KR20100089927A

KR20100089927A - Adult stem cell population of cell spheroid form for transplantation and method for producing the same

Info

Publication number: KR20100089927A
Application number: KR1020090009113A
Authority: KR
Inventors: 김병수; 방석호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2010-08-13
Also published as: KR101017710B1

Abstract

PURPOSE: An adult stem cell assembly for transplantation, cultured in cell spheroid form is provided to enhance cell viability and to improve treatment efficiency of stem cell therapeutic agent. CONSTITUTION: An adult stem cell assembly for transplantation is cultured in cell spheroid form in vitro. The adult stem cell is adipose-derived stem cell, umbilical cord blood stem cell or bone marrow stem cell. The adult stem cell assembly is used for transplantation of ischemic lesion. The ischemic disease is diabetes and various heart diseases. A method for transplanting adult stem cells comprises: a step of culturing adult stem cells under the hypoxia condition to prepare the adult stem cell assembly; and a step of transplanting the adult stem cell assembly to patient.

Description

세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법{ADULT STEM CELL POPULATION OF CELL SPHEROID FORM FOR TRANSPLANTATION AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}Adult stem cell aggregate for transplantation in the form of cell spheroids and a method of manufacturing the same {ADULT STEM CELL POPULATION OF CELL SPHEROID FORM FOR TRANSPLANTATION AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 줄기세포치료에 사용되는 줄기세포 집합체 및 그 대량 제조방법에 관한 것이며, 더 구체적으로는 체내 이식 후 생존율이 개선되어 줄기세포 치료제의 치료 효능의 향상 효과를 가지는 이식용 성체 줄기세포 집합체에 관한 것이다.The present invention relates to a stem cell aggregate used for stem cell therapy and a mass production method thereof, and more particularly, to an adult stem cell aggregate for transplantation having an effect of improving the therapeutic efficacy of a stem cell therapeutic agent by improving survival after transplantation in the body. It is about.

줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제 (Cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위(최소한 이상의 조작: more-than-minimal manipulation)를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 이 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 경우에서 활발하게 개발이 진행되고 있다.Cell therapy products, including stem cell therapies, can be used to proliferate, select, or otherwise invigorate living autologous, allogeneic or xenogeneic cells in vitro to restore cell and tissue function. It is defined as a drug used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions (more-than-minimal manipulation), such as altering the biological properties of the drug. Stem cell therapy refers to the use of stem cells, especially the current application field is the essential and naturally well-repaired recovery and regeneration of the lost cells such as neurological disease, heart disease, lung disease, liver disease, cancer In the case of not losing, development is actively progressing.

줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다. Stem cells have great potential in cell therapy in that they have differentiation potential and can induce differentiation from damaged tissues to necessary cells.However, at the present development level, the survival rate after transplantation in the body is not high. It is hard to find a successful example.

지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포치료제가 허혈성 질환 치료에 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 경우 줄기세포를 2차원 배양접시에서 배양하고, 부착되어 있는 배양한 세포를 트립신 처리에 의해 수거한 후 수거된 세포를 단일 세포(single cell)의 형태로 환자의 허혈성 병변부위에 이식하는 방법이 일반적으로 사용된다. Stamm C, Westphal B, et al., Lancet (2003년)에는 골수 유래 줄기세포를 배양하지 않고 또는 2차원적 배양접시에서 배양하여 단일 세포 형태로 허혈성 심근 질환 부위에 이식함으로써 심장 기능 회복 및 조직 재생의 효율을 높이는 내용을 보고하였다. It has been found that adipose, bone marrow or umbilical cord blood derived stem cell therapies can be used to treat ischemic diseases and can regenerate blood vessels. In this case, stem cells are cultured in a two-dimensional culture plate, and the attached cultured cells are collected by trypsin treatment, and then the collected cells are transplanted into ischemic lesions of patients in the form of single cells. Generally used. Stamm C, Westphal B, et al., Lancet (2003), repaired heart function and tissue regeneration by transplanting bone marrow-derived stem cells in a single cell form to ischemic myocardial disease without culturing them or in a two-dimensional culture dish. Reported to increase the efficiency of.

그러나, 허혈부위에 이식된 줄기세포의 대부분은 사멸되어 세포치료제의 치료효능이 크지 않은 문제점이 있어 왔다. 특히 트립신 처리를 통해 수거된 세포들은 트립신에 의해 세포가 해를 받거나, 세포에 붙어있는 세포외기질(extracellular matrix)가 트립신 효소에 의해 세포로부터 이탈되어, 세포외기질에 포함된 성분들이 소실되어 환자에 이식 후 세포 생존율이 낮아진다. 또한, 2차원 배양접시를 이용한 세포 배양은 대량 배양이 어려워 많은 수의 세포가 요구되는 임상 치료에 적합하지 않기 때문에 세포치료제의 임상 적용에 어려움이 있다.However, most of the stem cells transplanted into the ischemic site have been killed and there is a problem that the therapeutic effect of the cell therapeutic agent is not large. In particular, cells collected through trypsin treatment may be damaged by the trypsin, or the extracellular matrix attached to the cells may be separated from the cells by trypsin enzyme, resulting in the loss of components contained in the extracellular matrix. After transplantation, cell viability is lowered. In addition, the cell culture using the two-dimensional culture plate is difficult to clinically apply the cell therapy because it is difficult to mass culture and is not suitable for clinical treatment requiring a large number of cells.

Rehman J 등(Circulation 2004; 109(10): 1292-8)은 지방 유래 줄기세포에서 혈관 재생에 관련된 인자가 분비된다는 것을 보고한다. 그러나, 이 방법에서도 역시 줄기세포는 단일 세포 형태로 허혈 부위에 이식되어 이식된 세포의 생존율이 극히 낮았다.Rehman J et al. (Circulation 2004; 109 (10): 1292-8) report the secretion of factors related to blood vessel regeneration in adipose derived stem cells. However, even in this method, stem cells were transplanted to the ischemic site in a single cell form, and the survival rate of the transplanted cells was extremely low.

Nakagami H 등(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25(12): 2542-7)은 지방유래 줄기세포를 VEGF와 HGF로 처리한 후 마우스 하지 허혈 부위에 이식하는 내용을 보고하였다. 그 결과 VEGF와 HGF로 처리하지 않고 이식된 지방 유래 줄기세포보다 혈관 재생 효과가 높았다. 그러나, VEGF, HGF 등의 성장인자는 농도에 따라서는 암을 유발할 가능성이 높아 임상 허가도 주어지지 않을 정도이므로 임상 적용에는 위험이 있다.Nakagami H et al. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25 (12): 2542-7) reported the transplantation of adipose derived stem cells into VEGF and HGF and transplanted them into the lower limb ischemia. As a result, the vascular regeneration effect was higher than that of adipose derived stem cells transplanted without VEGF and HGF treatment. However, growth factors such as VEGF, HGF, etc. are likely to cause cancer depending on the concentration, and even clinical approval is not given, so there is a risk in clinical applications.

