 생성된 GC-C 발현 세포주의 cGMP 수준을, Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트(카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 사용하여 GC-C를 발현하지 않는 어버이 세포주 대조군 샘플(제시되지 않음)과 비교하였다. GC-C 발현 세포주는 구아닐린으로 처리 및 미처리한 어버이 세포보다 (cGMP 수준 증가에 상응하는) 흡광도 감소가 더 컸다.
구아닐린 용량-반응 실험을 위해서, 96웰 플레이트에서 20,000, 40,000, 60,000, 80,000, 120,000 및 160,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅한, 생성된 GC-C-발현 세포주의 세포를 30분 동안 증가하는 농도의 구아닐린으로 챌린징하였다. cGMP 수준 변화(Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트(카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 이용하여 측정함)에 따른 세포 반응(즉, 흡광도)은 SAFIRE2 ™ 플레이트 판독기(Tecan)를 이용하여 검출하였다. 이어서 데이터를 구아닐린 농도의 함수로서 플롯하고, GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용한 비선형 회귀 분석을 사용하여 분석하였으며, 그 결과 EC50 값은 1.1 nM이었다. 생성된 GC-C 발현 세포주는 다른 세포주(3.5 pmol/ml)에서 이전에 보고된 것(Forte et al., Endocr. 140(4):1800-1806 (1999))과 비교하여 저 농도의 구아닐린으로 처리한 경우 더 높은 수준의 cGMP (6 pmol/ml)를 나타내었으며, 이는 클론의 효능을 제시하는 것이다.
실시예 10: GC -C-발현 세포주 Z' 값의 형성
생성된 GC-C 발현 세포주에 대한 Z'는 직접 경쟁적 ELISA 분석을 이용하여 계산하였다. Direct Cyclic GMP 효소 면역분석 키트(카탈로그 900-014; AssayDesigns, Inc.)를 이용하여 ELISA를 실시하였다. 구체적으로, Z' 분석의 경우, 96웰 분석 플레이트의 24 양성 대조군 웰(160,000 또는 200,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅함)에 30분 동안 DMEM 배지 중 IBMX 및 40 μM 구아닐린의 GC-C 활성화 칵테일을 챌린징하였다. 96웰 분석 플레이트의 부피 및 표면적을 고려하면, 이 양의 구아닐린은 문헌[Forte et al. (1999) Endocr . 140(4), 1800-1806]에 사용된 10 μM과 유사한 농도를 형성하였다. DMEM/IMBX 중의 클론 세포를 함유하는 동수의 웰에 (활성화인자의 부재 하에) 비히클만 챌린징하였다. SAFIRE2 ™ 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 (cGMP 수준에 상응하는) 2가지 조건의 흡광도를 모니터링하였다. 2가지 조건의 평균 및 표준 편차를 계산하고, 문헌[Zhang et al., J Biomol Screen, 4(2):67-73 (1999)]에 개시된 방법을 이용하여 Z'를 산정하였다. 생성된 GC-C 발현 세포주의 Z' 값은 0.72인 것으로 측정되었다.
실시예 11: 단락 전류 측정
배양 삽입체(Snapwell, Corning Life Sciences) 상에 GC-C 발현 세포(1차 또는 불멸의 상피 세포, 예컨대 폐, 장, 유방, 자궁 또는 신장)를 플레이팅 한 후에 Ussing 챔버 실험을 7 내지 14일 동안 실시한다. 배양 삽입체 상의 세포를 세정하고, Ussing 타입 장치(EasyMount Chamber System, Physiologic Instruments)에 올려놓고, 37℃에서 유지되고, 120 NaCl, 25 NaHCO3, 3.3 KH2PO4, 0.8 K2HPO4, 1.2 CaCl2, 1.2 MgCl2, 및 10 글루코스(nM 농도)를 함유하는 연속적으로 가스공급되는 링거액(O2중 5% CO2, pH 7.4)에 담군다. 헤미챔버를 다채널 전압 및 전류 클램프(VCC-C8, Physiologic Instruments)에 연결한다. 전극[한천 브릿지(1M KCl 중 4%) Ag-AgCl]을 사용하고, 삽입체를 0 mV로 전압 고정하였다. 실험 기간 동안 매 10초마다 상피를 통한 전류, 전압 및 저항을 측정한다. 저항이 <200 mOhm인 막은 버린다. 이러한 2차 분석으로, 적절한 세포 유형(즉, 치밀 접합부를 형성하는 세포)에서 도입된 GC-C는 CFTR 활성을 변화시키고 상피를 통한 전류를 조절하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 12: 안정한 CFTR -발현 세포주의 형성
발현 구성체 형성
스트림라인 클로닝이 가능한 플라스미드 발현 벡터는 pCMV-SCRIPT (Stratagene)에 기초하여 형성하였으며, 하기를 포함하여 목적 유전자의 전사 및 번역을 위해 필요한 각종 성분을 포함하였다: CMV 및 SV40 진핵 프로모터; SV40 및 HSV-TK 폴리아데닐화 서열; 다중 클로닝 부위; 코자크 서열; 및 약물 내성 카세트.
세포주 형성
단계 1: 형질감염
표준 기술을 이용하여 인간 CFTR(서열 번호 CFTR1)을 코딩하는 플라스미드로 CHO 세포를 형질감염시켰다. (핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.)
본 발명의 세포 또는 세포주를 생성하기 위해서 약물 선별은 선택사항이지만, 본 발명자들은 플라스미드당 하나의 약물 내성 마커(즉, 푸로마이신)를 포함시켰다. 이 CFTR 서열은 CMV 프로모터의 조절 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 CFTR 표적 서열을 코딩하는 비번역 서열이 또한 약물 내성 마커를 코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 표적 서열은 CFTR 표적 서열 1(서열 번호 CFTR 2)이고, 이 실시예에서 CFTR 유전자 함유 벡터는 CFTR 표적 서열 1(서열 번호 CFTR 2)을 포함하였다.
단계 2: 선별
항생제 없이 Ham의 F12-FBS 배지에서 2일 동안 형질감염된 세포를 성장시킨 후, 12.5 ㎍/ml 푸로마이신 함유 Ham의 F12-FBS 배지에서 10일 동안 성장시켰다. 그 다음 세포를 잔여 시간 동안 항생제를 포함하지 않는 Ham의 F12-FBS 배지로 옮긴 후, 신호전달 프로브를 첨가하였다.
단계 3: 세포 계대배양
항생제에서 농축시킨 후에, 침강을 위해 선택된 시간 동안 안정하지 않은 발현 시간을 허용하도록 항생제 선별의 부재 하에 세포를 5회 내지 14회 계대배양하였다.
단계 4: 형광 프로브에의 세포 노출
표준 기법을 이용하여 세포를 수거하고 CFTR 신호전달 프로브 1(서열 번호 CFTR3)로 형질감염시켰다. (핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.) CFTR 신호전달 프로브 1(서열 번호 CFTR 3)은 CFTR 표적 서열 1(서열 번호 CFTR 2)에 결합하였다. 그 다음 분석을 위해 세포를 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
CFTR 표적 서열 1
5'- GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC -3' (서열 번호 CFTR2)
신호서열 프로브
100 μM 스톡으로서 제공
CFTR 신호전달 프로브 1
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2 -3' (서열 번호 CFTR3)
또한, Cy5와 스펙트럼 성질이 유사한 QUASAR® Dye (BioSearch)를 사용한 유사한 프로브를 특정 실험에 사용하였다. 일부 실험에서, DNA 프로브보다는 5-MedC 및 2-아미노 dA 믹스머를 사용하였다. 비표적화 FAM 표지된 프로브를 또한 로딩 대조군으로서 사용하였다.
