KR20100100858A - 안전한 ｎｍｄａ 수용체 길항제의 식별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에 있어서, 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능차, 또는 효능 상승(potency boost)를 분석하는 것을 포함하는, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 식별하는 방법에 관한 것이다. 효능 상승의 평가는, 생리적 pH 및 질병 유도 pH에서 화합물의 IC₅₀("효능 상승")을, 효능 상승에 대한 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 최소 5회 반복하여 측정하는 것을 포함한다. 상기 방법은 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병의 치료 또는 예방을 위한, 안전한 NMDA 수용체 길항제의 선택에 있어서 유용할 수 있다. 이러한 질병에는 신경병성 통증(neuropathic pain), 허혈(ischemia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 간질(epilepsy) 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury) 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

Description

안전한 ＮＭＤＡ 수용체 길항제의 식별 방법{METHODS OF IDENTIFYING SAFE NMDA RECEPTOR ANTAGONISTS}

관련출원의 교차 참조

본 출원은 2007년 11월 6일에 출원된 미국 임시 출원 60/985,922, 발명의 명칭, "Methods of Identifying Safe NMDAR Antagonists", 및 2007년 11월 6일에 출원된 미국 임시 출원 60/985,924, 발명의 명칭, "Methods of Identifying Safe NMDAR Antagonists to Treat Neuropathic Pain" 을 우선권으로 주장하며, 상기 출원에 공개된 모든 내용을 본원에 참조로 인용한다.

발명의 분야

본 발명은 pH-저하 현상의 전, 중, 후에 조직의 손상을 예방하거나 최소화시키기 위한 수단으로서 사용되는 안전하고 효과적인 pH 의존성 N-메틸 D-아스파르테이트 수용체 길항제를 선택하는 개선된 방법에 관한 것이다.

신경세포, 또는 뉴런은, 주변으로부터 중추 신경계(CNS)로, CNS의 서로 다른 영역 사이, 및 CNS로부터 다른 기관(즉, 말초)으로 되돌아가는 신호를 전달한다. 이러한 신호 전달은 기본적으로 신경 전달 물질이라 하는 작은 분자들에 의해 매개된다. 일반적으로, 신경 전달 물질은 자극성 또는 억제성으로 분류될 수 있다. 자극성 신경 전달 물질은 신호 수신(즉, 시냅스 후부) 뉴런의 활성(예: 발화율)을 증가시키고, 억제성 신경 전달 물질은 감소시킨다. 뉴런은 신경 전달 물질에 의해 전달된 신호를 인식, 통합 및 통과시키는 능력이 다르다. 예를 들면, 어떠한 뉴런은 특정 비율로 지속적으로 발화하여, 주위의 변화에 대해 자극되거나 억제될 수 있다. 다른 뉴런들은 통상적으로 외부 자극이 없는 경우 휴지 상태이다. 따라서, 이들 활성의 임의의 변형은 자극의 형태에서 일어난다. 결국, 뉴런의 자극은 뇌 기능을 통제하는 기초적인 역할을 한다. 일반적인 뇌 기능을 다스리는 거대 분자들 중, 글루타메이트(글루탐산이라고도 함)는 가장 중요한 것 중 하나이다. 그 기능에 대한 연구 결과는 뇌가 어떻게 작용하는지를 이해하는 데 상당한 발전을 가져왔다. 중요한 신호 분자로서의 글루타메이트의 역할은 단지 지난 20년 사이에 밝혀져 왔다.

글루타메이트는 아미노산이다. 그 밖의 아미노산으로서 글루타메이트는 상대적으로 높은 농도로 뇌 전반에 걸쳐 존재한다. 그 결과, 연구자들은 처음에는 글루타메이트가 원래 뉴런의 신호 전달과 관계없는 여러 세포 반응의 매개체 대사 산물이라고 생각해서, 신경 전달 물질로서의 잠재적인 역할을 하는 증거로 뉴런에서의 그것들의 존재를 해석하려 하지 않았었다. 뇌에서의 글루타메이트의 자극성 기능의 징후가 첫 번째로 부각된 것은 1950년대 였으나, 처음에는, 뉴런에 적용된 글루타메이트가 실질적으로 조사된 모든 뇌 영역에서 자극성 반응을 유도하였고, 이러한 자극은 특정 반응이 아니라고 생각하여, 이러한 발견들이 배제되었다. 단지 그 후에, 과학자들은 그것들이 CNS 전반에 걸쳐 존재하는 자극성 수용체의 활성 때문일 있다고 생각했기 때문에, 관측된 글루타메이트의 효과가 정말로 타당하다는 것을 알게 되었다. 1970년대와 1980년대 들어서, 연구자들은 특정 글루타메이트 수용체, 즉, 글루타메이트에 특정적으로 결합하는 뉴런 표면의 단백질이 다른 뉴런에 의해 분비되고, 그에 의해 시냅스 후부 뉴런의 자극이 유도되는 현상이 개시된다는 것을 인식하게 되었다. 이러한 글루타메이트 수용체의 인식은 자극성 신경 전달 물질로서, 글루타메이트의 중요성을 강조하게 되었다.

글루타메이트 작용성 시냅스(glutamatergic synapse)에 대한 지식은 무엇보다도, 글루타메이트 수용체 및 수송체의 연구에 대한 분자 생물학적 기술의 적용을 통해, 지난 10년간 현저하게 발전되었다. 현재, 내재성 양이온 침투성 채널(intrinsic cation permeable channel), N-메틸-D-아스파르테이트, 알파-아미노-3-히드록시-5메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 및 카이네이트 수용체를 갖는 3 과(three families)의 이온 채널 수용체가 있음이 알려져 있다. 또한, 막 이온 채널 및, 디아실글리세롤 및 cAMP와 같은 2차 전달자에 작용하는 G 단백질 서브유닛을 통해 뉴런 및 글리아 자극성을 변형시키는 3 그룹의 대사조절형, G 단백질-공액형(protein-coupled) 글루타메이트 수용체(mGluR)가 존재한다. 또한, 뇌에는 두개의 글리아 글루타메이트 수송체 및 세개의 뉴런 수송체가 존재한다.

글루타메이트는 통상적인 뇌 기능에 필수적인 것이다. 글루타메이트는 인식, 운동 기능, 시냅스 가소성, 학습 및 기억을 통제하는데 있어서 일차적인 역할을 한다. 높은 수준의 내인성 글루타메이트는, NMDA, AMPA 또는 mGluR1 수용체의 과잉활성화로 인해 뇌 손상을 일으킬 수 있다. 과잉 글루타메이트 또는 자극 독성과 관련된 뇌 손상의 예는 중첩성 간질, 뇌허혈, 및 외상성 뇌손상 후에 나타난다. 자극 독성(예: 글루타메이트 수용체의 과잉활성화로 생기는 독성)은 또한 파킨슨씨 병, 알츠하이머 질환, 루게릭 병 및 헌팅턴 무도병과 같은 만성 신경변성을 일으킬 수 있다. 뇌허혈 및 외상성 뇌손상의 동물 모델에 있어서, NMDA 및 AMPA 수용체 길항제는 심한 뇌손상에 대해 보호하고 행동 결손을 지연시킨다. 글루타메이트 전달에 작용하는 약물에 반응할 수 있는 다른 임상 조건에는 간질, 기억상실증, 불안증, 통각과민증 및 정신병이 포함된다(Meldrum BS. J Nutr. 2000 Apr;130(4S Suppl):1007S-15S).

NMDA 수용체 길항제

글루타메이트 의존성 이온 채널(glutamate-gated ion channel)의 NMDA 서브타입은 중추 신경계에서 뉴런 간의 자극성 시냅스 전달을 매개한다(Dingledine et al. (1999), Pharmacological Reviews 51:7-61). NMDA 수용체는 NR1, NR2(A, B, C 및 D), 및 NR3(A 및 B) 서브유닛으로 구성되고, 이는 선천적인 NMDA 수용체의 기능적인 특성을 결정 짓는다. NR1 서브유닛의 단독 발현으로는 기능성 수용체를 만들 수 없고; 기능성 채널을 형성하기 위해서는 하나 이상의 NR2 서브유닛의 동시발현이 필요하다. 글루타메이트 외에도, NMDA 수용체는 수용체가 작용하게 하기 위해 결합시키는 공작용제(co-agonist), 글리신을 필요로 한다. 글리신 결합 부위는 NR1 서브유닛에서 발견되는 반면, 글루타메이트 결합 부위는 NR2 서브유닛에서 발견된다. 또한, NR3 서브유닛은 글리신을 결합한다. 또, NR2B 서브유닛은 NMDA 수용체의 기능을 조절하는 조절 분자인 스페르민 유사 폴리아민(spermine-like polyamine)에 대한 결합 부위를 갖는다. 휴지 막 전위에서, NMDA 수용체는 매우 불활성이다. 이는 구멍을 통한 이온 흐름을 막는 마그네슘 이온에 의한 채널 구멍의 전압 의존성 장벽 때문이다. 탈분극은 채널 장벽을 제거하고, 활성화된 NMDA 수용체가 시냅스 후부 막을 통해 이온 전류를 흐르게 한다. NMDA 수용체는 칼슘 이온 뿐만 아니라, 다른 이온들도 투과시킬 수 있다. NMDA 수용체는 많은 내인성 및 외인성 화합물들에 의해 조절된다. 마찬가지로, 나트륨, 칼륨 및 칼슘 이온은 NMDA 수용체 채널을 통해 통과하는 것뿐만 아니라 NMDA 수용체의 활성도 조절한다. 아연은 비경쟁적, 높은 친화력 및 전압 의존성 방식으로 NR2A-함유 수용체를 통해 NMDA 전류를 차단한다. 또한, 폴리아민이 직접 NMDA 수용체를 활성화시키기 보다는, 글루타메이트-매개 반응을 강화시키거나 억제시키는 작용을 한다는 것이 증명되었다.

뇌졸중 및 뇌손상의 동물 모델에서, 감염된 뉴런으로부터 방출된 글루타메이트는 NMDA 수용체를 과잉자극시킬 수 있고, 이는 신경세포사(neuronal death)를 일으킬 수 있음이 확인되었다. 따라서, NMDA 수용체를 차단하는 화합물들이 뇌졸중 또는 뇌손상의 치료제가 될만한 것으로 고려되어 왔다. 최근의 동물 연구에서, NMDA 수용체가 뇌졸중, 뇌 및 척수 손상, 및 뇌허혈에 연루된 관련 세팅에서 신경방호작용(neuroprotection)을 위한 타겟임이 확인되었다. NMDA 수용체 차단제는 뇌졸중 및 외상성뇌손상(traumatic brain injury) 실험 모델에서 손상된 뇌 조직의 제한적인 부피에 효과적이다(Choi, D.(1998), Mount Sinai J Med 65:133-138; Dirnagle et al.(1999) Tr. Neurosci. 22:391-397; Obrenovitch, T.P. and Urenjak, J.(1997) J Neurotrauma 14:677).

수많은 NMDA 수용체 길항제가 뇌졸중에 대한 초기 임상 실험에서 시험 되어 왔다. 뇌졸중은 미국에서 세 번째 사망 원인이고, 성인 질환의 가장 일반적인 원인이다. 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)은 뇌의 각 부분으로의 혈류가 차단되는, 뇌혈관이 폐색되는 경우에 일어난다. 현재 유일하게 승인된 뇌졸중 치료인 조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA)는 혈관 내에서 혈전의 용해를 증진시키는 혈전용해제이다. 신경방호제(neuroprotective agent)는 혈전용해 치료만큼 많은 관심을 가졌으나(http://www.emedicine.com/neuro/topic488.htm, Lutsep & Clark "Neuroprotective Agents in Stroke", April 30, 2004)아직, 인간의 치료에 대해서는 승인 받지 못했다.

가장 일반적으로 연구된 급성 뇌졸중의 신경방호제는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 수용체를 차단한다. 덱스트로르판(dextrorphan), NMDA 채널 차단제 및 진해제의 구조 유사체는 인간 뇌졸중 환자들에서 연구된 첫번째 NMDA 길항제 중 하나이다. 안타깝게도, 덱스트로르판은 환각 및 흥분뿐만 아니라 저혈증을 유발하여, 그 사용이 제한된다(Albers et al. Stroke(1995) 26:254-258). 셀포텔(selfotel), 경쟁적 NMDA 길항제는 플라세보 치료군 집단(placebo-treated cohort)보다 치료군 환자 내에서 더 높은 치사율을 나타나는 경향을 보여, 시험이 조속히 중단되었다. 다른 NMDA 수용체 길항제의 시험, 압티가넬 HCl(Cerestat)은 얻는 이득에 대한 위험 비율의 우려 때문에 중단되었다. 이러한 역효과를 피하기 위한 시도로 수용체의 글리신 부위에 작용하는 간접적 NMDA 수용체 길항제가 개발되었다. 이러한 약제는 글리신이 결합하는 것을 막아, 글루타메이트가 수용체를 활성화시키는 것을 억제한다. 초기 임상 실험에서, 이러한 글리신 부위 NMDA 길항제에서 정신이상 부작용이 덜 일어난다는 것이 나타났다. 거대한 1367 환자군에서, 약제 GV150526의 효능 시험이 2000년에 완료되었다. 약이 안전하고 좋은 내성을 지녔다는 것이 보고되었지만, 임의의 3개월의 성과 측정에서는 더 이상의 개선점이 관찰되지 않았다 (http://www.emedicine.com/neuro/topic488.htm, Lutsep & Clark "Neuroprotective Agents in Stroke", April 30, 2004).

간질은 글루타메이트 수용체 길항제에 대한 잠재적 치료 타겟으로 고려되어 왔다. 물론, 치료 농도에서, 일반적인 항경련제 발프로에이트는 AMPA 수용체를 차단시킴으로써 부분적으로 항경련제로 작용할 수 있다. NMDA 수용체 길항제는 간질의 많은 실험 모델에서 항경련제로 알려져 있다(Bradford (1995) Progress in Neurobiology 47:477-511; McNamara, J.O. (2001) Drugs effective in the therapy of the epilepsies. In Goodman & Gliman's: The pharmaco logical basis of therapeutics [Eds. J.G. Hardman and L.E. Limbird] McGraw Hill, New York).

NMDA 수용체 길항제는 만성 통증의 치료에 유용할 수 있다. 말초 또는 중추 신경의 손상 때문에 생기는 만성 통증과 같은 것은 오피오이드(opioid)조차로도 치료하기 매우 어렵다고 종종 입증되고 있다. 케타민(ketamin) 및 아만타딘(amantadine)으로 만성 통증을 치료하는 것이 유용하다고 입증되어 있고, 케타민 및 아만타딘의 진통 효과는 NMDA 수용체의 차단에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 몇몇 보고에서, 아만타딘 또는 케타민의 전신 투여가 신경병성 통증(neuropathic pain)으로 유발되는 외상의 강도를 실질적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 작은 스케일의 이중 블라인드법(double blind), 무작위 임상 시험에서, 아만타딘이 암환자 군에서 신경병성 통증을 현저히 감소시켰고(Pud et al. (1998), Pain 75:349-354), 케타민은 말초 신경 손상(Felsby et al. (1996), Pain 64:283-291), 말초 혈관 질환을 갖는 환자군(Perrson et al. (1998), Acta Anaesthesiol Scand 42:750-758), 또는 신장 제공자(kidney donor) 환자군에서 통증을 감소시킨다는 것(Stubhaug et al. (1997), Acta Anaesthesiol Scand 41 : 1124-1132)이 입증되었다. 반복되는 핀프릭킹(pinpricking)으로 생기는 "와인드업 통증(wind-up pain)" 또한 현저히 감소되었다. 이러한 발견들은 침해수용성 입력(nociceptive input)으로 유발되는 중추성 감작(central sensitization)이 NMDA 수용체 길항제의 투여로 예방될 수 있음을 나타낸다.

NMDA 수용체 길항제는 또한 파킨슨씨 병의 치료에 유용하다(Blandini and Greenamyre (1998), Fundam Clin Pharmacol 12:4-12). 항파킨슨병 약인 아만타딘은 NMDA 수용체 채널 차단제이다(Blanpied et al. (1997), J Neurophys 77:309-323). 아만타딘은 제한된 효능 때문에 홀로 사용되는 혈청이다. 그러나, 작은 스케일의 임상 시험에서 L-DOPA와 함께 추가 치료로서 아만타딘의 가치가 입증되었다. 아만타딘은 L-DOPA 자체의 항파킨슨병 효과를 감소시키지 않고 이들 환자군에서 운동장해(dyskinesia)의 중증도를 60% 감소시켰다(Verhagen Metman et al. (1998), Neurology 50:1323-1326). 마찬가지로, 다른 NMDA 수용체 길항제, CP-101,606은 원숭이 모델에서 L-DOPA에 의한 파킨슨 증후군의 경감 가능성이 나타났다(Steece-Collier et al., (2000) Exper. Neurol, 163:239-243).

또한, NMDA 수용체 길항제는 뇌암(brain cancer)의 치료에 유용하다. 빠르게 성장하는 뇌 글리오마(glioma)는 소멸되는 뉴런이, 성장하는 종양에 룸을 제공하듯이, 글루타메이트 및 과잉활성 NMDA 수용체의 분비에 의해 인접 뉴런을 사멸시킬 수 있고, 종양 성장을 촉진시키는 세포 성분을 방출할 수 있다. 많은 연구들은 NMDA 수용체 길항제가 생체내 뿐만 아니라 어떠한 생체외 모델에서 종양 성장률을 감소시킬 수 있음을 나타낸다(Takano, T., et al. (2001), Nature Medicine 7:1010-1015; Rothstein, J.D. and Bren, H. (2001) Nature Medicine 7:994-995; Rzeski, W., et al. (2001), Proc. Nat'l Acad. Sci 98:6372).

NMDA 수용체 길항제가 많은 난치병의 치료에 유용함과 동시에, 지금까지, 용량 제한 부작용은 이러한 조건들에 대한 NMDA 수용체 길항제의 임상적 사용을 막아왔다. NMDA 수용체 길항제의 첫번째 3개의 발생물(채널 차단제, 글루타메이트 또는 글리신 길항제 부위의 경쟁적 차단제, 및 비경쟁적 알로스테릭 길항제)은 독성 부작용, 이를테면, 정신병 증상 및 심혈관계 영향 때문에, 임상적으로 유용하다는 것이 입증되지 않았다. 특히, 심혈관계 부작용(저혈압 및 고혈압)은 많은 작은 스케일의 인간 연구에서 가장 두드러지고, 용량 제한적이었다. 또한, NMDA 길항제의 투여로 인해 기억 및 주의력에 미치는 바람직하지 않은 효과가 유발되었다. 또, 케타민과 같은 NMDA 수용체 길항제는 인간에게서 통합실조증(schizophrenic) 증상을 연상시키는 정신병 상태를 야기시킨다(Krystal et al. (1994), Arch Gen Psychiatry 51 :199- 214). 게다가, 운동실조(ataxia), 인지장애, 운동장애, 흥분, 착란증, 현기증 및 저체온증은 모두 NMDA 길항제의 투여로부터 야기된다. 따라서, 많은 심각한 질병의 치료에 있어서 글루타메이트 길항제의 뛰어난 잠재성에도 불구하고, 부작용의 심각성으로 인해 내성 좋은 NMDA 수용체 길항제의 개발에 대한 희망을 포기하게 되었다(Hoyte L. et al (2004) "The Rise and Fall of NMDA Antagonists for Ischemic Stroke Current Molecular Medicine" 4(2): 131- 136; Muir, K.W. and Lees, K.R. (1995) Stroke 26:503-513; Herrling, P.L., ed. (1997) "Excitatory amino acid clinical results with antagonists" Academic Press; Parsons et al. (1998) Drug News Perspective II: 523 569).

pH 감지 NMDA 수용체

1980년대 후반, NMDA 수용체의 새로운 특성이 발견되었고, 보다 최근에 새로운 류의 NMDA 길항제를 개발하고 있다. NMDA 수용체의 가장 일반적인 2개의 서브타입은 통상적으로 생리적 pH에서 양자에 의해 약 50%가 억제되는 특별한 특성을 갖는다(Traynelis, S.F. and Cull-Candy, S.G. (1990) Nature 345:347). 양자에 의한 NMDA 수용체의 억제는 NR2B 서브유닛 및 NR2A 서브유닛과 NR1 서브유닛에서 스플리싱(splicing)하는 선택적 엑손에 의해 제어된다(Traynelis et al. (1998), J Neurosci 18:6163-6175).

세포외 pH는 포유류의 뇌에서 매우 다이나믹하고, 글루타메이트 수용체 작용을 포함하는 다수의 생화학 과정 및 단백질의 작용에 영향을 준다. NMDA 수용체의 pH-감지는 적어도 2가지 이유에서 주목을 끈다. 첫째, pH 7.4의 양자 억제에 대한 IC₅₀ 값은 수용체를 생리적 pH에서 지속성 억제하에 둔다. 둘째, pH 변화가 시냅스 전달, 글루타메이트 수용체 활성, 글루타메이트 수용체 흡수 중, 허혈 및 발작 중 CNS에서 광범위하게 기록된다(Siesjo, BK (1985), Progr Brain Res 63: 121- 154; Chesler, M (1990), Prog Neurobiol 34:401-427; Chesler and Kaila (1992), Trends Neurosci 15:396-402; Amato et al. (1994), J Neurophysiol 72: 1686-1696). 이러한 후자의 병리학적 상태와 연관된 산성화는 NMDA 수용체를 억제할 수 있고, 이는 신경독성에 대한 그것들의 기여도를 최소화시키는 부피드백(negative feedback)을 제공한다(Kaku et al. (1993), Science 260:1516-1518; Munir and McGonigle (1995), J Neurosci 15:7847-7860; Vornov et al. (1996), J Neurochem 67:2379-2389; Gray et al. (1997), J Neurosurg Anesthesiol 9: 180-187; but see O'Donnell and Bickler (1994), Stroke 25: 171-177; reviewed by Tombaugh and Sapolsky (1993), J Neurochem 61:793-803) and seizure maintenance (Balestrino and Somjen (1988), J Physiol (Lond) 396:247-266; Velisek et al. (1994), Exp Brain Res 101:44-52). 이러한 피드백 억제는 또한, 허혈성 세포사에 대한 NMDA 수용체 활성의 기여를, 글루타메이트가 세포간 공간(interstitial space)으로부터 제거되기 전 pH 구배가 회복되는 시점까지 지연시킬 수 있다. 글루타메이트 흡수의 pH 감지는, NMDA 수용체 길항제로 뇌졸중과 같은 상해 후 치료(post-insult treatment)의 기회를 증가시킬 수 있는(Tombaugh and Sapolsky (1993), J Neurochem 61 :793-803) 이러한 후자의 가능성과 일치한다(Billups and Attwell (1996), Nature (Lond) 379:171-173).

일부 질병은 pH를 급격히 감소시킨다. 예를 들면, 뇌졸중에서, 일시적 허혈은 핵 주변의 영역에서 약간의 감소와 함께, 경색(infarct)의 핵 영역에서 pH를 6.4-6.5까지 감소시킨다. 핵을 둘러싸고 외부로 확장하는 반음영 영역(penumbral region)은 상당한 뉴런 손실을 입는다. 이 영역에서의 pH는 약 pH 6.9까지 떨어진다. pH 유도 감소는 과잉 글루타메이트의 존재하에서 두드러지고, 저혈당 조건에서 약화된다(Mutch & Hansen (1984) J Cereb Blood Flow Metab 4: 17-27; Smith et al. (1986) J Cereb Blood Flow Metab 6: 574-583; Nedergaard et al. (1991) Am J Physiol 260(Pt3): R581-588; Katsura et al (1992a) Euro J Neursci 4: 166-176; and Katsura & Siesjo (1998)" Acid base metabolism in ischemia" in pH and Brain function (Eds Kaila & Ransom) Wiley-Liss, New York 등을 참조).

허혈 이외에도, NMDA 길항제로 쉽게 치료할 수 있는 일반적이고 특별한 조건하에서 pH가 변화하는 다양한 상태의 추가적인 예가 존재한다. 통상적으로, 조직 세포외 pH는, 대사물의 활발하고 수동적인 움직임뿐만 아니라, 양자의 조절 때문에, 뇌척수액보다 일반적으로 산성이다. 세포외 pH에 있어서 역학적 활성 의존성의 다각적인 산과 알칼리의 변화는 거의 20년간 일어나는 것으로 알려져 있다. 이러한 변화는 조제 및 뇌 영역의 넓은 범위에 걸쳐 설명된다. 여기에는 다중의 분자 메카니즘을 수반하고, 이러한 메카니즘은 대사성 변화, 락트산 분비물, 음이온 채널을 통한 바이카보네이트 발산, Na⁺/H⁺ 및 Ca²⁺/H⁺ 교환, 및 산성화된 소포로부터 방출하는 양자를 포함한다. 이것들은 바이카보네이트에 상당히 의존하는 포유류의 뇌에 있어서 세포외 완충 시스템에 의존적이다. 따라서, 관찰되는 pH 변화의 크기는 간혹 바이카보네이트-CO₂ 간에 빠르게 상호전환하는 CNS 조직의 능력에 의존된다. 이를 행하는 효소(카보닉 언히드라제)는 결국, 달성할 수 있는 pH 변화 수준을 셋팅함에 있어서 수단이 된다.

