KR20100120119A

KR20100120119A - 마이크로 입자 및 그 의약품 조성물

Info

Publication number: KR20100120119A
Application number: KR1020107014459A
Authority: KR
Inventors: 요시노리 카키자와; 레이지 니시오; 준지 미치조에; 마사카즈 코이와; 노부오 이다; 타이스케 히라노; 요이치로 코시
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2010-11-12
Also published as: WO2009104706A1; EP2251006B1; RU2010138925A; US20110003007A1; CN101932311A; KR101542433B1; AU2009216216A1; JP5712485B2; US8431161B2; DK2251006T3; CA2715665A1; HUE035331T2; PT2251006T; RU2490009C2; JPWO2009104706A1; PL2251006T3; BRPI0905790A2; ES2635515T3; EP2251006A4; CN101932311B

Abstract

폴리(히드록시산)의 소수성 세그먼트와 다당 또는 폴리에틸렌글리콜의 친수성 세그먼트로 이루어지는 양친매성 폴리머 및 친수성 활성 물질을 함유하여 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자는 친수성 활성 물질을 효율적으로 봉입하고, 생체내에 있어서 적절한 속도로 친수성 활성 물질을 방출할 수 있기 때문에 DDS제제로서 유용하다.

Description

마이크로 입자 및 그 의약품 조성물{MICROPARTICLES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF}

본 발명은 친수성 활성 물질을 함유하는 입자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자 및 그 의약품 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 소위, 드러그 딜리버리 시스템(Drug Delivery System)으로서 마이크로 입자 및 그 의약품 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 예컨대, 친수성이고 분자량이 큰 단백질·펩티드 의약, 핵산 의약 등을 효과적으로 내포하는 마이크로 입자 및 그 의약품 조성물에 관한 것이다.

나노 파티클, 마이크로 파티클, 나노 스피어(nano sphere), 마이크로 스피어 또는 마이크로 캡슐 등으로 불리는 미립자에 약제를 봉입한 미립자 제제가 개발되어 약물의 서방제로서 이용하는 것이 검토되고 있다.

폴리머 화합물을 기재로 하는 미립자 제제로서는 생분해성인 폴리락트산 또는 폴리(락트산-글리콜산)을 이용한 미립자가 열거된다. 이들 미립자 제제에 있어서는 친수성이고 분자량이 큰 단백질·펩티드 의약을 생리 활성을 유지한 상태로 봉입하는 것은 어렵다. 또한, 생체 투여시에 초기 버스트(burst)라고 불리는 약물이 단시간에 대량으로 방출되는 현상이 일어나는 것이 알려져 있다.

당류와 폴리(히드록시산)을 공유 결합시킨 폴리머로 이루어지는 미립자로서 특허문헌 1에서는 폴리올과 폴리락트산의 반응물로 이루어지는 약리학적 활성제를 담지하기 위한 마이크로 캡슐이 개시되어 있다. 이 기술에서는 다당은 사용되지 않고, 펩티드·단백질의 봉입에 대해서도 개시되지 않는다. 분무 건조법에 의해 제조한 마이크로 캡슐은 봉입한 약물을 24시간 동안 62% 방출시키고 있다. 이 방출 속도는 너무 빨라 마이크로 캡슐의 약물 서방제로서의 용도를 방해하고 있다.

특허문헌 2, 비특허문헌 1에서는 다당에서 생분해성 폴리머를 그래프트한 재료로 이루어지는 나노 입자 또는 마이크로 입자가 개시되어 있지만, 이들 문헌에서는 나노 입자가 회합하여 형성된 마이크로 입자에 대해서는 언급되지 않는다. 특허문헌 2에는 친수성의 활성성분을 피포(被包)하기 위한 마이크로 입자의 제조법으로서 문헌에 이미 기재된 방법 예컨대, 「더블 에멀션(double emulsion)」법이 열거되고 있지만 구체적인 기술은 없고, 입자로의 약물 봉입이나 입자로부터의 약물 방출이 실현되지 않는다. 비특허문헌 1에서는 「더블 에멀션」법에 의해 제조된 알부민을 봉입한 마이크로 입자가 개시되어 있지만 알부민의 투입량에 대한 봉입률은 53% 이하이고, 친수성 활성 물질의 낮은 봉입률은 제조에 비용이 드는 문제가 있다.

특허문헌 3에서는 다당과 지방족 폴리에스테르로 이루어지는 양친매성 폴리머를 포함하여 이루어지는 미립자로서, 다당으로 이루어지는 내핵, 지방족 폴리에스테르로 이루어지는 소수성 외층, 소수성 외층에 결합한 표면개질제로 이루어지는 미립자가 개시되어 있다. 상기 입자는 미립자가 회합한 구조를 갖지 않고, 입경이 마이크로미터 사이즈의 입자에 대해서 구체적인 예시는 없다. 또한, 친수성 활성 물질의 봉입률은 50% 이하이고, 상기와 같이 낮은 봉입률이 문제가 된다.

특허문헌 4에서는 덱스트란의 천연 유도화 폴리머로 이루어지는 평균 입경 300nm 미만의 나노 미립자가 개시되어 있지만, 구체적인 예시는 없다. 또한, 미립자가 회합한 구조를 갖지 않고 평균 입경이 몇백 나노미터인 것은 투여 부위로부터의 확산을 일으켜 서방제로서 바람직하지 않다.

또한, 입자를 형성하는 폴리머로서, 특허문헌 5, 특허문헌 6에서는 폴리에틸렌글리콜 등의 친수성 부분과 폴리(락트산-글리콜산) 등의 소수성 부분을 갖는 양친매성 블럭 폴리머를 이용하는 검토가 행해져 개시되어 있다. 이러한 양친매성 블럭 폴리머를 이용한 미셀(micelle) 입자는 통상 내부가 소수성, 외층부가 친수성의 구조를 갖기 때문에 소수성 저분자 약물의 내포에는 적합하지만, 단백질, 펩티드 등의 친수성 활성 물질의 내포에는 곤란하다.

또한, 특허문헌 7, 비특허문헌 2에서는 양친매성 블럭 폴리머를 이용한 입자에 단백질을 내포하는 시도에 대해서도 개시되어 있지만 내포가능한 약물량이 적고, 또한 초기 버스트가 크다는 결점이 있어 친수성 약물의 서방 주사제로서 바람직한 성질을 갖는 입자의 제작 기술은 아직 확립되지 않았다.

특허문헌 1:일본 특허 공보 평8-19226호 공보

특허문헌 2:일본 특허 공표 2004-521152호 공보

특허문헌 3:WO2006/095668

특허문헌 4:일본 특허 공표 평10-511957호 공보

특허문헌 5:일본 특허 공표 2004-513154호 공보

특허문헌 6:일본 특허 공표 2004-514734호 공보

특허문헌 7:일본특허공표 2000-501084호 공보

비특허문헌 1:오야 유이치외 3명, 「폴리락트산을 그래프트화한 덱스트란 마이크로 스피어로의 소혈청 알부민의 봉입 및/또는 방출 거동(Encapsulation and/or Release Behavior of Bovine Serum Albumin within and from Polylactide-Grafted Dextran Microspheres)」, 매크로몰레큘라 바이오사이언스(Macromolecular Bioscience), 2004년, 제4권, 458-463쪽

비특허문헌 2:양 안수(Anshu Yang)외 5명, 「TNF-α을 차단하는 펩티드를 내봉한 PEG-PLGA 입자의 조제와 생체내 거동(Tumor necrosis factor alpha blocking peptide loaded PEG-PLGA nanoparticles:Preparation and in vitro evaluation)」, 인터내셔널·저널·오브·파머수틱스(International Journal of Pharmaceutics), 2007년, 제331권, 123-132쪽

상기와 같이, 폴리머를 사용한 마이크로 입자 개발이 행해지고 있지만 친수성 활성 물질을 효율적으로 봉입가능한 마이크로 입자로서, 현저한 초기 버스트를 나타내지 않고, 또한 적당한 속도로 봉입된 약물을 방출가능한 마이크로 입자를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의연구를 행한 결과, 본 발명을 완성하는 것에 이르렀다.

즉, 본 발명은 폴리(히드록시산)의 소수성 세그먼트와 다당 또는 폴리에틸렌글리콜의 친수성 세그먼트로 이루어지는 양친매성 폴리머 및 친수성 활성 물질을 함유하여 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자, 구체적으로는, 내부에 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 갖고 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트의 외층을 갖는 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자, 그 제조방법 및 그 의약품 조성물에 대해서이다.

(발명의 효과)

본 발명의 마이크로 입자는 친수성 활성 물질을 효율적으로 봉입하여 생체내에 있어서 적절한 속도로 친수성 활성 물질을 방출할 수 있으므로, 신규한 DDS 제제로서 이용할 수 있다.

도 1은 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자로부터의 약물 방출.
도 2는 인간 인슐린 내포 덱스트란-PLGA 마이크로 입자로부터의 약물 방출.
도 3은 덱스트란-PLGA 마이크로 입자의 SEM상.
도 4는 폴리에틸렌글리콜-폴리(엡실론-카푸로락톤) 마이크로 입자의 SEM상.
도 5는 인간 성장 호르몬 내포 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 약물 농도의 경시 변화.
도 6은 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 약물 농도의 경시 변화.
도 7은 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 체중 변화.
도 8은 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 IGF-1 농도의 경시 변화.
도 9는 엑센딘 4 내포 마이크로 입자의 완충액 중에서의 약물 방출.
도 1O은 엑센딘 4 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 약물 농도의 경시 변화.
도 11은 인간 성장 호르몬 내포 회합 입자로부터의 약물 방출.
도 12는 S/O/W형 에멀션 작성시에 첨가한 탄산 디메틸량과 입경의 관계.
도 13은 FD40 내포 마이크로 입자의 내포율의 결과.
도 14는 PEG-PLGA 폴리머(5k-10k)로부터 조제한 마이크로 입자 분말의 SEM상.
도 15는 PEG-PLGA 폴리머(5k-61k)로부터 조제한 마이크로 입자 분말의 SEM상.
도 16은 FD40 내포 마이크로 입자로부터의 FD40 방출 거동.
도 17은 인간 인슐린 내포 마이크로 입자로부터의 약물 방출 거동.
도 18은 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 약물 농도의 경시 변화.
도 19는 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 약물 농도의 경시 변화.
도 20은 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 IGF-1 농도의 경시 변화.
도 21은 엑센딘 4 내포 마이크로 입자를 피하 투여한 마우스의 혈중 약물 동태의 경시 변화.
도 22는 S/O/W형 에멀션 작성시에 첨가한 탄산 디메틸량과 입경의 관계.

본 발명에 있어서는 양친매성 폴리머 및 친수성 활성 물질을 함유하여 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 마이크로 입자를 형성하는 것을 특징으로 하고 있다. 여기서 말하는 회합이란 2개 이상의 입자가 입자간력 또는 타물질을 통해서 결합하여 집합체를 형성하는 것이다. 입자간력은 특별히 한정되지 않지만, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반·데르·왈스력이 열거된다. 회합은 입자끼리가 접하고 있는 상태에 한정되지 않고, 입자간에 입자와 친화성을 갖는 물질이 존재하고 있어도 좋고, 매트릭스에 입자가 분산되어 있어도 좋다. 입자에 친화성을 갖는 물질, 매트릭스로서는 폴리머가 바람직하다. 본 발명에 있어서는 상기 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합함으로써, 단독 입자인 것보다도 친수성 활성 물질의 내포율이 우수하다는 효과가 달성된다. 또한, 회합하는 상기 친수성 활성 물질 함유 입자의 입경은 달라도 좋다.

마이크로 입자란 서브마이크론으로부터 서브밀리미터의 입경을 갖는 입자이다. 본 발명의 마이크로 입자의 평균 입경은 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 주사에 의해 상기 마이크로 입자를 생체 투여하는 경우, 평균 입경이 클수록 주사 바늘을 환자에게 있어서 부담이 큰 굵은 것을 사용할 필요가 있기 때문에 환자 부담의 경감의 관점에서도 1㎛∼50㎛인 것이 바람직하다. 마이크로 입자의 평균 입경은 주사형 전자현미경에 의한 화상 해석법에 의해 구할 수 있다.

마이크로 입자를 구성하는 친수성 활성 물질 함유 입자의 회합수는 10∼10의 7승의 범위인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10의 5승∼10의 7승의 범위이다. 회합수는 친수성 활성 물질 함유 입자의 평균 입경과 마이크로 입자의 평균 입경으로부터 계산할 수 있다.

본 발명에 있어서는 양친매성 폴리머가 폴리(히드록시산)의 소수성 세그먼트와 다당 또는 폴리에틸렌글리콜의 친수성 세그먼트로 이루어지는 것을 특징으로 하고 있다. 여기서 말하는 양친매성이란 친수성과 소수성 양쪽의 성질을 갖고 있다고 할 수 있는 것이고, 친수성이란 임의의 부위의 물에 대한 용해도가 다른 세그먼트보다 높을 때, 상기 부위를 친수성이라고 말한다. 친수성 세그먼트는 물에 가용인 것이 바람직하지만, 난용이어도 다른 부위와 비교하여 물에 대한 용해도가 높으면 좋다. 또한, 소수성이란 임의의 부위의 물에 대한 용해도가 다른 부위보다 낮을 때, 상기 세그먼트를 소수성이라고 한다. 소수성 세그먼트는 물에 불용인 것이 바람직하지만, 가용이어도 다른 부위와 비교하여 물에 대한 용해도가 낮으면 좋다.