단계 5: 양성 세포의 분리
세포를 해리시키고 분석을 위해 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 분류하였다. 표준 분석적 방법을 이용하여 배경 위의 세포 형광을 게이팅하고 게이트 내에 속하는 각 세포를 바코드 96웰 플레이트로 분리하였다. 하기 게이팅 분류 체계를 사용하였다:
플롯 FAM 대비 Cy5에서 동시 게이트 -> 싱글렛 게이트 -> 라이브 게이트 -> 분류 게이트: 생세포의 0.1-0.4 %
단계 6: 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
단계 1-5 및/또는 3-5를 반복하여 더 많은 수의 세포를 얻었다. 단계 1-5의 2 라운드를 실시하고, 이들 각 라운드에 대해 단계 3-5의 2회의 내부 사이클을 실시하였다.
단계 7: 세포군에 대한 성장 속도 추정
상기 플레이트를 Microlab Star (Hamilton Robotics)로 옮겼다. 세포를, 100 유닛/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된, 2-3일 조정한 성장 배지와 새로운 완전 성장 배지의 1:1 혼합물 100 ㎕ 중에서 9일 동안 항온처리하였다. 그 다음, 1회 또는 2회 트립신 처리하여 덩어리를 최소화하여 세포를 분산시킨 후 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 이미지화하여 웰의 세포포화도를 결정하였다(Genetix). 플레이트의 신뢰성 있는 이미지 획득을 위해 각 플레이트에 초점을 맞추었다. 70% 이상의 보고된 세포포화도는 신뢰하지 않았다. 분산후 1일 내지 10일 동안 연속하여 매일 세포포화도 측정값을 얻었으며, 이를 사용하여 성장 속도를 계산하였다.
단계 8: 성장 속도 추정값에 따른 세포군의 비닝
단계 7의 분산 단계 후에 2주 미만 동안 성장 속도에 따라서 세포를 비닝하였다(독립적으로 코호트로서 그룹핑 및 플레이팅하였다). 3개 성장 빈 각각을 개별 96웰 플레이트로 분리하였으며; 일부 성장 빈은 하나 이상의 96웰 플레이트를 형성하였다. 성장 속도의 분포를 고려하고 세포군의 총수의 고비율(%)을 포괄하는 범위를 묶어서 빈을 계산하였다. 성장 속도에서 12-16 시간차가 나도록 빈을 계산하였다.
세포는 배가 시간이 1일 미만 내지 2주 이상일 수 있다. 동시에 성장 속도에 따라서 적당하게 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위해서, 빈당 배가 시간이 0.25 내지 7일인 3-9개 빈을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 특정 상황에 대해서 빈의 치밀성 및 빈의 수를 조정할 수 있고, 빈의 치밀성 및 수는, 세포가 세포 주기에 대해 동시에 진행된다면 추가로 조정될 수 있음을 알 것이다.
단계 9: 유사 프로세싱 속도 및 엄격한 품질 관리를 위한 레플리카 플레이팅
항생제 없이 표준화되고 고정된 조건(즉, Ham의 F12-FBS 배지, 37℃/5% CO2) 하에 플레이트를 항온처리하였다. 세포 플레이트를 스플리팅하여 4개 세트의 96웰 플레이트(동결을 위해 3세트, 분석을 위해 1 세트 및 계대배양을 위해 1세트)를 생성하였다. 구별되는 독립적인 조직 배양 시약, 인큐베이터, 총원 및 이산화탄소 공급원을 각 플레이트 세트를 위해 사용하였다. 품질 관리 단계는 모든 조직 배양 시약의 품질 및 적당한 생산을 위해 실시되었다: 사용을 위해 준비된 각 배지병에 첨가된 각 성분은, 지정 후드 내에서 지정된 사람이 상기 후드 내에서 그 시약만을 이용하여 첨가하는 동안, 제2의 지정된 사람이 실수가 없도록 모니터링하였다. 액체 취급 조건을 정하여 벽을 통한 교차 오염을 제거하였다. 모든 단계를 위해 새로운 팁을 사용하거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜을 사용하였다. 정확한 부피 전달, 효과적인 세포 조작, 세척 사이클, 피펫팅 속도 및 배치, 세포 분산을 위한 피펫팅 사이클 수 및 플레이트에 대한 팁의 상대적 위치에 대한 액체 취급 조건을 정하였다.
단계 10: 세포군의 조기 계대배양 스톡의 동결
3 세트의 플레이트를 -70 내지 -80℃에서 냉동시켰다. 세트의 플레이트를 먼저 70 내지 100%의 세포 포화도가 되도록 하였다. 배지를 흡인하고 90% FBS 및 10% DMSO를 첨가하였다. 플레이트를 파라필름으로 각각 밀봉한 다음, 각각 1 내지 5 cm 발포체로 둘러쌓고, -80℃ 동결기에 넣었다.
단계 11: 생존가능하고, 안정하며, 기능적인( VSF ) 세포주를 생성하기 위한 초기 형질전환 단계의 방법 및 조건
남은 플레이트 세트를 단계 9에 개시된 바와 같이 유지하였다. 배지 제거, 세포 세척, 트립신 첨가 및 항온처리, 소광 및 세포 분산 단계를 포함하는 자동화 액체 취급 단계를 이용하여 모든 세포 스플리팅을 실시하였다.
단계 12: 임의의 남아있는 성장 속도의 편차를 보정하기 위한 정규화 방법
모든 세포군에 대해 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화를 조절하였다. 성장 속도의 약간의 차이로 인한 플레이트간의 차이는 플레이트의 세포 수의 정규화에 의해 조절하고, 재배열 후에 매 8회 계대배양을 실시하였다. 범위밖 세포군을 검출하여 제거하였다.
단계 13: 세포군의 특성화
세포를 배양물의 재배열 후에 6 내지 10주 동안 유지하여 이들 조건 하에서 시험관내 진화가 일어나도록 하였다. 이 기간 동안, 크기, 형태, 미세 세포포화도 경향, 취성, 트립신처리에 대한 반응 및 트립신처리후 평균 원형도, 또는 배양 플레이트 표면에의 부착성 및 유체 첨가시 급등에 대한 내성과 같은 다른 세포 유지 측면을 관찰하였다.
단계 14: VSF 조건 하에서 세포군의 가능한 기능성의 평가
기능적 기준을 이용하여 세포군을 테스트하였다. 막 전위 염료 키트(Molecular Devices, MDS)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
384웰 플레이트에서 밀도를 변화시켜 세포를 테스트하고(즉, 12.5 x 103 내지 20 x 103 세포/웰) 반응을 분석하였다. 세포 플레이팅과 분석 판독 사이의 시간을 테스트하였다. 염료 농도도 테스트하였다. 가능한 기능성 평가의 일부로서 용량 반응 곡선 및 Z' 스코어를 모두 계산하였다.
또한 하기 단계(즉, 단계 15 내지 18)를 실시하여 최종 및 백업의 생존가능하고, 안정하며, 기능성인 세포주를 선별할 수 있다.
단계 15:
낮은 및 더 높은 계대배양 수에서 실시한 실험으로부터 얻은 기능적 반응을 비교하여 지정된 기간(예, 3 내지 9주) 동안 가장 일관된 반응을 가지는 세포를 동정하였다. 경시적으로 변한 세포의 다른 특성도 주목하였다.