신경병성 통증은 척수에서 pH 변화와 연관되어 있다. 예를 들면, 랫트 새끼(rat pup)에서 분리한 척수에 단일의 전기 자극을 가하면 0.05 pH 단위의 알칼리 쉬프트가 일어나고, 10Hz 자극 후 0.1 pH 쉬프트가 일어난다. 자극이 정지되면 산성화가 일어나고, 이러한 산성화는 보다 나이 든 동물에서 더욱 크다(Jendelova & Sykova (1991) Glia 4: 56-63). 또한, 개구리의 후근(dorsal root)에서의 30-40 Hz 자극은 보다 낮은 후각(dorsal horn)에서 최대 상한 0.25 pH 단위의 감소에 이르는 생체내 일시적 세포외 산성화가 일어난다. 세포외 pH 변화는 자극 강도 및 빈도로 증가된다(Chvatal et al. (1988) Physiol Bohemoslov 37: 203-212). 또한, 성체 랫트 척수 생체내에서 높은 진동수(10 - 100 Hz)의 신경 자극은 세포외 pH에서 삼상 알칼리-산-알칼리 쉬프트를 일으킨다(Sykova et al. (1992) Can J Physiol Pharmacol 70: Suppl S301-309). 또한, 랫트 힌드포우(hindpaw)에 적용된 급성 침해성 자극(핀치, 압력, 열)은 보다 낮은 생체내 후각 에서 0.01-0.05 pH 단위의 일시적 산성화를 발생시킨다는 것이 나타났다.(라미나 III-VII). 화학적 또는 열적 손상은 0.05-0.1 pH 단위의 세포간 pH를 장기적인 2시간의 감소를 발생시켰다. 높은 진동수의 신경 자극은 알칼리 pH 쉬프트를 일으킨 후, 현저한 0.2 pH 단위의 산성 쉬프트를 일으켰다(Sykova & Svoboda (1990) Brain Res 512: 181-189). 따라서, 통증 섬유의 증가된 발화는 척수의 후각의 pH를 감소(산성화)시킬 수 있다. 이러한 산성화는 급성 신경 손상 또는 급성 통증 증후군의 치료에서 유용하게 만드는 영역에서, pH 의존성 차단제의 효능을 증가시킬 수 있다.

시상하부 뉴런은 파킨슨씨 병에서 과잉 활성 되고, 이는 국부에서 pH를 보다 낮추게 한다. 이러한 pH 감소는 이 영역에서의 pH-감지 길항제의 효능을 증가시킨다. 산성화를 일으키는 활성과 함께, 뉴런 활성 및 세포외 pH가 뇌 영역에서 상관관계가 있다. 뇌 박편에의 높은 진동수의 자극은 초기에 산성화 후, 알칼리화가 일어난 뒤, 천천히 산성화가 일어난다(Chesler (1990)Prog Neurobiol 34: 401-427, Chesler & Kaila (1992)Tr Neurosci 15:396-402, and Kaila & Chesler (1998) "Activity evoked changes in extracellular pH" in pH and Brain function (eds Kaila and Ransom). Wiley-Liss, New York 등을 참조).

또한, 발작 중에도 산상화가 일어난다. NMDA 길항제가 항경련제이므로, 간질은, 공간(spatial) 밖에서는 불활성이지만, pH 감지 NMDA 길항제가 항경련제로서 효과적으로 작용할 수 있는 타겟이 되고, 발작이 일시적으로 진정된다. 광범위한 조제법에서 전자그래픽 발작은 세포외 pH를 변화시킨다. 예를 들면, pH 0.2-0.36 이하의 저하가 전기적 또는 화학적으로 일으킨 발작 중, 캣 근막 치상돌기(cat fascia dentata) 또는 랫트 해마(rat hippocampal) CA1 또는 치상돌기(dentate)에서 일어날 수 있다. 0.5에 근접하는 더 큰 저하는 저산소 조건 하에서 일어날 수 있다. 이러한 발견은 잘 받아들여지고 있으며, 많은 조제법에서도 반복되고 있다(Siesjo et al (1985) J Cereb Blood Flow Metab 5: 47-57; Balestrino & Somjen (1988) J Physiol 396: 247-266; and Xiong & Stringer (2000) J Neurophysiol 83: 3519-3524).

또한, 다른 형태의 뇌 손상이 산성화를 일으킬 수 있다. "확연성 억제(spreading depression)"은 이어서 뇌 조직에 많은 외상성 상해를 일으키는 전기적 비활성파를 천천히 움직이는 것을 설명하는데 사용하는 용어이다. 확연성 억제는 (뇌)진탕 또는 편두통 중에 일어날 수 있다. 산성 pH 변화는 확연성 억제와 함께 일어난다. 전신성 알칼로시스(systemic alkalosis)는 전체 이산화탄소의 양의 감소(저탄산증), 이를 테면, 과호흡(hyperventilation)을 통해 함께 일어날 수 있다. 전신성 에시도시스(sytemic acidosis)는 호흡곤란 또는 가스 교환이나 폐기능이 손상된 조건에서 혈액 내 이산화탄소의 양의 증가(고탄산증)과 함께 일어날 수 있다. 당뇨병성 케토에시도시스(diabetic ketoacidosis) 및 락트 에시도시스는 가장 심각한 급성 당뇨병 합병증 중 셋을 나타내며, 이는 뇌 산성화를 일으킬 수 있다. 또한, 출산 중 태아 가사(fetal asphyxia)가 1000명당 25명의 비율로 일어난다. 이는 저산소증과, 허혈과 동일하지는 않으나 이와 유사한 뇌 손상과 관련되어 있다.

1995년까지, NMDA 수용체의 양자-감지 특성이, 치료법으로 개발될 수 있는 수용체의 작은 분자 조절에 대한 타겟으로 발전시킬 수 있을지는 알려지지 않았었다. Traynelis 등(1995 Science 268:873)에서, 작은 분자 스페르민이 양자 억제를 해제시켜, NMDA 수용체의 기능을 조절할 수 있다는 것이 제일 처음 보고되었다. 폴리아민인 스페르민은 양자 센서의 pKa를 산성 값으로 이동시켜, 생리적 pH에서 작용의 가능성을 나타내는 지속성 억제도(degree of tonic inhibition)를 감소시킨다(Traynelis et al. (1995), Science 268:873-876; Kumamoto, E (1996), Magnes Res 9(4):317-327).

1998년에, 양자 센서와 관련된 페닐에탄올아민 NMDA 길항제의 활성에 대한 메카니즘이 밝혀졌다. 이펜프로딜(ifenprodil) 및 CP-101,606은 양자에 대한 수용체의 감도를 증가시켜, 양자의 억제성을 증가시킨다. NMDA 수용체의 양자 차단에 대한 pKa 값을 보다 알칼리 값으로 이동시켜, 이펜프로딜 결합은 보다 많은 부분의 수용체를 생리적 pH에서 양자화 되도록 하고, 결국 억제된다. 또한, 랫트 대뇌피질의 초기 배양에서 NMDA-유도 자극독성의 생체외 모델의 테스트를 통해, 이펜프로딜은 보다 높은 pH(7.5)에서 보다, 더 낮은 pH(6.5)에서 더욱 효능을 발휘한다는 것을 알게 되었다. 발명자들은, 뇌졸중 치료에 사용되고, 생리적 pH에서는 비활성이지만, 허혈 중 일어나는 보다 낮은 pH 값에서는 활성일 수 있는 콘텍스트-의존성(context-dependent) 차단제가 생길 수 있다고 추측하였다(Mott et al. 1998 Nature Neuroscience 1:659).

이펜프로딜은 국소적 뇌 허혈의 동물 모델에서 신경방호적이다(Gotti et al. (1988), J Pharmacol Exp Ther 247: 1211-1221; Dogan et al. (1997), J Neurosurg 87(6):921- 926). 이펜프로딜은 중대뇌동맥폐색(middle cerebral artery occlusion) 후, 포유동물에서 신경방호성을 나타내었다. Dogan 등에서는 랫트에서 경색 체적(infarct volume)이 22% 감소되었다고 보고된 반면, Gotti 등에서는 캣의 실험에서, 더 높은 용량에서 경색 체적이 42% 감소되었다고 보고되었다. 또한, Gotti 등에서는 이펜프로딜 유도체인 SL 82.0715가 캣 및 랫트의 실험에서, 더 높은 용량에서 경색 체적이 36-48% 감소된 것으로 보고되었다. 안타깝게도, 이플프로딜 및 그의 몇몇 유사체들, 이를 테면, 엘리프로딜(eliprodil) 및 할로페리돌(haloperidol)(Lynch and Gallagher (1996), J Pharmacol Exp Ther 279:154-161; Brimecombe et al. (1998), J Pharmacol Exp Ther 286(2): 627-634)은, 그것들의 임상적 유용성을 제한하는, NMDA 수용체 이외에도 특정 세로토닌 수용체 및 칼슘 채널을 차단한다(Fletcher et al. (1995), Br J Pharmacol 116(7):2791-2800; McCool and Lovinger (1995), Neuropharmacology 34:621-629; Barann et al. (1998), Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 358:145-152). 또한, 이펜프로딜 유사체인 엘리프로딜은 IKr의 억제로 심재분극(cardiac repolarisation)을 늘리고(Lengyel et al. (2004) Br J Pharmacol. Aug 9 [Epub ahead of print]), 이펜프로딜 및 특정 유사체는 또한 칼슘 채널을 억제한다(Biton et al. (1994), Eur J Pharmacol 257:297-301; Biton et al. (1995), Eur J Pharmacol 294:91-100; Bath et al (1996), Eur J Pharmacol 299: 103-112). CP 101,606 (Menniti et al. (1997), Eur J Pharmacol 331: 117-126), Ro 25-6981 (Fischer et al. (1997), J Pharmacol Exp Ther 283:1285-1292) 및 Ro 8-4304 (Kew et al. (1998), Br J Pharmacol 123:463-472)를 포함하는 몇개의 보다 선택적인 이펜프로딜 유도체가 임상적 발전을 위해 고려되고 있다.

이러한 알로스테릭 조절인자 이외에도, 다른 NMDA 길항제가 국소적 허혈의 동물 모델에서 신경방호 효과를 일으킨다는 것이 드러났다(Gill et al (1994) Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews 6: 225-256). 이러한 NMDA 길항제는 세개의 기능성 부류로 나뉜다: 글루타메이트 결합 부위의 경쟁적 차단제, 글리신 결합 부위의 경쟁적 차단제 및 채널 차단제이며, 이는 인간에게서 독성 부작용을 일으키거나, 제한된 효능을 나타낸다.

(i) 글루타메이트 부위의 경쟁적 NMDA 길항제, 이를 테면, 셀포텔, D- CPPene (SDZ EAA 494) 및 AR-Rl 5896AR (ARL 15896AR)은, 흥분, 환각, 착란 및 인사불성과 같은 독성 부작용(Davis et al. (2000), Stroke 31(2):347-354; Diener et al. (2002), J Neurol 249(5):561-568); 이를 테면, 편집증 및 망상(Grotta et al. (1995), J Intern Med 237:89-94); 정신이상 유사 증후군(Loscher et al. (1998), Neurosci Lett 240(l):33-36); 낮은 치료 비율(Dawson et al. (2001), Brain Res 892(2):344-350); 암페타민 유사 스테레오타입 비헤이비어(Potschka et al. (1999), Eur J Pharmacol 374(2): 175-187) 등을 일으킨다.

(ii) 글리신 부위 길항제, 이를 테면, HA-966, L-701,324, d-시클로세린, CGP-40116, 및 ACEA 1021는 현저한 기억 손상 및 운동기능 손상 등을 포함하는 독성 부작용을 일으킨다(Wlaz, P (1998), Brain Res Bull 46(6):535-540).

(iii) NMDA 수용체 채널 차단제, 이를 테면, MK-801 및 케타민은 독성 부작용, 이를 테면, 유사 정신병(psychosis-like)(Hoffman, DC (1992), J Neural Transm Gen Sect 89: 1-10); 인지 장애(자유재생, 인식 기억 및 주의력의 감퇴; Malhotra et al (1996), Neuropsychopharmacology 14:301-307); 시조프레니아 유사 증후군(schizophrenia-like syndrome)(Krystal et al (1994), Arch Gen Psychiatry 51 :199-214; Lahti et al. (2001), Neuropsychopharmacology 25 :455-467)을 일으킬 수 있다.

에모리 대학의 WO 02/072542 에는 난모세포(oocyte) 어세이를 사용하는 생체외 및 간질의 실험모델에서 시험된 pH 감도를 나타내는 pH-의존성 NMDA 수용체 길항제의 부류가 기술되어 있다. 그러나, Xenopus oocyte를 사용하는 생체외 데이터는 최적으로 정확하게 선택된 화합물 또는 납화합물에 대해 측정된 IC₅₀에서 다양한 변수가 적용된다. 또한, 어세이가 세포기반 스크린(cell-based screen)으로 제한되어, pH-의존성 길항제로 생긴 실질적인 효과를 관찰하기 위한, 생체내 감염된 허혈 조직에서 pH가 충분히 크게 저하되는지 분석하기 어렵다. 또한, 허혈은 특히 코어 및 말초 손상을 지닌 생체내 조직기반(tissue-based) 질환이기 때문에, pH 저하가 경색의 코어로부터 방사상으로 감소되는 것으로 주어지는, 얼마만큼 pH 의존성 NMDA 길항제의 바깥쪽 코어가 효과적인지 알 수 없다. 결국, NMDA 수용체 길항제가 정신병 및 다른 의식변환(consciousness-altering) 부작용을 유도하는 것으로 알려져, 허혈성 pH 저하에 의해 유발되는 증가된 신경방호적 활성이 pH-감지 NMDA 수용체 길항제의 경감 효과를 관찰하고 NMDA 수용체 관련 부작용을 피하기에 충분한지는 알려지지 않았다.

에모리 대학의 WO 06/023957에는: (i) NR1/NR2A NMDA 수용체 및/또는 NR1/NR2B NMDA 수용체를 발현하는 세포 내의, 질병 유도의 낮은 pH와 생리적 pH에서의 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않을 때까지 효능 상승 실험을 반복하여평가하는 단계; (ii) 일시적인 국소적 허혈의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않을 때까지 실험을 반복하여 경색 체적에서 화합물의 효과를 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 최소 30%의 경색 체적 감소를 갖는 화합물을 선택하는 단계;를 포함하는 허혈 손상의 치료에 유용한 화합물의 식별법이 개시되어 있다.

요컨대, 인간에게서 내성을 지닐 수 있는 적절한 NMDA 수용체 길항제를 선택하기 위하여, 약물은 병리학적 상태 중 글루타메이트 시스템을 효과적으로 차단하여, 독성 부작용을 피하면서도 글루타메이트 신경전달의 일반적인 기능에 충분히 영향을 주지 않아야 한다. 생체외 보다 낮은 pH에서 NMDA 수용체에 보다 큰 친화력을 보이는 pH-의존성 선택적 NMDA 길항제가 또한 생체내 충분한 반응을 나타내어, 상업적인 약물로 제공할 수 있는지 예측하기 위해 도전해 왔다. pH-의존성 NMDA 수용체 길항제가 발전되어 온 한편, 인간의 임상 사용에 대한 약물로 선택하기 위해 성공적인 변수를 정확히 확립하기 위한 이들 약물의 적절한 특성은 아직 결정되지 않았다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

본 발명은 pH-저하 현상의 전, 중, 후에 조직의 손상을 예방하거나 최소화시키기 위여 사용되는 pH 의존성 N-메틸 D-아스파르테이트 수용체 길항제를 선택하는 개선된 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

특히, 본 발명은 신경병성 통증 또는 허혈 손상을 예방하거나 치료하는데 유용한 활성 화합물을 식별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 일면은, 병원성 pH-저하 현상을 예방하거나 치료하는데 유용한 화합물, 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

보다 뛰어난 인간 임상적 수행을 위하여, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병을 치료 또는 예방하기 위한, 개선된 NMDA 수용체 길항제의 개선된 식별 방법을 설명한다. 상세하게는, 상기 방법은 화합물의 pH 효능 상승, 즉, 생체외, 병원성 pH에 대하여 생리적 pH에서 NMDA 수용체 활성을 억제하는 화합물의 효능차를 평가하기 위해 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포를 사용한다. 이 방법은 이전에 공지된 기술 전반에 걸쳐, 개선된 안전성과 효율성 프로파일을 지닌 화합물을 식별한다.

발명자들은 놀랍게도, 다른 포유류로부터 NMDA 수용체를 발현하는 세포를 사용하는 경우와 비교하였을 때, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 평가된 pH 효능 상승(potency boost)이, 효과적이고 안전한 NMDA 수용체 길항제를 선택하는 개선된 방법을 제공한다는 것을 발견하였다. 특히, 인간 외의 NMDA 수용체, 예를 들면, 랫트 NMDA 수용체로부터 얻어진 pH 효능 상승으로부터, 인간 NMDA 수용체로부터 얻어진 pH 효능 상승을 예견할 수 있는 것이 아니다. NMDA 수용체 길항제의 안전성은 생리적 pH에서 화합물의 효능의 결핍으로부터 발생한다. 따라서, 이상적인 화합물은 생리적 pH에서 매우 낮은 효능을 갖지만, 보다 낮은 pH를 갖는 병리학적 상태에서 매우 효과적인 것들이다.

본원에서 제공되는 방법은 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는, 인간의 질병을 치료하거나 예방하기 위한, 안전한 NMDA 수용체 길항제의 선택을 위해 사용될 수 있다. 이러한 질병에는 신경병성 통증, 허혈, 파킨슨씨 병, 간질 및 외상성 뇌손상이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

일 구체예에서, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는, 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 식별하는 방법을 제공하며, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능차(예를 들면, 생리적 pH에서 IC₅₀/질병 유도의 낮은 pH에서 IC₅₀)를 분석하는 방법을 포함한다. 효능 상승의 분석은, 효능 상승에 대한 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 측정을 반복하는, 생리적 pH 및 질병 유도 pH에서 IC₅₀을 측정하는 방법(이른바, "효능 상승")을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 또한 상기 방법은 최소 5개의 이러한 세포들에서 효능 상승을 지닌 화합물을 식별하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 세포들에서 화합물의 효능 상승은, 인간 외의 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 동일한 화합물의 효능 상승을 측정할 때보다, 최소 2 이상, 또는 최소 3 이상, 또는 최소 4 이상, 또는 최소 5 이상, 또는 최소 6 이상, 또는 최소 7 이상, 또는 최소 8 이상, 또는 최소 9 이상, 또는 최소 10이 높다. 특정 구체예에서, 화합물의 효능 상승은, 인간 외의 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 동일한 화합물의 효능 상승을 측정할 때보다, 최대 100 또는 최대 50이 높다. 특정 구체예에서, 인간 외의 NMDA 수용체는 랫트 NMDA 수용체이다.

비제한적인 일 구체예에서, 감염된 조직은 뇌조직, 허혈로 손상된 조직, 통증, 특히 신경병성 통증으로 감염된 조직, 및 외상성 뇌 손상으로 감염된 조직으로부터 선택된다.

일 부수적 구체예에서, 95% 신뢰 구간은 새로운 실험의 추가로 10% 이상, 8% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 또는 2% 이상 변하지 않는 것이다.

다른 부수적 구체예에서, 효능 상승 실험은 5회, 최소 6회, 최소 7회, 최소 8회, 최소 9회, 또는 최소 10회 반복한다.

본 발명의 다른 면에서, 감염된 조직 영역에서 통증 장애를 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물의 식별법은: (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 인간 NMDA 수용체를 억제하는 화합물의 효능을 평가하는 단계; (ii) 생체내 화합물을 테스트하고 통증 역치(pain threshold)에서 화합물의 효과를 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.

특정 구체예에서, 효능 상승은 생리적 pH 및 질병 유도 pH에서 화합물의 IC₅₀을, 효능 상승에 대한 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 측정을 반복하여 측정(이른바, "효능 상승(potency boost)")함으로써 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 효능 상승을 최소 12회 측정한다. 다른 특정 구체예에서, 통증 역치를 최소 12회 측정한다.

일 부수적 구체예에서, 단계(i)에서 얻어진 효능 상승의 95% 신뢰 구간은 새로운 실험의 추가로 15% 이상, 10% 이상, 8% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 또는 2% 이상 변하지 않는 것이다.

다른 부수적 구체예에서, 단계(i)의 효능 상승 실험은 최소 5회, 최소 6회, 최소 7회, 최소 8회, 최소 9회, 또는 최소 10회 반복한다.

통증 역치는 통증의 동물 모델, 특히 신경병성 통증의 동물 모델에서 측정될 수 있다. 일 구체예에서, 단계(ii)에서 얻어진 통증 역치의 95% 신뢰 구간은 새로운 실험의 추가로 15% 이상, 10% 이상, 8% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 또는 2% 이상 변하지 않는 것이다. 특정 부수적 구체예에서, 단계(ii)에서 얻은 95% 신뢰 구간은 5% 이상 변하지 않는 것이다.

상술한 임의의 일 부수적 구체예에서, 질병은 감염 조직내의 pH를 낮춘다. 특정 구체예에서, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병은 통증 장애, 특히 신경병성 통증이다.

일 구체예에서, 신경병성 통증을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물의 식별법은: (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도의 낮은 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여 평가하는 단계; (ii) 신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여, 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 것과 관련된 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 화합물은, 단계(i)에서 최소 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20의 효능 상승을 나타내고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 증가한다.

또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 pH 저하와 관련된 허혈 또는 자극 독성 캐스케이드의 진행을 경감시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 pH 저하와 관련된 경색 체적을 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 pH 저하와 관련된 세포사를 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 pH 저하와 관련된 허혈 현상과 관련된 행동 장애를 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일면에 있어서, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 허혈 손상을 입은 환자를 치료하거나 허혈 손상과 관련된 신경 독성을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 하기 질환 또는 신경학적 상태, 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들면: 파킨슨씨 병, 만성 신경 손상, 만성 통증 증후군, 이에 한하는 것은 아니나, 이를 테면, 당뇨병성 신경장애, 허혈, 일시적 또는 지속적인 혈관 폐색에 따른 허혈, 발작, "확연성 억제", 저탄산증, 고탄산증, 당뇨병성 케토에시도시스, 태아가사, 바이패스 수술 후의 인지 장애, 지주막하출혈(subarachnoid hemorrhage) 후의 혈관경련, 척수 손상, 외상성 뇌손상, 중첩성 간질, 간질, 저산소증, 주산기(perinatal) 저산소증, (뇌)진탕, 편두통, 저탄산증, 과호흡, 락트 에시도시스, 출산중 태아가사, 뇌 글리오마, 및/또는 망막증 등을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물들은, 예를 들어, 유전성 소인(genetic predisposition)과 같은 허혈 현상에 대한 소인을 갖는 환자, 또는 혈관 경련을 나타내는 환자, 또는 심장 바이패스 수술을 받은 환자들에게서, 이러한 질환 또는 신경학적 상태에 대해 예방하거나 보호하기 위하여 예방적으로 사용할 수 있다.

상세한 설명

본 발명은 보다 우수한 인간 임상 수행을 위하여, 감염된 조직 영역에서 pH가 저하되는 질병의 치료 또는 예방을 위한 안전하고 효과적인 NMDA 수용체 길항제를 선택하는 개선된 방법을 제공한다. 이는 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포를 사용하여 수행함으로써, 생체외 화합물의 pH 효능 상승을 평가한다. 발명자들은 놀랍게도, 본원에서 설명하는 방법에 대하여, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 평가된 pH 효능 상승이 안전한 NMDA 수용체 길항제를 선택하는 개선된 방법이고, 다른 포유류 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서와는 동일한 결과를 나타내지 않는 다는 것을 발견하였다. 본원에서 제공되는 방법은 감염된 조직 영역에서 pH가 저하되는 인간의 질병의 치료 또는 예방을 위한 안전한 NMDA 수용체 길항제의 선택을 위해 사용될 수 있으며, 특정 구체예에 있어서 신경병성 통증, 허혈, 파킨슨씨 병, 간질 및 외상성 뇌손상과 같은 질병에 유용하다.