최근 보고(Rehman et al., 2004년)에 따르면 지방조직에서 추출한 지방 줄기 세포(adipose-derived stromal cells)는 혈관 재생에 직접적으로 참여하지는 않으나, 혈관 재생 인자를 분비하여 혈관 재생을 유도하는 가능성이 높은 것으로 확인되었다. 하지만 허혈성 질환 부위에 이식된 줄기세포들은 생존율이 매우 낮아, 이식된 줄기세포에서 허혈성 질환 부위로 분비되는 혈관 생성 인자의 양이 감소하여 치료 효율이 낮았다.According to a recent report (Rehman et al., 2004), adipose-derived stromal cells derived from adipose tissue do not directly participate in vascular regeneration, but are likely to induce vascular regeneration by secreting vascular regeneration factors. It was confirmed to be high. However, stem cells transplanted into the ischemic disease site have a very low survival rate, resulting in a low treatment efficiency due to a decrease in the amount of angiogenic factors secreted from the transplanted stem cells into the ischemic disease site.

따라서, 이식 후에도 세포 생존율이 높고 대량의 세포 배양이 가능하여 높은 세포치료 효능을 나타내면서도 안전성이 담보되는 이식용 줄기세포 치료제의 개발 필요성이 있다.Therefore, there is a need for the development of a stem cell therapeutic agent for transplantation, which has high cell survival even after transplantation and is capable of cultivating a large amount of cells, thereby ensuring safety while ensuring high cell therapeutic efficacy.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 줄기세포치료제의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 종래 사용되던 방법인 2차원적인 세포 배양 결과물을 이식하는 방법 대신 3차원적 배양을 통하여 세포 스페로이드 형태을 제조하면 시험관 내 세포 생존율이 유의하게 증가하는 것을 발견하여 시험관 내 생존율 및 세포 내 이식의 치료효과가 유의하게 개선된 본 발명의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법을 완성하였다.The present inventors are to solve the problems of the conventional stem cell therapy as described above, if the cell spheroid form through the three-dimensional culture instead of the method of implanting the two-dimensional cell culture product which is a conventional method used in vitro cells The survival rate was found to be significantly increased to complete the adult stem cell aggregate for transplantation of the present invention and a method for producing the same, which significantly improved the in vitro survival rate and the therapeutic effect of intracellular transplantation.

본 발명의 한 구체예에서는 3차원 스피너 플라스크 (spinner flask) 생물 반응기 배양 방식을 이용하여 줄기세포를 세포 스페로이드 형태로 대량으로 제조한 후 허혈 질환부위 등 치료가 필요한 부위에 이식함으로써 종래 사용되던 2차원 배양에 의한 단일 형태의 세포이식 방법보다 허혈성 질환 부위에 이식된 줄기세포의 생존율을 높이며, 세포 한 개당 혈관 재생 인자의 분비량을 보다 높게 분비하도록 유도하여 줄기세포치료제의 허혈 질환 치료효능을 높일 수 있다. 세포를 세포 스페로이드 형태로 배양하면 이식을 위해 세포를 수거할 때 트립신 효소처리가 필요없으므로 효소에 의하여 세포에 가해질 수 있는 피해를 줄일 수 있고 세포외기질도 손상됨 없이 세포에 붙은 채로 이식되어 이식 후 세포의 생존율이 높아진다. 게다가, 종래에 사용되던 2차원 배양법들과는 달리 3차원 배양방법은 대량 배양 공정에 적합한 방법이기 때문에 임상 적용하기에 필수적인 공정요소인 세포양의 증대까지 달성할 수 있는 추가적 이점이 있다.In one embodiment of the present invention by using a three-dimensional spinner flask bioreactor culture method to produce a large amount of stem cells in the form of a cell spheroid 2 and then transplanted to the area that needs to be treated such as ischemic disease site 2 The survival rate of stem cells transplanted to ischemic disease site is increased and the secretion of vascular regeneration factor per cell is higher than that of single cell transplantation by dimensional culture. have. By culturing cells in the form of cell spheroids, trypsin enzyme treatment is not necessary when collecting cells for transplantation, which reduces the damage that can be caused to the cells by enzymes and transplants the cells after they are transplanted without damage to the extracellular matrix. The survival rate of the cell is high. In addition, unlike the two-dimensional culture methods used in the prior art, since the three-dimensional culture method is suitable for mass cultivation process, there is an additional advantage of achieving an increase in cell volume, which is an essential process element for clinical application.

따라서, 본 발명의 한 양태에서는 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태로 세포 외 배양된 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제공한다. 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 바람직하게 선택될 수 있다.Accordingly, one aspect of the present invention provides an adult stem cell aggregate for transplantation, which is cultured extracellularly in the form of a cell spheroid. Adult stem cells may be preferably selected from adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells and bone marrow derived stem cells.

본 발명의 성체 줄기세포 집합체가 사용될 수 있는 질환은 제한되지 않는다. 줄기세포 이식이 필요한 어떠한 질환에 대하여도 적용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 성체 줄기세포 집합체는 당뇨, 각종 심장질환을 포함하는 허혈성 질환의 허혈조직 부위 이식될 수 있다.Diseases in which the adult stem cell aggregates of the present invention can be used are not limited. It can be applied to any disease requiring stem cell transplantation. Preferably, the adult stem cell aggregate of the present invention may be transplanted to an ischemic tissue site of ischemic disease including diabetes mellitus and various heart diseases.

본 발명의 다른 양태에서는 저산소 조건 하에서 세포 부착 지지체를 제공하지 않고 성체 줄기세포를 배양함으로써 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기 세포 집합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 구체예에서 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택될 수 있다. 본 구체예의 방법에 따라 제조되는 성체 줄기세포 집합체는 줄기세포 이식이 필요한 어떠한 질환에 대하여도 적용될 수 있다. Another aspect of the present invention provides a method for producing adult stem cell aggregates for transplantation in cell spheroid form by culturing adult stem cells without providing a cell attachment support under hypoxic conditions. In the present embodiment, adult stem cells may be selected from adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells, and bone marrow derived stem cells. Adult stem cell aggregates prepared according to the methods of this embodiment can be applied to any disease requiring stem cell transplantation.

