KR20100063064A - 부화된 나노구조 조성물 - Google Patents

Abstract

고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법이 개시된다. 이 방법은 (a) 상기 고체 분말을 가열하고, 그것에 의해 가열된 고체 분말을 제공하는 단계; (b) 상기 가열된 고체 분말을 기체 매체의 존재 하에서 상기 고체 분말보다 차가운 액체 내에 침지하는 단계; 및 (c) 상기 고체 분말의 입자로부터 나노구조가 형성되도록 그리고 상기 기체 매체로부터 안정한 기체상이 형성되도록 선택된 전자기 방사에 의해 상기 차가운 액체, 상기 가열된 고체 분말 및 상기 기체 매체를 조사하는 단계를 포함한다.

Description

부화된 나노구조 조성물{ENRICHED NANOSTRUCTURE COMPOSITION}

본 발명은 일부의 실시예에서 나노구조에 관한 것이고, 보다 상세하게는 그러나 제한적이지는 않으나 부화된 나노구조 조성물에 관한 것이다.

나노과학은 물질의 작은 입자의 과학으로서, 현대 과학에 있어서 가장 중요한 첨단 연구 영역의 하나이다. 이와 같은 작은 입자는 재료를 구성하는 입자가 나노 스케일이 되었을 때 재료 전체의 특성(예를 들면, 그 융점 및 그 전기적 및 광학적 특성 등)이 변화하므로 기초적인 관점으로부터 주목을 받는다.

생명공학 영역에서, 예를 들면, 나노입자는 생체 분자의 실제 공간 구조 및 기능을 탐구하기 위한 나노미터스케일의 장비에서 자주 사용된다. 칼슘 알기네이트 나노스피어(nanosphere)와 같은 보조 나노 입자는 또한 유전자 트랜스팩션(gene transfection) 프로토콜의 개선을 돕기 위해 사용되고 있다.

종래, 나노 입자는 아크 방전, 레이저 증발, 열분해 프로세스, 플라즈마의 사용, 졸 겔의 사용 등을 적용하는 것에 의해 분자 레벨(molecular level)로부터 합성된다. 널리 사용되는 나노 입자는 약 1 ㎛ 이하의 직경을 가진 물체(object)로서 폭넓게 정의되는 플러렌 탄소 나노튜브(fullerene carbon nanotube)이다. 이 단어의 좁은 의미로, 축과 실질적으로 평행한 탄소의 탄소 육각형 망상 시트(hexagonal mesh sheet)를 가진 물질을 탄소 나노튜브라 하며, 탄소 나노튜브를 포위하는 무정형 탄소를 가진 것도 또한 탄소 나노튜브의 부류 내에 포함된다.

유전성 코어와 도전성 쉘 층을 가진 나노 입자인 나노쉘(nanoshell)이 또한 이 분야에 공지되어 있다. 탄소 나노튜브와 마찬가지로, 나노셀도 또한 예를 들어 유전성 기판상의 금속 원자의 결합에 의한 분자 레벨로부터 제조된다. 나노쉘은 상기 언급한 광학장 강화 현상을 이용하는 것이 바람직한 응용예에서 특히 유용하다. 그러나 나노쉘은 근적외선 파장 응용예의 경우에만 유용하다.

가바이(Gabbai)의 국제특허공개 WO2003/053647 및 WO2005/079153는 고액 조성물의 제조를 위한 탑다운 공정(top down process)을 개시하고 있다. 마이크로 치수의 입자의 원료 분말이 고온으로 가열된 후, 전자기 무선주파수(RF) 조사의 조건 하에서 차가운 물 속에 침지된다. 차가운 물과 RF 조사의 조합은 입자와 물 사이의 계면에 영향을 주고, 물분자 및 입자를 모두 파쇄시킨다. 파쇄된 물 분자는 자유 라디칼 형태이고, 이것은 입자의 파편을 둘러싼다.

가바이의 조성물은 많은 응용분야, 특히 생명과학 분야에 이용되어 왔다. 이를 위해, 국제특허공개 WO2007/077562, WO2007/077560, WO2007/077561, WO2007/077563, WO2008/081456 및 WO2008/081455를 참조할 수 있다. 이들 특허공보의 내용은 참조로서 본 명세서에 도입되었다.

종래, 가바이의 조성물은 DNA 분자의 디폴딩(de-folding), 생체물질에 대한 박테리아 부착성의 변경, 효소활성의 안정화, 수지에 대한 핵산의 친화성 결합의 개선 및 겔 전기영동 분리의 개선, 칼럼의 성능의 증대, 핵산 증폭 프로세스의 효율의 개선, 고체 지지체의 존재 하에서의 거대분자의 조작, 약학적 제제의 세포 내 인비보 흡수의 향상, 진핵세포의 배양 및 모노클로날 항체의 생성을 위해 사용되어 왔다. 가바이의 조성물은 또한 완충(buffering), 세포융합, 검체검출, 소독, 살균 및 저온보호(cryoprotection)를 위해서도 사용되어 왔다.

발명의 요약

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법으로서: (a) 상기 고체 분말을 가열하고, 그것에 의해 가열된 고체 분말을 제공하는 단계; (b) 상기 가열된 고체 분말을 기체 매체의 존재 하에서 상기 고체 분말보다 차가운 액체 내에 침지하는 단계; 및 (c) 상기 고체 분말의 입자로부터 나노구조가 형성되도록 그리고 상기 기체 매체로부터 안정한 기체상이 형성되도록 선택된 전자기 방사에 의해 상기 차가운 액체, 상기 가열된 고체 분말 및 상기 기체 매체를 조사하는 단계를 포함하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 방법은 상기 기체 매체가 개입되도록 하기 위해 상기 침지 단계 전에 상기 가열된 고체 분말을 상기 기체 매체에 통과시키는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 방법은 상기 기체 매체가 개입되도록 하기 위해 상기 침지 단계 전에 상기 기체 매체를 상기 액체 내에 도입하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체 매체는 소수성 기체를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체 매체는 이산화탄소, 산소, 질소, 이산화황, 수소, 불소, 메탄, 헥산, 헥사플루오로에탄 및 공기로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 고체 분말은 마이크로 치수의 입자이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 마이크로 치수의 입자는 결정질 입자이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조는 결정질 나노구조이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 액체는 물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 고체 분말은 강유전체 물질 및 강자성체 물질로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 고체 분말은 BaTiO₃, WO₃, Ba₂F₉O₁₂ 및 BaSO₄로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 고체 분말은 히드록시아파타이트를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 고체 분말은 미네랄, 세라믹 물질, 유리, 금속 및 합성 중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 전자기 방사는 무선주파수 범위이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 전자기 방사는 연속파 전자기 방사이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 전자기 방사는 변조된 전자기 방사이다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 나노구조 조성물이 제공된다. 이 나노구조 조성물은 액체, 나노구조들 및 안정 기체상 또는 준안정 기체상을 포함하고, 상기 나노구조들 중의 적어도 하나는 나노 크기의 코어 물질 및 상기 코어 물질과 안정한 물리적 상태에 있는 정렬된 유체 분자의 인벨롭을 구비한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 이 조성물에 가해지는 여기 에너지에 반응하여 상기 기체를 방출할 수 있고, 상기 여기 에너지의 공급이 종료되었을 때 상기 기체를 포집할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 비-대기 조건에서 조제된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 기체 제트류의 존재 하에서 조제된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 상기 기체의 자연상태의 농도와 실질적으로 상이한 농도의 기체의 존재 하에서 조제된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 대기의 온도보다 실질적으로 낮은 온도의 기체의 존재 하에서 조제된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 유체 분자의 인벨롭은 상기 액체로부터 구별될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 코어 물질은 결정질이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 액체는 물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체상은 소수성 기체를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체상은 이산화탄소, 산소, 질소, 이산화황, 수소, 불소, 메탄, 헥산, 헥사플루오로에탄 및 공기로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체상은 상기 인벨롭 내에 존재하거나 상기 인벨롭에 부착된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체상은 상기 코어 내에 존재하거나 상기 코어에 부착된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 기체상은 상기 나노구조들 사이의 액체 영역 내에 존재한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물이 먼저 하나의 표면에 접촉되고, 다음에 소정의 세정 프로토콜에 의해 세정된 경우, 상기 조성물의 전기화학적 흔적이 상기 표면상에 보존된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물이 상기 액체 자체의 제타 포텐셜보다 실질적으로 큰 제타 포텐셜을 특징으로 한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조가 상기 액체의 비중 이하의 비중을 가진다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 상기 염료 용액의 스펙트럼 특성을 변화시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 물에 비해 향상된 초음파 속도를 특징으로 한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 박테리아 콜로니 팽창률의 증대를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 상기 파아지-박테리아 또는 바이러스-세포 상호작용을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 고체상 매트릭스에 대한 거대분자의 결합을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 DNA 분자를 적어도 부분적으로 디폴딩시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 효소 활성을 안정화시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 생체물질에 대한 박테리아의 부착성을 변경시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 수지에 대한 핵산의 친화성 결합을 향상시킬 수 있고, 겔 전기영동 분리를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 컬럼의 성능을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 물에 비해 향상된 물질의 용해 능력 또는 물질의 분산 능력을 특징으로 한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 물에 비해 향상된 완충 능력을 특징으로 한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 핵산 증폭 공정의 효율을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트가 제공된다. 이 키트는 별개로 포장된 (a) 열 안정성 DNA 폴리머라아제; 및 (b) 본 명세서에 기술된 나노구조 조성물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, DNA 서열을 증폭하는 방법으로서: (a) 본 명세서에 기술된 나노구조 조성물을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 나노구조 조성물의 존재 하에서, 상기 DNA 서열상에 복수의 폴리머라아제 연쇄반응 사이클을 실행하고, 그 것에 의해 DNA 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 실시간 폴리머라아제 연쇄반응의 효율을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 실시간 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트로서: (a) 열 안정성 DNA 폴리머라아제; (b) 이중사슬 DNA 검출 분자; 및 (c) 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 실시간 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트가 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 나노구조 조성물은 고체 지지체의 존재 하에서 적어도 하나의 거대분자의 조작을 가능하게 한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 살균제 조성물이 제공된다. 이 살균제 조성물은 적어도 하나의 살균제 및 본 명세서에 기술된 부화된 나노구조 조성물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 개체의 체 표면을 살균하는 방법으로서, 멸균이 필요한 개체에게 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 조성물을 살균에 유효한 양만큼 제공하는 단계, 및 그것에 의해 개체의 체표면을 살균하는 단계를 포함하는 개체의 체표면을 살균하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 물체를 살균하는 방법으로서, 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 조성물을 물체에 접촉하는 단계, 및 그것에 의해 상기 물체를 살균하는 단계를 포함하는 물체를 살균하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 동결방지 조성물로서, 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물 및 적어도 하나의 동결방지제를 포함하는 동결방지 조성물이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 세포 물질을 냉동보존하는 방법으로서, (a) 상기 세포 물질을 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물에 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포 물질을 냉동보존 온도에 노출시키고, 이것에 의해 상기 세포 물질을 냉동보존하는 단계를 포함하는 세포 물질을 냉동보존하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 동결방지 조성물을 포함하는 저온보존 용기가 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 약학 조성물로서, (a) 활성 성분인 적어도 하나의 약학적 제제; 및 (b) 상기 적어도 하나의 약학적 제제의 인비보 흡수를 향상시키도록 조제된, 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계, 및 그것에 의해 상기 약학 조성물의 세포 내로의 인비보 흡수를 향상시키는 단계를 포함하는 약학 조성물의 세포 내로의 인비보 흡수를 향상시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 세포 융합 방법으로서, 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 세포들을 융합하는 단계, 및 그것에 의해 세포들을 융합하는 단계를 포함하는 세포 융합 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 진핵세포를 배양하는 방법으로서, 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 세포들을 배양하는 단계, 및 그것에 의해 진핵세포를 배양하는 단계를 포함하는 진핵세포를 배양하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 진핵세포 배양 배지 및 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 제품으로서, 포장재료 및 이 포장재료 내에 수용되는 진핵세포의 배양을 위한 것으로 확인된 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 제품이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 제품으로서, 포장재료 및 이 포장재료 내에 수용되는 모노클로날 항체를 생성하기 위한 것으로 확인된 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 제품이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 모노클로날 항체의 생성 방법으로서, 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 하이브리도마를 얻기 위해, 불사화 세포와 항체 생산 세포를 융합시키는 단계를 포함하는 모노클로날 항체의 생성 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 세팔로스포린의 용해 또는 분산 방법으로서, 상기 물질의 용해 또는 분산을 허용하는 조건 하에서 상기 세팔로스포린을 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세팔로스포린의 용해 또는 분산 방법이 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 검체를 검출하기 위한 키트가 제공된다. 이 키트는 (a) 검출이 가능한 제제; 및 (b) 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 제품이 제공된다. 이 제품은 포장재료 및 이 포장재료 내에 수용되는 검출이 가능한 부분의 검출을 향상시키기 위한 것으로 확인된 본 명세서에 기재된 나노구조 조성물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 기체의 리사이클링을 위한 장치가 제공된다. 이 장치는 나노구조 조성물 및 상기 나노구조 조성물을 여기시키기 위한 여기장치를 포함하고, 상기 나노구조 조성물은 상기 여기장치가 작동 중일 때 기체를 방출하고, 상기 여기장치가 비작동 중일 때 기체를 포집한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 곤충 유인 방법이 제공된다. 이 방법은 본 발명의 장치의 여기장치를 기동하는 단계, 및 그것에 의해 상기 곤충을 유인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 식물의 성장을 향상시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 주간에 상기 여기장치를 기동하는 단계, 및 그것에 의해 식물의 성장을 향상시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 기체의 리사이클링을 위한 장치가 제공된다. 이 장치는 하나의 조성물 및 이 조성물을 여기시키기 위한 여기장치를 포함한다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 상기 조성물은 상기 여기장치가 작동 중일 때 기체를 방출하고, 상기 여기장치가 비작동 중일 때 기체를 포집할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 곤충을 유인하기 위한 장치에 결합된다. 따라서, 상기 장치의 여기 장치는 곤충을 유인하기 위해 기동될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 식물 성장을 향상시키기 위한 장치에 결합된다. 따라서, 상기 장치의 여기 장치는 식물 성장을 향상시키기 위해 기동될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 상기 조성물로부터 방출되는 이산화탄소로부터 조성물에 접촉하고 있는 기체를 분리하도록 설계 및 구축되는 기체 분리 기구를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 상기 조성물을 구속하는 체임버를 더 포함하고, 여기서 상기 기체 분리 기구는 환경으로부터 상기 조성물 내에 연장하는 하나의 슬리이브를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 출구 밸브를 더 포함한다. 이 출구 밸브는 상기 슬리이브 내에 배치되고, 환경에의 이산화탄소의 방출을 조절하도록 구성된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 유입 밸브를 더 포함한다. 이 유입 밸브는 상기 체임버의 벽에 위치되고, 상기 조성물의 표면과 환경 사이의 유체 연통을 조절하도록 구성된다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 곤충을 포획하기 위한 장치가 제공된다. 이 장치는 적어도 하나의 안정 상태 및 여기 상태를 가지는 조성물을 포함하는 체임버를 포함한다. 상기 여기 상태는 상기 체임버의 유출구를 통한 이산화탄소의 유출을 특징으로 하고, 여기 상태로부터 안정 상태로의 천이에 의해 체임버의 유입구를 통한 이산화탄소의 유입이 발생한다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 상기 장치는 상기 조성물을 여기시키기 위한 여기 장치 및 상기 출구에 인접한 곤충을 포획하기 위해 설계 및 구성된 곤충 포획장치를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따르면, 곤충의 포획 방법이 제공된다. 이 방법은 곤충 포획장치를 작동시키는 단계, 및 그것에 의해 곤충을 포획하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 여기 장치는 무선주파수 송신기를 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치 내의 조성물은 전술한 부화된 나노구조 조성이다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 유출구로부터 조성물 내에 연장하는 하나의 슬리이브를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 상기 슬리이브 내에 배치되는 그리고 상기 이산화탄소의 유출을 조절하도록 구성된 유출 밸브를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 상기 유입구에 배치되는 그리고 상기 유입을 조절하도록 구성된 유입 밸브를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 장치는 상기 여기 장치의 작동 및 비작동시키도록 구성되는 제어장치를 더 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 제어장치는 상기 여기 장치를 단속적으로 기동하도록 구성된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 있는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질은 아래 기술된다. 모순되는 경우에는 정의를 포함하여 본 특허 명세서가 우선한다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 설명을 위한 것일 뿐, 제한하고자 의도된 것이 아니다.

본 발명의 일부의 실시예들은 첨부된 도면과 관련하여 단지 일례로서 여기에 기술된다. 도면과 관련하여 상세하게는 도시한 도면은 일례로서 본 발명의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것이다. 이 점에서, 도면에 의한 설명은 본 발명의 일부의 실시예가 실제로 어떻게 구체화될 수 있는지를 당업자들에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따른 기체 부화된(gas enriched) 나노구조 조성물의 개략도이다;
도 2는 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따른 기체 재순환 공정의 개략도이다;
도 3은 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따른 부화된 조성물의 제조를 위한 방법의 흐름도이다;
도 4는 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따른 부화된 조성물의 제조를 위한 시스템의 개략도이다;
도 5는 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따른 기체를 재순환하기 위한 장치의 개략도이다;
도 6은 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따른 곤충을 포획하기 위한 장치의 개략도이다;
도 7은 본 발명자에 의해 수행된 실험에 사용된 전기화학 석출(ECD) 실험장치의 개략도이다;
도 8은 본 발명자에 의해 수행된 실험에서 얻어진 ECD 패턴을 정의하기 위해 본 발명의 일부의 실시예에 따라 사용된 ECD 스코어를 보여주는 이미지이다;
도 9는 본 발명자에 의해 수행된 실험에서 얻어진 무기 탄소(inorganic carbon; IC)의 함량의 함수로서의 전도도를 보여주는 그래프이다;
도 10은 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 제조된 이산화탄소 부화된 나노구조 조성물의 가열 후의 중량손실을 보여주는 그래프이다;
도 11은 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 제조된 이산화탄소 부화된 나노구조 조성물의 가열 전, 가열 직후, 및 가열 1주일 후에 측정된 IC 함량을 보여주는 그래프이다;
도 12는 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 제조된 이산화탄소 부화 나노구조 조성물의 가열 전 및 가열 1주일 후에 얻어진 pH값을 보여주는 그래프이다;
도 13은 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 제조된 시제품의 이미지이다;
도 14-53은 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 제조된 3개의 시제품에 대해 측정된 시간의 함수로서의 이산화탄소의 농도를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 일부의 실시예에서 나노구조에 관한 것이고, 보다 상세하게는 그러나 제한적이지는 않으나 부화된 나노구조 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 적어도 하나의 실시형태를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 하기의 발명의 상세한 설명 및/또는 도면 및/또는 실시예에 나타낸 구성요소의 상세 구조 및 배열로 그의 적용이 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 실시예가 가능하거나 다양한 방식으로 실행 또는 수행될 수 있다.

본 발명자는 나노구조를 포함하는 조성물을 그 조성물 내에 기체가 유지되도록 기체를 이용하여 부화시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이러한 조성물은 본 명세서에서 기체 부화된 나노구조 조성물(gas enriched nanostructure composition)이라고 불리고 GENC로 약기된다. 본 실시예를 위해 적합한 조성물은 안정 기체상 또는 준안정 기체상이 존재하는 나노구조의 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 안정한 기체상이라 함은 대기 중에 자발적으로 방출됨이 없이 장기간 동안(수일 내지 수년, 예를 들면, 수개월 동안) 액체 내에 유지되는 기체상을 말한다.

준안정 기체상이라 함은 비교적 단기간(수분 내지 수일, 예를 들면, 수시간) 후에 액체로부터 대기로 자발적으로 방출되는 기체상을 말한다.

기체의 자발적 방출이라 함은 액체가 에너지를 가하지 않은 상태에서 대기와 열적 안정상태에 있을 때 발생하는 기체 방출을 말한다.

후술하는 실시예 절에서 입증되는 바와 같이, 액체와 나노구조를 포함하는 나노구조 조성물은 안정한 기체상을 포함한다. 특정의 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자는 상기 조성물의 안정한 기체상은 나노구조의 근방에 또는 나노구조들의 사이에 형성된 공간들 내에 존재할 수 있다고 가정한다. 이와 같은 기체상은 전형적으로 나노기포(nanobubble)의 형태이다. 그러나, 기체상이 나노구조의 결정질 코어 내에 포획되는 것이 배제되지 않는다.

도 1은 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따른 기체 부화된(gas enriched) 나노구조 조성물(18)의 개략도이다. 조성물(18)은 나노구조(10)와 액체(16)(수성의, 예를 들면, 물)를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "나노구조(nanostructure)"는 하나 이상의 입자를 포함하는 마이크로 이하의 척도의 구조를 말한다. 각 입자는 나노미터 또는 나노미터 이하의 척도이고 공통적으로 "나노입자(nanoparticle)"로 약칭된다. 상기 구조의 상이한 요소들(예, 나노입자들, 분자들) 사이의 거리는 수십 피코미터 이하(이 경우의 나노구조는 "연속 나노구조(continuous nanostructure)"라 부른다), 또는 수백 피코미터 내지 수백 나노미터(이 경우의 나노구조는 "불연속 나노구조(discontinuous nanostructure)"라 부른다)일 수 있다. 따라서, 본 실시예의 나노구조는 나노입자, 나노입자들의 배열, 또는 하나 이상의 나노입자 및 하나 이상의 분자의 임의의 배열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 나노구조(10)는 나노미터 치수의 코어 물질(12)을 포함하고, 이 코어 물질의 외주는 전형적으로 기체 상태인 정렬된 유체 분자의 인벨롭(envelope; 14)에 의해 둘러싸여 있다. 코어 물질(12) 및 인벨롭(14)은 물리적 정상 상태인 것이 바람직하다. 이와 관련하여, "물리적 정상 상태(steady physical state)"는 코어 물질과 인벨롭이 적어도 국부적 최소치의 임의의 포텐셜에 의해 결합된 상황을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 어구 "정렬된 유체 분자"는 서로 상관관계가 있는 유체 분자의 조직화된 배열을 의미한다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 인벨롭(14)는 코어(12)로부터 구별될 수 있다. 이것은 예를 들면 후술하는 실시예의 절에서 더욱 상세히 설명되는 극저온 투과 전자 현미경을 이용하여 확증될 수 있다.

조성물(18)은 더욱 인벨롭(14), 코어(12) 및 액체(16) 중의 적어도 하나 내에 존재하거나, 또는 적어도 하나에 부착되는 하나의 기체상(20)을 포함한다. 더욱 상세하게는, (i) 기체상(20)은 인벨롭(14) 내에 존재할 수 있다. 이 경우, 상기 정렬된 유체 분자들도 기체상(20)을 둘러싼다; (ii) 기체상(20)은 나노구조(10)와 액체(16)의 사이의 경계 내에 존재할 수 있다. 이 경우 기체상(20)은 인벨롭(14)에 부착(예, 결합)되지만, 인벨롭에 의해 포위되지는 않는다; (iii) 기체상(20)은 코어 물질(12)의 고체 구조(예, 결정질 구조) 내에 존재할 수 있다. 이 경우, 기체상(20)은 코어 물질(12)의 원자들 사이 또는 분자들 사이에 포획된다; 및/또는 (iv) 기체상(20)은 나노구조(10)들의 사이의 액체 영역 내에 존재할 수 있다. 이들 관계의 임의의 조합도 고려될 수 있다.

기체상(20)은 기체 분자의 형태일 수 있거나, 2개 이상의 기체 분자를 포함하는 더 큰 물체(예, 나노기포, 그러나 이것에 한정되지 않음)의 형태일 수 있다.

많은 유형의 기체들이 조성물(18)에 대해 적합하다. 전형적으로 상기 기체는 소수성이다. 적합한 기체의 대표적인 예는 이산화탄소(CO₂), 산소(O), 질소(N), 이산화황(SO₂), 수소(H), 불소(F), 메탄(CH₄), 헥산(C₆H₁₄), 헥사플루오로에탄(C₂F₆) 및 공기를 포함한다. 그러나, 이것에 제한되지 않는다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서 기체는 이산화탄소이다. 이하에서 입증되는 바와 같이, CO₂ 기체상의 경우, 본 실시예의 부화된 조성물은 여전히 비교적 높은 pH값을 가지는데, 이것은 기체상이 액체 내에 용해되지 않는다는 것을 나타낸다.

본 발명자는 기체의 유출이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 여기 상태(excited state)로 여기시키는 것에 의해 발생될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자는 상기 조성물이 여기 상태로부터 안정 상태로 천이될 때 조성물이 기체를 위한 싱크 물질(sink material)의 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자는 따라서 기체의 유입이 여기된 조성물이 그 안정 상태로 복귀될 수 있도록 하는 것에 의해 발생될 수 있다는 것을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서 부화된 나노구조 조성물은 적어도 안정 상태 및 여기 상태를 특징으로 한다. 여기 상태는 조성물로부터 기체의 유출을 특징으로 하고, 여기 상태로부터 안정 상태로의 천이는 기체가 조성물 내로 유입되는 것에 수반되어 발생된다. 이들 실시예는 특히 상기 조성물이 기체 리사이클링을 위해 사용되는 경우에 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 일부의 실시예에서 부화된 나노구조 조성물은 CO₂의 리사이클링을 위해 사용된다.

기체 리사이클링 공정은 도 2에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 본 실시예의 조성물은 일반적으로 안정 상태 및 여기 상태를 가진다. 본 명세서의 용어 "일반적으로(generally)"는 상기 조성물이 2개 이상의 상태를 가질 수 있는 것을 암시한다. 예를 들면, 상기 조성물은 하나의 안정 상태 및 복수의 여기 상태를 가질 수 있다. 상기 조성물은 또 일련의 여기 상태를 가질 수 있다. 본 명세서의 용어 "여기 상태(excited state)"는 조성물의 에너지 E가 조성물이 안정 상태에 있을 때의 에너지에 비해 높은 상태를 의미한다.

본 명세서의 용어 "안정 상태(stable state)"는 조성물이 다른 상태로의 자발적인 거시적 천이를 실질적으로 경험하지 않는 상태로 장기간 동안 유지되는 상태를 의미한다. 전형적으로, 가혹한 조건(예, 다량의 에너지가 조성물에 전달되는 것)이 없는 상태에서, 본 실시예의 조성물은 적어도 1일 동안, 더 바람직하게는 적어도 1주 동안, 더 바람직하게는 적어도 1개월 동안, 더 바람직하게는 적어도 1년 동안, 더 바람직하게는 적어도 수년 동안, 그 안정 상태에 유지될 수 있다.

바람직하게, 그러나 필수적인 것은 아니지만, 상기 조성물의 여기 상태(또는 여기 상태들)는 불안정 상태 또는 준안정 상태이다. 여기 상태가 불안정 상태인 경우, 여기 상태로부터 안정 상태로의 천이는 자발적이므로, 이와 같은 천이를 달성하기 위해 조성물에 에너지를 공급할 필요가 없다. 여기 상태가 준안정 상태인 경우, 여기 상태로부터 안정 상태로의 천이는 조성물이 자발적으로 안정 상태로 복귀하는 불안정 상태까지 상기 조성물을 불안정화시키기에 충분한 양의 에너지를 공급하는 것에 의해 달성될 수 있다.

전형적으로, 상기 조성물의 기체 함량은 조성물이 안정 상태에 있는 경우에 충분히 높고, 조성물이 여기 상태에 있을 때 더 낮다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 상기 조성물은 표준적인 대기 농도보다 훨씬 높은 국부적인 기체 농도를 발생할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자에 의해 수행된 실험(후술하는 실시예 절을 참조할 것)에서, 기체가 이산화탄소인 경우 부화된 나노구조 조성물은 1000 체적ppm 이상의 국부 농도의 CO₂를 생산할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 상기 조성물은 적어도 2000 체적ppm의 국부 농도의 CO₂를 생산한다. 임의적으로 그리고 바람직하게, 상기 조성물은 10,000 체적ppm의 국부적 농도의 CO₂를 폭발적으로 생산한다.

조성물(18)의 코어 물질(12)은 특정 유형의 물질 또는 특정 패밀리의 물질에 제한되지 않고, 사용처에 요구되는 나노구조에 따라 선택될 수 있다. 대표적인 예는 강유전체 물질, 강자성체 물질, 및 압전 물질을 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다. 히드록시아파타이트(HA)로 제조된 코어도 고려된다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 코어 물질(12)은 결정질 구조를 가진다.

강유전체 물질은 일부의 온도 범위에 걸쳐 전기장의 인가에 의해 역전되거나 재배향될 수 있는 영구 전기 분극을 유지하는 물질이다. 강자성 물질은 자기장의 인가에 의해 역전될 수 있는 영구 자성을 유지하는 물질이다. 본 발명의 일부의 실시예에 따라, 코어 물질(12)이 강유전체 또는 강자성체인 경우, 나노구조(10)는 그 강유전 특성 또는 강자성 특성을 유지한다. 따라서, 나노구조(10)는 거시적 물리 특성이 나노 규모의 환경 내로 이동되는 특별한 특징을 가진다.

본 발명의 일부의 실시예에 따라, 나노구조(10)는 적어도 하나의 추가의 나노구조와 응집(clustering)될 수 있다. 더 상세하게는, 특정 농도의 나노구조(10)가 액체(예, 물) 내에 혼합된 경우, 다수의 나노구조들 사이의 정전기적 인력은 나노구조들 사이에 부착을 유발하여 나노구조들의 응집체(cluster)를 형성할 수 있다. 바람직하게, 나노구조들 사이의 거리가 응집체의 형성을 방해하는 경우에도 나노구조(10)는 다른 나노구조들과의 장범위 상호작용(약 0.5-10　μm)을 유지할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "약(about)"은 ±10%를 나타낸다.

나노 구조(10)의 독특한 특성은 예를 들어 "탑-다운(top-down)" 프로세스를 사용하여 나노 구조(10)를 생성함으로써 달성될 수 있다. 더욱 상세하게는, 나노 구조(10)는 마이크로 치수(즉, 직경 1 ㎛ 이상 또는 10 ㎛ 이하) 입자의 원료 분말로부터 생성될 수 있으며, 상기 분말은 나노미터 크기의 입자를 제공하도록 제어된 방법으로 파쇄된다. 전형적으로, 이러한 공정은 전자기 무선 주파수(RF) 조사의 조건 하에서 고온의 원료 분말이 삽입되는 차가운 액체(필수적이지는 않지만, 바람직하게는 물) 중에서 수행된다.

이하의 설명은 전술한 바와 같이 나노구조를 포함하는 조성물 내의 액체의 역할을 할 수 있는 물의 물리적 특성에 대한 검토이다.

물은 가장 주목할만한 물질 중의 하나이고, 매우 잘 연구되어 있다. 물은 하나의 산소 원자에 두 개의 수소 원자가 부착된 매우 간단한 분자처럼 보이지만, 복잡한 성질을 가진다.

물은 수소 결합 때문에 높은 표면 장력, 높은 점도, 및 다른 물질 주변에 자발적으로 배열된 정렬된 육각형, 오각형 또는 12면체의 물 배열을 형성하는 능력과 같은 다양한 성질을 가진다.

물의 녹는점은 유사한 분자량을 가진 다른 분자에 대해 예상되는 녹는점보다 100K 이상 더 높다. 물의 육각형 얼음 상태(얼음 및 눈의 일반적인 형태)에서, 모든 물 분자는 4 개의 수소 결합(2개는 도우너, 2개는 억셉터)에 참여하고, 비교적 정적으로 유지된다. 액체 물에서, 일부의 수소 결합이 파괴되어야만 분자가 주변으로 이동할 수 있다. 이 결합들을 파괴하는데 요구되는 다량의 에너지는 융해 과정 중에 공급되어야 하고, 상대적으로 소량의 에너지만이 체적 변화로부터 회수된다. 자유 에너지 변화는 녹는점에서 0이 되어야 한다. 온도가 증가함에 따라, 액체 물 내의 수소 결합의 양은 감소되고, 그의 엔트로피는 증가한다. 융해는 오직 결합을 파괴하는데 필요한 에너지를 제공하기에 충분한 엔트로피 변화가 있을 때에만 발생할 것이다. 액체 물의 낮은 엔트로피(높은 조직화)는 녹는점을 높여준다.

대부분의 물 특성은 하나의 수소 원자가 (상호 대향되어 있는) 두 개의 산소 원자에 대하여 비교적 강한 힘으로 끌어 당겨져서 두 원자들 사이를 결합하는 것으로 생각되는 전술한 수소 결합에 기인되는 것이다.

물은 높은 밀도를 가지며, 이 밀도는 국부적인 최대값을 가지게 되는 3.984 ℃까지 온도 증가에 따라 증가한다. 이 현상은 물의 밀도 이상(density anomaly)으로 알려져 있다. 액체 물의 높은 밀도는 주로 수소 결합된 망상구조의 응집 특성에 기인한 것이다. 이는 자유 체적를 감소시켜 비교적 높은 밀도를 확보함으로써 수소 결합된 망상구조의 부분적인 공소성(open nature)을 보상한다. 예외적인 물의 온도-밀도 거동은 상이한 정도의 12면체 퍽커링(puckering)을 수반하는 전체 또는 부분적으로 형성된 응집체 내부에서 다양한 환경 범위를 이용하여 설명될 수 있다.

밀도 최대치(및 몰 체적의 최소치)는, 구조의 붕괴에 의한 밀도 증가와 열 팽창에 의한 밀도 감소의 양자를 유발하는 온도 증가의 상반되는 효과에 의해 초래된다. 낮은 온도에서는 고농도의 팽창된 구조가 존재 하는 반면, 높은 온도에서는 고농도의 붕괴된 구조 및 단편들이 존재하지만, 이들이 차지하는 체적은 온도와 함께 팽창한다. 온도가 상승함에 따른 팽창 구조로부터 붕괴 구조로의 변화는 각각 정렬도가 낮은 구조 및 더 강한 수소 결합 벤딩(bending)에 기인한 엔트로피 및 엔탈피의 양(+)의 변화를 수반한다.

일반적으로, 물의 수소결합은 광범위한 망상구조를 생성하고, 이는 수많은 육각형, 오각형의 12면체형의 물 배열을 형성할 수 있다. 수소결합된 망상구조는 광범위의 질서를 가진다. 더욱, 수소 결합의 질서화(ordering) 작용 및 무질설화(disordering) 속도론적 작용 사이에 온도 의존성 경쟁이 존재한다.

공지된 바와 같이, 물 분자는 정렬된 구조(ordered structures) 및 초구조(superstructure)를 형성할 수 있다. 예를 들면, 정렬된 물의 쉘(shell)이 단백질 및 탄수화물과 같은 다양한 생체분자의 둘레에 형성된다. 이들 생체분자의 둘레에 정렬된 물 환경은 예를 들어 수용체로부터 셀 핵으로의 시그널 전달을 비롯한 셀내 기능과 관련된 생물학적 기능과 강하게 관련된다. 또한, 이러한 물 구조는 안정하여 분자의 표면을 보호할 수 있다.

액화된 물의 정렬된 구조의 대부분은 전형적으로 약 1 ㎚의 단범위 규모이다. 장범위 질서(order)가 원칙적으로 존재할 수 있지만, 물이 액상이면 장범위 질서는 자발적으로 발생할 가능성은 극히 낮은데, 이는 액체 상태에 있는 분자들이 일정한 열 운동을 하고 있기 때문이다. 수소 결합 및 비결합 상호작용으로 인해, 물 분자는 특정의 구조화된 응집화와 함께 무한한 수소결합 망상구조를 형성할 수 있다. 따라서, 물 분자의 작은 응집체는, 다른 작은 응집체와 추가로 응집되어 수 백개의 물 분자로 구성된 20면체의 물 응집체를 형성할 수 있는 물 옥타머(octamers)를 형성할 수 있다. 따라서, 물 분자는 정렬된 구조를 형성할 수 있다.

