KR20100121222A - 트레오네이트를 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-트레오네이트를 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

트레오네이트, 탈모

Description

트레오네이트를 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating alopecia comprising L-threonate}

본 발명은 L-트레오네이트를 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

탈모는 사람들이 갖는 흔한 고민거리이다. 특히 나이 들면서 남성과 여성에 나타나는 두피 탈모가 특징인 안드로겐성 탈모증(AGA)(즉, 남성형 탈모증 및 여성형 탈모증)이 일반적이다. 다른 탈모 고민으로는 미시적 염증성으로 보통 복원이 가능하고 국부적 탈모증이라고 지칭되는 원형 탈모증(AA), 및 화학요법 또는 방사선 치료와 관련한 탈모증(즉, 2차 탈모증)이 포함된다.

모발은 보통 두 종류, 즉 "종모"와 "연모"로 나뉜다. 종모는 굵고 색을 가지며 진피 속 깊이 발달한 모낭으로부터 자라는 긴 모발이다. 연모는 전형적으로 진피 속의 표면에 위치하는 더 작은 모낭으로부터 성장하는 가늘고 색을 갖지 않는 모발이다. 탈모가 진행되면서 종모가 연모 형태로 바뀌게 되고 이와 관련하여 모낭 이 상응하게 축소된다.

탈모의 또 다른 요인은 모발의 성장 주기의 변화이다. 모발은 전형적으로 세 가지 주기, 즉 성장기(활발한 모발 성장), 퇴행기(과도기) 및 휴지기(새로 성장하기 전에 모간이 빠지는 정지 시기)를 통해 성장한다. 보통, 두피 상의 모발의 약 88%는 성장기에 속하고 약 1%만이 퇴행기에 속하며 나머지는 휴지기에 속한다. 탈모가 진행될수록 급격히 높은 비율의 모발이 휴지기에 속하게 되고, 이에 상응하여 활발한 성장기에 속하는 모발의 비율은 더 낮아진다.

또한 탈모증과 관련하여 모낭의 크기와 밀도도 모두 현저하게 감소한다. 예컨대, 30세 내지 90세의 대머리인 사람은 평균 약 306개/㎠의 모낭만을 갖는 것으로 보고되었다. 이것은 동일 연령 범위의 대머리가 아닌 정상인이 갖는 평균 약 460개/㎠의 모낭에 비해 약 33%가 적은 것이다. 위와 같은 인자들이 조합되어 대머리를 만들게 된다.

AGA의 문제를 해결하기 위한 가장 일반적인 방법은 약물 요법이다. 비타민에서 호르몬까지 다양한 약물의 사용이 시도되고 있으나 성공률은 극히 제한적이다. 업존(Upjohn)에 허여된 미국 특허 제3,461,461호 및 제4,596,812호에 기재된 상품명 "미녹시딜(Minoxidil)"로 시판 중인 모발 성장제를 사용하는 방법이 보다 적극적으로 이루어지고 있다.

모발 성장 촉진 또는 탈모 방지제로서 시판되는 제품이 모발에 주는 효과는 모발 성장기 유도 효과, 모발 성장기 연장 효과, 5α-리덕타제 저해 효과, 혈행 촉진 효과, 살균 효과, 비듬 방지 효과, 보습 효과, 항산화 효과 등이 있으나, 이러 한 기존의 제제에서 탈모 방지, 모발 성장 촉진 효과는 충분하지 않다. 이는 탈모의 원인이 매우 복잡하고 다양하게 얽혀있는 한편, 이들 제제는 어느 한두 가지의 탈모 또는 발모 현상에만 초점을 맞추어 이를 개선 시키고자 하기 때문이다. 즉, 현재까지는 다양하고 복잡하게 얽혀 있는 모발 성장 메커니즘에 착안한 제제는 드문 실정이다.

일본 특허공개 제2000-169326(2000. 6. 20)은 안식향산, 안식향산의 알칼리 금속염, 벤즈알데히드, 쿠민알데히드, 미르테날 및 하이드록시 시트로넬랄로부터 선택된 적어도 1 종 이상을 유효성분으로 함유하는 혈류촉진제를 개시하고 있다. 이러한 혈류촉진제는 말초혈류 저하에 의한 국소조직의 대사장해를 개선하여 우수한 혈류촉진효과를 발휘하므로, 구강용 조성물, 의약품, 화장품, 육모제, 욕용제, 외용제 등에 배합하여 치주질환, 피부의 그을음, 탈모, 어깨결림, 근육통 등의 개선에 사용될 수 있는 것으로 기재되어있다. 그러나, 여기에서는 하이드록시 시트로넬랄 등의 혈류촉진 효과만을 보여주고 있을 뿐, 실제로 탈모 개선에 대한 효과는 구체적으로 입증되어있지 않다.