양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산) 쇄로서는, 구체적으로는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리(2-히드록시부티르산), 폴리(2-히드록시발레르산), 폴리(2-히드록시카프로산), 폴리(2-히드록시카프린산), 폴리(말산) 또는 이들 고분자 화합물의 유도체 및 공중합체가 열거되지만, 본 발명의 마이크로 입자는 생체 투여시에 현저하게 유해한 영향을 주지 않는 것이 바람직하기 때문에 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)에 대해서도 생체 적합성 고분자인 것이 바람직하다. 또한, 여기서 말하는 생체 적합성 고분자란 생체에 투여했을 때에 현저하게 유해한 영향을 끼치지 않는 것을 말하고, 보다 구체적으로는, 쥐에 상기 고분자를 경구 투여하는 경우의 LD50이 2,000mg/kg 이상인 것을 말한다.

생체 적합성 고분자인 폴리(히드록시산)으로서는 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리(락트산-글리콜산)의 공중합체가 바람직하다. 폴리(히드록시산)이 폴리(락트산-글리콜산)인 경우, 폴리(락트산-글리콜산)의 조성비(락트산/글리콜산)(몰/몰%)는 본 발명의 목적이 달성되는 한 특별히 한정되지 않지만, 100/0∼30/70의 것이 바람직하고, 60/40∼40/60의 것이 특히 바람직하다.

양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 다당인 경우, 다당으로서는 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 알긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란이 열거되지만, 덱스트란인 것이 바람직하다.

상기 양친매성 폴리머는 다당 주쇄에 폴리(히드록시산)의 그래프트 쇄가 그래프트 중합하고 있는 것이 바람직하다. 여기서, 다당 주쇄의 평균 분자량은 1,000∼100,000인 것이 바람직하고 2,000∼50,000인 것이 보다 바람직하며, 폴리(히드록시산)의 평균 분자량은 500∼100,000인 것이 바람직하고 1,000∼10,000이 보다 바람직하다. 또한, 다당의 평균 분자량에 대한 폴리(히드록시산)의 평균 분자량의 값으로서는, 바람직하게는 0.01배∼100배이고, 보다 바람직하게는 0.02배∼10배이며, 더욱 바람직하게는 0.02배∼1배이다.

다당 주쇄에 결합하고 있는 폴리(히드록시산) 그래프트 쇄의 수는 바람직하게는 2∼50이다. 그래프트 쇄수는 그래프트형 양친매성 폴리머, 다당 주쇄, 폴리(히드록시산) 그래프트 쇄 평균 분자량으로부터 구할 수 있다.

양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 폴리에틸렌글리콜인 경우, 상기 양친매성 폴리머는 폴리에틸렌글리콜과 폴리(히드록시산)의 블럭 폴리머인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 용어 「블록」이란 폴리머 분자의 일부분으로 적어도 5개 이상의 모노머 단위로 이루어지고, 그 부분에 인접하는 다른 부분과 화학 구조상 또는 입체 배치상 다른 것을 말하고, 적어도 2개 이상의 블록이 선상으로 연결되어 생긴 폴리머를 블럭 폴리머라고 한다. 블럭 폴리머를 구성하는 각 블록 자체가 2종류 이상의 모노머 단위로 이루어지는 랜덤, 교대, 그라디언트 폴리머이어도 좋다. 또한, 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 폴리에틸렌글리콜인 경우, 상기 양친매성 폴리머는 폴리에틸렌글리콜과 폴리히드록시산이 각각 1개씩 연결된 블럭 폴리머인 것이 바람직하다.

양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 폴리에틸렌글리콜인 경우, 사용되는 폴리에틸렌글리콜로서는 직쇄 또는 분기의 폴리에틸렌글리콜 또는 그 유도체가 열거되고, 바람직하게는 직쇄의 폴리에틸렌글리콜 유도체이다. 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바람직한 예로서는 폴리에틸렌글리콜모노알킬에테르가 열거된다. 폴리에틸렌글리콜모노알킬에테르의 알킬기로서는 탄소수 1∼10개의 직쇄상 또는 분기상 알킬기가 열거되고, 탄소수 1∼4개의 직쇄상 또는 분기상 알킬기가 바람직하며, 메틸, 에틸, 프로필, iso-프로필기가 보다 바람직하다.

폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량에는 특별히 제한은 없지만, 2,000∼15,000인 것이 바람직하고, 2,000∼12,000인 것이 보다 바람직하고, 4,000∼12,000인 것이 더욱 바람직하며, 5,000∼12,000인 것이 특히 바람직하다.

양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트가 폴리에틸렌글리콜인 경우의 폴리(히드록시산)의 평균 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 5,000∼200,000인 것이 바람직하고, 15,000∼150,000이 보다 바람직하며, 20,000∼100,000이 더욱 바람직하다. 또한, 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량에 대한 폴리(히드록시산)의 평균 분자량의 값으로서는, 바람직하게는 1배 이상이고, 보다 바람직하게는 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 4배 이상이며, 특히 바람직하게는 4배 이상 25배 이하이다.

또한, 본 명세서에서의 평균 분자량은 특별히 언급되지 않는 한 수평균 분자량을 말하고, 수평균 분자량이란 분자 크기의 무게를 고려하지 않는 방법으로 산출한 평균 분자량이고, 양친매성 폴리머, 다당 및 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량은 겔투과 크로마토그래피(GPC)로 측정한 폴리스티렌이나 풀루란 환산의 분자량으로서 구할 수 있다. 또한, 폴리(히드록시산)의 평균 분자량은 핵자기공명(¹H-NMR) 측정에 의해 말단 잔기의 피크 적분값과 말단 잔기 이외의 피크 적분값의 비로부터 구할 수 있다.

본 발명에 사용되는 다당 및 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 양친매성 폴리머는 기지의 방법으로 합성하면 좋고, 역상 에멀션을 형성할 수 있으면 합성법에 의해 한정되지 않지만, 예컨대, 이하의 (1), (2) 또는 (3)과 같이하여 제조할 수 있다.

(1) 주석 촉매 존재하, 다당에 히드록시산 활성화 모노머를 가하여 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 31, 1032-1039(1998년)].

(2) 수산기의 대부분이 치환기로 보호된 다당의 일부 미보호된 수산기를 염기로 활성화 후, 히드록시산 활성화 모노머를 가하여 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 그래프트 쇄를 도입하고, 최후에 보호기를 제거함으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Polymer, 44, 3927-3933(2003년)].

(3) 다당에 대하여, 폴리(히드록시산)의 공중합체를 탈수제 및/또는 관능기의 활성화제를 이용하여 축합 반응시킴으로써 그래프트형 양친매성 폴리머를 제조하는 방법[Macromolecules, 33, 3680-3685(2000년)].

본 발명에 사용되는 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 양친매성 폴리머는 기지의 방법으로 합성하면 좋고, 역상 에멀션을 형성할 수 있으면 합성법에 의해 한정되지 않지만, 예컨대, 주석 촉매 존재하 폴리에틸렌글리콜에 히드록시산 활성화 모노머를 가하여 중합 반응을 행하고, 폴리(히드록시산)을 도입함으로써 양친매성 블럭 폴리머를 제조하는 방법[Journal of Controlled Release, 71, 203-211(2001년)]에 의해 제조될 수 있다.

상술의 양친매성 폴리머와 친수성 생리 활성 물질을 함유하여 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자의 구조는 특별히 한정되지 않지만, 내부에 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 갖고 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트의 외층을 갖는 친수성 활성 물질 함유 입자인 경우, 내포되는 친수성 활성 물질이 보다 안정하게 유지될 수 있기 때문에 바람직하다.

친수성 활성 물질 함유 입자가 내부에 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 갖고 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트의 외층을 갖는 입자인 경우, 폴리(히드록시산) 외층에 표면개질제가 결합하고 있는 것에 대해서도 바람직한 형태 중 하나이다. 여기서 말하는 결합이란 비공유 결합이어도 공유 결합이어도 좋다. 비공유 결합은, 바람직하게는 소수적인 상호작용이지만 정전 상호작용, 수소 결합, 반·데르·왈스력이어도 좋고, 그들이 복합된 결합이라도 좋다. 비공유 결합에 있어서는 양친매성 폴리머를 포함하는 미립자의 소수성 외층과 후술의 표면개질제의 소수 부분이 소수적인 상호작용에 의해 결합하고 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 미립자의 분산매가 물, 완충액, 생리식염수, 표면개질제 수용액 또는 친수성 용매인 미립자분산체인 것이 특히 바람직하다.

표면개질제는 S/O/W형 에멀션의 수(水)-유(油) 계면 또는 S/O1/O2형 에멀션의 유(油)-유(油) 에멀션 계면을 안정화시키는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 마이크로 입자의 콜로이드 안정성을 향상시키는 성질을 갖는 화합물이다. 표면개질제는 1종이어도, 복수의 혼합물이어도 좋다. 여기서 콜로이드 안정성을 향상시키는 것이란 마이크로 입자의 용매 중에 있어서의 응집을 억제하는 것 또는 지연시키는 것을 말한다.

본 발명에서 표면개질제는 양친매성 화합물 또는 친수성 폴리머인 것이 바람직하다.

본 발명에서의 표면개질제의 친수성 폴리머로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리-1,3-디옥솔란, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 폴리머, 폴리-1,3,6-트리옥산, 폴리아미노산, 펩티드, 단백질, 당류 또는 어떠한 유연체인 것이 바람직하다.

상기 친수성 폴리머의 유연체로서는 친수성 폴리머를 장쇄 알킬 등의 소수기를 부분적으로 수식하는 등을 한 계면활성제가 열거되지만, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명에서의 표면개질제의 폴리에틸렌글리콜 유연체로서는 BASF로부터 시판되는 Pluronic(BASF의 등록상표) 또는 그 동등품이 바람직하다.

본 발명에서의 표면개질제의 폴리아미노산으로서는 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루탐산 또는 이들의 유연체가 바람직하다. 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루탐산의 일부에 장쇄 알킬기를 도입한 유연체가 특히 바람직하다.

본 발명에서의 표면개질제의 펩티드로서는 염기성 펩티드가 열거된다.

본 발명에서의 표면개질제의 단백질로서는 젤라틴, 카세인 또는 알부민이 입자의 분산성 향상을 위해서 바람직하다. 단백질로서는 항체도 바람직한 일례로서 열거된다.

본 발명에서의 표면개질제의 당류로서는 단당류, 올리고당류, 다당류가 바람직하다. 다당류로서는 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 알긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란이 바람직하고, 특히 콜레스테롤화 풀루란이 입자의 분산성 향상을 위해서 바람직하고, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 젤란검, 알긴산, 히알루론산, 풀루란 또는 덱스트란 중 어느 하나의 유연체가 바람직하다.

표면개질제로서의 이들 펩티드, 단백질, 당류는 장쇄 알킬 등의 소수기를 부분적으로 수식하는 등을 한 유연체나 상술의 친수성 폴리머나 양친매성 화합물을 수식한 유연체가 특히 바람직하다.

본 발명에서의 표면개질제에서 양친매성 화합물은 지질인 것도 바람직한 예 중 하나이다.

본 발명에서의 표면개질제에서 양친매성 화합물은 계면활성제인 것도 바람직한 예 중 하나이다. 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌글리콜 공중합체, 수크로오스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 디지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 모노지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 디지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 등의 비이온성 활성제나 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 암모늄, 스테아릴 황산 나트륨 등의 알킬 황산염 또는 레시틴이 바람직하다.

본 발명에 있어서 친수성 활성 물질이란 저분자 화합물, 단백질, 펩티드, DNA, RNA 또는 수식 핵산이 예시된다. 또한, 소수성 약물의 경우이어도, 가용화제 등의 친수성으로 함으로써 본 발명의 마이크로 입자에 함유시켜도 좋다. 여기서 말하는 가용화제로서는 시클로덱스트린이나 그 유연체가 바람직하다.

본 발명에 있어서 친수성 활성 물질로서 사용되는 단백질 또는 펩티드로서는 특별히 한정되지 않지만, 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드가 바람직하다. 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드로서는 펩티드 호르몬, 사이토카인, 효소 단백질, 항체 등이 열거되고, 구체예로서 부갑상선 호르몬(PTH), 칼시토닌, 인슐린, 인슐린과 같은 성장 인자, 앤지오텐신, 글루카곤, GLP-1이나 엑센딘 4로 대표되는 GLP-1 수용체 아고니스트 펩티드, 붐베신, 모틸린, 가스트린, 성장 호르몬, 프로락틴(황체 자극 호르몬), 고나도트로핀(성선 자극 호르몬), 티로트로픽 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬(ACTH), ACTH 유도체(에비레이티드 등), 멜라닌 세포 자극 호르몬, 난포 자극 호르몬(FSH), 세르모렐린, 바소프레신, 옥시토신, 프로티렐린, 황체 형성 호르몬(LH), 코르티코트로핀, 세크레틴, 소마트로핀, 티로트로핀(갑상선 자극 호르몬), 소마토스타틴, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), G-CSF, 에리스로포에틴(EPO), 트롬보포에틴(TPO), 메가카리오사이트 포텐셔에이터, HGF, EGF, VEGF, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨류, FGF(섬유종 세포증식 인자)류, BMP(골 형성 단백질)류, 흉선액성 인자(THF), 혈중 흉선 인자(FTS), 슈퍼옥시드 디무스타아제(SOD), 우로키나아제, 리소짐, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 아스파라키나아제, 칼리크레인, 그렐린, 아디포넥틴, 렙틴, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 심방성 나트륨 이뇨 인자, 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드(BNP), 코난토킨 G, 다이노르핀, 엔도르핀, 키요토르핀, 엔케팔린, 뉴로텐신, 안지오스틴, 브라디키닌, 서브스탠스 P, 칼리딘, 헤모글로빈, 프로틴 C, Ⅶa 인자, 글리코세레브로시다아제, 스트렙토키나아제, 스타필로키나아제, 사이모신(티모신), 판크레오지민, 콜레시스토키닌, 인간 태반 락토겐, 종양 괴사 인자(TNF), 폴리믹신 B, 콜리스틴, 그라미시딘, 바시트라신, 티모포에틴, 붐베신, 세룰레인, 티모스티물린, 세크레틴, 레지스틴, 헵시딘, 뉴로펩티드 Y, 뉴로펩티드 S, 콜레시스토키닌-판크레오지민(CCK-PZ), 뇌유래 신경 영양 인자(BDNF), 백신 등을 열거할 수 있다. 이들 생리활성 단백질 또는 생리활성 펩티드는 천연의 단백질 또는 펩티드이어도, 그 배열의 일부를 개변한 유도체이어도, 폴리에틸렌글리콜이나 당 쇄 등으로 수식한 것이어도 상관없다.