물의 다른 특성에는 높은 끓는점, 높은 임계점, 압력(압력 이상성)에 의한 녹는점 감소, 온도의 상승과 함께 저하하고, 약 46℃에서 최소치가 되는 압축률 등이 포함된다.

물의 이와 같은 특이한 특성은 조성물(18)을 제조하기 위해 본 발명의 발명자에 의해 채용되었다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 비-대기(non-atmospheric) 조건에서 제조된다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 자연 상태에서 대기 중에 존재하지 않는 기체의 존재 하에서 및/또는 농도가 자연 상태의 농도에 비해 실질적으로 높거나(예, 적어도 2배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 100배), 또는 실질적으로 낮은(예, 적어도 2배, 또는 적어도 10배, 또는 적어도 100배) 기체의 존재 하에서 제조된다.

예를 들면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 대기 중의 이산화탄소의 농도를 초과하는 농도의 이산화탄소의 존재 하에서 제조될 수 있다. 이산화탄소의 대기 중의 농도는 전형적으로 400 체적ppm 이하이다. 따라서, 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 적어도 400 ppm, 또는 적어도 600 ppm 또는 적어도 800 ppm의 농도의 이산화탄소의 존재 하에서 제조된다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 기체 제트류의 존재 하에서 제조된다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 대기의 온도보다 실질적으로 낮은 온도에서 기체, 바람직하게는 기체 제트류의 존재 하에서 제조된다.

고체 분말(예, 미네랄, 세라믹 분말, 유리 분말, 금속 분말, 합성 중합체 등)을 충분히 높은 온도(예를 들면, 약 700 ℃ 이상(예, 약 850 ℃))까지 가열한 후, 기체 매체의 존재 하에서 차가운 액체 내에 침지시킨다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 상기 액체는 그의 밀도 비정상 온도(density anomaly temperature) 이하(예, 3 ℃ 또는 2 ℃)의 물이다. 상기 침지와 실질적으로 동시에, 상기 차가운 액체, 분말 및 기체 매체를 전자기 무선주파수 방사선(예, 500 MHz, 750 MHz 이상)으로 조사한다.

상기 기체상은 하나 이상의 방법으로 조성물 내에 도입될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 가열된 분말은 상기 차가운 액체 내에 침지되기 전에 기체 매체, 전형적으로는 기체 매체의 흐름을 통과한다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 기체 매체는 상기 침지와 실질적으로 동시에 또는 상기 침지 전에 차가운 액체 내에 도입된다. 기체 매체는 기포의 형태로 액체 내에 도입된다.

상기 기체 매체는 소수성인 것이 바람직하다. 적합한 기체 매체의 대표적인 예는 이산화탄소(CO₂), 산소(O), 질소(N), 이산화황(SO₂), 수소(H), 불소(F), 메탄(CH₄), 헥산(C₆H₁₄), 헥사플루오로에탄(C₂F₆) 및 공기를 포함한다. 그러나, 이것에 제한되지 않는다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서 기체 매체는 이산화탄소(CO₂)이다.

본 발명자에 의해 전술한 생산 공정 중에 원료 분말의 대규모 응집체 중의 일부는 붕괴되고, 원료 분말의 개개의 입자들 중의 일부는 그 형상이 변경되어 구형의 나노구조가 된다는 것이 입증되었다. 생산 공정 중에 무선주파수 처리에 의해 나노기포들이 생성되고, 비정상 온도(anomaly temperature) 이하의 물 내에 고온 입자를 투입하는 것에 의해 캐비테이션이 생성된다고 가정되었다[Katsir et al., "The Effect of rf-Irradiation on Electrochemical Deposition and its Stabilization by Nanoparticle Doping", Journal of The Electrochemical Society, 154(4) D249-D259, 2007]. 물이 비정상 온도 이하에 유지되므로, 고온 입자들은 국부적인 가열을 유발하고, 그 결과 가열된 위치의 비체적(specific volume)의 국부적 감소를 유발하고, 그 결과 다른 위치의 압력 저하를 유발한다. 공정 중 및 공정 후의 수시간 이하의 시간 간격 중에 물은 외기와의 기체 교환 및 주위의 전자기 방사의 선택적 흡수를 포함하는 자기조직화 과정을 겪는다고 가정된다. 또, 상기 자기조직화 과정은 나노기포 및 나노구조로 구성되는 안정한 구조의 분포를 형성하게 된다고 가정된다.

본 발명의 실시 중에 본 발명자는 예상하지 않게 상기 생산 공정이 액체 내에 안정 기체상 또는 준안정 기체상의 생성을 유발한다는 것을 발견하였다. 기체 매체를 조성물 내에 도입하기 위한 상기 실시예들 중의 임의의 실시예에서 무선주파수 처리가 기체 매체의 나노기포의 형성을 초래한다는 것과 이들 나노기포가 전술한 자기조직화 과정에 의해 안정화된다는 것은 매력적인 사실이다.

많은 유형의 물질이 고체 분말로서 사용될 수 있다. 대표적인 예는 바륨티타네이트(BaTiO₃), W0₃, Ba₂F₉O₁₂, 바륨설페이트(BaSO₄) 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명자들은 예상치 않게 히드록시아파타이트(HA)도 조성물의 조제에 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 히드록시아파타이트는 특히 무독성을 특징으로 하고 인간의 치료를 위해 FDA가 승인한 것이므로 바람직하다. 많은 히드록시아파타이트 분말은 Sigma사, Aldrich사 및 Clarion Pharmaceuticals사(예, Catalogue No. 1306-06-5)와 같은 다수의 제조사로부터 입수할 수 있다.

나노구조 조성물 내의 나노구조의 농도는 제한되지 않는다. 바람직한 농도는 1리터 당 10²⁰개의 나노구조이고, 더 바람직한 농도는 1리터 당 10¹⁵개 미만의 나노구조이다. 본 기술분야의 통상 전문가는 이와 같은 농도에서 조성물 내의 나노구조들 사이의 평균 거리는 마이크론 정도로 비교적 크다는 것을 이해하고 있다. 본 발명자에 의해 본 발명의 나노구조 조성물은 나노구조들 사이의 장범위 상호작용을 촉진시킨다는 것이 입증되었다. 이와 같은 상호작용에 의해 나노구조들 사이의 공간 내에 안정한 기체상이 존재할 수 있게 된다는 것이 가정된다.

본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따라 부화된 조성물을 제조하기 위한 방법의 흐름도인 도 3에 대하여 설명한다. 이 방법은 예를 들면 전술한 조성물(18)을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법의 단계들은 다르게 정의되지 않는 한 동시에 수행되거나 단계들의 많은 조합 또는 순서에 따라 순차적으로 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 특히, 흐름도의 순서는 제한적이지 않다. 예를 들면, 후술되는 또는 특정의 순서로 흐름도에 나타나 있는 2개 이상의 방법의 단계는 상이한 순서(예, 역순)로 수행되거나 또는 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 추가하여, 후술되는 몇몇 방법의 단계는 임의적인 것으로서 수행을 생략할 수 있다.

본 방법은 단계 100에서 개시되어 단계 101로 진행한다. 여기서 고체 분말(예, 미네랄, 세라믹 분말, 유리 분말, 금속 분말, 합성 중합체 등)이 충분히 높은 온도(예를 들면, 약 700 ℃ 이상(예, 약 850 ℃))까지 가열된다.

선택적으로, 이 방법은 단계 102로 진행한다. 여기서, 가열된 분말은 전술한 소수성 기체 매체들 중의 하나(그러나 이것에 한정되지 않음)와 같은 기체 매체에 통과된다. 바람직하게, 가열된 분말은 기체의 제트류를 통과한다.

선택적으로, 이 방법은 단계 103으로 진행한다. 여기서, 전술한 소수성 기체 매체들 중의 하나(그러나 이것에 한정되지 않음)와 같은 기체 매체가 차가운 액체 내에 도입된다. 기체 매체는 기체 제트류의 형태로 액체 내에 도입될 수 있고, 이 제트류는 액체 내에 침투하여 기포를 생성할 수 있다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에서 단계 102 및 단계 103 중의 적어도 하나의 단계가 수행된다. 본 발명의 일부의 실시예에서 단계 102 및 단계 103의 양 단계가 모두 수행된다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 기체 매체는 6℃ 미만 또는 5℃ 미만(예, 약 4℃ 이하)의 온도를 가진다.

본 방법은 단계 104로 진행하고, 여기서 분말이 차가운 액체 내에 침지된다. 본 방법의 단계 102가 수행되는 실시예에서, 분말은 차가운 액체 내에 침지되는 중에 내부에 기체 매체의 분자들을 포함하고 있다. 단계 103이 수행되는 실시예에서, 기체 매체는 단계 104의 이전, 이후, 또는 단계 104의 수행 중에 도입될 수 있다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에서 상기 액체는 물이다. 이들 실시예에서, 물은 그 밀도 비정상 온도(예, 3℃ 또는 2℃) 미만의 온도를 가진다.

단계 105에서 차가운 액체, 기체 매체 및 분말은 전자기 무선주파수 방사(예, 500　MHz, 750　MHz 이상)에 의해 조사된다.

이 방법은 단계 106에서 종료된다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 부화된 조성물을 제조하기 위한 시스템(140)의 개략도인 도 4에 대하여 설명한다. 시스템(140)은 예를 들면 전술한 조성물(18)을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

시스템(140)은 고체 분말(예, 미네랄, 세라믹 분말, 유리 분말, 금속 분말, 합성 중합체 등)을 충분히 높은 온도(예를 들면, 약 700 ℃ 이상(예, 약 850 ℃))까지 가열하기 위해 구성된 노(furnace; 142), 액체(도시 생략)를 충분히 낮은 온도(예, 물의 밀도 비정상 온도 미만의 온도)에 유지하기 위한 용기(144), 및 무선주파수 방사를 발생시키고 전송하기 위한 무선주파수 장치(146)을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 시스템(140)은 용기(1440 내의 액체의 액위를 측정하기 위한 액위 측정장치(208)를 포함한다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 시스템(140)은 용기(144) 내의 액체의 온도를 측정하기 위한 온도 측정장치(210)를 포함한다. 장치(208) 및/또는 장치(210)는 액위 및/또는 온도를 측정하고 필요에 따라 표시할 수 있는 제어장치(162)와 교신할 수 있다.

노(142)는 돌출 슬리이브(148)를 경유하여 용기(144)와 접속되어 있다. 상기 돌출 슬리이브(148)는 가열된 분말(도시 생략)을 유출구(150)에서 수용하고, 이 분말을 용기(144)의 상측 부분에 형성된 분말 유입구(152)를 통해 용기(144) 내에 낙하하도록 구성되어 있다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 용기(144)는 액체 도관(156)을 통해 용기(144)에 액체를 공급하는 액체 탱크(154)와 유체 연통한다.

도관(156)은 하나 이상의 커넥터(158)에 의해 탱크(154) 및 용기(144)의 사이에 배치될 수 있다. 도관(156) 내의 액체의 흐름은 도관(156)에 장착된 밸브(160)에 의해 조절될 수 있다. 밸브(160)는 사용자의 수조작에 의해 가동되거나 제어장치(162)에 의해 자동적으로 가동될 수 있다. 상기 제어장치(162)는 다양한 생산 파라메터를 선택할 수 있는 사용자 인터페이스(164)를 구비한다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 시스템(140)은 탱크(154) 내의 액체의 액위를 측정하기 위한 추가의 액위 측정장치(212)를 포함한다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 시스템(140)은 탱크(154)의 온도를 측정하기 위한 추가의 온도 측정장치(214)를 포함한다. 장치(212) 및/또는 장치(214)는 액위 및/또는 온도를 측정하고 필요에 따라 표시할 수 있는 제어장치(162)와 교신할 수 있다.

무선주파수 장치(146)는 전형적으로 무선주파수 제어장치(166)(예, 데이터 프로세서), 무선주파수 발생기와 송신기(168), 및 무선주파수 안테나 장치(170)를 포함한다. 제어장치(166)는 무선주파수 방사를 생성하여, 적어도 일부의 무선주파수 방사가 용기(144) 내에 진입하도록 안테나 장치(170)를 통해 전송하는 발생기 및 송신기(168)를 제어한다. 안테나 장치(170)는 용기(144)의 내부 또는 그 인접부에 배치될 수 있다. 후자의 경우, 용기(144)는 무선주파수 방사가 투과할 수 있는 재료로 제작된다.

시스템(140)은 돌출 슬리이브(148) 및 액체 탱크(144) 중의 적어도 하나에 기체 도관(174, 176)을 경유하여 기체 매체를 공급하기 위해 구성된 기체 탱크(172)를 더 포함한다. 기체 도관(174, 176)을 통한 기체의 흐름은 각각 기체 밸브(178, 180)에 의해 제어될 수 있다. 각 기체 밸브는 사용자의 수작업에 의해 독립적으로 가동될 수 있거나 제어장치(162)에 의해 자동적으로 가동될 수 있다.

본 발명의 다양한 예시적인 실시예에서, 시스템(140)은 생성물 용기(182) 및 폐기물 용기(184) 중의 적어도 하나를 포함한다. 이들 용기 중의 적어도 하나는 액체 용기(144)와 유체 연통될 수 있다. 생성물 용기(182)는 생성물 도관(186)을 경유하여 액체 용기(144)에 접속될 수 있다. 생성물 도관(186)은 액체 용기(144)의 생성물 유출구(194)에서 생성물(예, 조성물(18))을 수용하고, 이 생성물을 생성물 용기(182)의 생성물 유입구(196)를 통해 도입하도록 구성된다. 폐기물 용기(184)는 폐기물 도관(188)을 경유하여 액체 용기(144)에 접속될 수 있다. 폐기물 도관(188)은 액체 용기(144)의 폐기물 유출구(198)에서 폐기물(예, 과잉의 액체, 분말 폐기물)을 수용하고, 이 폐기물을 폐기물 용기(184)의 폐기물 유입구(200)를 통해 도입하도록 구성된다.

폐기물 도관(188)을 통한 폐기물의 흐름은 폐기물 밸브(190)에 의해 조절될 수 있고, 생성물 도관(186)을 통한 생성물의 흐름은 생성물 밸브(192)에 의해 조절될 수 있다. 각 밸브(190, 192)는 사용자의 수조작에 의해 독립적으로 가동되거나 제어장치(162)에 의해 자동적으로 가동될 수 있다.

추가의 폐기물 용기(202)는 탱크(154)로부터 미처리된 액체를 배출하기 위한 도관(204)을 경유하여 탱크(154)에 연결될 수 있다. 도관(204)은 커넥터(158)를 경유하여 도관(154)에 연결될 수 있고, 도관(204)을 통한 액체의 흐름은 밸브(206)를 통해 조절될 수 있다. 이 밸브(206)는 사용자의 수조작에 의해 가동되거나 제어장치(162)에 의해 자동적으로 가동될 수 있다.

작동 시, 고체 분말이 노(142) 내에 도입되고, 충분히 높은 온도(예를 들면, 약 700 ℃ 이상(예, 약 850 ℃))까지 가열되고, 탱크(154) 내의 액체는 충분히 낮은 온도(예, 물인 경우, 2-3 ℃)까지 냉각된다. 밸브(160)는 차가운 액체가 용기(144)로 유동할 수 있도록 개방된다. 밸브(178) 및/또는 밸브(180)가 개방되고, 기체 탱크(172)로부터 기체 매체가 슬리이브(48) 및/또는 용기(144)에 도입된다. 제어장치(166)은 무선주파수 발생기 및 송신기(168)를 기동시키고, 용기(144)는 안테나 장치(170)로부터 방사되는 무선주파수 방사에 의해 조사된다. 슬리이브(148)는 가열된 분말을 용기(144) 내에 낙하시킨다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 나노구조들 사이의 상호작용(장범위 상호작용 및 단범위 상호작용의 양자)은 박테리아 콜로니의 자기조직화(self organization)와 유사한 부화된 나노구조 조성물의 자기조직화 능력을 촉진시킨다. 박테리아 콜로니가 성장하면, 자기조직화는 외부의 악조건에 대처할 수 있게 하고, 성장속도를 향상시키기 위해 환경으로부터의 "종합 학습(collectively learn)"이 가능하게 한다. 마찬가지로, 장범위 상호작용 및 이것에 의한 부화된 나노구조 조성물의 장범위 질서에 의해 부화된 나노구조 조성물은 자기조직화를 수행할 수 있고, 상이한 환경 조건(예를 들면, 상이한 온도, 전류, 방사 등의 조건, 그러나 이들 조건에 한정되지 않음)에 적응할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 장범위 질서는 부화된 나노구조 조성물로 전기화학적 석출(ECD) 실험을 수행할 때 가장 잘 보인다(후술하는 실시예 절을 참조할 것).

ECD 공정은 물질이 (예를 들면 2개의 전극을 이용하여) 포텐셜 차이에 노출되어 전기화학 공정이 개시되는 공정이다. ECD 공정의 특유의 특성은 그 공정에 의해 얻어지는 물질의 분포에 있다. 상기 전기화학적 공정 중에, 주어진 전류에서 전극들 사이에서 측정된 포텐셜은 다수의 유형의 과전압 및 기질 내의 저항 강하를 합한 값이다. 저항 강하의 크기는 기질의 전도도 및 전극 사이의 거리에 의존한다. 전극의 특별한 국부 영역의 전류 밀도는 대향하는 전극까지의 거리의 함수이다. 이 효과는 1차 전류 분포라 불리고, 이 효과는 전극의 형상 및 기질의 전도도에 의존한다.

전극들 사이의 포텐셜 차이가 평형 전압에 비해 큰 경우, 기질은 비평형 상태로 천이되고, 그 결과 상이한 형태학의 구조가 형성된다. 비평형 상태의 계는 형태를 선택할 수 있고 및/또는 2개의 형태, 즉 치밀한 분지 형태(dense branching morphology)와 수지 형태(dendritic morphology)의 사이에서 천이될 수 있다는 것이 밝혀져 있다[E. Ben-Jacob, "From snowflake formation to growth of bacterial colonies," Cont. Phys., 1993, 34(5)].

본 발명의 일부의 실시예에 따라, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 전기화학적 석출 셀(cell) 내에 배치되었을 때, 사전에 설정된 형태(예, 치밀한 분지 형태 및/또는 수지 형태)가 형성된다. 바람직하게, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 상기 셀의 표면상에 상이한 액체(예, 물)로 대체된 경우에도 전기화학적 흔적(signature)을 보존할 수 있다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 먼저 부화된 나노구조 조성물이 전기화학적 석출 셀의 표면에 접촉된 다음 소정의 세정 프로토콜에 의해 세정된 경우, 조성물의 전기화학적 흔적이 셀의 표면상에 보존된다.

나노구조의 장범위 상호작용은 또 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 새로운 환경 조건(예, 온도 변화)에 노출시킨 다음, 이 새로운 환경 조건이 조성물 내의 나노구조들 사이의 상호작용에 관련되는 하나 이상의 물리량에 미치는 영향을 조사함으로써 입증될 수 있다. 이와 같은 물리량의 하나는 초음파 속도이다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 물에 비해 개선된 초음파 속도를 특징으로 한다.

본 발명의 추가의 특징은 부화된 나노구조 조성물과 고체 표면 사이의 소각의 접촉각에 있다. 바람직하게, 부화된 나노구조 조성물과 고체 표면 사이의 접촉각은 액체(나노구조가 포함되지 않은 액체)와 고체 표면 사이의 접촉각에 비해 소각이다. 본 기술분야의 통상 전문가는 작은 접촉각에 의해 부화된 나노구조 조성물은 고체 표면에 더 큰 정도로 "웨팅(wet)"될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 같은 본 발명의 특징은 전술한 나노구조들 사이의 장범위 상호작용의 도움으로 인해 액체 내의 나노구조의 농도가 높은 경우뿐 아니라 낮은 경우에도 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 소멸되지 않는 원형광 2색성 신호(non-vanishing circular dichroism signal)를 특징으로 한다. 원형광 2색성은 물질이 특정 파장의 평면편광과 상호작용할 때 발생하는 광학적 현상이다. 원형광 2색성은 하나의 편광 성분의 상호작용 특성이 다른 물질의 다른 편광 성분의 상호작용 특성과 다를 때 발생한다. 예를 들면, 흡수 밴드는 물질에 대한 좌우의 원형 편광 성분들의 상이한 흡수도에 따라 음 또는 양이 될 수 있다.

부화된 나노구조 조성물의 소멸되지 않는 원형광 2색성 신호는 부화된 나노구조 조성물이 광학적 활성 매체라는 것을 나타낸다고 인정된다. 따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 광과 상호작용하는 중에 광의 편광을 변경시킬 수 있다. 본 발명자는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 광학적 활성이 나노기포 및 나노구조의 안정한 구조화된 분포의 형성에 의해 입증되는 장범위 질서의 결과라고 가정하였다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따른 기체를 리사이클링하기 위한 장치(30)의 개략도인 도 5에 대하여 설명한다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 장치(30)는 조성물(32) 및 이 조성물(32)을 여기시키기 위한 여기 장치(excitation device; 34)를 포함한다. 조성물(32)은 전형적으로 장치(30)의 필요에 따라 본체의 역할을 하거나 또는 본체의 일부의 역할을 할 수 있는 체임버(42) 내에 수용된다.

조성물(32)은 여기 장치(34)가 작동 중일 때 기체를 방출하고, 여기 장치(34)의 비작동시 기체를 포집할 수 있는 것이 바람직하다. 조성물(32)은 액체, 나노구조 및 기체상을 포함할 수 있다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 조성물(32) 내의 기체는 소수성이다. 적합한 기체의 대표적인 예는 이산화탄소(CO₂), 산소(O), 질소(N), 이산화황(SO₂), 수소(H), 불소(F), 메탄(CH₄), 헥산(C₆H₁₄), 헥사플루오로에탄(C₂F₆) 및 공기를 포함한다. 그러나, 이것에 제한되지 않는다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서 기체는 이산화탄소(CO₂)이다.

조성물(32)은 조성물(18)과 유사한 것일 수 있다.

여기 장치(34)는 채용된 조성물에 따라 구성된다. 본 발명자들에 의해 상기 조성물이 무선주파수 방사를 이용한 조사에 반응하여 기체를 방출할 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따라, 여기 장치(34)는 조성물을 여기 상태로 여기시키기 위해 무선주파수 방사를 이용하여 조성물(32)을 조사한다. 상기 무선주파수 방사가 가해지는 한 조성물(32)은 여기 상태에 유지되고, 그 조성물로부터 기체가 방출된다(도 2 참조). 여기 장치(34)의 비작동시, 조성물(32)은 그 안정 상태로 천이되고, 이 천이 중에 기체는 조성물에 의해 포집된다. 이 실시예에서, 여기 장치(34)는 무선주파수 송신기를 포함한다. 전형적으로, 여기 장치(34)는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 무선주파수 안테나(36) 및 무선주파수 발생기(38)를 포함한다.

상기 조성물이 전술한 바와 같은 "탑-다운" 공정에 의해 제조되는 경우, 무선주파수 방사의 주파수는 생산 공정 중에 채용된 주파수와 동일하게 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 범위가 임의의 특수한 주파수에 한정되는 것은 의도되지 않는다.

전술한 실시예는 무선주파수 방사를 이용한 여기(excitation)에 특히 강조하여 기술되었으나 무선주파수 방사에 대한 더욱 상세한 언급이 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 여기 장치(34)는 조성물(32)을 여기시킬 수 있는 임의의 장치일 수 있다. 대표적인 예는 열에 의한 여기, 종파(longitudinal wave)에 의한 여기(예, 초음파 여기), 및 충격파에 의한 여기를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.

장치(30)는 필요에 따라 조성물(32)로부터 방출된 기체(예, CO₂ 기체)로부터 조성물(32)에 접촉하고 있는 기체(44)를 분리하도록 설계 및 구축된다. 도 5에 도시된 바와 같이, 기체(44)는 전형적으로 체임버(42) 내에 구속되어 있고, 조성물(32)의 표면(46)에 접촉되어 있다. 기구(40)는 대기로부터 조성물(32) 내에 연장하는 슬리이브(50)일 수 있다. 이 실시예에서, 안테나(36)는 슬리이브 내에 배치되고, 이 안테나의 근처에 축적되는 자유기체의 분자(예, CO₂ 분자)와 슬리이브의 출구(48)의 사이에는 유체 연통이 형성된다. 추가하여, 조성물에 접촉해 있는 기체는 슬리이브 내로의 진입이 실질적으로 방지된다. 출구 밸브(52)는 필요에 따라 대기 중으로의 기체의 방출을 제어하기 위해 슬리이브(50) 내에 위치된다. 출구 밸브(52)는 소망에 따라 기계적 밸브 또는 전기적 밸브일 수 있다.

필요에 따라 그리고 바람직하게, 장치(30)는 조성물(32)의 표면(46)과 대기 사이의 유체 연통을 조절할 수 있도록 체임버(42)의 벽의 유입구(60)에 배치되는 유입 밸브(54)를 더 포함한다. 장치(30)는 이 장치(30)의 작동을 제어하는 제어장치(56)를 더 포함한다. 예를 들면, 제어장치(56)는 장치(34)를 기동 및 정지, 출구 밸브(52)의 개폐 및/또는 입구 밸브(54)의 개폐를 위해 구성될 수 있다.

작동 시, 여기 장치(34)가 기동되어 조성물(32)이 여기되고, 출구 밸브(52)가 개방되고, 입구 밸브(54)가 폐쇄되는 것이 바람직하다. 조성물(32)가 여기되는 중에 기체 유출물(예, CO₂ 기체)은 출구(48)를 통해 배출된다. 기체 방출 기간 중에, 장치(30)의 근처(특히, 출구(48)의 근처)의 기체의 국부 농도는 상대적으로 높다. 예를 들면, 기체가 CO₂인 경우, 1000 체적ppm의 국부농도의 CO₂가 출구(48)의 근처에 축적된다. 수천 체적ppm 내지 수만 체적ppm의 폭증도 고려된다.

기체가 방출되는 특정 시간 후, 장치(34)는 정지되고, 입구 밸브(54)는 그 개방 위치로 이동된다. 조성물(32)의 리사이클링 특성에 기인되어 기체의 유입물(예, 대기 중의 CO₂)은 입구(60)를 통해 체임버(42) 내에 유입되고, 조성물(32)은 그 여기 상태로부터 낮은 에너지 상태로 천이된다.

본 발명의 다양한 예시적인 실시예에서, 제어장치(56)는 소정의 시나리오에 따라 여기 장치(34)를 기동시킨다. 작동 시나리오는 활성/비활성의 비율로서 표현될 수 있다. 전형적으로, 그러나 필수적인 것으로 아니지만, 여기 장치(34)의 작동은 약 1/20 내지 약 2/1의 활성/비활성 비율에 따른다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 여기 장치(34)의 작동은 약 1/10의 활성/비활성 비율에 따른다. 이 실시예에서, 여기 장치(34)는 장치(30)의 총 가동시간의 약 1/10의 활성 상태와 약 9/10의 비활성 상태가 된다.

제어장치(56)는 또 여가장치가 활성 상태인 동안에 출구 밸브(54)를 제어할 수 있다. 출구 밸브(54)가 폐쇄된 경우, 여기 장치(34)는 활성 상태이고, 슬리이브(50) 내의 기체의 농도는 증대된다. 그 결과 출구 밸브(54)의 개방시 고농도의 기체가 폭발적으로 배출된다. 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에서, 제어장치(56)는 폐쇄/개방 비율로서 표현될 수 있는 소정의 시나리오에 따라 출구 밸브(54)를 제어한다. 예를 들면, 출구 밸브(54)는 30/1의 폐쇄/개방 비율에 따라 동작될 수 있고, 여기서 밸브는 약 30초간 폐쇄되고 약 1초간 개방된다. 많은 다른 작동 시나리오가 채용될 수 있다. 후술되는 실시예의 절에서, 충분히 고농도의 CO₂가 많은 작동 시나리오에서 생성될 수 있음이 입증된다.

장치(30)는 암컷 모기 또는 기타 깨무는 파리(쌍시류)와 같은 그러나 이들 곤충에 한정되지 않는 곤충들을 유인하기 위해 사용될 수 있다. 이 실시예는 조성물(32)의 기체상이 CO₂인 경우에 특히 유용하다. 암컷 모기는 숙주(혈액원)로부터 약 30m 밖에서 숙주가 발산하는 CO₂의 냄새를 맡을 수 있다. CO₂는 대기 중에 존재하므로, 암컷 모기는 정상 농도 보다 높은 농도에 반응한다. 장치(30)가 CO₂의 높은 국부적 농도를 생성하는 능력은 동물의 호흡 거동과 유사하므로 곤충을 유인한다.

본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따른 곤충을 포획하기 위한 장치(70)의 개략도인 도 6에 대하여 설명한다. 이 장치(70)는 곤충을 유인하기 위한 장치(예, 장치(30)) 및 장치(30)의 출구의 근처에 있는 곤충들을 포획하도록 설계 및 구성된 곤충 포획장치(72)를 포함하는 것이 바람직하다.

이 포획장치는 본 기술분야에 공지된 임의의 포획장치일 수 있다. 예를 들면, 포획장치는 팬 임펠러(fan impeller)를 포함하고, 이 팬 임펠러는 나선상으로 망에 충돌하는 모기를 살충하기 위해 팬 임펠러(fan impeller)의 하측에 고정된 원뿔형태의 망 내에 곤충을 흡입하도록 구성되어 있다. 필요에 따라, 상기 포획장치는 점착체(sticky body)의 적어도 하나의 외면상에서 곤충을 포획하기 위한 점착 표면을 가지는 점착체를 구비한다.

본 발명의 존속기간 중에 많은 관련된 곤충포획장치가 개발될 것으로 예상되므로, 곤충 포획장치라는 용어의 범위는 이와 같은 예상되는 새로운 기술을 모두 포함하는 것이 의도된다.

장치(30)는 식물의 성장을 향상시키기 위해서도 사용될 수 있다. 이 실시예에서, 조성물(32)의 기체상은 CO₂인 것이 바람직하다. CO₂는 야간에 포집되고, 광합성이 발생하는 주간에 방출되는 것이 바람직하다. 주간에 CO₂는 식물 지대에 이송되고, 여기서 식물 지대 내의 식물에 분배될 수 있다. 분배는 직접적인 방법(예, 식물의 근처에 장치(30)을 설치하는 것) 또는 기존에 설치된 관개(irrigation) 시스템(그러나 이것에 한정되지 않음)과 같은 분배 시스템을 이용하여 수행할 수 있고, 이 경우 CO₂는 밭(field)의 조건 하에서 분배될 수 있다.

CO₂는 온도가 광합성을 위한 최적의 온도 범위인 20℃ 내지 27℃의 사이에 있을 때 식물에 공급되는 것이 이상적이다. CO₂는 다른 온도에서 공급될 수도 있다는 것이 인정된다. 본 실시예의 이점은 이것이 식물의 성장을 향상시키고 식물의 성장에 요구되는 비료의 양을 감소시키는 것이다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 물에 비해 물질을 용해하거나 분산시키는 능력이 강화된 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "용해(dissolve)"는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 수성 환경 내에서 용해되는 능력 또는 그 용해도가 증가되는 능력을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "분산(disperse)"은 물질의 용해도의 정도에 따라 현탁물 내에 혼입되는 동작을 의미한다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따라, 물질의 분산 또는 용해를 허용하는 조건 하에서 나노구조를 가지는 물질과 액체를 접촉시키는 단계를 포함하는 물질의 용해 또는 분산 방법이 제공된다.

본 발명의 나노구조 및 액체는 의약품(예, 치료용 제제, 화장품용 제제, 진단용 제제)을 포함하는 단백질, 핵산, 소분자 및 탄수화물과 같은 임의의 물질(예, 활성 약제)을 용해/분산시키기 위해 사용될 수 있다.

치료약은 예를 들면 약물, 핵산 구축물, 백신, 호르몬, 효소, 소분자(예, 이오딘 또는 항체)와 같은 임의의 생물학적 활성 인자(active factor)일 수 있다. 치료용 제제의 예는 항생물질 제제, 자유 라디칼 생성 제제, 항균 제제, 항-바이러스 제제, 비핵산계 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 비스테로이드계 항염증약, 면역억제제, 항-히스타민 제제, 레티노이드 제제, 타르 제제, 앤티퓨리틱(antipuritic) 제제, 호르몬, 소라렌(psoralen), 및 개선충살충 제제를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 제조될 수 있는 핵산 구축물은 폴리펩티드(예, 효소 리간드 또는 펩티드 약), 안티센스 RNA, 또는 리보자임을 코드화(encode)할 수 있다.

본 발명의 화장품 제제는 예를 들면 주름방지제, 항여드름제, 비타민, 박피제, 모낭 자극제 또는 모낭 억제제일 수 있다. 화장품 제제의 예는 레티노인산 및 그 유도체, 살리실산 및 그 유도체, 황-함유 D 아미노산 및 L 아미노산 및 그들의 유도체 및 염, 특히 N-아세틸 유도체, 알파-히드록시산(예, 글리콜산), 유산(lactic acid), 피틴산, 리포산 및 본 기술분야에 공지되어 있는 많은 다른 제제를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 진단용 제제는 항체, 화학약품 또는 질병 상태를 나타내는 분자에 특이적인 염료일 수 있다.

기타의 치료용 제제, 화장품 제제 및 진단용 제제는 이하에 기술된다.

상기 물질은 용해 공정을 돕기 위해 본 발명의 부화된 나노구조 조성물의 첨가 전 또는 첨가 후에 용매 내에서 용해될 수 있다. 본 발명은 물질의 용해도를 더욱 증대시키기 위해 극성 용매, 비극성 용매, 유기 용매(예, 에탄올 또는 아세톤) 또는 비유기 용매를 포함하는 임의의 용매의 사용을 고려하는 것이 인정된다.

상기 용매는 물질이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에 용해/분산된 상태를 유지하도록 용해 공정 중의 임의의 시간에 (완전하게 또는 부분적으로) 제거될 수 있다. 용매를 제거하는 방법은 증발(즉, 가열 또는 압력을 가하는 것에 의한 증발) 또는 임의의 다른 방법과 같이 본 기술분야에 공지되어 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 추가의 특징은 완충 능력(buffering capacity)이다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 물에 비해 향상된 완충 능력을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용된 어구 "완충 능력(buffering capacity)"은 산이나 염기가 첨가될 때 안정한 pH를 유지하는 조성물의 능력을 의미한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 추가의 특징은 단백질 안정성이다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 향상된 단백질 안정화 능력을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들면, 부화된 나노구조 조성물은 단백질을 열의 작용으로부터 보호 및 안정화할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 상기 부화된 나노구조 조성물의 제조를 위해 사용된 고체 분말이 박테리아에 대해 독성을 가지는 경우에도 박테리아 콜로니 팽창률의 증대 및 파아지-박테리아 또는 바이러스-세포 상호작용을 촉진시킬 수 있다. 상기 부화된 나노구조 조성물을 제조하는 특유의 공정에 의해 코어 물질을 포위하는 인벨롭의 형성이 가능하고, 박테리아나 파아지에 미치는 부화된 나노구조 조성물의 임의의 독성 영향을 상당히 억제될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 추가적인 특징은 소위 제타(ζ) 포텐셜에 관한 것이다. ζ 포텐셜은, 내부에 존재하는 전기장의 영향 하에 입자가 액체 내로 이동할 수 있는 전기영동 및 유전영동(dielectrophoresis)이라 불리는 물리적 현상에 관한 것이다. ζ 포텐셜은 다른 거동을 가지는 액체의 두 영역 사이의 경계에서 정의된 전단 평면(shear plane)에서의 포텐셜이다. 입자의 전기영동적 이동(전장 강도에 대한 입자 속도의 비)은 ζ 포텐셜에 비례한다.

