KR20100100019A

KR20100100019A - 헬리코박터 세균에 대한 항균 활성을 갖는 오배자 추출물을함유하는 수의학적 조성물

Info

Publication number: KR20100100019A
Application number: KR1020090018669A
Authority: KR
Inventors: 박현; 김옥진; 김윤철; 이현아; 홍선화
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2010-09-15

Abstract

본 발명은 헬리코박터 세균에 대한 항균 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 헬리코박터 세균에 대한 뛰어난 항균 효과를 나타내므로, 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물 및 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

오배자, 헬리코박터, 항균

Description

헬리코박터 세균에 대한 항균 활성을 갖는 오배자 추출물을 함유하는 수의학적 조성물 {A veterinary composition comprising extracts of Galla Rhois showing antibacterial activity against Helicobacter species}

본 발명은 헬리코박터 세균에 대한 항균 활성을 갖는 오배자 추출물을 함유하는 수의학적 조성물 및 사료첨가제에 관한 것이다.

[문헌 1] Hahm et al., Korean J. Gastroenterol., 37, pp.399-405, 2001

[문헌 2] Marshall et al., Lancet, 1, pp.1311-1315, 1984

[문헌 3] Ho et al., J. Clin. Microbiol., 29, pp.2543-2549, 1991

[문헌 4] Kim et al., Kor. J. Lab. Anim. Sci., 20, pp.316-320, 2004

[문헌 5] Velazquez et al., Int. J. Microbiol., 53, pp.95-104, 1999

[문헌 6] Priestnall et al., J. Clin. Microbiol., 42, pp.2144-2151, 2004

[문헌 7] Watanabe et al., Gastroenterology, 115, pp.642-648, 1998

[문헌 8] Ahn et al., J. Kor. Med. Sci., 6, pp.7-14, 1991

[문헌 9] Jung et al., J. Korean Soc. Microbiol., 35, pp.97-108, 2000

[문헌 10] 정보섭 외, 향약대사전, pp.380-384, 영림사, 1998

[문헌 11] Narayan et al., Phytother Res. 21, pp.190-193, 2007

위점막에 미생물이 존재한다는 것은 1893년 Bizzozero가 개의 위점막에서 스피로헤타(spirochetes)의 세균을 관찰 보고한 이후로 여러 연구자에 의해서 사람과 동물의 위점막에서 유사한 세균을 관찰 보고하였으나, 음식으로부터 소화되지 않은 세균으로 생각하고, 병리학적 의미는 없다고 생각하였다(Hahm et al., Korean J. Gastroenterol., 37, pp.399-405, 2001). 그러나 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)가 Marshall과 Warren에 의하여 최초로 1984년에 만성 위염 환자의 위점막 생검 조직에서 나선형의 만곡형 그람음성 간균으로 분리 배양되었고, 이후로 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 위암에 이르는 각종 소화기 질환의 주요한 원인 인자로 밝혀지고 있다(Marshall et al., Lancet, 1, pp.1311-1315, 1984; Ho et al., J. Clin. Microbiol., 29, pp.2543-2549, 1991). 헬리코박터 속(Genus)은 현재 24개의 종(species)이 보고되어 있으며, 사람과 동물에서 위염 및 위궤양의 주요 인자로 보고되고 있다(Kim et al., Kor. J. Lab. Anim. Sci., 20, pp.316-320, 2004). 또한, 새로운 헬리코박터 종(species)들이 새로이 보고되고 있는 실정이다. 돼지, 소와 같은 축산 동물 뿐 아니라 개, 고양이 등의 동물들에는 다양한 헬리코박터 종이 분포하며, 이들 종들은 사람에서와 유사한 위장관 병변들을 유발하는 것으로 보고되고 있다. 또한 이들의 배설물들로 헬리코박터 종이 배출되고 있으며, 이들에 의한 음식물과 물의 오염 가능성이 보고되고 있다(Velazquez et al., Int. J. Microbiol., 53, pp.95-104, 1999). 헬리코박터 헤 일마니(Helicobacter heilmannii)는 개와 고양이 등의 동물에서 발견되는 종류이지만, 사람의 위염 및 위궤양 환자에서도 발견되어 이들에 대한 인과관계가 인정되고 있으며(Priestnall et al., J. Clin. Microbiol., 42, pp.2144-2151, 2004), 이로 인한 위염 및 위궤양 병변이 유발되는 것으로 알려져 있어 인수공통전염병으로 보아야 한다는 의견들이 강하게 대두되고 있다.

헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori, H. pylori)가 Marshall과 Warren에 의하여 최초로 1984년에 만성 위염 환자의 위점막 생검조직에서 나선형의 만곡형 그람음성 간균으로 분리 배양되었고, 이후로 위염, 위궤양, 십이지장궤양, 위암에 이르는 각종 소화기 질환의 주요한 원인 인자로 밝혀지고 있다(Ho et al., J. Clin. Microbiol., 29, pp.2543-2549, 1991). World Health Organization(WHO)은 최근 헬리코박터 파일로리를 명확한 발암인자(class I carcinogen)로 분류하였으며, 모래쥐(Mongolian gerbil)에 헬리코박터 파일로리의 장기감염 결과, 위암으로 선암(adenocarcinoma)이 유발되는 것을 확인하여 헬리코박터 파일로리가 위암을 유발하는 것이 증명되었다(Watanabe et al., Gastroenterology, 115, pp.642-648, 1998). 한국인의 연간 위암 발생율은 10만 명당 남성 57.9와 여성 25.1로 보고되고 있으며, 이는 다른 나라의 위암 발생율에 비교하여 매우 높은 수치임을 알 수 있다. 위암은 그 임상적 결과가 심각하여 한국 성인 사망률의 주요 원인 중의 하나로 보고되고 있다(Ahn et al., J. Kor. Med. Sci., 6, pp.7-14, 1991).

헬리코박터 파일로리의 유병율은 한국인에서 8살에 80%, 20살 이상에서는 90%를 보이는 것으로 보고되어지고 있다(Jung et al., J. Korean Soc. Microbiol., 35, pp.97-108, 2000). 이러한 자료들에 의하면 대부분의 한국인들은 헬리코박터 파일로리에 감염되어있으며, 평균 40-45년 이상의 생애 동안, 헬리코박터 파일로리에 감염된 상태로 지낸다는 것을 알 수 있다. 국내의 높은 위암 발생율은 헬리코박터 파일로리의 높은 유병율과 연관되어진 결과임을 알 수 있다.

헬리코박터 파일로리가 위궤양 및 위암을 유발하는 심각한 결과와 막대한 경제적 손실을 초래함에도 불구하고 현재 헬리코박터 파일로리를 효과적으로 예방할 수 있는 방법은 국내외적으로 전무한 상태이다. 현재 헬리코박터 파일로리에 관한 개발된 대책은 헬리코박터 파일로리 감염 진단 후 치료의 형태이며 이 때 사용되는 치료제는 항생제 메트로디나졸을 주로 사용하고 있는데 이에 대한 내성과 항생제 부작용의 문제가 야기되고 있어 새로운 기전의 예방 및 치료 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 오배자진딧물(Aphis chinensis J. Bell)이 자상(刺傷)을 주어생긴 벌레집을 말하는데, 우리나라 각지 에 분포한다. 오배자의 형태를 보면, 외면은 회갈색으로 연한 털이 있고, 길이는 3~7cm, 폭 2~5cm, 두께 2mm 정도이며 단단하면서도 쉽게 부숴 진다. 속은 대개 비어 있거나 회백색의 죽은 벌레와 분비물이 남아 있을 때도 있고, 역겨운 냄새가 나기도 한다. 채집한 오배자는 햇볕에 말리거나 삶거나 찐다. 주성분은 피로가롤 탄닌 (pyrogalloltannin)이 50~70% 함유되어 있으며, 몰식자산, 갈산(gallic acid) 등이 있다. 약효로는 수렴, 지사, 지혈제로 설사, 가래, 당뇨, 하혈, 빈혈 등에 이용한다(정보섭 외, 향약대사전, pp.380-384, 영림사, 1998).

