KR20100085527A - Novel cell penetrating domain and intracellular delivery system comprising the same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: An intracellular transmission system containing cellular transmembrane domain is provided to clinically apply to the human body without side effects and to develop novel drugs. CONSTITUTION: A cellular transmembrane domain contains a peptide denoted by general formula I((B-X1-X2)n/3). A cargo is additionally bound at the end of the peptide. The cargo is a chemical, peptide, polypeptide, nucleic acid, carbonhydrate, or lipid. An intracellular transmission system contains the celluar transmembrane domain. The peptide comprises an amino acid sequence selected from sequence numbers 1 to 36.

Description

신규한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템{Novel Cell Penetrating Domain and Intracellular Delivery System Comprising the Same} Novel Cell Penetrating Domain and Intracellular Delivery System Comprising the Same

본 발명은 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a cell membrane permeation domain and an intracellular delivery system comprising the same.

세포 투과 펩타이드(Cell Penetrating Peptides: CPP)는 약 10-30개 정도의 짧은 펩타이드로 이루어진 세포막 투과성 펩타이드로 대부분 단백질-투과 도메인(protein-transduction domain)이나 막-이동 시퀀스(membrane-translocating sequence)로부터 유도되었다1 -2. 또한 일반적인 외부 물질의 세포 내 유입 경로와는 달리 CPP는 세포막 손상을 주지 않으면서도 세포 내로 이동하고 세포막을 통과하지 못하는 것으로 알려져 있는 DNA나 단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있는 획기적인 역할을 할 것으로 기대되는 물질로써 떠오르고 있다3 -5. Cell Penetrating Peptides (CPP) are cell membrane permeable peptides consisting of about 10-30 short peptides, mostly derived from protein-transduction domains or membrane-translocating sequences. It was 1-2. In addition, unlike the usual cellular influx of foreign substances, CPP is expected to play a breakthrough role in transporting DNA and proteins that are known to be unable to pass through the cell membrane and move into the cell without damaging the cell membrane. It is emerging as 3 -5 .

CPP로 가장 잘 알려진 펩타이드 가운데 Tat 펩타이드는 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immuno-deficiency Virus: HIV)로부터 유도되어 현재 세포 치료제나 진단시약 같은 다양한 방면에서 응용되어 사용되고 있다6. Tat 단백질에 존재하는 단백질 투과 도메인 (Protein Transduction Domain: PTD)의 11개의 염기성 아미노산 (YGRKKRRQRRR)으로 이루어진 부분은 세포막을 통과하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Vives et . al ., 1997; Futaki et . al ., 2001; Suzuki et. al., 2002; Hakansson et . al ., 2001; Tyagi et . al ., 2001; Rusnati et . al ., 1997). 또한, Tat PTD (YGRKKRRQRRR)는 양전하를 갖는 아미노산이 높은 빈도로 존재하기 때문에, 다양한 방법으로 PTD 아미노산 서열을 바꾸어서 투과 효율을 비교, 분석하였고, 그 결과 Arg 폴리양이온성 호모폴리머 (RRRRRRRRR)의 경우 Tat PTD 보다 20배 정도 투과 효율이 증가하는 것이 관찰되었다 (Wender et . al ., 2000). Among the best known peptides as CPP Tat peptide of the human immunodeficiency virus: is derived from (Human Immuno-deficiency Virus HIV) has been used in various fields such as the current application of cell therapy and diagnostic reagents 6. The portion of the 11 basic amino acids (YGRKKRRQRRR) of the Protein Transduction Domain (PTD) present in the Tat protein has been shown to play an important role in the passage of cell membranes (Vives et . Al . , 1997; Futaki .. et al, 2001; Suzuki et al, 2002;.. Hakansson et al, 2001;.. Tyagi et al, 2001;.... Rusnati et al, 1997). In addition, since Tat PTD (YGRKKRRQRRR) has a high frequency of positively charged amino acids, the transmission efficiency was compared and analyzed by changing the PTD amino acid sequence in various ways, and as a result, Tat in the case of Arg polycationic homopolymer (RRRRRRRRR) A 20-fold increase in permeation efficiency was observed over PTD (Wender et . Al . , 2000).

PTD를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시켰을 경우에도 융합 단백질을 효율적으로 세포 내로 수송하는 것이 밝혀진 이후 PTD를 이용한 다양한 응용이 시도되었다 (Schwarze et . al ., 1999; Kim et. al ., 1997; Schwarze et . al ., 2000; Gius et . al ., 1999; Nagahara et . al ., 1998; Mai et . al., 2001; Xia et . al ., 2001; Embury et . al ., 2001; Rothbard et . al ., 2000; Lewin et . al ., 2000 및 Vocero-Akbani et . al ., 1999). 대부분이 Tat 단백질의 PTD를 이용하여 원하는 단백질, 핵산, 약물 등을 원하는 세포 내로 수송하는 데 초점이 모아지고 있다. 그 이외에 호메오도메인 전사 인자의 DNA-결합 도메인으로부터 유도된 페네트라틴(penetratin)은 인체에 유용한 단백질을 피부에 전달하는데 이용되고, 트랜스포탄(transportan)은 갈라닌(galanin)이라는 뉴로펩타이드와 마스토파란(mastoparan)이라는 말벌의 독으로부터 분리된 펩타이드 중 일부를 융합시켜 만든 펩타이드로 세포사를 유도시키는 펩타이드와 결합시켜 세포사 유도 펩타이드로써 이용되고 있다7 -8. 또한 세포 내로 유입되는 방식이 다른 Pep-1은 세포 안으로 유입하고자 하는 단백질이나 DNA를 화학적 또는 생물학적으로 결합시키지 않고 같이 섞어주는 것만으로도 세포 내로 유입이 가능한 펩타이드로 트립토판이 많고 C-말단에 시그널 시퀀스를 붙여서 만든 모델 펩타이드로써 현재 DNA 벡터를 트랜스펙션(transfection)시키는 시약으로 ANASPEC에서 판매되고 있다9 -10. Even when the PTD is linked with other peptides or proteins, various applications using PTD have been attempted since it has been found to efficiently transport fusion proteins into cells (Schwarze et . Al . , 1999; Kim et. Al . , 1997; Schwarze et. .. al, 2000; Gius et al, 1999;.. Nagahara et al, 1998;.. Mai et al, 2001;.. Xia et al, 2001;.. Embury et al, 2001;... Rothbard et al ., 2000;.... Lewin et al, 2000 and Vocero-Akbani et al, 1999) . Most of them focus on transporting desired proteins, nucleic acids, drugs, etc. into desired cells using PTD of Tat protein. In addition, penetratin, derived from the DNA-binding domain of the homeodomain transcription factor, is used to deliver proteins useful to the body to the skin, while transportan is a neuropeptide and mas, called galanin. was coupled with sat blue (mastoparan) by combining some of the peptide isolated from the venom of the wasp of peptides that induce cell death to create peptide is used as a cell death inducing peptides 7-8. In addition, Pep-1, which has a different way of entering into a cell, is a peptide that can be introduced into a cell simply by mixing together a protein or DNA to be introduced into a cell without chemically or biologically binding. illustration the transfected DNA vector as the current model created by attaching a peptide specification (transfection) can be sold as reagents in ANASPEC 9-10 to.

이외에도 약 50여 개 정도의 CPP가 더 존재하는데 이들이 세포 안으로 들어가는 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않았지만 일반적인 외부 물질 유입 시 세포 내에서 라이소좀에 의해 라이시스(lysis)되는 것과는 달리 특정 물질을 융합하였을 때, 그에 따른 세포 신호를 전달시키거나 단백질 합성을 저해 또는 촉진한다는 사실이 여러 가지 연구에 의해 밝혀지면서 엔도사이토시스가 아닌 다른 기작에 의해 세포 안으로 들어간다는 것이 간접적으로나마 알려지게 되었다11 -12. In addition, there are about 50 more CPPs. The exact mechanism by which they enter the cell is not known yet, but when fused with a specific substance, unlike the lysis by the lysosome in the cell, Many studies have shown that it transmits cellular signals or inhibits or promotes protein synthesis, and it has been indirectly known to enter cells by mechanisms other than endocytosis 11 -12 .

한편, 현재까지 알려진 막 투과성을 보유한 기능성 펩타이드들 간의 주된 차이점은 외부 단백질을 융합시킬 수 있는 크기에 대한 제한성을 들 수 있다. Antp의 경우는 아미노산 100개 미만 길이의 단백질만 융합 가능한 반면, Tat 및 VP22 경우는 1,000개 이상의 단백질까지도 융합이 가능하다 (Schwarze et . al ., 2000; Fawell et . al ., 1994; 및 Schwarze et . al ., 1999).On the other hand, a major difference between functional peptides possessing membrane permeability to date is a limitation on the size to which the foreign protein can be fused. Antp can only fuse proteins less than 100 amino acids long, while Tat and VP22 can fuse up to 1,000 proteins (Schwarze et . Al . , 2000; Fawell et . Al . , 1994; and Schwarze et. . al., 1999).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 이온 채널 단백질 가운데 세포막 내에서 유동성을 가진 센싱 도메인(sensing domain)에 대한 연구를 진행하였고, 소수성의 세포막에서 움직일 수 있는 패들(paddle)을 채널로부터 분리해내면 세포막을 통과할 수 있는 가능성이 있을 것으로 생각되어 이를 이용하여 세포 투과성 펩타이드로써 활용 가능한지 여부를 연구하였다. 그 결과 기존의 바이러스로부터 유래된 펩타이드 또는 서열 특이적으로 설계된 세포 투과성 펩타이드와는 다른 새로운 세포막 투과 도메인을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have studied the sensing domain of fluidity in the cell membrane among the ion channel proteins, and the possibility of passing through the cell membrane by separating the paddle, which is movable in the hydrophobic cell membrane, from the channel. It was thought that this may be used to study whether it can be utilized as a cell permeable peptide. As a result, the present invention was completed by finding a new cell membrane permeation domain different from a peptide derived from an existing virus or a cell-penetrating peptide designed specifically for sequence.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 세포막 투과 도메인을 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide novel cell membrane permeation domains.

본 발명의 다른 목적은 펩타이드의 말단에 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인을 포함하는 세포내 전달 시스템을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide an intracellular delivery system comprising a cell membrane permeation domain in which a cargo of an intracellular delivery target is bound to a terminal of a peptide.

