KR20100090683A - 액티빈 수용체-유사 키나제-ｉ 길항제 조성물 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
ALK-1 길항제를 사용하여 혈관신생 및/또는 림프관신생과 관련된 질병을 치료하는 방법 및 치료용 조성물을 본원에서 개시한다.
Description
관련 출원
본 출원은 2007년 11월 9일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제60/986,876호 및 2008년 9월 19일 출원된 제61/098,557호 (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
혈관신생 및/또는 림프관신생과 관련된 질병 치료를 위한 액티빈 수용체-유사 키나제-1 (ALK-1) 길항제의 사용과 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.
혈관 공급의 발생은 많은 생리학적 및 병리학적 과정의 기본 요건이다. 활발하게 성장하는 조직, 예를 들어, 배아 및 종양은 적절한 혈액 공급을 필요로 한다. 이들은 혈관신생으로 불리는 과정을 통해 새로운 혈관 형성을 촉진하는 전혈관신생 인자를 생산함으로써 상기 필요를 만족시킨다. 혈관 형성은 하기 단계 모두를 또는 그들 다수를 포함하는, 복잡하지만 체계적인 생물학적 이벤트이다: a) 내피 세포 (EC)가 현존 EC로부터 증식하거나 기원 세포로부터 분화하고; b) EC가 이동하고 융합하여 코드-유사 구조를 형성하고; c) 이어서 혈관 코드는 관생성을 거쳐 중심 관강을 갖는 관을 형성하고; d) 현존 코드 또는 관이 싹을 내밀어 2차 관을 형성하고; e) 원시 혈관총은 추가의 재형성 및 재성형을 거치고; f) 주변-내피 세포가 동원되어 내피관을 둘러싸, 관에 유지 및 조절 기능을 제공하며; 상기 세포는 작은 모세혈관에 대한 혈관주위세포, 보다 큰 혈관에 대해 평활근 세포, 심장에서 심근 세포를 포함한다 (문헌 ([Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997)]; [Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002)]; [Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell 112:19-28 (2003)])).
현재 혈관신생이 다양한 질병의 발병기전과 연루되어 있다는 것은 잘 확립되어 있다. 이들은 고형 종양 및 전이, 아테롬성 동맥경화증, 수정체후 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환, 예를 들어, 증식 망막병증, 예를 들어, 당뇨 망막병증, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 다른 조직의 면역 거부, 류마티스성 관절염, 및 건선을 포함한다 (문헌 ([Folkman et al., J. Biol . Chem ., 267:10931-10934 (1992)]; [Klagsbrun et al., Annu. Rev . Physiol. 53:217-239 (1991)]; 및 [Garner A., "Vascular diseases," In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710])).
종양 성장의 경우에, 혈관신생은 과다증식에서 신생물로의 이행 및 종양의 성장 및 전이를 위한 자양분을 공급하는데 있어 중요한 것으로 보인다 (문헌 [Folkman et al., Nature 339:58 (1989)]). 신생혈관형성은 정상 세포에 비해 종양 세포가 성장 이익과 증식 자율성을 획득하도록 한다. 종양은 보통 이용가능한 모세혈관층으로부터의 거리 때문에 수 세제곱밀리미터의 크기로만 증식할 수 있는 비전형적인 단일 세포로서 시작하고, 장시간 동안 추가의 성장 및 시딩없이 '휴면 상태'로 머무를 수 있다. 이어서 몇몇 종양 세포는 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시키고, 이는 증식하여 새로운 모세혈관으로 성숙해진다. 이들 새로 형성된 혈관은 원발성 종양의 지속적인 성장을 허용할 뿐만 아니라, 전이성 종양 세포의 파종 및 재콜로니 형성을 허용한다. 따라서, 종양 절편 내의 미세혈관의 밀도와 유방암 및 몇몇 다른 종양에서 환자 생존율 사이에 상호관련성이 있다는 것이 관찰되었다 (문헌 ([Weidner et al., N. Engl . J. Med 324: 1-6 (1991)]; [Horak et al., Lancet 340: 1120-1124 (1992)]; [Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992)])). 혈관신생 전환을 제어하는 정확한 기전은 잘 알려지지 않았지만, 종양 덩어리의 신생혈관형성은 많은 혈관신생 자극제와 억제제의 순 균형으로부터 생성되는 것으로 생각된다 (문헌 [Folkman Nat Med 1(1):27-31 (1995)]).
현재는 전이가 압도적 다수의, 추정컨대 90％의, 고형 종양으로부터 유발되는 사망의 원인이 된다는 사실이 인정되고 있다 (문헌 [Gupta and Massague, Cell 127, 679-695 (2006)]). 전이의 복잡한 과정은, 원발성 종양으로부터 종양 세포의 박리, 종양 세포의 림프관 또는 혈관 내로의 혈관내 침투, 및 2차 부위에서 종양 세포의 혈관외 유출 및 성장을 비롯한, 일련의 상이한 단계들을 포함한다. 다수의 종양 유형에서 국소 림프절을 분석한 결과, 림프 맥관이 인간 암의 파종에 중요한 경로라는 것이 제안되었다. 추가로, 거의 모든 암종에 있어서 림프절내 종양 세포의 존재가 가장 중요한 유해 예후 인자이다. 종래에는, 상기와 같은 전이는 악성 세포가 오로지 종양 근처에 있는 기존 림프관을 따라 통과하는 것만을 포함하는 것으로 여겨져 왔지만, 최근의 실험 연구와 임상 병리학적 보고 (문헌 ([Achen et al., Br J Cancer 94 (2006), 1355-1360] 및 [Nathanson, Cancer 98,413-423 (2003)])에서 리뷰됨)를 통해서는 림프관신생이 고형 종양에 의해서 유도될 수 있고, 종양 확산을 촉진시킬 수 있다고 제안되었다. 상기와 기타 다른 최근의 연구는, 림프관과 림프관신생을 표적하는 것이 암 전이 발생을 제한하는 유용한 치료학적 전략법이 될 수 있으며, 이는 많은 환자들에게 큰 이익을 안겨줄 것이라는 것을 제안한다.
본 발명의 요약
본 발명은 부분적으로는, ALK-1 경로를 조정하는 제제가 혈관신생과 림프관신생, 두가지 모두를 손상시킬 수 있다는 발견을 토대로 한다. ALK-1 길항제로 처리한 결과, 내피 세포의 발아는 증진되었고, 혈관주위세포의 조직은 파괴되었으며, 종양 및 림프 맥관을 비롯한 혈관의 부적절한 발생이 일어났다. ALK-1 길항제로 처리된 종양 모델의 경우에는 여러 유형의 암에서의 종양 성장은 억제되었다. 따라서, 본 발명은 혈관주위세포 조직의 파괴, 혈관신생 및/또는 림프관신생의 억제를 위한, 그리고 혈관신생 및/또는 림프관신생과 관련된 병적 상태를 표적하는데 사용하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 물품을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 림프관신생 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 림프관신생을 억제시키는 단계를 포함하는, 림프관신생을 억제시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 대상체는 예를 들어, 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선을 앓는 대상체이다. 몇몇 실시태양에서, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 림프관신생과 관련된 병적 상태를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 림프관신생과 관련된 병적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 림프관신생과 관련된 병적 상태는 예를 들어, 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병이다.
본 발명은 또한 질병, 예를 들어, 혈관신생 또는 림프관신생과 관련된 병적 상태의 치료학적 및/또는 예방학적 치료용 의약 제조에서 ALK-1 길항제의 용도를 제공한다. 그러한 병태로는 예를 들면, 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선을 포함한다. 또한, 종양 전이의 치료학적 및/또는 예방학적 치료용 의약 제조에서 ALK-1 길항제의 용도도 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양성 림프관신생을 억제시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양성 림프관신생을 억제시키는 방법을 제공한다. 또한, 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양 전이를 억제시키거나 예방하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 전이를 억제시키거나 예방하는 방법도 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 대상체에서 종양 전이가 발생하였거나, 발생할 위험에 있다. 종양 전이는 예를 들면, 림프계 또는 원위 장기에서 일어날 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 혈관주위세포 조직을 파괴시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관주위세포 조직을 파괴시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 대상체는 예를 들어, 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선을 앓고 있는 대상체이다. 몇몇 실시태양에서, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병이다.
추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양 성장을 억제시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병을 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양, 암 또는 세포 증식성 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병은 예를 들어, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 추가로 대상체에게 유효량의 항-혈관신생제를 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항-혈관신생제는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 길항제, 예를 들면, 항-VEGF 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 추가로 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 항-혈관신생제와 조합하여 투여함으로써 상기 항-혈관신생제의 억제 활성을 증진시키는 단계를 포함하는, 혈관신생과 관련된 병적 상태를 앓는 대상체에서 항-혈관신생제의 효능을 증진시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 혈관신생과 관련된 병적 상태는 종양, 암 또는 세포 증식성 질병이다.
몇몇 실시태양에서, ALK-1 길항제는 ALK-1 면역어드헤신이다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-352, 서열 번호: 4의 잔기 22-349, 서열 번호: 6의 잔기 22-347, 서열 번호: 8의 잔기 22-350, 또는 서열 번호: 10의 잔기 22-350을 포함한다. 다른 실시태양에서, ALK-1 길항제는 항-ALK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
또한, 종양 전이의 예방, 억제 또는 치료용의, 또는 종양, 암 또는 세포 증식성 질병 치료용의 ALK-1 길항제를 제공한다. ALK-1 길항제는 예를 들면, ALK-1 면역어드헤신 또는 항-ALK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-352, 서열 번호: 4의 잔기 22-349, 서열 번호: 6의 잔기 22-347, 서열 번호: 8의 잔기 22-350, 또는 서열 번호: 10의 잔기 22-350을 포함한다. 본 발명은 또한 유효량의 ALK-1 길항제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병 치료용의 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 길항제는 ALK-1 면역어드헤신이다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-352, 서열 번호: 4의 잔기 22-349, 서열 번호: 6의 잔기 22-347, 서열 번호: 8의 잔기 22-350, 또는 서열 번호: 10의 잔기 22-350을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 길항제는 항-ALK-1 항체이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 용기와, 용기 내에 함유되어 있는 조성물을 포함하는 물품을 제공하는데, 여기서, 상기 조성물은 ALK-1 길항제를 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 ALK-1 길항제 및 ALK-1 길항제의 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또한, 치료학적 유효량의 ALK-1 길항제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물 제조 방법을 제공한다.
도 1A-1B는 ALK1.Fc (5 ㎍/ml)의 부재 (도 1A) 및 존재 (도 1B)하에 3-D 피브린 겔 중 HUVEC 발아 분석법에서 9일째 촬영한 위상차 현미경 영상이다.
도 2A-2F는 P11에 수집하여 항-CD31 및 렉틴-FITC로 염색한 래트 망막으로부터의 공초점 영상이다. 생후 4일째 (P4), P6 및 P9에 10 mg/kg ALK1.Fc 또는 PBS를 신생 래트에 i.p. 주사하였다.
도 3A-3F는 P11에 수집하여 Cy3-접합된 항-알파 평활근 액틴 (ASMA) 및 렉틴-FITC로 염색한 래트 망막으로부터의 공초점 영상이다. P4, P6 및 P9에 10 mg/kg ALK1.Fc 또는 PBS를 신생 래트에 i.p. 주사하였다.
도 4A-4F는 P11에 수집하여 Cy3-접합된 항-알파 평활근 액틴 (ASMA) 및 렉틴-FITC로 염색한 래트 망막으로부터의 공초점 영상이다. P4, P6 및 P9에 10 mg/kg ALK1.Fc 또는 PBS를 신생 래트에 i.p. 주사하였다.
도 5A-5B는 ALK1.Fc (10 mg/kg)가 HM7 (도 5A) 및 MV522 (도 5B) 이종이식편에서의 종양 성장을 억제시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 평균 종양 부피 (+SE)를 제시한다.
도 6A-6B는 ALK1.Fc (10 mg/kg)가 C6 (도 6A) 및 Calu6 (도 6B) 이종이식편에서의 종양 성장을 억제시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 평균 종양 부피 (+SE)를 제시한다.
도 7은 ALK1.Fc가 항-VEGF와 함께 조합되었을 때에 HM7 이종이식편에서 부가적인 항-종양 활성을 갖는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 8은 ALK1.Fc가 항-VEGF와 함께 조합되었을 때에 LL2 이종이식편에서 부가적인 항-종양 활성을 갖는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 9A-9D는 PBS (도 9A), ALK1.Fc (도 9B), 항-VEGF 항체 (B20-4.1, 5 mg/kg) (도 9C) 또는 항-VEGF 항체 및 ALK1.Fc (도 9D)로 처리된 LL2 종양 모델 마우스의 종양 혈관 밀도를 보여주는 공초점 영상이다.
도 10A-10B는 PBS (도 10A) 또는 ALK1.Fc (도 10B)로 처리된 신생 마우스로부터 유래된 장 융모의 공초점 영상이다. 모세 혈관을 보여주기 위해서는 항-CD31을 사용하고, 림프 모세혈관을 보여주기 위해서는 항-LYVE-1을 사용하여 조직을 염색하였다.
도 11A-11B는 PBS (도 11A) 또는 ALK1.Fc (도 11B)로 처리된 신생 마우스로부터 유래된 단일의 장 융모의 공초점 영상이다. 모세 혈관을 보여주기 위해서는 항-CD31을 사용하고, 림프 모세혈관을 보여주기 위해서는 항-LYVE-1을 사용하여 조직을 염색하였다.
도 12A-12F는 PBS (도 12A-C) 또는 ALK1.Fc (도 12D-F)로 처리된 신생 마우스로부터 유래된 마우스 꼬리 피부의 공초점 영상이다. 모세 혈관을 보여주기 위해서는 항-CD31을 사용하고, 림프 모세혈관을 보여주기 위해서는 항-LYVE-1을 사용하여 조직을 염색하였다.
도 13A-B는 PBS (도 13A) 또는 ALK1.Fc (도 13B)로 처리된 TIB68 종양 모델 마우스에서 혈관주위세포 조직화를 보여주는 공초점 영상이다.
도 14는 P8에 수집하여 항-CD31로 염색한 마우스 망막으로부터의 공초점 영상이다. P4 및 P6에 PBS, ALK1.Fc, ALK1.Fc.2, ALK1.Fc.4 또는 ALK1.Fc.5를 마우스에 i.p. 주사하였다.
도 2A-2F는 P11에 수집하여 항-CD31 및 렉틴-FITC로 염색한 래트 망막으로부터의 공초점 영상이다. 생후 4일째 (P4), P6 및 P9에 10 mg/kg ALK1.Fc 또는 PBS를 신생 래트에 i.p. 주사하였다.
도 3A-3F는 P11에 수집하여 Cy3-접합된 항-알파 평활근 액틴 (ASMA) 및 렉틴-FITC로 염색한 래트 망막으로부터의 공초점 영상이다. P4, P6 및 P9에 10 mg/kg ALK1.Fc 또는 PBS를 신생 래트에 i.p. 주사하였다.
도 4A-4F는 P11에 수집하여 Cy3-접합된 항-알파 평활근 액틴 (ASMA) 및 렉틴-FITC로 염색한 래트 망막으로부터의 공초점 영상이다. P4, P6 및 P9에 10 mg/kg ALK1.Fc 또는 PBS를 신생 래트에 i.p. 주사하였다.
도 5A-5B는 ALK1.Fc (10 mg/kg)가 HM7 (도 5A) 및 MV522 (도 5B) 이종이식편에서의 종양 성장을 억제시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 평균 종양 부피 (+SE)를 제시한다.
도 6A-6B는 ALK1.Fc (10 mg/kg)가 C6 (도 6A) 및 Calu6 (도 6B) 이종이식편에서의 종양 성장을 억제시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. 평균 종양 부피 (+SE)를 제시한다.
도 7은 ALK1.Fc가 항-VEGF와 함께 조합되었을 때에 HM7 이종이식편에서 부가적인 항-종양 활성을 갖는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 8은 ALK1.Fc가 항-VEGF와 함께 조합되었을 때에 LL2 이종이식편에서 부가적인 항-종양 활성을 갖는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 9A-9D는 PBS (도 9A), ALK1.Fc (도 9B), 항-VEGF 항체 (B20-4.1, 5 mg/kg) (도 9C) 또는 항-VEGF 항체 및 ALK1.Fc (도 9D)로 처리된 LL2 종양 모델 마우스의 종양 혈관 밀도를 보여주는 공초점 영상이다.
도 10A-10B는 PBS (도 10A) 또는 ALK1.Fc (도 10B)로 처리된 신생 마우스로부터 유래된 장 융모의 공초점 영상이다. 모세 혈관을 보여주기 위해서는 항-CD31을 사용하고, 림프 모세혈관을 보여주기 위해서는 항-LYVE-1을 사용하여 조직을 염색하였다.
도 11A-11B는 PBS (도 11A) 또는 ALK1.Fc (도 11B)로 처리된 신생 마우스로부터 유래된 단일의 장 융모의 공초점 영상이다. 모세 혈관을 보여주기 위해서는 항-CD31을 사용하고, 림프 모세혈관을 보여주기 위해서는 항-LYVE-1을 사용하여 조직을 염색하였다.
도 12A-12F는 PBS (도 12A-C) 또는 ALK1.Fc (도 12D-F)로 처리된 신생 마우스로부터 유래된 마우스 꼬리 피부의 공초점 영상이다. 모세 혈관을 보여주기 위해서는 항-CD31을 사용하고, 림프 모세혈관을 보여주기 위해서는 항-LYVE-1을 사용하여 조직을 염색하였다.
도 13A-B는 PBS (도 13A) 또는 ALK1.Fc (도 13B)로 처리된 TIB68 종양 모델 마우스에서 혈관주위세포 조직화를 보여주는 공초점 영상이다.
도 14는 P8에 수집하여 항-CD31로 염색한 마우스 망막으로부터의 공초점 영상이다. P4 및 P6에 PBS, ALK1.Fc, ALK1.Fc.2, ALK1.Fc.4 또는 ALK1.Fc.5를 마우스에 i.p. 주사하였다.
본 발명의 상세한 설명
달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 기술내 포함되어 있는, 분자 생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상의 기법을 사용하게 될 것이다. 그러한 기법은 문헌, 예를 들어, (["Molecular Cloning: A Laboratory Manual," second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 주기적 업데이트)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction," (Mullis et al., eds., 1994)])에 전체적으로 설명되어 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 숙련인이 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌 ([(Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)])은 당업자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 관한 일반적인 가이드를 제공한다.
특허 출원 및 공개 문헌을 비롯한, 본원에서 인용되는 모든 참고 문헌은 그의 전문이 참고로서 인용된다.
정의
본원에서 사용되는 바, "ALK-1" (상호교환적으로 "액티빈 수용체-유사 키나제-1"로도 명명된다)이라는 용어는 구체적으로 또는 문맥과 관련하여 달리 명시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연이든 합성이든 간에) ALK-1 폴리펩티드를 의미한다. "천연 서열"이라는 용어는 구체적으로 천연적으로 발생된, 끝이 잘린 형태 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연적으로 발생된 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체를 포함한다. "야생형 ALK-1"이라는 용어는 일반적으로 천연적으로 발생된 ALK-1 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. "야생형 ALK-1 서열"이라는 용어는 일반적으로 천연적으로 발생된 ALK-1에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다.
"키메라 ALK-1" 분자는 이종 폴리펩티드에 융합되어 있거나, 그에 결합되어 있는, 전장의 ALK-1 또는 그의 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 키메라 ALK-1 분자는 일반적으로 천연적으로 발생된 ALK-1과 공통되는 생물학적 특성을 적어도 하나 공유할 것이다. 키메라 ALK-1 분자의 일례로는 정제 목적을 위해 태깅된 에피토프인 것이 있다. 또다른 키메라 ALK-1 분자로는 ALK-1 면역어드헤신이 있다.
본원에서 사용되는 바, "면역어드헤신"이라는 용어는, 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 조합한 항체-유사 분자를 지칭하는 것이다. 구조상, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 (즉, "이종성인"), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 중 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들어, IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
"ALK-1 면역어드헤신"이라는 용어는 "ALK-1-면역글로불린 키메라"라는 용어와 상호교환적으로 사용되고, ALK-1 분자 (천연 또는 변이체)의 적어도 일부를 면역글로불린 서열과 조합한 키메라 분자를 의미한다. 몇몇 경우에서, ALK-1 면역어드헤신은 ALK-1의 세포외 도메인 (ECD), 또는 ALK-1 리간드에 결합하기에 충분한 ALK-1의 세포외 도메인의 일부를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신의 ALK-1 일부의 N-말단은 서열 번호: 2의 Asp 22부터 Ser 27 (Ser 27 포함)까지의 임의의 아미노산 잔기에서 시작할 수 있고, ALK-1 면역어드헤신의 ALK-1 일부의 C-말단은 서열 번호: 2의 Ser 110으로부터 Glu 118 (Glu 118 포함)까지의 임의의 아미노산 잔기에서 끝날 수 있다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 1-118을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-118, 서열 번호: 2의 잔기 23-118, 서열 번호: 2의 잔기 24-118, 서열 번호: 2의 잔기 25-118, 서열 번호: 2의 잔기 26-118, 또는 서열 번호: 2의 잔기 27-118을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 프로세싱되지 않은 ALK-1 면역어드헤신이 ALK1.Fc (서열 번호: 2), ALK1.Fc.2 (서열 번호: 4), ALK1.Fc.3 (서열 번호: 6), ALK1.Fc.4 (서열 번호: 8) 또는 ALK1.Fc.5 (서열 번호: 10)이다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-352, 서열 번호: 4의 잔기 22-349, 서열 번호: 6의 잔기 22-347, 서열 번호: 8의 잔기 22-350, 또는 서열 번호: 10의 잔기 22-350을 포함한다. 면역글로불린 서열은 반드시 그러한 것은 아니지만, 면역글로불린 불변 도메인 (Fc 영역)인 것이 바람직하다. 면역어드헤신은 인간 항체의 많은 유용한 화학적 및 생물학적 특성을 가질 수 있다. 면역어드헤신은 적절한 인간 면역글로불린 힌지 및 불변 도메인 (Fc) 서열에 연결되어 있으며, 원하는 특이성을 갖는 인간 단백질 서열로부터 작제될 수 있으므로, 관심의 대상이 되는 결합 특이성은 전적으로 인간 성분을 사용하여 달성될 수 있다. 상기 면역어드헤신은 환자에게 최소한으로 면역원성이고, 장기 또는 반복 사용에 대하여 안전하다. 몇몇 실시태양에서, Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역이다. 몇몇 실시태양에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역이다. 몇몇 실시태양에서, Fc 영역은 기능적 Fc 영역이다. ALK-1 일부 및 ALK-1 면역어드헤신의 면역글로불린 서열 일부는 최소한의 링커에 의해 연결될 수 있다.