단계 16:
기능적 및 다른 기준을 만족하는 세포군을, 생존가능하고, 안정하며, 기능적인 세포주를 생성하기에 가장 좋은 것을 결정하기 위해서 추가로 평가한다. 거대 조직 배양 용기에서 선택된 세포군을 증식시키고, 상기 개시된 특성화 단계를 이들 조건하에서 지속 또는 반복한다. 이 지점에서, 추가의 표준화 단계, 예컨대 상이한 세포 밀도; 플레이팅 시간, 세포 배양 계대 길이; 세포 배양 접시 형태 및 코팅, 유체학 최적화, 예컨대 속도 및 전단력; 계대배양 시간; 및 세척 단계가, 일관되고 신뢰성 있는 계대배양을 위해 도입된다.
또한, 각 계대배양의 세포 생존율을 측정한다. 수동 개입을 증가시키고 세포를 더욱 면밀히 관찰하고 모니터링한다. 이 정보를 사용하여 목적하는 성질을 보유하는 최종 세포주의 확인 및 선택을 보조할 수 있다. 이들 조건 하에서 이 과정 후에 생성된 경우 고른 프레이팅(마이크로플루언시 결여)과 적당한 부착성/점착성, 성장 속도를 나타내는 최종 세포주 및 백업 세포주를 선별한다.
단계 17: 세포 은행 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 상응하는 저 계대배양 동결 스톡을 37℃에서 해동하고, Ham의 F12-FBS로 2회 세척한 다음, Ham의 F12-FBS에서 항온처리하였다. 그 다음 2 내지 4주 동안 세포를 증식시켰다. 각 최종 및 백업 세포주에 대한 클론의 세포 은행을 확립하며, 각 클론 세포에 대한 25 바이알을 동결보존한다.
단계 18:
세포 은행으로부터 얻은 하나 이상의 바이알을 해동하고 배양물에서 증식시킨다. 생성되는 세포를 테스트하여, 이들 세포가 처음 선택된 특성과 동일한 특성을 만족하는지를 확인한다.
실시예 13: 천연 CFTR 기능에 대한 안정한 세포주의 특성화
본 발명자들은 고처리량의 적합한 형광 막 전위 분석을 사용하여 생성된 안정한 CFTR 발현 세포주에서의 천연 CFTR 기능을 특성화하였다.
CFTR을 안정하게 발현하는 CHO 세포주를, 10% 태아 소 혈청 및 글루타민이 보충된 Ham의 F12 배지에서 표준 세포 배양 조건 하에 유지하였다. 분석 전날, 스톡 플레이트로부터 세포를 수거하고 블랙 투명한 바닥의 384 웰 분석 플레이트로 플레이팅하였다. 분석 플레이트를 37℃ 세포 배양 항온기에서 5% CO2 하에 22 내지 24 시간 동안 유지하였다. 이어서 배지를 분석 플레이트로부터 제거하고, 로딩 완충액(137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 글루코스)에서 희석된 청막 퍼텬셜 염료(Molecular Devices Inc.)를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 분석 플레이트를 형광 플레이트 판독기(Hamamatsu FDSS)에 로딩하고, 화합물 완충액(137 mM 글루콘산나트륨, 5 mM 글루콘산칼륨, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10mM 글루코스)에 용해된 포스콜린 및 IBMX의 칵테일을 첨가하였다.
형광 막 전위 분석에서 얻은 대표적인 데이터는, 안정한 CFTR 발현 CHO 세포주(세포주 1, M11, J5, E15, 및 O15)에서 기능성 CFTR에 기인하는 이온 플럭스가 분석 반응에 의해 제시되는 바와 같이 CFTR 결여 대조군 세포에서보다 모두 높았다는 것을 보여준다.
또한, 안정한 CFTR 발현 CHO 세포주(세포주 1, M11, J5, E15, 및 O15)에서 기능성 CFTR에 기인하는 이온 플럭스가 일시적으로 CFTR 감염된 CHO 세포에서보다 모두 높았다. CFTR에 의해 일시적으로 형질감염된 세포는, 10 cm 조직 배양 접시당 5 백만 내지 천 6백만으로 CHO 세포를 플레이팅하고, 형질감염전에 18 내지 20 시간 동안 항온처리하여 형성하였다. 지질 형질감염 시약과 CFTR을 코딩하는 플라스미드로 이루어진 형질감염 복합체를 각 접시에 직접 첨가하였다. 그 다음 세포를 37℃에서 6 내지 12 시간 동안 CO2 항온기에서 항온처리하였다. 항온처리 후에, 세포를 들어서 블랙 투명한 바닥의 384 웰 분석 플레이트로 플레이팅하고, 상기 개시한 형광 막 전위 분석을 이용하여 기능을 분석하였다.
포스콜린 용량-반응 실험을 위해서, 384웰 플레이트에서 15,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅한, 생성된 안정한 CFTR-발현 세포주의 세포에, CFTR 작동제로 알려져 있는 포스콜린을 농도를 증가시키면서 챌린징하였다. 형광 플레이트 판독기(Hamamatsu FDSS)에 의해 경시적으로 세포 형광 변화의 함수로서의 세포 반응을 모니터링하였다. 이어서 데이터를 포스콜린 농도의 함수로서 플롯하고, GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용한 비선형 회귀 분석을 사용하여 분석하였으며, 그 결과 EC50 값은 256 nM이었다. 생성된 CFTR 발현 세포주는 포스콜린의 EC50 값이, 포스콜린이 다른 세포주에서 이전에 보고된 경우의 EC50 범위(250 내지 500 nM)내에 있으며(Galietta et al ., Am J Physiol Cell Physiol. 281(5): C1734-1742 (2001)), 이는 클론의 효능을 나타내는 것이다.
실시예 14: CFTR 세포계 분석에 대한 Z' 값의 측정
생성된 안정한 CFTR 발현 세포주에 대한 Z' 값은 고처리량의 적합한 형광 막 전위 분석을 사용하여 계산하였다. 형광 막 전위 분석 프로토콜은 실질적으로 실시예 13의 프로토콜에 따라 실시하였다. 구체적으로, Z' 분석의 경우, 384웰 분석 플레이트의 24 양성 대조군 웰(15,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅함)에 포스콜린 및 IBMX의 CFTR 활성화 칵테일을 챌린징하였다. 비히클 단독 및 DMSO 함유 비히클(활성화인자의 부재)로 동수의 웰에 챌린징하였다. 2 조건 하의 세포 반응은 형광 플레이트 판독기(Hamamatsu FDSS)를 사용하여 모니터링하였다. 2 조건의 평균 및 표준 편차를 계산하고, 문헌[Zhang et al., J Biomol Screen, 4(2):67-73 (1999)]에 개시된 방법을 이용하여 Z'를 산정하였다. 생성된 안정한 GTFR 발현 세포주의 Z' 값은 0.82 이상인 것으로 측정되었다.