본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드의 말단에 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 카고를 세포 내로 운반하는 방법을 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a method for transporting cargo into a cell comprising contacting a cell membrane permeation domain having a cargo of an intracellular transport target to the end of the peptide.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a cell membrane permeation domain comprising a peptide represented by the following general formula (I):

일반식 ⅠFormula Ⅰ

(B-X1-X2)n/3 (BX 1 -X 2 ) n / 3

상기 일반식에서, B는 Arg 또는 Lys이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His 및 Cys으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이며, n은 3-150의 정수이고, n이 6 이상인 경우 반복서열에 있는 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다.In the above formula, B is Arg or Lys, X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His and Cys, n is an integer from 3-150, and if n is 6 or more, B, X 1 in the repetition sequence And X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence.

Tat을 포함한 CPP는 대부분 염기성의 아미노산을 많이 가지고 있고, 양전하를 띠는 잔기와 소수성 잔기가 적당하게 조합되어 있다. 이러한 특성은 펩타이드의 세포 내 유입을 용이하게 하는 것으로 생각되어지고 있다. 따라서, 본 발명자들은 이온 채널 단백질 가운데 세포막 내에서 유동성을 가진 센싱 도메인(sensing domain)을 가지고 시퀀스를 분석하였고, S4 도메인 가운데 (Rxx)n의 시퀀스를 가진 모티프가 존재하는 것을 발견하였다. 한편, 생체 세포막에 존재하는 이온 채널 가운데 전압-게이트(Voltage-gated) 이온 채널은 4개의 센싱 도메인과 2개의 포어 도메인(pore domain)으로 이루어져 있는데, 그 중 센싱 도메인(S3-S4)이 세포 안과 밖의 이온의 차이를 감지하여 세포 외부로부터 오는 전기 신호를 세포 안으로 전달하여 채널의 열고 닫힘을 조절한다. 최근, 전압-게이트 이온 채널의 구조가 밝혀지면서 센싱 도메인이 세포막 안에서 크게 이동한다는 사실이 알려졌다. 따라서, 본 발명자들은 소수성의 세포막에서 움직일 수 있는 패들(paddle)을 채널로부터 분리해내면 세포막을 통과할 수 있는 가능성이 있을 것으로 생각되어 이를 이용하여 CPP로써 활용 가능한지 여부를 연구하였고, 그 결과 새로운 세포막 투과 도메인을 발견하였다.Most CPPs including Tat have many basic amino acids, and a combination of positively charged residues and hydrophobic residues is appropriate. This property is thought to facilitate the influx of peptides into cells. Therefore, the present inventors analyzed the sequence with a sensing domain having fluidity in the cell membrane among the ion channel proteins, and found that a motif having a sequence of (Rxx) n exists in the S4 domain. Meanwhile, the voltage-gated ion channel among the ion channels present in the living cell membrane is composed of four sensing domains and two pore domains, among which the sensing domains (S3-S4) Sensing the difference of outside ions, it transmits the electric signal from outside the cell into the cell to regulate the opening and closing of the channel. Recently, as the structure of the voltage-gate ion channel has been revealed, it has been known that the sensing domain moves largely within the cell membrane. Therefore, the present inventors thought that there is a possibility that the paddle, which is movable in the hydrophobic cell membrane, can be passed through the cell membrane by separating it from the channel, and thus, whether or not it can be utilized as a CPP, as a result, the new cell membrane The transmission domain was found.

본 발명은 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 포함하는 세포막 투과용 조성물로 표현될 수 있다.The present invention provides a cell membrane permeation domain comprising the peptide represented by the general formula (I). In addition, the present invention can be expressed as a composition for cell membrane permeation comprising a peptide represented by the general formula (I).

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 아미노산 잔기 4-50개, 바람직하게는 4-40개, 보다 바람직하게는 4-30개, 가장 바람직하게는 4-20개로 이루어져 있다.As used herein, the term "peptide" refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds, 4-50 amino acid residues, preferably 4-40, more preferably 4-30, Most preferably 4-20.

본 명세서의 일반식 I에 기재되는 n은 3-150의 정수이다. 즉, (B-X1-X2)n/3은 3을 분모로 하는 분수의 형식으로 표현될 수 있으며, 예컨대, (B-X1-X2)4/3는 B-X1-X2-B를 의미하고, (B-X1-X2)11/3는 B-X1-X2-B-X1-X2-B-X1-X2-B-X1을 의미한다. 보다 상세하게는, 일반식 I에서 n이 7인 경우 일반식 I은 (B-X1-X2)7/3이 되고, 7/3은 2와 1/3이며, 이는 (B-X1-X2) 모티프가 두 번 반복되고 (B-X1-X2) 모티프에서 첫 번째 아 미노산 잔기인 B가 포함된다는 것을 의미한다. 한편, 일반식 I에서 n이 8인 경우 일반식 I은 (B-X1-X2)8/3이 되고, 8/3은 2와 2/3이며, 이는 (B-X1-X2) 모티프가 두 번 반복되고 (B-X1-X2) 모티프에서 첫 번째 및 두 번째 아미노산 잔기인 B-X1이 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에서 펩타이드의 C-말단은 일반식 I에서 표현되는 B, X1 또는 X2 중 어떠한 아미노산도 가능하다.N described in general formula I of this specification is an integer of 3-150. That is, (BX 1 -X 2 ) n / 3 can be expressed in the form of a fraction with denominator 3, for example, (BX 1 -X 2 ) 4/3 means BX 1 -X 2 -B , (BX 1 -X 2 ) 11/3 means BX 1 -X 2 -BX 1 -X 2 -BX 1 -X 2 -BX 1 . More specifically, when n is 7 in Formula I, Formula I becomes (BX 1 -X 2 ) 7/3 , and 7/3 is 2 and 1/3, which is (BX 1 -X 2 ) This means that the motif is repeated twice (BX 1 -X 2 ) and the first amino acid residue B in the motif is included. On the other hand, when n is 8 in Formula I, Formula I becomes (BX 1 -X 2 ) 8/3 and 8/3 is 2 and 2/3, which means that the (BX 1 -X 2 ) motif has two Repeated once (BX 1 -X 2 ) means that the first and second amino acid residues, BX 1, are included in the motif. Thus, the C-terminus of the peptide in the present invention may be any amino acid of B, X 1 or X 2 represented in formula (I).

한편, 일반식 I의 “(B-X1-X2)n/3”은 “(B-X1-X2)n (n은 1-50의 정수), (B-X1-X2-B)n (n은 1-50의 정수) 또는 (B-X1-X2-B-X1)n (n은 1-50의 정수)”로 나타낼 수도 있다.Meanwhile, “(BX 1 -X 2 ) n / 3” of the general formula I is “(BX 1 -X 2 ) n (n is an integer of 1-50), (BX 1 -X 2 -B) n (n Is an integer of 1-50) or (BX 1 -X 2 -BX 1 ) n (n is an integer of 1-50) ”.

본 발명의 세포막 투과 도메인에서, (B-X1-X2)n/3 반복서열에서 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다. 즉, Arg-Ile-Met-Lys-Ile-Leu-Arg-Leu-Ala, Arg-Ile-Met-Arg-Ser-Lys-Val-Leu-Arg-Ile과 같은 서열도 일반식 I에 포함되는 것으로 해석된다. 즉, 본 발명의 세포막 투과 도메인은 B-X1-X2를 최소 서열로 포함하면서, 서열의 반복성이 일반식 B-X1-X2에 부합되는 모든 펩타이드 서열을 포함한다.In the cell membrane permeation domain of the invention, B, X 1 in the (BX 1 -X 2 ) n / 3 repeat sequence And X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence. That is, sequences such as Arg-Ile-Met-Lys-Ile-Leu-Arg-Leu-Ala and Arg-Ile-Met-Arg-Ser-Lys-Val-Leu-Arg-Ile are also included in Formula I. Interpreted That is, the cell membrane permeation domain of the present invention includes BX 1 -X 2 as the minimum sequence, while repeating sequence includes all peptide sequences whose general formula BX 1 -X 2 conforms.

본 발명의 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am . Chem . Soc . , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal . Biochem ., 34:595-598(1970)). 즉, α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 남은 α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다. 상기 펩타이드의 합성은 수동 또는 자동으로 수행할 수 있다. 자동 합성의 경우에는, 예컨대, Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 사용하여 상기 펩타이드를 합성할 수 있다.Peptides of the invention are prepared by solid-phase synthesis methods commonly used in the art (Merrifield, RB, J. Am . Chem . Soc . , 85: 2149-2154 (1963), Kaiser, E .., Colescot, RL, Bossinger , CD, Cook, PI, Anal Biochem, 34:. 595-598 (1970)). In other words, after the α-amino and side chain functional groups are protected to bind the resin to the resin, the α-amino protecting group is removed, and the remaining α-amino and side chain functional groups are protected in a step-by-step manner in order to intermediate the intermediate. Get Synthesis of the peptide can be performed manually or automatically. In the case of automated synthesis, the peptide can be synthesized using, for example, Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer).

본 발명의 펩타이드는 그 자체로도 우수한 안정성을 나타내지만, 안정성을 더 크게 향상시키기 위하여 다양한 보호기(protection group)가 결합될 수 있다. 보호기의 예는, 아미노산, 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. 상기 보호기는 본 발명의 펩타이드의 다양한 아미노산 잔기에 결합될 수 있지만, 바람직하게는 N- 또는 C-말단에 결합되어 있다.While the peptides of the present invention exhibit excellent stability on their own, various protection groups can be combined to further improve the stability. Examples of protecting groups include amino acids, acetyl groups, fluorenyl methoxy carbonyl groups, formyl groups, palmitoyl groups, myristyl groups, stearyl groups, and polyethylene glycol (PEG). The protecting group may be linked to various amino acid residues of the peptides of the invention, but is preferably linked to the N- or C-terminus.

본 명세서에서 용어, “세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)”는 인 비트로 및/또는 인 비보 상에서 운반 대상의 카고(cargo)를 세포 내로 운반할 수 있는 능력을 가진 펩타이드를 의미하며, 용어 “세포막 투과 도메인”과 혼용된다.As used herein, the term “cell penetrating peptide (CPP)” refers to a peptide having the ability to carry a cargo of a subject of delivery into a cell in vitro and / or in vivo, and the term “cell penetrating peptide (CPP)”. Cell membrane permeation domain ”.