치료 용도로 기술된 동종다량체 면역어드헤신의 예로는 세포-표면 CD4에의 HIV의 결합을 차단하기 위한 CD4-IgG 면역어드헤신을 포함한다. CD4-IgG를 분만 직전의 임부에게 투여하는 I상 임상 시험으로부터 얻은 데이타는, HIV가 모체에서 태아로 전달되는 것을 예방하는데 있어서 상기 상기 면역어드헤신이 유용할 수 있음을 제안한다 (문헌 [Ashkenazi et al., Intern . Rev . Immunol. 10:219-227 (1993)]). 종양 괴사 인자 (TNF)에 결합하는 면역어드헤신 또한 개발되었다. TNF는 패혈성 쇼크의 주요 매개체인 것으로 나타난 전염증성 사이토카인이다. 패혈성 쇼크의 마우스 모델에 기초하여, TNF 수용체 면역어드헤신은 패혈성 쇼크를 치료하는데 있어서 임상 사용을 위한 후보 물질로서 유망한 것으로 나타났다 (문헌 [Ashkenazi, A. et al. PNAS USA 88:10535-10539 (1991)]). IgG Fc 영역에 융합된 TNF 수용체 서열을 포함하는 면역어드헤신인 엔브렐(ENBREL)® (에타네르셉트)은 류마티스성 관절염의 치료용으로 미국 식품의약청 (FDA)에서 1998년 11월 2일에 승인받았다. 류마티스성 관절염 치료에서 엔브렐®의 새로 확장된 용도는 FDA에서 2000년 6월 6일에 승인받았다. 엔브렐®을 비롯한, TNF 차단제에 대한 최근 정보는 문헌 ([Lovell et al., N. Engl . J. Med . 342:763-169 (2000), 및 p810-811에 수반되는 내용]; 및 [Weinblatt et al., N. Engl . J. Med. 340:253-259 (1999)]; [Maini and Taylor, Annu . Rev . Med. 51:207-229 (2000)])을 참조한다.
면역어드헤신 구조의 2개의 암이 상이한 특이성을 갖는다면, 면역어드헤신은 이중특이적 항체에 유사하게 "이중특이적 면역어드헤신"이라 명명된다. 문헌 [Dietsch et al., J. Immunol . Methods 162:123 (1993)]에는 상기 이중특이적 면역어드헤신이 부착 분자의 세포외 도메인, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴에 결합하고, 그의 각각의 셀렉틴은 자연에서 상이한 세포 유형에서 발현됨을 설명한다. 결합 연구는 이렇게 형성된 이중특이적 면역글로불린 융합 단백질이 그가 유래되는 단일특이적 면역어드헤신에 비해 골수세포주에 결합하는 능력이 향상되었음을 나타낸다.
"이종어드헤신"이라는 용어는 "키메라 이종다량체 어드헤신"이라는 표현과 상호교환적으로 사용되며, 각각의 키메라 분자는 생물학적 활성 부분, 예를 들어, 각각의 이종다량체성 수용체 단량체의 세포외 도메인을 다량체화 도메인과 결합시키는 키메라 분자 (아미노산 서열)의 복합체를 의미한다. "다량체화 도메인"은 이종다량체 복합체 내에서 키메라 분자의 안정한 상호작용을 촉진한다. 다량체화 도메인은 면역글로불린 서열, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 또는 키메라 이종다량체의 키메라 분자 사이에 분자간 디설피드 결합을 형성하는 유리 티올을 통해 상호작용할 수 있다. 다량체화 도메인은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 다량체화 영역은 입체 상호작용이 안정한 상호작용을 촉진할 뿐만 아니라, 단량체의 혼합물로부터 동종이량체에 비해 이종이량체의 형성을 추가로 촉진하도록 공학처리될 수 있다. "융기"는 제1 폴리펩티드의 경계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예로서, 티로신 또는 트립토판)로 교체함으로써 작제된다. 융기와 크기가 동일하거나 유사한 보상적 "캐비티(cavity)"는 임의로 제2 폴리펩티드의 경계면 상에서 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예로서, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 형성된다. 면역글로불린 서열은 반드시 그러한 것은 아니지만, 면역글로불린 불변 도메인인 것이 바람직하다. 본 발명의 키메라 내의 면역글로불린 부분은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM, 그러나, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3으로부터 얻을 수 있다.
본원에서 "Fc 영역"이라는 용어는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용되며, 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 면역글로불린 중쇄의 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 번호 매김 체계에 따라 잔기 447)은 예를 들면, 항체의 생산 또는 정제시에, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합에 의해 공학처리함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체 조성물은 K447 잔기 모두가 제거된 항체 집단, 어떤 K447 잔기도 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기를 포함하는 항체와 K447 잔기를 포함하지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에서 면역글로불린 중쇄 중에 있는 잔기를 번호 매김하는 것은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (이는 본원에서 참고로 명백히 인용된다)와 같은 EU 인덱스의 것이다. "카바트(Kabat)의 EU 인덱스"란 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호 매김을 나타낸다.
"기능적 Fc 영역"는 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 갖는다. "효과기 기능"의 예로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예로서, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 그러한 효과기 기능을 위해서는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예로서, 항체 가변 도메인)과 결합하여야 하며, 효과기 기능은 예를 들면, 본원에 개시된 다양한 분석법을 사용함으로써 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 그의 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해서 천연 서열 Fc 영역과 차이를 보이는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역, 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 천연 서열 Fc 영역, 또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역 중에 적어도 하나의 아미노산 치환, 예로서, 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 바람직하게는, 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모체 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80％의 상동성을, 가장 바람직하게는, 그와 적어도 약 90％의 상동성을, 더욱더 바람직하게는, 그와 적어도 약 95％의 상동성을 갖는다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의한 측정시, 항체의 95중량％ 초과, 가장 바람직하게는, 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제된다. 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"항체" 및 "면역글로불린"이라는 용어는 가장 넓은 의미로 상호교환적으로 사용되며, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기술됨)을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
"가변"이라는 용어는 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 항체들 사이에서 크게 상이함을 의미하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 둘 모두에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR 영역을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원에의 결합에는 직접 관여하지 않지만, 예를 들어, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같이, 상이한 효과기 기능을 나타낸다.
항체를 파파인으로 소화시키면 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 나머지 "Fc" 단편 (상기 명칭은 쉽게 결정화하는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이중-쇄 Fv 종에서, 상기 영역은 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일-쇄 Fv 종에서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 이중-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 회합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 결합 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나로 분류될 수 있다.
면역글로불린은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 상이한 부류로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위유니트 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체 내에 존재할 때 그 부분과 정상적으로 관련이 있는 기능 중 바람직하게는 적어도 하나를, 바람직하게는 그 대부분을 또는 전부를 보유하는, 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또다른 실시태양에서, 항체 단편, 예를 들면, Fc 영역을 포함하는 항체 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련이 있는 적어도 하나의 생물학적 기능, 예를 들어, FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합을 보유한다. 하나의 실시태양에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 암을 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "초가변 영역," "HVR," 또는 "HV"라는 용어는 서열에서 초가변이고/거나 구조상 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역; VH 내에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 많은 초가변 영역 묘사가 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 기초하고, 가장 흔히 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 그 대신 구조 루프의 위치를 나타낸다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합 결정 구조 분석에 기초한다. 각각의 상기 초가변 영역의 잔기를 하기와 나타낸다.
초가변 영역은 하기와 같이 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌 동일]에 따라 번호 매김된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는 것으로, 즉, 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는 변이체와 같이, 모노클로날 항체 생산시에 생성될 수 있는 가능한 변이체를 제외하면, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 동일하고/거나 같은 에피토프(들)에 결합하게 된다. 그러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 방법에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선별 방법은 다수의 클론, 예를 들어, 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양물에서 그의 생산을 개선시키고, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생산하기 위해서 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해하여야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그들의 특이성 외에도, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 기타 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, ([Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)])), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581- 597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]) 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]); 미국 특허 번호 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,591,669호 (모두 젠팜(GenPharm)); 제5,545,807호; WO 1997/17852; 미국 특허 번호 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호; 문헌 ([Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995)]) 참조)을 비롯한, 다양한 기법에 의해 제조할 수 있다.
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분 인간화된 항체는 수용체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체), 예를 들어, 마우스, 래트, 래빗 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린 (수용체 항체)이다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 추가로, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 설명에 대해서는 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다. 하기의 리뷰 논문 및 그에 인용되어 있는 참고 문헌도 참조할 수 있다: 문헌 ([Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]).
"키메라" 항체 (면역글로불린)는, 그가 원하는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종에서 유래하거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 키메라 항체 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 사용되는 바, 인간화된 항체는 키메라 항체의 하위세트이다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 여기서, 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. scFv에 대한 리뷰를 위해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조한다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는, 소정의 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 당질, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 다른 천연적으로 발생된 화합물 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게, 표적 항원은 폴리펩티드이다.
"디아바디"라는 용어는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하는데, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍을 형성할 수 있도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 상세히 기재되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나, 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체에 대한 이와 같은 정의는 구체적으로 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 제외한다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)되지 않은 모체 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 항체의 하나 이상의 CDR에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 ([Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)] 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 항체 효과기 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예로서, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
항체-의존성 세포-매개 세포독성 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예로서, 자연 살세포 (NK), 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가, 상기 세포독성의 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포로 "무장"하고 있고, 이는 상기와 같은 사멸을 위해서는 절대적으로 필요한 것이다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호 또는 미국 특허 번호 제6,737,056호 (프레스타(Presta))에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살세포 (NK)를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살세포 (NK), 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하는데; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예로서, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, 상기 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태를 비롯한, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (문헌 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 리뷰 참조). FcR은 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)] 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)])에 리뷰되어 있다. 추후에 확인되는 것을 포함하여 기타 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 본 용어는 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 면역글로불린의 항상성 조절에 작용하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다.
WO 00/42072 (프레스타)에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용이 구체적으로 본원에서 인용된다. 또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)] 참조한다.
FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Ghetie 1997], [Hinton 2004]) 참조). 생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드를 투여받은 영장류에서 분석될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 이루어지는 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 그의 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위부류의 항체)에 결합시킴으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예로서, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.
변경된 Fc 영역 아미노산 서열 갖고, C1q 결합 능력이 증가되었거나 감소된 폴리펩티드 변이체는 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,194,551호 B1 및 WO 99/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용이 구체적으로 본원에서 인용된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.
"Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 또는 면역어드헤신을 의미한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 번호 매김 체계에 따른 잔기 447)은 예를 들면, 폴리펩티드의 정제 동안 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 공학처리에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 폴리펩티드, 모든 K447 잔기가 제거된 폴리펩티드, 또는 K447 잔기를 포함하거나 포함하지 않는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제시킨다.
"장기" 투여는 장기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 단기 방식과는 반대로 연속 방식으로 약제(들)를 투여하는 것을 의미한다. "간헐" 투여는 중단하지 않고 연속적으로 수행되지 않고, 대신 사실상 주기적인 치료이다.
"질병" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 사용하는 치료가 도움이 되는 임의의 병태이다. 이는 포유동물이 해당 질병에 걸리기 쉽게 하는 병적 상태를 비롯한, 만성 및 급성 질병 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료하고자 하는 질병의 비제한적인 예로는 악성 및 양성 종양, 암종, 모세포종, 및 육종을 포함한다. 비정상적이거나 과도한 림프관신생과 관련된 병태로는 제한없이, 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 및 건선을 포함한다.
"세포 증식성 질병" 및 "증식성 질병"은 다소간의 비정상적인 세포 증식과 관련이 있는 질병을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 세포 증식성 질병은 암이다.
본원에서 사용되는 바, "종양"은 악성이든지 양성이든지 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다. "암," "암성," "세포 증식성 질병," "증식성 질병" 및 "종양"이라는 용어는 본원에서 지칭되는 바와 같이 상호 배타적인 것은 아니다.
"암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 병태를 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막의 암, 간 세포 암, 위장관암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간암(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암(liver cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 위암, 흑색종, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 혈관신생의 조절장애는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 질병을 일으킬 수 있다. 이러한 질병으로는 비신생물성 및 신생물성 병태, 둘 모두를 포함한다. 신생물성 질병은 하기 기술된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비-신생물성 질병으로는 바람직하지 못하거나 비전형적인 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건성 반점, 사코이드증, 아테롬성 동맥경화증, 죽상경화판, 당뇨성 및 기타 다른 증식 망막병증 (미숙 망막병증 포함), 수정체후 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식편 신생혈관형성, 각막 이식편 거부, 망막/맥락막 신생혈관형성, 전방각 신생혈관형성 (루베오시스), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과다증식 (그레이브스 병 포함), 각막 및 기타 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 대뇌 부종 (예를 들어, 급성 뇌졸증/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련된 대뇌 부종), 활막 염증, RA에서의 판누스 형성, 골화근육염, 비후성 골 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소병, 자궁내막증, 제3 공간으로의 체액이 이동하는 질환(3rd spacing of fluid diseases) (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유종, 조숙 산통, 만성 염증 예를 들어, IBD (크론병 및 궤양 대장염), 신장 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신증후군, 바람직하지 못하거나 비전형적인 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종, 수정체후 섬유증식증, 공피증, 트라코마, 혈관 유착, 윤활막염, 피부염, 전자간증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심장막염과 관련된 심낭 삼출), 및 흉막 삼출을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 시도로 수행되는 임상적 개입을 나타내고, 임상적 병상의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항체는 질환 또는 질병의 발생을 지연시키는데 사용된다.
"대상체"는 척추동물, 바람직하게는, 포유동물, 더욱 바람직하게는, 인간이다. 포유동물은 농장 동물 (예를 들어, 소 및 양), 경주용 동물, 애완 동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
치료를 목적으로 하는 "포유동물"은 포유동물로 분류되는 임의의 동물, 예를 들어, 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 경주용 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 나타낸다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
"유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 예를 들어, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 물질/분자, 효현제, 또는 길항제의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 물질/분자, 효현제, 또는 길항제의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 치료학적으로 유익한 효과가 있는 양이다. "예방학적 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 나타낸다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 대개 예방 용량은 질환의 보다 이른 초기 단계 전에, 또는 보다 이른 초기 단계에서 대상체에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용되는 바, "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포의 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, Il31, Il25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 (예로서, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제, 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 뉴클레오티드 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어, 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체, 및 하기 개시하는 각종 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 한다. 다른 세포독성제는 하기에 기술한다. 살종양제는 종양 세포를 파괴한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이톡산(CYTOXAN)® 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(Hycamtin)® 포함), CPT-11 (이로노테칸, 캄프토자(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히, 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디와인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항대사제, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (오레곤주 유진 소재의 JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products)); 로족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)), 아브락산(ABRAXANE)™ 크레모포-무함유(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-처리된 나노입자 제제 (일리노이주 샤윰버그 소재의 아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners)), 및 탁소티어(TAXOTERE)® 독세탁셀 (프랑스 안토니 소재의 롱-프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 겜시타빈 (젬자(GEMZAR)®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®); 및 상기 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 및 2개 이상의 상기 물질의 조합물, 예를 들어, CHOP (사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)™)을 사용한 치료 요법의 약어)를 포함한다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 신체 전체 치료 형태로 사용되는 항호르몬제가 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 그 예는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 (SERM), 예를 들어, 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 에비스타(EVISTA)® 랄록시펜, 드로록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON)® 토레미펜; 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향조절인자 (ERD); 난소를 억제하거나 기능을 차단하는 물질, 예를 들어, 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효현제, 예를 들어, 루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)® 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐제, 예를 들어, 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신선에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가제(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 상기 화학요법제의 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 디드로칼(DIDROCAL) ® 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)® 졸레드론산/졸레드로네이트, 포사맥스(FOSAMAX)® 알렌드로네이트, 아레디아(AREDIA)® 팔미드로네이트, 스키리드(SKELID)® 틸루드로네이트, 또는 액토넬(ACTONEL)® 리세드로네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 부착성 세포 증식과 관련이 있는 신호 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어, 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 GW572016으로도 알려진 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포 (예를 들어, ALK-1을 발현하는 세포)의 비율을 유의적으로 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어, G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 고전적 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 물질, 예를 들어, DNA 알킬화제, 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히, p.13]에서 살펴볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 모두 주목에서 유래된 항암약이다. 유럽 주목에서 유래된 도세탁셀 (탁소티어®), 롱-프랑 로러)은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세관의 조립을 촉진시키고, 세포의 유사분열을 억제하는 탈중합을 억제함으로써 미세관을 안정화시킨다.
질환의 "병상"이란 환자의 웰빙을 위협하는 모든 현상을 포함하다. 암의 경우로는, 제한없이, 비정상적이거나 제어가 되지 않는 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상적인 기능 방해, 사이토카인 또는 기타 다른 분비 생성물의 비정상적인 수준으로의 방출, 염증 반응 또는 면역 반응의 억제 또는 악화 등을 포함한다.
하나 이상의 추가의 치료제와 "함께" 투여한다는 것은 동시에 (동시 발생적으로) 및 임의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 바, "담체"는 사용되는 용량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충처리된 용액이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예는 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 다른 유기산; 항산화제 (아스코르브산 포함); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 당질 (글루코스, 만노스, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당 알코올, 예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨; 및/또는 비이온계 계면활성제, 예를 들어, 트윈(TWEEN)™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)™를 포함한다.
"리포좀"은 포유동물에 약물 (예를 들어, ALK-1 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체)의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포체이다. 리포좀의 성분은 일반적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형성으로 배열된다.
"VEGF" 및 "VEGF-A"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 이는 그의 천연적으로 발생된 대립유전자 형태 및 프로세싱된 형태와 함께, 문헌 ([Leung et al. Science, 246:1306 (1989)], [Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)], 및 [Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5):853-865 (2001)])에 기재되어 있는 바와 같이, 165개의 아미노산으로 이루어진 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 145-, 183-, 189-, 및 206개의 아미노산으로 혈관 내피 세포 성장 인자를 나타낸다.
"VEGF 길항제"는 하나 이상의 VEGF 수용체에의 VEGF의 결합을 비롯한, VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 의미한다. VEGF 길항제로는 항-VEGF 항체 및 그의 항원 결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에의 VEGF의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 항-VEGF 수용체 항체 및 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어, VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제, 및 융합 단백질, 예를 들어, VEGF-Trap (레제네론(Regeneron)), VEGF121-겔로닌 (페러그린(Peregrine))을 포함한다. VEGF 길항제는 또한 VEGF의 길항제 변이체, VEGF에 대해 작용하는 안티센스 분자, RNA 압타머 및 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임을 포함한다.
"항-VEGF 항체"는 충분한 친화도와 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 병태를 표적 및 간섭하는 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,582,959, 6,703,020; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202, WO 2005/044853; ; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208, 및 20050112126; 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]; 및 WO 2005012359)를 참조한다. 항-VEGF 항체는 보통 기타 다른 VEGF 상동체, 예를 들어, VEGF-B 또는 VEGF-C에도 결합하지 않을 것이며, 기타 다른 성장 인자, 예를 들어, PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. "rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴®"으로도 알려져 있는, 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에 따라 생성된 재조합 인간화된 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 돌연변이화된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에의 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 비롯한, 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％는 인간 IgG1로부터 유래된 것이며, 서열 중 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된 것이다. 베바시주맙의 분자량의 약 149,000 달톤이며, 이는 당화된 것이다. 베바시주맙 및 기타 다른 인간화된 항-VEGF 항체 ("루센티스(Lucentis)®"로도 알려져 있는 항-VEGF 항체 단편 "라니비주맙" 포함)는 추가로 2005년 2월 26일 등록된 미국 특허 번호 제6,884,879호에 추가로 기재되어 있다.
ALK-1 폴리펩티드와 관련하여 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인"이라는 용어는 ALK-1과 관련된 물리/화학적 특성 및 생물학적 기능을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1의 "생물학적 활성"은 하기 중 하나 이상을 포함한다: ALK-1 리간드, 예를 들어, BMP9 및/또는 BMP10에의 결합 또는 ALK-1 하류 분자 신호 전달 활성화, 예를 들면, Smad1, Smad5 및/또는 Smad8의 인산화를 포함한다.
"ALK-1 길항제"는 예를 들면, ALK-1 수용체 활성화의 감소 또는 차단, ALK-1 하류 분자 신호 전달, 예를 들면, Smad1, Smad5 및/또는 Smad8의 인산화의 감소 또는 차단, ALK-1에의 ALK-1 리간드 (예를 들어, BMP9 또는 BMP10) 결합 파괴 또는 차단을 비롯한, ALK-1의 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 의미한다. ALK-1 길항제는 항체 및 그의 항원 결합 단편, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 다당류, 올리고당, 핵산, 생체유기 분자, 펩티도미메틱, 약물 제제 및 그의 대사산물, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함한다. 길항제는 또한 단백질의 소분자 억제제, 및 융합 단백질 (면역어드헤신 포함), 단백질에 특이적으로 결합하여 그의 수용체에의 그의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 단백질의 길항제 변이체, 단백질에 대해 작용하는 siRNA 분자, 단백질에 대해 작용하는 안티센스 분자, RNA 압타머, 및 단백질에 대한 리보자임을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 길항제는 ALK-1에 결합하여 ALK-1의 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해하는 분자이다.