이에 본 발명자들은 헬리코박터 세균에 대한 뛰어난 항균 효과를 나타내는 천연물 제재를 개발하였고 시험관내(in vitro) 실험과 생체(in vivo) 실험에서 헬리코박터 세균에 대한 항균 효과를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

본원에서 정의되는 상기 헬리코박터 세균은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 헤일마니(Helicobacter heilmannii), 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis), 헬리코박터 무스틸레(Helicobacter mustelae), 헬리코박터 페넬리에(Helicobacter fenelliae), 헬리코박터 라피니(Helicobacter rappini), 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus), 헬리코박터 빌리스(Helicobacter bilis) 및 헬리코박터 풀로룸(Helicobacter pullorum), 바람직하게는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 헤일마니(Helicobacter heilmannii) 및 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis)로 구성된 헬리코박터 종(species)으로부터 선택된 균임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 헬리코박터 세균 감염의 대상 동물은 사람, 돼지, 소, 염소 등의 포유동물; 잉어, 금붕어 등의 어류; 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 오배자 추출물은, 건조된 오배자를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 6배(v/w)의 정제수를 포함한 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로, 20 내지 150℃, 바람직하게는 70 내지 120℃의 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 추출한 후 감압 농축하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물을 함유하는 수의학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명에 따른 오배자 추출물은 종류와는 상관없이 일정한 항균 효과를 나타내었다.

본 발명의 추출물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장 기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물의 수의학적 투여 형태는 이들의 수의학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 수의학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 수의학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물이 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.

본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 오배자 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.

상기의 동물사료 첨가제용 오배자 추출물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태일 수 있다.

본 발명의 동물사료 첨가제용 추출물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 오배자 추출물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 동물사료 첨가제용 추출물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 동물사료 첨가제용 추출물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 바이러스로 인한 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

또한, 오배자 추출물이 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물(예를 들어, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물(예를 들어, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축(예를 들어, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 오배자 추출물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명의 오배자 추출물은 헬리코박터 세균에 대한 뛰어난 항균 효과를 나타내므로, 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물 및 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오배자 추출물의 제조

익산시 대학한약국으로부터 구입한 건조된 오배자를 분쇄하여 오배자 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자 분말(1 kg) 질량의 3배(v/w)에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축한 후, 동결건조하여 분말상태의 오배자 추출물 620 g(추출율: 62%)을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, “GM-1”이라 명명함). 한편, 추출용매로 에탄올, 메탄올, 30% 에탄올 및 70% 에탄올을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 추출 방법과 동일한 방법을 적용하여 추출물을 각각 52%, 56%, 58% 및 54%의 추출율로 수득하였다.

참고예 1. 실험 준비

본 발명은 기존 문헌에 기재된 실험 방법(Ishizone et al., Int J Med Sci. 4, pp.203-208, 2007)을 응용하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

실험에 사용된 모래쥐(Mongolian gerbil) 모델은 사람의 헬리코박터 세균인 헬리코박터 파일로리 세균 감염이 유발되며 사람에서의 병태 양상을 가장 근접하게 재현하는 시험계이기 때문에 헬리코박터 세균의 항균효과를 알아보기 위한 생체(in vivo) 실험으로 가장 적합한 모델이다.

1-1. 실험동물 및 헬리코박터 균 준비

원광대학교 동물자원개발연구센터에서 계통이 유지되고 있는 모래쥐(Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus)를 6주령에 공급받아 1주일 동안 원광대학교 동물자원개발연구센터 실험동물 사육실에서 순화사육한 후 실험에 사용하였다. 사육기간 중 온도는 23± 1℃, 습도 50± 5%, 소음 60 phone 이하, 조명시간 08:00-20:00(1일 12시간), 환기 시간당 10-12회의 환경에서 사육되었고, 사료는 실험동물전용사료(샘타코)를 자유급식 시켰으며, 음수는 멸균수를 자유 급수하였다. 본 연구에 사용된 실험동물에 관련된 모든 실험과정과 절차는 원광대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care & Use Committee, IACUC)의 규정을 준수하 며 수행되었다.

헬리코박터 파일로리(ATCC 43504, American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천배지에 접종 후, 10% CO₂, 100% 습도가 유지되는 37℃ 항온기에서 3일간 배양하였다. 배양된 헬리코박터 파일로리를 멸균된 PBS(pH 7.2)가 들어있는 튜브에 모은 후, 1 ml 당 2.0×10⁹ colony-forming unit(CFU)의 균 수를 포함하게 준비하여 실험에 사용하였다.

