KR20100084623A - Vaccine for the treatment of osteoarthritis - Google Patents

Abstract

The present invention pertains to a vaccine for the treatment of osteoarthritis in a vertebrate comprising IL-1 β and optionally TNF-α cytokines or derivatives thereof, and in association with said IL-1 β and optional TNF-α or derivatives thereof a part that is non-self with respect to the vertebrate such that the vaccine elicits an immune response in the vertebrate against IL-1 β and TNF-α self-molecules of the said vertebrate.

Description

골관절염 치료용 백신{VACCINE FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS}Osteoarthritis Treatment Vaccine {VACCINE FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS}

본 발명은 척추동물의 골관절염 치료용 백신, 이러한 백신의 제조를 위한 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인의 용도 및 상기 백신을 투여하는 것에 의한 척추동물의 골관절염 치료법에 관한 것이다.The present invention relates to vaccines for the treatment of osteoarthritis in vertebrates, the use of IL-1β and optionally TNF-α cytokines for the production of such vaccines, and to the treatment of osteoarthritis in vertebrates by administering said vaccines.

골관절염(OA)은 고령의 인간 및 동물에서 주로 발생하는 비염증성 퇴행성 관절 질환으로서 관절 연골의 퇴행, 관절 변두리 뼈의 비대 및 활막의 변화를 특징으로 한다. 이 질환은 다중 기원으로부터 발생할 수도 있지만, 기계적 힘과 생화학적 힘 양자가 그 양상 및 진행의 주된 원인인 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 이 질환은, 특히 장시간의 활동 후에 통증 및 경직을 동반한다. 이 질환은 인간 및 동물, 특히 개와 말에게 만연되어 있기 때문에, 인간은 물론 동물의 보건에 있어서 중대한 이슈가 되고 있다.Osteoarthritis (OA) is a non-inflammatory degenerative joint disease that occurs primarily in older humans and animals and is characterized by degeneration of articular cartilage, hypertrophy of the articular marginal bone, and synovial changes. Although the disease may arise from multiple origins, it is generally recognized that both mechanical and biochemical forces are the main cause of its appearance and progression. This disease is accompanied by pain and stiffness, especially after prolonged activity. Since the disease is prevalent in humans and animals, especially dogs and horses, it is a significant issue in the health of humans as well as animals.

경도의 골관절염 환자는 아세트아미노펜과 같은 진통제만으로 치료할 수 있다. 그러나 다수의 환자들에게 비스테로이드성 소염제(NSAID)가 투여되고 있다. 이러한 NSAID는 통증만 완화시킬 뿐이며, 위궤양, 일광 노출에 대한 민감성, 신장 장애, 신경과민 및 우울증 유발을 비롯한 잠재적으로 위험한 부작용을 갖는다. 일부 환자들은 골관절염 진행을 늦추기 위해 관절에 직접 코티코스테로이드를 주사하는 치료를 받는다. 그러나 이 치료법은 코티코스테로이드의 잠재적 유해 부작용을 고려할 때 바람직하지 않다. 문헌에는 또한, 골관절염 연골 병변의 특징인 기질 분해 증가를 매개하는 데 관여하는 것으로 생각되는 사이토카인에 대한 길항제를 사용한 동소 치료(in situ treatment), 즉 골관절염의 관절에서의 치료로 골관절염을 치료하는 방법이 제안되어 있다. 이것은, 예를 들어 문헌[Pelletier (Arthritis & Rheumatism, Vol. 40, No. 6, June 1997, pp 1012-1019)] 및 문헌[Fernandes (Biorheology 39, 2002, 237-246)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 실험적으로 유도된 병변의 진행을 저하시킬 수 있는 인터루킨 수용체 길항제(IL-Ra) 유전자의 관절내 주사에 기초한 유전자 치료법을 개시한다. 그러나, 긍정적 효과는 지속 기간이 매우 짧고 치료법으로서의 적용성은 아직 입증되지 않았다. 또한, 사이토카인 자체, 특히 인터루킨 6에 대해 유도된 단일클론 항체의 동소 투여가 유럽 특허 출원 EP 1 715 891(Warner-Lambert Company, 2006년 공개)에 개시되어 있다. 이 치료법의 단점은 고용량이 요구됨으로 인해 치료가 본질적으로 고비용이라는 점, 국소(침습적) 투여라는 점 및 효과의 지속 기간이 짧다는 점이다.Mild osteoarthritis patients can be treated with painkillers such as acetaminophen. Many patients, however, are given nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). These NSAIDs only relieve pain and have potentially dangerous side effects, including gastric ulceration, sensitivity to sun exposure, kidney failure, neurosensitivity and depression. Some patients are treated with corticosteroids injected directly into their joints to slow the progression of osteoarthritis. However, this treatment is undesirable given the potential harmful side effects of corticosteroids. The literature also discloses methods for treating osteoarthritis by in situ treatment, ie treatment in the joints of osteoarthritis, with antagonists against cytokines that are thought to be involved in mediating increased substrate degradation characteristic of osteoarthritis cartilage lesions. Is proposed. This is described, for example, in Pelletier (Arthritis & Rheumatism, Vol. 40, No. 6, June 1997, pp 1012-1019) and Fernandes (Biorheology 39, 2002, 237-246), These documents disclose gene therapies based on intraarticular injection of interleukin receptor antagonist (IL-Ra) genes that can slow the progression of experimentally induced lesions. However, the positive effect has a very short duration and its applicability as a therapy has not yet been proven. In addition, in situ administration of monoclonal antibodies directed against the cytokine itself, especially interleukin 6, is disclosed in European patent application EP 1 715 891 (Warner-Lambert Company, published in 2006). Disadvantages of this therapy are that due to the high dose required, treatment is inherently expensive, local (invasive) administration and short duration of effect.

본 발명의 목적은 알려진 골관절염 치료법의 단점을 극복하거나 그러한 단점이 적어도 많이 감소된 골관절염 치료법을 제공하는 것이다. 이러한 점에서의 치료법은 골관절염을 예방하거나, 임상 징후를 경감하거나, 질환을 완화 또는 치유하거나, 발병 시작 후 질환의 진행을 억제하는 치료법을 포함할 수 있다.It is an object of the present invention to overcome the disadvantages of known osteoarthritis therapies or to provide osteoarthritis therapies with at least much reduced such disadvantages. Therapies in this regard may include therapies that prevent osteoarthritis, alleviate clinical signs, alleviate or cure the disease, or inhibit the progression of the disease after the onset of onset.

상기 목적을 위해, IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 포함하고, 상기 IL-1β 및 TNF-α 또는 그 유도체와 연합된, 백신이 척추동물에서 IL-1β 및 TNF-α 자가 분자에 대한 면역 반응을 유발하도록 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함하는 상기 서문에 따른 백신을 개발하였다. 임의적으로 상기 백신은 상기 비자가 부분과 연합된 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 담지하는 매체를 포함한다.For this purpose, vaccines comprising IL-1β and optionally TNF-α cytokines, or derivatives thereof, and associated with the IL-1β and TNF-α or derivatives thereof, in the vertebrate, IL-1β and TNF- A vaccine according to the foreword has been developed comprising a portion which is non-valent to the vertebrate to elicit an immune response against the α automolecule. Optionally the vaccine comprises a medium carrying the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, in which the visa is associated with a moiety.

이러한 점에서 백신은 척추동물, 즉, 관절을 가진 임의의 살아있는 동물, 예컨대 어류, 양서류, 파충류, 조류(鳥類), 및 인간을 비롯한 포유동물(이하, "동물"이란 용어는 임의의 척추동물을 지칭하는 것으로 사용됨)에 적용하기에 적합한 구성물이다. 일반적으로, 백신은 약독화 또는 사 미생물 및 그 서브유닛, 또는 유기체의 대사산물과 같은 임의의 다른 물질 등의 1종 이상의 항원을 포함한다. 백신을 동물에게 투여하면, 항원(들)에 대한 면역 반응이 유발되며, 이 반응은 질환 또는 질병의 예방, 개선 또는 치료를 보조한다. 일반적으로, 항원(들)은, 흔히 "약학적으로 허용되는 담체"라 칭하는, 항원을 담지하기 위한 매체와 혼합된다. 이러한 담체는 척추동물에 생리학적 적합성을 나타내는 임의의 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등일 수 있다. 이러한 담체 중 몇 가지 예로 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 박테리아 배양액, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 들 수 있다. 이들은 의도된 투여 방식에 따라 액체, 반고체 및 고체 제형을 제공할 수 있다. 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 담체의 존재는 백신의 유효성에 필수적이지 않지만, 항원의 투여량을 현저히 줄이고 투여 방법을 크게 단순화할 수 있다.In this regard, the vaccine may refer to vertebrates, ie any living animals with joints, such as fish, amphibians, reptiles, birds, and mammals, including humans (hereinafter, the term "animal" refers to any vertebrate). Suitable for application). Generally, the vaccine comprises one or more antigens, such as attenuated or dead microorganisms and subunits thereof, or any other substance such as metabolites of an organism. Administration of the vaccine to an animal elicits an immune response to the antigen (s), which assists in the prevention, amelioration or treatment of the disease or condition. In general, the antigen (s) are mixed with a medium for carrying the antigen, commonly referred to as a "pharmaceutically acceptable carrier." Such carriers can be any solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like that exhibit physiological compatibility to vertebrates. Some examples of such carriers include water, saline, phosphate buffered saline, bacterial cultures, dextrose, glycerol, ethanol and the like and combinations thereof. They may provide liquid, semisolid and solid formulations depending on the intended mode of administration. As is generally known, the presence of a carrier is not essential for the effectiveness of the vaccine, but can significantly reduce the dose of antigen and greatly simplify the method of administration.

백신은 흔히 보조제 또는 면역보조제(adjuvant)라 불리는 비특이적 면역자극제를 추가로 포함할 수 있다. 원칙적으로, 면역학적 사건의 캐스케이드의 특정 과정을 촉진 또는 증폭시킴으로써 궁극적으로 더 우수한 면역 반응(즉, 항원에 대한 종합적인 신체 반응, 특히 림프구에 의해 매개되고, 일반적으로 특정 항체 또는 이전에 감작화된 림프구에 의한 항원의 인식을 수반하는 반응)을 유도할 수 있는 각각의 물질이 면역보조제로서 정의될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 상기 특정 과정의 발생에 요구되는 것은 아니지만 상기 과정을 촉진하거나 증폭시킨다.The vaccine may further comprise a nonspecific immunostimulant, commonly referred to as an adjuvant or adjuvant. In principle, by ultimately promoting or amplifying the specific process of the cascade of immunological events, ultimately a better immune response (i.e. mediated by a comprehensive bodily response to the antigen, in particular lymphocytes, is generally mediated by specific antibodies or previously sensitized). Each substance capable of inducing a response involving recognition of antigen by lymphocytes can be defined as an adjuvant. An adjuvant is generally not required for the occurrence of this particular process but may promote or amplify the process.

본 발명의 백신은 IL-1β(인터루킨 1β) 및 TNF-α(종양 괴사 인자 α) 사이토카인을 사용하는 것에 기반을 두고 있다. 사이토카인은 일반적으로 항원과의 접촉시 세포 집단에 의해 방출되는 비항체 단백질로서 면역 반응의 생성에 있어서 세포내 매개체로서 작용한다. 인터루킨 1β는 인터루킨류의 하위 그룹, 즉, 주로 대식 세포 및 T 림프구에 의해 분비되며 림프구 및 조혈모 세포의 증식 및 분화를 유도하는 단백질류이다. 이것은 B 세포 및 T 세포의 활성화를 비롯한 광범위한 면역 및 염증 반응을 매개하는 강력한 면역 조절인자이다. TNF-α는 "종양 괴사 인자" 패밀리의 가장 잘 알려진 구성원으로서, 내독소 존재 하에 특히 대식 세포에 의해 생성되며 특히 암성 종양을 공격하여 파괴할 수 있음이 실험적으로 입증된 단백질을 대표하는 패밀리이다. 본 발명의 경우, 백신이 IL-1β 및 TNF-α 또는 그 유도체를 포함하고, 이것과 연합된, 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함한다. 이러한 점에서 비자가란 치료되는 동물에서 면역원성인 것, 즉, 면역 반응을 유발할 수 있는 것을 의미한다. 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 다른 분자와 연합된 비자가 부분을 사용함으로써, 이 다른 분자가 동물에 대해 자가인 경우에도 이 다른 분자에 대한 면역 반응을 제공할 수 있다. 사이토카인과 연합된 비자가 부분(또는 복수의 부분들)은 동물에 대해 이종성인 IL-1β 및 TNF-α를 선택함으로써 간단히 제공될 수 있다. 여기서 이종성이란 (동종성과는 반대로) 동일 종으로부터 유래된 것이 아님을 의미한다. 이 경우, 사이토카인은 치료되는 동물에 대해 비자가인 부분을 그 분자 구조 내에 본질적으로 포함하고 있다. 대안으로, 예를 들어 치료되는 동물에 대해 동종성이지만 돌연변이체이거나 재조합 기법에 의해 이종 단백질 부분과 함께 제공되는 사이토카인을 선택할 수도 있다. 사이토카인 또는 그 유도체와 연합된 비자가 부분을 제공하는 다른 방법으로는, 예를 들어 하나 이상의 비자가 분자, 비자가 구조물, 화합물, 또는 단지 임의의 비자가 구성체를 사이토카인에 물리적 또는 화학적으로 결합시키는 것이다. 어느 경우에나, 면역원성 구성체가 자가 사이토카인(즉, IL-1β 및 TNF-α)에 대한 면역 반응을 유발할 수 있도록 사이토카인 또는 그 유도체와 비자가 부분 사이에 기능적인(작동 가능한) 결합이 존재하는 면역원성 구성체가 제공된다. 상기에 언급한 바와 같이, 예를 들어 자가 단백질을 대형 이종 면역원성 담체 단백질에 화학적으로 결합하는 것(US 4,161,519), 자가 단백질과 이종 담체 단백질 간의 융합 구성체를 제조하는 것(WO 86/07383), 또는 하나의 단일 이종 T 헬퍼 에피토프를 자가 단백질에 치환하는 것(WO 95/05849)에 의해, 자가 단백질(자기 단백질이라고도 함)에 대한 백신을 개발하는 기법은 20세기 80년대 중반 이래로 공지되어 있다. 이러한 경우, 면역원성 구성체의 비자가 부분은 자가관용성의 파괴를 초래할 수 있는 T 헬퍼 림프구에 대한 에피토프를 제공하는 역할을 한다. 본 발명에 있어서 IL-1β 및/또는 TNF-α의 유도체는 출발 사이토카인보다 작거나 크지만, 이 출발 사이토카인에 대해 동종성인 하나 이상의 부분을 또한 포함하는 분자를 의미하는 것으로서, 상기 부분 또는 부분들은 이들 사이토카인의 항원성 결정인자를 구성한다. 이러한 부분은 하나의 단일 에피토프 정도로 작을 수 있다. 하나의 단일 에피토프만을 사용하는 것은 자가 IL-1β 및 TNF-α에 대해 매우 특이적인 항체, 실제로 단일클론 항체를 생성할 수 있다는 이점을 갖는다. 이것은 다른 사이토카인과의 교차 반응의 위험을 줄이거나 심지어 완전히 방지한다. 이러한 원리 자체는 공지되어 있고, 예를 들어, 사이토카인의 면역원성 펩티드(즉, 면역 반응을 유발할 수 있는 펩티드)를 명시적으로 개시하는 WO 2005/084198, WO 03/084979 및 EP 218531에 기재되어 있다. 백신에 두 사이토카인에 대한 유도체를 동시에 사용할 수도 있으나, 1종의 사이토카인은 천연 형태로 사용하고 다른 1종의 사이토카인은 천연 형태의 유도체로 사용할 수도 있다.The vaccine of the present invention is based on the use of IL-1β (interleukin 1β) and TNF-α (tumor necrosis factor α) cytokines. Cytokines are generally non-antibody proteins released by the cell population upon contact with the antigen and act as intracellular mediators in the generation of immune responses. Interleukin 1β is a class of proteins secreted by a subgroup of interleukins, ie mainly macrophages and T lymphocytes, which induce proliferation and differentiation of lymphocytes and hematopoietic stem cells. It is a potent immune modulator that mediates a wide range of immune and inflammatory responses, including activation of B and T cells. TNF-α is the best known member of the "tumor necrosis factor" family and is a family representative of proteins that have been experimentally demonstrated to be produced by macrophages, especially in the presence of endotoxins, and can attack and destroy cancerous tumors in particular. In the case of the present invention, the vaccine comprises IL-1β and TNF-α or derivatives thereof and includes a portion which is non-valent to vertebrates associated with it. In this sense non-Vega means immunogenic in the animal being treated, i.e. capable of eliciting an immune response. As is generally known, the use of non-valent moieties associated with other molecules can provide an immune response to these other molecules even if they are autologous to the animal. Non-valent portions (or plural portions) associated with cytokines can be provided simply by selecting IL-1β and TNF-α that are heterologous to the animal. Heterogeneity here means not derived from the same species (as opposed to homologous). In this case, the cytokine essentially contains in its molecular structure the portion that is non-virtual for the animal to be treated. Alternatively, cytokines may be selected that are homologous to the animal to be treated, for example, but which are mutant or provided with heterologous protein moieties by recombinant techniques. Other methods of providing a visa moiety associated with a cytokine or derivative thereof include, for example, one or more visas that physically or chemically bind molecules, visa structures, compounds, or just any visa structures to cytokines. It is to let. In either case, there is a functional (operable) bond between the cytokine or derivative thereof and the non-valent moiety so that the immunogenic construct can elicit an immune response to autologous cytokines (ie, IL-1β and TNF-α). Immunogenic constructs are provided. As mentioned above, for example, chemically binding autologous proteins to large heterologous immunogenic carrier proteins (US 4,161,519), preparing fusion constructs between autologous proteins and heterologous carrier proteins (WO 86/07383), Alternatively, by replacing one single heterologous T helper epitope with autologous protein (WO 95/05849), techniques for developing vaccines for autologous proteins (also called self proteins) have been known since the mid-80s of the 20th century. In this case, the non-valent part of the immunogenic construct serves to provide an epitope for T helper lymphocytes that can lead to the destruction of autotolerance. Derivatives of IL-1β and / or TNF-α in the present invention mean molecules which are smaller or larger than the starting cytokine but also comprise one or more moieties that are homologous to this starting cytokine, said portion or part Constitute the antigenic determinants of these cytokines. This portion may be as small as one single epitope. Using only one single epitope has the advantage of being able to produce highly specific, indeed monoclonal, antibodies against autologous IL-1β and TNF-α. This reduces or even completely prevents the risk of cross-reaction with other cytokines. This principle itself is known and is described, for example, in WO 2005/084198, WO 03/084979 and EP 218531, which explicitly disclose immunogenic peptides of cytokines (i.e., peptides that can elicit an immune response). have. Derivatives for both cytokines may be used in the vaccine simultaneously, but one cytokine may be used in its natural form and the other cytokine may be used as its derivative in its natural form.