실시예 15: CFTR 조절인자의 고처리량 스크리닝 및 동정
고처리량의 적합한 형광 막 전위 분석을 이용하여 CFTR 조절인자를 스크리닝 및 확인한다. 분석 전날, 세포를 스톡 플레이트로부터 항생제를 포함하지 않는 성장 배지로 수거하고 블랙의 투명한 바닥의 384 웰 분석 플레이트로 플레이팅한다. 분석 플레이트를 37℃ 세포 배양 항온기에서 5% CO2 하에 19 내지 24 시간 동안 유지한다. 이어서 배지를 분석 플레이트로부터 제거하고, 로딩 완충액(137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 글루코스)에서 희석된 청막 퍼텬셜 염료(Molecular Devices Inc.)를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 세포를 항온처리한다. 테스트 화합물을 디메틸설폭시드 중에 가용화시키고, 분석 완충액(137 mM 글루콘산나트륨, 5 mM 글루콘산칼륨, 1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10mM 글루코스) 중에 희석한 다음, 384웰 폴리프로필렌 미량역가 평판으로 로딩한다. 세포 및 화합물 플레이트를 형광 플레이트 판독기(Hamamatsu FDSS)로 로딩하고 3분 동안 작동시켜 테스트 화합물 활성을 동정한다. 그 다음 이 기기는 300 nM 내지 1 μM 농도의 포스콜린 용액을 세포에 첨가하여 이전에 첨가된 화합물의 조절인자 또는 차단인자 활성을 관찰한다. 화합물의 활성은, 세포에 테스트 화합물의 첨가 후 및/또는 후속 작동제 첨가 후에 생성된 형광 변화를 측정하여 결정한다.
실시예 16: 단락 전류 측정을 이용한 천연 CFTR 기능에 대한 안정한 CFTR 발현 세포주의 특성화
배양 삽입체(Snapwell, Corning Life Sciences) 상에 CFTR 발현 세포(1차 또는 불멸의 상피 세포, 비제한적인 예로서 폐 및 장 포함)를 플레이팅 한 후에 Ussing 챔버 실험을 7 내지 14일 동안 실시한다. 배양 삽입체 상의 세포를 세정하고, Ussing 타입 장치(EasyMount Chamber System, Physiologic Instruments)에 올려놓고, 37℃에서 유지되고, 120 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 3.3 mM KH2PO4, 0.8 mM K2HPO4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 및 10 mM 글루코스를 함유하는 연속적으로 가스공급되는 링거액(O2중 5% CO2, pH 7.4)에 담군다. 헤미챔버를 다채널 전압 및 전류 클램프(VCC-C8, Physiologic Instruments)에 연결한다. 전극[한천 브릿지(1M KCl 중 4%) Ag-AgCl]을 사용하고, 삽입체를 0 mV로 전압 고정하였다. 실험 기간 동안 매 10초마다 상피를 통한 전류, 전압 및 저항을 측정한다. 저항이 <200 mΩ인 막은 버린다.
실시예 17: 전기생리학 분석을 이용한 천연 CFTR 기능에 대한 안정한 CFTR 발현 세포주의 특성화
수동식 및 자동식 전기생리학 분석 모두를 개발하고, 이둘을 모두 적용하여 이 시스템을 분석할 수 있지만, 하기에는 수동식 패치 클램프 실험을 위한 프로토콜이 개시되어 있다.
세포를 낮은 밀도로 시딩하고 플레이팅 2 내지 4일 후에 사용한다. 보로실리케이트 유리 피펫을 파이어 폴리싱하여 2-4 매가Ω의 팁 저항을 얻는다. 전류를 샘플링하고 로우 패스(low pass) 필터링하였다. 세포외 (배스) 용액은 하기를 포함한다: 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM 글루코스, 10 mM 만니톨, 및 10 mM TES, pH 7.4. 피펫 용액은 하기를 포함한다: 120 mM CsCl, 1 mM MgCl2, 10 mM TEA-Cl, 0.5 mM EGTA, 1 mM Mg-ATP, 및 10 mM HEPES (pH 7.3). 막 전도도는 -80 mV 내지 -100 mV의 막 전위를 변화시켜 모니터링한다. 전류-전압 관계는 20 mV 단계로 -100 mV 내지 +100 mV 범위에서 전압 펄스를 적용하여 형성한다.
실시예 18: 안정한 NaV 1.7 헤테로삼량체 -발현 세포주의 형성
발현 구성체의 형성
스트림라인 클로닝이 가능한 플라스미드 발현 벡터는 pCMV-SCRIPT (Stratagene)에 기초하여 형성하였으며, 하기를 포함하여 목적 유전자의 전사 및 번역을 위해 필요한 각종 성분을 포함하였다: CMV 및 SV40 진핵 프로모터; SV40 및 HSV-TK 폴리아데닐화 서열; 다중 클로닝 부위; 코자크 서열; 및 네오마이신/카나마이신 내성 카세트(또는 앰피실린, 하이그로마이신, 푸로마이신, 제오신 내성 카세트).
세포주 형성
단계 1: 형질감염
표준 기술을 이용하여 293T 세포를 3개의 개별 플라스미드로 형질감염시켰는데, 한 플라스미드는 인간 NaV 1.7 α 서브유닛(서열 번호 NAV-1)을 코딩하고, 하나는 인간 NaV 1.7 β1 서브유닛(서열 번호 NAV-2)를 코딩하고, 하나는 인간 NaV 1.7 β2 서브유닛(서열 번호 NAV-3)을 코딩한다. (핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.)
본 발명의 세포 또는 세포주를 생성하기 위해서 약물 선별은 선택사항이지만, 본 발명자들은 플라스미드당 하나의 약물 내성 마커를 포함시켰다. 이 서열은 CMV 프로모터의 조절 하에 있었다. 신호전달 프로브에 의한 검출을 위해 NaV 표적 서열을 코딩하는 비번역 서열이 또한 약물 내성 마커를 코딩하는 서열과 함께 존재하였다. 이용된 NaV 표적 서열은 NaV 표적 서열 1(서열 번호 NaV-4), NaV 표적 서열 2(서열 번호 NaV-5) 및 NaV 표적 서열 3(서열 번호 NaV-6)이었다. 이 실시예에서, NaV 1.7α 서브유닛 유전자 함유 벡터는 NaV 표적 서열 1(서열 번호 NaV-4)를 포함하고; NaV 1.7 β1 서브유닛 유전자 함유 벡터는 NaV 표적 서열 2(서열 번호 NaV-5)를 함유하며; NaV 1.7 β2 서브유닛 유전자 함유 벡터는 NaV 표적 서열 3(서열 번호 NaV-6)을 포함하였다.
단계 2: 선별
형질감염된 세포를 DMEM-FBS 배지에서 2일간 증식시킨 후 항생제 함유 DMEM-FBS 배지에서 10일간 증식시켰다. 항생제 함유 기간에는 다음과 같이 항생제를 배지에 첨가하였다: 푸로마이신(0.1 ㎍/ml), 하이그로마이신(100 ㎍/ml) 및 제오신(200 ㎍/ml)
단계 3: 세포 계대배양
항생제에서의 농축 후에, 침강을 위해 선택된 시간 동안 안정하지 않은 발현 시간을 허용하도록 항생제의 부재 하에 세포를 6회 내지 18회 계대배양하였다.
단계 4: 형광 프로브에의 세포 노출
표준 기법을 이용하여 세포를 수거하고 신호전달 프로브(서열 번호 NaV-7, NaV-8, NaV-9)로 형질감염시켰다. (핵산을 숙주 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약의 예는 LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™ 2000, OLIGOFECTAMINE™, TFX™ 시약, FUGENE® 6, DOTAP/DOPE, 메타펙틴 또는 FECTURIN™을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.)