또 다른 양태에서 본 발명은 저산소 조건 하에서 세포 부착 지지체를 제공하지 않고 성체 줄기세포를 배양함으로써 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제공하는 단계 및 상기 성체 줄기세포 집합체를 환자의 필요 부위에 이식하는 단계를 포함하는 성체 줄기세포의 이식 방법을 제공한다. 줄기세포 집합체의 환부 이식은 당업계에 알려진 어떠한 세포 이식방법에 의하여 수행될 수 있으며, 줄기세포 치료제의 이식 방법은 당업자에게 주지이다.In another aspect, the present invention provides an adult stem cell aggregate for transplantation in cell spheroid form by culturing adult stem cells without providing a cell attachment support under hypoxic conditions, and providing the adult stem cell aggregate to a patient's required site. It provides a method for transplanting adult stem cells comprising the step of transplanting. Wound transplantation of stem cell aggregates can be performed by any cell transplantation method known in the art, and methods of transplanting stem cell therapeutics are well known to those skilled in the art.

상기 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 이식이 필요한 질환에 따른 필요에 따라 선택될 수 있다. 한 구체예에서 상기 줄기세포 집합체는 허혈성 질환 환자의 허혈 조직 부위에 이식될 수 있다. 허혈 조직 부위에 이식된 본 발명에 따르는 세포 스페로이드 형태의 줄기세포 집합체는 이식된 세포 생존율이 종래 방법에 의한 이식에서 보다 높고, 세포단 혈관 재생인자 등의 필요한 단백질 분비가 더 높으며 허혈 조직에서 혈관 재생 효과가 더 커서 줄기세포 치료제의 허혈질환 치료 효과가 뛰어나다.The adult stem cells may be selected according to the needs of the disease that requires transplantation from adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells and bone marrow derived stem cells. In one embodiment, the stem cell aggregate may be transplanted to an ischemic tissue site of an ischemic disease patient. The cell spheroid-type stem cell aggregate according to the present invention transplanted to an ischemic tissue site has higher transplanted cell viability than conventional transplantation, higher required protein secretion such as endothelial vascular regeneration factor and blood vessels in ischemic tissue. Because of its greater regenerative effect, stem cell therapy is effective in treating ischemic diseases.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르는 이식용 성체 줄기세포 집합체는 단일 세포 형태로 배양된 성체 줄기 세포보다 체내 이식 후 이식된 부위 에서 세포 생존율이 높으므로, 예를 들어 허혈 조직에 이식되는 경우 혈관 재생 촉진효과가 개선되어 줄기세포 치료제의 허혈 질환 치료효능을 제고할 수 있다. 본 발명에 따르는 이식용 성체 줄기세포 집합체의 제조방법은 세포를 2차원 배양 접시 등에서 배양하는 종래의 방법과는 달리 3차원 배양방법을 사용하므로 세포를 이식용으로 수거하는 과정에서 트립신 등의 효소처리가 필요하지 않아 효소로 인한 세포 손상이 없고 세포외기질도 그대로 유지되는 효과가 있다. 이로 인하여 이식 후 세포부착이 용이하여 세포 사멸이 줄어들어 세포치료제의 치료 효능이 증대된다. 또한 본 발명의 이식용 성체 줄기세포 집합체의 제조방법은 종래의 세포 부착방식의 배양방법과는 달리 대량 배양 공정에 적합한 형태이기 때문에 다량의 수를 확보하여 이식해야 하는 임상 적용에 더 유리한 추가적 효과가 있다.As described in detail above, the adult stem cell aggregate for transplantation according to the present invention has a higher cell viability at the transplanted site after transplantation than adult stem cells cultured in a single cell form, for example, when transplanted into ischemic tissue. The effect of promoting blood vessel regeneration can improve the ischemic disease treatment efficacy of stem cell therapy. The method for producing adult stem cell aggregates for transplantation according to the present invention uses a three-dimensional culture method, unlike conventional methods for culturing cells in a two-dimensional culture dish and the like, so as to process enzymes such as trypsin in the process of collecting the cells for transplantation. There is no need for cell damage caused by enzymes and extracellular matrix is also maintained. This facilitates cell adhesion after transplantation, thereby reducing cell death, thereby increasing the therapeutic efficacy of cell therapies. In addition, the production method of the adult stem cell aggregate for transplantation of the present invention, unlike the conventional method of culturing the cell attachment method is suitable for mass cultivation process, so the additional effect is more advantageous to the clinical application to secure a large number of transplants have.

본 발명의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법은 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생 치료를 위한 세포치료제의 개발에 유용하게 사용될 뿐 아니라 당뇨, 심장 질환 등 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생 치료제로서의 잠재성이 매우 높다.The adult stem cell aggregate for transplantation and its manufacturing method of the present invention are not only useful for the development of cell therapy for the treatment of vascular regeneration of ischemic vascular disease, but also have great potential as a therapeutic agent for vascular regeneration of ischemic vascular diseases such as diabetes and heart disease. high.

이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다. Specific embodiments of the present invention will be described through the following examples.

본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것 일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.The terminology used herein is not to be construed as being limited to a general and dictionary meaning, and the concept of a specific term may be defined within an appropriate range in order to explain the present invention in the best manner. Various equivalent or modified embodiments that are within the scope of the invention disclosed herein are also apparent to those skilled in the art in view of the present specification or the prior art in the art. The embodiments described below are only described for illustrative purposes, and the scope of the present invention is limited only by the claims.

실시예1: 세포 스페로이드의 제조Example 1 Preparation of Cell Spheroids

1.1.지방 유래 줄기 세포의 배양1.1.Cultivation of Adipose-derived Stem Cells

인간 지방 조직을 추출하여, 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 지방 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37 ℃, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직에서 분리된 세포를 α-최소 필수 배지(minimal essential medium)에서 배양하였다. Human adipose tissue was extracted and chopped after washing with phosphate-buffered saline (PBS). Pieces of adipose tissue were incubated in collagenase type 1 solution at 37 ° C. for 1 hour. Cells isolated from tissues were incubated in α-minimal essential medium.

1.2. 지방 유래 줄기 세포의 3차원 배양1.2. Three-Dimensional Culture of Adipose-derived Stem Cells

지방 유래 줄기 세포의 3차원 배양을 위해 3 일간 3차원 스피너 플라스크(spinner flask)에서 다른 성장인자를 첨가하지 않고 배양하여 주사전자현미경(SEM) 및 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) (H & E) 염색의 광학 현미경 사진을 통해 세포 스페로이드(cell spheroid) 생성 유도를 관찰하였다.For three-dimensional culture of adipose derived stem cells, the cells were cultured in a three-dimensional spinner flask for 3 days without adding other growth factors, followed by scanning electron microscopy (SEM), hematoxylin, and eosin (H). & E) Induction of cell spheroid production was observed through optical micrographs of staining.