친수성 활성 물질이 DNA, RNA 또는 수식 핵산인 경우, 양이온성 계면활성제, 양이온성 지질, 양이온성 폴리머 및 그들 유연체와 복합화한 것이어도 좋다.

본 발명에 있어서 친수성 활성 물질로서 사용되는 당류로서는 히알루론산, 헤파린, 덱스트란 황산, 덱스트란 또는 FITC 표식 덱스트란(예컨대, FD40) 등이 열거된다.

또한, 본 발명은 상기 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자의 제조방법으로서,

(a) 친수성 활성 물질을 포함하는 수계 용매와 양친매성 폴리머를 용해한 수 비혼화성 유기 용매를 혼합함으로써 역상 에멀션을 형성하는 공정,

(b) 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하여 친수성 활성 성분 함유 고형분을 얻는 공정,

(c) 친수성 활성 성분 함유 고형분 또는 친수성 활성 성분 함유 고형분 분산액을 표면개질제를 포함하는 액상에 도입하는 공정을 포함하는 마이크로 입자의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자의 제조방법에서는, 역상 에멀션은 친수성 활성 물질을 포함하는 수계 용매를 양친매성 폴리머를 용해한 수 비혼화성 유기 용매에 첨가하고 혼화함으로써 형성된다. 필요하면 예컨대, 마그네틱 스터러 등의 교반 장치, 터빈형 교반기, 호모지나이저, 다공질막을 장비한 막유화 장치 등을 사용해도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서의 수 비혼화성 유기 용매란 물에 대한 용해도가 30g(수 비혼화성 유기 용매)/100ml(물) 이하의 유기 용매이고, 상기의 물에 대한 용해도를 상회하는 유기 용매에 대해서는 수혼화성 유기 용매에 위치가 부여된다.

공정 (a)에 있어서의 수계 용매에는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액을 사용한다. 상기 수용성 성분으로서 예컨대, 무기염류, 당류, 유기염류, 아미노산 등이 열거된다.

공정 (a)에 있어서의 수 비혼화성 유기 용매의 성질로서는 특별히 한정되지 않지만, 상기 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트인 폴리(히드록시산)이 가용이고, 또한 친수성 세그먼트가 난용 또는 불용인 것이 바람직하다. 또한, 상기 비수혼화성 유기 용매는 동결 건조 등에 의해 휘산 제거할 수 있는 것이 바람직하고, 0.1g(수 비혼화성 유기 용매)/10Oml(물) 이하인 것이 보다 바람직하다. 상기 수 비혼화성 유기 용매의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화 메틸렌, 클로로포름이 열거된다. 또한, 상기 수 비혼화성 유기 용매에 대한 수계 용매의 비는, 바람직하게는 1,000:1∼1:1, 보다 바람직하게는 100:1∼3:1이다. 상기 수 비혼화성 유기 용매 중의 양친매성 폴리머의 농도는 수 비혼화성 유기 용매, 양친매성 폴리머의 종류에 의해 다르지만, 0.01∼90%(w/w), 보다 바람직하게는 0.1∼50%(w/w), 더욱 바람직하게는 1∼20%(w/w)이다.

공정 (a)에 있어서의 친수성 활성 물질을 포함하는 수계 용매, 양친매성 폴리머를 용해한 수 비혼화성 유기 용매에 의해 역상 에멀션을 형성하는 공정에 있어서, 제제학적 목적에 따라서 2종 이상의 양친매성 폴리머를 용해한 수 비혼화성 유기 용매에 의해 역상 에멀션을 형성해도 좋다.

공정 (a)에 있어서의 친수성 활성 물질을 포함하는 수계 용매, 양친매성 폴리머를 용해한 수 비혼화성 유기 용매에 의해 역상 에멀션을 형성하는 공정에 있어서, 역상 에멀션의 형성을 보조하고 균일 또는 미소한 역상 에멀션을 형성하는 목적을 위해서 공제를 첨가할 수 있다. 공제로서는 탄소수 3개∼6개의 알킬알콜, 탄소수 3개∼6개의 알킬아민, 탄소수 3개∼6개의 알킬카르복실산으로부터 선택되는 화합물이 바람직하다. 이들 공제의 알킬 쇄의 구조는 특별히 한정되지 않고, 직쇄 구조이어도 분기 구조이어도 좋고, 포화 알킬이어도 불포화 알킬이어도 좋다. 본 발명에 있어서, 공제로서는 tert-부탄올, iso-프로판올, 펜탄올이 특히 바람직하다.

공정 (a)에 있어서의 역상 에멀션의 평균 입경은 소망하는 본 발명의 마이크로 입자의 입경에 의해 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 마이크로 입자의 용도 중 하나인 의약품용의 마이크로 입자를 제조하기 위해서는, 평균 입경의 상한은 50㎛인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5㎛, 더욱 바람직하게는 500nm, 더욱더 바람직하게는 150nm, 가장 바람직하게는 1OOnm이다. 역상 에멀션의 평균 입경의 하한은 바람직하게는 1Onm이고, 보다 바람직하게는 50nm이다.

이어서, 마이크로 입자의 제조방법에서는 공정 (a)로 얻어진 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하여 친수성 활성 성분 함유 고형분을 얻는 공정 (b)를 포함하는 것이 중요하다.

공정 (b)에 있어서, 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대, 가열, 감압 건조, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과, 재침전 및 그들의 조합이 열거된다.

상기 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하는 방법 중에서도, 동결 건조는 역상 에멀션 중 입자의 합일 등에 의한 구조 변화가 적고, 또한 친수성 활성 물질의 고온에 의한 변성을 회피할 수 있으므로 특히 바람직하다. 동결 건조의 조건, 장치로서는 동결 과정과 감압하에서의 건조 공정을 포함하는 것이고, 동결 건조의 상법인 예비 동결, 감압·저온하에서의 일차 건조, 감압하에서의 ２차 건조를 거친 공정이 특히 바람직하다. 예컨대, 역상 에멀션을 구성하는 수계 용매와 수 비혼화성 유기 용매의 융점 이하로 냉각·동결하고, 이어서 감압 건조함으로써 동결 건조한 친수성 활성 물질 함유 고형분이 얻어진다. 예비 동결의 온도로서는 용매 조성으로부터 적당히 실험적으로 결정하면 좋지만 -20℃ 이하가 바람직하다. 또한, 건조 과정에 있어서의 감압도도 용매 조성으로부터 적당히 실험적으로 결정하면 좋지만, 3,000Pa 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 500Pa 이하가 건조 시간의 단축을 위해 보다 바람직하다. 동결 건조에는 콜드 트랩을 구비한 진공 펌프와 접속가능한 레버레토리(laboratory)용 동결 건조기나 의약품의 제조 등에 이용되는 선반식 진공동결 건조기를 사용하는 것이 바람직하고, 액체 질소, 냉매 등에 의한 예비 동결 후, 냉각하 또는 실온에서 진공 펌프 등의 감압 장치로 감압 건조를 행하면 좋다.

공정 (b)에 있어서 얻어지는 친수성 활성 성분 함유 고형분은 역상 에멀션의 구조를 반영한 양친매성 폴리머를 함유하여 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자의 응집체로서 얻어진다. 또한, 여기서 말하는 응집체란 미립자가 입자간력에 의해 집합한 부정형한 덩어리이고, 본 발명의 마이크로 입자와는 형상에 있어서 명확히 구별된다. 상기 응집체를 구성하는 친수성 활성 물질 함유 미립자의 평균 입경은 소망하는 본 발명의 마이크로 입자의 입경에 의해 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 마이크로 입자의 용도 중 하나인 의약품용의 마이크로 입자를 제조하기 위해서, 평균 입경의 상한은 50㎛인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5㎛, 더욱 바람직하게는 500nm, 더욱더 바람직하게는 150nm, 가장 바람직하게는 1OOnm이다. 친수성 활성 물질 함유 미립자의 평균 입경의 하한은, 바람직하게는 10nm이고, 보다 바람직하게는 50nm이다.

본 발명의 마이크로 입자의 제조방법에서는 친수성 활성 성분 함유 고형분 또는 친수성 활성 성분 함유 고형분 분산액을 표면개질제를 포함하는 액상에 도입하는 공정 (c)를 포함하는 것이 중요하다.

공정 (c)에 있어서, 친수성 활성 성분 함유 고형분 또는 친수성 활성 성분 함유 고형분 분산액을 표면개질제를 포함하는 액상에 도입하는 방법은 예컨대, 친수성 활성 성분 함유 고형분을 표면개질제를 포함하는 액상에 첨가하는 방법이나, 친수성 활성 성분 함유 고형분을 일단 분산매에 분산시켜서 얻어진 분산액(솔리드·인·오일(S/0) 서스펜션)을 표면개질제를 포함하는 액상에 첨가하는 방법이 열거된다.

친수성 활성 성분 함유 고형분을 일단 분산매에 분산시키는 경우, 분산매로서는 특별히 한정되지 않지만, 친수성 활성 성분 함유 고형분을 구성하는 역상 에멀션의 구조를 반영한 양친매성 폴리머로 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자 구조를 유지하는 목적으로 폴리(히드록시산)이 가용이고, 또한 양친매성 폴리머를 구성하는 친수성 세그먼트를 실질적으로 용해하지 않는 용매인 것이 보다 바람직하다. 또한, 폴리(히드록시산)이 가용이고, 또한 친수성 세그먼트를 실질적으로 용해시키지 않는 용매란 용매 중에서의 친수성 세그먼트의 용해도가 50mg/ml 이하, 바람직하게는 10mg/mL 이하의 용매이다.

또한, 분산매는 상기 특징을 갖고 있으면 수 비혼화성 유기 용매 또는 수혼화성 유기 용매이어도 좋지만, 수 비혼화성 유기 용매인 것이 바람직하다. 또한, 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산)이 가용이고, 또한 친수성 세그먼트를 실질적으로 용해시키지 않는 수 비혼화성 유기 용매의 구체예로서는 아세트산 에틸, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 탄산 디메틸, 탄산 디에틸, 염화 메틸렌, 클로로포름, 디옥산, 톨루엔, 크실렌 등이 열거된다.

친수성 활성 물질 함유 고형분을 분산시키는 분산매에는 친수성 활성 물질 함유 입자의 분해 또는 붕괴에 의한 친수성 활성 물질의 방출 속도의 제어를 목적으로 분산매에 가용한 각종 첨가제, 예컨대 산성 화합물, 염기성 화합물, 양친매성 폴리머 또는 생분해성 폴리머 등을 함유해도 좋다.

공정 (c)에 있어서의 액상은 상술의 표면개질제를 가용이고, 또한 친수성 활성 성분 함유 고형분 분산매보다도 높은 비점을 갖는 것이 바람직하고, 수계 용매, 수 비혼화성 유기 용매, 수혼화성 유기 용매 중 어느 것이어도 좋다. 여기서 말하는 수계 용매로서는 물 또는 수용성 성분을 함유하는 수용액이 바람직하고, 상기 수용성 성분으로서 예컨대, 무기염류, 당류, 유기염류, 아미노산 등이 열거되고, 수 비혼화성 유기 용매로서는 예컨대, 실리콘유, 참기름, 대두유, 옥수수유, 면실유, 코코넛유, 아마인유, 광물유, 피마자유, 경화 피마자유, 유동 파라핀, n-헥산, n-헵탄, 글리세롤, 올레인산 등이 열거되고, 수혼화성 유기 용매로서는 예컨대, 글리세린, 아세톤, 에탄올, 아세트산, 디프로필렌글리콜, 트리에탄올아민, 트리에틸렌글리콜 등이 열거된다. 본 발명에 있어서는, 공정 (c)에 있어서의 액상은 수계 용매 또는 수혼화성 유기 용매인 것이 바람직하다. 액상이 수계 용매이고, 또한 분산매가 수 비혼화성 유기 용매인 경우에는, 공정 (c)로 얻어진 현탁액은 소위, 솔리드·인·오일·인·워터(S/0/W)형 에멀션이 되고, 액상이 수 비혼화성 유기 용매 또는 수혼화성 유기 용매이고, 또한 분산매와 혼화하지 않는 경우에는 솔리드·인·오일·인·오일(S/O1/O2)형 에멀션이 된다.

친수성 활성 물질 함유 고형분을 분산시키는 분산매에 대한 액상의 용적비는, 일반적으로는 1,000:1∼1:1,000, 보다 바람직하게는 100:1∼1:100이다.

본 발명의 액상 중에 있어서의 표면개질제 농도는 표면개질제의 종류에 따라 다르지만, 바람직하게는 0.01∼90%(w/v)이고, 보다 바람직하게는 0.1∼50%(w/v), 더욱 바람직하게는 5∼10%(w/v)이다.

