KR20100120532A - Method for reactivating multipotency and proliferation of senescent stem cells - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A method for reactivating multipotency of senescenced adult stem cells is provided to produce a large amount of adult stem cells having differentiation and proliferation abilities. CONSTITUTION: A method for reactivating multipotency and proliferation rate of senescenced adult stem cells comprises: a step of seeding senescenced adult stem cells of low density in a medium; and a step of culturing the adult stem cells to obtain reactivated adult stem cells. The adult stem cells are multipotency mesenchymal stem cells, multipotency hematopoietic stem cells, multipotency neural stem cells, or multipotency epidermal stem cells. The multipotency mesenchymal stem cells are derived from bone marrow.

Description

노화된 줄기세포의 다능성 및 증식률 재활성화 방법{Method for Reactivating Multipotency and Proliferation of Senescent Stem Cells}Method for Reactivating Multipotency and Proliferation of Senescent Stem Cells

본 발명은 노화된 성체 줄기세포의 다능성(multipotency) 및 증식률 재활성화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for reactivating multipotency and proliferation rate of aged adult stem cells.

성체줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에서 발견되는 미분화 세포로써, 자기 스스로 증식할 수 있으며, 조직이나 기관의 특수한 기능을 가지고 있는 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 신체줄기세포(somatic stem cell)를 말한다. 성체줄기세포의 주된 역할은 성체줄기세포가 존재하고 있는 조직이나 기관의 세포를 유지하고, 손상된 세포가 있으면 치료하는 것이다.Adult stem cells are undifferentiated cells found between differentiated cells of tissues or organs. Somatic stem cells have the ability to proliferate on their own and to differentiate into cells with specific functions of tissues or organs. stem cell). The main role of adult stem cells is to maintain the cells of tissues and organs in which adult stem cells are present and to treat any damaged cells.

골수에 적어도 2개의 성체줄기세포가 존재한다. 조혈모세포로 불리는 골수줄기세포는 우리 몸의 혈구세포를 만들고, 골수 기질세포(基質細胞: stromal cell)로 불리는 간엽(間葉)줄기세포는 뼈, 연골, 지방 과 섬유조직을 만든다. There are at least two adult stem cells in the bone marrow. Bone marrow stem cells called hematopoietic stem cells make blood cells of our body, and mesenchymal stem cells called bone marrow stromal cells make bone, cartilage, fat and fibrous tissue.

성체줄기세포를 이해하는데 있어서 중요한 점은 성체줄기세포는 각각의 조직 에 소량으로 존재한다는 것이다.　조직이 병에 걸리거나 손상을 받아서 성체줄기세포가 활성화 될 때 까지는 수년간 분열 혹은 증식하지 않고 잠잠하게 지낸다.　성체줄기세포를 가지고 있는 것으로 보고 되고 있는 기관은 뇌, 골수 , 말초혈액, 혈관, 근육, 피부와 간 등이다.　학자들은 성체줄기세포를 세포배양을 통해서 증식 시키고, 특정세포로 분화를 유도하여 우리 몸이 상처를 받거나 질병에 걸리면 사용하는 방법을 연구하고 있다. An important point in understanding adult stem cells is that adult stem cells are present in small amounts in each tissue. It stays silent for years without dividing or proliferating until the tissue is diseased or damaged and the adult stem cells are activated. Organs reported to have adult stem cells include the brain, bone marrow, peripheral blood, blood vessels, muscles, skin and liver. Scholars are investigating how adult stem cells can proliferate through cell culture and induce differentiation into specific cells that can be used when our bodies are hurt or diseased.

중간엽 줄기세포(MSC)는 국소마취 하에서 장골의 골수로부터 쉽게 분리될 수 있는 장점을 가진다. 이렇게 분리된 세포들은 플라스틱 세포 배양 접시에 부착될 수 있고, 섬유아세포-유사 콜로니(fibroblast-like colony)를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 골아세포, 지방세포, 연골세포, 및 신경세포 등으로 분화할 수 있는 다분화능을 가진 것으로 알려져 있다. 이러한 MSC의 많은 장점들에도 불구하고, 서로 다른 조건에서 준비된 MSC 를 연구하기에 앞서 고려해야 할 점들이 많다. Mesenchymal stem cells (MSCs) have the advantage of being easily separated from the bone marrow of the iliac bone under local anesthesia. These isolated cells are known to be able to attach to plastic cell culture dishes and form fibroblast-like colonies. In addition, it is known to have a multipotent ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, neurons and the like. Despite the many advantages of these MSCs, there are many points to consider before studying MSCs prepared under different conditions.

그 예로, Clark 등(Ann NY Acad Sci, 29;770;70-78, 1995년)은 뮤린(murine) 골수로부터 분리된 초기배양세포들은 MSC뿐만 아니라 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell)를 포함하고 있어 최소 두 가지 이상의 세포들이 존재하고 있음을 설명하였다. Phinney등 (J Cell Biochem, 15;72(4):570-585, 1999년)은 마우스 골수로부터 배양된 세포들 중 순수한 MSC의 성격을 가지고 있는 세포들은 적은 부위만을 차지하고 있기 때문에 순수한 MSC를 얻기 위한 방법으로 기존의 세포 분리방법이 적용되기는 어렵다고 보고하였다. 이와 더불어, Mets, T.등(Mech Ageing Dev, 16(1):81-89, 1981년)이 발표한 논문에서, 인간 골수 유래 MSC를 적어도 두 가지 형태의 세포들로 나눌 수 있는데, 그 중 타입 Ⅰ세포는 작고 길쭉한 모양과 빠른 성장속도를 보여주었으며, 반대로 타입 Ⅱ 세포는 넓게 퍼진 모양과 느린 성장속도를 보여주었다. 이러한 문제들뿐만 아니라, MSC는 배양 기간이 길어지는 동시에, 여러 번의 계대배양을 거치면서 증식능력과 다양한 계통으로의 분화능력이 감소되는 것으로 알려져 있다. Prockop등(Brit J Haematol, 107:275-281 ,1999년)의 연구에서 초기 계대(passage)의 MSC에 비해, 후기 계대의 MSC에서 콜로니 형성 능력이 현저히 감소하였으며, 골아세포로의 분화능력은 감소되지 않은 반면, 지방세포로의 분화가 억제되었음을 확인하였다. 또한, MSC의 노화는 골수 공여자의 나이보다는 오랜 배양기간 동안의 약화된 증식능력과 관련이 있으며(Kassem, Bone, 33:919-926, 2003년), 텔로머라아제 활성(telomerase activity)의 감소와도 연관이 있는 것으로 보인다(Kassem, Nat. Biotechnol, 20:592-596, 2002).For example, Clark et al. ( Ann NY Acad Sci , 29; 770; 70-78, 1995) indicate that early cultured cells isolated from murine bone marrow contain hematopoietic precursor cells as well as MSCs. It has been described that at least two cells are present. Phinney et al . ( J Cell Biochem , 15; 72 (4): 570-585, 1999) suggest that pure cells have a small portion of cells cultured from mouse bone marrow. It is reported that the conventional cell separation method is difficult to apply as a method. In addition, in a paper published by Mets, T. et al. ( Mech Ageing Dev , 16 (1): 81-89, 1981), human bone marrow-derived MSCs can be divided into at least two types of cells, among which Type I cells showed small elongated shapes and fast growth rates, whereas type II cells showed widespread shapes and slow growth rates. In addition to these problems, MSCs are known to have a long incubation period and to decrease proliferation and differentiation into various lines through several passages. In Prockop et al. ( Brit J Haematol , 107: 275-281, 1999), the colony-forming ability of MSCs in the late passages was significantly reduced and osteoblast differentiation capacity decreased compared to the MSs in the early passages. On the other hand, it was confirmed that differentiation into adipocytes was suppressed. In addition, aging of MSCs is associated with attenuated proliferative capacity over long periods of culture rather than the age of bone marrow donors (Kassem , Bone , 33: 919-926, 2003), and a decrease in telomerase activity. It also appears to be relevant (Kassem , Nat. Biotechnol , 20: 592-596, 2002).

이렇듯 현재 사람의 골수에서 얻을 수 있는 MSC의 양은 제한되어 있으며, 이렇게 얻은 골수유래 세포는 크기와 모양에서 다양한 세포집단을 이루고 있다. 뿐만 아니라 특정 계통으로의 분화 유도를 위해선 계대배양에 따른 분화능력의 감소와 같은 문제점들이 따라올 수밖에 없다. 이러한 단점들은 정확한 타겟 세포로 의 분화 유도와 그를 위해 적절한 줄기세포를 대량으로 확보해야 하는 임상적용에 있어서는 비현실적으로 느껴진다. 이러한 점들을 보완하기 위한 많은 연구들이 있었다. 그 중에서, FGF (fibroblast growth factor)의 사용은 MSC의 증식률을 높이고 유지하는데 효율적일 수 있다. 그러나 in vivo 에서 FGF가 처리된 MSC들 은 면역억제 포텐셜(immunosuppressive potential)이 향상되었다(Papamichail, Stem Cells, 24:462-471, 2006). 뿐만 아니라, MSC의 다분화능에도 영향을 미치는 것으로 보인다 (Papamichail, Stem Cells, 24:462-471, 2006). As such, the amount of MSC that can be obtained from human bone marrow is currently limited, and the bone marrow-derived cells thus obtained form a diverse cell population in size and shape. In addition, in order to induce differentiation into a specific system, problems such as the reduction of differentiation capacity due to subculture are bound to follow. These shortcomings seem unrealistic in the induction of differentiation into precise target cells and in clinical applications where appropriate stem cells must be secured in large quantities. There have been many studies to supplement these points. Among them, the use of fibroblast growth factor (FGF) can be efficient in increasing and maintaining the proliferation rate of MSCs. In vivo , however, FGF-treated MSCs have enhanced immunosuppressive potential (Papamichail , Stem Cells , 24: 462-471, 2006). In addition, it appears to affect the multipotency of MSCs (Papamichail , Stem Cells , 24: 462-471, 2006).

따라서 오랜 기간 동안 일률적인 세포모양과 증식률을 유지하고 여러 계통으로의 분화능력을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 노화된 MSC의 줄기성을 재활성화 시킬 수 있는 새로운 MSC의 배양방법의 필요성이 대두되고 있다.Therefore, the necessity of a new method of culturing MSC that can maintain the uniform cell appearance and proliferation rate for a long time, maintain the differentiation ability into several strains, and reactivate stem cell aging of aging MSC.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 환자로부터 제공된 성체줄기세포를 대량생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 다계대배양으로 인한 노화된 성체줄기세포를 저밀도로 배양하여 초기 계대배양 성체줄기세포의 특성인 다능성 및 빠른 증식률을 가지는 성체줄기세포를 제조할 수 있는 프로토콜을 구축함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors earnestly researched to develop a method for mass production of adult stem cells provided from a patient, and as a result, adult stem cells are cultured at low density due to multi-culture and are characteristics of adult-cultured adult stem cells. The present invention has been completed by establishing a protocol for producing adult stem cells having pluripotency and rapid proliferation.

