KR20100077817A - Polypeptide and polynucleotide derived from mycobacteria and screening method for anti-mycobacterial agent - Google Patents

Polypeptide and polynucleotide derived from mycobacteria and screening method for anti-mycobacterial agent Download PDF

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KR20100077817A
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Abstract

PURPOSE: A method for screening mycobacteria-derived polypeptide, polynucleotide, and anti-mycobacterial agent is provided to develop anti-mycobacterial agent without side effects. CONSTITUTION: A mycobacteria-derivaed polypeptide contains an amino acid of sequence number 2. The polypeptide activates transcription of carbon monoxide dehydrogenase. A mycobacteria-derived polynucleotide comprises: (a) a nucleotide sequence encoding an amino acid of sequence number 2; (b) a complementary nucleotide sequence to the nucleotide sequence; or (c) a nucleotide sequence which is hybridized with the sequence (a) or (b) under stringent conditions. A method for screening the anti-mycobacterial agent comprises: a step of contacting a sample to cells containing a polypeptide of sequence number 2 or a polynucleotide of sequence number 1; a step of measuring transcription level or expression level of the polynucleotide or polypeptide activation; and a step of determining sample as the anti-mycobacterial agent.

Description

마이코박테리아―유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항―마이코박테리아제의 스크리닝 방법{Polypeptide and Polynucleotide Derived from Mycobacteria and Screening Method for Anti―Mycobacterial Agent}Polypeptide and Polynucleotide Derived from Mycobacteria and Screening Method for Anti-Mycobacterial Agent

본 발명은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to methods for screening mycobacterial-derived polypeptides, polynucleotides and anti-mycobacterial agents.

결핵은 전 세계적으로 널리 퍼져 있을 뿐만 아니라, 현재 사용되고 있는 BCG 백신의 낮은 예방효율과 에이즈 환자들의 기회감염 증가 및 기존 약제로 치료가 불가능한 다제내성 결핵(MDR-TB) 감염의 증가로 인하여 장차 심각한 보건상의 문제로 대두되고 있다1 ,2. 이와 같은 문제를 해결하는 하기 위해 새로운 결핵 백신 및 새로운 결핵치료제들이 개발되고 있으나, 현재 개발되고 있는 치료제들은 모두 결핵균의 마이콜릭 액시드(mycolic acid)의 생합성이나 RNA 전사과정, FASI 저해, 아라비노갈락탄 합성 또는 단백질 합성 등과 관련된 기존에 잘 알려진 목표들을 대상으로 하고 있어 결핵 치료에 큰 효과를 거두지 못할 것으로 생각된다. 따라서 본 발명자들에 의해 확인된 일산화탄소 탈수소효소(carbon monoxide dehydrogenase, CO-DH)는 현재 개발 중인 결핵치료제에 대한 전혀 새로운 목표이며3, CO-DH의 발현 및 활성에 관여하는 다른 단백질들도 결핵치료에 대한 새로운 목표가 될 것으로 기대한다. 현재 CO-DH를 신약 개발을 위한 하나의 목표로 설정한 후 CO-DH에 대한 저해제를 탐색하고 있으나, 컴퓨터를 이용한 분석을 통해 가상적인 CO-DH의 활성 부분을 분석한 결과, CO-DH의 활성 부분은 기체인 CO가 들어갈 수 있는 좁은 통로이기 때문에 CO-DH의 활성 부분에 직접적으로 결합할 수 있는 저해제는 발견이 어렵고, CO-DH의 다른 부분에 결합하여 CO-DH의 활성을 저해하는 물질을 탐색 중이나 아직까지 그 효과가 뛰어난 저해제를 발굴하지 못한 상황이다. 따라서 CO-DH의 활성을 저해할 수 있는 다른 방법으로 CO-DH의 전사나 발현에 관련되는 다른 단백질의 저해를 CO-DH의 활성저해의 또 다른 목표로 계획하고 있다. Tuberculosis is not only widespread worldwide, but also due to the low preventive effectiveness of the current BCG vaccine, increased opportunistic infections in AIDS patients, and increased multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) infections that cannot be treated with conventional drugs. 1 , 2 has emerged as a problem. New tuberculosis vaccines and new tuberculosis therapies are being developed to solve these problems, but all currently developed treatments are biosynthesis of mycolic acid of the Mycobacterium tuberculosis bacterium, RNA transcription, FASI inhibition and arabinol. It targets well-known targets related to lactan synthesis or protein synthesis, so it is unlikely to have a great effect on the treatment of tuberculosis. Therefore, carbon monoxide dehydrogenase (carbon monoxide dehydrogenase, CO-DH) confirmed by the present inventors are completely new targets for tuberculosis agents that are currently under development. 3, other proteins involved in the expression and activity of the CO-DH also tuberculosis Expect to be a new goal for Currently, CO-DH has been set as a target for drug development, and the inhibitors for CO-DH have been explored. However, the analysis of the virtual part of CO-DH through computer-based analysis revealed that Because the active moiety is a narrow passageway through which CO, a gas, can enter, inhibitors that can directly bind to the active moiety of CO-DH are difficult to find, and they bind to other moieties of CO-DH and inhibit the activity of CO-DH. We have been searching for substances, but we have not found any inhibitors that are effective. Therefore, as another method of inhibiting the activity of CO-DH, the inhibition of other proteins involved in the transcription or expression of CO-DH is planned as another goal of the inhibition of CO-DH activity.

현재까지 거의 150종 이상의 마이코박테리아가 알려져 있으며 (http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html), 그 중에서 게놈 프로젝트가 완료된 것은 17종이다. 이 17종의 마이코박테리아 중에 CO-DH를 가지고 있는 종은 14종으로 많은 종의 마이코박테리아가 CO-DH를 가지고 있다. 또한 게놈 프로젝트에 의한 경우가 아니라도 마이코박테리아에서 CO-DH는 다른 속의 세균과는 달리 많은 종이 CO-DH를 가지고 있음이 확인되었고4 ,5,6, 이는 다른 세균과는 달리 마이코박테리아 CO-DH 만의 특이한 NO 비독성화 능력에 의해 기인된다고 추정된다3. 결핵균의 CO-DH 주변에는 7개의 잘 보전된 유전자가 존재하고 있으며, 이들은 모두 CO-DH의 발현이나 활성에 영향을 줄 것이라 생각된다7. 본 발명자는 이러한 7개의 유전자의 기능을 확인하여, CO-DH의 발현이나 활성에 크게 영향을 미치는 단백질을 찾고자 하였다. 즉, 본 발명에서는 현재 사용 또는 개발 중에 있는 결핵치료제나 결핵치료제 후보물질들의 목표와는 전혀 다른 목표를 발굴하기 위하여, 결핵균에 공통적으로 존재하며 NO를 비독성화할 수 있는 NO-DH의 활성을 가지고 있는 CO-DH의 활성을 저해하기 위해3, CO-DH의 발현 및 활성에 영향을 주는 유전자들의 산물을 새로운 결핵치료의 목표로 발굴하고자 하였다. 이와 같은 연구는 현재까지 시도되지 않고 있는 새로운 목표를 대상으로 하는 연구로, 전 세계적으로 본 발명자에 의해서만 진행되고 있는 유일한 연구이다.To date, more than 150 mycobacteria are known (http://www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html), of which 17 have completed genome projects. Of these 17 mycobacteria, 14 have CO-DH, and many of them have CO-DH. In addition, in the case of the mycobacteria as well Genome Project CO-DH was confirmed that unlike other bacteria have a lot of paper in the CO-DH 4, 5,6, which, unlike other bacteria, mycobacteria CO-DH NO own unique non-toxic it is estimated that caused by the torch 3 capacity. There are seven well-conserved genes around the CO-DH of Mycobacterium tuberculosis, all of which are thought to affect the expression and activity of CO-DH 7 . The inventors have identified the functions of these seven genes, and tried to find proteins that greatly influence the expression and activity of CO-DH. That is, the present invention has the activity of NO-DH that is present in common in the tubercle bacillus and can detoxify NO in order to discover a totally different target from the targets of tuberculosis treatment or tuberculosis candidates currently in use or development. In order to inhibit the activity of CO-DH 3 , the aim of this study was to identify the products of genes that affect the expression and activity of CO-DH as a target for new tuberculosis treatment. Such a study is a study aiming at a new target that has not been attempted to date, and is the only study being conducted by the present inventors worldwide.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 현재까지 개발된 항-마이코박테리아제가 결핵을 비롯하여 마이코박테리아와 관련된 여러 질병들을 효과적으로 예방 또는 치료하는 데에 미흡하다는 점에 착안하여 연구를 통해 일산화탄소 탈수소효소가 새로운 항-마이코박테리아제의 타겟이 될 수 있음을 확인하였고, 일산화탄소 탈수소효소 유전자와 관련된 다른 유전자 및 단백질들을 지속적으로 연구한 결과, 일산화탄소 탈수소효소를 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 단백질을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.The inventors have focused on the fact that the anti-mycobacterial agents developed to date are insufficient for effectively preventing or treating various diseases related to mycobacteria including tuberculosis. It was confirmed that this can be, and as a result of continuous research of other genes and proteins related to the carbon monoxide dehydrogenase gene, the present invention was completed by identifying a new protein that can effectively inhibit the carbon monoxide dehydrogenase.

따라서 본 발명의 목적은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드를 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide mycobacterial-derived polypeptides.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide mycobacteria-derived polynucleotides.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 분자에 특이적으로 혼성화되는 프라이머 또는 프로브를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide primers or probes that hybridize specifically to mycobacterial-derived nucleotide molecules.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide an antibody that specifically binds to a mycobacterial-derived polypeptide.

본 발명의 또 다른 목적은 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising a mycobacterial-derived nucleotide sequence and a promoter.

본 발명의 다른 목적은 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a cell transformed with a recombinant vector comprising a mycobacterial-derived nucleotide sequence and a promoter.

본 발명의 또 다른 목적은 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for screening an anti-mycobacterial agent.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드를 제공한다.According to one aspect of the invention, the invention provides a mycobacteria-derived polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.

본 발명자들은 현재까지 개발된 항-마이코박테리아제가 결핵을 비롯하여 마이코박테리아와 관련된 여러 질병들을 효과적으로 예방 또는 치료하는 데에 미흡하다는 점에 착안하여 연구를 통해 마이코박테리아에서 일산화탄소 탈수소효소가 새로운 항-마이코박테리아제의 타겟이 될 수 있음을 확인하였고, 일산화탄소 탈수소효소 유전자와 관련된 다른 유전자 및 단백질들을 지속적으로 연구한 결과, 일산화탄소 탈수소효소를 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 단백질을 동정하였다.The inventors have focused on the fact that the anti-mycobacterial agents developed to date are insufficient in effectively preventing or treating various diseases related to mycobacteria including tuberculosis. It was confirmed that it can be a target of the agent, and continued research on other genes and proteins related to the carbon monoxide dehydrogenase gene, a new protein that can effectively inhibit the carbon monoxide dehydrogenase was identified.

대식세포는 인체에 침입한 병원체를 제거하는 기능을 하는 면역세포의 일종으로, 자신이 삼킨 병원체를 소화시키고 파괴하기 위하여 여러 가지 화합물을 만들어 내는데, 그 중의 하나가 일산화질소(nitric oxide, NO)이다. 그러나, 대식세포 내에서 생존할 수 있는 병원성 박테리아들은 대식세포가 만들어내는 천연 NO 저해제를 이용하여 NO의 작용을 저해, 회피하거나 박테리아 스스로 NO를 해독시키는 효소를 만들어 냄으로써 대식세포 내에서 살아남아 증식할 수 있다. 병원성 마이 코박테리아는 대식세포 내의 일산화질소를 산화하는 NO 디옥시게나아제(NO dioxigenase) 또는 퍼옥시나이트리타아제(peroxynitritase)와 같은 효소를 갖고 있으며(Couture, M., S. R. Yeh, B. A. Wittenberg, J. B. Wittenberg, Y. Ouellet, D. L. Rousseau, and M. Guertin., Proc . Natl . Acad . Sci. 96:11223-11228(1999) 및 Wengenack, N. L., Jensen, M. P., Rusnak, F., and Stern, M. K. Biochem. Biophys . Res . Commun . 256:485487(1999)), 본 발명의 일산화탄소 탈수소효소도 일산화질소를 산화시키는 기능을 가지고 있음이 알려져 있다(Park SW, Song T, Kim SY, Kim E, Oh JI, Eom CY, Kim YM., Biochem . Biophys . Res . Commun . 362(2):449-53(2007)).Macrophages are immune cells that function to remove pathogens that have invaded the body. They produce a variety of compounds to digest and destroy the pathogens they swallow, one of which is nitric oxide (NO). . However, pathogenic bacteria that can survive in macrophages can survive and proliferate in macrophages by using natural NO inhibitors produced by macrophages to inhibit or avoid the action of NO or to produce enzymes that decode NO by the bacteria themselves. have. Pathogenic mycobacteria have enzymes such as NO dioxigenase or peroxynitritase that oxidize nitric oxide in macrophages (Couture, M., SR Yeh, BA Wittenberg, JB Wittenberg). , Y. Ouellet, DL Rousseau, and M. Guertin., Proc . Natl . Acad . Sci. 96: 11223-11228 (1999) and Wengenack, NL, Jensen, MP, Rusnak, F., and Stern, MK Biochem. ... Biophys Res Commun 256: 485487 (1999)), is carbon monoxide dehydrogenase of the present invention is also known that has a function of oxidizing nitrogen monoxide (Park SW, Song T, Kim SY, Kim E, Oh JI, Eom CY, Kim Y M., Biochem . Biophys . Res . Commun . 362 (2): 449-53 (2007)).