세포막 투과성 펩타이드는 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드로, 예컨대, Tat-유래 펩타이드, 시그널 시퀀스(예컨대, 세포막 투과성 시퀀스), 아르기닌-리치 펩타이드, VP22, 트랜스포탄 또는 양친매성 펩타이드 캐리어 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(Morris, M. C. et al., Nature Biotechnol . 19:1173-1176 (2001); Dupont, A. J. and Prochiantz, A., CRC Handbook on Cell Penetrating Peptides, Langel, Editor, CRC Press, (2002); Chaloin, L. et al., Biochemistry 36(37):11179-87 (1997); Elliott and O'Hare, Cell 88:223-233(1997); 및 Lundberg, P. and Langel, U., J. Mol . Recognit . 16(5):227-233(2003)). 또한, 상기와 같은 천연적 서열과 더불어, 레트로인버소(retroinverso) 및 D-아이소머 형태를 포함하여, 세포막 투과 성질을 가진 다양한 안테나 다리(antennapedia) 기초 펩타이드들이 알려져 있다(Brugidou, J. et al., Biochem Biophys Res Commun . 214(2):685-93(1995); 및 Derossi, D. et al., Trends Cell Biol . 8:84-87(1998)). 상기 세포 투과성 펩타이드에 대한 자세한 설명은 Deshayes et al.(2005)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에서 참조로써 삽입된다.Cell membrane permeable peptides are themselves peptides having an amino acid sequence capable of passing through the cell membrane of a phospholipid bilayer, such as Tat-derived peptides, signal sequences (eg, cell membrane permeable sequences), arginine-rich peptides, VP22, transpotans or Amphiphilic peptide carriers, and the like, but are not limited thereto (Morris, MC et al., Nature Biotechnol . 19: 1173-1176 (2001); Dupont, AJ and Prochiantz, A., CRC Handbook on Cell Penetrating Peptides , Langel, Editor, CRC Press, (2002); Chaloin, L. et al., Biochemistry 36 (37): 11179-87 (1997); Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997); And Lundberg, P. and Langel, U., J. Mol . Recognit . 16 (5): 227-233 (2003). In addition to these natural sequences, a variety of antennapedia based peptides with cell membrane permeation properties, including retroinverso and D-isomer forms, are known (Brugidou, J. et al. ., Biochem Biophys Res Commun . 214 (2): 685-93 (1995); And Derossi, D. et al., Trends Cell Biol . 8: 84-87 (1998). A detailed description of such cell penetrating peptides is described in Deshayes et al. (2005), which is incorporated herein by reference.

본 발명에서는 이온 채널 단백질(바람직하게는, 포유동물-유래 이온 채널 단백질, 가장 바람직하게는 인간-유래 이온 채널 단백질) 가운데 세포막 내에서 유동성을 가진 센싱 도메인(sensing domain)내의 아미노산 시퀀스를 이용하여 세포막 투과성 펩타이드를 합성하였다.In the present invention, cell membranes using an amino acid sequence in a sensing domain having fluidity in the cell membrane among ion channel proteins (preferably mammalian-derived ion channel proteins, most preferably human-derived ion channel proteins) Permeable peptides were synthesized.

생체 세포막에 존재하는 이온 채널 가운데 전압-게이트(Voltage-gated) 이온 채널은 4개의 센싱 도메인과 2개의 포어 도메인(pore domain)으로 이루어져 있는데 그 중 센싱 도메인(S3-S4)이 세포 안과 밖의 이온의 차이를 감지하여 세포 외부로부터 오는 전기 신호를 세포 안으로 전달하여 채널의 열고 닫힘을 조절한다. 또한, 전압-게이트 이온 채널의 구조 내의 센싱 도메인은 세포막 안에서 크게 이동한 다. 이러한 세포막 내의 유동성은 이온 채널 단백질 상의 센싱 도메인 내에 세포막을 투과할 수 있는 능력을 가진 펩타이드가 있음을 의미하는 것이다.Voltage-gated ion channels among the ion channels present in biological cell membranes consist of four sensing domains and two pore domains, among which the sensing domains (S3-S4) By detecting the difference, electric signals from outside the cell are transmitted into the cell to control the opening and closing of the channel. In addition, the sensing domain within the structure of the voltage-gate ion channel migrates largely within the cell membrane. This fluidity in the cell membrane means that there is a peptide with the ability to penetrate the cell membrane in the sensing domain on the ion channel protein.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu 및 His으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 보다 바람직하게는, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Tyr으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이다.According to a preferred embodiment of the invention, the X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu and His. More preferably, the X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr and Tyr.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포막 투과 도메인은 서열번호 제1서열 내지 제36서열 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이다. 보다 바람직하게는, 서열번호 제2서열, 제3서열, 제4서열, 제5서열, 제7서열, 제8서열, 제9서열, 제12서열, 제13서열, 제14서열, 제16서열, 제19서열 및 제23서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이고, 보다 더 바람직하게는, 제2서열, 제12서열, 제14서열, 제16서열, 제19서열 및 제23서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포막 투과 도메인은 서열번호 제2서열 및 제23서열의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the cell membrane permeation domain of the present invention is a peptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to 36. More preferably, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16 , A peptide represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of 19th sequence and 23rd sequence, and more preferably, 2nd sequence, 12th sequence, 14th sequence, 16th sequence, 19th sequence and 23rd sequence A peptide represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of. According to the most preferred embodiment of the present invention, the cell membrane permeation domain of the present invention is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and 23.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포막 투과 도메인이 포함하는 펩타이드의 말단에는 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 추가적으로 결합되어 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, a cargo of an intracellular delivery target is additionally bound to the terminal of the peptide included in the cell membrane permeation domain of the present invention.

본 명세서에서 사용되는 용어, “카고(cargo)”는 상기 세포막 투과 펩타이드에 결합하여 세포 내로 운반될 수 있는 화학물질, 작은 분자, 폴리펩타이드, 핵산 또는 바이러스를 의미한다.As used herein, the term "cargo" refers to chemicals, small molecules, polypeptides, nucleic acids or viruses that can bind to and transport the cell membrane penetrating peptide.

본 발명의 CPP에 결합될 수 있는 물질은 다양하며, 예컨대, 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 서열, 화학 물질(약물) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 CPP에 결합된 물질은 세포막을 매우 높은 효율로 투과하고, 세포 내에서 세포질 및 핵에 잔류하게 된다.Substances that can be bound to the CPP of the present invention are various, and include, but are not limited to, for example, proteins, peptides, nucleotide sequences, chemicals (drugs), and the like. In particular, the substance bound to the CPP of the present invention permeates the cell membrane with very high efficiency and remains in the cytoplasm and nucleus within the cell.

본 발명에서 상기 카고(cargo)가 될 수 있는 작은 분자는 예를 들어, 약물, 조영제(예컨대, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등이 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 폴리펩티드는 둘 또는 그 이상의 잔기로 구성되는 아미노산의 중합체로 펩타이드 및 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 불멸에 관여하는 단백질(예컨대, SV40 라지 T 항원 및 텔로머라아제), 항-아폽토틱 단백질(예컨대, 돌연변이 p53 및 BclxL), 항체, 암유전자(예컨대, ras, myc, HPV E6/E7 및 아데노바이러스 Ela), 세포 주기 조절 단백질(예컨대, 사이클린 및 사이클린 의존성 인산화효소) 또는 효소(예컨대, 녹색 형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제)가 될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 핵산은 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다. 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 핵산 카고로서의 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드(예컨대, 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민, 이노신 및 우라실) 또는 아날로그(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)일 수 있다. 예를 들어, 핵산 카고는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 시퀀스 또는 RNAi일 수 있다.In the present invention, the small molecule which may be a cargo may be, for example, a drug, a contrast agent (eg, a T1 contrast agent, a T2 contrast agent such as a superparamagnetic substance, a radioisotope, etc.), a fluorescent marker, a dyeing agent, or the like. It may be, but is not limited thereto. A polypeptide is a polymer of amino acids consisting of two or more residues and includes peptides and proteins. Polypeptides include, for example, proteins involved in cell immortality (eg, SV40 large T antigen and telomerase), anti-apoptotic proteins (eg, mutant p53 and BclxL), antibodies, oncogenes (eg, ras, myc, HPV E6 / E7 and adenovirus Ela), cell cycle regulatory proteins (eg cyclin and cyclin dependent kinase) or enzymes (eg green fluorescent protein, beta-galactosidase and chloramphenicol acetyl transferase) It is not limited to this. In addition, the nucleic acid can be, for example, RNA, DNA or cDNA, and the sequence of nucleic acids can be coding site sequences or non-coding site sequences (eg, antisense oligonucleotides or siRNAs). The virus can be a virus core (ie, a nucleic acid of a virus packaged without the envelope of the virus) comprising the virus or the nucleic acid of the virus. Examples of viruses and viral cores that can be transported include, but are not limited to, papilloma virus, adenovirus, baculovirus, retrovirus core and semilky virus core. Nucleotides as nucleic acid cargo may be standard nucleotides (eg adenosine, cytosine, guanine, thymine, inosine and uracil) or analogs (eg phosphorothioate nucleotides). For example, the nucleic acid cargo may be an antisense sequence or RNAi consisting of phosphorothioate nucleotides.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포내 운반 대상의 카고는 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 지질이고, 더욱 바람직하게는 화학물질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다.According to a preferred embodiment of the invention, the cargo of the intracellular delivery subject of the invention is a chemical, peptide, polypeptide, nucleic acid, carbohydrate or lipid, more preferably a chemical, peptide or polypeptide.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 말단에 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인을 포함하는 세포내 전달 시스템을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides an intracellular delivery system comprising a cell membrane permeation domain in which a cargo of an intracellular delivery target is bound to a terminal of a peptide represented by the following general formula (I):

일반식 ⅠFormula Ⅰ

(B-X1-X2)n/3 (BX 1 -X 2 ) n / 3

상기 일반식에서, B는 Arg 또는 Lys이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His 및 Cys으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이며, n은 3-150의 정수이고, n이 6 이상인 경우 반복서열에 있는 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다.In the above formula, B is Arg or Lys, X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His and Cys, n is an integer from 3-150, and if n is 6 or more, B, X 1 in the repetition sequence And X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence.

본 발명의 세포내 전달 시스템은 상기 세포막 투과 도메인을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the intracellular delivery system of the present invention utilizes the cell membrane permeation domain, the contents in common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

예컨대, 본 발명의 CPP에 약물이 융합된 경우에는 약물 전달 시스템로서의 기능을 하게 된다. 본 발명의 세포내 전달 시스템은 단백질 및 펩타이드를 운반하는 데 특히 적합하다.For example, when a drug is fused to the CPP of the present invention, it functions as a drug delivery system. Intracellular delivery systems of the invention are particularly suitable for carrying proteins and peptides.