일 구체예에 있어서, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에 있어서, 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능차(예를 들면, 생리적 pH에서 IC₅₀/질병 유도의 낮은 pH에서 IC₅₀)를 평가하는 것을 포함하는, 감염된 조직 영역에서 pH가 저하되는 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 식별하는 방법을 제공한다. 효능 상승의 평가는, 효능 상승에 대한 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 측정을 반복하여, 생리적 pH와 질병 유도 pH에서 화합물의 IC₅₀("효능 상승")을 측정하는 것을 포함할 수 있다.

일 부수적 구체예에 있어서, 95% 신뢰 구간은 새로운 실험의 추가로, 10% 이상, 8% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 또는 2% 이상 변하지 않는다.

다른 부수적 구체예에 있어서, 효능 상승 실험은 5회, 최소 6회, 최소 7회, 최소 8회, 최소 9회, 또는 최소 10회 반복한다.

본 발명의 다른 면에 있어서, 감염된 조직 영역에서 통증 장애를 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물의 식별법은: (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 인간 NMDA 수용체를 억제하는 화합물의 효능을 평가하는 단계; (ii) 생체내 화합물을 테스트하고 통증 역치에서 화합물의 효과를 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 면에 있어서, 감염된 조직 영역에서 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물의 식별법은: (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도의 낮은 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여 평가하는 단계; (ii) 신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 실험을 반복하여, 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 것과 관련된 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.

일 부수적 구체예에 있어서, 단계(i)에서 얻은 95% 신뢰 구간은 새로운 실험의 추가로, 15% 이상, 10% 이상, 8% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 또는 2% 이상 변하지 않는다.

다른 부수적 구체예에 있어서, 단계(i)의 효능 상승 실험은 5회, 최소 6회, 최소 7회, 최소 8회, 최소 9회, 또는 최소 10회 반복한다.

일 부수적 구체예에 있어서, 단계(ii)에서 얻은 95% 신뢰 구간은 새로운 실험의 추가로, 15% 이상, 10% 이상, 8% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 또는 2% 이상 변하지 않는다. 특정 부수적 구체예에 있어서, 단계(ii)에서 얻은 95% 신뢰 구간은 5% 이상 변하지 않는다.

다른 부수적 구체예에 있어서, 단계(ii)의 효능 상승 실험은 5회, 최소 6회, 최소 7회, 최소 8회, 최소 9회, 최소 10회, 최소 11회, 최소 12회, 최소 13회, 최소 14회, 최소 15회, 최소 16회, 최소 17회, 최소 18회, 최소 19회, 또는 최소 20회 반복한다. 특정 부수적 구체예에 있어서, 단계(ii)의 효능 상승 실험은 최소 20회 반복한다.

상술한 임의의 구체예의 일 부수적 구체예에 있어서, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병은 신경병성 통증이다.

일 구체예에 있어서, 신경병성 통증을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물의 식별법은: (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도의 낮은 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여 평가하는 단계; (ii) 신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여, 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 것과 관련된 화합물을 선택하는 단계를 포함한다.

상술한 임의의 구체예의 일 부수적 구체예에 있어서, 세포는 NR1 서브유닛 및 인간 NMDA 수용체의 최소 하나의 NR 서브유닛을 발현할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2B 서브유닛일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2A 서브유닛일 수 있다.

일 부수적 구체예에 있어서, 생리적 pH는 약 7.6이다. 본 발명의 다른 면에 있어서, 본원에 설명된 방법에 의해 식별된 화합물은, 병리학적 상태 때문에 보통보다 낮은(lower-than-normal) pH를 갖는 뇌 조직에서 증가된 활성을 갖는다. 뇌졸중 중 허혈 조직 또는 다른 질병으로 발생된 산성 환경은 본원에서 설명된 신경방호제를 활성화시키는 스위치로 활용된다. 그리하여, 이러한 부위에서 약물이 덜 활성이 되므로, 비감염된 조직에서 부작용이 최소화된다. 국부적 pH를 변화시킬 수 있는 상태는, 뇌졸중으로 인한 저산소증, 외상성 뇌 손상, 심장 수술 중 일어날 수 있는 광범위한 허혈, 호흡정지로 일어날 수 있는 저산소증, 자간전증(pre-eclampsia), 척수 손상, 간질, 중첩성 간질, 신경병성 통증, 염증성 통증, 만성 통증, 혈관성 치매 또는 글리오마 종양을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 화합물의 IC₅₀ 값은 0.01 내지 10 μM, 0.01 내지 9 μM, 0.01 내지 8 μM, 0.01 내지 7 μM, 0.01 내지 6 μM, 0.01 내지 5 μM, 0.01 내지 4 μM, 0.01 내지 3 μM, 0.01 내지 2 μM, 0.01 내지 1 μM, 0.05 내지 7 μM, 0.05 내지 6 μM, 0.05 내지 5 μM, 0.05 내지 4 μM, 0.05 내지 3 μM, 0.05 내지 2 μM, 0.05 내지 1 μM, 0.05 내지 0.5 μM, 0.1 내지 7 μM, 0.1 내지 6 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.1 내지 4 μM, 0.1 내지 3 μM, 0.1 내지 2 μM, 0.1 내지 1 μM, 0.1 내지 0.5 μM, 0.1 내지 0.4 μM, 0.1 내지 0.3 μM, 또는 0.1 내지 0.2 μM 이다.

특정 구체예에 있어서, 상기 화합물은, 감염된 pH에서 IC₅₀에 대한 생리적 pH에서 IC₅₀을 비교(즉, (phys pH에서 IC₅₀/Dis pH에서 IC₅₀))하는 경우, 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 최소 6, 최소 7, 최소 8, 최소 9, 최소 10, 최소 15 또는 최소 20의 효능 상승을 나타낸다.

일 구체예에 있어서, 상기 화합물은 약 6 내지 9의 pH에서 10 μM 미만의 IC₅₀값을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 상기 화합물은 약 6.9의 pH에서 10 μM 미만의 IC₅₀값을 갖는다. 다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은 약 7.6의 pH에서 10 μM 미만의 IC₅₀값을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 상기 화합물은 생리적 pH에서 10 μM 미만의 IC₅₀값을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 상기 화합물은 감염된 pH에서 10 μM 미만의 IC₅₀값을 갖는다.

일 구체예에 있어서, pH 6.9에서 화합물의 IC₅₀값은 0.01 내지 10 μM, 0.01 내지 9 μM, 0.01 내지 8 μM, 0.01 내지 7 μM, 0.01 내지 6 μM, 0.01 내지 5 μM, 0.01 내지 4 μM, 0.01 내지 3 μM, 0.01 내지 2 μM, 0.01 내지 1 μM, 0.05 내지 7 μM, 0.05 내지 6 μM, 0.05 내지 5 μM, 0.05 내지 4 μM, 0.05 내지 3 μM, 0.05 내지 2 μM, 0.05 내지 1 μM, 0.05 내지 0.5 μM, 0.1 내지 7 μM, 0.1 내지 6 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.1 내지 4 μM, 0.1 내지 3 μM, 0.1 내지 2 μM, 0.1 내지 1 μM, 0.1 내지 0.5 μM, 0.1 내지 0.4 μM, 0.1 내지 0.3 μM, 또는 0.1 내지 0.2 μM 이고, 상기 화합물에 대한 pH 7.6 내지 pH 6.9 에서 IC₅₀값의 비는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100보다 크다.

일 구체예에 있어서, pH 6.9에서 상기 화합물의 IC₅₀값은 0.01 내지 10 μM, 0.01 내지 9 μM, 0.01 내지 8 μM, 0.01 내지 7 μM, 0.01 내지 6 μM, 0.01 내지 5 μM, 0.01 내지 4 μM, 0.01 내지 3 μM, 0.01 내지 2 μM, 0.01 내지 1 μM, 0.05 내지 7 μM, 0.05 내지 6 μM, 0.05 내지 5 μM, 0.05 내지 4 μM, 0.05 내지 3 μM, 0.05 내지 2 μM, 0.05 내지 1 μM, 0.05 내지 0.5 μM, 0.1 내지 7 μM, 0.1 내지 6 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.1 내지 4 μM, 0.1 내지 3 μM, 0.1 내지 2 μM, 0.1 내지 1 μM, 0.1 내지 0.5 μM, 0.1 내지 0.4 μM, 0.1 내지 0.3 μM, 또는 0.1 내지 0.2 μM 이고, 상기 화합물에 대한 pH 7.6 내지 pH 6.9 에서 IC₅₀값의 비는 1 내지 100, 2 내지 100, 3 내지 100, 4 내지 100, 5 내지 100, 6 내지 100, 7 내지 100, 8 내지 100, 9 내지 100, 10 내지 100, 15 내지 100, 20 내지 100, 25 내지 100, 30 내지 100, 40 내지 100, 50 내지 100, 60 내지 100, 70 내지 100, 80 내지 100, 또는 90 내지 100이다.

다른 구체예에 있어서, pH 약 7.6에서 상기 화합물의 IC₅₀값은 0.01 내지 10 μM, 0.01 내지 9 μM, 0.01 내지 8 μM, 0.01 내지 7 μM, 0.01 내지 6 μM, 0.01 내지 5 μM, 0.01 내지 4 μM, 0.01 내지 3 μM, 0.01 내지 2 μM, 0.01 내지 1 μM, 0.05 내지 7 μM, 0.05 내지 6 μM, 0.05 내지 5 μM, 0.05 내지 4 μM, 0.05 내지 3 μM, 0.05 내지 2 μM, 0.05 내지 1 μM, 0.05 내지 0.5 μM, 0.1 내지 7 μM, 0.1 내지 6 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.1 내지 4 μM, 0.1 내지 3 μM, 0.1 내지 2 μM, 0.1 내지 1 μM, 0.1 내지 0.5 μM, 0.1 내지 0.4 μM, 0.1 내지 0.3 μM, 또는 0.1 내지 0.2 μM 이다. 특정의 이러한 구체예에 있어서, 상기 화합물은, pH 7.6 내지 pH 6.9 에서, 1 내지 100, 2 내지 100, 3 내지 100, 4 내지 100, 5 내지 100, 6 내지 100, 7 내지 100, 8 내지 100, 9 내지 100, 10 내지 100, 15 내지 100, 20 내지 100, 25 내지 100, 30 내지 100, 40 내지 100, 50 내지 100, 60 내지 100, 70 내지 100, 80 내지 100, 또는 90 내지 100의 IC₅₀값의 비를 나타낸다. 다른 특정 구체예에 있어서, 상기 화합물은 10 미만, 또는 5 미만, 또는 4, 3, 2 또는 1의 비율을 나타낸다.

다른 구체예에 있어서, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 테스트하여, 화합물의 효능 상승을 "질병 유도 낮은 pH"에 대한 생리적 pH에서 효능을 비교함으로써 분석(예를 들어, phys pH에서 IC₅₀/"질병 유도 낮은 pH"에서 IC₅₀)하는 실험에 의해 결정된 최소 5의 효능 상승을 나타내는 화합물을 선택하는 방법을 제공하며, 상기 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복한다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 화합물을 선택하는 방법을 제공하고, 또는 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 15회 실험을 반복하여 결정된, 신경병성 통증의 동물 모델에서 측정된 통증 역치가 최소 2배 증가하는 화합물을 선택한다. 다른 특정 구체예에 있어서, "질병 유도 낮은 pH"는 뇌졸중과 같은 허혈성 질병과 관련될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본원에서 설명하는 방법 및 과정에 따라 선택되는 화합물은 선택적 NR1/NR2A 인간 NMDA 수용체 및/또는 NR1/NR2B 인간 NMDA 수용체 길항제이다. 일 구체예에 있어서, 상기 화합물은 NMDA 수용체 채널 차단제가 아니다.

추가적인 구체예에 있어서, 상기 화합물은 실질적인 독성 부작용, 이를 테면, 운동 손상, 인지 장애 및 심장 독성을 나타내지 않는다. 추가적으로 또는 택일적으로, 상기 화합물은 최소 2:1 보다 크거나 같은 치료율(therapeutic index)를 갖는다. 추가적 또는 택일적인 구체예에 있어서, 상기 화합물은 다른 어떠한 글루타메이트 수용체보다 NMDA 수용체에 최소 10배 선택적으로 결합한다. 일 구체예에 있어서, 효능 상승을 측정하기 위해 난모 세포가 사용된다. 다른 구체예에 있어서, 중 대뇌 동맥 폐색 모델이 일시적인 국소적 허혈의 동물 모델, 예를 들면, 마우스와 같은 설치류 동물 모델로서 사용된다.

다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은, 단계(i)에서 최소 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20의 효능 상승을, 그리고, 단계(ii)의 통증 역치에서 최소 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배의 증가를 나타낸다.

또한, 본원에 설명된 방법 또는 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한, pH 저하와 관련된 허혈 또는 자극독성 캐스케이드(excitotoxic cascade)의 진행을 경감시키는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본원에서 설명된 방법 또는 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한, pH 저하와 관련된 경색 체적을 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에서 설명된 방법 또는 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한, pH 저하와 관련된 세포사를 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본원에서 설명된 방법 또는 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한, pH 저하와 관련하여 허혈 현상과 관련된 행동 결손을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가적인 면에 있어서, 본원에서 설명된 방법 또는 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의해, 환자들에게서 허혈 손상을 치료하거나, 허혈 손상과 관련된 뉴런 독성을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물의 투여에 의한 하기 질환 또는 신경학적 상태, 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들면: 파킨슨씨 병, 만성 신경 손상, 만성 통증 증후군, 이에 한하는 것은 아니나, 이를 테면, 당뇨병성 신경장애, 허혈, 일시적 또는 지속적인 혈관 폐색에 따른 허혈, 발작, "확연성 억제", 저탄산증, 고탄산증, 당뇨병성 케토에시도시스, 태아가사, 바이패스 수술 후의 인지 장애, 지주막하출혈 후의 혈관경련, 척수 손상, 외상성 뇌손상, 중첩성 간질, 간질, 저산소증, 주산기 저산소증, (뇌)진탕, 편두통, 저탄산증, 과호흡, 락트 에시도시스, 출산중 태아가사, 뇌 글리오마, 및/또는 망막증 등을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본원에 기술된 방법이나 과정에 따라 선택되는 화합물들은, 예를 들어, 유전성 소인과 같은 허혈 현상에 대한 소인을 갖는 환자, 또는 혈관 경련을 나타내는 환자, 또는 심장 바이패스 수술을 받은 환자들에게서, 이러한 질환 또는 신경학적 상태에 대해 예방하거나 보호하기 위하여 예방적으로 사용할 수 있다.

효능 상승의 분석

용어 "난모세포"는 난형성(oogenesis)의 최종 산물이며, 또한 난원세포, 각각 1차 난모세포, 2차 난모세포인 성체 동물의 난자를 나타낸다.

"트랜스펙션"은 숙주 세포로 DNA를 도입하는 것을 말한다. 세포는 자연적으로 DNA를 흡수하지 않는다. 따라서, 다양한 기술적 "트릭"을 사용하여 유전자 이동을 용이하게 한다. 트랜스펙션의 많은 방법들, 예를 들면, CaPO₄법, 지질기반법(lipid-based method) 및 전기천공법(electoroporation) 등은 당업자에게 알려져 있다(J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, 1989).

세포에서 NMDA 수용체의 발현

본 발명의 주된 면에 있어서, 화합물의 효능 상승은 최소 하나의 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 결정된다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 NMDA 수용체를 내생적으로 발현할 수 있다. NMDA 수용체를 내생적으로 발현할 수 있는 세포에는: 간세포, P19 세포, 신경상피세포, 신경내피세포, 도파민작동성 흑질 뉴런, 성상교세포, 거대세포성 신경내분비세포, 시색상뉴런, 소뇌뉴런, 뇌간세포, 간뇌뉴런, 중뇌뉴런, 후뇌뉴런, 척수운동뉴런, 척수개재뉴런, 후각뉴런, 피질뉴런, 소뇌과립세포, 해마뉴런, 격막뉴런, 미상세포, 피각세포, 선조체세포, 후구세포, 시상세포, CA1 피라미드세포, 대뇌기저핵세포, 랫트 시각피질의 래이어 IV 뉴런, 체성감각피질뉴런, 난모세포, 태반세포 및 췌장세포 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 인간 NMDA 수용체를 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 일 특정 구체예에 있어서, 난모세포는 인간 NMDA 수용체를 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 임의의 적절한 난모세포는 당업자에게 공지된 것을 사용할 수 있고, 이에 한하지 않으나, 개구리 난모세포, 이를 테면, Xenopus oocyte가 포함되며, 여기에는, Xenopus laevis, Xenopus tropicalis, Xenopus muelleri, Xenopus wittei, Xenopus gilli, 및 Xenopus borealis 가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 일 구체예에 있어서, 상기 난모세포는 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 동물의 난소로부터 분리할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 일차 세포주를 포함하는 임의의 적절한 세포 타입은 인간 NMDA 수용체를 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수 있고, 여기에는: 차이니스 햄스터(CHO) 난모세포, HEK 신세포, 박테리아세포, E.콜리세포, 효모세포, 뉴런세포, 심장세포, 폐세포, 위세포, 비장세포, 췌장세포, 신세포, 간세포, 장세포, 피부세포, 헤어세포, 시상하부세포, 하수체세포, 상피세포, 선유아세포, 신경계세포, 케라티노사이트, 조혈세포, 멜라노사이트, 콘드로사이트, 림포사이트(B 및 T), 매크로파지, 모노사이트, 단핵세포, 심근세포, 기타 근세포, 난구세포, 표피세포, 내피세포, 랑게르한스의 아일렛세포, 혈액세포, 혈액전구체세포, 골세포, 골전구체세포, 신경계간세포, 시원간세포, 헤파토사이트, 케라티노사이트, 제정맥 내피세포, 대동맥 내피세포, 모세혈관 내피세포, 섬유아세포, 간성상세포, 대동맥 평활근세포, 심근세포, 뉴런, 쿱퍼세포, 평활근세포, 슈반 세포, 및 상피세포, 에리트로사이트, 혈소판, 호중구, 림포사이트, 호산구, 호염기구, 아디포사이트, 콘드로사이트, 판크레아틱 아일렛세포, 감상선세포, 부갑상선세포, 이하선세포, 종양세포, 체세포, 하수체세포, 부신세포, 기포세포, 신세포, 레티날세포, 간체세포, 콘세포, 심장세포, 페이스메이커세포, 비장세포, 항원제시세포, 기억세포, T 세포, B 세포, 플라즈마세포, 근세포, 난소세포, 자궁세포, 전립선세포, 질 상피세포, 정자세포, 정소세포, 생식세포, 난세포, 레이딕세포, 페리튜블러세포, 세르톨리세포, 루테인세포, 경부세포, 자궁내막세포, 유선세포, 여포세포, 점액세포, 섬모세포, 비케라틴성 상피세포, 케라틴성 상피세포, 폐세포, 배세포, 원주상피세포, 편평상피세포, 배간세포, 오스테오사이트, 오스테오블라스트, 및 오스테오클라스트 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

다른 구체예에 있어서, 상기 세포는 선택된 인간 NMDA 수용체 서브유닛을 발현하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. NMDA 수용체는 NR1, NR2(A, B, C, 및 D), 및 NR3(A 및 B) 서브유닛으로 구성되고, 이는 고유의 NMDA 수용체의 기능적 특성을 결정한다. NMDA 수용체는 NR1, NR2 및/또는 NR3로 구성된 이종 단백질(heteromeric protein)이다. 인간으로부터의 임의의 NMDA 수용체 서브유닛의 DNA 인코딩을 사용하여 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있다. 표 1은 인간 NMDA 수용체 서브유닛에 대한 GenEMBL 어세션 넘버를 제공한다.

예를 들어, mRNA는 cDNA 주형으로 부터 합성되어, 세포로 주입될 수 있다. 택일적으로, 수용체 서브유닛을 인코딩하는 cDNA는 세포에 삽입되기에 앞서, 컨스트럭트(construct) 또는 백터(vector)로 삽입될 수 있다. DNA 컨스트럭트 또는 벡터를 숙주세포로 도입하기 위해 사용될 수 있는 기술은, 칼슘 포스페이트/DNA 공침법(co-precipitation), 핵으로의 DNA의 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션, 무상세포(intact cell)로 박테리아 원형질 융합, 트랜스펙션, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법들을 포함한다. DNA는 선형 또는 원형의, 이완형 또는 초나선형(supercoiled) DNA일 수 있다. 포유류 세포에 도입하기 위한 다양한 기술들은, 예를 들어, Keown et al., Methods in Enzymology Vol. 185, pp. 527-537 (1990)을 참조한다.

컨스트럭트 또는 벡터는 업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 컨스트럭트는, 원핵세포 복제 시스템(예를 들면, E.coli 에 의해 각 단계에서 기점 인식이 가능함)을 포함하는 박테리아 백터를 사용하여 제조할 수 있으며, 복제되고 분석될 수 있다. 또한, 선택가능한 마커를 사용할 수 있다. 컨스트럭트를 함유하는 벡터가 완성되면, 박테리아 시퀀스, 선형화, 상동 시퀀스 내 쇼트 결실의 도입의 제거와 같은 것에 의해 더욱 촉진될 수 있다. 마지막 조작 후, 컨스트럭트가 세포로 도입될 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 하나 이상의 시퀀스를 포함하는 재조합 컨스트럭트를 포함한다. 컨스트럭트는 정배향 또는 역배향으로, 본 발명의 시퀀스로 삽입될 수 있는 플라스미드 또는 바이러스성 벡터(viral vector)와 같은 벡터의 형태일 수 있다. 또한, 컨스트럭트는, 예를 들어, 시퀀스에 조작가능하도록 링크된 프로모터를 포함하는 조절 시퀀스를 포함할 수 있다. 적절한 벡터 및 프로모터의 대다수는 당업자에게 알려져 있고, 상업적으로 이용가능하다. 하기 벡터들이 예로 제공될 수 있다: pBs, pQE-9 (Qiagen), 파지스크립스, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pBSSK, pGEM, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pCiNeo, pWLneo, pSv2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPv, pMSG, pSVL (Pharmiacia). 또한, 다른 플라스미드 및 벡터는 그것들이 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능한 한 사용될 수 있다. 업계에 공지된 벡터 및 상업적으로 이용가능한 것들(및 이형 또는 그의 유도체)는, 본 발명의 방법에 사용하기 위해, 하나 이상의 재조합 부위를 갖도로 설계된 발명에 따라서 사용될 수 있다. 이러한 벡터는, 예를 들면, Vector Laboratories Inc., Invitrogen, Promega, Novagen, NEB, Clontech, Boehringer Mannheim, Pharmacia, EpiCenter, OriGenes Technologies Inc., Stratagene, PerkinElmer, Pharmingen, 및 Research Genetics으로부터 얻을 수 있다. 다른 흥미 있는 벡터로는, 진핵생물 발현 벡터, 이를 테면, pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV, 및 pTet-Splice (Invitrogen), pEUK-Cl, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBHOl, pBI121, pDR2, pCMVEBNA, 및 pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCHl lO, 및 pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, 및 pOG44 (Stratagene, Inc.), 및 pYES2, pAC360, pBlueBacHis A, B, 및 C, pVL1392, pBlueBacIII, pCDM8, pcDNAl, pZeoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4, 및 pEBVHis (Invitrogen, Corp.) 및 이형 또는 그의 유도체를 포함한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 추가적인 벡터에는 pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, 코스미드, 파지미드, YACs (효모 인공 염색체), BACs (박테리아 인공 염색체), Pl (에셰리치아 콜리 파지), pQE70, pQE60, pQE9 (쿠아겐), pBS 벡터, PhageScript 벡터, BlueScript 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORTl, pSPORT2, pCMVSPORT2.0 및 pSV-SPORTl (Invitrogen) 및 이형 또는 그의 유도체가 포함된다. 바이러스성 벡터는 또한, 렌티비랄(lentiviral) 벡터와 같은 것(예를 들어, WO 03/059923; Tiscornia et al. PNAS 100:1844-1848 (2003) 참조)을 사용할 수도 있다. 추가적으로 흥미 있는 벡터에는 pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBacHis2, pcDNA3. I/His, pcDNA3.1(-)/Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pPICZ, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pGAPZA, pGAPZB, pGAPZC, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, PSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SPl), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZErO1.1, pZEiO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP 10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni, 및 pCRBac (Invitrogen); λ ExCell, λ gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1 λ T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCHHO, pKK232-8, pSL1180, pNEO, 및 pUC4K (Pharmacia); pSCREEN-1b(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32LIC, pET-30LIC, pBAC-2cp LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, λ SCREEN-1, λ BlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET- 32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-l, pBACgus4x-l, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg, 및 Selecta Vecta-Gpt (Novagen); pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGADIO, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2-Promoter, pSEAP2-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Control, pβgal-Promoter, pβgal-Enhancer, pCMV, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRESlneo, pIRESlhyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, λgt1O, λgt11, pWE15, 및 λTripffix (Clontech); Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-11abcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pMClneo Poly A, pOG44, pOG45, pFRTβGAL, pNEOβGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, 및 pRS416 (Stratagene)가 포함된다.