따라서 본 발명의 목적은 노화된 성체 줄기세포의 다능성(multipotency) 및 증식률의 재활성화 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for reactivating multipotency and proliferation rate of aged adult stem cells.

본 발명의 다른 목적은 방법에 의하여 다능성(multipotency)이 재활성화된 성체 줄기세포를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide an adult stem cell whose multipotency is reactivated by the method.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 노화된 성체 줄기세포를 저밀도로 배지에 씨딩하는 단계; 및 (b) 상기 노화된 성체 줄기세포를 배양하여 다능성(multipotency) 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 노화된 성체 줄기세포의 다능성(multipotency) 및 증식률 재활성화 방법을 제 공한다.According to one aspect of the invention, the present invention comprises the steps of (a) seeding aged adult stem cells in the medium at low density; And (b) culturing the adult adult stem cells to obtain adult stem cells with reactivation of multipotency and proliferation rate. To provide.

본 발명자들은 환자로부터 제공된 성체줄기세포를 대량생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 다계대배양으로 인한 노화된 성체줄기세포를 저밀도로 배양하여 초기 계대배양 성체줄기세포의 특성인 다능성 및 빠른 증식률을 가지는 성체줄기세포를 제조할 수 있는 프로토콜을 구축하였다.The present inventors earnestly researched to develop a method for mass production of adult stem cells provided from a patient, and as a result, adult stem cells are cultured at low density due to multi-culture and are characteristics of adult-cultured adult stem cells. A protocol was established to prepare adult stem cells with pluripotency and rapid proliferation.

본 명세서에서 본 발명의 방법은 “노화된 성체 줄기세포의 다능성(multipotency) 및 증식률의 재활성화 방법”으로 표현되고 있다. 이는, “다능성 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포의 배양방법” 또는 “다능성 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포의 제조방법”으로 표현될 수도 있다.In the present specification, the method of the present invention is expressed as "a method for reactivating multipotency and proliferation rate of aged adult stem cells." This may be expressed as "a method of culturing adult stem cells with reactivation of pluripotency and proliferation rate" or "method of producing adult stem cells with reactivation of pluripotency and proliferation rate".

줄기세포는 크게 두 종류로 구별된다: 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell). 본 발명에서 이용되는 성체줄기세포는 다능성 줄기세포이며, 자가재생산(self-renewal) 능력을 갖는다.Stem cells are broadly divided into two types: pluripotent stem cells and multipotent stem cells, including embryonic stem cells (ES) and embryonic germ cells (EG). Adult stem cells used in the present invention are pluripotent stem cells, and have a self-renewal ability.

본 명세서에서 사용되는 용어 “노화된 성체줄기세포”는 성체줄기세포가 초기 계대 성체줄기세포의 특성 즉, 빠른 세포증식성과 다능성이 없는 성체줄기세포를 의미한다. 용어 “다능성(multipotency)”은 제한된 배엽의 세포로만 가는 분화능 또는 제한된 장기로만 분화가 가능한 세포분화능력을 의미한다.As used herein, the term "aged adult stem cells" refers to adult stem cells that adult stem cells do not have the characteristics of early passage adult stem cells, that is, rapid cell proliferation and pluripotency. The term "multipotency" refers to the ability to differentiate only to cells of restricted germ cells or to differentiate into only limited organs.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 성체줄기세포는 다능성 중간엽 줄기세포, 다능성 조혈모 줄기세포, 다능성 신경 줄기세포, 다능성 간 줄기세포, 다능성 췌장 줄기세포 또는 다능성 표피줄기세포를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 성체줄기세포는 다능성 중간엽 줄기세포, 다능성 조혈모 줄기세포이며, 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 성체줄기세포는 골수로부터 유래된 다능성 중간엽 줄기세포이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the adult stem cells used in the present invention are pluripotent mesenchymal stem cells, pluripotent hematopoietic stem cells, pluripotent neural stem cells, pluripotent stem stem cells, pluripotent pancreatic stem cells or Pluripotent epidermal stem cells. Even more preferably, the adult stem cells are pluripotent mesenchymal stem cells, pluripotent hematopoietic stem cells, most preferably, the adult stem cells used in the present invention are pluripotent mesenchymal stem cells derived from bone marrow to be.

골수에서 발견되는 줄기세포의 종류는 조혈줄기세포, 내피줄기세포, 중간엽줄기세포를 포함하여 다양하다. 조혈줄기세포는 피를 만들고, 표피줄기세포는 혈관계(예를 들면, 동맥과 정맥)를 만들고, 간줄기세포는 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아세포를 만든다.Stem cells found in the bone marrow are diverse, including hematopoietic stem cells, endothelial stem cells, and mesenchymal stem cells. Hematopoietic stem cells make blood, epidermal stem cells make blood vessels (eg arteries and veins), and liver stem cells make bones, cartilage, muscle, fat, and fibroblasts.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 노화된 성체줄기세포는 3-30회 계대배양된 성체줄기세포를 의미하며, 보다 바람직하게는 5-20회, 보다 더 바람직하게는 6-10회, 가장 바람직하게는 7-10회 계대배양된 세포를 의미한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the aged adult stem cells used in the present invention means adult stem cells passaged 3-30 times, more preferably 5-20 times, even more preferably 6-10 Per cell, most preferably 7-10 times.

본 발명에서는 노화된 성체줄기세포를 저밀도로 배양 배지에 씨딩(seeding)하여 재활성화시킨다.In the present invention, the aged adult stem cells are seeded in the culture medium at low density and reactivated.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 노화된 성체줄기세포를 1-1 x 103 세포수/cm2로 배지에 저밀도로 씨딩하며, 보다 바람직하게는 5-1 x 102 세포수/cm2로 씨딩하고, 보다 더 바람직하게는 10-50 세포수/cm로 씨딩하며, 가장 바람직하게는 15-20 세포수/cm2의 저밀도로 노화된 성체줄기세포를 배지에 씨딩한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the aged adult stem cells in the present invention are seeded in the medium at a low density of 1-1 × 10 3 cells / cm 2 , more preferably 5-1 × 10 2 cells / seeding in cm 2 , even more preferably 10-50 cell number / cm, most preferably 15-20 Aged adult stem cells at a low density of cell number / cm 2 are seeded in the medium.

본 발명의 배양 과정에서 이용되는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 배양 과정에서 이용되는 배지는 바람직하게는 혈청(예컨대, 우태아혈청)을 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는, 우태아 혈청이 첨가된 DMEM-LG (Dulbecco's modification of Eagle's medium-low glucose) 배지가 이용된다.The medium used in the culture process of the present invention may be any medium conventionally used for culturing animal cells, for example, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), α-MEM (Stanner, CP et al., Nat. New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 Medium (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. , 73: 1 (1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199: 519 (1967 )), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53: 288 (1965)), F10 (Ham, RG Exp. Cell Res. 29: 515 (1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8: 396 (1959)), mixtures of DMEM and F12 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980)), Way-mouth's MB752 / 1 ( Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22: 1003 (1959)), McCoy's 5A (McCoy, TA, et al., Proc. Soc.Exp. Biol. Med. 100: 115 (1959)) and the MCDB series (Ham, RG et al., In Vitro 14:11 (1978)) and the like can be used. The medium used in the culturing process of the present invention preferably further comprises serum (eg, fetal bovine serum), and most preferably, DMEM-LG (Dulbecco's modification of Eagle's medium-low glucose) to which fetal bovine serum is added Medium is used.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 성체줄기세포 배양 방법은 FBS(fetal bovine serum)의 농도를 단계적으로 변화시키면서 배양한다. 보다 바람직하게는 FBS 농도는 3-40 부피%의 범위에서 단계적으로 변화시키며, 가장 바람직하게는 10-20 부피%의 범위에서 단계적으로 변화시킨다.According to a preferred embodiment of the present invention, the adult stem cell culture method of the present invention is cultured by changing the concentration of fetal bovine serum (FBS) step by step. More preferably the FBS concentration is varied stepwise in the range of 3-40 vol%, most preferably in the range of 10-20 vol%.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 노화된 성체줄기세포 배양방법에 있어서 초기 배양 배지에는 고농도의 FBS(바람직하게는, 15-30 부피%, 보다 바람직하게는 약 20 부피%)를 첨가하고, 후기 배양 배지에는 저농도의 FBS(바람직하게는 5-13 부피%, 보다 바람직하게는 약 10 부피%)로 단계적으로 감소시켜 배양한다.According to a preferred embodiment of the present invention, in the aged adult stem cell culture method of the present invention, a high concentration of FBS (preferably 15-30% by volume, more preferably about 20% by volume) is added to the initial culture medium. The late culture medium is incubated in stages with a low concentration of FBS (preferably 5-13% by volume, more preferably about 10% by volume).

본 발명의 명세서 용어 “고농도”는 배지양(부피)을 기준으로 15 부피% 이상의 FBS의 농도를 의미하고, 용어 “저농도”는 배지양(부피)을 기준으로 13 부피% 이하의 FBS의 농도를 의미한다.In the present specification, the term "high concentration" means a concentration of 15% by volume or more of FBS based on the amount of medium (volume), and the term "low concentration" refers to a concentration of FBS of 13% by volume or less based on the amount of medium (volume). it means.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 재활성화된 성체줄기세포의 형태는 방추형(spindle) 형태의 세포 모양을 가지는 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the form of the reactivated adult stem cells in the present invention is characterized in that it has a spindle-like cell shape.

상기 방추형 형태는 환자로부터 채취하여 초기 배양한 경우 즉, 다능성을 가진 성체줄기세포 모양이며, 형태학적으로 상기 방추형 형태의 성체줄기세포는 다능성을 가지는 것으로 판단한다. The fusiform forms are taken from the patient and initially cultured, i.e., the shape of adult stem cells with pluripotency.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 단계에 수득한 다능성이 재활성화된 성체 줄기세포는 골아세포, 연골 세포 및 지방세포로 분화가 가능하다.According to a preferred embodiment of the present invention, the pluripotent reactivated adult stem cells obtained in the step (b) can be differentiated into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes.

환자로부터 성체줄기세포를 채취하여 다단계의 계대 배양을 하는 경우, 성체 줄기세포는 최초의 다능성을 거의 상실하여 골아세포로만 분화된다. 그러나, 본 발명의 방법에 의하여 노화된 성체줄기세포를 배양하는 경우 최초의 성체줄기세포의 특성 즉, 빠른 세포증식률과 다능성이 재활성화 되어 골아세포 뿐만 아니라 연골세포 및 지방세포로의 분화가 가능하다. When adult stem cells are harvested from a patient and subjected to multiple passages, adult stem cells almost lose their original pluripotency and only differentiate into osteoblasts. However, when aging adult stem cells are cultured by the method of the present invention, the characteristics of the first adult stem cells, that is, rapid cell proliferation and pluripotency, are reactivated to allow differentiation into chondrocytes and adipocytes as well as osteoblasts. .

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 수득한 다능성 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포는 MsX2, Osterix, CDK2, CDK4 및 Cyclin A2 유전자가 고발현 된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the pluripotent and proliferative adult stem cells obtained by the method of the present invention are highly expressed in MsX2 , Osterix , CDK2 , CDK4 and Cyclin A2 genes.