"항-신생물성 조성물"이라는 용어는 예를 들어, "항암제"와 같이 적어도 하나의 활성 치료제를 포함하는 것으로, 암 치료에 유용한 조성물을 의미한다. 치료제 (항암제, 이는 또한 본원에서 ""항-신생물성 제제"로도 명명된다)의 예로는 예를 들어, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용되는 제제, 항-혈관신생제, 아포프토시스 제제, 항-튜불린제, 독소, 및 암 치료용의 기타 다른 제제, 예를 들어, 항-VEGF 중화 항체, VEGF 길항제, 항-HER-2, 항-CD20, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제, 엘로티닙, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토카인, ErbB2, ErbB3, ErbB4 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), 또는 VEGF 수용체(들), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 및/또는 줄기 세포 인자 (SCF)에 대한 수용체 티로신 키나제에 관한 억제제 (예를 들어, 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)® 노파르티스(Novartis)), TRAIL/Apo2L, 및 기타 다른 생물학적 활성제 및 유기 화학제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서 사용되는 바, "프로드럭"은 모체 약물에 비하여 종양 세포에 대한 세포독성이 더 약하고, 효소에 의해서 더욱 활성을 띠는 모체 형태로 활성화되거나 전환될 수 있는, 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다. 예로서, 문헌 ([Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)])을 참조한다. 본 발명의 프로드럭은 보다 활성을 띠며 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는 것인, 포스포네이트-함유 프로드럭, 티오포스포-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형 프로드럭, 당화된 프로드럭, 베타-락탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 기타 다른 5-플루오로우리딘 프로드럭을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기술된 화학요법제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"혈관신생 인자 또는 혈관신생제"는 예를 들어, 혈관신생, 내피 세포 성장,혈관 안정성, 및/또는 혈관 생성 등을 촉진시키는 것과 같이, 혈관 발생을 자극하는 성장 인자이다. 예를 들면, 혈관신생 인자로는 예를 들어, VEGF 및 VEGF 패밀리의 구성원, PlGF, PDGF 패밀리, 섬유모세포 성장 인자 패밀리 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴), 에프린, ANGPTL3, ALK-1 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상처 치유를 가속화시키는 인자, 예를 들어, 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 패밀리의 구성원, 및 TGF-α 및 TGF-β도 포함할 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예를 들어, 혈관신생 인자를 나열한 표 1)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)])을 참조한다.
"항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관 생성, 또는 바람직하지 못한 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는, 소분자량 물질, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA) 포함), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 의미한다. 예를 들면, 항-혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 기타 다른 길항제, 예를 들어, VEGF에 대한 항체, VEGF 수용체에 대한 항체, VEGF 수용체 신호 전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, 수텐트(SUTENT)®/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2004/113304에 기재되어 있는 것)이다. 항-혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등도 포함한다. 예를 들어, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예를 들어, 악성 흑색종의 항-혈관신생 요법을 나열한 표 3)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예를 들어, 항혈관신생 인자를 나열한 표 2)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003) (예를 들어, 임상 시험에서 사용된 항-혈관신생제를 나열한 표 1)])을 참조한다.
본 발명의 방법 및 조성물
본 발명은 부분적으로는, ALK-1 경로를 조정하는 제제 (예를 들어, ALK-1 면역어드헤신 또는 항-ALK-1 항체)가 혈관신생과 림프관신생, 두가지 모두에 영향을 줄 수 있다는 발견을 토대로 한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 내피 세포를 ALK-1 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 내피 세포가 보다 성숙한 분화 단계로 분화되지 못하도록 하는 방법을 제공한다. 내피 세포는 임의 유형의 내피 세포, 예를 들어, 혈액 또는 림프 내피 세포일 수 있다. 또다른 측면에서, 본 발명은 혈관주위세포를 ALK-1 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 혈관주위세포 조직을 파괴시키는 방법을 제공한다. 또한, 상기 제제는 단일 제제로서, 및 VEGF 길항제와 함께 조합하여 사용될 때 종양 성장을 억제시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, ALK-1 길항제는 혈관신생 뿐만 아니라, 림프관신생과 관련된 병적 상태 및 질병에 대해 유용하다.
ALK-1 길항제는 각종 병적 상태 또는 질병을 치료 또는 예방할 수 있다는 것에 주시한다. 본 발명은 유효량의, 예를 들면, 제한 없이, ALK-1 면역어드헤신 또는 항-ALK-1 항체와 같은 ALK-1 길항제를 사용하여 ALK-1 수용체 경로의 활성화를 억제시키는, 림프관신생을 억제시키는 방법을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 림프관신생을 억제시키는 방법을 제공한다.
비정상적인 림프관신생과 관련된 병적 상태 또는 질병의 예로는, 제한 없이, 종양, 암, 종양 또는 암 전이, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 및 건선을 포함한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양성 림프관신생을 억제 또는 예방하는 방법을 제공한다. 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 전이를 억제 또는 예방하는 방법도 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 대상체는 종양 전이가 발생하였거나, 발생할 위험에 있을 수 있다. 상기 전이는 예를 들면, 림프계 또는 원위 장기에서 있어날 수 있다.
본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관주위세포 조직을 파괴시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 대상체는 종양, 암, 종양 또는 암 전이, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 및 건선을 앓는 대상체이다. 몇몇 실시태양에서, 혈관주위세포의 조직 파괴는 예를 들어, 종양 또는 암과 같이, 신생물성 질환을 앓는 대상체의 종양 혈관에서 일어난다.
본 발명은 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양, 암, 세포 증식성 질병 및/또는 신생물성 질병을 치료하는 방법을 주시한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 ALK-1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제시키는 방법을 제공한다. ALK-1 길항제를 사용하여 치료하고자 하는 신생물성 질병의 예로는 "암" 및 "암성"이라는 용어하에 정의된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 유용한 ALK-1 길항제로 치료할 수 있는 비-신생물성 병태로는 예를 들어, 바람직하지 못하거나 비전형적인 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건성 반점, 사코이드증, 아테롬성 동맥경화증, 죽상경화판, 심근경색으로부터의 부종, 당뇨성 및 기타 다른 증식 망막병증 (미숙 망막병증 포함), 수정체후 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식편 신생혈관형성, 각막 이식편 거부, 망막/맥락막 신생혈관형성, 전방각 신생혈관형성 (루베오시스), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과다증식 (그레이브스 병 포함), 각막 및 기타 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 대뇌 부종 (예를 들어, 급성 뇌졸증/폐쇄성 두부 손상/외상과 관련된 대뇌 부종), 활막 염증, RA에서의 판누스 형성, 골화근육염, 비후성 골 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소병, 자궁내막증, 제3 공간으로의 체액이 이동하는 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유종, 조숙 산통, 만성 염증 예를 들어, IBD (크론병 및 궤양 대장염), 신장 동종이식편 거부, 염증성 장 질환, 신증후군, 바람직하지 못하거나 비전형적인 조직 덩어리 성장 (비-암), 비만, 지방 조직 덩어리 성장, 혈우병성 관절, 비후성 반흔, 모발 성장 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종, 수정체후 섬유증식증, 공피증, 트라코마, 혈관 유착, 윤활막염, 피부염, 전자간증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심장막염과 관련된 심낭 삼출), 및 흉막 삼출을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 질병에 대한 추가의 예로는 상피성 질병 또는 심장 질병을 포함한다.
조합 요법
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 ALK-1 길항제 (예를 들어, ALK-1 면역어드헤신 또는 항-ALK-1 항체)를 또다른 용법과 함께 투여하는 것인 조합 요법을 제공한다. 예를 들면, ALK-1 길항제는 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 병태를 치료하는 항암제 또는 항-혈관신생제와 함께 조합하여 사용된다. 또다른 일례로, ALK-1 길항제는 항-림프관신생제 (예를 들어, VEGFC 길항제, 예를 들어, 항-VEGFC 항체)와 함께 조합하여 사용된다. 하나의 실시태양에서, 신생물성 또는 비-신생물성 병태는 비전형적이거나 바람직하지 못한 혈관신생 또는 림프관신생과 관련된 병적 질병을 특징으로 한다. ALK-1 길항제는 순차적으로, 또는 상기 목적을 위해 효과적인 또다른 제제와 함께 조합하여 동일 조성물 또는 별개의 조성물로 투여될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 다수의 ALK-1 억제제가 투여될 수 있다.
ALK-1 길항제 및 기타 다른 치료제 (예를 들어, 항암제, 항-혈관신생제)의 투여는 예를 들면, 단일 조성물로서 또는 2개 이상의 상이한 조성물로서 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 투여는 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 단계는 임의의 순서로 순차적 투여 및 동시 투여, 둘 모두의 조합으로서 수행될 수 있다.
특정 실시태양에서, 2개 이상의 조성물을 투여하는 경우, 그 둘 사이의 간격 범위는 수분 내지 수일, 수주, 수개월일 수 있다. 예를 들면, 항암제를 먼저 투여한 후, ALK-1 길항제를 투여할 수 있다. 그러나, ALK-1 길항제를 동시에 투여하거나, 먼저 투여하는 것도 주시된다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 ALK-1 길항제 (예를 들어, ALK-1 면역어드헤신 또는 항-ALK-1 항체)를 투여한 후, 항-혈관신생제 (예를 들어, VEGF 길항제, 예를 들어, 항-VEGF 항체)를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 항-혈관신생제는 항-VEGF 중화 항체 또는 단편 (예를 들어, 인간화된 A4.6.1, 아바스틴® (캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재의 제넨테크(Genentech), Y0317, M4, G6, B20, 2C3 등)이다. 예를 들어, (미국 특허 6,582,959, 6,884,879, 6,703,020; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 및 20050112126; 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004)]; 및 WO 2005012359)를 참조한다.
ALK-1 길항제와 함께 조합하여 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 치료하고자 하는 병태를 최고로 관리할 수 있는 투여량이 투여되고 그에 대한 조절이 이루어질 수 있다. 용량은 사용되는 치료제의 유형 및 치료받을 특정 환자와 같은 인자에 따라서 추가로 달라질 것이다. 항암제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 것이고, 이는 항암제 및 ALK-1 길항제의 조합 작용 (시너지)에 기인하여 줄일 수 있다. 특정 실시태양에서, 억제제의 조합은 단일 억제제의 효능을 증가시킨다. "증가시킨다"라는 용어는 통상의 용량 또는 허가받은 용량에서의 치료제 효능을 개선시키는 것을 의미한다. 본원의 약제학적 조성물이라는 표제의 섹션도 참조한다.
전형적으로 ALK-1 길항제 및 항암제는 동일하거나 유사한 질병에 대하여 병적 질병, 예를 들어, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병을 차단 또는 감소시키는데 적합하다. 하나의 실시태양에서 항암제는 항-혈관신생제이다.
암과 관련된 항혈관신생 요법은 종양 성장을 지지하기 위해 영양을 제공하는데 필요한 종양 혈관의 발생을 억제시키는 것을 목적으로 하는 암 치료 전략법이다. 혈관신생이 원발성 종양 성장과 전이, 두가지 모두에 관여하기 때문에 본 발명에 의해 제공되는 항혈관신생 치료법은 1차 부위에서의 종양의 신생물성 성장을 억제시킬 수 있을 뿐만 아니라, 2차 부위에서의 종양 전이를 예방할 수 있고, 이에 따라 다른 치료제에 의해 종양을 공격할 수 있다.
다수의 항-혈관신생제가 확인되었고, 이는 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 나열되어 있는 것, 예를 들어, 정의 섹션하에, 및 예를 들어, 문헌 ([Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)]; [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)]; 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003)])에 나열되어 있는 것을 포함한다. 또한, 미국 특허 출원 US20030055006도 참조한다. 하나의 실시태양에서, ALK-1 길항제는 항-VEGF 중화 항체 (또는 단편) 및/또는 또다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제 (예를 들면, 가용성 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, 뉴로필린 (예를 들어, NRP1, NRP2)) 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머), 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제 (RTK)의 저분자량 억제제, VEGF에 대한 안티센스 전략법, VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 리보자임, VEGF의 길항제 변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 및 그의 임의의 조합물과 함께 조합하여 사용된다. 별법으로, 또는 추가로, VEGF 길항제 및 기타 다른 제제 이외에도 2개 이상의 혈관신생 억제제가 임의로 환자에게 함께 공-투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 항암제는 ALK-1 길항제, VEGF 길항제, 및 항-혈관신생제와 함께 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, ALK-1 길항제와 함께 조합된 조합 종양 요법에 유용한 기타 다른 치료제로는 기타 다른 암 요법 (예를 들어, 수술, 방사선 치료법 (예를 들어, 방사성 물질의 조사 또는 투여를 포함), 화학요법, 본원에 나열되어 있고, 당업계에 공지되어 있는 함암제를 사용한 치료법, 또는 그의 조합 포함)을 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된, 동일하거나, 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 2개 이상의 항체는 환자에게 함께 공-투여될 수 있다. 때때로, 하나 이상의 사이토카인을 환자에게 투여하는 것도 유익할 수 있다.
화학요법제
하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 ALK-1 길항제 (및/또는 혈관신생 억제제(들)) 및 하나 이상의 화학요법제를 투여하여 질병 (예를 들어, 종양, 암, 또는 세포 증식성 질병)을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조합 치료법에서 다양한 화학요법제가 사용될 수 있다. 주시되는 화학요법제의 예에 관한 비제한적인 목록은 본원 "정의"부에서 제공된다. ALK-1 길항제 및 화학요법제의 투여는 예를 들면, 단일 조성물로서 또는 2개 이상의 상이한 조성물로서 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 투여는 임의의 순서로 순차적으로 수행될 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 단계는 임의의 순서로 순차적 투여 및 동시 투여, 둘 모두의 조합으로서 수행될 수 있다. 특정 실시태양에서, 2개 이상의 조성물을 투여하는 경우, 그 둘 사이의 간격 범위는 수분 내지 수일, 수주, 수개월일 수 있다. 예를 들면, 화학요법제를 먼저 투여한 후, ALK-1 길항제를 투여할 수 있다. 그러나, ALK-1 길항제를 동시에 투여하거나, 화학요법제 투여 이전에 ALK-1 길항제를 투여하는 것도 주시된다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 ALK-1 길항제 (예를 들어, ALK-1 면역어드헤신 또는 항-ALK-1 항체)를 투여한 후, 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
화학요법제의 적절한 용량은 화학요법제가 단독으로 또는 기타 다른 화학요법제와 함께 조합하여 투여되는 임상 요법에서 이미 사용되고 있는 양이 될 것이라는 당업계의 숙련인은 이해할 것이다. 치료되는 병태에 따라서 투여량을 달라지게 될 것이다. 치료법을 수행하는 의사는 개개의 대상체에 대해 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다.
ALK
-1
ALK-1은 TGFβ 수용체 패밀리의 내피-특이 I형 수용체이다. ALK-1 유전자는 503개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하고, 친수성의 시스테인이 풍부한 리간드-결합 도메인, 단일의 소수성 막통과 영역 및 주로 세린/트레오닌 키나제 도메인으로 구성된 C-말단 세포내 부분을 포함한다. 인간 ALK-1의 수탁 번호는 CAA80255이고, 마우스 ALK-1의 수탁번호는 CAA83484이다.
ALK-1의 돌연변이는 유전 출혈 모세혈관 확장증 2형과 관련이 있다. 여러 해동안 ALK-1은 고아 수용체였다. 이전에는 TGFβ1 및 TGFβ3이 ALK-1 리간드인 것으로 추측되긴 했지만, 최근에 ALK-1의 생리학적 리간드는 BMP9 및 BMP10인 것으로 확인되었다 (문헌 [David, L. et al., Blood 109:1953-1961 (2007)]). ALK-1의 활성화가 Smad1, Smad5 및 Smad8의 인산화를 유도할 수 있는 것으로 나타났다.
ALK
-1 길항제
주시되는 ALK-1 길항제 (예를 들어, 항-ALK-1 항체 및 ALK-1 면역어드헤신)의 예에 관한 비제한적인 목록은 본원 "정의"부에서 제공된다.
본 발명에 유용한 ALK-1 길항제는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해서 그의 물리학적/화학적 특성과 생물학적 기능에 관해 특징 규명이 이루어질 수 있다. 몇몇 실시태양에서, ALK-1 길항제는, ALK-1에의 결합, 하나 이상의 ALK-1 리간드, 예로서, BMP9 또는 BMP10에의 결합, ALK-1 수용체 활성화의 감소 또는 차단, ALK-1 하류 분자 신호 전달 (예를 들면, Smad1, Smad5 및/또는 Smad8의 인산화)의 감소 또는 차단, ALK-1에의 예를 들어, BMP9 또는 BMP10 결합 파괴 또는 차단, 혈관신생 억제, 림프관신생 억제, 종양, 세포 증식성 질병 또는 암의 치료 및/또는 예방; ALK-1 발현과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방 중 임의의 하나 이상을 특징으로 한다. ALK-1 길항제의 특징을 규명하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이중 일부를 본원에서 설명하고 예시한다.
ALK
-1
면역어드헤신
면역어드헤신의 구조 및 제조를 비롯한, 면역어드헤신은 예로서, WO 91/08298; 및 미국 특허 번호 제5,428,130호 및 제5,116,964호 (상기 문헌의 개시 내용이 본원에서 참고로 명백히 인용된다)에 기술되어 있다.
면역어드헤신
또는
키메라
이종다량체
어드헤신
제조
하기 설명은 주로 면역어드헤신 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 면역어드헤신을 제조하는 것에 관한 것이다. 물론, 당업계에 주지되어 있는 대체 방법도 면역어드헤신을 제조하는데 사용될 수 있다고 주시된다. 예를 들면, 면역어드헤신 서열, 또는 그의 일부는 고상 기법을 사용하여 직접적인 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, ([Stewart et al., Solid - Phase Peptide Synthesis , W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am . Chem . Soc., 85:2149-2154 (1963)]) 참조). 수동 기법을 사용하여 또는 자동화에 의해 시험관내 단백질 합성을 수행할 수 있다. 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기(Applied Biosystems Peptide Synthesizer) (캘리포니아주 포스트 시티 소재)를 사용하여 제조사의 설명서를 이용함으로써 자동화 합성법을 수행할 수 있다. 면역어드헤신의 다양한 부분을 각각 따로따로 화학적으로 합성한 후에 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장의 면역어드헤신을 제조할 수 있다.
천연 서열 ALK-1 수용체를 코딩하는 핵산은 예를 들면, ALK-1 수용체를 발현하는 세포로부터 단리될 수 있다. 인간 ALK-1 cDNA의 수탁 번호는 Z22533이고, 마우스 ALK-1 cDNA의 수탁번호는 Z31664.1이다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA는 공지되어 있거나, cDNA 라이브러리로부터 쉽게 이용할 수 있거나, 합성된다. 예를 들면, 문헌 ([Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719 (1980)]; [Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 (1980)]; [Dolby et al; P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980)]; [Rice et al P.N.A.S USA 79:7862-7865 (1982)]; [Falkner et al; Nature 298:286-288 (1982)]; 및 [Morrison et al; Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984)])를 참조한다.
본 발명의 면역어드헤신 또는 키메라 이종어드헤신은 바람직하게는 숙주 세포에서의 발현에 의해 제조되고 그로부터 단리된다. 숙주 세포는 일반적으로 본 발명의 핵산으로 형질전환된다. 바람직하게는, 핵산은 발현 벡터로 혼입된다. 본원의 클로닝 또는 발현 벡터용으로 적합한 숙주 세포로는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, E. 콜라이(E. coli), 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 기타 다른 세균 균주), 효모 및 기타 다른 진핵성 미생물, 및 고등 진핵 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 기타 다른 포유동물 세포)를 포함한다. 세포는 살아있는 동물에 (예를 들면, 소, 염소 또는 양에) 존재하는 것일 수 있다. 곤충 세포 또는 사용될 수 있다. 클로닝 및 발현 방법론은 당업계에 주지되어 있다.
면역어드헤신, 예를 들어, ALK1.Fc 분자 (실시예 1에 상세히 기술되어 있는 것)를 발현시키기 위해서, 하나 이상의 발현 벡터(들)를 형질전환 또는 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입하고, 프로모터를 유도하거나, 재조합 세포를 선별하거나, ALK1.Fc DNA를 증폭시키는데 적절하게 변형된, 통상의 영양 배지에서 생성된 재조합 숙주 세포를 배양시킨다. 일반적으로, 시험관내 포유동물 세포 배양물에서의 생산성을 최대화시키기 위한 원리, 프로토콜 및 실시 기법은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)]에서 살펴볼 수 있다.
면역어드헤신을
코딩하는 핵산의
작제
본 발명의 면역어드헤신을 제조할 때, 천연 수용체의 세포외 도메인을 코딩하는 핵산을 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단쪽에 융합하는 것이 바람직하지만, N-말단쪽에 융합할 수도 있다. 전형적으로, 상기 융합에서 코딩된 키메라 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의, 적어도 기능적으로 활성을 띠는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 불변 도메인의 Fc 영역의 C-말단에, 또는 중쇄의 CH1의 N-말단에 인접하게, 또는 경쇄의 상응하는 영역에 대해 융합이 이루어질 수 있다. 생성된 DNA 융합 작제물은 적절한 숙주 세포에서 발현된다.