3차원 배양법을 이용하여 3 일간 지방 유래 줄기 세포를 배양한 결과, 세포 스페로이드가 형성되었음을 확인하였다. H&E 염색법 (도 1의 A,B)과 주사전자현미경 이미지(도 1의 C)를 확인한 결과, 세포 스페로이드가 내부 괴사 없이 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다.Adipose-derived stem cells were cultured for 3 days using a three-dimensional culture method, and it was confirmed that cell spheroids were formed. As a result of confirming the H & E staining method (A, B of FIG. 1) and the scanning electron microscope image (C of FIG. 1), it was confirmed that the cell spheroid was well formed without internal necrosis.

실시예 2: 제조된 세포 스페로이드의 시험관 내 특성 확인Example 2 In Vitro Characterization of Prepared Cell Spheroids

2.1. 세포 스페로이드 내 세포의 사멸 및 증식 특성2.1. Killing and Proliferation Characteristics of Cells in Cellular Spheroids

저산소(hypoxia)(허혈 조건 조성: 1% O₂, 0% 혈청, 다른 언급이 없는 경우 이하 같음) 조건에서 3 일간 배양한 세포들을 TUNEL 염색과 RT-PCR을 통해 세포사 분석을 실시하였다. TUNEL 염색은 세포사 세포의 특성인 단편화된(fragmented) DNA를 검출함으로써 세포사의 정도를 측정하는 염색법이다. 3차원 배양법을 사용하여 제조된 세포 스페로이드(도 2의 A)가 2차원 배양 (도 2의 B)에 비해 통계학적으로 유의한 수준의 감소된 세포사를 보였으며(도 2의 C) 이러한 경향은 RT-PCR을 통해서도 일치함(도 2의 D)을 확인하였다. Cell cultures were cultured for 3 days under hypoxia (ischemic condition composition: 1% O ₂ , 0% serum, unless otherwise mentioned) under TUNEL staining and RT-PCR. TUNEL staining is a staining method that measures the degree of cell death by detecting fragmented DNA that is characteristic of cell death cells. Cell spheroids prepared using three-dimensional culture (A in FIG. 2) showed a statistically significant level of reduced cell death compared to two-dimensional culture (B in FIG. 2) (FIG. 2C). Was confirmed also by RT-PCR (D in Fig. 2).

RT-PCR을 위해서 수거된 세포와 조직들은 세포 용해 용액 (Trizol solution)을 처리하거나 잘게 부순 후 분쇄기를 이용해 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml 을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm 으로 15분간 4도씨에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4도씨에서 10분 동안 방치후 다시 원심분리하였다. 상등액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃ 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상등액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다. Cells and tissues harvested for RT-PCR are processed or crushed into a trilysis solution and then made completely in solution using a grinder. The mixture was treated with 0.2 ml of chloroform and mixed for 15 seconds, and then left at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 4 ° C. for 15 minutes at 12,000 rpm, the transparent layer was extracted and treated with 80% isopropanol in the same amount, and left at 4 ° C. for 10 minutes, followed by centrifugation. After removing the supernatant, the mixture was placed in 1ml 75% ethanol, and left for 4 minutes at 4 ° C. After centrifugation, the supernatant was removed and dried in air for 10 minutes.

RNA 1㎕에 RNA 완충용액 7㎕와 이차 증류수 2㎕를 넣고 1% 아가로스젤에 적재하여 비특이 결합용 프라이머 1㎕ 처리 후 Super Script Ⅱ Reverse Transcriptase 등의 처리를 거쳐 RNA 를 정량하여 cDNA 를 제작였다. 이후 프라이머 센스 0.5㎕, 프라이머 안티센스 0.5㎕, 2x 완충용액 I 12.5㎕, 증류수 6.75㎕, dNTP 혼합용액 4㎕ 와 표지인자텍 0.25㎕를 혼합하여 제작된 샘플들의 cDNA 0.5㎕ 씩 사용하여 RT-PCR을 94℃ 5분간 / 94℃ 30초간 / 60℃ 45초간 / 72℃ 45초간 과정을 거쳐 실시하였다.7 μl of RNA buffer solution and 2 μl of secondary distilled water were added to 1 μl of RNA, loaded on 1% agarose gel, and then treated with 1 μl of non-specific binding primer. It was. Then, RT-PCR was prepared using 0.5 μl of cDNA of samples prepared by mixing 0.5 μl of primer sense, 0.5 μl of primer antisense, 12.5 μl of 2x buffer solution, 6.75 μl of distilled water, 4 μl of dNTP mixed solution, and 0.25 μl of label factorec. 94 ℃ 5 minutes / 94 ℃ 30 seconds / 60 ℃ 45 seconds / 72 ℃ 45 seconds was carried out through the process.

프라이머 이름Primer name 프라이머 구성 (sense)Primer Sense 프라이머 구성 (anti-sense)Primer composition (anti-sense) bcl-XLbcl-XL 5'-CGG GCA TTC AGT GAC CTG AC -3'5'-CGG GCA TTC AGT GAC CTG AC -3 ' 5'-TCA GGA ACC AGC GGT TGA AG-3'5'-TCA GGA ACC AGC GGT TGA AG-3 ' bcl-2bcl-2 5'-AGA TGT CCA GCC AGC TGC ACC TGA-3'5'-AGA TGT CCA GCC AGC TGC ACC TGA-3 ' 5'-AGA TAG GCA CCA GGG TGA GCA AGC T-3'5'-AGA TAG GCA CCA GGG TGA GCA AGC T-3 ' baxbax 5'- GTG CAC CAA GGT GCC GGA AC-3'5'- GTG CAC CAA GGT GCC GGA AC-3 ' 5'-TCA GCC CAT CTT CTT CCA GA-3'5'-TCA GCC CAT CTT CTT CCA GA-3 ' p53 p53 5'-CGG GAT CCA TGG AGG AGC CGC AGT CAG AT-3'5'-CGG GAT CCA TGG AGG AGC CGC AGT CAG AT-3 ' 5'- CCG CTC GAG TTT CTG GGA AGG GAC AGA AGA -3'5'- CCG CTC GAG TTT CTG GGA AGG GAC AGA AGA -3 ' VEGFVEGF 5'-GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT-3'5'-GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT-3 ' 5'-ACA CTC CAG GCC CTC GTC ATT-3'5'-ACA CTC CAG GCC CTC GTC ATT-3 ' bFGFbFGF 5'-CTT TGG CTG CTA CTT GGA GG-3'5'-CTT TGG CTG CTA CTT GGA GG-3 ' 5'-GAA GCT TTC CAG CAA AGT GG-3'5'-GAA GCT TTC CAG CAA AGT GG-3 ' HGFHGF 5'-GTT ATC GTG GGA ATG GCA A-3'5'-GTT ATC GTG GGA ATG GCA A-3 ' 5'-ATG ATC CTC CGC AGA TAT-3'5'-ATG ATC CTC CGC AGA TAT-3 ' β-액틴β-actin 5'-GCA CTC TTC CAG CCT TCC TTC C-3'5'-GCA CTC TTC CAG CCT TCC TTC C-3 ' 5'-TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT TT-3'5'-TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT TT-3 '