본 출원인은 놀랍게도 본 발명에 따른 백신을 투여하는 것에 의해 골관절염을 성공적으로 치료할 수 있음을 발견하였다. 특히, 골관절염이 발병하기 전에 동물에게 백신접종을 할 경우 그 동물에게 실제로 골관절염을 발병하였을 때 임상 징후가 적게 나타난다는 것을 발견하였다. 이 질환의 임상 징후가 임의의 심각한 만성 부작용 없이 억제된다. 이러한 긍정적 결과를 고려할 때, 예측과는 달리, 적정량의 유도된 IL-1β 항체와, 적용 가능하다면, TNF-α 항체가 골관절염 관절에 도달한다는 것이 분명하다. 사이토카인 길항제가 골관절염 관절에 존재할 때 골관절염 진행이 억제된다는 사실을 고려할 때(상기에 언급한 Pelletier, Fernandes 및 Warner-Lambert Company의 문헌 참조), 본 발명에 따른 백신으로 치료된 동물은 골관절염의 진행에 대한 감수성이 적다. 골관절염은 진행성 퇴행성 질환이기 때문에, 골관절염 발병이 시작된 후 본 발명에 따른 백신으로 동물을 치료할 때에도 상응하는 결과가 얻어지는 것으로 이해되어야 한다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 백신을 사용한 백신접종은 동물에 있어서 자가 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α의 완전한 기능적 파괴를 초래하지는 않지만, 특히 관절 내에서의 이들 사이토카인의 농도를 정상 수준으로 줄인다는 것을 가정하면, 중증의 만성 부작용이 예상외로 없는 점이 설명될 수 있다.Applicant has surprisingly found that osteoarthritis can be successfully treated by administering a vaccine according to the present invention. In particular, if the animal is vaccinated before osteoarthritis, the clinical signs are less likely to occur when the animal actually develops osteoarthritis. Clinical signs of this disease are suppressed without any serious chronic side effects. Given these positive results, it is clear that, contrary to prediction, an appropriate amount of induced IL-1β antibody and, where applicable, a TNF-α antibody reaches the osteoarthritis joint. Given the fact that cytokine antagonists are present in osteoarthritis joints, osteoarthritis progression is inhibited (see literature of Pelletier, Fernandes, and Warner-Lambert Company, mentioned above), the animals treated with the vaccine according to the present invention are responsible for the progression of osteoarthritis. Low sensitivity to Since osteoarthritis is a progressive degenerative disease, it should be understood that corresponding results are also obtained when treating animals with the vaccine according to the invention after the onset of osteoarthritis. While not being bound by theory, vaccination with a vaccine according to the present invention does not result in complete functional destruction of the autologous cytokines IL-1β and TNF-α in animals, but in particular in the concentration of these cytokines in the joints. Assuming reduced to normal levels, the unexpected absence of severe chronic side effects can be explained.

문헌[Goldring (Clinical Orthopaedics and Related Research, No 427S, pp S27-S36)]은 IL-1 및 TNF-α 등의 향염증성 사이토카인이 연골 기질의 진행성 분해와 관절 기능의 상실을 초래하는 연골 세포 기능의 조절 장애에 기여한다는 점이 시사된다고 언급한다. 그러나, 상기 문헌에서는 또한 Clements에 의한 최근의 연구[Arthritis & Rheumatism, Vol. 48, No. 12, pp 3452- 3463, 2003]가 IL-1β 또는 IL-1β 전환 효소의 유전자 결실이 무릎 골관절염의 발달을 더 가속화한다는 것을 입증하였다고 언급한다. 따라서, 선행 기술은 골관절염에 있어서의 상기 사이토카인의 역할에 대해 확신을 갖고 있지 않다. 심지어 이들 사이토카인이 골관절염을 촉진하는지 억제하는지도 알고 있지 않다. 이것은, 예를 들어 골관절염의 발병에 있어서의 사이토카인의 역할을 평가하기 위한 연구 프로그램을 기술하는 최근의 연구 논문에 의해 확인된다[Baggio, Veterinary Immunology and Immunopathology 107 (2005) 27-39]. 이 연구 논문은, IL-1과 TNF가 둘 다 골관절염을 촉진하는 것으로 보고되었지만, 이들 사이토카인의 파괴가 골관절염을 치료하는 데 적합한지에 대해서는 여전히 논의의 여지가 있음을 명시적으로 언급한다. 문헌[Wildbaum (Immunity, Vol. 19, 679-688, November, 2003]은 또한 중화 TNF-α가 염증성 질환인 류마티스성 관절염은 억제하지만 골관절염은 억제하지 못한다고 보고한다. 따라서, 전문 의료인이 골관절염 치료법을 검토할 때 IL-1β 및 임의적인 TNF-α의 억제를 확신을 가지고 선택하지는 않을 것이다. 게다가, 사이토카인 길항제를 사용한 동소 치료법이 골관절염에 도움이 될 수 있는 경우에도 전신적 방법은 성공적이지 못하다는 것이 선행 기술로부터 명백히 알려져 있다(EP 1 715 891; 실시예 3 참조). 이것은 혈액-관절 장벽으로 인해 관절에의 도달이 매우 어렵다는 일반적 이해와 일치한다[Bas et al., British Journal of Rheumatology, 1996; 35(6): 548-552; 및 Kushner et al., Arthritis Rheum, 1971; 14(5): 560-570].Goldring (Clinical Orthopaedics and Related Research, No 427S, pp S27-S36) describes cartilage cell function in which proinflammatory cytokines such as IL-1 and TNF-α cause progressive degradation of cartilage substrates and loss of joint function. It is suggested that it contributes to the control disorders of patients. However, the literature also discloses a recent study by Clements [Arthritis & Rheumatism, Vol. 48, No. 12, pp 3452-3463, 2003, demonstrated that gene deletion of IL-1β or IL-1β converting enzymes further accelerates the development of knee osteoarthritis. Thus, the prior art is not convinced of the role of the cytokines in osteoarthritis. We do not even know whether these cytokines promote or inhibit osteoarthritis. This is confirmed by a recent research paper describing a research program for evaluating the role of cytokines in the development of osteoarthritis, for example (Baggio, Veterinary Immunology and Immunopathology 107 (2005) 27-39). Although this study paper has reported that both IL-1 and TNF promote osteoarthritis, it remains to be argued that the destruction of these cytokines is suitable for treating osteoarthritis. Wildbaum (Immunity, Vol. 19, 679-688, November, 2003) also reports that neutralizing TNF-α inhibits rheumatoid arthritis, an inflammatory disease but does not inhibit osteoarthritis. We will not confidently choose to inhibit IL-1β and optional TNF-α in our review, and furthermore, even if orthotopic therapies with cytokine antagonists can help osteoarthritis, systemic methods are not successful. It is clearly known from the prior art (EP 1 715 891; see Example 3) This is consistent with the general understanding that it is very difficult to reach joints due to the blood-joint barrier [Bas et al., British Journal of Rheumatology, 1996; 35 (6): 548-552; and Kushner et al., Arthritis Rheum, 1971; 14 (5): 560-570.

또한, 급성 염증성 질환의 치료에 관한 많은 참고 문헌들이 알려져 있고, 이 문헌들에서는 자가 IL-1 및/또는 TNF-α에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 IL-1 및/또는 TNF-α를 포함하는 백신을 사용하여 질환을 치료할 수 있음을 보여주었다. 이러한 참고 문헌의 대표적 예로 스위스의 Cytos Biotechnology AG에 양도된 WO 2007/039552가 있다. 골관절염과 같은 질환과는 달리 염증에 있어서의 사이토카인의 역할은 매우 분명한데, 즉, 하향 조절이 경감을 제공하고 따라서 이것이 치료에 유효하다. 상기 참고 문헌에서는, 실시예의 형태로 증거를 개시하지 않은 채, IL-1β 및 TNF-α가 이 질환에서 역할을 할 수 있기 때문에, 동일한 치료가 골관절염에도 유효할 것이라고 종종 시사하거나 심지어 명시하고 있다. 그러나, 상기에 설명한 바와 같이, 골관절염은 비염증성 질환이며, 따라서, 염증성 질환과는 완전히 다르다. IL-1β 및/또는 TNF-α와 같은 사이토카인의 역할은 아직 명확하지가 않고 모호한 부분이 있는 것으로 생각된다. 따라서, 골관절염 분야의 전문 의료인에게 있어서 이같은 참고 문헌은, 전신 투여되는 면역원성 IL-1β 및 임의적으로 면역원성 TNF-α가 골관절염의 적절한 치료를 제공할 것임을 예측하는 것은 말할 것도 없이, 면역원성 IL-1β 및/또는 TNF-α를 사용한 골관절염 치료의 합리적인 성공 기회를 예측하는 데 합당한 기반을 제공하지 못한다.In addition, many references are known regarding the treatment of acute inflammatory diseases, which include IL-1 and / or TNF-α to elicit an immune response to autologous IL-1 and / or TNF-α. It has been shown that the vaccine can be used to treat the disease. A representative example of this reference is WO 2007/039552, assigned to Cytos Biotechnology AG, Switzerland. Unlike diseases such as osteoarthritis, the role of cytokines in inflammation is very clear, that is, down regulation provides relief and thus is effective for treatment. The reference often suggests or even specifies that the same treatment will be effective for osteoarthritis, since IL-1β and TNF-α may play a role in this disease without providing evidence in the form of examples. However, as described above, osteoarthritis is a non-inflammatory disease and, therefore, is completely different from an inflammatory disease. The role of cytokines such as IL-1β and / or TNF-α is not yet clear and is believed to be vague. Thus, for medical practitioners in the art of osteoarthritis, these references should, of course, not predict that systemically administered immunogenic IL-1β and optionally immunogenic TNF-α will provide adequate treatment of osteoarthritis. It does not provide a reasonable basis for predicting the reasonable chance of success in treating osteoarthritis with 1β and / or TNF-α.

요약하면, 골관절염에 대한 입수 가능한 지식에 기초해서는, 당업자가 골관절염 치료를 위해 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α에 대한 백신을 개발하려고 하지 않는 것에는 2 가지의 중요한 이유가 있다: 첫째, 선행 기술은 골관절염에서의 사이토카인, 특히 IL-1β 및 TNF-α의 역할이 무엇인지 명확하게 교시하고 있지 않으며, 둘째, 관절 자체에서의 사이토카인의 역할을 조절하기 위해 사이토카인 길항제를 사용하는 전신적 방법은 동일한 길항제에 기초한 동소 치료법이 성공적인 것으로 입증된 경우에도 성공적이지 못한 것으로 입증되었기 때문이다. 따라서, 이것은, 매우 불이익이 될 수 있는 이들 사이토카인에 대한 전신 공격이 발생할 수 있음을 의미하기 때문에, 당업자는 현재 입수 가능한 지식에 기초해서는 골관절염 치료를 위해 자가 사이토카인 IL-1β 및/또는 TNF-α에 대한 백신을 개발할 생각은 하지 못할 것이다. 예를 들어 인터루킨-1은 미생물 감염에 대한 면역 반응에 관여하고, 골수 세포의 수를 증가시키고, (구강) 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 하고, 항당뇨병 효과를 나타내며, 임신 말기의 세포내 사건을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 사이토카인의 봉쇄는 일반적으로 바람직하지 않은 것으로 간주된다.In summary, based on the available knowledge about osteoarthritis, there are two important reasons why a person skilled in the art would not want to develop a vaccine against IL-1β and optionally TNF-α for the treatment of osteoarthritis: first, prior art Does not clearly teach the role of cytokines, especially IL-1β and TNF-α in osteoarthritis, and secondly, systemic methods of using cytokine antagonists to modulate the role of cytokines in the joints themselves This is because, even if orthotopic therapies based on the same antagonist proved successful, they proved unsuccessful. Thus, this means that systemic attacks on these cytokines, which can be very disadvantageous, may occur, and therefore those skilled in the art will, based on the knowledge currently available, autologous cytokine IL-1β and / or TNF- for the treatment of osteoarthritis. You will not think of developing a vaccine against α. For example, interleukin-1 is involved in the immune response to microbial infections, increases the number of bone marrow cells, plays an important role in (oral) wound healing, has antidiabetic effects, and prevents intracellular events at the end of pregnancy. It is known to regulate. Thus, such blockade of cytokines is generally considered undesirable.

일 실시형태에서, IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체는 치료되는 척추동물에 대해 동종성이다. 여기서 동종성이란, 상기에 정의된 이종성과는 반대의 의미로, 동일한 종으로부터 유래되었음을 의미한다. 예측과는 달리, 본 발명에서는 동일한 종으로부터 유래된 항원 사이토카인이 치료된 척추동물에서 더 높은 항체 역가를 유도한다는 것을 발견하였다.In one embodiment, the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are homologous to the vertebrate being treated. Homogeneous here means opposite to the heterogeneity defined above, originating from the same species. Contrary to prediction, the present invention has found that antigen cytokines derived from the same species induce higher antibody titers in treated vertebrates.

또 다른 실시형태에서, 척추동물에 대해 비자가인 부분은 미생물로부터 유래된 항원성 결정인자를 포함한다. 여기서 미생물(microorganism)이란, 특히 박테리아, 효모, 사상균, 원생동물, 조류(藻類), 리케차, 미생물(microbe) 또는 바이러스에 속하는 미소 또는 극미소 크기의 유기체를 의미한다. 이러한 항원성 결정인자, 즉 림프구 또는 분비된 항체 상의 항원 특이적 막 수용체에 결합하는 면역학적 활성 부위를 제공하는 에피토프를 포함시키는 것에 의해, 척추동물의 자가 사이토카인에 대한 고항체 역가를 제공할 수 있는 것으로 생각된다.In another embodiment, the non-valent portion for vertebrates comprises antigenic determinants derived from microorganisms. Herein, microorganism means, in particular, micro or micro organisms belonging to bacteria, yeast, filamentous fungi, protozoa, algae, Rickettsia, microbe or virus. By including an epitope that provides an immunologically active site that binds to these antigenic determinants, ie antigen-specific membrane receptors on lymphocytes or secreted antibodies, it is possible to provide high antibody titers to autologous cytokines in vertebrates. I think there is.