1-2. 군 구성

상기 참고예 1-1에서 1주일간 순화 사육한 7주령의 건강한 수컷 모래쥐 40두를 실험에 사용하였다. 각 군당 10두의 동물들을 사용하여 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 적용군(I군), 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 무처치 적용군(II군) 및 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 적용군(III군), 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 4개 군으로 나누어 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 7주령 모래쥐를 12시간 절식 시킨 후, I군 및 II군의 동물들은 1 ml 당 2.0×10⁹ colony-forming unit (CFU)의 헬리코박터 파일로리 균 수가 포함되게 준비된 배양액을 두당 0.5 ml씩 마우스용 존대를 이용하여 경구(p.o.)로 투여하여 헬리코박터 파일로리 감염을 유발하였다. III군 및 IV군의 동물들은 12시간 절식 후 멸균 PBS(pH 7.2)를 0.5ml씩 경구로 투여하였다. 투여 후 각 군의 동물들은 12시간의 절 식 후 사료를 급여하였다. 절식 동안에 음수는 자유 급이할 수 있도록 하였다. 헬리코박터 파일로리 또는 PBS를 투여한 I군과 III군의 동물들은 2주일 후인 9주령부터 상기 실시예에서 수득한 오배자 추출물을 체중 기준으로 500mg/kg 용량으로 경구 투여를 4주간, 즉 13주령까지 연일 투여하였다. 이 기간 동안 II군 및 IV군의 동물들은 다른 처치 없이 사료와 음수를 자유 급여하였다(도 2 참조). 9주령에서 13주령까지 각 시험군의 동물들은 1주에 1회 체중을 측정하고 실험 종료일인 13주령에 각 개체를 12시간 절식한 후 에테르 마취 하에 안락사 시킨 후 위를 적출하여 육안병변 점수를 구하고, PCR 검사와 신속요소분해효소검사를 통하여 감염 여부를 확인하였으며, 추가적인 병리조직학적 검사를 통하여 조직병변의 점수를 구하여 오배자 추출물 투여가 헬리코박터 세균 감염에 미치는 영향을 평가하였다.

Group		Treatment			n
Group		헬리코박터 파일로리	오배자	기 간	n
Ⅰ	Test	(○)	(○)	6 weeks	10
Ⅱ	Positive control	(○)	(×)	6 weeks	10
Ⅲ	Vehicle control	(×)	(○)	6 weeks	10
Ⅳ	Negative control	(×)	(×)	6 weeks	10

1-3. 통계 분석

각 시험 군의 통계학 유의성은 95% 신뢰구간(confidential interval, CI)이 MINITAB software(Minitab Inc, USA)를 사용하여 구해졌다. 각 군의 신뢰구간이 헬리코박터 감염 양성대조군 II군과 차이가 있으면 통계적으로 유의한 것으로 판단되었다(p<0.05).

실험예 1. 항균 효과

상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물에 의한 헬리코박터 세균 배양 플레이트에 적용한 디스크 각각의 주변 클리어 존의 형성을 관찰하고 형성된 클리어 존의 지름을 기존 문헌에 기재된 실험 방법(Narayan et al., Phytother Res. 21, pp.190-193, 2007)으로 측정하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

헬리코박터 파일로리(ATCC 43504, American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) 균주를 10% calf serum이 첨가된 브루셀라 한천 배지 플레이트에 도말(streak)하고 대조를 위한 항생제 디스크 겐타마이신(바이엘동물약품, 한국), 가나마이신(바이엘동물약품, 한국) 및 엔로플록사신(바이엘동물약품, 한국)을 각각 100mg/ml 용량으로 적용하였다. 또한 상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물을 증류수에 녹여 디스크 여과지에 10⁰(원액)(최종농도 100mg/ml), 10^-1(최종농도 10mg/ml)과 용매대조를 위한 증류수를 각각 적용하였다. 본 실험에서는 균이 접종된 배지에 멸균된 디스크(지름 5 mm)를 배치하고, 이후 10% CO₂, 100% 습도가 유지되는 항온기에서 배양하고 4일 후 평가하였다. 균을 접종한 후 4일 후 표준자를 이용하여 클리어 존의 지름으로 표현되는 억제범위(the zone of inhibition)를 측정하여 균이 자라지 않은 투명한 원의 지름(clear zone)을 관찰하였다. 디스크는 각 균주 당 5개씩 검사하여 억제 범위의 평균값을 분석하였다. 결과의 평가는 항생제 디스크 각각의 주변 클리어 존 형성 관찰하고 형성된 클리어 존의 지름을 측정하여 지름이 클수록 항균 효과가 높은 것으로 판정하였다.

실험결과, 표 2 및 도 1에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 균주를 가지고 오배자의 항균 감수성을 관찰한 결과, 오배자 추출물은 대표적 항생제로 널리 알려진 겐타마이신, 가나마이신 및 엔로플록사신 보다도 우수한 수준의 억제 범위를 보였다.