NaV 신호전달 프로브 1(서열 번호 NaV-7)은 NaV 표적 서열 1(서열 번호 NaV-4)에 결합하고; NaV 신호전달 프로브 2(서열 번호 NaV-8)는 NaV 표적 서열 2(서열 번호 NaV-5)에 결합하며; NaV 신호전달 프로브 3(서열 번호 NaV-9)은 NaV 표적 서열 3(서열 번호 NaV-6)에 결합하였다. 그 다음 세포를 해리시키고 분석을 위해 수거하고 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
신호전달 프로브에 의해 검출되는 표적 서열
NaV 1.7 서브유닛 이식유전자를 위해 하기 태그 서열을 사용하였다.
NaV 표적 서열 1
5'-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3' (서열 번호 NAV-4) (NaV 1.7 α 서브유닛)
NaV 표적 서열 2
5'-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3' (서열 번호 NAV-5) (NaV 1.7 β1 서브유닛)
NaV 표적 서열 3
5'-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3' (서열 번호 NAV-6) (NaV 1.7 β2 서브유닛)
신호전달 프로브
100 μM 스톡으로서 제공
NaV 신호전달 프로브 1 - 이 프로브는 표적 서열 1에 결합한다.
5' - Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 NAV-7)
NaV 신호전달 프로브 2 - 이 프로브는 표적 서열 2에 결합한다.
5'- Cy5 .5 CGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3 소광기 -3' (서열 번호 NAV-8)
NaV 신호전달 프로브 3 - 이 프로브는 표적 서열 3에 결합한다.
5'- Fam CGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1 소광기 -3' (서열 번호 NAV-9)
NaV 신호전달 프로브 1 및 2의 BHQ3을 BHQ2 또는 금 입자로 대체할 수 있다. NaV 신호전달 프로브 3의 BHQ1을 BHQ2, 금 입자 또는 DABCYL로 대체할 수 있다.
또한, Cy5와 스펙트럼 성질이 유사한 Quasar® Dye (BioSearch)를 사용한 유사한 프로브를 특정 실험에 사용하였다. 일부 실험에서, DNA 프로브보다는 5-MedC 및 2-아미노 dA 믹스머 프로브를 사용하였다.
단계 5: 양성 세포의 분리
표준 분석적 방법을 이용하여 배경 위의 세포 형광을 게이팅하고 정해진 게이트 내에 속하는 세포를 96웰 플레이트로 단리시켰다. 유세포분석 세포 분류를 실시하여 웰당 단일 세포가 부착되도록 하였다. 선별 후에, 약물을 포함하지 않는 배지에서 세포를 증식시켰다. 하기 게이팅 분류 체계를 사용하였다:
플롯 FAM 대비 Cy5에서 동시 게이트 -> 싱글렛 게이트 -> 라이브 게이트 -> 분류 게이트: 생세포의 0.1-1.0 %
단계 6: 단계 1-5 및/또는 3-5의 추가 사이클
단계 1-5 및/또는 3-5를 반복하여 더 많은 수의 세포를 얻었다. 단계 1-5의 4회 이상의 독립적인 라운드를 완료하고, 이들 사이클 각각에 대해서 단계 3-5의 2 이상의 내부 사이클을 각각의 독립적인 라운드에 대해 실시하였다.
단계 7: 세포군에 대한 성장 속도 추정
상기 플레이트를 Microlabstar 자동화 액체 조작기(Hamilton Microlabstar)로 옮겼다. 세포를, 100 유닛/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충한, 2-3일 조정한 성장 배지와 새로운 완전 성장 배지(DMEM/10% FBS)의 1:1 혼합물로 5 내지 7일 동안 항온처리하였다. 그 다음, 트립신처리하여 덩어리를 최소화하여 세포를 분산시킨 후 새로운 96웰 플레이트로 옮겼다. 클론을 분산시킨 후에, 플레이트를 이미지화하여 웰의 세포포화도를 측정하였다(Genetix). 플레이트의 신뢰성 있는 이미지 획득을 위해 각 플레이트에 초점을 맞추었다. 70% 이상의 보고된 세포포화도는 신뢰하지 않았다. 9일(즉, 분산후 1일 내지 10일) 동안 매 3회 세포포화도 측정값을 얻었으며, 이를 사용하여 성장 속도를 계산하였다.
단계 8: 성장 속도 추정값에 따른 세포군의 비닝
단계 7의 분산 단계 후에 10-11일 동안 성장 속도에 따라서 세포를 비닝하였다(독립적으로 코호트로서 그룹핑 및 플레이팅하였다). 빈을 독립적으로 수거하고 후속 취급을 위해서 각 96웰 플레이트에 플레이팅하였는데; 일부 성장 빈은 하나 이상의 96웰 플레이트를 형성하였다. 성장 속도의 분포를 고려하고 세포군의 총수의 고비율(%)을 포괄하는 범위를 묶어서 빈을 계산하였다. 단계 5에 개시된 분류 반복에 따라서, 1 내지 4일 간격으로 5-9개의 성장 빈을 사용하였다. 따라서, 각 빈은 반복에 따라서 8 내지 14.4 시간의 군 배가 시간 또는 성장 속도에 해당하였다.
세포는 배가 시간이 1일 미만 내지 2주 이상일 수 있다. 동시에 성장 속도에 따라서 적당하게 비닝될 수 있는 가장 다양한 클론을 처리하기 위해서, 빈당 배가 시간이 0.25 내지 7일인 3-9개 빈을 사용하는 것이 바람직하다. 당업자는 특정 상황에 대해서 빈의 치밀성 및 빈의 수를 조정할 수 있고, 빈의 치밀성 및 수는, 세포가 세포 주기에 대해 동시에 진행된다면 추가로 조정될 수 있음을 알 것이다.
단계 9: 동시 프로세싱을 촉진하고 엄격한 품질 제어성을 제공하기 위한 레플리카 플레이팅
플레이트들을 항생제 무함유 DMEM-10% FBS 배지 중에 표준 및 고정 조건(가습 37℃, 5% CO2) 하에서 항온배양하였다. 세포의 플레이트들을 나누어 4 세트의 표적 플레이트를 생성시켰다. 이들 4세트의 플레이트들은 초기 세트의 4 복제물이 존재한다는 것을 보증하도록 모든 성장 빈을 갖는 모든 플레이트를 포함한다. 최대 3 표적 플레이트 세트를 냉동보관하고(단계 10에 기술), 나머지 세트는 계대 및 기능성 분석 실험을 위해 규모확장하고 추가로 레플리카 플레이팅하였다. 개별적이고, 독립적인 배양 시약, 인큐베이터, 인원, 및 이산화탄소 공급원을 하류의 레플리카 플레이트에서 사용하였다. 품질 제어 단계를 수행하여 모든 조직 배양 시약의 적절한 생산 및 품질을 확보하였는데, 즉 사용을 위해 준비된 각각의 배지 보틀에 부가되는 각 성분은 실수 방지를 위해 제2 지정인이 모니터링하는 중에 오직 그 각 성분이 존재하는 하나의 지정된 후드에서 지정된 1인이 부가하였다. 액체 취급을 위한 조건은 웰에 걸친 교차 오염이 제거되도록 설정하였다. 신선한 팁을 모든 단계 동안 사용하거나, 또는 엄격한 팁 세척 프로토콜을 사용하였다. 액체 취급 조건은 정확한 부피 전달, 효율적인 세포 조작, 세척 사이클, 파이펫팅 속도 및 위치, 세포 분산을 위한 파이펫팅 횟수, 및 플레이트에 대한 팁의 상대적 위치에 대해 설정하였다.