또 다른 실시형태에서, 척추동물에 대해 비자가인 부분은 면역보조제를 포함한다. 상기에 기재한 바와 같이, 면역보조제는 원칙적으로 임의의 비특이적 면역자극제일 수 있다. 면역보조제 부분은 임의의 화학적 또는 물리적 결합에 의해 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체에 연합될 수 있으며, 또는 면역보조제 부분이 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체와 기능적으로 연결되어 있는 한, 즉, 면역보조제 부분이 이러한 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체에 대한 면역 반응, 따라서, 또한, 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α의 상응하는 항원성 결정인자에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 한 다른 방식으로 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체에 연합될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 이것이 유도하는 면역학적 사건에 따라 분류될 수 있다. 특히 ISCOM(면역자극 복합체), 사포닌(또는 QuilA와 같은 그 분획 및 유도체), 수산화알루미늄, 리포솜, 코클레이트(cochleate), 폴리락트산/글리콜산을 포함하는 제1 부류는 항원 흡수, 수송 및 APC(항원 제시 세포)에 의한 항원 제시를 촉진한다. 오일 에멀션, 겔, 중합체 미소구, 비이온성 블록 공중합체 및 가장 바람직하게는 또한 수산화알루미늄을 포함하는 제2 부류는 데포 효과를 제공한다. 특히 CpG 풍부 모티프, 모노포스포릴 지질 A, 마이코박테리아(뮤라밀 디펩티드), 효모 추출물, 콜레라 독소를 포함하는 제3 부류는 보존된 미생물 구조, 소위 시그널 0으로 정의되는 병원균 관련 미생물 패턴(pathogen associated microbial pattern: PAMP)의 인식에 기초한다. 특히 오일 에멀션 표면 활성제, 수산화알루미늄, 하이폭시아(hypoxia)를 포함하는 제4 부류는 위험한 것과 유해한 것을 구별하는(자가 및 비자가와 동일할 필요는 없음) 면역계의 능력을 촉진하는 것에 기초한다. 특히 사이토카인을 포함하는 제5 부류는 APC에 대한 동시 자극 분자 시그널 2의 상향 조절에 기초한다. 면역보조제는 적절한 면역 반응을 제공하는 것을 돕는다. 따라서, 사이토카인 또는 그 유도체의 비자가 부분이 이미 자가관용성을 파괴할 수 있는 점은 덜 중요하다. 따라서, 면역보조제는 항원 선택에 더 많은 자유를 제공한다. 특히, 예를 들어 사포닌, 그 분획 및 수중유 에멀션(예를 들어, 리포솜)으로 구현되는 제1 부류로부터의 면역보조제를 사용할 때, 우수한 결과가 얻어졌다.In another embodiment, the portion that is non-visible to vertebrates includes an adjuvant. As described above, the adjuvant may in principle be any nonspecific immunostimulator. The adjuvant moiety may be associated with the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof by any chemical or physical bond, or the adjuvant moiety may be associated with the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof As long as they are functionally linked, that is, the adjuvant moiety is responsible for the immune response to such IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, and therefore also corresponding autologous IL-1β and TNF-α in vertebrates. It may be associated with IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, in another way that can stimulate an immune response against antigenic determinants. An adjuvant can generally be classified according to the immunological event it induces. In particular, the first class, including ISCOMs (immunostimulatory complexes), saponins (or their fractions and derivatives such as QuilA), aluminum hydroxide, liposomes, cochleates, polylactic acid / glycolic acid, can be used for antigen uptake, transport and APC. Promotes antigen presentation by (antigen presenting cells). A second class comprising oil emulsions, gels, polymeric microspheres, nonionic block copolymers and most preferably also aluminum hydroxide provides the depot effect. In particular, the third class, which includes CpG-rich motifs, monophosphoryl lipid A, mycobacteria (myramyl dipeptides), yeast extracts, and cholera toxins, has a pathogen associated microorganism pattern defined by a conserved microbial structure, the so-called signal 0. microbial pattern: PAMP). In particular, the fourth class, which includes oil emulsion surface active agents, aluminum hydroxide, hypoxia, is based on promoting the ability of the immune system to distinguish between dangerous and harmful (not necessarily self and non-self). The fifth class, particularly involving cytokines, is based on the upregulation of co-stimulatory molecular signal 2 for APC. Adjuvant helps to provide an appropriate immune response. Therefore, it is less important that the non-valent portion of the cytokine or derivative thereof can already destroy autotolerance. Thus, adjuvant provides more freedom in antigen selection. In particular, excellent results have been obtained when using an adjuvant from the first class, for example embodied with saponins, their fractions and oil-in-water emulsions (eg liposomes).

또 다른 실시형태에서, IL-1β 및 TNF-α 사이토카인 또는 그 유도체는 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인와 비교하여 감소된 생물학적 활성을 갖는다. 감소된 생물학적 활성, 즉, 살아있는 동물 또는 그 조직에 대한 물질의 감소된 효과는 백신 투여시 급성 부작용의 위험을 줄인다. 사이토카인의 생물학적 활성이 감소되지 않을 경우, 구토, 쇼크, 배앓이 등과 같은 급성 부작용이 발생할 수 있다. 생물학적 활성의 감소는 박테리아 독소를 변성독소로 전환하는 데 사용되는 것과 유사한 화학적 포름알데히드 치료 등의 다양한 사이토카인 불활성화법에 의해 얻을 수 있다. 이러한 방법은 백신 기술 분야에 일반적으로 알려져 있다. 대안적 방법으로, 감소된 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 사이토카인을 제조할 수 있다. 이 역시 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 감소된 생물학적 활성을 갖는 사이토카인을 (실질적인 생물학적 활성이 남아 있더라도) 생물학적 불활성 사이토카인이라고 칭하기도 한다.In another embodiment, the IL-1β and TNF-α cytokines or derivatives thereof have reduced biological activity compared to autologous IL-1β and TNF-α cytokines in vertebrates. Reduced biological activity, ie the reduced effect of the substance on living animals or their tissues, reduces the risk of acute side effects when administering the vaccine. If the biological activity of the cytokine is not reduced, acute side effects, such as vomiting, shock, and stomach ache, can occur. Reduction of biological activity can be achieved by various cytokine inactivation methods, such as chemical formaldehyde treatment similar to those used to convert bacterial toxins into denaturing toxins. Such methods are generally known in the vaccine art. Alternatively, mutant cytokines with reduced biological activity can be prepared. This is also commonly known in the art. Cytokines with reduced biological activity are sometimes referred to as biologically inactive cytokines (although substantial biological activity remains).

본 발명은 또한 척추동물의 골관절염 치료를 위한 백신을 제조하기 위한 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인의 용도 및 치료법 그 자체에 관한 것이다. 백신은 백신 기술 분야에서 사용되는 임의의 통상적인 경로에 의해, 특히 근육내 경로, 피하 경로, 피내 경로 또는 점막하 경로에 의해, 또는 예를 들어 주사 가능한 현탁액의 형태로 정맥내 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 단일 용량으로 또는 일정한 간격을 두어 1회 이상 반복 투여되는 용량으로 실시될 수 있다. 적절한 용량은 특히 치료 대상 개체의 체중에 따라 달라질 수 있다.The present invention also relates to the use of IL-1β and optionally TNF-α cytokines for the manufacture of vaccines for the treatment of osteoarthritis in vertebrates and to the therapy itself. The vaccine can be administered by any conventional route used in the vaccine art, in particular by intramuscular route, subcutaneous route, intradermal route or submucosal route, or by intravenous route, for example in the form of injectable suspensions. have. Administration can be in a single dose or in doses repeated one or more times at regular intervals. Appropriate doses may depend, in particular, on the weight of the subject being treated.

이하, 본 발명을 하기 실시예와 관련하여 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples.

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

A. 개에서의 자가 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체의 유도A. Induction of antibodies to autologous IL-1β and TNF-α in dogs

재조합 개(Ca) 및 말(Eq) 단백질:Recombinant Canine (Ca) and Equine (Eq) Proteins:

각각 개 또는 말의 혈액으로부터 추출한 말초혈 림프구(PBL)로부터의 단리된 RNA를 사용한 표준 분자생물학 기법을 이용하여 CaIL-1β, CaTNF-α, EqIL-1β 및 EqTNF-α를 클로닝하였다. Ca 분자의 3' 말단을 개 디스템퍼(Distemper) 바이러스 융합 단백질(CDV-F)의 유래의 최소(17 aa) T 세포 에피토프에 유전적으로 융합시켰다[Ghosh et al. (2001) Immunology 104 pp. 58-66]. IL-1β 및 TNF-α를 코딩하는 cDNA 단편을, (정제를 위해) 5' 말단이 His 태그와 프레임 내에 있도록 pET 벡터로 최종적으로 결찰시켰다. 말 IL-1β 및 TNF-α에는 CDV 태그를 결찰시키지 않았다. 모든 단백질을 이. 콜라이(E. coli)에 의해 발현시키고, His 태그로 정제하고, LPS 함량을 조사하였다. 항원으로서 사용된 단백질은 모두 LPS 함량이 20 U/ml 미만이었다. 서열 번호 1은 최소 CDV-F 태깅 CaIL-1β에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 CDV F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)을 나타낸다. 서열 번호 2는 최소 CDV-F 태깅 CaIL-1β 단백질 자체를 나타낸다. 서열 번호 3은 최소 CDV-F 태깅 CaTNFα에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 CDV F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타낸다. 서열 번호 4는 최소 CDV-F 태깅 CaTNFα 단백질 자체를 나타낸다. 서열 번호 5는 말 IL-1β에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타낸다. 서열 번호 6은 말 IL-1β 단백질 자체를 나타낸다. 서열 번호 7은 말 TNFα에 대한 DNA를 나타낸다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타낸다. 서열 번호 8은 말 TNFα 단백질 자체를 나타낸다.CaIL-1β, CaTNF-α, EqIL-1β and EqTNF-α were cloned using standard molecular biology techniques using isolated RNA from peripheral blood lymphocytes (PBL) extracted from dog or horse blood, respectively. The 3 'end of the Ca molecule was genetically fused to a minimal (17 aa) T cell epitope from the dog Distemper virus fusion protein (CDV-F) [Ghosh et al. (2001) Immunology 104 pp. 58-66]. CDNA fragments encoding IL-1β and TNF-α were finally ligated with the pET vector so that the 5 ′ end (in purification) was in frame with His tag. Equine IL-1β and TNF-α were not ligated with CDV tags. This is all protein. Expressed by E. coli , purified with His tag, and LPS content was investigated. All of the proteins used as antigens had an LPS content of less than 20 U / ml. SEQ ID NO: 1 shows DNA for minimal CDV-F tagged CaIL-1β. Nucleotides 1 to 75 represent His tags and nucleotides 532 to 585 represent CDV F epitopes (17 amino acids + termination codon). SEQ ID NO: 2 shows the minimal CDV-F tagged CaIL-1β protein itself. SEQ ID 3 shows the DNA for the minimal CDV-F tagged CaTNFα. Nucleotides 1 to 63 represent His tags and nucleotides 535 to 588 represent CDV F epitopes (17 amino acids + termination codon). SEQ ID NO: 4 shows the minimal CDV-F tagged CaTNFα protein itself. SEQ ID NO: 5 shows DNA for equine IL-1β. Nucleotides 1 to 63 represent His tags. SEQ ID NO: 6 shows the equine IL-1β protein itself. SEQ ID NO: 7 shows DNA for equine TNFα. Nucleotides 1 to 63 represent His tags. SEQ ID NO: 8 shows the equine TNFα protein itself.

가능한 전신 유해 반응을 방지하기 위해, 부위 지정 돌연변이 유발법을 이용하여, 상기 단락에서 언급된 이러한 야생형 분자 다음에 일련의 생물학적 불활성 돌연변이체(mt) 분자를 생성하였다(주: 본 명세서에서, 생물학적 활성의 야생형 분자를 "wt"로 언급하거나 이것으로 표시하기도 하고, 생물학적 불활성 또는 생물학적 활성이 "적은" 돌연변이체 분자를 "mt"로 언급하거나 이것으로 표시하기도 하며, 이러한 언급 또는 표시가 없을 경우 야생형 형태임을 의미함). 이러한 돌연변이체를 개 디스템퍼 바이러스 융합 단백질(CDV-F)[Ghosh et al. (2001) Immunology 104 pp. 58-66] 유래의 최소(17 aa) 또는 최대(32 aa) T 세포 에피토프의 3' 말단 및 개 파보 바이러스(CPV)[Rimmelzwaan et al. (1990) J. Gen. Virology 71 pp. 2321-2329] 유래의 최대(35 aa) T 세포 에피토프의 5' 말단(His 태그 뒤)에 유전자 조작으로 융합시켰다. 돌연변이 부위는 인간 IL-1β 및 TNF-α에 대한 입수 가능한 과학 문헌에 기초하여 선택하였다: IL-1β 점 돌연변이에 대해서는 문헌[Simon et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, pp. 9771-9779]; 및 문헌[Evans et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, pp. 11477-11483], TNF-α 점 돌연변이에 대해서는 문헌[Zhang et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, pp. 24069-24075] 참조. 1개 TNF-α 돌연변이체(12번 돌연변이체 12번, 하기 참조)는 자발적 돌연변이와 조합된 특정 점 돌연변이의 유도체이다. 모든 단백질을 이. 콜라이에 의해 발현시키고, His 태그로 정제하고, LPS 함량을 조사하였다. 항원으로서 사용된 테스트 단백질은 모두 LPS 함량이 20 U/ml 미만이었다. 18종의 생물학적 불활성 돌연변이체를 제조하였다. 이러한 돌연변이체를 코딩하는 DNA를 이하에 기재한다.In order to prevent possible systemic adverse reactions, site directed mutagenesis was used to generate a series of biologically inactive mutant (mt) molecules following these wild-type molecules mentioned in the paragraph above (Note: herein, biological activity The wild type molecule of may be referred to or denoted as "wt", and the biologically inactive or biologically active "little" mutant molecule may be referred to or denoted as "mt", and in the absence of such reference or indication, the wild type form Means that). Such mutants are described in dog distemper virus fusion protein (CDV-F) [Ghosh et al. (2001) Immunology 104 pp. 58-66] 3 'terminus of a minimum (17 aa) or maximum (32 aa) T cell epitope and canine parvovirus (CPV) from Rimmelzwaan et al. (1990) J. Gen. Virology 71 pp. 2321-2329] genetically fused to the 5 'end of the maximum (35 aa) T cell epitope from the back (His tag). Mutation sites were selected based on the available scientific literature on human IL-1β and TNF-α: For IL-1β point mutations, see Simon et al. (1993) J. Biol. Chem. 268, pp. 9771-9779; And Evans et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, pp. 11477-11483, for TNF-α point mutations in Zhang et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, pp. 24069-24075. One TNF-α mutant (mutant 12, see below) is a derivative of a specific point mutation in combination with a spontaneous mutation. This is all protein. Expressed by E. coli, purified with His tag, and LPS content was examined. All test proteins used as antigens had an LPS content of less than 20 U / ml. 18 biologically inactive mutants were prepared. DNA encoding such a mutant is described below.

1번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 H30G CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 이 DNA의 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 163C>G 및 164A>G는 H30G 돌연변이를 나타낸다.Mutant 1 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged H30G CaIL-1β mutant. Nucleotides 1-75 of this DNA represent His tags, nucleotides 532-585 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + stop codon), and nucleotides 163C> G and 164A> G represent H30G mutations.

2번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 K92G CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼72는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 529∼582는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 346A>G 및 347A>G는 K92G 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 2 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged K92G CaIL-1β mutant. Nucleotides 1-72 represent His tags, nucleotides 529-582 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + stop codon), and nucleotides 346A> G and 347A> G represent K92G mutations.

3번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 H30G + K92G CaIL-1β 이중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 163C>G 및 164A>G는 H30G 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 349A>G 및 350A>G는 K92G 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 3 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged H30G + K92G CaIL-1β double mutant. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 532-585 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), nucleotides 163C> G and 164A> G represent H30G mutations, nucleotides 349A> G and 350A> G represents the K92G mutation.

4번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 C7S CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 98G>C는 C7S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 4 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged C7S CaIL-1β mutant. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 532-585 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), and nucleotides 98G> C represent C7S mutations.

5번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 K8E CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 100A>G 및 102G>A는 K8E 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 5 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged K8E CaIL-1β mutant. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 532-585 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), and nucleotides 100A> G and 102G> A represent K8E mutations.

6번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 L9S CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 104T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 6 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged L9S CaIL-1β mutant. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 532-585 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), and nucleotides 104T> C represent L9S mutations.

7번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 C7S + K8E + L9S CaIL-1β 삼중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 532∼585는 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 98G>C는 C7S 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 100A>G 및 102G>A는 K8E 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 104T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 7 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged C7S + K8E + L9S CaIL-1β triple mutant. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 532-585 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), nucleotides 98G> C represent C7S mutations, and nucleotides 100A> G and 102G> A K8E mutation, and nucleotides 104T> C represent L9S mutation.

8번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 C7S CaIL- 1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 194G>C는 C7S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 8 is encoded by DNA for maximal CPV and CDV-F tagged C7S CaIL-1β mutants. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 76-171 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 628-726 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 194G> C represents a C7S mutation.

9번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 K8E CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 196A>G 및 198G>A는 K8E 돌연변이를 나타낸다.Mutant 9 is encoded by the DNA for a maximal CPV and CDV-F tagged K8E CaIL-1β mutant. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 76-171 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 628-726 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 196A> G and 198G> A represent K8E mutations.

10번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 L9S CaIL-1β 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼75는 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 200T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 10 is encoded by DNA for maximal CPV and CDV-F tagged L9S CaIL-1β mutants. Nucleotides 1-75 represent His tags, nucleotides 76-171 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 628-726 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 200T> C represents an L9S mutation.

11번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 C7S + K8E + L9S CaIL-1β 삼중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼76은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 628∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 194G>C는 C7S 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 196A>G 및 198G>A는 K8E 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 200T>C는 L9S 돌연변이를 나타낸다.Mutant 11 is encoded by DNA for maximal CPV and CDV-F tagged C7S + K8E + L9S CaIL-1β triple mutants. Nucleotides 1-76 represent His tags, nucleotides 76-171 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 628-726 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 194G> C represents the C7S mutation, nucleotides 196A> G and 198G> A represent the K8E mutation, and nucleotides 200T> C represent the L9S mutation.