표면개질제는 본 발명의 마이크로 입자의 양친매성 폴리머의 폴리(히드록시산) 외층에 결합해도 좋지만, 그 경우 결합량은, 바람직하게는 마이크로 입자 중량에 대하여 0.0001%∼1%이다.

공정 (c)에 있어서의 액상은 표면개질제에 더하여 제제학적인 목적에 따라서, 각종 첨가물 예컨대, 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당 등을 함유해도 좋다.

공정 (c)에 있어서는 액상에 무기염류를 첨가하는 것도 바람직하다. 무기염류는 알칼리 금속염 또는 알칼리토류 금속염인 것이 바람직하고, 염화 나트륨이 보다 바람직하다. 액상 중의 무기염류의 농도는, 바람직하게는 0∼1M이고, 보다 바람직하게는 10mM∼1M이며, 더욱 바람직하게는 10mM∼100mM이다.

공정 (c)에 있어서, 보다 미세한 마이크로 입자를 제조하는 목적으로 형성되는 솔리드·인·오일·인·워터(S/0/W)형 에멀션 또는 솔리드·인·오일·인·오일(S/O1/O2)형 에멀션의 유화 조작을 행해도 좋다. 유화방법은 안정한 에멀션을 조제할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 교반에 의한 방법, 고압 호모지나이저, 고속 호모 믹서 등을 이용하는 방법 등이 열거된다.

공정 (c)에서, 친수성 활성 성분 함유 고형분을 일단 분산매에 분산시켜서 얻어진 분산액을 표면개질제를 포함하는 액상에 첨가하는 경우에는, 분산매를 제거함으로써 소망의 친수성 활성 물질 함유 미립자가 회합하여 이루어지는 마이크로 입자의 현탁액이 얻어진다. 분산매를 제거하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 액중 건조, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과, 재침전이 열거되고, 액중 건조, 동결 건조가 특히 바람직하다. 공정 (c)에 있어서, 액상으로서 수계 용매를 이용하는 경우에는, 본 공정에 의해 마이크로 입자의 수계 분산체가 얻어진다.

상술한 바와 같이 마이크로 입자 분산체로부터 액상을 제거함으로써, 본 발명의 마이크로 입자를 얻을 수 있다. 액상을 제거하는 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 증발에 의한 증류제거, 투석, 동결 건조, 원심 조작, 여과가 바람직하다.

본 발명에 의해 얻어지는 마이크로 입자의 응용 분야는 널리, 다방면 이용이 가능하지만, 의약품 조성물로서 바람직하게 이용된다. 본 발명의 마이크로 입자를 의약품 조성물로서 이용하려면, 마이크로 입자 이외에 제제학적으로 유용한 각종 첨가제를 함유하고 있어도 좋고, 첨가할 수 있는 첨가물은, 바람직하게는 완충제, 항산화제, 염, 폴리머 또는 당이다.

본 발명의 마이크로 입자를 의약품 조성물로서 이용하는 경우의 투여 방법으로서 예컨대, 경구 투여 또는 비경구 투여가 열거되지만, 바람직하게는 비경구 투여이다. 비경구 투여로서는 피하 투여, 근육내 투여, 경장 투여, 경폐 투여, 국소 투여(코, 피부, 눈) 및 복강내 투여 등에 이용할 수 있지만, 특히 바람직한 투여 방법으로서 피하 또는 근육내로의 주사가 열거된다. 또한, 본 발명의 의약 조성물을 생체에 투여할 때의 투여량이나 투여 횟수는 친수성 활성 물질, 투여 형태, 환자의 연령, 체중, 증상의 중독도에 의해 적당히 선택될 수 있지만, 통상 성인 1일당 O.1㎍∼1OOmg, 바람직하게는 1㎍∼1Omg의 범위로 투여된다.

(실시예)

이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1 덱스트란-폴리락트산(PLA)의 합성

1-1. TMS-덱스트란(화합물(1))의 합성

덱스트란(Nacalai Tesque Inc.에 의해서 제작, 나카라이규격 특급 적합품, 수평균 분자량 13000, 5.0g)을 포름아미드(100ml)에 가하여 80℃로 가열했다. 이 용액에 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔(100ml)을 20분에 걸쳐 적하했다. 적하 종료 후, 80℃로 2시간 교반했다. 반응 종료 후, 반응 용액을 실온으로 되돌리고, 분액 깔대기로 2층을 분리했다. 상층을 감압하 농축한 후, 메탄올(300ml)을 가하여 얻어진 고체를 여과, 건조하여 TMS-덱스트란(11.4g)을 백색 고체로서 얻었다.

1-2. TMS-덱스트란-PLA(화합물(2))의 합성

화합물 (1)(0.5g)과 tert-부톡시 칼륨(35mg)을 감압하 1시간 건조 후, 테트라히드로푸란(20ml)을 가하여 1시간 실온으로 교반했다. 이 용액에 (L)-락티드(4.49g)의 테트라히드로푸란(20ml) 용액을 적하하여 5 분간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압하 농축하고, 클로로포름-메탄올계로 재침전 정제를 행함으로써 TMS-덱스트란-PLA(1.9g)를 백색 고체로서 얻었다.

1-3. 덱스트란-PLA(화합물(3))의 합성

화합물 (2)(1.9g)의 클로로포름(24ml)용액에 메탄올(10.8ml)과 12N 염산(1.2ml)을 첨가하여 실온에서 30분간 교반했다. 용매를 감압하 증류제거 후, 잔사를 클로로포름(1Oml)에 용해하고, O℃로 냉각시킨 디에틸에테르에 적하함으로써 생성물을 석출시켰다. 석출물을 여과선별 후, 감압하 농축하여 덱스트란-PLA(1.6g)를 얻었다. 본 폴리머의 중량평균 분자량은 48720, 수평균 분자량은 43530이었다(GPC 에 의한 측정:컬럼 Toso-TSK-gelα-5000×2, DMF계 용매, 검출기 RI, 표준품 풀루란). 본 폴리머의 ¹H-NMR 측정에 의해 결정된 그래프트 쇄의 평균 분자량은 2300이었다. 그래프트 쇄수는 10∼12개이었다.

실시예 2 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)의 합성

2-1. TMS-덱스트란-PLGA(화합물 (4), 화합물 (5), 화합물 (6))의 합성

화합물 (1)(0.5g)과 tert-부톡시 칼륨(35mg)을 감압하 1시간 건조 후, 테트라히드로푸란(10ml)을 가하여 1시간 실온에서 교반했다. 이 용액에 (DL)-락티드(1.12g)와 글리콜리드(0.9g)의 테트라히드로푸란(15ml) 용액을 적하하여 5분간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압하 농축하고, 클로로포름-메탄올계로 재침전 정제를 행함으로써 TMS-덱스트란-PLGA(1.96g)를 백색 고체로서 얻었다(화합물 (4)). 동일한 방법으로, (DL)-락티드(0.784g)와 글리콜리드(0.63g)의 투여량으로 화합물 (5)을, 동일한 투여량으로 (DL)-락티드(1.12g)와 글리콜리드(0.9g)로 화합물 (6)을 합성했다.

2-2. 덱스트란-PLGA(화합물 (7), 화합물 (8), 화합물 (9))의 합성

화합물 (4)(1.96g)의 클로로포름(14ml) 용액에 메탄올(6.3ml)과 12N 염산(0.7ml)을 첨가하여 실온에서 30분간 교반했다. 용매를 감압하 증류제거 후, 잔사를 클로로포름(1Oml)에 용해시키고, O℃로 냉각시킨 디에틸에테르에 적하함으로써 생성물을 석출시켰다. 석출물을 여과선별 후, 감압하 농축하여 덱스트란-PLGA(1.25g)를 얻었다(화합물 (7)). 화합물 (5), (6)으로부터도 트리플루오로 아세트산을 사용한 것 이외에는 유사 방법으로 덱스트란-PLGA를 얻었다(화합물 (8), 화합물 (9)). 화합물 (7)∼(9) 폴리머의 중량평균 분자량, 수평균 분자량은 GPC 측정(컬럼 Toso-TSK-gelα-5000×2, DMF계 용매, 검출기 RI, 표준품 풀루란)에 의해 결정했다. 그래프트 쇄의 평균 분자량, 그래프트 쇄수는 ¹H-NMR 측정에 의해 결정했다.

화합물 (7)에 대해서는 중량평균 분자량 43,820, 수평균 분자량 33,422, 그래프트 쇄 분자량 1,900, 그래프트 쇄수 7∼10개이었다.

화합물 (8)에 대해서는 중량평균 분자량 94,088, 수평균 분자량 81,250, 그래프트 쇄 분자량 3,250, 그래프트 쇄수 21개이었다.

화합물 (9)에 대해서는 중량평균 분자량 137,695, 수평균 분자량 109,630, 그래프트 쇄 분자량 6,442, 그래프트 쇄수 15개이었다.

실시예 3 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 조제법

실시예 1의 덱스트란-폴리락트산(PLA)(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLA 평균 분자량 2,300, PLA 그래프트 쇄수 10∼12개, 화합물 (3)) 또는 실시예 2의 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLGA 평균 분자량 1,900, PLGA 그래프트 쇄수 7∼10개, 화합물 (7)) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해시켜 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후, 2mg/ml의 hGH 수용액 20㎕를 적하하고, 보텍스(vortex)로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하시키고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 마이크로 입자의 평균 입경은 4.0㎛이었다.

실시예 4 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 약물 내포율의 측정

덱스트란-PLA(화합물 (3)) 또는 덱스트란-PLGA(화합물 (7)) 폴리머를 이용하여 실시예 3의 방법으로 작성한 인간 성장 호르몬 내포 마이크로 입자 20mg을 1.5ml 에펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 칭량하고, 1ml의 완충액 A(0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS)에 용해하여 18,000×g, 10분간의 원심에 의해 입자(침전)와 상청을 분리했다. 상청을 다른 튜브에 회수한 후, 입자를 1ml의 완충액에 재현탁시키고, 상기 조건에서의 원심에 의한 입자와 상청의 분리를 다시 행했다. 이 세정 조작을 또 한번 반복(계 3회 원심)하고, 각 원심으로 회수한 상청 중의 인간 성장 호르몬 농도를 ELISA 키트(R&D Systems에 의해서 제작)로 측정했다. 입자 제작시의 투입 hGH량(입자 중량 20mg당)으로부터 3회의 원심 상청 중의 hGH량 합계를 공제함으로써 이하의 식에 의해 내포율을 계산했다.

덱스트란-PLA 마이크로 입자 또는 덱스트란-PLGA 마이크로 입자에 있어서의 hGH의 내포율은 덱스트란-PLA 마이크로 입자에 있어서 92.6%, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자에 있어서 85.7%이며, 어느 쪽의 입자도 높은 효율로 단백질 약물을 내포가능한 것을 나타냈다.

실시예 5 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자로부터의 in vitro 약물 방출 속도의 해석

실시예 4에서 3회 세정을 행한 마이크로 입자를 1.2ml의 완충액 A에 현탁 분산시켰다. 이 용액으로부터 일부(40㎕)를 다른 튜브에 옮기고, 18,000×g l0분간 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청 30㎕를 다른 튜브에 회수했다(0시간 샘풀). 나머지 입자 현탁액은 1.5ml 에펜돌프 튜브 중에서 37℃ 인큐베이터내에 로터리를 이용하여 6rpm의 속도로 천천히 전도 혼화시켰다. 이 용액으로부터 경시적으로 소량(40㎕)을 분취하여 상기와 동일하게 원심에 의한 상청 분리를 행했다. 각 시점에서 회수한 상청 샘플 중의 hGH 농도를 ELISA 키트로 측정하여 방출량(%)을 이하의 식에 의해 계산했다.

덱스트란-PLA 또는 덱스트란-PLGA 폴리머를 이용하여 제작한 마이크로 입자로부터의 약물 방출의 타임 코스를 도 1에 나타낸다. 어떠한 입자도 초기 버스트가 거의 없고, 시간 경과에 비례하여 약물이 직선적으로 방출되는 양호한 프로파일을 나타냈다. 50%의 약물이 방출되는데 필요한 시간은 덱스트란-PLA 마이크로 입자에서 약 1개월, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자에서는 약 1주간이고, 폴리(히드록시산)의 종류를 선택함으로써 방출 속도를 조절가능한 것을 나타냈다.

실시예 6 인간 인슐린 내포 마이크로 입자의 조제법

덱스트란-PLA(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLA 평균 분자량 2,300, PLA 그래프트 쇄수 10∼12개, 화합물 (3)) 또는 덱스트란-PLGA(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLGA 평균 분자량 1,900, PLGA 그래프트 쇄수 7∼10개, 화합물 (7)) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해시켜 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후, 2mg/ml의 인간 인슐린 수용액 20㎕를 적하시키고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하시키고 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/O/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 인간 인슐린 내포 입자 분말을 얻었다. 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 화합물 (3)으로 얻어지는 마이크로 입자의 평균 입경은 6.4㎛, 화합물 (7)로 얻어지는 마이크로 입자의 평균 입경은 5.3㎛이었다.

실시예 7 인간 인슐린 내포 마이크로 입자의 약물 내포율의 측정

덱스트란-PLGA(화합물(7)) 폴리머를 이용하여 실시예 6의 방법으로 작성한 인간 인슐린 내포 마이크로 입자 20mg을 1.5ml 에펜돌프 튜브에 칭량하고, 1ml의 완충액 A(0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS)에 용해하여 18,800×g, 10분간의 원심에 의해 입자(침전)와 상청을 분리했다. 상청을 다른 튜브에 회수한 후, 입자를 1ml의 완충액에 재현탁시키고, 상기 조건에서의 원심에 의한 입자와 상청의 분리를 다시 행했다. 이 세정 조작을 또 한번 반복(계 3회 원심)하고, 각 원심으로 회수한 상청 중의 인간 성장 호르몬 농도를 샌드위치 ELISA법으로 측정했다. 입자 제작시의 투입 인간 인슐린량(입자 중량 20mg당)으로부터 3회의 원심 상청 중의 인간 인슐린량 합계를 공제함으로써 이하의 식에 의해 내포율을 계산했다.