본 명세서에서 사용되는 용어, “마이코박테리아”는 왁시(waxy)한 소수성의 풍부한 마이콜릭 액시드(mycolic acid)가 포함된 두꺼운 세포벽을 갖는 호기성의 항산성 그람 양성 박테리아로 분류되는 박테리아 집단을 의미한다. 마이코박테리아는 배양시 빠르게 생장하는 비병원성 마이코박테리아(non-pathogenic mycobacteria) 및 배양시 느리게 생장하는 병원성 마이코박테리아(pathogenic mycobacteria)로 분류될 수 있다. 비병원성 마이코박테리아로는 Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei, Mycobacterium cuneatum , Mycobaterium gastri , Mycobacterium ID-Y, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum , Mycobacterium diernhoferi , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1 등이 있으며, 병원성 마이 코박테리아로는 Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum , Mycobacterium avium , Mycobacterium ulcerans , Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum 등이 있다. 이들 마이코박테리아 집단의 상당수는 일산화탄소를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있다고 보고되어 있으며(Park SW, Hwang EH, Park H, Kim JA, Heo J, Lee KH, Song T, Kim E, Ro YT, Kim SW, Kim YM., J. Bacteriol . 185(1):142-7(2003)), 병원성 마이코박테리아를 연구하는 그룹들은 배양의 편의성 및 안전성을 위해 병원성 마이코박테리아와 유전적 특성이 유사한 비병원성 마이코박테리아를 모델로 하여 병원성 마이코박테리아의 특성을 밝히고 있다.As used herein, the term “mycobacteria” refers to a population of bacteria that are classified as aerobic, acidic, gram-positive bacteria with thick cell walls that contain waxy, hydrophobic, rich mycolic acid. . Mycobacteria can be classified into non-pathogenic mycobacteria that grow rapidly in culture and pathogenic mycobacteria that grow slowly in culture. Mycobacterium as a non-pathogenic mycobacteria fortuitum , Mycobacterium parafortuitum , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei, Mycobacterium cuneatum , Mycobaterium gastri , Mycobacterium ID-Y, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum , Mycobacterium diernhoferi , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, and the pathogenic mycobacteria include Mycobacterium. tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum , Mycobacterium avium , Mycobacterium ulcerans , Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae , Mycobacterium asiaticum , Mycobacterium porcinum . Many of these mycobacteria are reported to use carbon monoxide as their only carbon and energy source (Park SW, Hwang EH, Park H, Kim JA, Heo J, Lee KH, Song T, Kim E, Ro YT, Kim). SW, Kim YM., J. Bacteriol . 185 (1): 142-7 (2003)), Groups studying pathogenic mycobacteria are non-pathogenic mycobacteria that have similar genetic characteristics to pathogenic mycobacteria for the convenience and safety of culture. The model reveals the characteristics of pathogenic mycobacteria.

본 명세서에서 사용되는 용어, “카복시도박테리아”는 일산화탄소를 유일한 탄소 및 에너지원으로 사용하여 생장하는 박테리아 집단을 의미한다(Kim, Y. M., and G. D. Hegeman., Int . Rev . Cytol . 81:1-32(1983)).As used herein, "carboxy FIG bacteria" means bacteria that grow groups using carbon monoxide as the sole source of carbon and energy (Kim, YM, and GD Hegeman , Int Rev Cytol 81:.... 1- 32 (1983).

본 명세서에서 사용되는 용어, “일산화탄소 탈수소효소(CO-DH)”는 카복시도박테리아에서 일산화탄소를 이산화탄소로 산화시키는 주효소를 의미하며, 다음과 같은 반응을 통해 일산화탄소를 산화시킨다: CO + H2O → CO2 + 2H+ + 2e-. 또한, 마이코박테리아 내에서 상기 일산화탄소 탈수소효소는 일산화질소를 산화하여 유독한 일산화질소를 무해한 이산화질소로 해독시키는 기능을 하며, 이는 병원성 마이코박테리아가 대식세포 내에서 생존할 수 있는 기작으로 작용할 수 있다(Park SW, Song T, Kim SY, Kim E, Oh JI, Eom CY, Kim YM., Biochem. Biophys. Res. Commun. 362(2):449-53(2007)). 따라서 본 명세서에서 상기 일산화탄소 탈수소효소는 용어 “일산화질소 탈수소효소(NO-DH)”와 혼용된다. 또한, 본 명세서에서 사용된 Mycobacterium sp. strain JC1의 일산화탄소 탈수소효소의 구조유전자는 “cutBCA”로 표시된다. 하기 실시예에서 사용된 박테리아인 “Mycobacterium sp. strain JC1”은 상기 마이코박테리아 집단에 속하는 박테리아의 한 종류로 카복시도박테리아에 포함되는 박테리아인데, Mycobacterium sp. strain JC1의 16S rRNA 유전자는 다른 마이코박테리아 집단의 16S rRNA 유전자와 최소 96% 이상의 유사성을 나타내며 일부 마이코박테리아 집단(예컨대, M. peregrinum , M. wolinsky 등)의 16S rRNA 유전자와 최대 99%의 유사성을 나타낸다 (Kusunoki and Ezaki, Intl . J. System . Bacteriol . 42:240-245(1992); Brown et al., Intl . J. System . Bacteriol . 49:1493-1511(1999)). 또한, 튜버큘로스테아린산(tuberculostearic acid)라고 불리는 10-메틸 C18 :0를 가지고 있음은 물론, 지방산의 분포도 다른 마이코박테리아의 지방산 분포와 유사한 박테리아이다(Song et al., J. Microbiol . 40:237-240(2002)).As used herein, the term “carbon monoxide dehydrogenase (CO-DH)” refers to a main enzyme that oxidizes carbon monoxide to carbon dioxide in a carboxydobacteria, and oxidizes carbon monoxide through the following reaction: CO + H 2 O → CO 2 + 2H + + 2e -. In addition, the carbon monoxide dehydrogenase in mycobacteria functions to oxidize nitrogen monoxide to detoxify toxic nitrogen monoxide into harmless nitrogen dioxide, which may act as a mechanism for pathogenic mycobacteria to survive in macrophages (Park SW, Song T, Kim SY, Kim E, Oh JI, Eom CY, Kim YM., Biochem.Biophys.Res.Commun. 362 (2): 449-53 (2007)). Thus, the carbon monoxide dehydrogenase herein is used interchangeably with the term “nitrogen monoxide dehydrogenase (NO-DH)”. In addition, Mycobacterium sp. The structural gene of carbon monoxide dehydrogenase of strain JC1 is expressed as “ cutBCA ”. The bacterium used in the examples below is “ Mycobacterium sp. strain JC1 ”is one of the bacteria belonging to the mycobacterial population and is included in the carboxydobacterium. Mycobacterium sp. The 16S rRNA gene of strain JC1 exhibits at least 96% similarity to the 16S rRNA gene of other mycobacterial populations and may be expressed in some mycobacterial populations (eg, M. peregrinum , M. wolinsky). And up to 99% similarity with 16S rRNA genes (Kusunoki and Ezaki, Intl . J. System . Bacteriol . 42: 240-245 (1992); Brown et al., Intl . J. System . Bacteriol . 49) . : 1493-1511 (1999). In addition to having 10-methyl C 18 : 0 called tuberculostearic acid, the distribution of fatty acids is similar to that of other mycobacteria (Song et al., J. Microbiol . 40: 237-240 (2002)).

본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는다.Mycobacterial-derived polypeptides of the present invention have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

첨부한 서열목록 제2서열을 포함하는 폴리펩타이드는 일산화탄소 탈수소효소의 유전자의 전사 또는 일산화탄소 탈수소효소의 발현을 활성화하는 단백질에 해당한다.The polypeptide comprising the appended SEQ ID NO: 2 sequence corresponds to a protein that activates the transcription of the carbon monoxide dehydrogenase gene or the expression of the carbon monoxide dehydrogenase.

본 발명에서 사용되는 용어 “아미노산 서열”은 아미노산의 중합체(예컨대, 단백질, 폴리펩타이드 등)를 의미하며, 용어 “폴리펩타이드”는 “단백질” 및 “펩타이드”와 혼용된다.As used herein, the term “amino acid sequence” refers to a polymer of amino acids (eg, protein, polypeptide, etc.), and the term “polypeptide” is used interchangeably with “protein” and “peptide”.

본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) 및 Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.The mycobacterial-derived polypeptides of the present invention are also construed to include amino acid sequences that exhibit substantial identity to the amino acid sequences described above. This substantial identity is at least 60% when the amino acid sequence of the present invention is aligned with the maximal correspondence of any other sequence, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. Means a sequence that exhibits homology of, more preferably 80%, and most preferably 90%. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2: 482 (1981) ; Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48: 443 (1970) ; Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24: 307-31 (1994). NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215: 403-10 (1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NCBI), etc. It can be used in conjunction with sequencing programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLAST can be accessed at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparison methods using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

또한, 본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드의 변이체란 본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York(1979)). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.In addition, the mycobacterial-derived polypeptides of the present invention are also within the scope of the present invention as well as proteins having their native amino acid sequences, as well as amino acid sequence variants thereof. A variant of mycobacteria-derived polypeptide means a protein in which the mycobacteria-derived polypeptide natural amino acid sequence of the present invention and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. do. Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurath, RL Hill, The Proteins , Academic Press, New York (1979). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thr / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, or the like.

상기 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer . chem . Soc .. 85:2149-2156(1963)) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, (1989)). The mycobacteria-derived polypeptide or variant thereof is derived from natural or synthetic (.... Merrifleld, J. Amer chem Soc 85: 2149-2156 (1963)) , or be produced by recombinant methods to a DNA sequence as the primary (Sambrook et al., Molecular Cloning , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd Edition, (1989).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention is (a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a); Or (c) a mycobacteria-derived polynucleotide consisting of a nucleotide sequence that hybridizes with the sequence of (a) or (b) under stringent conditions.

본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term “nucleotide” is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide present in single- or double-stranded form, encompasses RNA genome sequences, cDNAs, and RNA sequences transcribed therefrom, and unless otherwise stated, natural Includes analogs of nucleotides (Scheit, Nucleotide Analogs , John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990).

본 발명의 뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인 (complementary) 서열도 포함한다. 본 발명의 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열 (perfectly complementary sequence)뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열 (substantially complementary sequence)도 포함한다. 용어 “실질적으로 상보적인 서열”은 당업계에 공지된 엄격 조건 (stringent conditions) 하에서 예컨대 서열목록 제1서열 의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 용어 “엄격 조건"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있으며, 엄격 조건은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 a) 50℃ 온도 및 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트로 세척하거나, b) 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어질 수 있다.The nucleotide of the present invention includes not only the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but also a complementary sequence to the sequence. Complementary sequences of the present invention include not only perfectly complementary sequences, but also substantially complementary sequences. The term “substantially complementary sequence” means a sequence that can hybridize with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, under stringent conditions known in the art. The term “strict conditions” refers to Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach , IRL Press, Washington, DC (1985), stringent conditions can be determined by controlling temperature, ionic strength (buffer concentration) and the presence of compounds such as organic solvents, and the like. It can be determined differently according to the. For example, stringent conditions may be a) washed with 50 ° C. temperature and 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate, or b) hybridization buffer (50% formamide, 2 × SSC and 10%). Hybridization to 55 ° C. in dextran sulfate), followed by washing at 55 ° C. with EDTA-containing 0.1 × SSC.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 엄격 조건은 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어져 있다.The nucleotide sequence of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions or a nucleotide sequence that hybridizes to the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence. The stringent conditions consist of hybridization at 55 ° C. in hybridization buffer (including 50% formamide, 2 × SSC and 10% dextran sulfate), followed by washing at 55 ° C. with EDTA-containing 0.1 × SSC.

한편, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부 서열, 즉, 단편 (fragment)을 포함한다.On the other hand, the nucleotide sequence of the present invention includes a partial sequence, that is, a fragment of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이코박테리아-유래 뉴클레오타 이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.According to a preferred embodiment of the present invention, the mycobacterial-derived nucleotide sequence consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention provides primers or probes that specifically hybridize to the aforementioned mycobacteria-derived nucleotides.

본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. As used herein, the term “primer” refers to a single-strand that can act as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) at a suitable temperature. Oligonucleotides. Suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a hybrid complex that is sufficiently stable with the template.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트는 주형인 상기 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오타이드의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.The sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template to perform the primer-specific function. Therefore, the primer set provided in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence that is a template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to the sequence to act as a primer. The design of such primers can be easily carried out by those skilled in the art with reference to the cDNA sequences of the above-described nucleotides, for example, by using a primer design program (eg, PRIMER 3 program).

한편, 본 발명에서 제공하는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵 산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다.On the other hand, the primer provided in the present invention is hybridized or annealed to one site of the template to form a double-chain structure. Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming such double chain structures are described by Joseph Sambrook, et al., Molecular. Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach , IRL Press, Washington, DC (1985).

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.As used herein, the term “probe” refers to a linear oligomer having naturally occurring or modified monomers or bonds, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides that can hybridize to a particular nucleotide sequence. Preferably, the probe is single stranded for maximum efficiency in hybridization. The probe is preferably deoxyribonucleotide.

본 발명에 제공되는 프로브로서, 상기 뉴클레오타이드 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열일 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 상술한 바와 같다.As the probe provided in the present invention, the sequence may be perfectly complementary to the nucleotide sequence, but may also be a sequence complementary to the range that does not prevent specific hybridization. Conditions suitable for hybridization are as described above.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an antibody that specifically binds to the aforementioned mycobacterial-derived polypeptide.

본 발명의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:581-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, (1999); Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida(1984); 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY(1991)에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.Antibodies that specifically bind to the mycobacterial-derived polypeptides of the invention are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies. Antibodies that specifically bind to the aforementioned mycobacterial-derived polypeptides are commonly practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European). Journal of Immunology , 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,56) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. . Mol Biol, 222:.. can be prepared by 581-597 (1991)). General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, (1999); Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1984); And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY , Wiley / Greene, NY (1991), which is incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing immortalized cell lines with antibody-producing lymphocytes, and the techniques required for this process are well known to those skilled in the art and can be readily implemented. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting the mycobacterial-derived polypeptide antigens described above into a suitable animal, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using known affinity techniques. .

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 상술한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant vector comprising (i) the nucleotide sequence of the present invention as described above and (ii) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence.