원하는 면역어드헤신을 제조하는데 사용되는 천연 서열 세포외 도메인 (예를 들어, ALK-1로부터의 세포외 도메인) 및/또는 항체 서열의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해서 제조된다. 이러한 방법으로는 천연 공급원으로부터의 단리 또는 앞서 제조된, 천연 서열 ALK-1의 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 카세트 돌연변이유발법에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
키메라 이종어드헤신에 포함된 천연 서열 세포외 도메인의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변형을 천연 세포외 도메인 DNA 서열 내로 도입하거나, 원하는 키메라 이종어드헤신 단량체 폴리펩티드의 시험관내 합성에 의해서 제조한다. 그러한 변이체는 예를 들면, 면역어드헤신 또는 키메라 이종어드헤신 중 아미노산 서열 중의 잔기로부터의 결실, 또는 삽입 또는 치환을 포함한다.
상기 기술된 천연 서열의 변이는 보존적 및 비-보존적 돌연변이화에 대한 임의의 기법 및 가이드라인을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
하나의 실시태양에서, 핵산은, 면역글로불린, 예로서, IgG1의 효과기 기능을 포함하며, ALK-1 수용체 세포외 도메인 서열이 항체 (특히, Fc 도메인)의 C-말단부의 N-말단쪽에 융합되어 있는 키메라 분자를 코딩한다. 전체 중쇄 불변 영역을 ALK-1 수용체 세포외 도메인 서열과 융합시키는 것도 가능하다. 그러나, 더욱 바람직하게는, 파파인 절단 부위의 바로 상류에 있는 힌지 영역에서 시작되는 서열 (이는 화학적으로 IgG Fc로 정의되며; 잔기 216, (중쇄 불변 영역의 첫번째 잔기를 114로 간주) (문헌 [Kobet et al., 상기 문헌 동일]), 또는 기타 다른 면역글로불린의 유사 부위)이 융합에 사용된다. 하나의 실시태양에서, ALK-1 수용체 세포외 도메인 서열을 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 중쇄의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 또는 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합시킨다. 융합이 이루어지는 정확한 부위가 중요한 것은 아니며, 최적의 부위는 통상의 실험을 통해서 결정될 수 있다.
인간 면역어드헤신의 경우, 인간 IgG1 및 IgG3 면역글로불린 서열을 사용하는 것이 바람직하다. IgG1을 사용하는 것이 갖는 주된 장점은, IgG1 면역어드헤신이 고정화된 단백질 A 상에서 효율적으로 정제될 수 있다는 점이다. 대조적으로, IgG3을 정제하기 위해서는 유의적으로 덜 변하는 매질인 단백질 G가 필요하다. 그러나, 특정 면역어드헤신 작제를 위한 Ig 융합 파트너를 선택할 때에는 면역글로불린의 기타 다른 구조적 및 기능적 특성을 고려하여야 한다. 예를 들면, IgG3 힌지는 좀더 길고, 가요성이 더 크기 때문에, IgG1에 융합되었을 때 적절히 폴딩할 수 없거나 기능을 발휘하지 못하는 보다 큰 "어드헤신" 도메인을 제공할 수 있다. 또다른 고려 사항은 원자가일 수 있다; IgG 면역어드헤신은 2가 동종이량체인 반면, IgA 및 IgM과 같은 Ig 하위유형은 각각 기본 Ig 동종이량체 유니트의 이량체 또는 사량체 구조를 형성할 수 있다.
생체내 적용을 위해 디자인된 ALK-1 면역어드헤신의 경우, Fc 영역에 의해 특정되는 효과기 기능과 약동학적 특성도 중요하다. IgG1, IgG2 및 IgG4 모두 생체내 반감기는 21일이지만, 보체계를 활성화시키는데 있어서의 그들의 상대적인 효능은 상이하다. IgG4는 보체를 활성화시키지 못하고, IgG2는 보체 활성화에 있어 IgG1보다 유의적으로 더 약하다. 또한, IgG1과 달리, IgG2는 단핵 세포 또는 호중구 상의 Fc 수용체에 결합하지 못한다. 보체 활성화를 위해서는 IgG3이 최적인 반면, 그의 생체내 반감기는 기타 다른 IgG 반감기의 약 ⅓ 정도이다.
인간용 치료제로서 사용될 수 있도록 디자인된 면역어드헤신에 대한 고려 사항 중 또다른 중요 사항은 특정 이소형의 동종이형 변이체의 갯수이다. 일반적으로, 혈청학적으로 정의된 동종이형의 수가 더 적은 IgG 이소형이 바람직하다. 예를 들면, IgG1은 혈청학적으로 정의된 동종이형 부위를 단지 4개 갖는데, 이중 둘 (G1m 및 2)은 Fc 영역 중에 위치하고, 이들 부위 중 하나인 G1m1은 비-면역원성이다. 대조적으로, IgG3에는 혈청학적으로 정의된 동종이형이 12개 존재하는데, 이들 모두 Fc 영역에 존재하면, 이중 단지 3개 (G3m5, 11 및 21)만이 비-면역원성인 하나의 동종이형을 갖는다. 따라서, IgG3 면역어드헤신의 잠재적인 면역원성은 IgG1 면역어드헤신의 것보다 더 크다.
AKL-1 수용체 서열 (예로서, 세포외 도메인 서열) 및 면역어드헤신의 Ig 부분을 코딩하는 cDNA는, 선택된 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터 내로 나란히 직렬로 삽입된다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해서는, 예를 들면, pRK5-기반 벡터 (문헌 [Schall et al., Cell 61, 361-370 (1990)]) 및 CDM8-기반 벡터 (문헌 [Seed, Nature 329, 840 (1989)])가 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-지정 결실 돌연변이유발법을 사용하여 디자인된 연접부 코돈 사이의 추가 서열을 제거함으로써 정확한 연접부를 생성할 수 있다 (문헌 ([Zoller and Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982)]; [Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989)])). 각 절반이 원하는 연접부 양측 상의 서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있고; 36 내지 48-mers가 이상적이다. 별법으로, PCR 기법을 사용하여 프레임 내의 두 분자 부분을 적절한 벡터와 연결시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 키메라 이종어드헤신 폴리펩티드는, 키메라 이종어드헤신의 단량체와, 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드가 융합된 융합체를 제공한다. 상기와 같이 에피토프가 태깅된 형태의 키메라 이종어드헤신의 존재는 태그 폴리펩티드에 대해 작용하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있기 때문에 상기와 같은 형태의 키메라 이종어드헤신이 유용하다. 또한, 에피토프 태그를 제공하면 항-태그 항체를 사용하여 친화도 정제에 의해서 쉽게 정제할 수 있다. 태그 폴리펩티드와 그에 대한 각 항체는 당업계에 주지되어 있다. 그 예로 flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5(12):3610-3616 (1985)]); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)])를 포함한다.
키메라 이종다량체에 대한 또다른 유형의 공유 변형으로는 이종다량체의 단량체 폴리펩티드를 각종 비-단백질성 중합체, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결시키는 것을 포함한다. 키메라 이종다량체는 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합화에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 면역어드헤신을 위한, 본원에 기술된 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양시킨다. 예를 들어, 배지 온도, pH 등의 배양 조건은 과도한 실험없이도 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화시키기 위한 원리, 프로토콜 및 실시 기법은 문헌 ([Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach , M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al. 상기 문헌 동일])에서 살펴볼 수 있다.
형질전환 또는 형질감염 후에, 본 발명의 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있거나, 염색체외 요소로서 존재할 수 있다. 진핵 세포 형질감염 방법 및 원핵 세포 형질전환 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 그 예로는 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개법 및 전기천공법을 포함한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기법을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]에 기재된 바와 같이, 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵 생물에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 ([Shaw et al., Gene. 23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859)에 기재된 바와 같은 특정 식물 세포의 형질전환을 위해 사용된다. 그러한 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 번호 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 전형적으로 문헌 ([Van Solingen et al., J. Bact ., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al. Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ), 76:3829 (1979)])의 방법에 따라 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들어, 핵 미세주사, 전기천공, 무손상 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법도 또한 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하기 위한 다양한 기술에 대해서는 문헌 ([Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature. 336:348-352 (1988)])을 참조한다.
본원에서 벡터 내에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위해 적합한 숙주 세포는 원핵, 효모, 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 적합한 원핵 생물은 진정세균, 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 예를 들어, E. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 E. 콜라이 균주, 예를 들어, E. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); E. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 이용가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 엔테로박테리아세, 예를 들어, 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어, E. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스(Bacilli), 예를 들어, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어. P. 애루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이다. 바람직하게, 숙주 세포는 최소량의 단백 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이를 발생시키도록 변형될 수 있고, 상기 숙주의 예는 완전한 유전형 tonA를 갖는 E. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전형 tonA ptr3을 갖는 E. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan r 을 갖는 E. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 을 갖는 E. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이가 존재하는 균주 37D6인 E. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일 등록된 미국 특허 번호 제4,946,783호에 개시된 돌연변이체 주변 세포질 프로테아제를 갖는 E. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
원핵 생물 이외에, 진핵 미생물, 예를 들어, 사상형 진균 또는 효모가 면역어드헤신-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)는 흔히 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 숙주로는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (문헌 ([Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383)); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주 ((미국 특허 번호 제4,943,529호; 문헌 [Fleer et al., Bio / Technology. 9:968-975 (1991)])), 예를 들어 K. 락티스(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Bacteriol . 154(2):737-1742 [1983]]), K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커라미(K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio / Technology, 8:135 (1990)]), K. 테르모톨레란스(K. thermotolerans) 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76:5259-5263 [1979]]); 쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어, 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 사상형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 A. 니둘란스(A. nidulans) (문헌 ([Ballance et al., Biochem . Biophys . Res . Commun., 112:284-289 [1983]]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [19831]; [Yelton et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 81: 1470-1474 [1984]])) 및 A. 니거(A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]])를 포함한다. 메탄올 자화(methylotropic) 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다, 클로에케라(Kloeckera), 피키아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 효모 부류의 예시적인 특정 종에 관한 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 살펴볼 수 있다.
당화된 면역어드헤신의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 뿐만 아니라, 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 더축 구체적인 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양물 중에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포 (문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)])); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, (문헌 [Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)])); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, (문헌 [Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)])); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 적절한 숙주 세포를 선택하는 것은 당업계의 기술내 포함되어 있는 것을 간주된다.
일반적으로, ALK-1 면역어드헤신의 발현을 위한 포유동물 숙주 세포를 선택하는 것은 대개 발현 벡터에 따라 달라진다. 또다른 고려 사항은 필요한 단백질의 양이다. 종종 일과성 형질감염에 의해서는 밀리그램의 양으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 인산칼슘법의 변형 방법에 의해 아데노바이러스 EIA-형질감염된 293 인간 배아 신장 세포주를 pRK5-기반 벡터로 일과성으로 형질감염시킴으로써 면역어드헤신이 효율적으로 발현될 수 있게 할 수 있다. CDM8-기반 벡터를 사용함으로써 DEAE-덱스트란 방법에 의해서 COS 세포를 형질감염시킬 수 있다 (문헌 ([Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990)]; [Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347-353 (1990)])). 더 많은 양의 단백질이 필요할 경우에는 숙주 세포주를 안정적으로 형질감염시킨 후에 면역어드헤신을 발현시킬 수 있다. 예를 들면, pRK5-기반 벡터는, 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하고 G418에 대한 내성을 부여하는 추가의 플라스미드의 존재하에 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 내로 도입될 수 있다. 배양물 중에서 G418에 대해 내성을 갖는 클론을 선별할 수 있다: 수준이 증가된 DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에서 상기 클론을 성장시키고; 클론을 선별하는데, DHFR 및 면역어드헤신 서열을 코딩하는 다수의 유전자 카피를 함께 증폭시킨다. 면역어드헤신이 그의 N-말단에 소수성 리더 서열을 함유한다면, 형질감염된 세포에 의해서 프로세싱되고 분비될 수 있다. 구조가 더 복잡한 면역어드헤신을 발현시키기 위해서는 특별하게 적합화된 숙주 세포가 필요할 수 있는데; 예를 들면, 성분, 예를 들어, 경쇄 또는 J 쇄가 특정 흑색종 또는 하이브리도마 세포 숙주에 의해 제공될 수 있다 (문헌 ([Gascoigne et al., 1987, 상기 문헌 동일]; [Martin et al., J. Virol. 67, 3561-3568 (1993)])).
복제가능 벡터의 선별 및 용도
면역어드헤신을 코딩하는 핵산은 클로닝 (DNA 증폭)을 위해, 또는 발현을 위해서 복제가능 벡터로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지 형태로 존재할 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 성분 중 하나 이상을 포함하는 적합한 벡터 작제시 당업자에게 공지된 표준 결찰 기법이 사용된다.
면역어드헤신은 직접적으로 재조합 방식으로 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 신호 서열, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 면역어드헤신-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더로 구성된 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 α-인자 리더 및 미국 특허 번호 제5,010,182호에 기재된 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 단백질의 분비를 지시하기 위해 포유동물 신호 서열, 예를 들어, 동일한 또는 관련 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더가 사용될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터, 둘 모두는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 그러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 주시되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 세균에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기점이 효모에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스 또는 BPV)이 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 대해 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로, 선별가능한 마커로도 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들면, 바실러스에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 면역어드헤신-코딩 핵산을 흡수하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어, DHFR, 또는 티미딘 키나가 있다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조하고 번식시킨 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 트립토판 중에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 보통 mRNA 합성을 지시하는, 면역어드헤신-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터가 주지되어 있다. 원핵 숙주와 함께 사용하는데 적합한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 ([Chang et al., Nature. 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature. 281:544 (1979)])), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776), 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 면역어드헤신을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함할 것이다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 ([Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)])), 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 면역어드헤신 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 화합성이라면, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 레트로바이러스 (예를 들어, 조류 육종 바이러스), 사이토메갈로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터; 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 또는 열-충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 제어된다.
고등 진핵생물에 의한 면역어드헤신을 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키도록 프로모터에 대해 작용하는, 보통 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스 작용 요소이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예로는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 면역어드헤신 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터도 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 면역어드헤신을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양액에서 면역어드헤신의 합성에 채용하기 적합한 추가의 다른 방법, 벡터, 및 숙주 세포는 문헌 ([Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058)에 기재되어 있다.
면역어드헤신의
정제 및 특징 규명
면역어드헤신 또는 키메라 이종어드헤신은 또한 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있지만, 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수된다. 제1 단계로서, 입자형 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거하고; 임의로, 단백질을 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터를 사용하여 농축시킨 후, 면역친화도 칼럼 상의 분획화; 이온-교환 칼럼 상의 분획화; 황산암모늄 또는 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 헤파린 세파로스(Sepharose) 상의 크로마토그래피; 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 및 겔 여과로부터 선택되는 하나 이상의 정제 방법에 의해서 기타 다른 불순물로부터 분리시킬 수 있다.
면역어드헤신을 정제하는데 있어 특히 유익한 방법은 친화도 크로마토그래피이다. 친화도 리간드를 선택하는 것은 키메라에 사용되는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 중쇄에 기초한 면역어드헤신을 정제하는데 사용될 수 있다(문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 IgG3에 대해 추천된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5, 15671575 (1986)]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스일 수 있지만, 다른 매트릭스 또한 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 조절형 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠을 통해 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 갖게 된다. 면역어드헤신이 단백질 A 또는 G 친화도 칼럼에 결합하는 조건은 전체적으로 Fc 도메인의 특징; 특, 그의 종 및 이소형에 의해 조정된다. 일반적으로, 적절한 리간드가 선택되었을 때에 조절되지 않은 배양액으로부터 직접적으로 효율적인 결합이 일어난다. 면역어드헤신의 한가지 특징적인 특성은 인간 IgG1 분자의 경우, 단백질 A에 대한 결합능이 동일한 Fc 유형의 항체에 비하여 다소 감소되어 있다는 점이다. 결합된 면역어드헤신은 산성 pH (3.0 이상)에서 또는 약각의 카오트로픽 염을 함유하는 중성 pH 완충액 중에서 효율적으로 용출될 수 있다. 이러한 친화도 크로마토그래피 단계를 통해 >95％ 순도의 면역어드헤신 제제가 생산될 수 있다.
면역어드헤신을 정제하는데에는 단백질 A 또는 G 상의 친화도 크로마토그래피 대신, 또는 그 이외에도 당업계에 공지된 기타 다른 방법이 사용될 수 있다. 면역어드헤신은 친티오성(thiophilic) 겔 크로마토그래피 (문헌 [Hutchens and Porath, Anal. Biochem. 159, 217-226 (1986)]) 및 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 (문헌 [Al-Mashikhi and Makai, J. Dairy Sci. 71, 1756-1763 (1988)])에서 항체와 유사한 방식으로 반응한다. 그러나, 이온 교환 칼럼 상에서 면역어드헤신의 반응은 항체와는 대조적으로 그의 등전점 뿐만 아니라, 그의 키메라 성질에 기인하여 분자 중에 존재할 수 있는 전하 쌍극자에 의해 조정된다.
에피토프가 태깅된 면역어드헤신의 제조는 융합 폴리펩티드에 흡착하는 에피토프에 대한 항체를 포함한, 면역친화도 칼럼을 이용하는 정제를 촉진시킨다.
몇몇 실시태양에서, ALK-1 면역어드헤신은 본질적으로 WO 91/08298에 예시된 바와 같이, 단량체, 또는 이종- 또는 동종-다량체, 이량체 또는 삼량체로서 조립된다. 일반적으로, 이들 조립된 면역글로불린은 공지된 단위 구조를 갖는다. 4쇄로 구성된 기본 구조 단위는 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4쇄로 구성된 단위 구조가 고분자량 면역글로불린에서 반복된다; IgM은 일반적으로 디설피드 결합에 의해 유지되는 4쇄로 구성된 기본 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린 또한 혈청 중에서 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체일 경우, 각각의 4쇄로 구성된 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 ALK-1 면역어드헤신은 하기 특성들: ALK-1 수용체 활성화의 감소 또는 차단, ALK-1 하류 분자 신호 전달, 예를 들면, Smad1, Smad5 및/또는 Smad8의 인산화의 감소 또는 차단, ALK-1에의 ALK-1 리간드 (예를 들어, BMP9 또는 BMP10) 결합 파괴 또는 차단을 비롯한, ALK-1의 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 감소 또는 방해할 수 있는 특성 중 임의의 하나 이상을 가질 것이다.
항체
하나의 실시태양에서, 항-ALK-1 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에서 제공하는 항-ALK-1 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 (Fab')2 단편 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 이들 항체 단편은 예를 들면, 효소적 소화와 같은 전통적인 수단에 의해 형성될 수 있거나, 재조합 기법에 의해 생성될 수 있다. 그러한 항체 단편은 키메라 또는 인간화된 것일 수 있다. 이러한 단편은 하기 기술하는 진단 및 치료 목적에 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 것으로, 즉, 이 집단을 포함하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"이란 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다.
항-ALK-1 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 제4,816,567호)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터는 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. ALK-1에 대한 항체는 ALK-1 및 애주번트를 피하 (sc) 또는 복강내로 (ip) 다회 주사하여 동물에서 유도된다. ALK-1은 그 일부가 본원에서 추가로 기재되는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, ALK-1의 재조합 방식에 따른 생산은 하기에 기술되어 있다. 하나의 실시태양에서, 동물을 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분에 융합된 ALK-1의 세포외 도메인 (ECD)을 함유하는 ALK-1의 유도체로 면역화시킨다. 또다른 실시태양에서, 동물을 ALK-1-IgG1 융합 단백질로 면역화시킨다. 보통 동물을 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM) (몬타나주 해밀턴 소재의 리비 이뮤노켐 리서치, 인크.(Ribi Immunochem. Research, Inc.))를 사용하여 ALK-1의 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시키고, 용액을 여러 부위에 피내로 주사한다. 2주 후, 동물을 부스팅시킨다. 7 내지 14일 후, 동물을 출혈시키고, 혈청을 항-ALK-1 역가에 대해 분석한다. 동물을 역가가 안정한 수준에 도달할 때까지 부스팅한다.
별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 하이브리도마 세포를 형성하는데 적합한 융합제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예를 들어, 융합되지 않은 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 배양 배지에 시딩하고 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우라면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함하는데, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방해한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 지지하고, 배지, 예를 들어, HAT 배지에 민감한 세포이다. 이중, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 로크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능)에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 것으로 기재된 바 있다 (문헌 ([Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)])).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 ALK-1에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어, 방사면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 측정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드(Scatchard) 분석에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론을 제한 희석 방법에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)])에 의해 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 방법, 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
항-ALK-1 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론을 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 사용함으로써 제조할 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 디스플레이하는 파지를 함유하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 선택된다. 이러한 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대한 친화도 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되어, 라이브러리 내의 비-결합 클론으로부터 분리된다. 이어서, 결합 클론을 항원으로부터 용출시키고, 항원 흡착/용출의 반복되는 추가의 사이클에 의해 더욱 농축시킬 수 있다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에 기재된 바와 같이, 임의의 항-ALK-1 항체는 관심의 대상이 되는 파지 클론에 대해 선택하는데 적합한 항원 스크리닝 방법을 디자인한 후, 관심의 대상이 되는 파지 클론으로부터의 Fv 서열 및 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 사용하여 전장 항-ALK-1 항체 클론을 작제함으로써 얻을 수 있다.
항체의 항원 결합 도메인은, 둘 모두가 3개의 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 제공하는 것인, 약 110개의 아미노산으로 이루어진 2개의 가변 (V) 영역 (각각 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)에 하나씩)으로부터 형성된다. 가변 도메인은 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol, 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 단일 쇄 Fv (scFv) 단편으로서 (여기서, VH 및 VL은 짧은 가요성 펩티드를 통해 공유 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 이들을 각각 불변 도메인에 융합되고, 비공유 상호작용한다) 파지 상에 기능적으로 디스플레이될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, scFv 코딩 파지 클론 및 Fab 코딩 파지 클론은 통칭하여 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 지칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 따로 클로닝되고, 파지 라이브러리 내에서 무작위로 재조합될 수 있고, 이어서 이는 항원 결합 클론에 대해 검색될 수 있다. 면역화 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 별법으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이, 임의의 면역화없이 광범위한 비-자가 및/또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해, 천연 레퍼토리가 클로닝될 수 있다. 마지막으로, 천연 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 부위를 코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써 합성적으로 제조될 수 있다.