12번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 K8D + L9S + Q10del CaIL-1β 삼중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼76은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 76∼171은 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 625∼723은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 196A>G 및 198G>T는 K8D 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 200T>C는 L9S 돌연변이를 나타내고, 야생형 서열에 비해 10번 아미노산이 결실되었다(Q10del).Mutant No. 12 is encoded by DNA for maximal CPV and CDV-F tagged K8D + L9S + Q10del CaIL-1β triple mutants. Nucleotides 1-76 represent His tags, nucleotides 76-171 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 625-723 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 196A> G and 198G> T represent K8D mutations, nucleotide 200T> C represents L9S mutations, and 10 amino acids were deleted (Q10del) relative to the wild type sequence.

13번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 Y87S CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 323A>C는 Y87S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 13 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged Y87S CaTNF-α mutant. Nucleotides 1-63 represent His tags, nucleotides 535-588 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + stop codon), and nucleotides 323A> C represent Y87S mutations.

14번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 Y119N CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 418T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 14 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged Y119N CaTNF-α mutant. Nucleotides 1-63 represent His tags, nucleotides 535-588 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), and nucleotides 418T> A represent Y119N mutations.

15번 돌연변이체는 최소 CDV-F 태깅 Y87S + Y119N CaTNF-α 이중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 535∼588은 최소 CDV-F 에피토프(17개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내며, 뉴클레오티드 323A>C는 Y87S 돌연변이를 나타내고, 뉴클레오티드 418T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 15 is encoded by the DNA for a minimal CDV-F tagged Y87S + Y119N CaTNF-α double mutant. Nucleotides 1 to 63 represent His tags, nucleotides 535 to 588 represent minimal CDV-F epitopes (17 amino acids + termination codon), nucleotides 323A> C represent Y87S mutations, and nucleotides 418T> A represent Y119N mutations. .

16번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 Y87S CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 64∼159는 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 631∼729는 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 419A>C는 Y87S 돌연변이를 나타낸다.Mutant No 16 is encoded by the DNA for maximal CPV and CDV-F tagged Y87S CaTNF-α mutants. Nucleotides 1-63 represent His tags, nucleotides 64-159 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 631-729 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 419A> C represents Y87S mutation.

17번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 Y119N CaTNF-α 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 64∼159는 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 631∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 514T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.Mutant 17 is encoded by DNA for maximal CPV and CDV-F tagged Y119N CaTNF-α mutants. Nucleotides 1-63 represent His tags, nucleotides 64-159 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 631-726 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotide 514T> A represents the Y119N mutation.

18번 돌연변이체는 최대 CPV 및 CDV-F 태깅 Y87S + Y119N CaTNF-α 이중 돌연변이체에 대한 DNA에 의해 코딩된다. 뉴클레오티드 1∼63은 His 태그를 나타내고, 뉴클레오티드 64∼159는 최대 CPV 에피토프(32개 아미노산)를 나타내며, 뉴클레오티드 631∼726은 최대 CDV-F 에피토프(32개 아미노산 + 종결 코돈)를 나타내고, 뉴클레오티드 419A>C는 Y87S 돌연변이를 나타내며, 뉴클레오티드 514T>A는 Y119N 돌연변이를 나타낸다.Mutant 18 is encoded by DNA for a maximum CPV and CDV-F tagged Y87S + Y119N CaTNF-α double mutant. Nucleotides 1-63 represent His tags, nucleotides 64-159 represent maximum CPV epitopes (32 amino acids), nucleotides 631-726 represent maximum CDV-F epitopes (32 amino acids + termination codon), and nucleotides 419A> C represents Y87S mutation and nucleotide 514T> A represents Y119N mutation.

백신 보조제:Vaccine Supplements:

사용된 보조제는 QuilA(0.01 M 인산염 완충 식염수(PBS로 약칭함) 중 250 ㎍/ml, "식염수"라 칭하기도 함), 매트릭스 C(0.01 M PBS 중 125 ㎍/ml) 및 마이크로솔(25% 수중유 에멀션)이다. QuilA는 남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)(장미과)의 나무껍질로부터 분리된 잘 알려진 사포니 보조제이다. 이것은 덴마크 칼브헤이브 소재의 Biolang 또는 독일 칼스루에 소재의 Roth로부터 입수할 수 있다. 매트릭스 C(면역자극 복합체 또는 ISCOM)는 사포닌, 콜레스테롤 및 인지질(포스파티딜콜린)을 함유하는 백신 보조제로서, 일반적으로 직경 40 nm의 케이지형 구조를 형성한다. 이것은 오스트레일리아 멜버른 소재의 CSL 또는 스웨덴 웁살라 소재의 Isconova로부터 입수할 수 있다. 마이크로솔은, Acros Organics로부터 입수 가능한, 1% Tween 80 계면활성제(폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레에이트)를 사용하여 안정화시킨, 수중 작은(일반적으로 1 ㎛ 이하) 미네랄 오일 소적(ExxonMobil의 Marcol 52)으로 이루어진 수중유 에멀션이다.Adjuvants used were QuilA (250 μg / ml in 0.01 M phosphate buffered saline (abbreviated PBS), also referred to as “saline”), matrix C (125 μg / ml in 0.01 M PBS) and microsol (25% Oil-in-water emulsion). QuilA is a well-known sapony supplement isolated from the bark of South American tree Quillaja saponaria Molina (rose). It is available from Biolang, Kalbehave, Denmark or Roth, Kalsruhe, Germany. Matrix C (immunostimulatory complex or ISCOM) is a vaccine adjuvant containing saponin, cholesterol and phospholipids (phosphatidylcholine) and generally forms a cage-like structure with a diameter of 40 nm. This is available from CSL, Melbourne, Australia or Isconova, Uppsala, Sweden. Microsols are small (usually 1 μm or less) mineral oil droplets (ExxonMobil) in water, stabilized using 1% Tween 80 surfactant (polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate), available from Acros Organics. It is an oil-in-water emulsion consisting of Marcol 52).

실험 계획:Experiment plan:

생물학적 활성(wt) 사이토카인 "단독" 실험의 경우, 그 계획은 다음과 같다. 약 4월령의 일반 품종 비글견으로 구성된 5개 그룹에 하기 표 1에 기재된 제제 1.0 ml를 오른쪽 옆구리로 피하 주사하여 백신접종하였다.For a biologically active (wt) cytokine "alone" experiment, the scheme is as follows. Five groups of general breed beagle dogs of about 4 months of age were vaccinated by subcutaneous injection of 1.0 ml of the formulation shown in Table 1 into the right flank.

1차 백신접종 후 4주, 8주, 20주 및 24주째 개에게 1.0 ml를 (오른쪽 옆구리에 피하 주사로) 추가 접종하였다. 1차 백신접종 후 T = 0주, 3주, 6주, 9주, 12주, 16주, 20주, 24주, 28주, 32주 및 36주째 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청은 항원 특이적 ELISA를 이용하여 CaIL-1β 및 CaTNF-α에 대한 항체 수치를 측정하기 위해(1); 웨스턴 블롯 분석을 위해(2); 중화 항체를 확인하기 위해(3) 사용하였다.Dogs at 4, 8, 20 and 24 weeks post primary vaccination were further inoculated with 1.0 ml (by subcutaneous injection to the right flank). Blood samples were collected at T = 0, 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24, 28, 32 and 36 weeks after the first vaccination. Serum was assayed to determine antibody levels against CaIL-1β and CaTNF-α using antigen specific ELISA (1); For western blot analysis (2); (3) was used to identify neutralizing antibodies.

혼합 생물학적 활성(wt)/생물학적 불활성(mt) 사이토카인 실험의 경우, 그 계획은 다음과 같다. 15∼18 주령의 일반 품종 비글견으로 구성된 6개 그룹에 하기 표 1A에 기재된 제제 1.0 ml를 오른쪽 옆구리에 피하 주사하여 백신접종하였다. 이 실험에서는, 1개의 돌연변이체 CaIL-1β 단백질(4번 돌연변이체: 최소 CDV-F 태깅 C7S CaIL-1β 돌연변이체) 및 1개의 돌연변이체 CaTNF-α 단백질(13번 돌연변이체: 최소 CDV-F 태깅 Y87S CaTNF-α 돌연변이체)를 단일 단백질 항원으로서 또는 조합물로 테스트하였다.For mixed biologically active (wt) / biologically inactive (mt) cytokine experiments, the scheme is as follows. Six groups of 15-18 week-old general breed beagle dogs were vaccinated with subcutaneous injection of 1.0 ml of the formulation shown in Table 1A below in the right flank. In this experiment, one mutant CaIL-1β protein (mutant 4: minimal CDV-F tagging) and one mutant CaTNF-α protein (mutant 13: minimal CDV-F tagging) Y87S CaTNF-α mutant) was tested as a single protein antigen or in combination.

1차 백신접종 후 4주, 8주, 11주, 14주 및 16주째 개에게 1.0 ml를 (오른쪽 옆구리에 피하 주사로) 추가 접종하였다. 1차 백신접종 후 T = 0주, 4주, 8주, 11주, 14주, 16주 및 17주째 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청은 항원 특이적 ELISA(샌드위치 포획법)를 이용하여 CaIL-1β 및 CaTNF-α에 대한 항체 수치를 측정하는 데 사용하였다.Dogs at 4, 8, 11, 14 and 16 weeks post primary vaccination were further inoculated with 1.0 ml (subcutaneously in the right flank). Blood samples were collected at T = 0, 4, 8, 11, 14, 16 and 17 weeks after the first vaccination. Serum was used to measure antibody levels against CaIL-1β and CaTNF-α using antigen specific ELISA (sandwich capture method).

ELISA 및 웨스턴 블롯 분석:ELISA and Western Blot Analysis:

표준 절차를 이용하여 ELISA 분석을 수행하였다. 이를 위해, 포획성 다클론 염소 항개 IL-1β 및 포획성 단일클론 마우스 항개 TNF-α 항체를 사용하여 96웰 미량적정 플레이트를 코팅하였다. 그 후, C 말단 His(C-His)-태깅 CaIL-1β 또는 C-His-태깅 CaTNF-α를 플레이트에 첨가한 후, 개 혈청을 계열 희석액을 조제하였다. 다클론 토끼 항개 IgG(H+L) HRP 표지 항체를 사용하여 항IL-1β 또는 항TNF-α 특이적 항체의 결합을 검출하였다.ELISA analysis was performed using standard procedures. To this end, 96-well microtiter plates were coated with capturing polyclonal goat anti-IL-1β and capturing monoclonal mouse anti-TNF-α antibodies. Thereafter, C-term His (C-His) -tagged CaIL-1β or C-His-tagged CaTNF-α was added to the plate, and then the dog serum was prepared with serial dilutions. Polyclonal rabbit anti-dog IgG (H + L) HRP labeled antibodies were used to detect binding of anti-IL-1β or anti-TNF-α specific antibodies.

IL-1β 및 TNF-α의 억제에 대한 생물학적 분석:Biological Assays for Inhibition of IL-1β and TNF-α:

억제를 측정하기 위해 IL-1β 및 TNF-α 반응성 NIH-3T3 NFκB 루시퍼라제 리포터 세포주를 사용하였다. 여러 시점으로부터 얻은 혼주(pooled) 개 혈청을 10 ng/ml의 Ca 및 Eq IL-1β 및 TNF-α 단백질과 함께 사전 항온처리하고, 중화(즉, 수용체 결합) 활성의 억제에 대해 테스트하였다. 항체에 의한 IL-1β 또는 TNF-α 활성의 억제는 상대 광 단위(Relative Light Unit: RLU)로 정량하였다.IL-1β and TNF-α reactive NIH-3T3 NFκB luciferase reporter cell lines were used to measure inhibition. Pooled dog serum from several time points was pre-incubated with 10 ng / ml of Ca and Eq IL-1β and TNF-α proteins and tested for inhibition of neutralization (ie receptor binding) activity. Inhibition of IL-1β or TNF-α activity by antibodies was quantified in Relative Light Units (RLU).

B. 비글견에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축B. Construction of Urate Crystal-Induced Osteoarthritis Model in Beagle Dogs

실험 계획: 본 발명자들은 요산염(urate) 결정 유도성 골관절염 모델을 사용하였다(특히, 문헌[Bonneau et al; Revue Med. Vet., 2005, 156, 4, 179-181] 참조). 일반 품종의 비글견(약 5월령) 4 마리로 구성된 2개 그룹에 0.9% NaCl 1.0 ml(대조군)(대조 그룹) 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml의 요산염 결정 1.0 ml(골관절염 모델 그룹)을 한쪽 무릎 관절(뒷다리)에 관절내 주사하였다. 용액 1.0 ml의 관절내 주사는 전신 마취 하에 행하였다. 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 30 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 각각의 개별 개에 대해 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 실험 종료시 개를 안락사시키고 병리학자 참석 하에 무릎을 육안으로 관찰하였다. Experiment plan: We used a urate crystal-induced osteoarthritis model (see, in particular, Bonnau et al; Revue Med. Vet., 2005, 156, 4, 179-181). Two groups of 4 beagle dogs (approximately 5 months old) of the general breed were divided into 1.0 ml of 0.9% NaCl (control) (control group) or 1.0 ml of 10 mg / ml urate crystals in 0.9% NaCl (osteoarthritis model group). Was injected intraarticularly in one knee joint (hind leg). Intra-articular injection of 1.0 ml of solution was performed under general anesthesia. General behavior, lameness (standing and standing) for each individual dog at T = 0 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours after injection Scoring by walking), palpation pain and knee joint effusion (swelling). At the end of the experiment, the dogs were euthanized and their knees were visually observed with a pathologist.

요산염 결정: 0.9% NaCl 용액 중 10 mg/ml의 요산염 결정(Sigma 물품 번호 U2875; 뱃치 번호 120K5305)을 관절내 주사에 사용하였다. 이를 위해, 50 mg/g 농도의 0.9% NaCl 중 22 g의 요산염 결정 용액을 제조하였다. 이 용액을 50 ㎛ 이하의 입자(현미경 관찰)를 갖는 현탁액이 얻어질 때까지 음파 처리(sonify)하였다. 현미경 이미지로 입자 크기가 50 ㎛ 이하임을 확인한 후, 현탁액 20 g을 0.9% NaCl로 100 g으로 희석시켰다(최종 농도 10 mg/ml). pH를 pH 7.0으로 조정하고, 현탁액을 고압 멸균처리하였다. 또한, 고압 멸균처리 직전과 후에 현탁액의 현미경 이미지로 결정 크기(50 ㎛ 이하여야 함)를 조사하였다. 제조 후 후속 사용시까지 현탁액을 2∼8℃에 보관하였다. Urate Crystals: 10 mg / ml urate crystals (Sigma Article No. U2875; Batch No. 120K5305) in 0.9% NaCl solution were used for intraarticular injection. To this end, a 22 g solution of urate crystals in 0.9% NaCl at a concentration of 50 mg / g was prepared. This solution was sonicated until a suspension with particles of up to 50 μm (microscopic observation) was obtained. After microscopic image confirmed that the particle size was 50 μm or less, 20 g of the suspension was diluted to 100 g with 0.9% NaCl (final concentration 10 mg / ml). The pH was adjusted to pH 7.0 and the suspension was autoclaved. In addition, the crystal size (should be 50 μm or less) was examined by microscopic images of the suspension immediately before and after autoclaving. The suspension was stored at 2-8 ° C. until preparation and subsequent use.

식별: 개들의 귀에 개별적으로 번호를 매겼다(문신하였다). discrimination: Dogs' ears were individually numbered (tattooed).

사육: 개들을 자연적인 비제한 환경 하에 표준 개집에서 개별적으로 사육하였고, 야외 운동 기회를 주었으며, 물은 무제한 공급하였다. 사료는 일정량만 공급하였다. breed: Dogs were bred individually in standard kennels under natural, unrestricted conditions, provided outdoor sports opportunities, and an unlimited supply of water. Feed was given only a certain amount.

0.9% NaCl의 주사: 그룹 1(대조 그룹)의 동물 4 마리에 전신 마취 하에 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 왼쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 1.0 ml를 관절내 주사하였다. Injection of 0.9% NaCl: Four animals in group 1 (control) were injected intraarticularly with 1.0 ml of 0.9% NaCl into one knee joint (haired left hind leg) under general anesthesia.

요산염 결정의 주사: 그룹 2(골관절염 모델 그룹)의 동물 4 마리에 전신 마취 하에 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 왼쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 1.0 ml를 관절내 주사하였다. Injection of urate crystals: Four animals in group 2 (osteoarthritis model group) were injected intraarticularly with 1.0 ml of 10 mg / ml urate crystals in 0.9% NaCl to one knee joint (haired left hind limb) under general anesthesia.