본 발명의 세포내 전달체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자 , 혈액 응고 인자 및 백신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 약물전달체에 의해 운반되는 단백질 또는 펩타이드는 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin) 및 지코노타이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Proteins or peptides carried by the intracellular carriers of the present invention are not particularly limited and include hormones, hormone analogs, enzymes, inhibitors, signaling proteins or portions thereof, antibodies or portions thereof, single chain antibodies, binding proteins or binding thereof Domains, antigens, adhesion proteins, structural proteins, regulatory proteins, toxin proteins, cytokines, transcriptional regulators, blood coagulation factors and vaccines, and the like. More specifically, the protein or peptide carried by the drug carrier of the present invention is insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF-1), growth hormone, erythropoietin, granulocyte-colony stimulating factors ), GM-CSFs (granulocyte / macrophage-colony stimulating factors), interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, EGFs (epidermal growth factors, calcitonin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), tumor necrosis factor (TNF), atobisban, buserelin, cetrorelix, deslorelin , Desmopressin, dynorphin A (1-13), elcatonin, eleidosin, eptifibatide, growth hormone releasing (GHRH-II) hormone-II), gonadorelin, goserelin, hisstrin, Leuprorelin, lypressin, octreotide, octootide, oxytocin, pitressin, secretin, sincalide, terlipressin, Thymopentin, thymosine α1, triptorelin, bivalirudin, carbetocin, cyclosporin, exedine, lanreotide, Include but are not limited to luteinizing hormone-releasing hormone, nafarelin, parathyroid hormone, pramlintide, T-20 (enfuvirtide), thymalfasin and ziconotide It is not.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu 및 His으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 또한, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Tyr으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 것이 더욱 바람직하다.According to a preferred embodiment of the invention, the X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu and His. In addition, the X 1 And More preferably X 2 is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr and Tyr independently of one another.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포내 전달 시스템이 포함하는 세포막 투과 도메인은 서열번호 제1서열 내지 제36서열 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이다. 보다 바람직하게는, 서열번호 제2서열, 제3서열, 제4서열, 제5서열, 제7서열, 제8서열, 제9서열, 제12서열, 제13서열, 제14서열, 제16서열, 제19서열 및 제23서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이고, 보다 더 바람직하게는, 제2서열, 제12서열, 제14서열, 제16서열, 제19서열 및 제23서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포막 투과 도메인은 서열번호 제2서열 및 제23서열의 아미노산 서열로 나타내는 펩타이드이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the cell membrane permeation domain included in the intracellular delivery system of the present invention is a peptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to 36. More preferably, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16 , A peptide represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of 19th sequence and 23rd sequence, and more preferably, 2nd sequence, 12th sequence, 14th sequence, 16th sequence, 19th sequence and 23rd sequence A peptide represented by an amino acid sequence selected from the group consisting of. According to the most preferred embodiment of the present invention, the cell membrane permeation domain of the present invention is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and 23.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 말단에 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 카고를 세포 내로 운반하는 방법을 제공한다:According to still another aspect of the present invention, a cell carrying a cargo comprising the step of contacting the cell membrane transmembrane domain in which the cargo of the intracellular transport target (cargo) is bound to the end of the peptide represented by the general formula (I) Provide a way:

일반식 ⅠFormula Ⅰ

(B-X1-X2)n/3 (BX 1 -X 2 ) n / 3

상기 일반식에서, B는 Arg 또는 Lys이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His 및 Cys으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이며, n은 3-150의 정수이고, n이 6 이상인 경우 반복서열에 있는 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다.In the above formula, B is Arg or Lys, X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His and Cys, n is an integer from 3-150, and if n is 6 or more, B, X 1 in the repetition sequence And X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence.

본 발명의 방법은 상기 세포막 투과 도메인을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the method of the present invention utilizes the cell membrane permeation domain, the contents in common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

카고가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인이 세포막과 접촉할 수 있는 기회가 부여되면 세포막 투과 모메인에 의해 카고가 세포 내로 운반된다. 세포막 투과 도메인과 세포막의 접촉에서 특별하게 요구되는 조건, 예컨대, 제한적인 시간, 온도 및 농도 등의 조건은 없으며, 당업계에서 세포막 투과에 적용되는 일반적인 조건으로 실시될 수 있다.When the cell membrane permeable domain to which the cargo is bound is given an opportunity to contact the cell membrane, the cargo is transported into the cell by the cell membrane permeation mother. There are no conditions specifically required at the contact of the cell membrane permeation domain with the cell membrane, such as limited time, temperature and concentration, and can be carried out under general conditions applied to cell membrane permeation in the art.

본 발명의 특징 및 이점(advantages)를 요약하면 다음과 같다:In summary, the features and advantages of the present invention are as follows:

(ⅰ) 본 발명은 신규 합성한 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템을 제공한다.(Iii) The present invention provides a novel synthetic membrane membrane permeation domain and an intracellular delivery system comprising the same.

(ⅱ) 본 발명의 세포막 투과 도메인은 기존의 바이러스로부터 유래된 펩타이드 또는 서열 특이적으로 설계된 펩타이드들과 비교할 때, 유전적인 면역 문제 또는 세포 독성에 있어서 매우 우수하다.(Ii) The cell membrane permeation domain of the present invention is very excellent in genetic immune problems or cytotoxicity when compared to peptides derived from existing viruses or peptides designed specifically for sequence.

(ⅲ) 따라서, 본 발명의 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 세포내 전달 시스템은 부작용의 우려 없이 임상적으로 인체에 적용할 수 있으며, 여러 질병에 관한 진단 및 신약 개발에도 활용할 수 있다는 장점이 있다.(Iii) Therefore, the cell membrane permeation domain of the present invention and the intracellular delivery system including the same can be clinically applied to the human body without fear of side effects, and there is an advantage that it can be used for diagnosis and development of new drugs for various diseases.

이하, 도면을 참고한 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention to those skilled in the art. Will be self explanatory.

실시예Example

실험 내용 및 방법Experiment Contents and Methods

펩타이드Peptide 합성 및 분리 Synthesis and Separation

모든 펩타이드는 고체상 펩타이드 합성법을 이용하여 합성((주)애니젠)하고 세포 내 투과성을 확인하기 위하여 펩타이드의 N-말단 부분에 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC, Lancaster)를 결합시켰다. 합성은 30 μmole 용량으로 Wang 레진(Nova)을 이용하여 9-플루오레닐-메톡시카르보닐 보호기가 있는 각각의 아미노산(Nova)을 C-말단부터 차례로 합성하고 최종적으로 N-말단에 N-메틸파이로리딘(N-methylpyrrolidine: NMP)과 2 M의 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine: DIEA)으로 활성화 시킨 FITC를 12시간 동안 결합시 켰다. 합성된 펩타이드는 1% 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid: TFA)를 사용하여 레진으로부터 분리한 후 2 M 아세트산에 의해 추출했다. 추출된 펩타이드는 역상 크로마토그래피(reverse phase-high performance liquid chromatography) C18 실리카겔 컬럼으로 정제하여 MALDI-TOF 질량분석기(AXIHA-CFR, Shimadzu)로 분자량을 확인한 후 동결 건조에 의해 분말상태로 만들어 1 μM 농도로 물 또는 2%의 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide: DMSO, Sigma)에 녹여서 실험에 사용하였다.All peptides were synthesized using solid phase peptide synthesis (Anigen Co., Ltd.) and fluorescein isothiocyanate (FITC, Lancaster) was bound to the N-terminal portion of the peptide to confirm intracellular permeability. Synthesis was performed using Wang resin (Nova) at 30 μmole, each amino acid (Nova) having a 9-fluorenyl-methoxycarbonyl protecting group in sequence from the C-terminus and finally N-methyl at the N-terminus. N-methylpyrrolidine (NMP) and FITC activated with 2 M diisopropylethylamine (DIEA) were combined for 12 hours. The synthesized peptides were separated from the resin using 1% Trifluoroacetic acid (TFA) and then extracted with 2M acetic acid. The extracted peptide was purified by reverse phase-high performance liquid chromatography C 18 silica gel column, and the molecular weight was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometer (AXIHA-CFR, Shimadzu), and then made into powder by lyophilization and 1 μM It was dissolved in water or 2% dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma) at the concentration was used for the experiment.

세포 배양 및 세포 투과성 확인Cell culture and cell permeability confirmation

펩타이드의 세포 투과성을 확인하기 위한 동물 세포로 HeLa 세포(한국세포주은행)를 사용하였고, 90 mm 세포 배양 플레이트에 10%(v/v) 우태아 혈청, 200 mM 글루타민 및 1%(v/v) 항생제가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM, Gibco)를 넣고 5%의 CO2가 주입되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포 가운데 각각 1 x 105의 세포를 γ-메타크릴옥시프로필트리메톡시실란으로 코팅시킨 커버슬립이 있는 12-웰 플레이트에서 하루 동안 배양한 후 10 μM 펩타이드를 1 ㎖의 DMEM에 희석시켜서 각각 37℃ 및 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 처리된 시료들을 1x PBS로 세척한 후 3.7% 파라포름알데히드로 고정시키고 1x PBS에 1/20,000로 희석된 핵 염색 시약(Sigma) 1 ㎖을 넣고 1분 동안 세포핵을 염색하였다. 준비된 세포는 형광 현미경(Plan-Apochromat 63x1.40 OIL lens, Carl Zeiss)과 콘포칼 스 캐닝 레이저 현미경 (HCX PL APO CS 63.0x1.40 OIL PH lens, Leica Microsystems Heidelberg GmbH)을 이용하여 분석하였다.HeLa cells (Korea Cell Line Bank) were used as animal cells to confirm the cell permeability of the peptide, and 10% (v / v) fetal bovine serum, 200 mM glutamine and 1% (v / v) in a 90 mm cell culture plate. Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM, Gibco) with antibiotics was added and cultured in a 37 ° C. incubator with 5% CO 2 . 1 x 10 5 cells of the cultured cells were incubated for one day in a 12-well plate with coverslips coated with γ-methacryloxypropyltrimethoxysilane, and the 10 μM peptide was diluted in 1 ml of DMEM. Treatment was carried out at 37 ° C. and 4 ° C. for 30 minutes, respectively. The treated samples were washed with 1x PBS, fixed with 3.7% paraformaldehyde, and 1 ml of nuclear staining reagent (Sigma) diluted 1 / 20,000 in 1x PBS was added and stained for 1 minute. Prepared cells were analyzed using a fluorescence microscope (Plan-Apochromat 63x1.40 OIL lens, Carl Zeiss) and a confocal scanning laser microscope (HCX PL APO CS 63.0x1.40 OIL PH lens, Leica Microsystems Heidelberg GmbH).