사상형 파지는 부(minor) 외피 단백질 pIII에의 융합에 의해 항체 단편을 디스플레이하는데 사용된다. 항체 단편은 단일 쇄 Fv 단편으로서 (여기서, VH 및 VL 도메인은 예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 기재된 바와 같이 가요성 폴리펩티드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩티드 쇄 상에서 연결된다), 또는 Fab 단편으로서 (여기서, 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al.,, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)]에 기재된 바와 같이 하나의 쇄는 pIII에 융합되고, 다른 쇄는 세균 숙주 세포 원형질막 공간 내로 분비되어, 여기서 Fab-외피 단백질 구조의 조립체가 야생형 외피 단백질의 일부를 치환함으로써 파지 표면 상에 디스플레이된다) 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수거한 면역 세포로부터 수득한다. 항-ALK-1 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 바람직한 경우, 대상체를 ALK-1로 면역화시켜 항체 반응을 일으키고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 또는 다른 말초혈 림프구 (PBL)를 라이브러리 작제를 위해 회수한다. 바람직한 실시태양에서, 항-ALK-1 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 ALK-1 면역화가 ALK-1에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 유도하도록 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 갖는 (또한 기능적 내인성 항체 생산 시스템이 결핍된) 트랜스제닉 마우스에서 항-ALK-1 항체 반응을 생성함으로써 수득한다. 인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 하기에 기술한다.
항-ALK-1 반응성 세포 집단을 추가로 농축시키는 것은 예를 들어, ALK-1 친화도 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 ALK-1에 대한 세포의 흡착 후 유동-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 세포 분리에 의해 ALK-1-특이적 막 결합 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 적합한 스크리닝 방법을 이용하여 수득할 수 있다.
별법으로, 비면역화 공여체로부터의 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL을 사용함으로써 가능한 항체 레퍼토리의 보다 우수한 예시를 제공하고, 또한 ALK-1가 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 사용한 항체 라이브러리를 작제할 수 있다. 시험관내 항체 유전자 작제를 포함하는 라이브러리에 대해, 재배열되지 않은 항체 유전자 세그먼트를 코딩하는 핵산을 제공하기 위해서 줄기 세포를 대상으로부터 수거한다. 관심의 대상이 되는 면역 세포는 각종 동물 종, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 늑대, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종 등으로부터 얻을 수 있다.
항체 가변 유전자 세그먼트 (예를 들어, VH 및 VL 세그먼트)를 코딩하는 핵산을 관심의 대상되는 세포로부터 회수하고 증폭시킨다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 원하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA를 단리시킨 후, 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:3833-3837 (1989)]에 기재된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 매치시키는 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 제조함으로써 수득할 수 있다. V 유전자는 문헌 ([Orlandi et al., (1989)] 및 [Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)])에 기재된 바와 같이, 성숙 V-도메인을 코딩하는 엑손의 5' 말단에서 역방향 프라이머 및 J-세그먼트 내에 기반한 정방향 프라이머를 사용하여 cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭시키기 위해서는, 역방향 프라이머 또한 문헌 [Jones et al., Biotechnol, 9: 88-89 (1991)에 기재된 바와 같이 리더 엑손에 기반할 수 있고, 정방향 프라이머는 문헌 [Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)]에 기재된 바와 같이 불변 영역 내에 기반할 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, 문헌 ([Orlandi et al. (1989)] 또는 [Sastry et al. (1989)])에 기재된 바와 같이 프라이머 내에 축퇴성을 혼입시킬 수 있다. 바람직하게는, 라이브러리 다양성은 예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]의 방법 또는 문헌 [Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)]의 방법에 기재된 바와 같이 면역 세포 핵산 샘플 내에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭하기 위해 각각의 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 사용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀 제한 부위가 문헌 [Orlandi et al. (1989)]에 기재된 바와 같이 한 단부에서 태그로서, 또는 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 태깅된 프라이머를 사용하는 추가의 PCR 증폭에 의해 PCR 프라이머 내에 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 세그먼트로부터 시험관내에서 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 세그먼트는 클로닝되고 서열 분석되고 (문헌 [Tomlinson et al., J. Mol. Biol, 227: 776-798 (1992)]에 보고됨), 지도화되었고 (문헌 [Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)]에 보고됨); 상기 클로닝된 세그먼트 (H1 및 H2 루프의 주요 형태를 모두 포함하는 세그먼트)는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 코딩하는 PCR 프라이머를 사용하여 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하는데 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)]에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에 집중된 모든 서열 다양성을 갖도록 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 세그먼트가 클로닝되어 서열 분석되었고 (문헌 [Williams and Winter, Eur. J. Immunol, 23: 1456-1461 (1993)]에 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는데 사용될 수 있다. (VH 및 VL 폴드의 범위, 및 L3 및 H3 길이에 기반하는) 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당히 구조적으로 다양한 항체를 코딩할 것이다. V-유전자 코딩 DNA의 증폭 후, 생식계열 V-유전자 세그먼트는 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227: 381-388 (1992)]의 방법에 따라 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 몇 가지 방식으로 함께 결합함으로써 작제될 수 있다. 각각의 레퍼토리는 상이한 벡터 내에 생성될 수 있고, 벡터는 예를 들어, 문헌 [Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)]에 기재된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들어, 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)]에 기재된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 E. 콜라이 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기의 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-쇄 특성을 활용한다. 천연 VH 및 VL 레퍼토리는 하나는 파지미드 내로, 다른 하나는 파지 벡터 내로 따로 클로닝된다. 이어서, 2개의 라이브러리는 파지미드-함유 세균의 파지 감염에 의해 조합되어, 각각의 세포가 상이한 조합을 함유하고, 라이브러리 크기는 존재하는 세포의 수에 의해서만 제한된다 (약 1012개 클론). 두 벡터 모두는 생체내 재조합 신호를 함유하여, VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘 상으로 재조합되고, 파지 비리온 내로 함께 패킹된다. 상기 큰 라이브러리는 우수한 친화도 (약 10-8 M의 Kd -1)를 갖는 다수의 다양한 항체를 제공한다.
별법으로, 레퍼토리들은 예를 들어, 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝되거나, 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립된 후 클로닝될 수 있다. PCR 조립은 또한 VH 및 VL DNA를 가요성 펩티드 스페이서를 코딩하는 DNA와 연결시켜 단일 쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하는데 사용될 수 있다. 추가의 또다른 기법에서, 문헌 [Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)]에 기재된 바와 같이 "세포내 PCR 조립"은 VH 및 VL 유전자를 림프구 내에서 PCR로 결합시킨 후, 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하는데 사용된다.
천연 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 중간 정도의 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1)의 것일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 문헌 [Winter et al., (1994), 상기 문헌 동일]에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리를 작제하고 그로부터 재선택함으로써 시험관내에서 모사될 수도 있다. 예를 들어, 돌연변이는 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법에서 오류-허용 중합효소 (문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고됨)를 사용함으로써 시험관내에서 무작위로 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은 예를 들어, 선택된 개별 Fv 클론에서 관심의 대상이 되는 CDR에 이르는 무작위 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR을 이용하여 하나 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이화시키고, 보다 고친화도의 클론을 스크리닝함으로써 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 공개)에서는 경쇄 유전자의 라이브러리를 생성하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이를 유발하는 방법을 기재한 바 있다. 또다른 효과적인 접근법은 비면역화 공여체로부터 얻은 천연적으로 발생된 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 사용하는 파지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 문헌 [Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 수회의 쇄 재셔플링으로 보다 고친화도에 대해 스크리닝하는 것이다. 상기 기법을 통해 친화도가 10-9 M 범위인 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다.
ALK-1 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 추가로 논의한다. ALK-1을 코딩하는 DNA는 당업계에 공지되어 있는 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 방법으로는 문헌 [Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl, 28: 716-734 (1989)]에 기재되어 있는 임의의 방법, 예를 들어, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트 방법에 의한 화학적 합성법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 실시태양에서, ALK-1 코딩 DNA를 디자인하는데 발현 숙주 세포가 선호하는 코돈이 사용된다. 별법으로, ALK-1을 코딩하는 DNA는 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
ALK-1을 코딩하는 DNA 분자의 작제 후, DNA 분자는 발현 벡터, 예를 들어, 플라스미드 중의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되는데, 여기서, 제어 서열은 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 숙주 세포와 화합성인 종으로부터 유래된 복제 및 제어 서열을 포함한다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 추가로 기술한다. 진핵 유기체, 예를 들어, 효모, 또는 다세포 유기체, 예를 들면, 포유동물로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다.
임의로, ALK-1을 코딩하는 DNA는 숙주 세포에 의해 배양 배지로 발현 생성물이 분비될 수 있게 하는 분비 리더 서열로 작동가능하게 연결된다. 분비 리더 서열의 예로는 stII, 에코틴, lamB, 헤르페스 GD, lpp, 알칼리성 포스파타제, 인버타제 리더, 및 알파 인자를 포함한다. 또한, 단백질 A의 36 아미노산 리더 서열도 본원에서 사용하기에 적합하다 (문헌 [(Abrahmsen et al., EMBO J., 4: 3901 (1985))]).
숙주 세포를 상기 기술된 본 발명의 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염시키고, 바람직하게는 형질전환시킨 후, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된, 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.
형질감염이란, 임의의 코딩 서열이 사실상 발현되든 아니든 간에 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 유입을 의미하는 것이다. 많은 형질감염 방법이 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 그 예로는 CaPO4 침전 및 전기천공이 있다. 상기 벡터의 조작에 대한 임의의 지시가 숙주 세포 내에서 일어날 경우, 일반적으로 성공적인 형질감염인 것으로 이해된다. 형질감염 방법은 당업계에 주지되어 있고, 일부는 본원에서 추가로 기술한다.
형질전환이란, 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해서 DNA가 복제될 수 있도록, DNA를 유기체 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그러한 세포에 적절한 표준 기법을 사용함으로써 수행된다. 형질전환 방법은 당업계에 주지되어 있고, 일부는 본원에서 추가로 기술한다.
일반적으로 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌 동일]에 기재되어 있는 바와 같이 ALK-1을 제조하는데 사용되는 원핵 숙주 세포를 배양할 수 있다.
당업계에 주지되어 있고, 일부는 본원에서 추가로 기술하는, 각종 배지 중에서 ALK-1을 제조하는데 사용되는 포유동물 숙주 세포를 배양할 수 있다.
본 개시 내용에서 언급하는 숙주 세포는 시험관내 배양물 중의 세포 뿐만 아니라, 숙주 동물 내에 있는 세포도 포함한다.
ALK-1를 정제하는 것은 당업계에서 인정되는 방법으로서, 그 일부는 본원에 기술되어 있는 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다.
정제된 ALK-1은 파지 디스플레이 클론의 친화도 크로마토그래피 분리에 사용하기에 적합한 매트릭스, 예를 들어, 아가로스 비드, 아크릴아미드 비드, 유리 비드, 셀룰로스, 다양한 아크릴 공중합체, 하이드록실 메타크릴레이트 겔, 폴리아크릴 및 폴리메타크릴 공중합체, 나일론, 중성 및 이온성 캐리어와 같은, 적합한 매트릭스에 부착될 수 있다. ALK-1 단백질을 매트릭스에 부착시키는 것은 문헌 [Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)]에 기재되어 있는 방법에 의해 달성될 수 있다. 단백질 리간드를 다당류 매트릭스, 예로서, 아가로스, 덱스트란 또는 셀룰로스에 부착시키는데 통상 사용되는 기법은 시아노겐 할라이드로 캐리어를 활성화시킨 후, 펩티드 리간드의 1차 지방족 또는 방향족 아민을 활성화된 매트릭스에 커플링시키는 것을 포함한다.
별법으로, ALK-1은 흡착 플레이트의 웰을 코팅하는데 사용될 수 있거나, 흡착 플레이트에 고정된 숙주 세포 상에서 발현될 수 있거나 세포 분류에서 사용될 수 있거나, 스트렙트아비딘-코팅된 비드로 포획하기 위해 비오틴에 접합될 수 있거나, 파지 디스플레이 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 기타 다른 방법에서 사용될 수 있다.
파지 라이브러리 샘플을 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는데 적합한 조건하에 고정된 ALK-1과 접촉시킨다. 보통, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 조건을 모사하도록 선택된다. 고체상에 결합된 파지를 세척한 후, 예를 들어, 문헌 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)]에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991)]에 설명된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]의 항원 경쟁 방법에 유사한 방법으로 ALK-1 항원 경쟁에 의해 용출시킨다. 파지는 1회의 선택 주기로 20-1,000배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파지를 세균 배양물 내에서 성장시키고, 추가 회차의 선택 주기를 실행할 수 있다.
선택 효율은 세척하는 동안의 해리 역학, 및 단일 파지 상에서 다수 항체 단편이 항원과 동시에 결합할 수 있는지 여부를 비롯한, 많은 요인에 따라 달라질 수 있다. 고속 해리 역학 (및 약한 결합 친화도)을 갖는 항체는 단시간의 세척, 다가 파지 디스플레이 및 고체상에서 높은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 보유시킬 수 있다. 고밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정화시킬 뿐만 아니라, 해리된 파지의 재결합에 유리하다. 저속 해리 역학 (및 우수한 결합 친화도)을 갖는 항체를 선택하는 것은 문헌 ([Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)] 및 WO 92/09690)에 기재된 바와 같이 장기간의 세척 및 1가 파지 디스플레이, 및 문헌 [Marks et al., Biotechnol, 10: 779-783 (1992)]에 기재된 바와 같이 낮은 코팅 밀도의 항원을 사용하여 촉진될 수 있다.
ALK-1에 대한 상이한 친화도, 심지어 근소하게 상이한 친화도를 갖는 파지 항체 사이에서 선택할 수도 있다. 그러나, (예로서, 상기 기술된, 일부 친화도 성숙 기법에서 수행되는) 선택된 항체의 무작위 돌연변이화는 대부분은 항원에 결합하고 몇몇은 보다 고친화도를 갖는 많은 돌연변이체를 초래하는 경향이 있다. ALK-1을 제한하면, 희귀한 고친화도 파지가 경쟁에 의해 제거될 수 있다. 보다 고친화도의 돌연변이체를 모두 보유하기 위해, 파지를 과량의 비오틴화된 ALK-1과 함께 인큐베이션시킬 수 있지만, 비오틴화된 ALK-1은 ALK-1에 대한 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도로 사용된다. 이어서, 고친화도 결합 파지를 스트렙트아비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획할 수 있다. 그러한 "평형 포획"에 의해 항체를 그들의 결합 친화도에 따라 선택할 수 있고, 그의 감도로 인해 초과량의 보다 낮은 친화도의 파지로부터 2배 더 높은 정도로 낮은 친화도를 갖는 돌연변이체 클론을 단리시킬 수 있다. 고체상에 결합된 파지를 세척하는데 사용되는 조건은 또한 해리 역학을 기초로 하여 차별화되도록 조작될 수 있다.
항-ALK-1 클론은 활성에 기초하여 선택될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 ALK-1 수용체 활성화의 감소 또는 차단, ALK-1 하류 분자 신호 전달, 예를 들면, Smad1, Smad5 및/또는 Smad8의 인산화의 감소 또는 차단, 또는 ALK-1에의 ALK-1 리간드 (예를 들어, BMP9 또는 BMP10) 결합 파괴 또는 차단을 하는 항-ALK-1 항체를 제공한다.
하이브리도마-유래된 모노클로날 항체 또는 파지 디스플레이 Fv 클론을 코딩하는 DNA는 통상적인 방법을 이용하여 (예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심의 대상이 되는 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열 분석된다. 일단 단리되고 나면, DNA를 발현 벡터 내로 도입할 수 있고, 이어서 이를 재조합 숙주 세포 내에서 원하는 모노클로날 항체를 합성하기 위해 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시킨다. 세균에서의 항체-코딩 DNA의 재조합 발현에 관한 논문으로 문헌 ([Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5: 256 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)])를 리뷰한다.
Fv 클론을 코딩하는 DNA는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 공지의 DNA 서열 (예를 들어, 적절한 DNA 서열은 문헌 [Kabat et al. 상기 문헌 동일]으로부터 수득할 수 있다)과 조합되어, 전장 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 클론을 형성할 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한 임의의 이소형의 불변 영역을 상기 목적을 위해 사용할 수 있고, 그러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하나의 동물 (예를 들어, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래된 후 또다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드" 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에 사용된 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 바람직한 실시태양에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 전장 또는 부분 길이의 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
하이브리도마로부터 유래된 항-ALK-1 항체를 코딩하는 DNA는 또한 예를 들어, 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 (예를 들어 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]의 방법에서와 같이) 변형시킬 수 있다. 하이브리도마 또는 Fv 클론-유래된 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 연결시켜 추가로 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정한 상황하에서는 전 항체를 이용하는 것보다 항체 단편을 이용하는 것이 더 많은 장점을 갖고 있다. 단편의 크기가 작을수록 더 빨리 제거할 수 있고, 고형 종양으로의 접근도 개선될 수 있다.
항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기법이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백 분해 소화를 통해 유도되었다 (문헌 ([Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)]; 및 [Brennan et al, Science, 229:81 (1985)]) 참조). 그러나, 현재 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 E. 콜라이에서 발현되고 이로부터 분비되어 다량의 이들 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리시킬 수 있다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하여, 생체내 반감기를 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 번호 제5,869,046호에 기재되어 있다. 기타 다른 항체 단편 생산 기법은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시태양에서, 최상의 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)일 수 있다. (WO 93/16185; 미국 특허 번호 제5,571,894호; 및 제5,587,458호)을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 포함한 유일의 종이 되며; 따라서, 생체내 이용시 감소된 비특이 결합에 대해 적합하다. sFv 융합 단백질을 작제하여 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질을 융합시킬 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌 동일]을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,641,870호에 기재되어 있는 바와 같이, "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중 특이적일 수 있다.
인간화된 항체
본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 인간화된 항체는 그 내부로 공급원이 비-인간인 것으로부터 유래된 것인 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입될 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입" 잔기로서 종종 언급되고, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter)와 동료들의 방법 (문헌 ([Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536])을 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 따라서, "인간화된" 항체 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간 종의 상응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 번호 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화된 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적-맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류와 가장 근접한 인간 서열이 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크로서 허용된다 (문헌 ([Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901])). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크가 수개의 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌 ([Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623])).
항체가 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 기타 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한가지 방법에 따라, 인간화된 항체는 모체 서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하는 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화된 생성물의 분석의 방법에 의해 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 그리고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이를 조사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용체 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 원하는 항체 특성, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
인간 항-ALK-1 항체는 상기 기술된 바와 같이, 인간-유래의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 작제할 수 있다. 별법으로, 인간 모노클로날 항-ALK-1 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들면, (문헌 ([Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol, 147: 86 (1991)]))에 의해 설명된 바 있다.
면역화시에 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 현재는 생산할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 영역 (J H) 유전자의 동종접합성 결실은 내인성 항체 생산을 완전히 억제시키는 것으로 설명된 바 있다. 그러한 생식계열 돌연변이체 마우스 내로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 전달하면 항원 시험 접종시에 인간 항체를 생산할 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol, 7: 33 (1993)])을 참조한다.
인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도와 특이성을 갖는 것인, 비-인간, 예로서, 설치류 항체로부터의 인간 항체를 유도하는데 유전자 셔플링 또한 사용될 수 있다. 소위 "에피토프 각인"으로도 명명되는 상기 방법에 따라, 상기 기술된 바와 같이 파지 디스플레이 기법에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인간 V 도메인 유전자 레퍼토리로 대체하여 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성할 수 있다. 항원을 사용하여 선별함으로써, 1차 파지 디스플레이 클론 중의 상응하는 비-인간 쇄를 제거할 때 파괴되는 항원 결합 부위를 인간 쇄가 수복하는 것인 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab를 단리시킬 수 있으며, 즉, 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 지배한다 (각인시킨다). 남아있는 비-인간 쇄를 대체하기 위해 상기 방법을 반복할 경우, 인간 항체를 수득하게 된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT WO 93/06213 참조). 종래의 CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 인간화와는 달리, 상기 기법은, 비-인간 기원의 FR도 CDR 잔기도 갖지 않는 완전한 인간 항체를 제공한다.
이중특이적
항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는, 모노클로날, 바람직하게는, 인간 또는 인간화된 항체이다. 본 경우에서는, 하나의 결합 특이성은 ALK-1에 대한 것이며, 나머지는 임의의 기타 다른 항원에 대한 것이다. 예시적인 이중특이적 항체는 ALK-1 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 ALK-1을 발현하는 세포에 편재시키는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 ALK-1-결합 암, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하는데, 여기서, 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마(quadroma))는 그 중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생산율은 낮다. 유사한 방법이 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
상이하고 더욱 바람직한 방법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 바람직하게는, 융합은 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 작제에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄가 고수율로 발현될 때, 또는 상기 비가 유의한 영향을 갖지 않을 때, 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생산하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들면, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 공학처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예로서, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예로서, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써, 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티(cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어, 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들면, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 번호 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089) 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 통상적인 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기법과 함께 미국 특허 번호 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생산하기 위한 기법은 또한 문헌에서 설명된 바 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결기를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 무손상 항체가 단백 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디설피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재하에 환원된다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성하게 된다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, E. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 E. 콜라이로부터 따로 분비시키고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응시켰다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양물으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기법 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 후, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에도 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 기전을 제공하였다. 이 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍이 형성되기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략법도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)]).
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3 개 이상인 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 부류 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 구성된다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 구성된다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하는데, 여기서, 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다) 를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 더 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 더 포함한다.