본 발명의 제조합 벡터에서 마이코박테리아-유래 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결(operatively linked)된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 연결된”은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서 열은 상기 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.Mycobacterial-derived nucleotide sequences in the production vectors of the present invention are operatively linked to the promoter. As used herein, the term “operably linked” refers to a functional bond between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence, whereby the regulatory sequence is responsible for the transcription and / or transcription of the other nucleotide sequence. Control detoxification.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are described in Sambrook et al., Molecular . Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), which is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 박테리아 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. It is preferable that the polynucleotide of the present invention is derived from bacteria, and has a prokaryotic cell as a host in consideration of the convenience of culture and the like. Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018- 1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, the tac promoter, lac Promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, p L λ promoter, p R λ promoter, rac 5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), ribosomal binding site for initiation of detoxification and It is common to include transcription / detox termination sequences. If E. coli is used as the host cell, E. coli Promoter and operator sites of the tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol . , 158: 1018-1024 (1984)) and the leftward promoter of phage λ (p L λ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., . Ann Rev Genet, 14:. . 399-445 (1980)) may be used as a control region.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. On the other hand, vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phages (eg, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 which are often used in the art). And M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.).

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 마이코박테리아-유래 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.Vectors of the present invention may also be fused with other sequences to facilitate the purification of mycobacteria-derived proteins expressed therefrom. Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA), and most preferably Is 6 × His. Because of the additional sequence for this purification, the protein expressed in the host is purified quickly and easily through affinity chromatography.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.On the other hand, the expression vector of the present invention as an optional marker, and includes antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo There are resistance genes for mycin, hygromycin and tetracycline.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a cell transformed with the recombinant vector of the present invention described above.

본 발명의 형질전환 세포를 제조하기 위하여, 게놈 DNA 서열 및 그의 전사체(transcripts)가 이용될 수 있다. 전사체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 실시할 수 있으며, 재조합 벡터를 이용하여 전사체를 제조하는 경우에는 우선, 벡터를 선형화 하여 전사체를 제조하는 것이 바람직하다.To prepare the transformed cells of the invention, genomic DNA sequences and their transcripts can be used. The method for preparing a transcript may be carried out according to a method known in the art, and when preparing a transcript using a recombinant vector, it is preferable to first prepare a transcript by linearizing the vector.

본 발명의 형질전환을 위한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.Host cells for transformation of the invention are known in the art and can be used with any host cell, for example E. coli JM109, E. coli Bacillus sp. Strains such as BL21 (DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium Enterobacteria and strains such as Um, Serratia Marcesons and various Pseudomonas species.

형질전환 과정에 있어서 벡터 등을 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. In the transformation process, a method of transporting a vector or the like into a host cell may include the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA , 9: 2110-2114, when the host cell is a prokaryotic cell) . (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA , 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol . , 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic . Acids Res . , 16: 6127-6145 (1988)).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (ⅰ) 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 (ⅱ) 상술한 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩 타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 활성, 전사량 또는 발현량이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료를 항-마이코박테리아제로 판정하는 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention provides a method for contacting a sample to be analyzed with a cell comprising (a) (my) the above-described mycobacteria-derived polypeptide or (ii) above the above-mentioned mycobacteria-derived polynucleotide. step; And (b) measuring the activity of the polypeptide, the amount of transcription or expression of the polynucleotide, wherein the sample is measured if the activity, amount of transcription or expression is down-regulated. It provides a method for screening an anti-mycobacterial agent, which is determined as an anti-mycobacterial agent.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 스크리닝 대상의 물질을 접촉시킨다.According to the method of the present invention, a substance to be screened is first contacted with a cell comprising the above-mentioned mycobacteria-derived polypeptide or above-mentioned mycobacteria-derived polynucleotide.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.As used to refer to the screening methods of the present invention, the term “sample” refers to an unknown substance used in screening to examine whether it affects the activity of the polypeptide, the amount of transcription or expression of the polynucleotide. The sample includes, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural extracts.

본 발명에서 이용되는 세포는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드 또는 상술한 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 세포(예컨대, 형질전환된 E. coli 또는 야생형 마이코박테리아)를 포함한다. 본 발명의 스크리닝에 사용될 수 있는 형질전환 미생물 또는 야생형 마이코박테리아의 구체적인 예는 상술한 바와 같다.The cells used in the present invention are all cells (eg, transformed E. coli) comprising the above-mentioned mycobacteria-derived polypeptides or above-mentioned mycobacteria-derived polynucleotides. Or wild type mycobacteria). Specific examples of transgenic microorganisms or wild type mycobacteria that can be used in the screening of the present invention are as described above.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 마이코박테리아는 Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum, Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei , Mycobacterium cuneatum , Mycobaterium gastri , Mycobacterium ID-Y, Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum , Mycobacterium diernhoferi , Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum , Mycobacterium avium , Mycobacterium ulcerans , Mycobacterium abscessus , Mycobacterium chelonae , Mycobacterium asiaticum 또는 Mycobacterium porcinum 이고, 보다 바람직하게는 Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei, Mycobaterium gastri , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium 또는 Mycobacterium ulcerans이며, 보다 더 바람직하게는 Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei , Mycobaterium gastri , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium avium 이고, 가장 바람직하게는 Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium sp. strain JC1 또는 Mycobacterium tuberculosis이다.Preferably, the mycobacteria used in the present invention is Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum, Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei , Mycobacterium cuneatum , Mycobaterium gastri , Mycobacterium ID-Y, Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum , Mycobacterium diernhoferi , Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum , Mycobacterium avium , Mycobacterium ulcerans , Mycobacterium abscessus , Mycobacterium chelonae , Mycobacterium asiaticum or Mycobacterium porcinum , and more preferably Mycobacterium fortuitum , Mycobacterium parafortuitum , Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei, Mycobaterium gastri , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium peregrinum, Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium wolinsky , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae , Mycobacterium marinum, Mycobacterium avium or Mycobacterium ulcerans , more preferably Mycobacterium vaccae , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium phlei , Mycobaterium gastri , Mycobacterium flavescens , Mycobacterium neoaurum , Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium sp. strain JC1, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis , Mycobacterium avium , most preferably Mycobacterium smegmatis , Mycobacterium sp. strain JC1 or Mycobacterium tuberculosis .

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험 물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.The test substance analyzed by the screening method of the present invention is a single compound or a mixture of compounds (eg, a natural extract or cell or tissue culture). Test substances can be obtained from libraries of synthetic or natural compounds. Methods of obtaining libraries of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are commercially available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA), and Sigma-Aldrich (USA), and libraries of natural compounds are available from Pan Laboratories (USA). ) And MycoSearch (USA).

시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 90:6909(1993); Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 91:11422(1994); Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37:2678(1994); Cho et al., Science 261:1303(1993); Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33:2059(1994); Carell et al., Angew. Chem . Int . Ed . Engl . 33:2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37:1233(1994) 등에 개시되어 있다.Test materials can be obtained by a variety of combinatorial library methods known in the art, for example, biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries, deconvolution By the required synthetic library method, “1-bead 1-compound” library method, and synthetic library method using affinity chromatography screening. Methods of synthesizing molecular libraries are described in DeWitt et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90: 6909 (1993); Erb et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med . Chem . 37: 2678 (1994); Cho et al., Science 261: 1303 (1993); Carell et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33: 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem . Int . Ed . Engl . 33: 2061; Gallop et al., J. Med . Chem . 37: 1233 (1994) and the like.

이어, 세포 내 상기 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 측정한다. 상기 활성, 전사량 또는 발현량이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 물질은 항-마이코박테리아제로 판 정된다. Then, the activity of the polypeptide, the amount of transcription or expression of the polynucleotide in the cell is measured. If the activity, transcription or expression level is measured to be down-regulation, the substance is determined to be an anti-mycobacterial agent.

상기 폴리펩타이드의 양을 측정하는 방법은 다양한 분석 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 다양한 면역분석 포맷으로 상기 폴리펩타이드의 양을 측정할 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida(1980); Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ(1984); 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.The method for measuring the amount of the polypeptide can be carried out according to various analytical methods. For example, the amount of the polypeptide can be measured in various immunoassay formats using an antibody that specifically binds to the polypeptide. Such immunoassays can be performed according to various quantitative immunoassay protocols developed in the prior art. The immunoassay formats include, but are not limited to, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), capture-ELISA, inhibition or hardwood assay, sandwich assay, immunofluorescence staining and immunoaffinity purification. It is not limited. The method of immunoassay or immunostaining is Enzyme Immunassay , ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology , Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ (1984); And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), which is incorporated herein by reference.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 상기 폴리펩타이드를 검출하는 데 이용될 수 있다.For example, when the method of the present invention is carried out according to a radioimmunoassay, radioisotopes (eg, C 14 , I 125 , P 32) And antibody labeled S 35 ) can be used to detect the polypeptide.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단 계; (ⅱ) 일차항체로서 상기 폴리펩타이드-특이적 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the present invention is carried out in ELISA mode, certain embodiments of the present invention comprise the steps of: (i) coating an unknown cell sample lysate to be analyzed on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting said polypeptide-specific antibody with said cell lysate as a primary antibody; (Iii) reacting the resultant of step (ii) with the secondary antibody to which the enzyme is bound; And (iii) measuring the activity of the enzyme.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (eg polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, most preferably microtiter plates.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m- PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.Enzymes bound to the secondary antibody include, but are not limited to, enzymes catalyzing color reaction, fluorescence, luminescence or infrared reaction, for example, alkaline phosphatase, β-galactosidase, hose Radish peroxidase, luciferase and cytochrome P 450 . When alkaline phosphatase is used as the enzyme binding to the secondary antibody, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-AS) as a substrate Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis) if colorimetric substrates such as -B1-phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) are used, and horse radish peroxidase is used -N-methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, Amflex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol (HYR), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o -phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine, glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS substrates such as phenzaine methosulfate can be used. The.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 상기 폴리펩타이드에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the invention is carried out in a capture-ELISA mode, certain embodiments of the invention comprise (i) coating an antibody against said polypeptide as a capturing antibody on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting the capture antibody with the cell sample; (Iii) reacting the product of step (ii) with a detecting antibody having a label that generates a signal and which specifically reacts with the polypeptide; And (iii) measuring the signal resulting from the label.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)에 기재되어 있다.The detection antibody carries a label which generates a detectable signal. The label may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P 450 ), radioactive substances (eg C 14 , I 125 , P 32 And S 35 ), fluorescent materials (eg, fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET). Various labels and labeling methods are available in Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999).

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 상기 폴리펩타이드의 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이 블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.Measurement of the final enzyme activity or signal in the ELISA method and the capture-ELISA method can be carried out according to various methods known in the art. Detection of this signal allows for quantitative analysis of the polypeptide. If biotin is used as a label, the signal can be easily detected with streptavidin and luciferase if luciferase is used.

시료에서 상기 폴리펩타이드에 대한 시그널이 비처리 대조군 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 항-마이코박테리아제로 판정된다.If the signal for the polypeptide in the sample is weaker than the untreated control sample, it is determined to be an anti-mycobacterial agent.

상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC press, 102-108(2004)), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.Determination of the amount of transcription or expression of the polynucleotide can be carried out through a variety of methods known in the art. For example, RT-PCR (Sambrook et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Northern blotting (Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine , CRC press, 102-108 (2004)), hybridization reactions using cDNA microarrays (Sambrook et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) or in situ (in situ ) Hybridization reaction (Sambrook et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머(예컨대, 진핵세포) 또는 확인하고자 하는 유전자(예컨대, 원핵세포)에 대한 특이적 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 상기 폴리뉴클레오타이드-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 cutI 유전자의 발현양 변화를 측정한다.When performing according to the RT-PCR protocol, first, total RNA is isolated from cells treated with a sample, and then oligo dT primers (e.g., eukaryotic) or specific primers for the gene (e.g., prokaryotic) to be identified. And reverse transcriptase to prepare a first-chain cDNA. Subsequently, the first chain cDNA is used as a template and PCR reaction is performed using the polynucleotide-specific primer set. Then, PCR amplification products are electrophoresed and the formed bands are analyzed to determine the change in the expression level of the cutI gene.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 상기 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 이 감소-조절(down-regulation)하는 것으로 분석된 물질은 항-마이코박테리아제로서 이용될 수 있다.Substances that have been analyzed to down-regulate the activity of the polypeptide, the amount of transcription or expression of the polynucleotide by the screening method of the present invention can be used as anti-mycobacterial agents.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-마이코박테리아제는 부룰리 궤양(Buruli ulcer), 임파선염(lymphadenitis) 또는 결핵의 예방 또는 치료용 물질이다. According to a preferred embodiment of the invention, the anti-mycobacterial agent is a substance for the prevention or treatment of Buruli ulcer, lymphadenitis or tuberculosis.

대표적인 결핵균인 M. tuberculosis H37Rv를 포함한 여러 병원성 마이코박테리아들이 CO-DH를 가지고 있으며(예컨대, M. tuberculosis C, M. tuberculosis CDC1551, M. tuberculosis F11, M. bovis, M. tuberculosis sp. Haarlem, M. marinum, M. ulcerans 등), 이들 중에는 결핵 외에 부룰리 궤양 및 임파선염 등 다른 질병을 유발하는 세균도 있다(예컨대, M. marinum, M. ulcerans 등). 이들은 모두 마크로파지 내에서 NO의 독성을 제거하여 생존함으로써 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Subbian et al., BMC Microbiol. 7:4(2007); Ouellet et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:59025907(2002)). 바람직하게는 상기 항-마이코박테리아제는 부룰리 궤양 또는 결핵의 예방 또는 치료용 물질이며, 가장 바람직하게는 결핵의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 스크리닝되는 항-마이코박테리아제가 사용될 수 있는 결핵의 종류로는 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장 결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두결핵, 중이결핵, 장결핵 및 폐결핵이 있으나, 이에 한정하지는 않는다. M. tuberculosis Several pathogenic mycobacteria, including H37Rv that has a CO-DH and (e. G., M. tuberculosis C, M. tuberculosis CDC1551 , M. tuberculosis F11, M. bovis , M. tuberculosis sp. Haarlem, M. marinum , M. ulcerans In addition to tuberculosis, there are also bacteria that cause other diseases such as burulic ulcers and lymphadenitis (eg, M. marinum , M. ulcerans Etc). They are all known to cause disease by eliminating the toxicity of NO in macrophages (Subbian et al., BMC) . Microbiol . 7: 4 (2007); Ouellet et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99: 59025907 (2002). Preferably the anti-mycobacterial agent is a substance for the prevention or treatment of ulcer ulcers or tuberculosis, and most preferably can be used for the prevention or treatment of tuberculosis. Examples of tuberculosis in which anti-mycobacterial agents screened by the method of the present invention can be used include eye tuberculosis, skin tuberculosis, adrenal tuberculosis, kidney tuberculosis, epididymal tuberculosis, lymphatic tuberculosis, laryngeal tuberculosis, middle ear tuberculosis, intestinal tuberculosis and pulmonary tuberculosis. It is not limited to this.