단계 10: 세포 개체군의 초기 계대 스톡의 냉동
3 세트의 플레이트를 -70∼-80℃에서 냉동시켰다. 각 세트의 플레이트를 우선 세포포화도(confluency)가 70∼80%로 확보되도록 하였다. 배지를 흡인하고 90% FBS 및 5%∼10% DMSO를 부가하였다. 플레이트를, 개별적으로 1∼5 cm의 폼으로 둘러싸인, 파라필름으로 밀봉하고, -80℃ 냉동기에 보관하였다.
단계 11: 생존하는, 안정한 기능성( VSF ) 세포주 생산을 위한 초기 변형 단계의 방법 및 조건
나머지 플레이트 세트를 단계 9에서 기술한 바와 같이 유지시켰다. 모든 세포 분리(splitting)는 배지 제거, 세포 세척, 트립신 부가 및 항온배양, 켄칭 및 세포 분산 단계를 비롯한 자동 액체 취급 단계를 이용하여 수행하였다. 일부 플레이팅 단계 동안, 세포는 트립신 보다는 세포 해리(dissociation) 완충액(예를 들어, CDB, Invitrogen 또는 CellStripper, CellGro)을 사용하여 해리시켰다.
단계 12: 성장률의 임의의 나머지 가변성을 보정하기 위한 정규화 방법
모든 세포 개체군에 대한 세포 및 배양 조건의 일관성 및 표준화를 제어하였다. 성장률에서의 약간의 편차에 의한 플레이트들 전반의 편차는 매 2 내지 8 계대마다 플레이트들간의 세포수를 주기적으로 정규화하여 제어하였다. 영외 성장된(outlier) 세포 개체군이 검출되어 제거하였다.
단계 13: 세포 개체군의 특징 규명
세포들을 3 내지 8주간 유지시켜 이러한 조건 하에서 이들 세포가 시험관 내 진화하도록 하였다. 이 시간 동안, 본 발명자들은, 크기, 형태, 취약성, 트신화 또는 해리에 대한 반응, 해리 후 환형/평균 환상, 생존률, 미세 세포포화도(microconfluency)에 대한 경향, 또는 세포 유지성의 다른 측면 예컨대 배양 플레이트 표면에 대한 부착성 등을 관찰하였다.
단계 14: VSF 조건 하에서 세포 개체군의 잠재적 기능의 평가
기능적 기준을 이용하여 세포 개체군을 시험하였다. 막 전위 분석 키트(Molecular Devices/MDS)를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 세포를 96웰 또는 384웰 플레이트에서 다수의 상이한 밀도로 시험하고 반응을 분석하였다. 다양한 플레이팅 후 시간점, 예를 들어 플레이팅 후 12∼48시간을 사용하였다. 분석 반응 편차에 대해서 또한 다양한 플레이팅 밀도를 시험하였다.
단계 15:
저 및 고 계대수에서 수행된 실험들에서 얻은 기능적 반응을 비교하여 3 내지 9주 범위의 정해진 기간 동안 가장 일관적인 반응을 보이는 세포를 동정하였다. 시간 경과에 따라 변화된 세포의 다른 특징들도 검토하였다.
단계 16:
기능 및 다른 기준을 충족하는 세포 개체군을 추가로 평가하여 생존하는, 안정한 기능성 세포주를 생산할 수 있는 최고의 개체군을 확인하였다. 선택된 세포 개체군을 보다 큰 조직 배양 용기에서 증폭시키고 상기 기술된 특징규명 단계를 그 조건 하에서 반복하거나 계속하였다. 이 시점에서, 추가의 표준화 단계, 예컨대 상이한 플레이팅 세포 밀도; 계대 시기; 배양 디쉬 크기/포맷 및 코팅; 유체 최적화; 세포 해리 최적화(예를 들어, 유형, 사용 부피, 및 시간 길이 등); 및 세척 단계 등을 일관적이고 신뢰가능한 계대 동안 도입하였다. 온도차를 또한 표준화를 위해 사요하였다(즉, 30℃ 대 37℃).
또한, 각 계대시 세포의 생존성을 확인하였다. 수동 조정을 증가시켜 세포를 보다 밀접하게 관찰하고 모니터링하였다. 이 정보를, 원하는 특성을 보유하는 최종 세포주를 동정하고 선택하는데 도움이 되도록 사용하였다. 일관된 성장, 적절한 부착성 및 기능적 반응을 보인 최종 세포주 및 백업 세포주를 선별하였다.
단계 17: 세포 은행의 확립
최종 세포주 및 백업 세포주에 해당하는 상기 기술된 저계대의 냉동 플레이트를 37℃에서 해동하고, DMEM-10% FBS로 2회 세척한 후 가습된 37℃/5% CO2 조건에서 항온배양하였다. 다음으로 세포를 2 내지 3주 동안 증폭시켰다. 15∼20 바이알로 구성된 각각의 최종 및 백업 세포를 위한 세포 은행을 확립하였다.
단계 18:
세포주가 살아있고, 안정하며, 기능성인 것을 검증하기 위해 다음의 후속 단계를 수행할 수도 있다. 세포 은행으로부터 1 이상의 바이알을 해동하고 배양 증폭시켰다. 얻어진 세포를 시험하여 이들이 최초에 선별되었던 동일 특징을 충족시키는지 확인하였다.
실시예 19: 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에서 이종성 NaV 1.7 서브유닛의 상대적 발현 특징규명
정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 사용하여 생산된 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에서 이종성 인간 NaV 1.7 α, β1 및 β2 서브유닛의 상대적 발현을 확인하였다. 전체 RNA는 RNA 추출 키트(RNeasy Mini Kit, Qiagen)를 사용하여 1-3x106 포유동물 세포로부터 정제하였다. 엄격한 DNase 처리 프로토콜(TURBO DNA-free Kit, Ambion)에 따라 DNase를 처리하였다. 제1 가닥 cDNA 합성은 역전사효소 키트(SuperScript III, Invitrogen)를 사용하여 1 ㎍ DNA-무함유 전체 RNA 및 250 ng 랜덤 프라이머(Invitrogen)를 포함하는 20 ㎕ 용량으로 수행하였다. 역전사효소가 없는 샘플 및 RNA가 없는 샘플을 이 반응의 음성 대조군으로 사용하였다. 써머 싸이클러(Mastercycler, Eppendorf)에서 다음의 조건으로 실시하였다: 25℃에서 5분, 50℃에서 60분; 반응 종결은 70℃에서 15분간 수행하였다.
유전자 발현 분석을 위해, qRT-PCR용 프라이머 및 프로브(MGB TaqMan probes, Applied Biosystems)를 표적 서열(서열 번호 NaV-4, NaV-5, NaV-6)에 특이적으로 어닐링되도록 디자인하였다. 샘플 정규화를 위한, 대조군(글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH)) 프리-디벨로프드 어세이(Pre-Developed Assay) 시약(TaqMaN, Applied Biosystems)을 사용하였다. 음성 대조군 및 양성 대조군(플라스미드 DNA)을 포함한, 반응물은 50 ㎕ 반응 부피 중 40 ng의 cDNA로 하여 삼중으로 셋업하였다. 3종 NaV 1.7 서브유닛 각각이 발현되는 상대량을 측정하였다. 모든 3종 서브유닛은 생산된 안정한 NaV 1.7-발현 세포주에서 성공적으로 발현되었다.