또한, 저산소 조건에서 3 일간 배양한 세포들의 DNA 정량을 통해, 세포 증식도의 차이를 확인한 결과 3차원 배양법을 이용해 만들어진 세포 스페로이드가 2차원 배양법 배양된 세포에 비해 통계학적으로 유의한 수준의 증가된 세포 증식도를 모든 배양 시점에서 나타내었다(도 3). In addition, as a result of confirming the difference in cell proliferation rate by DNA quantification of cells cultured in hypoxic conditions for 3 days, the cell spheroids produced using the 3D culture method increased statistically significant level compared to the cells cultured in the 2D culture method. Cell proliferation was shown at all culture time points (FIG. 3).

2.2. 세포 스페로이드의 생존 관련 물질의 분비 특성2.2. Secretion Characteristics of Survival-related Substances in Cellular Spheroids

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 배양에 사용한 배지를 수거하여 (저산소 조건이 아닌) 정상산소 배양 조건에서 새로운 지방 유래 줄기 세포를 배양한 후 세포사 정도를 분석하였다. 3차원 배양법을 이용해 만들어진 세포 스페로이드의 배양액을 사용한 경우에서 2차원 배양법을 이용한 세포 배양액을 사용한 경우보다 세포사가 감소하였다(도 4). 이와 같은 결과는 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양 조건에서 배양된 세포보다 많은 양의 세포 생존 관련 물질을 분비한다는 것을 시사한다.After culturing the cells for 3 days in the hypoxic condition, the medium used for cultivation was collected and cultured fresh fat-derived stem cells under normal oxygen culture conditions (not hypoxic conditions) and analyzed for the degree of cell death. Cell death was decreased in the case of using the cell spheroid culture solution made using the three-dimensional culture method than in the case of using the cell culture solution using the two-dimensional culture method (Fig. 4). These results suggest that three-dimensional cell spheroids secrete a greater amount of cell survival-related substances than cells cultured in two-dimensional culture conditions.

2.3. 세포 생존율 분석2.3. Cell viability assay

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 배양된 세포를 대상으로 MTT 조사법 (도 5의 A)와 뉴트럴 레드 조사법(neutral red assay)(도 5의 B)을 실시하여 세포생존율을 분석하였다. 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양시보다 높은 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다(도 5).After culturing the cells in hypoxic conditions for 3 days, the cell viability was analyzed by MTT irradiation (A of FIG. 5) and neutral red assay (B of FIG. 5) on the cultured cells. It was confirmed that the three-dimensional cell spheroid shows a higher cell viability than when the two-dimensional culture (Fig. 5).

2.4. 혈관생성인자 및 세포 생존율 향상인자 분비 특성2.4. Secretion characteristics of angiogenesis and cell survival factors

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양 세포에 비해 많은 양의 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor:섬유아세포 기본 성장인자)(세포 생존율 향상 및 혈관 재생에 관여), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor: 혈관내피 성장인자)(세포사 감소 및 혈관 재생에 관여), HGF(간세포 성장인자: hepatocyte growth factor)(세포사 감소 및 혈관 재생에 관여)의 분비량이 증진되는 것을 확인하였다(도 6). After culturing the cells for 3 days in hypoxic conditions, secretion of angiogenesis factors and cell viability enhancing factors was confirmed by RT-PCR. Three-dimensional cell spheroids have higher amounts of basic fibroblast growth factor (bFGF) (enhanced in cell survival and blood vessel regeneration) and VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) compared to two-dimensional cultured cells. ) (Involved in reducing cell death and vascular regeneration), HGF (hepatocyte growth factor: involved in reducing cell death and vascular regeneration) was confirmed to increase the secretion amount (Fig. 6).

또한, 저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 면역염색을 통해 정성적으로 확인한 결과 3차원 세포 스페로이드는 HGF, VEGF, bFGF가 활성도가 유지된 단백질 형태로 분비되고 있음을 확인하였다(도 7의 A, B, C). 게다가, 혈관 생성 인자와 세포 생존율 향상 인자의 분비량이 2차원 배양에 비해 증진되는 것 역시 확인하였다(도 7 하단).In addition, after culturing the cells for 3 days under hypoxic conditions, the secretion of angiogenesis factors and cell viability enhancing factors was qualitatively confirmed by immunostaining. As a result, the three-dimensional cell spheroid was a protein in which HGF, VEGF, and bFGF remained active. It was confirmed that the secretion in the form (A, B, C of Figure 7). In addition, it was also confirmed that the secretion of angiogenesis factor and cell viability enhancing factor compared to the two-dimensional culture (bottom of Figure 7).

2.5. 세포 부착 특성2.5. Cell adhesion properties

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 2차원 배양된 세포와 3차원 세포스페로이드의 세포외기질에 존재하는 세포부착 단백질인 라미닌(laminin), 피브로 넥틴(fibronectin)과 비부착성 세포사멸(ANOIKIS: 아노이키스) 관련 단백질(AKT)을 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 확인하였다. 3차원 세포 스페로이드에서 세포 표면 부착 단백질과 항-세포사 관련 인자의 발현이 2차원 배양에 비해 높게 나타났다(도 8a).After culturing the cells in hypoxic conditions for 3 days, laminin, fibronectin and non-adherent apoptosis, which are cell adhesion proteins present in the extracellular matrix of two-dimensional cultured cells and three-dimensional cell spheroids (ANOIKIS: Anoikis) related protein (AKT) was confirmed by performing Western blot analysis. Expression of cell surface adhesion proteins and anti-cell death related factors was higher in three-dimensional cell spheroids than in two-dimensional culture (FIG. 8A).

3차원 세포 스페로이드를 제작한 후 배양용 접시에 옮긴 후 시간대별로 부착특성 및 형태를 관찰하였다. 3차원 세포 스페로이드는 36시간 내에 2차원 배양과 같은 형태로 세포가 퍼져나갈 수 있음을 확인하였다(도 8b). 이와 같은 결과는 3차원 배양에 의하여 생성된 세포 스페로이드를 생체 내로 이식할 경우에도 세포가 이식 부위에서 부착 및 이식될 수 있다는 가능성을 시사하는 것이다.After the three-dimensional cell spheroids were prepared and transferred to the culture dish, the adhesion characteristics and morphology were observed for each time period. Three-dimensional cell spheroid was confirmed that cells can spread in the same form as the two-dimensional culture within 36 hours (Fig. 8b). This result suggests that even when the cell spheroid produced by the three-dimensional culture is transplanted in vivo, the cells can be attached and transplanted at the transplant site.