본 발명의 스크리닝 방법에 따라 개발되는 항-마이코박테리아제는 종래의 항-마이코박테리아제와의 시너지 효과로 상술한 마이코박테리아 관련 질병의 치료에 보다 효과적으로 이용될 수 있다.The anti-mycobacterial agent developed according to the screening method of the present invention can be used more effectively in the treatment of the above-mentioned mycobacteria-related diseases in synergy with conventional anti-mycobacterial agents.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명은 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.(Iii) The present invention relates to methods for screening mycobacterial-derived polypeptides, polynucleotides and anti-mycobacterial agents.

(ⅱ) 본 발명은 현재까지 알려지지 않은 마이코박테리아의 CutI 단백질에 의해 일산화탄소 탈수소효소의 발현이 조절되고, 일산화탄소 탈수소효소의 활성에 영향을 미친다는 것을 확인하여 항-마이코박테리아제의 가능성을 제시하였다.(Ii) The present invention has shown that the expression of carbon monoxide dehydrogenase is regulated by the CutI protein of mycobacteria, which is not known to date, and affects the activity of carbon monoxide dehydrogenase, suggesting the possibility of anti-mycobacterial agent.

(ⅲ) 본 발명은 마이코박테리아에 존재하고 인체에는 존재하지 않는 일산화탄소 탈수소효소의 발현 조절을 대상으로 한 것이므로 인체에 부작용이 없는 항-마이코박테리아제의 개발에 유리하다.(Iii) The present invention is directed to the control of the expression of carbon monoxide dehydrogenase present in mycobacteria and not present in the human body, which is advantageous for the development of anti-mycobacterial agents that do not have adverse effects on the human body.

이하, 도면을 참고한 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention to those skilled in the art. Will be self explanatory.

실시예Example

1. 실험 방법1. Experiment Method

사용 균주 및 세균 배양Strains and Bacteria Culture Used

본 발명에서 사용한 균주는 Mycobacterium sp. strain JC1이며8 ,9, 세균의 배양은 종래의 카복시도박테리아(carboxydobacteria)의 배양에 사용하였던 기본염류배지(Standard Mineral Base, SMB)10를 사용하였으며, 일산화탄소(30%, v/v) 또는 포도당(0.2%, w/v)을 공급하면서 37℃에서 배양하였다. 유전자 조작을 위해 대장균을 루리아-버타니(LB)배지에서 배양하였다.The strain used in the present invention is Mycobacterium sp. strain JC1, 8 , 9 , Cultivation was performed using Standard Mineral Base (SMB) 10 , which was used for the conventional culture of carboxydobacteria, and carbon monoxide (30%, v / v) or glucose (0.2%, w / v). Incubated at 37 ° C. with feeding. E. coli was cultured in Luria-Butani (LB) medium for genetic manipulation.

염색체 chromosome DNADNA 의 분리Separation of

염색체 DNA의 분리는 Murray 및 Thomson11의 방법을 변형하여 수행하였다. SMB에 포도당을 첨가한 배지에서 지수성장기까지 진탕배양 (37℃, 200 rpm)한 5 ㎖의 Mycobacterium sp. strain JC1 배양액을 원심분리 (18,000 × g, 15분, 4℃)하여 얻은 침전물에 567 ㎕의 TE 버퍼 (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0])를 넣어 현탁하였다. 여기에 20 ㎎/㎖ 농도로 TE 버퍼에 녹인 10 ㎕의 라이소자임 용액 및 30 ㎕의 10% (w/v) SDS 용액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이 혼합액에 100 ㎕의 5 M 소듐 클로라이드를 넣어 혼합한 후, 80 ㎕의 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)/소듐 클로라이드 용액 (4.1 g의 소듐 클로라이드를 80 ㎖의 증류수에 녹인 다음, 10 g의 CTAB을 가열하면서 천천히 첨가하고, 전체 부피를 100 ㎖이 되게 증류수를 더한다)을 넣어 65℃에서 10분 동안 방 치하였다. 동량의 페놀-클로로포름-아이소아밀 알코올(25:24:1, v/v/v)용액을 첨가하고 원심분리(18,000 × g, 15분, 4℃)하여 상층액을 취하여 같은 과정을 2회 반복하였다. 이렇게 하여 얻은 용액에 3 M 소듐 아세테이트 (pH 5.2)를 최종 농도가 0.3 M이 되게 첨가하여 혼합한 후, 2배 용량의 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 30분간 방치한 다음, 원심분리(18,000 × g, 15분, 4℃)하여 얻은 침전물을 70% (v/v) 에탄올로 세척하여 건조한 후, RNase (10 ㎍/㎖)-TE 버퍼 20 ㎕에 용해하여 사용하였다.Isolation of chromosomal DNA was performed by modifying the methods of Murray and Thomson 11 . 5 ml of Mycobacterium shaken (37 ° C, 200 rpm) from the medium supplemented with SMB to the exponential growth phase sp. The strain JC1 culture was suspended by adding 567 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]) to the precipitate obtained by centrifugation (18,000 × g , 15 min, 4 ° C.). 10 μl of lysozyme solution and 30 μl of 10% (w / v) SDS solution dissolved in TE buffer at a concentration of 20 mg / ml were added thereto and left at 37 ° C. for 1 hour. 100 μl of 5 M sodium chloride was added to the mixture, followed by mixing. Then, 80 μl of hexadecyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) / sodium chloride solution (4.1 g of sodium chloride was dissolved in 80 ml of distilled water, followed by 10 g of CTAB). Was added slowly while heating, and distilled water was added to make the total volume to 100 ml) and left at 65 ° C. for 10 minutes. Add the same amount of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1, v / v / v) solution, centrifuge (18,000 × g , 15 minutes, 4 ° C), take the supernatant, and repeat the same process twice. It was. To this solution was added 3 M sodium acetate (pH 5.2) to a final concentration of 0.3 M and mixed, followed by addition of 2 volumes of ethanol and left at -20 ° C for 30 minutes, followed by centrifugation (18,000 × g , 15 minutes, 4 ℃), the precipitate obtained was washed with 70% (v / v) ethanol and dried, and dissolved in 20 μl of RNase (10 μg / ml) -TE buffer.

플라스미드 Plasmid DNADNA 분리 detach

DNA-스핀TM 플라스미드 DNA 정제 키트(Intron)의 설명서를 참고하였다. 플라스미드를 추출하기 위해서 LB 배지에 대장균을 밤새도록 배양한 세포배양액 3 ㎖을 튜브에 넣고 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 얻은 균체를 250 ㎕의 버퍼 1(Intron)에 현탁하였다. 250 ㎕의 버퍼 2(Intron)를 넣어준 후 천천히 섞고 실온에서 2분 동안 방치하였다. 그 다음 350 ㎕의 버퍼 3(Intron)을 넣고 천천히 섞고 즉시 얼음에 2분 동안 방치하였다. 원심분리(18,000 × g, 10분, 4℃)하여 상층액을 조심스럽게 취한 후, 실리카 비드 멤브레인으로 채워진 컬럼(Intron)에 넣고 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 통과시켰다. 통과액을 버리고 컬럼에 다시 700 ㎕의 워싱 버퍼를 넣고 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)를 하였다. 워싱 버퍼를 완전히 제거한 컬럼을 상온에서 2분 동안 방치하여 건조시킨 후 50 ㎕의 증류수를 넣고 상온에서 1분 동안 방치하였다. 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 플라스미드를 포함하는 용액을 얻었다. See instructions in the DNA-Spin ™ Plasmid DNA Purification Kit (Intron). To extract the plasmid, 3 ml of the cell culture medium in which E. coli was incubated overnight in LB medium was placed in a tube, and the cells obtained by centrifugation (18,000 × g , 1 min, 25 ° C.) were suspended in 250 μl of buffer 1 (Intron). . 250 μl of Buffer 2 (Intron) was added and slowly mixed and left at room temperature for 2 minutes. 350 μl of Buffer 3 (Intron) was then added slowly mixed and immediately left on ice for 2 minutes. The supernatant was carefully taken off by centrifugation (18,000 × g , 10 min, 4 ° C.), then placed in a column filled with silica bead membrane (Intron) and passed through centrifugation (18,000 × g , 1 min, 25 ° C.). The pass-through was discarded and 700 μl of wash buffer was added to the column, followed by centrifugation (18,000 × g , 1 min, 25 ° C.). The column from which the washing buffer was completely removed was left to dry at room temperature for 2 minutes, and then, 50 µl of distilled water was added thereto and left at room temperature for 1 minute. Centrifugation (18,000 × g, 1 bun, 25 ℃) to obtain a solution containing the plasmid.

아가로즈Agarose 젤로부터  From gel DNADNA 절편의 분리 Separation of Sections

아가로즈 젤로부터 DNA 절편의 분리는 메가-스핀 키트(Intron)를 사용하였다. 제한효소로 처리한 DNA 시료를 아가로즈 젤 상에서 전기영동한 후, 원하는 DNA 절편 위치를 UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 확인하였다. 원하는 부분의 아가로즈 젤을 잘라내서 튜브에 옮긴 후, 여기에 500 ㎕의 gel extraction 버퍼(Intron)를 넣고 오븐에 5분 동안 방치하였다. 젤이 녹으면, 상온에서 잘 섞어준 후, 일루션 컬럼에 시료를 주입하여 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 통과시켰다. 통과한 시료를 버리고 컬럼에 700 ㎕의 워싱 버퍼를 주입한 후, 원심 분리 (18,000 × g, 1분, 25℃)하여 통과시키고, 통과한 시료를 버리고 상온에서 1분 동안 건조하였다. 컬럼을 완전히 건조시킨 후, 30 ㎕의 증류수를 컬럼의 가운데 부위에 떨어뜨려 실온에서 2분 동안 방치하였다. 사용한 컬렉팅 튜브를 제거하고 멸균된 새로운 튜브로 교체한 후, 원심분리(18,000 × g, 1분, 25℃)하여 분리된 DNA 절편을 얻었다. Separation of DNA fragments from agarose gels was performed using a mega-spin kit (Intron). DNA samples treated with restriction enzymes were electrophoresed on agarose gels, and then the desired DNA fragment position was confirmed using a UV transilluminator. The desired portion of the agarose gel was cut out and transferred to a tube, and then 500 μl of gel extraction buffer (Intron) was placed in an oven for 5 minutes. When the gel melted, the mixture was mixed well at room temperature, and then the sample was injected into the elution column and centrifuged (18,000 × g , 1 minute, 25 ° C.). After passing through the sample was injected, 700 μl of washing buffer was injected into the column, followed by centrifugation (18,000 × g , 1 minute, 25 ° C.), and passed through the sample, and dried at room temperature for 1 minute. After the column was completely dried, 30 μl of distilled water was dropped in the middle of the column and left at room temperature for 2 minutes. The used collecting tube was removed and replaced with a sterile fresh tube, followed by centrifugation (18,000 × g , 1 minute, 25 ° C.) to obtain the isolated DNA fragments.

형질전환 Transformation

형질전환은 대장균의 경우 CaCl2 방법을 사용하였고12, Mycobacterium sp. strain JC1의 경우 Parish 및 Stocker의 방법을 변형한 전기 천공법을 사용하였다13. 전기 천공법은 Bio-Rad사의 Gene PulserTM와 Pulse Controller를 사용하였다. CaCl2 방법 용 컴피턴트 세균을 만들기 위하여 대장균을 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 100 ㎖의 새 LB 액체배지에 접종하여 약 3시간 진탕 배양하여 OD600 값이 0.7 정도 될 때 멸균된 원심분리 튜브에 옮기고 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)하여 균체를 모아 10 ㎖의 차가운 0.1 M CaCl2 용액으로 재현탁하고 얼음에 30분 동안 방치하였다. 다시 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)하여 균체를 모은 후 상층액은 버리고 여기에 15% (v/v) 글리세롤이 포함된 차가운 0.1 M CaCl2 용액 2 ㎖을 넣고 균체를 풀고 50 ㎕씩 멸균된 튜브에 분주하여 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다. DNA 적당량을 컴피턴트 세균과 섞고 얼음에서 20분 동안 방치한 후 42℃에서 90초 동안 열 충격을 준 다음, 얼음에서 1분간 식히고 여기에 200 ㎕의 LB 액체배지를 넣어주고 37℃에서 1시간 배양한 다음 적절한 항생제가 포함되어 있는 LB 고체배지에 평판도말하고 37℃에서 배양하였다. 칼라 셀렉션을 위해서는 플레이트에 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노사이드 (X-gal, 20 ㎎/㎖) 40 ㎕ 및 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG, 1 M) 4 ㎕를 첨가하였다. Transformation is CaCl 2 for Escherichia coli 12 was used, Mycobacterium sp. For JC1 strain was used for electroporation a modification of the method of Parish and Stocker 13. Electroporation was performed using Gene Pulser TM and Pulse Controller of Bio-Rad. CaCl 2 Method after the inoculation of E. coli to make a competent bacteria were cultured in LB broth overnight at 37 ℃ for, to about 3 hours by shaking culture was inoculated into a new LB broth in 100 ㎖ OD 600 When the value was about 0.7, it was transferred to a sterile centrifuge tube and left for 30 minutes on ice. The cells were collected by centrifugation (4,000 × g , 10 minutes, 4 ° C.), resuspended in 10 ml of cold 0.1 M CaCl 2 solution, and left on ice for 30 minutes. The cells were collected by centrifugation (4,000 × g , 10 min, 4 ° C.), and the supernatant was discarded. Cold 0.1 M CaCl 2 containing 15% (v / v) glycerol was added thereto. 2 ml of the solution was added, the cells were released, and 50 µl each was dispensed into sterilized tubes and stored at -70 ° C until use. Mix appropriate amount of DNA with competent bacteria, leave on ice for 20 minutes, heat shock at 42 ℃ for 90 seconds, cool for 1 minute on ice, add 200 μL of LB liquid medium and incubate for 1 hour at 37 ℃ The plate was then plated in LB solid medium containing appropriate antibiotics and incubated at 37 ° C. For color selection, 40 μl of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, 20 mg / ml) and isopropylthio-β-D- 4 μl of galactoside (IPTG, 1 M) was added.