실시예 20: 전기생리학적 분석을 이용한 천연 NaV 기능에 대한 안정한 NaV 1.7-발현 세포주의 특징규명
자동화된 팻치-클램프 시스템을 사용하여 NaV 1.7 α, β1 및 β2 서브유닛을 발현하는 생산된 안정한 HEK293T 세포주로부터의 나트륨 흐름을 기록하였다. 아래에 기술한 프로토콜을 또한 QPatch, Sophion 또는 Patchliner, Nanion 시스템에 대해 사용할 수 있다. 세포외 링커액은 140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.6 mM MgCl2, 11 mM 포도당 및 5 mM HEPES을 함유하고, 실온에서 pH 7.4였다. 세포내 링거액은 120 mM CsF, 20 mM Cs-EGTA, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 및 10 mM HEPES를 함유하고, pH 7.2였다. 실험은 실온에서 수행하였다.
NaV 1.7 α, β1 및 β2 서브유닛을 안정하게 발현하는 세포는 실시예 18에 기술된 표준 배양 프로토콜 하에서 성장시켰다. 세포를 회수하고 팻치되는 능력 또는 품질의 유의한 변화없이 최대 4시간 동안 연속 교반하면서 현탁물로 유지시켰다. 표준 팻치 플레이트를 사용하여 전기생리학적 실험(전체-세포)을 수행하였다. 팻치-클램프 홀(칩에 마이크로엣칭됨)은 직경이 대략 1 ㎛이고 저항력이 ∼2 ㏁이다. 막 전위는 -100 mV의 홀딩 전위로 클램핑하였다.
HEK293T 세포에서 안정하게 발현되는 전압-게이티드 인간 NaV 1.7 나트륨 채널의 전류-전압 관계 및 불활성화 특징을 규명하였다. 나트륨 전류는 -100 mV의 홀딩 전위로, -80 mV 내지 +50 mV의 20 ms 탈분극 펄스에 반응시켜 측정하였다. 피크 나트륨 채널 전류에 대해 얻어진 전류-전압(I-V) 관계도를 규명하였다. 활성화 역치는 - 35 mV( 활성화 중심점, Va = - 24.9 mV +/- 3.7 mV)였고, 최대 전류 진폭은 -10 mV에서 획득되었다. 나트륨 채널에 대한 불활성화 그래프를 작성하였다. 막 전위는 홀딩 전위를 -100 mV로 유지시킨 후, 1000 ms 동안 -110 mV 내지 +10 mV 범위의 조건 전위로 바꾸었고, 마지막으로, 전류는 0 mV로의 스텝에서 측정하였다. 얻어진 전류 진폭은 나트륨 채널의 일부가 불활성화된 상태임을 의미하였다. -85 mV 보다 더 마이너스인 전위에서 채널은 주로 닫힌 상태였는데 반해 -50 mV 보다 높은 전위에서는 주로 불활성화된 상태였다. 그래프는 볼트만 피트를 나타내며 이때 안정 상태에서의 V1 /2는 -74 mV로 추정되었다. 생산된 안정한 NaV 1.7-발현 세포주의 전류-전압 프로파일은 앞서 보고된 전류-전압 프로파일과 일관되었다(Va= -28.0 mV ± 1.1 mV; V1 /2 = -71.3 mV ± 0.8 mV)(Sheets et al ., J Physiol. 581(Pt 3):1019-1031. (2007)).
실시예 21: 막 전위 분석법을 이용한 천연 NaV 기능에 대한 안정한 NaV 1.7-발현 세포주의 특징 규명
NaV 1.7 α, β1 및 β2 서브유닛을 발현하는 생산된 안정한 세포를 10% 소태아 혈청, 글루타민 및 HEPES가 보충된 둘배코의 변형 이글 배지 중에서 표준 세포 배양 조건하에 유지시켰다. 분석 전날, 세포 해리 완충액, 예를 들어 CDB(GIBCO) 또는 세포 스트립퍼(Mediatech)를 사용하여 스톡 플레이트로부터 회수하고, 성장 배지가 있는 384 웰 플레이트에 웰당 10,000∼25,000 세포로 플레이팅하였다. 분석 플레이트를 22 내지 24시간 동안 5% CO2 하 37℃ 세포 배양 인큐베이터에 유지시켰다. 이후 배지를 분석 플레이트에서 제거하고, 로딩 완충액(137 mM NaCl, 5 mM KCl,1.25 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 10 mM 포도당)으로 희석한 파란색 형광발광 막전위 염료(Molecular Devices Inc.)를 부가하였다. 1시간 동안 37℃에서 파란색 막전위 염료와 세포를 항온반응시켰다. 이후, 분석 플레이트를 고효율 형광발광 플레이트 판독기(Hamamastu FDSS)에 로딩시켰다. 형광발광 플레이트 판독기는 초당 1회 세포 플레이트를 찍은 영상에서 세포 형광발광도를 측정하고 상대적 형광발광 단위로서 그 데이타를 표시한다.
완충액 및 채널 활성인자(즉, 베라트리딘 및 스콜피온 독(SV)) 부가에 대한 안정한 NaV 1.7-발현 세포 및 대조군 세포(즉, HEK293T 모세포)의 분석 반응도를 측정하였다. 제1 부가 반응(즉, 부가 1)시, 완충액만을 부가하고, 시험 화합물은 부가하지 않았다. 원한다면, 시험 화합물을 이 단계에서 부가할 수 있다. 제2 부가 반응에서, 나트륨 채널 활성인자인 베라트리딘 및 스콜피온 독을 원하는 농도(즉, 25 μM 베라트리딘, 및 5∼25 ㎍/㎖ 스콜피온 독)로 분석 완충액에 희석하고, 384웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에 부가하였다. 결합하면, 베라트리딘 및 스콜피온 독 단백질은 활성화 및 불활성화 동역학의 변화를 포함하는, 기전들의 조합에 의해 전압-게이티드 나트륨 채널의 활성이 조정된다. 안정한 NaV 1.7-발현 세포의 나트륨 채널 활성화 결과 세포 막 전위가 변하였고 형광발광 신호가 증가하였다. 상기 기술된 기능성 분석을 또한 사용하여 NaV 1.7 이온 채널에서 시험 화합물의 상대적인 전위를 특징규명할 수 있다.
실시예 22: 베타 서브유닛에 의한 NaV 1.7 알파 서브유닛의 조절에 대한 특징 규명
베타 서브유닛에 의한 알파 서브유닛 유전자 발현의 조절
독립적인 플라스미드 DNA 또는 α 및 대조군 플라스미드의 몰 비율을 조작하여(예를 들어, α:β1:β2 = 1:1:1), HEK293T 세포의 풀이 다양한 비율로 α 및 β 서브유닛을 발현시키도록 조작하였다. 약물 선별 후, 6종의 상이한 세포 풀에서의 서브유닛 발현을 실시예 19에 기술된 바와 같이 qRT-PCR을 통해 평가하였다. 비교 qRT-PCR은 약물 선별된 세포 검출에서 α 서브유닛 발현이, 단지 α 서브유닛 및 대조군 플라스미드만을 형질감염시킨 경우와 비교하여 모든 3종의 인간 NaV 1.7 서브유닛(즉, α, β1 및 β2)을 공동 형질감염시 증가되었음을 보여주었다. β 서브유닛 전사체의 존재는 α 서브유닛 유전자 발현에 영향을 미쳤고, 이는 생리적으로 관련되는 기능성 분석을 위해 모든 3종의 NaV 1.7 서브유닛을 공동 발현시키는 것이 중요하다는 것을 의미한다.