실험 절차 및 파라미터Experimental procedure and parameters

관찰: 각각의 개별 개에 대해 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 3O 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 먼저 개집 안에서의 개를 관찰하여 점수를 매기고, 그 후 관찰대 위에서 걷기, 마지막으로 서있기를 관찰하여 점수를 매겼다. observe: For each individual dog general behavior, lameness (standing and standing at T = 0 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 24 hours, 3O hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours after injection) Scoring by walking), palpation pain and knee joint effusion (swelling). The dog was first scored by observing the dog in the kennel, then walked on the observation platform and finally scored by observing standing.

파행 점수 채점:Strike score scoring:

서있기 점수Standing score

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 서있음.0: Standing normally under full weight load.

1: 부분 체중 부하 상태의 비정상적인 자세.1: Abnormal position with partial weight load.

2: 체중 비부하 상태의 비정상적인 자세(세 다리만 사용하는 개).2: Abnormal posture with no weight (three legged dog).

3: 서려고 하지 않음.3: Do not stand.

걷기 점수Walking score

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 걸음.0: Walk normally with full weight load.

1: 부분 체중 부하 상태로 약간 절뚝거림.1: slightly limping with partial weight load.

2: 간헐적 부분 체중 부하 상태로 눈에 띄게 절뚝거림.2: Notably limping with intermittent partial weight load.

3: 체중 비부하 상태(세 다리만 사용하는 개).3: No-weight body weight (three legged dog).

4: 걸으려고 하지 않음.4: Do not try to walk.

빨리 걷기 점수Fast walking score

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 빨리 걸음.0: Fast walking normally with full weight load.

1: 부분 체중 부하 상태로 약간 절뚝거림.1: slightly limping with partial weight load.

2: 간헐적 부분 체중 부하 상태로 눈에 띄게 절뚝거림.2: Notably limping with intermittent partial weight load.

3: 체중 비부하 상태(세 다리만 사용하는 개).3: No-weight body weight (three legged dog).

4: 빨리 걸으려고 하지 않음.4: Do not try to walk fast.

촉진시 통증 점수:Pain Points During Palpation:

0: 통증 징후 없음.0: No pain signs.

1: 경도 내지 중등도의 통증(촉진은 허용했으나 머리를 돌리거나 끌거나 하지는 못하게 하며, 소리를 내고, 의기소침함).1: Mild to moderate pain (allowing palpation but not turning or dragging the head, making a sound, and being depressed).

2: 중도의 통증(관찰자의 관절 촉진을 허용하지 않음).2: moderate pain (does not allow observer palpation).

주사하지 않은 관절 점수와 비교한 무릎 관절 삼출(종창):Knee joint effusion (swelling) compared to non-injected joint score:

0: 관절 삼출 없음(촉진할 수 있는 슬개 인대가 뚜렷함).0: no joint bleeding (the patellar ligament is palpable).

1: 경도의 삼출(인대를 감지할 수 있으며 극소량의 활액이 참).1: Mild exudation (can detect ligaments and very little synovial fluid is true).

2: 중등도의 삼출(인대가 뚜렷하지 않으며 현저히 활액이 참).2: moderate exudation (no ligament is pronounced, markedly true synovial fluid).

3: 중도의 삼출(인대를 촉진할 수 없음).3: moderate exudation (cannot promote ligament).

C. 셰틀랜드 포니에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축Construction of Urate Crystal Induced Osteoarthritis Model in C. Shetland Pony

실험 계획: 본 발명자들은 포니를 대상으로 구축한 동일한 골관절염 모델을 사용하였다. 일반 품종의 셰틀랜드 포니(약 12 월령) 2 마리로 구성된 2개 그룹에 0.9% NaCl 5.0 ml(대조 그룹) 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 5.0 ml(골관절염 모델 그룹)를 한쪽 무릎 관절(오른쪽 뒷다리)에 관절내 주사하였다. 약간의 진정제를 사용하여 용액 5.0 ml의 관절내 주사를 행하였다. 각각의 개별 포니에 대해 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 30 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 실험 종료시, 포니를 안락사시키고, 병리학자가 무릎을 육안으로 관찰하였다. Experiment plan: We used the same osteoarthritis model built on pony. Two groups of two common shetland pony (approximately 12 months of age) were placed on either knee with 5.0 ml of 0.9% NaCl (control group) or 5.0 ml of 10 mg / ml urate crystals (group of osteoarthritis model group) in 0.9% NaCl. Intra-articular injection was made in the joint (right hind limb). A slight sedative was used for intraarticular injection of 5.0 ml of the solution. For each individual pony, general behavior, lameness (standing and standing at T = 0 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 24 hours, 30 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours after injection) Scoring by walking), palpation pain and knee joint effusion (swelling). At the end of the experiment, the pony was euthanized and the pathologist observed the knee visually.

요산염 결정: 섹션 B 참조. Urate Crystals: See section B.

식별: 셰틀랜드 포니는 이식된 칩 및 번호가 매겨진 목벨트로 식별하였다. Identification: Shetland Pony was identified by implanted chips and numbered neck belts.

사육: 포니를 자연적인 비제한 환경 하에 통상적인 마구간에서 개별적으로 사육하였고, 건초와 물은 무제한 공급하였으며, 사료는 일정량만 공급하였다. Breeding: The ponies were bred individually in normal stalls under natural unrestricted conditions, with unlimited feed of hay and water, and only for a certain amount of feed.

0.9% NaCl의 주사: 그룹 1(대조 그룹)의 동물 2 마리에 약간의 진정제를 사용하여 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 오른쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 5.0 ml를 관절내 주사하였다. Injection of 0.9% NaCl: 5.0 ml of 0.9% NaCl was intraarticularly injected into one knee joint (hairy right hind leg) with a slight sedative in two animals of Group 1 (control).

요산염 결정의 주사: 그룹 2(골관절염 모델 그룹)의 동물 2 마리에 약간의 진정제를 사용하여 한쪽 무릎 관절(털을 깎은 오른쪽 뒷다리)에 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 5.0 ml를 관절내 주사하였다. Injection of urate crystals: 5.0 ml of 10 mg / ml urate crystals in 0.9% NaCl into one knee joint (hairy right hind leg) with a slight sedative in two animals of group 2 (osteoarthritis model group) My injection

실험 절차 및 파라미터Experimental procedure and parameters

관찰: 각각의 개별 포니에 대해 주사 후 T = 0 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 3O 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. observe: For each individual pony, general behavior, lameness (standing and standing at T = 0 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 24 hours, 3O hours, 48 hours, 72 hours, and 96 hours after injection) Scoring by walking), palpation pain and knee joint effusion (swelling).

먼저 마구간 안에서의 포니를 관찰하여 점수를 매기고, 그 후 회랑에서의 걷기를 관찰하여 점수를 매겼다.First, scored by observing the pony in the stable, and then by walking in the corridor.

파행 점수 채점:Strike score scoring:

서있기 점수Standing score

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 서있음.0: Standing normally under full weight load.

1: 부분 체중 부하 상태의 비정상적인 자세.1: Abnormal position with partial weight load.

2: 체중 비부하 상태의 비정상적인 자세(세 다리만 사용하는 포니).2: Abnormal posture with no weight (three legged pony).

3: 서려고 하지 않음.3: Do not stand.

걷기 점수Walking score

0: 완전 체중 부하 상태로 정상적으로 걸음.0: Walk normally with full weight load.

1: 부분 체중 상태로 약간 절뚝거림.1: slightly limping with partial weight.

2: 간헐적 체중 부하 상태로 눈에 띄게 절뚝거림.2: Notably limping with intermittent weight load.

3: 체중 비부하 상태(세 다리만 사용하는 포니).3: No-load weight (pony using only three legs).

4: 걸으려고 하지 않음.4: Do not try to walk.

촉진시 통증 점수:Pain Points During Palpation:

0: 통증 징후 없음.0: No pain signs.

1: 경도 내지 중등도의 통증(촉진은 허용했으나 머리를 돌리거나 끌거나 하지는 못하게 하며, 소리를 내고, 의기소침함).1: Mild to moderate pain (allowing palpation but not turning or dragging the head, making a sound, and being depressed).

2: 중도의 통증(관찰자의 관절 촉진을 허용하지 않음).2: moderate pain (does not allow observer palpation).

주사하지 않은 관절 점수와 비교한 무릎 관절 삼출(종창):Knee joint effusion (swelling) compared to non-injected joint score:

0: 관절 삼출 없음(촉진할 수 있는 슬개 인대가 뚜렷함).0: no joint bleeding (the patellar ligament is palpable).

1: 경도의 삼출(인대를 감지할 수 있으며 극소량의 활액이 참).1: Mild exudation (can detect ligaments and very little synovial fluid is true).

2: 중등도의 삼출(인대가 뚜렷하지 않으며 현저히 활액이 참).2: moderate exudation (no ligament is pronounced, markedly true synovial fluid).

3: 중도의 삼출(인대를 촉진할 수 없음).3: moderate exudation (cannot promote ligament).

D. IL-1β 및 TNF-α에 대해 예방 목적으로 백신접종된 비글견에 있어서의 골관절염 증상의 예방D. Prevention of Osteoarthritis Symptoms in Beagle Dogs Vaccinated for Prophylaxis Against IL-1β and TNF-α

실험적 백신접종 계획: 연구 A에서는, "wt 단독" 실험을 위해, 그룹당 몇 종의 상이한 면역증강제와 함께 조제한 IL-1β 및 TNF-α로 백신접종 후 T = 0주, 4주, 8주, 20주 및 24주째 개에게 백신접종하였다(하기 표 1 참조). 본 연구에서는, 이들 개에게 마지막 백신접종 후 24주째 2회, 즉, 제1기(primo) 백신접종 후 T = 48주 및 T = 54주째 하기 표 4에 기재된 백신 제제 1.0 ml를 (오른쪽 옆구리에 피하 주사로) 재접종하였다. 혈청 분석을 위해 1차 백신접종 후 T = 48주, T = 54주 및 T = 58주째 혈액 샘플을 수집하였다. 혈청은 항원 특이적 ELISA 및 표준 절차를 이용하여 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체 수치를 측정하는 데 사용하였다. Experimental Vaccination Scheme: In Study A, T = 0, 4, 8, 20 after vaccination with IL-1β and TNF-α formulated with several different adjuvant agents per group for the "wt only" experiment. Dogs were vaccinated at week and week 24 (see Table 1 below). In the present study, these dogs received 1.0 ml of the vaccine formulation shown in Table 4 (in the right flank) twice at 24 weeks after the last vaccination, i.e., T = 48 weeks and T = 54 weeks after primo vaccination. By subcutaneous injection). Blood samples were collected at T = 48 weeks, T = 54 weeks and T = 58 weeks after primary vaccination for serum analysis. Serum was used to measure antibody levels against IL-1β and TNF-α using antigen specific ELISA and standard procedures.

혼합 wt/mt 실험을 위해, 표 1A에 기재된 실험적 백신접종을 이용하였다.For mixed wt / mt experiments, the experimental vaccinations described in Table 1A were used.

골관절염의 유도: wt 단독 실험의 경우, 그룹 1(PBS 대조 그룹)의 개로부터 마지막으로 혈액 샘플을 수집한(T = 59주) 후 1주째 2개의 새 그룹으로 나누었다(N=2 및 N=4). 이 시점에서 약 18월령인 5개 그룹의 개 모두에게 0.9% NaCl 1.0 ml(대조 그룹 1) 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml 요산염 결정 1.0 ml(골관절염 그룹 2∼5)를 한쪽 무릎 관절(뒷다리)에 관절내 주사하였다. 용액 1.0 ml의 관절내 주사는 전신 마취 하에 행하였다. 주사 후 T = 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 32 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간째 각각의 개별 개에 대해 일반적 행동, 파행(서있기 및 걷기로 점수 매김), 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창)의 점수를 매겼다. 실험 종료시 개를 안락사시키고, 병리학자 참석 하에 무릎을 육안으로 관찰하였다. Induction of Osteoarthritis: For the wt alone experiment, blood samples were collected from group 1 (PBS control group) dogs last (T = 59 weeks) and then divided into two new groups (N = 2 and N = 4). ). At this point, in all five groups of dogs about 18 months of age, 1.0 ml of 0.9% NaCl (control group 1) or 1.0 ml of 10 mg / ml urate crystals (osteoarthritis groups 2-5) in 0.9% NaCl (one osteoarthritis group 2-5) Hind legs). Intra-articular injection of 1.0 ml of solution was performed under general anesthesia. T = 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 24 hours, 32 hours, 48 hours, 72 hours, and 96 hours after injection for general behavior, claudication (standing and walking) Pagination), palpation pain and knee joint effusion (swelling). At the end of the experiment, the dogs were euthanized and their knees were visually observed with a pathologist.

혼합 wt/mt 실험의 경우, 표 1A에 기재된 바와 같이 골관절염 유도를 계획하였다.For mixed wt / mt experiments, osteoarthritis induction was planned as described in Table 1A.

파행 점수: 섹션 B 참조Lame score: see section B

통계 분석: 다중 비교 검정으로서 최소 유의차(L.S.D.)를 갖는 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 평균 득점값의 비교를 행하였다. 모든 결과는 SAS 엔터프라이즈 가이드 2 소프트웨어(미국 노쓰개롤라이나주 캐리 소재의 SAS Institute Inc. 제품)를 이용하여 생성하였다. 신뢰 수준 95%(P<0.05)에서 차이는 유의적인 것으로 간주되었다. Statistical Analysis: A comparison of the mean scores was made using ANOVA with least significant difference (LSD) as a multiple comparison test. All results were generated using SAS Enterprise Guide 2 software (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA). At 95% confidence level (P <0.05), the difference was considered significant.

2. 결과2. Results

A. 개에서의 자가 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체의 유도A. Induction of antibodies to autologous IL-1β and TNF-α in dogs

백신접종에 기인한 부작용(wt 단독 실험): 제1기 백신접종(제1기) 후, QuilA 중 Eq 단백질을 투여받은 개에게서 국소(피부) 반응이 관찰되었다. 따라서, 이 백신접종 그룹에서 후속 추가 백신접종은 PBS 중 QuilA로 대체하였다(역시 표 1 참조). 1차 추가 백신접종 직후, 그룹 2(QuilA 중 Ca 단백질), 그룹 3(매트릭스 C 중 Ca 단백질) 및 그룹 4(마이크로솔 중 Ca 단백질)의 개 대부분은 앓기 시작하였고, 이것은 아마도 백신 제제 중의 고농도의 (유리) 생물학적 활성 TNF-α의 존재 때문인 것으로 생각된다. 이러한 급성 전신 부작용은, Ca 단백질 및 Eq 단백질 둘 다에 대해 TNF-α의 양을 개 1 마리당 투여량을 50 ㎍에서 5 ㎍으로 줄임으로써 방지하였다. Side effects due to vaccination (wt alone experiment): After stage 1 vaccination (phase 1), local (skin) responses were observed in dogs receiving Eq protein in QuilA. Therefore, subsequent additional vaccinations in this vaccination group were replaced with QuilA in PBS (also see Table 1). Immediately after the first booster vaccination, most of the dogs in Group 2 (Ca protein in Quila), Group 3 (Ca protein in Matrix C), and Group 4 (Ca protein in microsol) began to suffer, which was probably due to high concentrations in the vaccine formulation. It is thought to be due to the presence of (free) biologically active TNF-α. This acute systemic side effect was prevented by reducing the amount of TNF-α for both Ca and Eq proteins by reducing the dose per dog from 50 μg to 5 μg.

백신접종에 기인한 부작용(혼합 wt/mt 실험): 제1기 백신접종(제1기) 후, 마이크로솔 보조제를 투여받은 개(그룹 3∼6)의 대부분에서 국소(피부) 반응이 관찰되었다. 1차 및 후속(추가) 백신접종 후, 국소 반응은 덜 현저하였다. 이용된 CaIL-1β 및 CaTNF-α 단백질 농도에서는 급성 전신 부작용이 관찰되지 않았다. Side effects due to vaccination (mixed wt / mt experiments): After the first vaccination (Phase 1), local (skin) reactions were observed in the majority of dogs (Groups 3 to 6) receiving microsol adjuvant. . After the first and subsequent (additional) vaccinations, the local response was less pronounced. No acute systemic side effects were observed at the CaIL-1β and CaTNF-α protein concentrations used.