일반적으로 DHT(dihydrotestosterone)를 포함한 순환하는 안드로젠은 모유두 모세혈관을 통해 모낭으로 들어 간 뒤 모유두 세포에 존재하는 안드로젠 수용체와 결합한 후 타겟 유전자들의 발현을 활성화 시키거나 억제시킨다(Randall VA, Thornton MJ, Hamada K, Messenger AG. Skin Pharmacol 1994;7:20-6). 최근 연구들은 모유두 세포에서 DHT에 의해 조절되는 자가분비 인자와 파라크린 (주변분비) 인자가 남성형 탈모의 중심이 될 것이라고 발표하고 있다(Inui S, Fukuzato Y, Nakajima T, Yoshikawa K, Itami S. FASEB J 2002;16:1967-9;Hibino T, Nishiyama T. J Dermatol Sci 2004;35:9-18;Hamada K, Randall VA. Br J Dermatol 2006;154:609-18). 아주 최근에 우리는 대머리 모유두세포에서 DHT에 의해 조절 되어지는 유전자 중 dickkopf 1 (DKK-1)이 아주 높게 발현 하는 것을 발견하였다(Kwack MH, Sung YK, Chung EJ, Im SU, Ahn JS, Kim MK, Kim JC. J Invest Dermatol 2008;128:262-9). 아래 관찰을 바탕으로 우리는 DHT에 의해 유도되어진 DKK-1이 남성형탈모에 관여하는 중요 인자 중의 하나 일 것이라고 주장하였다:1) 모유두세포에서 DKK-1 mRNA는 50~100 nM DHT 처리 후 3~6시간 이내 증가되고, ELISA방법을 통하여 DHT에 의해 DKK-1 단백의 분비가 증가함을 관찰하였고, 2) 모낭의 케라티노사이트인 외모근초와 모유두 세포를 이용하여 동시배양(co-culture) 한 경우 DHT가 외모근초 세포의 성장을 저해하는 것을 보았으며, DKK-1에 대한 중화항체 처리시 외모근초 세포의 성장 저해가 역전됨을 확인하였으며, 3) 재조합 인간 DKK-1은 외모근초 세포의 성장을 저해하고 세포 사멸을 야기함. 4) 배양된 모낭 안에서 DHT에 의해 상피세포의 세포사멸이 야기되며, DKK-1에 대한 중화항체는 이를 다시 역전시킴. 5) 남성형 탈모환자의 탈모부위가 비탈모부위 보다 DKK-1이 높게 발현 되는 것을 immunobloting방법을 통해 확인하였다.

DKK-1은 강력하고 특이적인 Wnt 길항제로, 모발의 성장에 관여하는 canonical Wnt 신호에서 요구되어지는 수용체인 low-density lipoprotein receptor related protein과 결합하여 Wnt 작용을 저해시킨다(Millar SE, Willert K, Salinas PC, Roelink H, Nusse R, Barsh GS. Dev Biol 1999;207:133-49;Kishimoto J, Burgeson RE, Morgan BA. Genes Dev 2000; 14:1181-5;Shimizu H, Morgan BA. J Invest Dermatol 2004; 122:239-45).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 탈모 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 트레오네이트(threonate)를 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 트레오네이트(threonate)는 L-트레오네이트인 것이 바람직하고, 칼슘 L-트레오네이트, 나트륨 L-트레오네이트, 크롬 L-트레오네이트, 및 철 L-트레오네이트로 구성된 군으로부터 선택된 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 아니한다.

또한 본 발명의 탈모는 남성형 탈모인 것이 바람직하고, 안드로겐에 의하여 유발되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 탈모 부위 또는 모발 성장을 원하는 부위에 국소 투여하도록 고안된다. 상세하게, 본 발명의 조성물의 투여는 유효량의 조성물을 모발 성장의 자극을 원하는 피부 부위(이하, "치료 부위"라고 부른다)에 선택적으로 전달(모낭에의 전달을 포함)시키는 어떠한 방법으로도 달성될 수 있다.

예를 들면, 투여는 치료 부위에 직접 국소 투여하거나, 두피를 포함한 치료 부위에 주사(예: 피내 주사)함으로써 달성할 수 있다. 본원 명세서에서 "유효량"이 란 위에서 확인하였고 본원 명세서에서 논의한 탈모와 관련된 질환의 치료 또는 예방하는 조성물의 양을 의미한다.

본 발명의 조성물은 외용제인 경우 1일 0.1∼20mg/kg체중, 바람직하게는 1∼10mg/kg체중의 양을 1회에서 3회로 나누어 도포할 수 있고, 경구용 제제의 경우에는 1일 1∼500mg/kg체중, 바람직하게는 10∼100mg/kg체중의 양을 1회에서 3회로 나누어 복용할 수 있다.