세포 독성 실험Cytotoxicity experiment

합성된 펩타이드 아날로그가 정상 세포에서 세포 독성을 가지는지 확인하기 위하여, 96-웰 마이크로 플레이트에 웰 당 1 x 104의 NIH 3T3 섬유아세포(한국세포주은행)를 배양한 후 12.5 μM에서 100 μM까지 농도를 달리하여 37℃에서 24시간 동안 처리하였다. 멜리틴(melittin)과 Tat 펩타이드는 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다. 펩타이드를 처리하고 24시간이 지난 후 1x PBS로 세척하고 1x PBS에 5 ㎎/㎖로 녹인 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma) 50 ㎕를 첨가하였다. MTT 시약을 처리한 후 4시간 동안 추가로 배양한 다음 웰에 남아있는 배지를 버리고 50 ㎕ DMSO로 세포를 용해시켜서 ELISA(Enzyme-linked immunosobent assay) 리더기 (μQuant Bio-TEK Instrument, Inc.)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. To determine whether the synthesized peptide analogues are cytotoxic in normal cells, incubate 1 x 10 4 NIH 3T3 fibroblasts (Korea Cell Line Bank) per well in 96-well microplates and concentrating from 12.5 μM to 100 μM. Was treated for 24 hours at 37 ℃. Melittin and Tat peptide were used as negative and positive controls, respectively. After 24 hours of peptide treatment, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (washed with 1x PBS and dissolved at 5mg / ml in 1x PBS) MTT, Sigma) 50 μl was added. After incubation for 4 hours after treatment with MTT reagent, discard the remaining medium in the wells and lyse the cells with 50 μl DMSO using an Enzyme-linked immunosobent assay (ELISA) reader (μQuant Bio-TEK Instrument, Inc.). Absorbance at 570 nm was measured.

유세포Flow cell 분석기를 이용한 세포 투과성 정량 분석 Cell Permeability Quantitation Using Analyzer

합성된 세포 투과성 펩타이드 아날로그의 세포 내 이동 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 12-웰 플레이트에 웰당 1 x 105개의 헬라 세포를 분주하여 하루 동안 배양한 후 FITC가 결합된 펩타이드를 각각 37℃ 및 4℃에서 10 μM 농도로 30분 동안 처리하였다. 이후 1x PBS로 세척하고 3.7% 파라포름알데히드를 10분 동안 처리하여 세포를 고정시켰다. 1x PBS로 파라포름알데히드를 씻어내고 1x 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 플레이트로부터 떼어낸 후 한 번 더 세척하였다. 준비된 시료는 유세포 분석기(Expo 32 ADC BECKMAN COULTER)를 이용해 전체 세포군 가운데 형광 입자를 포함한 세포의 비율을 측정하여 비교하였다.In order to quantitatively analyze the intracellular migration of the synthesized cell permeable peptide analog, 1 x 10 5 HeLa cells per well were dispensed in a 12-well plate and cultured for one day, and the FITC conjugated peptide was 37 ° C. and 4 ° C., respectively. 30 min treatment at 10 μM concentration. The cells were then fixed with 1 × PBS and treated with 3.7% paraformaldehyde for 10 minutes. Paraformaldehyde was washed off with lx PBS and cells were removed from the plate using lx trypsin-EDTA and washed once more. The prepared samples were compared by measuring the ratio of cells including fluorescent particles in the entire cell population using a flow cytometer (Expo 32 ADC BECKMAN COULTER).

GFPGFP 융합  fusion 펩타이드Peptide 발현 및 정제 Expression and Purification

pEGFPLuc 벡터(Clontech)로부터 각각 NcoI과 EcoRI 제한 효소 시퀀스로 디자인한 순방향 프라이머(5'-CAT GCC ATG GCT CGA GGT CGA GGT CGA CGG TAT CGA T-3') 및 역방향 프라이머(5'-GAA TTC GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3')를 가지고 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) DNA를 PCR로 증폭시킨 후, pBluescript SK+ 서브클로닝 벡터(Stratagene)에 재조합 시켰다. 펩타이드 시퀀스는 E. coli의 코돈 사용빈도(codon usage)를 이용하여 DNA 서열로 바꾼 뒤 EcoRI과 HindⅢ 제한 효소 시퀀스가 추가된 프라이머 (Tat 순방향 프라이머: 5`-AAT TCT ACG GCC GTA AAA AAC GTC GTC AGC GTC GTC GTT A-3`, Tat 역방향 프라이머: 5`-AGC TTA ACG ACG ACG CTG ACG ACG TTT TTT ACG GCC GTA G-3`, DS4-3 순방향 프라이머: 5`-AAT TCC GTA TCA TGC GCA TTC TGC GTA TTC TGA AAC TGG CGC GTT A-3`, DS4-3 역방향 프라이머: 5`-AGC TTA ACG CGC CAG TTT CAG AAT ACG CAG AAT GCG CAT GAT ACG G-3`, KS4-1 순방향 프라이머: 5`-AAT TCA GGC TCG TGA GGC TTC TCA GGT TCC TCA GGT A-3`, KS4-1 역방향 프라이머: 5`-AGC TTA CCT GAG GAA CCT GAG AAG CCT CAC GAG CCT G-3`)를 각각 어닐링시켰다. GFP는 아가로즈 젤로부터 DNA를 추출하고, DNA 단편은 에탄올 침전에 의하여 분리한 후, 6x His-tag이 있는 pRSET B 단백질 발현 벡터(Invitrogen)에 옮겼다. 클로닝된 GFP 융합 펩타이드를 시퀀싱하여 확인한 후 단백질 발현을 위하여 BL21(DE3) codon plus에서 1 mM의 이소프로필 b-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl b-D-thiogalactopyranoside: IPTG, Sigma)를 넣고 3시간 동안 37℃에서 혼탁 배양시킨 후 원심 분리 하였다. 모아진 E. coli 세포를 침전물 무게 당 2-5 ㎖의 라이시스 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 10 mM 이미다졸, NaOH에 의해 pH 8.0으로 맞춤)를 넣고 소니케이터(sonicator, Branson 5510)에 의해 세포를 깬 후 상층액에 Ni-NTA 레진(Novagen)을 섞은 다음 실온에서 1시간 동안 결합시켜 용출 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 250 mM 이미다졸, NaOH에 의해 pH 8.0으로 맞춤)로 정제하여 SDS-PAGE로 확인하였다.Forward primer (5'-CAT GCC ATG GCT CGA GGT CGA GGT CGA CGG TAT CGA T-3 ') and reverse primer (5'-GAA TTC) designed with Nco I and Eco RI restriction enzyme sequences from pEGFPLuc vector (Clontech), respectively Green fluorescent protein (GFP) DNA was amplified by PCR with GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3 ') and recombined into pBluescript SK + subcloning vector (Stratagene). Peptide sequence was transformed into DNA sequence using codon usage of E. coli , followed by primers with Eco RI and Hind III restriction enzyme sequences (Tat forward primer: 5`-AAT TCT ACG GCC GTA AAA AAC GTC GTC AGC GTC GTC GTT A-3`, Tat reverse primer: 5`-AGC TTA ACG ACG ACG CTG ACG ACG TTT TTT ACG GCC GTA G-3`, DS4-3 Forward primer: 5`-AAT TCC GTA TCA TGC GCA TTC TGC GTA TTC TGA AAC TGG CGC GTT A-3`, DS4-3 Reverse Primer: 5`-AGC TTA ACG CGC CAG TTT CAG AAT ACG CAG AAT GCG CAT GAT ACG G-3`, KS4-1 Forward Primer: 5 `-AAT TCA GGC TCG TGA GGC TTC TCA GGT TCC TCA GGT A-3`, KS4-1 Reverse Primers: 5`-AGC TTA CCT GAG GAA CCT GAG AAG CCT CAC GAG CCT G-3`), respectively. GFP extracted DNA from agarose gel, DNA fragments were isolated by ethanol precipitation, and then transferred to pRSET B protein expression vector (Invitrogen) with 6x His-tag. After sequencing the cloned GFP fusion peptide, 1 mM isopropyl bD-thiogalactopyranoside (IPTG, Sigma) was added to BL21 (DE3) codon plus for protein expression. After incubation in turbidity was centrifuged. The collected E. coli cells were placed in 2-5 ml of Lysis buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl and 10 mM imidazole, adjusted to pH 8.0 by NaOH) per soaked precipitate. Branson 5510) cells were disrupted and mixed with Ni-NTA resin (Novagen) in the supernatant and then bound for 1 hour at room temperature in elution buffer (50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl and 250 mM imidazole, NaOH). To pH 8.0) and confirmed by SDS-PAGE.

실험 결과Experiment result

CPPCPP 후보군의 디자인 및 선정 Design and Selection of Candidates

래트에 존재하는 포타슘 채널 중에 Kv2.1(DRK1)과 Aeropyrum pernix에 존재하는 KvAP의 센싱 도메인으로부터 CPP 후보군을 선정하였다. Kv2.1과 KvAP의 S4 도메인 시퀀스는 VQIFRIMRILRILKLARHST 및 FRLVRLLRFLRILLIIS로 각각 DS4, KS4로 명명하였다. 합성된 펩타이드는 세포 투과성을 확인하기 위하여 펩타이드 합성 시 N-말단에 FITC를 붙였고 이는 불용성이므로 2% DMSO에 용해시켜 사용하였다. DS4와 KS4 펩타이드가 물에 잘 녹지 않고 세포에 처리했을 때 응집되는 경향을 보여서 펩타이드의 N-말단과 C-말단에 있는 소수성 시퀀스를 제거한 5가지 아날로그를 추가로 합성하였다 (표 1). Among the potassium channels present in rats, Kv2.1 (DRK1) and Aeropyrum from the sensing domain of KvAP present in pernix CPP candidates were selected. The S4 domain sequences of Kv2.1 and KvAP were named VQIFRIMRILRILKLARHST and FRLVRLLRFLRILLIIS, named DS4 and KS4, respectively. The synthesized peptide was attached to FITC at the N-terminus at the time of peptide synthesis in order to confirm cell permeability, which was insoluble, so that it was dissolved in 2% DMSO. The DS4 and KS4 peptides were insoluble in water and showed a tendency to aggregate when treated with cells, thereby further synthesizing five analogues removing the hydrophobic sequences at the N- and C-terminus of the peptide (Table 1).