Mycobacterium sp. strain JC1의 경우는 전기 천공용 컴피턴트 세균을 준비하기 위하여 SMB에 포도당을 첨가한 배지에서 지수성장기(OD600에서 0.5)까지 진탕 배양한 후 얼음에서 2시간 방치하고 원심분리(4,000 × g, 10분, 4℃)하여 균체를 얻었다. 이를 배양액과 같은 양의 멸균된 차가운 10% (v/v) 글리세롤 용액으로 씻어준 후, 부피를 1/3씩 줄여나가며 2번 더 씻어주었다. 최종적으로 10% (v/v) 글리세롤 용액에 풀어 -70℃에서 보관하였다가 컴피턴트 세균으로 사용하였다. 0.2 cm의 형질전환용 큐벳(Bio-Rad)에 100 ㎕의 컴피턴트 세균과 300 ng의 DNA를 넣고 2.5 ㎸/㎝, 25 ㎌ 및 600 Ω의 조건으로 12 msec 동안 전기 천공을 하였다. 형질전환을 수행하기 전 얼음에 10분 동안 방치하였고, 형질전환 수행 후 얼음에 10분 동안 방치한 뒤 큐벳당 0.5 ㎖의 0.2% (w/v) 포도당이 포함된 SMB 배지를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 다음 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖) 및 0.2% (w/v) 포도당이 첨가된 고체 SMB 배지에 형질전환 시킨 균주를 도말하였다. Mycobacterium sp. In the case of strain JC1, in order to prepare an electroporation competent bacterium, shaking culture was carried out to the exponential growth phase (OD 600 to 0.5) in a medium containing glucose in SMB, and then left on ice for 2 hours, followed by centrifugation (4,000 × g , 10 Minute, 4 ℃) to obtain the cells. This was washed with sterilized cold 10% (v / v) glycerol solution in the same amount as the culture medium, and then washed twice more by decreasing the volume by 1/3. Finally, the solution was dissolved in 10% (v / v) glycerol solution, stored at -70 ° C, and used as a competent bacterium. 100 μl of competent bacteria and 300 ng of DNA were put into a 0.2 cm transformation cuvette (Bio-Rad), and electroporated for 12 msec under conditions of 2.5 ㎸ / cm, 25 ㎌ and 600 Ω. After transformation, it was left on ice for 10 minutes, and after transformation was left on ice for 10 minutes, and then SMB medium containing 0.5 ml of 0.2% (w / v) glucose per cuvette was added at 37 ° C. Incubated for 4 hours. Then, the strains were transformed into solid SMB medium to which hygromycin (75 μg / ml) and 0.2% (w / v) glucose were added.

효소 및 시약Enzymes and Reagents

제한 효소는 KOSCO (Seoul, Korea)에서, T4 DNA 리가아제는 Invitrogen (Carlsbad, California)에서 구입하였다. 제한 효소의 사용, DNA 연결 반응 및 기타 DNA 재조합 방법은 시료 제공자의 지시에 따라 수행하였다. 암피실린은 Gemini Bio-Product 제품 (Gemini Bio-Product Co., Calabasas, CA)을 사용하였고, 하이그로마이신은 Roche(Mannheim, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 그 외의 시약들은 Sigma 제품 (Sigma, St. Louis, MO)을 사용하였다.Restriction enzymes were purchased from KOSCO (Seoul, Korea) and T4 DNA ligase was purchased from Invitrogen (Carlsbad, California). The use of restriction enzymes, DNA ligation reactions and other DNA recombination methods were performed according to the sample provider's instructions. Ampicillin was used as Gemini Bio-Product (Gemini Bio-Product Co., Calabasas, Calif.) And hygromycin was purchased from Roche (Mannheim, Germany). Other reagents were obtained from Sigma (Sigma, St. Louis, Mo.).

MycobacteriumMycobacterium spsp . . strainstrain JC1JC1 cutIcutI -- 돌연변이체 제작 Mutant Construction

cutI 유전자를 포함하고 있는 pJK53을 KpnI으로 절단하여 얻은 4,020-bp와 2,739-bp 및 589-bp의 조각 중 4,020-bp와 2,739-bp 조각을 연결하여 결실된 cutI 유전자가 포함된 pSW58 벡터를 제작하였다. pSW58의 결실된 cutI 유전자부분을 pKO에 삽입하기 위하여, pSW58을 PstI으로 잘라서 얻은 DNA 절편 중에서 2,167-bp 절편을 PstI으로 자른 pKO에 삽입하여 pSW60이라 명명하였다(표 1 및 도 1). 제조된 pSW60를 전기 천공법으로 Mycobacterium sp. strain JC1에 도입한 후, 하이그로마이신(75 ㎍/㎖)을 포함하고 있는 SMB-포도당 고체배지를 이용하여 싱글 크로스오버 돌연변이체를 얻었다. 이 싱글 크로스오버 돌연변이체를 하이그로마이신이 없는 SMB-포도당 배지에서 일주일 동안 충분히 배양하여 두 번째 상동 재조합(homologous recombination)을 유도하였다. 이 컬쳐를 30 ㎕ 씩 10%(w/v) 수크로오즈를 포함하는 SMB 고체배지에 도말함으로써 수크로오즈가 있는 환경에서 성장이 가능한 더블 크로스오버 돌연변이체를 탐색하였다. 획득한 더블 크로스오버 돌연변이체로부터 염색체 DNA를 분리하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 산물의 염기서열을 분석하여 이 돌연변이체가 cutI - 돌연변이체임을 확인하였다.including cutI gene and connect the 4,020-bp and 2,739-bp and 589-bp of the 4,020-bp fragment of the 2,739-bp fragment obtained by cutting the pJK53 with Kpn I in the deletion cutI PSW58 vector containing the gene was constructed. In order to insert the deleted cutI gene portion of pSW58 into pKO, 2,167-bp fragments of the DNA fragment obtained by cutting pSW58 with Pst I were inserted into pKO cut with Pst I and named pSW60 (Table 1 and FIG. 1). PSW60 prepared by Mycobacterium sp. After introduction into strain JC1, a single crossover mutant was obtained using SMB-glucose solid medium containing hygromycin (75 μg / ml). This single crossover mutant was sufficiently incubated for one week in SMB-glucose medium without hygromycin to induce a second homologous recombination. The culture was searched for double crossover mutants capable of growing in an environment with sucrose by spreading the culture on SMB solid medium containing 10% (w / v) sucrose in 30 μl. PCR was performed by separating chromosomal DNA from the obtained double crossover mutant, and then analyzing the nucleotide sequence of the amplified product to confirm that the mutant was cutI - mutant.

중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction PCRPCR ))

PCR은 Master gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 수행하였다. 50 ㎕ PCR 반응용액 중에는 2.5 mM MgCl2, dNTP, 10x 버퍼, 각각 20 pmol의 양방향 프라이머, Ex Taq DNA 중합효소 (Takara, Shiga, Japan)와 100 ng의 DNA 주형을 포함하였다. PCR 조건은 전-변성은 94℃에서 10 분, 변성은 94℃에서 1 분, 어닐링은 65℃에서 1분, 그리고 신장은 72℃에서 2분 조건에서 30회 반복 수행한 후, 마지막으로 후-신장을 72℃에서 10분 동안 수행하였다. PCR was performed using a master gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany). The 50 μl PCR solution contained 2.5 mM MgCl 2 , dNTP, 10 × buffer, 20 pmol bidirectional primer, Ex Taq DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan) and 100 ng of DNA template. PCR conditions were repeated 30 times under conditions of pre-denaturation at 94 ° C for 10 minutes, denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 65 ° C for 1 minute, and elongation at 72 ° C for 2 minutes, and finally post- Elongation was performed at 72 ° C. for 10 minutes.

성장곡선 측정Growth curve measurement

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 표현형을 확인하기 위해 SMB-포도당 배지 또는 SMB-CO 배지에서 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 성장곡선을 분광광도계(U-2000, Hitachi)를 이용하여 측정하였다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - To determine the phenotype of the mutant, Mycobacterium sp. in SMB-glucose medium or SMB-CO medium. The growth curve of strain JC1 cutI - mutant was measured using a spectrophotometer (U-2000, Hitachi).

보상실험(Compensation Experiment complementationcomplementation testtest ))

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 보상실험을 위해 Mycobacterium sp. strain JC1의 cutI을 포함하는 1,539 bp의 PCR 산물을 cutI-CT-F( 5'-AAGCTTAGTCCAGTCCGAACCCGAAC-3'; 밑줄, HindIII 인식 부위) 및 cutI-CT-R( 5'-GGATCCCGAATAGGAAGCCAGCTTTC-3'; 밑줄, BamHI 인식 부위) 프라이머를 이용하여 염색체 DNA로부터 증폭한 후, HindIII와 BamHI으로 동시에 자른 pNBVI에 연결하여 pSW98 벡터를 제작하였다 (표 1). 제작된 pSW98은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에 보상실험을 위해 전기 천공을 하였다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - Mycobacterium sp. PCR products of 1,539 bp containing a cutI of strain JC1 cutI-CT-F ( 5'- AAGCTT AGTCCAGTCCGAACCCGAAC-3 '; underline, Hin dIII recognition site) and cutI-CT-R (5'- GGATCC CGAATAGGAAGCCAGCTTTC-3' Underscore, amplified from chromosomal DNA using a Bam HI recognition site primer, and then connected to pNBVI cut simultaneously with Hin dIII and Bam HI to prepare a pSW98 vector (Table 1). PSW98 was produced by Mycobacterium sp. The strain JC1 cutI - mutant was electroporated for compensation experiments.

단백질 추출Protein extraction

CO-DH 활성 염색과 웨스턴 블롯에 사용할 효소추출액을 얻기 위해, SMB-포도당 배지에서 배양한 세균을 18,000 × g로 4℃에서 10분간 원심분리 (Eppendorf centrifuge-5403, Hamburg, Germany)하여 모은 다음, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액으로 두 번 씻고, 3 ㎖의 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액에 재현탁하였다. 현탁된 세균을 0℃에서 초음파 분쇄기 (Sonics & Materials Inc., Danbury, CT)로 20% 진폭에서 3초간 초음파를 가하고 10초간 쉬는 것을 20회 반복하여 세균을 파쇄하였다. 파쇄된 배양액을 18,000 × g로 4℃에서 30분간 원심분리(Eppendorf centrifuge-5403)하여 모은 다음 상등액을 효소추출액으로 사용하였다.To obtain enzyme extract for CO-DH active staining and Western blot, bacteria cultured in SMB-glucose medium were collected by centrifugation (Eppendorf centrifuge-5403, Hamburg, Germany) at 18,000 x g for 10 minutes at 4 ° C. Washed twice with 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer and resuspended in 3 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer. The suspended bacteria were sonicated at 0 ° C. (Sonics & Materials Inc., Danbury, CT) by sonication at 20% amplitude for 3 seconds and 20 seconds of 10 seconds off to break the bacteria. The crushed culture solution was collected by centrifugation (Eppendorf centrifuge-5403) at 18,000 × g for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as the enzyme extract.

단백질 정량Protein Quantitation

BSA를 표준단백질로 사용하여 Bradford의 방법에 따라 단백질을 정량하였다 14.Proteins were quantified according to Bradford's method using BSA as the standard protein 14 .

전기영동Electrophoresis

전기영동은 Mighty Small SE245 vertical slab gel 장치 (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)를 이용하여 Laemmli 방법을 변형하여 실시하였다15. 네이티브 효소의 분석을 위해서는 SDS (Sigma, St. Louis, MO)를 포함하지 않고 전기영동을 실시하였다. 아크릴아미드 농도는 30% (w/v) 아크릴아미드 (Sigma)와 0.8% (w/v)의 N,N'-비스-메틸렌 아크릴아미드(Sigma)를 포함하는 저장 용액으로부터 7.5% (w/v) 젤을 만들어 사용하였다. 단백질 시료는 시료 버퍼와 섞어서 로딩하였으며 전기영동은 얼음물 순환 장치를 이용하여 냉각시키면서 실시하였다. 전기영동시 전압은 전원 공급장치 (EPS-310, Amersham Pharmacia Biotech.)를 통하여 일정하게 유지시켜 주었는데, 스태킹 젤에는 80 V로 전압을 유지시켰고, 시료 버퍼가 세퍼레이트 젤로 들어가면 전압을 120 V로 증가시켜 전기영동하였다.Electrophoresis was carried out by modifying the Laemmli method by using a Mighty Small SE245 vertical slab gel apparatus (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) 15. For the analysis of native enzymes, electrophoresis was performed without SDS (Sigma, St. Louis, MO). Acrylamide concentration was 7.5% (w / v) from a stock solution containing 30% (w / v) acrylamide (Sigma) and 0.8% (w / v) of N , N' -bis-methylene acrylamide (Sigma) ) Gel was used. Protein samples were loaded with sample buffer and electrophoresis was performed while cooling using an ice water circulation system. During electrophoresis, the voltage was kept constant through the power supply (EPS-310, Amersham Pharmacia Biotech.), Which maintained a voltage of 80 V on the stacking gel, and increased the voltage to 120 V when the sample buffer entered the separator gel. Electrophoresis.

CBBCBB 염색 dyeing

CBB R-250을 사용하여 단백질을 염색하기 위해16, 45% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 아세트 산 및 0.25% (w/v) CBB R-250이 함유된 용액에서 30분 동안 염색하였다. 염색이 완료된 젤은 탈염색 용액 (30% [v/v] 메탄올 및 10% [v/v] 아세트 산)으로 여러번 반복하여 세척하였다.30 in a solution containing 16 , 45% (v / v) methanol, 10% (v / v) acetic acid and 0.25% (w / v) CBB R-250 for staining proteins using CBB R-250 Stain for minutes. The dyed gel was washed several times with destaining solution (30% [v / v] methanol and 10% [v / v] acetic acid).