ζ 포텐셜은 표면과 관련된 양이므로, 입자의 총 표면적이 입자의 총 체적에 비해 큰 입자 크기가 작은 계에서 특히 중요하고, 표면 관련 현상은 그들의 거동을 결정한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따라, 부화된 나노구조 조성물은 액체 그 자체의 ζ 포텐셜 보다 실질적으로 큰 ζ 포텐셜을 특징으로 한다. 큰 ζ 포텐셜은 액체 중의 향상된 나노 구조의 이동에 대응하고, 따라서 큰 ζ 포텐셜은 예를 들어 전기화학 석출 공정에서 특정 형상의 형성에 기여할 수 있다.

마이크로 전기영동, 광 산란, 광 회절, 음향학, 전기 음향학 등을 포함하는 부화된 나노구조 조성물의 ζ 포텐셜을 측정하는 다수의 방법이 존재한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면, ζ 포텐셜을 측정하는 방법 중 하나가 미국특허 US6,449,563에 개시되어 있고, 그의 내용은 본 명세서에 참고로 도입되었다.

본 실시예는 또한 분자 생물학 연구 및 진단 분야에 관한 것이고, 특히 폴리머라아제 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 스트랜드 치환 증폭(SDA) 및 자립적 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, SSSR)와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 핵산 증폭 기술에 관한 것이다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 핵산 증폭 공정의 효율을 개선할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "핵산 증폭 공정 효율의 개선(improving the efficiency of a nucleic acid amplification process)"은 PCR 공정에서 DNA 폴리머라아제의 촉매 활성을 향상시키는 것, 그 반응에 필요한 단백질의 안정성을 증대시키는 것, 증폭 공정의 민감도 및/또는 안정성을 증대시키는 것 및/또는 증폭 반응의 반응체적을 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 촉매 활성의 향상은 마그네슘 또는 망간과 같은 그러나 이들에 한정되지 않는 추가의 보조인자를 사용하지 않고 달성되는 것이 바람직하다. 본 기술분야의 통상 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 마그네슘-무함유 또는 망간-무함유 PCR을 채용할 수 있는 능력은 매우 이점이 있다. 이는 PCR 공정의 효율이 반응에 존재하는 보조인자의 농도에 매우 민감한 것으로 알려져 있기 때문이다. 목적하는 증폭 효율을 달성하기 전에, 숙련된 과학자들이 보조인자의 농도를 사전에 계산하거나 보조인자의 농도를 변화시키면서 다수의 시험을 행할 것이 요구되는 경우가 많다.

따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 사용하면 사용자가 PCR 혼합물 내의 보조인자의 농도를 계산하거나 농도를 변화시킬 필요없이 간단하고 높은 효율의 멀티-사이클 PCR 공정을 수행할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 폴리머라아제 연쇄반응이 임의 추가 완충액 또는 추가 액체 없이 일어날 수 있다. 임상 진단에 PCR을 적용하는 것과 관련된 주요 문제점 중 하나는 캐리오버(carryover) 오염에 대한 PCR의 감수성이다. 이는 이전 PCR에서 증폭된 분자를 가지는 샘플의 오염에 기인한 거짓 양성(false positives)이다. 전체 공정이 임의의 추가 완충액 또는 추가의 액체를 필요로 하지 않고 수행될 수 있기 때문에, 단독 PCR 혼합물인 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 사용하면 캐리오버 오염의 가능성을 상당히 감소시키므로 오염의 위험을 피할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 민감도를 향상시키고, 실시간 PCR 반응의 반응 체적을 감소시킨다. 본 명세서에서 사용된 용어 "실시간 PCR 반응"은 각 PCR 사이클 중에 이중사슬 DNA 검출 분자(예, 염료)의 존재 하에서 수행되는 PCR 반응을 의미한다.

더욱, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 극소의 체적의 PCR 반응(예, 2㎕)에 사용될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 가열 탈수된 멀티플렉스 PCR 반응에 이용된다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예에 따라 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트가 제공된다. 본 발명의 PCR 키트는 필요한 경우 본 발명의 하나 이상의 키트의 유닛을 포함할 수 있는 팩 내에 제공될 수 있다. 이 팩은 키트의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 또한, 팩에는 실험 보충물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부당국에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태에 대한 상기 정부당국의 승인을 반영한다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 상기 키트는 바람직하게는 별도의 포장으로 Taq 폴리머라제와 같으나 이에 한정되지 않는 열안정성 DNA 폴리머라아제 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 상기 키트는 실시간 PCR 키트용으로 이용될 수 있고, 추가하여 이중사슬 DNA 검출분자와 같은 적어도 하나의 실시간 PCR 시약을 포함한다. 키트의 구성요소들은 독립적으로 포장되거나 임의의 조합으로 포장될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 어구 "이중사슬 DNA 검출분자(double stranded DNA detecting molecule)"는 정량화 가능한 신호(예, 형광 신호)를 생성하는 이중사슬 DNA 상호작용 분자를 의미한다. 예를 들면, 이 이중사슬 DNA 검출분자는 형광 염료로서, (1) DNA 단편 또는 앰플리콘(amplicon; 단위복제배열)과 상호작용하고, (2) 독립된 앰플리콘의 존재 하에서보다 이중사슬 형태의 앰플리콘의 존재 하에서 상이한 파장을 방출하는 것일 수 있다. 이중사슬 DNA 검출분자는 이중사슬 DNA 삽입 검출분자이거나 프라이머-베이스 이중사슬 DNA 검출분자일 수 있다.

이중사슬 DNA 삽입 검출분자는 프라이머, 앰플리콘 또는 핵산 주형(template)에 공유결합된다. 검출분자는 이중사슬 DNA의 존재 하에서 그 방출을 증대하고 이중사슬 DNA가 풀릴 때 그 방출을 감소한다. 예는 에티디움 브로마이드, YO-PRO-1, Hoechst 33258, SYBR Gold, 및 SYBR Green I을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 에티디움 브로마이드는 이중사슬 DNA 단편 내의 염기쌍들 사이에 삽입되는 형광 화학물질로서, 보통 겔 전기영동 후의 DNA를 검출하기 위해 사용된다. 이것은 254 nm 내지 366 nm 사이의 자외광에 의해 여기되었을 때, 590 nm의 형광을 방출한다. DNA-에티디움 브로마이드 착체는 단일사슬 DNA의 존재 하에서 에티디움 브로마이드에 비해 약 50배 이상의 형광을 생성한다. SYBR Green I은 497 nm에서 여기되고 520 nm에서 방출한다. SYBR Green I의 형광 강도는 이중사슬 DNA에 결합시 단일사슬 DNA에 결합시에 비해 100배 이상 증대된다. SYBR Green I의 대체물은 몰리큘라 프로브 사(Molecular Probes Inc.)에 의해 소개된 SYBR Gold이다. SYBR Green I과 유사하게 SYBR Gold의 형광 발광은 이중사슬 DNA의 존재 하에서 향상되고 이중사슬 DNA가 풀릴 때 감소된다. 그러나, SYBR Gold의 여기 피이크는 495 nm이고, 발광 피이크는 537 nm이다. 보고에 따르면 SYBR Gold는 SYBR Green I에 비해 더욱 안정한 것으로 보인다. Hoechst 33258은 이중사슬 DNA의 AT 풍부 영역에 결합되는 공지된 비스벤지마이드(bisbenzimide) 이중사슬 DNA 검출분자이다. Hoechst 33258은 350 nm에서 여기되고, 450 nm에서 방출한다. YO-PRO-1는 450 nm에서 여기되고, 550 nm에서 방출되는 것으로서, 이중사슬 DNA 특이적 검출분자로서 보고되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 이중사슬 DNA 검출분자는 SYBR Green I이다.

프라이머-베이스 이중사슬 DNA 검출분자는 프라이머에 공유결합되고, 앰플리콘이 이중구조를 형성할 때 형광 발광을 증대시키거나 감소시킨다. 형광 발광의 증대는 프라이머-베이스 이중사슬 DNA 검출분자가 프라이머의 3' 말단에 인접하여 부착되고, 프라이머 말단 염기가 dG 또는 dC인 경우에 관찰된다. 상기 검출분자는 말단 dC-dG 및 dG-dC 염기쌍의 인접부에서 소광(quenched)되고, 상기 검출분자가 프라이머의 양단부로부터 내측으로 적어도 6 뉴클레오티드의 거리만큼 이격되어 위치된 경우 앰플리콘의 이중 형성의 결과로서 발광(dequenched)된다. 상기 발광에 의해 형광 발광은 상당량 증대된다. 이들 유형의 검출분자는 플루오레세인(fluorescein)(488 nm에서 여기, 530 nm에서 발광), FAM (494 nm에서 여기, 518 nm에서 발광), JOE (527nm에서 여기, 548 nm에서 발광), HEX (535 nm에서 여기, 556 nm에서 발광), TET (521 nm에서 여기, 536 nm에서 발광), Alexa Fluor 594 (590 nm에서 여기, 615 nm에서 발광), ROX (575 nm에서 여기, 602 nm에서 발광), 및 TAMRA (555 nm에서 여기, 580 nm에서 발광)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 대조적으로, 일부의 프라이머-베이스 이중사슬 DNA 검출분자는 단일사슬 DNA에 비해 이중사슬 DNA의 존재 하에서 그 방출을 감소시킨다. 예는 로다민(rhodamine), 및 BODIPY-FI(504 nm에서 여기, 513 nm에서 발광)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 이들 검출분자는 일반적으로 5' 말단 dC 또는 Dg에서 프라이머에 공유결합되고, 앰플리콘이 이중사슬인 경우에 적은 형광을 발광한다. 이중사슬의 형성시의 형광의 감소는 검출분자의 인접부의 상보사슬(complementary strand) 내의 구아노신의 소광(quenching)에 기인되거나 말단 dC-dG 염기쌍의 소광에 기인된다.

또, 상기 PCR 및 실시간 PCR 키트는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP와 같은 그러나 이들에 한정되지 않는 적어도 하나의 dNTP를 포함할 수 있다. dITP 및 7-deaza-dGTP와 같은 유사물도 고려된다.

본 발명의 일부의 실시예에 따라, 상기 키트는 사용자가 PCR 성능을 확보하기 위해 적어도 하나의 대조 실험을 수행할 수 있도록 적어도 하나의 대조 주형 DNA 및/또는 적어도 하나의 대조 프라이머를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따라 DNA 서열의 증폭방법이 제공된다. 이 방법의 제1의 단계에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 제공되고, 제2의 단계에서 상기 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 상기 DNA 서열상에서 복수의 PCR 사이클이 수행된다.

이 PCR 사이클은 본 기술분야에서 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 공지의 PCR 사이클은 미국특허 US 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, 5,512,462, 6,007,231, 6,150,094, 6,214,557, 6,231,812, 6,391,559, 6,740,510 및 국제특허출원 WO99/11823에 개시되어 있다. 그러나, 이들 공보의 것에 한정되지 않는다.

각 PCR 사이클에서, 먼저 DNA 서열이 단일사슬의 상보사슬을 형성하도록 처리되는 것이 바람직하다. 다음, DNA 서열에 특이적인 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 부화된 나노구조 조성물에 첨가된다. 다음, 상기 프라이머의 쌍이 단일사슬의 상보사슬 상에서 어닐(annealed)되어 상보서열이 된다. 적절한 조건 하에서, 상기 어닐된 프라이머는 각 단일사슬에 대해 상보적인 연장 생성물(extension products)을 합성하도록 연장된다.

유리 비이드와 같은 고체 지지체에 폴리뉴클레오티드를 고정하는 것은 분자 생물학 연구 분야 및 의약 분야에서 최상의 유익을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "폴리뉴클레오티드(polynucleotides)"는 임의의 크기의 사슬을 형성하기 위해 결합된 DNA 또는 RNA 분자로서 정의된다.

폴리뉴클레오티드는 연구의 과정 및 의학적 적용의 과정에서 증폭, 전사, 역전사, 결찰, 제한 소화, 트랜스펙션, 트랜스포메니션을 포함하는 그러나 이들에 한정되지 않는 많은 방법으로 조작될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "결찰(ligation)"은 핵산사슬의 3'말단을 다른 5'말단과 결합하여 연속사슬을 형성하는 것으로 정의된다. "전사(Transcription)"는 DNA로부터 메신저 RNA를 합성하는 것으로서 정의된다. "역전사(Reverse transcription)"는 RNA로부터 DNA를 합성하는 것으로서 정의된다. "제한 소화(Restriction digestion)"는 제한 엔도뉴클레아제(Restriction Endonucleases)라 부르는 특수 효소를 이용하여 DNA분자를 더 작은 절편으로 절단하는 공정으로서 정의된다. "트랜스포메이션(Transformation)"은 박테리아 세포가 나(naked) DNA분자를 취하는 공정으로서 정의된다. "트랜스펙션(Transfection)"은 세포가 DNA분자를 취하는 공정이다.

전형적으로, DNA 조작은 순차적으로 일어나는 일련의 반응을 포함한다. 따라서, 전형적 예로서, 먼저 DNA가 제한 소화되고, 증폭되고, 다음에 박테리아 내에 트랜스포메이션될 수 있다. 각 반응은 그 고유의 특이적 완충액이 필요한 고유의 반응 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 전형적으로, 각 반응의 사이에 DNA 샘플 또는 RNA 샘플은 침전된 다음, 새로운 적절한 완충액 내에서 재구성되어야 한다. 반복되는 침전 및 재구성은 시간이 걸리고, 더 중요한 것은 출발 물질이 손실되는 것인데, 물질이 희귀한 것인 경우 더 문제가 된다. 폴리뉴클레오티드를 고체 지지체에 고정하면 이 문제를 회피할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따라, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 고체 지지체의 존재 하에서 적어도 하나의 거대분자의 조작을 가능하게 하고, 그 결과 각 나노구조는 정렬된 유체 분자의 인벨롭에 의해 포위되는 나노미터 크기의 코어 물질을 포함한다. 상기 코어 물질 및 정렬된 유체 분자의 인벨롭은 물리적 정상 상태에 있다.

상기 고체 지지체는 전술한 바와 같은 후속 반응에서 DNA 및 RNA와 결합 및 상호작용하기 위한 기타 분자의 접근을 허용함과 동시에 상기 DNA 및 RNA와 결합할 수 있는 임의의 고체 지지체일 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 유리 비이드는 폴리뉴클레오티드를 고정할 수 있는 것으로서 폴리뉴클레오티드를 무상 상태로 유지하기 위해 부화된 나노구조 조성물을 필요로 한다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 유리 비이드의 존재 하에서 PCR 증폭 중에 있는 DNA는 PCR 생성물의 시각화를 위해 부화된 나노구조 조성물이 필요하다.

핵산 증폭 이외에, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 많은 화학적 및 생물학적 분석 및 반응을 향상시키기 위한 완충액 또는 기존의 완충액에의 추가물로서 이용될 수 있다.

따라서, 일 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 적어도 부분적으로 DNA 분자를 디폴딩(de-fold)시키기 위해 이용될 수 있다.

다른 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 DNA의 단리 및 정제를 촉진시키기 위해 이용될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 핵산 하이브리드화를 향상시키기 위해 이용될 수 있다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA 분자(즉, 핵산서열 또는 그것의 단일 염기)일 수 있다.

핵산들 중의 하나는 고체 지지체(예, DNA 칩)에 고정될 수 있다. DNA 칩의 예는 초점 배열 칩(focus array chips), 어피메트릭스 칩(Affymetrix chips) 및 일루미나 비이드 배열 칩(Illumina bead array chips)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

부화된 나노구조 조성물은 하이브리드 형성을 향상시키는 것이 입증되었으므로, 본 발명은 특히 낮은 발현 수준을 가지는 유전자의 검출에 유용할 수 있다.

추가의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 결합되거나 비결합된 많은 효소(알칼라인 포스파타아제 또는 β-갈락토시다아제)의 효소 활성의 안정화를 위해 이용될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 거대분자의 고체상 매트릭스에 대한 결합을 향상시키기 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 친수성 물질 및 소수성 물질의 양 물질에 대한 결합을 향상시킨다. 추가하여, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 소수성 영역과 친수성 영역을 가지는 물질에 대한 결합을 향상시킬 수 있다. 하나 이상의 탄수화물 친수성 영역 또는 탄수화물 소수성 영역을 가지는 분자, 항체, 폴리클로날 항체, 렉틴, DNA 분자, RNA 분자 등과 같은 거대분자를 포함하는 그러나 이들 분자에 한정되지 않는 거대분자들의 상기 물질에 대한 결합이 향상될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 컬럼의 용량을 증대시키기 위해, 수지에 대한 핵산의 결합을 위해, 및 겔 전기영동 분리를 향상시키기 위해 이용될 수 있다.

본 실시예는 또 새로운 살균제 조성물 및 그 이용방법을 포함한다. 특히, 본 실시예는 체표면(예, 입)의 살균(구강세정액에 의한 구상의 살균) 또는 물체를 살균하기 위해 이용될 수 있다.

살균제는 외과적 개입의 전, 주사 및 천자(punctures)의 전, 피부나 점막을 살균시켜야 하는 경우 중공 기관의 검사 전에 적용되는 것을 포함하는 수많은 목적을 위해 이용될 수 있다. 추가하여, 살균제는 또 상처의 치료를 위해 그리고 국부적인 피부 표면의 감염(예, 진균 감염증)의 치료를 위해 이용될 수 있다. 살균제를 함유하는 용액은 구강세정액의 형태로 충치 예방을 위해 이용될 수 있다.

구강세정액은 플라그, 치육염(gingivitis) 및 구취의 원인이 되는 구강 내 박테리아를 살균하기 위해 유용하다. 대부분의 구강세정액은 에탄올이 용매로서 사용된다. 알코올-함유 구강세정액은 사용자의 입 안에 화끈거림 또는 쏘는 느낌을 유발할 수 있고, 또 구강암을 유발하는 경향이 있다는 단점이 있다. 더욱, 알코올-함유 구강세정액은 생리학적인 이유(예, 화학요법을 받고 있는 환자), 심리학적인 이유, 사회적 또는 직업적인 이유로 알코올을 사용할 수 없거나 사용해서는 안되는 사람들을 포함하는 일부의 사용자에 대해서는 문제가 있다. 따라서, 상기 제한점들을 회피할 수 있는 새로운 살균제 조성물이 크게 요구된다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 그 자체로 사용되거나 또는 살균제를 위한 담체로서 사용되어 체표면 또는 물체의 살균을 위해 이용된다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 구강세정액 활성 성분(예, 티몰, 메틸 살리실레이트, 멘톨 및 유칼립톨)을 위한 용매로서 유효하다. 살균제 활성 제제는 시간의 경과에 따라 더욱 미세한 미셀(micelles)을 생성한다. 이 미셀은 역삼투(reverse osmosis; RO)에 비해 본 발명의 부화된 나노구조 조성물 내에서 분산도가 크다. 살균성 구강세정액의 효과 및 맛은 그 활성 성분(예, 티몰, 메틸 살리실레이트, 멘톨 및 유칼립톨)의 유효성 및 용해도에 기인하므로, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 구강세정액 내에 함유된 활성 성분을 위한 효과적인 용매일 수 있다. 더욱, 본 실시예의 조성물은 분산을 위해 추가의 알코올이 불필요하므로 알코올 무함유일 수 있다. 본 실시예의 조성물은 따라서 용매로서 알코올의 대체물로서 이용될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물 및 적어도 하나의 살균제를 포함하는 살균제 조성물이 제공된다.

본 명세서에 사용되는 어구 "살균제 조성물(antiseptic composition)"은 박테리아, 균류, 아메바, 원생동물 및/또는 바이러스와 같은 병원체에 대해 세포증식억제성(cytostatic) 및/또는 세포독성(cytotoxic)을 가지는 고체, 반고체 또는 액체 조성물을 의미한다. 바람직하게, 본 실시예의 살균제 조성물은 20 %(w/v)을 초과하는 알코올을 포함하지 않고, 더욱 바람직하게, 알코올을 전혀 포함하지 않는다(전술한 이유에 의함).

바람직하게, 부화된 나노구조 조성물은 유기체의 체표면에 가했을 때 상당한 자극을 유발하지 않고, 또 용해된 살균제의 생물학적 활성 및 특성을 무효화하지 않는다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 일반적으로 제제를 그리고 특히 스트립에 제공되는 살균제를 물에 비해 더 많은 정도로 용해시키거나 분산시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 소수성 막을 통한 살균제의 투과를 향상시킨다. 부화된 나노구조 조성물은 또 안정된 환경(예, 열 효과로부터 단백질을 안정화시킴)을 제공함으로써 살균제의 살균 특성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물의 살균 특성은 이 조성물이 특수한 물질과 접촉할 때, 특히 상인두(upper pharynx)에 전형적으로 존재하는 특수한 생물학적 물질(예, 진핵성 균류, 원생 생물, 메탄 생성 아키아 또는 박테리아)과 접촉할 때 표현되거나 제고된다. 반면에, 이들 물질이 존재하지 않으면 살균 특성이 관찰되지 않는다. 따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 특수 생물학적 물질이 살균 공정에 대한 "점화제(primers)"의 역할을 한다는 의미에서 휴면 상태의 살균 특성을 가진다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 살균제 조성물은 적어도 하나의 살균제를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 어구 "살균제(antiseptic agent)"는 박테리아, 균류, 아메바, 원생동물 및/또는 바이러스와 같은 병원체에 대해 세포증식억제성 및/또는 세포독성을 가지는 제제를 의미한다.

본 실시예의 살균제 조성물의 살균제는 본 실시예의 살균제 조성물의 의도된 용도에 따라 선택된다.

살균제는 합리적으로 긴 보관기간(예, 2년)에 걸쳐 안정한 것이 바람직하고, 살균제의 효과가 가해질 미생물과 살균제 사이에 지속성, 즉 장기간의 접촉시간을 가지는 것이 바람직하다.

따라서, 예를 들면, 살균제 조성물이 생명체에의 투여를 위해 이용되는 경우, 살균제는 비독성의 살균제인 것이 바람직하다. 예를 들면, 구강세정액으로서 사용되는 경우, 본 실시예의 살균제는 구강에 비독성인 살균제인 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "구강에 비독성인 살균제(an orally non-toxic antiseptic agent)"는 추천 투여량에서 그리고 처방대로 투여되었을 때 안전한(즉, 원하지 않는 부작용을 유발하지 않는) 살균제를 의미한다. 예를 들면, 구강세정액으로 이용되는 경우, 구강에 비독성인 살균제는 구강의 세정 중에 살균제의 일부가 삼켜진 경우에도 비독성이어야 한다. 본 실시예의 구강 살균제 조성물은 충치, 치육염, 치아 감염, 농양 및 치주 질환과 같은 구강 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.

구강에 비독성인 살균제의 예는 티몰, 메틸 살리실레이트, 멘톨, 염화나트륨, 과산화수소, 클로헥시딘 글루코네이트(chlorhexidine gluconate), 클로부타놀 헤미하이드레이트(chlorbutanol hemihydrate), 페놀 및 유칼립톨을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에 의해 사용될 수 있는 기타의 살균제는 1가 알코올, 금속 화합물, 제4급 암모늄 화합물, 이오딘, 이오도퍼, 또는 페놀 화합물을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에 따라 사용될 수 있는 1가 알코올의 예는 에탄올 및 이소프로판올을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에 따라 사용될 수 있는 금속 화합물의 예는 질산은 및 설파디아진은(silver sulfadiazine)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에 따라 사용될 수 있는 제4급 암모늄 화합물의 예는 디에틸 벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 디에틸 도데실 벤질 암모늄 클로라이드, 디메틸 디도데실 암모늄 클로라이드, 옥타데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 트리메틸 테트라데실 암모늄 클로라이드, 트리메틸 옥타데실 암모늄 클로라이드, 트리메틸 헥사데실 암모늄 클로라이드, 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 세틸 피리디늄 브로마이드, 세틸 피니디늄 클로라이드, 도데실 피리디늄 클로라이드, 및 벤질 도데실 비스(B-히드록시에틸) 암모늄 클로라이드를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에 따라 사용될 수 있는 페놀 화합물의 예는 페놀, 파라-클로로메타크실레놀, 크레졸 및 헥실레소시놀을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

살균제는 또 대상(subject)을 위해 유익할 수 있는 기타의 제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항생제, 또는 구강세정액의 경우, 상기 조성물은 또 염화아연 및 불화물 유도체와 같은 치과 치료용 기타 제제를 포함할 수 있다.

전술한 부화된 나노구조 조성물 및/또는 살균제 조성물은 일부의 실시예에서 살균 특성을 특징으로 하고, 따라서 물체 및 체표면의 살균 또는 멸균을 위해 이용될 수 있다.

용어 "멸균(sterilizing)" 및 "살균(disinfecting)"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이것은 박테리아, 균류, 아메바, 원생동물 및/또는 바이러스와 같은 병원체를 살균하는 것, 예방하는 것 또는 성장을 지연시키는 것을 의미한다.

본 실시예의 조성물을 이용하여 살균될 수 있는 물체의 예는 카테터(예, 혈관 카테터, 요관 카테터 , 복막 카테터 , 경막외 카테터 및 중추신경계 카테터), 튜브(예, 신루조설(nephrostomy) 튜브 및 기관내 튜브), 스텐트, 정형외과 장치, 인공 밸브, 및 의료용 임플란트를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 기타의 예는 마루, 테이블의 표면, 카운터의 표면, 병원 시설, 휠체어, 거즈 및 솜과 같은 무기질의 표면을 포함한다.

이와 같은 물체는 일정한 기간(예, 실온에서 1분) 동안 본 실시예의 조성물과 접촉된다. 그러나, 본 실시예의 조성물은 필요한 경우 살균제 조성물의 존재 하에서 물체가 가열될 수 있도록 고온(예, 50℃)에서 그 살균 특성을 유지해야 한다.

살균 효율을 향상시키기 위해, 방부제 또는 세척제(연마제, 세제 또는 마모제)와 같은 기타 제제가 사용될 수 있다. 살균제 조성물이 무생물에 사용하기 위한 것인 경우, 살균제는 독성 제제 또는 비독성 제제일 수 있다. 독성의 살균제의 예는 포름알데히드, 염소, 염화제2수은 및 에틸렌 옥사이드를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 비독성 제제의 예는 전술한 바와 같다.

대안으로서 본 실시예의 조성물은 개체(individual)의 체표면의 살균을 위해 이용될 수 있다. 이것은 본 실시예의 조성물의 일정량을 이것을 필요로 하는 개체의 체표면에 제공하는 것에 의해 수행된다.

살균을 향상시키기 위해, 살균제, 또는 전술한 바와 같은 치료용 제제와 같은 기타의 제제가 제공될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "체표면(body surface)"은 피부, 치 또는 점막(예, 구강 내의 점막)을 의미한다. 본 실시예의 조성물은 체표면을 투과하여 혈액순환 내에 진입하지 않는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "개체(individual)"는 인간 또는 동물의 대상체(예, 사체 또는 생체)를 의미한다.

본 실시예의 살균제 조성물은 또 기타 생리학적으로 허용이 가능한 담체를 포함할 수 있다. 추가하여, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 또 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다.

본 명세서의 용어 "부형제(excipient)"는 활성 성분의 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당류 및 다양한 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

약물의 제조기법 및 투여기법은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판"에 기술되어 있다. 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 도입되었다.

본 실시예의 살균제 조성물은 국부적으로 적용되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 피부에 배치되거나, 구강 내를 세정하거나, 목을 가글하는 것이 바람직하다.

본 실시예의 살균제 조성물은 예를 들면, 공지의 혼합 공정, 용해 공정, 조립 공정(granulating), 당의정 제조공정, 미립자 제조공정(levigating), 유화 공정, 캡슐화 공정, 봉입 공정 또는 동결 건조 공정과 같은 본 기술분야에 주지된 공정에 의해 제조될 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 제조 공정은 후술된다.

따라서 본 실시예에 따른 용도를 위한 살균제 조성물은 종래의 방법으로 조제(formulated)될 수 있다. 적합 조제는 목적으로 하는 용도에 따라 달라진다.

예를 들면, 본 실시예의 살균제 조성물은 구강의 살균용으로 조제될 수 있고, 따라서 고의로 삼키지 않는 한 임의의 경구투여 형태로 조제될 수 있다. 경구투여 형태의 예는 구강세정액, 스트립(strip), 거품, 추잉검, 구강 스프레이, 캡슐 및 약용 캔디(lozenge)를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예의 살균제 조성물은 또한 국소투여 형태 또는 점막투여 형태로서 조제될 수 있다. 국소투여 형태 또는 점막투여 형태의 예는 크림, 스프레이, 와이프(wipe), 거품, 비누, 오일, 용액, 로션, 연고, 페이스트 및 젤을 포함한다.

살균제 조성물은 적어도 1체적%의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 액체로서 조제될 수 있다. 대안으로서, 살균제 조성물은 0.258 g/100ml 이하의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 고체 또는 반고체로서 조제될 수 있다.

구강용 약리학적 제제(Pharmacological preparation)는 고체 부형제를 이용하고, 필요에 따라 얻어지는 혼합물을 분쇄하고, 과립의 혼합물을 처리하고, 필요시 정제 또는 당의정 코어를 얻기 위해 적절한 보조제를 첨가하여 제조될 수 있다. 적절한 부형제는 락토스, 스쿠로스, 마니톨, 또는 소비톨을 포함하는 당류와 같은 특히 충전제(fillers); 예를 들면, 옥수수 전분, 호밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 고무(gum tragacanth), 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소디움 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용이 가능한 폴리머이다. 필요하면, 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소디움 알기네이트와 같은 알긴산의 염과 같은 붕괴제(disintegrating agents)가 첨가될 수 있다.

당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이 목적을 위해, 농축된 당 용액이 이용될 수 있다. 이 용액은 필요에 따라 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 티타늄 다이옥사이드, 라카 용액(lacquer solutions) 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물이 함유할 수 있다. 염료 또는 색소가 식별을 위해 또는 활성 화합물의 용량의 다양한 조합을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구용으로 사용될 수 있는 의약 조성물은 젤라틴으로 제조되는 푸시-핏(push-fit) 캡슐뿐 아니라 젤라틴 및 가소제(예, 글리세롤 또는 소르비톨)로 제조되는 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제(예, 락토오스), 결합제(예, 전분), 활제(예, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트) 및 필요에 따라 안정제로 된 혼합물 내에 활성 성분들을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분들은 지방유, 유동 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체 내에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가하여, 안정제가 첨가될 수 있다. 경투 투여용 모든 조제물은 선택된 투여 경로에 적합한 용량으로 제조되어야 한다.

본 실시예에 따른 용도를 위한 활성 성분들은 압력 팩으로부터 또는 적절한 추진제(예, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소)를 사용하는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 투여되는 것이 편리하다. 압력 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 투여하기 위한 밸브를 제공하는 것에 의해 결정될 수 있다. 분배기에서 사용하기 위한 젤라틴 캡슐 및 젤라틴 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 원료(예, 락토오스 또는 전분)의 분말 혼합물을 함유하도록 조제될 수 있다.

본 실시예에 관련한 용도에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분들이 의도된 목적을 달성하는 유효한 양이 함유되는 조성물을 포함한다. 더욱 상세하게는, 치료적으로 유효한 양이라 함은 살균에 유효한 활성 성분(살균제)의 양을 의미한다.

치료적으로 유효한 양을 결정하는 것은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 설명에 비추어 본 기술분야의 전문가의 능력 범위 내에 있다.

본 실시예의 방법에 이용되는 임의의 제제에 있어서, 치료적으로 유효한 양 또는 용량은 최초에 인비트로(in vitro) 및 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들면, 용량은 소망의 농도 또는 적정농도(titer)를 달성하기 위한 동물 모델에서 조제될 수 있다. 이와 같은 정보는 인간에 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하기 위해 이용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 활성 성분들의 독성 및 치료 효과는 인비트로, 세포배양 또는 실험동물을 이용한 표준 약학 공정에 의해 측정될 수 있다. 이들 인비트로, 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어지는 데이터는 인간에게 사용하기 위한 용량 범위를 처방하는데 이용될 수 있다. 상기 용량은 채용된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 처방, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 감안하여 개별 의사가 선택할 수 있다(참고예, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

투여량 및 투여간격을 개별적으로 조절하여 생물학적 효과를 유발하거나 억제하는데 충분한 활성 성분의 혈장중 농도 또는 뇌중 농도(최소유효농도; MEC)를 제공할 수 있다. MEC는 각 제제마다 다르지만 인비트로 데이터로부터 추정이 가능하다. MEC를 달성하기 위해 필요한 용량은 개인의 특징 및 투여 경로에 따라 달라진다. 검출 분석은 혈장 농도를 측정하기 위해 이용될 수 있다.

치료 대상의 질환의 중증도 및 반응 정도에 의존하여, 투여는 단일회 국부 투여 또는 복수회 국부 투여로 할 수 있고, 치료과정은 수일로부터 수주까지 또는 치료 효과가 나타날 때까지 또는 질환상태가 감소될 때까지로 할 수 있다.

국부 투여될 조성물의 양은 물론 치료의 대상, 질병의 중증도, 투여 방법, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라진다.

본 발명의 조성물은 필요한 경우 활성 성분을 함유하는 일회 이상의 투여 형태를 포함할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 분배장치 또는 팩 내에 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면 블리스터 팩(blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 포일을 포함한다. 이 팩 또는 분배장치에는 투약 설명문이 첨부될 수 있다. 또한, 팩 또는 분배장치에는 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부당국에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태나 인체 또는 동물에의 투여에 대한 상기 정부당국의 승인을 반영한다. 이와 같은 통지서는 예를 들면 미국 식품의약품국에 의해 승인된 처방 약품 또는 승인된 생성물 삽입에 관한 라벨일 수 있다. 적합한 의약 담체 내에 조제된 본 실시예의 제제를 포함하는 조성물은 전술한 바와 같이 조제 후, 적절한 용기 내에 투입되고, 표시된 질환의 치료를 위한 라벨이 부착될 수 있다.

본 실시예는 새로운 동결방지 조성물 및 그 사용방법을 더 포함한다. 특히, 본 실시예는 세포 물질의 그 보관, 수송 및 취급을 용이하게 하기 위한 저온보전을 위해 이용될 수 있다.

저온생물학은 광범위한 응용분야를 포함하고, 많은 유형의 생물학 물질의 장기 보관을 위한 해결책을 제공할 수 있다. 그러나, 적절하게 제어되지 않으면 저온보존은 열적 충격, 삼투압 충격, 및/또는 기계적 충격 그리고 세포의 구조(특히 원형질막)를 손상시킬 수 있는 결정의 형성에 기인되어 세포 손상 및 세포 생존력의 감소를 유발할 수 있다. 추가하여, 냉동 및 해동 과정은 세포 손상을 유발할 수 있는 세포의 탈수를 유발한다. 항동결제(즉, 동결방지제)를 사용하면 이들 문제점들의 일부를 완화시키는데 도움이 된다. 일반적으로 이용되는 항동결제는 글리세롤, 히드록시에틸 전분(HES) 에틸렌 글리콜 및 DMSO를 포함한다. 이들 항동결제는 냉동 및 해동 중에 세포의 손상을 감소시키는데 불가결한 것이지만 또한 세포에 대해 독성도 가진다. 예를 들면, 정자 세포에 미치는 글리세롤의 독성 효과는 농도가 2 % 미만인 경우에도 보고되어 있다(Tulandi and McInnes, 1984). 추가하여, 정자의 운동성은 글리세롤 농도가 증대함에 따라 감소하는 것이 밝혀져 있다(Weidel and Prins, 1987, J Androl., Jan-Feb;8(1):41-7; Critser et al., 1988, Fertil Steril. Aug; 50(2):314-20). 더욱, 동결방지제가 존재하면 삼투압 응력에 기인되어 정자 세포의 손상이 유발되는 것이 밝혀졌다(Critser et al., 1988, Fertil Steril. Aug; 50(2):314-20).