상기 MsX2 및 Osterix 유전자는 골-관련 유전자 마커이다. 노화된 성체줄기세포는 Cbfa 1, Dix5, ALP, Osteopontin, MsX2 및 Osterix 유전자의 발현이 유지된다. 그러나, 본 발명의 방법으로 노화된 성체줄기세포를 배양하는 경우 상기 유전자 마커 중 Cbfa 1, Dix5, ALP 및 Osteopontin 유전자의 발현은 현저히 감소되고 MsX2 및 Osterix 유전자는 고발현된다(참조: 본 발명의 도 8). 이러한 현상은 본 발명 저밀도 배양 방법으로 노화된 성체줄기세포를 배양하는 경우 골분화 뿐만 아니라 연골 세포 및 지방세포로의 분화가 가능하다는 것을 증명한다.The MsX2 and Osterix genes bone-related gene is a marker. The aging adult stem cells The expression of Cbfa 1, Dix5, ALP, Osteopontin , MsX2 and Osterix gene is maintained. However, in the case of culturing the adult stem cell aging by the method of the present invention, the genetic markers Cbfa 1, Dix5, ALP and Expression of Osteopontin gene of is significantly reduced gene MsX2 and Osterix are expressing high levels (Fig of the invention 8). This phenomenon proves that not only bone differentiation but also differentiation into chondrocytes and adipocytes is possible when culturing aged adult stem cells by the low density culture method of the present invention.

또한, 상기 CDK2, CDK4 및 Cyclin A2 유전자는 세포 사이클-관련 마커로서, 세포 주기과정에서 DNA가 2배로 증가하는 S기와 체세포분열을 일으키는 단계인 G1/M기에 중요한 역할을 한다. 노화된 성체줄기세포에서는 상기의 유전자의 발현이 현저히 감소되어 있음을 알 수 있으며, 이러한 유전자의 저발현으로 인하여 노화된 성체줄기세포는 세포증식률이 현저히 감소하게 된다.In addition, the CDK2 , CDK4 and Cyclin A2 genes are cell cycle-related markers, and play an important role in the G1 / M phase, which is a step of causing S-group and somatic division of DNA that doubles in the cell cycle. It can be seen that the expression of the gene is significantly reduced in aged adult stem cells. Due to the low expression of these genes, the aged adult stem cells are significantly reduced in cell proliferation.

그러나, 본 발명의 저밀도 배양 방법을 이용하여 노화된 성체줄기세포를 배 양하는 경우에는 CDK2, CDK4 및 Cyclin A2 유전자가 고발현 되며, 이러한 유전자들의 고발현을 통하여 본 발명의 배양 방법이 노화된 성체줄기세포를 재활성화 시켜 초기 배양 성체줄기세포와 동일한 빠른 세포증식률을 갖는다(참조: 본 발명의 도 도 6 및 도 9).However, when aging adult stem cells are cultured using the low density culture method of the present invention, CDK2 , CDK4 and Cyclin A2 genes are highly expressed, and the adult culture method of the present invention is aged through the high expression of these genes. Stem cells are reactivated to have the same rapid cell proliferation rate as the initial cultured adult stem cells (see FIGS. 6 and 9 of the present invention).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 방법은 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 이용하지 않고 노화된 성체줄기세포를 재활성화 시키는 것을 특징으로 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the culturing method of the present invention is characterized by reactivating aged adult stem cells without using a basic fibroblast growth factor (bFGF).

종래 성체줄기세포를 배양하는 방법에 따르면, 세포 증식률을 높이기 위하여 배지에 bFGF를 첨가한다. 그러나, in vivo에서 FGF를 처리하는 경우에는 면역억제 포텐셜이 증가하고 다분화능에 영향을 미친다(참조: 본 명세서의 종래기술). 본 발명에서는 배양 배지에 상기 FGF를 처리하지 않음으로써 노화된 성체줄기세포의 다분화능을 오랜 기간 동안 효율적으로 유지시킬 수 있다.According to the conventional method for culturing adult stem cells, bFGF is added to the medium in order to increase the cell proliferation rate. However, treatment of FGF in vivo increases the immunosuppressive potential and affects multipotency (see prior art herein). In the present invention, by not treating the FGF in the culture medium, it is possible to efficiently maintain the multipotency of the aged adult stem cells for a long time.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 노화된 성체줄기세포 재활성화 방법에 의하여 다능성(multipotency) 및 증식률이 재활성화된 성체줄기세포를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides adult stem cells whose multipotency and proliferation rate are reactivated by the aged adult stem cell reactivation method.

상기 다능성 및 증식률이 재활성화된 성체줄기세포는 본 발명의 일 양태인 노화된 성체줄기세포 재활성화 방법에 의하여 제조된 성체줄기세포이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the adult pluripotent stem cells of which the pluripotency and the proliferation rate are reactivated are adult stem cells prepared by the aged adult stem cell reactivation method, which is an aspect of the present invention, common contents between the two are excessive complexity of the present specification. In order to avoid, the description is omitted.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 노화된 성체줄기세포의 다능성(multipotency) 및 증식률 재활성화 방법 을 제공한다.(Iii) The present invention provides a method for reactivating multipotency and proliferation rate of aged adult stem cells.

(ⅱ) 본 발명은 종래의 줄기세포 배양 배지에 사용되는 성장인자(예를 들면, bFGF)나 화합물질을 전혀 사용하지 않으므로써, 이에 의한 부작용 억제와 초기 계대배양 성체줄기세포의 성질을 그대로 회복시킬 수 있는 장점이 있다.(Ii) The present invention does not use any growth factors (e.g., bFGF) or compounds used in conventional stem cell culture media, thereby restraining side effects and restoring the characteristics of early passage adult stem cells. There is an advantage to this.

(ⅲ) 본 발명은 노화된 성체줄기세포를 재활성화시킴으로써 환자로부터 추가적인 성체줄기세포 채취 없이 매우 적은 양의 성체줄기세포로 초기 계대배양세포와 동일한 분화력과 증식력을 가지는 성체줄기세포를 대량생산할 수 있다.(Iii) The present invention can mass-produce adult stem cells having the same differentiation and proliferative capacity as early subcultured cells with a very small amount of adult stem cells without additional adult stem cells from the patient by reactivating the aged adult stem cells. have.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 배아줄기세포보다 안전성면에서 매우 우수한 자가 골수 유래 성체줄기세포의 사용을 증가시킴으로서 다양한 임상분야에서 사용될 수 있다.(Iii) In addition, the present invention can be used in various clinical fields by increasing the use of autologous bone marrow-derived adult stem cells, which are much better in safety than embryonic stem cells.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “% “는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.Throughout this specification, unless otherwise indicated, “%” used to indicate the concentration of a particular substance is solid / solid (weight / weight)%, solid / liquid (weight / volume)%, and Liquid / liquid is (volume / volume)%.

실시예Example

재료 및 방법Materials and methods

인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (MSC)의 분리 배양Isolation and Culture of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (MSC)

성인 골수 부유물은 19-60세의 환자로부터 임상시험윤리위원회(Institutional Review Board: IRB) 승인 하에, 세브란스병원 정형외과 수술실로부터 수득하였다. 특수 코팅된 플라스틱 세포배양 접시에 대한 접착성을 이용하여 골수 부유물로부터 중간엽 줄기세포를 분리하였으며, 배양 후 7일째 플라스틱 세포배양 접시에 붙지 않은 조혈모세포들은 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하여 제거되었다. 이렇게 분리 배양된 세포들은 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)과 1 x 항생-항진균제(antibiotic-antimycotic, 인비트로젠, 미국)가 함유된 DMEM-LG (Dulbecco’s Modified Eagle’s mesium-low glucose; 인비트로젠, 미국)에서 배양하였다. 배양접시의 세포들을 90% 정도(컨플루언시)가 될 때까지 배양한 후, 0.25% 트립신/1 mM EDTA (인비트로젠, 미국)을 이용하여 배양접시에서 분리하였다. 분리된 세포들을 1,300 rpm에서 3분간 원심분리 시킨 후, 10 ㎠ 세포 배양접시에 다시 분주하였다. 이때 분주된 세포의 배양밀도는 10 ㎠ 배양접시 당 2 x 105개의 세포를 나타내었다(4,408 세포수/㎠). 이때가 제1계대 단계 이다. 이후, 배양 접시에 세포가 약 90% 정도 이르게 되면 같은 방법으로 계대배양을 해주었다.Adult bone marrow suspensions were obtained from a Severance Hospital orthopedic surgery room with approval from the Institutional Review Board (IRB) from patients aged 19-60 years. Mesenchymal stem cells were isolated from bone marrow suspended solids using adhesion to a specially coated plastic cell culture dish, and hematopoietic stem cells that did not adhere to the plastic cell culture dish were removed by washing with PBS (phosphate-buffered saline) 7 days after culture. It became. The isolated cells were cultured with DMEM-LG (Dulbecco's Modified Eagle's mesium-low glucose) containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 x antibiotic-antimycotic (Invitrogen, USA). (Invitrogen, USA). Cells in the petri dish were incubated until 90% (confluency) and then separated from the petri dish using 0.25% trypsin / 1 mM EDTA (Invitrogen, USA). The separated cells were centrifuged at 1,300 rpm for 3 minutes and then aliquoted again in a 10 cm 2 cell culture dish. At this time, the culture density of the divided cells is 10 cm 2 2 x 10 5 cells were shown per culture dish (4,408 cell numbers / cm 2). This is the first pass phase. Since, about 90% of the cells in the culture dish was passaged in the same manner.

MSC의 계대배양Subculture of MSC

제1계대(P1) 세포를 지속적으로 키우면서, 위에서 언급한 것과 같은 방법으로 90%이상의 세포가 배양접시에 차게 되면 계대 배양을 해주었다. 제7계대(P7)까지 배양이 진행된 후, 콜로니 형성 능력과 분화 능력을 관찰하였다.While continuously growing the first passage (P1) cells, passage culture was performed when more than 90% of the cells in the culture dish in the same manner as mentioned above. After incubation to the seventh passage (P7), colony forming ability and differentiation ability were observed.

표준배양방법과 저밀도배양방법에 의한 MSC의 배양Cultivation of MSC by Standard Culture and Low Density Culture

① 표준배양방법(Standard Culture Method: STD): 상기 MSC 분리 배양방법과 같은 방법으로서, 콜로니형성능력과 분화능력이 떨어진 제7계대 세포가 배양접시에 90% 정도 차있을 때, 2 x 105개의 세포(4408 세포/㎠)를 기준으로 새로운 지름 10 ㎝ 배양접시에 계대 배양하였다. 배지의 조성은 DMEM배지에 10% FBS와 1%의 항체가 첨가된 배지를 사용하였다. 90%정도의 세포가 배양 접시에 채워지게 되면, 트립신(0.25% 트립신/1 mM EDTA)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 각 실험에 사용하였다.① Standard Culture Method (STD): Same method as the above MSC separation culture method, when the 7th passage cell with poor colony forming ability and differentiation capacity is about 90% full in the culture dish, 2 x 10 5 cells Cells were passaged on a fresh 10 cm diameter dish based on cells (4408 cells / cm 2). The composition of the medium was a medium in which 10% FBS and 1% antibody was added to DMEM medium. When about 90% of the cells were filled in the culture dish, trypsin (0.25% trypsin / 1 mM EDTA) to remove the cells were used in each experiment.