추가적인 벡터에는, 예를 들면, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGADl-3, pGADIO, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-l, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp 및 이형 또는 그의 유도체가 포함된다.

또한, 선택가능한 마커는, 인간 NMDA 수용체 서브유닛을 함유하는 세포를 선택할 수 있도록 벡터 내로 삽입될 수 있다. 적절한 선택가능한 마커는: 특정 배지 기질에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 유전자, 이를 테면, HAT 배지(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘)에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 tk 유전자(티미딘 키나아제) 또는 hprt 유전자(하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제); MAX 배지(마이코페놀산, 아데닌, 및 크산틴)에서 성장할 수 있는 박테리아 gpt 유전자(구아닌/크산틴 포스포리보실트렌스퍼라아제)를 포함하나, 이에 한하지 않는다. 예를 들어, Song, K-Y., et al. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 84:6820-6824 (1987); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Chapter 16을 참조한다. 선택가능한 마커는: 항생 물질과 같은 화합물에 대한 내성을 제공하는 유전자, 선택된 기질에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 유전자, 검출가능 신호, 이를 테면, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질(eGFT)과 같은 발광 또는 형광을 나타내는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 광범위한 이러한 마커들은 공지되어 있고, 사용가능하며, 여기에는, 예를 들어, 항생물질 내성 유전자, 이를 테면, 네오마이신 내성 유전자(neo)(Southern, P., and P. Berg, J. MoI. Appl. Genet. 1 :327-341 (1982)); 및 하이그로마이신 내성 유전자(hyg)(Nucleic Acids Research U -.6895-69 U (1983), 및 Te Riele, H., et al, Nature 348:649-651 (1990))가 포함된다. 다른 선택가능한 마커 유전자에는: 아세토히드록시산 신타아제(AHAS), 알칼리 포스페이타아제(AP), 베타 칼락토시다아제(LacZ), 베타 글루코로니다아제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 녹색 형광 단백질(GFP), 레드 형광 단백질(RFP), 옐로우 형광 단백질(YFP), 시안 형광 단백질(CFP), 호세라디시 퍼옥시다아제(HRP), 루시퍼라아제(Luc), 노팔린 신타아제, 옥토파인 신타아제(OCS), 및 이들의 유도체가 포함된다. 다중 선택가능한 마커는, 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트랙세이트, 포르피노트리신, 퓨로마이신, 및 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것이 통용된다.

항생물질 내성 유전자와 음성 선택 인자의 결합법은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들어, WO 99/15650; U.S. Patent No. 6,080,576; U.S. Patent No. 6.136,566; Niwa, et al., J. Biochem. 113:343-349 (1993); 및 Yoshida, et al., Transgenic Research, 4:277-287 (1995) 참조).

인간 NMDA 수용체를 발현하기 위해 성공적으로 변환된 세포는 기능 분석 또는 분자 분석을 통해 확인할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 세포, 이를 테면, 인간 NMDA 수용체 서브유닛 cRNA가 삽입된 난모세포는, 기능성 인간 NMDA 수용체의 존재에 대하여 전기생리적 기록을 통해 테스트할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 인간 NMDA 수용체 서브유닛 유전자 및 선택가능한 마커 유전자를 인코딩하는 DNA가 삽입된 세포는, 적절하게 선택된 배지에서 성장하여, 적절하게 통합시키는 세포를 식별할 수 있다. 그 후, 원하는 페노타입을 나타내는 세포들은 한정 분석, 전기영동법, 서던 분석(Southern analysis), 폴리머라아제 연쇄반응, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술로 분석할 수 있다. 타겟 유전자 부위에 적절한 삽입을 나타내는 단편들을 식별함으로써, 세포에서 타겟 유전자를 비활성화시커거나 변형시키기 위해 상동 재조합이 일어나는지를 식별할 수 있다.

효능 상승 실험 (Potency Boost Experiment)

본 발명의 추가적인 면에 있어서, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포는 특정 화합물, 이를 테면, 본원의 방법 및 과정에 따라 설명된 화합물의 효능 상승을 결정하는데 사용할 수 있다.

화합물의 효능 상승은, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서의 질병 유도 낮은 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 효능 상승 실험을 반복함으로써, 테스트하여 결정할 수 있다. 바람직한 일 구체예에 있어서, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서의 질병 유도 낮은 pH와 생리적 pH에서 평가된 화합물의 효능 상승 실험을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 효능 상승 실험을 반복함으로써, 실험으로 결정된 화합물의 효능 상승이 최소 5의 효능 상승을 나타내는 화합물을 선택하는 방법을 제공한다.

"질병 유도 낮은 pH"는 본원에서 언급한 임의의 질병 또는 질환과 관련된 pH 저하로 정의된다. 상기 "질병 유도 낮은 pH"는 약 6.4 내지 7.1이고, 일반적으로 약 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 또는 7.1이다. 생리적 뇌조직 pH는 약 7.2 내지 약 7.8이고, 일반적으로 약 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 또는 7.8이다. 일 구체예에 있어서, 상기 "질병 유도 낮은 pH"는 허혈성 질병, 이를 테면, 뇌졸중 등과 관련될 수 있다.

일 구체예에 있어서, 질병 유도 낮은 pH는 약 6.9이다. 다른 구체예에 있어서, 질병 유도 낮은 pH는 약 6.7 내지 약 7.1이다.

일 구체예에 있어서, 생리적 pH는 약 7.6이다. 다른 구체예에 있어서, 생리적 pH는 약 7.4 내지 7.8이다.

"효능 상승" 실험은, 생리적 pH, 이를 테면, pH 7.6 및 허혈 또는 신경병성 통증 pH, 이를 테면, pH 6.9에서, 화합물에 대한 NMDA 채널 작용의 반값 억제(half-maximal inhibition)를 일으키는 화합물의 농도(IC₅₀)를 결정한다. 화합물에 대한 IC₅₀값을 결정하기 위해 업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. IC₅₀값은 비율로 나타내고, IC₅₀에서 평균 시프트를 결정하기 위해 통합하여 평균치를 구할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 화합물에 대한 IC₅₀값을 결정하기 위해 2 전극 전압 클램프(two electrode voltage-clamp) 기록법을 사용할 수 있다. 글래스 극소전극은, 전압 전극이 전류 전극보다 더 낮은 농도의 염화 칼륨을 함유할 정도로, 염화 칼륨으로 채울 수 있다. 세포를 체임버에 놓고, 생리용액을 넣을 수 있다. 외부 pH를 허혈이나 신경병성 통증 pH, 이를 테면, pH 6.9 또는 생리적 pH, 이를 테면, pH 7.6으로 조정할 수 있다. 그 후, 최대로 효과적인 농도의 글루타메이트 및 글리신을 연속적인 방식으로 적용하고, 뒤이어, 글루타메이트/글리신에 다양한 농도의 테스트 화합물을 더하여, 용량 반응 곡선을 얻을 수 있다. 적용된 길항제에 의한 억제 수준을 초기 글루타메이트 반응의 퍼센트로 나타낼 수 있다. 이러한 값들은 세포 전역에서, 예를 들면, 단일의 개구리로부터의 난모세포 전역에서, 통합하여 평균치를 구할 수 있다. 각각의 길항제 농도에서 평균 퍼센트 반응을 계산식, (100-min)/(1+([conc]/IC₅₀)^nH)+min으로 맞출 수 있고, 여기에서, min은 포화 길항제에서 잔류 퍼센트 반응이고, IC₅₀은 최대로 달성가능한 억제의 반을 일으키는 길항제의 농도이며, nH는 억제 곡선의 가파름을 나타내는 기울기 인자이다. min은 0과 같거나 큰 것으로 한정될 수 있다. 예를 들면, 공지된 채널 차단제로 한 실험에 있어서 min은 0으로 셋팅할 수 있다. 생리적 pH 및 허혈 pH에서 얻어진 IC₅₀값은 비율로 나타내고, IC₅₀에서 평균 시프트를 결정하기 위해 통합하여 평균치를 구할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 상기 화합물은 질병 유도 낮은 pH와 생리적 pH에서, 최소 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23보다 큰 효능 상승을 나타낼 수 있다.

효능 상승 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 효능 상승 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 약 14%, 13,%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 효능 상승 실험은 96%, 97%, 98% 또는 99% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다.

동물 모델

본 발명의 일면에 있어서, (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 질병 유도 낮은 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 효능 상승 실험을 반복하여 평가하는 단계; (ii) 신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 실험을 반복하여 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 것과 관련된 화합물을 선택하는 단계를 포함하는, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 화학적 화합물을 식별하는 방법이 제공된다. 일 구체예에 있어서, 후보 약물은 인간 용도에 우수한 약물이기 위해, 생체외 및 생체내 기준을 충족하거나 능가해야 한다.

바람직한 구체예에 있어서, 신경병성 통증의 동물 모델에서 통증 역치를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 최소 15회 실험을 반복함으로써, 통증 역치가 최소 2배 증가를 나타내는 것으로 선택되는 화합물 또는 화합물을 선택하는 방법을 제공한다.

신경병성 통증의 동물 모델

본 발명의 일면에 있어서, 본원에 개시된 화합물은 통증, 특히 신경병성 통증 및 관련 질병의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.

본 발명의 일면에 있어서, (i) 세포에서 "질병 유도 pH"와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여 평가(예를 들면, 생리적 pH에서 IC₅₀/"질병 유도 pH"에서 IC₅₀)하는 단계; (ii) 신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 화합물을 선택하는 단계에 의한 포유류, 특히 인간에게서 신경병성 통증을 치료하는데 유용한 화학적 화합물을 식별하는 방법을 제공한다.

특정 구체예에서, 후보 약물은 인간 용도에 우수한 약물이기 위해, 생체외 및 생체내 기준을 충족하거나 능가해야 한다. 일 구체예에서, 효능 상승은 인간으로부터 유도된 글루타메이트 수용체를 발현한 세포에서 결정될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 효능 상승은 적어도 하나의 인간에서 유도된 NMDA, AMPA, 및/또는 카이네이트 수용체를 발현하는 세포에서 결정될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛 및 최소 하나의 NR2 서브유닛을 발현할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2B 서브유닛일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 NR2 서브유닛은 NR2A 서브유닛일 수 있다.

본 발명의 보다 다른 일반적인 면에 있어서, (i) 실험에서 최소 5의 효능 상승을 나타내고, 여기에서 화합물의 효능 상승은, "질병 유도 pH"와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승(예를 들면, 생리적 pH에서 IC₅₀/"질병 유도 pH"에서 IC₅₀)을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여, 세포에서 테스트하며, (ii) 신경병성 통증의 동물모델에서 상기 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여 측정하며, (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 화합물을 선택한 것으로부터, NMDA 수용체 길항제를 활성화시키는 방식으로 pH를 저하시키는 질병을 치료하는 화합물이 선택되고, 그 방법이 제공된다. 일 구체예에 있어서, 효능 상승은 글루타메이트 수용체를 발현하는 세포에서 결정될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 효능 상승은 NMDA, AMPA, 및/또는 카이네이트 수용체를 발현하는 세포에서 결정될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛 및 최소 하나의 NR2 서브유닛을 발현할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2B 서브유닛일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 NR2 서브유닛은 NR2A 서브유닛일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 신경병성 통증의 동물 모델은 만성 협착 손상 모델, 부분성 좌골 결찰 모델, 척수 신경 결찰 모델 또는 당업자에게 공지된 다른 모델들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한하지 않는다. 특정 구체예에 있어서, 척수 신경 결찰 모델은 생체내 동물 모델로 사용될 수 있다.

"통증 역치"는 통증의 감각을 경험하기까지 필요한 자극의 양의 측정치이다. 만성 신경병성 통증 동물 모델에 있어서, 동물은 손상을 입고 만성 통증 상태가 유도된다. 그 후, 침해 자극(noxious stimulus)이 적용될 수 있고, 동물이 침해 자극에 반응하지 않고 그것을 견딜 수 있는 시간의 양이 계산될 수 있다. 예를 들면, 비손상 동물은, 표면으로부터 그의 포우를 거두기까지 20분간 냉표면(cold surface)에 노출될 수 있으나, 하기 기술된 신경병성 통증으로 만든 것과 같은 손상 후에는, 단지 1분 후에 그의 포우를 거둘 수도 있다. 침해 자극의 예는: 열, 냉기, 본 프레이 자극과 같은 기계적, 화학적 자극 등을 포함하나, 이에 한하지 않는다.

일 구체예에 있어서, 만성 협착 손상 모델(CCI, 또는 Bennett 모델)은 신경병성 통증의 동물 모델을 사용할 수 있다(예를 들면, Bennett, Gary J. et al. Pain, 1988, 33, 87-107 참조). 이러한 모델에 있어서, 동물(예를 들면, 랫트)의 좌골 신경은 신경병성 통증을 갖는 인간 환자군에 의해 보고된 증후군을 유도할 수 있는 방식으로, 고의적으로 주입할 수 있다. 특히, 좌골 신경은 슬와(popliteal fossa)에서 신경의 삼분할 근위에 있는 대퇴의 가운데(midthigh)에서 노출될 수 있다. 그 위치에서, 약 7 mm의 신경 궤적이, 약 1 mm 간격으로 그 주변에 느슨하게 붙어 있는 조직과 4개의 결찰사(ligature)의 부착이 없어 질 수 있다. 각 동물에 있어서, 각 동물이 그 자체의 대조군으로 역할을 하기 위해 동일한 해부를 결찰 없이 반대쪽으로 수행할 수 있다. 결찰된 측면에서, 감염된 힌드포우 스킨은 분명히 통각과민성 및 이질통성(allodynic)(즉, 일반적으로 통증 반응을 유도하지 않는 자극으로부터 유발된 통증을 경험), 및 아마도 자발적 통증의 근원이 된다. 통각과민증 테스트를 위해서, 열과 같은 침해 자극을 글래스 플로어 밑으로부터 플랜터 힌드포우에 가할 수 있고, 포우 이탈(withdrawal)에 대한 잠복(통증 역치에 대한 마커)를 측정할 수 있다. 신경손상 측면에 대한 반응은 비정상적인 규모 및 지속성, 과도한, 예를 들어, 30초의 포우 상승(elevation)을 나타내는 경향이 있고, 연장된 리킹(licking)을 동반할 수 있다. 통상적인 반응은 동물이 포우를 단지 들어올릴 것이고, 2 미만 지속할 것이다. 냉 이질통(cold allodynia)에 대한 테스트를 위해서, 동물군을, 예를 들면, 4℃에서 냉각된 금속 플로어에 놓을 수 있다. 비결찰된 포우를 위해서, 상기 플로어는, 접촉 20분 후 조차도 통증을 발생시키지 않는다. 결찰된 랫트를 신경손상 포우의 이탈에 대해 측정할 수 있고, 이는, 예를 들면, 5배 이상 증가할 수 있고, 지속성을 측정할 수 있고, 예를 들면, 2배 이상 증가할 수 있다. 이러한 모델을 사용하는 경우, 약물 없이, 또, 본원에 기술된 화합물의 투여후의 통증 역치를 계산할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 부분적 좌골 결찰 모델(Seltzer 모델)은 신경병성 통증 역지를 테스트하는데 사용될 수 있다(Seltzer, A. et al. Pain, 1990, 43, 205-218 참조). 이러한 모델에 있어서, 랫트와 같은 동물의 상부 대퇴부의 좌골 신경의 절반은 편면적으로 결찰될 수 있다. 조작후 몇시간 내, 그 후 몇 달 동안, 동물군은 자발적 통증의 가능성을 암시하는, 동측의 힌드포우의 보호 행동을 전개하고, 간혹 핥을 수 있다. 풋의 플랜터 표면은 무해성 및 유해성 자극에 균등하게 감각과민(hyperesthetic)일 수 있다. 유해성 자극에 대한 통상적인 측정은 동물에서, 본 발명의 화합물에 대한 노출 및 비노출로 측정될 수 있다. 유해성 자극은 본 프레이 헤어 자극, CO₂ 레이저 열 진동 및 핀 프록(prock)을 포함할 수 있다. 플랜터 측면에서 반복적인 본 프레이 헤어 지각극에 대한 반응에 있어서, 이탈 역치가 예리하게 감소할 수 있다. 조작된 측면에서 이러한 일련의 자극 후에, 광 접촉(light touch)은, 접촉에 대한 이질통을 암시하는 혐오 반응(aversive response)을 유도한다. 또한, CO₂ 레이저 열 진동에 대한 이탈 역치는 현저히 낮아진다. 역치상 유해성 열 진동은 열적 통각과민증을 암시하는, 편면적으로 두드러진 반응을 유도한다. 또한, 핀-프릭도 이러한 두드러진 반응을 일으킬 수 있다(기계적 통각과민증). 이러한 모델을 사용하는 경우, 약물 없이 그리고, 본원에 설명된 화합물의 투여 후의 통증 역치를 계산할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 척수 신경 결찰 모델(Chung model)이 신경병성 통증을 측정하는데 사용될 수 있다(Kim, S.H. and Chung, J.M. Neurosci. Lett. 1991, 134, 131-134; Kim, S.H. and Chung, J.M. Pain, 1992, 50, 355-363 참조). 이러한 모델에 있어서, L5(또는 L5+L6) 척수 신경은 단단하게 결찰된 후 컷팅된다. 외과적 과정은 감염된 풋의 유해성 열 및 기계적 이질통에 대한 통각과민증을 오래 지속시키도록 한다. 감염된 힌드포우의 기계적 감도를 측정할 수 있다. 본 프레이 필라멘트로 힌드포우에 적용된 무해성 기계적 자극에 대한 풋 이탈 증가 현상으로 입증된 것으로서, 외과적 조작 후 첫날로부터 눈에 띄게 상승할 수 있다. 또한, 감염된 풋에서 자발적 통증의 존재의 행동적인 표시가 나타난다. 이러한 측정은 본 발명의 화합물의 투여 및 미투여로 결정될 수 있고, 통증 역치를 계산할 수 있다.

신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치에 대한 화합물의 효과를 측정한 후, 통증 역치에서 최소 2배 증가를 나타내는 것을 화합물로 선택할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 화합물은 통증 역치에서 최소 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 30배 증가를 나타낼 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 상기 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않을 때까지 최소 15회 반복할 수 있다. 신경병성 통증 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 신경병성 통증 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 신경병성 통증 실험은 96%, 97%, 98% 또는 99% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다.

신경병성 통증의 다른 동물 모델은, 스페어드(spared) 신경 손상 모델(see Decosterd & Woolf. Pain. 2000 Aug;87(2): 149-58 참조), 프랭크 트라우마의 결핍에서 좌골 신경의 국소적 염증, 및/또는 화학요법제 빈크리스틴의 주사로 유도된 통증의 말초신경 모델로 유도된 좌골 염증 신경장해(SIN) (Aley et al Neurosci 1996;73:259-65)를 포함하나, 이에 한하지 않는다. 추가적인 모델은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, Zimmerman M. Eur J Pharmacol 2001;429:23-37; Shir et al Neurosci Lett 1990;l 15:62-7. Wall et al Pain 1979;7:103-l l; DeLeo et al Pain 1994;56:9-16; Courteix et al Pain 1994;57: 153-60; Aley et al; Slart et al Pain 1997; 69:119-25; Hargreaves et al Pain 1988;32:77-88 등을 참조한다.

일시적인 국소적 허혈의 생체내 모델

본 발명의 일면에 있어서, (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 “질병 유도 낮은 pH"에 대한 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승(예를 들어, 생리적 pH에서 IC₅₀/"질병 유도 낮은 pH"에서 IC₅₀)을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여, 평가하는 단계; (ii) 일시적인 국소적 허혈의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 경색 체적에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여 측정하는 단계; (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 경색 체적이 최소 30% 감소하는 화합물을 선택하는 단계에 의해, 인간에게서 허혈 손상을 치료하는 데 유용한 화학적 화합물을 식별하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라, 후보 약물은 인간 용도에 대해 우수한 약물이기 위해서 생체외 및 생체내 기준을 충족시키거나 능가해야 한다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛 및 최소 하나의 NR2 서브유닛을 발현할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2B 서브유닛일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2A 서브유닛일 수 있다.

본 발명의 보다 다른 일반적인 면에 있어서, (i) 실험에서 최소 5의 효능 상승을 나타내고, 여기에서 화합물의 효능 상승은, "질병 유도 pH"와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여, 세포에서 테스트하며, (ii) 국소적 허혈의 동물 모델에서 측정된 경색 체적이, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여, 측정한 결과 최소 30% 감소를 나타내는, 인간 NMDA 수용체 길항제를 활성화시키는 방식으로 pH를 저하시키는 질병을 치료하는 화합물이 선택되고, 그 방법이 제공된다. 일 구체예에 있어서, 상기 세포는 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛 및 최소 하나의 NR2 서브유닛을 발현할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2B 서브유닛일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, NR2 서브유닛은 NR2A 서브유닛일 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 국소 허혈의 동물 모델에서 측정된 경색 체적에 있어서, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않을 때까지 최소 15회 실험을 반복함으로써, 최소 30% 감소를 나타내는 것으로부터 선택된 화합물 또는 화합물을 선택하는 방법이 제공된다. 다른 특정 구체예에 있어서, “질병 유도 낮은 pH"는 뇌졸중과 같은 허혈성 질병과 관련될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 중대뇌 동맥 폐색 모델은 마우스와 같은 설치류에서 일시적인 국소적 허혈의 동물 모델로서 사용될 수 있다.

국소적 허혈성 뇌졸중은, 뇌의 각 영역에 혈액 공급을 차단함으로써, 뇌에 손상을 줄 수 있다. 국소적 허혈성 뇌졸중은 일반적으로, 2차 동맥 또는 소동맥(arteriole)에 대비되는, 임의의 하나 이상의 “주 대뇌 동맥” (예를 들면, 중대뇌 동맥, 전대뇌 동맥, 후대뇌 동맥, 내부 경동맥, 척추 동맥 또는 기저 동맥)의 폐색에 의해 일어난다. 따라서, 본원에서 정의된 국소적 허혈성 뇌졸중은, 복수의 응고 입자가 2차 동맥 또는 소동맥을 폐색시키는 대뇌 색전증 뇌졸중(cerebral embolism stroke) 모델(이를 테면, Bowes et al., Neurology 45:815-819(1995))과는 구별된다.

국소적 허혈은 임의의 포유류에서 유도될 수 있고, 포유류에는, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 저빌(gerbil) 등이 포함되나 이에 한하지 않는다(또한, Renolleau S, Stroke. 1998 Jul;29(7):1454-60; Gotti, B. et al., Brain Res, 1990, 522, 290-307 참조). 예를 들면, 저빌은, 뇌 혈액 공급이 오로지 두 개의 공통적인 경동맥에 의해 통제되므로, 허혈성 뇌졸중의 연구에 있어서 폭넓게 사용되는 실험 모델이다. 이들은 불완전한 윌리스 원(incomplete circle of Willis)을 갖기 때문에, 저빌에게서 특별한 특성이 생긴다(Chandler et al., J. Pharmacol. Methods 14:137-146, 1985; Finkelstein et al., Restor. Neurol. Neurosci. 1:387-394, 1990; Levine and Sohn, Arch. Pathol. 87:315-317, 1969; Kahn, Neurology 22:510-515, 1972).

테스트 화합물을 동맥의 폐색 전 또는 후에 동물에 투여할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 테스트 화합물을 복강내 투여할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 테스트 화합물을 뇌실 내 투여할 수 있다. 테스트 화합물을 동맥의 폐색 전, 예를 들면, 허혈 현상의 약 10, 20, 30, 40, 50 또는 60분 전에 투여할 수 있다. 택일적으로, 테스트 화합물을 동맥의 폐색 후, 예를 들면, 허혈 현상(즉, 재관류 후(post-reperfusion))의 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 또는 120분, 또는 약 4, 6, 8, 또는 10 시간, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 후에 투여할 수 있다.