그러므로, 상기 제한들을 회피하는 새로운 동결방지 조성물은 매우 유리할 것이다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 세포 물질을 효과적으로 동결방지하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 동결방지제(글리세롤)을 포함하는 완충액의 존재 하에서 동결방지 후의 정자 세포의 보호 및 해동 후의 정자의 질을 향상하는 것의 양자에 있어서 완충액만을 사용하는 것에 비해 더욱 효과적이다. 따라서 본 실시예의 조성물을 사용하면 동결방지를 위해 필요한 독성의 동결방지제(예, 글리세롤)의 양을 감소시킬 수 있고, 그 결과 동결방지제의 유해한 효과를 제한할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 필요에 따라 적어도 하나의 동결방지제를 포함하는 동결방지 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "동결방지 조성물(cryoprotective composition)"은 냉동 및 해동 중에 세포의 손상(세포내 및 세포외의 얼음결정의 형성에 의해 유발되는 기계적 손상; 세포외의 얼음의 형성에 의해 유발되는 용질의 상태 변화에 의해 생성되는 삼투압에 의한 손상)을 감소시키는 액체 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 어구 "동결방지제(cryoprotective agent)"는 냉동 및 해동 중에 세포의 손상을 감소시키는 것에 의해 동결방지 공정을 촉진하는 화학약품 또는 화학용액을 의미한다. 상기 동결방지제는 이것이 사용되는 조건 (즉, 특정 농도, 특정 노출시간, 및 특정 삼투압의 매체 내의 세포) 하에서 세포 물질에 대해 비독성인 것이 바람직하다. 본 실시예에 따르면, 동결방지제는 세포 침투성 또는 비침투성일 수 있다. 동결방지제의 예는 탈수제, 삼투제 및 글래스화(vitrification) 용질(즉, 용액이 저온에 노출된 경우 결정질 고체보다는 유리로 변태되도록 도와주는 용질)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

이론에 구애됨이 없이, 비침투성 동결방지제는 세포내의 물의 유출을 억제함으로써 세포가 그 최소 임계 체적을 초과하여 수축되는 것을 방지하는 것으로 생각된다. 세포의 수축을 감소시키는 것에 의해 동결방지제는 세포내 유체의 과도한 농축을 감쇄시키고, 그 결과 단백질의 석출을 억제한다. 동결방지제를 침투시키면 세포 내에 형성되는 얼음의 양이 감소되고, 따라서 세포막 및 세포소기관에 미치는 물리적 손상의 양이 감소된다.

각 세포는 그 유형 및 환경에 따라 특정의 방식으로 개별의 동결방지제에 반응하므로 상기 동결방지제 및 그 농도는 경험적 근거에 의해 선택된다. 전형적으로, 조직(tissue)은 세포 현탁에 비해 더 많은 동결방지제의 침투를 요한다. 역으로, 소형 세포의 동결방지는 세포막에 침투하는 제제가 불필요하다. 추가하여, 상기 동결방지제 및 그 농도는 후술하는 동결방지 방법 및 단계에 따라 선택된다.

본 실시예에 따라 사용될 수 있는 동결방지제는 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부타네디올, 콘드로이틴 설페이트, 클로로포름, 클로라인, 덱스트란, 디에틸렌 글리콜, 디메틸렌 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭시드(DMSO), 에리트리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리세롤, 알파-글리세로포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 하이드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토오스, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 말토오스, 마니톨, 만노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 우레아, 페놀, 플루로닉 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보오스, 세린, 소디움 브로마이드, 소디움 클로라이드, 소디움 이오다이드, 소디움 나트레이트, 소디움 설페이트, 소비톨, 스크로오스, 트레할로오스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메티아민 아세테이트, 우레아, 발린 및 크실로오스를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예의 동결방지 조성물은 20%미만의 글리세롤을 포함하는 것이 바람직하고, 글리세롤을 함유하지 않는 것이 더욱 바람직하다(이유는 전술한 바와 같음).

나노구조의 농도는 후술되는 동결방지의 특정의 단계 또는 방법에 따라 선택되는 것이 바람직하다.

이론에 구애됨이 없이, 나노구조들 사이의 장범위 상호작용은 동결방지 조성물에 독특한 특성을 부여한다. 이러한 특징 중의 하나는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 글리세롤과 같은 다른 동결방지제의 동결방지 특성을 향상시킬 수 있는 것이다. 이것에 의해 글리세롤을 저농도로 첨가할 수 있고(또는 글리세롤을 첨가하지 않을 수 있고), 그 결과 독성의 부작용이 일어날 가능성이 감소되는 이점이 있다. 다른 특징은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 안정된 환경을 제공함으로써 동결방지 특성을 향상시키는 것이다.

본 실시예의 동결방지 조성물은 하나 이상의 안정제를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 어구 "안정제(stabilizing agent)"는 세포의 생존력을 증대시키는 제제를 의미한다. 본 실시예의 동결방지 조성물의 안정제 및 그 농도는 세포의 유형 및 세포의 환경에 따라 선택된다. 안정제의 농도는 일반적으로 약 1 μm 내지 약 1 mM, 또는 약 10 μm 내지 약 100 μm의 범위로 사용되는 것이 바람직하다.

일 실시예에서, 안정제는 배양 배지로부터 유해 물질들을 제거함으로써 세포의 생존력을 증대시킨다. 상기 안정제는 자연 발생 물질(즉, 세포의 성장 또는 사멸 중에 세포에 의해 분비된 물질) 및 배양 배지로부터 인위적으로 도입된 물질을 모두 제거할 수 있다. 예를 들면, 안정제는 활성 산소종 및 기타 자유 라디칼의 존재에 기인될 수 있는 유해한 영향을 중화시켜주는 라디칼 포착(radical scavenger) 화학약품 또는 항산화제일 수 있다. 이 물질들은 세포막(세포내막 및 세포외막)을 손상시킬 수 있으므로 세포 물질의 동결방지 및 회복에 심각한 장해가 된다. 이들 물질이 제거되지 않거나 무효화되지 않으면, 이들 물질이 세포의 생존력에 미치는 영향이 시간의 경과에 따라 누증되어 실제 보관기간을 심각하게 제한한다. 더욱, 세포가 사멸되거나 응력을 받음에 따라 추가의 유해한 물질들이 방출됨으로써 인접 세포들의 손상 및 사멸을 증대시킨다.

본 실시예에 따라 사용될 수 있는 산소 라디칼 포착제 및 항산화제의 예는 환원된 글루타티온, 1,1,3,3-테트라메틸우레아, 1,1,3,3-테트라메틸-2-티오우레아, 소디움 티오설페이트, 실버 티오설페이트, 베타인, N,N-디메틸포름아미드, N-(2-메르캅토프로피오닐)글리신, 베타-메르캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 프로필갈레이트, 디메르캅토프로판올, 아스코르빈산, 시스테인, 소디움 디에틸 디티오카보메이트, 스페르민, 스페르미딘, 페루라산, 세사몰, 레소시놀, 프로필갈레이트, MDL-71,897, 카다베린, 프트레신, 1,3- 및 1,2-디아미노프로판, 데옥시글루코오스, 요산, 살리실산, 3- 및 4-아미노-1,2,4-트리아졸, 벤조산, 히드록실아민 및 이들 제제의 조합 및 유도체를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

식물 세포의 동결방지에 유용할 수 있는 안정제는 에틸렌 생합성 및/또는 에틸렌 작용을 지연시키거나 실질적으로 방지하는 제제를 포함할 수 있다. 식물 세포는 응력을 받으면 독성 에틸렌을 방출한다는 것은 주지되어 있다. 따라서, 에틸렌의 생성이나 에틸렌의 작용을 방지하면 세포의 생존력 및 동결방지 공정으로부터의 세포의 회복이 더 향상될 수 있다.

본 실시예에 이용될 수 있는 에틸렌 생합성 억제제의 예는 리조비톡신(Rhizobitoxin), 메톡실아민(Methoxylamine) 염산, 히드록실아민 유사물질, 알파-카날린(Canaline), DNP (2,4- SDS (소디움 라우릴 설페이트) 디니트로페놀), 트리톤(Triton) X-100, 트윈(Tween) 20, 스페르민, 스페르미딘, ACC 유사물질, 알파-아미노이소부틸산, n-프로필 갈레이트, 벤조산, 벤조산 유도체, 페루라산, 살리실산, 살리실산 유도체, 세사몰, 카다바린, 히드로퀴논, 에일라(Alar) AMO-1618, BHA (부틸화 히드록시아니솔), 페닐에틸아민, 브라시노스테로이드, P-클로로머큐리벤조에이트, N-에틸말레이이미드, 로도아세테이트, 코발트, 염화물 및 기타 염, 비피리딜 아미노 (옥시아세트) 염화수은 및 기타 산성염, 살리실 알코올, 살리신 니켈, 염화물 및 기타 염, 카테콜, 플로로글루시놀(Pffloroglucinol), 1,2-디아미노프로판, 데스페리옥사민 인도메타신 1,3-디아미노프로판을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

에틸렌 작용의 억제제의 예는 은염, 벤질이소티오시아네이트, 8-히드록시퀴놀린 설페이트, 8- 히드록시퀴놀린 시트레이트, 2,5-노르보나디엔, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린, 트랜스-시클로옥텐, 7-브로모-5-클로로-8-히드록시퀴놀린, 시스-프로페닐포스폰산, 디아조시클로펜타디엔, 메틸시클로프로판, 2-메틸시클로프로판, 카르복실산, 메틸시클로프로판 카르복실레이트, 시클로옥타디엔, 시클로옥토딘 (클로로메틸) 및 시클로프로판을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

은 이온도 다양한 식물에서 강력한 항-에틸렌 제제로서 식물 조직의 수명 및 세포 배양의 수명을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 본 실시예에 따라 사용될 수 있는 은염의 예는 실버 티오설페이트, 실버 나이트레이트, 실버 클로라이드, 실버 아세테이트, 실버 포스페이트, 시트르산 트리-은염, 실버 벤조에이트, 실버 설페이트, 실버 옥사이드, 실버 나이트라이트, 실버 시아네이트, 유산 은염 및 펜타플루오로프로피오네이트 헥사플루오로포스페이트의 은염 및 톨루엔술폰산을 포함한다.

다른 실시예에서, 상기 안정제는 세포막을 안정화시킴으로써, 예를 들면, 지질 이중층(예, 스테롤, 인지질, 당지질, 당단백질) 내에 삽입시키거나 또는 막단백질(예, 이가 양이온)을 안정화시킴으로써, 세포의 생존력을 증대시킨다. 본 실시예의 동결방지 조성물에 이용될 수 있는 이가 양이온의 예는 CaCl₂, MnCl₂ 및 MgCl₂를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 소디움은 임의의 미량 농도를 초과하는 농도에서의 독성에 기인되어 사용도가 낮다. 바람직한 농도의 범위는 약 1 mM 내지 약 30 mM, 더 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 20 mM, 더 바람직하게는 약 10 mM 또는 15 mM이다. 이가 양이온도 냉동 온도를 저하시키고, 세포가 더 신속하게 빙점(freezing point)을 통과할 수 있게 한다.

또 다른 실시예에서, 안정제는 열충격을 방지하거나 최소화함으로써 세포의 생존력을 증대시킨다. 따라서, 안정제는 열충격 단백질일 수 있고, 또는 열충격 단백질 안정제(예, 전술한 이가 양이온)일 수 있다.

본 실시예의 동결방지 조성물은 성장 인자, 난황, 혈청(예, 소의 태아 혈청) 및 항생 화합물(예, 티로실, 겐타미신, 리코스펙틴, 및/또는 스펙티노마이신)을 더 포함할 수 있다.

추가하여, 본 실시예의 동결방지 조성물은 성장 배지 또는 성장 완충액을 포함할 수 있다. 선택된 배지 또는 완충액의 유형은 동결방지될 세포의 유형에 따라 달라지고, 예는 본 기술분야에 공지되어 있다. 허용가능한 세포 완충액의 적합한 예는 PBS와 같은 포스페이트를 주성분으로 하는 완충액 및 트리스 EDTA와 같은 트리스를 주성분으로 하는 완충액을 포함한다. 본 실시예의 동결방지 조성물에 첨가될 수 있는 성장 배지의 일예는 DMEM이다.

전술한 바와 같이, 본 실시예의 조성물은 동결방지 특성을 특징으로 하고, 따라서 세포 물질의 냉동보존에 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예에 따라, (a) 세포 물질을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포 물질을 냉동보존 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 세포 물질의 냉동보존 방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "냉동보존(cryopreserving)"은 세포 물질을 극저온에 저장함으로써 그 생존력을 유지하거나 보존하는 것을 의미한다. 전통적으로, 냉동보존은 동결방지제의 존재 하에서 수행된다. 세포 물질은 본 실시예의 교시에 따라 적어도 5년간 냉동보존될 수 있다.

본 명세서에 사용된 어구 "세포 물질(cellular matter)"은 세포를 포함하는 생물학적 물질을 의미한다.

본 실시예에 따른 냉동보존될 세포 물질의 예는 원핵 세포 물질 및 진핵 세포 물질(예, 포유류, 식물, 이스트), 세포의 체액(예, 척추액, 혈액, 양수액, 타액, 활액(synovial fluid), 질분비물 및 정액), 단리된 세포, 세포 배양물(예, 세포주, 초대 세포 배양물, 이스트 또는 박테리아 배양물), 세포 현탁물, 고정화 세포(예, 결합된 골격), 조직, 기관(organ) 또는 유기물을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

식물 세포 물질의 예는 성장 침상엽(growth needles), 잎사귀, 뿌리, 나무껍질, 줄기, 지하경, 칼러스(callus) 세포, 원형질체(protoplasts), 세포 현탁액, 기관(organs), 분열조직, 씨 및 배, 및 이들의 일부를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

특별한 실시예에서, 상기 세포 물질은 줄기세포, 정자세포 또는 난자(즉, 난모세포)를 포함할 수 있다.

다른 특별한 실시예에서, 상기 세포 물질은 순수한 것이거나 유전자 조작된 것일 수 있다.

세포 물질은 살아있는 유기체 또는 사체로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 세포 물질은 수술(예, 생검)이나 사정(ejaculate)에 의해 얻을 수 있다. 대안으로서, 세포 물질은 연구실에서 세포 배양에 의해 얻을 수 있다.

하기는 예시적인 세포 물질을 위한 전형적인 저온보존 과정을 요약한 것이다.

정액

정액은 정상의 남성, 정자 감소증의 남성, 기형 정자증의 남성, 또는 정자 무력증의 남성으로부터의 기증을 통해 얻는 것이 바람직하다. 그러나, 이것은 수술을 통해서도 얻을 수 있다. 상기 정자는 전형적으로 저온보존이 필요한 샘플이 회복 후에 수정이 실현될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해 기능 검사를 받는다. 정액 샘플은 전형적으로 본 실시예의 동결방지 조성물과 1:1의 비율로 혼합되고, 정적 기체상 냉각법을 이용하여 스트로우 내에서 0.5 ml의 분할량(aliquots)이 냉동된다.

배아( Embryo )

배아는 전형적으로 인비트로 수정 후 착상전(pre-implantation) 단계(예, 태반포 단계)에서 저온보존된다. 배아는 성공적인 저온보존의 최적화를 위해 일련의 기준(예를 들면, 1. 태반포 성장 속도 - 5일째의 성장률은 6일째의 성장률보다 더 커야 하고, 6일째의 성장률은 7일째의 성장률보다 더 커야 한다; 2. 세포의 총수 -세포의 총수는 (성장 일수에 따라) 60개 이상이어야 한다; 3. 영양외배엽(trophectoderm): 내세포괴(inner cell mass)의 상대적 세포 분배; 4. 할구 규칙성(blastomere regularity); 5. 단핵생성(mononucleation); 6. DNA 단편화)에 따라 선택된다.

표준적인 배아 저온보존 기법은 배아를 5-15분간 소디움을 주성분으로 하는 염 용액에 의해 희석된 본 실시예의 동결방지 조성물에 노출시켜 흡수시키는 단계를 포함한다. 다음, 상기 배아는 약 7℃까지 급냉(-2℃/분)되고, 이 온도에서 접종되고, 약 30℃ 이하의 온도까지 서냉된 다음, 액체 질소 내에 직접 돌입(plunged)된다. 제어된 속도로 냉각시키기 위해서는 전형적으로 프로그램이 가능한 냉동장치가 필요하다. 배아들은 급속 해동될 수 있다. 배아들은 세포가 수분 이상 노출되는 경우 세포에 대해 독성을 가지는 매우 높은 저온보존 농도(2M 내지 6M)만을 사용하여 급속 냉동되거나 글래스화될 수도 있다.

난모세포

저온보존을 위해 사용되는 난모세포는 성숙 세포이다. 성숙 난모세포는 외과수술에 의해 채취될 수 있다. 채취 전에 난모세포 자극이 또한 필요할 수 있다. 전형적인 난모세포가 다음의 기준에 기초하여 저온보존을 위해 선택되었다: 반투명, 형상 및 제1극체의 돌출. 난모세포의 저온보존을 위한 전형적인 프로토콜은 US 6,500,608 및 US 5,985,538에 기술되어 있다.

줄기세포

다능성 줄기세포의 보존은 세포가 생존능력이 있는 상태로 유지되어야 할 뿐 아니라 분화능력도 유지해야 하므로 (즉, 미분화 상태에 유지되어 있어야 하므로) 저온생물학의 추가의 난제이다. 따라서, 특정의 신호전달 경로가 소정의 위치에 유지되어야 하고, 냉동 및 건조에 관련된 스트레스는 미숙(premature)을 유발하거나 또는 잘못된 분화를 유발해서는 안 된다. 해동 직후의 세포의 미분화 표현형(differentiationless phenotype)을 유지하는 안정제가 포함될 수 있다.

전형적인 줄기세포의 저온보존 프로토콜은 (1) 접착 줄기세포 콜로니에 대해 적용되는 공지의 서냉 프로토콜 및 (2) 접착 줄기세포 콜로니 및 자유 현탁된 줄기세포괴(stem cell clumps)를 위한 글래스화(vitrification) 프로토콜을 포함한다.

피부

피부는 전형적으로 사체 또는 건강한 개인으로부터 채취된다. 동물 피부 조직은 또 이식(grafting)에 이용하기 위해 저온보존시킬 수 있다. 피부는 전형적으로 저온보존 전 또는 해동 후에 조직 유형(tissue-typed)이다. 피부 세포는 저온보전 전에 인비트로에서 배양 및 성장될 수 있다. 저온보존은 전형적으로 급속해동 프로토콜을 필요로 한다. 이 프로토콜의 성패는 창상상(wound bed)에 취해진 이식에 의해서 또는 세포 생존능력 분석에 의해서 판정된다.

난소 조직

난소 조직(전체 난소 또는 그 일부분)은 건강한 여성 또는 건강하지 않은 여성으로부터 채취될 수 있다. 난소 조직의 저온보존이 유리할 수 있는 질환의 예는 암, 악성 질환(예, 지중해빈혈; thalassemia) 및 특정의 자기면역 질환을 포함한다. 조기 폐경의 병력을 가지는 건강한 여성도 난소 조직의 저온보존을 희망할 수 있다. 이 조직은 채취 후 또는 해동 후에 악성종양 검사가 수행될 수 있고, 후속의 자기이식(auto-grafting)을 위한 안정성 분석이 수행될 수 있다.

이 세포 물질은 저온보존 공정을 촉진하기 위한 조건이 부여되거나 본 실시예의 조성물과 직접 접촉될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "조건부여(conditioning)"는 나노구조 및/또는 동결방지제의 독성 효과 및/또는 저온의 독성 효과로부터 세포 물질을 보호하는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 세포 물질은 안정제를 이용하여 조건부여될 수 있고, 이어서 본 실시예의 조성물의 존재 하에서 배양될 수 있다. 대안으로서, 본 실시예의 조성물이 먼저 세포에 가해진 다음 안정제 또는 기타 동결방지제가 첨가될 수 있다.

안정제의 예는 위에 기술되어 있다.

추가하여 또는 대안으로서, 상기 세포 물질은 동결방지 전에 저온에 순화(cold acclimatized)될 수 있다. 이 저온 순화는 안정제를 이용한 조건 부여와 동시에 또는 그 후에, 그리고 본 실시예의 조성물을 이용한 배양의 전 또는 배양과 동시에 수행될 수 있다. 저온 순화는 세포의 대사작용을 상당히 지연시킴과 동시에 일부의 더욱 중대한 온도변화를 통해 급격한 온도변화의 충격을 저감시킴으로써 저온보존 공정에 대비하기 위한 세포의 준비과정이다. 중대한 온도 범위는 세포 손상의 위험이 가장 높은 온도 범위, 예를 들면, 얼음 결정 형성의 임계 온도 부근이다. 본 기술분야의 통상 전문가에게 공지되어 있는 바와 같이, 이들 온도는 용액의 조성에 따라 다소 변화한다(대부분의 세포 배양 배지의 주성분인 물에 있어서, 얼음 결정 형성 및 재형성은 약 0℃ 내지 약 -50℃에서 발생한다).

저온순화에 의해 내인성 용질이 축적되고, 이 내인성 용질은 임의의 주어진 삼투압 포텐셜(osmotic potential)에서 세포의 탈수의 정도를 감소시키고, 극단의 탈수 중에 단백질 및 세포막의 안정화에 기여한다.

저온순화는 계단형 또는 점진형으로 실행될 수 있다. 계단형의 단차(steps)는 세포가 손상됨이 없이 더욱 저온에서 순화될 수 있는 충분한 시간 동안 약 0.5℃ 내지 약 10℃의 감소하는 증분으로 할 수 있다. 점진형이든 계단형이든 온도의 기울기는 세포가 가능한 신속하게 빙점을 통과하는 기울기로 결정된다. 순화 온도는 약 1℃ 내지 약 15℃의 범위가 바람직하고, 약 2℃ 내지 약 10℃의 범위가 더 바람직하고, 약 4℃가 더 바람직하다. 세포는 강하된 온도까지 점진적으로, 계단형 또는 연속형으로, 또는 급속하게 순화될 수 있다. 순화 기법은 통상 전문가들에게 공지되어 있고, 시판되는 순화장치(acclimators)를 포함한다. 점진적 순화는 목표 온도가 달성될 때까지 1시간당 약 1℃만큼 배양 온도를 저감시키는 것을 포함한다. 점진적 순화는 가장 민감하고 동결방지가 곤란한 것으로 간주되는 세포에 대해 가장 유용하다. 계단형 순화는 세포를 일정한 시간 동안 저온에 방치하는 단계, 및 후속하여 추가의 저온에 다른 일정한 시간 동안 방치하는 단계를 포함한다. 이들 단계는 필요에 따라 반복될 수 있다.

세포 물질의 동결건조도 동결방지 전에 수행될 수 있다. 동결건조는 진공 증발에 의해 세포의 수분 함량을 감소시키는 것을 목적으로 한다. 진공 증발은 세포를 저기압의 환경 하에 방치하는 단계를 포함한다. 원하는 수분 제거의 속도에 따라, 약 -30℃ 내지 -50℃의 온도범위에서 가동하는 저기압은 100토르, 1토르, 0.01 토르 이하일 수 있다. 저기압 조건 하에서, 수분 증발 속도는 세포 내의 수분의 최대 65%가 밤새 제거될 수 있는 정도로 증대된다. 최적의 조건에서, 수분 제거는 수시간 이하 내에 완료될 수 있다. 증발 중의 열 손실은 세포를 냉각 상태에 유지시켜 준다. 진공의 레벨을 신중하게 조절함으로써, 세포는 진공 증발 공정 중에 저온 순화 온도에 유지될 수 있다. 강력한 진공은 신속한 수분의 제거를 가능하게 하지만 세포가 빙결될 우려가 있다.

빙결(Freezing)은 세포에 직접 열을 가하거나 진공의 레벨을 조절하는 것에 의해 제어될 수 있다. 세포가 증발실 내에 장입된 초기에는 세포 내의 잔열이 빙결을 방지하므로 고진공이 가해질 수 있다. 탈수가 진행됨에 따라 세포 온도가 하강하므로, 빙결을 방지하기 위해 진공이 감소되거나 열이 가해질 수 있다. 반건조된 세포는 증발실 내에서 부서지는 경향이 있을 수 있다. 이 경향은 처리의 말기에 공기류가 증발실 내로 복귀될 때 특히 가능성이 높다. 공기류가 반건조 세포에 접근하는 경우, 공기류는 세포를 공기 중에 부유시키고 샘플의 2차오염을 유발할 수 있다. 이와 같은 혼란을 방지하기 위해 증발 냉각은 세포가 원심력에 의해 튜브 내에 구속된 상태로 건조되는 진공 원심분리기 내에서 수행될 수 있다. 이 공정에서 제거되는 수분의 양은 주기적으로 세포의 건조 중량을 측정함으로써 관측될 수 있다.

동결방지 전의 저온 순화의 대안으로서 열충격(heat shock) 처리가 수행될 수도 있다. 열충격 처리는 스트레스에의 적응에 관련되는 것으로 생각되는 특정 단백질(열충격 단백질)의 데노보 합성(de novo synthesis)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 추가하여, 열충격 처리는 세포막 및 단백질을 안정화시키는 작용을 한다. 이것은 저온보존 후의 세포의 생존율을 약 20% 내지 약 40% 만큼 향상시키는 경향이 있다. 이 과정은 세포 물질(조건부여된 것 또는 조건부여되지 않은 것)을 수조 쉐이커(water-bath shaker) 내에서 약 31℃ 내지 약 45℃의 온도범위, 바람직하게는 약 33℃ 내지 약 40℃의 온도범위, 더 바람직하게는 약 37℃에서 배양하는 것을 포함한다. 배양은 수분 내지 수시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 6시간, 더 바람직하게는 약 2시간 내지 약 4시간 수행된다.

전술한 바와 같이, 본 실시예의 방법은 세포 물질을 본 실시예의 조성물과 접촉시키는 단계(배양하는 단계)에 의해 수행된다. 바람직하게, 상기 접촉단계는 나노구조의 세포내 농도 및/또는 세포외 농도를 평형화하는 작용을 한다. 본 실시예의 조성물은 세포 물질에 직접 첨가되거나 또는 세포 물질이 배양되는 배지 내에 희석될 수 있다. 평형화에 필요한 시간을 최소화하기 위해, 접촉단계는 실온에서 수행될 수 있다. 그러나, 최적 온도 및 장입을 위한 다른 조건은 세포의 생존을 유지하는 배지, 광의 강도 및 산소 농도와 같은 조건들과 일치하는 것이 바람직하다.

본 실시예의 조성물은 세포 물질에 직접 첨가되거나 또는 배양물 배지와 같은 세포 배양 배지 내에 희석될 수 있다. 또한 계단형 배양(접촉단계)이 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 세포 물질이 증대하는 농도의 나노구조의 존재 하에서 배양되도록 계단형 접촉단계가 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 세포 물질은 최초단계에서 1리터당 10¹⁰ 개의 나노구조를 포함하는 조성물과 접촉될 수 있고, 최종단계에서 1리터당 10¹⁵ 개의 나노구조를 포함하는 조성물과 접촉될 수 있다.

계단형 접촉단계는 단일 투여 장입(single dose loading)에 비해 다소 약하므로 나노구조를 세포에 이송하는 것을 촉진하는 것을 목적으로 하는 경우가 있다. 계단형 장입을 위한 첨가들 사이의 시간 증분 또는 시간 간격은 수분 내지 수시간 이상의 범위, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 10분, 더 바람직하게는 약 1분 내지 약 5분, 더 바람직하게는 약 1분 내지 약 2분이다. 계단형 접촉단계에서의 첨가 횟수는 전형적으로 제한이 없으며, 극히 작은 횟수로부터 아주 많은 횟수까지의 범위일 수 있다. 바람직하게, 첨가횟수는 약 20회 이하이고, 더 바람직하게는 약 10회 이하, 더 바람직하게는 약 5회 이하이다. 시간 간격 및 간격의 횟수는 특정 세포의 유형 및 첨가제에 따라 본 기술분야의 통상 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 배양 시간은 실제로 수분 내지 수시간의 범위이다.

본 실시예의 조성물 내의 동결방지제 또는 나노구조는 접촉단계가 세포 물질의 글래스화를 촉발시키도록 충분한 고농도일 수 있다.

글래스화 공정은 세포 물질을 액체 질소 내에서 급냉시키기 전에 농축 용액에 직접 노출시키는 것에 의한 세포 물질의 점진적 또는 계단형의 삼투적인 탈수를 포함한다.

글래스화 단계의 전, 세포 물질은 농도가 글래스화를 유발할 만큼 충분히 높지 않은 본 실시예의 조성물을 이용하여 배양시킬 수 있다. 이것은 세포막 및 경우에 따라 단백질의 탈수에 유발되는 불안정화를 방지하는 역할을 주로 한다. 필요시 이들 조성물은 글래스화 전에 제거될 수 있다. 이 조성물이 잔류하는 경우, 나노구조의 농도는 글래스화를 촉진시키기 위한 점진형 또는 계단형에서 증대될 수 있다. 또한 전술한 계단형 또는 점진형에서 세포 물질과 초기에 접촉하기 위해 사용되는 동결방지제 이외의 다른 동결방지제가 첨가되거나, 또는 대안으로서 동일한 동결방지제가 더욱 고농도로 첨가될 수 있다. 동결방지제의 농도는 약 4M 내지 약 10M, 또는 약 25 중량% 내지 약 60중량%의 범위일 수 있다. 이것은 샘플 세포의 극단적인 탈수를 발생시킨다. 7M을 초과하는 용액은 전형적으로 90%를 초과하는 삼투활성수(osmotically active water)를 세포로부터 제거한다; 그러나 각 제제에 대한 정확한 농도는 실험에 의해 결정될 수 있다. 글래스화를 위해 사용될 수 있는 동결방지제는 DMSO, 프로필렌 글리콜, 마니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄에디올, 포름아미드, 프로판에디올 및 이들 물질의 혼합물을 포함한다.

동결방지제 또는 나노구조의 고농도에의 노출의 유해한 결과를 최소화하기 위해, 탈수는 약 0℃ 내지 약 4℃의 온도 및 가능한 짧은 노출시간에서 수행될 수 있다. 이 조건 하에서, 물과 용질의 투과계수의 차로 인해 추가의 동결방지가 세포 물질 내로 상당량 유입되지 않는다. 그 결과, 세포 물질은 수축된 상태에 유지되고, 글래스화를 위해 필요한 세포질 농도의 증대가 탈수에 의해 얻어진다.

본 실시예의 조성물에 의해 수축된 세포 물질은 저온보존 온도까지 냉동시키는 것에 의해 저온보존된다. 냉동의 속도는 급속 냉동 중의 기계적 힘에 의해 세포에 유발되는 손상과 저속 냉동 중에 삼투압에 의해 세포에 유발되는 손상 사이에 균형을 유지시켜야 한다. 다양한 세포들에 대한 다양한 최적의 냉각 속도들이 알려져 있다. 다양한 최적의 냉각 속도는 세포의 빙핵 형성 상수(ice nucleation constant)의 차이 및 다양한 세포 유형에 대한 세포막의 상변이 온도의 차이에 기인된다는 것이 제안되어 있다(PCT 공개 WO 98/14058; Karlsson et al., Biophysical J 65: 2524-2536, 1993). 본 기술분야에서 -1℃/분 내지 -10℃/분의 냉동 속도가 선호된다(Karlsson et al., Biophysical J 65: 2524-2536, 1993). 냉동 속도는 얼음 결정의 형성을 억제하도록 충분히 빠른 속도이어야 한다. 냉동 시간은 약 5분, 또는 4분, 3분, 2분, 또는 1분 이하이어야 한다. 임계 냉동 시간은 단일 세포의 시점에서 측정되어야 한다. 예를 들면, 대형 세포 샘플을 액체 질소 내에 투입하기 위해 10분이 소요될 수 있으나, 이 방법에 의해 개별 세포는 신속하게 냉동된다.

전술한 바와 같이, 세포 물질은 글래스화될 수 있다. 상기 조건 하에서, 세포 물질은 세포간 얼음 형성 또는 세포내 얼음 형성을 겪지 않고 극단의 냉각 속도로 냉각될 수 있다. 급냉은 얼음의 형성에 영향을 미치는 모든 인자들을 미연에 방지할 뿐 아니라, 또한 일부 세포 물질의 저온 감수성 문제를 회피한다.

세포 물질은 직접 냉동될 수 있다. 직접 냉동 방법은 세포를 액체 질소 또는 액체 헬륨과 같은 극저온도의 유체 내에 직접적으로 적하하는 것(dripping), 분사하는 것(spraying), 주입하는 것(injecting), 또는 투하(pouring)하는 것을 포함한다. 세포 물질은 액체 질소에 의해 냉각된 강철 블록과 같은 냉각된 고체에 직접 접촉시킬 수도 있다. 극저온의 유체를 세포 물질 상에 직접 붓는 것도 가능하다. 이 직접 방법은 또 세포를 극저온의 기체(공기를 포함)와 접촉시키는 것도 포함한다. 질소 또는 헬륨의 극저온 기체류는 세포 현탁물 상에 직접 송취되거나 세포 현탁물 내에 기포로서 도입될 수 있다. 간접 방법은 세포를 용기 내에 장입하는 단계 및 상기 용기를 극저온의 고체, 액체, 또는 기체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 용기의 예는 극저온에서 견딜 수 있는 플라스틱 바이얼, 유리 바이얼, 앰플을 포함한다. 간접 냉동 방법을 위한 용기는 공기 또는 액체에 대해 불침투성일 필요는 없다. 예를 들면, 플라스틱 백 또는 알루미늄 포일이 적합하다. 더욱, 상기 용기는 극저온에서 견딜 수 있는 능력을 반드시 가질 필요는 없을 수도 있다. 극저온 하에서 균열되지만 실질적으로 손상되지 않는 플라스틱 바이얼도 사용이 가능하다. 세포는 또 금속 포일의 일측면 상에 세포의 샘플을 재치하고, 금속 포일의 타측면 상에는 극저온의 기체, 고체, 또는 액체가 접촉된 상태에서 냉동될 수도 있다.

본 실시예의 조성물은 저온보존을 위해 적합한 용기 내에 수용될 수 있다. 이 용기는 예를 들면 나노구조 및 후술되는 바와 가은 추가의 동결방지제를 포함하도록 설계되는 화학물질에 대해 불투성인 것이 바람직하다. 이 용기는 극저온에 견딜 수 있는 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 이 용기는 냉동/해동 사이클 중에 다양한 성분들의 체적 변화를 흡수할 수 있도록 가요성인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 본 실시예의 용기는 개방된 튜브를 포함한다.

저온보존된 세포 물질은 저온보관을 위해 적합한 온도에 유지될 수 있다. 최종 보관 온도는 세포의 유형에 의존하지만, 본 기술분야에서 드라이아이스 및 액체질소 냉동장치에 의해 유지되는 온도로서 대략 -80℃ 내지 -196℃의 범위가 공지되어 있다. 바람직하게, 세포는 액체질소(약 -196℃), 액체 아르곤, 액체 헬륨 또는 액체 수소 내에 유지된다. 이들 온도는 세포의 장기 보관에 가장 적합하고, 더욱 온도 변화가 최소화될 수 있다. 장기 보관은 세포의 회복시 세포 생존능력의 상당한 손실이 없는 상태로 수개월, 바람직하게는 수년일 수 있다. 수개월 미만의 단기 보관도 필요할 수 있고, 보관 온도는 -150℃, -100℃ 또는 심지어 -50℃가 사용될 수 있다. 드라이아이스(이산화탄소) 및 공업용 냉동장치를 이용하여 상기 온도를 유지하는 것이 가능하다.