따라서, 한 양태에서 본 발명의 조성물은 치료 부위에 피내 주사하도록 제형화되며, 이러한 주사에 적합한 비히클을 추가로 함유한다. 적합한 비히클로는 염수, 정균 염수 및 멸균수가 포함되나 이에 한정되지 아니한다. 이러한 조성물의 제조방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, 계량된 양의 활성 화합물을 바이알 안에 넣고, 안의 내용물을 멸균시키고 밀봉한다. 투여 전에 분산액을 형성하기 위한, 주사용의 멸균수 또는 본 발명의 화합물을 비히클로서 함유하는 부수적인 바이알이 제공된다.

다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 조성물을 피부에 국소 투여하기에 적합하도록 생리적으로 허용되는 불활성 담체 또는 희석제를 추가로 함유한다. 생리적으로 허용되는 불활성의 적합한 담체 또는 희석제로는 물, 생리 식염수, 정균 염수(0.9㎎/㎖의 벤질 알코올을 함유하는 염수), 크림, 로션, 각종 형태의 겔 및 단쇄 알코올 및 글리콜(예: 에틸 알코올 및 프로필렌 글리콜)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일례로서, 남성형 탈모증을 치료하기 위하여 사람 피부에 국소 투여하도록 동일한 부의 에틸 알코올 및 프로필렌 글리콜 중의 1% 미녹시딜을 사용하는 방법이 미국 특허 제4,596,812호에 기재되어 있다. 또한, 모발 성장을 자극하기 위하여 피부 부위에 국소 투여하기 위해, 상기 열거된 것과 같은 생리적으로 허용되는 불활성 담체 또는 희석제와 배합하여 사용하는 방법이 미국 특허 제5,538,945호에 기재되어 있다.

특정 양태에서 국소 투여를 위한 조성물은 본 발명의 화합물을 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.1% 내지 약 20%의 농도로 함유한다.

관련 양태에서, 국소 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 투과 증진제, 표면활성제 또는 이들의 혼합물을 추가로 함유한다. 예를 들면, 이러한 조성물은 하나 이상의 표면활성제(유화제라고도 부른다)를 0.5% 내지 10%(중량)로 함유할 수 있다. 표면활성제는 이온성 또는 비이온성일 수 있다.

적합한 비이온성 표면활성제의 예는 노닐페녹시폴리에톡시 에탄올(노녹시놀-9), 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르(Brij-97), 각종 폴리옥시에틸렌 에테르(Tritons), 및 각종 분자량의 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌의 블록 공중합체(예: Pluronic F68)이다. 적합한 이온성 표면활성제의 예는 나트륨 라우릴 설페이트 및 유사한 화합물을 포함한다. 적합한 투과 증진제는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 우레아 및 치환된 우레아 화합물을 포함한다. 국소 투여용 액상 제제의 경우, 투과 증진제(예: DMSO)의 농도는 조성물의 30% 내지 80% 범위일 수 있다.

더욱 특정한 또 다른 관련 양태는 일광 차단제, 스킨 컨디셔닝제, 피부 보호제, 연화제, 보습제, 헤어 컨디셔닝제 또는 이들의 혼합물을 추가로 함유하는 국소 투여에 적합한 본 발명의 조성물이다.

적합한 일광 차단제는 290 내지 400nm의 UV 범위 파장에서 복사선을 흡수, 반사 또는 분산시키며, 이의 특정 예로는 벤조페논-3(옥시벤존), 벤조페논-4(설이소벤존), 벤조페논-8(디옥시벤존), 부틸 메톡시디벤조일메탄(Avobenzone), DEA-메톡시신나메이트(디에탄올아민 메톡시신나메이트), 에틸 디하이드록시프로필 PABA(에틸 4-[비스(하이드록시프로필)]아미노벤조에이트), 에틸헥실디메틸 PABA(Padimate O), 에틸헥실 메톡시신나메이트(옥틸 메톡시신나메이트), 에틸헥실 살리실레이트(옥틸 살리실레이트), 호모살레이트, 멘틸안트라닐레이트(Meradimate), 옥토크릴렌, PABA(아미노벤조산), 페닐벤즈이미다졸 설폰산(Ensulizole), TEA-살리실레이트(트롤라민 살리실레이트), 이산화티탄 및 산화아연이 포함된다.