IL-7β 및 TNF-α에 대한 항체 역가(wt 단독 실험): 도 1A∼D에 도시된 바와 같이, 자가 분자 CaIL-1β 및 CaTNF-α에 대해 유의적인 ELISA 항체 역가가 생성될 수 있다. 이 도면으로부터, 항체가 교차 반응성이라는 것, 즉, Ca 단백질에 대해 생성된 항체가 Eq 단백질을 인식하고, 또한 그 반대도 가능하다는 것이 명백하다. CaTNF-α에 대해 생성된 항체는, (아마도 친화성/특이성으로 인해) 특히 이른 시점에, CaTNF-α 단백질보다 더 높은 역가로 EqTNF-α를 인식한다는 것이 주목할 만하다(도 1C 및 1D). 일반적으로, Ca 단백질로 백신접종한 개에게서 상응하는 Eq 대응물로 백신접종한 개보다 총 항체 역가가 더 높게 생성되었다. 제1기 백신접종 후 12주째 그룹 1 및 3은 사육 제약으로 인해 실험으로부터 배제되었다. 요약하면, 유전적으로 변형된 개 자가 분자 또는 이종성 말 단백질을 사용함으로써, 자가 분자에 대한 면역 관용성을 파괴하고 높은 항체 역가를 유도할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 돌연변이 사이토카인에 대해서도 유사한 결과를 얻었다. Antibody Titers for IL-7β and TNF-α (wt Only Experiments): As shown in FIGS. 1A-D, significant ELISA antibody titers can be generated for the self molecules CaIL-1β and CaTNF-α. From this figure, it is clear that the antibody is cross reactive, that is, the antibody generated against Ca protein recognizes Eq protein and vice versa. It is noteworthy that the antibodies produced against CaTNF-α recognize EqTNF-α with higher titers than CaTNF-α protein (possibly due to affinity / specificity) (FIG. 1C and 1D). In general, dogs vaccinated with Ca protein produced higher total antibody titers than dogs vaccinated with the corresponding Eq counterpart. Twelve weeks after the first vaccination groups 1 and 3 were excluded from the experiment due to farming restrictions. In summary, it can be concluded that by using genetically modified dog autologous molecules or heterologous equine proteins, it is possible to disrupt immune tolerance to autologous molecules and induce high antibody titers. Similar results were obtained for mutant cytokines.

웨스턴 블롯 분석: 항IL-1β 및 항TNF-α 항체의 특이성을 확인하기 위해, CDV 태깅 및 비태깅 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯을 제1기 백신접종 후 T = 9주째의 혈청과 함께 항온처리하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 모든 항체가 Ca 및 Eq IL-1β 및 TNF-α 단백질과 교차 반응한다. 비관련 His 태그 정제 이. 콜라이 발현 단백질인 닭 IL-18(ChIL-18)을 대조군으로 사용하였으며 이것은 항체에 의해 인식되지 않았다. Western blot analysis: To confirm the specificity of anti-IL-1β and anti-TNF-α antibodies, western blot analysis was performed using CDV tagged and non-tagged proteins. Western blots were incubated with serum at T = 9 weeks after the first vaccination. As shown in FIG. 2, all antibodies cross react with Ca and Eq IL-1β and TNF-α proteins. Unrelated His tag tablets E. coli expressing protein chicken IL-18 (ChIL-18) was used as a control and was not recognized by the antibody.

항IL-1β 항체 및 항TNF-α 항체의 중화 능력: 개에서 IL-1β 및 TNF-α에 대해 고항체 역가가 유도되었지만, 이 항체가 상응하는 단백질의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는지는 불분명하였다. 이를 위해, IL-1β 및 TNF-α 반응성 NIH-3T3 NFκB 루시퍼라제 리포터 세포주를 사용하였다. Ca 및 Eq IL-1β 및 TNF-α를 여러 시점에 얻은 혼주 혈청과 함께 사전 항온처리하고, 중화(즉, 수용체 결합의 억제) 활성을 테스트하였다. 도 3A 및 3B에 도시된 결과로부터, 제1기 백신접종 후 24주째 얻은 혼주 혈청이 가장 많은 항CaIL-1β 및 항EqIL-1β 중화 항체를 포함하고 있다는 결론을 내릴 수 있다. 상대 광 단위(RLU)로 측정된 CaIL-1β 및 EqIL-1β의 생물학적 활성은 다른 혈청과 비교할 때 현저히 감소된다. 이것은 또한, 덜 두드러지긴 하지만, CaTNF-α 및 EqTNF-α의 생물학적 활성의 억제에 있어서도 그러하다(도 3C 및 3D). 제1기 백신접종 후 6주, 9주 및 12주째 얻은 혼주 혈청은 중화 IL-1β 항체를 거의 함유하고 있지 않지만, 중화 TNF-α 항체를 상당량 함유하고 있다. Neutralization Ability of Anti-IL-1β Antibodies and Anti-TNF-α Antibodies: Although high antibody titers were induced for IL-1β and TNF-α in dogs, it was unclear whether this antibody could neutralize the biological activity of the corresponding protein. For this purpose, IL-1β and TNF-α reactive NIH-3T3 NFκB luciferase reporter cell lines were used. Ca and Eq IL-1β and TNF-α were preincubated with pooled serum obtained at various time points and tested for neutralization (ie, inhibition of receptor binding) activity. From the results shown in Figures 3A and 3B, it can be concluded that the pooled serum obtained 24 weeks after the first vaccination contains the most anti-CaIL-1β and anti-EqIL-1β neutralizing antibodies. The biological activities of CaIL-1β and EqIL-1β measured in relative light units (RLU) are significantly reduced when compared to other sera. This is also less pronounced, but also in the inhibition of the biological activity of CaTNF-α and EqTNF-α (FIGS. 3C and 3D). The mixed serum obtained at weeks 6, 9 and 12 after the first vaccination contains little neutralizing IL-1β antibody, but contains a significant amount of neutralizing TNF-α antibody.

결론conclusion

결론적으로 본 발명자들은 최소 CDV 태깅 야생형 및 돌연변이체 CaIL-1β 및 CaTNF-α 자가 분자에 대한 능동 면역화에 의해 항체를 생성할 수 있다는 분명한 증거를 제공하였다.In conclusion, we provided clear evidence that antibodies can be produced by active immunization against minimal CDV tagged wild type and mutant CaIL-1β and CaTNF-α self molecules.

B. 비글견에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축B. Construction of Urate Crystal-Induced Osteoarthritis Model in Beagle Dogs

무릎 관절로의 액 주사: 일반적으로, 0.9% NaCl 1.0 ml 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml의 요산염 결정 1.0 ml의 무릎 관절로의 주사를 어떠한 심각한 부작용도 없이 행하였다. Liquid injection into the knee joint: In general, injection into the knee joint of 1.0 ml of 0.9% NaCl or 1.0 ml of 10 mg / ml urate crystal in 0.9% NaCl was done without any serious side effects.

임상 평가: 파행 점수 채점: 요산염 결정을 주사한 동물은 주사 후 2 시간 내에 걷기와 서있기 둘 다에서 명백한 파행을 나타내었다(도 4 참조). 2 마리의 개는 24 시간 내에 완전히 회복된 반면, 다른 2 마리의 개는 실험 종료시까지 요산염 결정으로 인해 괴로워했다. 안락사시킨 개의 무릎 관절의 육안 관찰 결과는 상기 2 마리 개는 슬개골 탈구(해부학적 관절 이상)가 있음을 나타내었다. 이러한 슬개골 탈구가 요산염 결정 용액의 주사와 함께 작용하여, 상기에 언급한 장기간의 고통을 초래했을 가능성이 가장 크다. 0.9% NaCl 용액을 주사한 개의 그룹에서는, 1 마리의 개만이 다소 단기간 동안 주사에 기인한 고통을 받았다(T = 8 시간에 관찰 가능). 이 개의 무릎 관절을 육안으로 관찰하였을 때, 이 개 역시 슬개골 탈구가 있었음이 분명해졌다. Clinical Evaluation: Lameness Score Grading: Animals injected with urate crystals showed clear lameness in both walking and standing within 2 hours after injection (see FIG. 4). Two dogs recovered completely within 24 hours, while the other two dogs suffered from urate crystals until the end of the experiment. Visual observation of the euthanasia of the knee joints of the euthanized dogs indicated that the two dogs had patella dislocation (anatomical joint abnormalities). It is most likely that this patellar dislocation acted with the injection of the urate crystal solution, resulting in the long-term pain mentioned above. In the group of dogs injected with 0.9% NaCl solution, only one dog suffered from the injection for a rather short time (observable at T = 8 hours). When the dog's knee joints were visually observed, it became clear that the dog also had a patella dislocation.

임상 평가: 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창): 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출도 모니터링하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, SEM(평균의 표준 오차)은 크고, 이것은 개별 개들 간에 상당한 편차가 있음을 나타낸다. 요산염 결정을 주사한 후 2∼8 시간 사이에 촉진시 통증을 측정할 수 있으며, 4∼6 시간 사이에 최대였다. 무릎 관절 삼출은 촉진시 통증에 비해 다소 늦게 나타나나, 주사 후 4 시간째 나타나기 시작하여 8 시간째 최대였다. Clinical Evaluation: Palpation and Knee Joint Exudation (Swelling): Palpation and Knee Joint Exudation were also monitored. As can be seen in FIG. 5, the SEM (standard error of the mean) is large, indicating that there is a significant deviation between the individual dogs. Pain on palpation can be measured between 2-8 hours after injection of urate crystals, with a maximum between 4-6 hours. Knee joint effusion appeared somewhat later than palpation at palpation, but began to appear 4 hours after injection and peaked at 8 hours.

임상 평가: 무릎의 병리학적 분석: 실험 종료시, 모든 개를 안락사시키고, 무릎을 육안으로 관찰하였다. 모든 개에게서, 주사액의 흔적은 관찰되지 않았다. 개 1 마리에서만 주사 부위가 여전히 관찰되었다. 개 3 마리의 무릎에서 다량의 액이 관찰되었다. 이것은 이들 개 3 마리에 슬개골 탈구가 발생하였음을 입증하였다. Clinical Evaluation: Pathological Analysis of Knees: At the end of the experiment, all dogs were euthanized and the knees were visually observed. In all dogs, no trace of injection was observed. The injection site was still observed in only one dog. A large amount of fluid was observed in the knees of three dogs. This demonstrated that patella dislocation occurred in three of these dogs.

결론conclusion

한쪽 무릎 관절(뒷다리)로 요산염 결정 함유 용액을 관절내 주사함으로써 적용된 개의 관절염 모델은 신속하고(2 시간 내에 효과를 관찰할 수 있음), 유효 기간이 짧고(수시간 내지 1, 2일), 가역적이다. 과정을 모니터링하기 위한 관련 파라미터는 걷기 및 서있기시의 파행, 촉진시 통증 및 관절 삼출의 점수 채점을 포함한다. 이 모델에서 체온과 무릎 온도는 관련이 없는 파라미터이다.Arthritis models in dogs applied by intraarticular injection of a solution containing urate crystals to one knee joint (hind limb) are rapid (you can observe the effect within 2 hours), have a short shelf life (hours to 1, 2 days), Reversible Relevant parameters for monitoring the process include scoring of lameness on walking and standing, pain on palpation, and joint exudation. Body temperature and knee temperature are not relevant parameters in this model.

C. 셰틀랜드 포니에서의 요산염 결정 유도성 골관절염 모델의 구축Construction of Urate Crystal Induced Osteoarthritis Model in C. Shetland Pony

무릎 관절로의 액 주사: 일반적으로, 0.9% NaCl 5.0 ml 또는 0.9% NaCl 중 10 mg/ml의 요산염 결정 5.0 ml의 무릎 관절로의 주사를 어떠한 심각한 부작용도 없이 행하였다. Liquid injection into the knee joint: In general, injection into the knee joint of 5.0 ml of 0.9% NaCl or 5.0 ml of 10 mg / ml urate crystal in 0.9% NaCl was done without any serious side effects.

임상 평가: 파행 점수 채점: 요산염 결정을 주사한 포니는 주사 후 2 시간 내에 걷기와 서있기 둘 다에서 명백한 파행을 나타내었다(도 6 참조). 주사 후 6∼8 시간 사이에 최대 고통이 기록되었다. 대조 그룹 포니 2 마리는 파행 징후를 나타내지 않았다. Clinical Evaluation: Lameness Score Grading: Pony injected with urate crystals showed clear lameness in both walking and standing within 2 hours after injection (see FIG. 6). Maximum pain was recorded between 6 and 8 hours after injection. Two control groups pony showed no signs of lameness.

임상 평가: 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출(종창): 촉진시 통증 및 무릎 관절 삼출도 모니터링하였다. 도 7A에서 알 수 있는 바와 같이, 주사 후 2 시간 내에 통증이 기록된 반면, 무릎 관절 삼출(도 7B)은 후기 단계에서(48 시간 초과) 검출할 수 있었다. 무릎 관절 삼출은 72∼96 시간 사이에 증가하지 않기 때문에, 이것은 종창이 96시간째 최고에 도달함을 나타낼 수 있다. Clinical Evaluation: Palpation and Knee Joint Exudation (Swelling): Palpation and Knee Joint Exudation were also monitored. As can be seen in FIG. 7A, pain was recorded within 2 hours after injection, while knee joint effusion (FIG. 7B) could be detected at later stages (greater than 48 hours). Since knee joint effusion does not increase between 72 and 96 hours, this may indicate that the swelling reaches its peak at 96 hours.

임상 평가: 무릎의 병리학적 분석: 실험 종료시, 모든 포니를 안락사시키고, 무릎을 육안으로 관찰하였다. 모든 포니에게서, 주사액의 흔적은 관찰되지 않았다. 요산염을 주사한 포니의 무릎 관절을 육안 관찰하여, 황색 활액량의 증가, 부종 및 출혈이 있는 활막의 비후를 확인하였다. 대조 그룹은 병리학적 소견을 보이지 않았다. Clinical Evaluation: Pathological Analysis of the Knee: At the end of the experiment all pony was euthanized and the knee was visually observed. In all pony no traces of injection were observed. The knee joint of the pony injected with urate was visually observed to confirm the thickening of the synovial membrane with an increase in the amount of yellow synovial fluid, edema and bleeding. The control group showed no pathological findings.

결론conclusion

개에게서도 나타난 바와 같이, 한쪽 무릎 관절(오른쪽 뒷다리)로 요산염 결정 함유 용액을 관절내 주사함으로써 적용된 포니의 관절염 모델은 신속하고(2 시간 내에 효과를 관찰할 수 있음), 유효 기간이 짧고(수시간 내지 1, 2일), 파행 및 통증 점수 채점시 가역적이다. 주사 후 48 시간째부터 무릎 관절 삼출(종창)을 촉진할 수 있고 72∼96 시간 사이에 최고에 도달하는 것으로 보인다.As also seen in dogs, the arthritis model of pony applied by intraarticular injection of a solution containing urate crystals to one knee joint (right hind limb) is rapid (you can observe the effect within 2 hours), and the shelf life is short ( Hours to 1, 2 days), lameness and pain scores are reversible at scoring. Knee joint effusion (swelling) can be promoted from 48 hours after injection and peaks appear between 72 and 96 hours.

D. IL-1β 및 TNF-α에 대해 예방 목적으로 백신접종한 비글견에서의 골관절염 증상의 예방D. Prevention of Osteoarthritis Symptoms in Beagle Dogs Vaccinated for Prevention Against IL-1β and TNF-α

재백신접종 후 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체 역가: 도 8A∼D(wt 단독 실험)에 도시된 바와 같이, 백신접종 후 T = 48주째, 즉, 마지막 추가 백신접종 후 24주째의 총 항체 역가는 다소 높은 수준으로 유지되었다. 개의 재백신접종은 테스트된 모든 항원과 모든 그룹에서 항체 역가를 중간 정도로 증가시켰다. Antibody Titers for IL-1β and TNF-α after Re-vaccination: T = 48 weeks post vaccination, ie 24 weeks post last boost vaccination, as shown in FIGS. 8A-D (wt alone experiment). Antibody titers were maintained at somewhat high levels. Re-vaccination of dogs moderately increased antibody titers in all antigens tested and in all groups.

임상 평가: 불편감 점수: 도 9(wt 단독 실험)에는, '서있기'(도 9B), '걷기'(도 9C), '촉진시 통증'(도 9D), '무릎 관절 삼출(종창)'(도 9E)에 대한 불편감 점수 및 측정된 모든 불편감 점수의 평균인 '총 임상 점수'(도 9A)가 도시되어 있다. 모든 도면으로부터, 비백신접종 개가 주사 후 2 시간 내에 현저한 불편감을 나타내었음이 명백하다. 몇몇 사례에서 백신접종 개는 유의적으로 감소된 또는 중등도 내지 경도의 불편감을 나타내었다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 백신접종 개에 대한 불편감 점수는 비백신접종 개와 비교할 때 현저히 낮었거나 지연을 나타내었다. Clinical Evaluation: Discomfort Score: FIG. 9 (wt alone experiment) includes 'standing' (FIG. 9B), 'walking' (FIG. 9C), 'pain on palpation' (FIG. 9D), 'knee joint effusion (swelling)' The discomfort score for (FIG. 9E) and the 'total clinical score' (FIG. 9A), which is the average of all the discomfort scores measured, are shown. From all figures it is clear that the non-vaccinated dogs exhibited significant discomfort within 2 hours after injection. In some cases the vaccinated dogs exhibited significantly reduced or moderate to mild discomfort. As can be seen from the figure, the discomfort score for vaccinated dogs was markedly lower or delayed compared to non-vaccinated dogs.

임상 평가: 무릎의 병리학적 분석: 실험 종료시, 모든 개를 안락사시키고, 병리학자가 무릎을 육안 관찰하였다. 일반적으로, NaCl 대조 그룹 개를 제외하고, 모든 개에서 활막이 두꺼워지고 붉어지는 것으로 나타났다. 이외에도 모든 무릎에서 소량의 점액이 검출되었다. Clinical Evaluation: Pathological Analysis of Knees: At the end of the experiment, all dogs were euthanized and the pathologist visually observed the knees. In general, the synovial membrane was thickened and reddened in all dogs except the NaCl control dog. In addition, a small amount of mucus was detected in all knees.