적절한 해동 및 회복은 세포의 생존능력에 필수적이고, 또 세포가 냉동되었을 당시의 상태와 실질적으로 동일한 상태로 세포를 회복시키는데 필수적이다. 세포 물질의 해동 중에 동결방지된 세포 물질의 온도가 증대함에 따라, 작은 얼음의 결정들이 응집하여 크기가 증대한다. 대형 세포내 얼음 결정들은 세포의 생존능력에 일반적으로 유해하다. 이것을 방지하기 위해, 동결방지된 세포 물질은 가능한 신속하게 해동시켜야 한다. 가열 속도는 적어도 약 30℃/분 내지 60℃/분일 수 있다. 90℃/분, 140℃/분, 또는 200℃/분 이상과 같은 더 빠른 가열 속도도 사용될 수 있다. 신속한 가열이 요구되지만, 대부분의 세포는 실온을 상당히 초과하는 배양 온도에서 생존능력이 감소된다. 과열을 방지하기 위해, 세포 온도가 모니터링되는 것이 바람직하다. 전도, 대류, 복사, 전자기 방사 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 가열 방법이 채용될 수 있다. 전도 방법은 수조 내에의 침지, 가열 블록에의 배치 또는 직화에의 직접 배치를 포함한다. 대류 방법은 가열총(heat gun) 또는 오븐의 사용이 포함된다. 복사 방법은 예를 들면 가열 램프 또는 오븐(예, 대류 오븐 또는 복사 오븐)을 포함한다. 전자기 방사는 마이크로파 오븐 및 유사 장치의 사용을 포함한다. 일부는 장치는 이들 방법의 조합에 의해 가열할 수 있다. 예를 들면, 오븐은 대류 및 복사에 의해 가열한다. 가열은 세포 및 그 주변의 용액이 0℃ 이상의 액상이 되었을 때 즉각 종료하는 것이 바람직하다. 동결방지된 세포 물질은 나노구조 및 필요에 따라 빙점을 억제하는 기타 제제의 존재 하에서 냉동되므로, 냉동된 세포는 0℃ 미만의 온도, 예를 들면, 약 -10℃, -20℃, -30℃ 또는 -40℃와 같은 온도에서 액화될 수 있다. 동결방지된 세포의 해동은 이들 온도 중의 임의의 온도 또는 0℃를 초과하는 온도에서 종료될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 희석 및 후속되는 제거는 전형적으로 가능한 신속하게 수행되고, 동결방지된 세포 물질의 해동 후 가능한 신속하게 수행된다. 조성물 내의 나조구조 또는 동결방지제의 농도가 고농도인 경우, 삼투압 팽창을 최소화하면서 현탁 배지의 희석을 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 현탁 배지의 희석 및 세포 물질 내로부터의 나노구조 또는 기타 동결방지제의 유출은 고침투성 배지에서의 희석 또는 계단형 희석에 의해 수행될 수 있다.

해동된 세포는 세포가 정상적으로 기능할 수 있는 상태로, 또 세포 물질이 해동 후 성장되어야 하는 것인 경우에는 그 성장을 촉진시켜주는 상태로 점진적으로 순화될 수 있다. 동결방지제는 세포독성, 세포증식 억제성 또는 돌연변이원성을 가질 수 있고, 이 동결방지제는 세포에 유해하지 않은 해동 속도로 해동된 세포 물질로부터 제거되는 것이 바람직하다. 재현탁 및 원심분리, 투석, 연속 세척, 바이오레미디에이션(bioremediation) 및 화학약품에 의한 중화, 또는 전자파방사와 같은 다수의 제거 방법이 사용될 수 있다. 나노구조 및 기타 동결방지제의 신속 제거는 세포 스트레스 및 세포 사멸을 증대시킬 수 있고, 따라서 제거 단계는 점진적으로 실시되어야 한다. 제거 속도는 소량의 나노구조 또는 동결방지제를 함유하는 용액을 이용한 연속 세척에 의해 제어될 수 있다.

해동 및 해동 후처리는 생존능력을 확보하고 유전적 손상 및 세포 손상을 최소화하기 위해 안정제(전술한 안정제)의 존재 하에서 수행될 수 있다. 안정제(예를 들면, 2가 양이온 또는 에틸렌 억제제)는 저온보존의 결과 발생되는 손상을 일으키는 제제를 감소, 제거 또는 중화시켜준다. 이와 같은 손상을 일으키는 제제는 자유 라디칼, 산화제 및 에틸렌을 포함한다.

세포 물질은 해동 후에 생존하는 세포의 백분율을 증대시키는 완전 기능성(fully-functioning) 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 낮은 임신 잠재력을 가진 비정상 정자 세포는 정상 정자 세포에 비해 본 실시예의 동결방지 조성물의 존재 하에서 냉동 후에 저하된 생존율을 가지는 것이 예상된다. 따라서, 본 실시예의 조성물 내의 기능성 정자 세포 물질 및 비기능성(non-functioning) 정자 세포 물질의 혼합물을 동결방지 처리하면 기능성 세포: 비기능성 세포의 비율이 증대하고, 그 결과 해동 후의 수정의 가능성이 향상된다.

세포 물질 내의 세포의 적어도 10%(더 바람직하게는 20%, 더 바람직하게는 30%, 더 바람직하게는 40%, 더 바람직하게는 50%, 더 바람직하게는 60%, 더 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%)가 완전 기능성인 것이 바람직하다(예, 정자 세포는 운동성이고, 난모세포에 수정이 가능하고, 분열된 DNA를 포함해서는 안 된다).

해동 후, 세포 물질은 필요에 따라 생존능력 분석이 실시될 수 있고, 또는 직접 이식에 사용될 수 있다. 생존능력은 조직학적 방법 및 기능적 방법에 의해 측정될 수 있다. 세포는 예를 들면, 형태학적 인덱스, 생체 염색 배제법, 및 세포내 pH법을 포함하는 본 기술분야에 공지된 조직학적 방법에 의해 분석된다.

하나 이상의 인비트로 분석은 세포 물질의 기능성을 설정하기 위해 사용이 바람직하다. 본 기술분야에 공지된 분석법 및 진단 실험이 이들 목적을 위해 사용될 수 있다. 참조예, METHODS IN ENZYMOLOGY, (Abelson, Ed.), Academic Press, 1993. 예를 들면, ELISA(효소-결합된 면역흡착제 분석), 크로마토그래피 분석 또는 효소 분석, 또는 분비 생성물에 대해 특이적인 생물학적 분석이 사용될 수 있다.

구체적으로, 세포 물질이 정자를 포함하는 경우, 그 상태는 파동 분석, 운동성 분석, 및 생존수 계수(viability count)에 의해 분석될 수 있다. 예를 들면, 정액의 전체 현미경 분석은 저배율(예, 10배) 하에서 파동을 분석하고, 파동의 점수를 0 내지 5로 매기고, 점수가 0인 경우 무파동(no wave motion)이고, 점수가 5인 경우 와류를 동반한 급속 파동(rapid wave motion)으로 함으로써 수행될 수 있다. 둘째, 고배율(예, 40배) 하에서, 운동 정자의 수가 계수되고, 총 정자수에 대한 백분율로서 점수가 매겨질 수 있다. 이 백분율에 농도/총수를 곱함으로써 명백하게 생존능력을 가지는 정자의 수가 결정된다. 정자의 농도는 다양한 공정으로 측정될 수 있다: 0.9%의 생리식염수를 이용하여 1:10으로 희석된 정액을 수용하는 마이크로큐벳을 스퍼매큐 광도계(Spermacue photometer) 내에서 분석하거나; 또는 일련의 정자 희석액(1:1000)이 제조되고, 이것이 혈구계에 의해 계수된다.

생존능력이 있는 정자의 비율의 백분율은 15 리일드롭(lilldrop)의 생체/사체 염색(Morphology Stain, Lane Manufacturing, Inc., Denver Colo.)된 현미경 슬라이드 상에 적하된 15 μl의 정자 액적 샘플에 의해 측정될 수 있다. 2개의 액적을 혼합한 후 얇은 도포표본(smear)이 제조되었다. 이 샘플은 공기 중에서 건조된 후, 100 배의 유침렌즈(oil immersion lens)를 구비하는 현미경 하에서 생체염색색소를 이용하여 염색하는 것에 의해 200개의 개별 정자가 계수되었다.

정자의 완전성(integrity)은 스퍼맥 염색(Spermac stain)을 이용하여 정자의 선체모(acrosomal cap) 및 꼬리의 형태를 관찰함으로써 분석될 수 있다. 15 μl의 정자 액적을 가지는 다른 현미경 슬라이드가 준비되고, 공기 중에서 건조되고, 제조회사의 설명서에 따라 스퍼맥을 이용하여 염색된다. 이 샘플의 전체적인 질 및 형태는 선체모의 무상성(intact) 또는 비무상성(non-intact)을 점수화하는 것 및 200개의 개별 정자 당 정상 꼬리의 개수를 계수하는 것에 의해 측정된다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 약학적 제제의 인비보 흡수를 향상시킨다.

펩티드, 단백질 및 핵산과 같은 생물학적 이용률(bioavailability)이 낮은 많은 약학적 제제의 개발은 거대분자를 그 적절한 세포 표적에 이송하는 것과 같은 새롭고 효과적인 이송 방법의 개발의 필요성을 발생시켰다. 특이적 폴리펩티드 성장인자의 사용 또는 결여되거나 불완전한 유전자를 대체 또는 보완하기 위한 특이적 유전자의 사용에 기초한 치료학은 이와 같은 새로운 이송 시스템을 필요로 하는 치료학의 예들이다. DNA와 상호작용하여 유전자의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 치료용 제제제도 또한 세포막의 전역에 걸쳐 인비보 흡수를 향상시킬 수 있는 이송 시스템을 필요로 한다. 이와 같은 치료의 임상적 적용은 새로운 이송 시스템의 신뢰성 및 효율에 의존할 뿐 아니라, 그 안정성 및 이 시스템에 내재하는 기술이 대규모 약학 생산, 보관 및 약학적 제제의 유통판매에 적용될 수 있는 용이성에도 의존한다.

나노입자 기술은 다양한 영역에서 용도가 발견되었으나, 약리학 및 약물 송달에서는 최소의 용도만을 가지고 있다. 종래, 나노입자는 항암제 및 기타 약물의 담체로서 제안되어 왔다[Couvreur et al., (1982) J. Pharm. Sci., 71: 790-92]. 종래, 특수 질환의 치료를 위해 나노입자의 사용에 대한 다른 시도들이 추구되어 왔다. 전형적으로, 나노입자는 약학적 제제가 충만되어 있다.

비록 나노입자가 약물 이송계를 위한 유용한 도구로서 유망한 것이었으나, 많은 문제를 가지고 있다. 미해결된 문제들 중의 일부는 치료용 제제를 갖춘 입자의 로딩(loading)에 관련된다. 또한, 나노입자가 망내계(reticuloendothelial system; RES)의 세포에 의해 흡수(taken up)되므로 로딩된 나노입자의 생물학적 이용률이 저하된다. 따라서, 상기 한계를 회피하는 나노입자 수송 시스템을 가지는 것이 매우 유리할 것이다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 세포막을 통한 치료용 제제의 인비보 침투(in vivo penetration)를 향상시킨다. 예를 들면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 피부를 통한 치료용 제제의 침투를 향상시킬 수 있다. 또, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 박테리아 내로 항생제의 흡수를 향상시킬 수 있고, 그 결과 그 생물학적 이용률을 증대시킨다.

본 발명의 일부의 실시예의 일 관점에 따라, 활성 성분으로서 적어도 하나의 약학적 제제 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "활성 성분으로서의 약학적 제제(pharmaceutical agent as an active ingredient)"는 약학적 조성물의 생물학적 효과에 책임이 있는 치료용 제제, 화장품 제제, 진단용 제제를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 양자 모두 명세서에서 기술된 부화된 나노구조 조성물을 구비하는 하나 이상의 활성 성분의 제제를 의미한다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 약학적 제제의 인비보 흡수를 향상시키도록 조제된다. 이론에 구애됨이 없이, 나노구조들 사이의 장범위 상호작용은 본 실시예의 약학적 조성물의 특유의 특성에 도움을 준다. 이러한 특성 중의 하나는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 소수성이고, 따라서 세포막을 통해 활성 제제의 침투를 향상시킬 수 있는 것이다. 예를 들면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 세포 내로의 뉴클레오티드의 흡수, 박테리아 세포 내로의 파아지 흡수 및/또는 항생물질의 흡수를 향상시킬 수 있다.

따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 세포막, 세포소기관막, 혈액 관문(blood barrier) 또는 조직과 같은 임의의 생물학적 장벽을 통한 침투를 향상시킨다. 예를 들면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 피부를 침투하도록 조제될 수 있다.

본 실시예의 약학적 제제는 위에서 상술된 바와 같이 치료용 제제, 화장품 제제 또는 진단용 제제일 수 있다.

치료용 제제의 구조적 분류(classes)의 예는 무기 화합물 또는 유기 화합물; 소형 분자(즉, 1000달톤 미만) 또는 대형 분자(즉, 1000 달톤을 초과); 생체분자(예, 단백질(예, 효소 또는 호르몬) 펩티드, 폴리펩티드, 번역 후 수식된 단백질, 항체, 등을 포함하는 단백질성 분자. 그러나, 이들에 한정되지 않음) 또는 핵산 분자(예, 이중사슬 DNA, 단일사슬 DNA, 이중사슬 RNA, 단일사슬 RNA, 또는 삼중나선 핵산 분자) 또는 화학약품을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 치료용 제제는 임의의 공지의 유기체(동물, 식물, 박테리아, 균류, 원생생물 또는 바이러스를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다)로부터 유도되거나 합성 분자의 라이브러리로부터 유도되는 세포 제제일 수 있다. 바이러스성 치료적 세포 제제의 예는 박테리오파아지이다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 박테리아 내로의 박테리오파아지의 흡수를 증대시킬 수 있다.

뇌질환의 치료에 특히 유용할 수 있는 치료용 제제의 예는 항생제, 항종양제, 항염증제, 구충제, 항진규제, 항항산균제, 항바이러스제, 항혈액응고제, 방사선치료용 제제, 화학요법제, 세포독성제, 혈관확장제, 항산화제, 소생제(analeptic agents), 항경련제, 항히스타민제, 신경영양제, 신경치료용 제제, 항불안진정제, 흥분제, 진정제, 진통제, 마취제, 피임약, 신경전달물질제, 신경전달물질제 유사물질, 제거제 및 수태능력향상제를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 신경전달물질제의 예는 아세티콜린, 도파민, 노프레피네프린, 세포토닌, 히스타민, 에피네프린, 감마-아미노부틸산(GABA), 글리신, 글루타메이트, 아데노신, 이노신 및 아스파르테이트를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

신경전달물질제 유사물질은 신경전달물질 애고니스트 및 앤테고니스트를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 신경전달물질 애고니스트의 예는 알모트리프탄(almotriptan), 아니라세탐(aniracetam), 아토목세틴(atomoxetine), 벤세라지드(benserazide), 브로모크리프틴(bromocriptine), 부프로피온(bupropion), 카베르골린(cabergoline), 시탈로프람(citalopram), 클로미프라민(clomipramine), 데시프라민(desipramine), 디아제팜(diazepam), 디히드로에르고타민(dihydroergotamine), 독세핀 듈로섹틴(doxepin duloxetine), 엘레트리프탄(eletriptan), 에시탈로프람(escitalopram), 플루복사민(fluvoxamine), 가바펜틴(gabapentin), 이미프라민(imipramine), 모클로베미드(moclobemide), 나라트리프탄(naratriptan), 네파조돈(nefazodone), 네피라세탐 아캄프로세이트(nefiracetam acamprosate), 니세르골린(nicergoline), 노르트리프틸린(nortryptiline), 파록세틴(paroxetine), 페르골리드(pergolide), 프라미펙솔(pramipexole), 리자트리프탄(rizatriptan), 로피니롤(ropinirole), 세르트랄린(sertraline), 시부트라민(sibutramine), 수마트리프탄(sumatriptan), 티아가빈(tiagabine), 트라조돈(trazodone), 벤라팍시네(venlafaxine), 및 졸미트리프탄(zolmitriptan)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용될 수 있는 신경전달물질 앤테고니스트의 예는 6 히드록시도파민(6 hydroxydopamine), 펜톨라민(phentolamine), 라우월파 알칼로이드(rauwolfa alkaloid), 에티클로프리드(eticlopride), 설피리드(sulpiride), 아트로핀(atropine), 프로마진(promazine), 스코포타민(scopotamine), 갈라닌(galanin), 클로페니라민(chlopheniramine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 디헤닐히드라민(dihenylhydramine), 메틸세르지드(methylsergide), 올란자핀(olanzapine), 시탈로프람(citalopram), 플루옥시킨(fluoxitine), 플루옥사민(fluoxamine), 케탄세린(ketanserin), 오리단제트론(oridanzetron), p 클로페닐알라닌(p chlophenylalanine), 파록세틴(paroxetine), 세르트랄린(sertraline) 및 벤라팍신(venlafaxine)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에서 특히 유용한 것은 체 내에서 특이적 효과를 가지지만 정상 조건 하에서 세포막 또는 혈액 관문을 침투하기 어려운 펩티드(예, 뉴로펩티드)와 같은 치료용 제제다. 또한, 박테리아(예, 그램 음성 박테리아)는 자신들의 세포막의 침투성을 감소시키는 것에 의해 아미노글루코시드, β 락탐 및 퀴놀린과 같은 항생제에 대한 내성을 증가시킬 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 첨가는 이들 박테리아에 대한 인비보 흡수를 증대시킬 수 있고, 그 결과 항생제의 치료효과를 향상시킬 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 다른 예는 고혈압, 심장마비 및 죽상동맥경화의 치료를 위한 EDTA와 같은 킬레이트화 제제와 함께 사용하는 것이 특히 유용하다. 킬레이트화 제제는 동맥 플라그로부터 칼슘을 제거하는 것에 관여한다. 그러나, 동맥의 세포막은 킬레이트화제에 대하여 비교적 불투성이다. 따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 킬레이트화제와 결합함으로써 그 생물학적 이용률이 크게 증가한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴로펩티드(neuropeptides)"는 펩티드 호르몬, 펩티드 성장인자 및 기타 펩티드를 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 뉴로펩티드의 예는 옥시토신, 바소프레신, 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH), 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 소마토스타틴 성장 호르몬 방출 억제 호르몬, 티로트로핀 방출 호르몬(TRH), 뉴로키닌 a(물질 K), 뉴로키닌 β, 뉴로펩티드 K, 물질 P, β-엔돌핀, 디놀핀, Met-엔케팔린 및 leu-엔케팔린, 뉴로펩티드 티로신(NPY), 췌장 폴리펩티드, 펩티드 티로신-티로신(PYY), 글루코겐-라이크(Glucogen-like) 펩티드-1(GLP-1), 펩티드 히스티딘 이소루신(PHI), 하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 펩티드(PACAP), 혈관작동성 장관 폴리펩티드(VIP), 뇌 나트륨이뇨 펩티드(Brain natriuretic peptide), 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)(α-형태 및 β-형태), 콜레시스토키닌(CCK), 갈라닌, 췌도 아밀로이드 폴리펩티드(IAPP), 멜라닌 응집 호르몬(MCH), 멜라노크로틴(ACTH, α-MSH 및 기타), 뉴로펩티드 FF, 튜로텐신, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 아구티(Agouti) 유전자-관련 단백질(AGRP), 코카인 및 마피타민 조절된 전사물(transcript)(CART)/펩티드, 엔도몰핀-1(Endomorphin-1) 및 엔도몰핀-2, 5-HT-모듈린, 히포크레틴/오렉신 노시셉틴/오르파닌 FQ, 노시스타틴, 프로락틴 방출 펩티드, 세크레토뉴린(Secretoneurin) 및 유로코르틴(Urocortin)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 진단용 제제의 인비보 수송을 향상키기기 위해 사용된다. 본 실시예에 따라 사용될 수 있는 진단용 제제의 예는 x-선 조영제(imaging agents), 형광 조영제 및 콘트라스 미디어(contrast media)를 포함한다. x-선 조영제의 예는 디아트라존산 에틸 에스테르(ethyl ester of diatrazoic acid; EEDA)로도 알려진 WIN-8883 (에틸 3,5-디아세타미도-2,4,6-트리이도벤조에이트), WIN 67722, 즉 (6-에톡시-6-옥소헥실-3,5-비스(아세-타미도)-2,4,6-트리이도벤조에이트; 에틸-2-(3,5-비스(아세타미도)-2,4,6-트리이오도벤조일록시)부티레이트(WIN 16318); 에틸 디아트리족시아세테이트(WIN 12901); 에틸 2-(3,5-비스(아세타미도)-2,4,6-트리이오도벤조일록시)프로피오네이트(WIN 16923); N-에틸 2-(3,5-비스(아세타미도)-2,4,6-트리이오도벤조일록시 아세타미드(WIN 65312); 이소프로필2-(3,5-비스(아세타미도)-2,4,6-트리이오도벤조일록시)아세타미드(WIN 12855); 디에틸 2-(3,5-비스(아세타미도)-2,4,6-트리이오도벤조일록시)말로네이트(WIN 67721); 에틸 2-(3,5-비스(아세타미도)-2,4,6-트리이오도)페닐라세테이트(WIN 67585); 프로판이산(propanedioic acid), [3,5-비스(아세틸아미노)-2,4,5-트리오도벤조일록시]비스(1-메틸)에스테르(WIN 68165); 및 벤조산, 3,5-비스(아세틸아미노)-2,4,6-트리오도-4-(에틸-3-에톡시-2-부테노에이트)에스테르(WIN 68209)를 포함한다. 다른 콘트라스트 미디어는 자기공명 조영보조제(예, 가돌리늄 킬레이트) 또는 다른 상자성체 콘트라스트 제제를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 이와 같은 화합물의 예는 가도펜테테이트 디메글루민(gadopentetate dimeglumine; Magnevist^RTM) 및 가도테리돌(gadoteridol; Prohance^RTM)이다. 특허출원 20010001279는 초음파 콘트라스트 제제로서 사용될 수 있는 미세기포(microbubbles)를 포함하는 리포좀을 개시하고 있다. 따라서, 진단용 콘트라스트 제제는 또한 뇌의 초음파 영상화를 돕기 위해 본 발명과 결합하여 사용될 수 있다.

표지 항체(Labeled antibody)도 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 진단용 제제로서 사용될 수 있다. 표지 항체의 사용은 특히 특이 단백질(예, β 아밀로이드 단백질)의 존재에 의해 표시되는 알츠하이버병과 같은 질환을 진단하기 위해 중요하다.

치료용 제제 및 진단용 제제의 종류의 기술 및 각 종류 내의 종(species)의 목록은 마틴데일(Martindale, The Extra Pharmacopoeia, Twenty ninth Edition, The Pharmaceutical Press, London, 1989)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 도입되어 이 명세서의 일부를 구성한다. 상기 치료용 제제 및 진단용 제제는 시판의 것을 구입 및/또는 종래기술에 공지된 기법에 의해 제조하는 것이 가능하다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 화장품용 제제의 침투를 향상시키기 위해 사용된다. 본 발명의 화장품용 제제는 예를 들면 주름방지제, 항여드름제, 비타민, 박피제, 모낭 자극제 또는 모낭 억제제일 수 있다. 화장품 제제의 예는 레티논산 및 그 유도체, 살리실산 및 그 유도체, 황-함유 D 아미노산 및 L 아미노산 및 그들의 유도체 및 염, 특히 N-아세틸 유도체, 알파-히드록시산(예, 글리콜산), 유산(lactic acid), 피틴산, 리포산 및 본 기술분야에 공지되어 있는 많은 다른 제제를 포함한다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다.

본 실시예의 약학적 제제는 임의의 병상 또는 질환의 치료 또는 진단을 위해 선택될 수 있다. 본 실시예의 약학적 조성물은 물적 장벽(physical barriers)에 의해 보호되는 조직에 대해 특히 유리하다. 예를 들면, 피부는 상피의 외측에 의해 보호된다. 이것은 지질 영역에 의해 분리된 소형의 각질화 세포 잔여물(강인한 단백질 주성분의 구조)의 복잡한 구조이다. 각질층은 구강 점막이나 위 점막에 비해 체외 또는 체내 분자에 대한 침투성이 크게 낮다.

본 실시예의 약학적 조성물에 의해 치료될 수 있거나 진단될 수 있는 피부병의 예는 여드름, 건선, 백반, 켈로이드(keloid), 화상, 흉터, 주름, 건조증, 어린선(ichthyosis), 각화증, 각피증, 피부염, 소양증, 습진, 피부암, 치질 및 굳은살을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예의 약학적 제제는 혈액 관문(예, 뇌)에 의해 보호되는 조직의 치료를 위해 선택될 수 있다. 본 실시예의 약학적 제제에 의해 치료되거나 진단될 수 있는 뇌질환의 예는 뇌종양, 신경장해, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증, 운동뉴런 질환, 외상성 신경 손상, 다발성 경화, 급성 산재성 뇌척수염, 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 디스마이엘리네이션병(dysmyelination disease), 미토콘드리아 질환, 편두통 질환, 박테리아 감염, 진균 감염증, 뇌졸증, 노화, 치매, 정신분열증, 우울증, 조울증, 불안신경증, 공황 장해, 대인 공포증, 수면 장해, 주의 결함증, 행위 장해, 과다행동성 장해, 성격 장해, 약물 오용, 불임 및 두부 외상을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예의 약학적 조성물은 또한 생리학적으로 허용가능한 담체(즉, 전술한 부화된 나노구조 조성물에의 첨가물) 및 개체에 대한 화합물의 투여를 향상시키는 부형제를 포함할 수 있다.

이하, 상호 교화적으로 사용될 수 있는 어구 "생리학적으로 허용가능한 담체(physiologically acceptable carrier)" 및 "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 유기체에 대해 상당한 자극을 유발하지 않고, 또 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 무효화하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 보조제는 이들 어구 내에 포함된다.

본 명세서에서 용어 "부형제(excipient)"는 활성 성분의 투여를 더욱 촉진하기 위해 약학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다. 부형제의 예는 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당류 및 다종의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴레에틸렌 글리콜을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

약물의 조제 및 투여의 기법은 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences, " Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판)에 기재되어 있다. 위 문헌은 본 명세서에 참조로서 도입되었다.

본 실시예의 약학적 조성물은 다양한 투여 경로를 통해 개체(예, 인간과 같은 포유동물)에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예는 경구 투여, 직장 투여, 경점막 투여(특히, 경비 투여), 장관 투여 또는 비경구 투여(근육내 투여, 피하 주사 및 수내 주사, 수강내 주사, 직접 심실내 주사, 정맥 주사, 복강내 주사, 비강내 투여 또는 안구내 투여를 포함한다)를 포함한다.

대안으로서, 예를 들면, 상기 약학적 조성물은 전신 투여 방식보다는 환자의 조직 영역 내에 직접 주사되는 방식인 국부 투여 방식으로 투여될 수 있다.

본 실시예의 약학적 조성물은 예를 들면, 공지의 혼합 공정, 용해 공정, 조립 공정(granulating), 당의정 제조공정, 미립자 제조공정(levigating), 유화 공정, 캡슐화 공정, 봉입 공정 또는 동결 건조 공정과 같은 본 기술분야에 주지된 공정에 의해 제조될 수 있다. 본 실시예의 나노구조 및 액체의 제조 공정은 후술된다.

따라서 본 실시예에 따른 용도의 약학적 조성물은 약학적으로 이용될 수 있는 제제 내로의 활성 성분의 도입을 촉진하는 보조제 및 부형제를 포함하는 기타의 생리학적으로 허용가능한 담체의 존재 하에서 또는 비존재 하에서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 공지의 방법으로 조제될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.

주사의 경우, 약학적 조성물의 활성 성분은 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거액, 또는 생리학적 염완충액과 같은 생리학적 적합성 완충액의 존재 하에서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 중에 조제될 수 있다. 경점막 투여의 경우, 침투되어야 할 장벽에 적합한 기타 침투제가 제제 내에 사용될 수 있다. 이와 같은 침투제는 본 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여의 경우, 상기 약학적 조성물은 활성 화합물을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 조합하는 것에 의해 용이하게 조제될 수 있다. 상기 부화된 나노구조 조성물에 의해 약학적 조성물은 환자에 의한 경구 섭취를 위한 정제(tablets), 알약(pills), 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액, 및 기타의 형태로서 조제될 수 있다. 경구용 약리학적 제제는 고체 부형제를 이용하고, 필요에 따라 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 과립의 혼합물을 처리하고, 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가하여 정제나 당의정 코어를 얻는 것에 의해 조제될 수 있다. 적절한 부형제는 락토스, 스쿠로스, 마니톨, 또는 소비톨을 포함하는 당류와 같은 특히 충전제(fillers); 예를 들면, 옥수수 전분, 호밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 고무(gum tragacanth), 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소디움 카보메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용이 가능한 폴리머이다. 필요하면, 가교결합 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 소디움 알기네이트와 같은 알긴산의 염과 같은 붕괴제(disintegrating agents)가 첨가될 수 있다.

당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이 목적을 위해, 농축된 당 용액이 이용될 수 있다. 이 용액은 필요에 따라 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜, 티타늄 다이옥사이드, 라카 용액(lacquer solutions) 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물이 함유할 수 있다. 염료 또는 색소가 식별을 위해 또는 활성 화합물의 용량의 다양한 조합을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.

경구용으로 사용될 수 있는 의약 조성물은 젤라틴으로 제조되는 푸시-핏(push-fit) 캡슐뿐 아니라 젤라틴 및 가소제(예, 글리세롤 또는 소르비톨)로 제조되는 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제(예, 락토오스), 결합제(예, 전분), 활제(예, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트) 및 필요에 따라 안정제로 된 혼합물 내에 활성 성분들을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분들은 지방유, 유동 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 액체 내에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가하여, 안정제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용 모든 조제물은 선택된 투여 경로에 적합한 용량으로 제조되어야 한다.

구강 투여의 경우, 조성물은 공지의 방법으로 조제되는 정제나 약용 캔디의 형태를 취할 수 있다.

비공흡입 투여의 경우, 본 실시예에 따른 용도의 활성 성분들은 압력 팩으로부터 또는 적절한 추진제(예, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소)를 사용하는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 투여되는 것이 편리하다. 압력 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 투여하기 위한 밸브를 제공하는 것에 의해 결정될 수 있다. 분배기에서 사용하기 위한 젤라틴 캡슐 및 젤라틴 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 원료(예, 락토오스 또는 전분)의 분말 혼합물을 함유하도록 조제될 수 있다.

본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 비경구 투여용으로, 예를 들면, 볼러스 주사(bolus injection) 또는 지속 주사(continuous infusion)용으로 조제될 수 있다. 주사용 제제는 예를 들면 앰플 내의 단위 용량 형태 또는 보존제가 첨가된 다수 용량 형태로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 및 또는 수성 매체 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼일 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 조제제(formulatory agents)를 함유할 수 있다.

비경구 투여의 경우, 활성 성분들은 기타 용매의 존재 하에서 또는 비존재 하에서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 결합될 수 있다. 수성의 주사용 현탁액은 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질들을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 또 활성 성분들의 용해도를 증대시켜 고농축 용액을 조제할 수 있는 기타 제제 및 적합한 안정제를 포함할 수 있다.

본 실시예의 약학적 조성물은 국소성 투여용으로 조제될 수 있다. 국소성 투여 제제의 예는 겔, 크림, 연고, 페이스트, 로션, 밀크, 현탁액, 에어로졸, 스프레이, 거품 및 혈청(serum)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

대안으로서, 상기 활성 성분들은 사용 전 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 조합되기 위한 분말 형태일 수 있다.

본 실시예의 약학적 조성물은 또 (예를 들면 코코아 버터 또는 기타 글리세리드와 같은 공지의 좌약 베이스(suppository bases)를 이용하는) 좌약 관장제 또는 체류 관장제와 같은 직장용 조성물 내에 조제될 수 있다.

본 실시예에 관련한 용도에 적합한 약학적 조성물은 상기 활성 성분들이 의도된 목적의 달성에 유효한 양 만큼 포함되는 조성물을 포함한다. 더 구체적으로, 치료적으로 유효한 양은 질환(예를 들면, 빈혈)의 증상을 예방, 완화, 개선하는데, 또는 치료되어야 할 대상의 생존기간을 연장하는데 유효한 활성 성분(핵산 구축물)의 양을 의미한다.

치료적으로 유효한 양의 결정은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 설명에 비추어 본 기술분야의 전문가의 능력의 범위 내에 있다.

본 실시예의 방법에 사용되는 임의의 제제의 경우, 상기 치료적으로 유효한 양 또는 용량은 최초에 인비트로(in vitro)로부터 그리고 세포 배양 분석으로부터 평가될 수 있다. 예를 들면, 용량은 희망하는 농도 또는 적정농도(titer)를 달성하기 위한 동물 모델에서 조제될 수 있다. 이와 같은 정보는 인간에 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하기 위해 이용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 활성 성분들의 독성 및 치료 효과는 인비트로, 세포배양 또는 실험동물을 이용한 표준 약학 공정에 의해 측정될 수 있다. 이들 인비트로, 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어지는 데이터는 인간에게 사용하기 위한 용량 범위를 처방하는데 이용될 수 있다. 상기 용량은 채용된 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 처방, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 감안하여 개별 의사가 선택할 수 있다(참고예, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

투여량 및 투여간격을 개별적으로 조절하여 생물학적 효과를 유발하거나 억제하는데 충분한 활성 성분의 혈장중 농도 또는 뇌중 농도(최소유효농도; MEC)를 제공할 수 있다. MEC는 각 제제마다 다르지만 인비트로 데이터로부터 추정이 가능하다. MEC를 달성하기 위해 필요한 용량은 개인의 특징 및 투여 경로에 따라 달라진다. 검출 분석은 혈장 농도를 측정하기 위해 이용될 수 있다.

치료 대상의 질환의 중증도 및 반응정도에 의존하여, 투여는 단일회 국부 투여 또는 복수회 국부 투여로 할 수 있고, 치료과정은 수일로부터 수주까지 또는 치료 효과가 나타날 때까지 또는 질환상태가 감소될 때까지로 할 수 있다.

국부 투여될 조성물의 양은 물론 치료의 대상, 질병의 중증도, 투여 방법, 처방 의사의 판단 등에 따라 달라진다.

본 실시예는 세포 성장 및 세포 융합의 양자를 향상시킬 수 있는 신규의 조성물을 더 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 모노클로날 항체 생산을 개선하기 위해 사용될 수 있다.

인간 모노클로날 항체의 생산은 골수원의 파트너 세포주(partner cell-line)와의 융합에 의한 인간 B-임파구의 불사화(immortalization)가 필요하다. 그러나, 말초혈 내에서 순환하는 인간 B-세포만이 모노클로날 항체 생산용으로 사용이 가능한 것이므로 모노클로날 항체 생산용 세포원(source of cells)은 제한적이다.

더욱, 분비된 모노클로날 항체의 양이 전형적으로 많지 않으므로 하이브리도마 세포 배양물로부터 고농도의 단리된 모노클로날 항체를 생산하는 것은 곤란하다는 것이 증명되어 있다.

모노클로날 항체 생산의 이론적 결과와 실제적 결과 사이의 차이를 극복하기 위해, 말초혈로부터 얻어진 B-세포의 희소성을 극복하고, 그 결과 그 불사화의 가능성을 더욱 높이기 위해 융합 과정의 효율이 매우 높을 필요가 있다. 더욱, 하이브리도마 및 그 모노클로날 항체의 분비물의 안정성을 모두 향상시키기 위한 방법이 모색되어야 한다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 세포 융합 및 세포 안정성의 양자를 촉진시킨다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 인간 말초혈 모노클로날 세포(human peripheral blood mononuclear cells; PBMC) 및 융합 파트너(MFP-2) 세포의 융합을 촉진시키고, 또 그것으로부터 생성된 하이브리도마의 안정성을 촉진시킨다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 상기 하이브리도마로부터의 항체 분비물을 증가시킨다. 따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 나노클로날 항체의 단리 및 생성에 도움을 줄 수 있다.

본 실시예는 이 연구결과를 이용하여 모노클로날 항체 생성을 촉진시킬 뿐 아니라 다른 진핵생물 세포들 사이의 융합을 향상시키고, 또 세포 특히 간엽 줄기세포의 성장을 촉진시킨다.

따라서, 본 실시예의 일 관점에 따르면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하여, 그것에 의해 세포 융합에 영향을 주는 배지 내에서 세포를 융합하는 단계를 포함하는 세포 융합의 방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "세포 융합(cell-fusion)"은 2개 이상의 생존능력이 있는 세포들의 (엑스비보 또는 인비보) 융합을 의미한다.