분류	용매대조	항생제 대조			오배자 추출물
적용물질	증류수	겐타마이신	가나마이신	엔로플록사신	10⁰ (원액)	10^-1 (10배 희석)
클리어존 지름(mm)	-	6	7	12	14	8

실험예 2. 오배자 추출물에 의한 헬리코박터 세균 감염 동물의 체중 변화

상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물을 헬리코박터 세균 감염 및 비감염 동물에 투여한 후, 체중변화를 확인하여 하기 표 3과 같은 결과를 얻었다.

Group	Treatment		몸무게 (gram)
Group	헬리코박터 파일로리	오배자	9 weeks	10 weeks	11 weeks	12 weeks	13 weeks
Ⅰ	(○)	(○)	135.6 ± 3.65	138.2 ± 2.86	141.6* ± 2.30	144.4* ± 3.65	146.4* ± 1.95
Ⅱ	(○)	(×)	136.2± 4.49	135.8 ± 3.11	136.0 ± 2.65	136.8 ± 2.59	137.0 ± 1.58
Ⅲ	(×)	(○)	137.0 ± 6.16	141.0 ± 4.85	145.4* ± 4.45	149.4* ± 2.88	153.4* ± 2.41
Ⅳ	(×)	(×)	136.4 ± 4.28	139.4 ± 3.21	144.0* ± 3.24	148.4* ± 2.30	152.6* ± 2.07
*p<0.05(compare with Ⅱ군)

실험예 3. 오배자 추출물에 의한 위 병변 육안점수 변화

상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물을 헬리코박터 세균 감염과 비감염 동물에 투여한 후, 위 육안병변 점수를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

상기 참고예 1-2의 실험동물을 각 시험 군별로 실험 종료일에 위를 적출한 후, 대만부를 따라 절개하여 펼친 후에 실체현미경(×10)을 사용하여 병변을 관찰하고, 육안 병변의 점수를 산정하였다. 육안병변의 점수는 위궤양 병변의 가로길이 × 세로길이(mm²)의 총합으로 계산하였다. 각 개체의 점수를 구한 후, 각 군별로 평균 점수를 구하였다.

실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 적용군(III군), 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 경우에 위궤양 병변이 관찰되지 않아 육안점수 0의 값을 얻었다. 반면, 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 무처치 적용군(II군)은 74± 26.7의 육안점수를 보여 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 적용군(I군)의 14± 4.1 보다 유의한 변화를 보였다(p<0.05).

실험예 4. 오배자 추출물에 의한 위병변 병리조직점수 변화

상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물을 헬리코박터 세균 감염과 비감염 동물에 투여하고 위 병리조직병변 점수를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

상기 실험예 3에서 각 군의 동물들로부터 육안병변 관찰과 병변 점수를 구한 후, 위 조직을 10% 중성 포르말린에 고정하였다. 위 조직 검사를 위하여 선위(glandular stomach) 부위를 가로 방향으로 5 mm 간격으로 잘라, 3개 부위를 검사하고 병변의 등급을 결정하였다. 위의 선별된 부위들은 다른 개체들 간에 서로 동일한 부위가 되도록 주의하여 선정하였다. 선정된 부위들의 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4㎛ 두께로 절편하여 H & E 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다. 각 조직 소견의 병변에 대한 평가를 수행하여 이들의 정도를 4단계{0(no lesion), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)}의 점수로 나누어 기록하고, 3개 부위의 점수의 합을 구한 후, 위의 병리조직학적 소견에 대한 각 군의 평균 점수를 구하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 적용군(III군), 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 경우에 병리조직학적 병변이 관찰되지 않아 육안점수 0의 값을 얻었다. 반면, 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 무처치 적용군(II군)은 6.2± 0.84의 육안점수를 보여 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 적용군(I군)의 1.2± 0.84 보다 유의한 변화를 보였다(p<0.05).