COCO -- DHDH 활성 염색 Active dyeing

CO-DH 활성염색은 Kim과 Hegeman의 방법을 이용하여 실시하였다10. 효소추출액을 SDS가 포함되지 않은 아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 젤을 50 mM Tris- HCl (pH 7.5) 완충용액이 든 유리관에 넣어 5분 동안 CO로 포화시킨 다음 이 반응액에 0.05% (w/v) 페나진 메토설페이트(PMS, Sigma) 및 0.25% (w/v) 니트로블루 테트라졸리움(NBT, Sigma)을 혼합한 용액 1 ㎖을 첨가한 후 선명한 활성염색 밴드가 나타날 때까지 방치하였다. 이 때 모든 과정을 빛을 차단한 상태에서 수행하였다.CO-DH activation staining was performed using Kim and Hegeman's method 10 . The enzyme extract was electrophoresed in acrylamide gel without SDS, and the gel was placed in a glass tube containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer, saturated with CO for 5 minutes, and then 0.05% (w / v) 1 ml of a mixture of phenazine methosulfate (PMS, Sigma) and 0.25% (w / v) nitroblue tetrazolium (NBT, Sigma) was added and left until a clear active dye band appeared. At this time, all the processes were performed in a state of blocking the light.

웨스턴Weston 블롯Blot

효소추출액을 SDS가 포함되지 않은 아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 젤의 단백질을 멤브레인에 Western blotter (Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 밤새도록 전기로 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼한 멤브레인을 1× PBS (13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl, 0.43 mM Na2HPO4·7H2O 및 0.14 mM KH2PO4)에 1분 동안 담그고 10% 블로킹 솔루션(1× PBS에 10% [w/v]의 탈지분유를 녹인다)으로 1시간 동안 서서히 흔들어주면서 바인딩시켰다. 여기에 Mycobacterium sp. strain JC1의 CO-DH를 순화(Kim et al., J. Bacteriol . 171:958-964(1989))하여 토끼에서 얻은 항체를 1:5,000으로 희석되게 넣고 다시 1시간 동안 서서히 흔들어주면서 바인딩시켰다. 1× PBS로 15분씩 2회 씻어주고 ZymaxTM Goat anti-Rabbit IgG(H+L) (Zymed, S. Sanfrancisco, California) 1:5,000으로 희석되게 넣은 10% 블로킹 솔루션으로 1시간 동안 서서히 흔들어주면서 바인딩시켰다. PBS로 15분씩 3회 씻어주고 WEST-ZOLTM (Intron, Sungnam, Korea)의 A용액과 B용액을 1:1 비율로 섞어 멤브레인에 골 고루 뿌려준 후 X-ray 필름 (Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokyo, Japan)으로 감광하였다.The enzyme extract was electrophoresed on an acrylamide gel containing no SDS, and then the protein of the gel was transferred to the membrane overnight by using Western blotter (Amersham Pharmacia Biotech.). The transferred membrane is soaked in 1 × PBS (13.7 mM NaCl, 0.27 mM KCl, 0.43 mM Na 2 HPO 4 .7H 2 O and 0.14 mM KH 2 PO 4 ) for 1 minute and 10% blocking solution (10% in 1 × PBS). [w / v] of skim milk powder was dissolved) and slowly bound for 1 hour. Here Mycobacterium sp. The CO-DH of strain JC1 was purified (Kim et al., J. Bacteriol . 171: 958-964 (1989)) and the antibodies obtained from rabbits were diluted 1: 5,000 and bound again by shaking slowly for 1 hour. Rinse gently for 1 hour with 10% blocking solution washed twice with 1 × PBS for 15 minutes and diluted to 1: 5,000 in Zymax TM Goat anti-Rabbit IgG (H + L) (Zymed, S. Sanfrancisco, California). I was. Rinse 3 times with PBS for 15 minutes and WEST-ZOL TM A solution and B solution of (Intron, Sungnam, Korea) were mixed at a 1: 1 ratio and evenly sprayed onto the membrane, followed by X-ray film (Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokyo, Japan).

β-β- 갈락토시다아제Galactosidase 활성 측정 Active measurement

CO-DH 프로모터 활성에 대한 cutI 유전자 산물의 영향을 조사하기 위해, cutB의 시작코도(ATG)의 ‘A'로부터 cutB의 전사 반대방향으로 12 bp 위치에서 cutR 유전자 시작코돈(GTG)의 처음 ‘G'로부터 cutR의 전사 방향으로 411 bp 위치까지 720-bp의 잠정적인 카피 I CO-DH 유전자의 프로모터가 포함되어 있는 pCS617, cutB의 시작코돈(ATG)의 ‘A'로부터 cutB의 전사 반대방향으로 12 bp 위치에서 orf1 유전자 시작코돈(ATG)의 ‘A'로부터 orf1의 전사 방향으로 496 bp 위치까지 760-bp의 잠정적인 카피 II CO-DH 유전자의 프로모터가 포함되어 있는 pCS717, 그리고 프로모터가 없는 대조군인 pCS817을 Mycobacterium sp. strain JC1에 전기 천공법을 통해 형질전환시켰다. 0.2% (w/v) 포도당과 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 SMB 배지에 pCS6, pCS7 및 pCS8로 각각 형질전환된 Mycobacterium sp. strain JC1를 37℃, 200 rpm에서 밤새 진탕 배양한 후, 0.2% (w/v) 포도당과 하이그로마이신 (75 ㎍/㎖)이 포함된 500 ㎖의 SMB 배지에 5㎖ 접종하였다. 접종된 것을 37℃, 200 rpm에서 적당한 시기까지 배양한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 3 ㎖에 재현탁하였다. 균체를 초음파 분쇄기 (Sonic & Materials, VCX600, Danbury, CT)를 이용하여 진폭 20% 조건으로 3.0초간 파쇄하고, 9.9초간 쉬는 과정을 5분간 반복하여 균체를 파쇄한 다음 원심분리(18,000 x g, 4℃, 30분)하여 얻어진 상층액을 효소추출액으로 사용하여 Miller18의 방법에 따라 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 효소추출액 200 ㎕에 500 ㎕의 Z 버퍼 (0.1 M 소듐 포스페이트 [pH 7.0], 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 50 mM β-머캅토에탄올)를 첨가한 후 기질로서 o-니트로페닐-β-D-갈락토사이드 (ONPG [4 ㎎/㎖])를 200 ㎕ 첨가하였다. 이 혼합액의 색 변화를 420 nm의 흡광도에서 시간당 측정하였다. β-갈락토시다아제 1 유닛은 ONPG로부터 분당 1 nmole의 o-니트로페놀을 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였고, 효소 활성(specific activity)는 단백질 ㎎당 분당 β-갈락토시다아제 유닛으로 표시하였다. In order to investigate the effect of cutI gene product of the CO-DH promoter activity, the beginning of the start nose cutB started cutR gene in the 12 bp position in the transfer direction opposite to the cutB from the 'A' of the (ATG) codon (GTG) ' G transferred in the opposite direction of cutB from a '' of the start of pCS6 17, cutB containing the provisional copy I promoter of CO-DH gene of the 720-bp to 411 bp position in the transfer direction of the cutR codon (ATG) from the " PCS7 17 , which contains a promoter of 760-bp tentative copy II CO-DH gene from the 'A' of the orf1 gene start codon (ATG) at the 12 bp position to the 496 bp position in the direction of orf1 transcription, and the promoter PCS8 17 as a control without Mycobacterium sp. Strain JC1 was transformed by electroporation. 5 ml of SMB medium containing 0.2% (w / v) glucose and hygromycin (75 [mu] g / ml) were transformed into Mycobacterium sp. Transformed with pCS6, pCS7 and pCS8, respectively. The strain JC1 was shaken overnight at 37 ° C. and 200 rpm, and then inoculated with 5 ml of 500 ml SMB medium containing 0.2% (w / v) glucose and hygromycin (75 μg / ml). The inoculated one was incubated at 37 ° C., 200 rpm to a suitable time, and then resuspended in 3 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5). The cells were crushed for 3.0 seconds at 20% amplitude using an ultrasonic grinder (Sonic & Materials, VCX600, Danbury, CT), and the cells were crushed by repeating the 9.9 seconds rest for 5 minutes, followed by centrifugation (18,000 x g , 4 Β-galactosidase activity was measured according to the method of Miller 18 , using the supernatant obtained as an enzyme extract. To 200 μl of enzyme extract, 500 μl of Z buffer (0.1 M sodium phosphate [pH 7.0], 10 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 50 mM β-mercaptoethanol) was added, followed by o -nitrophenyl-β- as a substrate. 200 μl of D-galactoside (ONPG [4 mg / ml]) was added. The color change of this mixed solution was measured per hour at an absorbance of 420 nm. 1 unit of β-galactosidase was defined as the amount of enzyme required to produce 1 nmole of o -nitrophenol per minute from ONPG, and the enzyme activity is expressed in β-galactosidase units per mg of protein. It was.

생존률Survival rate 측정 Measure

각 세균에서 SNP에 대한 생존률을 측정하기 위해 Hernandez-Urzua 등의 방법을 변형하여 실행하였다1 9. SMB-포도당 배지에서 지수성장기 중반까지 성장시킨 각 세균을 100 ㎕씩 튜브에 넣었다. 측정 시간은 0, 30, 60 및 90분으로 정하고 5 mM의 SNP를 넣은 실험군과 넣지 않은 대조군을 각각 3개씩 준비하였다. 이렇게 준비한 것을 시간별로 배양한 후, 적절히 희석한 후 SMB-포도당 고체배지에 도말하여 얻어진 콜로나 숫자를 바탕으로 CFU(colony forming units)를 계산하여 생존곡선을 얻었다. 시간별로 배양시에는 무균상태에서 빛이 있는 아래에서 실험했는데 SNP는 빛에 의해 분해되어 NO를 발생시키기 때문이다20. In order to measure the survival rate of the SNP in each bacterial strain it was performed by a method such as Hernandez-Urzua 1 9. 100 μl of each bacterium grown in SMB-glucose medium until the mid-exponential growth period was placed in a tube. The measurement time was set to 0, 30, 60, and 90 minutes, and three experimental groups containing 5 mM SNP and three control groups were prepared. The preparation was incubated with time, and after appropriate dilution, a survival curve was obtained by calculating CFU (colony forming units) based on the number of colonies obtained by plating on SMB-glucose solid medium. Hour by hour incubation, the experiment was under which the light from the sterile SNP is that decomposes by light to generate NO 20.

플라스미드Plasmid 설 명Explanation 출 처source pBluescriptⅡ SK(+)pBluescriptⅡ SK (+) pUC19로부터 유래한 2,961-bp의 플라스미드, Ampr 2,961-bp plasmid from pUC19, Amp r StratageneStratagene pNBVIpNBVI p16R1으로부터 유래한 5.8-kb 플라스미드, Hygr 5.8-kb plasmid from p16R1, Hyg r 참고문헌 21Reference 21 pKOpKO Mycobacterium sp. strain JC1에서 자살 벡터로 사용되는 8,366-bp 플라스미드, Kmr, Hygr, sacB. Mycobacterium sp. 8,366-bp plasmid used as suicide vector in strain JC1, Km r , Hyg r , sacB . 참고문헌 22Reference 22 pJK53pJK53 람다 클론 #2으로부터의 4.4-kb SacI 절편을 포함하는 pBluescriptⅡ SK(+)PBluescriptII SK (+) containing 4.4-kb Sac I segment from lambda clone # 2 본 발명Invention pSW58pSW58 4,020-bp 및 2,739-bp의 KpnI 절편이 자가 연결된 pJK534,020-bp and a 2,739-bp fragment of Kpn I pJK53 self connected 본 발명Invention pSW60pSW60 pSW58으로부터의 2,167-bp PstI 절편을 포함하는 pKOpKO containing a 2,167-bp Pst I segment from pSW58 본 발명Invention pSW98pSW98 cutI 유전자를 포함하는 1,539-bp PCR 생산물을 지닌 pNBVI. pNBVI with a 1,539-bp PCR product comprising the cutI gene. 본 발명
The present invention
pCS6pCS6 잠정적인 카피 I CO-DH 프로모터-lacZ 융합체를 포함하는 pNBV1; 9,341 bpPNBVl comprising a potential copy I CO-DH promoter- lacZ fusion; 9,341 bp 참고문헌 17
Reference 17
pCS7pCS7 잠정적인 카피 II CO-DH 프로모터-lacZ 융합체를 포함하는 pNBV1; 9,381 bpPNBVl comprising a potential copy II CO-DH promoter- lacZ fusion; 9,381 bp 참고문헌 17
Reference 17
pCS8pCS8 프로모터가 없는 lacZ를 포함하는 pNBV1; 8,621 bpPNBVl with lacZ without promoter; 8,621 bp 참고문헌 17Reference 17

2. 실험 결과2. Experimental Results

MycobacteriumMycobacterium spsp . . strainstrain JC1JC1 의 of cutBCAcutBCA 및  And cutIcutI 와 병원성 And pathogenic 마이코박테리아에Mycobacteria 존재하는  Present cutBCAcutBCA 및  And cutIcutI 유사유전자와의 동일성 비교 Comparison of identity with pseudogenes

본 실시예에서 사용된 Mycobacterium sp. strain JC1의 일산화탄소 탈수소효소의 구조유전자인 cutBCA와 병원성 마이코박테리아의 cutBCA 유사유전자와의 동일성 여부를 조사하기 위해 ClustalW 프로그램을 이용하여 분석을 수행하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 Mycobacterium sp. strain JC1의 cutBCA는 M. tuberculosis를 포함한 병원성 마이코박테리아의 cutBCA 유사유전자와 뉴클레오티드 서열에 있어서 상당히 높은 동일성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 cutI에 대해서도 위와 동일한 방법으로 여러 병원성 마이코박테리아의 유사유전자에 대한 동일성을 조사하였다(표 3). 이러한 결과는 본 실시예에서 사용된 Mycobacterium sp. strain JC1의 일산화탄소 탈수소효소 및 일산화탄소 탈수소효소 발현 관련 유전자들이 병원성 마이코박테리아의 그것들과 큰 차이가 없음을 보여준다. Mycobacterium sp. Used in this example. cutBCA , a structural gene of carbon monoxide dehydrogenase of strain JC1, and c utBCA of pathogenic mycobacteria The analysis was performed using the ClustalW program to investigate the identity with the pseudogene. As shown in Table 2, Mycobacterium sp. cutBCA of strain JC1 is pathogenic mycobacteria, including M. tuberculosis cutBCA Significantly high identity for pseudogenes and nucleotide sequences. In addition, the cutI of the present invention was examined for the identity of similar genes of various pathogenic mycobacteria by the same method as described above (Table 3). These results are shown in Mycobacterium sp. Genes related to the expression of carbon monoxide dehydrogenase and carbon monoxide dehydrogenase of strain JC1 are not significantly different from those of pathogenic mycobacteria.