② 저밀도배양방법(Low Density Culture Method: LD): 표준배양방법에서 사용된 세포와 같은 세포를 이용하였다. 1 x 103개의 세포(17 세포/㎠)를 기준으로 새로운 지름 10 ㎝ 배양접시에 계대 배양하였다. 배지의 조성은 상기 STD와 동일 한 DMEM 배지에 FBS와 1%의 항체를 첨가하여 사용하였다. 배양 초기 FBS의 농도는 밀도가 작고, 세포가 자라는 속도를 촉진시켜 주기 위하여 20% 농도의 FBS를 사용하지만, 세포가 밀집된 상태에서 높은 농도의 FBS는 세포의 형태를 바꾸고 성질을 변화시키는 주요원인이 될 수 있기 때문에, 배양 후기에는 일반적으로 배지에 첨가하는 농도인 10%로 바꾸어 배양하였다. 대략 10-12일(Donor variation) 배양한 후 트립신(0.25% 트립신/1 mM EDTA)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 각 실험에 사용하였다.② Low Density Culture Method (LD): The same cells used in the standard culture method were used. Subcultured on a fresh 10 cm diameter dish based on 1 x 10 3 cells (17 cells / cm 2). The composition of the medium was used by adding FBS and 1% antibody to the same DMEM medium as the STD. The concentration of FBS at the initial stage of culture is small and the 20% concentration of FBS is used to promote the rate of cell growth.However, the high concentration of FBS in the densely packed cells is a major cause of changing the shape and properties of the cells. In the late stage of culture, the culture was changed to 10%, which is a concentration added to the medium. After culturing for approximately 10-12 days (Donor variation), trypsin (0.25% trypsin / 1 mM EDTA) to remove the cells were used in each experiment.

콜로니-형성 유니트 섬유아세포(Colony-forming unit fibroblast: CFU-F) 분석Colony-forming unit fibroblast (CFU-F) assay

제1계대 MSC과 제7계대 MSC를 STD 배양 방법과 LD 배양 방법으로 각각 배양된 MSC들의 증식 포텐셜(replicative potential) 정도를 파악하기 위하여 CFU-F 분석을 다음과 같이 실시하였다.CFU-F analysis was performed to determine the proliferative potential of MSCs cultured in the first passage MSC and the seventh passage MSC by STD culture method and LD culture method, respectively.

4 종류의 세포(제1계대 MSC, 제7계대 MSC, STD 배양 방법을 배양된 제7계대 MSC 및 LD 배양 방법으로 배양된 제7계대 MSC)를 10 ㎠ 배양접시 하나에 103개씩 각각 분주하여 20%의 FBS가 첨가된 DMEM-LG 배지에서 배양하였다. 배지는 3일에 한번 씩 교환하였으며, 12일 동안 배양하였다. 배양된 각각의 세포를 PBS로 세척한 후, 세포고정액(아세톤: 메탄올=1:1)으로 2분간 고정시켰다. 그 다음, 각각의 세포들을 크리스탈 바이롤렛(crystal violet: CV, Merck, Darmstadt, 독일)으로 30분 동안 염색하였다. CV로 염색된 각각의 세포를 멸균된 3차 증류수로 다시 세척 한 후 콜로니 형성 정도를 비교하였다.Four kinds of cells (1st passage MSC, 7th passage MSC, STD culture method 7th passage MSC and LD culture method cultured in 7th passage MSC cultured in each 10 cm 2 culture dish was dispensed 10 3 each Cultured in DMEM-LG medium with 20% FBS added. The medium was changed every 3 days and incubated for 12 days. Each cultured cell was washed with PBS and then fixed for 2 minutes with a cell fixative solution (acetone: methanol = 1: 1). Each cell was then stained with crystal violet (CV, Merck, Darmstadt, Germany) for 30 minutes. Each cell stained with CV was washed again with sterile tertiary distilled water and then compared with the degree of colony formation.

배양 방법에 따른 증식력 분석(Hexosaminidase assay)Hexosaminidase assay according to the culture method

P7 MSC를 STD 방법과 LD 방법을 이용하여 각각 배양하였다. 각각의 세포 컨플루언시(confluency)가 90% 정도 되었을 때, 24 웰 플레이트에 10%의 FBS가 첨가된 DMEM-LG 배지를 넣은 후 각 웰 당 104개의 세포수로 분주하여 배양하였다. 각 그룹의 증식능력은 1, 3 및 5일째에 각각 관찰하였다. 각각의 세포를 PBS로 세척한 후, 7.5 mM PNAD(p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide; pH 5.0, 시그마, 미국)가 포함된 0.1 M 시트레트 완충액(citrate buffer; 시그마, 미국)과 동일한 양의 0.5% 트리톤 X-100(시그마, 미국)이 첨가된 혼합용액에 37℃에서 3시간 반응시켰다. 그 다음, 5 mM의 EDTA(ethylenediaminetetra acetic acid; 시그마, 미국)가 포함된 50 mM 글리신 완충액(glycine buffer; pH 10.4, 암레스코, 미국)을 첨가하였다. 반응 후, 방출된 헥소사미니다아제(hexosaminidase)의 흡광도를 405 ㎚에서 측정하였다. P7 MSCs were cultured using the STD method and the LD method, respectively. When the cell confluency was about 90%, DMEM-LG medium containing 10% FBS was added to a 24 well plate, and the cells were divided and cultured with 10 4 cells per well. Proliferative capacity of each group was observed at 1, 3 and 5 days, respectively. After washing each cell with PBS, 0.1 M citrate buffer containing 7.5 mM PNAD (p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide; pH 5.0, Sigma, USA) The same amount of 0.5% Triton X-100 (Sigma, USA) was added to the mixed solution at 37 ° C for 3 hours. Then 50 mM glycine buffer (pH 10.4, Amlesco, USA) containing 5 mM EDTA (ethylenediaminetetra acetic acid; Sigma, USA) was added. After the reaction, the absorbance of the released hexosaminidase was measured at 405 nm.

유세포 분석기(fluorescent activated cell sorter: FACS)를 이용한 DNA 세포주기 분포 측정DNA Cell Cycle Distribution Measurement Using Fluorescent Activated Cell Sorter (FACS)

STD 배양법과 LD배양법을 이용하여 각각 배양된 P7 MSC를 PBS로 세척한 후, 0.25% 트립신/1 mM EDTA를 이용하여 세포를 분리하였다. 배양접시에서 분리된 세 포들을 1 x 106 세포수/㎖의 농도로 PBS에 부유시킨 후, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 시켰다. 세포를 제외한 상층액을 제거한 후, 70% 에탄올로 세포를 -20℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포들을 원심분리 후, PBS 세척 한 후, FACS 튜브로 옮겼다. 50 ㎍/㎖의 PI(propidium iodide; 시그마, 미국)와 100 ㎍/㎖의 RNase A (시그마, 미국)혼합액에 세포를 부양시킨 후, 4℃에서 40분간 반응시켰다. DNA 세포주기분포 분석은 FACScan (Becton Dickinson Instrument, 미국)상에서 이루어졌다.P7 MSCs cultured using STD culture and LD culture were washed with PBS, and then cells were separated using 0.25% trypsin / 1 mM EDTA. Cells isolated from the culture dish were suspended in PBS at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, and then centrifuged at 13,000 rpm for 3 minutes. After removing the supernatant except the cells, the cells were fixed for 1 hour at -20 ℃ with 70% ethanol. The fixed cells were centrifuged, washed with PBS and then transferred to FACS tubes. Cells were suspended in 50 μg / ml of PI (propidium iodide; Sigma, USA) and 100 μg / ml of RNase A (Sigma, USA), followed by 40 minutes of reaction at 4 ° C. DNA cell cycle analysis was performed on FACScan (Becton Dickinson Instrument, USA).

유세포 분석기를 이용한 세포의 크기분포 분석Analysis of Cell Size Distribution Using Flow Cytometry

STD 배양법과 LD배양법을 이용하여 각각 배양된 P7 MSC를 PBS로 세척한 후, 0.25% 트립신/1 mM EDTA를 이용하여 세포를 분리하였다. 배양접시에서 분리된 세포들을 1 x 106 세포수/㎖의 농도로 PBS에 부유시킨 후, 세포크기분포를 FACScan을 이용하여 분석하였다. P7 MSCs cultured using STD culture and LD culture were washed with PBS, and then cells were separated using 0.25% trypsin / 1 mM EDTA. Cells isolated from the culture plate were suspended in PBS at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, and cell size distribution was analyzed using FACScan.

유세포 분석기를 이용한 세포크기분류(cell sorting)Cell sorting using flow cytometer

STD 배양법과 LD배양법을 이용하여 각각 배양된 P7 MSC를 PBS로 세척한 후, 0.25% 트립신/1 mM EDTA를 이용하여 세포를 분리하였다. 배양접시에서 분리된 세포들을 1 x 106 세포수/㎖의 농도로 PBS에 부유시킨 후, 빠르게 FACScan 기계로 이동 시켰다. 이동된 세포들을 FACScan상에서 10 ㎛ 이하, 10-30 ㎛, 그리고 30 ㎛ 이상의 세포들로 분리하였다. 크기 별로 분리된 세포들을 세포배양접시에 다시 배양하여 CFU-F 분석을 하였다.P7 MSCs cultured using STD culture and LD culture were washed with PBS, and then cells were separated using 0.25% trypsin / 1 mM EDTA. Cells isolated from the culture dish were suspended in PBS at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, and then rapidly transferred to the FACScan machine. The migrated cells were separated into cells of 10 μm or less, 10-30 μm, and 30 μm or more on FACScan. Cells separated by size were cultured again in a cell culture dish for CFU-F analysis.

MSC의 골분화 유도 및 분화 확인Induction and Differentiation of Bone Differentiation of MSCs

P7 MSC를 STD 배양법과 LD 배양법을 각각 이용하여 배양하였다. 배양 10-12일 후, P7 MSC를 골아 세포로의 분화를 유도시키기 위하여 12 웰 플레이트에 웰 당 8 x 104개의 세포로 분주하였다. 배양 24시간 후, 골분화 배지[10% FBS, 1% 항생-항진균액(antibiotic-antimycotic; Gibco BRL, 미국), 100 nM 덱사메사손(dexamethasone; 시그마, 미국), 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate; 시그마, 미국), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid; Gibco, 미국)을 첨가한 DMEM-LG]를 첨가하여 14일간 배양하였다. 3일 간격으로 분화배지를 교체하였으며, 아스코르브산는 매일 주입 하였다.P7 MSCs were cultured using STD culture and LD culture, respectively. After 10-12 days of culture, P7 MSCs were dispensed at 8 × 10 4 cells per well in 12 well plates to induce differentiation into osteoblasts. After 24 hours of culture, bone differentiation medium [10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic (Gibco BRL, USA), 100 nM dexamethasone (Sigma, USA), 10 mM β-glycerophosphate (β-glycerophosphate (Sigma, USA), 50 ㎍ / ㎖ ascorbic acid (Dascorbic acid (Gibco, USA) added DMEM-LG)] was incubated for 14 days. Differentiation medium was replaced every three days, and ascorbic acid was injected daily.