화합물이 허혈성 영역의 세포를 보호할 수 있다는 증거는 중대뇌 동맥(MCA)을 실험적으로 폐색한 동물 모델, 즉, 중대뇌 동맥 폐색 모델(MCAO)에서 테스트할 수 있다. 인간 대상에서 발생할 수도 있는 생체내 허혈 현상을 자극하기 위한 이러한 동물 모델이 업계에 공재되어 있다. MCA의 실험적 폐색은 전형적으로 기저핵(basal ganglion) 및 전두, 정수리, 측두 피질 영역과 관계된 거대한 편측성(unilateral) 허혈 영역을 일으킨다(Menzies et al., Neurosurgery 31, 100-106(1992)). 허혈성 병변(ischemic lesion)은 MCA에 의해 관류된 부위에서, 보다 작은 코어로 시작하여, 시간에 따라 성장한다. 코어 경색으로 둘러싸인 이러한 반음영 영역(penumbra)은 코어로부터 폐색 중 측부 혈행(collateral circulation)으로 관류된 조직으로, 병변의 전파에 의한 것이다. 허혈 현상의 코어로 둘러싸인 반음영에 대한 치료제의 효과는, 동물로부터 뇌절편을 얻어 조사할 수 있다. MCA는 혈액을 전두, 정수리, 및 측두엽의 피질 표면뿐만 아니라 기저핵 및 내부 캡슐로 공급한다. 뇌절편은 가장 큰 허혈 효과가 일어나는 영역에 걸쳐 취할 수 있다. MCAO는 임의의 포유류, 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 및 저빌로부터 유도될 수 있으나, 이에 한하지 않는다(또한, Renolleau S, Stroke. 1998 Jul;29(7): 1454-60; Gotti, B. et al., Brain Res, 1990, 522, 290-307 참조). MCA 모델은 허혈 현상(즉, 좌측 중대뇌 동맥의 폐색)에 이은 신경 세포사의 간접적 측정을 가능케 한다. 일 구체예에 있어서, 중대뇌 동맥의 일시적인 국소적 대뇌 허혈은 화합물을 테스트하는데 사용될 수 있다.

일시적인 국소적 대뇌 허혈은 관강내(intraluminal) 중대뇌 동맥(MCA) 폐색으로 유발될 수 있다. 폐색은 동맥을 차단하는 임의의 수단, 예를 들면, 모노필라멘트 봉합과 같은 봉합(suture)으로 수행할 수 있다. 동물을 마취한 후, 국부적 대뇌 혈류의 상대적 변화를 모니터링하기 위해 프로브(probe)를 두개골에 고정할 수 있다. 이러한 변화는 레이저 도플러 플로우미터(Perimed)로 모니터링 할 수 있다. 예를 들면, 마우스에서, 프로브를 브레그마(bregma)의 2 mm 후부 및 4-6 mm 측면에 고정할 수 있다. 그 후, 절개하여 MCA에 접근하고, 재료를 삽입하여 MCA를 폐색시킬 수 있다. 예를 들면, 모니터링된 혈류이 멈출 때까지 외경동맥 스텀프(stump)를 통해 내경동맥으로 봉합을 수행할 수 있다. 30분, 45분 또는 60분과 같은 MCA 폐색 주기 후, 차단 재료를 철회하여 혈류를 회복시킬 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 화합물이 허혈 영역에서 세포를 보호할 수 있다는 것을 증명하기 위해 양측 경동맥 폐색 모델이 사용될 수 있다. 동물군을 마취하고, 경부복측(ventral neck)에 절개를 수행하여 통상적인 경동맥을 분리하고, 일정 주기, 예를 들면, 5, 10, 15, 20, 30, 45 또는 60분 동안 완전히 폐색 시킬 수 있다. 동맥을 임의의 수단, 예를 들면, 미세동맥류 클립과 같은 클립으로 폐색할 수 있다. 그 후, 폐색을 중단하고 절개를 봉합할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 양측 경동맥 폐색을 저빌에서 수행할 수 있다.

외과적 조작 후, 동물군을 회복시킬 수 있다. 동물이 일정 주기, 예를 들면, 약 12, 24, 36, 48 또는 72시간 동안 생존한 후, 동물은 희생될 수 있고, 뇌를 제거하여, 예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 10 mm 섹션으로 분할될 수 있다. 그 후, 적절한 염료, 예를 들어 PBS 내 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 37℃에서 약 20분간 뇌섹션을 착색하여, 경색 체적을 식별할 수 있다. 그리고 나서, 각 섹션의 경색 영역을 섹션 두께를 측정하고 곱하여, 섹션의 경색 체적을 얻을 수 있다. 또한, 반대측 대 동측 반구 섹션 체적의 비를 부종 억제를 위한 상응하는 경색 섹션 체적으로 곱할 수 있다. 경색 체적은 모든 섹션에 대한 경색 영역의 빈도 섹션 두께를 합하여 결정할 수 있다.

일시적인 국소적 허혈의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 경색 체적에 대한 화합물의 효과를 측정한 후, 경색 체적을 최소 30% 감소시키는 화합물을 선택할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 경색 체적을 최소 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100% 감소시키는 화합물을 선택할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 상기 화합물은 허혈성 pH와 생리적 pH에서 최소 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40 또는 50의 효능 상승(즉, phys pH/Isc pH)을 나타내고, 도 1에 도시된 바와 같이, 경색 체적을 최소 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 또는 100% 감소시킨다는 것을 나타내며, 상기 숫자는 독립적으로 이들 숫자의 임의의 조합, 특별히 개시된 것으로 간주하는 각 조합을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 평균, 즉, 모든 관측치의 합을 관측의 수로 나눈 것은 효능 상승 및 경색 체적 실험을 위해 계산될 수 있고, 화합물의 평균값은 허혈성 pH와 생리적 pH에서 최소 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23의 효능 상승(즉, phys pH/Isc pH)을 나타낼 수 있고, 도 1에 도시된 바와 같이, 경색 체적을 최소 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80 또는 80% 감소시킬 수 있다.

경색 체적 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 경색 체적 실험은 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로, 약 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이상 ㅂ변하지 않을 때까지 반복할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 경색 체적 실험은 96%, 97%, 98% 또는 99% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 약 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 2% 이상 변하지 않을 때까지 반복할 수 있다.

일시적인 국소적 허혈의 다른 동물 모델은, 랫트에서 마이크로스페어 또는 응고혈액의 동맥내 주입, 4 혈관 폐색, 저빌에서 2 혈관 폐색, 또는 용해로 광화학적으로 유발된 클롯(clot) 형성 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 이러한 모델들은 당업자에게 공지되어 있다.

화합물

본 발명의 일면에 있어서, 본원에서 제공된 방법으로 식별된 화합물은, 다른 글루타메이트 수용체, 본원에 개시된 다른 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 10배 더 선택적이다. 추가적인 또는 택일적인 구체예에 있어서, 화합물은 최소 2:1 이상의 치료율(therapeutic index)을 갖는다.

다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은, 다른 글루타메이트 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 78, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 또는 1000 배 더 선택적이며, 상기 글루타메이트 수용체에는 하기의 글루타메이트 수용체: AMPA GIuRl (GenEMBL 어세션 넘버. X57497, Xl 7184, 157354), AMPA GluR2 (GenEMBL 어세션 넘버. X57498, M85035, A46056), AMPA GluR3 (GenEMBL 어세션 넘버. M85036, X82068), AMPA GluR4 (GenEMBL 어세션 넘버. M36421, U16129), Kainate GluR5 (GenEMBL 어세션 넘버. X66118, M83560, U16125), Kainate GluR6 (GenEMBL 어세션 넘버. D10054, Zl 1715, U16126), Kainate GluR7 (GenEMBL 어세션 넘버. M83552, U16127), Kainate KA-I (GenEMBL 어세션 넘버. X59996, S67803α), Kainate KA-2 (GenEMBL 어세션 넘버. DlOOl 1, Zl 1581, S40369), Orphan dl GRIDl (GenEMBL 어세션 넘버. DlO 171, Z 17238), Orphan d2 GRID2 (GenEMBL 어세션 넘버. D13266, Z17239), 및/또는 메타보트로픽 글루타메이트 수용체 (mGluRs), 이를 테면, mGluR 1 및 mGluR 5을 포함하는 그룹 1 GluRs, , mGluR 2 and mGluR 3을 포함하는 그룹 2 mGluRs, 및 mGluR 4, mGluR 6, mGluR 7, 및 mGluR 8을 포함하는 그룹 3 mGluRs가 포함되나, 이에 한하지 않는다. NMDA 수용체는 임의의 그의 서브유닛, 이에 한하는 것은 아니나, 예를 들면, NMDA NRl (염색체(인간) 9q34.3, GenEMBL 어세션 No. 마우스: D10028, GenEMBL 어세션 No. 랫트: X63255, GenEMBL 어세션 No. 인간: X58633), NMDA NR2A (염색체(인간): 16pl3.2, GenEMBL 어세션 No. 마우스: D 10217, GenEMBL 어세션 No. 랫트: D13211, GenEMBL 어세션 No. 인간: U09002); NMDA NR2B (염색체(인간): 12pl2 GenEMBL 어세션 No. 마우스: D10651 ' GenEMBL 어세션 No. 랫트: M91562, GenEMBL 어세션 No. 인간: U28861α); NMDA NR2C (염색체(인간) 17q24-q25, GenEMBL 어세션 No. 마우스: D10694, GenEMBL 어세션 No. 랫트: D13212); NMDA NR2D (염색체(인간) 19ql3.1qter, GenEMBL 어세션 No. 마우스: D12822, GenEMBL 어세션 No. 랫트: D13214, GenEMBL 어세션 No. 인간: U77783); NMDA NR3A (GenEMBL 어세션 No. 랫트: L34938 및/또는 NMDA NR3B 등으로 구성될 수 있다. 택일적으로, 상기 화합물은, 상기 개시된 다른 글루타메이트 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9배 더 선택적이다.

추가적으로 또는 택일적으로, 상기 화합물은 다른 수용체 타입보다 NMDA 수용체에 결합함에 있어서 최소 10배 더 선택적일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은 하기의 다른 수용체 타입보다 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 78, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 또는 1000배 더 선택적일 수 있으며, 상기 다른 수용체 타입에는: D1, D2, D3, D4 및 D5와 같은 도파민 수용체; mu 오피오이드 수용체, 이를 테면, mu1 및 mu2 와 같은 오피오이드 수용체; 델타 1 및 델타 2와 같은 델타 오피오이드 수용체 및 카파 1 및 카파 2와 같은 카파 오피오이드 수용체; 무스카린 및 니코틴 수용체를 포함하는 콜리너직 수용체; 에피네프린 수용체 및 에피네프린 수용체, GABA 수용체, 이를 테면, 이들로 한정되는 것은 아니나, 하기 표 2에 기재된 펩타이드에 대한 수용체와 같은 GABA-A 및 GABA-B 수용체를 포함하는 아드레너직 수용체가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 택일적으로, 상기 화합물은 상기 기재된 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 대하여 보다 선택적이지 않거나, 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배 더 선택적이다.

다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은 세로토닌 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 78, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 또는 1000배 더 선택적일 수 있다. 택일적으로, 상기 화합물은 세로토닌 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 보다 선택적이지 않거나 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9배 더 선택적이다. 세라토닌 수용체는 5HT_1A, 5HT_1B, 5HT_1D, 5HT_1E, 및 5HT_1F를 포함하는 5HT₁; 5HT_2A, 5HT_2B, 및 5HT_2C를 포함하는 5HT₂; 5HT₃; 5HT₄; 5HT_5a 및 5HT_5B를 포함하는 5HT₅; 5HT₆ 및 5HT₇를 포함하나, 이에 한하지 않는다. 다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은, H1, H2, H3 및 H4 히스타민 수용체를 포함하는 히스타민 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 78, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 또는 1000배 더 선택적일 수 있다. 택일적으로, 상기 화합물은 H1, H2, H3 및 H4 히스타민 수용체를 포함하는 히스타민 수용체보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 보다 선택적이지 않거나 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9배 더 선택적이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 화합물은 칼슘 채널보다 인간 NMDA 수용체에 결합함에 있어서, 최소 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 78, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 또는 1000배 더 선택적일 수 있다.

특정 수용체에 대한 약물의 친화력을 결정하기 위해 화합물을 차폐(screening)하는 것은 약물 발견 과정에서 중요한 것 중 하나이다. 수용체 선택성을 결정하는 방법은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 차폐는 거대 화합물 거대 화합물 라이브러리에 대한 1차 차폐법 또는 다양한 수용체 타입 또는 서브타입에 대한 결합 친화도의 순위를 메기기 위해 2차 차폐로서 사용될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 이러한 분석은, 높은 스루풋(throughput) 시스템, 예를 들면, Millipore Multiscreen^TM _HTS 필터 플레이트와 같은 필터-플레이트 차폐 시스템에서 수행할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 방사성리간드 결합 분석을 사용하여 특정 수용체에 대한 수용체 선택성을 결정할 수 있다. 일 특정 구체예에 있어서, 포화 결합 분석(saturation binding assay)를 사용하여 특정 수용체에 대한 테스트 화합물의 결합 상수(K_d)를 결정할 수 있다. 포화 결합 분석은 업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 일반적으로, 포화 결합 분석은, 특정 수용체를 발현하는 세포의 멤브레인을 얻어 수행될 수 있다. 예를 들면, CHO 세포와 같은 세포를, 인간 NMDA 수용체, 예를 들면, NR1/NR2A 또는 NR1/NR2B 인간 NMDA 수용체를 발현하기 위하여 트랜스펙션할 수 있다. 택일적으로, 인간 NMDA 수용체, 예를 들면, NR1/NR2A 또는 NR1/NR2B 인간 NMDA 수용체를 내생적으로 발현하기 위해 세포가 사용될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 전체 세포 결합 분석을 수행할 수 있다. 택일적으로, 예를 들면, 세포를 용해시킨 후, 용해물(lysate)의 멤브레인 부분을 얻기 위해 원심분리를 사용하는 것과 같이, 멤브레인을 세포로부터 분리할 수 있다(예를 들면, Laboratory method for isolation of cell membranes, A. Hubbard and Z. Conn The Journal of Cell Biology (1975) and Rogers et al., 1991, J.Neuroscience: 2713-2724 참조). 그 후, 전체 세포 또는 세포 멤브레인은 방사성표지 리간드, 즉, 테스트 화합물, 예를 들면, 3H-표지 리간드의 일련의 희석으로 배양될 수 있다. 일정 주기동안, 예를 들면, 최소 1, 2 또는 3시간 동안 배양한 후, 멤브레인을 수회, 예를 들면, 5, 10, 15 또는 20회 세척할 수 있다. 그 후, 신틸레이션액(scintillation fluid)을 첨가하고 세포 또는, 세포 또는 멤브레인의 방사성활성화를 수행할 수 있다. 비특이적 결합 또한 과량의 비표지 경쟁자 리간드로 분리 실험하여 결정할 수 있다. 특이적 결합은, 전체 활성으로부터 비특이적 활성을 뺌으로써 계산될 수 있다. 그 후, 결합 상수(K_d)는 비선형 회귀 및 스캣차드 분석, 예를 들면, 프리즘 데이터 소프트웨어(www.Graphpad.com)을 사용하여, 자유 리간드 농도에 의한 특이적 결합의 조정에 의해 결정할 수 있다. 또한, 결합 부위의 수[최대 결합 용량(B_max)]도 비선형 회귀(non-linear regression) 및 스캣차드(Scatchard) 분석, 예를 들면, 프리즘 데이터 소프트웨어를 사용하여 계산할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 치환 방사성리간드 결합 분석을 수행하여, 상대적 친화도 값(IC₅₀)을 결정할 수 있다. 특정 수용체를 발현하는 전체 세포 또는 분리된 세포 멤브레인을 상술한 바와 같이 사용할 수 있다. 일정한 방사성리간드 농도 및 대조 결합 실험에 대한 비교로서 비표지 경쟁자 리간드의 일련의 희석액을 사용하여, 비표지 리간드 없이 억제도를 결정할 수 있다(% 대조). 상대적 친화도 값(IC₅₀)은, 비선형 회귀, 예를 들면 프리즘 데이터 소프트웨어를 사용하여 결합 억제값의 조정에 의해 결정할 수 있다.

감염된 조직의 영역에 있어서 영역을 낮추는 질병의 치료에 있어서 우수한 인간 임상 실험의 수행을 위해 하기 화합물이 선택될 수 있다. 본원에 일반적으로 개시된 하기 가이던스에 따라 새로운 파라미터를 만족하는 다른 화합물을 선택할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본원에 개시된 과정 및 방법에 따라 선택된 화합물은 하기 화합물로 구성된 군 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에난티오머, 에난티오머 혼합물, 및 이들의 혼합물로부터 선택된다:

및

.

입체화학

화합물의 3차원적 배열은 치료적 용도에 있어서 화합물의 활성 및/또는 적합성에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. 화합물의 에난티오머가 본원에 기재된 기준을 사용하여 둘 다 선택될 수 있거나, 하나는 선택되고, 하나는 선택되지 않는다는 것이 본원에서 실험적으로 관찰되었다. 추측컨대, 특정 위치에서, 제공된 기준을 사용하여 두 에난티오머가 모두 선택될 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 본원에 기재된 과정 및 방법에 따라 선택된 화합물은 NMDA 수용체 채널 차단제, 이로써 한정되는 것은 아니나, 이를 테면, FR 115427, NPS 1506, 펜시클리딘(PCP), 레마세미드, TCP, 또는 EAA-090 이 아니다. 다른 구체예에 있어서 본원에 기재된 과정 및 방법에 따라 선택된 화합물은 NMDA 수용체 글루타메이트 부위 길항제, 이를 테면, 이로써 한정되는 것은 아니나, CGP 40116, D-CPPene, GPI3000 (NPC 17742), MDL 100,453, 또는 셀포텔(CGS 19755)이 아니다. 다른 구체예에 있어서, 본원에 기재된 과정 및 방법에 따라 선택된 화합물은 NMDA 수용체 글리신 부위 길항제, 이를 테면, 이로써 한정되는 것은 아니나, 7-Cl-키뉴레네이트, HA966, MRZ 2/576, ZD9379, 가베스티넬(GVl 50526), 및 리코스티넬(ACEA 1021, 5-니트로-6,7-디클로로-l,4-디히드로-2,3-퀴녹살린디온)이 아니다.

다른 구체예에 있어서, 본원에 기술된 과정 및 방법에 따라 선택된 화합물은 PCT 공개공보 WO 02/072542 호에 게재된 것이 아니다.

부작용

본원에서 설명된 방법 및 과정의 추가적인 면에 있어서, 화합물은 실질적인 독성 부작용을 나타내지 않는다. 다른 인간 이외의 종보다 인간 NMDA 수용체를 사용하면, 생체내, 특히 인간 환자군에서, 화합물이 생체내 셋팅으로 들어가기 전 독성 부작용을 최소화시키는 생체외 분석을 사용하여, 화합물의 효력 및 효능 상승을 효과적으로 평가할 수 있다.

독성 부작용에는 흥분, 환각, 착란, 인사불성, 편집증, 망상, 정신이상 유사증후군, 로타로드(rotarod) 손상, 암페타민 유사 스테레오타입 비헤이비어, 상동증, 정신병 기억손상, 운동손상, 항불안 유사 효과, 혈압 상승, 혈압 저하, 맥박 상승, 맥박 저하, 혈액학적 이상, 심전도(ECG) 이상, 심장 독성, 심장 두근거림, 운동 자극, 신경운동 기능, 무드 변화, 단기 기억상실, 장기 기억상실, 각성, 진정, 피라미드외로(extrapyramidal) 부작용, 심실 빈박, 심재분극의 연장, 운동실조, 인지 장애 및/또는 통합실조 유사 증후군 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

또한, 다른 구체예에 있어서, 본원에 기재된 방법 및 과정에 따라 선택되거나 식별된 화합물은 다른 류의 NMDA 수용체 길항제와 관련된 실질적인 부작용을 갖지 않는다. 일 구체예에 있어서, 이러한 화합물들은, 셀포텔, D-CPPene (SDZ EAA 494) 및 AR-Rl 5896AR (ARL 15896AR)와 같은 글루타메이트 부위의 NMDA 길항제와 관련된 부작용, 이를 테면, 흥분, 환각, 착란 및 인사불성(Davis et al. (2000), Stroke 31(2):347-354; Diener et al. (2002), J Neurol 249(5):561-568); 편집증 및 망상(Grotta et al. (1995), J Intern Med 237:89-94); 정신이상 유사 증후군(Loscher et al. (1998), Neurosci Lett 240(l):33-36); 낮은 치료 비율(Dawson et al. (2001), Brain Res 892(2):344-350); 암페타민 유사 스테레오타입 비헤이비어(Potschka et al. (1999), Eur J Pharmacol 374(2): 175-187) 등을 실질적으로 나타내지 않는다. 다른 구체예에 있어서, 이러한 화합물들은, HA-966, L-701,324, d-시클로세린, CGP-40116, 및 ACEA 1021와 같은 글리신 부위의 NMDA 길항제와 관련된 부작용, 이를 테면, 현저한 기억 손상 및 운동기능 손상(Wlaz, P (1998), Brain Res Bull 46(6):535-540) 등을 나타내지 않는다. 또한, 추가적인 구체예에 있어서, 이러한 화합물들은, MK-801 및 케타민과 같은 NMDA 수용체 채널 차단제와 관련된 부작용, 이를 테면, 유사 정신병(Hoffman, DC (1992), J Neural Transm Gen Sect 89: 1-10); 인지 장애(자유재생, 인식 기억 및 주의력의 감퇴; Malhotra et al (1996), Neuropsychopharmacology 14:301-307); 시조프레니아 유사 증후군(Krystal et al (1994), Arch Gen Psychiatry 51 :199-214; Lahti et al. (2001), Neuropsychopharmacology 25 :455-467), 및 다동활성(hyperactivity) 및 스테레오타입 상승(Ford et al (1989) Physiology and behavior 46: 755-758) 등을 나타내지 않는다.

추가적 또는 택일적인 다른 구체예에 있어서, 최소 2:1, 최소 3:1, 최소 4:1, 최소 5:1, 최소 6:1, 최소 7:1, 최소 8:1, 최소 9:1, 최소 10:1, 최소 15:1, 최소 20:1, 최소 25:1, 최소 30:1, 최소 40:1, 최소 50:1, 최소 75:1, 최소 100:1 또는 최소 1000:1 보다 크거나 같은 치료율을 갖는다. 치료율은 독성 또는 치사 효과를 낳는데 필요한 용량 대 무해성 또는 치료 반응을 낳는데 필요한 용량의 비로 정의된다. 이는 반수 유효 용량(특정 방식에서 집단의 50%가 약물에 효과를 나타내는 때의 용량)과 반수 독성 용량(그룹의 50%가 약물의 역효과를 나타낼 때의 용량)의 관계일 수 있다. 치료율이 높을수록, 더 안전한 약물로 고려된다. 단순히, 유리한 효과를 발생시키기 위해 독성 반응을 유발시키도록 훨씬 높은 용량을 취한다는 것을 나타낸다.

화합물의 부작용 프로파일은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 결정될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 운동 손상은, 예를 들어, 운동 활성(locomotor activity) 및/또는 로토로드(rotorod) 수행을 측정하여, 측정될 수 있다. 로토로드 실험은 동물이 가속 로드에서 머무를 수 있는 지속성의 측정과 관련된다. 다른 구체예에 있어서, 기억 손상은, 예를 들어, 수동 회피 파라다임; 슈테른베르크 기억 스캐닝 및 단기 기억에 대한 페어워드(paired words), 또는 장기 기억에 대한 상의 지연된 자유재생을 사용하여 평가할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 항불안 유사 효과는, 예를 들어, 고가식 십자 미로 태스크(elevated plus maze task)에서 측정될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 심장 기능은, 혈압 및/또는 체온 측정, 및/또는 부작용 테스트를 위한 심전도 수행으로 모니터링될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 신경운동 기능 및 각성은, 예를 들어, 플리커 융합 빈도(critical flicker fusion) 역치, 선택 반응 시간, 및/또는 신체의 요동(body sway)을 분석하여 측정할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 무드(mood)는, 예를 들어, 자기평가(self-rating)를 사용하여 평가할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 시조프레니아 증후군(schizophrenic symptom)은, 예를 들어, PANSS, BPRS, 및 CGI를 사용하여 평가할 수 있고, 부작용은 HAS 및 S/A 스케일로 평가할 수 있다.

질환

본 발명의 추가적인 면에 있어서, 환자군에서 조직내 pH 차이를 유발하거나 이와 관련된 질병을, 본원에서 설명된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물을 투여함으로써, 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. pH 저하를 유발하는 임의의 질환, 상태 또는 질병은 본원에 기술된 방법에 따라 치료될 수 있다.