덱스트란-PLGA 마이크로 입자로의 인간 인슐린의 내포율은 75.7%이고, 높은 효율로 내포가능한 것을 나타냈다.

실시예 8 인간 인슐린 내포 마이크로 입자로부터의 in vitro 약물 방출 속도의 해석

실시예 7에서 3회 세정을 행한 입자를 1.2ml의 완충액 A에 현탁 분산시켰다. 이 용액으로부터 일부(40㎕)를 다른 튜브에 옮기고, 18,800×g l0분간 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청 30㎕를 다른 튜브에 회수했다(0시간 샘플). 회수 후의 샘플은 측정까지 동결 보존했다. 나머지 입자 현탁액은 1.5ml 에펜돌프 튜브 중에서 37℃ 인큐베이터내에 로터리를 이용하여 6rpm의 속도로 천천히 전도 혼화시켰다. 이 용액으로부터 경시적으로 소량(40㎕)을 분취하여 상기와 동일하게 원심에 의한 상청 분리를 행했다. 각 시점에서 회수한 상청 샘플 중의 인간 인슐린 농도를 샌드위치 ELISA법으로 측정하여 방출량(%)을 이하의 식에 의해 계산했다.

인간 인슐린 방출의 타임 코스를 도 2에 나타낸다. 초기 버스트가 거의 없고, 시간 경과에 비례하여 약물이 직선적으로 방출되는 양호한 프로파일을 나타냈다. 50%의 약물이 방출되는데 필요한 시간은 약 6일이었다.

실시예 9 마이크로 입자 형태의 경시적 변화

실시예 3에서 조제한 hGH 내포 마이크로 입자 분말 5mg을 에펜돌프 튜브에 칭량하고 Milli-Q 1ml에 분산 후, 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상청을 제거 후에 다시 Milli-Q 1ml에 분산시켜 원심분리함으로써 마이크로 입자의 세정을 행했다. 또한, 소정 시간 인큐베이트한 마이크로 입자 현탁 용액에 Milli-Q 1ml을 가하여 13,000rpm으로 30분간 원심분리하고, 상청 제거 후에 다시 Milli-Q 1ml에 분산시켜 동일하게 원심분리함으로써 마이크로 입자의 세정을 행했다. 얻어진 세정 후의 마이크로 입자를 Milli-Q 100㎕에 분산시켜 마이크로 입자 분산 용액을 실리콘 기판 상에 5㎕ 적하하고, 약 10분간 실온 방치한 후에 데시케이터내에서 3시간 건조시켰다. 그 후, 이온 스퍼터(HITACHI, E-1030)를 이용하여 시료 표면에의 백금 증착(증착 시간 15초)을 행하고, 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 가속 전압을 1kV, 프로브 전류를 high로 설정하여 마이크로 입자 형상, 표면 상태 관찰을 행했다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 제작 직후는 구형으로 표면이 매끈매끈했던 입자가 37℃, 13일간 인큐베이션 후에는 형상이 현저하게 붕괴되어 많은 구멍이 있던 상이 되어 약물의 방출에 대응하여 입자의 분해가 진행되고 있는 것을 나타냈다.

비교예 1

폴리에틸렌글리콜-폴리(엡실론-카푸로락톤)(폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량 5,000, 폴리(엡실론-카푸로락톤)의 평균 분자량 37,000) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해시켜 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕을 첨가 후, 2mg/ml의 hGH 수용액 20㎕을 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하시키고 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 입자 분말을 얻었다. 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 얻어진 마이크로 입자의 평균 입경은 8.0㎛이었다.

조제한 hGH 내포 마이크로 입자 분말 5mg을 에펜돌프 튜브에 칭량하고 Milli-Q 1ml에 분산 후, 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상청을 제거 후에 다시 Milli-Q 1ml에 분산시켜 원심분리함으로써 마이크로 입자의 세정을 행했다. 또한, 소정 시간 인큐베이트한 마이크로 입자 현탁 용액에 Milli-Q 1ml을 가하여 13,000rpm으로 30분간 원심분리하고, 상청 제거 후에 다시 Milli-Q 1ml에 분산시켜 동일하게 원심분리함으로써 마이크로 입자의 세정을 행했다. 얻어진 세정 후의 마이크로 입자를 Milli-Q 100㎕에 분산시켜 마이크로 입자 분산 용액을 실리콘 기판 상에 5㎕ 적하하여 약 10분간 실온 방치한 후에 데시케이터내에서 3시간 건조시켰다. 그 후, 이온 스퍼터(HITACHI, E-1030)를 이용하여 시료 표면에의 백금 증착(증착 시간 15초)을 행하고, SEM(HITACHI, S-4800)에 의해 가속 전압을 1kV, 프로브 전류를 high로 설정하여 마이크로 입자 형상, 표면 상태 관찰을 행했다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 9의 덱스트란-PLGA 마이크로 입자의 경우와는 다르고, 37℃, 21일 인큐베이션 후에도 입자의 형태는 거의 변화되지 않아 친수성 활성 물질의 방출성에 문제를 나타냈다.

실시예 10 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 마우스 피하 투여

덱스트란-폴리락트산(PLA)(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLA 평균 분자량 2,300, PLA 그래프트 쇄수 10∼12개, 화합물 (3)) 또는 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(덱스트란 평균 분자량 13000, PLGA 평균 분자량 1,900, PLGA 그래프트 쇄수 7∼10개, 화합물 (7)) 25mg을 탄산 디메틸 500㎕에 용해시켜 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 100㎕을 첨가 후, 10mg/ml의 hGH 수용액 250㎕을 적하시키고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 1ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 1O% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 10ml에 적하시키고 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 얻어진 마이크로 입자의 평균 입경은, 화합물 (3)의 마이크로 입자는 4.9㎛, 화합물 (7)의 마이크로 입자는 4.2㎛이었다.

상기에서 작성한 마이크로 입자 300mg을 3ml의 인산 생리 완충액(PBS)에 현탁 분산시키고, 80×g, 5분간의 원심에 의해 마이크로 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간의 원심을 행하고 잔존하고 있는 입자를 침전시켜 상청을 제거했다. 첫번재의 원심 침전과 두번째의 원심 침전을 합쳐서 1ml의 PBS에 재분산시키고 동일한 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 마이크로 입자에 내포되어 있지 않은 성장 호르몬을 제거했다. 최후에 침전을 200㎕의 PBS에 재분산시켜 투여 용액이라고 했다. 또한, 덱스트란-PLA 마이크로 입자 및 덱스트란-PLGA 마이크로 입자 각각에 내포된 성장 호르몬량은 세정액 중의 농도를 ELISA 키트로 측정하여 투입량으로부터 공제함으로써 계산한 결과, 마우스 1마리당 투여한 300mg의 입자에 내포되어 있는 양으로서 덱스트란-PLA 마이크로 입자는 590㎍, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자는 536㎍이었다.

본 용액을 10주령의 수컷 Balb/C 마우스의 등부 피하 2개소에 주사 투여하고, 꼬리 정맥으로부터 경시적으로 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/ml의 헤파린을 첨가하여 5,000rpm 5분간 원심하여 혈장을 회수하고, ELISA 키트를 이용하여 혈장 중 성장 호르몬 농도를 측정했다.

비교로서, 입자화하지 않는 인간 성장 호르몬 단백질 용액(700㎍/0.2ml)을 피하 투여한 마우스에 대해서도 같이 채혈을 행했다.

또한, 마우스에 있어서 이종 단백질인 인간 성장 호르몬 투여에 의한 항체 산생을 억제하기 위해서, 입자 투여의 3일 전에 면역 억제제 타크로리무스(tacrolimus) 수화물(Astellas에 의해서 제작) 26㎍/마우스를 피하 투여하고, 그 후 약물 투여시 3일 후, 7일 후에도 13㎍/마우스를 피하 투여했다.

혈장 중 인간 성장 호르몬 농도의 경시 변화를 도 5에 나타낸다. 마이크로 입자화하지 않는 약물을 투여한 마우스에서는 투여 1시간 후에 혈중 농도는 5,000ng/ml 이상 매우 높은 값을 나타내고, 그 후 급속히 저하하여 1일 후에는 투여 전의 레벨까지 저하했다. 한편, 덱스트란-PLA 폴리머를 이용하여 제작한 마이크로 입자화 약물을 투여한 마우스에서, 투여 직후의 일과성의 혈중 농도의 상승은 200ng/ml 이하로 억제할 수 있어 7일 후까지 혈중 농도가 지속적으로 높은 값을 나타냈다. 또한, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자에 대해서는 투여 후의 일과성의 농도 상승이 전혀 없고, 또한 7일 후까지 거의 일정한 혈중 농도를 유지하는 매우 양호한 서방 성능을 나타냈다.

실시예 11 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 마우스 피하 투여(약리 활성 평가)

실시예 2의 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLGA 평균 분자량 1,900, PLGA 그래프트 쇄수 7∼10개, 화합물 (7)) 25mg을 탄산 디메틸 500㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 100㎕을 첨가 후, 10mg/ml의 hGH 수용액 250㎕을 적하시키고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 1ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 10ml에 적하시키고 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/O/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 얻어진 마이크로 입자의 평균 입경은 4.1㎛이었다.

상기에서 작성한 마이크로 입자 300mg을 3ml의 인산 생리 완충액(PBS)에 현탁 분산시키고, 80×g, 5분간의 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간의 원심을 행하여 잔존하고 있는 입자를 침전시켜 상청을 제거했다. 첫번째의 원심 침전과 두번째의 원심 침전을 합쳐서 1ml의 PBS에 재분산시키고, 동일한 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 입자에 내포되어 있지 않은 성장 호르몬을 제거했다. 최후에 침전을 200㎕의 PBS에 재분산시켜 투여 용액이라고 했다.

본 용액을 8주령의 뇌하수체 적출 ICR 마우스(Japan SLC에 의해서 제작)의 등부 피하에 주사 투여하고, 꼬리 정맥으로부터 경시적으로 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/ml의 헤파린을 첨가하여 5,000rpm 5분간 원심하여 혈장을 회수하고, ELISA법을 이용하여 혈장 중 성장 호르몬 농도 및 마우스 IGF-1 농도를 측정했다.

비교로서, 입자화하지 않은 인간 성장 호르몬 단백질 용액(700㎍/0.2ml)을 피하 투여한 마우스에 대해서도 동일하게 채혈을 행했다.

또한, 마우스에 있어서 이종 단백질인 인간 성장 호르몬 투여에 의한 항체 산생을 억제하기 위해서, 입자 투여의 3일 전에 면역 억제제 타크로리무스 수화물(Astellas에 의해서 제작) 26㎍/마우스를 피하 투여하고, 그 후 약물 투여시 3일 후, 7일 후에도 13㎍/마우스를 피하 투여했다.

혈장 중 인간 성장 호르몬 농도의 경시 변화를 도 6에 나타낸다. 마이크로 입자화하지 않은 약물을 투여한 마우스에서, 투여 1시간 후에 혈중 농도는 매우 높은 값을 나타내고, 그 후 급속히 저하하여 2일 후에는 투여 전의 레벨까지 저하했다. 한편, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자에 대해서는 투여 후의 일과성의 농도 상승이 낮게 억제되고, 또한 투여 10일 후까지 혈장 중의 농도가 높은 값으로 유지됐다. 또한, 이 때의 마우스의 체중 변화 추이를 도 7에 나타낸다. 성장 호르몬 단독을 투여한 마우스에서 체중 증가는 5% 정도로 억제될 수 있었지만, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자를 투여한 마우스에서는 20% 정도의 체중 증가가 확인됐다.

혈장 중의 IGF-1 농도를 도 8에 나타낸다. 혈장 중의 IGF-1 농도는 혈중 인간 성장 호르몬 농도와 상관하여 덱스트란-PLGA 마이크로 입자를 투여한 마우스에서는 투여 후 10일째까지 높은 값을 유지하고 있는 것이 확인됐다.

실시예 12 엑센딘 4(GLP-1 수용체 애고니스트) 내포 마이크로 입자로부터의 완충액 중 약물 방출 속도의 해석

덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(덱스트란 평균 분자량 13,000, PLGA 평균 분자량 3,250(화합물 (8)) 또는 6,442(화합물 (9)), PLGA 그래프트 쇄수 21개(화합물 (8)) 또는 15(화합물 (9))) 25mg를 탄산 디메틸 500㎕에 용해시켜 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 100㎕를 첨가 후, 10mg/ml의 엑센딘 4(Sigma Genosys에 의한 의탁 합성) 수용액 250㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 1ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 1Oml에 적하하고 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/O/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 엑센딘 4 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 얻어진 마이크로 입자의 평균 입경은, 화합물 (8)의 마이크로 입자는 4.3㎛, 화합물 (9)의 마이크로 입자는 4.5㎛이었다.

이들 마이크로 입자를 실시예 4의 방법에 따라 3회 세정한 후, 1.2ml의 완충액 A에 현탁 분산시켰다. 이 용액으로부터 일부(40㎕)를 다른 튜브에 옮기고, 18000×g 10분간 원심에 의해 마이크로 입자를 침전시켜 상청 30㎕를 다른 튜브에 회수했다(0시간 샘플). 나머지 마이크로 입자 현탁액은 1.5ml 에펜돌프 튜브 중에서 37℃ 인큐베이터내에 로터리를 이용하여 6rpm의 속도로 천천히 전도 혼화시켰다. 이 용액에서 경시적으로 소량(40㎕)을 분취하여 상기와 동일하게 원심에 의한 상청 분리를 행했다. 각 시점에서 회수한 상청 샘플 중의 엑센딘 4 농도를 ELISA법으로 측정하여 방출량(%)을 이하의 식에 의해 계산했다.