항체
변이체
몇몇 실시태양에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변형을 항체 핵산으로 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 가해지게 할 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조될 때 대상체 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 하전된 잔기), 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감도를 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발법이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 면역글로불린은 원하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합체를 포함한다.
폴리펩티드의 당화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄로의 당질 부분의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성시킨다. O-연결 당화는 당 N-아세일갈락토스아민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있다.
항체에 대한 당화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열 을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 당화 부위의 경우). 또한, 변경은 원래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 여기에 부착된 당질은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 결핍된 성숙 당질 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 (프레스타, L.(Presta, L.))에 기재되어 있다. 또한, US 2004/0093621 (교와 학꼬 고교 가부시키가이샤(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. 항체의 Fc 영역에 부착된 당질 중에 이등분된 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878 (장-메레(Jean-Mairet) 등)과 미국 특허 번호 제6,602,684호 (우마나(Umana) 등)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당 중에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체는 WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등)에 보고되어 있다. 또한, 그의 Fc 영역에 부착된 변경된 당질을 갖는 항체에 관하여는 WO 1998/58964 (라주, S.(Raju, S.))와 WO 1999/22764 (라주, S.)를 참조한다. 또한, 변형된 당화가 존재하는 항원 결합 분자에 대해서는 US 2005/0123546 (우마나 등)을 참조한다.
본원의 바람직한 당화 변이체는 Fc 영역에 부착된 당질 구조에 푸코스가 결핍되어 있는 Fc 영역을 포함한다. 상기 변이체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 임의로, Fc 영역은 ADCC를 추가로 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 번호 매김)의 치환을 더 포함한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체와 관련된 간행물의 예로는 (US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)])를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산하는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (프레스타, L); 및 WO 2004/056312 A1 (아담스(Adams) 등), 특히, 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)])를 포함한다.
또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항체 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 잔기에 의해 대체된 것이다. 치환 돌연변이유발을 위해 가장 큰 관심의 대상이 되는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 2에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시킨다면, 표 2에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 부류에 대해 하기에서 상세히 기술하는 보다 큰 실질적 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
<표 2>
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은, (a) 치환 부위내 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선 형태, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크성을 유지하는 것에 미치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연적으로 발생된 잔기는 그의 측쇄의 특성을 토대로 하여 하기와 같은 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe
비보존적 치환은 이러한 부류의 구성원 중 하나를 다른 부류의 것와 교환하는 것을 수반할 것이다.
1가지 유형의 치환 변이체는 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택되어진 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모체 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법으로는 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙을 포함한다. 간략하면, 수개의 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하도록 돌연변이화된다. 이렇게 생성된 항체는 각 입자 내에 패킹된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서 사상형 파지 입자로부터 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에서 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발법을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가, 본원에서 기재된 기법에 따른 치환에 대한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에서 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석법에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연적으로 발생된 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 카세트 돌연변이유발법에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 위치를 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
본 명세서 및 선행기술의 교시 내용에 따르면, 몇몇 실시태양에서, 본 방법에 사용되는 항체는 야생형의 대응 항체에 비해, 예를 들어, Fc 영역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다는 것이 주시된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 항체는 그의 야생형의 대응 항체와 비교할 때 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 보유할 것이다. 예를 들어, WO 99/51642에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 야기하는 특정 변경이 Fc 영역에서 형성될 수 있다고 생각된다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는 문헌 ([Duncan ＆ Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 제5,648,260호; 미국 특허 번호 제5,624,821호; 및 WO 94/29351)을 참고한다. WO 00/42072 (프레스타) 및 WO 2004/056312 (로만(Lowman))에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용은 본원에서 참고로 구체적으로 인용된다. 또한, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다. 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]))에 대한 개선된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 항체는 US2005/0014934A1 (힌톤(Hinton) 등)에 기재되어 있다. 상기 항체는 Fc 영역의 FcRn에 대한 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc 영역를 포함한다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체는 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 99/51642에 기재되어 있다. 상기 특허 공보의 내용은 본원에서 참고로 구체적으로 인용된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.
항체 유도체
항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용할 수 있는 추가의 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정하기 때문에, 제조상의 잇점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 종류는 개선시키고자 하는 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에서 요법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
원하는 특성을 갖는 항체에 대한 스크리닝
항체는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해서 그의 물리학적/화학적 특성과 생물학적 기능에 관해 특징 규명이 이루어질 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 항체는, ALK-1에의 결합, ALK-1 수용체 활성화의 감소 또는 차단, ALK-1 하류 분자 신호 전달 (예를 들면, Smad1, Smad5 및/또는 Smad8의 인산화)의 감소 또는 차단, ALK-1에의 ALK-1 리간드 결합 (예를 들어, BMP9 또는 BMP10) 파괴 또는 차단, 혈관신생 억제, 림프관신생 억제, 종양, 세포 증식성 질병 또는 암의 치료 및/또는 예방, ALK-1 발현 및/또는 활성과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방 중 임의의 하나 이상을 특징으로 한다.
정제된 항체는 N-말단 서열 분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 일련의 분석에 의해 추가로 특징 규명이 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 본원에서 제조된 항체는 그의 생물학적 활성에 대하여 분석된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 항체는 그의 항원 결합 활성에 대하여 시험된다. 당업계에 공지되어 있으며, 본원에서 사용될 수 있는, 항원 결합 분석법으로는 제한 없이, 예를 들면, 웨스턴 블롯, 방사면역분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법, 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기법을 사용하는 임의의 직접 또는 경쟁적 결합 분석법을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 항체는 모든 효과기 기능이 아니라 일부의 효과기 기능만을 보유하는 변경된 항체인데, 이를 통해 생체내 항체의 반감기가 중요하지만, 특정 효과기 기능 (예를 들어, 보체 및 ADCC)에는 불필요하거나 유해한 많은 용도에 대한 바람직한 후보가 될 수 있다. 특정 실시태양에서, 원하는 특성만이 유지되는 것을 보장하기 위해 제조된 면역글로불린의 Fc 활성을 측정한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석법을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석법은 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 수 있다), 항체가 FcRn 결합능을 보유한다는 것을 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 예는 미국 특허 번호 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재되어 있다. 예를 들어, 이러한 분석법에 유용한 효과기 세포로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살세포 (NK)를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 관심의 대상이 되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 분석법을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없는지를 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석법을 수행할 수 있다. 또한, FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정을 당업계에 공지된 방법, 예로서, 실시예 섹션에 기술되어 있는 것을 이용하여 수행할 수 있다.
벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
항체의 재조합 생산을 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입시킨다. 항체를 코딩하는 DNA를 통상의 방법을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리시키고 서열을 분석한다. 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 벡터의 선택은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵 생물 또는 진핵 생물 (일반적으로 포유동물)에서 기원한다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한, 임의의 이소형의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 얻을 수 있음을 이해할 것이다.
원핵
숙주 세포를 사용한 항체의 생산:
벡터
작제
항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기법을 사용하여 수득할 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드 서열은 항체 생산 세포, 예를 들어, 하이브리도마 세포로부터 단리되어 서열 분석될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 일단 수득하고 나면, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 원핵 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제 및 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입된다. 이용가능하고 당업계에 공지된 많은 벡터를 본 발명의 목적을 위해 이용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 모두) 및 벡터가 존재하게 되는 특정 숙주 세포와의 화합성에 따라 다양한 성분을 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입체 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 화합성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 상기 숙주와 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 및 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 마킹 서열을 포함한다. 예를 들어, E. 콜라이는 전형적으로 E. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지도 내인성 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 상기 프로모터를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현을 위해 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터(Carter) 등의 미국 특허 번호 제5,648,237호에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 숙주 미생물과 화합성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터를 상기 숙주에 대한 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지, 예를 들어, λGEMTM-11이 E. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 재조합 벡터 제조에 사용될 수 있다.
발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2개 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조정하는 시스트론에 대해 상류 (5')에 위치하는 비번역 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 두가지 유형의 프로모터, 즉, 유도가능 및 구성적 프로모터로 분류된다. 유도가능 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어하에 시스트론의 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 매우 많은 프로모터가 주지되어 있다. 선택된 프로모터는, 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터, 두가지 모두를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 가능하게 하기 때문에 이것이 이용된다.
원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 또는 trc 프로모터를 포함한다. 그러나, 세균에서 기능적인 다른 프로모터 (예를 들어, 다른 공지의 세균성 또는 파지 프로모터)도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있고, 따라서 당업자는 임의의 요구되는 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어댑터를 사용하여 이들 서열을 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 작동가능하게 결찰시킬 수 있다 (문헌 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269]).
본 발명의 하나의 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 발현된 폴리펩티드의 막을 가로지른 전위를 지시하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내에 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택되는 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 대해 천연의 것인 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 구성된 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 발현 시스템의 두 시스트론 모두에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각 시스트론 내의 분비 신호 서열이 반드시 존재할 필요는 없다. 이와 관련하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고 조립되어 세포질 내에서 기능적 면역글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어, E. 콜라이 trxB-균주)는 디설피드 결합 형성에 유리한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유니트가 적절하게 폴딩 및 조립될 수 있도록 한다 (문헌 [Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)]).
항체 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 세균의 예로는 에스케리치아 (예를 들어, E. 콜라이), 바실러스 (예를 들어, B. 섭틸리스, 장내세균(Enterobacteria), 슈도모나스 종 (예를 들어, P. 애루기노사), 살모넬라 티피무륨, 세라티아 마르세스칸스, 클렙시엘라, 프로테우스, 시겔라, 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 또는 파라코커스(Paracoccus)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 하나의 실시태양에서, E. 콜라이 세포가 본 발명에서 숙주로서 사용된다. E. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR (미국 특허 번호 제5,639,635호)을 갖는 균주 33D3를 비롯한 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어, E. 콜라이 294 (ATCC 31,446), E. 콜라이 B, E. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 E. 콜라이 RV308 (ATCC 31,608) 또한 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 정의된 유전자형을 갖는 상기 언급된 세균 중 임의의 것의 유도체를 작제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 세균 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, E. 콜라이, 세라티아 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같이 주지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용될 경우, 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
항체 생산
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.
형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적절한 표준 기법을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 세균 세포에 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 이용되는 또다른 기법은 전기천공이다.
폴리펩티드를 생성하는데 사용되는 원핵 세포를 당업계에 공지되고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 보충물이 부가된 루리아 브로쓰 (LB)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 작제를 기초로 하여 선택된 선별제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포를 성장시키기 위한 배지에 첨가된다.
또한, 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 보충물이, 단독으로 또는 복합 질소 공급원과 같은 또다른 보충물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 특정 실시태양에서, E. 콜라이 성장을 위해서 바람직한 온도 범위는 예를 들면, 약 20℃ 내지 약 39℃, 더욱 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 더욱더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. E. 콜라이의 경우, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4이고, 더욱 바람직하게는, 약 7.0이다.
유도가능 프로모터가 발현 벡터에 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 하나의 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 다른 유도제가 사용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투압 충격, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 일단 세포가 분쇄되면, 세포 파쇄물 또는 온전한 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질은 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리시킬 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리시키고, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석법과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 ℓ의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 ℓ의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양물, 특히, 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분배시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 ℓ 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하며, 약 1 ℓ 내지 약 100 ℓ 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건하에서 원하는 밀도, 예를 들어, 약 180-220의 OD550으로 성장시킨 후에 개시되며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기술된 바와 같이, 사용되는 벡터 작제물에 따라 다양한 유도제를 사용할 수 있다. 유도 전 단기간 동안 세포를 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12-50시간 동안 유도시키지만, 보다 장기간의 또는 보다 단기간의 유도 시간을 사용할 수 있다.
폴리펩티드의 생산율 및 품질을 개선시키기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 적절한 조립 및 폴딩을 개선시키기 위해, 예를 들어, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 샤페론 단백질을 과발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 동시에 형질전환시킬 수 있다. 샤페론 단백질은 세균 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 적절한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 (문헌 ([Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 미국 특허 번호 제6,083,715호 (조지오(Georgiou) 등); 미국 특허 번호 제6,027,888호 (조지오 등); [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210])).
발현된 이종 단백질 (특히, 단백질 분해에 감수성인 단백질)의 단백질 분해를 최소화하기 위해, 단백질 분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포 균주는 예를 들어, 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그의 조합물과 같은 공지된 세균 프로테아제를 코딩하는 유전자에서 유전자 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 몇몇 E. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어, 문헌 ([Joly et al. (1998), 상기 문헌]; 미국 특허 번호 제5,264,365호 (조지오 등); 미국 특허 번호 제5,508,192호 (조지오 등); [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)])에 기재되어 있다.
하나의 실시태양에서, 단백질 분해 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 E. 콜라이 균주가 본 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
항체 정제
당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 방법은 적합한 정제 방법의 예이다: 면역친화도 또는 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 및 예를 들어, 세파덱스 (Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과.
하나의 측면에서, 고체상 상에 고정된 단백질 A가 전장 항체 생성물의 면역친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 41 kD 세포벽 단백질이다 (문헌 [Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]). 단백질 A가 고정되는 고체상은 바람직하게 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 칼럼 또는 조절형 공극을 갖는 유리 칼럼 또는 규산 칼럼일 수 있다. 일부 용도에서, 칼럼을 글리세롤과 같은 시약으로 코팅하여 가능하게는 오염물의 비특이적 부착을 방지한다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기술된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제제를 단백질 A가 고정된 고체상에 적용하여 관심의 대상이 되는 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 할 수 있다. 이어서, 고체상을 세척하여 고체상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로, 관심의 대상이 되는 항체를 용출에 의해 고체상으로부터 회수한다.
진핵
숙주 세포를 사용한 항체의 생산
벡터 성분은 일반적으로 하기: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 신호 서열, 또는 관심의 대상이 되는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호가 이용가능하다.
그러한 전구체 영역에 대한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 결찰된다.
복제 기점
일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 그 이유는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커로도 명명되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 관련이 있는 경우에는 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선별 요법시에도 생존한다. 이러한 우세한 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능 마커의 또다른 예는 항체 핵산, 예를 들어, DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는, 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취할 수 있는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들면, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 우선, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선별가능 마커, 예를 들어, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 이것으로 함께 형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커에 대한 선별제, 예를 들어, 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 번호 제4,965,199호를 참조한다.
프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 폴리펩티드 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 진핵 세포에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT가 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발부로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열 모두가 진핵 발현 벡터 내에 적합하게 삽입될 수 있다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 화합성일 경우, 바이러스, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절될 수 있다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 번호 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 번호 제4,601,978호에 기재되어 있다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스의 장쇄 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수도 있다.
인핸서 요소 성분
고등 진핵 세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 하류 (bp 100-270) 쪽의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소를 기재한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 벡터에서 위치 5' 또는 3'에서 항체 폴리펩티드 코딩 서열로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터부터 부위 5'에 위치한다.
전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 수도 있다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. W0 94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원의 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 척추동물 숙주 세포를 비롯한, 본원에 기술된 고등 진핵 세포를 포함한다. 배양물 (조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장주 (현탁 배양물 중에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포 (문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)])); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)])); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, (문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)])); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 기술한 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양시킨다.
숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어, 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코스 변형된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 번호 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985)에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물 또한 당업자에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다.
항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파쇄물, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 사용하여 농축시킬 수 있다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어, PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있는데, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (문헌 [Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스일 수 있지만, 다른 매트릭스 또한 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 조절형 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠을 통해 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 갖게 된다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (뉴저지주 필립스버그 소재의 J.T. 베이커(J.T. Baker))가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예를 들어, 이온-교환 칼럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 관심의 대상이 되는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 예를 들어, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5의 pH의 용출 완충액을 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가의 정제 단계에 적용시킬 수 있다.
면역접합체
본 발명은 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항-ALK-1 항체를 포함하는 면역접합체 (상호교환적으로 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로도 명명된다)를 제공한다.
암 치료에서 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉, 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용 (문헌 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172]; 미국 특허 4,975,278))으로 약물 부분을 종양으로 표적화하여 전달할 수 있고, 그 내부의 세포내에 축적시킬 수 있는데, 여기서, 상기 비접합된 약물 물질의 전신 투여는 정상 세포뿐만 아니라, 제거하고자 하는 종양 세포에 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (문헌 ([Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506])). 이에 따라 최소 독성을 가지면서 최대 효능을 보이는 것이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 모두 상기 전략법에서 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87]). 상기 방법에서 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (문헌 [Rowland et al., (1986) 상기 문헌 동일]). 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소는 세균 독소, 예를 들어, 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어, 리신, 소분자 독소, 예를 들어, 겔다나마이신 (문헌 ([Mandler et al., (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581]; [Mandler et al., (2000) Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10:1025-1028]; [Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791])), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 ([Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928]; [Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53:3336-3342]))을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 기전에 의해 그들의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 달성할 수 있다. 몇몇 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 활성이 작은 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙 티욱세탄, 비오젠/이덱(Biogen/Idec))은 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된, 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대해 작용하는 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 이루어진 항체-방사성 동위원소 접합체이다 (문헌 ([Wiseman et al., (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al., (2002) Blood 99(12):4336-42]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al., (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69])). 제발린이 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대한 활성을 갖지만, 이를 투여하면 대부분의 환자에서 중증의 혈구감소증이 장기간 나타난다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 마일로타그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신; 와이어쓰 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))는 주사에 의해 급성 골수성 백혈병 치료용으로 2000년에 승인받았다 (문헌 (문헌 ([Drugs of the Future (2000) 25(7):686]; 미국 특허 번호 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호)). 디설피드 링커 SPP를 통하여 메이탄시노이드 약물 부분인 DM1에 연결된 huC242 항체로 이루어진 항체-약물 접합체인 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노겐, 인크.(Immunogen, Inc.))을 대상으로 하여, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어, 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 II상 시험이 진행되고 있다. 메이탄시노이드 약물 부분인 DM1에 연결된 항-전립선 특이 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체-약물 접합체인 MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노겐, 인크.)는 현재 전립선 종양의 가능한 치료를 위해 개발되고 있다. 오리스타틴 펩티드인 오리스타틴 E (AE) 및 모노메틸오리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAC10 (혈액학적 악성 종양 상의 CD30에 특이적임)에 접합시켰고 (문헌 [Doronina et al., (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784]), 이는 현재 치료제 개발 중에 있다.
면역접합체 생성에 유용한 화학요법제를 본원에서 기술한다 (예로서, 상기 참조). 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)를 참조한다. 다양한 방사선핵종이 방사성접합된 항체의 생산에 이용될 수 있다. 그 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이기능성 단백질-커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., (1987) Science, 238:1098]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이 항체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어, 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 오리스타틴, 트리코테센 및 CC1065, 및 세포독성 활성을 갖는 상기 독소의 유도체의 접합체도 본원에서 주시된다.
메이탄신
및
메이탄시노이드
몇몇 실시태양에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합화를 억제시킴으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 번호 제3,896,111호). 뒤이어, 특정 미생물도 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 번호 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 부분은, 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의해 제조하는 것이 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디설피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체 약물 접합체에서 관심을 끄는 약물 부분이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료학적 용도는 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 (상기 문헌의 개시 내용인 본원에서 참고로 명벽히 인용된다)에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 높은 세포독성을 보이는 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석법에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HER-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디설피드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 기재하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은 세포당 3 X 105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관내에서 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.
항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,208,020호 (그의 개시 내용이 본원에서 참고로 명백히 인용된다)를 참조한다. 심지어 하나의 독소/항체 분자라도 네이키드 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상되기는 하지만, 1개의 항체 분자에 접합된 평균 3 내지 4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타낸다. 메이탄시노이드는 당업계에 주지되어 있으며, 공지된 기법에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,208,020호, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 환 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어, 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예를 들어, (미국 특허 번호 제5,208,020호 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)], 및 미국 특허 출원 번호 제10/960,602호 (2004년 10월 8일 출원) (상기 문헌의 개시 내용은 본원에서 참고로 명백히 인용된다))에 개시된 것을 비롯한, 항체-메이탄시노이드 접합체 제조용의 연결기가 당업계에 다수 공지되어 있다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 접합체는 미국 특허 출원 번호 제10/960,602호 (2004년 10월 8일 출원)에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 링커기는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같은 디설피드기, 티오에테르기, 산불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함하며, 디설피드 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가의 링커기가 본원에서 기재되고 예시된다.
항체와 메이탄시노이드의 접합체는 다양한 이기능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 디설피드 연결을 제공하기 위해 특히, 바람직한 커플링제는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]) 또는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는 결합 유형에 따라서 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기법을 이용하여 하이드록실기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 이러한 반응은 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
오리스타틴
및
돌라스타틴
몇몇 실시태양에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌라스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 즉, 오리스타틴에 접합된 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 제5635483호; 제5780588호). 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하며 (문헌 [Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 (미국 특허 5663149) 및 항진균 활성 (문헌 [Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965])을 갖는 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 부분은 펩티드성 약물 부분의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적인 오리스타틴 실시태양은 미국 시리얼 번호 제10/983,340호 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 2004년 11월 5일 출원) (상기의 개시 내용 전문이 참고로 명백히 인용된다)에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸오리스타틴 약물 부분 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 부분은 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이의 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어, 펩티드 화학 분야에 주지된 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다. 오리스타틴/돌라스타틴 약물 부분은 (US 5635483; US 5780588; 문헌 [Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465]; [Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725]; 및 [Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]))의 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 문헌 ([Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784]; 미국 시리얼 번호 제10/983,340호 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 2004년 11월 5일 출원) (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다) (상기 문헌은 예를 들면, 링커, 및 예를 들어, 링커에 접합된 MMAE 및 MMAF와 같은 모노메틸발린 화합물 제조 방법을 개시한다)도 참조한다.
칼리케아미신
다른 실시태양에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 패밀리는 피코몰 미만의 농도에서 더블-스트랜드 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니(American Cyanamid Company)의 특허)을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다 (문헌 ([Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)]; 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드 컴퍼니의 미국 특허)). 항체가 접합될 수 있는 또다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA는 둘다 세포내 작용 부위를 갖고, 형질막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 물질을 세포 내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 향상된다.