또한, 본원에 기술된 특성을 나타내는 화합물의 유효량을 투여함으로써, pH 저하와 관련된 허혈성, 저산소성, 또는 흥분독성 케스케이드의 진행을 경감시키는 방법이 제공된다. 또한, 본원에 기술된 특성을 나타내는 화합물을 투여함으로써, pH 저하와 관련된 세포사를 감소시키는 방법이 제공된다. 또한, 본원에 기술된 특성을 나타내는 화합물을 투여함으로써, pH 저하와 관련된 허혈 현상과 관련된 행동 결핍(behavioral deficit)을 감소시키는 방법이 제공된다.

일 구체예에 있어서, 본원에 기술된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물을 투여함으로써, 허혈 손상 또는 저산소증을 갖는 환자군을 치료하는 방법, 또는 허혈 손상 또는 저산소증과 관련된 신경 독성을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 특정의 일 구체예에 있어서, 허혈 손상은 뇌졸중일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 허혈 손상은, 외상성 뇌손상, 바이패스 수술 후의 인지장애, 경동맥 혈관형성술 후의 인지장애, 및/또는 저체온 순환 정지에 이은 신생아 허혈 중의 하나로 부터 선택될 수 있으나, 이에 한하지 않는다.

다른 특정 구체예에 있어서, 허혈 손상은 지주막하출혈(subarachnoid hemorrhage) 후의 혈관경련(vasospsm)일 수 있다. 지주막하출혈은 뇌를 둘러싼 멤브레인, 지주막의 아래에 혈액이 축적되는 이상 상태를 말한다. 지주막하 공간이라고 불리우는 이 영역은 일반적으로 뇌척수액을 함유한다. 지주막하 공간에 서의 혈액의 축적 및 그로부터 발생되는 혈관의 경련은 뇌졸중, 발작 및 다른 합병증을 유발할 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 화합물을 사용하여 지주막하출혈을 겪는 환자군을 치료할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 본원에 기술된 방법 및 화합물을 사용하여 지주막하출혈의 독성 효과, 예를 들면, 지주막하출혈로부터 유발될 수 있는 뇌졸중 및/또는 허혈을 포함하는 독성 효과를 제한할 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 본원에 기술된 방법 및 화합물을 사용하여, 외상성 지주막하출혈을 겪는 환자군을 치료할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 외상성 지주막하출혈은 머리 손상 때문일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 환자군은 자연적인 지주막하출혈을 갖는다.

다른 구체예에 있어서, 본원에 기술된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물을 투여함으로써, 신경병성 통증 또는 관련 질병을 갖는 환자군을 치료하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에 있어서, 신경병성 통증 또는 관련 질병은 말초 당뇨병성 신경장애, 대상포진 후 신경통(postherpetic neuralgia), 복합성 국소 통증 증후군, 말초 신경장애, 화합요법 유발 신경병성 통증, 암 신경병성 통증, 신경병성 통증, HIV 신경병성 통증, 3차 신경통(trigeminal neuralgia), 및/또는 중앙 뇌졸중후 통증(central post-stroke pain)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한하지 않는다.

신경병성 통증은 말초 또는 중추신경계에서 병리학적 과정에 의한 진행중인 유해 현상의 결핍에 있어서, 이소성으로(ectopically) 및 가끔씩 발생되는 신호와 관련될 수 있다. 이러한 기능장애는 통상적인 증후군, 이를 테면, 본원에 기술된 화합물 및 방법으로 치료될 수 있는, 이질통, 통각과민증, 간헐적인 비정상적 감각, 및 자발적, 버닝, 슈팅, 찌름(stabbing), 발작성 또는 전기 감각(electrical-sensation), 감각이상(paresthesia), 통각과민증 및/또는 감각장애(dysesthesia)와 연관될 수 있다.

또한, 본원에 기술된 화합물 및 방법을 사용하여, 말초 또는 중추신경계의 병리학적 현상로부터 유발되는 신경병성 통증을 치료할 수 있으며, 상기 병리학적 현상에는, 외상성 허혈; 진행중인 대사로부터의 전염병 또는 독성 질환, 전염병 또는 내분비성 질병, 이를 테면, 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 당뇨병성 신경장애, 이질통, 아밀로이드 다발성신경장애(1차 및 가족성), 단일클론 단백질을 갖는 신경장애, 혈관 신경장애, HIV 전염병, 대상포진 슁글(herpes zoster-shingle) 및/또는 대상포진 후 신경통 등; 길라인-바레(Guillain-Barre) 증후군과 관련된 신경장애; 파브리병과 관련된 신경장애; 해부학적 이상으로 인한 교액(entrapment); 3차 및 기타 CNS 신경통; 악성종양; 염증성 질환 또는 자기면역 질병, 이를 테면, 탈수성(demyelinating) 염증 질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반 부스럼(systemic lupus erythematosus), 쉐그렌(Sjogren) 증후군 등; 및 원인불명의 질환, 이를 테면, 특발성 원위 세경섬유 신경장애(idiopathic distal small-fiber neuropathy) 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 따라 치료될 수 있는 신경병성 통증의 기타 원인에는, 독소 또는 약물(이를 테면, 비소, 탈륨, 알콜, 빈크리스틴, 시스플라티늄 및 디데옥시뉴클레오사이드)에의 노출, 섭취 또는 흡수 이상, 면역 글로불린 혈(immuno-globulinemia), 유전적 이상 및 절단술(유선절제술 포함) 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 또한, 신경병성 통증은 신경 섬유의 압착(compression), 이를 테면, 신경근장애(radiculopathy) 및 수근관 증후군(carpal tunnel syndrome)으로부터 유발될 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 본원에 기재된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물의 투여에 의해서, 뇌종양을 갖는 환자군을 치료하는 방법이 제공된다. 추가적인 구체예에 있어서, 본원에 기재된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물의 투여에 의해서, 신경변성질환(neurodegenerative disease)를 갖는 환자군을 치료하는 방법이 제공된다. 일 구체예에 있어, 신경변성질환은 파킨슨씨 병일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 신경변성질환은 알츠하이머, 헌팅톤 및/또는 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic Lateral Scerosis)일 수 있다.

또한, 본원에 기술된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물을 예방적으로 사용하여, 본원에 기술된 것과 같은 질병 또는 신경학적 상태에 대하여 예방 또는 보호할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 허혈 현상에 대한 소인, 이를 테면, 유전적 소인을 갖는 환자군들을 본원에 기술된 방법 및 화합물로 예방적으로 치료할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 혈관경련이 나타나는 환자군들을 본원에 기술된 방법 및 화합물로 예방적으로 치료할 수 있다. 추가적인 구체예에 있어서, 심장 바이패스 수술을 받은 환자군들을 본원에 기술된 방법 및 화합물로 예방적으로 치료할 수 있다.

추가적으로, 하기 질병 또는 신경학적 상태를 본원에 기술된 방법 또는 과정에 따라 선택된 화합물의 투여에 의해 치료하는 방법을 제공한다. 상기 질병 또는 신경학적 상태에는; 만성 신경 손상, 만성 통증 증후군, 이를 테면, 당뇨병성 신경장애, 허혈, 일시적 또는 지속적인 혈관 폐색에 따른 허혈, 발작, 확연성 억제, 하지불안 증후군(restless leg syndrome), 저탄산증, 고탄산증, 당뇨병성 케토에시도시스, 태아가사, 척수 손상, 외상성 뇌손상, 중첩성 간질, 간질, 저산소증 등; 주산기 저산소증, (뇌)진탕, 편두통, 저탄산증, 과호흡, 락트 에시도시스, 출산중 태아가사, 뇌 글리오마, 및/또는 망막증 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

투여/제제

본원에 개시된 임의의 질병으로 고생하는 포유류 및 특히 인간을 포함하는 숙주(host)를, 본원에 개시된 유효량의 화합물, 또는 약제학적으로 허용되는 프로드럭, 에스터, 및/또는 그의 염을, 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 숙주에 투여함으로써, 치료할 수 있다. 활성 화합물을 임의의 적절한 루트, 예를 들면, 경구적, 비경구적, 정맥내, 피내, 근육내, 피하, 설하, 경피적, 기관지, 인후, 비강내, 크림 또는 연고와 같이 국부적, 직장, 관절내, 낭내, 수강내, 질내, 복강내, 안구내, 흡입으로, 볼 또는 구강 또는 비강 스프레이로서, 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물은 무기 또는 유기산으로부터 유도된 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은, 의학적 판단 근거의 범위에 들고, 인간 및 그보다 하등 동물의 조직에, 지나친 독성, 과민증, 알레르기 반응 등을 일으키지 않고, 접촉시켜 사용하기에 적합한 것이며, 합리적인 이익/위험 비를 갖는 적당한 염들을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 업계에 주지되어 있다. 예를 들면, P. H. Stahl, et al.은 약제학적으로 허용되는 염에 대해서, "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Wiley VCH, Zurich, Switzerland: 2002)에 상세히 기술하고 있다. 염은 본 발명의 화합물의 최종 분리 및 정제 중 그대로(in situ), 또는 유리 염기 작용물을 적절한 유기산과 반응시킴으로써 분리하여 제조할 수 있다. 대표적인 산 부가염에는, 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 비설페이트, 뷰티레이트, 캄포레이트, 캄포르서포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 2-히드록시에탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 또한, 염기성 질소-함유 그룹은, 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드와 같은 저급 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트와 같은 디알킬 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드, 및 아이오다이드와 같은 긴 사슬 할라이드; 벤질 및 페네틸 브로마이드 등과 같은 아릴알킬 할라이드; 등과 같은 에이전트를 사용하여, 4차화(quaternize)시킬 수 있다. 물 또는 유용해성(oil-soluble) 또는 분산성 생성물은 그에 의해 얻을 수 있다. 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성하기 위해 사용할 수 있는 산의 예에는, 염산, 브롬화수소, 황산 및 인산과 같은 무기산, 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산 등이 포함된다.

염기 부가염은, 카복시 산-함유 부분을 약제학적으로 허용되는 금속 양이온의 하이드록사이드, 카보네이트 또는 바이카보네이트와 같은 적절한 염기, 또는 암모니아, 또는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 반응시킴으로써, 본 발명의 화합물의 최종 분리 및 정제 중 그대로 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는, 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 양이온, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민 등을 포함하는 비독성 4차 암모니아 및 아민 양이온이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 염기 부가염을 형성하는데 유용한 기타 대표적인 유기 아민은 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등을 포함한다.

약제학적으로 허용되는 염은 또한, 업계에 주지된 표준 과정, 예를 들면, 아민과 같은 염기 화합물을 생리적으로 허용되는 음이온을 내놓는 적절한 산과 충분히 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 카복시산의 알칼리 금속(예를 들면, 소듐, 포타슘 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예를 들면, 칼슘 또는 마그네슘) 염 또한 제조될 수 있다.

제제는 편리하게 단위 용량 형태로 존재할 수 있고 약학업계에 주지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 모든 방법은 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 솔베이트를, 하나 이상의 부속 화합물을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는, 활성 화합물을 액체 담체 또는 정교하게 분할된 고체 담체 또는 이들 모두와 일률적으로 및 친밀하게 결합시키고, 그 후 필요에 따라, 생성물을 원하는 제제로 형태화 시킴으로써 제조될 수 있다.

화합물 또는 약제학적으로 허용되는 에스터, 염, 솔베이트 또는 프로드럭은, 원하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질과, 또는 원하는 작용을 보충하는 다른 물질과 혼합될 수 있다. 비경국적, 피내, 피하, 또는 국부적 적용에 사용되는 용액 또는 서스펜션에는, 예를 들어, 하기 성분: 주사용 물, 살린 용액, 고정유(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 살균 희석액; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 도는 소듐 비설파이드와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 버퍼 및 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 강장 조정제 등을 포함할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱제의 앰플, 일회용 주사기 또는 반복 투여용 바이알에 넣을 수 있다. 정맥내 투여에 바람직한 담체는 생리적 살린 또는 포스페이트 완충 살린(PBS)이다.

비경구 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 살균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 서스펜션 또는 에멀젼 및 살균 주사용액 또는 분산액으로 개조하기 위한 살균 파우더를 포함한다. 적절한 수성 및 비수성 담체, 희석액, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 적절한 이들의 혼합물, 식물성유(이를 테면, 올리브유) 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자크기 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한, 방부제, 습윤제, 유화제, 및 분산제를 포함하는 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 미생물의 작용을 예방하기 위해서, 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빅산 등을 사용할 수 있다. 또한, 슈가, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 약제학적 제형의 흡수를 연장시키기 위해서, 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 사용하는 것이 가능하다.

어떠한 경우에 있어서, 약물의 효과를 연장시키기 위하여, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 때때로 바람직하다. 이는 물에 낮은 용해성을 나타내는 결정질 또는 비결정질 물질의 액체 서스펜션을 사용하여 수행할 수 있다. 약물의 흡수 속도는 결과적으로, 결정 크기 및 결정질 형태에 의존할 수 있는 용해 속도에 의존한다. 택일적으로, 비경구적으로 투여된 약물 제형의 흡수를 연장시키기 위해서, 오일 비히클 내에 약물을 용해 또는 현탁시킬 수 있다.

활성 화합물 외에도, 서스펜션은 현탁화제, 예를 들면, 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스터, 미세결정화성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가르-아가르, 트라가칸스, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.

불활성 희석제 외에, 제제 조성물은 또한, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 및 방향제(perfuming agent)와 같은 애쥬번트를 포함할 수 있다.

활성 화합물은 또한, 필요에 따라, 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로 또는 나노 캡슐화 형태일 수 있다.

주사용 데포 형태는, 폴리엑티드-폴리글리콜리드와 같은 생물분해성 폴리머에 약물의 마이크로 캡슐화된 모체(matrix)를 형성하여 만들어진다. 폴리머에 대한 약물의 비와 사용되는 특정 폴리머의 성질에 의존하는 경우, 약물 방출 속도를 통제할 수 있다. 기타 생물분해성 폴리머의 예에는, 폴리(오르토에스터) 및 폴리(언하이드라이드)가 포함된다. 데포 주사용 제제는 또한, 생체 조직과 융화되는 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 약물을 넣어 제조된다.

주사용 제제는, 예를 들면, 사용 직전에 살균수 또는 기타 살균 주사용 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 살균 고체 조성물의 형태로 살균제를 넣거나 박테리아 보유 필터(bacterial-retaining filter)를 통해 여과하여 살균할 수 있다. 주사용 제제, 예를 들면, 살균 주사용 수성 또는 유성 서스펜션은 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 방법에 따라 조제될 수 있다. 살균 주사용 제제 1,3-부탄디올 내 용액과 같은 비독성, 비경구적으로 허용되는 희석액 또는 용매에서의 살균 주사용 용액, 서스펜션 또는 에멀젼일 수 있다. 허용되는 비히클 및 용매 가운데, 링거 용액(Ringer's solution), U.S.P. 및 등장의 소듐 클로라이드 용액이 사용될 수 있다. 또한, 살균, 고정유는 통상적으로 용매 또는 현탁성 매질로서 사용된다. 이러한 목적으로, 합성 모노 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 무미의(bland) 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사용 제제에 사용된다.

비경구적(피하, 피내, 근육내, 정맥내 및 관절내 포함) 투여용 제제는, 의도하는 수용기관(recipient)의 혈액과 등장의 제제가 되도록 하는, 항산화제, 버퍼, 정균제(bacteriostat) 및 용질을 함유할 수 있는, 수성 및 비수성 살균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는, 수성 및 비수성 살균 서스펜션을 포함한다. 제제는 봉인된 앰플 및 바이알과 같은 단위 용량 또는 복수 용량의 컨테이너에 존재할 수 있고, 사용 직전, 단지, 살린, 주사용 증류수와 같은 살균액 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태(lyophilize)로 저장될 수 있다. 즉석의(extemporaneous) 주사 용액 및 서스펜션은 상술한 종류의 살균 파우더, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 조제의 다른 방법은 본원에서 설명된 화합물을 수성 용해도를 증강시킨 폴리머에 결합시키는 것과 관련된다. 적절한 폴리머의 예예는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-(d-글루탐산), 폴리-(l-글루탐산), 폴리-(l-글루탐산), 폴리-(d-아스파르틱산), 폴리-(l-아스파르틱산), 폴리-(l-아스파르틱산) 및 이들의 코폴리머를 포함하나, 이에 한하지 않는다. 폴리글루탐산의 분자량은 약 5,000 내지 약 100,000 을 갖는 것이 바람직하고, 약 20,000 내지 80,000 인 것이 보다 바람직하며, 약 30,000 내지 60,000 인 것이 가장 바람직하다. 상기 폴리머는 본질적으로 본원에 참조로 인용되는 미국특허 5,977,163호에 설명된 프로토콜을 사용하여, 발명의 에포틸론의 하나 이상의 히드록실기에 에스터 결합을 통해, 결합된다. 바람직한 결합 부위는 본 발명의 21-히드록시-유도체의 경우에 21번 탄소의 히드록실기 이탈이 포함된다. 기타 결합 부위는 3번 탄소 및/또는 7번 탄소의 히드록실기 이탈이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

다른 조제 방법에 있어서, 본 발명의 화합물은 단일클론 항체에 결합될 수 있다. 이러한 전략은 본 발명의 화합물의 타겟을 특정 타겟으로 하게 한다. 결합된 항체의 디자인 및 사용에 대한 일반적인 프로토콜은 "Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer" (by Michael L. Grossbard, ed. (1998))에 기술되어 있다.

본 발명의 화합물을 임의의 적절한 투여 루트, 예를 들면, 경구적, 비경구적, 정맥내, 피내, 근육내, 피하, 설하, 경피적, 기관지, 인후, 비강내, 크림 또는 연고와 같이 국부적, 직장, 관절내, 낭내, 수강내, 질내, 복강내, 안구내, 흡입으로, 볼 또는 구강 또는 비강 스프레이로서, 투여할 수 있다. 그러나, 투여 루트는 당뇨병성 혈관 질환 또는 안염증(ocular inflammation)의 상태 및 심각성에 따라 변할 수 있다. 숙주 또는 환자에 투여되는 정확한 화합물의 양은 이를 수행하는 의사의 임무일 것이다. 그러나, 사용되는 용량은, 환자의 연령, 성별, 치료되는 정확한 질병, 및 그 심각성 등을 포함하는 많은 요소에 의존될 것이다.

단일 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 결합할 수 있는 활성 화합물의 양은, 치료되는 대상 및 특정의 투여 방식에 따라 변할 것이다. 예를 들면, 정맥내의 용도를 위한 제제는, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 바람직하게 약 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 보다 바람직하게 약 10 mg/mL의 본 발명의 화합물의 양을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 있어서, 전형적인 용량 범위는 1일당 약 0.001 mg/kg 내지 1일당 약 2500 mg/kg이다. 바람직하게, 용량의 범위는 1일당 약 0.1 mg/kg 내지 1일당 약 1000 mg/kg이다. 보다 바람직하게, 용량의 범위는 1일당 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg, kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg 및 이 범위에서 주어진 임의의 두 값의 사이를 포함하여, 1일당 약 0.1 mg/kg 내지 1일당 약 500 mg/kg이다. 인간에 대한 용량의 범위는 일반적으로 1일당 약 0.005 mg 내지 100 g이다. 택일적으로, 본 발명에 따른 용량 범위는, 본 발명의 화합물의 혈액 혈청 수준인 약 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게 약 0.1 μM 내지 약 100 μM이다. 본 발명에 따른 혈액 혈청 수준의 적당한 값은, 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 0.5 μM, 약 1 μM, 약 5 μM, 약 10 μM, 약 15 μM, 약 20 μM, 약 25 μM, 약 30 μM, 약 35 μM, 약 40 μM, 약 45 μM, 약 50 μM, 약 55 μM, 약 60 μM, 약 65 μM, 약 70 μM, 약 75 μM, 약 80 μM, 약 85 μM, 약 90 μM, 약 95 μM 및 약 100 μM, 그리고 상기의 임의의 두 값의 범위에 포함되는 임의 혈액 혈청 수준(예: 약 10 μM 내지 약 60 μM)을 포함하나, 이에 한하지 않는다.

정제 또는 개별 단위로 제공되는 용량 제시방법의 다른 형태는, 편리하게 이러한 용량 범위, 또는 이들 범위 사이의 범위에서 효과적일 수 있는, 본 발명의 하나 이상의 화합물의 양을 함유한다.

본 발명의 화합물 및 제제는 업계에 공지된 임의의 표준 제형; 고체 제형, 준고체 제형, 또는 액체 제형, 뿐만 아니라, 이들 각 형태의 하위카테고리의 형태로 투여될 수 있다.

경구 투여용 고체 제형에는 캡슐제, 카플렛제, 정제, 환제, 분말제, 드롭제(lozenge) 및 과립제가 포함된다. 이러한 고체 제형에 있어서, 활성 화합물은, 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 최소 하나의 불활성, 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체 및/또는 a) 녹말, 락토오스, 수크로오스, 글루코스, 만니톨, 및 살리실산과 같은 필러 또는 증량제; b) 카복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 겔라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로오스, 및 아카시아와 같은 바인더; c) 글리세롤과 같은 보습제; d) 아가르-아가르, 칼슘 카보네이트, 포테이토 또는 타피오카 녹말, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카보네이트와 같은 붕괴제; e) 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; h) 카올린 및 벤토나이트 클래이와 같은 흡수제; 및 i) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트와 같은 윤활제, 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캅셀제, 정제 및 환제의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.

유사한 타입의 고체 조성물은 또한, 락토오스 또는 밀크 슈가와 같은 부형제 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여, 소프트 및 하드 충전 겔라틴 캡슐에서 필러로 사용될 수 있다.

정제, 캅셀제, 환제 및 과립제의 고체 제형은, 약제학적 조제 분야에 주지된 장 코팅 및 기타 코팅과 같은, 코팅 및 껍질로 제조될 수 있다. 그것들은 임의로 유백제(opacifying agent)를 함유할 수 있고, 또한, 활성 화합물(들)만을 방출하거나, 바람직하게, 장관(intestinal tract)에서 지연된 방식으로 방출하는 조성물이 될 수 있다. 사용될 수 있는 포매(embedding) 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스를 포함한다.

정제는 임의로 하나 이상의 부속 화합물(accessory compound)과 함께, 압축 또는 몰딩에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는, 분말제 또는 과립제와 같은 자유유동성(free-flowing) 형태의 활성 화합물을, 임의로 바인더, 윤활제, 불활성 희석액, 윤활성, 표면 활성 또는 분산제와 혼합하여, 적당한 기계에서 압축하여 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는, 불활성 액체 희석액으로 적셔진 분말형 화합물의 혼합물을 적당한 기계에서 몰딩하여 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅되거나 자국(scored)을 낼 수 있고, 안에서 활성 화합물의 느린 방출 또는 제어 방출을 제공하기 위해 조제될 수 있다.

직장 또는 질 투여용 조성물은 바람직하게, 본 발명의 화합물을, 주변 온도에서는 고체이지만 체온에서는 액체가 되어, 직장 또는 질 공동(cavity)에서 녹아 활성 화합물을 방출시키는, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 같은 적절한 비자격성 부형제(non-irritating excipient) 또는 담체와 혼합하여 제조될 수 있는 좌약이다.

준액체(semi-liquid) 제형은, 구조적으로 매우 부드러워 고체라고 할 수 없지만, 액체로 간주하기에는 점도가 높은 제형을 포함한다. 여기에는 본 발명의 활성 화합물을 함유하는, 크림, 페이스트, 연고, 젤, 로션, 및 기타 준고체 에멀젼이 포함된다.

경구 투여용 액체 제형은, 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 서스펜션, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물에 추가적으로, 액체 제형은, 업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석액, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 용해제 및 유화제, 이를 테면, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면실, 그라운드넛트, 옥수수, 싹(germ), 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로퍼퓨릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이들의 혼합물 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물을 함유하는 제제는, 경피 패치와 같은 기구로 피부를 통하여 투여될 수 있다. 패치는 폴리아크릴아미드, 폴리실록산과 같은 모체, 또는 물질이 피부에 흡수되는 속도를 제어하기 위한 적당한 폴리머로부터 만들어진 반투과성 멤브레인과 함께로부터 만들어질 수 있다. 기타 적절한 경피 패치 제제 및 구성에 대해서는, 미국특허 5,296,222 호 및 5,271,940 호, 또한, Satas, D., et al, "Handbook of Pressure Sensitive Adhesive Technology, 2nd Ed.", Van Nostrand Reinhold, 1989: Chapter 25, pp. 627-642 에 설명되어 있다.

