KR20100081805A - Method for producing cloned canidae using nuclear transfer of somatic cells or stem cells - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 또는 줄기세포의 핵 이식 산자 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 핵 공여 세포로 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포를 사용하고, 수용 세포로 감수분열 말기 II 단계의 난모 세포를 사용함을 특징으로 하는, 신규한 복제된 개과 동물의 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing nuclear transplanted litters of somatic cells or stem cells of canidae animals, and more specifically, using somatic cells or stem cells of mitotic G2 / M stage as nuclear donor cells, and susceptible to recipient cells. A novel method for producing cloned canine animals, characterized by the use of oocytes in the late stage II stage of division.
근래에 생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 유용한 작물들을 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다. 복제동물의 생산은 현실적으로 생명공학 분야에서도 실로 고도로 축적된 기술적 뒷받침이 전제된 후에야 비로소 가능한 것이므로, 이러한 점에서 상기 복제동물의 생산은 당해 기술 수준의 척도가 되는 것이다.Recently, according to the development of biotechnology or genetic engineering technology, various production success cases of various recombinant organisms combining useful crops with desired traits have been published. Recently, success cases of producing cloned animals such as sheep have been reported one after another. It became. Since the production of cloned animals is practically possible only after a highly accumulated technical support is premised in the field of biotechnology, the production of cloned animals is a measure of the technical level in this respect.
그 중 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다. Among them, the somatic cell nuclear transfer technology is a technology that can give birth to progeny without passing through meiosis and hemi-chromosomal-bearing germ cells. Producing and transplanting the fertilized egg into vivo to produce new individuals.
일반적으로 체세포 핵이식 기술에서 핵 공여 세포를 이식할 수핵 난자(recipient oocyte)는 인위적으로 시험관 내(in vitro)에서 배양하여 2차 감수분열 중기까지 도달하도록 성숙시켜 사용한다. 그 다음 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상 발생을 방지하기 위하여 체세포를 이식하기 전에 상기 성숙 난자의 핵을 제거하고 상기 탈핵 난자의 주란강 또는 세포질 내에 체세포를 주입한다. 그 후 상기 탈핵 난자와 주란강 또는 세포질에 주입된 체세포를 전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시키고 전기자극 또는 화학물질에 의하여 활성화시킨 후 대리모에 이식하여 산자를 탄생시킨다.In general, in a somatic cell nuclear transfer technique, recipient oocytes to be transplanted with nuclear donor cells are artificially cultured in vitro and matured to reach the second stage of meiosis. Then, in order to prevent the occurrence of chromosomal aberration due to somatic cell nuclear transfer, the nucleus of the matured egg is removed and somatic cells are injected into the oocytes or cytoplasm of the denuclear egg before transplanting the somatic cell. Thereafter, the denuclear eggs and somatic cells injected into the egg oocyte or cytoplasm are physically fused through electrical stimulation, activated by electric stimulation or chemicals, and then transplanted into surrogate mothers to produce litters.
이러한 체세포 핵 이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀 멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포 유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.These somatic cell nuclear transfer technologies are of great medical value, such as breeding high-quality animals, preserving rare endangered animals, producing specific nutrients, producing biomaterials for treatment, producing organ transplant animals, producing diseased animals, and treating cell genes. It can be widely used in such fields as the production of an animal for transplant transplantation.
체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577). 한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다. Mammalian cloning technology using somatic cell nuclear transfer was performed by Dr. Wilmut of the Roslin Institute in the UK, where mammary gland cells harvested from a 6-year-old sheep were transplanted into a nucleated egg to produce a nuclear transfer embryo, and then transplanted in vivo. It succeeded for the first time by creating Dolly, a somatic cell clone. Since then, cloned litter production by somatic cell nuclear transfer methods has been reported in cattle, mice, goats, pigs and rabbits (WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 and US5,945,577). On the other hand, cloning of dogs or other pets, along with cloning of industrial animals such as cattle and pigs, is of interest to many people. Recently, a cat was cloned for the first time as a pet, and research on dog cloning was conducted with millions of dollars.
그러나 개의 경우 발정이 오지 않은 암캐의 난소에서 미성숙 난자를 채취하여, 이 난자를 체외에서 성숙 배양하는 것은 매우 어렵다. 이것은 독특한 종-특이적 생식 특성으로 인해 다른 동물에 비해 체세포 핵 이식에 의한 복제가 매우 어려운 이유 중 하나이다. However, in the case of dogs, it is very difficult to obtain immature eggs from female ovaries that do not have estrous, and mature the eggs in vitro. This is one of the reasons why replication by somatic cell nuclear transfer is very difficult compared to other animals due to its unique species-specific reproductive properties.
그럼에도 불구하고 개는 인간과 생리학적 특성이 비슷하고 사람과 동물의 유사한 질병 발생 패턴을 을 가지고 있어 병리학적, 생리학적으로도 유사하며, 실제로 인간 질병연구에 응용할 수 있는 유전 질병의 수가 65개의 돼지나 136개의 고양이와 비교해 개는 224개로 월등히 많아 (http://omia.angis.org.au/) 이러한 유전 형질을 이용하여 인간의 질병모델 복제개를 만들면 인간 질병연구에 큰 도움이 되는 중요한 의미가 있다. 그렇기 때문에 오랜 기간 개복제에 대한 시도가 이루어져왔으나, 현재까지 개 복제는 여전히 성공률이 극히 낮고, 성공하기 어려운 복제로 여겨지고 있으므로, 개과 동물의 복제 효율을 향상시키기 위한 효과적인 방법이 필요한 실정이다Nevertheless, dogs have similar physiological characteristics to humans and have similar pattern of disease outbreaks in humans and animals, so they are pathologically and physiologically similar, and the number of genetic diseases that can be applied to human disease research is actually 65 pigs. Compared with 136 cats, there are 224 dogs (http://omia.angis.org.au/). Creating a cloned human disease model using these genetic traits is important for human disease research. There is. As a result, there have been many attempts at cloning for a long time, but until now, dog cloning is still considered to be extremely low and difficult to succeed. Therefore, an effective method for improving canine cloning efficiency is needed.
이에 본 발명자들은 핵이식 방법에 의한 향상된 복제개의 생산방법을 연구하 던 중 핵 공여 세포로 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포를, 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 이식함으로써, 기존의 방법에서의 재구성된 배의 핵 재프로그래밍 등의 공정이 필요없은 간단한 방법에 의해서 고효율로 복제개를 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors transplanted somatic cells or stem cells of mitotic G2 / M stages into denucleated oocytes of late stage of meiosis as nuclear donor cells while studying improved production methods of cloned dogs by nuclear transplantation. The present invention was completed by confirming that the cloned dog can be produced with high efficiency by a simple method that does not require a process such as nuclear reprogramming of the reconstructed ship in the existing method.
본 발명의 목적은 감수분열 말기의 난모 세포를 사용한 핵이식 기술을 이용하여 개과 동물의 핵 이식란을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. . It is an object of the present invention to provide a method for producing a nuclear transfer embryo in canine by using a nuclear transplantation technique using oocytes in the late meiosis. .
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된, 복제된 개과 동물 생산을 위한 핵 이식란을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a nuclear transfer embryo for the production of cloned canine animals produced by the above method.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 핵 이식란을 대리모에 이식하여 산자를 출생하는 단계를 포함하는, 생산 효율이 향상된 복제된 개과 동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a method for producing a cloned canine animal, the production efficiency of which includes the step of implanting the nuclear transfer egg into the surrogate mother to give birth.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 핵이식 기술을 이용한 개의 핵 이식란 생산방법에 있어서, 핵 공여 세포를 감수분열 말기의 탈핵된 난모 세포, 바람직하게는 감수분열 말기 II단계의 탈핵된 난모 세포에 이식시키는 단계를 포함하는 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a nuclear transfer embryo of a dog using nuclear transfer technology, wherein the nuclear donor cells are denuclearized oocytes at the end of meiosis, preferably endothelial oocytes at the end of meiosis. It provides a method for producing a nuclear transfer egg of a dog animal comprising the step of implanting in.
이 때, 핵 공여 세포로서 유사분열 G2/M단계의 체세포 또는 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 유사분열 G2/M단계의 체세포는 핵공여 세포 제조시에 로스코비틴(R-Roscovitine)과 같은 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 과정을 거쳐 유사분열 G2/M단계로 유도시킬 수 있고, 상기 줄기세포는 배아 또는 성체 유래일 수 있다. At this time, it is preferable to use somatic cells or stem cells of the mitotic G2 / M stage as nuclear donor cells. In particular, the somatic cells of the mitotic G2 / M stage may be induced to mitotic G2 / M stage through the process of culturing by adding a cell cycle synchronization inducer such as R-Roscovitine at the time of nuclear donor cell preparation. The stem cells may be of embryo or adult origin.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 개과 동물의 핵 이식란을 제공한다.The present invention also provides a canine nuclear transfer embryo prepared by the above method.
본 발명은 또한 상기 핵 이식란을 제조 즉시 대리모에 이식하여 발생시키는단계를 포함하는, 복제된 개과 동물의 생산 방법을 제공하는 것이다.The present invention also provides a method for producing a cloned canine animal comprising the step of transplanting the nuclear transfer embryos into surrogate mothers immediately after preparation.
본 발명은 개과 (Canidae) 동물의 체세포 또는 줄기세포를 이용한 새로운 핵 이식 산자 생산 방법으로서, 재구성된 배의 핵 재프로그래밍 과정이 없는 간단한 방법에 의해 복제가 어려운 개과 동물의 복제를 효과적으로 가능하게 함으로써 개과 동물의 우량 품종의 번식, 보존, 이종이식, 질환 모델동물 등 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있다.The invention canine (Canidae) canine by enabling a new nuclear transfer method offspring produced using somatic cell or stem cell of the animal, the replication, the replication of difficult canines by not a nuclear reprogramming process of the reconstructed ship simple way effectively It can contribute to the development of veterinary medicine, anthropology and medical research, such as breeding, preservation, xenotransplantation and disease model animals.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.Definitions of terms used in the present invention are as follows.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식'은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다.As used herein, the term 'nuclear transplant' refers to a genetic engineering technique for artificially binding another cell or nucleus to a denuclearized egg to have the same trait.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 이식란'은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.As used herein, the term 'nuclear transplant' refers to an egg into which a nuclear donor cell is introduced or fused.
본 발명에서 사용된 용어 '복제'는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. As used herein, the term 'cloning' is a genetic engineering technique that creates a new individual with the same set of genes as one individual, and in particular in the present invention, cells, embryonic cells, fetal-derived cells and / or adult-derived cells are nuclear DNA of another cell. Refers to a nuclear DNA sequence that is substantially identical to the sequence.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 공여 세포'는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. As used herein, the term 'nuclear donor cell' refers to a cell or cell nucleus that delivers the nucleus to a nucleus pulposus that is a nuclear receptor.
본 발명에서 사용된 용어 '계대배양(Subcultury)' 은 세포는 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양 접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양 접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시키는데 이때 세포를 동물에서 떼어 내어 일차, 이차, 삼차 등등 계속하여 배양하는 방법 즉, 주기적으로 새로운 배지를 교환함으로써 세포주를 보존하는 방법을 말한다. The term 'subcultury' used in the present invention is because the cells grow and stop in a monolayer, the cells are multiplied by detaching the cells from the culture dish and culturing them in a new culture dish. , Tertiary, etc., and the method of continually culturing, that is, the method of preserving cell lines by periodically changing fresh medium.