다른
세포독성제
항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기재된, 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)를 참조한다.
본 발명은 추가로 항체와 뉴클레오티드 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체도 주시한다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 방사성접합된 항체의 생산을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 접합체를 검출용으로 사용하는 경우에는, 접합체는 섬광조영 연구용 방사성 원자, 예를 들어, Tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어, 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.
항체와 세포독성제의 접합체는 다양한 이기능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이 항체에 대한 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디설피드-함유 링커 (문헌 ([Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 제5,208,020호))가 사용될 수 있다.
본 화합물은 상업적으로 이용가능한 (예를 들어, 미국 일리노이주 록퍼드 소재의 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터 입수가능) 가교결합 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 사용하여 제조된 ADC를 주시하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]를 참조한다.
항체 약물 접합체의 제조
항체 약물 접합체 (ADC)에서, 항체 (Ab)는 링커 (L)를 통해 항체 1개당 하나 이상의 약물 부분 (D), 예를 들어, 약 1개 내지 약 20개의 약물 부분에 접합된다. 하기 화학식 (I)의 ADC는 하기를 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 후, 이를 약물 부분 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 부분의 친핵기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법. ADC를 제조하기 위한 추가의 방법은 본원에 기재되어 있다.
<화학식 I>
링커는 하나 이상의 링커 성분으로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 ("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카르복실레이트 ("SMCC), 및 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트 ("SIAB")를 포함한다. 추가의 링커 성분은 당업계에 공지되어 있고, 일부가 본원에 기재되어 있다. 또한, 미국 시리얼 번호 제10/983,340호 (발명의 명칭: "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," 2004년 11월 5일 출원) (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)도 참조한다.
몇몇 실시태양에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분은 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 또는 펜타펩티드를 포함한다. 예시적인 디펩티드로는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연적으로 발생된 아미노산 잔기 뿐만 아니라, 소수 아미노산 및 비-천연적으로 발생된 아미노산 유사체, 예를 들어, 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어, 종양-관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단에 대한 그들의 특이성 측면에서 디자인되고 최적화될 수 있다.
항체 상의 친핵기는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어, 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어, 시스테인; 및 (iv) 당 하이드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체는 당화된 것이다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아민, 티올 및 하이드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자성 기, 예를 들어, (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디설피드, 즉, 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 환원제, 예를 들어, DTT (디티오트레이톨)로 처리함으로써 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론상 2개의 반응성 티올 친핵기를 형성할 것이다. 아민의 티올로의 전환시에 생성된 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)과 리신의 반응을 통해 항체 내로 추가의 친핵기가 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다.
항체 약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입하는 위한 항체 변형에 의해 생산될 수 있다. 당화된 항체의 당을, 예를 들어, 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 당화된 항체의 당질 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 단백질 내에 생성될 수 있다 (문헌 [Hermanson, Bioconjugate Techniques]). 또다른 실시태양에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신에 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 ([Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146]; US 5362852)). 상기 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵기와 반응할 수 있다.
유사하게, 약물 부분 상의 친핵기는 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드기를 포함하는, 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는, 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어, 재조합 기법 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되거나 또는 서로 인접해 있는 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
추가의 또다른 실시태양에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (상기, 스트렙트아비딘)에 접합시킬 수 있고, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환으로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
ALK
-1 폴리펩티드에의 공유 변형
본 발명의 폴리펩티드 길항제 (예를 들어, 폴리펩티드 길항제 단편, ALK-1 융합 분자, 예를 들어, ALK-1 면역어드헤신, 또는 항-ALK-1 항체)의 공유 변형이 본 발명의 범주내 포함된다. 상기 변형은 적용가능할 경우, 화학적 합성에 의해, 또는 폴리펩티드의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응을 할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나, 변형된 아미노산 또는 비천연 아미노산을 성장 폴리펩티드 쇄 내로 혼입시킴으로써 폴리펩티드의 다른 유형의 공유 변형을 분자 내로 도입시킬 수 있다 (예를 들면, 문헌 ([Ellman et al. Meth . Enzym . 202:301-336 (1991)]; [Noren et al. Science 244: 182 (1989)]; 및 미국 특허 출원 공보 20030108885 및 20030082575).
가장 보편적으로는 시스테이닐 잔기를 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예를 들어, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응시켜 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 수득한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미다조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스포네이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설피드, 메틸 2-피리딜 디설피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응으로 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸피로카보네이트와의 반응으로 유도체화되는데, 상기 제제는 상대적으로 히스티딜 측쇄에 대하여 특이성을 띤다. 파라-브로모페나실 브로마이드 또한 유용한데; 반응은 전형적으로는 0.1 M 카코딜산나트륨 (pH 6.0) 중에서 실시된다.
리시닐 및 아미노-말단 잔기는 숙신산 또는 기타 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이러한 제제를 사용한 유도체화는 리시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. 리시닐 잔기를 유도체화시키는데 적합한 기타 다른 시약으로는 이미도에스테르, 예를 들어, 메틸 피코리니미데이트, 피리독살 포스포네이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠설폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매화 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 수개의 종래 시약, 그중, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온, 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기를 유도체화시키기 위해서는 반응을 알칼리성 조건하에서 실시하여야 하는데, 이는 구아니딘 관능기의 pKa가 높기 때문이다. 추가로, 이러한 시약은 리신기 뿐만 아니라, 아르기닌 엡실론-아미노기와도 반응할 수 있다.
구체적으로 티로실 잔기를 변형시킬 수 있는데, 특히, 관심의 대상이 되는 것은, 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시켜 티로실 잔기로 스펙트럼 표지를 도입시키는 것이다. 가장 일반적으로는, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성한다. 티로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화시킴으로써 방사면역분석법에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조한다.
카르복실 측쇄 (아스파틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R') (여기서, R 및 R'는 상이한 알킬기이다), 예를 들어, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카르보디이미드와의 반응에 의해서 선택적으로 변형된다. 추가로, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해서 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번히 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 탈아미드화된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건하에서 탈아미드화된다. 탈아미드화된 형태의 이들 잔기도 본 발명의 범주내 포함된다.
기타 변형으로는 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (문헌 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
또다른 유형의 공유 변형으로는 화학적으로 또는 효소적으로 글리코시드를 본 발명의 폴리펩티드에 커플링시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 N- 또는 O-연결된 당화를 위한 당화 능력을 갖는 숙주 세포에서 폴리펩티드를 생산할 필요가 없다는 점에서 이롭다. 사용된 커플링 모드에 따라서, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 유리 설프하이드릴기, 예를 들어, 시스테인의 것, (d) 유리 하이드록실기, 예를 들어, 세린, 트레오닌, 또는 하이드록실프롤린의 것, (e) 방향족 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이러한 방법은 WO 87/05330 (1987년 9월 11일 공개) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev . Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드 상에 존재하는 임의의 당질 부분을 화학적으로 효소적으로 제거할 수 있다. 화학적 탈당화에서는 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄설폰산, 또는 등가 화합물에 노출시켜야 한다. 이러한 처리를 통해 폴리펩티드는 무손상 상태로 유지되면서 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸 갈락토스아민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당은 절단된다. 화학적 탈당화는 문헌 ([Hakimuddin, et al. Arch . Biochem . Biophys. 259:52 (1987)] 및 [Edge et al. Anal. Biochem ., 118:131 (1981)])에 기재되어 있다. 예를 들어, 항체 상의 당질 부분의 효소적인 절단은 문헌 [Thotakura et al. Meth . Enzymol . 138:350 (1987)]에 기재되어 있는 바와 같이, 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 관한 또다른 유형의 공유 변형은 미국 특허 번호 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 기재된 방식으로 각종 비단백질성 중합체들 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
약제학적 제제
본 발명의 항체 또는 면역어드헤신을 포함하는 치료학적 제제는 보관을 위해서, 원하는 순도를 갖는 항체를 옵션의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 수용액, 동결건조되거나 또는 기타 다른 건식 제제의 형태로 제조된다 (문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성이며, 이는 완충액, 예를 들어, 포스포네이트, 시트레이, 히스티딘 및 기타 다른 유기산; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 당질, 예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정 징후에 필요하면 1 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않으며 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 그러한 분자는 의도되어진 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절히 제시된다.
활성 성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합화에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제약 제제는 멸균성을 띠어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지효성-방출 제제가 제조될 수 있다. 지효성-방출 제제의 적합한 예는 면역글로불린을 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지효성-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포 (LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미세구) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들어, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 봉입된 면역글로불린이 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이는 37℃에서 습기에 노출되면 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 손실할 수 있게 되고, 가능하게는 면역원성이 변경될 수 있다. 관여하는 기전에 따라서 안정화를 위한 합리적인 전략법을 고안할 수 있다. 예를 들면, 응집 기전이 티오-디설피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다.
본 발명에 유용한 제제는 유전자 유법에 의해 대상체에게 도입될 수 있다는 것도 추가로 주시된다. 유전자 요법이란 대상체에게 핵산을 투여함으로써 수행되는 요법을 의미한다. 유전자 요법 적용시, 예를 들면, 결손 유전자의 대체를 위해 치료학적 유효량의 유전자 생성물이 생체내에서 합성될 수 있도록 하기 위하여 유전자를 세포 내로 도입한다. "유전자 요법"은, 단일 치료로 효과가 장기간 지속적으로 이루어지는 종래 유전자 요법과, 치료학적 유효량의 DNA 또는 mRNA를 1회 또는 반복하여 투여하는 것을 포함하는 것인, 유전자 치료제의 투여법, 이 둘 모두를 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA 또는 siRNA는 생체내 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포막에 의한 그의 흡수가 제한됨에 따라 그의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 그가 억제제로서 작용할 수 있는 세포내로 도입될 수 있다는 것을 이미 제시된 바 있다 (문헌 [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)]). 올리고뉴클레오티드는 예로서, 그의 음으로 하전된 포스포디에스테르기를 비하전된 기로 치환하여 변형시킴으로써 그의 흡수를 증진시킬 수 있다. 유전자 요법 방법에 관한 일반적인 리뷰에 대해서는 예를 들면, (문헌 ([Goldspiel et al. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)]; [Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan Science 260:926-932 (1993)]; [Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)]; 및 [May TIBTECH 11:155-215 (1993)]))을 참조한다. 재조합 DNA 기술 분야에 널리 알려져 있는 것으로서, 사용될 수 있는 방법은 문헌 ([Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]; 및 [Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.])에 기재되어 있다.
투여량 및 투여
본 분자는 공지 방법에 따라, 예를 들면, 볼루스로서 정맥 투여에 의해 또는 일정 기간 동안의 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 경막내, 경구, 국소, 흡입 경로, 및/또는 피하 투여에 인간 환자에게 투여된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 치료법은 ALK-1 길항제와 하나 이상의 항암제, 예를 들어, 항-혈관신생제 또는 항-림프관신생제의 조합 투여를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 추가의 항암제, 예를 들어, 하나 이상의 상이한 항-혈관신생제, 하나 이상의 화학요법제 등인 존재한다. 본 발명은 또한 다중의 억제제를 투여하는 것, 예를 들면, 동일 항원에 대한 다중 항체를 투여하거나, 상이한 암 활성 분자에 다중 항체를 투여하는 것도 주시한다. 하나의 실시태양에서, 상이한 화학요법제의 칵테일을 ALK-1 길항제 및/또는 하나 이상의 항-혈관신생제와 함께 투여한다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일의 약제학적 제제를 사용하여 공투여하는 것, 및/또는 임의 순서로 연속하여 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, ALK-1 길항제를 항암제 투여 이전에, 그 후에 또는 교대로 투여할 수 있거나, 그와 함께 동시에 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 두가지 모두 (또는 모든) 활성 제제가 동시에 그들의 생물학적 활성을 발휘하는데는 일정 기간이 소요된다.
질환을 예방 또는 치료하기 위한 ALK-1 길항제의 적절한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 진행 상태, 억제제가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 기시행된 요법, 환자의 임상 병력 및 억제제에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 억제제는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 기간에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 조합 요법 치료법에서, 본 발명의 조성물은 치료학적 유효량으로, 또는 치료학적으로 상승 작용을 하는 양으로 투여된다. 본원에서 사용되는 바, 치료학적 유효량은, 본 발명의 조성물의 투여 및/또는 ALK-1 길항제와 하나 이상의 기타 다른 치료제의 공투여에 의해 표적하는 질환 또는 병태가 감소되거나 억제되도록 하는 것이다. 제제 조합물을 투여하면 효과는 부가될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 투여 결과는 상승 효과이다. 치료학적으로 상승 작용을 하는 양이란, 특정 질환과 관련된 병태 또는 증상을 상승적 효과를 발휘하거나 유의적으로 감소 또는 제거시키는데 필요한, ALK-1 길항제 및 하나 이상의 기타 다른 치료제, 예를 들어, 혈관신생 억제제의 양이다.
질환의 유형 및 중증도에 따라서, ALK-1 길항제 또는 혈관신생 억제제 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예로서, 0.1-20 mg/kg)이 예를 들면, 1회 이상의 별도 투여에 의하는지, 또는 연속 주입에 의하는지와는 상관없이 환자에 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량의 범위는 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상일 수 있다. 수일에 걸쳐 또는 그보다 장기간에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 상태에 따라서 치료는 질환의 증상이 원하는 대로 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량을 사용한 치료법도 유용할 수 있다. 전형적으로, 임상의는 투여량(들)이 필요한 생물학적 효과를 제공하는 양에 도달할 때까지 분자(들)를 투여할 것이다. 본 발명의 요법의 진행 상태는 통상의 기법과 분석법에 의해 쉽게 모니터링할 수 있다.
예를 들면, 혈관신생 억제제, 예를 들어, 항-VEGF 항체, 예를 들어, 아바스틴® (제넨테크)에 대한 제제 및 투약 스케줄은 제조사의 설명서에 따라 사용될 수 있거나, 당업자의 실험을 통해 결정될 수 있다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, VEGF-특이 길항제 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)이 예를 들면, 1회 이상의 별도 투여에 의하는지, 또는 연속 주입에 의하는지와는 상관없이 환자에 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량의 범위는 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 특히, 바람직할 수 있는 투여량으로는 예를 들면, 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 및 15 mg/kg을 포함한다. 수일에 걸쳐 또는 그보다 장기간에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 상태에 따라서 치료는 상기 기술되거나 당업계에 공지된 방법에 의해 측정되는 바에 따라 암이 치료될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량을 사용한 치료법도 유용할 수 있다. 일례로는 VEGF-특이 길항제가 항체라면, 본 발명의 항체는 매주, 매 2주마다, 또는 매 3주마다 1번씩 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg (7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 용량 범위로 투여된다. 본 발명의 요법의 진행 상태는 통상의 기법과 분석법에 의해 쉽게 모니터링할 수 있다.
일례로, 베바시주맙이 VEGF-특이 길항제이다. 베바시주맙은 4 ml 또는 16 ml의 베바시주맙 (25 mg/ml)을 전달하기 위해 100 mg 및 400 mg의, 방부제-무함유의 1회용 바이알 중에 치료용으로서 공급된다. 100 mg 제품은 240 mg α,α-트레할로스 데하이드레이트, 23.2 mg 인산나트륨 (일염기성, 일수화물), 4.8 mg 인산나트륨 (이염기성, 무수물), 1.6 mg 폴리소르베이트 20, 및 주사용수, USP로 제조된다. 400 mg 제품은 960 mg α,α-트레할로스 데하이드레이트, 92.8 mg 인산나트륨 (일염기성, 일수화물), 19.2 mg 인산나트륨 (이염기성, 무수물), 6.4 mg 폴리소르베이트 20, 및 주사용수, USP로 제조된다.
또다른 일례로, 상기 화학요법제에 대한 제제 및 투약 스케줄은 제조사의 설명서에 따라 사용될 수 있거나, 당업자의 실험을 통해 결정될 수 있다. 화학요법용 제제 및 투약 스케줄은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.
치료 효능
본 발명의 치료 효능은 통상 신생물성 또는 비-신생물성 질병을 평가하는데 사용되는 다양한 종점에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 암 치료는 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 병이 진행되기까지의 시간, 생존 기간, 무진행생존율, 전체 반응 속도, 반응 지속 기간, 및 삶의 질에 의해 평가될 수 있다. 본원의 항-혈관신생제는 종양 맥관을 표적하는 것이지, 반드시 신생물성 세포 그 자체를 표적하는 것은 아니기 때문에, 이는 특유한 부류의 항암 약물을 나타나며, 따라서, 약물에 대한 임상적 반응에 관한 특유의 척도와 정의를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 2차원 분석법에서 50％ 초과로 종양이 수축하였을 때가 반응을 보였다고 선언할 수 있는 표준 컷-오프가 된다. 그러나, 억제제는 원발성 종양을 수축시키지 않고서도 전이성 확산을 억제시킬 수 있거나, 간단하게는 종양증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 혈관신생의 혈장 또는 뇨 마커 측정, 및 방사선 영상을 통한 반응 측정을 비롯한, 요법의 효능을 측정하는 접근법을 사용할 수 있다.
본원에서 교시될 때 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예
1:
ALK1
.
Fc
분자 생성
표준 분자생물학 기법을 사용함으로써 폴리펩티드 링커를 통해 ALK-1 (인간 ALK-1의 아미노산 잔기 1-118)의 세포외 도메인을 인간 IgG1의 Fc 영역에 부착시킴으로써 ALK1.Fc 분자를 생성하였다. 간략하면, 인간 IgG1의 C-말단을 포함하는 융합 단백질이 발현될 수 있도록 공학처리된 pRK5 벡터 내로 인간 ALK-1의 세포외 단편 (아미노산 1-118)을 서브클로닝시켰다. 발현 플라스미드로 일과성으로 형질감염된 CHO 세포의 무혈청 배양물로부터 수거된 조절된 배지로부터 ALK1.Fc를 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. ALK1.Fc 분자는 하기 cDNA 및 아미노산 서열을 가졌다:
실시예
2:
ALK1
.
Fc
처리가
시험관내
내피 세포의 발아를 증진시킨다
HUVEC 피브린 겔 비드 분석법을 사용하여 ALK-1 신호 전달을 억제시키는 것이 내피 세포 성장에 미치는 효과를 조사하였다. HUVEC 피브린 겔 비드 분석법에 관한 상세한 설명은 종래에 설명된 바 있다 (문헌 [Nakatsu, MN, Microvascular Research 44:102-112 (2003)]). 간략하면, 사이토덱스(Cytodex) 3 비드 (아머샴 파마시카 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))를 2 ml EGM-2 배지 (클론틱스(Clonetics)) 중에서 비드 1개당 350-400개의 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)로 코팅하였다. 약 200개의 HUVEC-코팅 비드를 12-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰 중 피브린 응괴에 포매시켰다. 80 X 103개의 D551 인간 섬유모세포 세포를 응괴 상단에 플레이팅시키고, 배지를 이틀에 한번씩 교체하였다. ALK1.Fc를 5 ug/ml로 배양 배지에 첨가하였다. 9일째 위상차 현미경으로 영상 촬영하였다.
공배양된 인간 섬유모세포의 존재하에 피브린 겔 중에서 성장하는 HUVEC는 뚜렷이 루멘-유사 구조를 갖는 발아를 생성한다 (문헌 [Nakatsu, M. N. et al. Microvasc Res 66, 102-12 (2003)]). ALK1.Fc를 첨가하였을 때 발아의 길이는 현저히 증가하였으며 (도 1), 이는 ALK-1 신호 전달을 차단하게 되면 내피 세포는 더 많은 탐색 행동에 적응하게 될 수 있다는 것을 제안하는 것이다. 이러한 결과는 ALK1.Fc가 ALK-1 리간드를 격리시키고, 내인성 ALK-1의 활성화를 방해함으로써 내피 세포에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사하였다.
실시예
3:
ALK1
-
Fc
처리가
생체내
망막 혈관 발생에 영향을 미친다
같은 한배 새끼로부터 얻은 신생 SD 래트를 사용하여 ALK1.Fc가 망막 혈관 발생에 미치는 효과를 연구하였다. 생후 4일째 (P4), P6 및 P9에 래트에 ALK1.Fc (10 mg/kg 체중)를 i.p. 주사하였다. P11에 이소플루란을 사용하여 래트를 마취시켰다. FITC-표지된 라이코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon Esculentum) 렉틴 (150 ㎕의 0.9％ NaCl 중 150 ㎍; 벡터 라보라토리즈(Vector Laboratories))을 심장내로 주사하고, 3분 동안 순환이 이루어지게 하였다. 눈을 수집하고, 밤새도록 PBS 중 4％ PFA로 고정시킨 후, PBS로 세척하였다. 절개한 망막을 3시간 동안 PBST (PBS, 0.5％ 트리톤 X-100) 중 10％ 염소 혈청으로 차단시킨 후에 비오틴화된 이소류신 B4 (1:100, 반데이라에다 심플리시폴리아(Bandeiraea simplicifolia); 몰레큘라 프로브(Molecular Probe)) 또는 Cy3-접합된 항-알파 평활근 액틴 (ASMA, 1:200, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), PBST 중 10％ 염소 혈청과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 비오틴화된 이소류신 B4를 시각화하기 위해 망막을 PBST 중에서 4회에 걸쳐 세척하고, Cy3-스트렙트아비딘 (1:200, 시그마-알드리치)과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. 염색을 마친 후, 망막을 PBST 중에서 4회에 걸쳐 세척하였다. 모두 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 평평하게 올려진 망막의 영상을 형광 공초점 현미경으로 포착하였다.