적합한 스킨 컨디셔닝제는 건조하거나 손상된 피부의 외관을 향상시키며, 플레이크 형성을 감소시키고, 유연성을 복원하고, 일반적으로 피부의 외관을 개선시킨다. 대표적인 예로는 아세틸 시스테인, N-아세틸 디하이드로스핑고신, 아크릴레이트/베헤닐 아크릴레이트/디메티콘 아크릴레이트 공중합체, 아데노신, 아데노신 사이클릭 포스페이트, 아데노신 포스페이트, 아데노신 트리포스페이트, 알라닌, 알부멘, 조류 추출물, 알란토인 및 유도체, 알로에 바바덴시스 추출물, 알루미늄 PCA, 아밀로글루코시다제, 알부틴, 아르기닌, 아줄렌, 브로멜라인, 버터밀크 파우더, 부틸렌 글리콜, 카페인, 칼슘 글루코네이트, 캅사이신, 카보시스테인, 카노신, 베타-카로텐, 카제인, 카탈라제, 세팔린, 세라마이드, 카모밀라 레쿠티타(메트리카 리아) 꽃 추출물, 콜레칼시페롤, 콜레스테릴 에스테르, 코코-베타인, 조효소 A, 개질된 옥수수 전분, 크리스탈린, 사이클로에톡시메티콘, 시스테인 DNA, 시토크롬 C, 다루토사이드, 덱스트란 설페이트, 디메티콘 코폴리올, 디메틸실란올 히알우로네이트, DNA, 엘라스틴, 엘라스틴 아미노산, 표피 성장 인자, 에르고칼시페롤, 에르고스테롤, 에틸헥실 PCA, 피브로넥틴, 폴산, 겔라틴, 글리아딘, 베타-글루칸, 글루코오스, 글리신, 글리코겐, 글리코리피드, 글리코프로테인, 글리코스아미노글리칸, 글리코스핑고리피드, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 수소화된 단백질, 가수분해된 단백질, 호호바 오일, 케라틴, 케라틴 아미노산 및 키네틴이 포함된다.

사용 가능한 스킨 컨디셔닝제의 다른 예로는 락토페린, 라노스테롤, 라우릴 PCA, 레시틴, 리놀레산, 리놀렌산, 리파제, 라이신, 리소자임, 맥아 추출물, 말토덱스트린, 멜라닌, 메티오닌, 광물염, 니아신, 니아신아미드, 귀리 아미노산, 오리자놀, 팔미토일 가수분해된 단백질, 판크리아틴, 파파인, PEG, 펩신,포스포리피드, 피토스테롤, 태반 효소, 태반 지질, 피리독살 5-포스페이트, 쿠에르세틴, 레소르시놀 아세테이트, 리보플라빈, RNA, 사카로마이스 상등액 추출물, 실크 아미노산, 스핑고리피드, 스테아르아미도프로필 베타인, 스테아릴 팔미테이트, 토코페롤, 토코페릴 아세테이트, 토코페릴 리놀레이트, 우비퀴논, 비티스 비니페라(vitis vinifera)(포도)씨 오일, 밀 아미노산, 크산탄검 및 아연 글루코네이트가 포함된다.

본원 명세서에서 피부 보호제란 손상되거나 노출된 피부를 유해하거나 자극적인 외부의 화합물로부터 보호하는 화합물을 의미한다. 적합한 예로는 조류 추출 물, 알란토인, 수산화알루미늄, 황산알루미늄, 베타인, 카멜리아 시넨시스 잎 추출물, 세레브로사이드, 디메티콘, 글루쿠로노락톤, 글리세린, 카올린, 라놀린, 맥아 추출물, 광물유, 바셀린, 칼륨 글루코네이트 및 활석이 포함된다.

본원 명세서에서 연화제란 피부를 부드럽고 매끄러우며 유연한 외관을 유지하도록 도울 수 있는 화장 성분을 의미한다. 연화제는 주로 피부 표면 위에 남아서 윤활제로서 작용하고 플레이크 형성을 감소시키는 능력 때문에 상기 이점들을 제공할 수 있다. 본 발명의 양태에 적합한 연화제의 일부 예로는 아세틸 아르기닌, 아세틸화된 라놀린, 조류 추출물, 아프리콧 커넬 오일 PEG-6 에스테르, 아보카도 오일 PEG-11 에스테르, 비스-PEG-4 디메티콘, 부톡시에틸 스테아레이트, C18-C36 산 글리콜 에스테르, C12-C13 알킬 락테이트, 카프릴릴 글리콜, 세틸 에스테르, 세틸 라우레이트, 코코넛 오일 PEG-10 에스테르, 디-C12-C13 알킬 타르트레이트, 디에틸 세바케이트, 디하이드로콜레스테릴 부티레이트, 디메티코놀, 디미리스틸 타르트레이트, 디스테아레스-5 라우로일 글루타메이트, 에틸 아보카데이트, 에틸헥실 미리스테이트, 글리세릴 이소스테아레이트, 글리세릴 올레이트, 헥실데실 스테아레이트 및 헥실 이소스테아레이트가 포함된다.