각 덱스트란-PLGA 폴리머를 이용하여 제작한 마이크로 입자로부터의 약물 방출의 타임 코스를 도 9에 나타낸다. 어떠한 마이크로 입자도 초기 버스트가 거의 없고, 시간 경과에 비례하여 약물이 직선적으로 방출되는 양호한 프로파일을 나타냈다.

실시예 13 엑센딘 4(GLP-1 수용체 아고니스트) 내포 마이크로 입자의 마우스 피하 투여

실시예 12의 마이크로 입자 300mg을 3ml의 인산 생리 완충액(PBS)에 현탁 분산시키고, 80×g, 5분간 원심에 의해 마이크로 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간의 원심을 행하여 잔존하고 있는 마이크로 입자를 침전시켜 상청을 제거했다. 첫번째 원심 침전과 두번째 원심 침전을 합쳐서 1ml의 PBS에 재분산시키고, 동일한 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 마이크로 입자에 내포되어 있지 않은 엑센딘 4를 제거했다. 최후에 침전을 200㎕의 PBS에 재분산시켜 투여 용액이라고 했다.

본 용액을 8주령의 SCID 마우스(CB17/lcr-Prkdcscid/CrlCrlk)(Crea Japan Inc.에 의해서 제작)의 등부 피하에 주사 투여하고, 꼬리 정맥으로부터 경시적으로 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/ml의 헤파린을 첨가하여 5000rpm 5분간 원심하여 혈장을 회수하고, ELISA법을 이용하여 혈장 중 엑센딘 4 농도를 측정했다. 비교로서, 마이크로 입자화하지 않은 엑센딘 4 용액(700㎍/0.2ml)을 피하 투여한 마우스에 대해서도 동일하게 채혈을 행했다.

혈장 중 엑센딘 4 농도의 경시 변화를 도 10에 나타낸다. 마이크로 입자화하지 않은 약물을 투여한 마우스에서 투여 1시간 후에 혈중 농도는 매우 높은 값을 나타내고, 그 후 급속히 저하하여 투여 전의 레벨까지 저하했다. 한편, 덱스트란-PLGA 마이크로 입자에 대해서는 투여 후의 일과성의 농도 상승이 낮게 억제되고, 또한 5주간까지 높은 혈장 중 농도를 유지했다.

실시예 14 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)의 합성

14-1. TMS-덱스트란-PLGA(화합물 (10), 화합물 (11), 화합물 (12), 화합물 (13))의 합성

화합물 (1)(0.5g)과 tert-부톡시 칼륨(35mg)을 감압하 1시간 건조 후, 테트라히드로푸란(10ml)을 가하여 1시간 실온으로 교반했다. 이 용액에 (DL)-락티드(0.558g)와 글리콜리드(0.45g)의 테트라히드로푸란(15ml) 용액을 적하하여 5분간 교반했다. 반응 종료 후, 용매를 감압하 농축하고, 클로로포름-메탄올계로 재침전 정제를 행함으로써 TMS-덱스트란-PLGA(1.96g)를 백색 고체로서 얻었다(화합물 (10)).

동일한 방법으로, (DL)-락티드(0.67g)와 글리콜리드(0.54g)의 투입량으로 화합물 (11)을 합성했다.

동일한 방법으로, (DL)-락티드(0.781g)와 글리콜리드(0.629g)의 투입량으로 화합물 (12)를 합성했다.

동일한 방법으로, (DL)-락티드(1.123g)와 글리콜리드(0.9g)의 투입량으로 화합물 (13)을 합성했다.

14-2. 덱스트란-PLGA(화합물 (14), 화합물 (15), 화합물 (16), 화합물 (17))의 합성

화합물 (10)의 클로로포름 용액(10mL)에, 트리플루오로 아세트산(1mL)을 첨가하여 실온으로 30분간 교반했다. 용매를 감압하 증류제거 후, 잔사를 클로로포름(10ml)에 용해시키고 0℃로 냉각한 디에틸에테르에 적하함으로써 생성물을 석출시켰다. 석출물을 여과선별 후, 감압하 농축한 덱스트란-PLGA(0.44g)를 얻었다(화합물 (14)).

화합물 (11), (12), (13)으로부터도 유사한 방법으로 덱스트란-PLGA를 얻었다(화합물 (15), 화합물 (16), 화합물(17)). 화합물 (14)∼(17) 폴리머의 중량평균 분자량, 수평균 분자량은 GPC측정(컬럼 Toso-TSK-gel α-5000×2, DMF계 용매, 검출기 RI, 표준품 풀루란)에 의해 결정했다. 그래프트 쇄의 평균 분자량, 그래프트 쇄수는 ¹H-NMR 측정에 의해 결정했다.

화합물 (14)에 대해서는 중량평균 분자량 99,462, 수평균 분자량 85,101, 그래프트 쇄수 평균 분자량 2,167, 그래프트 쇄수 33개이었다.

화합물 (15)에 대해서는 중량평균 분자량 107,779, 수평균 분자량 92,134, 그래프트 쇄수 평균 분자량 3,127, 그래프트 쇄수 25개이었다.

화합물 (16)에 대해서는 중량평균 분자량 121,281, 수평균 분자량 101,873, 그래프트 쇄수 평균 분자량 3,000, 그래프트 쇄수 30개이었다.

화합물 (17)에 대해서는 중량평균 분자량 144,838, 수평균 분자량 122,151, 그래프트 쇄수 평균 분자량 4,864, 그래프트 쇄수 22개이었다.

실시예 15 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 조제법

실시예 14의 각 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(덱스트란-PLGA폴리머, 화합물 (14)∼(17)) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후, 1mg/ml의 hGH 수용액 50㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰한 결과, 입경은 1.0∼10㎛의 범위내이었다.

실시예 16 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 약물 내포율의 측정

각 덱스트란-PLGA 폴리머(화합물 (14)∼(17))를 이용하여 실시예 15의 방법으로 작성한 성장 호르몬 내포 마이크로 입자 20mg을 1.5ml 에펜돌프 튜브에 칭량 하고, 1ml의 완충액 A(0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 및 0.02% 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS)에 용해하여 18,000×g, 10분간의 원심에 의해 입자(침전)와 상청을 분리했다. 상청을 다른 튜브에 회수한 후, 입자를 1ml의 완충액에 재현탁시키고, 상기 조건에서의 원심에 의한 입자와 상청의 분리를 다시 행했다. 이 세정 조작을 또 한번 반복(계 3회 원심)하고, 각 원심으로 회수한 상청 중의 인간 성장 호르몬 농도를 ELISA 키트(R&D Systems에 의해서 제작)로 측정했다. 입자 제작시의 투입 hGH량(입자 중량 20mg당)으로부터 3회의 원심 상청 중의 hGH량 합계를 공제함으로써 이하의 식에 의해 내포율을 계산했다.

덱스트란-PLGA 마이크로 입자 각각에 있어서의 hGH의 내포율은 화합물 (14)의 마이크로 입자에서 87.5%, 화합물 (15)의 마이크로 입자에서 94.2%, 화합물 (16)의 마이크로 입자에서 95.7%, 화합물 (17)의 마이크로 입자에서 97.5%이고, 어떠한 마이크로 입자도 높은 효율로 단백질 약물을 내포가능한 것을 나타냈다.

비교예 2 성장 호르몬 내포 입자의 조제 및 약물 내포율의 측정

덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(화합물 (14) 또는 화합물 (17)) 10mg을 아세트산 에틸 2ml에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에, 0.5mg/ml의 성장 호르몬 용액 100㎕를 적하하여 교반했다. 교반 후, 20ml의 디옥산에 첨가했다. 용매를 증발시켜 약 2ml까지 농축한 후, 상기 입자 분산액을 500mg의 Pluronic F-68(BASF의 등록상표)을 함유한 물에 첨가했다. 시료를 동결 건조한 후, 50mg의 시료에 1ml의 물을 첨가하여 입자를 재분산시켜 회합하지 않는 친수성 활성 물질 함유 입자를 얻었다. 상기 입자의 평균 입경은 장치 ELS-Z(Otsuka Denshi에 의해서 제작)를 사용하여 동적광 산란법으로 측정하고, 약제의 내포율은 실시예 16과 동일하게 구했다.

그 결과, 화합물 (14)의 입자에 대해서는 평균 입경 190.5nm, 내포율은 73%, 화합물 (17)의 입자에 대해서는 평균 입경 197.0nm, 내포율은 70%이고, 실시예 16의 마이크로 입자와 비교하여 내포율은 열악했다.

실시예 17 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자로부터의 in vitro 약물 방출 속도의 해석

실시예 16에서 3회 세정을 행한 입자를 1.2ml의 완충액 A에 현탁 분산시켰다. 이 용액으로부터 일부(40㎕)를 다른 튜브에 옮기고, 18000×g 10분간의 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청 30㎕를 다른 튜브에 회수했다(0시간 샘플). 나머지 입자 현탁액은 1.5ml 에펜돌프 튜브 중에서 37℃ 인큐베이터내에 로터리를 이용하여 6rpm의 속도로 천천히 전도 혼화시켰다. 이 용액으로부터 경시적으로 소량(40㎕)을 분취하여 상기와 동일하게 원심에 의한 상청 분리를 행했다. 각 시점에서 회수한 상청 샘플 중의 hGH 농도를 ELISA 키트로 측정하여 방출량(%)을 이하의 식에 의해 계산했다.

실시예 15에서 제작한 마이크로 입자로부터의 약물 방출의 타임 코스를 도 11에 나타낸다. 어떠한 입자도 초기 버스트가 거의 없고, 시간 경과에 비례하여 약물이 직선적으로 방출되는 양호한 프로파일을 나타냈다. 50%의 약물이 방출되는데 필요한 시간은 화합물 (14)의 마이크로 입자에서 약 6일, 화합물 (15)의 마이크로 입자에서 약 9일, 화합물 (16)의 마이크로 입자에서 약 16일, 화합물 (17)의 마이크로 입자에서 약 1개월이며, TMS-덱스트란-PLGA 합성시의 락티드 및 글리콜리드 투입량을 변경함으로써 약물의 방출 속도가 조절가능한 것을 나타냈다.

실시예 18 입자경이 다른 플루오레세인 표식 덱스트란(FD40) 내포 마이크로자의 조제

실시예 2의 덱스트란-폴리(락트산-글리콜산)(PLGA)(화합물 (7)) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕을 첨가 후, 1mg/ml의 FD40 수용액 20㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 50㎕, 100㎕, 200㎕, 350㎕, 500㎕, 1ml, 2ml, 6ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 1O% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출했다.

평균 입자경과 S/O/W형 에멀션 작성시에 첨가한 탄산 디메틸량의 상관을 도 12에 나타낸다. 50㎕∼500㎕의 사이에서는 탄산 디메틸량의 증가에 따른 평균 입자경의 저하가 관측됐다. 500㎕∼6ml의 사이에서는 평균 입자경의 차는 거의 관측되지 않았다.

실시예 19 PEG-PLGA 폴리머의 합성(PEG2k 시리즈)

폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르(NOF Corporation에 의해서 제작, SUNBRIGHT MEH-20H, 수평균 분자량 1,862, Mw/Mn=1.03), (DL)-락티드와 글리콜리드를 하기 표 1의 투입량으로 혼합하여 140℃로 가열했다. 20분 교반 후, 옥틸산 주석(Ⅱ)(폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르에 대하여 0.05중량%)을 가하여 180℃로 3시간 교반했다. 반응액을 실온으로 되돌린 후, 클로로포름(약 100mg/ml 농도가 되도록)에 용해하여 0℃로 냉각한 디에틸에테르에서 재침전 정제하여 얻어진 고체를 여과선별, 감압 건조함으로써 PEG-PLGA 폴리머를 백색 또는 엷은 갈색의 고체로서 얻었다. 본 폴리머의 수평균 분자량은 ¹H-NMR로 구했다(표 1).

실시예 20 PEG-PLGA 폴리머의 합성(PEG5k 시리즈)

폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르(NOF Corporation에 의해서 제작, SUNBRIGHT MEH-20H, 수평균 분자량 5,128, Mw/Mn=1.02), (DL)-락티드와 글리콜리드를 하기 표 2의 투입량으로 혼합하여 140℃로 가열했다. 20분 교반 후, 옥틸산 주석(Ⅱ)(폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르에 대하여 0.05중량%)을 가하여 180℃로 3시간 교반했다. 반응액을 실온으로 되돌린 후, 클로로포름(약 100mg/ml 농도가 되도록)에 용해하여 0℃로 냉각한 디에틸에테르에서 재침전 정제하여 얻어진 고체를 여과선별, 감압 건조함으로써 PEG-PLGA 폴리머를 백색 또는 엷은 갈색의 고체로서 얻었다. 본 폴리머의 수평균 분자량은 ¹H-NMR로 구했다(표 2).