P7 MSC의 골분화 유도 및 분화를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 염색하였다.In order to confirm osteoinduction and differentiation of P7 MSC, staining was performed as follows.

① ALP(Alkaline phosphatase) 염색: 14일 동안 골아세포로 분화 유도된 세포들을 ALP 고정용액(시트레이트 완충액(citrate buffer):아세톤=2:3)에 30초간 고정하였다. 고정된 세포들을 증류수로 세척한 후, 알카라인-다이(Alkaline-Dye) 용액(시그마, 미국)을 각 웰에 첨가하여 실온에서 빛을 차단한 채 30분간 반응시켰다. 반응시킨 세포를 증류수로 세척한 후, Mayer’s 헤마톡실린hematoxylin 용 액(시그마, 미국)에 5분간 염색시켰다. 마지막으로 탭 워터(tap water)로 헹군 후, 현미경하에서 염색된 세포를 관찰하였다.① ALP (Alkaline phosphatase) staining: The cells induced to differentiate into osteoblasts for 14 days were fixed in ALP fixation solution (citrate buffer: acetone = 2: 3) for 30 seconds. After the fixed cells were washed with distilled water, an Alkaline-Dye solution (Sigma, USA) was added to each well and allowed to react for 30 minutes while blocking light at room temperature. The reacted cells were washed with distilled water, and then stained for 5 minutes in Mayer's hematoxylin hematoxylin solution (Sigma, USA). Finally, after rinsing with tap water, the stained cells were observed under a microscope.

② 본 코사(Von kossa) 염색: 14일 동안 골아세포로 분화 유도된 세포들을 메탄올:아세톤(1:1) 고정 용액에 30초간 고정하였다. 고정된 세포들을 증류수로 세척한 후, 2% 실버 니트래이트(silver nitrate; 시그마, 미국) 용액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 빛을 차단한 채 30분간 반응시켰다. 반응시킨 세포를 증류수에 세척한 후, 30분간 강한 빛(36 watt light bulb)에 노출시켰다. 약 30분 후, 염색된 세포는 칼슘염이 갈색-검은색으로 염색되었다. 이 후, 칼슘 침착량 정도를 현미경하에서 관찰하였다.② Von kossa staining: The cells induced differentiation into osteoblasts for 14 days were fixed in methanol: acetone (1: 1) fixation solution for 30 seconds. After the fixed cells were washed with distilled water, 2% silver nitrate (Sigma, USA) solution was added to each well and allowed to react for 30 minutes while blocking light at room temperature. The reacted cells were washed in distilled water and then exposed to strong light (36 watt light bulb) for 30 minutes. After about 30 minutes, the stained cells were stained brown-black with calcium salt. Thereafter, the amount of calcium deposition was observed under a microscope.

MSC의 지방분화 유도 및 분화 확인Induction and differentiation of adipose differentiation of MSCs

P7 MSC를 STD 배양법과 LD 배양법을 각각 이용하여 배양하였다. 배양 10-12일 후, 지방 세포로 분화유도하기 위하여 12 웰 플레이트에 각 웰당 8 x 104개의 세포로 분주하였다. 배양 24시간 후, 지방세포 분화배지[10% FBS, 1% 항생-항진균액(Gibco BRL, 미국), 0.5 mM IBMX(isobutylmethylxanthine; 시그마, 미국), 1 μM 덱사메사손(시그마, 미국), 5 ㎍/㎖ 인슐린(Gibco, 미국), 200 μM 인도메타신(indomethacin; 시그마, 미국)을 첨가한 DMEM-LG]를 첨가하여 14일간 배양하였다. 분화배지는 3일 간격으로 교체하였다.P7 MSCs were cultured using STD culture and LD culture, respectively. After 10-12 days of culture, 12 well plates were dispensed at 8 x 10 4 cells per well in 12 well plates to induce differentiation into adipocytes. After 24 hours of culture, adipocyte differentiation medium [10% FBS, 1% antibiotic-antifungal solution (Gibco BRL, USA), 0.5 mM IBMX (isobutylmethylxanthine (Sigma, USA), 1 μM dexamethasone (Sigma, USA), 5 DMEM-LG with [mu] g / ml insulin (Gibco, USA) and 200 [mu] M indomethacin (Sigma, USA) was added and cultured for 14 days. Differentiation medium was replaced every three days.

MSC의 지방분화 유도 및 분화를 확인하기 위하여 다음과 같이 오일 레드 O(Oil red O) 염색을 실시하였다.In order to confirm the induction and differentiation of fat differentiation of MSC, oil red O (Oil red O) staining was performed as follows.

14일 동안 지방세포로 분화 유도된 세포들을 10% 포르말린-중성액(formalin-neutral buffer)에 30분 동안 고정시킨 후 증류수로 세척하였다. 그 다음, 60% 이소프로판올(isopropanol)로 5분 동안 방치한 후, 0.18%의 오일 레드 O (시그마, 미국) 용액으로 5-30분간 염색하였다. 증류수로 다시 세척한 후, 지방세포로 분화 유도된 세포들을 현미경하에서 관찰하였다.Cells induced to differentiate into adipocytes for 14 days were fixed in 10% formalin-neutral buffer for 30 minutes and then washed with distilled water. It was then left for 5 minutes with 60% isopropanol and then stained for 5-30 minutes with 0.18% oil red O (Sigma, USA) solution. After washing again with distilled water, cells differentiated into adipocytes were observed under a microscope.

MSC의 연골분화 유도 및 분화 확인 염색방법Induction of cartilage differentiation and confirmation of differentiation of MSC

P7 MSC를 STD 배양법과 LD 배양법을 각각 이용하여 배양하였다. 배양 10-12일 후, 연골 세포로 분화 유도시키기 위하여 12 웰 플레이트에 각 웰 당 8 x 104개의 세포로 분주하였다. 배양 24시간 후, 연골세포 분화배지[1 x ITS (Insulin-Transferrin-Selenium-A; Gibco, 미국), 1% 항생-항진균액(antibiotic-antimycotic), 50 ㎍/㎖ 아스코르빈산(ascorbic acid), 10 ng/㎖ TGF-β3 (R&D 시스템, 미국)을 첨가한 DMEM-HG(high glucose)]를 첨가하여 14일간 배양하였다. 3일 간격으로 분화배지를 교체하였으며, TGF-β3은 2일 간격으로 처리하였다.P7 MSCs were cultured using STD culture and LD culture, respectively. After 10-12 days of culture, 12 well plates were dispensed at 8 x 10 4 cells per well in 12 well plates to induce differentiation into chondrocytes. After 24 hours of culture, chondrocyte differentiation medium [1 x ITS (Insulin-Transferrin-Selenium-A; Gibco, USA), 1% antibiotic-antimycotic, 50 μg / ml ascorbic acid , DMEM-HG (high glucose) with 10 ng / ml TGF-β3 (R & D system, USA) was added and cultured for 14 days. Differentiation medium was replaced every three days, and TGF-β3 was treated every two days.

14일 동안 연골세포로 분화 유도된 세포들을 고정용액에 고정하지 않고 증류수로 세척하였다. 세척된 세포에 1% 아세트산(acetic acid)에 용해시킨 1% 사프라닌 O(safranin O; 시그마, 미국) 염색 용액을 넣고 1-3시간 동안 방치시킨다. 1% 아세트산으로 세척한 후, 현미경하에서 관찰하였다. Cells induced to differentiate into chondrocytes for 14 days were washed with distilled water without being fixed in fixed solution. The washed cells were added with 1% safranin O (Sigma, USA) staining solution dissolved in 1% acetic acid and allowed to stand for 1-3 hours. After washing with 1% acetic acid, it was observed under a microscope.

역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR)Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

P7 MSC를 STD 배양법과 LD 배양법을 각각 이용하여 배양한 후, 12 일째에 0.25% 트립신/1 mM EDTA를 이용하여 배양접시에서 분리하였다. 수집한 세포들로부터 RNeasy 미니 키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 cDNA 합성에 사용될 모든 RNA를 분리하였다. 그리고 분광 광도계를 이용하여 260 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 유출액 내의 총 RNA를 정량 한 후에 -70℃에 보관하였다.P7 MSCs were cultured using STD culture and LD culture, respectively, and then separated from the culture dish using 0.25% trypsin / 1 mM EDTA on day 12. From the collected cells, all RNA to be used for cDNA synthesis was isolated using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA). The absorbance at 260 nm was measured using a spectrophotometer and the total RNA in the effluent was quantified and stored at -70 ° C.

분리한 각 세포의 총 RNA 1 ㎍을 옴니스크립트 키트(Omniscript kit; Qiagen, 미국)의 정해진 용액과 교반하여 최종 부피를 20 ㎕로 맞춘 다음 37℃에서 90분간, 95℃에서 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.1 μg of total RNA from each cell was stirred with a predetermined solution of Omniscript kit (Qiagen, USA) to adjust the final volume to 20 μl, followed by 90 minutes at 37 ° C. and 5 minutes at 95 ° C. to cDNA. Synthesized.

합성된 각각의 cDNA 2 ㎕에 10 피코몰(picomole)의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 첨가한 후 Taq 폴리머라아제 키트(Qiagen, 미국)의 정해진 용액과 교반하였다. 최종 부피가 50 ㎕가 되게 한 후 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 반응액 20 ㎕를 취하여 1.5% (w/v) 아가로스 젤 전기영동을 시행한 후, UV 상에서 각 밴드의 굵기를 확인하였다.2 pi of each synthesized cDNA was added with 10 picomole of forward primer and reverse primer, followed by stirring with a predetermined solution of Taq polymerase kit (Qiagen, USA). The final volume was 50 μl and the polymerase chain reaction was performed. 20 μl of the reaction solution was taken, 1.5% (w / v) agarose gel electrophoresis was performed, and the thickness of each band was confirmed on UV.

Figure 112009027223256-PAT00001
Figure 112009027223256-PAT00001

역전사-중합효소 연쇄반응을 위한 프라이머 염기 서열 목록.List of primer base sequences for reverse transcriptase-polymerase chain reaction.