본 발명에서 사용된 용어 '수핵 난자'는 탈핵 과정을 통해 본래의 핵이 제거되고 핵 공여 세포로부터 핵을 전달받는 난자를 말한다.As used herein, the term 'nucleated nucleus egg' refers to an egg whose original nucleus is removed through a denuclearization process and receives a nucleus from a nuclear donor cell.
본 발명에서 사용된 용어 '난자'는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다.The term 'oval', as used herein, preferably refers to mature eggs that have reached the second mid-meiosis.
본 발명에서 사용된 용어 '탈핵 난자'는난자의 핵이 제거된 것을 말한다. As used herein, the term 'denuclear egg' refers to an egg whose nucleus has been removed.
본 발명에서 사용된 용어 '융합'은 핵 공여 세포와 수핵 난자의 지질막 부분의 결합을 의미한다. 예를 들어, 지질막은 세포의 플라스마 막 또는 핵막이 될 수 있다. 융합은 핵 공여 세포와 수핵 난자가 서로 인접하게 위치해 있는 경우 또는 핵 공여 세포가 수핵 난자의 주란강(perivitelline space) 내에 위치해 있는 경우 에 전기적 자극을 가함으로써 일어날 수 있다.As used herein, the term 'fusion' refers to the binding of a nuclear donor cell to a lipid membrane portion of a nucleus cell. For example, the lipid membrane can be the plasma membrane or nuclear membrane of a cell. Fusion can occur by applying electrical stimulation when the nuclear donor cells and the nucleus ova are located adjacent to each other or when the nuclear donor cells are located in the perivitelline space of the nucleus ova.
본 발명에서 사용된 용어 '핵 재프로그래밍(nuclear reprogramming)'는 핵 이식 과정 중 수핵 난자와 공여 세포를 융합한 후 공여 세포주의 핵이 재구성 되도록 일정 시간을 항온 배양하는 것으로, 핵 이식란(복제 수정란)의 정상적인 발생을 유도하는 과정을 말한다. The term 'nuclear reprogramming' used in the present invention is to incubate a predetermined time so that the nucleus of the donor cell line is reconstructed after fusion of the nucleus nucleus and the donor cell during the nuclear transplantation process. Refers to the process of inducing normal occurrence.
본 발명에서 사용된 용어 '활성화'는 핵 전이 단계 전, 핵 전이 단계 동안 및 핵 전이 단계 후에 세포가 분열하도록 자극을 주는 것을 말한다. 바람직하게는, 본 발명에서는 핵 전이 단계 이전에 미리 자극을 주는 것을 말한다.As used herein, the term 'activation' refers to stimulating cells to divide before, during, and after the nuclear transfer stage. Preferably, in the present invention refers to the stimulation before the nuclear transfer step.
본 발명에서 사용된 용어 '산자(living offspring)'는 자궁 밖에서 생존할 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 1초, 1분, 한 시간, 하루, 한 주, 한달, 6달 또는 일년 이상 생존할 수 있는 동물을 말한다. 상기 동물은 생존을 위해 자궁 내 환경을 필요로 하지 않는다.As used herein, the term 'living offspring' refers to an animal that can survive outside the uterus. Preferably, an animal capable of surviving at least one second, one minute, one hour, one day, one week, one month, six months, or one year. The animal does not need an intrauterine environment for survival.
본 발명에서 '개과 동물(canidae)'은 크게 개족(Tribe Canini)과 여우족(Tribe Vulpini)으로 나눌 수 있고, 개, 늑대, 재칼, 여우, 승냥이, 너구리, 코요테 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 개 또는 늑대가 포함된다. 상기 개는 야생의 늑대가 가축화된 것으로 알려져 있으며 이에 따라 늑대와 개는 염색체 수가 동일하고 임신기간, 성 호르몬의 변화가 유사한 양상을 나타낸다(Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본 발명에 있어서 상기 '개과 동물'이라는 용어에 대하여, '개'로 단순히 줄여서 혼용하여 쓰기도 한다.In the present invention, 'canidae' can be largely divided into tribe (Tribe Canini) and fox (Tribe Vulpini), and may include dogs, wolves, jackals, foxes, hunters, raccoons, coyotes and the like. Preferably dogs or wolves are included. The dogs are known to have lived wild wolves, and therefore, the wolf and the dog have the same chromosome number, and the pregnancy and sex hormones are similar (Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21: 1057-1066). ). In the present invention, the term 'canine animal' may be shortened to 'dog' and used interchangeably.
본 발명은 일 관점에서 핵 공여 세포를 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 이식 후 융합시키는 단계를 포함하는, 개과 동물의 핵 이식란을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵 공여 세포로서 개의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있고, 바람직하게는 줄기세포를 사용한다. In one aspect, the present invention relates to a method for producing a nuclear transfer embryo in a canine, comprising the step of fusion after nuclear donor cells to denuclearized oocytes in the late stage of meiosis. Dog somatic cells or stem cells can be used as the nuclear donor cells, preferably stem cells.
본 발명의 일 구체예에서는 핵 공여 세포로서 개의 체세포를 사용한다. In one embodiment of the present invention, dog somatic cells are used as nuclear donor cells.
본 발명에서 사용하는 체세포는 특히 유사분열 G2/M단계의 체세포를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 유사분열 G2/M단계의 체세포는 핵공여 세포 제조시에 로스코비틴(R-Roscovitine)과 같은 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 과정을 거쳐 유사분열 G2/M단계로 유도시킬 수 있다. In particular, the somatic cells used in the present invention preferably use somatic cells of the mitotic G2 / M stage. In particular, the somatic cells of the mitotic G2 / M stage may be induced to mitotic G2 / M stage through the process of culturing by adding a cell cycle synchronization inducer such as R-Roscovitine at the time of nuclear donor cell preparation. Can be.
구체적으로, 본 발명의 개과 동물의 핵 이식란 생산방법은 Specifically, the method for producing a nuclear transfer egg of a canine animal of the present invention
(a) 감수분열 중기 II 단계의 개 난모 세포를 활성화 시킨 후 일정 시간 항온 배양하여 감수분열 말기 II 단계를 유도하는 단계; (a) activating dog oocytes in the middle stage of meiosis and then incubating for a period of time to induce end stage II of meiosis;
(b) 상기 감수분열 말기 II 단계의 개 난모 세포의 핵을 제거하여 탈핵된 난모 세포를 수득하는 단계;(b) removing the nuclei of the dog oocytes of stage II of meiosis to obtain denucleated oocytes;
(c) 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 유사분열 G2/M단계로 유도하여 핵 공여 체세포를 수득하는 단계; 및(c) inducing somatic cells isolated from the dog tissues to mitosis G2 / M to obtain nuclear donor somatic cells; And
(d) 상기 (b) 단계의 탈핵 난모 세포에 (c) 단계의 핵 공여 세포를 주입하고 융합시키는 단계를 포함한다. (d) injecting and fusing the nuclear donor cells of step (c) to the denuclear oocytes of step (b).
본 발명의 (b)에서, 핵 공여 세포의 수용 세포로는 감수분열 말기 II 단계(제2 감수분열 말기)의 탈핵된 난모 세포 를 사용한다. In (b) of the present invention, denuclearized oocytes of end stage II (end stage 2) are used as recipient cells of nuclear donor cells.
기존의 개 복제 기법은 도 1에 간단하게 모식도로 나타내고 있는데, 기존의 복제 개 생산을 위한 체세포 핵이식 과정은 감수분열 중기 II 단계의 난모세포 와 휴지기의 공여세포를 사용 하여 왔다. 복제 수정란의 정상적인 발달을 위해서는, 수핵 난자와 공여세포의 핵의 세포주기 동기화가 필수적이다. 일반적으로, 핵이식에 필요한 대량의 난모세포를 안정적으로 얻기 위하여, 수정 혹은 활성화 이전, 난모세포의 세포주기가 정지되어 있는 상태인, 감수분열 중기 II 단계를 그 적기로 이용해 왔다. 이러한 감수분열 중기 II 단계의 난모세포를 이용한 핵이식에 적절한 공여 세포의 세포주기로 일반적으로 간기인 G1 혹은 휴지기인 G0 기의 체세포가 선택 되어져 왔다. 그 이유는, 이 시기로의 세포주기 동기화 기법이 간단하면서도 그 수율이 80~90% 이상으로 매우 높기 때문이다. 그러나, 간기 혹은 휴지기의 세포는 실제 난모세포의 세포주기인 감수분열 중기 II 시기와는 큰 차이가 나는 단계이기에, 이 난모세포-공여핵세포 간 세포주기 차이를 극복할 수 있는 새로운 전략이 필요해 왔다. The conventional dog cloning technique is shown schematically in FIG. 1, and the somatic cell nuclear transfer process for producing cloned dogs has used oocytes in the middle stage of meiosis and donor cells in the resting phase. For normal development of replication fertilized eggs, cell cycle synchronization of the nucleus of the nucleus pulposus and donor cells is essential. In general, in order to stably obtain a large amount of oocytes required for nuclear transfer, the stage of meiosis mid-phase II, in which the cell cycle of the oocytes is stopped before fertilization or activation, has been used as the appropriate time. As a cell cycle of donor cells suitable for nuclear transplantation using oocytes of the meiosis mid-phase II stage, somatic cells of the interphase G1 or the resting phase G0 have been selected. This is because the cell cycle synchronization technique at this time is simple and the yield is very high, more than 80-90%. However, since the cells in the interphase or resting phase are very different from the period of meiosis II, which is the actual cell cycle of oocytes, a new strategy to overcome the cell cycle difference between oocyte-donor nuclei cells has been needed. .
이러한 이유로 기존의 개 복제 기법에 있어서는, 감수분열 중기 II 난모세포에 G0/G1 기의 공여세포주를 융합 시킨 후, 추가적인 자극 없이 수 시간동안 항온 배양을 하는 재프로그래밍 (Reprogramming) 의 단계를 가지고 있었다. 이 과정 동안, 공여세포의 세포핵은 중기 II 난모세포가 가지고 있는 고농도의 MPF(Matufation Promoting Factor)에 의해, 핵막 붕괴 과정 (NEBD; Nuclear Envelope Break Down) 및 조숙 염색체 응축 과정 (PCC; Premature Chromosomal Condensation) 등의 일련의 과정을 거치며, 난모세포와 유사한 형상의 핵상으로 변화되어 갔다. For this reason, in the conventional dog cloning technique, the G0 / G1 donor cell line was fused to meiosis mid-II oocytes, and then reprogrammed for several hours without further stimulation. During this process, the cell nuclei of donor cells are enriched by high concentrations of the maturation promoting factor (MPF) of medium II oocytes. Through a series of processes, such as the oocytes have been changed into a nuclear image.
그러나 이와같은 고농도의 MPF에 의한 인위적 핵상 변화는 그 과정이 매우 불안정 적이고, 초래되는 결과 역시 우연성에 기초한 무작위적인 것이란 점에서 복제 동물 생산의 큰 문제로 지적되어져 왔다. 실제로, 이러한 방법의 핵이식에 기초한 복제 동물 생산 과정은 동물 종을 막론하고, 그 효율이 매우 낮았던 것이 현실이다. However, the artificial nuclear phase change caused by the high concentration of MPF has been pointed out as a big problem in the production of cloned animals in that the process is very unstable and the result is random based on contingency. Indeed, the process of producing cloned animals based on nuclear transfer of this method has been very low, regardless of the animal species.