분말제 및 스프레이는, 본 발명의 화합물에 추가적으로, 락토오스, 탈크, 실리식산, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 파우더와 같은 부형제, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본과 같은 통상적인 추진제를 함유할 수 있다. 이러한 부형제들은, 예를 들어, "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed.", A.H. Kibbe, Ed. (American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, Washington, DC, 2000)에 설명되어 있고, 이들 내용은 모두 본원에 참조로 인용된다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 활성 화합물은, 생체로부터의 빠른 제거 또는 빠른 방출에 대하여 화합물을 보호하기 위한(이를 테면, 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제제) 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터, 및 폴릴아세트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명백하다.

도 1은 일시적 또는 지속적 국소적 허혈 현상에 따른 C57B1/6 마우스에서, NMDA 수용체 길항제의 선택과 대조 치료에 있어서의 조직 경색 체적 감소에 대한 pH 6.9 대 7.6 에서 생체외 효능 상승 비교 그래프이다. 약물은 뇌실내로 적용하거나(ICV; 0.5 mM의 1 마이크로리터; 정방형 고체) 복강내 주입하였다(IP, 원형 고체; NP93-4, 30 mg/kg; NP93-5, 10-30 mg/kg; NP93-40, 10-30 mg/kg; NP93-8, 30 mg/kg; NP93-31, 3 mg/kg). 에러바는 SEM이다. 약물 처리된 동물군 내 경색 체적을 직접 측정하고, 비히클 주입된 대조군 마우스 내 경색 체적을 퍼센트로 나타내었다. 오픈 심볼은 문헌에 기술된 CNSl 102 (CN, 압티가넬 또는 Cerestat, Dawson et al., 2001), 덱스트로메토르판(DM, Steinberg et al., 1995), 덱스트로판(DX; Steinberg et al., 1995), 레보메토르판(LM; Steinberg et al., 1995), (S) 케타민(KT; Proescholdt et al., 2001), 메만틴(MM; Culmsee et al. 2004), 이펜프로딜(IF, Dawson et al. 2001), CP101,606 (CP; Yang et al. 2003), AP7 (Swan and Meldrum, 1990), 셀포텔(CGS19755, Dawson et al., 2001), (R)HA966 (HA; Dawson et al., 2001), 레마세미드(RE, Dawson et al., 2001), 할로페리돌(O'Neill et al., 1998), 7-Cl-키뉴렌산(CK, Wood et al., 1992) 및 MK801 (+MK or -MK; Dravid et al.)의 입체이성질체의 투여에 의한 경색 체적의 감소를 나타낸다. 경색에서 감소 퍼센트는, 뉴런 밀도에서 감소 퍼센트를 측정하기 위해, 케타민을 제외한 모든 화합물에 대해 경색 체적의 비율로부터 계산하였다. 이펜프로딜 및 CP101,606에 대한 pH 상승은 문헌(Mott et al., 1998)으로부터 결정하였다. 경쟁적 길항제를 제외한 모든 다른 화합물에 있어서 pH 6.9 대 7.6 에서 NMDA 수용체를 함유하는 NR1/NR2B의 억제에 대한 효능 상승을 본원에서 설명한 대로 계산하였고, 이를 2 실험에서 평가하였다(하기 표 3 참조). 회색 음영에 속하는 약물들은 생체내 안전성과 효율성을 잠재하는 우수한 것들이다.
도 2는 테스트 약물을 뇌실내로 적용한 경우(ICV; 정방형 고체), 조직 경색 체적 보호에 대한 pH 6.9 대 7.6 에서 선택된 화합물의 생체외 효능 향상을 비교한 그래프이다. 회색 음영은 우수한 약물 작용에 대한 기준의 확인된 경계를 나타내는 영역이다.
도 3은 테스트 약물을 복강내 주입으로 적용한 경우(IP; 원형 고체), 조직 경색 체적 보호에 대한 pH 6.9 대 7.6 에서 선택된 화합물의 생체외 효능 향상을 비교한 것이다. 회색 음영은 우수한 약물 작용에 대한 기준의 확인된 경계를 나타내는 영역이다.
도 4는 선택된 화합물의 조직 경색 체적에 대한 pH 6.9 대 7.6 에서 생체외 효능 향상을 비교한 것이다. 회색 음영은 우수한 약물 작용에 대한 기준의 확인된 경계를 나타내는 영역이다. 오른쪽 패널은 NR1/NR2A 에 대한 비교이고, 왼쪽 패널은 NR1/NR2B 에 대한 비교를 나타낸다.
도 5는 1시간 순화 후, 2시간 주기 동안 컴퓨터로 카운트되는 광선 단락(break)으로서 정량화된, 랫트의 운동 활성(locomotor activity)에 대한 화합물 93-31 및 (+)MK-801 의 효과를 나타낸다. 운동 활성 지수는 시행중 광선 단락의 총 수를 1000으로 나눈 것이다.
도 6은 신경병성 통증의 동물 모델에서 실질적인 이질통(allodynia)을 나타내는 손상된 포우(paw)를 도시하고 있다. 비히클 군의 동물들은 전체 연구 기간 동안 주목할 만한 기계적인 이질통을 나타내었다. 도시된 것은 비히클 처리된 동물의 손상된 포우 및 일반 포우에서 평균 ± SEM (n = 10) 본 프레이 역치(von Frey threshold)이다. 포우 간 차이가 모든 시점에서 눈에 띈다(Mann- Whitney 테스트).
도 7은 화합물 93-31(i.p. 투여)가 일반 포우에 영향이 전혀 없음을 보여준다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-31 처리된 동물의 일반 포우에서 평균 ± SEM (n = 10 - 12) 본 프레이 역치이다.
도 8은 화합물 93-97 (i.p.)가 일반 포우에 영향이 전혀 없음을 보여준다. NeurOp 93-97 은 일반 포우에서 본 프레이 역치가 변하지 않는다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-97 처리된 동물의 일반 포우에서 평균 ± SEM (n = 10 - 12) 본 프레이 역치이다.
도 9는 i.p. 투여된 화합물 93-31 (100 mg/kg)이 랫트의 척수 신경 결찰(SNL) 모델에서 기계적인 이질통을 경감시킨다는 것을 나타낸다. 화합물 93-31 (100 mg/kg i.p.)으로 처리한 것은 투여 후 30분 및 60분에서 눈에 띄는 진통을 발생시켰다. 연구된 임의의 시점에서 30 mg/kg 의 화합물 93-31과 30 및 100 mg/kg 의 93-97 은 진통 효과가 없었다. 본 연구에서, 비히클 군의 통계적 분석은 기준선과 60, 120, 240분 시점 사이의 눈에 띄는 차이가 없음을 나타내었다(Friedman two-way ANOVA).
도 10은 i.p. 투여된 화합물 93-31 (100 mg/kg)이 SNL 랫트의 기계적인 이질통을 경감시킨다는 것을 보여준다. 화합물 93-31 테스트 화합물의 I.P. 투여는 기계적인 이질통을 감소시켰다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴(기준 화합물) 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-31 처리된 동물의 손상된 포우에서 평균 ± SEM (n = 10 - 12) 본 프레이 역치이다. 포스트-호크 분석(Dunn 테스트)은 30분 및 60분에서 화합물 93-31(100 mg/kg )과 비히클 군 사이에 눈에 띄는 페어와이즈(pair-wise) 차이를 보였다. 또한 60, 120 및 240분에서 가바펜틴의 효과가 눈에 띄었다(각각 p < 0.001, p < 0.01, 및 p < 0.01).
도 11은 설치류 척수 신경 결찰 모델에 있어서 통증 역치의 배수 증가에 대한 pH 6.9 대 7.6 에서 생체외 효능 상승을 비교한 것이다. 본원에서 설명한 각 화합물에 대하여 효능 상승을 결정하였다. 화합물 93-31의 투여 후 통증 역치를 측정하였다. 통증 역치 값은 종래에 IF (ifenprodil, De Vry et al, Eur J Pharmacol 491:137-148, 2004), K (ketamine, Chaplan et al. JPET 280:829-838 1997), CP (CPlOl, 606, Boyce et al. Neduropharmacol 38:611-623, 1999), MK (MK801, Chaplan et al. JPET 280:829-838 1997), D (dextrorphan, Chaplan et al. JPET 280:829-838 1997), DM (dextromethorphan, Chaplan et al. JPET 280:829-838 1997), 및 M (memantine, Chaplan et al. JPET 280:829-838 1997)에 대하여 보고되었다. 회색 음영은 우수한 약물 작용에 대한 기준의 확인된 경계를 나타내는 영역이다.
실시예
하기 실시예들은 설명을 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 이들로 제한하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: NMDA 수용체 대 기타 글루타메이트 수용체에 대한 화합물 93-4의 선택성
화합물 93-4 시리즈는, AMPA 수용체 및 카이네이트 수용체 서브유닛으로 주입된 Xenopus oocyte에 대한 효과가 결핍되어 NMDA 수용체에 대해 선택적인 것으로 나타났다. 글루타메이트 또는 도모에이트(domoate) 유도 전류 기록을, 2 전극 전압 클램프, 및 길항제(AMPA 수용체에 대해 글루타메이트, 카이네이트 수용체에 대해 도모에이트)와 함께 투여된 3μM의 화합물 93-4을 사용하여 수행하였다. 화합물 93-4가 AMPA 및 카이네이트 수용체를 억제하지 않는다는 것을 나타내는, 길항제 유도 반응의 감소가 관찰되지 않았다. 또한, 수용체가 NR1/NR2B 서브유닛으로 구성되고, NR1/NR2A 또는 NR1/NR2D 수용체를 포함하지 않는 경우, 3μM의 화합물 93-4이 NMDA 수용체 중개 전류(mediated current)의 억제에 효과적이었다.
실시예 2: 랫트의 운동 활성에 대한 93 시리즈 화합물의 효과
광선 단락으로 운동 활성을 수량화시키기 위해, 100-150 gm 스프라게-돌리(Sprague-Dawley) 랫트를, 광학 모니터가 장착된 활성 박스에서 1시간 순화 후, 각종 용량의 93-4, 93-5, 93-8, 93-31, 93-40, 93-41로 IP 주입하였다. 주입 후, 2시간 동안 운동 활성을 모니터링하였다. MK801의 입체이성질체 둘다를 양성 대조군으로 사용하였다. (+)MK801 은, 초기 운동 활성의 증가에 이어 운동실조(ataxia)를반영한 감소를 나타내어, 운동 활성에 대한 정형화된 이상효과(biphasic effect)를 나타내었다. 데이터는 (-)MK801이 (+)MK801보다, 비히클 주입된 대조 동물군에 비해 운동 활성의 유발을 일으킨 점에서, 효능이 최소 10배 감소한다는 것을 나타내었다. 또한, 3-300 mg/kg 93-4, 3-300 mg/kg 93-5, 30-300 mg/kg의 93-8, 3-300 mg/kg의 93-31 (도 5), 30 mg/kg의 93-40, 및 30-300 mg/kg의 93-41은 운동 활성에 눈에 띄는 효과가 없었다. 신경보호성인 것으로 알려진 93 시리즈 화합물의 용량은 운동 활성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 3: Xenopus oocyte 에서 pH 의존성 효능 시프트의 결정
Xenopus oocyte에서 NMDA 수용체의 발현.
cRNA는 제조업자의 명세서(Ambion:)에 따라, NMDA 수용체 서브유닛(NR1-1a, NR2B, NR2A)에 대한 선형 주형(linearized template) cDNA로부터 합성하였다. 사용한 cDNA는 GenBank 번호 U08261 및 U11418 (NR1-1a), AF001423 및 CD13211 (NR2A), U11419 (NR2B)에 해당되었다. 간단하게, cDNA를 코드 영역의 적절한 제한 효소 다운스트림(downstream)으로 선형화하고, 정제하여, RNA 중합효소 및 적절한 농도의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 배양하였다. 생체외 전사 cRNA를 표준 방법으로 정제하였다. 합성된 cRNA의 퀄리티를 겔 전기영동으로 평가하고, 수량을 분광기 및 겔 전기영동으로 평가하였다. 스테이지 V 및 VI 난모세포를 거대 난소로부터 제거하고, 잘 배양하여, 건강한 Xenopus laevis를 3-아미노-벤조산 에틸 에스터(1 gm/l)로 마취하였다. 난모세포의 클러스터(cluster)를, 292 U/ml Worthington (Freehold, NJ) 타입 IV 콜라겐아제 또는 1.3 mg/ml 콜라겐아제(Life Technologies, Gaithersburg, MD; 17018-029)로, 115 NaCl, 2.5 KCl, 및 10 HEPES, pH 7.5(단위: mM)로 구성된 Ca²⁺-유리 용액에서 2시간 동안, 여포 세포층을 제거하기 위해 천천히 교반하면서 배양하였다. 그 후, 난모세포를 1.8 mM CaCl₂로 보충된 동일한 용액에서 광범위하게 세척하고, 88 NaCl, 1 KCl, 24 NaHCO₃, 10 HEPES, 0.82 MgSO₄ , 0.33 Ca(NO₃)₂, 및 0.91 CaCl₂ (단위: mM)로 구성되고, 100 ug/ml 겐타마이신, 40 ug/ml 스트렙토마이신, 및 50 ug/ml 페니실린으로 보충된 바스(Barth's) 용액에서 유지하였다. 난모세포를 수동식으로 모낭제거시키고(defolliculate), 24시간의 이탈내에, 50 nl 부피내 5 ng의 NRl 서브유닛 및 10 ng의 NR2 서브유닛으로 주입시키고, 바스 용액에서, 18℃, 3-7일간 배양시켰다. 글래스 주입 피펫의 팁 사이즈는 10-20마이크론이었고, 뒤를 광유로 채웠다.
테스트용 pH 의존성 NMDA 수용체 길항제의 제조.
NMDA 수용체 길항제를 전형적으로 100% DMSO 내 20 mM 용액으로 만들고, -20℃에 저장하였다. 이 모액(stock solution)을 모두 100% DMSO 내에서, 순차적으로 2 mM, 0.2 mM, 및 0.02 mM(1/10 v/v)로 희석시켰다. 그 후, 이 모액을, 90 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM HEPES, 0.5 mM BaCl₂, 10 uM EDTA, 100 uM 글루타메이트, 50 uM 글리신(필요에 따라, NaOH 또는 HCl로 조정된 pH 6.9 또는 7.6)로 구성된 작업 용액(working solution) 내에서, 적당한 농도 범위로 희석시켰다. 테스트한 약물의 농도는 0.01, 0.03 마이크로몰(0.02 mM 모액(stock)을 적당한 부피로 희석), 0.1, 0.3 마이크로몰(0.2 mM 모액을 적당한 부피로 희석), 1, 3 마이크로몰(2 mM 모액을 적당한 부피로 희석), 및/또는 10, 30, 100 마이크로몰(20 mM 모액을 적당한 부피로 희석)이었다.
Xenopus oocyte로부터 전압-클램프 기록.
2 전극 전압 클램프 기록을 주입 후 2-7일 작성하였다. 난모세포를 이중궤도 플레시글래스 기록 체임버(dual-track plexiglass recording chamber)에, Y 배열(Y configuration)에서 분할하는 단일 살포선(single perfusion line)과 함께, 두개의 난모세포를 살포하기 위해, 놓아두었다. 이중 기록(dual recording)을 실온에서 2-Warner OC725B 2-전극 전압 클램프 증폭기를, 제조자가 추천한대로 배열하고 사용하여 실시하였다. 글래스 마이크로 전극(1-10 메가옴)을 300 mM KCl (전압 전극) 또는 3 M KCl (전류 전극)으로 채웠다. 배스 클램프는 기록 체임버의 각 측면으로 놓여진 실버 클로라이드 전선를 통해 연결하였고, 둘 다 0 mV의 기준 퍼텐셜에 있는 것으로 가정하였다. 난모세포를 90 NaCl, 1 KCl, 10 HEPES, 및 0.5 BaCl₂(단위: mM), pH 7.3로 구성된 용액으로 살포하고, -40 mV에서 유지시켰다. 글루타메이트(100 마이크로몰) 및 글리신(50 마이크로몰)의 대조 응용군에 대한 최종 농도를, 각각 100 mM 및 30 mM 모액으로부터 적당한 부피를 첨가하여 수행하였다. 추가적으로, 10 mM EDTA의 1:1000 희석액을 첨가하여, 10 마이크로몰의 최종 EDTA를, Zn²⁺와 같은 2가 이온 오염물질을 착물화하기 위해, 수득하였다. 외부 pH를 6.9 또는 7.6으로 조정하였다. 연속 방식 최대(successive fashion maximal) 글루타메이트 및 글리신에 적용하여 용량 반응 곡선을 얻은 후, 글루타메이트/글리신에 다양한 농도의 길항제를 더했다. 4 내지 6 농도로 구성된 용량 반응 곡선을 이러한 방식으로 얻었다. 기록 및 누설 전류에서 임의의 변화에 대해 선형적으로 수정된 완전한 기록(full recording)의 전후, -40 mV에서 기준치 누설 전류(baseline leak current)를 측정하였다. pH 7.6에서 100 nA 또는 pH 6.9에서 50 nA보다 작은, 글루타메이트 유발성 반응을 갖는 난모세포는 포함되지 않았다. 적용된 길항제에 의한 억제 수준을, 초기 글루타메이트 반응의 퍼센트로서 나타내었고, 단일 개구리로부터의 난모세포 전반에 걸쳐 평균화하였다.각 실험은 단일 개구리로부터 얻은 3 내지 10 난모세포의 각 pH에서의 기록들을 포함하였다. 4 내지 8 길항제 농도 각각에서 평균 퍼센트 반응을 계산식, (100-min)/(1+([conc]/IC₅₀)^nH)+min으로 조정하였고, 여기에서, min은 포화 길항제에서 잔류 퍼센트 반응이고, IC₅₀은 달성가능한 억제의 반을 일으키는 길항제의 농도이며, nH는 억제 곡선의 가파름을 나타내는 기울기 인자이다. min은 0과 같거나 큰 것으로 한정될 수 있다. 공지된 채널 차단제로 한 실험에 있어서 min은 0으로 셋팅할 수 있다. pH 7.6 및 6.9에서 얻은 IC₅₀ 값은 IC₅₀에서 평균 시프트를 결정하기 위해 비율 및 함께 평균화한 것으로 나타내었다.
실시예 4: 일시적인 국소 허혈의 생체내 모델에서 신경방호작용의 결정
일시적인 국소 허혈
일시적인 국소 허혈을, 모노필라멘트 봉합으로, 관강내 중대뇌 동맥(MCA) 폐색에 의해 유발시켰다. 간단하게, 수컷 C57BL/6 마우스(3-5월령, The Jackson Laboratory)을 98% O2내 2% 이소플루란으로 마취시켰다. 직장 온도는 항온성 블랜킷으로, 37℃로 제어했다. 국부적 대뇌 혈류에서의 상대적 변화를 레이저 도플러 플로우미터(Perimed)로 모니터링하였다. 이를 행하기 위해, 프로브를, 브레그마의 2 mm 후부 및 4-6 mm 측면으로, 두개골에 직접 고정시켰다. 팁 둥근 플레임(tip flame-rounded)이 있는 11-mm 5-0 더말론 또는 룩(Dermalon or Look)(SP185) 검은 나일론 비흡수성 봉합을 좌측 내부 경동맥으로, 모니터링된 혈류가 멈출 때까지(10.5-11 mm의 봉합) 외부 경동맥 스텀프를 통하여 도입하였다. MCA 폐색 30분 후, 봉합을 해제시켜 혈류를 복구시켰다. 24시간 생존 후, 뇌를 제거하고 2 mm 절편으로 잘랐다. 상해(lesion)를 PBS 내 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 37℃에서 20분간 식별하였다. 각 절편의 경색 영역을 NIH IMAGE(Scion Corporation, Beta 4.0.2 방출)로 측정하고, 절편 두께로 곱하여 각 절편의 경색 체적을 구하였다. NIH IMAGE 내 밀도 슬라이스 옵션(density slice option)을 사용하여, 반대쪽의 비손상 피질에서의 70% 또는 75%로서 결정된 강도에 기초한 이미지를 분할하였다. 이러한 기준은 분석 전반에 걸쳐, 모든 동물군에서 유지시켰고, 단지 이러한 세기에서의 목적을 영역 측정에 대해 강조시켰다. TTC 염료에서 전자적으로 식별된 역치의 감소에 의해 식별된 것으로서, 상해의 영역을 직접 윤곽으로 나타내었다. 반대측 대 동측 반구 절편 체적의 비를, 부종을 교정하기 위해 상응하는 경색 절편 체적으로 곱했다. 경색체적을, 모든 절편에 대하여 경색 영역 횟수 절편 두께를 합계하여 결정하였다. 각 측정에 최소 12 동물군을 포함시켰다. 어떠한 실험에 대해서, 손상의 영역을, 감소된 염료의 영역을 자유재량으로 서클링하여, 직접 측정하였다. 두 과정에서 동일한 결과를 얻었다.
pH 의존성 NMDA 수용체 길항제의 복강내 투여.
C57Bl/6 마우스에, MCA 폐색술 30분 전, 93-4, 93-5, 93-8, 93-31, 93-40을 복강내(IP) 투여하였다. 50% DMSO 내 30 mg/ml 모액을, 30 mg의 화합물을 0.5 ml의 DMSO에 첨가한 후, 0.5 ml의 0.9% 살린을 휘저으며 첨가하여, 제조하였다.
IP 주사 용액에 대한 작업 용액은 0.9% 살린 내 3 mg/ml(50% v/v DMSO)이었고, 0.2 ml의 모액을 새로운 튜브로 이동시키고, 0.9 ml의 DMSO 및 0.9 ml의 0.9% 살린을 휘저으며 첨가하여 제조하였다. 3-30 mg/kg 최종 용량을, 동물의 체중 및 원하는 용량에 의존하여 변화시킨 주사 부피로, 마우스에 투여하였다.
pH 의존성 NMDA 수용체 길항제의 뇌실내 투여.
실험의 분리 셋팅에서, 마우스에, 수술에 앞서, NMDA 길항제(93-5, 93-97, 93-31, 93-41, 93-43) 또는 적절한 비히클을 작은 부피로 뇌실내(ICV) 주사하였다. 초기에 100% DMSO 내 20 mM 모액을 모든 약물에 대해 제조하였다. 이 모액 5 마이크로리터를 새로운 튜브로 옮기고, 45 마이크로리터의 DMSO를 약물 93-41, 93-43에 대하여 휘저으며 첨가하였다. 그 후, 150 마이크로리터의 포스페이트 완충 살린(PBS, 0.9% NaCl, pH 7.4, Sigma 1000-3)을 첨가하여, 25% (v/v) DMSO 내 0.5 mM 약물 용액을 얻었다. 다른 모든 약물에 대해서, 5 마이크로리터의 20 mM DMSO 모액을 새로운 튜브로 옮기고, 15 ul의 DMSO를 휘저으며 첨가하였다. 이 용액에 180 마이크로리터의 PBS를 첨가하여 10% v/v DMSO 내 0.5 mM의 작업 용액을 얻었다. 비히클에 대해서, DMSO를 DMSO 내 20 mM 약물로 교체하였다. MCA 폐색술 30분 전에 수컷 C57BL/6 마우스(3-5월령, The Jackson Laboratory)의 우측 뇌실내(브레그마의 2 mm 후부 및 1 mm 측면, 3 mm 니들 삽입)로, 모두 ICV 주사를 수행하였다. MCA 폐색술 후 24시간에 마우스를 죽이고, 병변(lesion)을 식별하여, 상기와 같이 분석하였다. 지주막하출혈의 마우스를, 두개골 기저에서 ~1 mm을 초과하여 혈액 응고 현상으로 식별하고, 배제시켰다.
결과
화합물 93-97, 93-43, 93-5, 93-41, 및 93-31
도 2에 화합물 93-97, 93-43, 93-5, 93-41, 및 93-31의 ICV 투여 후, 조직 경색 체적에 대한, pH 6.9 대 7.6에서 이들 화합물의 생체외 효능 상승의 비교를 나타내었다. 데이터는 비히클 주입된 대조군에 대해서 결정된 경색 체적 % 및 상술한 바와 같이 측정한 효능 상승을 나타낸다. 회색 음영 영역은, 우수한 약물 작용에 대하여, 기준으로부터 식별된 바운드를 정의하는 영역을 나타낸다. 바운드의 범위에 속하는 약물들은 회색 차단 영역에서 평균값(에러바 아닌)을 갖는 것들이다.
각 화합물에 대하여 상술한 바와 같은 일시적 국소 허혈 현상에 따른 C57Bl/6 마우스에서의 경색 체적을 측정하였다. 화합물 93-97, 93-43, 93-5, 93-41, 및 93-31을 상술한 바와 같이 뇌실내로 적용(ICV; 고체 서클)하였다. 에러바는 평균의 표준 오차(SEM)이다. 화합물 93-97, 93-43, 93-5, 93-41, 및 93-31에 대한 pH 6.9 대 7.6에서 효능 상승을, NR1/NR2B 수용체를 발현하는 난모세포에서 설명한 바와 같이 계산하였다.
화합물 93-4, 93-5, 93-8, 93-31, 93-40, (-)MK801 및 (+)MK801
도 3에 조직 경색 체적에 대한 pH 6.9 대 7.6에서 화합물 93-4, 93-5, 93-8, 93-31, 93-40의 생체외 효능 상승의 비교를 나타내었다. 데이터는, 대조 동물군에 주사한 비히클에서의 것을 퍼센트로 표현한 실제의 경색 체적을 나타내고, 효능 상승을 상술한 바와 같이 계산하였다. 회색 음영 영역은 우수한 약물 작용에 대하여, 기준으로부터 식별된 바운드를 정의하는 영역을 나타낸다. 바운드의 범위에 속하는 약물들은 회색 차단 영역에서 평균값(에러바 아닌)을 갖는 것들이다.
각 화합물에 대하여 상술한 바와 같은 일시적 국소 허혈 현상에 따른 C57Bl/6 마우스에서의 경색 체적을 측정하였다. 약물을 상술한 바와 같이 복강내 주사로 적용하였다. 에러바는 SEM이다. 경색 체적을, 짝지은 대조군(paired control)에 비교하여, IP 투여에 대한 경색 체적의 퍼센트 감소로부터 추측하였다. 이는, 독립된 실험 및 고체선(solid line)으로 나타난(단락선은 평균 대조 경색+-SEM을 나타냄), ICV 실험에 대한 평균 대조 경색 체적(mm³)에서 약물에 의해 유발된 대조 경색의 퍼센트로서 나타난, 경색 체적의 생성물로서 계산하였다. 화합물 93-4, 93-5, 93-8, 93-31, 93-40, (-)MK801 및 (+)MK801에 대한 pH 6.9 대 7.6에서 효능 상승을, NR1/NR2B 수용체를 발현하는 난모세포에서 설명한 바와 같이 계산하였다.
추가 화합물
도 4에 퍼센트 대조 조직 경색 체적에 대한 pH 6.9 대 7.6에서 공지 화합물의 NR1/NR2A 및 NR1/NR2B에서의 생체외 효능 상승의 비교를 나타내었다. 회색 음영 영역은 우수한 약물 작용에 대하여, 기준으로부터 식별된 바운드를 정의하는 영역을 나타낸다. 바운드의 범위에 속하는 약물들은 회색 차단 영역에서 평균값(에러바 아닌)을 갖는 것들이다.
오픈 심볼(open symbol)은, CNS 1102 (CN, 압티가넬 또는 Cerestat, Dawson et al., 2001), 덱스트로메토르판(DM, Steinberg et al., 1995), 덱스트로르판(DX; Steinberg et al., 1995), 레보메토르판(LM; Steinberg et al., 1995), (S)케타민(KT; Proescholdt et al., 2001), 메만틴(MM; Culmsee et al. 2004), 이펜프로딜(IF, Dawson et al. 2001), CP 101,606 (CP; Yang et al. 2003), AP7 (Swan 및 Meldrum, 1990), 셀포텔(CGS19755, Dawson et al., 2001), (R)HA966 (HA; Dawson et al., 2001), 레마세미드(RE, Dawson et al., 2001), 할로페리돌(O'Neill et al., 1998), 7-Cl-키뉴렌산(CK, Wood et al., 1992) MK801의 입체이성체(+MK 또는 -MK; Dravid et al., 제조)을 다양한 설치류 또는 토끼 허혈 모델에서 문헌에 설명된대로 투여함으로써, 경색 체적에 있어서의 감소를 나타낸다(하기 레퍼런스 참조). 경색의 퍼센트 감소는, 약물에 의한 신경 밀도의 퍼센트 감소를 측정하기 위해, 약물에서의 경색 체적 대 케타민 및 7-Cl-키뉴렌산을 제외한 모든 화합물에 대한 대조에 있어서의 경색 체적의 비로부터 계산하였다.
모든 화합물에 대한 pH 6.9 대 7.6에서 효능 상승을, NR1/NR2A 또는 NR1/NR2B 수용체를 발현하는 난모세포에서 상술한 바와 같이 계산하였다(실험 수의 요약에 대한 표 3 및 표 4 참조). 이펜프로딜(IF), CP 101,606에 대한 pH 상승을 문헌으로부터 결정하였다(Mott et al., 1998).
경색 체적에 관해 조사된 마우스의 수를 표 3에 나타내었다. NR1-1a/NR2B 수용체에서의 효능 상승 측정에 있어서, pH 6.9 및 pH 7.6의 단일 농도에서, 사용된 개구리의 수 및 테스트한 난모세포의 가장 큰 수를 표 3에 나타내었다. 각 pH에서 IC50의 결정에 있어서, 각 약물의 다양한 농도를 테스트하였다. NR1-1a/NR2A 수용체에서의 효능 상승 측정에 있어서, pH 6.9 및 pH 7.6의 단일 농도에서, 사용된 개구리의 수 및 테스트한 난모세포의 가장 큰 수를 표 4에 나타내었다.