실험예 5. PCR에 의한 헬리코박터 병원체 검사

상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물을 헬리코박터 세균 감염과 비감염 동물에 투여한 후, 헬리코박터 세균 치료에 의한 제거 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

실험 종료일에 해당 개체들의 위 유문부 점막 일부를 무균 채취하여 DNA를 추출한 후 헬리코박터 파일로리 감염 유지를 확인하기 위한 PCR을 수행하였다. DNA 추출은 bead beater-phenol extraction method를 사용하였다. 검체를 1 ml 멸균 증류수가 들어있는 Mini-Bead Beater(Biospec product) 전용 2 ml 튜브에 무균 채취하여 세절한 후 멸균 3차 증류수에 부유시킨 glass bead(0.1 mm size, Biospec product) 200μl와 phenol-chlorform-isoamyl alcohol 용액(50:49:1(v/v/v)) 200μl를 넣어 Mini-Bead Beater(Biospec product)로 30초간 5,000rpm으로 진탕하였다. 진탕 후 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 멸균 2ml 튜브에 옮겼다. 3 M 초산나트륨(sodium acetate) 10 μl와 ice-cold 에탄올 250μl를 넣어 -20℃에서 10분간 정체시킨 후, 15,000rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 침전물은 70% 알코올로 세척하여 실온에서 건조시키고 Tris EDTA(pH 8.0) 60μl에 용해시켜 실험에 사용하였다. 헬리코박터 속(Genus Helicobacter)의 rpoB DNA 분절을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. Forward primer(HF; 5' ACTTTAACGCATGAAGATAT 3')와 Reverse primer(HR; 5' ATATTTTGACCTTCTGGGGT 3')를 사용하여 PCR은 Taq DNA polymerase 1U, 각 dNTP 250μM, 50mM Tris-HCl(pH 8.3), 40mM KCl, 1.5mM MgCl₂를 포함하는 AccuPower PCR Premix(Bioneer)를 이용하였다. 추출된 DNA를 template로 50ng, 각 프라이머 20 pmol을 AccuPower PCR Premix tube에 넣고 멸균 증류수로 최종 부피를 20μl로 맞춘 후, 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 45초의 30cycle의 PCR을 수행한 후, 1.2% 아가로스 겔에서 458 bp의 특이 밴드의 유무를 확인하였다.

실험결과, 표 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 적용군(III군) 및 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 경우에 PCR 검사에 의하여 헬리코박터 세균 DNA가 검출되지 않았다. 반면, 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 무처치 적용군(II군)은 10마리 개체 모두에서 헬리코박터 세균 DNA가 검출되었으며, 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 적용군(I군)은 1마리 개체에서 헬리코박터 세균 DNA가 검출되었을 뿐 다른 9두 모두에서 음성의 결과를 보여 헬리코박터 감염 양성대조군 II군과 유의한 변화를 보였다(p<0.05).

Group	Treatment		n	Positive No.	Positive %
Group	헬리코박터 파일로리	오배자	n	Positive No.	Positive %
Ⅰ	(○)	(○)	10	1	10
Ⅱ	(○)	(×)	10	10	100
Ⅲ	(×)	(○)	10	0	0
Ⅳ	(×)	(×)	10	0	0

실험예 6. 신속요소분해효소검사에 의한 헬리코박터 세균 병원체 검사

상기 실시예 1에서 수득한 오배자 추출물을 헬리코박터 세균 감염과 비감염 동물에 투여하고 헬리코박터 세균의 치료에 의한 제거 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

실험 종료일에 해당 개체들의 위 유문부 점막 일부를 무균 채취하여 신속요소분해효소검사(rapid urease test)를 실시하였다. 신속요소분해효소검사는 CLO test 키트(Asan Pharmaceutical Co., Korea)를 사용하여 제조회사의 설명서에 따라 실온에서 배양하여 노란색 배지가 적색으로 변하는 경우를 양성으로 판정하였다. 신속요소효소분해검사인 CLO test의 결과는 검체에 감염된 헬리코박터 세균 성장 시 요소효소분해와 제공된 배지의 요소와의 반응 결과로 유도되는 색깔 변화로 감염 여부를 손쉽게 알 수 있는 방법이다.

실험결과, 표 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 적용군(III군), 헬리코박터 파일로리 감염 없이 오배자 추출물 무처치 적용군(IV군)의 경우에 신속요소분해효소검사에 의하여 헬리코박터 세균에 음성 결과를 보였다. 반면, 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 무처치 적용군(II군)은 10마리 개체 모두에서 헬리코박터 세균 양성반응이 검출되었다. 헬리코박터 파일로리 감염 후 오배자 추출물 적용군(I군)은 10두 모두에서 음성의 결과를 보여 헬리코박터 감염 양성대조군 II군과 유의한 변화를 보였다(p<0.05).