세포 융합은 융합 조건 하에서 세포들을 결합하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 세포들은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 센다이(Sendai) 바이러스(참조예, Harlow & Lane (1988) in Antibodies, Cold Spring Harbor Press, New York)와 같은 융합 자극체의 존재 하에서 융합될 수 있다. 대안으로서, 세포들은 적합한 전기적 조건 하에서 융합될 수 있다.

이론에 구애됨이 없이, 나노구조들 사이의 장범위 상호작용은 부화된 나노구조 조성물의 독특한 특성에 도움이 된다. 이와 같은 특성 중의 하나는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 2개의 세포 유형들 사이의 융합과정을 촉진시킬 수 있다는 것이다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 세포 융합 과정에 도움을 줄 수 있다. 세포들의 예는 일차(primary) 세포 및 불사화(immortalized) 세포, 동일 세포 및 비동일 세포, 인간 세포 및 비인간 세포를 포함한다.

상기 어구 "불사화 세포(immortalized cells)"는 복수의 세대 동안 또는 무제한적으로 세포 배양물 내에서 계대(passage)될 수 있는 세포 또는 세포주를 의미한다. 불사화 세포의 일례는 종양 세포이다.

따라서, 예를 들면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 하이브리도마를 생산하기 위해 종양 세포와 세포(예, B-임파구)를 생산하는 항체 사이의 엑스비보 융합을 돕는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "하이브리도마(hybridoma)"는 단일의 세포막 내에서 면역 시스템의 분비 세포(예, B-세포)와 불사 세포(예, 골수종 세포)의 2개의 세포를 융합함으로써 생성되는 하나의 세포를 의미한다. 그 결과 얻어진 하이브리드 세포는 클론화되어 동일한 딸 세포를 생산한다. 이들 딸 클론(daughter clones)의 각각은 복수의 세대에 걸쳐 면역 세포의 세포 생성물을 분비할 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 상기 B임파구는 인간 B임파구이다. 본 발명의 일부의 실시예에서, 상기 B임파구는 말초혈 내에서 순환하는 것(예, PBMC)이다.

본 실시예에 따른 하이브리도마를 생산하기 위해 사용될 수 있는 종양 세포의 예는 마우스 골수종 세포 및 세포주, 랫 골수종 세포 및 인간 골수종 세포주를 포함한다.

골수종 세포주는 선택 수순이 확립될 수 있도록 마아커를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 골수종 세포주는 HGPRT 음성(하이폭산신-구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제 음성)일 수 있다. 그 특이적 예는 마우스로부터 유도되는 X63-Ag8(X63), NS1-Ag4/1(NS-1), P3X63-Ag8.UI(P3UI), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO.BU.1; 랫으로부터 유도되는 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3); 및 인간으로부터 유도되는 U266AR(SKO-007), GM1500 GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2), 8226AR/NIP4-1(NP41) 및 MFP-2를 포함한다.

본 실시예에 따르면, 종양 세포 및/또는 B 임파구는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 배지(예, 배양물 배지) 내에서 배양된다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "배양물 배지(culture medium)"는 진핵 세포를 적어도 12시간 동안 생존 상태에 유지시킬 수 있는 조성물 및 바람직하게는 복제할 수 있는 배지를 의미한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서의 배양은 하이브리도마의 수를 증가시키기 위해 융합과정의 이전 및/또는 이후에 수행될 수 있다. 융합과정의 이전의 본 실시예의 부화 나노구조 조성물 내에서의 배양은 하이브리도마 생성을 향상시키기 위한 임의의 시간 동안 수행될 수 있다. 바람직하게 배양 기간은 1일 이상이다.

배양 중인 배지의 액체 부분은 그 전체 또는 일부가 후술되는 바와 같이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 교환될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예에 따른 배양물 배지는 각 세포가 상이한 배양물 배지에 특정의 방식으로 반응하므로 전형적으로 실험에 기초하여 선택된다. 배양물 배지의 예는 이하에서 추가로 설명된다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 종양 세포 및 수지상 세포와 같은 다른 세포들 사이의 엑스비보 융합을 돕기 위해 사용될 수 있다.

이와 같은 융합된 세포는 항암 백신으로서 효과적일 수 있다는 것이 입증되어 있다[Zhang K et al., World J Gastroenterol . 2006 Jun 7;12(21):3438-41].

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 체세포 및 줄기세포 사이의 인비보 융합에서 도움이 되도록 사용될 수 있다. 줄기세포는 그 강력한 생성능력 및 재생능력으로 인해 골수 및 다양한 기관들(예, 간장, 뇌 및 심장)의 손상을 회복시키기 위해 사용될 수 있다. 줄기세포의 회복 특성이 회복 중에 있는 기관 내에 자연적으로 내재하는 세포와 융합하기 위한 줄기세포의 능력에 기인한다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 골세포 및 근육세포와 같은 체세포와 줄기세포 사이의 융합을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 줄기세포는 더욱 신속하게 융합하도록 그리고 표적 부위에 더욱 효과적으로 융합하도록, 그 결과 줄기세포 회복과정을 수행하도록, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 처리될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 또 세포 융합에 의해 핵산을 인비보 이식(transferring)시키는데 사용될 수 있다. 참조예, Hoppe UC, Circ Res . 1999 Apr 30;84(8):964-72.

본 실시예의 조성물에 의해 도움을 받을 수 있는 다른 엑스비보 융합과정은 배아줄기세포와 인간 세포 사이의 융합이다. 이와 같은 융합은 배아줄기세포와 유사한 방식으로 거동하여, 따라서 이식을 위한 유전학적으로 일치하는 줄기세포를 생성하는 하이브리드를 생성하는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 인간배아 줄기(hES) 세포는 인간 섬유아세포와 융합하여, 안정한 4배체 DNA 함량을 유지하고, hES세포의 형태, 성장률 및 항원발현 패턴 특징을 가지는 하이브리드 세포를 형성한다[Cowan et al., Science, 2005 Aug 26;309(5739):1369-73].

본 실시예의 조성물에 의해 촉진될 수 있는 또 다른 엑스비보 융합과정은 체세포 핵이식이다. 이것은 체세포가 제핵 난모세포(enucleated oocyte)와 융합하는 과정이다. 체세포의 핵은 유전정보를 제공하고, 난모세포는 배아의 성장을 위해 필요한 영양소 및 기타 에너지를 발생하는 물질을 제공한다. 이 과정은 배아줄기세포의 클론화(cloning) 및 생성을 위해 사용된다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 융합과정을 포함하는 전체의 모노클로날 항체 생산과정, 이것에 의해 생성되는 하이브리도마의 클론화 및 그 항체의 분비를 향상시킬 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 생성되는 클론화된 하이브리도마는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 비존재 하에서 생성되는 클론화된 하이브리도마에 비해 더 안정할 것이라고 예측된다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 불사화 세포와 항체 생산 세포를 융합하여 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 하이브리도마를 얻는, 모노클로날 항체 생성방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 면역 분자로서 이 면역 분자가 면역 반응을 하는 임의의 항원에 대해 단일의 결합 친화성을 포함하는 면역 분자를 의미한다.

본 실시예에 따르면, 모노클로날 항체는 하나의 불사화 세포를 항체 생산 세포와 융합하여, 전술한 바와 같이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 하이브리도마를 생산하는 것에 의해 생성된다. 다음에 생성된 하이브리도마는 클론화될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시예에 따라, 클론화는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 단일 하이브리도마를 배양하는 것에 의해 수행된다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 생성된 클론화된 하이브리도마는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 비존재 하에서 생성된 클론화된 하이브리도마에 비해 더 안정하므로, 클론화 과정은 전형적으로 HCF와 같은 안정화 인자의 첨가가 불필요하다.

하이브리도마의 생성 및 선택적인 그 클론화 후, 모노클로날 항체는 검사 및 채취된다. 기능분석 및 구조분석을 포함하는 많은 검사방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 하이브리도마의 예시적인 검사방법은 샌드위치 ELISA 분석을 이용하는 후술하는 실시예 2에 기술되어 있다.

모노클로날 항체의 채취 기법도 또 본 기술분야에 주지되어 있고, 전형적으로 표준 단백질 정제법을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 전술한 본 실시예의 조성물을 포함하고, 포장 재료 내에 포장되고, 본 명세서에 기술된 바와 같이 모노클로날 항체의 생성을 위한 용도가 상기 포장 재료 내에 또는 그 외면에 인쇄되어 표시되는 제품이 제공된다.

본 실시예의 조성물은 전술한 하이브리도마와 같은 진핵성 세포 물질의 안정화를 향상시킬 수 있으므로 본 발명자들은 본 실시예의 조성물을 이용하여 기타의 진핵성 세포 물질의 안정화를 향상시킬 수 있다는 것을 명확히 이해하였다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따라 진핵성 세포의 배양방법이 제공된다. 이 방법은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 특히 많은 이유에서 배양물 배지에서 사용하기에 적합한 것으로 생각한다.

첫째, 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 그 조성물 내에서 배양된 세포의 증식 속도를 증가시킬 수 있다.

둘째, 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 제제의 용해도를 향상시킨다. 이것은 특히 배양물 배지에 첨가될 필요가 있는 수용성 제제의 용해도를 향상시키는 것에 관련이 있을 수 있다.

셋째, 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 향상된 완충 능력, 즉, 물보다 큰 완충 능력을 포함한다. 이것은 특히 pH 민감성의 세포에 대해 관련이 있을 수 있다.

넷째, 본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 단백질을 안정화시킬 수 있다. 이것은 특히 비안정성 펩티드 제제가 배양물 배지에 첨가될 필요가 있는 경우 또는 세포 분비된 펩티드 제제의 안정화를 위해 관련이 있을 수 있다.

본 실시예에 따르면 세포는 성장, 유지 및/또는 클론화와 같은 그러나 이것에 한정되지 않는 임의의 목적을 위해 배양될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 또한, 배양 시간은 임의의 방식으로 제한되지 않고, 세포는 필요한 시간 동안 본 실시예의 조성물 내에서 배양될 수 있다는 것이 인식되어야 한다.

본 실시예의 조성물은 전형적으로 저농도로 존재하는 인자들의 자기분비(autocrine secretion)를 필요로 하는 세포의 배양에 특히 유용할 수 있다. 예를 들면, 간엽조직 줄기세포는 증식을 향상시키는 DKK1을 분비하는 것이 밝혀졌다. 본 실시예의 조성물의 정렬된 구조는 DKK1 농도를 효과적으로 증대하고, 그 결과 그 성장을 향상시키는 역할을 할 수 있다.

본 실시예의 조성물은 또 특히 불안정해지는 경향을 가지는 세포의 배양에 특히 유용할 수 있다. 이와 같은 세포의 예는 냉동 후 재배양되는 하이브리도마 세포 및 저농도로 존재하는 세포를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 임의의 진핵 세포 배양물 배지의 전체 또는 일부의 수분 함량을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 교체하는 것을 고려한다. 지의 수분 함량의 제거는 동결건조, 공기건조 및 오븐건조와 같은 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 배양 배지의 액체 부분은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 5 %, 바람직하게는 10 %, 더 바람직하게는 20 %, 더 바람직하게는 40 %, 더 바람직하게는 60 %, 더 바람직하게는 80 %, 더 바람직하게는 100 % 포함할 수 있다.

많은 배지는 또한 건조된 성분으로서 시판되고 있다. 따라서, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 배지의 수성분을 제거할 필요 없이 첨가시킬 수 있다.

진핵 세포 배양물 배지의 예는 DMEM, RPMI, Ames 배지, CHO 세포 배지, 햄(Ham's) F-10 배지, 햄 F-12 배지, 레이보비타(Leibovita) L-15 배지, 맥코이(McCoy's) 배지, MEM 알파 배지를 포함한다. 이와 같은 배지들은 많은 제조사(예, Sigma Aldrich 및 Invitrogen)로부터 광범위하게 구입할 수 있다.

상기 배지는 성장 인자, 혈청, 항생제와 같은 기타 성분을 포함할 수 있다. 이와 같은 성분들은 예를 들면 Sigma Aldrich 및 Invitrogen으로부터 구입할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 그 안에서 세포를 배양하기 전에 살균(예, 필터 살균)될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 전술한 본 실시예의 조성물을 포함하고, 포장 재료 내에 포장되고, 본 명세서에 기술된 바와 같이 진핵 세포의 배양을 위한 용도가 상기 포장 재료 내에 또는 그 외면에 인쇄되어 표시되는 제품이 제공된다.

전술한 바와 같이, 본 실시예의 조성물은 기성의(ready-made) 배양물 배지로서 제조될 수 있다. 따라서, 진핵 세포 배양물 배지와 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 세포 배양물 배지가 제공된다.

본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 세팔로스포린(cephalosporin)의 용해 또는 분산방법이 제공된다. 이 방법은 상기 세팔로스포린을 이 물질의 분산 또는 용해를 허용하는 조건 하에서 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 나노구조는 액체의 정렬된 유체 분자에 의해 포위되는 나노치수의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질과 상기 정렬된 유체 분자의 인벨롭은 정상의 물리적 상태에 있다.

상기 세팔로스포린은 용해 과정을 돕기 위해 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 첨가 전 또는 후에 용매 내에 용해될 수 있다. 본 실시예는 물질의 용해도를 더욱 증대시키기 위해 극성 용매, 비극성 용매, 유기 용매(예, 에탄올 또는 아세톤) 또는 비유기 용매를 포함하는 임의의 용매의 사용을 고려하는 것이 인정된다.

상기 용매는 상기 물질이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에 용해/분산된 상태로 유지되도록 용해 과정 중의 임의의 시간에 (완전하게 또는 부분적으로) 제거될 수 있다. 용매를 제거하는 방법은 증발(즉, 가열 또는 압력을 가하는 것에 의한 증발) 또는 임의의 다른 방법과 같이 본 기술분야에 공지되어 있다.

본 실시예는 검체의 검출을 향상시키는데 사용될 수 있는 키트 및 제품을 포함한다.

의료 및 진단 시험 산업에서는 생분자를 검출하기 위한 더욱 세심한 방법이 끊임없이 추구되고 있다. 예를 들면, 의약은 고도로 민감한 바이러스 검출 방법이 분명히 필요하다. 화학약품 또는 기타 물질의 검출을 위한 더욱 민감한 분석은 광범위한 환경 분야에서 유용할 수 있다. 화학약품 또는 기타 물질의 조기 검출은 재앙을 충분히 조기에 저지하기 위한 정확한 행동을 촉발시킬 수 있다. 고감도의 검출기법은 또 반도체 제조의 최적화 제어를 위해서도 유용하다.

본 발명의 일부의 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 검체의 검출을 향상시킨다. 본 발명의 다양한 예시적 실시예에서, 부화된 나노구조 조성물은 ECL 단백질 검출 시스템의 감도를 증대시킨다.

본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 포장 재료 및 이 포장 재료 내에 수용되는 검출이 가능한 부분(moiety)의 검출을 향상시키는 것이 확인된 조성물을 포함하는 제품이 제공된다. 상기 부화된 나노구조 조성물은 본 명세서에 기술되는 부화된 나노구조 조성물이다.

이론에 구애됨이 없이, 나노구조들 사이의 장범위 상호작용은 검출 시스템의 감도를 향상시키도록 부화된 나노구조 조성물의 독특한 특성에 도움을 준다. 예를 들면, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 혈의 효과로부터 단백질을 차폐 및 안정화시킬 수 있고 및/또는 향상된 완충 능력을 포함할 수 있다. 이들 양 인자는 검출 시스템 내의 단백질의 상태에 기여하여, 검출 시스템의 전체적인 감도를 향상시켜준다.

제제의 용해도를 향상시키기 위한 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 능력은 검출 시스템의 향상된 감도에 도움을 줄 수 있다.

전술한 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 키트의 일부를 형성할 수 있다는 것이 인식된다.

따라서, 본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, (i) 검출이 가능한 제제; 및 (ii) 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 검체를 검출하기 위한 키트가 제공된다.

본 실시예의 키트는 필요한 경우 본 실시예의 키트의 하나 이상의 유닛을 포함하는 팩(pack) 내에 제공될 수 있다. 상기 팩 내에는 키트의 사용 설명서가 포함될 수 있다. 상기 팩은 키트의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 또한, 팩에는 실험 보충물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부당국에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태에 대한 상기 정부당국의 승인을 반영한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "검체(analyte)"는 검출될 분자 또는 화합물을 의미한다. 적절한 검체는 생체 분자를 포함하는 유기 분자 및 무기 분자를 포함한다. 상기 검체는 환경 화학물질 또는 임상 화학물질 또는 오염물질 또는 생체분자 살충제(pesticides), 살충제(insecticides), 독소, 치료제 및 남용약물(abused drugs), 호르몬, 항생제, 유기물질, 및 용매를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 적합한 생체분자는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 전세포(whole cells)[원핵세포(예, 병원성 박테리아) 및 진핵세포(예, 포유류 종양세포)를 포함], 바이러스, 포자(spores), 등을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 검체는 효소를 포함하는 단백질; 약물, 항체; 항원; 세포막 항원 및 수용체(신경 수용체, 호르몬 수용체, 영양소 수용체, 및 세포 표면 수용체) 또는 그 리간드이다.

본 실시예의 검출 키트는 액체 및 나노구조를 포함하는 액체 조성물로 인해 향상된 감도를 보여준다.

본 실시예는 검출을 위해 필요한 적어도 하나의 성분을 액체 및 나노구조를 포함하는 조성물 내에 용해시키는 단계 및/또는 상기 검출분석을 수행하는 단계를 예상한다. 여기서 물 성분은 적어도 부분적으로 액체 및 나노구조를 포함하는 상기 조성물과 교환된다. 검출분석물의 액체 부분은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 5 %, 바람직하게는 10 %, 더 바람직하게는 20 %, 더 바람직하게는 40 %, 더 바람직하게는 60 %, 더 바람직하게는 80 %, 더 바람직하게는 100 % 포함할 수 있다.

상기 본 실시예의 키트는 액체 및 나노구조를 포함하는 조성물을 포함할 뿐 아니라 검출이 가능한 제제도 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 검출이 가능한 제제(형광 제제, 인광 제제 또는 화학발광 제제)는 전형적으로 특수 파장의 방사를 방출하므로 직접 검출될 수 있다.

특수 검체를 검출하기 위해, 전형적으로 이와 같은 검출이 가능한 제제는 표적 검체에 결합하는 친화성 인식 부분을 포함한다. 친화성 인식 부분의 예는 아비딘(avidin) 유도체(예, 아비딘, 스트렙아비딘 및 뉴트라비딘), 항체 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

아비딘은 약 10.5의 등전점(isoelectric point)을 가지는 고 양이온성의 66,000-달톤의 당단백질이다. 스트렙트아비딘은 거의 중성의 등전점을 가지는 비글리코실화(nonglycosylated) 52,800-달톤의 단백질이다. 뉴트라비딘은 아비딘의 탈글리코실레이트화(deglycosylated) 형태이다. 이들 단백질 전부는 바이오틴(biotin)에 대해 극히 높은 친화성 및 선택성을 가지고, 각 단백질은 1개의 분자당 4개의 바이오틴이 결합될 수 있다. 아비딘 인식 부분을 포함하는 검출이 가능한 제제는 자연발생의 바이오틴화(biotinylated) 생체분자 또는 바이오틴을 포함하도록 인공조작된 생체분자를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

본 실시예에서 사용되는 용어 "항체(antibody)"는 무상 분자 및 그것의 기능성 단편, 예를 들면 특이적 단백질 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2, 및 Fv를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynuleotide)"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 그 모방제의 단일사슬 또는 이중사슬의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 이 용어는 자연발생의 염기, 당 및 공유결합성 인터뉴클레오티드 결합(예, 골격(backbone))으로 구성되는 올리고뉴클레오티드뿐 아니라 각각의 자연발생의 부분과 유사한 기능을 하는 비자연발생의 부분을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 표지(labeled) 폴리뉴클레오티드는 샘플에 하이브리드화(hybridizing)될 수 있는 샘플 내의 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 어구 "하이브리드화 가능한(capable of hybridizing)"은 핵산 제제의 적어도 하나의 사슬이 H19 mRNA에 적어도 부분적으로 상동인 염기대합(base-pairing)을 의미한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 본 실시예의 키트의 검출이 가능한 제제는 비직접적으로 검출될 수 있다. 예를 들면, 상기 검출이 가능한 제제는 검출이 가능한 생성물을 생성할 수 있는 효소 반응을 위한 기질일 수 있다.

형광 생성물을 생성할 수 있는 기질은 전형적으로 형광색소분자(fluorophores)를 포함한다. 이와 같은 형광색소분자는 쿠마린(coumarin), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 레소루핀(resorufin) 및 DDAO를 포함하는, 그러나 이들 분자에 한정되지 않는, 많은 분자로부터 유도될 수 있다.

형광 생성물을 생성할 수 있는 기질의 예는 가용성 형광 생성물을 생산하는 기질(예, 수용성 쿠마린으로부터 유도되는 기질, 수용성 녹색 내지 황색의 형광색소분자로부터 유도되는 기질, 수용성 적색 형광색소분자로부터 유도되는 기질, 티올 반응성 형광성 기질, 지방친화성 형광색소분자, 펜타플루오로벤조일 형광성 효소 기질); 불용성 형광 생성물을 생산하는 기질(여기 상태의 에너지 전달에 기초하는 기질 및 불연속 효소 분석을 위한 형광 유도체화 시약)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다. 이와 같은 기질에 관한 상세는 Invitrogen의 웹사이트(예, www.probes.invitrogen.com/handbook/sections/1001.html)에서 찾아볼 수 있다.

형광 생성물을 생성할 수 있는 기질의 특별한 예는 플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노시드(FDG), 레소루핀 β-D- 갈락토피라노시드, DDAO 갈락토시드, β-메틸움베릴페릴 β-D-갈락토피라노시드, 6,8-디플루오로-4-메틸움베릴페릴 β-D-갈락토피라노시드, 3-카르복시움베릴페릴-β-D-갈락토피라노시드, ELF 97 포스페이트, 5-클로로메틸플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노시드(CMFDG), 4-메틸움베릴페릴-β-D-글루크로니드, 플루오레세인 디-β-D-글루크로니드, PFB 아미노플루오레세인 디 글루크로니드, ELF 97-β-D-글루크로니드, BODIPY FL chloramphenicol substrate™, 및 10-아세틸-3,7-디히드록시페녹사진을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

화학발광 생성물을 생성할 수 있는 기질의 예는 루시페린, 루미놀, 이소루미놀, 아크리단, 페닐-10-메틸아크리단-9-카르복실레이트, 2,4,6-트리클로로페닐-1-0-메틸아크리단-9-카르복실레이트, 피로갈롤, 플로로글루시놀 및 레소시놀을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

발색(chromogenic) 생성물을 생성할 수 있는 기질의 예는 BCIP, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-글루크론산(X-GlcU) 및 5-브로모-6-클로로-3- 인돌일-β-D-글루크로니드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드(X-Gal), 디아미노벤지딘(DAB), 테트라메틸벤지딘(TMB) 및 o-페닐린디아민(OPD)을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

상기 키트는 다양한 검출 분석에 유용할 수 있다.

하기는 본 실시예의 키트를 이용하여 수행될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 분석의 목록이다.

노던 블롯 분석법( Northern Blot analysis )

이 방법은 RNA의 혼합물 내에서 특정 RNA의 검출에 관련된다. RNA 샘플은 염기대합들 사이의 수소결합을 방지하고, 모든 RNA 분자가 언폴딩(unfolded)되어 선형의 배좌(linear conformation)를 가지도록 하는 제제(예, 포름알데히드)를 이용한 처리에 의해 변성된다. 다음 개개의 RNA 분자들은 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 분리되고, 니트로셀룰로오스 또는 나일론을 주성분으로 하는 막으로 이동되어 그 막에 부착된다. 다음 상기 막은 표지 DNA 프로브에 노출된다. 이 프로브는 효소 결합된 뉴클레오티드를 이용하여 표지될 수 있다. 검출은 비색반응(colorimetric reaction) 또는 화학발광을 이용하여 수행될 수 있다. 이 방법에 의해 특정 RNA 분자량의 정량화 및 전기영동 중의 겔 내에서의 이동거리를 나타내는 막 상의 상대위치에 의한 동일성의 결정이 가능해진다.

RNA 인시츄 하이브리드화 염색법

이 방법에서 DNA 또는 RNA 프로브는 세포 내에 존재하는 RNA 분자에 부착된다. 일반적으로, 세포는 먼저 세포의 구조를 보존하고 RNA 분자의 분해를 방지하기 위해 현미경 슬라이드 상에 고정된 다음, 표지 프로브(labeled probe)를 함유하는 하이브리드화 완충액에 노출된다. 하이브리드화 완충액은 포름아미드 및 염(예, 소디움 클로라이드 및 소디움 시트레이트)과 같은 시약을 포함한다. 이 시약에 의해 프로브의 비특이적 결합이 회피됨과 동시에 인시츄에서 표적 Mrna 분자를 이용한 DNA 또는 RNA 프로브의 특이적 하이브리드화가 가능해진다. 본 기술분야의 전문가는 특수한 프로브 및 세포의 유형에 따라 하이브리드화 조건(즉, 온도, 염 및 포름아미드의 농도 등)을 조절할 수 있다. 하이브리드화 후, 임의의 결합되지 않은 프로브는 세척되고, 슬라이드는 화학발광에 관련되는 프로브를 이용하여 생성된 신호를 드러내는 사진 에멀젼이나 효소 결합된 표지 프로브를 이용하여 생성된 신호를 드러내는 비색반응에 노출시킨다.

올리고뉴클레오티드 미세분석법

이 방법에서, 본 실시예의 폴리뉴클레오티드를 이용한 특이적 하이브리드화가 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 표면(예, 유리판)에 부착된다. 각 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 20-25개의 핵산의 길이이다. 특정의 세포 샘플(예, 혈액 세포) 내에서 본 실시예의 폴리뉴클레오티드의 발현 패턴을 검출하기 위해, RNA는 본 기술분야에 공지된 방법(예, TRIZOL 솔루션, Gibco BRL, USA)을 이용하여 세포로부터 추출된다. 하이브리드화는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브(5'-바이오티닐레이트화 프로브) 또는 표지된 상보적 DNA(cDNA) 또는 상보적 RNA(cRNA)를 이용하여 수행될 수 있다. 간단히 말하면, 이중사슬 cDNA가 제조회사(Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, USA)의 설명서에 따라 역전사 트랜스크립타아제(RT)(예, Superscript II RT), DNA 리가아제 및 DNA 폴리머라아제 I을 이용하여 RNA로부터 제조된다. 표지된 cRNA를 제조하기 위해, 이중사슬 cDNA는, 예를 들면 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo, Diagnostics, Affymetix Santa Clara CA)를 이용하여, 바이오티닐레이트화 뉴클레오티드의 존재 하에서 인비트로 전사반응에 노출된다. 표지된 cRNA는 효율적인 하이브리드화를 위해 40 mM의 트리스 아세테이트(pH 8.1), 100 mM의 포타슘 아세테이트 및 30 mM의 마그네슘 아세테이트 내에서 35 분간 94 ℃의 온도에서 RNA를 배양하는 것에 의해 단편화시킬 수 있다. 하이브리드화 후, 미세분석물은 세척되고, 하이브리드화 신호는 공초점 레이저 형광 스캐너를 이용하여 스캔된다. 상기 스캐너는 프로브 분석물에 결합된 표지 cRNA에 의해 방출되는 형광의 강도를 측정한다.

예를 들면, Affymetrix 미세분석법(Affymetrix® Santa Clara, CA)에서, 분석물질 상의 각 유전자는 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 표시된다. 각 프로브 쌍은 완전 일치 올리고뉴클레오티드 및 불일치 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 완전 일치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보되는 서열을 구비하므로, 특정 유전자의 발현 수준의 측정이 가능해지고, 불일치 프로브는 중심 염기의 위치의 단일 염기 치환에 의해 완전 일치 프로브와 상이하다. 하이브리드화 신호는 애질런트(Agilent) 스캐너를 이용하여 스캔되고, 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 일치 프로브로부터 얻어지는 신호로부터 불일치 프로브로부터 얻어지는 비특이적 신호를 감산한다.

하기는 본 실시예의 키트를 이용하여 수행할 수 있는 폴리펩티드의 검출을 위한 분석법의 목록이다.

웨스턴 블롯법

이 방법은 아크릴아미드 겔을 이용하여 다른 단백질로부터 기질을 분리한 후 이 기질을 막(예, 나일론 또는 PVDF)에 이동시키는 것이 수반된다. 다음 기질의 존재가 이 기질에 특이적인 항체에 의해 검출되고, 이 항체는 항체 결합 시약에 의해 검출된다. 항체 결합 시약은 예를 들면 단백질 A, 또는 기타 항체일 수 있다. 항체 결합 시약은 전술한 바와 같이 방사성 표지되거나 효소 결합된 것일 수 있다. 검출은 오토라디오그래피, 비색반응 또는 화학발광에 의해 수행될 수 있다. 이 방법에 의해 기질의 양의 정량화 및 전기영동 중의 아크릴아미드 겔 내에서의 이동거리를 나타내는 막 상의 상대위치에 의한 동일성의 결정이 가능해진다.

형광 활성화 세포 분류법( FACS )

이 방법은 기질 특이적 항체에 의한 세포 내 인시츄 기질 검출을 수반한다. 기질 특이적 항체는 형광색소분자에 연결된다. 검출은 각 세포가 광의 비임을 통과하는 중에 각 세포로부터 방출되는 광의 파장을 독출하는 세포 분류장치를 이용하여 수행된다. 이 방법은 2개 이상의 항체를 동시에 사용할 수 있다.

면역조직화학 분석법

이 방법은 기질 특이적 항체에 의해 고정된 세포 내 인시츄 기질의 검출을 수반한다. 기질 특이적 항체는 효소 결합된 것 또는 형광색소분자에 결합된 것일 수 있다. 검출은 현미경 및 주관평가 또는 자동평가에 의해 수행될 수 있다. 효소 결합된 항체가 사용되는 경우, 비색반응이 필요할 수 있다. 면역조직화학의 분석 후 예를 들면 헤마톡시린 또는 기엠자(Giemsa) 염색을 이용한 세포핵의 대비염색이 실시되는 경우가 많다.

인시츄 활성 분석법

이 방법에 따르면, 발색 기질이 활성 효소를 포함하는 세포 상에 적용되고, 상기 활성 효소는 기질이 분해되어 광학현미경 또는 형광현미경에 의해 볼 수 있는 발색 생성물을 생산하는 반응을 촉매한다.

본 발명의 일부의 실시예에 따르면, 상기 키트는 화학형광 검출분석법을 이용하여 고정화된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

이 분석법에서, 표적 검체는 산화제의 존재 하에서 화학발광 기질의 산화를 촉매할 수 있는 효소(예, 호스라디시 페록시다아제(horseradish peroxidase))에 직접적 또는 간접적으로 결합된다. 상기 기질은 산화 후 여기 상태가 되어 검출이 가능한 광파를 방출한다. 광 방출의 강한 향상은 인핸서에 의해 발생될 수 있다.

따라서, 상기 키트는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 검출이 가능한 제제(즉, 루미놀 및 전술한 제제와 같은 화학형광적 화합물)에 추가하여 상기 형광화학 기지를 산화시킬 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 전형적으로 효소는 항체 또는 스트랩아비딘과 같은 아비딘 유도체에 접합된다. 이와 같은 효소의 예는 호스라디시 페록시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 콜레스테롤 옥시다아제 및 카탈라아제를 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 실시예에 따른 키트는 또 산화제를 포함할 수 있다. 예시적인 산화제는 과산화수소, 과산화요소, 탄산나트륨 과산화수소 또는 과붕산염을 포함한다. 본 기술분야의 전문가에 공지된 다른 산화제(oxidants; oxidizing agents)도 본 명세서에서 사용될 수 있다. 바람직한 산화제는 과산화수소 또는 과산화요소 및 이들의 혼합물이다.

전술한 바와 같이, 본 실시예의 키트는 또한 화학발광 인핸서를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 인핸서는 유기 용매 또는 완충액 내에서 가용성이고, 화학발광의 유기 화합물, 산화제 및 효소 또는 기타 생물학적 분자 사이의 발광 반응을 향상시키는 유기 화합물을 포함한다. 적절한 인핸서는 예를 들면 p-이오도페놀, p-브로모페놀, p-클로로페놀, 4-브로모-2-클로로페놀, 3,4-디클로로페놀과 같은 할로겐화 페놀 및 4-메틸페놀 and, 4-터트-부틸페놀, 3-(4-히드록시페닐) 프로피오네이트 등, 4-벤질페놀, 4-(2',4'-디니트로스티릴) 페놀, 2,4-디클로로페놀, p-히드록시시남산, p-플루오로시남산, p-니트로이시남산, p-아미노시남산, m-히드록시시남산, o-히드록시시남산, 4-페녹시페놀, 4-(4-히드록시페녹시)페놀, p-페닐페놀, 2-클로로-4-페닐페놀, 4'-(4'-히드록시페닐)벤조페논, 4-(페닐아조)페놀, 4-(2'-카르복시페닐아자)페놀, 1,6-디브로모나프토-2-올, 1-브로모나프토-2-올, 2-나프톨, 6-브로모나프트-2-올, 6-히드록시벤조티아졸, 2-아미노-6-히드록시벤조티아졸, 2,6-디히드록시벤조티아졸, 2-시아노-6-히드록시벤조티아졸, 데하이드로루시페린, 파이어플라이 루시페린, 페놀인도페놀, 2,6-디클로로페놀인도페놀, 2,6-디클로로페놀-o-크레졸, 페놀인도아닐린, N-알킬페녹사진 또는 치환된 N-알킬페녹사진, N-알킬페노티아진 또는 치환된 N-알킬페노티아진, N-알킬피리미딜-페녹사진 or 치환된 N-알킬피리미딜페녹사진, N-알킬피리딜페녹사진, 2-히드록시-9-플루오레논 또는 치환된 2-히드록시-9-플루오레논, 6-히드록시벤조옥사졸 또는 치환된 6-히드록시벤조옥사졸과 같은 알킬화 페놀을 포함한다. 다른 유용한 화합물은 p-페닐페놀 포스페이트 또는 p-이오도페놀 포스페이트 또는 기타 효소 분할기를 가지는 기타 페놀 포스페이트, p-페닐렌 디아민 및 테트라메틸 벤지딘과 같은 효소에 의해 분할될 수 있는 보호된 인해서를 포함한다. 기타 유용한 인핸서는 5-(n-테트라데카닐) 아미노 플루오레세인 등과 같은 플루오레세인을 포함한다.

본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 상기 키트는 형광 검출 분석물 또는 발색 검출 분석물을 이용하여 고정된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 호스라디시 페록시다아제 또는 그 유도체를 포함하는 대신, 이와 같은 키트는 전형적으로 알칼리 포스파타아제 및 형광 기질 또는 발색 기질을 포함한다. 포타슘 페리시아니드 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)와 같은 발색 생성물의 생산을 위한 산화제도 키트 내에 포함될 수 있다.

본 실시예의 키트는 또한 세포 또는 세포 추출물 내의 다수의 공통의 레포터 유전자의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 키트는 β-갈라토시다아제, β-글루크로니다아제, 분비된 알칼리 포스파타아제, 클로암페니콜 아세틸트랜스페라아제 및 루시페라아제를 위한 기질을 포함한다.

본 실시예의 키트는 효소반응을 위한 억제제를 더 포함한다. 이와 같은 억제제의 예는 레바미졸, L-p-브로모테트라미졸, 테트라미졸 및 5,6-디히드로-6-(2-나프틸)이미다조-[2,1-b]티아졸을 포함한다. 그러나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 일부의 실시예의 하나의 관점에 따르면, 세팔로스포린을 이 물질을 분산 또는 용해시킬 수 있는 조건 하에서 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함하는 세팔로스포린의 용해 또는 분산방법이 제공된다. 상기 나노구조는 상기 액체의 정렬된 유체분자에 의해 포위된 나노치수의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질과 상기 정렬된 유체 분자의 인벨롭은 물리적 정상 상태에 있다.