도 1은 도 2, 3 및 4를 합성화하여 나타내었다. 이는 테스트된 24 화합물, 20 화합물(83%)의 것이 본 발명의 범위를 벗어나고(어두운 영역으로 표시됨), 테스트된 화합물의 80% 이상이, 생체내 치료에 우수한 식별된 표준을 만족하지 못한다는 것을 나타낸다. 회색 음영 영역은 우수한 약물 작용에 대하여, 기준으로부터 식별된 바운드를 정의하는 영역을 나타낸다. 바운드의 범위에 속하는 약물들은 회색 차단 영역에서 평균값(에러바 아닌)을 갖는 것들이다. 화합물 93-4, 93-5, 93-41, 93-31의 평균은 NR1/NR2B에 대한 어두운 영역에 속한다. (-)MK801 및 케타민의 평균은 NR1/NR2A에 대한 어두운 영역에 속한다(도 4).
특히, 도 1에서, 일시적 국소 허혈 현상 후, 심볼로 표시된 화합물들에 대하여 상술한 바와 같이, C57Bl/6 마우스에서 경색 체적을 측정하였다. 약물을 뇌실내(ICV; 정방형) 또는 복강내 주입에 의해 상술한 바와 같이, 적용하였다. 에러바는 SEM이다. 경색 체적을, 짝지은 대조군에 비해 IP 투여에 대하여 대조 경색 체적의 퍼센트로서 직접 측정하였다. 대조군은 고체선으로 나타났다(단락선은 평균 대조 경색 +/- SEM을 나타냄). 오픈 심볼은, CNS 1102 (CN, 압티가넬 또는 Cerestat, Dawson et al., 2001), 덱스트로메토르판(DM, Steinberg et al., 1995), 덱스트로르판(DX; Steinberg et al., 1995), 레보메토르판(LM; Steinberg et al., 1995), (S)케타민(KT; Proescholdt et al., 2001), 메만틴(MM; Culmsee et al. 2004), 이펜프로딜(IF, Dawson et al. 2001), CP 101,606 (CP; Yang et al. 2003), AP7 (Swan 및 Meldrum, 1990), 셀포텔(CGS19755, Dawson et al., 2001), (R)HA966 (HA; Dawson et al., 2001), 레마세미드(RE, Dawson et al., 2001), 할로페리돌(O'Neill et al., 1998), 7-Cl-키뉴렌산(CK, Wood et al., 1992) MK801의 입체이성체(+MK 또는 -MK; Dravid et al., 제조)을 다양한 설치류 또는 토끼 허혈 모델에서 문헌에 설명된대로 투여함으로써, 경색 체적에 있어서의 감소를 나타낸다(하기 레퍼런스 참조). 경색의 퍼센트 감소는, 약물에 의한 신경 밀도의 퍼센트 감소를 측정하기 위해, 약물에서의 경색 체적 대 케타민 및 7-Cl-키뉴렌산을 제외한 모든 화합물에 대한 대조에 있어서의 경색 체적의 비로부터 계산하였다.
또한, 도 1에서, 화합물 93-4, 93-5, 93-8, 93-31, 93-40, 93-43, 93-97, (+)MK801, (-)MK801, 및 다른 모든 화합물에 대한 pH 6.9 대 7.6에서 효능 상승을, 상술한 바와 같이, 표 1 및 2에 보고된 실험의 수로 계산하였다. 이펜프로딜(IF), CP 101,606(CP)에 대한 pH 상승을 문헌으로부터 결정하였다(Mott et al., 1998).
실시예 5: 신경병성 통증의 생체내 모델에서의 평가
방법
동물군: 시술 당일 100 ± 10g 및 테스트 당일 250 ± 10g으로 무게를 단 수컷 스프라구-돌리 랫트(Hsd:Sprague-Dawley^®TMSD^®TM, Harlan, Indianapolis, Indiana, U.S.A.)를 케이지 당 3마리를 넣어두었다. 동물군은 먹이와 물에 자유롭게 드나들게 하였고, 12:12시간 낮/밤 스케쥴을 유지시켰다. 동물 집단을 21℃, 60% 습도로 유지하였다. 모든 실험은 통증 연구에 관한 국제협회(International Association for the Study of Pain)의 가이드라인에 따라 수행하였고, 미네소타 동물 보호 대학(University of Minnesota Animal Care) 및 미국 협회의 승인을 얻었다.
약물 및 용량 용액: 약물을 증류수 내 1% v/v DMSO 및 66% v/v PEG 400에 용해시켰다. 화합물을 i.p. 루트로 투여하였다.
만성 신경병성 통증의 유발: 척수 신경 결찰(SNL) 모델(Kim and Chung 1992 Pain 50:355-63.)을 사용하여 만성 신경병성 통증을 유발시켰다. 동물군을 이소플루란으로 마취시키고, 좌측 L5 트랜스버스(transverse) 과정을 제거하여, L5 및 L6 척수 신경을 6-0 실크 봉합으로 타이트하게 결찰시켰다. 그리고 나서, 상처(wound)를 내부 봉합 및 외부 스테이플로 봉합하였다. 상처 클립을 시술 10일 후에 제거하였다.
기계적 이질통 테스트: 무해성 기계적 감도에 대한 기준선 및 치료 후 값을, 업-다운법(up-down method)(haplan, Bach et al. 1994 J Neurosci Methods 53: 55-63)에 따라, 다양한 스티프니스(stiffness)(0.4, 0.7, 1.2, 2.0, 3.6, 5.5, 8.5, 및 15 g)로 8 셈메스-바인슈타인 필라멘트(8 Semmes-Weinstein filament) (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)를 사용하여 평가하였다. 테스트 전에, 동물군을 천공 금속 플랫폼에 놓고, 최소 30분간 주변에 순응시켰다. 각 치료군에서, 각 동물에 대한 평균 및 평균에 대한 표준 오차(SEM)을 결정하였다. 이러한 자극은 일반적으로 고통스럽지 않다고 여겨지므로, 본 테스트에서, 반응성에 있어서의 충분한 손상 유도성 증가는 기계적 이질통의 척도로서 해석되었다.
실험 디자인: 약물 투여 전에, 본 프레이 기준선 측정을 각각 30분 및 24시간에서 하였다. 추가적인 본 프레이 측정을 30, 60, 120 및 240분에 수행하였다. 테스트에 대한 시각표(timeline)를 아래에 요약하였다. 실험군은: 비히클(증류수내 1% DMSO + 66% PEG 400, i.p., 4 ml/kg, n = 10)·30 mg/kg 화합물 93-31 테스트(i.p., 4 ml/kg, n = 10)·100 mg/kg 화합물 93-31 테스트(i.p., 4 ml/kg, n = 10)·30 mg/kg 화합물 93-97 테스트(i.p., 4 ml/kg, n = 10)·100 mg/kg 화합물 93-97 테스트(i.p., 4 ml/kg, n = 10)·100 mg/kg 가바펜틴(i.p., 4 ml/kg, n = 12)(총 랫트: 62)이었다.
실험 시각표

블라인딩 과정: 약물 용액을 행동 테스트를 수행하지 않는 다른 실험자에 의해 투여하였다.
데이터 분석: Prism™ 4.01(GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용하여, 통계적 분석을 행하였다. 손상된 포우의 기계적 이질통을, 비히클군내에서, 반대측 및 동측 포우에서 관찰된 값을 비교하여 결정하였다. 시간에 걸쳐 비히클군 손상된 포우 값의 안정성을, 순위에 의해 프리드맨 이원적 분산 분석(Friedman two-way analysis of variance)을 사용하여 테스트하였다. 각 시간 포인트에서 약물 효과를, 순위에 의해 크루스칼-왈리스 일원적 분산 분석(Kruskal-Wallis one-way analysis of variance)을 수행한 후, 던 포스트 호크 테스트(Dunn's post hoc test)에 의해 분석하였다.
결과
본 프레이 테스트
기계적 이질통의 테스트를 SNL 수술 14일 후, 개시하였다. 단일 약물 투여 후, 기준선(약물 투여 30분 전) 및 30, 60, 120 및 240분에, 손상(동측) 및 일반(반대측) 포우 모두에게서 테스트를 수행하였다.
기준선에서 모든 동물군은 손상된 포우에서 기계적 이질통을 나타내었다(표 2). 손상의 수준을 집단 사이에서 비교할 수 있었고, 손상된 포우의 본 프레이 역치 연구 전반에 걸쳐, 비히클 치료군의 일반 포우에서 관찰된 것과 상당히 달랐다(도 6). 도 6은, 비히클군에서의 동물은 연구 전체 기간 동안 눈에 띄는 기계적 이질통을 보였다는 것을 나타낸다. 도시된 것은 손상된 포우 및 비히클로 치료된 동물군의 일반 포우에서의 평균±SEM (n=10) 본 프레이 역치이다. 포우간의 차이는 모든 시간대에서 눈에 띄었다(Mann-Whitney 테스트). 화합물 93-31 및 93-97은 일반 포우에서 측정된 본 프레이 역치에 영향이 없었다(도 7 및 8). 도 7은 화합물 93-31이 일반 포우에서 본 프레이 역치를 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-31로 치료된 동물군의 일반 포우에서의 평균±SEM (n=10) 본 프레이 역치이다. 도 8은 화합물 93-97이 일반 포우에서 본 프레이 역치를 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-97로 치료된 동물군의 일반 포우에서의 평균±SEM (n=10) 본 프레이 역치이다.
표 2: - 손상된 포우 - 본 프레이 역치값

표 3: - 손상된 포우 - 통계적 분석 요약

화합물 93-31(100 mg/kg i.p.)로의 치료는, 투여 후 30분 및 60분에서 식별할 수 있는 진통(analgesia)을 발생시켰다(도 9). 도 9는 화합물 93-31(100 mg/kg)의 i.p. 투여가 기계적 이질통을 감소시킨다는 것은 나타낸다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴(참조 화합물) 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-31로 치료된 동물군의 손상된 포우에서의 평균±SEM (n=10-12) 본 프레이 역치이다. 포스트-호크 분석(Dunn 테스트)는 30분 및 60분에 화합물 93-31(100 mg/kg)과 비히클군 사이에 중요한 패어와이즈(pair-wise) 차이를 보였다(p<0.01). 60분, 120분 및 240분에서 가바펜틴의 효과 또한 두드러졌다(각각, p<0.001, p<0.01, p<0.01). 30 mg/kg의 화합물 93-31, 30 및 100 mg/kg의 화합물 93-97의 진통 효과는 연구한 어느 시점에서도 없었다. 본 연구에서 비히클군의 통계적 분석은, 기준선과 30, 60, 120 및 240분 시점 사이에 본 프레이 역치에 있어서, 눈에 띌만한 차이가 없었음을 나타내었다(Friedman two-way ANOVA).
추가적으로, i.p. 투여된 화합물 93-97은 SNL 랫트에서 기계적 이질통을 경감시키지 못했다. 도 10은 화합물 93-97(30 및 100 mg/kg)의 i.p. 투여가 본 프레이 역치에 영향이 없음을 보여준다. 도시된 것은 비히클, 가바펜틴(참조 화합물) 또는 i.p. 투여된 30 및 100 mg/kg 용량의 화합물 93-97로 치료된 동물군의 손상된 포우에서의 평균±SEM (n=10-12) 본 프레이 역치이다. 60분, 120분 및 240분에서 가바펜틴의 효과 또한 두드러졌다(각각, p<0.001, p<0.01, p<0.01).
본 연구에서 테스트된 동물군에서 어떠한 부작용이 관찰되었다(62 동물군 중 8). 관찰된 부작용은 라이딩(writhing) 및 스트레칭(stretching)이었다(8 관찰군). 이들 부작용은 i.p. 약물 투여 후, 처음 몇 분(~ 5분) 동안 가장 일반적으로 관찰되었다. 스트레칭/라이딩은, 비히클 i.p.로 치료된 동물군(3/10) 및 약물 용량에 의존성을 나타내지 않는 동물군을 포함하는 모든 연구군에서 관찰되었다. 이들 부작용의 심각성은 심하지 않았고, 연구로부터 동물군을 배제시키기에 충분한 종말점(endpoint) 측정을 방해하지 않았다. 표 1에 본 연구에서 관찰된 부작용을 요약하였다. 일부 부작용이 종말점을 측정하는 동안 관찰되었다. 가장 일반적인 것은, 일부 내장통(visceral pain) 또는 과민성의 신호일 수 있는 스트레칭/라이딩이었다. 이는 비히클 및 i.p. 약물 치료군에서 관찰되었다. 동물군의 서브셋에서 비히클의 i.p. 투여와 연관된 것으로 생각되었다. 이는 상대적으로 희박하고, 단명하였고(< 5분), 종말점의 측정을 방해할 만큼 규모가 크지 않았다.
표 1 : 부작용

화합물 93-31은 100 mg/kg에서 i.p. 투여되는 경우, 신경병성 통증의 SNL 모델에서 기계적 이질통을 경감하는 것으로 나타났다. 화합물 93-97은 본 연구에서 테스트된 용량에서(30 및 100 mg/kg) SNL 랫트의 기계적 이질통을 경감시킬 수 없었다. 화합물 93-31(100 mg/kg)은 참조 화합물 가바펜틴(100 mg/kg)보다 빠르게 작용을 개시하고(30분), 작용의 보다 짧은 지속성(60분)을 나타내었다. 100 mg/kg 용량의 화합물 93-31로 치료된 동물군에서 관찰된 피크 역치는 대략 일반 포우에서 관찰된 것의 절반이었다. 완전한 전도(reversal)를 보다 높은 용량의 화합물 93-31로 수행할 수 있다면, 이는 ED50 이 대략 100 mg/kg 임을 암시한다.
실시예 6 : 선택된 화합물의 pH 의존성
n-알킬 유도체 시리즈가 pH 의존성에 대해 테스트되었다.

실시예 7 : Xenopus oocyte 어세이에서 수용체를 함유하는 NMDA-NR2B의 길항작용에 대한 IC ₅₀ 을 결정함에 있어서 인간 대 랫트 수용체 cDNA
효능 상승을 비교하기 위하여 랫트 NMDA 및 인간 NMDA 수용체를 사용한 상술한 실시예의 신경병성 통증의 SNL 모델에 있어서, pH 6.9 및 7.6에서 몇몇 화합물들의 효능을, 생체외 스크리닝 및 테스팅법에 따라 평가하였다.길항작용에서 pH 의존성 효능 상승의 결정은, pH 6.9에서 수용체의 차단에 대한 IC₅₀을 pH 7.6에서 수용체의 차단에 대한 IC₅₀으로 나누는 것으로 정의하였다. 랫트 수용체로부터 얻은 pH 의존성 효능 상승은, 모든 화합물에 대하여 인간 수용체에 대해 얻어진 pH 의존성 효능 상승을 예견하지 않았다.
표 A : 랫트 대 인간 pH 효능 상승

상술한 발명은 명확성과 이해를 목적으로 상세히 설명되어 있으나, 본 명세서의 개시로부터, 당업자는 본 발명의 진정한 범위로부터 벗어나지 않고, 형태 및 상세한 것들의 다양한 변화를 줄 수 있을 것이다.

Claims (26)

1. 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도 pH와 생리적 pH에서의 화합물의 효능(potency)차를 평가하는 단계를 포함하는, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 식별하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 효능차가, 효능 상승(potency boost)에 대한 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 생리적 pH 및 질병 유도 pH에서 화합물의 IC₅₀을 최소 5회 반복 측정함으로써, 평가되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 효능차가, 생리적 pH에서의 효능에 비해 질병 유도 pH에서의 효능 증가인 방법.
4. 제1항에 있어서, 효능차가, 생리적 pH에 비해 질병 유도 pH에서의 효능 상승인 방법.
5. 제1항에 있어서, 감염된 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병이, 신경병성 통증(neuropathic pain), 허혈(ischemia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 간질(epilepsy) 및 외상성 뇌손상(traumatic brain injury)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
6. 제4항에 있어서, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 최소 5의 효능 상승을 갖는 화합물을 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 화합물의 효능 상승이, 인간외(non-human) NMDA 수용체를 발현하는 세포에서 시험된 경우, 동일한 화합물의 효능 상승보다, 최소 2 이상인 화합물을 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 인간외 NMDA 수용체가 랫트 NMDA 수용체인 방법.
9. 제1항에 있어서, 감염된 조직이, 뇌조직, 허혈로 손상된 조직, 통증으로 영향을 받은 조직, 신경병성 통증으로 영향을 받은 조직, 및 외상성 뇌손상으로 영향을 받은 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
10. 제1항에 있어서, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 10% 이상 변하지 않는 방법.
11. 제1항에 있어서, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않는 방법.
12. 제1항에 있어서, 효능차 실험이 5회 반복되는 방법.
13. (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 인간 NMDA 수용체를 억제하는 화합물의 효능 상승을 평가하는 단계;
    (ii) 생체내 화합물을 테스트하고, 통증 역치(pain threshold)에 대한 화합물의 효과를 측정하는 단계;
    (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 것과 관련된 화합물을 선택하는 단계를 포함하는,
    감염된 조직 영역에서 통증 장애를 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 식별하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 효능 상승이, 효능차에 대한 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지, 생리적 pH 및 질병 유도 pH에서 화합물의 IC₅₀을 최소 5회 반복 측정함으로써, 측정되는 방법.
15. 제14항에 있어서, 효능 상승이 최소 12회 측정되는 방법.
16. 제13항에 있어서, 통증 역치가, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 측정되는 방법.
17. 제16항에 있어서, 통증 역치가 최소 12회 측정되는 방법.
18. 제13항에 있어서, 단계(i)에서 얻은 효능 상승의 95% 신뢰 구간이 15% 이상 변하지 않는 방법.
19. 제13항에 있어서, 단계(i)에서 얻은 효능 상승의 95% 신뢰 구간이 5% 이상 변하지 않는 방법.
20. 제13항에 있어서, 단계(i)의 효능 상승 실험이 최소 5회 반복되는 방법.
21. 제13항에 있어서, 단계(ii)이, 화합물을 신경병성 통증의 동물 모델에서 테스트하는 단계를 포함하는 방법.
22. 제13항에 있어서, 단계(ii)에서 얻은 통증 역치의 95% 신뢰 구간이 15% 이상 변하지 않는 방법.
23. 제13항에 있어서, 단계(ii)에서 얻은 통증 역치의 95% 신뢰 구간이 5% 이상 변하지 않는 방법.
24. 제13항에 있어서, 통증 장애가, 영향을 받은 조직에서 pH를 저하시키는 방법.
25. 제13항에 있어서, 영향을 받은 조직 영역에서 pH를 저하시키는 질병이 신경병성 통증인 방법.
26. (i) 인간 NMDA 수용체를 발현하는 세포에서, 질병 유도 pH와 생리적 pH에서 화합물의 효능 상승을, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 15% 이상 변하지 않을 때까지 최소 5회 효능 상승 실험을 반복하여 평가하는 단계;
    (ii) 신경병성 통증의 동물 모델에서 화합물을 테스트하고, 통증 역치의 증가에 대한 화합물의 효과를, 95% 신뢰 구간이 새로운 실험의 추가로 5% 이상 변하지 않을 때까지 최소 12회 실험을 반복하여 측정하는 단계;
    (iii) 단계(i)에서 최소 5의 효능 상승이 일어나고, 단계(ii)에서 통증 역치가 최소 2배 증가하는 것과 관련되는 화합물을 선택하는 단계를 포함하는,
    신경병성 통증을 치료 또는 예방하는데 유용한 화합물을 식별하는 방법.

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