이에 반하여, 본 발명에서는 제2 감수 분열 중기의 난모세포를 미리 활성화 시킨 후 유도된 제2 감수 분열의 말기(telophase-stage)의 난모세포를 사용하고, 이에 대응하는 공여 세포로 유사 분열 G2/M 단계의 체세포 혹은 줄기 세포를 사용한다는 점을 특징으로 한다. 이는 기존의 기법이 가지고 있던 수용체 난모 세포 와 공여 세포간의 세포주기의 차이를 최소화한 기법으로, 복제 수정란의 정상적이로 건강한 발달을 유도, 그 생산의 효율을 높일 수 있는 방법이다. 또한, 세포 주기 상 유사한 수핵 난자 및 공여 세포주의 결합에 의한 방법이므로, 별도의 핵의 재프로그래밍 과정을 거칠 필요가 없는 장점이 있다. In contrast, the present invention uses the oocytes at the end of the second meiosis after activating the oocytes of the second meiosis during the second period, and mitosis G2 / M as corresponding donor cells. It is characterized by the use of somatic or stem cells. This method minimizes the difference in cell cycle between receptor oocytes and donor cells, which is a conventional technique, and induces healthy development of cloned fertilized eggs and enhances their production efficiency. In addition, since it is a method by combining similar nucleated nucleus ova and donor cell line in the cell cycle, there is an advantage that does not need to go through a separate reprogramming process of the nucleus.
본 발명의 상기 개과 동물의 핵 이식란 생산방법 중 (c)단계는, 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 배양하는 공정에 의해 수행될 수 있다. Step (c) of the method for producing a nuclear transfer embryo of the canine animal of the present invention, may be performed by the step of culturing the somatic cells isolated from the dog tissue by adding a cell cycle synchronization inducing substance.
유사 분열 세포 주기에는 뚜렷한 4 단계, 즉 G, S, G2 및 M이 있고, 개시기라고 부르는 세포 주기의 초기 상태는 G1단계에서 일어나고, 다른 세포 주기를 나타내게 하는 선택이나 결정 또는 유도는 개시기에 이루어진다. 세포는 일단 개시기를 지나 진행하면, 전(前)DNA 합성 단계인 G1 단계의 후반 단계까지 진행된다. 제2 단계인 S 단계는 DNA 합성이 일어나는 시기이다. 이 시기 다음에는 DNA 합성과 유사 분열기 사이의 시기인 G2 단계가 온다. 유사 분열 자체는 M 단계에서 일어나는 시기이다. 휴지기 세포(quiescent cell)는 일반적으로 분열 또는 증식을 하지 않는 상태에 있는 세포로서, 상기 세포 주기의 4 단계 중 어느 한 단계에 있는 것이 아닌 것으로 간주된다. 따라서, 이들이 세포 주기를 통해 정상적으로 진행되지 않는다는 것을 나타내기 위해 보통 G0상태에 있는 것으로 표기한다. There are four distinct stages of the mitotic cell cycle: G, S, G2, and M, and the initial state of the cell cycle, called the initiator, occurs at the G1 stage, and the selection, determination, or induction that leads to a different cell cycle occurs at the initiator. Is done. Once the cell has passed past the initiator, it progresses to the later stages of the pre-DNA synthesis stage, the G1 stage. The second step, S, is when DNA synthesis occurs. This period is followed by the G2 phase, the period between DNA synthesis and mitosis. Mitosis itself is the time that occurs in phase M. Quiescent cells are generally cells that do not divide or proliferate and are not considered to be in any of the four phases of the cell cycle. Thus, they are usually labeled as G0 to indicate that they do not progress normally through the cell cycle.
종래의 방법에 따르면, 체세포 핵 이식에 사용하는 핵 공여 세포로서 기아 배양 등을 통해 수득한 휴지기 세포를 사용하는 것이 적합한 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서는 유사분열 G2/M 단계의 핵 공여 체세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. According to the conventional method, it is known to use resting cells obtained through starvation culture or the like as nuclear donor cells used for somatic cell nuclear transfer. However, the present invention is characterized by using nuclear donor somatic cells of the mitotic G2 / M stage.
세포주기 동기화 유도물질이란, 핵분열기(M기)·DNA합성전기(G1기)·DNA합성기(S기)·DNA합성후기(G2기)로 이루어진 세포주기 중 특정한 하나의 세포주기로 세포들을 일시정지 시키는 물질이며, 본 발명에서는 핵 공여 체세포의 세포주기를 DNA합성후기인 G2기에서 정지시키는 물질을 사용한다. G2/M기로의 특정 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가함으로써, 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모세포와 융합하여 발생을 위한 별도의 핵 재프로그래밍 공정을 생략할 수 있는 핵 공여 체세 포를 수득할 수 있고, 나아가 개과 (canidae) 동물의 체세포 핵 이식 산자 생산 효율을 향상시킬 수 있다. Cell cycle synchronization inducer is a cell cycle consisting of nuclear fission (M), DNA synthesis (G1), DNA synthesis (S), and late DNA synthesis (G2). In the present invention, a substance which stops the cell cycle of nuclear donor somatic cells in the G2 phase, which is a late stage of DNA synthesis, is used. By adding a specific cell cycle synchronization inducer to the G2 / M group, a nuclear donor cell can be obtained that can be fused with denuclearized oocytes at the end of meiosis to omit a separate nuclear reprogramming process for development. In addition, it is possible to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer production of canidae animals.
상기 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 저농도에서는 G0/G1기를 블로킹하고 고농도에서는 G2/M기를 블로킹 하는 로스코비틴(Roscovitine)(화학식 1); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide)(화학식 2); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO)(화학식 3); Cdk 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I)(화학식 4); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin)(화학식 5); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine)(화학식 6);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine)(화학식 7); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine)(화학식 8); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342)(화학식 9)등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 이하와 같다. 본 발명에서는, G2/M기의 세포주기를 유도하기 위하여, 바람직하게는 로스코비틴(Roscovitine), 디메콜신(Demecolcine) 또는 콜치신(colchicine)을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 로스코비틴을 사용한다. Examples of the cell cycle synchronization inducing substance include Roscovitine (Chemical Formula 1), which blocks G0 / G1 groups at low concentrations and blocks G2 / M groups at high concentrations as cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitors; Cycloheximide (Formula 2) blocking the G0 / G1 group; Dimethyl Sulfoxide (DMSO) blocking the G0 / G1 group (Formula 3); Butyrolactone I (Chemical Formula 4) blocking the G1 / S group with a Cdk inhibitor; Aphidicolin (Scheme 5) blocking S initiation as an inhibitor of DNA polymerase A and D; Demecolcine (Formula 6), which blocks the M group in mitosis mid-phase; Mimosine (Formula 7), which blocks the S group as a DNA replication inhibitor; Colchicine blocking the G2 / M group as microtubule inhibitors (Formula 8); And Hoechst 33342 (Formula 9) as DNA topoisomerase, and the chemical structural formulas for the respective substances are as follows. In the present invention, in order to induce the cell cycle of the G2 / M phase, roscovitine, demecolcine or colchicine may be preferably used, and most preferably roscovitine use.
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2][Formula 2]
[화학식 3](3)
[화학식 4][Formula 4]
[화학식 5][Chemical Formula 5]
[화학식 6][Formula 6]
[화학식 7][Formula 7]
[화학식 8][Formula 8]
[화학식 9][Formula 9]
본 발명의 일 실시예에서는 개의 조직으로부터 분리한 체세포에 로스코비틴(Roscovitine)을 고농도(25-100 uM)로 처리하여 세포 주기를 유사분열 G2/M단계로 유도시킨 핵 공여 세포를 제조한다. In an embodiment of the present invention, the somatic cells isolated from the dog tissues are treated with roscovitine at a high concentration (25-100 uM) to prepare nuclear donor cells induced with a mitotic G2 / M phase.
이처럼, 종래 방법과는 상이하게 G2/M기의 핵 공여 세포를 사용하면, 기존의 방법과 비교하여 좀 더 안정적인 복제 수정란 생산이 가능하다. G2/M기의 세포는 세포분열에 앞서 DNA 의 복제를 마무리하고, 세포 분열의 시작을 위해 대기하는 단계이다. 이 시기의 세포 핵은, 정상적인 난자와 정자의 융합에 의해 이루어진 수정란이 전핵시기를 거친 후 첫 번째 분열을 시작하기 직전의 단계와 동일한 주기 및 핵상과 동일한 단계이다. As such, using nuclear donor cells of the G2 / M phase differently from the conventional method, more stable replication fertilized egg production is possible as compared with the conventional method. Cells in G2 / M phase complete the replication of DNA prior to cell division and wait for cell division to begin. The cell nucleus of this period is at the same cycle and nuclear phase as the stage just before the fertilized egg made by the fusion of normal eggs and sperm passes the pronuclear stage and begins the first division.
기존의 기법에 있어서는 이식된 휴지기 및 G1 기의 세포 핵이 중기 II 난모 세포의 MPF 에 의해 무작위적으로, 우연에 의해 G2/M 시기와 유사한 세포 핵으로 유도 된 것과 달리, 본 발명은, 정상적인 세포주기를 이용해 좀 더 안정적이고 정확하게 G2/M 기를 유도하여 사용한다. 그러므로 본 발명은, 이후 복제 수정란의 발달에 있어서, 세포주기의 부정확성에 의해 야기될 수 있는 비정상적인 발달을 미연에 방지하고, 그 생산 효율을 높일 수 있다.In the conventional technique, the transplanted resting and G1 cell nuclei are randomly induced by the MPF of mid-term II oocytes, and by chance, to the cell nucleus similar to the G2 / M phase. Use the cycle to guide G2 / M groups more stably and accurately. Therefore, the present invention can later prevent abnormal development that may be caused by inaccuracy of the cell cycle in the development of replication fertilized eggs, and increase its production efficiency.
본 발명의 상기 (c)단계는 크게 세포막융합법 및 세포질내미세주입법으로 수행될 수 있다. 세포막융합법은 간단하며 대규모 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질내 미세주입법은 핵과 난자내 물질들과의 접촉을 극대화시킬 수 있다. Step (c) of the present invention can be largely performed by cell membrane fusion and cytoplasmic microinjection. Cell membrane fusion is simple and suitable for large-scale fertilized egg production. Intracellular microinjection can maximize the contact between the nucleus and egg material.
본 발명에서는 두가지 기법이 모두 사용 가능하지만, 바람직 하게는 세포막융합법을 사용하는 것이 유리하다. 세포질내 미세주입법은 그 기법의 특성상, 수용 난모세포의 세포막을 침습적으로 뚫고 들어가므로, 그 과정에서 세포막의 손상을 입고, 난모세포가 사멸하는 경우가 흔히 발생한다. 개과 동물의 복제 생산에 있어서는, 체내 성숙된 소량의 난모세포를 사용해 핵 이식을 시행하므로, 난모세포의 사멸을 최소화 할 수 있는 세포막융합법이 보다 바람직하다. In the present invention, both techniques can be used, but it is advantageous to use the cell membrane fusion method. Due to the nature of the technique, intracellular microinjection penetrates the cell membranes of the receiving oocytes invasively, so that the cell membranes are damaged in the process and oocytes are often killed. In cloned production of canine animals, since nuclear transfer is performed using a small amount of mature oocytes in the body, a cell membrane fusion method that can minimize oocyte death is more preferable.