실시예 21 PEG-PLGA 폴리머의 합성(PEG10k 시리즈)

폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르(NOF Corporation에 의해서 제작, SUNBRIGHT MEH-10T, 수평균 분자량 9,975, Mw/Mn=1.02), (DL)-락티드와 글리콜리드를 하기 표 3의 비율로 혼합하여 140℃로 가열했다. 20분 교반 후, 옥틸산 주석(Ⅱ)(폴리에틸렌글리콜모노메틸에테르에 대하여 0.05중량%)을 가하여 180℃로 3시간 교반했다. 반응액을 실온으로 되돌린 후, 클로로포름(약 100mg/ml 농도가 되도록)에 용해하여 0℃로 냉각한 디에틸에테르에서 재침전 정제하여 얻어진 고체를 여과선별, 감압 건조함으로써 PEG-PLGA 폴리머를 백색 또는 엷은 갈색의 고체로서 얻었다. 본 폴리머의 수평균 분자량은 ¹H-NMR로 구했다(표 3).

실시예 22 FD40 내포 마이크로 입자의 조제법

실시예 19∼21로 제작한 PEG-PLGA 폴리머 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올을 20㎕ 첨가 후, 하기 표 4에 나타낸 소정량의 10mg/ml FD40 수용액을 가하여 교반함으로써 역상 에멀젼 용액을 제조했다. 상기 역상 에멀션 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 200㎕에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 FD40 내포 마이크로 입자 분말을 얻고, 그들 일부에 대해서는 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰하여 평균 입자경을 산출했다(표 4). 5k-10k의 PEG-PLGA 폴리머로 조제한 분말의 SEM상을 도 14에, 5k-61k의 PEG-PLGA 폴리머로 조제한 분말의 SEM상을 도 15에 나타낸다.

실시예 23 FD40 내포 마이크로 입자의 내포율의 측정

PEG-PLGA 폴리머를 이용하여 실시예 22의 방법으로 작성한 FD40 내포 마이크로 입자(5mg)를 1.5ml 에펜돌프 튜브에 칭량하고, Milli-Q(1ml)에 분산 후, 30분간의 원심분리에 의해 미내포 FD40을 포함하는 상청과 FD40 내포 입자를 분리, 회수했다. 회수한 FD40 내포 마이크로 입자는 N,N-디메틸 포름아미드(250㎕)에 용해시킴으로써 입자를 붕괴시켰다. 미내포 FD40을 포함하는 상청과 내포 FD40을 포함하는 N,N-디메틸 포름아미드 용액(50㎕)을 각각 Milli-Q(3ml)에 첨가하고, 더 교반 후, 형광분광 광도계(HORIBA, Fluoro MAX-3, 여기 파장 495nm, 형광 파장 520nm)를 이용하여 FD40의 정량을 행하여 전회 수량에 대한 내포율을 산출했다.

PEG-PLGA 폴리머로 제작한 마이크로 입자에 있어서의 FD40 내포율을 도 13에 나타낸다. PEG의 분자량이 2k, 5k, 10k 전체 시리즈에 있어서, PLGA의 분자량이 높을 때에 봉입율이 높아지는 경향이 확인됐다. 특히, PEG5k 시리즈의 경우에서는 5k-65k에 있어서 약 90%로 하는 고봉입율이었다. 고봉입율(약 80%)인 5k-47k(PLGA/PEG=9.4)과 동일한 정도의 분자량비인 10k-95k(PLGA/PEG=9.5)에서는 봉입율이 약 55%이었다.

비교예 3 FD40 내포 입자의 조제

PEG-PLGA 폴리머(5k-61k) 10mg을 아세트산 에틸 2mL에 용해하여 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에, 2mg/mL의 성장 호르몬 용액 100㎕을 적하하여 교반했다. 교반 후, 20mL의 디옥산에 첨가했다. 용매를 증발시켜 약 2mL까지 농축한 후, 상기 입자 분산액을 500mg의 Pluronic F-68(BASF의 등록상표)을 함유한 물에 첨가했다. 시료를 동결 건조한 후, 50mg의 시료에 1mL의 물을 첨가하여 입자를 재분산시켜 회합하지 않는 친수성 활성 물질 함유 입자를 얻었다. 상기 입자의 평균 입경은 장치 ELS-Z(Otsuka Denshi에 의해서 제작)를 사용하여 동적광 산란법으로 측정하고, 약제의 내포율은 실시예 23과 동일하게 구했다.

그 결과, FD40의 내포율은 48%, 평균 입경은 203.8nm이고, 실시예 23의 마이크로 입자와 비교하여 내포율은 열악했다.

실시예 24 FD40 내포 마이크로 입자로부터의 in vitro FD40 방출 속도의 해석

PEG-PLGA 폴리머 입자를 구성하는 PLGA 쇄의 길이와 서방 거동의 관계를 평가하기 위해서, 실시예 22에서 작성한 FD40 내포 마이크로 입자 중 5k-23k, 5k-32.5k, 5k-47k, 5k-61k 입자의 방출 거동을 평가했다.

마이크로 입자는 조제 후, 동결 건조 상태로 -30℃에서 보존하고, 사용 전에 상온으로 되돌려 사용했다. 입자 분말 20mg을 칭량하여 1.5ml 튜브(에펜돌프)에 넣은 후, 에세이 버퍼(assay buffer)(0.02% 아자이드화 나트륨, 0.1% Pluronic F-68(BASF의 등록상표), 0.1% 소 혈청 알부민 첨가 PBS 용액) 1ml를 첨가하고, 터치 믹서로 격렬하게 교반하여 현탁했다. 그 후, Hitachi 고속 원심기(CF16RX)를 이용하여 18,900×g로 10분간 원심하여 내포되지 않은 FD40이 포함되는 상청 화분 950㎕를 제거하고, 그 후, 에세이 버퍼 950㎕를 다시 가하여 현탁 후 원심을 행하는 입자 세정을 반복하여 합계 3회의 세정을 행했다.

3회의 세정을 행한 입자는 다시 에세이 버퍼를 950㎕ 가한 입자를 현탁시킨 후, 100㎕씩 1.5ml 튜브에 분할 주입했다. 각각의 튜브에 에세이 버퍼 900㎕를 가하여 합계 1ml로 하고, 37℃ 인큐베이터내에 로터리를 이용하여 1Orpm으로 회전하면서 인큐베이트했다. 인큐베이트한 각각의 튜브는 경시적으로 18900×g, 10분간 원심하고, 상청 950㎕를 분취하여 형광강도의 측정까지 4℃에서 보존했다.

샘플링한 용액의 형광강도의 측정은 3ml 디스포잘 큐벳(disposal cuvette)(KARTELL)과 HORIBA Fluoro MAX-3을 이용하여 여기 파장 494nm, 형광 파장 512nm로 측정하여 입자 작성시에 사용한 FD40량의 비로부터 서방 비율을 결정했다.

방출 평가에 의해 결정한 각종 마이크로 입자로부터의 FD40 방출량을 도 16에 나타낸다. 횡축은 인큐베이션 시간, 종축은 투입량에 대한 방출 비율을 나타낸다. PLGA 쇄의 짧은 5k-23k의 입자에서는 인큐베이션 초기 1일 이내에 투입량의 40% 정도가 방출되고, 그 후, 1개월에서 초기 버스트분을 제외한 거의 전량이 방출됐다. 이것에 대하여, PLGA 쇄의 길이가 길어짐에 따라서 초기의 방출량이 저하되고, 5k-61k의 마이크로 입자에서는 초기 1일간의 방출량은 10% 이하였다.

실시예 25 인간 인슐린 내포 마이크로 입자의 약물 내포율의 측정

실시예 20에서 제작한 PEG-PLGA 폴리머(5k-61k)를 이용하여 실시예 22와 동일한 방법으로 인간 인슐린 내포 마이크로 입자를 제작했다. 얻어진 마이크로 입자(20mg)를 1.5ml 에펜돌프 튜브에 칭량하고, 1ml의 완충액 A(0.1% 소 혈청 알부민, 0.1% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 및 0.02% 아자이드화 나트륨을 포함하는 PBS)에 용해하여 18,800×g, 10분간의 원심에 의해 입자(침전)와 상청을 분리했다. 상청을 다른 튜브에 회수한 후, 입자를 1ml의 완충액 A에 재현탁하여 상기 조건에서의 원심에 의한 입자와 상청의 분리를 다시 행했다. 이 세정 조작을 또 한번 반복하고(계 3회 원심), 각 원심으로 회수한 상청 중의 인슐린 농도를 샌드위치 ELISA법으로 측정했다.

샌드위치 ELISA법은 이하의 방법으로 행했다. 항 인간 인슐린 모노클로날 항체(Fitzgerald에 의해서 제작, clone No. E6E5)를 5㎍/ml의 농도로 고상화한 ELISA 플레이트(Nunc Corporation에 의해서 제작된 Maxisorp)에, ELISA 완충액(0.25% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 0.1M Tris 염산 완충액 pH8.0) 50㎕ 및 ELISA 희석액(0.25% BSA 및 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)으로 희석한 측정 샘플 또는 표준 인슐린 용액 50㎕를 가하여 실온에서 1시간 진동 반응시켰다. 플레이트를 세정액(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)으로 3회 세정하여 미반응의 시약을 제거한 후, 바이오틴 표식한 항 인간 인슐린 모노클로날 항체(Fitzgerald에 의해서 제작, clone No. D4B8) 0.5㎍/ml 및 스트렙토 알비딘(strepto avidin)-HRP 콘주게이트(Zymed에 의해서 제작)를 실온에서 1시간 및 15분간 순차 진동 반응시켰다. 각 반응 후에는 플레이트를 세정액(0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)으로 3회 세정하여 미반응의 시약을 제거했다. 최후에 HRP의 기질을 가하여 결합한 콘주게이트의 HRP효소 활성을 비색 정량하고, 표준 인슐린의 발색으로부터 작성한 검량선을 바탕으로 샘플 중의 인슐린 농도를 읽었다.

입자 제작시의 투입 인슐린량(입자 중량 20mg당)으로부터 3회의 원심 상 청 중의 인슐린량 합계를 공제함으로써 이하의 식에 의해 내포율을 계산했다.

얻어진 마이크로 입자의 평균 입경은 4.7㎛이었다. 또한, 마이크로 입자 중 인간 인슐린의 내포율은 86.7%이고, 높은 효율로 단백질 약물을 내포가능한 것을 나타냈다.

실시예 26 인간 인슐린 내포 마이크로 입자로부터의 in vitro 약물 방출 속도의 해석

실시예 25에서 3회 세정을 행한 마이크로 입자를 1.0ml의 완충액 A에 현탁 분산시켰다. 이 용액을 0.1ml씩 10개의 에펜돌프 튜브(1.5ml 용량)로 분할 주입하고 각각 완충액 A 0.9ml을 가하여 10배로 희석했다. 희석 직후에, 1개의 튜브를 18800×g 10분간으로 원심하여 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 회수했다(0시간 샘플). 나머지 9개의 튜브는 37℃ 인큐베이터내에 로터리를 이용하여 6rpm의 속도로 천천히 전도 혼화시켰다. 경시적으로 1개씩 튜브를 이용하여 상기와 동일하게 원심에 의한 상청 분리를 행했다. 각 시점에서 회수한 상청 샘플 중의 인슐린 농도를 샌드위치 ELISA로 측정하여 인슐린 방출량(%)을 이하의 식에 의해 계산했다.

인슐린 방출의 타임 코스를 도 17에 나타낸다. 시간 경과와 함께 약물이 서서히 방출되고 30일 이후에 방출 속도가 상승하여 약 60일에서 대부분의 약물이 방출됐다.

실시예 27 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 마우스 피하 투여

PEG-PLGA 폴리머(5k-61k) 25mg을 탄산 디메틸 500㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 1OO㎕를 첨가 후, 10mg/ml의 hGH 수용액 250㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 1ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 10ml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체질소로 예비동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자의 평균 입경은 6.0㎛이었다.

상기에서 작성한 마이크로 입자 300mg을 3ml의 인산 생리 완충액(PBS)에 현탁 분산시키고 80×g, 5분간 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간 원심을 행하여 잔존하고 있는 입자를 침전시켜 상청을 제거했다. 첫번째의 원심 침전과 두번째의 원심 침전을 합쳐서 1ml의 PBS에 재분산시키고, 동일한 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 입자에 내포되지 않은 성장 호르몬을 제거했다. 최후에 침전을 200㎕의 PBS에 재분산시켜 투여 용액이라고 했다. 또한, PEG-PLGA 입자에 내포된 성장 호르몬량은 세정액 중의 농도를 ELISA 키트로 측정하여 투입량으로부터 공제함으로써 계산한 결과, 마우스 1마리당 투여한 300mg의 입자에 내포되어 있었던 양으로서 PEG-PLGA 마이크로 입자는 700㎍이었다.

본 용액을 10주령의 수컷 Balb/C 마우스의 등부 피하 2개소에 주사 투여하고, 꼬리 정맥으로부터 경시적으로 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/ml의 헤파린을 첨가하여 5,000rpm으로 5분간 원심하여 혈장을 회수하고, ELISA 키트를 이용하여 혈장 중 성장 호르몬 농도를 측정했다.

비교로서, 입자화하지 않는 인간 성장 호르몬 단백질 용액(700㎍/0.2ml)을 피하 투여한 마우스에 대해서도 동일하게 채혈을 행했다.

혈장 중 인간 성장 호르몬 농도의 경시 변화를 도 18에 나타낸다. 마이크로 입자화하지 않는 약물을 투여한 마우스에서는 투여 1시간 후에 혈중 농도는 5,000ng/ml 이상의 매우 높은 값을 나타내고, 그 후 급속히 저하하여 1일 후에는 투여 전의 레벨까지 저하했다. 한편, PEG-PLGA 폴리머를 이용하여 제작한 마이크로 입자화 약물을 투여한 마우스에서는 투여 직후의 일과성의 혈중 농도의 상승은 100ng/ml 이하로 억제되어 7일 후까지 혈중 농도가 지속적으로 높은 값을 나타냈다.