세팔로스포린은 용해 공정을 돕기 위해 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 첨가 전 또는 후에 용매 내에서 용해될 수 있다. 본 실시예는 물질의 용해도를 더욱 증대시키기 위해 극성 용매, 비극성 용매, 유기 용매(예, 에탄올 또는 아세톤) 또는 비유기 용매를 포함하는 임의의 용매의 사용을 고려하는 것이 인정된다.

상기 용매는 물질이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에 용해/분산된 상태로 유지되도록 용해 공정 중의 임의의 시간에 (완전하게 또는 부분적으로) 제거될 수 있다. 용매를 제거하는 방법은 증발(즉, 가열 또는 압력을 가하는 것에 의한 증발) 또는 임의의 다른 방법과 같이 본 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 필요한 경우 활성 성분을 함유하는 일회 이상의 투여 형태를 포함할 수 있는 FDA 승인 키트와 같은 분배장치 또는 팩 내에 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면 블리스터 팩(blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 포일을 포함한다. 이 팩 또는 분배장치에는 투약 설명문이 첨부될 수 있다. 또한, 팩 또는 분배장치에는 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부당국에 의해 규정된 형태의 용기와 연관된 통지서가 첨부될 수 있으며, 이 통지서는 조성물의 형태나 인체 또는 동물에의 투여에 대한 상기 정부당국의 승인을 반영한다. 이와 같은 통지서는 예를 들면 미국 식품의약품국에 의해 승인된 처방 약품 또는 승인된 생성물 삽입에 관한 라벨일 수 있다. 적합한 의약 담체 내에 조제된 본 실시예의 제제를 포함하는 조성물은 전술한 바와 같이 조제 후, 적절한 용기 내에 투입되고, 표시된 질환의 치료를 위한 라벨이 부착될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 ±10%를 나타낸다.

용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "가지는(having)" 및 그 동근어는 "포함하지만 한정되지 않는(including but not limited to)"의 의미이다.

용어 "구성되는(consisting of)"은 "포함하고 그리고 제한되는(including and limited to)"의 의미이다.

용어 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 조성물, 방법 또는 구조가 추가의 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있다. 그러나, 이것은 추가의 성분, 단계 및/또는 부분아 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적인 특징 및 새로운 특징을 실질적으로 변경하지 않는 것을 조건으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 단수 형태의 용어("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확하게 다른 의미를 지시하고 있지 않으면 복수의 의미를 포함한다. 예를 들면, "화합물(a compound)" 또는 "적어도 하나의 화합물(at least one compound)"은 그 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.

본 출원서의 전체를 통해, 본 발명의 다양한 실시예가 범위의 형식(range format)으로 기재될 수 있다. 범위의 형식의 기재는 단지 편리성 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야 하고, 본 발명의 범위의 융통성이 없는 한정으로서 해석되어서는 안 된다. 따라서, 본 범위의 기재는 그 범위 내의 개개의 수치뿐 아니라 모든 가능한 하위 범위를 특정하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 이 범위 내의 개개의 수치, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6 뿐 아니라, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 상기 범위의 폭에 무관하게 적용된다.

본 명세서에 수치 범위가 표시된 경우, 이것은 표시된 범위 내의 임의의 수치(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 어구 "첫 번째에 표시된 수와 두 번째에 표시된 수 사이를 범위로 하는/범위로 한다(ranging/ranges between a first indicate number and a second indicate number)" 및 "첫 번째에 표시된 수로부터 두 번째에 표시된 수까지를 범위로 하는/범위로 한다(ranging/ranges from a first indicate number to a second indicate number)"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 것으로서, 첫 번째에 표시된 수, 두 번째에 표시된 수, 및 이들 두 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 "방법(method)"은 화학분야, 약리학 분야, 생물학 분야, 생물화학분야 및 의학분야의 실행자에 의한 공지의 방법, 수단, 기법 및 공정으로부터 용이하게 개발될 수 있거나 공지된 방법, 수단, 기법 및 공정을 포함하는 주어진 과제를 완수하기 위한 방법, 수단, 기법 및 공정을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료(treating)"는 질환의 진행의 무효화, 실질적인 억제, 지연 또는 역전, 질환의 임상적 또는 감각적 증상의 실질적인 개선, 또는 질환의 임상적 또는 감각적 증상의 외관의 실질적인 방지를 포함한다.

명확화를 위해 별개의 실시예에 관련하여 기술되는 본 발명의 특정의 특징은 단일의 실시예로 조합하여 제공될 수 있다. 반대로, 간략화를 위해 단일의 실시예에 관련하여 기술되는 본 발명의 다양한 특징은 별개의 실시예로 또는 임의의 적합한 하위 실시예로 제공되거나, 본 발명의 임의 다른 실시예에 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 실시예에 관련하여 기술되는 특정의 특징들은, 상기 실시예가 그 요소들이 없는 상태에서 작용하지 않으면, 그 실시예들의 본질적인 특징으로 간주될 수 없다.

전술된 그리고 후술된 청구범위의 절에서 청구된 본 발명의 다양한 실시예 및 관점들은 다음의 실시예에 의해 실험적으로 지지된다.

실시예

이하, 전술한 기재와 함께 본 발명을 비제한적인 방식으로 설명하는 실시예에 대하여 설명한다.

일반적으로, 본 명세서에 사용되는 용어 및 본 발명에서 사용되는 실험과정은 분자 기술, 생물화학 기술, 미생물학 기술 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이와 같은 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 참조문헌의 예: "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); available immunoassays are extensively described in the patent and scientific literature, see, for example, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). 이들 모든 문헌은 본 명세서에 충분히 설명된 것처럼 참조로서 도입되었다. 다른 일반적인 참조문헌은 이 문헌을 통해 제공된다. 이 문헌의 공정들은 본 기술분야에 주지된 것으로 생각되는 것으로서, 독자의 편의를 위해 제공된다. 이 문헌에 포함된 모든 정보들은 본 명세서에 참조로서 도입되었다.

실시예 1

탄소 측정

본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따라 제조된 물, 나노구조 및 CO₂상을 포함하는 이산화탄소 부화된 조성물의 총 탄소량(TC), 총 유기탄소량(TOC) 및 무기탄소량(IC)의 측정이 수행되었다. 유사한 측정이 RO수(water)에 대해서 수행되었다. 모든 측정은 시버스 탄소 분석장치(Sievers Carbon Analyzer)를 이용하여 수행되었다.

표 1은 RO수 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 TOC, IC 및 TC　=　TOC　+　IC의 결과를 요약한 것이다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물(gas enriched nanostructure composition)"과 상호교환적인 의미를 가진다.

샘플 유형	바이얼 번호	Rep	TOC	IC	TC
RO수	1	1	96.4 ppb	168 ppb	264.4 ppb
		2	85.5 ppb	175 ppb	260.5 ppb
		3	83.1 ppb	178 ppb	261.1 ppb
		4	83.6 ppb	180 ppb	263.6 ppb
		평균	84.1 ppb	178 ppb	261.7 ppb
		SD	1.27 ppb	2.92 ppb	1.64 ppb
		RSD	1.51　%	1.42　%	0.63 %
	2	1	90.7 ppb	139 ppb	229.7 ppb
		2	87.7 ppb	141 ppb	228.7 ppb
		3	88.5 ppb	142 ppb	230.5 ppb
		4	90.7 ppb	144 ppb	234.7 ppb
		평균	89.0 ppb	142 ppb	231.3 ppb
		SD	1.55 ppb	1.53 ppb	3.08 ppb
		RSD	1.75　%	1.07　%	1.33　%
GENC	3	1	261 ppb	1.21 ppm	1.471 ppm
		2	284 ppb	1.22 ppm	1.504 ppm
		3	277 ppb	1.23 ppm	1.507 ppm
		4	278 ppb	1.24 ppm	1.518 ppm
		평균	280 ppb	1.23 ppm	1.510 ppm
		SD	3.79 ppb	10.0 ppm	7.37 ppb
		RSD	1.35　%	0.81　%	0.49　%
	4	1	178 ppb	250 ppb	428 ppb
		2	169 ppb	246 ppb	415 ppb
		3	167 ppb	243 ppb	410 ppb
		4	168 ppb	243 ppb	411 ppb
		평균	168 ppb	244 ppb	412 ppb
		SD	1.00 ppb	1.73 ppb	2.65 ppb
		RSD	0.60　%	0.71　%	0.64　%

표 1은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 RO수에 비해 더 많은 양의 탄소를 함유하는 것을 입증하고 있다. RO수에서, 평균 TC값은 261.7 ppb(바이얼 번호 1) 및 231.3 ppb(바이얼 번호 2)였다. ENPD액에서, 평균 TC값은 1.51 ppm(바이얼 번호 3) 및 412 ppb(바이얼 번호 4)였다. 따라서, GENC의 평균 TC값은 RO수의 평균 TC값의 약 1.5배 내지 약 6.5배이다.

실시예 2

초기 탄소 함량의 효과

부화된 나노구조 조성물의 다양한 배취(batches)가 본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따라 준비되었다. 탄소 함량이 각 배취의 제조 직후에 측정되었다. 추가의 측정은 전기화학 석출(ECD), ζ 포텐셜, pH 및 전도도이다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

방법

GENC 의 조제

GENC는 시스템(140)(도 4 참조)을 사용하여 조제되었다. 고체 분말은 바륨 티타네이트(BT) 또는 히드록시아파타이트(HA)였다. 액체는 주사 등급의 물(WFI)이었다. 기체는 적어도 99.9% 순도의 CO₂로서, 물에 직접 도입되거나 슬리이브(148)에 도입되었다.

탱크(154)는 약 2℃의 온도로 되는 10 L의 WFI로 충만시켰다. 약 0.45　g의 고체 분말이 약 859℃의 온도까지 가열시킨 노(142) 내에 장입되었다.

포텐셜

포텐셜은 ZetaSizer(모델 ZEN3600, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 측정되었다.

전기화학 석출

실험 배치는 도 7에 도시되어 있다. 의사(quasi) 2차원 셀(220)은 직경이 125mm로서 플렉시글라스(Plexiglas)의 베이스(222) 및 플렉시글라스의 커버(224)를 포함한다. 커버(224)가 베이스(222) 상에 위치되었을 때, 높이가 약 1mm인 의사 2차원 공동이 형성되었다. 2개의 동심상의 외측 전극 및 내측 전극(226, 228)이 셀(220) 내에 위치되었고, 12.4±0.1　V의 전압원(230)에 접속되었다. 외측 전극(226)은 90mm 직경의 링형상으로서 0.5mm의 동선으로 제작되었다. 내측 전극(228)은 0.1mm 두께 및 28mm의 직경을 가지는 디스크 형상이다. 외측 전극은 상기 전압원의 양극에 접속되었고, 내측 전극은 그 음극에 접속되었다.

얻어진 ECD 패턴은 0점 내지 10점의 기준으로 점수가 매겨졌다. 전형적으로, 8개의 정수값 숫자(0, 1, 3, 6, 7, 8, 9 및 10)가 점수로서 사용되었다. 이들 점수는 도 8의 대표 이미지에서 도시되었다. 점수 0 및 1은 "음(negative)"의 결과로서 표시되고, 점수 8, 9 및 10은 "양(positive)"의 결과로서 표시되었다.

하기의 프로토콜이 사용되었다:

(a) 실험용액의 조제

500ml의 용량측정 플라스크에서, 28.75g의 ZnSO₄(MW=287.5)를 RO수에 녹이고, 용량까지 채워서 0.2M의 ZnSO₄용액을 제조한다.

(b) 시스템 안정성

(i) RO수를 이용하여 ECD 셀을 철저히 세척한다.

(ii) 베이스에 약 12 ml의 0.2M의 ZnSO₄용액을 붓는다.

(iii) 베이스의 중앙에 내측 전극을 배치한다.

(iv) 베이스의 상측에 커버를 배치하여 기포를 회피하고, 커버의 상면에 중량체를 배치한다.

(v) 약 10분간 기다린다.

(vi) 전압원을 기동시킨다.

(vii) 네거티브 ECD 패턴이 발생될 때까지 (a)(i) 내지 (a)(vi)을 반복한다.

(c) ECD 시험

(i) 네거티브 패턴이 형성된 후, ECD 셀을 RO수로 세척한다.

(ii) ECD 셀의 커버 및 베이스의 양면에 약 12 ml의 GENC를 균일하게 전개하고, 약 30분간 기다린 후, 커버 및 베이스로부터 GENC를 배수한다.

(iii) 커버 및 베이스에 RO수를 붓고, 5분간 기다린 후, 배수하고, 이 과정을 한번 더 반복한다.

(iv) 베이스 상에0.2M의 ZnSO₄ 용액을 붓고, 베이스의 상측에 커버를 설치하여 기포를 회피한다.

(v) 약 30분간 기다린다.

(vi) 전압원을 기동시킨다.

(vii) 형성된 ECD 패턴을 관측 및 채점한다.

pH 시험

pH 측정이 USP 논문에 따라 에탄올 용액에 용해한 브로보티몰 블루(bromothymol bleu)(pH 6.0-7.6) 및 에탄올 용액에 용해한 페놀 레드(phenol red)(pH 6.8-8.4)를 이용하여 수행되었다.

전도도

전도도 지침은 1413 μS, 111.8 μS 및 12.88 μS였다. 이 측정은 교정(calibration) 후 수행되었다. 측정 전에, GENC의 샘플이 클래스-A 바이얼 내에 투입되고, 프로브가 초고순도의 물을 이용하여 세척되었다.

결과

표 2는 본 실시예의 CO₂ 부화 나노구조 조성물의 일부의 샘플에 대한 ECD 점수, IC 함량(ppm), pH값, 전도도(μS) 및 ζ 포텐셜의 목록이다. 표 2에는 또 부화된 나노구조 조성의 나노구조 코어를 형성하는 각 샘플의 조제에 사용된 고체 분말이 기재되어 있다. 상기 코어 물질은 바륨 티타네이트(BT) 및 히드록시아파타이트(HA)였다.

일부의 샘플은 일부의 시험이 수행되지 않았고, 수행되지 않은 시험의 항목은 공란이다. 샘플 번호 15에서, 고체 분말의 유형이 기록되지 않았고, 샘플 번호 15에 대한 "코어" 항목은 공란이다.

표 2는 pH, 전도도 및 ζ 포텐셜은 일반적으로 IC 함량과 함께 상승한다는 것을 입증한다. 표 2는 또 높은 IC 함량은 일반적으로 높은 ECD 점수를 초래한다는 것을 입증한다.

도 9는 IC 함량의 함수로서의 전도도를 도시하는 그래프이다. 또한 전도도는 IC 함량과 함께 상승하는 것을 입증하는 회귀직선(regression line)도 도시되어 있다.

샘플 번호	코어	ECD	초기 IC	pH	전도도	ζ
1	BT	7	0.497 ± 0.10	6.61 ± 0.16	20.50 ± 12.30	-7.09
2	BT	8	6.950 ± 1.89	7.56 ± 0.26	207.06 ± 19.	-5.29
3	BT	8	2.863 ± 0.09	6.58 ± 0.79	15.15 ± 1.17	-35.87
4	BT	6	1.962 ± 0.53	7.33 ± 0.38	65.98 ± 36.55	-6.67
5	BT	8	0.711 ± 0.16	6.83 ± 0.30	24.58 ± 7.38
6	BT	10	0.450 ± 0.53	7.04 ± 0.04	92.18 ± 5.09
7	BT	8	1.452 ± 0.37	7.05 ± 0.07	47.95 ± 5.73	-12.40
8	BT	10	0.863 ± 0.15	6.80 ± 0.14	43.60 ± 2.83
9	BT	10	0.696 ± 0.05	5.75 ± 0.64	15.45 ± 2.33
10	BT	9	2.162 ± 0.04	6.54 ± 0.25	17.76 ± 5.19	-22.80
11	BT	6	0.697 ± 0.02	6.64 ± 0.34	14.17 ± 1.99	-4.44
12	BT	9	1.630 ± 0.03	6.37 ± 0.20	9.23 ± 1.00	-5.67
13	BT	6	1.047 ± 0.10	6.72 ± 0.24	24.30 ± 10.25
14	BT	10	1.233 ± 0.03	7.10 ± 0.00	25.75 ± 0.78	-6.28
15		7	1.753 ± 0.06	7.15 ± 0.21	15.05 ± 0.49	-14.00
16	HA	8	0.723 ± 0.15	7.25 ± 0.07	35.75 ± 2.62
17	HA	7	0.864 ± 0.08	6.80	17.80	-13.10
18	HA		0.799 ± 0.03
19	HA		0.923 ± 0.15
20	HA	9	2.876 ± 0.84	7.70	53.00	-15.37
21	HA		0.845 ± 0.08	12.20	5.80
22	HA		0.307 ± 0.11	6.40	25.50
23	HA		2.179 ± 0.09	6.30	23.70	-25.25
24	HA		3.251 ± 1.30	7.40	69.60	-15.25
25	HA	9	1.664 ± 0.15	6.80	35.20	-4.88
26	HA		3.155 ± 0.07	7.10	90.00	-10.25
27	HA		3.066 ± 0.22	7.40	63.20	-3.57
28	HA		7.514 ± 1.29
29	HA		0.992	7.20	39.10
30	HA		1.446	7.50	40.20
31	HA		1.148	9.10	121.50
32	HA		0.872 ± 0.18	7.20	60.20
33	HA		0.546	7.40	13.70
34	HA	7	0.472	6.90	8.00
35	HA		0.276	7.70	3.50
36	HA		0.356	7.10	2.50
37	HA		0.373	7.00	3.80
38	HA		0.343	6.60	10.80

실시예 3

가열의 효과

본 발명의 다양한 예시적인 실시예에 따라 조제된 물, 나노구조 및 CO₂상을 포함하는 이산화탄소 부화 조성물에 대해 가열시험을 수행하여, 조성물의 IC 함량에 미치는 플레이트 가열의 효과를 조사하였다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

물질 및 방법

5개의 GENC 샘플(샘플번호 1 내지 5)이 전술한 실시예 2에서 기술된 바와 같이 조제되었다.

샘플 번호 1 및 4에서, 코어 물질은 HA이고, 실험전 IC 함량은 약 0.7ppm; 샘플 번호 2 및 3에서, 코어 물질은 HA이고, 실험전 IC 함량은 약 1.5ppm; 샘플 번호 5에서, 코어 물질은 BT이고, 실험전 IC 함량은 약 1.9ppm이었다.

초고순도의 물(UPW)이 대조로서 사용되었다.

각 샘플은 1개당 50mL인 2개의 복제물로서 조제되었다.

모든 샘플들은 60℃의 온도까지 사전에 설정된 핫플레이트 상에서 2시간 동안 가열되었다.

2시간 후 모든 샘플들은 핫플레이트로부터 제거되었다. 각 샘플의 제1의 복제물의 IC 함량은 TOC 계기의 오토샘플러 모드(autosampler mode)를 이용하여 측정되었다. 각 샘플의 제2의 복제물은 실온의 탁상에 폐쇄된 상태 및 비차광(no light protection) 상태에서 1주 동안 보관되었다. 1주 후, 이 보관된 샘플들의 IC가 TOC 계기의 오토샘플러 모드를 이용하여 측정되었다.

1주 보관 복제물의 IC 결과에 기인되어, CO₂의 용해 및 이온화를 배제하기 위해 Ph 측정이 실시되었다.

결과

표 3 및 도 10은 2시간 동안의 플레이트 가열 후 중량 손실을 표시한 것이다.

샘플	초기 중량 [g]	가열 후 중량 [g]	중량 손실
대조	48.911 ± 0.291	48.473 ± 0.119	0.9 %
1	48.946 ± 0.191	48.595 ± 0.174	0.72 %
2	49.572 ± 0.290	49.091 ± 0.422	0.97 %
3	49.008 ± 0.106	47.668 ± 0.320	2.74 %
4	48.822 ± 0.790	47.146 ± 0.434	3.43 %
5	49.096 ± 0.183	47.698 ± 0.770	2.85 %

표 4 및 도 11은 플레이트 가열 직후 및 1주 후의 IC 함량을 표시한 것이다.

샘플	IC 함량 [ppm]
	가열 전	가열 후	가열 1주 후
대조	0.029 ± 0.038	0.181 ± 0.009	0.287 ± 0.008
1	0.799 ± 0.022	0.710 ± 0.012	0.930 ± 0.017
2	0.872 ± 0.126	0.878 ± 0.013	1.057 ± 0.016
3	1.307 ± 0.091	1.101 ± 0.012	4.241 ± 0.092
4	1.179 ± 0.063	3.368 ± 0.062	9.885 ± 0.128
5	1.900 ± 0.178	1.652 ± 0.028	2.706 ± 0.037

표 5 및 도 12는 플레이트 가열 1주 후의 pH값을 표시한 것이다.

샘플	초기 pH	1주 후 pH
대조	7.0	6.45
5	6.9	7.0
1	6.9	6.7
2	6.4	7.1
3	6.3	7.4
4	7.2	6.9

표 3-5 및 도 10-12는 하기를 입증한다:

비교적 낮은 초기 IC 함량을 가지는 샘플 번호 1 및 4는 동일한 중량 손실 및 유사한 IC 함량 변화를 나타내었다. 이들 중량 손실 및 IC 함량 변화는 대조 샘플의 것과도 유사하였다.

비교적 높은 초기 IC 함량을 가지는 샘플 번호 2, 3 및 5는 유사한 중량 손실을 나타내었다. 이 중량 손실은 기타 샘플들 및 대조 샘플의 것과는 상이하였다.

핫플레이트 상에서 60℃로 2시간 가열 후 측정된 IC 함량 변화의 관점에서 샘플 번호 2를 제외한 모든 샘플은 IC 함량값에서 약간의 변화를 보이는 동일한 거동을 나타냈다.

샘플 번호 1, 4 및 대조 샘플을 핫플레이트 상에서 60℃로 2시간 가열 후 측정된 IC 함량 변화 및 실온에서 1주간 보관한 후 측정된 IC 함량 변화는 유사하였다(즉, 0.1-0.2 ppm 만큼 증가).

샘플 번호 2, 3 및 5를 실온에서 1주간 보관한 후 측정된 IC 함량 변화도 유사하였다. 이들 각 샘플에서 IC 함량은 초기값 및 2시간 가열 후 측정된 값에 비해 크게 증가되었다.

이 실험은 높은 IC 함량을 가지는 조성물은 중량 손실이 더 크므로 낮은 IC 함량을 가지는 조성물에 비해 가열 중에 더 많은 물을 증발시킨다는 것을 입증한다. 높은 초기 IC 함량을 가지는 조성물의 상기 열 처리 후의 IC 함량은 보관 후에 증가하였다. 이와 같은 증가는 이들 샘플의 pH값도 상승하므로 대기의 CO₂의 용해에 기인되는 것이 아니다. 이것은 본 실시예의 조성물이 안정 또는 준안정 기체상을 가진다는 것을 나타낸다. IC 함량의 증가는 초기 IC 함량이 1ppm을 초과하는 조성물에서 더욱 현저하다. 따라서, 핫플레이트 기법은 본 실시예의 부화된 조성물의 농축 및 재생(reclamation)을 위한 적합한 방법이다.

실시예 4

프로토타입(prototype)의 CO ₂ 리사이클링 장치

CO₂의 리사이클링을 위해 사용될 수 있는 3개의 프로토타입 장치가 본 발명의 실시예에 따라 제작되었다. 이 장치는 본 발명의 일부의 실시예에 따라 조제된 CO₂ 부화 나노구조 조성물을 포함하였다. 이 장치는 더욱 무선주파수 발생장치 및 안테나 형태의 여기장치를 포함하였다. 안테나는 전술한 바와 같은 유출구를 가지는 슬리이브 내에 배치되었다. 유출구 밸브 및 유입구 밸브가 전술한 바와 같이 CO₂의 방출 및 포집을 위해 사용되었다. 상기 3개의 프로토타입의 장치는 그 성능이 상이하다. 제1, 제2 및 제3의 장치의 액체실(도 5의 참조번호 42를 참조할 것)의 용적은 각각 50　ml, 100　ml 및 200　ml이다. 제2의 프로토타입의 장치의 이미지는 도 13에 도시되어 있다.

상기 프로토타입의 장치가 CO₂ 농도 수준 시험을 받았다. 각 장치에 대해, 그 유출구에서 30초의 간격으로 CO₂의 농도 수준이 측정되고, 기록되었다. 이 시험은 유출구 밸브가 복수의 시나리오에 따라 단속적으로 동작하는 중에 수행되었다. 이 동작 시나리오는 이하에서 폐쇄/개방 비율로서 표시된다. 상기 X/Y 표기법은 밸브가 X초 동안 폐쇄되고, Y초 동안 개방되는 동작 시나리오를 의미한다. 모든 실험에서, 상기 여기장치의 동작 시나리오는 1/10의 활성/비활성 비율에 따른다.

결과는 도 14-53에 시간의 함수로서의 CO₂ 농도 수준의 그래프로서 작도되어 있다. 여기서, CO₂ 수준은 체적ppm으로 표시되고, 시간은 분으로 표시되어 있다. 모든 시험은 t　=　0에서 개시된다.

도 14-23은 제1의 장치의 실험결과를 보여준다. 도 14-23에 도시된 결과는 각각 30/1, 20/1, 15\1, 10\1, 5\2, 3\2, 2\2, 1\3, 1\3 및 1\4의 작동 시나리오에 대응한다.

도 24-39는 제2의 장치의 실험결과를 보여준다. 도 24-26에 도시된 결과는 30\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 27-29에 도시된 결과는 20\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 30-31에 도시된 결과는 15\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 32-39에 도시된 결과는 각각 12\1, 10\1, 8\1, 5\2, 3\2, 2\2, 1\2 및 1\3의 작동 시나리오에 대응한다.

도 40-53은 제3의 장치에 대한 실험결과를 보여준다. 도 40에 도시된 실험결과는 30\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 41-42에 도시된 실험결과는 20\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 43-49에 도시된 실험결과는 15\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 50에 도시된 실험결과는 10\1의 작동 시나리오에 대응하고; 도 51에 도시된 실험결과는 5/2의 작동 시나리오에 대응하고; 도 52-53에 도시된 실험결과는 1/3의 작동 시나리오에 대응한다.

전술한 결과들은 충분히 높은 CO₂ 농도는 많은 작동 시나리오에 대해 달성될 수 있다는 것을 입증한다. 도시된 바와 같이, 프로토타입의 장치의 유출구에서의 CO₂ 농도 수준은 대략 300 체적ppm 이하인 대기의 수준을 상당히 초과한다. 일반적으로, 상기 프로토타입의 장치는 1000 체적ppm 정도의 국부 농도를 발생한다. 다수의 실험에서, 극히 높은 수준(10,000 체적ppm을 초과하는 수준)의 순간적인 폭증이 관찰되었다.

실시예 5

고-액 결합

본 실시예는 극저온 투과전자현미경(cryo-TEM)을 사용하여 코어 물질에 그 주변의 유체 분자가 결합하는 것을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 이것은 구조적 유체계의 현대적 기법이다. 이 분석은 다음의 단계를 포함할 수 있다. 즉, 제1단계에서 본 발명의 부화된 나노구조 조성물이 유리질(vitreous)의 샘플을 제공하기 위해 초고속으로 냉각될 수 있고, 제2단계에서 상기 유리질 샘플이 극저온에서 TEM을 통해 조사될 수 있다. 나노구조를 둘러싸고 있는 평행흔(striations)은 그 결정질 구조를 암시하고, 어두운 코로나는 코어를 포위하고 있는 유체 분자의 정렬된 구조를 나타낼 수 있으므로 전체 나노구조는 물리적 정상 상태에 있다.

실시예 6

광학 활성

본 실시예는 유도된 장범위 질서의 흔적(signatures)을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 이 목적을 위해, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 광학 활성(원편광 및 타원편광의 관점에서)이 원편광 이색성(Circular Dichroism; CD) 방법을 이용하여 측정될 수 있다.

CD 분광법은 수성 용액을 통과하는 좌회전(L) 편광 및 우회전(R) 편광 사이의 흡수차이를 검출하는 것을 목표로 한다. 이와 같은 차이는 물에 침지된 광학 활성된 (키랄) 분자들, 분자 또는 나노입자의 분산 또는 물이나 용액 내의 임의의 다른 유도된 정렬된 구조로부터 생성될 수 있다. 측정은 실온에서 Jasco K851 CD 편광계를 이용하여 수행될 수 있다. DDW는 기준치로서 사용될 수 있다.

상기 스펙트럼은 190nm 내지 280nm의 사이에서 1nm 및 10초의 증분(increment)을 사용하여 스캐닝될 될 수 있다. 감도 및 해상도를 증대시키기 위해, (1mm 이하의 정상 작동 모드에 비해) 매우 긴 광학경로가 10 cm의 석영 큐벳(quartz cuvette)을 사용하여 확보될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 CD 스펙트럼 내에 비소멸 신호(non vanishing signal)가 존재하는 것은 그 내부에 장범위 지향성 질서가 형성되는 것을 나타낼 수 있다. 이 같은 장범위 질서는 나노입자 및 나노기포의 망상구조(network)에 의해 형성될 수 있다.

실시예 7

염료의 효과

본 실시예는 염료를 이용하여 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 상호작용을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 전술한 바와 같이 조제된 부화된 나노구조 조성물은 에탄올 내에 용해된 Ru을 주성분으로 하는 염료(N3)를 이용하여 염색될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 제1의 큐벳이 염료 용액에 24시간 동안 접촉될 수 있다. 상기 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 제2의 큐벳에 다음의 프로토콜이 수행될 수 있다: (i) 교반, (ii) 공기류를 이용한 건조, 및 (iii) 염색. 대조군으로서 순수한 물을 수용하는 2개의 추가의 큐벳에 대해 상기 시험이 수행될 수 있다.

순수한 물의 경우에 대비되는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서의 염료의 색상 변화는 전자의 구조 변화에 기인되거나 또는 염료의 산화에 기인되어 염료 스펙트럼에 영향을 미치는 나노구조와의 상호작용을 나타낼 수 있다.

실시예 8

고 g원심분리

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 상에 가해지는 고 g 원심분리의 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 수용하는 튜브가 고 g값(약 30g)에서 원심분리될 수 있다. 원심분리 후에 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 적분 광산란(Integrated light scattering; ILS) 측정이 수행될 수 있다. 튜브의 상하측 부분에서의 측정치가 다른 것은 나노구조가 주 액체(물)의 비중보다 낮은 비중을 가진다는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 9

박테리오파아지 반응

본 실시예는 박테이오파아지의 유형화(typing)에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 황색포도구균(staphylococcus aureus; SA)의 파아지 유형화를 위한 국제 표준 키트의 박테리오파아지가 조사될 수 있다(예, 박테리오파아지 번호 6 및 83A). 한천 플레이트(agar plate)를 위한 배지는 Nutrient agar Oxoid No2(카탈로그 번호 CM 67 Oxoid Ltd.) + CaCl₂일 수 있다. 오토클레이브 멸균 후, 배지 1리터당 20 ml의 CaCl₂를 첨가시킬 수 있다. 액체 배양물을 위한 배지는 Nutrient Broth No2 Oxoid일 수 있다: 28 g/1리터.

각 박테리오파아지는 1 및 100 RTD(Routine Test Dilution; 통상의 시험 희석도)에서 시험될 수 있다. 각 파아지는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 시험 배지 및 대조배지에서 동시에 배양될 수 있다. 박테리아 용해 표면(bacteriolysis surface)은 표면적 측정용 컴퓨터 소프트웨어인 "Sketch"를 사용하여 측정될 수 있다. 반복 측정을 이용한 분산분석(Analysis-of-variance; ANOVA)은 광학 밀도 분석을 위해 사용될 수 있고, 2방향(ways)의 ANOVA는 마이크로소프트 윈도우™ SPSS™ 소프트웨어를 이용한 용해 표면적의 측정을 위해 사용될 수 있다.

대조에 대비하여 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 파아지 반응 면적이 증대하는 것은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 파아지에 대해 동일한 경향의 작용을 한다는 것을 입증할 수 있다.

RTD 시험에서, 대조 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 사이의 상이한 시간 동향(trends)은 파아지의 반응에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 입증할 수 있다.

실시예 10

파아지 -박테리아 상호작용

본 실시예는 람다(λ) 파아지에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. λ 파아지는 유기체의 게놈 DNA를 표현하기 위해 분자 생물학에서 사용된다. 본 실험은 표준 λ 파아지 상호작용 적용에 의존할 수 있다. 실험군의 물질은 용매로서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 조제될 수 있다. 대조군의 물질은 이하에 기술되는 바에 따라 조제될 수 있다. 대조군의 Ph는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 pH(7.2 내지 7.4)로 조절될 수 있다.

1) LB 배지

10 g의 박토 트립톤(Bacto Tryptone), 5 g의 효모 추출물, 10 g의 NaCl을 1000 ml의 증류수에 용해할 수 있고, 다음에 오토클레이브에 의해 멸균할 수 있다(121℃ 및 1.5 기압에서 45분간).

2) LB 플레이트

15 g의 박토 아가(Bacto Agar)를 1000 ml의 LB 배지에 첨가할 수 있고, 혼합한 후 전술한 바와 같이 오토클레이브에 의해 멸균할 수 있다. 50℃까지 냉각시킨 후, 상기 배지를 다수의 멸균 플라스틱 플레이트 내에 부을 수 있다. 이들 플레이트를 사용 전에 2일간 예비배양하는 것이 가능하다.

3) 탑 아가로스(Top Agarose) 0.7　%

100 ml의 LB 배지를 0.7 g의 화학적으로 순수하고, 전기영동 등급의 아가로스(Difco 또는 기타 공급자의 제품)와 혼합한 다음, 오토클레이브에 의해 멸균할 수 있다(121℃, 1.5 기압에서 45분간).

4) MgSO₄ - 10 mM

1.2 g의 MgSO₄를 1000 ml의 증류수에 용해시키고, 오토클레이브에 의해 멸균할 수 있다.

5) 말토오스 20　% (w/v)

200 g의 말토오스를 1000 ml의 증류수에 용해시키고, 20 μm의 필터를 통한 여과에 의해 멸균할 수 있다.

6) MgSO₄ - 1 M

120.37 g의 MgSO₄를 1000 ml의 증류수에 용해시키고, 오토클레이브에 의해 멸균할 수 있다.

7) 10 mM의 MgSO₄ 및 0.2　%의 말토오스를 가지는 LB

100 μl의 MgSO₄ 1M 및 100 μl의 말토오스 20%를 99.8 ml의 LB 매체에 첨가할 수 있다.

8) SM 완충액(파아지 보관 완충액)

5.8 g의 NaCl, 2 g의 MgSO₄, 50 ml의 1M 트리스 염산(Tris Hydrochloric acid)(pH 7.5), 5 ml의 2　%(w/v) 젤라틴을 증류수에 용해시켜 최종 1000 ml의 체적을 얻고, 다음에 오토클레이브에 의해 멸균하는 것이 가능하다.

9) 박테리아 균주(숙주)

대장균 XL1 블루 MRA (Stratagene).

10) 파아지:

λ GEM 11 (Promega).

11) LB 플레이트 상에서의 박테리아 배양

XL1 세포를 박테리아 접종의 일반 과정에 따라 세균 루우브(bacteriological loop)를 구비하는 LB 플레이트 상에 분산시킬 수 있다. 이 플레이트를 37℃에서 16시간 동안 배양할 수 있다.

12) LB 액체 배지에서 박테리아 배양

XL1 세포의 단일 콜로니가 LB 플레이트로부터 채취되고, OB 액체 배지에 접종된 후, 37℃에서 16시간 동안(밤새), 200 rpm으로 쉐이킹을 가하면서 배양될 수 있다.