한편, 본 발명의 다른 구체예로, 본 발명의 개과 동물의 핵 이식란 생산방법은 On the other hand, in another embodiment of the present invention, the method for producing a nuclear transfer egg of the canine animal of the present invention
(a) 감수분열 말기 II 단계의 개 난모 세포를 활성화 시킨 후 핵을 제거하여 탈핵된 난모 세포를 수득하는 단계; (a) activating dog oocytes in stage II of meiosis and then removing nuclei to obtain denucleated oocytes;
(b) 핵 공여 세포로서, 개의 배아 유래 줄기세포 또는 개의 조직으로부터 분리한 성체 줄기세포를 수득하는 단계; 및(b) obtaining, as a nuclear donor cell, adult stem cells isolated from dog embryo derived stem cells or dog tissue; And
(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난모 세포에 (b) 단계의 핵 공여 줄기세포를 주입하고 융합시키는 단계를 포함한다. (c) injecting and fusing the nuclear donor stem cells of step (b) to the denuclear oocytes of step (a).
단계 (a)의 감수분열 말기 II 단계의 탈핵된 난모 세포에 대한 설명 및 단계 (c)의 주입에 대한 설명은 상기와 같다.The description of the denuclearized oocytes of the late stage of meiosis of step (a) and the injection of step (c) is as described above.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능성 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells. Totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and pluripotent stem cells can be classified as a multipotent stem cell.
만능성 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4∼5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라고 한다. 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to 8 cell stages after fertilization of eggs and sperm have these properties. If you transplant it into a single, complete entity. Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer. The inner cell mass located inside the blastocyst appears after 4-5 days of fertilization. Derived from, it is called embryonic stem cells. Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into cells specific to the tissues and organs that contain them, as well as the growth and development of individual tissues and organs in the prenatal, neonatal, and adult phases. It is involved in maintaining homeostasis of adult tissues and inducing regeneration in case of tissue damage and collectively called tissue-specific pluripotent cells are called adult stem cells.
본 발명에서는 개과 동물로부터 배아 유래 줄기세포 또는 성체 유래 줄기세포 모두 사용가능하다. 바람직하게는 성체 줄기세포를 사용한다. In the present invention, both an embryo-derived stem cell or an adult-derived stem cell from a canine animal can be used. Preferably adult stem cells are used.
본 발명의 개 유래 성체 줄기세포는 이미 공지되어 있는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있기 때문이다.Dog-derived adult stem cells of the present invention can be isolated and used from tissues consisting of known breast, bone marrow, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus and the like. This is because adult stem cells, unlike embryonic stem cells, have a very clinically important advantage because cells that have not differentiated in a desired direction are very unlikely to cause cancer.
본 발명에 있어서, 공여세포로서 줄기세포의 사용은 그 효율성을 극대화 하는데 유용한 사항이 될 수 있다. In the present invention, the use of stem cells as donor cells may be useful to maximize the efficiency.
핵 이식 과정의 재프로그래밍은 앞서 기술한 수용체 난자와 공여 세포 핵간의 세포주기 동기화를 위한 과정 이외에도, 세포 분화 과정에서 그 발현이 억제되었던, 초기 배아 단계의 미분화 표지 유전자들을 재 발현 시키는 과정 역시 포함한다. 그러므로, 재프로그램 과정의 생략은 전자의 핵 주기의 동기화에는 유익한 영향을 줄 수 있으나, 반대로, 억제된 배아 유전자의 재 발현에는 역효과를 낼 수 있는 가능성이 존재한다. 물론, 유전자의 재 발현 기전은, 핵이식 이후에도 초기 복제 배아 발달 과정에 걸쳐 지속적으로 일어나는 과정이기에 핵 이식 이후에 보완이 가능하며, 세포주기 동기화가 정상적인 발달을 위해서 더 주요 인자이므로, 본 발 명의 방법이 유용하게 이용되어질 수 있지만, 유전자 재발현 문제까지 보완될 수 있다면, 본 발명의 방법을 통해 더 큰 효율의 향상을 기대할 수 있을 것이다. 이와 같은 문제의 보완을 위해 일반적으로 사용 되어지던 섬유 아세포에 비해 미분화 단계인, 즉, 좀 더 배아 세포의 단계와 유사한 줄기세포의 사용이 고려될 수 있다. Reprogramming of the nuclear transfer process involves the reprogramming of early embryonic undifferentiated marker genes, which have been inhibited in cell differentiation, in addition to the process for cell cycle synchronization between the recipient egg and the donor cell nucleus described above. . Therefore, the omission of the reprogramming process may have a beneficial effect on the synchronization of the nuclear cycle of the former, but on the contrary, there is a possibility of adverse effects on the re-expression of the suppressed embryo gene. Of course, the mechanism of reexpression of genes can be complemented after nuclear transfer because it is a process that occurs continuously throughout the initial development of cloned embryos, and since cell cycle synchronization is a more important factor for normal development, the method of the present invention This may be usefully used, but if the gene re-expression problem can be compensated for, the improvement of the efficiency may be expected through the method of the present invention. In order to compensate for such a problem, the use of stem cells, which are similar to those of embryonic cell stages, which are more undifferentiated stages than the fibroblasts, which are generally used, may be considered.
미분화 단계의 줄기세포의 핵이식으로의 사용은, 본 발명에 있어서, 재프로그램 시간의 부재에 의해 발생할 수 있는 부작용을 최소화 할 수 있다. 또한 역으로, 그간 줄기세포를 공여세포로 사용한 연구에서 제기되어졌던, 과도한 재프로그래밍에 의한 역효과 역시 본 발명을 통해 상호 보완적으로 개선이 가능하다. The use of stem cells in the non-differentiated stage for nuclear transfer can, in the present invention, minimize the side effects that can occur due to the absence of reprogramming time. Conversely, adverse effects due to excessive reprogramming, which have been raised in studies using stem cells as donor cells, can also be complementarily improved through the present invention.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵 이식란을 이용하는 것을 특징으로 하는, 복제된 개과 동물의 생산방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing a cloned canine animal, characterized in that the nuclear transfer embryo is used in another aspect.
보다 구체적으로, 본 발명의 복제된 개과 동물의 생산방법은 More specifically, the method of producing a cloned canine animal of the present invention
(a) 감수분열 중기 II 단계의 개 난모 세포를 활성화 시킨 후 상온 배양하여 말기 II 단계로 유도한 후, 핵을 제거하여 탈핵된 난모 세포를 수득하는 단계;(a) activating dog oocytes in the middle stage of meiosis, followed by incubation at room temperature to induce stage II, followed by removal of the nucleus to obtain denucleated oocytes;
(b) 핵 공여 세포로서, 개의 배아 유래 줄기세포 또는 개의 조직으로부터 분리한 성체 줄기세포를 수득하거나 개의 조직으로부터 분리한 체세포를 유사분열 G2/M단계로 유도하여 핵 공여 체세포를 수득하는 단계; (b) obtaining a donor embryonic stem cell or an adult stem cell isolated from a dog tissue or inducing somatic cells isolated from the dog tissue to a mitotic G2 / M stage as a nuclear donor cell to obtain a nuclear donor somatic cell;
(c) 상기 (a) 단계의 탈핵 난모 세포에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 주입하고 융합시키는 단계;(c) injecting and fusing the nuclear donor cells of step (b) to the denuclear oocytes of step (a);
(d) 상기 (c) 단계에서 융합된 핵 이식란을 대리모의 난관에 즉시 이식하는 단계를 포함한다(d) immediately implanting the nuclear transfer embryo fused in step (c) into the fallopian tube of the surrogate mother;
그 밖의 상기 단계들에 대한 구체적인 설명은 상기와 같다. Details of the other steps are as described above.
특히, (d) 단계에서 본 발명에 따른 핵 이식란은 in vitro에서의 별도의 핵 재프로그래밍 공정이 필요없기 때문에, 제조된 핵 이식란을 (c)단계의 융합 후 즉시 대리모의 난관에 이식하는 것을 특징으로 한다. In particular, since the nuclear transfer egg according to the present invention in step (d) does not require a separate nuclear reprogramming process in vitro , the nuclear transfer egg thus prepared is transplanted into the fallopian tube of the surrogate mother immediately after the fusion of step (c). It is done.
즉, 별도의 in vitro에서의 핵 재프로그래밍 공정이 필요없기 때문에 상기 공정상에서 발생할 수 있었던 i) 수용체 난자 와 공여 세포의 주기 차이에 의해 발생되는 비정상적 복제 배아의 발달을 방지할 수 있고, ii) 핵이식 과정을 좀 더 효율적으로 빠르고 간편하게 진행할 수 있으며, iii) 난모세포의 회수 ~ 복제수정란 이식 과정의 시간을 최소화 함으로서, 체내 성숙 난모세포의 체외 노출시간을 단축, 그 효율을 향상시킬 수 있을것으로 기대되는 등 종래의 방법보다 훨씬 간단한 방법으로, 복제가 어려운 것으로 알려져 있는 개과 동물의 복제를 효율적으로 성공할 수 있다.In other words, since there is no need for a separate in vitro nuclear reprogramming process, i) it can prevent the development of abnormally duplicated embryos caused by the difference in the cycle between the receptor egg and the donor cell, which could have occurred in the process, and ii) the nucleus. The transplantation process can be carried out more efficiently and quickly, and iii) recovery of oocytes ~ cloning and fertilization can minimize the time of transplantation process, thereby reducing the in vitro exposure time of mature oocytes in the body and improving its efficiency. In much simpler ways than the conventional methods, such as canine can be effectively replicated in dogs known to be difficult to replicate.
본 발명에 따른 개과 동물의 핵 이식란 생산방법 및 복제된 개과 동물의 생산방법에 있어서, 구체적으로 각 단계들을 설명하면 다음과 같다.In the method of producing a nuclear transfer embryo of a canine animal according to the present invention and a method of producing a cloned canine animal, each step will be described in detail.
제1단계: 수핵 난자의 Stage 1: Nucleus of the Nucleus 탈핵Denuclearization
일반적으로 포유동물(예컨대 소, 돼지, 양 등)의 난자는 성숙난자, 즉 제2차 감수분열 중기(metaphase Ⅱ)에 배란되는 것에 반해, 개과 동물의 난자는 다른 동 물과는 달리 제1차 감수분열의 전기에 배란되어 난관 내에서 48∼72시간 동안 머물면서 성숙되는 특징이 있다. In general, eggs from mammals (such as cattle, pigs, sheep, etc.) are ovulated to mature eggs, ie, the second phase of metaphase II, whereas canine eggs, unlike other animals, are primary. Ovulation in meiosis is characterized by maturation in the fallopian tube for 48 to 72 hours.