적합한 연화제의 추가의 예로는 수소화된 야자 글리세라이드, 수소화된 대두 글리세라이드, 수소화된 우지 글리세라이드, 하이드록시프로필 비스이소스테아르아미드 MEA, 이소스테아릴 네오펜타노에이트, 이소스테아릴 팔미테이트, 이소트리데실 이소노나노에이트, 라우레스-2 아세테이트, 라우릴 폴리글리세릴-6 세테아릴 글리콜 에테르, 메틸 글루세스-20 벤조에이트, 광물유, 미레스-3 팔미테이트, 옥틸데 칸올, 옥틸도데칸올, 오돈텔라 아우리타(odontella aurita) 오일, 2-올레아미도-1,3 옥타데칸디올, 야자 글리세라이드, PEG 아보카도 글리세라이드, PEG 피마자유, PEG-22/도데실 글리콜 공중합체, PEG 쉐(shea) 버터 글리세라이드, 피톨, 라피노오스, 스테아릴 시트레이트, 해바라기씨유 글리세라이드 및 토코페릴 글루코사이드가 포함된다.

보습제는 피부에 수분을 유지시키는 것을 돕는 화장 성분이다. 적합한 예로는 아세틸 아르기닌, 조류 추출물, 알로에 바바덴시스 잎 추출물, 베타인, 2,3-부탄디올, 키토산 라우로일 글리시네이트, 디글리세레스-7 말레이트, 디글리세린, 디글리콜 구아니딘 석시네이트, 에리트리톨, 프럭토오스, 글루코오스, 글리세린, 꿀, 수소화된 밀 단백질/PEG-20 아세테이트 공중합체, 하이드록시프로필트리모늄 히알우로네이트, 이노시톨, 락티톨, 말티톨, 말토오스, 만니톨, 만노오스, 메톡시 PEG, 미리스트아미도부틸 구아니딘 아세테이트, 폴리글리세릴 소르비톨, 칼륨 PCA, 프로필렌 글리콜, 나트륨 PCA, 소르비톨, 수크로오스 및 우레아가 포함된다. 당업자가 이해하듯이 기타의 보습제도 본 발명의 양태에 사용할 수 있다.

헤어 컨디셔닝제는 모발에 특정한 효과를 제공하는 데에 사용되는 화장 성분이다. 이것은 모발의 외관과 감촉을 향상시키고, 모발 유연성을 증가시키며, 스타일링을 손쉽게 하고, 광택 또는 윤기를 개선하며, 화학물질 또는 환경적 영향으로 손상된 모발의 조직을 개선하는 성분들을 포함한다. 적합한 예로는 아세틸화된 라놀린, 아모디메티콘, 베헨아미도프로필 에틸디모늄 에토설페이트, 베헨트리모늄 클로라이드, 부티로스페르뭄 파르키(Butyrospermum Parkii)(쉐 버터) 오일, 카프릴산/카프르산 글리세라이드, 세테아레스-20, 세틸피리디늄 클로라이드, 코카미도프로필 베타인, 코카미도프로필 하이드록시설타인, 코코디모늄 하이드록시프로필 가수분해된 케라틴, 디세틸디모늄 클로라이드, 디메틸 라우르아민 이소스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트 SE, 구아르 하이드록시프로필트리모늄 클로라이드, 가수분해된 글리코사미노글리칸, 가수분해된 케라틴, 하이드록시프로필 구아르 하이드록시프로필트리모늄 클로라이드, 이소스테아릴 글리세릴 펜타에리트리틸 에테르, 라우르디모늄 하이드록시프로필 가수분해된 밀 단백질, 리놀레아미도프로필 디메틸아민 다이머 딜리놀레이트, 리놀레아미도프로필 에틸디모늄 에토설페이트, 리놀레아미도프로필 PG-디모늄 클로라이드 포스페이트, 메틸클로로이소티아졸리논, 판테닐 하이드록시프로필 스테아르디모늄 클로라이드, PEG-40 소르비탄 라우레이트, PET-3 소르비탄 스테아레이트, PEG-6 소르비탄 스테아레이트, PPG-5-세테스-20, 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 실크 아미노산, 스테아피리움 클로라이드 및 스테아릴 에틸헥실디모늄 메토설페이트가 포함된다. 당업자가 이해하듯이 기타의 헤어 컨디셔닝제도 본 발명의 양태에 사용할 수 있다.