출생 후 초기 래트의 망막에서는 잘 정의된 이벤트 순서로 정형적인 혈관 패턴이 발생한다. 표층의 망막 맥관은 시신경두로부터의 확장 네트워크로 발생하게 되는데, 주변부에서는 활발히 발아가 일어나고, 중심부에서는 확장형의 재형성이 일어난다. 예로서, 혈관 발아, 재형성, 성숙, 및 동맥-정맥 전문화와 같은 혈관 발생의 다른 측면들도 쉽게 이어서 진행될 수 있다. ALK1.Fc로 처리한 망막에서는 방사상으로 교호로 배열된 동맥 및 정맥의 특징적인 패턴 대부분이 영향을 받지 않았다. 그러나, 혈관 밀도, 특히, 정맥에 인접해 있는 미세혈관의 혈관 밀도는 증가한 것으로 뚜렷이 나타났다 (이소류신-Cy3; 도 2). 또한, 미세혈관과 정맥에서의 혈액 관류는 현저히 감소하였다 (렉틴-FITC; 도 3 & 4). 흥미롭게도, 망막 동맥은 외관상 확장되었는데, 이는 Alk1 결핍 배아에서 관찰되는 혈관 결함을 연상시켰다. 추가로, 확장된 망막 동맥은 혈관 평활근 세포 피복의 조직을 파괴시켰다 (ASMA; 도 3 & 4). 이러한 결과는, ALK1.Fc가 생체내에서 ALK-1 신호 전달을 방해함으로써 신생 래트의 망막에서의 혈관 발생에 영향을 줄 수 있다는 것을 시사한다.
실시예
4:
ALK1
-
Fc
처리가
생체내
종양 성장을
억제시킨다
ALK-1 신호 전달이 종양 성장에 직접 관여하는지 여부를 조사하기 위하여 본 발명자들은, 피하 인간 종양 이종이식편을 포함하는 누드 마우스에서 ALK1.Fc가 종양 혈관신생 및 종양 성장에 미치는 효과를 시험하였다. 베이지색의 누드 마우스 (캘리포니아주 홀리스터 소재의 찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories))를 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 가이드에 따라 유지시켰다. 6 내지 8주령된 암컷 마우스를 각 연구에 사용하였다. 피하 종양을 수득하기 위해, 50％ 마트리겔 (BD 바이오사이언스(BD Bioscience))을 함유하는 0.1 ml 종양 세포 현탁액을 마우스의 우측 뒤 옆구리쪽에 주사하였다. 5 X 106 인간 결장암 HM7 세포, 10 X 106 인간 폐암종 MV-522 세포, 10 X 106 래트 아교모세포종 C6 세포 또는 10 X 106 인간 폐암종 Calu6 세포를 각 마우스에 주사하였다. ALK1.Fc (10 mg/kg)를 하기와 같이 i.p.를 통해 주사하였다: HM7에 대해서는 ALK1.Fc 처리 (q/2d)를 종양 접종 후 3일째 개시하고, MV-522에 대해서는 ALK1.Fc 처리 (q/2d)를 종양 접종 후 16일째 개시하고, C6에 대해서는 ALK1.Fc 처리 (2x/w)를 종양 접종 후 3일째 개시하고, Calu6에 대해서는 ALK1.Fc 처리 (q/2d)를 종양 접종 후 22일째 개시하였다. 종양 성장은 캘리퍼 측정에 의해 측량하였다. 종양 부피 (mm3)는 길이 (l)와 폭 (w)을 측정함으로써 측정하고, 부피 (V = lw 2 /2)를 계산하였다. 각 군당 10 내지 15마리의 동물을 포함하였다.
ALK1.Fc로 처리한 결과, 비히클 처리와 비교하였을 때 종양 성장은 유의적으로 억제되었다 (도 5 & 6). 종양 성장에 미치는 효과는 시험된 모든 이종이식편 종양 모델에서 관찰되었고, 이는 관찰된 항-종양 효과가 종양 유형에 특이적인 것은 아니라는 것을 시사한다.
실시예
5:
ALK1
-
Fc
및 항-
VEGF
조합
실시예 4에서 상기 기술된 HM7 종양 연구에서, 종양 세포를 주사한 후 3일째에 ALK1.Fc 처리를 시작하였다. 종양 세포 접종 후 9일째에 처리 (q/3d로 10 mg/kg))를 개시하였을 때, ALK1.Fc의 종양 성장 억제 활성은 감소되었다 (도 7). 상기 모델에서, 항-VEGF 항체 (B20-4.1, q/3d로 5 mg/kg) 처리는 또한 처리가 지연된 경우에는 효과가 더 작았다. 그러나, 두 제제를 조합하여 사용하였을 때에는 유의적인 추가의 효과가 관찰되었다 (도 7). 항-VEGF 항체와 ALK1.Fc의 조합된 효과를 또한 LL2 이종이식편 모델에서도 연구하였다. 5 X 106 마우스 루이스 폐암종 LL2 세포를 각각의 마우스에 주사하고, 종양 접종 후 2일째에 ALK1.Fc (q/2d로 10 mg/kg) 및 항-VEGF 항체 (q/2d로 5 mg/kg) 처리를 개시하였다. 상기 결과, LL2 종양 모델에서 조합 요법이 단일요법과 비교하여 더 큰 항-종양 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 8).
CD31 염색에 의해 평가한 후, 항-VEGF 항체 및 ALK1.Fc가 종양 혈관 밀도에 미치는 효과를 LL2 종양 모델에서 조사하였다. 종양 세포 접종 후 18일째, 종양을 제거하고, PBS 중 1％ 파라포름알데히드 (PFA) 중에 2시간 동안 침지시켜 고정시킨 후, 동결방지를 위해 30％ 수크로스 중에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 샘플을 OCT 중에 포매시키고, 40 ㎛ 두께의 절편을 제조하고, 항-마우스 CD31 (1:50, BD 파민겐(BD Pharmingen))로 염색한 후, FITC-접합된 염소 항-래트 IgG로 염색하였다. 예측대로, 항-VEGF 항체 단독으로 처리한 결과, 처리된 종양의 혈관 밀도는 유의적으로 감소하였다. 그러나, ALK1.Fc로 처리하였을 때에는 종양 혈관 밀도에 대하여 미미한 효과를 발휘하였다. 놀랍게도, 두 제제 모두로 처리한 결과, 종양 혈관 밀도는 더욱더 현저하게 감소하였으며 (도 9), 이는 부가적인 항-종양 효과와도 일치하는 결과이다. 또한, 이러한 결과는, ALK1.Fc를 사용하여 Alk1 신호 전달을 차단하는 것이, 특히, 항-VEGF와 조합하여 수행할 경우, 광범위한 항-종양 효능을 발휘할 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예
6:
ALK1
-
Fc
처리가
생체내
림프 맥관 발생에 영향을 미친다
같은 한배 새끼로부터 얻은 신생 CD1 마우스를 사용하여 ALK1.Fc가 림프관신생에 미치는 효과를 연구하였다. 생후 1일째 (P1), P3 및 P6에 마우스에 ALK1.Fc (10 mg/kg 체중)를 i.p. 주사하고, P9에 조직을 수거하였다. 소장을 통째로 제거하고, PBS로 세정하였다. 꼬리 피부의 경우, 진피를 표피로부터 분리하고, PBS로 세척시키고, 추후 염색 단계에서 사용하였다. 조직을 실온에서 2시간 동안 PBS 중 4％ PFA로 차단시켰다. 실온에서 2시간 동안 PHT1 (PBS 중 5％ 염소 혈청, 0.2％ BSA, 0.5％ 트리톤 X-100, NaN3)로 차단시킨 후, 조직을 PHT1 중 래트 항-CD31 (1:50, BD 파민겐) 및 래빗 폴리클로날 항-LYVE-1 (1:500, 업스테이트)과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. PHT2 (PBS 중 2％ BSA, 0.5％ 트리톤 X-100) 중 2차 알렉사플루오르(AlexaFluor) 488-접합된 염소 항-래트(1:400, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)) 및 알렉사플루오르 594-접합된 염소 항-래빗 (1:400, 몰레큘라 프로브스)을 사용하여 항원-항체 복합체를 시각화하였다. 염색을 마친 후, 조직을 PBST (PBS, 0.5％ 트리톤 X-100) 중에서 4회에 걸쳐 세척하고, 그 후 실온에서 5-10분 동안 PBS 중 4％ PFA로 고정시킨 후, PBS 중에서 추가로 4회에 걸쳐 세척하였다. 모두 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 평평하게 올려진 망막의 영상을 형광 공초점 현미경으로 포착하였다.
ALK1.Fc로 처리된 신생 마우스의 소장에서 융모 중의 모세 혈관 (CD31 염색)은, 비록 융모가 대조군보다는 중간 정도로 길이가 더 짧기는 하지만, 정상적인 것으로 나타났다 (도 10 & 11). 대조적으로, 림프 모세혈관 (LYVE-1 염색)은 심각하게 영향을 받은 것으로 나타났다. 림프 모세혈관은 전체적으로 융모로 확장되지 못했고, 대개는 융모 기저부에서 멈췄다.
신생 마우스 꼬리 피부에 존재하는 림프 혈관 네트워크는 또한 ALK1.Fc 처리 우헤 현저하게 변경되었다 (도 12). 특징이 되는 벌집모양과 유사한 패턴은 대개 파괴되었고, 단지 림프관이 단편화되고 조직이 파괴되었다. 이러한 결과는, Alk1 신호 전달이 혈관 형성을 조절하는데 있어 중요한 역할을 하는 것 이외에도, 출생 후의 림프 맥관 발생에서도 필수적이라는 것을 시사한다.
실시예
7:
ALK1
-
Fc
처리가 혈관주위세포 조직에 영향을 미친다
ALK1.Fc 처리가 종양 혈관 중 혈관주위세포 조직에 미치는 효과를 조사하였다. 50％ 마트리겔 (BD 바이오사이언스)을 함유하는 0.1 ml 종양 세포 현탁액을 베이지색의 누드 마우스의 우측 뒤 옆구리쪽에 주사하였다. 5 X 106개의 마우스 단핵구 백혈병 TIB68 세포 (BALB/c-유래의 것으로, 단핵구-골수세포 분화시 초기 단계에 나타나는 것으로 사료된다)를 각 마우스에 주사하여 피하 종양을 확립하였다. Alkl.Fc (10 mg/kg) 또는 대조군 비히클 (PBS)을 3일에 한번씩 i.p.를 통해 투여하였다. 세포를 접종한 다음날 처리를 개시하고, 첫번째 투약 후 16일째에 종결지었다. 종양을 실온 (RT)에서 4％ 파라포름알데히드 (PFA) 중에서 2시간 동안 고정시키고, PBS 중에서 세정하고, 4℃에서 밤새도록 30％ 수크로스로 옮기고, OCT에 포매시켰다. 80 ㎛의 종양 조직 절편을 PBS 중에서 세척하고, RT에서 2시간 동안 PHT1 (PBS/10％ 염소 혈청/0.5％ 트리톤 X-100)로 차단하고, 4℃에서 밤새도록 PHT2 (PBS/2％ 염소 혈청/0.5％ 트리톤 X-100) 중에 희석된 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다 (래트 항-마우스 CD31, 1:50, BD 파민겐; 래빗 항-데스민, 1:400, 진텍스(GeneTex)). PBS/0.2％ 트리톤 X-100 중에서 4회에 걸쳐 세척한 후, 절편을 RT에서 2시간 동안 2차 항체 (염소-항 래트 알렉사 488; 염소 항-래빗 알렉사 594, 1:400, 몰레큘라 프로브스)와 함께 인큐베이션시켰다. 절편을 PBS/0.2％ 트리톤 X-100 중에서 세척한 후, PBS로 세척하고, RT에서 5분 동안 4％ PFA로 고정시키고, 최종적으로 PBS로 세척하였다. 이는 ALK1.Fc로 처리된 종양 혈관은 불완전하게 조직화되고 분리된 혈관주위세포를 갖는다는 결과를 보여준다 (도 13).
실시예
8: 추가의
ALK1
면역어드헤신
분자 생성
표준 분자 생물학 기법을 사용하여 하기의 추가 분자를 생성하였다:
실시예
9:
ALK1
면역어드헤신
처리가
생체내
망막 혈관 발생에 영향을 미친다
생후 4일째 (P4) 및 P6에 마우스에 ALK1.Fc, ALK1.Fc.2, ALK1.Fc.4 또는 ALK1.Fc.5 (10 mg/kg 체중)를 i.p. 주사하였다. P8에, 마우스를 마취시켰다. 눈을 수집하고, 밤새도록 PBS 중 4％ PFA로 고정시킨 후, PBS로 세척하였다. 절개한 망막을 3시간 동안 PBST (PBS, 0.5％ 트리톤 X-100) 중 10％ 염소 혈청으로 차단시킨 후에 PBST 중 래트 항-CD31 (1:50, BD 파민겐)과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. 항-CD31을 시각화하기 위해 망막을 PBST 중 알렉사 플루오르 488-접합된 염소 항-래트 (1:400, 몰레큘라 프로브스)와 함께 인큐베이션시켰다. 염색을 마친 후, 망막을 PBST 중에서 4회에 걸쳐 세척하였다. 모두 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 평평하게 올려진 망막의 영상을 형광 공초점 현미경으로 포착하였다.
출생 후 초기 마우스의 망막에서는 잘 정의된 이벤트 순서로 정형적인 혈관 패턴이 발생한다. 표층의 망막 맥관은 시신경두로부터의 확장 네트워크로 발생하게 되는데, 주변부에서는 활발히 발아가 일어나고, 중심부에서는 확장형의 재형성이 일어난다. 예로서, 혈관 발아, 재형성, 성숙, 및 동맥-정맥 전문화와 같은 혈관 발생의 다른 측면들도 쉽게 이어서 진행될 수 있다. ALK1 면역어드헤신 (ALK1.Fc, ALK1.Fc.2, ALK1.Fc.4 및 ALK1.Fc.5)로 처리한 망막에서는 방사상으로 교호로 배열된 동맥 및 정맥의 특징적인 패턴 대부분이 영향을 받지 않았다. 그러나, 혈관 밀도, 특히, 정맥에 인접해 있는 미세혈관의 혈관 밀도는 증가한 것으로 뚜렷이 나타났다 (도 14). 이러한 결과는, 신생 마우스의 망막에서의 혈관 발생에 대하여 추가의 ALK1 면역어드헤신 (ALK1.Fc.2, ALK1.Fc.4 및 ALK1.Fc.5) 처리가 미치는 효과는 ALK1.Fc 처리가 미치는 효과와 유사하다는 것을 시사한다.
Sequence Listing
<110> Yan, Minhong
<120> ACTIVIN RECEPTOR-LIKE KINASE-1 COMPOSITIONS AND
METHODS OF USE
<130> P4042R1
<150> US 60/986,876
<151> 2007-11-09
<150> US 61/098,557
<151> 2008-09-19
<160> 10
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 1
atgaccttgg gctcccccag gaaaggcctt ctgatgctgc tgatggcctt 50
ggtgacccag ggagaccctg tgaagccgtc tcggggcccg ctggtgacct 100
gcacgtgtga gagcccacat tgcaaggggc ctacctgccg gggggcctgg 150
tgcacagtag tgctggtgcg ggaggagggg aggcaccccc aggaacatcg 200
gggctgcggg aacttgcaca gggagctctg cagggggcgc cccaccgagt 250
tcgtcaacca ctactgctgc gacagccacc tctgcaacca caacgtgtcc 300
ctggtgctgg aggccaccca acctccttcg gagcagccgg gaacagatgg 350
ccagaccggt gtcaccgaca aagctgcgca ctatactctg tgcccaccgt 400
gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 450
aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt 500
ggtggtggcc gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg 550
tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 600
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga 650
ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 700
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 750
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaagagatga ccaagaacca 800
ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg 850
tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 900
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 950
ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc 1000
atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1050
ggtaaatga 1059
<210> 2
<211> 352
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 2
Met Thr Leu Gly Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met
1 5 10 15
Ala Leu Val Thr Gln Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro
20 25 30
Leu Val Thr Cys Thr Cys Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr
35 40 45
Cys Arg Gly Ala Trp Cys Thr Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly
50 55 60
Arg His Pro Gln Glu His Arg Gly Cys Gly Asn Leu His Arg Glu
65 70 75
Leu Cys Arg Gly Arg Pro Thr Glu Phe Val Asn His Tyr Cys Cys
80 85 90
Asp Ser His Leu Cys Asn His Asn Val Ser Leu Val Leu Glu Ala
95 100 105
Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln Pro Gly Thr Asp Gly Gln Thr Gly
110 115 120
Val Thr Asp Lys Ala Ala His Tyr Thr Leu Cys Pro Pro Cys Pro
125 130 135
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
140 145 150
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
155 160 165
Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
170 175 180
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
185 190 195
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
200 205 210
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
215 220 225
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
320 325 330
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
335 340 345
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
350
<210> 3
<211> 1051
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 3
atgaccttgg gctcccccag gaaaggcctt ctgatgctgc tgatggcctt 50
ggtgacccag ggagaccctg tgaagccgtc tcggggcccg ctggtgacct 100
gcacgtgtga gagcccacat tgcaaggggc ctacctgccg gggggcctgg 150
tgcacagtag tgctggtgcg ggaggagggg aggcaccccc aggaacatcg 200
gggctgcggg aacttgcaca gggagctctg cagggggcgc cccaccgagt 250
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ctggtgctgg aggccaccca acctccttcg gagcagccgg gaacagatgg 350
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ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 450
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cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg 550
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 600
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tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca 700
tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 750
tacaccctgc ccccatcccg ggaagagatg accaagaacc aggtcagcct 800
gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 850
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 900
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tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1050
g 1051
<210> 4
<211> 349
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 4
Met Thr Leu Gly Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met
1 5 10 15
Ala Leu Val Thr Gln Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro
20 25 30
Leu Val Thr Cys Thr Cys Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr
35 40 45
Cys Arg Gly Ala Trp Cys Thr Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly
50 55 60
Arg His Pro Gln Glu His Arg Gly Cys Gly Asn Leu His Arg Glu
65 70 75
Leu Cys Arg Gly Arg Pro Thr Glu Phe Val Asn His Tyr Cys Cys
80 85 90
Asp Ser His Leu Cys Asn His Asn Val Ser Leu Val Leu Glu Ala
95 100 105
Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln Pro Gly Thr Asp Gly Gln Thr Gly
110 115 120
Val Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
125 130 135
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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200 205 210
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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230 235 240
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245 250 255
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
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275 280 285
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Ser Pro Gly Lys
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> sequence is synthesized
<400> 5
atgaccttgg gctcccccag gaaaggcctt ctgatgctgc tgatggcctt 50
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tcgtcaacca ctactgctgc gacagccacc tctgcaacca caacgtgtcc 300
ctggtgctgg aggccaccca acctccttcg gagcagccgg gaacagatgg 350
ccagaccggt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac 400
tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 450
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggccgtgag 500
ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 550
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cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 850
atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 900
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg 950
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<220>
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95 100 105
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Claims (28)
- 림프관신생 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 림프관신생을 억제시키는 단계를 포함하는, 림프관신생을 억제시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 대상체가 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선을 앓고 있는 것인 방법.
- 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 림프관신생과 관련된 병적 상태를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 림프관신생과 관련된 병적 상태를 치료하는 방법.
- 제3항에 있어서, 림프관신생과 관련된 병적 상태가 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선인 방법.
- 제2항 또는 제4항에 있어서, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병이 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 방법.
- 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양성 림프관신생을 억제시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양성 림프관신생을 억제시키는 방법.
- 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양 전이를 억제시키거나 예방하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 전이를 억제시키거나 예방하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 대상체에서 종양 전이가 발생하였거나, 발생할 위험에 있는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 종양 전이가 림프계에서 일어나는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 종양 전이가 원위 장기에서 일어나는 것인 방법.
- 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 혈관주위세포 조직을 파괴시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관주위세포 조직을 파괴시키는 방법.
- 제11항에 있어서, 대상체가 종양, 암, 세포 증식성 질병, 황반 변성, 염증 매개 질환, 류마티스성 관절염, 당뇨 망막병증 또는 건선을 앓고 있는 것인 방법.
- 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양 성장을 억제시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제시키는 방법.
- 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 투여함으로써, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병을 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양, 암 또는 세포 증식성 질병을 치료하는 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 종양, 암 또는 세포 증식성 질병이 암종, 림프종, 모세포종, 육종 또는 백혈병인 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 대상체에게 유효량의 항-혈관신생제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 항-혈관신생제가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 길항제인 방법.
- 제17항에 있어서, VEGF의 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
- 제18항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
- 혈관신생과 관련된 병적 상태를 앓고 있는 대상체에게 유효량의 ALK-1 길항제를 항-혈관신생제와 함께 투여함으로써, 항-혈관신생제의 억제 활성을 증진시키는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 항-혈관신생제의 효능을 증진시키는 방법.
- 제20항에 있어서, 혈관신생과 관련된 병적 상태가 종양, 암 또는 세포 증식성 질병인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ALK-1 길항제가 ALK-1 면역어드헤신인 방법.
- 제22항에 있어서, ALK-1 면역어드헤신이 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-352, 서열 번호: 4의 잔기 22-349, 서열 번호: 6의 잔기 22-347, 서열 번호: 8의 잔기 22-350, 또는 서열 번호: 10의 잔기 22-350을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ALK-1 길항제가 항-ALK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
- 종양 전이의 예방, 억제 또는 치료, 또는 종양, 암 또는 세포 증식성 질병 치료에 사용하기 위한 ALK-1 길항제.
- 제25항에 있어서, ALK-1 면역어드헤신인 ALK-1 길항제.
- 제26항에 있어서, ALK-1 면역어드헤신이 서열 번호: 2의 아미노산 잔기 22-352, 서열 번호: 4의 잔기 22-349, 서열 번호: 6의 잔기 22-347, 서열 번호: 8의 잔기 22-350, 또는 서열 번호: 10의 잔기 22-350을 포함하는 것인 ALK-1 길항제.
- 제25항에 있어서, 항-ALK-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 ALK-1 길항제.
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