수핵 난자는 개과 동물의 미성숙난자, 성숙난자, 초기 노화, 중간노화, 심한 노화 단계의 난자일 수 있다. 바람직하게는, 개에서 회수된 미성숙 난자를 체외에서 성숙시켜 이용하거나 개과 동물의 체내에서 성숙된 난자를 회수하여 이용할 수 있다. 개과 동물의 미성숙 난자는 체외에서의 핵 성숙률이 매우 낮으며, 배란시기 및 번식 생리가 다른 포유동물과는 달라서, 개과 동물의 수핵 난자는 개과 동물의 생체 내에서 성숙된 난자를 회수하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로 개과 동물로부터 성숙 난자의 회수는 개과 동물의 배란이 이루어 진 후 약 48∼72시간째, 보다 바람직하게는 72시간째에 수행하는 것이 바람직하다. The nucleus pulmonary egg may be an immature egg, mature egg, early aging, intermediate aging, or severe aging egg in a canine animal. Preferably, Immature oocytes recovered from dogs may be matured in vitro, or matured oocytes recovered from canine animals. Canine immature oocytes have a very low nuclear maturation rate in vitro, and unlike mammals with different ovulation periods and reproductive physiology, it is preferable that cannuclear oocytes of canine animals recover mature eggs in canine animals. Do. More specifically, the recovery of mature eggs from canine animals is about 48-72 hours after canine ovulation. More preferably, it is carried out at 72 hours.
상기에서 개과 동물의 배란일은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 배란일을 결정하는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 질세포 도말검사(vaginal smear), 혈장 성 호르몬 수준 측정 및 초음파 진단 시스템을 사용할 수 있다. 개과 동물의 발정의 시작은 외음부 팽창 및 장액성 혈액의 배출 여부를 통해 확인할 수 있다.The ovulation date of the canine animal in the above can be determined using methods known in the art. Methods of determining ovulation date may include, but are not limited to, vaginal smear, plasma hormone level measurement, and ultrasound diagnostic system. Initiation of canine estrus can be confirmed by vulvar swelling and the release of serous blood.
본 발명의 일 실험 예에서는 개과 동물의 배란일을 질세포 도말검사와 혈장 프로게스테론 농도 검사를 수행함으로써 결정한 결과 무각화 상피 세포가 80%이상이고 혈장 프로게스테론 농도가 약 4.0ng/mL 이상으로 처음 도달할 때 배란이 이루어짐을 알 수 있었다. In one experimental example of the present invention, the ovulation day of a canine animal was determined by performing a vaginal cell smear and a plasma progesterone concentration test. Ovulation was found.
생체 내 성숙 난자를 회수하는 방법으로는 대상 동물을 마취한 후 개복시키 는 것을 포함하는 외과적 방법을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체 내 성숙 난자의 회수는 당업계에 공지된 방법인 난관 절제법을 사용할 수 있다. 상기 난관 절제법은 난관을 수술적으로 잘라낸 후 배아 수집 배지를 난관 내부에 관류시켜 관류액을 수득하고 상기 관류액으로부터 난자를 회수하는 방법이다.As a method of recovering mature eggs in vivo, a surgical method including anesthetizing an animal and then opening it can be used. More specifically, the recovery of mature eggs in vivo can use a tubal resection method known in the art. The tubal resection is a method of surgically cutting the fallopian tube and perfusing the embryo collection medium into the fallopian tube to obtain a perfusion solution and recovering the egg from the perfusion solution.
또한, 생체 내 성숙 난자는 카테터를 난관채에 장착한 후 난관-자궁 접합부위에 주사침을 이용하여 관류액을 주입함으로써 회수할 수 있다. 이 방법은 난관을 손상시키지 않기 때문에 난자를 공여하는 동물을 다음 발정에도 이용할 수 있는 장점이 있다.In addition, mature oocytes in vivo can be recovered by mounting the catheter in the fallopian tube and injecting perfusion fluid into the fallopian tube-uterine junction using a needle. Since this method does not damage the fallopian tubes, it is advantageous to use an animal that donates eggs for the next estrus.
본 발명에서는 제2 감수분열 말기의 난모세포를 탈핵하여 사용한다. 특히 난관의 관류에 의해 회수된 제2 감수분열 중기의 난모세포를 활성화 시킨 후 약 2 내지 3시간 항온 배양한 후 핵을 제거한다. In the present invention, the oocytes at the end of the second meiosis are denuclearized and used. In particular, after activating the second meiosis oocytes recovered by perfusion of the fallopian tube and incubated for about 2 to 3 hours, the nucleus is removed.
탈핵공정은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 수핵 난모세포의 탈핵은 크게 두 가지 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 방법으로는 성숙한 수핵 난모세포의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 미세침을 이용하여 수핵 난모세포의 투명대 일부를 절개하여 절개창을 형성하고 이를 통하여 제1극체, 제2극체 및 난모세포의 핵 및 세포질(가능한 적은 양)을 제거한다. 다른 방법으로는 수핵 난모세포의 난구 세포를 제거한 다음 난모세포를 염색하고 미세 흡입 피펫(aspiration pipette)을 이용하여 제1극체, 제2극체 및 제2 난모세포의 핵을 제거한다. 보다 바람직하게는, 난모세포의 탈핵은 수핵 난모세포의 상태를 육안으로 평가하여 생존율이 높은 난모세포에 대해서 흡입 방법을 사용하 고, 그렇지 않은 난모세포에 대해서는 절개창을 형성하는 방법을 사용한다.Denuclearization can be carried out using methods known in the art. Preferably, denuclearization of nucleated oocytes can be largely performed using two methods. One method is to remove the cumulus cells of mature nucleated oocytes, and then use a microneedle to incise a portion of the zona pellucida of the nucleated oocytes to form an incision through which the first, second, and oocytes are made. Removes the nucleus and cytoplasm (as little as possible) of the Alternatively, the oocytes of the nucleated oocytes are removed, followed by staining the oocytes, and removing the nuclei of the first, second and second oocytes using aspiration pipette. More preferably, the denuclearization of oocytes is performed using the inhalation method for oocytes with high survival rate by visually assessing the state of nucleated oocytes, and the method of forming an incision for oocytes that do not.
제2단계: 핵 공여 세포의 준비Step 2: Preparation of Nuclear Donor Cells
체세포 핵이식 기술에 의한 목적 유전자를 발현하는 형질전환동물의 생산에는 핵 공여 세포가 필요하다. 본 발명에서의 핵 공여 세포로는 개로부터 유래된 체세포 또는 줄기세포를 사용한다. Nuclear donor cells are required for the production of transgenic animals expressing the gene of interest by somatic cell nuclear transfer technology. As the nuclear donor cells in the present invention, somatic cells or stem cells derived from dogs are used.
구체적으로, 본 발명에서 사용된 체세포로는 개의 배아세포(embryonic cell), 태아 유래 세포(fetal derived cells), 유세포(juvenile cell), 성체 유래 세포(adult derived cell), 바람직하게는 성체 유래 세포로부터 수득될 수 있는 난구, 피부, 구강 점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육 및 생식기관 등과 같은 형태의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. Specifically, the somatic cells used in the present invention include embryonic cells, fetal derived cells, juvenile cells, adult derived cells, preferably adult derived cells of a dog. It may be derived from tissues in the form of eggs, such as eggs, skin, oral mucosa, blood, bone marrow, liver, lungs, kidneys, muscles and reproductive organs, which can be obtained.
본 발명에서 사용될 수 있는 체세포로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 체세포로는 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있다. 가장 바람직하게는, 개의 태아 및 성체에서 분리한 섬유아세포를 이용한다. 이 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.Somatic cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, cumulus cells, epithelial cells, fibroblasts, nerve cells, keratinocytes, hematopoietic cells, melanocytes, chondrocytes, macrophages, monocytes, muscle cells, B lymphocytes, T lymphocytes, embryonic stem cells, embryonic germ cells, fetal-derived cells, fetal cells and embryonic cells. More preferably, used in the present invention Somatic cells may be fetal-derived cells, adult fibroblasts, oocytes. Most preferably, fibroblasts isolated from the fetus and adult of the dog are used. The characteristics of these cells have the advantage that a large number of cells can be obtained at initial separation, the cell culture is relatively easy, and the culture and manipulation are easy in vitro.
핵 공여 세포로서 제공되는 상기 체세포는 외과용 표본 또는 생체검사용 표 본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있으며 상기 표본으로부터 이하와 같은 방법을 사용하여 최적화된 조건으로 배양된 단일세포를 수득할 수 있다. The somatic cells provided as nuclear donor cells can be obtained from a method for preparing a surgical specimen or a biopsy sample, and from the sample can be obtained single cells cultured under optimized conditions using the following method. .
대상동물로부터 조직의 일부를 채취하여 세포를 분리한 다음 기본 조직 배양용 배지에서 배양한 후 세포주기 동기화 유도 물질을 첨가하여 재배양한 다음 완전히 자라면 트립신을 처리하여 회수한 후 핵 공여 세포로 사용할 수 있다. A part of the tissue is taken from the target animal, the cells are separated, cultured in a basic tissue culture medium, cultured with the addition of cell cycle synchronization inducer, and when fully grown, trypsin treated and recovered to be used as a nuclear donor cell. Can be.
본 발명에서는 유사분열 G2/M단계의 체세포의 제조 및 복제 개의 생산 효율을 향상시키기 위하여, 세포 주기 동기화 유도 물질을 첨가하는 것을 특징으로 한다. 사용할 수 있는 세포 주기 동기화 유도 물질로는 Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 저농도에서 G0/G1기를 블로킹하고 고농도에서 G2/M기를 블로킹하는 로스코비틴(Roscovitine); G0/G1기를 블로킹하는 사이클로헥사마이드(Cycloheximide); G0/G1기를 블로킹하는 디엠에스오 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO); Cdk(cyclin-dependent kinase) 저해제로 G1/S기를 블로킹하는 부티로락톤 I(Butyrolactone I); DNA 폴리머라아제 A,D의 저해제로 S 초기를 블로킹하는 아피디콜린(Aphidicolin); 유사분열 중기에서 M기를 블로킹하는 디메콜신(Demecolcine);DNA 복제 저해제로서 S기를 블로킹하는 미모신(Mimosine); 미소관 저해제로서 G2/M기를 블로킹하는 콜치신(colchicine); 및 DNA 토포이소머라아제로서 훽스트 33342(Hoechst 33342) 등이 있고, 각각의 물질에 대한 화학 구조식은 앞서 설명한 바와 같다. 바람직하게는 로스코비틴, 디메콜신, 및 콜치신을 사용하고, 더욱 바람직하게는 25~100 μM의 고농도의 로스코비틴을 사용한다. In the present invention, in order to improve the production efficiency of somatic cells of the mitotic G2 / M stage and the production of cloned dogs, a cell cycle synchronization inducing substance is added. Cell cycle synchronization inducers that can be used include Roscovitine, which blocks G0 / G1 groups at low concentrations and blocks G2 / M groups at high concentrations with cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitors; Cycloheximide, which blocks G0 / G1 groups; Dimethyl Sulfoxide (DMSO) blocking the G0 / G1 groups; Butyrolactone I, which blocks the G1 / S group as a cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor; Aphidicolin, which blocks S early as an inhibitor of DNA polymerase A and D; Demecolcine, which blocks the M group in the mitotic phase, Mimosine, which blocks the S group as a DNA replication inhibitor; Colchicine blocking G2 / M groups as microtubule inhibitors; And Hoechst 33342 as DNA topoisomerase, and the chemical structural formulas of the respective materials are as described above. Preferably, roscovitine, dimetholcine, and colchicine are used, and more preferably, high concentration roscovitine of 25-100 μM is used.