실시예 3: 세포 스페로이드의 생체 내 이식 및 특성 확인Example 3: In Vivo Transplantation and Characterization of Cell Spheroids

3.1. 세포 스페로이드의 생체 내 이식3.1. In vivo transplantation of cell spheroids

마우스 하지 허혈 모델을 유도하였다. 마우스 하지 허혈 모델은 Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation. 2007116:2409-2419.에서 밝힌 바와 같이 실시되었다. 마우스 하지 허혈 모델 유도에 사용된 마우스는 4 주령, 암컷 면역 결핍 마우스를 사용하였으며, 시술 당시 20 g의 평균 체중을 유지하고 있었다. 하지 허혈 모델 유도에 사용된 마우스들은 럼푼 (10mg/kg) 과 케타민 (100mg/kg)을 1:9의 비율로 혼합하여 마취되었다. 고동맥과와 이하 지류 혈관들은 피부 절개 후 6-0 수술용 봉합사를 사용하여 상단과 하단의 혈관을 묶은 후 제거되었다. 외부 장 골 동맥의 시작 지점을 6-0 수술용 봉합사을 이용하여 묶고, 복재와 슬와 동맥으로로 분리되는 하단 혈관 역시 6-0 수술용 봉합사를 이용하여 묶었다. 상하단의 묶음으로 혈류의 흐름을 차단한 후 사이에 존재하는 고동맥을 모두 제거하였다. 실험에 사용된 마우스들은 모두 "the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (published by the National Institutes of Health, NIH publication No. 85-23, revised 1996) 에 따라 관리되었다.Mouse lower limb ischemia model was induced. Mouse lower limb ischemia models are described by Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation. 2007116: 2409-2419. The mice used to induce the lower limb ischemia model were 4 week old, female immunodeficiency mice, and maintained an average body weight of 20 g at the time of the procedure. Mice used to induce the lower limb ischemia model were anesthetized by mixing lump (10 mg / kg) and ketamine (100 mg / kg) in a 1: 9 ratio. The arterial and lower triangular vessels were removed after incision of the skin, using the 6-0 surgical suture to bind the upper and lower vessels. The starting point of the external iliac artery was tied using 6-0 surgical suture, and the lower vessel, which was divided into saphenous and knee artery, was also tied using 6-0 surgical suture. The upper and lower bundles blocked the flow of blood and removed all the arteries in between. Mice used in the experiments were all managed according to "the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (published by the National Institutes of Health, NIH publication No. 85-23, revised 1996).

3차원 배양을 통하여 제조된, 배양 중의 지방 유래 줄기 세포의 스페로이드를 수거하여, 다른 세포 이식용 지지체를 사용하지 않고 세포 스페로이드만 마우스 하지 허혈 부위에 이식하였다. The spheroids of adipose derived stem cells in culture, which were produced through three-dimensional culture, were collected and transplanted to the lower limb ischemic site of only the cell spheroid without using a support for transplantation of other cells.

지방 유래 줄기세포를 2차원 배양한 후 트립신 처리하여 이식한 실험군(2D ADSC)과 3차원 배양하여 생성된 세포 스페로이드(3D ADSC)를 이식한 실험군의 이식 28일 후 H&E 염색을 수행하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 정상에 더 가까운 조직 형태를 나타내었다(도 9a).H & E staining was performed 28 days after transplantation of the experimental group (2D ADSC) transplanted with trypsin-treated cells and the three-dimensional cultured cell spheroids (3D ADSC). The 3D ADSC experimental group showed closer tissue normal morphology than 2D ADSC (FIG. 9A).

한편, 지방 유래 줄기세포를 2차원 배양 후 트립신 처리하여 이식한 실험군 (2D ADSC)과 3차원 배양하여 생성된 세포 스페로이드(3D ADSC)를 이식한 실험군의 이식 28일 후에 massion's trichome 염색을 수행하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 정상에 더 가까운 조직 형태를 나타내었다. 게다가, 2D ADSC 실험군에서는 하지 허혈 모델 유도에 의한 근육의 섬유화가 다량 발견되었다(도 9b). On the other hand, massion's trichome staining was performed 28 days after transplantation of the experimental group in which the adipose-derived stem cells were transplanted by trypsin treatment after 2D culture and the cell spheroids (3D ADSC) generated by 3D culture. . The 3D ADSC experimental group showed closer tissue normal morphology than 2D ADSC. In addition, in the 2D ADSC experimental group, muscle fibrosis was found by induction of the lower limb ischemia model (FIG. 9B).

3.2. 생체 내 이식된 세포의 생존율3.2. Survival rate of transplanted cells in vivo

세포 이식 3일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 이식된 세포의 세포사 진행을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 인간 특이적 프라이머(human specific primer) 중 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 항-세포사 인자(bcl-2)가 많이 발현되고 있었으며, 세포사 촉진 인자(pro-apoptotic factor: bax)의 발현이 감소하고 있음을 확인하였다. 이로부터 세포 이식 시 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양 후 트립신 처리 후 이식된 세포에 비해 세포 생존율이 높음을 확인할 수 있었다(도 10 a). 한편, 세포 이식 3일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 이식된 세포의 세포사 진행을 캐스파아제-3 면역염색을 통해 확인하였다. Three days after cell transplantation, cell death progression of the transplanted cells in the hull region of the 2D ADSC and 3D ADSC experimental groups was confirmed by RT-PCR. Among the human specific primers, the 3D ADSC experimental group expressed more anti-cell death factor (bcl-2) than the 2D ADSC, and the expression of pro-apoptotic factor (bax) was decreased. It was confirmed. From this, three-dimensional cell spheroids during cell transplantation were confirmed to have higher cell viability compared to cells transplanted after trypsin treatment after two-dimensional culture (FIG. 10 a). On the other hand, 3 days after cell transplantation, the cell death progress of the transplanted cells in the hull region of the 2D ADSC test group and the 3D ADSC test group was confirmed by caspase-3 immunostaining.