서열번호SEQ ID NO: 펩타이드 명Peptide Name 시퀀스sequence 제1서열First sequence DS4DS4 VQIFRIMRILRILKLARHSTVQIFRIMRILRILKLARHST 제2서열2nd sequence DS4-1DS4-1 RIMRILRILKLARHSTRIMRILRILKLARHST 제3서열Third sequence DS4-2DS4-2 VQIFRIMRILRILKLARVQIFRIMRILRILKLAR 제4서열4th sequence DS4-3DS4-3 RIMRILRILKLARRIMRILRILKLAR 제5서열5th sequence KS4KS4 FRLVRLLRFLRILLIISFRLVRLLRFLRILLIIS 제6서열6th sequence KS4-1KS4-1 FRLVRLLRFLRILLFRLVRLLRFLRILL 제7서열Seventh Sequence KS4-2KS4-2 RLVRLLRFLRRLVRLLRFLR

CPPCPP 후보군의 세포 투과성 측정 Cell Permeability Measurement of Candidates

CPP의 세포 투과성이 일반적인 엔도사이토시스에 의한 것인지 그 이외의 다른 기작에 의한 것인지 구분하기 위한 세포 투과성 실험은 4℃ 및 37℃에서 수행하였다. 양성 대조군으로 Tat 펩타이드를 사용하였으며 1x105 헬라 세포에 2%의 DMSO에 녹인 DS4와 KS4 펩타이드 10 μM을 30분 동안 처리 하였을 때 Tat 펩타이드와 다른 패턴으로 세포질에 있는 것을 확인하였다 (도 1). Tat과 비교했을 때 다른 패턴을 보인 것을 비교 및 확인하기 위해서, 동일한 시료를 콘포칼 스캐닝 레이저 현미경으로 분석한 결과 펩타이드가 세포질 안에 존재하는 것을 알 수 있었다 (도 2). Cell permeability experiments were performed at 4 ° C. and 37 ° C. to distinguish whether CPP's cell permeability was due to general endocytosis or other mechanisms. Tat peptide was used as a positive control, and when treated with 10 μM of DS4 and KS4 peptide dissolved in 2% DMSO in 1 × 10 5 HeLa cells for 30 minutes, it was confirmed that the cytoplasm was in a different pattern from the Tat peptide (FIG. 1). In order to compare and confirm that the pattern shows a different pattern when compared with Tat, the same sample was analyzed by a confocal scanning laser microscope, and the peptide was found in the cytoplasm (FIG. 2).

아날로그 analog 펩타이드의Peptide 세포 투과성 및 단백질 전달 효과 확인 Confirm cell permeability and protein delivery effect

DS4와 KS4의 용해도를 향상시키기 위해 합성한 펩타이드 아날로그 DS4-1, DS4-2, DS4-3, KS4-1 및 KS4-2을 동일한 조건에서 세포에 처리했을 때 DS4-2의 경우 세포막 주위에 형광이 띠처럼 나타나는 것으로 보아 세포 안으로 들어가지 못하고 세포막에 박혀 있음을 알 수 있었고, DS4-1의 경우 37℃에서 형광 입자가 들어있는 소낭이 많은 것으로 관찰되었다 (도 3). 세포막에 존재하는 DS4-2를 제외하고 나머지 4개의 아날로그 펩타이드의 세포 내 형광 정도를 측정한 결과 DS4-3과 KS4-1이 가장 효율이 우수한 것으로 나타났다 (도 4). 따라서 이를 바탕으로 두 펩타이드에 GFP를 재조합하여 GFP 융합 펩타이드를 제조하였다. GFP 융합 펩타이드 10 ㎍을 세포에 처리하고 4시간 후에 형광 현미경으로 관찰한 결과 DS4-3은 Tat과 비교했을 때 비슷한 정도로 세포질과 핵에 들어가는 반면 KS4-1의 경우 펩타이드 자체만을 처리했을 때와는 달리 GFP와 같은 단백질을 재조합 시켰을 때 소낭이 생기고 세포막 바깥으로 GFP가 분해되어 나오는 것으로 관찰되었고 이에 엔도사이토시스가 일어나는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).When the peptide analogs DS4-1, DS4-2, DS4-3, KS4-1, and KS4-2, which were synthesized to improve the solubility of DS4 and KS4, were treated to cells under the same conditions, DS4-2 fluoresced around the cell membrane. This band-like appearance was found to be embedded in the cell membrane rather than into the cell, DS4-1 was observed that many vesicles containing fluorescent particles at 37 ℃ (Fig. 3). Intracellular fluorescence of the remaining four analog peptides except DS4-2 present in the cell membrane was found to be the most efficient DS4-3 and KS4-1 (Fig. 4). Therefore, GFP fusion peptide was prepared by recombining GFP to two peptides based on this. After fluorescence microscopy after 10 hours of treatment with 10 μg of GFP fusion peptides, DS4-3 enters the cytoplasm and nucleus to a similar extent as compared to Tat, whereas KS4-1 does not treat the peptides alone. When a protein such as GFP was recombined, vesicles formed and GFP was decomposed to the outside of the cell membrane, and it was confirmed that endocytosis occurred (FIG. 6).

세포 내 독성 실험Intracellular Toxicity Experiment

합성된 펩타이드를 이용하여 세포 내로 유입하고자 하는 물질을 융합시키기 이전에 펩타이드 자체가 정상세포에서 독성이 있는지를 확인하기 위하여 양성 대조군으로 Tat 펩타이드를, 음성 대조군으로 항균 펩타이드인 멜리틴을 사용하여 NIH 3T3 세포에서 독성 실험을 하였다. 세포에 MTT를 처리하면 노란색을 띠는 테트라졸리움 염이 살아있는 세포에서 포마잔 침전을 형성하여 보라색으로 변하는데, 이를 이용하여 처리 후 4시간이 지나서 죽은 세포들은 1x PBS로 씻어내고 포마잔 침전을 형성한 남아있는 세포를 DMSO로 녹여서 살아있는 세포 수를 570 nm에서 흡광도로 측정하여 값을 비교하였다. 그 결과 DS4 및 KS4, 아날로그들 가운데는 DS4-2를 제외한 나머지 펩타이드들이 대조군과 비교하였을 때 100 μM까지의 농도에서 세포 독성이 거의 없는 것으로 나타났다 (도 5). 상대적으로 용해도가 높은 DS4-1, DS4-3, KS4-1 및 KS4-2에서는 세포 독성이 거의 없는 것과 비교했을 때, DS4, KS4 및 DS4-2가 50 μM 이상에서 독성을 보인 것은 펩타이드의 용해도와도 연관성이 있는 것으로 생각된다.In order to confirm whether the peptide itself is toxic in normal cells, the Tat peptide is used as a positive control and the antimicrobial peptide melittin as a negative control before fusion of the substance to be introduced into the cell using the synthesized peptide. Toxicity experiments were performed on the cells. After treatment with MTT, the yellowish tetrazolium salt forms a formazan precipitate in living cells and turns purple. After 4 hours of treatment, dead cells are washed with 1x PBS to form formazan precipitate. One remaining cell was dissolved in DMSO and the number of living cells was measured by absorbance at 570 nm to compare the values. As a result, among the analogues of DS4 and KS4, the other peptides except DS4-2 showed little cytotoxicity at concentrations up to 100 μM compared to the control group (FIG. 5). The relative solubility of DS4-1, DS4-3, KS4-1, and KS4-2 showed that the cytotoxicity of DS4, KS4, and DS4-2 was higher than 50 μM compared to that of little cytotoxicity. It seems to be related to.

(( RxxRxx )) nn 모티프의 세포 투과성 확인 Check cell permeability of the motif

CPP 후보군 선정을 위한 세포 투과성, 독성 실험 및 단백질 전달 효과와 같은 실험 결과 최종적으로 DS4-3 펩타이드가 효율이 가장 뛰어난 것으로 나타나 DS4-3를 가지고 펩타이드 길이와 Rxx의 xx부분의 시퀀스의 변화에 따른 세포 투과능의 차이를 확인하기 위하여 다양한 펩타이드를 추가로 합성하였다. (Rxx)n 모티프를 기준으로 펩타이드 길이, 즉 n=1, 3, 5 및 7인 펩타이드 4종을 합성하여 실험한 결과 길이가 너무 짧거나 길어도 세포 내 투과성이 떨어지고 펩타이드 길이가 9개에서 15개 정도의 길이가 가장 적합한 것으로 나타났다 (도 7 및 도 8). 또한 DS4-3 시퀀스 에서 Rxx 기본 모티프를 해치지 않고 xx 부분의 시퀀스를 바꿔 가면서 펩타이드의 세포 내 투과능을 비교하기 위하여 총 20가지의 펩타이드를 추가로 합성하였다 (표 2). xx 부분에 들어갈 펩타이드 시퀀스는 이온 채널의 센싱 도메인 시퀀스를 분석하여 시스테인을 제외한 19가지 아미노산을 조합하여 만들었다 (표 2).Experimental results such as cell permeability, toxicity test and protein delivery effect for CPP candidate selection showed that DS4-3 peptide was the most efficient, and according to the change of peptide length and sequence of xx part of Rxx with DS4-3 Various peptides were further synthesized to confirm the difference in permeability. (Rxx) Synthesis of four peptides based on the n motif, i.e., n = 1, 3, 5, and 7, resulted in poor intracellular permeability even if the length was too short or long, and the peptide length was 9 to 15 The length of degree was found to be most suitable (FIGS. 7 and 8). In addition, a total of 20 peptides were further synthesized in order to compare intracellular permeability of peptides by changing the sequence of the xx region without harming the Rxx basic motif in the DS4-3 sequence (Table 2). Peptide sequence to enter the xx portion was made by combining the 19 amino acids except cysteine by analyzing the sensing domain sequence of the ion channel (Table 2).