Figure 112009027223256-PAT00002
Figure 112009027223256-PAT00002

각 primer의 중합 효소 연쇄 반응 조건Polymerase chain reaction condition of each primer

실험 결과Experiment result

MSC의 노화 정도를 확인하기 위하여, 제7계대까지 계대배양을 진행한 후, 제1계대(P1)와 제7계대(P7) MSC의 콜로니형성능력과 분화능력을 확인하였다. 콜로니 형성능력과 분화능력은 MSC의 줄기성(stemness)을 결정짓는 중요한 인자(factor)로서 알려져 있다. 크리스탈 바이롤렛(CV) 염색을 통하여 초기 배양된 P1 MSC의 콜로니형성 능력이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 P7 MSC는 P1 MSC에 비해 콜로니형성 능력이 감소된 모습을 보여 주었다. 반대로 골아세포의 초기 표지인자로서 알려져 있는 ALP 발현은 P7 MSC에서 증가되어 있는 모습을 보여 주었다. 분화능력에 있어서도, P1 MSC는 골아세포, 지방세포, 연골 세포로 분화가 다 잘되는 반면에 P7 MSC는 골아세포로의 분화만 잘되었다. 이러한 결과들은, P7 MSC가 골아 전구세포로 고정(arrest)되어 있다는 것을 보여주는 동시에 줄기성이 감소되어 MSC의 노화가 진행 중임을 알 수 있었다(도 2).In order to confirm the degree of aging of the MSC, after passage to the seventh passage, the colony forming ability and differentiation ability of the first passage (P1) and the seventh passage (P7) MSC was confirmed. Colony forming ability and differentiation capacity are known as important factors that determine the stemness of MSCs. Crystal viallet (CV) staining was confirmed that the colony-forming ability of the initial cultured P1 MSC. However, P7 MSC showed reduced colony forming ability compared to P1 MSC. In contrast, ALP expression, known as an early marker of osteoblasts, was increased in P7 MSCs. In terms of differentiation capacity, P1 MSCs were well differentiated into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes, while P7 MSCs were only well differentiated into osteoblasts. These results show that the P7 MSCs are arrested as osteoblastic progenitors (arrest), and at the same time, stemming was reduced, indicating that the aging of MSCs is in progress (FIG. 2).

노화가 진행 중인 P7 MSC가 특정 배양 방법을 통해 다시 초기의 줄기성을 되찾을 수 있는지 알아보기 위해, 저밀도 배양 방법(LD)을 이용하여 세포를 배양하였다. 그 결과, 세포의 모양에서 작고 뾰족한 형태를 가진 P1 MSC와 달리 크고 넓게 퍼진 형태를 보여주었던 P7 MSC의 모양이 초기 MSC의 모습인 방추(spindle) 형태로 회복되는 것을 확인할 수 있었으며, 다양한 공여자(donor)에서 이러한 패턴(pattern)이 확인되었다(도 3).Cells were cultured using the low density culture method (LD) to see if aging P7 MSCs could regain their initial stem cellity through specific culture methods. As a result, it was confirmed that the shape of the P7 MSC, which showed a large and wide spread form unlike the P1 MSC having a small and pointed shape in the cell shape, was restored to a spindle form, which is the shape of the initial MSC, and various donors This pattern was confirmed in Fig. 3).

또한, 초기 계대의 MSC (P1 MSC)에 비해 현저히 감소되어 있던 P7 MSC의 콜로니 형성 능력이 LD 배양방법을 통하여 다시 회복되는 모습을 보여주었다. 그러나 STD 배양방법으로의 세포 배양은 계대가 거듭되면서 MSC의 콜로니 형성능력을 감소시켰다(도 4).In addition, colony-forming ability of P7 MSC, which was significantly reduced compared to MSC (P1 MSC), was recovered through LD culture method. However, cell culture by STD culture method reduced the colony forming ability of MSC as passage was repeated (Fig. 4).

이러한 배양방법의 차이가 P7 MSC의 세포크기 변화에도 영향을 줄 수 있는지 알아보기 위하여, 유세포 분석기(FACS-fluorecence cell sorter)를 통하여 세포크기에 따른 세포군(population) 분포를 분석하였다. 그 결과, 본래 MSC의 초기 특성 중에 하나인 작은 크기(5-10 ㎛)의 세포들이 LD 배양법으로 키운 그룹에서는 30.9%, STD 배양법으로 키운 그룹에서는 10.9%로 상대적으로 많은 양의 크기가 작은 세포 들이 LD그룹에 존재하고 있었으며, 반대로 크기가 큰 세포들(30 ㎛ 이상)은 상대적으로 적은 분포를 차지하고 있었다(도 5a).In order to determine whether the difference of the culture method can affect the cell size change of P7 MSC, population distribution according to cell size was analyzed by flow cytometry (FACS-fluorecence cell sorter). As a result, small sized cells (5-10 ㎛), one of the initial characteristics of MSC, were 30.9% in the group grown by LD culture and 10.9% in the group grown by STD culture. In the LD group, large cells (30 μm or more) occupy a relatively small distribution (FIG. 5A).

실제 이러한 배양방법에 따른 노화세포의 모양과 크기의 변화가 세포주기에도 변화를 일으키는지 알아보기 위해 PI 염색을 통해 DNA 세포 사이클을 분석하였다. 그 결과, 상대적으로 LD 배양세포들 이 실제로 DNA 합성이 두 배로 일어나는 S 기(phase)에 많은 부분(portion)을 차지하고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 반대로 STD 배양세포들은 휴지기에 들어가 있는 G0/G1 기에 고정되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 5b). 이에 따른 증식능력의 차이를 헥소사미니다아제 분석 기법을 이용해 확인한 결과, LD 배양세포에서 활발한 증식이 일어나고 있음을 확인할 수 있었으며, 같은 방법으로 지속적으로 키워왔던 STD 배양세포에서는 LD 배양세포와 비교할 때 증식률이 감소된 모습을 보여주었다(도 6). In fact, DNA cell cycle was analyzed by PI staining to determine whether the changes in the shape and size of senescent cells caused by these culture methods cause changes in the cell cycle. As a result, it was found that LD culture cells occupy a large portion of the S phase where DNA synthesis is actually doubled, whereas STD culture cells are fixed at the G0 / G1 phase which is in the resting phase. It was confirmed that it was (FIG. 5B). As a result of confirming the difference in proliferative capacity by using hexosaminidase analysis technique, it was confirmed that the active proliferation is occurring in LD cultured cells. This reduced appearance was shown (FIG. 6).

이러한 배양 방법에 따른 노화세포의 세포의 모양, 크기, 콜로니 형성 능력 그리고 증식 능력의 차이가 실제 MSC의 분화능력에는 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, MSC분화에서 잘 알려져 있는 세 가지 계통으로의(골아세포로의 분화, 연골세포로의 분화, 지방세포로의 분화)로의 분화 능력을 확인해 보았다. 그 결과, 골아세포로의 분화력은 기존 배양방법인 STD방법 의해 키운 세포들이 분화가 더 잘 일어나고 있음을 ALP 염색과 본 코사 염색을 통하여 확인 할 수 있었으며, LD방법에 의해 키운 세포들은 골아세포로의 분화에서 상대적으로 약한 분화 정도를 보여주었다. 그러나, 연골세포와 지방세포로의 분화는 LD 방법으로 키운 세포들이 더 잘 일어나는 것을 사프라닌 O 염색과 오일 레드 O 염색을 통하여 확인할 수 있었다. 이는 노화세포가 LD 배양 방법을 통해 다양한 계통으로의 분화능력이 회복되었음을 말하여 주는 동시에, 미분화 세포가 골아 전구세포화 되어가는 현상을 제어해 줄 수 있음을 나타낸 것이다(도 7).In order to examine how the difference in the shape, size, colony forming ability and proliferation of senescent cells according to these culture methods affects the differentiation ability of MSCs, the three strains well known in MSC differentiation Differentiation ability into cells, differentiation into chondrocytes, differentiation into adipocytes) was confirmed. As a result, the differentiation ability into osteoblasts was confirmed by ALP staining and Boncossa staining that cells grown by the STD method, which is a conventional culture method, are better occurring. The degree of differentiation was relatively weak in the differentiation of. However, the differentiation into chondrocytes and adipocytes was confirmed by safranin O staining and oil red O staining that cells grown by the LD method are more likely to occur. This suggests that senescent cells have recovered the differentiation ability into various strains through the LD culture method, and at the same time, control the phenomenon that undifferentiated cells become osteoblasts (Fig. 7).

미분화 MSC는 여러 번의 계대배양을 통한 노화 과정을 통해 ALP의 발현이 증가하며, 골아세포로의 분화능력만이 감소되지 않고 유지된다고 알려져 있다. 이러한 이유로, 골아세포 분화와 연관 된 유전자들의 발현 역시 영향을 받을 것이라 생각되어, 계대배양 기간 중 골아세포와 연관된 유전자들의 발현을 관찰하고 LD 배양 방법이 이러한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는지 알아보았다. 실제로 계대배양을 거친 P7 MSC는 골아세포 분화에 중요한 전사 인자로 알려져 있는 Cbfa1(core binding factor 1)과 Dlx5의 발현이 증가되어 있었다. 뿐 만 아니라, 골아세포 중요 표지 인자인 ALP와 오스테오폰틴의 발현 역시 증가되어 있는 패턴을 보여주었다. 하지만 골아 세포의 증식과 관련되어 있을 것으로 생각되는 Msx2 와 Osterix의 발현에는 크게 영향을 받지는 않았다. 이러한 유전자 발현 패턴들은 LD배양 방법으로 세포를 배양하여 초기 MSC와 유사하게 회복할 수 있었다. P7 MSC를 키워온 것과 같은 방법인 STD 방법으로 배양했을 경우, 골아세포의 분화와 연관된 유전자들(Cbfa1, Dlx5, ALP, & OP N)의 발현이 유지되고 있었다. 그러나 LD 방법으로 다시 배양 했을 경우, STD방법으로 키운 세포와 비교해 골분화 주요 전사인자인 Cbfa1과 Dlx5 그리고 주요 표지인자인 ALP와 오스테오폰틴의 발현이 현저히 줄어 있었다. 그러나 Msx2와 Osterix의 발현은 증가 되어 있었다. 이러한 결과들은, 골아 세포로의 분화능력만을 유지했던 STD 배양세포들이 LD 배양세포들에 비해 우수한 골분화 능력을 보인 것과 일치한다. LD 배양세포들은 골아 전구세포로 고정되어 가는 노화 세포의 골분화 관련 유전자의 발현을 감소시켜 연골세포와 지방세포로의 분화능력이 더 우수했다는 점을 설명하여 줄 수 있다(도 7a-7c).Undifferentiated MSC is known to increase the expression of ALP through the aging process through several passages, and it is known that only the differentiation capacity into osteoblasts is maintained without being reduced. For this reason, the expression of genes associated with osteoblast differentiation is also likely to be affected, so we observed the expression of genes associated with osteoblasts during the passage and examined whether LD culture methods could influence the expression of these genes. In fact, passaged P7 MSCs had increased expression of core binding factor 1 (Cbfa1) and Dlx5, which are important transcription factors for osteoblast differentiation. In addition, the expression of ALP and osteopontin, important markers for osteoblasts, also showed increased patterns. However, it was not significantly affected by the expression of Msx2 and Osterix, which are thought to be involved in the proliferation of osteoblasts. These gene expression patterns could be recovered similar to the initial MSC by culturing the cells by LD culture method. When cultured by the STD method, the same method as the P7 MSC was grown, the expression of genes (Cbfa1, Dlx5, ALP, & OP N) associated with osteoblast differentiation was maintained. However, when cultured again by LD method, expression of major transcription factors Cbfa1 and Dlx5 and major markers, ALP and osteopontin, were significantly reduced compared to cells grown by STD method. However, expression of Msx2 and Osterix was increased. These results are consistent with the STD culture cells that maintained only the differentiation ability into osteoblasts showed superior bone differentiation ability compared to LD culture cells. LD culture cells may reduce the expression of genes related to osteoblast differentiation of senescent cells fixed to osteoblastic progenitor cells to explain that the differentiation ability to chondrocytes and adipocytes was better (FIGS. 7a-7c).