임상 평가: 불편감 점수: 도 10(혼합 wt/mt 실험)에는, 관절내 요산염 주사 후 6 시간 및 8 시간 시점에 '서있기'(도 10A) 및 '걷기'(도 10B)에 대한 불편감 점수가 도시되어 있다. 두 도면으로부터, 비백신접종 개(요산염 대조 그룹)는 주사 후 6 시간 및 8 시간째 현저한 불편감을 나타내었음이 명백하다. 몇몇 사례에서 백신접종 개는 유의적으로 감소된 또는 중등도 내지 경도의 불편감을 나타내었다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 백신접종 개에 대한 불편감 점수는 비백신접종 개(요산염 대조 그룹)와 비교할 때 현저히 낮았다. 또한, 특히, 주사 후 8 시간째, 야생형 CaIL-1β 단독 또는 돌연변이체 CaIL-1β 단독을 사용한 백신접종이 비백신접종 요산염 대조 그룹 개와 비교할 때 불편감을 감소시킨다는 것이 분명하다. Clinical Evaluation: Discomfort Score: In FIG. 10 (mixed wt / mt experiment), discomfort for 'standing' (FIG. 10A) and 'walking' (FIG. 10B) at 6 and 8 hours after intraarticular urate injection. The score is shown. From both figures, it is clear that the non-vaccinated dogs (urate control group) showed significant discomfort 6 and 8 hours after injection. In some cases the vaccinated dogs exhibited significantly reduced or moderate to mild discomfort. As can be seen in FIG. 10, discomfort scores for vaccinated dogs were significantly lower compared to non-vaccinated dogs (uric acid control group). It is also clear that vaccination with wild type CaIL-1β alone or mutant CaIL-1β alone, especially at 8 hours post injection, reduces discomfort when compared to the non-vaccinated urate control group dogs.

결론conclusion

이 실험에서 얻은 결과로부터, 본 발명자들은 야생형 또는 돌연변이 사이토카인을 사용하는 것에 기초하여 자가 분자 IL-1β 및 TNF-α에 대한 항체를 유도할 수 있고, IL-1β 단독에 대해 유도된, 또는 TNF-α에 대해 유도된 이들 항체가 관절염 증상을 억제할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 또한, IL-1β 및 TNF-α 둘 다에 대해 유도된 백신을 사용할 때 최상의 결과가 얻어질 것이라는 결론을 내릴 수 있다.From the results obtained in this experiment, we can induce antibodies against the autologous molecules IL-1β and TNF-α, based on the use of wild type or mutant cytokines, induced against IL-1β alone, or TNF It can be concluded that these antibodies directed against -α can suppress arthritis symptoms. It can also be concluded that the best results will be obtained when using a vaccine derived for both IL-1β and TNF-α.

E. 기타E. Other

생물학적 활성 IL-1β 및 TNF-α를 사용할 때, 본 발명자들은 급성 부작용을 관찰하였다. 이러한 부작용은, 예를 들어 미국 특허 제6,093,405호에 기재된 바와 같이, 상기 사이토카인의 생물학적 불활성 형태를 사용함으로써 예방할 수 있다. 면역원성과 생물학적 활성 간의 균형을 맞추기 위해 부분 불활성화 사이토카인을 선택할 수 있다. 본 발명자들은 골관절염을 유도하기 위해 요산염 결정을 사용하였다. 골관절염에 대한 다른 모델, 예를 들어 전방 십자 인대 횡단면(Anterior Cruciate Ligament Transection) 모델(ACLT, 문헌[Fleming et al; Curr Opin Orthop. 2005 October; 16(5): 354-362]에 개시됨) 또는 그루브(Groove) 모델(문헌[Mastbergen et al; Rheumathology, 2006; 45(4): 405-413]에 기재됨)은 선행 기술에 개시되어 있다. 본 출원에 기재된 실험의 긍정적 결과를 고려할 때, 자연적 원인으로 인해 골관절염을 앓고 있거나 골관절염이 진행중인 이러한 모델 또는 환자에게 적용될 때 상응하는 결과가 얻어질 것으로 생각한다. 본 발명자들은 IL-1β 및 TNF-α 또는 그 유도체의 조합을 사용하여 백신접종하였을 때 골관절염 환자에게 현저한 경감 효과를 보여주었다. 이것은 비글견에서 확인되었다. 이 척추동물에서의 결과 및 척추동물군, 특히 개, 말 및 인간 등 포유류 척추동물의 관절과 관련된 생리학적 과정의 유사성을 고려할 때, 본 발명은 임의의 척추동물, 특히 포유류 척추동물에 사용될 수 있다.When using biologically active IL-1β and TNF-α, we observed acute side effects. Such side effects can be prevented by using biologically inactive forms of the cytokines, for example as described in US Pat. No. 6,093,405. Partially inactivated cytokines can be selected to balance immunogenicity and biological activity. We used urate crystals to induce osteoarthritis. Other models for osteoarthritis, such as the Anterior Cruciate Ligament Transection model (ACLT, disclosed in Fleming et al; Curr Opin Orthop. 2005 October; 16 (5): 354-362) or Groove models (described in Mustbergen et al; Rheumathology, 2006; 45 (4): 405-413) are disclosed in the prior art. Given the positive results of the experiments described in this application, it is believed that corresponding results will be obtained when applied to such models or patients suffering from or having osteoarthritis due to natural causes. We have shown a significant alleviating effect on osteoarthritis patients when vaccinated using a combination of IL-1β and TNF-α or derivatives thereof. This was confirmed in beagle dogs. Given the results in this vertebrate and the physiological processes associated with the joints of vertebrate groups, particularly mammalian vertebrates such as dogs, horses and humans, the present invention can be used in any vertebrate, especially mammalian vertebrates. .

F. 도면의 설명F. Description of Drawings

도 1은 백신접종 후 여러 시점에 측정된 IL-β 및 TNF-α 특이적 항체 반응을 보여준다. 개를 면역화하지 않거나(식염수 대조군), QuilA, 매트릭스 C 또는 마이크로솔 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α] 단백질(Ca로 약칭함)로 면역화하거나, 또는 QuilA(제1기 접종 단독)/식염수(추가 접종) 중에서 조제한 [EqIL-1β + EqTNF-α] 단백질(Eq로 약칭함)로 면역화하였다. 제1기 백신접종 후 4주, 8주, 20주 및 24주째, 개에게 추가 백신접종을 실시하였다. CDV 태그가 없는 단백질이 사용되는 항원 특이적 ELISA를 이용하여 항체를 측정하였다. [A]. CaIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [B]. EqIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [C]. CaTNF-α에 대해 측정된 항체 역가; [D]. EqTNF-α에 대해 측정된 항체 역가. T = 제1기 백신접종 후 경과 일수(주). 1 shows IL-β and TNF-α specific antibody responses measured at various time points after vaccination. Dogs are not immunized (saline control), immunized with [CaIL-1β + CaTNF-α] protein (abbreviated Ca) prepared in QuilA, Matrix C or microsol, or QuilA (first inoculation alone) / saline (EqIL-1β + EqTNF-α] protein (abbreviated as Eq) prepared in (inoculation) was immunized. Four, eight, twenty, and twenty-four weeks after the first vaccination, the dogs were further vaccinated. Antibodies were measured using an antigen specific ELISA using a protein without the CDV tag. [A]. Antibody titers measured against CaIL-1β; [B]. Antibody titers measured against EqIL-1β; [C]. Antibody titers measured against CaTNF-α; [D]. Antibody titers measured against EqTNF-α. T = days after vaccination (weeks).

도 2는 CDV 태깅 및 비태깅 CaIL-β, CaTNF-α 및 EqIL-1β 및 EqTNF-α 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 레인당 1 ㎍의 단백질을 4∼12% Nu-PAGE하고, 제1기 백신접종 후 9주째 각각의 백신접종 그룹의 개 1 마리로부터 얻은 혈청을 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시함으로써 분석하였다. [A]. 쿠마시 염색 겔; [B]. 대조군 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [C]. QuilA 보조제 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [D]. 매트릭스 C 보조제 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [E]. 마이크로솔 보조제 중에서 조제한 [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯; [F]. QuilA(제1기 백신접종 단독)/식염수(추가 접종) 보조제 중에서 조제한 [EqIL-1β + EqaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 혈청과 함께 항온처리한 웨스턴 블롯.2 shows Western blot analysis of CDV tagged and untagged CaIL-β, CaTNF-α and EqIL-1β and EqTNF-α proteins. 1 μg of protein per lane was 4-12% Nu-PAGE and analyzed by western blotting using serum from one dog of each vaccination group 9 weeks after the first vaccination. [A]. Coomassie Dyeing Gel; [B]. Western blot incubated with control serum; [C]. Western blot incubated with serum from dogs vaccinated with [CaIL-1β + CaTNF-α] prepared in QuilA adjuvant; [D]. Western blot incubated with serum from dogs vaccinated with [CaIL-1β + CaTNF-α] formulated in Matrix C adjuvant; [E]. Western blot incubated with serum from dogs vaccinated with [CaIL-1β + CaTNF-α] prepared in microsol adjuvant; [F]. Western blot incubated with serum from dogs vaccinated with [EqIL-1β + EqaTNF-α] prepared in QuilA (first vaccination alone) / saline (booster) adjuvant.

도 3은 백신접종된 개로부터 얻은 혈청에 의한 IL-1β 또는 TNF-α 유도성 NFκB 활성화의 억제를 보여준다. 10 ng/ml의 [A] CaIL-1β, [B] EqIL-1β, [C] CaTNF-α, 또는 [D] EqTNF-α를, [CaIL-1β + CaTNF-α]로 백신접종한 개로부터 얻은 항체 혈청의 희석액과 혼합하여 NIH-3T3 리포터 세포와 함께 항온처리하였다. 항체의 의한 IL-1β 또는 TNF-α 활성의 억제는 상대 광 단위(RLU)로 정량하였다. T = 6주: 이것은 제1기 백신접종 후 6주째 수집한 그룹 2+3+4의 개로부터 얻은 혼주 혈청이다(표 1 참조). T = 9+12주: 이것은 제1기 백신접종 후 9주 및 12주째 수집한 그룹 2+3+4의 개로부터 얻은 혼주 혈청이다(표 1 참조). T = 24주: 이것은 제1기 백신접종 후 24주째 수집한 그룹 2+4의 개로부터 얻은 혼주 혈청이다(표 1 참조).3 shows the inhibition of IL-1β or TNF-α induced NFκB activation by serum from vaccinated dogs. From dogs vaccinated with [C] a CaIL-1β, [B] EqIL-1β, [C] CaTNF-α, or [D] EqTNF-α at 10 ng / ml [CaIL-1β + CaTNF-α] Dilutions of the obtained antibody serum were mixed and incubated with NIH-3T3 reporter cells. Inhibition of IL-1β or TNF-α activity by antibodies was quantified by relative light units (RLU). T = 6 weeks: This is a pooled serum from group 2 + 3 + 4 dogs collected 6 weeks after the first vaccination (see Table 1). T = 9 + 12 weeks: This is a mixed sera from dogs of group 2 + 3 + 4 collected 9 and 12 weeks after the first vaccination (see Table 1). T = 24 weeks: This is a bleeding serum from group 2 + 4 dogs collected 24 weeks after the first vaccination (see Table 1).

도 4는 비글견에 대한 서있기 평가시의 평균 점수[A], 걷기 평가시의 평균 점수[B] 및 평균 총 파행 점수[C](서있기 + 걷기)를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다.4 shows the mean score [A] for standing beagle dogs, the mean score [B] for walking assessments and the mean total lame score [C] (standing + walking). Data are shown as geometric mean ± SEM.

도 5는 비글견에 대한 촉진시 통증 평가시의 평균 점수[A] 및 무릎 관절 삼출 평가시의 평균 점수[B]를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다.FIG. 5 shows the mean score [A] for palpation pain evaluation on beagle dogs and the mean score [B] for knee joint effusion evaluation. Data are shown as geometric mean ± SEM.

도 6은 셰틀랜드 포니에 대한 서있기 평가시의 평균 점수[A], 걷기 평가시의 평균 점수[B] 및 평균 총 파행 점수[C](서있기 + 걷기)를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. 왼쪽 세로축의 화살표는 표시된 파라미터에 대한 최고 점수를 가르킨다.FIG. 6 shows the mean score [A] at standing assessment, the mean score at walking assessment [B], and the average total lame score [C] (standing + walking) for Shetland Pony. Data are shown as geometric mean ± SEM. The arrow on the left vertical axis indicates the highest score for the indicated parameter.

도 7은 촉진시 통증 평가시의 평균 점수[A] 및 무릎 관절 삼출 평가시의 평균 점수[B]를 보여준다. 도 7[C]는 셰틀랜드 포니에 대한 총 임상 점수(서있기 + 걷기 +통증 + 종창)를 보여준다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. 왼쪽 세로축의 화살표는 표시된 파라미터에 대한 최고 점수를 가르킨다.FIG. 7 shows the mean score [A] for pain assessment at palpation and the mean score [B] for knee joint effusion evaluation. 7 [C] shows the total clinical score (standing + walking + pain + swelling) for Shetland Pony. Data are shown as geometric mean ± SEM. The arrow on the left vertical axis indicates the highest score for the indicated parameter.

도 8은 제1기 백신접종 후 여러 시점에서 측정한 IL-β 및 TNF-α 특이적 항체 반응을 보여준다. 개를 면역화하지 않거나(식염수 대조군), 제1기 백신접종 후 T = 48주 및 T = 54주째 QuilA 또는 마이크로솔 중에서 조제한 [CDV 태깅 CaIL-1β + CaTNF-α] 단백질(Ca로 약칭함)로 재백신접종하거나, 또는 QuilA(제1기 접종 단독)/식염수(추가 접종) 중에서 조제한 [EqIL-1β + EqTNF-α] 단백질(Eq로 약칭함)로 재백신접종하였다. 제1기 백신접종 후 T = 4주, T = 54주 및 T = 58주째 CDV 태그가 없는 단백질이 사용되는 항원 특이적 ELISA를 이용하여 항체를 측정하였다. [A]. CaIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [B]. EqIL-1β에 대해 측정된 항체 역가; [C]. CaTNF-α에 대해 측정된 항체 역가; [D]. EqTNF-α에 대해 측정된 항체 역가. ★ = 식염수 그룹과 유의적인 차이 있음(P<0.05);

= 표시된 그룹 간에 유의적인 차이 있음(P<0.05). T = 제1기 백신접종 후 경과 일수(주).8 shows IL-β and TNF-α specific antibody responses measured at various time points after stage 1 vaccination. Dogs are not immunized (saline control) or with [CDV tagged CaIL-1β + CaTNF-α] protein (abbreviated Ca) prepared in QuilA or microsol at T = 48 weeks and T = 54 weeks after the first vaccination Re-vaccinated or re-vaccinated with [EqIL-1β + EqTNF-α] protein (abbreviated as Eq) prepared in QuilA (first inoculation only) / saline (booster inoculation). Antibodies were measured using antigen specific ELISA using CDV-tagged proteins at T = 4, T = 54 and T = 58 weeks after the first vaccination. [A]. Antibody titers measured against CaIL-1β; [B]. Antibody titers measured against EqIL-1β; [C]. Antibody titers measured against CaTNF-α; [D]. Antibody titers measured against EqTNF-α. ★ = significant difference from saline group (P <0.05);

= Significant difference (P <0.05) between marked groups. T = days after vaccination (weeks).

도 9는 비글견에 대한 평균 총 임상 점수를 보여준다. 도 9[A]는 총 임상 점수(서있기 + 걷기 + 촉진시 통증 + 무릎 관절 종창)을 제시한다. 도 9[B]는 서있기 평가시의 평균 점수를 제시한다. [C]에는 걷기 평가시의 평균 점수, [D]에는 촉진시 통증 평가시의 평균 점수, [E]에는 무릎 관절 삼출(종창) 평가시의 평균 점수가 제시된다. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. ★ = 표시된 시점에서 요산염 결정 대조 그룹과 유의적인 차이 있음(P<0.05);

= 표시된 그룹 간에 유의적인 차이 있음(P<0.05).9 shows the average total clinical score for beagle dogs. 9 [A] shows the total clinical score (standing + walking + pain on palpation + knee joint swelling). 9 [B] shows the average score at standing assessment. [C] shows the average score during walking evaluation, [D] shows the average score during palpation pain evaluation, and [E] shows the average score during knee joint effusion (swelling) evaluation. Data are shown as geometric mean ± SEM. ★ = significant difference from urate crystal control group at indicated time point (P <0.05);

= Significant difference (P <0.05) between marked groups.

도 10은 비글견에 대한 평균 임상 점수를 보여준다. [A]. 서있기 평가시의 평균 임상 점수; [B]. 걷기 평가시의 평균 임상 점수. 데이터는 기하 평균±SEM으로 나타낸다. ★ = 표시된 시점에서 요산염 결정 대조 그룹과 유의적인 차이 있음(P<0.05).10 shows the average clinical score for beagle dogs. [A]. Mean clinical score at standing assessment; [B]. Average clinical score at walking assessment. Data are shown as geometric mean ± SEM. ★ = significant difference from urate crystal control group at indicated time point (P <0.05).