마우스 하지 허혈 모델 유도 후 3일과 28일째 허혈이 유도된 하지 근육 조직을 수거하여 동결박절용 고정 용액에 담근 후 동결 박절을 위해 냉동 보관하였다. 동결 박절은 10 ㎛로 영하 20도에서 제작되었다. 동결 박절된 조직들은 4% 파라포름알데히드 용액에서 10분간 상온 고정되었으며, 이후 영하 20도에서 에탄올과 아세트산 (2:1) 혼합 용액에서 2차 고정되었다. 실험에 사용된 모든 형광 면역 염색에서 이식한 인간 세포를 염색하기 위해서 인간 세포 핵과 반응하는 항체를 사용하였으며 모세혈관과 세동맥을 염색하기 위해서 vWF 항체와 평활근 알파 액틴 (smooth muscle (SM) -actin) 항체를 각각 사용하였다. 혈관생성인자 분비효과를 보기 위해서는 혈관내피 형성 인자, 간세포성장인자, 그리고 섬유아세포성장인자의 항체가 각각 사용되었다. 위에서 사용된 항체들은 적색(rhodamine) 과 녹색(FITC) 이차 항체를 사용하여 형광표지하였다. 면역 염색이 종료된 후에는 모든 샘플들은 DAPI 용액을 사용하여 덮었다. 실험에 사용된 염색 방법과 염색용 시료들은 Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation. 2007116:2409-2419.에서 밝힌 바에 기초하여 실시되었다.3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 이식된 세포(DiI 표지-적색)가 다량 존재하고 있음을 확인하였고, 세포사(녹색)가 진행 중인 이식된 세포가 2차원 배양 후 트립신 처리 후 이식된 세포에 비해 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 통계학적으로도 두 실험군 간에 유의한 차이를 보였다(도 10b). At 3 and 28 days after induction of the lower limb ischemia model, ischemia-induced lower limb muscle tissues were collected, immersed in the fixation solution for cryoablation, and stored frozen for freeze dissection. Frozen slices were prepared at minus 20 degrees with 10 μm. Frozen tissues were fixed at room temperature for 10 minutes in 4% paraformaldehyde solution, and then secondary fixed in ethanol and acetic acid (2: 1) mixed solution at -20 ° C. In all fluorescence immunostaining experiments, antibodies were used to react with human cell nuclei to stain the transplanted human cells. VWF and smooth muscle alpha-actin antibodies were used to stain capillaries and arterioles. Were used respectively. To see the effect of angiogenesis factors, vascular endothelial factor, hepatocyte growth factor, and fibroblast growth factor antibodies were used. The antibodies used above were fluorescently labeled with red (rhodamine) and green (FITC) secondary antibodies. After the immunostaining was complete, all samples were covered with DAPI solution. The dyeing methods and samples used for the experiments are Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation. Based on the findings in 2007116: 2409-2419. The 3D ADSC experimental group confirmed that a large amount of transplanted cells (DiI marker-red) existed compared to 2D ADSC, and transplanted cells undergoing apoptosis (green). Was significantly less than the cells transplanted after trypsin treatment after two-dimensional culture. These results also showed a significant difference between the two experimental groups statistically (Fig. 10b).

3.3. 생체 내 혈관생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비

3.3. Secretion of Angiogenesis Factors and Cell Viability Enhancers in Vivo

세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 각 인자들에 대한 항체를 사용한 면역염색을 통해 확인하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비해 HGF, VEGF, bFGF를 더 많이 분비하고 있음을 확인하였다(도 11a). 28 days after cell transplantation, secretion of angiogenesis factors and cell viability-enhancing factors in the hull regions of the 2D ADSC and 3D ADSC groups was confirmed by immunostaining with antibodies to each factor. It was confirmed that the 3D ADSC test group secrete more HGF, VEGF, and bFGF than the 2D ADSC test group (FIG. 11A).

또한, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 RT-PCR을 통해 확인하였고, 면역 염색 실험과 유사하게 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비해 HGF, VEGF, bFGF를 유의하게 더 많이 분비하고 있음을 확인하였다(도 11b). In addition, the secretion of angiogenesis factors and cell viability-enhancing factors was confirmed by RT-PCR at the hulls of 2D ADSC and 3D ADSC groups 28 days after cell transplantation. Compared with HGF, VEGF, bFGF significantly higher than that (Fig. 11b).

3.4. 생체 내 혈관 재생3.4. In vivo blood vessel regeneration

세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 정도를 평활근 알파 액틴(smooth muscle alpha actin) 면역염색을 통해 확인 하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비하여 유의하게 높은 세동맥(arteriole)의 분포를 보임을 확인하였다(도 12a).28 days after cell transplantation, the degree of blood vessel formation in the hull regions of the 2D ADSC and 3D ADSC experimental groups was confirmed by smooth muscle alpha actin immunostaining. It was confirmed that the 3D ADSC experimental group showed a significantly higher distribution of arterioles than the 2D ADSC experimental group (FIG. 12A).

또한, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 정도를 vWF 면역염색을 통해 확인하였다. 유사하게, 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비하여 유의하게 높은 모세혈관(capillaries)의 분포율을 보임을 확인하였다(도 12b).In addition, 28 days after cell transplantation, the degree of blood vessel formation in the hull regions of the 2D ADSC and 3D ADSC experimental groups was confirmed by vWF immunostaining. Similarly, it was confirmed that the 3D ADSC experimental group showed a significantly higher distribution of capillaries than the 2D ADSC experimental group (FIG. 12B).

3.5. 생체 내 이식 후의 동물의 외형적 변화3.5. Outward Changes in Animals After Transplantation In Vivo

세포 이식 후 주기적으로 하지 허혈 부위의 외형적 변화를 관찰하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비해 현저히 높은 수준의 형태 유지를 보이고 있었다. 특히 사지 손실(limb loss)이나 발 괴사(foot necrosis)의 정도가 유의하게 감소한 것을 확인하였다(도 13).After cell transplantation, the external changes of the lower limb ischemia were periodically observed. The 3D ADSC group showed significantly higher morphology than the 2D ADSC group. In particular, it was confirmed that the degree of limb loss or foot necrosis was significantly reduced (FIG. 13).

도 1은 3차원 배양 방법에 따라 지방 유래 줄기 세포를 배양하여 형성된 세포 스페로이드의 H&E 염색법에 의한 사진(도 1의 A,B) 및 주사전자현미경 이미지(도 1의 C)를 나타낸다.Figure 1 shows a photograph (A, B of Figure 1) and scanning electron microscopy image (C of Figure 1) by the H & E staining method of the cell spheroid formed by culturing adipose derived stem cells according to the three-dimensional culture method.

도 2는 3차원 배양법을 사용하여 제조된 세포 스페로이드(도 2의 A) 및 2차원 배양에 의한 세포(도 2의 B)의 사진 및 TUNEL 염색과 RT-PCR을 통한 세포사 분석 그래프 및 PCR 신호 사진이다.Figure 2 is a photograph of the cell spheroid prepared using the three-dimensional culture (A of Figure 2) and cells by two-dimensional culture (B of Figure 2) and cell death analysis graph and PCR signal via TUNEL staining and RT-PCR It is a photograph.