베타 서브유닛에 의한 약리학적 특성의 조절
모든 3종의 NaV 1.7 서브유닛(즉, α, β1 및 β2)을 안정하게 공동 발현하는 세포 및 NaV 1.7 α 서브유닛만을 안정하게 발현하는 대조군 세포의 시험 화합물에 대한 반응을 측정하기 위해 막전이 세포-기반 분석법을 사용하였다. 2종의 화합물(즉, C18 및 K21)을 실시예 21의 프로토콜에 따라 실질적으로 수행된 막전이 분석법에서 시험하였다. 구체적으로, 이 실시예를 위해서, 시험 화합물은 제1 부가 단계에서 부가하였다.
C18 및 K21은 클론 44(NaV 1.7 α, β1 및 β2 서브유닛 발현)의 발현을 강력하게 하였고 클론 C60(NaV 1.7 α 서브유닛만을 발현)의 반을을 차단시켰다. 2종의 시험 화합물의 분석 반응도는 2 클론 각각에 대해 완충액 단독시의 반응도로 정규화시켰다.
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SEQUENCE LISTING <110> CHROMOCELL CORPORATION <120> NOVEL CELL LINES AND METHODS <130> 002298-0024-WO1 <140> PCT/US2009/032900 <141> 2009-02-02 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaggaaaa gtccaggtct gtctgactgt ctttgggcct ggatcctcct tctgagcaca 60 ctgactggaa gaagctatgg acagccgtca ttacaagatg aacttaaaga caataccact 120 gtcttcacca ggattttgga cagactccta gatggttatg acaatcgcct gagaccagga 180 ttgggagagc gtgtaaccga agtgaagact gatatcttcg tcaccagttt cggacccgtt 240 tcagaccatg atatggaata tacaatagat gtatttttcc gtcaaagctg gaaggatgaa 300 aggttaaaat ttaaaggacc tatgacagtc ctccggttaa ataacctaat ggcaagtaaa 360 atctggactc cggacacatt tttccacaat ggaaagaagt cagtggccca caacatgacc 420 atgcccaaca aactcctgcg gatcacagag gatggcacct tgctgtacac catgaggctg 480 acagtgagag ctgaatgtcc gatgcatttg gaggacttcc ctatggatgc ccatgcttgc 540 ccactaaaat ttggaagtta tgcttataca agagcagaag ttgtttatga atggaccaga 600 gagccagcac gctcagtggt tgtagcagaa gatggatcac gtctaaacca gtatgacctt 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Claims (22)

  1. 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서,
    상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 이종이량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  2. 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된, 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서,
    상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 이종이량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  3. 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하고, 이때 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되는 것을 특징으로 하는 세포.
  4. 목적하는 이종이량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된, 목적하는 이종이량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하고, 이때 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되는 것을 특징으로 하는 것인 세포.
  5. 3 이상의 서브유닛을 포함하고, 1 이상의 서브유닛은 도입 핵산에 의해 코딩되는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 이종다량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석 시 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  6. 3 이상의 서브유닛을 포함하는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하고, 목적하는 이종다량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 이종다량체 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석 시 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  7. 3 이상의 서브유닛을 포함하고, 1 이상의 서브유닛은 도입 핵산에 의해 코딩되는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포.
  8. 3 이상의 서브유닛을 포함하는 목적하는 이종다량체 단백질을 발현하고, 목적하는 이종다량체 단백질의 서브유닛 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포.
  9. 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  10. 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하고, 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 단백질을 생산하며, 이때 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 단백질은 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  11. 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 도입 핵산으로부터 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포.
  12. 2 이상의 목적하는 단백질을 발현하고, 목적하는 단백질 중 1 이상을 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 것인 세포.
  13. 도입 핵산에 의해 코딩되는 1 이상의 목적하는 RNA를 발현하는 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 1 이상의 RNA를 생산하며, 이때 상기 목적하는 RNA는 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 RNA는 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  14. 1 이상의 목적하는 RNA를 발현하고, 1 이상의 목적하는 RNA를 코딩하는 내생성 핵산의 전사를 활성화시키도록 조작된 세포로서, 상기 세포는 기능성 분석에 사용하기 적합한 형태로 목적하는 1 이상의 RNA를 생산하며, 이때 상기 목적하는 RNA는 태그를 포함하지 않거나 또는 상기 RNA는 세포가 기능성 분석에서 0.4 이상의 Z' 계수를 갖도록 일관적이며 재생가능하게 상기 형태로 생산되거나, 또는 상기 세포는 선택적 압력 부재하에 배양되거나, 또는 이의 임의의 조합을 특징으로 하는 것인 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 세포에서 생성된 세포주.
  16. 목적하는 단백질을 발현하는 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 세포는 시간 경과에 따라 일관된 1 이상의 원하는 특성을 가지는 것이고,
    a) 목적하는 단백질을 코딩하는 mRNA를 발현하는 다수의 세포를 제공하는 단계;
    b) 개별 배양 용기에 개별적으로 세포를 분산시켜 다수의 개별 세포 배양물을 제공하는 단계;
    c) 배양 조건이 각각의 개별 세포 배양물에 대해 실질적으로 동일하고, 배양 동안 개별 세포 배양물 당 세포 수를 배양물마다 정규화시키며, 개별 배양물들은 동일 스케쥴로 계대되는 것을 특징으로 하는 자동화 세포 배양법을 사용하여 원하는 배양 조건 세트 하에서 세포를 배양하는 단계;
    d) 목적하는 단백질의 1 이상의 원하는 특징에 대해 개별 세포 배양물을 2회 이상 분석하는 단계; 및
    e) 양쪽 분석에서 원하는 특징을 갖는 개별 세포 배양물을 동정하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  17. 클론 세포주의 매칭된(matched) 패널로서, 여기서 클론 세포주는 세포 유형이 동일한 것이고, 패널의 각 세포주는 목적하는 단백질을 발현하며, 패널의 클론 세포주는 대등한 프로세싱이 가능하게 동일한 생리적 특성을 공유하도록 매칭시킨 것인 패널.
  18. 목적하는 단량체 단백질을 코딩하는 도입 핵산으로부터 목적하는 단량체 단백질을 발현하는 세포로서, 상기 세포는 생물학적으로 활성이 있거나 또는 생물학적으로 활성화될 수 있는 형태로 목적하는 단백질을 생산하고, 이때 세포는 선택적 압력 부재 하에 배양되고, 단백질의 발현율은 3개월 동안 30%가 넘게 변화되지 않는 것을 특징으로 하는 것인 세포.
  19. 목적하는 단백질의 조절인자를 동정하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포에서의 단백질 활성과 비교하여 시험 화합물과 접촉한 세포에서의 목적하는 단백질의 활성 변화를 검출하는 단계를 포함하며,
    부재시와 비교하여 존재시 활성 변화를 일으키는 화합물이 목적하는 단백질인, 동정 방법.
  20. 제19항의 방법을 통해 동정된 조절인자.
  21. 1 이상의 목적하는 단백질을 발현하는 세포로서, 여기서 목적하는 단백질은 공지된 리간드가 없거나, 또는 상기 목적하는 단백질의 기능적 발현을 검출하기 위한 공지 분석법이 존재하지 않고, 상기 목적하는 단백질은 단백질 태그를 포함하지 않는 것인 세포.
  22. 세포주를 생성하는 방법으로서, 동일한 배양 조건 하에서 다수의 세포주를 다수의 대등한 배양물에서 배양하는 단계, 및 시간 경과에 따라 일관되게 유지되는 1 이상의 특성을 갖는 세포주를 동정하는 단계를 포함하는 생성 방법.
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