박테리아bacteria 유전자gene Mycobacterium sp. strain JC1 cutB, cutC 및 cutA와의 동일성 (%)a Mycobacterium sp. strain JC1 cutB , identity with cutC and cutA (%) a cutB와 동일성 same as cutB cutC와 동일성 same as cutC cutA와 동일성 same as cutA M. M. tuberculosistuberculosis rv0375crv0375c 7171 -- -- rv0374crv0374c -- 7373 -- rv0373crv0373c -- -- 8181 M. M. bovisbovis mb0382cmb0382c 7171 -- -- mb0381cmb0381c -- 7373 -- mb0380cmb0380c -- -- 8181 M. M. marinummarinum mmarmmar _0655_0655 7272 -- -- mmarmmar _0656_0656 -- 7171 -- mmarmmar _0657_0657 -- -- 8282 M. M. ulceransulcerans mulmul _0117_0117 7171 -- -- mulmul _0116_0116 -- 7171 -- mulmul _0115_0115 -- -- 8282

MycobacteriumMycobacterium spsp . . strainstrain JC1JC1 cutIcutI -- 돌연변이체 획득 Mutant Acquisition

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI -의 돌연변이는 상동 재조합에 의해 유도되었으며, 돌연변이체의 스크리닝은 마이코박테리아의 돌연변이체를 만들 때 가장 많이 이용되는 방법 중 하나인 sacB 유전자 산물인 레반수크라아제를 이용하여 제작되었다23. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체를 각각 배양시켜 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 성장기질로 포도당을 이용한 성장에는 문제가 없으나(도 3), CO를 성장 기질로 하여 성장하지 못하는 것으로 확인되었다(도 4). Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - the mutation was induced by homologous recombination, screening of a mutant was produced by using the number of levan, which is one of sacB gene product of the method used most frequently Klein azepin to create the mutants of the mycobacterial 23. Mycobacterium sp. Strain JC1 cutI - mutants were cultured and then Mycobacterium sp. The strain JC1 cutI - mutant had no problem in growth using glucose as a growth substrate (FIG. 3), but was unable to grow using CO as a growth substrate (FIG. 4).

MycobacteriumMycobacterium spsp . . strainstrain JC1JC1 cutIcutI -- 돌연변이체의 보상 실험 Compensation Experiment of Mutant

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체가 cutI의 돌연변이 때문에 CO를 성장기질로 성장하지 못하는 것인지 아니면 다른 원인이 있는지 확인하기 위해 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 보상실험을 실험방법에 설명된 것과 같이 실시하였다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 보상실험 결과 cutI의 돌연변이로 인해 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 CO를 성장기질로 하여 성장하지 못함을 확인하였다(도 5). Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - Mycobacterium sp. to determine whether the mutant is unable to grow CO as a growth substrate due to mutations in cutI . Compensation experiment of strain JC1 cutI - mutant was performed as described in the experimental method. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - because of a compensating mutation experiment the result of cutI mutant Mycobacterium sp. It was confirmed that strain JC1 cutI - mutant did not grow with CO as a growth substrate (FIG. 5).

MycobacteriumMycobacterium spsp . . strainstrain JC1JC1 cutIcutI -- 돌연변이체에서의  In mutants COCO -- DHDH 발현 확인 Expression confirmation

CO를 성장기질로 성장하지 못하는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체가 CO-DH 단백질이 발현되지 않아 CO를 이용하지 못하는 것인지, CO-DH 단백질은 발현이 되었으나 보조인자(cofactor) 등이 제대로 갖추어지지 않아 활성이 없는 상태로 발현이 되어 CO를 이용하지 못하는 것인지 확인하기 위해, CO-DH 효소 활성 염색 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. CO-DH 효소 활성 염색 및 웨스턴 블롯을 수행 결과, CO-DH 단백질 자체가 발현되지 않아 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체가 CO를 성장기질로 이용하지 못하는 것으로 확인되었다(도 6). Mycobacterium sp., Which cannot grow CO as a growth substrate. strain JC1 cutI - Mutant does not use CO because CO-DH protein is not expressed, CO-DH protein is expressed, but cofactor is not properly prepared, and CO is expressed without activity. CO-DH enzyme activity staining and western blots were performed to confirm that they were not available. As a result of CO-DH enzyme activity staining and Western blot, CO-DH protein itself was not expressed, resulting in Mycobacterium sp. It was confirmed that strain JC1 cutI - mutant did not use CO as a growth substrate (FIG. 6).

Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 CO-DH의 전사를 확인하기 위해, 노던 블롯과 프로모터 어세이를 수행하였다. 노던 블롯 결과Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 CO-DH의 전사가 전혀 이루어지지 않았고(도 7), 이러한 결과는 프로모터 어세이에 의해 재검증되었다(도 8a 내지 도 8d). Mycobacterium sp. strain JC1의 CO-DH는 포도당을 기질로 하여 성장할 때도 발현되는 것으로 알려져 있으며24, 지수성장기 후반에서 발현이 많이 되는 것으로 알려져 있다24. 프로모터 어세이 결과에서도, 지수성장기 후반에 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형의 카피 II cutBCA의 프로모터 활성이 증가하는 것으로 확인되었으나 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 프로모터 활성은 증가되지 않았다. 따라서 CutI는 CO-DH의 전사에 중요한 역할을 하는 단백질임이 재확인되었다. Mycobacterium sp. In order to confirm the transcription of CO-DH in strain JC1 cutI - mutant, a Northern blot and a promoter assay were performed. Northern blot results Mycobacterium sp. There was no transcription of CO-DH in the strain JC1 cutI - mutant (FIG. 7), and this result was revalidated by promoter assays (FIGS. 8A-8D). Mycobacterium sp. CO-DH of strain JC1 is also known to be expressed when grown on glucose as a substrate 24 , and it is known to be highly expressed during the late exponential growth phase 24 . In promoter assay results, Mycobacterium sp. The promoter activity of copy II cutBCA of strain JC1 wild type was found to be increased, but Mycobacterium sp. The promoter activity of the strain JC1 cutI - mutant was not increased. CutI was thus reconfirmed as a protein that plays an important role in the transcription of CO-DH.

NONO 에 대한 생존율 실험Survival test for

실제적으로 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체가 NO에 대해 저항성이 있는지 확인하기 위해 NO를 발생시키는 SNP를 사용하여 NO에 대한Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 저항성을 확인하였다. SNP 실험 결과 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형보다 NO에 대한 생존율이 80% 정도 감소하였다(도 9).Practically Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - Mycobacterium sp. for NO using SNPs that produce NO to determine if the mutant is resistant to NO. The resistance of strain JC1 cutI - mutant was confirmed. SNP test results Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - mutant is Mycobacterium sp. Survival for NO was reduced by 80% compared to strain JC1 wild type (FIG. 9).

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

도 1은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체를 획득하기 위한 방법이다. 유전자의 중간 부분이 결실되어 돌연변이된 cutI 유전자를 가지고 있으며, 돌연변이체 선별을 위한 sacB 유전자 및 hygR 유전자를 가지고 있는 pSW60을 이용하여 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체를 선별하였다.1 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - is a method for obtaining mutants. CutI mutated by deletion of the middle of the gene Psw60 having a gene and having a sacB gene and a hygR gene for mutant selection using Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - mutant was selected.

도 2는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체를 확인하기 위한 PCR 결과이다. 분석을 위한 프라이머로는 cutI-F(5'-CCGAGACCATCGACTGGGTG-3') 및 cutI-R(5-GCGCATTACCGTGCGACGTG-3')를 사용하였다. Mycobacterium sp. strain JC1 야생형의 경우 1,772-bp, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 경우1,183-bp의 PCR 산물이 나타나게 된다. 레인 1은 PCR 산물의 크기를 확인하기 위한 사이즈 마커이며, 레인 2-7은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체 후보군을 대상으로 PCR한 결과이다. PCR 결과, 레인 2, 4 및 6번의 후보가 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체임이 확인되었다.2 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - PCR result to identify the mutant. CutI-F (5'-CCGAGACCATCGACTGGGTG-3 ') and cutI-R (5-GCGCATTACCGTGCGACGTG-3') were used as primers for analysis. Mycobacterium sp. Strain JC1 wild type 1,772-bp, Mycobacterium sp. In the case of strain JC1 cutI - mutant, a 1,183 -bp PCR product appears. Lane 1 is a size marker to confirm the size of the PCR product, lanes 2-7 are Mycobacterium sp. Strain JC1 cutI - PCR result of mutant candidate group. As a result of PCR, candidates of lanes 2, 4 and 6 were Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - was identified as a mutant.

도 3은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 포도당을 이용한 성장을 확인한 결과이다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 표현형을 확인하기 위해, SMB-포도당 배지에서 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형과 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체를 배양하여 성장곡선을 그렸다. 포도당을 성장 기질로 이용시 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 야생형과 비교했을 때, 전혀 성장에 차이가 없었다.3 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI -The result of the growth using the mutant glucose was confirmed. Mycobacterium sp. To identify the phenotype of strain JC1 cutI - mutant, Mycobacterium sp. strain JC1 wild type and Mycobacterium sp. The growth curve was drawn by culturing strain JC1 cutI - mutant. When glucose was used as a growth substrate, Mycobacterium sp. The strain JC1 cutI - mutant showed no difference in growth as compared to the wild type.

도 4는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 CO를 이용한 성장을 확인한 결과이다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 표현형을 확인하기위해, SMB-CO 배지에서 Mycobacterium sp. strain JC1 야생형 및 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체를 배양하여 성장곡선을 그렸다. CO를 성장 기질로 이용시 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 거의 성장하지 못하는 것으로 확인되었다. 4 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI -The result of confirming the growth using the mutant CO. Mycobacterium sp. To identify the phenotype of strain JC1 cutI - mutant, Mycobacterium sp. strain JC1 wild type and Mycobacterium sp. The growth curve was drawn by culturing strain JC1 cutI - mutant. When CO is used as a growth substrate, Mycobacterium sp. The strain JC1 cutI - mutant was found to hardly grow.

도 5는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 보상실험 결과이다. Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 보상실험 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 cutI의 돌연변이로 인해 CO를 성장기질로 이용하지 못함이 확인되었다.5 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - Compensation test results for mutants. Mycobacterium sp. Strain JC1 cutI -As a result of compensation of the mutant, Mycobacterium sp. The strain JC1 cutI - mutant could not use CO as a growth substrate due to the mutation of cutI .

도 6은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 CO-DH 단백질이 발현되지 않음을 보여준다. 도면 6A에서 CBB 스테이닝 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 야생형(도면 6A, B 및 C의 l번 레인)과 비교하여 보았을 때 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체(도면 6A, B 및 C의 2번 레인)의 다른 단백질 등은 동일한 수준으로 발현이 되었으나 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 CO-DH는 발현되지 않음이 확인되었다. 도면 6B에서 CO-DH 활성염색 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체는 CO-DH 활성이 없었고, 이는 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 CO-DH가 발현되지 않아서 나타난 결과였음이 Mycobacterium sp. strain JC1 CO-DH 항체를 이용한 웨스턴 블롯 결과 확인되었다(도면 6C).6 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - shows no CO-DH protein expression in mutants. CBB staining results in Figure 6A, Mycobacterium sp. When compared to strain JC1 wild type (lanes l in Figures 6A, B and C), Mycobacterium sp. Other proteins of strain JC1 cutI - mutant (lanes 2 in Figures 6A, B and C) were expressed at the same level, but Mycobacterium sp. It was confirmed that CO-DH was not expressed in the strain JC1 cutI - mutant. CO-DH activation staining results in Figure 6B, Mycobacterium sp. The strain JC1 cutI - mutant had no CO-DH activity, indicating that Mycobacterium sp. Strain JC1 cutI - Mycobacterium sp. Western blot using strain JC1 CO-DH antibody was confirmed (Fig. 6C).

도 7은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서의 cutBCA의 전사를 확인한 결과이다. 노던 블롯으로 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 cutBCA의 전사를 cutB를 프로브로 조사한 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서는 cutBCA의 전사가 일어나지 않음을 확인하였다. A, 추출한 전체 RNA. B, cutB를 프로브로 이용한 노던 블롯 결과. 레인 1, Mycobacterium sp. strain JC1에서 추출한 전체 RNA. 레인 2, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 추출한 전체 RNA. 세균은 모두 SMB-포도당 배지에서 지수성장기까지 배양시킨 후 RNA를 추출하였다.7 is Mycobacterium sp. strain JC1 cutI -This is the result of confirming the transcription of cutBCA in the mutant. Northern blot, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - results of the investigation of the transcription of the mutant in cutBCA cutB as a probe, Mycobacterium sp. It was confirmed that the transcription of cutBCA did not occur in strain JC1 cutI - mutant. A, extracted total RNA. Northern blot results using B and cutB as probes. Lane 1, Mycobacterium sp. Total RNA extracted from strain JC1. Lane 2, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - Total RNA extracted from mutants. All bacteria were cultured in SMB-glucose medium until exponential growth and RNA was extracted.