도 3은 3차원 배양 및 2차원 배양에 의한 세포의 세포 증식도를 배양 시간에 따라 측정한 그래프이다.Figure 3 is a graph measuring the cell proliferation of the cells by three-dimensional culture and two-dimensional culture according to the culture time.

도 4는 여러 조건(3차원, 2차원 배양 및 신선한 배지)에서 세포 배양 후 사용 배지를 사용하여 새로운 지방 유래 줄기 세포를 배양한 후 세포사 정도를 분석한 결과이다. 4 is a result of analyzing the degree of cell death after culturing new fat-derived stem cells using a culture medium after the cell culture under various conditions (three-dimensional, two-dimensional culture and fresh medium).

도 5는 저산소 조건 배양 후 배양된 세포에 대한 MTT 조사법 (도 5의 A)와 뉴트럴 레드 조사법(도 5의 B) 결과이다.FIG. 5 shows the results of MTT irradiation (FIG. 5A) and neutral red irradiation (FIG. 5B) of cells cultured after hypoxic conditions.

도 6은 저산소 조건 세포 배양한 후, bFGF, VEGF, 및 HGF의 분비량를 RT-PCR을 통해 확인한 데이터이다.FIG. 6 shows data confirming secretion of bFGF, VEGF, and HGF through RT-PCR after culturing hypoxic cells.

도 7은 저산소 조건 세포 배양한 후 분비된 bFGF, VEGF, 및 HGF 단백질의 활성도(도 7의 A, B, C) 유지 여부 및 그 분비량을 기록한 그래프이다(도 7 하단).Figure 7 is a graph recording the maintenance of the activity (b, A, B, C) of the secreted bFGF, VEGF, and HGF protein after hypoxic condition cell culture and its secretion amount (bottom of Figure 7).

도 8은 저산소 조건 세포 배양한 후 세포외기질에 존재하는 세포부착 단백질인 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin)과 비부착성 세포사멸(ANOIKIS: 아노 이키스) 관련 단백질(AKT)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과(도 8a), 및 3차원 세포 스페로이드를 제작한 후 배양용 시쉬에 옮긴 후 시간대별로 촬영한 현미경 사진(도 8b)이다.FIG. 8 is a western blot for cell adhesion proteins laminin, fibronectin and non-adherent apoptosis (AKNO) related proteins (AKT) present in extracellular matrix after cell culture in hypoxic condition As a result of the analysis (FIG. 8A), and a three-dimensional cell spheroid, and then transferred to the culture Shish and photographed by time zone (Fig. 8B).

도 9는 마우스 하지 허혈 모델에서, 지방 유래 줄기세포를 2차원 배양한 후 트립신 처리하여 이식한 실험군(2D ADSC)과 3차원 배양하여 생성된 세포 스페로이드(3D ADSC)를 이식한 실험군의 이식 28일 후 H&E 염색 결과(도 9a) 및 massion's trichome 염색 결과(도 9b) 사진이다.FIG. 9 shows a transplantation of an experimental group transplanted with 2D ADSC and 3D cultured cell spheroids (3D ADSC). H & E staining results (Fig. 9a) and massion's trichome staining results (Fig. 9b) after day.

도 10은 마우스 하지 허혈 모델에서, 세포 이식 3일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 항-세포사 인자(bcl-2) 및 세포사 촉진 인자(pro-apoptotic factor: bax) 발현에 대한 RT-PCR 결과(도 10 a) 및 세포사 진행 확인을 위한 캐스파아제-3 면역염색 결과이다(도 10b). 이식된 세포(DiI 표지-적색), 세포사(녹색)가 진행 중인 이식된 세포.FIG. 10 shows RT for anti-cell death factor (bcl-2) and pro-apoptotic factor (bax) expression in the hull regions of 2D ADSC and 3D ADSC groups 3 days after cell transplantation. PCR results (FIG. 10 a) and caspase-3 immunostaining results for cell death progression confirmation (FIG. 10 b). Transplanted cells (DiI label-red), transplanted cells undergoing cell death (green).

도 11은 마우스 하지 허혈 모델에서, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 HGF, VEGF, bFGF에 대한 항체를 사용한 면역염색 사진(도 11a) 및 발현 확인을 위한 RT-PCR 결과(도 11b)이다.FIG. 11 shows immunostaining photographs using antibodies against HGF, VEGF, and bFGF in the 2D ADSC and 3D ADSC experimental groups at 28 days after cell transplantation, and RT-PCR for confirming expression. FIG. The result is (Fig. 11B).

도 12는 마우스 하지 허혈 모델에서, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위의 평활근 알파 액틴(smooth muscle alpha actin) 면역염색 결과(도 12a) 및 vWF 면역염색 결과이다(도 12b).FIG. 12 shows smooth muscle alpha actin immunostaining results (FIG. 12A) and vWF immunostaining results in the hull regions of 2D ADSC and 3D ADSC groups in the mouse lower limb ischemia model (FIG. 12B). ).

도 13은 세포 이식 후 주기적으로 촬영한 하지 허혈 부위의 외형적 변화를 나타내는 사진 및 사지 회복, 발 괴사 및 사지 손실의 비율을 나타내는 표와 그래 프이다.FIG. 13 is a table and graph showing the change in limb recovery, foot necrosis and limb loss of the lower limb ischemia site taken periodically after cell transplantation.

Claims

세포 스페로이드(cell spheroid) 형태로 세포 외 배양된 이식용 성체 줄기세포 집합체. Transplanted adult stem cell aggregates cultured extracellularly in the form of cell spheroids.

제 1 항에 있어서, 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체.The adult stem cell aggregate for transplantation according to claim 1, wherein the adult stem cells are selected from adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells, and bone marrow derived stem cells.

제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 성체 줄기세포 집합체는 허혈성 질환의 허혈조직 부위 이식용인 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체.The adult stem cell aggregate for transplantation according to claim 1 or 2, wherein the adult stem cell aggregate is for transplantation of an ischemic tissue site of an ischemic disease.

세포 부착 지지체를 제공하지 않고 3차원 생물 반응기에서 성체 줄기세포를 배양함으로써 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.A method of producing adult stem cell aggregates for transplantation in cell spheroid form by culturing adult stem cells in a three-dimensional bioreactor without providing a cell attachment support.

제 4 항에 있어서, 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.The method of claim 4, wherein the adult stem cells are selected from adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells, and bone marrow derived stem cells.

제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 성체 줄기세포 집합체는 허혈성 질환의 허혈조직 부위 이식용인 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.The method for producing an adult stem cell aggregate for transplantation according to claim 4 or 5, wherein the adult stem cell aggregate is for transplantation of an ischemic tissue site of an ischemic disease.