일 구체예를 들어 설명하면, 우선, 대상동물로부터 조직의 일부를 무균적으 로 절개하여 상기 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 수득하고 이를 미세하게 세절하여 트립신으로 처리한 다음 조직 배양용 배지에서 배양한다. 상기 조직 배양용 배지로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며 예를 들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이 있다. 조직 배양용 배지에서 3-4일 배양 후에 배양 접시(dish)에 자라는 것을 확인하고, 배양한 후 완전히 다 자라면 트립신 처리하여 일부는 추후 사용을 위하여 동결하여 액체 질소에 보관하며, 나머지는 핵 이식에 이용하기 위하여 계속 배양을 실시한다. 계속하여 배양하여 핵이식에 사용할 세포는 새로운 배양접시에서 배양한 후, 트립신 처리하여 세포를 단일세포로 제조한다. Referring to one embodiment, first, aseptically, a portion of the tissue is removed from the target animal. An incision is made to obtain the surgical specimen or the biopsy specimen, which is finely cut, treated with trypsin, and then cultured in a tissue culture medium. The tissue culture medium may be one known in the art, for example, TCM-199, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) and the like. After 3-4 days of incubation in the tissue culture medium, it is confirmed that it grows in a culture dish, and if fully grown after incubation, trypsin treatment is used to freeze some of it for later use and store it in liquid nitrogen. The culture is continued for use. The cells to be used for nuclear transplantation by cultivation are cultured in a new culture dish and then trypsinized to prepare the cells as single cells.
마지막으로, 상기 세포에 로스코비틴을 첨가하여 추가 배양 한 후, 트립신 처리하여 세포를 회수하여 체세포 핵이식을 실시한다. 이 때 첨가하는 로스코비틴의 농도는 바람직하게는 10~100μM, 보다 바람직하게는 25~100μM이며, 가장 바람직하게는 45~55μM이다. 그리고, 배양시간은 바람직하게는 14~35시간, 보다 바람직하게는 16~30시간 동안 배양한다. Finally, the cells are further cultured by addition of roscovitine, followed by trypsin treatment to recover the cells to carry out somatic cell nuclear transfer. The concentration of roscovitine added at this time is preferably 10 to 100 µM, more preferably 25 to 100 µM, and most preferably 45 to 55 µM. And, the incubation time is preferably 14 to 35 hours, more preferably 16 to 30 hours incubation.
한편, 상기 체세포 이외에도 본 발명에서 사용될 수 있는 줄기세포로는 개의 배아 유래 또는 성체 유래의 것을 사용할 수 있다. On the other hand, in addition to the somatic cells, stem cells that can be used in the present invention can be used in the embryo-derived or adult-derived dog.
성체 유래 줄기세포의 예를 들면, 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래된 조직으로부터 분리, 사용할 수 있다. 성체 줄기세포는 배아줄기세포와 달리 원하는 방향으로 분화되지 않은 세 포가 암을 유발할 가능성이 매우 희박하여 임상적으로 매우 중요한 장점을 갖고 있다.For example, adult stem cells can be isolated and used from tissues derived from the group consisting of breast, bone marrow, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus, and the like. Adult stem cells, unlike embryonic stem cells, have a clinically important advantage because the cells that do not differentiate in the desired direction are very unlikely to cause cancer.
개로부터 배아 줄기세포를 수득하거나 개의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용할 수 있다. Methods for obtaining embryonic stem cells from dogs or for separating adult stem cells from various tissues of dogs can be used conventional methods known in the art.
일 구체예로 이하와 같은 방법을 사용하여 줄기세포를 수득할 수 있다. In one embodiment, stem cells can be obtained using the following method.
개 지방조직을 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라게나아제 I(collagenase type 1)을 첨가한 DMEM 배지를 이용해 37℃에서 2시간동안 침지(digestion)하고, PBS로 세척 후 원심분리한다. 상층액은 석션하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 다시 원심분리한다. 100㎛ 메쉬에 필터링하여 찌꺼기(debris)를 제거하고, PBS로 세척한 후 DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid) 배지에 인큐베이션한다. 붙지않은 세포들은 PBS로 세척하고, K-NAC 배지(Keratinocyte-SFM media + 2mM NAC + 0.2mM ascorbic acid + 0.09mM calcium + 5ng/ml rEGF + 50㎍/ml BPE + 5㎍/ml insulin + 74ng/ml hydrocortisone)를 2일마다 교체하면서 배양하여, 개 지방조직 유래 줄기세포를 수득할 수 있다. After washing the dog adipose tissue with PBS, the tissue was chopped and then immersed for 2 hours at 37 ℃ using DMEM medium containing collagenase I (collagenase type 1), washed with PBS and centrifuged . The supernatant is suctioned and the remaining pellets are washed with PBS and centrifuged again. Filter to 100㎛ mesh to remove debris (debris), washed with PBS and incubated in DMEM (10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid) medium. Non-stick cells were washed with PBS and K-NAC medium (Keratinocyte-SFM media + 2 mM NAC + 0.2 mM ascorbic acid + 0.09 mM calcium + 5 ng / ml rEGF + 50 µg / ml BPE + 5 µg / ml insulin + 74 ng / Stem cells derived from dog adipose tissue can be obtained by culturing ml hydrocortisone) every two days.
줄기세포를 핵 공여 세포로 사용하는 경우, 상기 줄기세포는 '미분화' 상태이기 때문에, 미분화 상태의 세포 핵이 핵이식 과정에서의 재프로그래밍이 과도하게 일어날 수 있는 문제점이 존재한다. 실제로, 줄기세포를 공여세포로 사용해 왔던 기존의 연구에 있어서, 많은 경우에 있어서, 미분화 관련 유전자의 과도한 발현에 의해, 시험과적 체외 성숙에는 일부 향상된 결과를 얻기도 하였으나, 복제 수정란의 임신 및 산자 생산 효율이 일반적인 체세포에 비해 낮았던 것이 사실이다. 본 발명에서는, 수핵 난모세포로서 핵 재프로그래밍 공정을 요하지 않는 감수분열 말기 II 단계의 난모 세포를 사용함으로써 상기와 같은 문제점을 극복할 수 있다. When stem cells are used as nuclear donor cells, since the stem cells are in 'undifferentiated' state, there is a problem that excessive reprogramming of the undifferentiated cell nucleus may occur. Indeed, in previous studies in which stem cells have been used as donor cells, in many cases, overexpression of undifferentiated genes has resulted in some improvement in in vitro maturation, but the pregnancy and birth production of cloned fertilized eggs. It is true that the efficiency was lower than that of normal somatic cells. In the present invention, the above problems can be overcome by using oocytes in the late stage of meiosis that do not require nuclear reprogramming as nucleated oocytes.
또한, 줄기세포를 사용할 경우, 줄기세포의 특성 상 일반적으로 초기 배아 발달에 필수적이라 여겨지고 있는, 미분화 유전자들이 발현되고 있다는 점이 그 장점으로 부각 될 수 있다. 일반적으로, 섬유아세포등의 분화된 체세포를 공여세포롤 사용할 경우, 핵 이식 후 비특이적 재프로그램에 의해 무작위로 발현되는 유전자 중 우연에 의해 미분화 관련 유전자들이 재 발현 되어야 그 성공이 가능했지만, 줄기세포는 이와같은 과정이 조절 가능하므로 좀 더 안정적이고 고 효율로 복제 동물 생산이 가능하다.In addition, when stem cells are used, the advantage of the expression of undifferentiated genes, which are generally considered essential for early embryo development, may be highlighted. In general, in the case of using donor cells with differentiated somatic cells such as fibroblasts, success was possible only when undifferentiated genes were reexpressed by chance among genes randomly expressed by nonspecific reprogramming after nuclear transfer. This process can be controlled to produce cloned animals more stably and with higher efficiency.
제3단계: 핵 공여 세포의 미세주입 및 융합 - 핵 이식란의 제조Step 3: Microinjection and Fusion of Nuclear Donor Cells-Preparation of Nuclear Transplanted Eggs
제1단계에서 준비한 탈핵 난자에 제2단계에서 제조한 핵 공여 세포를 미세주입한다. 이 때, 상기 미세주입은 이식용 피펫을 사용하여 핵 공여 세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입함으로써 수행한다.The nuclear donor cells prepared in step 2 are microinjected into the denucleated eggs prepared in step 1. At this time, the microinjection is performed by injecting nuclear donor cells between the cytoplasm and the zona pellucida of the denucleated egg using a transplant pipette.
핵 공여 세포의 미세주입이 완료된 탈핵 난자는 세포 조작기를 이용하여 전기적으로 핵 공여 세포와 융합시킨다. 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있다. 특히, 전기적 융합에서 전류는 교류 또는 직류일 수 있으며, 바람직하게는 전압이 2.0～6.0 kV/cm 조건으로 수행할 수 있으며 보다 바람직하게는 직류전압이 3.0～5.0 kV/cm 조건으로 10～30 ㎲ 동안 1～3 회 수행할 수 있다. 가장 바람직하게는, 전압 3.5～5.0 kV/cm 조건으로 15㎲ 동안 2회 수행할 수 있다. The denucleated oocytes that have undergone microinjection of nuclear donor cells are electrically fused with nuclear donor cells using a cell manipulator. In electrical fusion the current may be alternating current or direct current. In particular, in the electrical fusion, the current may be alternating current or direct current, and preferably, the voltage may be performed under the condition of 2.0 to 6.0 kV / cm, and more preferably under the condition of 10 to 30 mA under the condition of 3.0 to 5.0 kV / cm. It can be done 1 to 3 times. Most preferably, it can be performed twice for 15 kV under the condition of 3.5-5.0 kV / cm voltage.
상기 전기적 융합시의 전압 범위는 지금까지 알려진 다른 종에서의 일반적인 전기적 융합시의 전압 범위보다 매우 높은 특징이 있다. 이같은 범위는 전기융합의 최적화된 조건으로서, 보다 높은 복제효율로 복제개를 생산할 수 있게 한다. The voltage range at the time of the electrical fusion has a feature that is much higher than the voltage range at the time of the general electrical fusion in other species known up to now. This range is an optimized condition for electrofusion, allowing the production of cloned dogs with higher replication efficiency.
상기 핵 공여 세포와 난자의 전기적 자극에 의한 융합은 다양한 융합용 배지, 예를 들면 짐머맨 (Zimmerman) 또는 만니톨 등의 내에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 만니톨, MgSO4, 헤페스, BSA가 혼합된 배지를 사용할 수 있다. The fusion by the electrical stimulation of the nuclear donor cell and the egg may be performed in various fusion media, for example, Zimmerman or mannitol. Preferably, a medium in which mannitol, MgSO 4 , hepes, and BSA are mixed may be used.
본 발명은 또 다른 관점에서 상술한 방법에 의해 제조된 개의 핵 이식란에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a nuclear transfer embryo of a dog produced by the above-described method.