SEQUENCE LISTING <110> Intervet International BV <120> Osteo arthritis vaccine <130> 2007.018 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(582) <400> 1 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg ata tcg aat tca gca gcc atg caa tcg gtg gac 96 Arg Gly Ser His Met Ile Ser Asn Ser Ala Ala Met Gln Ser Val Asp 20 25 30 tgc aag tta cag gac ata agc cac aaa tac ctg gtg ctg tct aac tca 144 Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser 35 40 45 tat gag ctt cgg gct ctc cac ctc aat ggg gaa aat gtg aac aaa caa 192 Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln 50 55 60 gtg gtg ttc cac atg agc ttt gtg cac ggg gat gaa agt aat aac aag 240 Val Val Phe His Met Ser Phe Val His Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys 65 70 75 80 ata cct gtg gtc ttg ggc atc aaa caa aag aat ctg tac ctg tcc tgt 288 Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys 85 90 95 gtg atg aag gat gga aag ccc acc cta cag cta gag aag gta gac ccc 336 Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro 100 105 110 aaa gtc tac cca aag agg aag atg gaa aag cga ttt gtc ttc aac aag 384 Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys 115 120 125 ata gaa atc aag aac aca gtg gaa ttt gag tct tct cag tac cct aac 432 Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn 130 135 140 tgg tac atc agc acc tct caa gtc gaa gga atg cct gtc ttc cta gga 480 Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu Gly Met Pro Val Phe Leu Gly 145 150 155 160 aat acc aga ggt ggc cag gat ata act gac ttc acc atg gaa ttt tct 528 Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser 165 170 175 tcc aca gct gca caa atc act gca gga ata gct tta cat caa tcc aac 576 Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 180 185 190 ctc aat tag 585 Leu Asn <210> 2 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ile Ser Asn Ser Ala Ala Met Gln Ser Val Asp 20 25 30 Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser 35 40 45 Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln 50 55 60 Val Val Phe His Met Ser Phe Val His Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys 65 70 75 80 Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys 85 90 95 Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys 115 120 125 Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn 130 135 140 Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu Gly Met Pro Val Phe Leu Gly 145 150 155 160 Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser 165 170 175 Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 180 185 190 Leu Asn <210> 3 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(585) <400> 3 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg gtc aaa tca tct tct cga acc cca agt gac aag 96 Arg Gly Ser His Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 cca gta gct cat gtt gta gca aac ccc gaa gct gag ggg cag ctc cag 144 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 tgg ctg agc cga cgt gcc aat gcc ctc ctg gcc aac ggc gtg gag ctg 192 Trp Leu Ser Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu 50 55 60 aca gac aac cag ctg ata gtg ccg tca gat ggg ttg tac ctc atc tac 240 Thr Asp Asn Gln Leu Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 tcc cag gtc ctc ttc aag ggc caa ggg tgc cct tcc acc cat gtg ctc 288 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 ctc acc cac acc atc agc cgc ttc gcc gtc tcc tac cag aca aag gtc 336 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val 100 105 110 aac cta ctc tct gcc atc aag agc cct tgc caa agg gag acc cca gag 384 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu 115 120 125 ggg acc gag gcc aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctg gga ggg gtc 432 Gly Thr Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 ttc caa ctg gag aag ggt gat cga ctc agc gct gag atc aat ctg cct 480 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro 145 150 155 160 aac tat ctg gac ttt gcc gag tcc ggg cag gtg tac ttt ggg atc att 528 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 gcc ctg aca gct gca caa atc act gca gga ata gct tta cat caa tcc 576 Ala Leu Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser 180 185 190 aac ctc aat tag 588 Asn Leu Asn 195 <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 Trp Leu Ser Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu 50 55 60 Thr Asp Asn Gln Leu Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val 100 105 110 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu 115 120 125 Gly Thr Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 Ala Leu Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser 180 185 190 Asn Leu Asn 195 <210> 5 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(522) <400> 5 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg gca gct gtg cat tca gtg aac tgc aga ctc cgg 96 Arg Gly Ser His Met Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg 20 25 30 gac ata tac cat aaa tcc ctg gtg ctg tcc ggt gca tgt gag ctg cag 144 Asp Ile Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln 35 40 45 gct gtc cac ctc aat gga gag aat aca aac caa caa gtg gtg ttc tgc 192 Ala Val His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys 50 55 60 atg agc ttt gtg caa gga gaa gaa gag act gac aag ata cct gtg gcc 240 Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala 65 70 75 80 ttg ggc ctc aag gga aag aat ctg tac ctg tct tgt ggg acg aaa gat 288 Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Thr Lys Asp 85 90 95 ggg aag ccc atc ctg cag ctg gag aca gta gac ccc aat act tac cca 336 Gly Lys Pro Ile Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro 100 105 110 aag agg aaa atg gaa aag cga ttt gtc ttc aac aag atg gaa atc aag 384 Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys 115 120 125 ggc aac gtg gaa ttt gag tct gca atg tac ccc aac tgg tac atc agc 432 Gly Asn Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser 130 135 140 acc tct caa gca gaa aaa aag cct gtc ttc cta gga aat acc aga ggc 480 Thr Ser Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly 145 150 155 160 ggc cgg gac ata act gac ttc atc atg gaa atc acc tct gcc taa 525 Gly Arg Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala 165 170 <210> 6 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg 20 25 30 Asp Ile Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln 35 40 45 Ala Val His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys 50 55 60 Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala 65 70 75 80 Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Thr Lys Asp 85 90 95 Gly Lys Pro Ile Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro 100 105 110 Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Asn Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser 130 135 140 Thr Ser Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly 145 150 155 160 Gly Arg Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala 165 170 <210> 7 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(534) <400> 7 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg ctc aga tca tct tct cga acc cca agt gac aag 96 Arg Gly Ser His Met Leu Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 cct gta gcc cat gtt gta gca aac ccc caa gcc gag ggg cag ctc cag 144 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 tgg ctg agt ggg cgt gca aat gcc ctc ctg gcc aat ggc gtg aag ctg 192 Trp Leu Ser Gly Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Lys Leu 50 55 60 aca gac aac cag ctg gtg gta cca ttg gat ggg ctg tac ctc atc tac 240 Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Leu Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 tcc cag gtc ctc ttc aaa ggc caa ggc tgc cct tcc acc cat gtg ctc 288 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 ctc acc cac acc atc agc cgc tta gct gtc tcc tac ccg tcc aag gtc 336 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Leu Ala Val Ser Tyr Pro Ser Lys Val 100 105 110 aac ctc ctc tct gcc atc aag agc cct tgc cac acg gag tcc cca gag 384 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Thr Glu Ser Pro Glu 115 120 125 cag gct gaa gcc aag ccc tgg tat gag ccc atc tac ctg gga gga gtc 432 Gln Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 ttc cag ctg gag aag ggt gat caa ctc agc gct gag atc aat cag ccc 480 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ile Asn Gln Pro 145 150 155 160 aac tat ctc gac ttt gcg gag tcc ggg cag gtc tac ttt ggg atc att 528 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile 165 170 175 gcc ctg tga 537 Ala Leu <210> 8 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Leu Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys 20 25 30 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 35 40 45 Trp Leu Ser Gly Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Lys Leu 50 55 60 Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Leu Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 85 90 95 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Leu Ala Val Ser Tyr Pro Ser Lys Val 100 105 110 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Thr Glu Ser Pro Glu 115 120 125 Gln Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ile Asn Gln Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val 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(582) <400> 1 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg ata tcg aat tca gca gcc atg caa tcg gtg gac 96 Arg Gly Ser His Met Ile Ser Asn Ser Ala Ala Met Gln Ser Val Asp             20 25 30 tgc aag tta cag gac ata agc cac aaa tac ctg gtg ctg tct aac tca 144 Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser         35 40 45 tat gag ctt cgg gct ctc cac ctc aat ggg gaa aat gtg aac aaa caa 192 Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln     50 55 60 gtg gtg ttc cac atg agc ttt gtg cac ggg gat gaa agt aat aac aag 240 Val Val Phe His Met Ser Phe Val His Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys 65 70 75 80 ata cct gtg gtc ttg ggc atc aaa caa aag aat ctg tac ctg tcc tgt 288 Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys                 85 90 95 gtg atg aag gat gga aag ccc acc cta cag cta gag aag gta gac ccc 336 Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro             100 105 110 aaa gtc tac cca aag agg aag atg gaa aag cga ttt gtc ttc aac aag 384 Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys         115 120 125 ata gaa atc aag aac aca gtg gaa ttt gag tct tct cag tac cct aac 432 Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn     130 135 140 tgg tac atc agc acc tct caa gtc gaa gga atg cct gtc ttc cta gga 480 Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu Gly Met Pro Val Phe Leu Gly 145 150 155 160 aat acc aga ggt ggc cag gat ata act gac ttc acc atg gaa ttt tct 528 Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser                 165 170 175 tcc aca gct gca caa atc act gca gga ata gct tta cat caa tcc aac 576 Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn             180 185 190 ctc aat tag 585 Leu asn                                                                            <210> 2 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ile Ser Asn Ser Ala Ala Met Gln Ser Val Asp             20 25 30 Cys Lys Leu Gln Asp Ile Ser His Lys Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser         35 40 45 Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln     50 55 60 Val Val Phe His Met Ser Phe Val His Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys 65 70 75 80 Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys                 85 90 95 Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro             100 105 110 Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys         115 120 125 Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn     130 135 140 Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu Gly Met Pro Val Phe Leu Gly 145 150 155 160 Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser                 165 170 175 Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn             180 185 190 Leu asn          <210> 3 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS (222) (1) .. (585) <400> 3 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg gtc aaa tca tct tct cga acc cca agt gac aag 96 Arg Gly Ser His Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys             20 25 30 cca gta gct cat gtt gta gca aac ccc gaa gct gag ggg cag ctc cag 144 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln         35 40 45 tgg ctg agc cga cgt gcc aat gcc ctc ctg gcc aac ggc gtg gag ctg 192 Trp Leu Ser Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu     50 55 60 aca gac aac cag ctg ata gtg ccg tca gat ggg ttg tac ctc atc tac 240 Thr Asp Asn Gln Leu Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 tcc cag gtc ctc ttc aag ggc caa ggg tgc cct tcc acc cat gtg ctc 288 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu                 85 90 95 ctc acc cac acc atc agc cgc ttc gcc gtc tcc tac cag aca aag gtc 336 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val             100 105 110 aac cta ctc tct gcc atc aag agc cct tgc caa agg gag acc cca gag 384 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu         115 120 125 ggg acc gag gcc aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctg gga ggg gtc 432 Gly Thr Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val     130 135 140 ttc caa ctg gag aag ggt gat cga ctc agc gct gag atc aat ctg cct 480 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro 145 150 155 160 aac tat ctg gac ttt gcc gag tcc ggg cag gtg tac ttt ggg atc att 528 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile                 165 170 175 gcc ctg aca gct gca caa atc act gca gga ata gct tta cat caa tcc 576 Ala Leu Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser             180 185 190 aac ctc aat tag 588 Asn Leu Asn         195 <210> 4 <211> 195 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys             20 25 30 Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln         35 40 45 Trp Leu Ser Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu     50 55 60 Thr Asp Asn Gln Leu Ile Val Pro Ser Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu                 85 90 95 Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Phe Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val             100 105 110 Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu         115 120 125 Gly Thr Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val     130 135 140 Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile                 165 170 175 Ala Leu Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser             180 185 190 Asn Leu Asn         195 <210> 5 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS (222) (1) .. (522) <400> 5 atg ggc agc agc cat cat cat cat cat cac agc agc ggc ctg gtg ccg 48 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 cgc ggc agc cat atg gca gct gtg cat tca gtg aac tgc aga ctc cgg 96 Arg Gly Ser His Met Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg             20 25 30 gac ata tac cat aaa tcc ctg gtg ctg tcc ggt gca tgt gag ctg cag 144 Asp Ile Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln         35 40 45 gct gtc cac ctc aat gga gag aat aca aac caa caa gtg gtg ttc tgc 192 Ala Val His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys     50 55 60 atg agc ttt gtg caa gga gaa gaa gag act gac aag ata cct gtg gcc 240 Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala 65 70 75 80 ttg ggc ctc aag gga aag aat ctg tac ctg tct tgt ggg acg aaa gat 288 Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Thr Lys Asp                 85 90 95 ggg aag ccc atc ctg cag ctg gag aca gta gac ccc aat act tac cca 336 Gly Lys Pro Ile Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro             100 105 110 aag agg aaa atg gaa aag cga ttt gtc ttc aac aag atg gaa atc aag 384 Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys         115 120 125 ggc aac gtg gaa ttt gag tct gca atg tac ccc aac tgg tac atc agc 432 Gly Asn Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser     130 135 140 acc tct caa gca gaa aaa aag cct gtc ttc cta gga aat acc aga ggc 480 Thr Ser Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly 145 150 155 160 ggc cgg gac ata act gac ttc atc atg gaa atc acc tct gcc taa 525 Gly Arg Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala                 165 170 <210> 6 <211> 174 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Ala Val His Ser Val Asn Cys Arg Leu Arg             20 25 30 Asp Ile Tyr His Lys Ser Leu Val Leu Ser Gly Ala Cys Glu Leu Gln         35 40 45 Ala Val His Leu Asn Gly Glu Asn Thr Asn Gln Gln Val Val Phe Cys     50 55 60 Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Glu Thr Asp Lys Ile Pro Val Ala 65 70 75 80 Leu Gly Leu Lys Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Gly Thr Lys Asp                 85 90 95 Gly Lys Pro Ile Leu Gln Leu Glu Thr Val Asp Pro Asn Thr Tyr Pro             100 105 110 Lys Arg Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Met Glu Ile Lys         115 120 125 Gly Asn Val Glu Phe Glu Ser Ala Met Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser     130 135 140 Thr Ser Gln Ala Glu Lys Lys Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly 145 150 155 160 Gly Arg Asp Ile Thr Asp Phe Ile Met Glu Ile Thr Ser Ala                 165 170 <210> 7 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> fusion gene <220> <221> CDS (222) (1) .. 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Claims (11)

척추동물의 골관절염 치료용 백신으로서, IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 포함하고, 상기 IL-1β 및 임의적인 TNF-α, 또는 그 유도체와 연합된, 상기 백신이 상기 척추동물에서 상기 척추동물의 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 자가 분자에 대한 면역 반응을 유발하도록 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분을 포함하는 백신.A vaccine for treating osteoarthritis of vertebrates, the vaccine comprising IL-1β and optionally TNF-α cytokines, or derivatives thereof, wherein the vaccine is associated with the IL-1β and optional TNF-α, or derivatives thereof A vaccine comprising a non-valent portion of said vertebrate to elicit an immune response against said vertebrate's IL-1β and optionally TNF-α automolecules. 제1항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 치료되는 척추동물에 대해 동종성인 백신.The vaccine of claim 1, wherein the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are homologous to the vertebrate being treated. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분이 미생물로부터 유래된 항원성 결정인자를 포함하는 것인 백신.The vaccine of claim 1 or 2, wherein the non-valent portion of the vertebrate comprises an antigenic determinant derived from a microorganism. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 척추동물에 대해 비자가인 부분이 면역보조제(adjuvant)를 포함하는 것인 백신.The vaccine according to any one of claims 1 to 3, wherein the portion which is non-valent to the vertebrate comprises an adjuvant. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 상기 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인과 비교할 때 감소된 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 백신.5. The reduced biological activity of claim 1, wherein said IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are reduced compared to autologous IL-1β and TNF-α cytokines of said vertebrate. Vaccine, characterized in that having a. 척추동물의 골관절염 치료용 백신을 제조하기 위한 IL-1β 및 임의적으로 TNF-α 사이토카인의 용도.Use of IL-1β and optionally TNF-α cytokine to prepare a vaccine for treating osteoarthritis of vertebrates. 제6항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 치료되는 척추동물에 대해 동종성인 용도.Use according to claim 6, wherein the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are homologous to the vertebrate being treated. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 백신을 제조하기 위해 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 미생물로부터 유래된 항원성 결정인자와 연합하는 것인 용도.8. Use according to claim 6 or 7, wherein the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are associated with antigenic determinants derived from a microorganism to prepare the vaccine. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신을 제조하기 위해 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체를 면역보조제와 연합하는 것인 용도.The use according to any one of claims 6 to 8, wherein the IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are associated with an adjuvant to prepare the vaccine. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인, 또는 그 유도체가 상기 척추동물의 자가 IL-1β 및 TNF-α 사이토카인과 비교할 때 감소된 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.9. The reduced biological activity according to claim 6, wherein said IL-1β and TNF-α cytokines, or derivatives thereof, are reduced compared to autologous IL-1β and TNF-α cytokines of said vertebrate. Use, characterized in that having. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 백신을 투여하는 것에 의한 척추동물의 골관절염 치료법.
A method for treating osteoarthritis in vertebrates by administering a vaccine according to any one of claims 1 to 5.

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