세포주기와 연관된 유전자들의 발현 역시, MSC의 줄기성에 중요한 것으로 알려져 있다. 노화된 MSC에서 감소된 증식력이 LD 배양방법을 통하여 다시 증가되는 것이 세포주기와 연관된 유전자들과도 관련이 있는지 알아보았다. STD 배양세포에서 발현이 감소되어 있던 사이클린 A, CDK2, 및 CDK4의 발현이 LD 방법에 의해 다시 증가되어 있는 것이 확인되었다(도 9). 그러므로, 이러한 LD 배양방법에 의한 세포증식률의 증가는 사이클린 A와 그와 연관된 CD K2의 발현 회복과 관련되어 있을 것으로 사료되었다.Expression of genes associated with the cell cycle is also known to be important for stem cell severity. We investigated whether the increased proliferative capacity in aging MSCs was increased by LD culture, which is related to cell cycle-related genes. It was confirmed that the expression of cyclin A, CDK2, and CDK4, which had decreased expression in STD cultured cells, was increased again by the LD method (FIG. 9). Therefore, the increase of cell proliferation rate by this LD culture method may be related to the recovery of cyclin A and its associated CD K2 expression.

우리는 LD 배양방법에 의하여 세포의 모양이 작아지고 방추형 모습으로 돌아가는 현상이, 커진 세포가 역분화되어 초기 MSC의 모습으로 돌아오는 것인지, 아니면 특정 세포집단에 의한 증식 때문 인지 궁금하였다. 노화된 MSC라도 여러 크기의 세포들이 존재한다. 그래서 P7 MSC를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 세포 크기 별로 분류하였다. 그 후, 크기에 따라 분리된 세포를 가지고 LD 배양을 한 후, CFU-F 분석을 수행하였다. 10 ㎛ 이하의 세포집단에서는 비교적 콜로니 형성이 잘 일어났다. 그러나 10-30 ㎛ 사이의 세포집단과 30 ㎛ 이상의 세포집단에서는 콜로니 형성이 잘 일어나지 않았다(도 10). 현미경하에서 관찰했을 때, 작은 크기의 세포(10 ㎛ 이하의 세포)들은 크기가 작은 세포들의 빽빽한 콜로니 집단을 보여 주었으나 중간 크기의 세포(10-30 ㎛ 사이의 세포)와 크기가 큰 세포(30 ㎛ 이상의 세포)에서는 세포의 크기가 크고, 이들끼리 콜로니 형성을 잘 하지 못하며 증식도 거의 하지 않는 모습을 보였다(도 10). 즉, LD 배양법이 노화된 MSC의 증식률, 세포모양 및 콜로니 형성능력의 재활성화 기전은 노화 MSC의 직접적인 탈분화 보다는, 이종 MSC에 존재하는 10 ㎛ 이하의 세포집단의 증식에 의한 것일 가능성이 있음을 시사한다.We wondered if the shape of the cells became smaller and fusiform by the LD culture method, whether the larger cells were dedifferentiated and returned to the initial MSC, or because of the proliferation by a specific cell population. Even aged MSCs have cells of different sizes. Therefore, P7 MSCs were classified by cell size using a flow cytometer (FACS). Then, LD culture was performed with the cells separated according to the size, and then CFU-F analysis was performed. Colony formation was relatively good in cell populations of 10 μm or less. However, colony formation did not occur well in the cell population between 10-30 μm and the cell population larger than 30 μm (FIG. 10). When viewed under the microscope, small-sized cells (cells less than 10 μm) showed a dense colony of small cells but medium-sized cells (cells between 10-30 μm) and large cells (30 In the cells of μm or more), the cells were large in size, and they did not form colonies well and hardly proliferated (FIG. 10). In other words, the LD culture method suggests that the reactivation mechanism of the proliferation rate, cell shape, and colony formation capacity of aged MSCs may be due to the proliferation of cell populations of 10 μm or less present in heterologous MSCs, rather than direct dedifferentiation of aging MSCs. do.

고찰Review

인간 골수에서 유래된 중간엽 줄기세포들이 줄기세포의 특징인 증식능력과 분화능력을 유지하는데 있어서는 배양조건이 굉장히 중요한 것으로 사료된다. The culture conditions are very important for mesenchymal stem cells derived from human bone marrow to maintain the proliferative and differentiating ability of stem cells.

본 연구에서는 노화가 진행되어 세포의 모양이 변하고 콜로니 형성능력과 분화능력이 감소한 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포들을 기존 배양 방법인 STD 배양법과 함께 LD 배양법으로 분류하여 키운 후, CFU-F 분석을 시행한 결과, STD 배양세포들은 오랜 기간 배양시 콜로니 형성능력이 감소하였으나, 같은 기간 키워오면서 배양 방법만 바꿔준 LD 배양세포에서는 콜로니 형성능력이 다시 초기와 같이 회복되고 있는 모습을 보여 주었다. 뿐만 아니라, 세포 의 크기와 증식능력에도 차이를 보였으며 이러한 세포배양 조건이 실제 DNA 세포 사이클에도 영향을 주고 있음을 확인할 수 있었다. LD 배양세포들은 세 가지 계통으로의 분화에서 골아세포를 제외한 연골세포와 지방세포에서 더 높은 분화 효율을 보여 주었으며, STD 배양세포는 골아 세포의 분화능력만이 유지되고 있는 것으로 보여 졌다. 또한, LD 배양법에 따른 줄기성의 증가는 불균질한 MSC 세포군에서 주로 크기가 작은 세포들에 의한 재증식 때문으로 보여진다. In this study, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, whose morphology changed and colony formation and differentiation capacity decreased, were categorized into LD culture method and STD culture method, and then subjected to CFU-F analysis. As a result, STD cultured cells showed reduced colony forming ability during long-term cultivation, but colony forming ability was restored to the same condition in LD cultured cells which had been grown for the same period. In addition, there were differences in cell size and proliferative capacity, and these cell culture conditions were found to affect the actual DNA cell cycle. LD cultured cells showed higher differentiation efficiency in chondrocytes and adipocytes except osteoblasts in differentiation into three lineages. STD cultured cells showed only differentiation capacity of osteoblasts. In addition, the increase in stemity by the LD culture method seems to be mainly due to the repopulation by small cells in the heterogeneous MSC cell population.

실제 골수 유래 줄기세포의 문제점 중 하나가 배양기간이 길어지면서 세포의 모양이 넓게 퍼지고 비대해지는 현상이다. 결국, 세포가 거의 증식하지 않아 실험에 필요한 많은 세포를 획득하기 어렵다는 단점도 존재한다. 초기 세포에 비해 크기가 커진 MSC는 증식을 거의 하지 않는다. 따라서 LD 배양방법은 불균질한 MSC에 존재하는 적은 숫자의 작은 사이즈 크기 세포들에게 증식할 수 있는 공간을 제공함과 동시에 큰 사이즈 세포들과의 접촉을 피하면서 더 많은 공간을 차지할 수 있을 것으로 생각된다. 크기 별 세포 분류 실험에서도, 10 ㎛ 이하의 작은 세포들에 비해서 크기가 큰 세포들 은 충분한 공간에도 불구하고 콜로니형성을 하지 못하였다. 이는 작은 사이즈 세포들만이 MSC의 특성인 콜로니형성 능력을 지니고 있는 것으로 여겨진다. 또한, 노화된 MSC에서는 골아세포 분화와 연관된 유전자들의 발현이 증가되었다. 골분화에 있어 중요한 전사 인자로 알려진 Cbfa1과 Dlx5의 발현이 증가되었으며, 이와 더불어 ALP와 오스테오폰틴 같은 골분화 마커들의 발현 역시 증가되고 있었다. 이러한 결과들은, 오랜 배양기간을 거쳐 배양되어 온 MSC들이 다분화능을 잃고 점점 골아전구세포(preosteoblast)화 되어가다가, 결국 노화 되어버린다는 이전 보고와도 일치되는 내용이다. Msx2는 전사 억제인자이지만 Dlx5와 이종이합체(heterodimer)를 형성하여 각각 의 활성을 억제할 뿐만 아니라, 골아 전구세포의 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. LD배양법에 의해 배양된 세포에서 증가된 Msx2는 아마도 세포 증식과 연관되어 있을 것으로 생각 된다. Osterix역시 골아 세포 분화에 있어 필수적인 전사인자로서 알려져 있지만, 최근에는 골아 전구세포 증식에도 관여할 것이라는 보고가 있다. 이와 더불어 LD 배양법은 세포주기에서 중요한 인자로 알려 져 있는 사이클린 A와 CDK-2 그리고 CDK-4의 발현에도 영향을 주었다. 특히, 사이클린 A와 CDK2 (cyclin-dependent kinase 2)는 세포주기 과정에서, 실제 DNA 합성이 두 배로 일어나는 S 기와 체세포 분열을 일으키는 단계인 G2/ M 기에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 기존배양법(STD 배양법)에서는 이러한 유전자들의 발현이 줄어 있었고, 이는 STD 배양법에 의해서 MSC의 증식 능력이 줄어드는 것과도 연관되어 보인다. 즉, 세포배양방법에 따라 세포주기와 관련 된 유전자들의 발현이 달라질 수 있음을 암시 한다.One of the problems of stem cells derived from bone marrow is a phenomenon in which the shape of cells spreads and enlarges as the culture period becomes longer. As a result, there is a disadvantage that it is difficult to obtain many cells necessary for the experiment because the cells hardly proliferate. Larger MSCs than early cells rarely proliferate. Therefore, the LD culture method can provide a small number of small size cells in the heterogeneous MSC to grow and occupy more space while avoiding contact with the large size cells. . In the cell sorting experiment by size, large cells did not colonize in spite of sufficient space compared to small cells of 10 μm or smaller. It is believed that only small size cells have colony forming properties that are characteristic of MSCs. In addition, expression of genes associated with osteoblast differentiation was increased in aged MSCs. The expression of Cbfa1 and Dlx5, which are important transcription factors in bone differentiation, was increased, as well as the expression of bone differentiation markers such as ALP and osteopontin. These results are consistent with previous reports that MSCs that have been cultured over a long period of time lose their multipotency and become more preosteoblasts and eventually age. Msx2 is a transcription inhibitor but is known to form heterodimers with Dlx5 to inhibit their respective activities as well as to contribute to the proliferation of osteoblastic progenitor cells. Increased Msx2 in cells cultured by LD culture is probably associated with cell proliferation. Osterix is also known as an essential transcription factor for osteoblast differentiation, but recently it has been reported to be involved in osteoblast progenitor proliferation. In addition, LD culture also affected the expression of cyclin A, CDK-2 and CDK-4, which are important factors in the cell cycle. In particular, cyclin A and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) are known to play an important role in the G2 / M phase, which is a stage in which the actual DNA synthesis doubles in the S cycle and somatic division. The expression of these genes was reduced in conventional culture (STD culture), which seems to be related to the decreased proliferation capacity of MSC by STD culture. In other words, it suggests that the expression of genes related to the cell cycle may vary depending on the cell culture method.