제4단계: 핵 Phase 4: Nuclear 이식란의Transplanted 대리모 이식 및 Surrogate mother transplantation and 산자생산Production
통상적으로, 융합된 핵 이식란은 '재프로그래밍'과정을 통해 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키게 된다. 즉, 융합된 핵 이식란을 핵 재프로그래밍하여 정상적인 발생을 유도한다. 이 때, 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키타제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 물리적 또는 화학적방법을 사용할 수 있다. Typically, the fused nuclear transfer embryos reactivate the cell cycle, which has been temporarily suspended through a 'reprogramming' process. That is, nuclear reprogramming of the fused nuclear transfer embryos induces normal development. At this time, a physical or chemical method for lowering the activity of cell signal transduction substances such as MPF, MAP kinase, which is a cell cycle stop element, may be used.
그러나, 본 발명에 따른 복제개의 생산방법에 있어서는 상기 융합된 핵 이식란을 별도로 in vitro에서 재프로그래밍시키지 않고, 융합시킨 즉시 대리모에 이식하는 것을 특징으로 한다. 즉, 융합된 핵 이식란에 대하여 별도의 핵 재프로그래밍 공정 또는 체외 배양공정없이 융합 후 바로 이식하는데, 상기 이식은 당업계에 공 지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며 바람직하게는 카테터를 사용하여 복제 배아를 이식할 수 있다.However, the method of producing cloned dogs according to the present invention is characterized in that the fused nuclear transfer embryos are transplanted into surrogate mothers immediately after fusion without reprogramming in vitro. That is, the fused nuclear transfer embryos are transplanted immediately after fusion without a separate nuclear reprogramming process or in vitro culture process. The transplantation can be performed using a method known in the art, and preferably, a cloned embryo using a catheter. Can be implanted.
핵 이식란을 이식하여 정상적으로 태아로 발생시킬 수 있는 대리모를 선발한다. 성숙에 도달한 후 자연적 발정을 보인 개 또는 성성숙 전 또는 후의 개에서 인위적 호르몬 처치 등으로 발정이 유발된 개의 발정기 및 배란을 파악하여 이식적기를 선정한다. 일반적으로, 적당한 이식 시기는 핵이식에 사용된 난자를 제공한 난자제공 개와 배란시기가 1-2일 범위 내에서 일치하는 것을 선택할 수 있으며, 바람직하게는 난자제공견이 1일 먼저 배란 된 것, 가장 바람직한 것으로는 동일한 날짜에 배란이 된 것이다. 대리모의 바람직한 발정주기 평가는 프로게스테론 농도를 기준으로 할 수 있다.A nuclear transfer embryo is transplanted to select a surrogate mother that can normally develop into the fetus. After maturity is reached, estrus and ovulation in dogs with spontaneous hormonal treatment, such as those with spontaneous estrus or before or after maturity, are selected and selected for transplantation. In general, the time of transplantation can be selected to match the oocyte-providing dog that provided the egg used for nuclear transfer and the ovulation time within the range of 1-2 days, preferably the oocyte-providing dog was ovulated one day earlier, most Preferred is ovulation on the same date. A preferred estrous cycle assessment of the surrogate mother may be based on progesterone concentration.
핵이식란의 이식 후 3주 이후에 초음파 검사를 실시하여 임신여부를 확인한다. 이 후에도 2주일 간격으로 초음파검사를 통하여 임신지속여부 및 태아의 발육상태 등을 확인한다. 태아의 출산은 분만간격이 30분 이상이 지났는데도 산자가 태어나지 않으면 분만을 도와야 하며, 분만 예정일이 지난 경우는 호르몬 제제 주사 또는 제왕절개와 같은 수술방법을 통하여 산자를 생산하게 된다.Three weeks after the transplantation of the nuclear transfer embryos, ultrasound is performed to confirm pregnancy. After this, the ultrasound status is checked at 2 weeks intervals to determine whether the pregnancy continues and the development of the fetus. If the birth of the fetus is more than 30 minutes after the birth interval, if the birth is not born, the birth should be helped, and if the due date is due to hormonal injection or cesarean section to produce the birth.
본 발명에 따른 복제개의 생산은 종래 극히 낮았던 임신 성공률을 높이는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법은 복제 효율이 너무 낮아 실용화가 어려웠던 이전에 공지된 방법의 단점을 개선하여 실질적으로 복제 개를 생산의 효율을 높이는데 적용될 수 있을 것이다.Production of cloned dogs according to the present invention has the effect of increasing the pregnancy success rate, which was extremely low in the prior art. Thus, the method of the present invention may be applied to substantially improve the efficiency of production of cloned dogs by improving the disadvantages of the previously known methods, which are so difficult to commercialize that the replication efficiency is so low.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1:개로부터 수핵 난자의 회수Example 1 Recovery of Nucleated Nucleus Oocytes from Dogs
난자 공여자로 실험에 사용한 개는 1~5년령의 발정주기가 일정하고, 생식기에 질병이 없는 암캐를 사용하였다. 상기 난자 공여자로 사용한 개들은 서울대학교의 사육관리 기준에 따라 사육하였다. 자연적으로 발정기가 시작된 개를 대상으로 질세포 도말검사(vaginal smear)와 혈청 프로게스테론의 농도를 매일 측정하여 배란일을 결정하고, 배란일로부터 72시간 후에 수술을 실시하여 난자를 회수하였다. The dogs used for the experiment as egg donors used female bitch with a constant estrous period of 1 to 5 years and genitals. The dogs used as egg donors were bred according to the breeding management standards of Seoul National University. The ovulation day was determined daily by measuring vaginal smear and serum progesterone concentrations in dogs with natural estrus stage, and surgery was performed 72 hours after the ovulation day to recover eggs.
혈청 프로게스테론의 농도는 혈액 3-5ml을 매일 채취하고 원심분리하여 혈청을 수득한 다음 DSL-3900 ACTIVE 프로게스테론 코팅된 튜브 방사선면역 분석 키트(Diagnostic Systems Laboratories, Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 프로게스테론 농도가 4.0 ng/ml 이상에 처음 도달되면 배란일로 간주하였다(Hase et al., J. Vet. Med. Sci., 62:243-248, 2000).Serum progesterone concentrations were analyzed using a DSL-3900 ACTIVE progesterone coated tube radioimmunoassay kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., USA), with 3-5 ml of blood taken daily and centrifuged to obtain serum. When progesterone concentrations first reached 4.0 ng / ml or higher, they were considered ovulation days (Hase et al., J. Vet. Med. Sci ., 62: 243-248, 2000).
질세포 도말검사는 발정기의 초기 증후가 나타난 날로부터 매일 표본을 수득 함으로써 수행하였다. 질세포 표본은 면봉을 외음부로 삽입함으로써 수집하였고 이를 슬라이드 글라스 위에 도말하였다. 그 다음 디프-퀴(Diff-Quik) 염색(International chemical co., Japan)으로 염색한 후 현미경으로 검경하여 표피세포가 상피세포 인덱스(cornified index, Evans J.M. et al., Vet. Rec, 7:598-599, 1970)의 80%이상인 경우를 배란시기로 간주하였다.Vaginal cell smears were performed by obtaining samples daily from the day of the initial symptoms of estrus. Vaginal cell samples were collected by inserting cotton swabs into the vulva and spread them on slide glass. The cells were then stained with Diff-Quik (International chemical co., Japan) and examined under a microscope to determine the epidermal cells in the cornified index, Evans JM et al., Vet. Rec , 7: 598. -599, 1970) more than 80% of cases were considered ovulation time.
본 발명자들은 상술한 방법에 따라 배란시기를 확인한 후 개복술을 통하여 난자 공여자 개로부터 다음과 같은 방법으로 회수하였다. The present inventors, after confirming the ovulation time according to the method described above was recovered from the egg donor dog through the laparotomy in the following method.
먼저, 난자 공여자인 암캐에 케타민 HCl(ketamine HCl) 6mg/kg과 자일라진(xylazine) 1mg/kg을 투여하여 마취시키고, 이소플루란(isoflurane)을 흡입 투여함으로써 마취상태를 유지하였다.First, anesthetized by administering 6 mg / kg of ketamine HCl and 1 mg / kg of xylazine to an bitch donor, an oocyte donor, and maintained anesthesia by inhaling isoflurane.
상기 마취된 개의 생식열구(bursal slit)를 통하여 난관의 술 모양의 말단에 접근하고 앞부분이 둥글게 처리된 니들을 삽관하였다. 삽입된 니들을 수술용 봉합사로 고정하였다. 이때 3cm 플라스틱 튜브(직경 2mm) 및 지혈겸자(hemostatic forceps)를 이용한 퀵-릴리즈 장치(quick-release device)를 사용하였다. 그 다음 난관의 도관을 잘 보이게 하기 위하여, 디지털 압력을 난관과 주위의 자궁-난관 접합부의 아랫부분에 가하고, 정맥 내 카테터(24 게이지)를 삽입한 다음 상기 카테터를 통해 10% (v/v) FBS, 2 mM NaHCO3, 5 mg/ml BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA)가 첨가된 헤페스-버퍼 조직 배양 배지 표1의 난자 회수용 배지를 관류시켜 난자가 흘러나오도록 하였다.Through the bursal slit of the anesthetized dog, the tuft-shaped end of the fallopian tube was approached and the needle was rounded at the front. The inserted needle was fixed with a surgical suture. At this time, a quick-release device using a 3 cm plastic tube (diameter 2 mm) and hemostatic forceps was used. Then, to visualize the catheter of the fallopian tube, digital pressure is applied to the lower part of the fallopian tube and the surrounding uterine-tubal junction, an intravenous catheter (24 gauge) is inserted and 10% (v / v) through the catheter. Hepes-buffer tissue culture medium to which FBS, 2 mM NaHCO 3 , 5 mg / ml BSA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Was added was perfused with the egg recovery medium of Table 1 to allow the egg to flow out.
(Gibco 31100-027)For TCM powder 1L
(Gibco 31100-027)
실시예 2: 수핵 난자의 제2 감수분열 말기 유도 및 탈핵Example 2: Terminal Induction and Denuclearization of Second Hypothesis of Nucleated Nucleus Oocytes
상기 수득한 난자를 표 1의 난자 회수용 배지에 넣고, 히알루로니다제(Sigma, USA)를 반복적으로 피펫팅함으로써 난구세포를 제거하였다. 그 다음 난구세포가 제거된 난자를 5㎍/mL 훽스트(Hoechst 33342)로 5분간 염색하고 형광 도립 현미경을 이용하여 x 200의 배율로 관찰하여 제1극체가 확인된 난자만을 선별하였다. The obtained oocytes were placed in the oocyte recovery medium of Table 1, and the oocytes were removed by repeatedly pipetting hyaluronidase (Sigma, USA). Then, the oocytes from which the oocytes were removed were stained for 5 minutes with 5 μg / mL Hoechst (Hoechst 33342) and observed at a magnification of 200 using a fluorescent inverted microscope to select only the eggs whose first polar bodies were identified.