Group	Treatment		n	Positive No.	Positive %
Group	헬리코박터 파일로리	오배자	n	Positive No.	Positive %
Ⅰ	(○)	(○)	10	0	0
Ⅱ	(○)	(×)	10	10	100
Ⅲ	(×)	(○)	10	0	0
Ⅳ	(×)	(×)	10	0	0

실험예 7. 시험물질에 의한 독성여부 평가

실시예 1의 오배자 추출물을 오랜 기간 섭취함으로 인해 독성발현으로 의심되는 세포 손상이 있는지 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험은 9주령 수컷 모래쥐를 사용하여 수행되었으며, 28일 동안 매일 500mg/kg 용량으로 시험물질을 경구 투여하였다. 실험 종료일 에테르 마취하에 안락사하여 부검을 실시하고 각 실질 장기의 육안병변을 관찰한 후, 대뇌(cerebrum), 소뇌(cerebellum), 연수(pons), 고환(Testis), 심장(Heart), 간(Liver), 폐장(Lung), 신장(Kidney), 근육(Muscle), 비장((Spleen), 전립선(Prostate), 췌장(Pancreas), 흉선(Thymus), 부신(Adrenal gland), 소장(Small Intestine), 대장(Large Intestine), 골수(Bone marrow), 갑상선(Thyroid gland) 및 정낭(seminal vesicle)을 적출하여 10 % 중성완충 포르말린용액(neutral buffered formalin)에 고정하였다. 고정이 완료된 조직들은 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4 ㎛ 두께로 절편하여 H & E 염색 후 병리조직학적인 검사를 수행하였다.

실험결과, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, 실질장기에 별다른 세포손상은 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

Group	실험군	n	Gross lesion	Pathological lesion
Ⅰ	오배자 추출물 투여군	10	0	0
Ⅱ	대조군	10	0	0

하기에 본 발명의 오배자 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예1. 사료 조성물

오배자 추출물(GM-1) 240g

부형제(말분) 760g

상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

RTI05-03-02

[부처명]

지식경제부

[연구사업명]

지방기술혁신사업

[연구과제명]

인수공통감염병 치료제 연구개발사업

[주관기관]

원광대학교

[연구기간]

2005년 05월 01일 ~ 2010년 04월 30일

도 1은 시험관내(in vitro) 항균효력시험으로 헬리코박터 세균에 대한 항균 활성을 나타낸 도이고,

도 2는 생체(in vivo) 실험 처치 구성 및 일정을 나타낸 도이며,

도 3은 위 병변의 육안점수를 나타낸 도이고,

도 4는 위 병변의 병리조직 점수를 나타낸 도이며,

도 5는 헬리코박터 감염 확인 PCR 결과를 나타낸 도이고(M=100bp marker; P=DNA from H. pylori ATCC 43504; N=negative control(Ⅳ군); 1~2= gerbil treated with Obaeja with H. pylori(Ⅰ군); 3~6= gerbil infected with H. pylori without Obaeja(Ⅱ군),

도 6은 헬리코박터 감염 확인 신속요소분해효소검사 결과를 나타낸 도이다(A: Ⅰ군, B: Ⅱ군).

<110> industry-academic cooperation foundation wonkwang university <120> a veterinary composition comprising extracts of galla rhois showing antibacterial activity against helicobacter species <130> DIF/2009-02-0012/RS <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Forward primer(HF) <400> 1 actttaacgc atgaagatat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Reverse primer(HR) <400> 2 atattttgac cttctggggt 20

Claims

오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물인 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 세균 감염의 대상 동물은 포유동물, 어류 및 가금류인 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 헬리코박터 세균은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 헤일마니(Helicobacter heilmannii), 헬리코박터 펠리스(Helicobacter felis), 헬리코박터 무스틸레(Helicobacter mustelae), 헬리코박터 페넬리에(Helicobacter fenelliae), 헬리코박터 라피니(Helicobacter rappini), 헬리코박터 헤파티쿠스(Helicobacter hepaticus), 헬리코박터 빌리 스(Helicobacter bilis) 및 헬리코박터 풀로룸(Helicobacter pullorum)로 구성된 헬리코박터 종(species)으로부터 선택된 균임을 특징으로 하는 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량% 포함하는 수의학적 조성물.
오배자 추출물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 세균 감염의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제.
제 6항에 있어서, 상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 동물사료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 동물사료 첨가제.
제 6항의 동물사료 첨가제를 포함하는 사료.