다른 대표적 양태에서, 활성 화합물들을 이온 영동에 의해 모낭에 전달하기 위하여 이들을 장치 안에 제형화한다. 당업자가 이해하듯이, 이와 같이 제형화된 조성물은 크림 또는 겔보다는 전형적으로 액체(즉, 용액)의 형태를 갖는다. 이러한 전달을 위해 적용되는 장치의 일례가 챔버를 포함하고 전류를 공급하는 대형 붕대이다. 챔버는 피부와 접촉하도록 위치하고 제제를 포함한다. 관련된 특정 양태에서, 활성 화합물은 초음파를 통해 모낭에 전달되도록 제형화된다. 당업자가 이해하듯이, 초음파 및 이온 영동은 각질층을 파괴하여 활성 화합물의 이동을 향상시킴으로써 활성 화합물의 모낭으로의 전달을 증진시킨다.

다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 액체, 크림, 현탁액, 겔, 유액, 로션 또는 오일의 형태를 가질 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 위에서 기술한 본 발명의 조성물을 사용하여 탈모 환자의 모발 성장을 자극하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 이 방법은 AGA, AA 또는 2차 탈모증 환자의 탈모된 피부 부위에 자극에 유효한 양의 본 발명의 조성물을 국소 투여 또는 피내 주사에 의해 투여함을 포함한다. 관련 양태에서, AGA를 저지하거나 AGA로부터 복원시킬 필요가 있는 환자의 두피에 본 발명의 조성물 유효량을 국소 투여 또는 피내 주사를 통해 연속적 또는 주기적 방식으로 투여함을 포함하는 AGA를 저지하거나 AGA로부터 복원하는 방법이 기재된다.

예를 들면, 본 발명은 방법은 상술한 바와 같이 국소 투여하도록 제조된 본 발명의 조성물을 로션 또는 겔 형태로 치료 부위의 피부 위에 문지르거나 액체 형태로 치료 부위 위에 분무함으로써 치료 부위 위에 직접 도포하는 단계를 포함할 수 있다. 모발 성장 속도를 촉진하거나 계속되는 탈모를 막기에 충분한 양의 조성물이 효과적이며, 모발 성장의 진행이 나타내는 대로 자주 치료를 반복할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 L-threonate가 사람 모유두 세포에서 DHT에 의한 DKK-1발현을 억제시키는 것을 보고한다.

본 발명은 100nM DHT(dihydrotestosterone)를 처리 한 경우 DKK-1 mRNA 발현 이 증가하는 것을 RT-PCR을 이용하여 확인하였다 (도 1, lane 1과 2 비교). 한편, L-threonate와 DHT를 동시에 처리한 경우 DHT에 의해 유도 되어진 DKK-1 mRNA 발현이 확연히 줄어드는 것을 관찰하였다 (도 1, lane 2, 3, 4 비교).

ELISA방법를 이용하여 조건 배지 안에 있는 DKK-1의 농도를 측정하였을때, DHT가 없는 경우 5.25 ng/ml이며, 100nM DHT를 처리 한 경우 11.49 ng/ml으로 DHT에 반응하여 DKK-1이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2, lane 1과 2 비교). 0.25mM과 1mM L-threonate를 DHT와 동시에 처리한 경우 DKK-1의 양은 각각 5.03ng/ml과 5.62ng/ml로 줄었으며, 이는 L-threonate에 의해 모유두세포에서 DHT에 의해 DKK-1 단백의 생성이 감소되고 따라서 분비되는 단백의 양이 감소되어지는 것을 알 수 있다 (도 2, lane 2, 3, 4 비교).

또한 모유두세포와 케라티노사이트를 이용한 동시배양 시스템은 안드로젠에 의해 분비되는 인자에 의한 epithelial-mesenchymal interaction을 연구하는데 이용되어져왔다(Inui S, Fukuzato Y, Nakajima T, Yoshikawa K, Itami S. FASEB J 2002;16:1967-9;Kwack MH, Sung YK, Chung EJ, Im SU, Ahn JS, Kim MK, Kim JC. J Invest Dermatol 2008;128:262-9;Itami S, Kurata S, Takayasu S. Biochem Biophys Res Commun 1995; 212:988-94.). 우리는 최근에 DHT가 동시배양 되어진 외모근초 케라티노사이트의 성장을 저해하며, 이것은 주로 DKK-1 때문이라고 증명하였다 (Kwack MH, Sung YK, Chung EJ, Im SU, Ahn JS, Kim MK, Kim JC. J Invest Dermatol 2008;128:262-9). 본 발명에서도 동시배양 되어진 외모근초 세포 성장은 100 nM DHT에 의해 억제 되어지는 것을 확인하였다 (도3, lane 1과 2 비교). L-threonate는 DHT에 의한 DKK-1 발현을 억제함으로 (도 1, 2 참조) L-threonate가 DHT에 의한 동시배양된 케라티노사이트 성장 제해를 약화시키는지를 연구하였다. 예상한 것 같이 L-threonate는 DHT에 의한 케라티노사이트 성장 제해를 역전시킴을 관찰하였다 (도 3, lane 2, 3, 4 비교).