실시예 28 공정 (c)에 있어서 액상에 염을 첨가한 마이크로 입자 제조

50mg/ml의 PEG-PLGA 폴리머(5k-61k)/탄산 디메틸 용액 100㎕에 tert-부탄올을 20㎕ 첨가하고, 10mg/ml의 FD40 수용액을 20㎕ 가하여 교반함으로써 역미셀(W/0 에멀젼) 용액을 조제했다. 얻어진 용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기로 하룻밤 동결 건조함으로써 FD40 함유 고형분(solid)이라고 했다. 얻어진 FD40 함유 고형분에 탄산 디메틸 200㎕를 첨가하여 보텍스로 10초간 교반함으로써 S/0 서스펜션이라고 하고, 소정 농도의 염화나트륨(0M, 10mM, 50mM, 1M)을 포함하는 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하하고, 30초간 보텍스로 교반하여 유화시킴으로써 S/O/W형 에멀젼 용액을 조제했다. 얻어진 S/0/W형 에멀젼 용액으로부터, 에바포레이터를 이용하여 수 비혼화성 유기 용매를 제거(30hPa까지 감압 후, 5분간 감압 증류 제거)함으로써 FD40 봉입 마이크로 입자의 수분산체라고 했다. FD40 봉입 마이크로 입자 분산 수용액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기로 하룻밤 동결 건조함으로써 분말상의 FD40 봉입 마이크로 입자를 조제했다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 어떠한 염화나트륨 농도 조건하에서 있어서도 마이크로 입자의 평균 입경은 6.5㎛이었다.

얻어진 분말상 FD40 봉입 마이크로 입자를 20mg 칭량하고, PBS 완충액 1ml(0.1% Pluronic F-68(BASF의 등록상표), 0.1% BSA, 0.02% 아자이드화 나트륨을 포함)에 분산 후, 원심분리(14,000rpm, 10분간)했다. 상청 회수 후, PBS 완충 액 1ml에 마이크로 입자를 재현탁, 원심분리함으로써 마이크로 입자의 세정을 2회 더 행했다. 세정한 마이크로 입자를 PBS 완충액 1ml에 다시 현탁시켜 1.5ml 에펜돌프 튜브에 100㎕씩 분할 주입하고, PBS 완충액 900㎕를 가하여 37℃로 인큐베이션하여 1일 후에 샘플 회수했다. 회수한 샘플은 14,000rpm으로 10분간 원심분리를 행하고, 형광분광 광도계(HORIBA, Fluoro MAX-3, 여기 파장 495nm, 형광 파장 520nm)를 이용하여 상청 중에 포함되는 FD40을 형광 측정하여 방출량을 산출했다. 또한, 세정시에 회수한 성청 중의 FD40량도 동일하게 형광 측정을 행하여 투입량 값으로부터 봉입률을 산출했다.

봉입률은 염화나트륨 농도 0M, 10mM, 50mM, 1M 각각의 조건에 있어서 73%, 97%, 84%, 82%이었다. 또한, 1일 후의 방출량은 염화나트륨 농도 0M, 10mM, 50mM, 1M 각각의 조건에 있어서, 14%, 7%, 15%, 11%이고, 염화나트륨 10mM 첨가시에 가장 내포율이 높고, 1일 후의 방출량(초기 버스트)이 적은 결과이었다.

실시예 29 인간 성장 호르몬(hGH) 내포 마이크로 입자의 마우스 피하 투여(약리 활성 평가)

실시예 20의 PEG-PLGA 폴리머(5k-55k) 및 PEG-PLGA 폴리머(5k-105k) 각각 25mg을 탄산 디메틸 500㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 1OO㎕를 첨가 후, 1Omg/ml의 hGH 수용액 250㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 1ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 1Oml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 hGH 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 마이크로 입자의 평균 입경은 PEG-PLGA 폴리머(5k-55k)의 마이크로 입자(5k-55k 마이크로 입자)는 4.2㎛, PEG-PLGA 폴리머(5k-105k)의 마이크로 입자(5k-105k 마이크로 입자)는 7.5㎛이었다.

상기에서 작성한 마이크로 입자 300mg을 각각 3ml의 인산 생리 완충액(PBS)에 현탁 분산시키고, 80×g, 5분간의 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간의 원심을 행하여 잔존하고 있는 입자를 침전시켜 상청을 제거했다. 첫번째의 원심 침전과 두번째의 원심 침전을 합쳐서 1ml의 PBS에 재분산하고, 동일한 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 입자에 내포되지 않은 성장 호르몬을 제거했다. 최후에 침전을 200㎕의 PBS에 재분산하여 투여 용액이라고 했다.

본 용액을 8주령의 뇌하수체 적출 처치 ICR 마우스(Japan SLC에 의해서 제작)의 등부 피하에 주사 투여하고, 꼬리 정맥으로부터 경시적으로 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/ml의 헤파린을 첨가하여 5,000rpm 5분간 원심하여 혈장을 회수하고, ELISA법을 이용하여 혈장 중 성장 호르몬 농도 및 혈장 중 IGF-1 농도를 측정했다.

또한, 마우스에 있어서 이종 단백질인 인간 성장 호르몬 투여에 의한 항체 산생을 억제하기 위해서, 입자 투여의 3일 전에 면역 억제제 타크로리무스 수화물(Astellas에 의해서 제작) 26㎍/마우스를 피하 투여하고, 그 후 약물 투여시 이후, 주 2회 간격으로 13㎍/마우스를 피하 투여했다.

혈장 중 인간 성장 호르몬 농도의 경시 변화를 도 19에 나타낸다. 마이크로 입자화하지 않는 약물을 투여한 마우스에서는 투여 1시간 후에 매우 높은 값을 나타내고, 그 후 급속히 저하하여 1일 후에는 투여 전의 레벨까지 저하했다. 한편, PEG-PLGA 폴리머를 이용하여 제작한 마이크로 입자화 약물을 투여한 마우스에서는 투여 직후의 일과성의 혈중 농도의 상승은 마이크로 입자화하지 않은 약물을 투여한 마우스의 약 100분의 1 이하로 억제할 수 있어 투여 9일 이상 혈중 농도가 지속적으로 높은 값을 나타냈다.

이 때 혈장 중의 IGF-1 농도를 도 20에 나타낸다. 혈장 중의 IGF-1 농도는 5k-55k 마이크로 입자 및 5k-105k 마이크로 입자 모두 투여 후 상승하고, 5k-55k 마이크로 입자에서는 7일째까지, 5k-105k 마이크로 입자에서는 14일 이상 높은 값으로 유지됐다.

실시예 30 엑센딘 4(GLP-1 수용체 아고니스트) 내포 마이크로 입자의 마우스 피하 투여

실시예 20의 PEG-PLGA 폴리머(5k-61k) 25mg을 탄산 디메틸 500㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 100㎕를 첨가 후, 10mg/ml의 엑센딘 4(Sigma Genosys에 의한 의탁 합성) 수용액 250㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 1ml에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 1Oml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/O/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 엑센딘 4 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEMHITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출한 결과, 마이크로 입자의 평균 입경은 6.0㎛이었다.

상기에서 작성한 마이크로 입자 30Omg을 3ml의 인산 생리 완충액(PBS)에 현탁 분산시키고, 80×g, 5분간 원심에 의해 입자를 침전시켜 상청을 다른 튜브에 옮겼다. 상청은 다시 80×g, 5분간 원심을 행하여 잔존하고 있는 입자를 침전시켜 상청을 제거했다. 첫번째의 원심 침전과 두번째의 원심 침전을 합쳐서 1ml의 PBS에 재분산하고, 동일한 원심 세정 조작을 3회 반복함으로써 입자에 내포되지 않은 엑센딘 4를 제거했다. 최후에 침전을 200㎕의 PBS에 재분산하여 투여 용액이라고 했다.

본 용액을 10주령의 수컷 Balb/C 마우스(Japan SLC에 의해서 제작)의 등부 피하 2개소에 주사 투여하여 꼬리 정맥으로부터 경시적으로 채혈을 행했다. 채취한 혈액은 종농도 3.3IU/ml의 헤파린을 첨가하여 5,000rpm으로 5분간 원심하여 혈장을 회수하고, ELISA법을 이용하여 혈장 중 엑센딘 4 농도를 측정했다.

비교로서, 입자화하지 않는 엑센딘 4 용액(700㎍/0.2ml)을 피하 투여한 마우스에 대해서도 동일하게 채혈을 행했다.

또한, 마우스에 있어서 이종 단백질인 엑센딘 4 투여에 의한 항체 산생을 억제하기 위해서, 입자 투여의 3일 전에 면역 억제제 타크로리무스 수화물(Astellas에 의해서 제작) 26㎍/마우스를 피하 투여하고, 그 후 약물 투여시 이후, 주 2회 간격으로 13㎍/마우스를 피하 투여했다.

혈장 중 엑센딘 4 농도의 경시 변화를 도 21에 나타낸다. 마이크로 입자화하지 않는 약물을 투여한 마우스에서는 투여 1시간 후에 혈중 농도는 매우 높은 값을 나타내고, 그 후 급속히 저하하여 1일 후에는 투여 전의 레벨까지 저하했다. 한편, PEG-PLGA 폴리머를 이용하여 제작한 마이크로 입자화 약물을 투여한 마우스에서는 투여 직후의 일과성의 혈중 농도의 상승은 약 100분의 1 이하로 억제할 수 있어 1개월 후까지 혈중 농도가 지속적으로 높은 값을 나타냈다.

실시예 31 입자경이 다른 플루오레세인 표식 덱스트란(FD40) 내포 마이크로 입자의 조제

실시예 20의 PEG-PLGA 폴리머(5k-55k) 5mg을 탄산 디메틸 100㎕에 용해하여 50mg/ml의 폴리머 용액을 조제했다. 상기 폴리머 용액에 tert-부탄올 20㎕를 첨가 후, 1mg/ml의 FD40 수용액 20㎕를 적하하고 보텍스로 교반하여 역상 에멀션을 제조했다. 상기 역상 에멀션을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조했다. 얻어진 고형분을 탄산 디메틸 50㎕, 200㎕, 500㎕에 분산시켜 S/O 서스펜션을 조제했다. 상기 S/O 서스펜션을 10% Pluronic F-68(BASF의 등록상표) 함유 수용액 2ml에 적하하고, 보텍스 믹서로 교반·유화시켜 S/0/W형 에멀션을 조제했다. 상기 S/0/W형 에멀션으로부터 액중 건조에 의해 수 비혼화성 유기 용매를 제거하여 마이크로 입자 분산액이라고 했다. 상기 마이크로 입자 분산액을 액체 질소로 예비 동결한 후, 동결 건조기(EYELA, FREEZE DRYER FD-1000)를 이용하여 트랩 냉각 온도 -45℃, 진공도 20Pa로 24시간 동결 건조함으로써 FD40 내포 마이크로 입자 분말을 얻었다. 얻어진 마이크로 입자를 주사형 전자현미경(SEM:HITACHI, S-4800)에 의해 관찰함으로써 평균 입자경을 산출했다.

평균 입자경과 S/O/W형 에멀션 작성시에 첨가한 탄산 디메틸량의 상관을 도 22에 나타낸다. 50㎕∼500㎕의 사이에서 탄산 디메틸량의 증가에 따른 평균 입자경의 저하가 관측됐다.

본 발명의 마이크로 입자는 생체내에 있어서 적절한 속도로 친수성 활성 물질을 방출할 수 있으므로 DDS제제로서 이용할 수 있다.

Claims

폴리(히드록시산)의 소수성 세그먼트와 다당 또는 폴리에틸렌글리콜의 친수성 세그먼트로 이루어지는 양친매성 폴리머 및 친수성 활성 물질을 함유하여 이루어지는 친수성 활성 물질 함유 입자가 회합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 1 항에 있어서,
상기 친수성 활성 물질 함유 입자는 내부에 양친매성 폴리머의 친수성 세그먼트를 갖고, 양친매성 폴리머의 소수성 세그먼트의 외층을 갖는 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는 다당 주쇄 및 폴리(히드록시산) 그래프트 쇄로 이루어지는 그래프트형 양친매성 폴리머인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 3 항에 있어서,
상기 다당 주쇄는 덱스트란인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 양친매성 폴리머는 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(히드록시산)으로 이루어지는 블럭 폴리머인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 5 항에 있어서,
상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량은 2,000∼15,000인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
상기 폴리에틸렌글리콜의 평균 분자량에 대한 폴리(히드록시산)의 평균 분자량의 비가 4 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리(히드록시산)은 폴리(락트산-글리콜산)인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
평균 입경이 1∼50㎛인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친수성 활성 물질은 펩티드 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자.
(a) 친수성 활성 물질을 포함하는 수계 용매와 양친매성 폴리머를 용해한 수 비혼화성 유기 용매를 혼합함으로써 역상 에멀션을 형성하는 공정,
(b) 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하여 친수성 활성 성분 함유 고형분을 얻는 공정, 및
(c) 친수성 활성 성분 함유 고형분 또는 친수성 활성 성분 함유 고형분 분산액을 표면개질제를 포함하는 액상에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로 입자의 제조방법.
제 11 항에 있어서,
상기 역상 에멀션으로부터 용매를 제거하는 방법은 동결 건조법인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자의 제조 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 친수성 활성 성분 함유 고형분 분산액의 분산매는 폴리(히드록시산)이 가용이고, 또한 양친매성 폴리머를 구성하는 친수성 세그먼트의 용해도가 10mg/mL 이하인 용매인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자의 제조방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
액상이 수계 용매 또는 수혼화성 유기 용매인 것을 특징으로 하는 마이크로 입자의 제조방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 기재된 마이크로 입자를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의약품 조성물.