따라서, 본 연구는 통상적인 배양방법으로 오랜 기간 키워 증식 능력과 분화능력을 소실한 골수유래 중간엽 줄기세포들을 저밀도 배양 방법을 이용, 세포를 다시 배양하여 증식능력과 분화 능력을 가진 세포를 재성장 시킬 수 있었다는데 의의가 있다. 이는 중간엽 줄기세포와 연관된 연구를 하는 연구자들이 세포를 좀 더 효율적으로 다룰 수 있는 실험적 프로토콜을 제공해 줄 뿐만 아니라, 대량의 세포를 필요로 하는 환자 치료에 있어, 양질의 세포를 제공할 수 있는 궁극적인 임상적 프로토콜이 되어줄 수 있을 것으로 사료된다.Therefore, this study is to grow the cells with proliferative and differentiation capacity by reculturing the cells using low density culture method of bone marrow-derived mesenchymal stem cells that have been grown for a long time as a conventional culture method and have lost proliferative and differentiation capacity. It is meaningful. This not only provides experimental protocols for researchers involved in mesenchymal stem cells to handle cells more efficiently, but also provides the ultimate in providing high quality cells for the treatment of patients requiring large numbers of cells. It may be a clinical protocol.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

도 1은 본 발명의 전체적인 실험에 대한 모식도를 나타낸 것이다.Figure 1 shows a schematic diagram for the overall experiment of the present invention.

도 2는 초기 계대 중간엽 줄기세포(Early passage MSC: P1 MSC)와 노화된 중간엽 줄기세포(Late passage MSC: P7 MSC)의 콜로니 형성 능력과 분화 능력을 비교한 결과이다. P1 MSC는 골아 세포로의 분화(Osteogenesis), 지방세포(Adipogenesis)로의 분화 및 연골세포로의 분화(Chondrogenesis)가 잘 분화된 모습을 나타내지만, P7 MSC는 골아세포로만 잘 분화됨을 나타낸다. 골아세포로의 분화는 본 코사(Von kossa)와 알카라인 포스파타아제(ALP), 지방세포로의 분화는 오일 레드 O(Oli red O), 및 연골세포로의 분화는 사프라닌 O(Safranin O)로 염색하여 확인 한다.FIG. 2 shows the results of comparing colony formation and differentiation ability of early passage mesenchymal stem cells (P1 MSC) and aged mesenchymal stem cells (Late passage MSC: P7 MSC). P1 MSCs show differentiation into osteoblasts, differentiation into adipogenesis, and chondrogenesis, whereas P7 MSCs differentiate well into osteoblasts. Differentiation into osteoblasts is Von kossa and alkaline phosphatase (ALP), differentiation into adipocytes is Oli red O, and differentiation into chondrocytes is Safranin O Dye it and check it.

도 3은 P7 MSC를 표준배양방법(STD)와 저밀도배양방법(LD)으로 배양한 결과이다. P7 MSC를 STD로 배양한 경우 크고 넓게 퍼진 형태를 나타내지만, LD로 배양한 경우에는 P1 MSC의 모습과 비슷한 작고 뾰족한 형태(방추형 형태)를 나타낸다.3 shows the results of culturing P7 MSCs with standard culture method (STD) and low density culture method (LD). The culture of P7 MSC with STD shows a large and wide spread form, but the culture with LD shows a small, pointed shape (like spindle form) similar to that of P1 MSC.

도 4는 P1 MSC와 P7 MSC의 콜로니 형성 능력을 나타낸 결과이다. 콜로니 형성 능력이 현저히 감소된 P7 MSC는 LD 방법으로 배양한 경우에는 콜로니 형성 능력이 회복되는 반면, STD 방법으로 배양한 경우 계대가 될 수록 MSC의 콜로니 형성 능력을 감소된다.4 shows the colony forming ability of P1 MSC and P7 MSC. Significantly reduced colony-forming ability of P7 MSCs was recovered when cultured by the LD method, while colonies were reduced when passaged by the STD method.

도 5a-5b는 STD 및 LD 배양 방법에 따른 P7 MSC의 세포크기 및 DNA 세포 사이클의 변화를 나타낸 것이다. 도 5a는 STD 및 LD로 배양된 P7 MSC의 세포 크기 분포를 각각 나타낸 결과이며, 도 5b는 STD 및 LD로 각각 배양된 P7 MSC의 DNA 세포 사이클의 분포를 각각 나타낸 결과이다.Figures 5a-5b shows the change in cell size and DNA cell cycle of P7 MSC according to the STD and LD culture method. 5A shows the cell size distribution of P7 MSCs cultured with STD and LD, respectively. FIG. 5B shows the distribution of DNA cell cycles of P7 MSCs cultured with STD and LD, respectively.

도 6은 STD 및 LD 배양 방법에 따른 P7 MSC의 세포 증식률을 나타낸 결과이다.Figure 6 shows the cell proliferation rate of P7 MSC according to the STD and LD culture method.

도 7a-7b는 STD 및 LD 배양 방법에 따른 P7 MSC의 분화 능력을 나타낸 결과이다. 도 7a는 STD 및 LD 방법으로 각각 배양된 P7 MSC의 골아세포로의 분화능력, 연골세포로의 분화능력 및 지방세포로의 분화능력을 나타낸 것이다.7A-7B show the differentiation capacity of P7 MSCs according to STD and LD culture methods. Figure 7a shows the differentiation ability to osteoblasts, the differentiation ability to chondrocytes and differentiation into adipocytes of P7 MSC cultured by STD and LD method, respectively.

도 8은 각각의 계대배양 단계에서의 MSC와. STD 및 LD 방법으로 각각 배양된 P7 MSC의 골-관련 유전자 마커들(Bone-related gene markers)의 발현 양상을 나타낸 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR) 결과이다. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)유전자는 하우스 키핑 유전자(House keeping gene)로서 대조군으로 사용된다.8 shows MSCs at each passaging step. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) results show the expression patterns of bone-related gene markers of P7 MSCs cultured by STD and LD methods, respectively. The GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) gene is used as a control as a house keeping gene.

도 9는 STD 및 LD 방법으로 각각 배양된 P7 MSC의 세포 주기 관련 유전자 마커들(Cell cycle-related markers)의 mRNA 발현 패턴을 나타낸 RT-PCR 결과이다. GAPDH 유전자는 하우스 키핑 유전자로서 대조군으로 사용된다.9 is an RT-PCR result showing mRNA expression patterns of cell cycle-related markers of P7 MSCs cultured by STD and LD methods, respectively. The GAPDH gene is used as a control as a housekeeping gene.

도 10은 노화된 중간엽 줄기세포(P7 MSC)를 유세포분석기를 이용하여 크기 별로 분류하고, 총 3가지의 크기로 분류된 P7 MSC의 콜로니-형성 능력을 나타낸 결과이다.FIG. 10 shows the aging mesenchymal stem cells (P7 MSCs) sorted by size using a flow cytometer and shows the colony-forming ability of P7 MSCs classified into three sizes.

Claims (15)

(a) 노화된 성체 줄기세포를 저밀도로 배지에 씨딩하는 단계; 및 (b) 상기 노화된 성체 줄기세포를 배양하여 다능성(multipotency) 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 노화된 성체 줄기세포의 다능성(multipotency) 및 증식률 재활성화 방법.(a) seeding aged adult stem cells into the medium at low density; And (b) culturing the adult adult stem cells to obtain adult stem cells with reactivation of multipotency and proliferation rate. . 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 성체 줄기세포는 다능성 중간엽 줄기세포, 다능성 조혈모 줄기세포, 다능성 신경 줄기세포, 다능성 간 줄기세포, 다능성 췌장 줄기세포 또는 다능성 표피줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the adult stem cells used in step (a) are pluripotent mesenchymal stem cells, pluripotent hematopoietic stem cells, pluripotent neural stem cells, pluripotent liver stem cells, pluripotent pancreatic stem cells or It is a pluripotent epidermal stem cell. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 성체 줄기세포는 다능성 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the adult stem cells used in step (a) are pluripotent mesenchymal stem cells. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 다능성 중간엽 줄기세포는 골수로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.4. The method of claim 3, wherein the pluripotent mesenchymal stem cells used in step (a) are derived from bone marrow. 제 1 항에 있어서, 상기 노화된 성체 줄기세포는 다계대배양된 성체 줄기세포로서 다능성 성체 줄기세포를 3-30회 계대배양된 세포인 것을 특징으로 하는 배양 방법.The method of claim 1, wherein the aged adult stem cells are multi-cultured adult stem cells, which are cells passaged 3-30 times of pluripotent adult stem cells. 제 1 항에 있어서, 상기 저밀도는 1-1 x 103 세포수/cm2인 것을 특징으로 하는 배양 방법.The method of claim 1, wherein the low density is 1-1 × 10 3 cells / cm 2 . 제 6 항에 있어서, 상기 저밀도는 10-1 x 102 세포수/cm2인 것을 특징으로 하는 배양 방법.The method of claim 6, wherein the low density is 10-1 × 10 2 cells / cm 2 . 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양은 FBS의 농도를 단계적으로 변화시키면서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the culturing of step (b) is characterized in that the culturing while changing the concentration of the FBS step by step. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 배양은 FBS 농도 3-40 부피%를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 8, wherein the culturing of step (b) is performed using a FBS concentration of 3-40% by volume. 제 9 항에 있어서, 상기 FBS 농도는 고농도에서 저농도로 단계적으로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the FBS concentration is reduced step by step from high concentration to low concentration. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 단계에 수득한 다능성 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포는 방추형(spindle) 형태의 세포 모양을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1, wherein the pluripotency and proliferation rate of the adult stem cells obtained in the step (b) is characterized in that the spindle-shaped cell shape (spindle) shape. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 단계에 수득한 다능성 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포는 골아세포, 연골 세포 및 지방세포로 분화가 가능한 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1, wherein the pluripotency and proliferation rate of the adult stem cells obtained in the step (b) is characterized in that the differentiation into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 단계에 수득한 다능성 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포는 MsX2, Osterix, CDK2, CDK4 및 Cyclin A2 유전자가 고발현 되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.The mesenchymal stem according to claim 1, wherein the adult pluripotent and proliferative adult stem cells obtained in step (b) have high expression of MsX2 , Osterix , CDK2 , CDK4 and Cyclin A2 genes. cell. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 이용하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein step (b) does not use a basic fibroblast growth factor (bFGF). 상기 제 1 항 내지 제 14 항의 방법에 의하여 다능성(multipotency) 및 증식률이 재활성화된 성체 줄기세포.An adult stem cell in which multipotency and proliferation are reactivated by the method of claim 1.
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