또한 DKK-1 프로모터 활성화정도에 따라 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 pGL3-DKK-1 플라스미드를 만들었고, 이것을 이용하여 리포터 에세이를 수행하였다. 모유두 세포에 DHT를 처리한 경우 루시퍼레이즈 활성이 증가됨이 관찰되었다 (도 4, lane 1과 2 비교). L-threonate와 DHT를 동시에 처리한 경우, 모유두세포에서 DHT에 의해 증가된 루시퍼레이즈 활성화가 L-threonate에 의해 확연히 억제되었다 (도 4, lane 2, 3, 4 비교).

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이 남성형 탈모의 예방과 치료에 있어 L-threoniate 사용이 하나의 방법이 될 수 있음을 강력히 제시한다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 기재된 것으로서, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:모유두 세포와 외모근초 케라티노사이트 배양

생검조직 (4mm)은 남성형 탈모 환자의 모발이식 과정 중에 얻었다. 경북 대학교병원 윤리 위원회가 연구를 승인하였으며, 시술환자의 동의를 얻었다. 모낭은 이전의 방법을 약간 수정하여 분리하였다(Philpott MP, Sanders DA, Westgate GE, Kealey T. J Invest Dermatol 1994; 102:857-61; Magerl M, Kauser S, Paus R, Tobin DJ. Exp Dermatol 2002; 11:381-5). 간략히 말하면, 모낭하부를 포함하여 두피의 피하지방 부분을 표피와 진피로부터 분리하고 모낭은 현미경 하에서 핀셋을 이용하여 분리하였다.모유두는 절단된 모낭의 모구로부터 분리 한 뒤, type Ⅰ콜라겐이 코팅된 배양접시에 옮기고 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml)과 20% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM에서 95% 공기, 5% CO₂와 37℃조건으로 배양하였다. 일주일 동안 그대로 두었다가 모유두가 배양접시에 부착되어 세포가 뻗어 나오기 시작하면, 3일에 한 번씩 배지를 바꿔주었다. 세포가 자라면 0.25% trypsin/10mM EDTA를 이용하며 세포를 모으고, 1:3의 비율로 나눠 10% DMEM에서 유지하였다.

외모근초는 모낭조직으로부터 분리하게 되며 다른 세포의 오염을 방지하기 위해 모발의 모간과 모구 부위를 제거하여 정리한 후 20% 열비활성 혈청을 첨가한 DMEM에서 배양하였다. 3일 뒤, 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100ug/ml)과 암포테리신 B (250ng/ml)가 첨가된 KGM으로 배지를 바꿔 주었다. 이후부터는 계속 KGM에서 유지하며, 본 실험에서는 두 번 계대배양된 세포를 이용하여 실험을 진행하였다.

실시예 2:모유두세포와 케라티노사이트의 동시배양

모유두세포는 Transwell 배양접시 아래 칸에 3×10⁴개의 세포를 넣고 무혈청 배지에서 배양하였다. 24시간 뒤, 케라티노사이트 (1.5×10⁴)를 type Ⅰ과 Ⅲ 콜라겐이 코팅된 투과막 위 칸에서 배양하였다. 두 종류의 세포는 MCDB 153 배지로 4일 동안 co-culture하며, 조건에 따라 DHT와 L-threonate를 처리하였다. MTT 용액 (70ug/well) 넣고 3시간 뒤, formazan을 DMSO로 녹여 내고 570nm에서 측정하였다,

실시예 3:RT-PCR 분석

전체 RNA는 Trizol을 이용하여 분리하고. SuperscriptⅡ reverse transcriptase (Promega)와 oligo dT를 이용하여 3㎍ total RNA로부터 cDNA를 합성하고 한 후, 프라이머를 이용하여 적정 조건에서 PCR 증폭하였다. DKK-1의 발현을 보기위해 5'-TGATGAGT ACTGCGCTAGTC-3'(서열번호 1)와 5'-CTCCTATGCTTGGTACACAC-3' (서열번호 2)프라이머를 이용하여 25 cycles (94℃에서 1분, 58℃에서 45초, 및 72℃에서 45초) 증폭시켰다. β-actin의 발현을 보기위해 5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT -3'(서열번호 3)와 5'-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3'(서열번호 4) 프라이버를 이용하여 23 cycles (94℃에서 1분, 58℃에서 45초, 및 72℃에서 45초) 증폭시켰다. 1% agarose gel로 전기 영동한 후 UV 하에서 확인하였다.