(Rxx)n (Rxx) n 적용apply 서열번호SEQ ID NO: 펩타이드명Peptide Name 시퀀스sequence Rxx motif의 길이에 따른 펩타이드Peptides Along Rxx Motif Length n=1,3,5 및7n = 1,3,5 and 7 제8서열8th sequence N1N1 RILRIL 제9서열Ninth sequence N3N3 RILRILRILRILRILRIL 제10서열10th sequence N5N5 RILRILRILRILRILRILRILRILRILRIL 제11서열11th sequence N7N7 RILRILRILRILRILRILRILRILRILRILRILRILRILRIL 인간 유래 포타슘 채널, 칼슘 채널 및 소디움 채널에 존재하는 센싱 도메인 Sensing domains present in human-derived potassium channels, calcium channels, and sodium channels KCNG3
CACN1A3
CACNA1C4
SCN4A2
SCN9A4KCNG3
CACN1A3
CACNA1C4
SCN4A2
SCN9A4 제12서열Article 12 K3K3 RIFWVIKLARHFIRIFWVIKLARHFI 제13서열The thirteenth sequence C3C3 KSLRVLRVLRPLKTIKKSLRVLRVLRPLKTIK 제14서열Article 14 C4C4 RLFRVMRLVKLLSRGRLFRVMRLVKLLSRG 제15서열Sequence 15 S2S2 RSFRLLRVFKLAKSWRSFRLLRVFKLAKSW 제16서열16th sequence S4S4 RVIRLARIGRILRLVKGAKGIRRVIRLARIGRILRLVKGAKGIR xx 부분의 소수성 잔기 조합combination of hydrophobic residues in the xx moiety 극성/비극성
극성/극성
비극성/비극성
(시스테인 제외)Polar / non-polar
Polarity / polarity
Non-polar / non-polar
(Excluding cysteine) 제17서열SEQ ID NO: 17 D1D1 RAGRILRILKLARRAGRILRILKLAR 제18서열Article 18 D2D2 RIMRGLRILKLARRIMRGLRILKLAR 제19서열Article 19 D3D3 RIMRILRLMKLARRIMRILRLMKLAR 제20서열Article 20 D4D4 RIMRILRILKMFRRIMRILRILKMFR 제21서열Article 21 D5D5 RIMRILRALKLARRIMRILRALKLAR 제22서열Article 22 D6D6 RIMRGMRILKLARRIMRGMRILKLAR 제23서열SEQ ID NO: 23 D7D7 RLFRILRILKLARRLFRILRILKLAR 제24서열Article 24 D8D8 RIMRMVRILKLARRIMRMVRILKLAR 제25서열Article 25 D9D9 RIMRILRLVKLARRIMRILRLVKLAR 제26서열Article 26 D10D10 RIMRILRILKGVRRIMRILRILKGVR 제27서열Article 27 D11D11 RNLRILRILKLARRNLRILRILKLAR 제28서열Article 28 D12D12 RIMRDIRILKLARRIMRDIRILKLAR 제29서열SEQ ID NO: 29 D13D13 RIMRILRELKLARRIMRILRELKLAR 제30서열Sequence 30 D14D14 RIMRILRILKQLRRIMRILRILKQLR 제31서열SEQ ID NO: 31 D15D15 RIMRILRHMKLARRIMRILRHMKLAR 제32서열SEQ ID NO: 32 D16D16 RIMRSVRILKLARRIMRSVRILKLAR 제33서열SEQ ID NO: 33 D17D17 RTMRILRILKLARRTMRILRILKLAR 제34서열SEQ ID NO: 34 D18D18 RIMRYARILKLARRIMRYARILKLAR 제35서열SEQ ID NO: 35 D19D19 RIMRILRQIKLARRIMRILRQIKLAR 제36서열SEQ ID NO: 36 D20D20 RIMRILRILKEVRRIMRILRILKEVR

펩타이드 조합은 비극성/비극성, 극성/극성 및 극성/비극성을 이루도록 하였으며 펩타이드의 xx부분 가운데 한 부분씩 조합된 시퀀스를 삽입하여 그에 따른 세포 투과능의 변화를 측정하고자 하였다. 각각의 펩타이드들 간에 약간의 용해도에 의한 차이가 있었지만 대부분 물에 잘 녹았고, DS4-3과 비슷한 정도의 세포 투과능을 보였지만, 그 중 DS4-3-3, DS4-3-4, DS4-3-5, DS4-3-7, DS4-3-10 및 DS4-3-14의 경우 다른 펩타이드들보다 세포 투과능이 뛰어난 것으로 나타났다 (도 7 및 도 9). 또한 같은 포타슘 채널의 Kv10.1 S4 시퀀스 중 유형이 다른 RIFWVIKLARHFI을 가지고 실험한 결과는 DS4-3보다 낮은 투과성을 보인 것으로 나타나서 세포 투과에 Rxx 모티프가 중요하게 작용하는 것을 예측할 수 있었다. 이온 채널 가운데 포타슘 채널뿐만 아니라 칼슘 채널 또는 소듐 채널의 센싱 도메인 가운데 각각 두 개의 펩타이드를 선정하여 Rxx 모티프를 중심으로 합성한 후 세포 투과 정도를 확인한 결과 칼슘 채널 중 CACN1A3는 대조군에 비해 상대적으로 세포 투과능이 낮았지만 실험한 다른 이온 채널(KCNG3, CACNA1C4, SCN4A2 및 SCN9A4, 참조: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)은 세포 투과능이 뛰어난 것으로 나타났다. 결과적으로 이온 채널의 센싱 도메인 가운데 S4의 Rxx 모티프가 기존의 엔도사이토시스가 아닌 CPP로써 세포막을 통과하기 용이한 특징을 가지고 있다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 결과는 종래에 밝혀져 있는 동물 또는 식물에 존재하는 이온 채널의 센싱 도메인 중에도 Rxx 모티프를 포함한다면 CPP로써 이용할 수 있음을 강력히 시사한다.Peptide combinations were made to achieve non-polar / non-polar, polar / polar and polar / non-polar, and inserted the sequence of one of the xx portion of the peptide to measure the change in cell permeability. Although there was a slight solubility difference between each of the peptides, most of them were soluble in water and showed cell penetration similar to DS4-3, but among them, DS4-3-3, DS4-3-4, DS4-3 -5, DS4-3-7, DS4-3-10 and DS4-3-14 were found to be superior in cell permeability than other peptides (Figs. 7 and 9). In addition, experiments with heterogeneous RIFWVIKLARHFI in the Kv10.1 S4 sequence of the same potassium channel showed lower permeability than DS4-3, suggesting that the Rxx motif plays an important role in cell permeation. Two peptides were selected from the sensing domains of calcium or sodium channels as well as potassium channels among the ion channels and synthesized around the Rxx motif. Other ion channels (KCNG3, CACNA1C4, SCN4A2 and SCN9A4, see http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), which were low but tested, were found to have excellent cell permeability. As a result, it can be seen that the Rxx motif of S4 among the sensing domains of the ion channel has a characteristic of easily passing through the cell membrane by CPP instead of endocytosis. These results strongly suggest that if the Rxx motif is included among the sensing domains of ion channels existing in the animals or plants that are known in the art, they can be used as CPP.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that such a specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

참고 문헌references

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도 1은 Tat을 양성 대조군으로 사용하여 펩타이드의 N 말단에 FITC를 붙인 DS4 및 KS4를 1 x 105의 헬라 세포(HeLa cell)에 각각 10 μM씩 처리한 후 4℃ 및 37℃에서 30분 동안 배양한 후에 3.5% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시키고 1 x PBS로 씻어낸 다음 핵 염색을 하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.1 is treated with 10 μM of DS4 and KS4 with FITC attached to the N-terminus of the peptides, respectively, in HeLa cells of 1 × 10 5 using Tat as a positive control for 30 minutes at 4 ° C. and 37 ° C. After incubation, fixed with 3.5% paraformaldehyde for 10 minutes, washed with 1 x PBS, and then stained with nuclear fluorescence microscopy shows the results.

도 2는 DS4(A) 및 KS4(B) 펩타이드가 세포막에 존재하는지 세포질 안으로 들어갔는지 여부를 보다 정확히 확인하기 위하여 도 1에서와 같은 조건에서 준비한 시료를 콘포칼 현미경에 의해 관찰한 결과이다.2 is a result of observing a sample prepared under the same conditions as in FIG. 1 by confocal microscopy to more accurately determine whether the DS4 (A) and KS4 (B) peptides are present in the cell membrane or into the cytoplasm.

도 3은 DS4 및 KS4의 용해도를 향상시키기 위하여 각각 N 말단과 C 말단의 아미노산 잔기를 제거하여 합성한 5개의 아날로그 펩타이드를 1 x 105의 헬라 세포에 10 μM씩 처리한 후 4℃ 및 37℃에서 30분 동안 배양하여 현미경으로 관찰한 결과이다. 왼쪽 구획은 4℃를 나타내고, 오른쪽 구획은 37℃를 나타내며, 각각 형광과 핵 염색이 오버레이된 도면이다.3 is DS4 and a five analog peptide synthesis by removing the N-terminal and the amino acid residues of the C-terminal, respectively in order to improve the solubility of KS4 1 x 10 after 5 treatment by 10 μM on HeLa cells in 4 ℃ and 37 ℃ Incubated for 30 minutes at and observed under a microscope. The left section represents 4 ° C., the right section represents 37 ° C., overlaying fluorescence and nuclear staining, respectively.

도 4는 DS4, KS4 및 아날로그 펩타이드가 정상세포에서 독성이 있는지를 확인하기 위하여 1 x 104 NIH 3T3 세포에 12.5 μM부터 100 μM까지 펩타이드를 처리하고 24시간 후에 MTT 시약을 첨가하여 추가로 4시간 더 배양시킨 결과를 그래프로 나타낸다.Figure 4 is treated with peptides from 12.5 μM to 100 μM in 1 x 10 4 NIH 3T3 cells to determine whether the DS4, KS4 and analog peptides are toxic in normal cells and additionally 4 hours by adding MTT reagent after 24 hours The results of further incubation are shown graphically.

도 5는 펩타이드 독성 실험 결과 독성이 없는 것으로 나타난 대조군으로 Tat, DS4-1, DS4-3, KS4-1 및 KS4-2 펩타이드를 1 x 106의 헬라 세포에 각각 10 μM씩 처리한 후 4℃ 및 37℃에서 30분 동안 배양한 후 유세포 분석기로 형광 정도를 측정한 결과이다.FIG. 5 shows that the peptide toxicity test showed no toxicity, and treated with Tat, DS4-1, DS4-3, KS4-1, and KS4-2 peptides to 1 x 10 6 Hella cells at 10 μM, respectively, at 4 ° C. FIG. And after culturing for 30 minutes at 37 ℃ is the result of measuring the degree of fluorescence with a flow cytometer.