선별된 난자를 10μM 아이오노포어(Sigma)가 함유된 mSOF에 넣고 39℃에서 4분간 배양하여 난모세포의 활성화를 유도하였다. 그 다음 상기 난모세포를 세척하고 1.9mM 6-디메틸아미노퓨린이 첨가된 mSOF(표 2)에서 2시간 동안 추가로 배양하여 제2 감수분열 말기를 유도하였다. 상기 배양은 미네랄 오일이 덮여진 mSOF 25 미세유적(microdrop)에서 이루어 졌다. Selected eggs were placed in mSOF containing 10 μM ionofore (Sigma) and incubated at 39 ° C. for 4 minutes to induce oocyte activation. The oocytes were then washed and further incubated for 2 hours in mSOF (Table 2) with 1.9 mM 6-dimethylaminopurine added to induce the second meiosis. The incubation was done in mSOF 25 microdrops covered with mineral oil.
배양중인 난모 세포에 미세조작장치(micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan)를 이용하여 탈핵을 수행하였다. 즉, 홀딩 마이크로 피펫(약 150㎛ 직경)으로 수핵 난자를 고정한 후 제1극체 및 추가 배양 과정에서 배출된 제2극체를 난자 핵 그리고 일부 세포질(5% 이하)과 함께 흡입 피펫(약 20 μm 직경)을 이용하여 제거하였다. Denuclearization was performed on the oocytes in culture using a micromanipulator (micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan). In other words, the nucleus of the nucleus pulposus was fixed with a holding micropipette (approximately 150 μm in diameter), and then the first and second poles discharged from the incubation process were inhaled together with the egg nucleus and some cytoplasm (5% or less). ) Was removed.
실시예 3: 핵 공여세포의 준비 Example 3: Preparation of Nuclear Donor Cells
핵 공여 세포로는 개로부터 수득한 성체 섬유아세포를 사용하였다. 이를 위해 먼저 개의 귀 피부 조직을 분리하였다. 상기 귀 피부 조직 단편을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 3회 세척하고 수술용 칼로 잘게 조각내었다. 상기 조각낸 피부조직을 1mM EDTA가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지(DMEM Life Technologies, Rockville, MD)에 넣고 300 x g로 2분간 원심분리한 후 60mm 플라스틱 배양용 접시(Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)에서 배양하였다. Adult fibroblasts obtained from dogs were used as nuclear donor cells. For this purpose, ear ear skin tissue was first isolated. The ear skin tissue fragments were washed three times with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) and chopped with a surgical knife. The fragmented skin tissue was placed in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) medium containing 1 mM EDTA (DMEM Life Technologies, Rockville, MD) and centrifuged at 300 xg for 2 minutes, followed by a 60 mm plastic petri dish (Becton Dickinson, Lincoln Park). , NJ).
그 다음 상기 세포를 10%(v/v) FBS, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO3 및 1%(v/v) 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산 용액(Invitrogen, CA)이 첨가된 DMEM 배지에서 39℃, 5% CO2 및 95% 공기로 가습된 조건으로 3~4일간 배양하였다. The cells were then challenged in DMEM medium with 10% (v / v) FBS, 1 mM glutamine, 25 mM NaHCO 3 and 1% (v / v) minimum essential medium (MEM) non-essential amino acid solution (Invitrogen, CA) added. Incubated for 3-4 days at humidified conditions with ℃, 5% CO 2 and 95% air.
세포가 컨플루언시(confluency)가 될 때까지 배양한 후, 체세포가 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 나머지 세포는 0.1% 트립신 및 0.02% EDTA가 포함된 배지 내에서 1분간 트립신 처리하고 추가 계대를 위해 3개의 새로운 배양접시로 옮기어 4 내지 6일 간격으로 계대배양하였다. 그 다음 80%(v/v) DMEM, 10%(v/v) DMSO 및 10%(v/v) FBS로 이루어진 동결 배지에 넣고 -196℃의 액체 질소에 보관하였다. After culturing until cells become confluency, cells without attached somatic cells are removed and the remaining cells trypsinized for 1 minute in medium containing 0.1% trypsin and 0.02% EDTA and added Three passages were transferred for passage and subcultured at 4-6 day intervals. It was then placed in a freezing medium consisting of 80% (v / v) DMEM, 10% (v / v) DMSO and 10% (v / v) FBS and stored in liquid nitrogen at -196 ° C.
체세포 핵 이식을 하기에 앞서, 세포들을 해동하고, 50 μM의 로스코비틴이 첨가된 배양 배지(즉, DMEM + 10% FBS + 50 μM 로스코비틴) 에서 24시간 동안 배양하여 G2/M기로 유도하고, 세포를 회수하였다. Prior to somatic cell nuclear transfer, cells were thawed and incubated for 24 hours in culture medium (i.e., DMEM + 10% FBS + 50 μM roscovitine) added with 50 μM roscovitine to induce G2 / M groups. And cells were harvested.
실시예 4 :체세포 Example 4 Somatic Cells 핵이식Nuclear transfer
상기 실시예 2에서 제조한 탈핵 난자에 상기 실시예 3에서 제조한 핵 공여 세포를 미세주입하였다. 핵 공여 세포는 탈핵 난자의 주란강(perivitellin) 공간으로 다음과 같은 방법으로 미세주입하였다. 미세주입시 정치된 탈핵 난자를 100/mL 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)이 함유된 표1의 배지에 처리하고, 탈핵 난자의 절개창을 고정용 피펫으로 고정한 다음 이식용 피펫을 절개창으로 삽입하여 실시예 3에서 단일세포로 분리된 섬유아세포를 탈핵 난자의 세포질과 투명대 사이에 주입하였다. 미세조작장치(Nikon-Narishige, Japan)에 부착되어 있는 평행한 2개의 전극사이에 놓고 전기-세포 융합 장치(Electro-Cell Fusion apparatus) (NEPA GENE Co., Chiba, Japan)로 전기적 자극을 가하였다. The nuclear donor cells prepared in Example 3 were microinjected into the denucleated eggs prepared in Example 2 above. Nuclear donor cells were microinjected into the perivitellin space of denuclearized eggs in the following manner. The micronucleus-implanted denuclearized eggs were treated with 100 / mL phytohemagglutinin-containing medium in Table 1, the denucleated oocytes were fixed with a fixed pipette, and the transplantation pipette was inserted into the incision. In Example 3, the fibroblasts isolated into single cells were injected between the cytoplasm and the zona pellucida of the denucleated egg. Electrical stimulation was performed between two parallel electrodes attached to a micromanipulator (Nikon-Narishige, Japan) with an electro-cell fusion apparatus (NEPA GENE Co., Chiba, Japan). .
전기자극 후에 핵 공여 세포와 난자 세포질체의 융합을 입체현미경 하(stereomicroscope)에서 관찰하였다. 이를 수정란 이식에 바로 이용하였다.After electrostimulation, the fusion of nuclear donor cells and egg cytoplasm was observed under a stereomicroscope. This was used directly for fertilized egg transplant.
실시예 5: 대리모 이식 및 Example 5: Surrogate Mother Transplantation 복제개의Replica 생산 production
상기 실시예 4에서 융합시켜 제조한 핵 이식란을 발정 동기화된 대리모의 난관에 외과적 수술방법을 사용하여 즉시 이식하였다. 이식은 상기에서 핵 이식란을 활성화한 후 4시간 이내에 수행하였다. 대리모로는 질병에 이환되지 않으며 정상적인 발정주기가 반복되며 자궁상태가 정상인 암캐를 사용하였다. Nuclear transfer embryos prepared by fusing in Example 4 were immediately implanted into the oviducts of estrus-synchronized surrogate mothers using a surgical procedure. Transplantation was performed within 4 hours after activating the nuclear transfer embryos. The surrogate mother was a disease-free, repeated normal estrous cycle and a normal uterus.
이를 위해 먼저 대리모에 0.1mg/kg 아세프로마진(acepromazine)과 6mg/kg 프로포폴(propofol)을 혈관주사하여 마취시켰고, 2% 이소플루란(isoflurane)을 이용하여 흡입마취상태를 유지하였다. 마취된 개의 수술부위를 무균처리하고 난관을 노출시키기 위해 일반적인 개복수술법에 따라 등배쪽 부위를 절개하였다. 손으로 복강 내를 촉진하여 난소와 난관 및 자궁을 절개창으로 견인하였다. 견인된 난소의 난소간막을 조심스레 다루어 난관의 개구부를 인지하고 1.0ml 튜버큘린(tuberculin) 주사기(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417)가 장착된 3.5F 톰 캣 카테터(Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO)를 난관 내로 넣어 카테터 전방에 충분한 공간을 확보하고 핵 이식란을 주입하였다. 핵 이식란의 주입여부는 현미경을 검경하였다. 복부의 봉합은 흡수성 봉합사를 이용하였고 이후 피부봉합을 실시하였다. 수술 후 감염을 방지하기 위하여 광범위 항생제를 3일간 투여하였다. For this purpose, anesthesia was first anesthetized by injecting 0.1 mg / kg acepromazine and 6 mg / kg propofol into the surrogate mother and inhaled anesthesia using 2% isoflurane. In order to aseptically treat the surgical site of the anesthetized dog and expose the fallopian tube, the dorsal area was incised according to the general open surgery. The abdominal cavity was promoted by hand to pull the ovaries, fallopian tubes and uterus into the incision. Carefully handle the ovarian mesentery of the towed ovary to recognize the openings of the fallopian tubes and the 3.5F Tom cat catheter with a 1.0ml tuberculin syringe (Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417) catheter, Sherwood, St. Louis, MO) were placed into the fallopian tube to secure sufficient space in front of the catheter and to inject nuclear transfer eggs. The injection of nuclear transfer eggs was examined under a microscope. Abdominal sutures were performed using absorbent sutures, followed by skin closure. Broad antibiotics were administered for 3 days to prevent postoperative infection.
임신여부는 대리모에 핵 이식란을 이식한 후 23일째에 7.0 MHZ 리니어-어레이 프로브(linear-array probe)가 장착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너(Medison Co. LTD, Korea)를 이용하여 검사하였다. 임신상태는 초기에 임신을 확인한 후 2주마다 초음파로 모니터링하였다. 그 결과, 개에게서 임신 사실을 확인하였고 자연분만을 유도하거나 제왕절개 수술로 복제개를 생산하였다. Pregnancy was examined using a SONOACE 9900 ultrasound scanner (Medison Co. LTD, Korea) equipped with a 7.0 MHZ linear-array probe at 23 days after implanting the nuclear transfer embryos into surrogate mothers. Pregnancy status was monitored by ultrasound every two weeks after confirming pregnancy in the early stage. As a result, the dog was confirmed to be pregnant and cloned dogs were produced by inducing natural delivery or by caesarean section surgery.
도 1은 종래 통상적인 체세포 핵이식에 의한 복제 동물 생산과정을 나타내는 모식도이다. Figure 1 is a schematic diagram showing a cloned animal production process by conventional conventional somatic cell nuclear transfer.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 복제 동물 생산과정을 나타내는 모식도이다. Figure 2 is a schematic diagram showing a cloned animal production process according to an embodiment of the present invention.
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| KR1020090001211A KR20100081805A (en) | 2009-01-07 | 2009-01-07 | Method for producing cloned canidae using nuclear transfer of somatic cells or stem cells |
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| KR20210056439A (en) * | 2018-10-31 | 2021-05-18 | 서울대학교산학협력단 | Production of transgenic dogs overexpressing muscle-specific peroxisome proliferative activating receptor delta (PPARδ) |
-
2009
- 2009-01-07 KR KR1020090001211A patent/KR20100081805A/en not_active Application Discontinuation
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