도 8은 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 cutBCA 프로모터 활성을 확인한 결과이다. 성장시기별로 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 cutBCA 프로모터의 활성을 확인한 결과, 카피 I cutBCA과 카피 II cutBCA의 활성이 거의 없음을 확인하였다. Mycobacterium sp. strain JC1에서 CO-DH는 정지기(stationary phase)에서 발현이 많이 되는 것으로 알려져 있으므로, 성장시기를 구분하여(그림 A의 #1, #2 및 #3), 지수정장 중반기(B), 이른 정지기(C), 정지 중반기(D)에서 각각 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체에서 cutBCA 프로모터의 활성을 확인하였다.8 is Mycobacterium sp. Strain JC1 cutI -The result confirmed the cutBCA promoter activity in the mutant. Mycobacterium sp. As a result of confirming the activity of the cutBCA promoter in the strain JC1 cutI - mutant, it was confirmed that the activity of Copy I cutBCA and Copy II cutBCA is little. Mycobacterium sp. In strain JC1, CO-DH is known to be highly expressed in the stationary phase. In phase (C) and mid-still phase (D), respectively, of Mycobacterium sp. The activity of the cutBCA promoter was confirmed in strain JC1 cutI - mutant.

도 9는 NO에 의한 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 성장 저해를 확인한 결과이다. NO를 발생시키는 SNP를 이용하여, Mycobacterium sp. strain JC1 야생형과 Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체의 NO에 대한 저항율을 측정한 결과, Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - 돌연변이체(-○-)는Mycobacterium sp. strain JC1 야생형(-●-)보다 80% 이상 생존률이 감소함을 확인하였다.9 is Mycobacterium sp. Strain JC1 cutI -The result confirmed the growth inhibition of the mutant. Using SNPs that generate NO, Mycobacterium sp. strain JC1 wild type and Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - Mycobacterium sp. strain JC1 cutI - mutant (-○-) was Mycobacterium sp. Survival was reduced by more than 80% compared to strain JC1 wild type (-●-).

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ctgggagccg gtcgtactcg cgcggacccg gccgcgccag 660 cactcccggc gcatggtgct gatgtgcgac gtcagcgggt cgatgcaggc ctatgcatcc 720 gtctatctgc acttgatgcg tgcggcggcg ttgcagcaga aggggatgcg gccggaggtt 780 ttcgccttct cgacatcgct gacccgactg actccggtgc tgtcacatcg gtccgcggag 840 gtggcgctgg cgcgcgccaa cgccaaggtc gccgaccgct acggcggtac ccacctcggg 900 cggagtgtca ccgaattgct ggccacgtcg cacggtaatg cgctgcgcgg cgcggtggtg 960 atcatcgctt ccgacggttg ggacagcgat ccgccggagc tgctggcgcg agcggtcgcc 1020 cgggttcgcc ggcgtgcgca tcagctggtg tggctcaacc cgcgggccgc gcgcccggga 1080 tttcagccgc tggccggggc gatggcggcc gcgttgccgt actgcgacgc cgtgctgccg 1140 gcgcattcgc tttctgggtt gcaggagctg ttcgcggtgc tggccgaggg atcgggctac 1200 cgagcatga 1209 <210> 2 <211> 402 <212> PRT <213> Mycobacterium sp. <400> 2 Met Ala Ser Pro Phe Leu Leu Arg Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Gly Leu Leu Val Ser Ala 20 25 30 Ser Ser Ala Ala Gly Leu Val Glu Ala Leu Arg Arg Phe Trp Pro Thr 35 40 45 Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Thr Ala Arg Leu Thr Leu Val Ser Arg 50 55 60 Ala Glu Asp Leu Ile Gly Phe Asp Ala Ala Phe Asp Ala Leu Phe Ala 65 70 75 80 Asp Ala Val Leu Gly Leu Asp Pro Pro Gly Leu Lys Gln Ser Leu Gly 85 90 95 Thr Thr Thr Val Pro Glu Pro Gly Val Arg Gly Arg Gln His Ala Gln 100 105 110 Ala Glu Gly Gly Leu Pro Trp Ala Thr Arg Pro Ala Ser Ile Thr Ala 115 120 125 Ala Ser Glu Asp Asn Asp Ser Asp Ile Gly Ile Pro Glu Met Leu Pro 130 135 140 Ser Arg Leu Val Ala Arg Ala Glu Glu Pro Phe Glu Arg Phe Asp Ala 145 150 155 160 Ala Asp Leu Arg Leu Ile Gly Ala Trp Leu Glu Gln Ala Val Ala Arg 165 170 175 Trp Pro Arg Arg Arg Ser Leu Arg Arg Glu Pro His Pro His Gly Lys 180 185 190 Arg Ile Asp Leu Arg Arg Thr Met Lys Ala Ser Arg Ala Thr Gly Trp 195 200 205 Glu Pro Val Val Leu Ala Arg Thr Arg Pro Arg Gln His Ser Arg Arg 210 215 220 Met Val Leu Met Cys Asp Val Ser Gly Ser Met Gln Ala Tyr Ala Ser 225 230 235 240 Val Tyr Leu His Leu Met Arg Ala Ala Ala Leu Gln Gln Lys Gly Met 245 250 255 Arg Pro Glu Val Phe Ala Phe Ser Thr Ser Leu Thr Arg Leu Thr Pro 260 265 270 Val Leu Ser His Arg Ser Ala Glu Val Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ala 275 280 285 Lys Val Ala Asp Arg Tyr Gly Gly Thr His Leu Gly Arg Ser Val Thr 290 295 300 Glu Leu Leu Ala Thr Ser His Gly Asn Ala Leu Arg Gly Ala Val Val 305 310 315 320 Ile Ile Ala Ser Asp Gly Trp Asp Ser Asp Pro Pro Glu Leu Leu Ala 325 330 335 Arg Ala Val Ala Arg Val Arg Arg Arg Ala His Gln Leu Val Trp Leu 340 345 350 Asn Pro Arg Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gln Pro Leu Ala Gly Ala Met 355 360 365 Ala Ala Ala Leu Pro Tyr Cys Asp Ala Val Leu Pro Ala His Ser Leu 370 375 380 Ser Gly Leu Gln Glu Leu Phe Ala Val Leu Ala Glu Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Arg Ala <110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Yonsei University <120> Polypeptide and Polynucleotide Derived from Mycobacteria and          Screening Method for Anti-Mycobacterial Agent <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1209 <212> DNA <213> Mycobacterium sp. <400> 1 gtggcttcgc cgtttctgct gcgcggcgtc gatctcgcag ccttcgccgc cgccctggta 60 gcacgcttgc gtggtgccgg gttgctggtg tccgccagca gtgcagcagg actcgtcgag 120 gcactgcgcc ggttctggcc gactgaccgg gaacagctgt actggaccgc ccggctgaca 180 cttgttagcc gggcggagga cctgattggc ttcgacgccg cgttcgacgc tctgttcgcc 240 gacgccgtcc tgggtttgga cccgcccggc ctcaaacaaa gtctcggcac cacgacggta 300 cccgagcccg gcgtgcgggg ccgacagcac gcacaggctg agggcggttt gccgtgggcg 360 acccggccag cgtcgatcac agcagcgagc gaggacaacg acagcgacat cggtattccc 420 gagatgctgc ccagtcggct cgtcgcgcgc gccgaggagc cgttcgaacg ttttgacgcg 480 gccgatctac gcctgatcgg cgcctggctg gaacaggcgg tggctcgctg gccgcgtcgt 540 cggagtctgc gccgcgaacc gcatccgcat ggaaagcgca tcgacttgcg gcgcaccatg 600 aaagcgtcgc gggccaccgg ctgggagccg gtcgtactcg cgcggacccg gccgcgccag 660 cactcccggc gcatggtgct gatgtgcgac gtcagcgggt cgatgcaggc ctatgcatcc 720 gtctatctgc acttgatgcg tgcggcggcg ttgcagcaga aggggatgcg gccggaggtt 780 ttcgccttct cgacatcgct gacccgactg actccggtgc tgtcacatcg gtccgcggag 840 gtggcgctgg cgcgcgccaa cgccaaggtc gccgaccgct acggcggtac ccacctcggg 900 cggagtgtca ccgaattgct ggccacgtcg cacggtaatg cgctgcgcgg cgcggtggtg 960 atcatcgctt ccgacggttg ggacagcgat ccgccggagc tgctggcgcg agcggtcgcc 1020 cgggttcgcc ggcgtgcgca tcagctggtg tggctcaacc cgcgggccgc gcgcccggga 1080 tttcagccgc tggccggggc gatggcggcc gcgttgccgt actgcgacgc cgtgctgccg 1140 gcgcattcgc tttctgggtt gcaggagctg ttcgcggtgc tggccgaggg atcgggctac 1200 cgagcatga 1209 <210> 2 <211> 402 <212> PRT <213> Mycobacterium sp. <400> 2 Met Ala Ser Pro Phe Leu Leu Arg Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Ala   1 5 10 15 Ala Ala Leu Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Gly Leu Leu Val Ser Ala              20 25 30 Ser Ser Ala Ala Gly Leu Val Glu Ala Leu Arg Arg Phe Trp Pro Thr          35 40 45 Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Thr Ala Arg Leu Thr Leu Val Ser Arg      50 55 60 Ala Glu Asp Leu Ile Gly Phe Asp Ala Ala Phe Asp Ala Leu Phe Ala  65 70 75 80 Asp Ala Val Leu Gly Leu Asp Pro Pro Gly Leu Lys Gln Ser Leu Gly                  85 90 95 Thr Thr Thr Val Pro Glu Pro Gly Val Arg Gly Arg Gln His Ala Gln             100 105 110 Ala Glu Gly Gly Leu Pro Trp Ala Thr Arg Pro Ala Ser Ile Thr Ala         115 120 125 Ala Ser Glu Asp Asn Asp Ser Asp Ile Gly Ile Pro Glu Met Leu Pro     130 135 140 Ser Arg Leu Val Ala Arg Ala Glu Glu Pro Phe Glu Arg Phe Asp Ala 145 150 155 160 Ala Asp Leu Arg Leu Ile Gly Ala Trp Leu Glu Gln Ala Val Ala Arg                 165 170 175 Trp Pro Arg Arg Arg Ser Leu Arg Arg Glu Pro His Pro His Gly Lys             180 185 190 Arg Ile Asp Leu Arg Arg Thr Met Lys Ala Ser Arg Ala Thr Gly Trp         195 200 205 Glu Pro Val Val Leu Ala Arg Thr Arg Pro Arg Gln His Ser Arg Arg     210 215 220 Met Val Leu Met Cys Asp Val Ser Gly Ser Met Gln Ala Tyr Ala Ser 225 230 235 240 Val Tyr Leu His Leu Met Arg Ala Ala Ala Leu Gln Gln Lys Gly Met                 245 250 255 Arg Pro Glu Val Phe Ala Phe Ser Thr Ser Leu Thr Arg Leu Thr Pro             260 265 270 Val Leu Ser His Arg Ser Ala Glu Val Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ala         275 280 285 Lys Val Ala Asp Arg Tyr Gly Gly Thr His Leu Gly Arg Ser Val Thr     290 295 300 Glu Leu Leu Ala Thr Ser His Gly Asn Ala Leu Arg Gly Ala Val Val 305 310 315 320 Ile Ile Ala Ser Asp Gly Trp Asp Ser Asp Pro Pro Glu Leu Leu Ala                 325 330 335 Arg Ala Val Ala Arg Val Arg Arg Arg Ala His Gln Leu Val Trp Leu             340 345 350 Asn Pro Arg Ala Ala Arg Pro Gly Phe Gln Pro Leu Ala Gly Ala Met         355 360 365 Ala Ala Ala Leu Pro Tyr Cys Asp Ala Val Leu Pro Ala His Ser Leu     370 375 380 Ser Gly Leu Gln Glu Leu Phe Ala Val Leu Ala Glu Gly Ser Gly Tyr 385 390 395 400 Arg ala          

Claims (11)

서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드.Mycobacteria-derived polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 일산화탄소 탈수소효소 유전자의 전사를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드.2. The mycobacterial-derived polypeptide of claim 1, wherein said polypeptide activates transcription of a carbon monoxide dehydrogenase gene. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 일산화탄소 탈수소효소의 발현을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드.2. The mycobacterial-derived polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide activates expression of carbon monoxide dehydrogenase. (a) 상기 제 1 항의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오타이드.(a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of claim 1; (b) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a); Or (c) a mycobacteria-derived polynucleotide consisting of a nucleotide sequence that hybridizes with the sequence of (a) or (b) under stringent conditions. 제 4 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 마이코박테리아-유래 폴리뉴클레오 타이드.5. The mycobacteria-derived polynucleotide according to claim 4, wherein the nucleotide sequence consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 상기 제 4 항의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 되는 프라이머 또는 프로브.A primer or probe specifically hybridized to the nucleotide sequence of claim 4. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 마이코박테리아-유래 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.An antibody that specifically binds to the mycobacterial-derived polypeptide of any one of claims 1 to 3. (ⅰ) 상기 제 4 항의 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.A recombinant vector comprising (i) the nucleotide sequence of claim 4 and (ii) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence. 상기 제 8 항의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포.Cell transformed by the recombinant vector of claim 8. 다음의 단계를 포함하는 항-마이코박테리아제의 스크리닝 방법: Screening method of anti-mycobacterial agent comprising the following steps: (a) (ⅰ) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 (ⅱ) 상기 제 4 항 또는 제 5 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (a) contacting a sample to be analyzed with (i) the polypeptide of any one of claims 1 to 3 or (ii) a cell comprising the polynucleotide of claim 4 or 5; And (b) 상기 폴리펩타이드의 활성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사량 또는 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 활성, 전사량 또는 발현량이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시료는 항-마이코박테리아제로 판정된다.(b) measuring the activity of the polypeptide, the amount of transcription or expression of the polynucleotide, wherein the sample is determined to be down-regulated when the activity, amount of transcription or expression is reduced; It is determined to be a mycobacterial agent. 제 10 항에 있어서, 상기 항-마이코박테리아제는 부룰리 궤양(Buruli ulcer), 임파선염(lymphadenitis) 또는 결핵의 예방 또는 치료용 물질인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the anti-mycobacterial agent is a substance for the prevention or treatment of Buruli ulcer, lymphadenitis or tuberculosis.
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