도 6은 Tat, DS4-3 및 KS4-1에 GFP를 재조합 시킨 단백질을 발현 및 정제한 후 1 x 105의 헬라 세포에 10 ㎍씩 4시간 동안 처리하여 형광현미경으로 관찰한 결과이다. 왼쪽 구획은 형광 염색이고, 오른쪽 구획은 핵 염색이 오버레이된 도면을 나타낸다.FIG. 6 shows the results of fluorescence microscopy analysis of Tat, DS4-3 and KS4-1 expressing and purifying GFP-recombined proteins and treating the cells at 1 × 10 5 HeLa cells for 10 ㎍ for 4 hours. The left compartment is the fluorescent staining and the right compartment is the overlay of the nuclear staining.

도 7은 (Rxx)n 모티프를 기준으로 길이에 따른 아날로그와(n=1, 3, 5 및 7) 다른 이온 채널의 S4 도메인 시퀀스를 이용하여 합성된 9개의 펩타이드 및 DS4-3 펩타이드의 xx 부분의 아미노산 서열을 바꾼 아날로그를 합성하여 1 x 106의 헬라 세포에 10 μM씩 처리한 후 4℃ 및 37℃에서 30분 동안 배양한 후 남아있는 펩타이드를 씻어내고 1 x 트립신-EDTA로 세포막에 남아있는 펩타이드를 제거하여 유세포 분석기로 형광 정도를 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.FIG. 7 shows the xx portion of 9 peptides and DS4-3 peptides synthesized using S4 domain sequences of analog (n = 1, 3, 5 and 7) and other ion channels along their length based on the (Rxx) n motif. Analogues were synthesized by changing the amino acid sequence of 1 x 10 6 to 10 μM Hela cells and incubated for 30 minutes at 4 ℃ and 37 ℃, washed the remaining peptides and remained on the cell membrane with 1 x trypsin-EDTA The peptide is removed and the degree of fluorescence is measured by a flow cytometer.

도 8은 (Rxx)n 모티프를 기준으로 길이에 따른 아날로그(n=1, 3, 5 및 7) 및 다른 이온 채널의 S4 도메인 시퀀스를 이용하여 합성된 29개의 아날로그 펩타이드를 1 x 105 HeLa 세포에 10 μM씩 처리하여 30분 동안 배양한 후 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.FIG. 8 shows 1 × 10 5 HeLa cells with 29 analog peptides synthesized using S4 domain sequences of analog (n = 1, 3, 5 and 7) and other ion channels over length based on the (Rxx) n motif. 10 μM of the solution was incubated for 30 minutes and then observed under a fluorescence microscope.

도 9은 DS4-3 펩타이드의 xx 부분 서열을 바꾼 20개의 아날로그를 1 x 105 HeLa 세포에 10 μM씩 처리한 후 4℃ 및 37℃에서 30분 동안 배양한 후 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.Figure 9 shows the results of observing with 20 fluorescence microscopy after incubating for 30 minutes at 4 ° C and 37 ° C treated 20 analogs of the xx partial sequence of the DS4-3 peptide to 1 x 10 5 HeLa cells.

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<213> Artificial Sequence <220> <223> D4 <400> 20 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Met Phe Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D5 <400> 21 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ala Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D6 <400> 22 Arg Ile Met Arg Gly Met Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D7 <400> 23 Arg Leu Phe Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D8 <400> 24 Arg Ile Met Arg Met Val Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D9 <400> 25 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Leu Val Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D10 <400> 26 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Gly Val Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D11 <400> 27 Arg Asn Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D12 <400> 28 Arg Ile Met Arg Asp Ile Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D13 <400> 29 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D14 <400> 30 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D15 <400> 31 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg His Met Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D16 <400> 32 Arg Ile Met Arg Ser Val Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D17 <400> 33 Arg Thr Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D18 <400> 34 Arg Ile Met Arg Tyr Ala Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D19 <400> 35 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Gln Ile Lys Leu Ala Arg 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D20 <400> 36 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Glu Val Arg 1 5 10 <110> Gwangju Institute of Science and Technology          ANYGEN CO., LTD. <120> Novel Cell Penetrating Domain and Intracellular Delivery System          Comprising the Same <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4 <400> 1 Val Gln Ile Phe Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala   1 5 10 15 Arg His Ser Thr              20 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4-1 <400> 2 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg His Ser Thr   1 5 10 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4-2 <400> 3 Val Gln Ile Phe Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala   1 5 10 15 Arg     <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DS4-3 <400> 4 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS4 <400> 5 Phe Arg Leu Val Arg Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ile Leu Leu Ile Ile   1 5 10 15 Ser     <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS4-1 <400> 6 Phe Arg Leu Val Arg Leu Leu Arg Phe Leu Arg Ile Leu Leu   1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KS4-2 <400> 7 Arg Leu Val Arg Leu Leu Arg Phe Leu Arg   1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N1 <400> 8 Arg Ile Leu   One <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 9 Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu   1 5 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N5 <400> 10 Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu   1 5 10 15 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N7 <400> 11 Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Arg   1 5 10 15 Ile Leu Arg Ile Leu              20 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K3 <400> 12 Arg Ile Phe Trp Val Ile Lys Leu Ala Arg His Phe Ile   1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 <400> 13 Lys Ser Leu Arg Val Leu Arg Val Leu Arg Pro Leu Lys Thr Ile Lys   1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4 <400> 14 Arg Leu Phe Arg Val Met Arg Leu Val Lys Leu Leu Ser Arg Gly   1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S2 <400> 15 Arg Ser Phe Arg Leu Leu Arg Val Phe Lys Leu Ala Lys Ser Trp   1 5 10 15 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1 <400> 16 Arg Val Ile Arg Leu Ala Arg Ile Gly Arg Ile Leu Arg Leu Val Lys   1 5 10 15 Gly Ala Lys Gly Ile Arg              20 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 17 Arg Ala Gly Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2 <400> 18 Arg Ile Met Arg Gly Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3 <400> 19 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Leu Met Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4 <400> 20 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Met Phe Arg   1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D5 <400> 21 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ala Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D6 <400> 22 Arg Ile Met Arg Gly Met Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D7 <400> 23 Arg Leu Phe Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D8 <400> 24 Arg Ile Met Arg Met Val Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D9 <400> 25 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Leu Val Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D10 <400> 26 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Gly Val Arg   1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D11 <400> 27 Arg Asn Leu Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D12 <400> 28 Arg Ile Met Arg Asp Ile Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D13 <400> 29 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D14 <400> 30 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Gln Leu Arg   1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D15 <400> 31 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg His Met Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D16 <400> 32 Arg Ile Met Arg Ser Val Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D17 <400> 33 Arg Thr Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D18 <400> 34 Arg Ile Met Arg Tyr Ala Arg Ile Leu Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D19 <400> 35 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Gln Ile Lys Leu Ala Arg   1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D20 <400> 36 Arg Ile Met Arg Ile Leu Arg Ile Leu Lys Glu Val Arg   1 5 10  

Claims (11)

다음의 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드를 포함하는 세포막 투과 도메인:A cell membrane permeation domain comprising a peptide represented by the following general formula I: 일반식 ⅠFormula Ⅰ (B-X1-X2)n/3 (BX 1 -X 2 ) n / 3 상기 일반식에서, B는 Arg 또는 Lys이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His 및 Cys으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이며, n은 3-150의 정수이고, n이 6 이상인 경우 반복서열에 있는 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다.In the above formula, B is Arg or Lys, X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His and Cys, n is an integer from 3-150, and if n is 6 or more, B, X 1 and X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence. 제 1 항에 있어서, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu 및 His으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인. The method of claim 1 , wherein X 1 And X 2 is a cell membrane permeable domain characterized in that it is an amino acid independently selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu and His . 제 2 항에 있어서, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Tyr으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미 노산인 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인. The method of claim 2, wherein X 1 And X 2 is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr and Tyr independently of each other. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 제1서열 내지 제36서열 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인. The cell membrane permeation domain according to claim 1, wherein the peptide consists of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 36. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드의 말단에는 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 추가적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인. [Claim 2] The cell membrane permeation domain according to claim 1, wherein a cargo of an intracellular delivery target is further bound to the terminal of the peptide. 제 5 항에 있어서, 상기 세포내 운반 대상의 카고는 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 지질인 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.The cell membrane permeation domain according to claim 5, wherein the cargo of the intracellular delivery target is a chemical, a peptide, a polypeptide, a nucleic acid, a carbohydrate or a lipid. 다음의 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 말단에 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인을 포함하는 세포내 전달 시스템.An intracellular delivery system comprising a cell membrane permeation domain in which a cargo of an intracellular delivery target is bound to a terminal of a peptide represented by the following general formula (I). 일반식 ⅠFormula Ⅰ (B-X1-X2)n/3 (BX 1 -X 2 ) n / 3 상기 일반식에서, B는 Arg 또는 Lys이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His 및 Cys으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이며, n은 3-150의 정수이고, n이 6 이상인 경우 반복서열에 있는 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다.In the above formula, B is Arg or Lys, X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His and Cys, n is an integer from 3-150, and if n is 6 or more, B, X 1 in the repetition sequence And X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence. 제 7 항에 있어서, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu 및 His으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인을 포함하는 세포내 전달 시스템.8. The method of claim 7, wherein X 1 And X 2 is a cell membrane permeable domain characterized in that it is an amino acid independently selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu and His Intracellular delivery system comprising a. 제 7 항에 있어서, 상기 X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Tyr으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인을 포함하는 세포내 전달 시스템.8. The method of claim 7, wherein X 1 And X 2 is an intracellular delivery comprising a cell membrane permeable domain, characterized in that independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr and Tyr system. 제 7 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 제1서열 내지 제36서열 중 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인을 포함하는 세포내 전달 시스템.8. The intracellular delivery system of claim 7, wherein the peptide comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 36. 다음의 일반식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 말단에 세포내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포막 투과 도메인을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 카고를 세포 내로 운반하는 방법:A method of transporting cargo into a cell, comprising contacting a cell with a cell membrane permeation domain having a cargo of an intracellular transport target bound to a terminal of a peptide represented by the following general formula I: 일반식 ⅠFormula Ⅰ (B-X1-X2)n/3 (BX 1 -X 2 ) n / 3 상기 일반식에서, B는 Arg 또는 Lys이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His 및 Cys으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산이며, n은 3-150의 정수이고, n이 6 이상인 경우 반복서열에 있는 B, X1 및 X2는 그 이전 또는 그 이후의 반복서열에 있는 B, X1 및 X2 각각과 동일 또는 다른 서열을 갖는다.In the above formula, B is Arg or Lys, X 1 And X 2 independently of one another is an amino acid selected from the group consisting of Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, His and Cys, n is an integer from 3-150, and if n is 6 or more, B, X 1 in the repetition sequence And X 2 is B, X 1 in the repetition sequence before or after it And X 2 Each has the same or different sequence.
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