실시예 4:효소면역측정법 (ELISA)

ELISA는 이전의 방법을 약간 수정하여 수행하였다(Tian E, Zhan F, Walker R, Rasmussen E, Ma Y, Shaughnessy JD. N Engl J Med 2003;349:2483-94). 간략히 말하면, 96 well plate에 1μg/ml 농도의 goat-anti-human DKK-1 항체를 100 μl씩 4^oC 에서 코팅시켰다. 16시간 후 4% BSA를 넣어 1시간동안 블라킹 시킨후 조건 배지를 100μl 씩 넣고 실온에 2시간 보관하였다. 그 이후 바이오틴이 붙어 있는 goat anti-human DKK-1 IgG( 농도 0.2 μg/ml)와 horseradish peroxidase-conjugated streptavidin을 넣고 30분 동안 두었다. TMB 기질을 넣고 450 nm에서 측정하였다. 재조합 인간 DKK-1을 농도별로 희석하여 표준을 설정하였다.

실시예 5:인간 DKK-1 프로모터/루시퍼라제 플라스미드 제조와 리포터 에세이(reporter assay)

인간게놈 DNA는 QIAamp DNA Mini kit을 이용하여 남성형 탈모환자의 모유두 세포에서 분리하여 사용하였다. pGL3-DKK-1 프로모터 플라스미드 제조는 이전에 언급된 것처럼 만들었다(Ohnaka K, Taniguchi H, Kawate H, Nawata H, Takayanagi R. BBRC 2004; 318:259-64). 간략히 말하면, 인간 DKK-1 프로모터의 앞쪽 988bp는 5´-CTCACGCGTCTGCCTAATCA-3´ (sense)(서열번호 5) 와 5´-AAGCTTTCAGAAGGACTCAAGAGGGA-3´ (antisense)(서열번호 6) 프라이머를 이용하여 PCR을 하여 증폭을 하였다. 제한효소 Mlu와 Hind 를 이용하여 절단한 다음, 프로모터를 가지고 있지 않는 루시퍼라제 발현벡터인 pGL3-Basic vector (Promega)에 클 로닝을 하여 pGL3-DKK-1 으로 지정하였다. 인간 모유두 세포(10⁴/well)에 마이크로포레이터를 이용하여 450ng pGL3-DKK-1와 control로 50ng pRLCMV를 도입시키고 24시간 후 무혈청 배지에 조건에 따라 100nM DHT와 L-threonate를 처리하였다. 24시간 후 dual luciferase assay kit를 이용하여 firefly와 renilla luciferase activity를 측정하였다.

도 1은 L-threonate에 의해 DHT에 의한 DKK-1 mRNA 발현이 억제되는 것을 보여주는 그림. 인간 모유두 세포에 100 nM DHT 및 L-threonate (0.25mM 과 1mM)를 6시간 동안 처리 한 후 RT-PCR로 분석하였다.

도 2는 L-threonate에 의해 DHT에 의한 DKK-1 단백질 생성 억제되는 것을 보여주는 그림. 인간 모유두 세포에 100 nM DHT 및 L-threonate (0.25mM 과 1mM)를 4일 동안 처리 한 후 조건배지의 DKK-1 농도를 ELISA를 통해 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험결과를 바탕으로 평균+/- 표준편차로 표기하였다.

도 3은 L-threonate에 의해 DHT에 의한 외모근초 성장 저해의 감쇠되는 것을 보여주는 그림. 모유두 세포와 외모근초세포 동시배양하면서, 100 nM DHT 및 L-threonate (0.25mM 과 1mM)를 4일 동안 처치하였다. 데이터는 각 조건 당 3개씩 수행하고, 세 번의 독립적인 실험결과를 바탕으로 평균+/- 표준편차로 표기하였다.

도 4는 L-threonate에 의해 DHT에 의한 DKK-1 프로모터의 활성화가 억제되는 것을 보여주는 그림. 인간 모유두 세포에 100 nM DHT 및 L-threonate (0.25mM 과 1mM)를 처치하고 루시퍼라제 리포터 활성을 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험결과를 바탕으로 평균+/- 표준편차로 표기하였다.

<110> Trichogene Inc. <120> A composition for preventing or treating alopecia comprising L-threonate <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgatgagtac tgcgctagtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcctatgct tggtacacac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggaaatcgt gcgtgacatt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggagttgaag gtagtttcgt g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctcacgcgtc tgcctaatca 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aagctttcag aaggactcaa gaggga 26

Claims (6)

1. 트레오네이트(threonate)를 유효성분으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 트레오네이트(threonate)는 L-트레오네이트인 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 트레오네이트는 칼슘 L-트레오네이트, 나트륨 L-트레오네이트, 크롬 L-트레오네이트, 및 철 L-트레오네이트로 구성된 군으로부터 선택된 탈모 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 탈모는 남성형 탈모인 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 탈모는 안드로겐에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 트레오네이트(threonate)은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1% ∼ 20%인 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물.

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