13) 숙주 박테리아 균주의 파지에 의한 감염

XL1 세포가 10 mM의 MgSO₄ 및 0.2%의 말토오스에 의해 보충된 LB 배지에 접종될 수 있다. 600 nm의 파장에서 0.6의 탁도(turbidity)가 달성될 때까지(약 4-5 시간), 200 rpm의 쉐이킹 하에서 37　℃에서의 배양시 지속되었다. 성장된 배양물을 4000 rpm에서 5분간 원심분리할 수 있다. 상징액을 버리고, 박테리아를 600 nm의 파장에서 0.6의 탁도가 달성될 때까지 10 mM의 MgSO₄ 내에 재현탁시킬 수 있다. 파아지를 포함하는 필요한 체적의 SM 완충액을 200 ml의 재현탁 박테리아에 첨가할 수 있다. 37　℃에서 15분간 배양 후, 2개의 대안적인 공정을 수행할 수 있다:

(i) 용해물(lysate)의 조제를 위해, 적절한 용적의 LB 배지를 숙주-파이지 혼합물에 첨가하고, 200rpm으로 쉐이킹하는 상태에서 37℃에서 16시간(밤새) 동안 배양할 수 있다.

(ii) 고체 배지(플레이크) 상에 파아지가 출현하도록 하기 위해, 용융 탑 아가로스(50℃)를 숙주-파아지 혼합물 상에 붓고, 신속히 혼합한 다음 예열된 LB 플레이트 상에 펼쳐놓는다. 아가로스가 응고된 후, 37℃에서 16시간 동안(밤새) 배양을 수행할 수 있다.

14) 파아지 DNA의 추출

박테리아 용해물을 6000rpm에서 5-10분간 원심분리하여 박테리아 잔해를 침전시킬 수 있다. 상징액을 포집하고 14000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 파아지 입자들을 침전시킬 수 있다. 상징액을 버리고, 파아지 팰릿을 젤라틴이 없는 SM 완충액 내에 재현탁시킬 수 있다. 핵산분해효소(nucleases; 임의의 공급업자에 의한 리보뉴클레아제(RNase) 및 데옥시리보뉴클레아제(DNase))를 재현탁 파아지에 첨가하여 1 μl의 파아지 현탁액 당5 - 10 바이스 단위(Weiss units)의 최종 농도를 얻을 수 있다. 37℃에서 30분간의 배양 후, 파아지의 DNA를 하기의 공정에 의해 추출할 수 있다.

(i) 페놀:클로로포름:이소-아밀-알코올(25:24:1 v/v)을 이용한 추출;

(ii) 클로로포름에 의한 페놀 오염의 제거;

(iii) 0.3 M의 최종농도의 포타슘 아세테이트 및 1체적의 이소-프로판올의 석출;

(iv) 70% 에탄올을 이용한 세척; 및

(v) 건조 및 추가 분석을 위해 증류수 내에 재현탁.

대조에 비해 낮은 파아지 희석(10^-3 및 10^-4)에서 PFU가 증가하는 것은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 파아지의 숙주 감염 능력에 영향을 미친다는 것 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 박테리아 수용체와 파아지 입자 사이의 친화성을 증대시킨다는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 11

마이크로타이터 플레이트( Microtiter Plate )에 대한 부착

본 실시예는 마이크로타이터 플레이트에 대한 코아귤라아제-음성 포도구균의 부착에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

점액 다당류(slime polysaccharide)의 생산은 생물막의 발생 및 유지에 불가결한 것이고, 박테리아의 독성 인자로서 중요한 역할을 한다[Gotz F., "Staphylococcus and biofilms," Mol Microbiol 2002, 43(6):1367-78]. 점액은 표면에 대한 박테리아의 점착 및 축적에 의한 다층의 클러스터를 형성을 촉진한다. 점액은 또 숙주의 면역 방어 및 항생물질 치료를 방어한다[Kolari M. et al., "Colored moderately thermophilic bacteria in paper-machine biofilms," to apear in J Ind Microbiol Biotechnol 2003]. 박테리아에 의해 생성된 생물막은 산업에서도 문제를 일으킬 수 있다.

점액의 보호에 대한 현재의 대부분의 개념은 생물막의 새로운 항감염 활성을 위한 연구 및 생물막을 복잡하게 구성하는 새로운 생체적합성 물질의 연구에 관련이 있다.

코아귤라아제-음성 포도구균의 실리콘에 대한 점착은 항균제의 서브-MIC에 의해 개질될 수 있다는 것이 종래에 입증되었다[Besnier JM et al., "Effect of subinhibitory concentrations of antimicrobial agents on adherence to silicone and hydrophobicity of coagulase-negative staphylococci," Clin Microbiol Infect 1996, 1(4):244-248]. 이 효과는 점액-생성 균주 및 비-점액-생성 균주에서 상이하고, 이들 항균제의 억제 효과의 기구 또는 소수성의 개질과 무관하므로, 이것은 소수성에 관련되지 않는 일부의 표면 성분이 인비트로 점착에 역할을 할 수 있다는 것을 암시한다.

이식 관련 감염의 심각한 병원균인 표피 포도구균의 내균성은 항생제의 접근성 및 숙주의 방어기구에 의한 살균성을 약화시키는 글리코칼릭스 점액(glycocalyx slime)의 생성에 관련된다[Konig DP et al., "In vitro adherence and accumulation of Staphylococcus epidermidis RP 62 A and Staphylococcus epidermidis M7 on four different bone cements," Langenbecks Arch Surg 2001, 386(5):328-32]. 생체재료에 관련된 감염을 방어하기 위해 개발된 항생제를 함유하는 다양한 골 시멘트에 대한 인비트로 연구는 생체재료-접착성 박테리아의 완전한 박멸을 항상 입증해 주지는 않는다. 점액의 점착으로부터 더욱 양호한 방어기구를 찾아내기 위해 더욱 노력하였다.

또, 표면의 상호작용은 점액의 점착을 개질할 수 있다. 예를 들면, 파룩(Farooq) 등은 젤라틴이 함침된 폴리에스터 이식편(grafts)이 대동맥 이식편 삽입의 개 모델에서 표피 포도구균의 생물막 감염을 억제한다는 것을 입증하였다[Farooq M et al., "Gelatin-sealed polyester resists Staphylococcus epidermidis biofilm infection," J Surg Res 1999, 87(1):57-61]. 젤라틴이 함침된 폴리에스터 이식편은 코아귤라아제-음성 포도구균 생물막 감염에 대해 인비보 내성을 보여주었다.

본 실시예의 예언적 실험의 목적은 점액 생성 표피 포도구균의 플라스틱에 대한 점착에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 조사하는 것이다.

점액 점착은 후술하는 분광광도계 광학밀도(optical density; OD)를 이용하여 정량적으로 실험할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 보통의 물을 이용한 TSB 내에서의 철야 배양물을 대응하는 배지를 이용하여 1:2.5로 희석시키고, 총 체적이 250 μl인 멸균 마이크로타이터 조직 배양 플레이트에 설치한 다음 37℃에서 배양할 수 있다. 상기 플레이트를 수돗물로 3회 세척하고, 크리스털 바이올렛으로 염색하고, 수돗물로 3회 더 세척할 수 있다. 염색 후, 염색된 점착 박테리아 막의 OD를 550nm 파장을 이용하는 MicroElisa 자동 독출장치를 이용하여 측정할 수 있다. 박테리아 배양물의 OD는 450nm 및 630nm의 이중 필터를 이용하여 염색을 하기 전에 측정할 수 있다. 각 박테리아 균주의 시험은 4회 실시할 수 있다.

상기 실험은 주기적으로 점액의 점착을 평가하기 위해 설계될 수 있다. 반응속도 평가를 위한 시각표는 18, 20, 22, 24 및 43시간일 수 있다. 균주는 동일한 플레이트 상에서 평가되었다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 표준 배지의 조제를 위해 사용할 수 있고, 표준 오토클레이브 멸균 처리할 수 있다.

점착값은 ANOVA를 사용하여 동일 플레이트 시험에 대한 반복 측정과 비교될 수 있고, 그룹화 인자(grouping factors)는 플레이트와 균주였다. 3방향 ANOVA는 마이크로소프트 윈도우™ SPSS™ 11.0을 사용한 다양한 플레이트 시험을 위해 사용될 수 있다.

대조에 비해 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서의 높은 점착 상태가 되는 점착의 차이는 상기 나노구조에 의해 도입되는 새로운 질서(new order)를 나타내는 것으로서, 물의 소수성 능력의 변화를 유도할 수 있다.

실시예 12

박테리아 콜로니 성장

고초균(Bacillus subtilis)의 콜로니 성장이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 조사될 수 있다. 대조군은 역삼투 정제(RO)수 내의 동일 박테리아를 포함할 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서의 콜로니 성장의 가속이 예상된다.

실시예 13

고체상 매트릭스에 대한 거대분자의 결합

무수한 생물학적 처리 및 반응을 미세적정 플레이트(Microtitration plates), 막, 비이드, 칩 등과 같은 고체상 매트릭스 상에 수행할 수 있다. 고체상 매트릭스는 예를 들면, 소수성 특성, 친수성 특성, 전기적 특성(예, 하전, 극성) 및 친화성 특성을 포함하는 다양한 물리적 및 화학적 특성을 가질 수 있다.

본 예언적 실험의 목적은 다양한 물리적 및 화학적 특성을 가지는 미세적정 플레이트 및 막에 대한 생물학적 물질의 결합에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 조사하기 위한 것이다.

다수의 유형의 미세적정 플레이드가 사용될 수 있다(예, MaxiSorp™ 이것은 친수성 영역/소수성 영역이 혼합되어 있고, IgG와 다른 분자에 대한 높은 결합능력 및 친화성을 특징으로 한다; PolySorp™ 이것은 소수성 표면을 가지고, 지질에 대한 높은 결합능력 및 친화성을 특징으로 한다; MedimSorp™ 이것은 PolySorp™ 및 MaxiSorp™ 사이에 계면화학을 구비하고, 단백질에 대한 높은 결합능력 및 친화성을 특징으로 한다; Non-Sorp™, 이것은 생물분자에 대한 낮은 결합능력 및 친화성을 특징으로 하는 미처리된 미세적정 플레이트이다; MultiSor™ 이것은 친수성 표면을 구비하고, 글리칸에 대한 높은 결합능력 및 친화성을 특징으로 한다; 배지 결합 미세적정 플레이트, 이것은 친수성 표면을 구비하고, 250 ng/cm2의 IgG에 대해 결합능력을 구비한다; 탄소 결합 미세적정 플레이트, 이것은 탄수화물에 대해 공유 결합한다; 고결합성 미세적정 플레이트, 이것은 높은 흡착능력을 가진다; 고결합성 흑색 미세적정 플레이트, 이것도 높은 흡착능력을 가진다).

미세적정 플레이트에 대한 생물분자의 결합 효율은 4개의 범주로 실험될 수 있다: 이온 강도, 완충액 pH, 온도 및 시간.

결합 실험은 미세적정 플레이트에 형광 표지 생물분자를 코팅하거나 동일 유형의 표지된 생물분자와 표지되지 않은 생물분자의 혼합물을 코팅하고, 세척에 의해 결합되지 않은 분자들을 제거하고, 플레이트 상에 잔류하는 형광신호를 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다.

하기의 프로토콜이 사용될 수 있다:

1) 형광 표지된 생체분자를 결합용 완충액 내에서 상이한 농도(통상 0.4 - 0.02 μg/ml)로 사전 희석하는 단계. 각 희석은 2종의 결합용 완충액 내에서 수행될 수 있다: (i) 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물; 및 (ii) 역삼투에 의해 정수된 대조수(control water).

2) 각 농도의 100 μl의 샘플을 3개씩 미세적정 플레이트에 분배하고, 초기 형광 수준을 측정하는 단계.

3) 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 또는 37　℃에서 2시간 동안 배양하는 단계.

4) 코팅 용액을 폐기하는 단계.

5) 150 μl의 세척용액을 각 웰(well)에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반하는 단계. 이 세척단계는 3회 반복할 수 있다. 전형적인 세척용액은 1 x PBS, pH 7.4; 0.05 % Tween20™; 및 0.06 M NaCl을 포함한다.

6) 0.01 M의 수산화나트륨을 포함하는 200 μl의 형광 독출 용액(fluorescence reading solution)을 첨가하고, 실온에서 180분 동안 또는 밤새 배양하는 단계.

7) 485　nm의 여기파장, 535 nm의 방출파장 및 10 플래쉬(flashes)의 최적이득을 이용하여 형광 최저 모드(fluorescence bottom mode)를 이용하여 형광을 독출하는 단계.

전술한 플레이트에 대한 당단백질(플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate; FITX)를 이용하여 표지되거나 표지되지 않은 150,000 D의 IgG)의 결합 효율에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 조사할 수 있다. IgG는 주로 친수성 분자의 혼합물로 구성된 폴리클로날 항체이다. 이 분자들은 그 보편적인 영역에 탄수화물 친수성 영역을 가지고, 가변적인 영역은 약간 소수성이다. 이와 같은 유형의 분자들은 매우 높은 효율(650 ng/cm²로 MaxiSorp™ 플레이트와 결합하는 것이 공지되어 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 IgG의 결합 효율을 향상시킬 것으로 예상된다.

땅콩(낙화생) 응집소(PNA)의 결합 효율에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과를 MaxiSorp™ 및 Non-Sorp™ 플레이트 상에서 조사할 수 있다. PNA는 각각 27,000 달톤의 4개의 동일한 당단백질 서브유닛으로 구성된 110,000 달톤의 렉틴(lectin)이다. PNA 렉틴은 특수 형태의 당 잔기를 이용하여 친수성 영역을 통해 당단백질과 당지질을 결합한다. PNA는 소수성 영역도 가진다. 이 분석은 3종의 코팅 완충액의 사용을 포함할 수 있다: (i) 카보네이트 완충액(pH 9.6), (ii) 아세테이트 완충액(pH 4.6) 및 (iii) 포스페이트 완충액(pH 7.4). 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 PNA의 결합을 억제할 것으로 예측된다.

핵산의 결합 효율에 미치는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 효과는 MaxiSorp™, Polysorp™ 및 Non-Sorp™ 플레이트 상에서 조사할 수 있다. 일반적으로, DNA 분자는 폴리스티렌 플레이트에 잘 결합되지 않는다. 수천 달통의 분자량을 가지는 소형의 단일사슬 DNA 분자인 올리고뉴클레오티드의 결합은 더욱 문제가 된다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 코팅 완충액에 염을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서 결합 효율을 향상시킬 것으로 예측된다.

실시예 14

DNA 의 단리 및 정제

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 PCR 생성물의 정제에 미치는 효과를 PCR 키트의 재구성에 의해 연구할 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 사용하면 핵산 증폭 공정의 효율이 향상될 것으로 예측된다. 하기의 예언적 실험에서, 프로메가 키트(Promega kit)인 "Wizard - PCR preps DNA 정제 시스템" (A7170)이 기술된다.

Promega Wizard™ 키트의 사용은 하기의 단계를 포함한다.

1) DNA를 수지에 결합하기 위한 조건을 형성하기 위해, 정제 완충액을 PCR 샘플과 혼합한다;

2) DNA를 수지에 결합하기 위해 수지 현탁액과 PCR 혼합물을 혼합하고, 수지 샘플을 주사기에 적용하고, 진공을 형성한다;

3) 이소프로판올을 첨가하고, 결합되지 않은 DNA를 제거하기 위해 진공에 의해 용액을 흡입한다;

4) 물을 이용하여 결합된 DNA를 용출시킨다;

5) 후에 더욱 상술하는 바와 같이, 겔 전기영동법을 수행한다.

키트의 재구성은 키트에 공급된 원수(original water)(이하, 대조라 함)를 이용하여 수행하거나, 단계 1, 2 및 4에 대해서는 키트의 수용액을 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물로 교체하여 수행할 수 있다. 단계 3에서 키트에 들어있는 동일한 80　%의 이소프로판올 용액이 모든 실험에서 사용될 수 있다.

하기의 프로토콜이 겔 전기영동을 위해 사용될 수 있다:

(a) 겔 용액: 8　% PAGE (+ 요소)를 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 조제할 수 있다;

(b) 405μl 10　% APS and 55　μl TEMED (Sigma T-7024) to 50 ml의 겔 용액에405μl의 10　% APS 및 55　μl의 TEMED(Sigma T-7024)를 포함하는 중합 시약을 첨가한다;

(c) 상기 겔 용액을 겔 카세트(Rhenium Ltd, Novex NC2015, 09-01505-C2)에 붓고, 플라스틱 콤(comb)을 설치하고, 실온에서 30분 동안 중합을 허용한다;

(d) 상기 콤을 제거하고, 테이프를 벗겨내서 단일의 장치의 양면 상에 2개의 겔이 조립될 수 있도록 한다;

(e) RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내의 작용 완충액- TBE x1을 내측 체임버의 겔의 상측까지 충만시키고, 외측 체임버의 겔의 높이의 약 1/5까지 충만시킨다;

(f) TBE Ficoll, 브로모페놀 블루 및 요소(SBU)를 포함하는 샘플 완충액 내에 샘플을 희석시키는 것에 의해 샘플을 조제하고, DNA 샘플과 1:1로 혼합한다;

(g) 8 -10 μl의 혼합물을 각 웰 내에 로딩한다;

(h) 전원을 100　V로 설정하고, 유색 색소(브로모페놀 블루)가 바닥으로부터 1 cm의 높이에 도달할 때까지 DNA의 이동이 계속되도록 한다.

하기의 프로토콜이 겔 염색 시각화 촬영 및 분석을 위해 사용될 수 있다.

(a) 쉐이킹 상태 하에서 15분 동안 1xTBE 내에 1 U/μl의 GelStar™ 함유하는 염색 용액에 겔을 위치시킨다;

(b) 상기 겔을 1xTBE 완충액 내에서 30분 동안 탈염색시킨다;

(c) 상기 겔을 자외선 테이블 상에 올려놓고; 365 nm의 광을 이용하여 DNA를 관찰한다;

(d) DC120™ 디지털 카메라를 이용하여 겔의 사진을 촬영하고, 이 디지털 정보를 추가의 분석을 위해 저장한다.

(100개의 반응에 대한) 하기의 프로토콜에 따라, ApoE 유전자 특이적 프라이머(단편의 크기는 265 bp)를 이용하여 인간 DNA로부터 PCR을 조제할 수 있다:

(a) 적절한 일련번호로 0.2　μl의 PCR-튜브에 마아크를 붙인다;

(b) 2.5　μl의 40 μg/ml의 인간 DNA(Promega G 3041) 또는 물을 상기 튜브에 첨가한다;

(c) 14.5 μl의 DDW를 이용하여 17　μl까지 조절한다;

(d) 3630 μl의 PCR 혼합물을 조제한다;

(e) 각 튜브에 33 μl의 혼합물을 첨가한다;

(f) PCR 장치 내에 상기 샘플을 위치시킨다;

(g) PCR 프로그램을 작동한다;

(h) 8　%의 PAGE 겔 상에서 5 μl의 각 생성물을 분석한다;

(i) 반응물을 -20℃에서 보관한다.

실시예 15

컬럼 성능

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 컬럼의 성능에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 각각의 반응이 실시예 14의 프로토콜에 따르는 복수(예, 100개 이상)의 PCR 반응물이 조제하고 결합하여 5 ml의 원액(stock solution)을 제조할 수 있다. 본 실험은 2개의 단계를 포함할 수 있다. 그 중 예비 단계(이하, 단계 A라 함)는 상기 컬럼에 가해지는 용적이 결합 및 용출에 미치는 영향을 조사하는 것을 목적으로 할 수 있고, 주요 단계(이하, 단계 B라 함)는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 컬럼의 성능에 미치는 영향을 조사하는 것을 목적으로 할 수 있다.

단계 A에서, 4개의 컬럼(예, 컬럼 1-4)에 50, 150, 300 또는 600　μl의 원료 PCR 생성물 용액을 가하고, 13개의 컬럼(예, 컬럼 5-17)에 300　μl의 원료 PCR 용액을 가할 수 있다. 모든 컬럼들을 50 μl의 물을 이용하여 용출시킬 수 있다. 용출된 용액을 하기 순서로 레인 7-10에 로딩할 수 있다: 레인 7 (원형 PCR, 농도 인자×1), 레인 8 (원형×3), 레인 9 (×6) 및 레인 10 (×12). 컬럼 5-17(×6)의 모든 용출물의 "혼합물(mix)"을 레인 11에 로딩할 수 있다. 레인 1-5에는 컬럼 1-4의 용출물과 원형 농도(×1)로 사전 희석된 컬럼 5-17의 "혼합물"을 로딩할 수 있다. 레인 6은 래더 마아커(ladder marker)일 수 있다.

하기의 프로토콜은 단계 A에서 사용할 수 있다:

1) 각 샘플에 대해 사용될 Wizard™ 미니컬럼 및 주사기에 마아크를 하고, 진공 매니폴드 내에 삽입한다;

2) 100 μl의 각각의 직접 PCR 정제 완충 용액을 마이크로튜브 내에 분주한다;

3) 약하게 와류시킨다;

4) 1 ml의 각 수지 용액을 첨가하고, 1분간 3회 약하게 와류시킨다;

5) 상기 주사기에 수지/DNA 혼합물을 첨가하고, 진공을 가한다;

6) 2ml의 80　% 이소프로판올 용액을 각 주사기에 첨가하여 세척한 후 진공을 가한다;

7) 30초간 상기 진공을 유지함으로써 수지를 건조한다;

8) 상기 미니컬럼을 1.5 ml의 미세원심 튜브로 이동시킨다;

9) 2분간 10000 g에서 원심분리한다;

10) 상기 미니컬럼을 청정한 1.5 ml의 튜브로 이동시킨다;

11) 50 μl의 관련되는 물(뉴클리아제를 함유하지 않는 물 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물)를 첨가한다;

12) 20초간 10000 g에서 원심분리한다;

13) 50 μl의 보관 마이크로튜브에 이동시키고, -20℃에서 보관한다;

14) 제2의 용출 사이클을 위해 단계 9-11을 반복실시한다;

가시화 단계:

15) 6 μl의 각 샘플을 6 μl의 로딩 완충액과 혼합한다;

16) 10 μl의 각 혼합물을 아크릴아미드 요소 겔(AAU)에 로딩하고, 상기 겔을 70 V, 10mA에서 영동(run)시킨다;

17) 상기 겔을 Gel Star™ 용액(50ml TBE에 용해된 5 μl의 10000 u 용액)을 이용하여 염색하고, 실온에서 15분간 쉐이킹을 가한다;

18) TBE 완충액 내에서 실온에서 30분간 쉐이킹을 가하여 겔을 탈염색시킨다;

19) 상기 겔을 촬영한다.

단계 B에서, 단계 A의 "혼합된(mixed)" 용출물은 "농축된 PCR 용액"으로서 사용할 수 있고, 또 12개의 컬럼에 가할 수 있다. 컬럼 1-5에는 키트 시약을 사용하여 각각 8.3　μl, 25　μl, 50　μl, 75　μl 및 100　μl가 가해질 수 있다. 이들 컬럼을 50　μl의 키트 물에 의해 용출할 수 있고, 5　μl의 각 용출물을 겔 상의 대응하는 레인에 가할 수 있다. 컬럼 7-11은 컬럼 1-5와 같이 그러나 결합 및 용출 완충액으로서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 처리될 수 있다. 상기 샘플들은 대응하는 겔 레인에 가할 수 있다. 컬럼 13은 단계 A의 컬럼 5-17의 "혼합물"과 함께 대조의 역할을 할 수 있다.

하기의 프로토콜은 단계 B에서 사용할 수 있다:

1) 각 샘플에 대해 사용될 Wizard™ 미니컬럼 및 주사기에 마아크를 하고, 진공 매니폴드 내에 삽입한다;

2) 100 μl의 각각의 직접 PCR 정제 완충 용액을 마이크로튜브 내에 분주한다;

3) 약하게 와류시킨다;

4) 1 ml의 각 수지 용액을 첨가하고, 1분간 3회 약하게 와류시킨다;

5) 상기 주사기에 수지/DNA 혼합물을 첨가하고, 진공을 가한다;

6) 2ml의 80　% 이소프로판올 용액을 각 주사기에 첨가하여 세척한 후 진공을 가한다;

7) 30초간 상기 진공을 유지함으로써 수지를 건조한다;

8) 상기 미니컬럼을 1.5 ml의 미세원심 튜브로 이동시킨다;

9) 2분간 10000 g에서 원심분리한다;

10) 상기 미니컬럼을 청정한 1.5 ml의 튜브로 이동시킨다;

11) 50 μl의 뉴클리아제를 함유하지 않는 물 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 첨가한다;

12) 20초간 10000 g에서 원심분리한다;

13) 50 μl의 보관 마이크로튜브에 이동시키고, -20℃에서 보관한다;

14) 제2의 용출 사이클을 위해 단계 11-13을 반복실시한다

가시화 단계들은 단계 A와 동일할 수 있다.

레인 1-5에 비해 레인 7-11의 밀도가 더 높은 것은 본 실시예의 나노부화된 나노구조 조성물이 키트 시약에 비해 더 많은 DNA를 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 16

겔 전기영동에 의한 DNA 의 단리

겔 전기영동은 크기와 형상에 기초하여 DNA 분자를 측정 및 단리하기 위해 보통 사용되는 방법이다. DNA 샘플은 DNA 분자를 포위하는 작용을 하는 완충액의 역할을 하는 겔의 상측부분에 가해진다. 상기 겔은 전류가 가해지면 양전하로 대전되어, 음전하로 대전된 DNA 단편들을 겔의 하류측으로 이동시킨다. 그 이동 속도는 더 작은 분자 및 코일(coiled)을 이루거나 폴드(folded)된 분자에 대해서는 더 빠르고, 크기가 크고 언폴드(unfolded)된 분자에 대해서는 더 느리다. 이동이 완료된 후, DNA는 형광 표지가 부착됨으로써 자외선 조명 하에서 가시화된다. 상기 DNA는 또 막에 이동시켜 고감도의 효소 착색에 의해 가시화될 수도 있다. DNA는 겔 상에서의 그 위치 및 밴드 강도에 따라 평가된다.

하기는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 겔 전기영동에 의한 DNA 이동에 미치는 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

2가지 유형의 DNA가 사용될 수 있다: (i) PCR 생성물, 280 염기쌍; 및 (ii) 하기의 크기의 11개의 DNA 단편으로 구성되는 래더 DNA: 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1030 bp. 상기 겔은 실시예 14의 프로토콜에 따라 조제될 수 있다.

RO수의 존재 하에서의 이동속도는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서의 이동속도에 비해 더 빠를 것으로 예측된다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 RO수에 비해 DNA 이동의 지연을 유발시킬 것으로 예측된다. 이와 같은 결과는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 영향 하에서 상기 DNA의 구조는 DNA의 폴딩(folding)이 감소(un-folding)되는 방식으로 변화된다는 것을 암시하는 것일 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서의 DNA의 언폴딩은 DNA 분자와 RO수 사이에 비해 DNA 분자와 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 사이에 더욱 강력하게 수소결합된 상호작용이 존재한다는 것을 암시하는 것일 수 있다.

실시예 17

효소 활성 및 안정성

효소 활성 및 안정성 양자의 증대는 효소를 사용하는 모든 공정의 효율의 향상 및 비용의 절약을 위해 중요하다. 효소는 장기간의 보관 중 및 장기간의 활성 중에 그리고 과도하게 희석된 경우에 전형적으로 스트레스에 노출되어 안정성의 손실 및 결국에는 활성의 손실이 유발된다.

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 효소의 활성 및 안정성에 미치는 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 이 예언적 연구는 생물공학 산업에서 일반적으로 사용되는 2종의 효소에 관련된다: 알칼리성 포스파타아제(AP), 및 β-갈락토시다아제. 2가지 형태의 AP가 사용될 수 있다: 비결합 형태 및 AP가 스트렙-아비딘(ST-AP)에 결합된 결합 형태.

하기는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 희석된 효소에 미치는 영향을 조사할 수 있는 예언적 실험을 기술한다. 상기 희석은 첨가제가 없는 상태 및 중성(Ph=7.4)의 상태에서 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에서 수행될 수 있다.

비결합 형태의 알칼리성 포스파타아제

알칼리성 포스파타아제(Jackson INC)는 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 연속적으로 희석시킬 수 있다. 희석된 샘플 1:1,000 및 1:10,000은 실온에서 튜브 내에서 배양될 수 있다.

상이한 시간 간격에서, 효소 활성은 10 μl의 효소를 90 μl의 pNPP 용액(AP 특이적 비색 기질(colorimetric substrate))과 혼합하는 것에 의해 측정될 수 있다. 분석은 미세적정 플레이트(각 시험점에 대해 4회 이상 반복 시험). 색 강도는 ELISA 독출장치에 의해 405 nm의 파장에서 측정될 수 있다.

효소 활성은 RO수에 의한 희석 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 의한 희석에 대해 시간 t=0에서 측정될 수 있다. 안정성은 22 시간(t=22) 후의 활성 및 48 시간(t=48) 후의 활성을 t=0에서의 활성으로 나눈 값으로서 결정될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서의 활성은 RO수의 존재 하에서의 활성에 비해 더 높을 것으로 예측된다.

결합 형태의 알칼리성 포스파타아제

효소를 다른 분자에 결합하는 것은 전형적으로 그 안정성을 증대시켜 준다. 효소는 전형적으로 고농도에서 저장되고, 사용하기 전에 희망하는 희석도로 희석된다. 하기는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 장기간 동안 고농도로 보관되는 효고에 미치는 안정화 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한 것이다.

스트렙트-아비딘 알칼리성 포스파타아제(Sigma)는 RO수 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 1:10 및 1:10,000로 희석될 수 있다. 희석된 샘플은 튜브 내에서 실온에서 5일간 배양시킬 수 있다. 모든 샘플들을 1:10,000의 최종 효소 농도까지 희석시킨 후, 후에 더욱 상술하는 바와 같이 활성을 측정할 수 있다. 효소 활성은 시간 t=0 및 5일 후에 측정될 수 있다.

효소는 RO수 내에서 보다 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 실질적으로 더욱 활성을 가질 것으로 예측된다.

β- 칼락토시다아제

β-갈락토시다아제를 이용한 실험은 전술한 알칼리성 포스파타아제의 예언적 실험에 대해 사용된 프로토콜과 동일한 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 단 효소 유형, 농도 및 배양 시간은 다르게 할 수 있다. β-갈락토시다아제(Sigma)는 RO수 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 연속적으로 희석될 수 있다. 상기 샘플들은 1:330 및 1:1000로 희석될 수 있고, 실온에서 배양될 수 있다.

효소의 활성은 37℃에서 15분간 10 μl의 효소를 100 μl의 ONPG 용액(β-갈락토시다아제 특이적 비색 기질)를 혼합하고, 50 μl 정지용액(1M의 Na₂HCO₃)을 첨가하는 것에 의해 0, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 120 시간의 간격을 두고 측정될 수 있다. 분석은 미세적정 플레이트에서 수행될 수 있다(각 시험점으로부터 약 8회 반복실시). 405 nm의 파장의 ELISA 독출장치를 이용하여 색 강도를 측정할 수 있다.

효소의 활성은 RO수 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 대한 각 희석에 대해 시간 t=0에서 측정할 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서의 활성이 RO수의 존재 하에서의 활성에 비해 더 높을 것으로 예측된다.

건조 알칼리성 포스파타아제의 활성 및 안정성

많은 효소들은 보관 전에 건조된다. 건조 공정 및 그 후의 건조된 상태에서의 장기간의 보관은 효소의 활성에 영향을 미친다는 것이 공지되어 있다. 하기는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 건조된 알칼리성 포스파타아제의 활성 및 안정성에 미치는 안정화 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

알칼리성 포스파타아제(Jackson INC)는 후에 더욱 기술되는 바와 같이 RO수 내에서 그리고 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 1:5000로 희석될 수 있다.

복수(예, 9개)의 미세적정 플레이트를 5 μl 용액의 분할량으로 충전시킬 수 있다. 1개의 플레이트는 후에 더욱 기술되는 바와 같이 시간 t=0에서 효소 활성에 대해 실험되고, 나머지 플레이트는 37℃에서 밤새 건조될 수 있다. 건조 공정은 건조 분위기 내에서 16시간 동안 수행될 수 있다.

2개의 플레이트는 먼저 실온까지 냉각시키고, 이어서 실온에서 100 μl의 pNPP 용액을 첨가하는 것에 의해 효소의 활성을 시험할 수 있다. 색 강도는 ELISA 독출장치에 의해 405 nm에서 측정될 수 있고, 안정성은 후에 더 기술되는 바와 같이 계산될 수 있다. 다른 플레이트들은 30분간 60℃로 가열된 후 효소 활성이 측정될 수 있다. 건조 및 열처리의 목적은 효소를 손상시키기 위한 것이다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 효소의 활성을 적어도 부분적으로 안정화시킬 것으로 예측된다.

실시예 18

DNA 의 고착

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하 또는 비존재 하에서 DNA의 유리 비이드에 대한 고착의 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호 교환적인 의미를 가진다.

유리 비이드와 같은 고체 지지체에 폴리뉴클레오티드를 고정하는 것은 분자 생물학 연구 분야 및 의약 분야에서 최상의 유익을 제공할 수 있다. 전형적으로, DNA 조작은 PCR, 결찰, 제한 및 트랜스포메이션을 포함하는 순차적으로 일어나는 일련의 반응을 포함한다. 각 반응은 그 고유의 특이적 완충액이 필요한 고유의 반응 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 전형적으로, 각 반응의 사이에 DNA 샘플 또는 RNA 샘플은 침전된 다음, 새로운 적절한 완충액 내에서 재구성되어야 한다. 반복되는 침전 및 재구성은 시간이 걸리고, 더 중요한 것은 출발 물질이 손실되는 것인데, 물질이 희귀한 것인 경우 더 문제가 된다.

하기는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 PCR 반응 중에 유리 비이드의 존재 하의 DNA에 미치는 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

PCR은 얻어진 단편의 크기가 750bp가 되도록 T7 포워드 프라이버(TAATACGACTCACTATAGGG) 서열번호:1 및 M13 리버스 프라이버(GGAAACAGCTATGACCATGA) 서열번호:2를 이용하여 750개의 염기쌍 유전자에 의해 클론화된 pBS 플라스미드로부터 조제될 수 있다. 상기 프라이머들은 200μM (200pmol/μl)의 농도의 PCR-급의 물 내에서 구성될 수 있다. 이들은 이어서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 1:20으로 희석되어 복합 혼합물을 조제하기 위한 10μM의 작업 농도가 될 수 있다. 예를 들면, (200μM 원료 중의) 1 μl의 각 프라이머는 18 μl의 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 결합 및 희석되고, 혼합 및 원심분리에 의해 침강될 수 있다. 농축된 DNA는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 의해 1:500으로 희석되어 2ρg/μl의 작업 농도가 될 수 있다. 상기 PCR은 Biometra T- Gradient PCR 장치 내에서 수행될 수 있다. 효소는 완충액 Y 내의 SAWADY Taq DNA 폴리머라아제(PeqLab 01-1020)일 수 있다.

PCR 혼합물은 하기와 같이 조제될 수 있다:

시약	농도	X1	최종 농도
완충액 Y	X10	1μl	X1
dNTPs	10mM each	0.2μl	0.2mM
Taq	5u/μl	0.08μl	0.4 유닛
GENC		3.22μl
유리 비드 - 어떤 처리도 하지 않음	수개의 비즈의 팁 엔드(tip end)를 잡고 열려 있는 튜브의 상측에서 팁의 상부를 가볍게 두드린다 - 수개의 유리 비드가 관 내로 낙하한다. 너무 많은 양의 유리 분말은 PCR 반응을 저해하므로 혼합물 중 분말의 양은 거의 볼 수 없는 것이 바람직하다.

샘플을 혼합하되 교반하지 않는 것이 바람직하다. 이들을 94 ℃에서 1 분 동안 PCR 장치에 놓아둔 다음 꺼냈다. 그 후, 4.5 μl의 PCR 혼합물을 깨끗한 튜브 내로 분취하고, 0.5 μl의 프라이머 혼합물과 5 μl의 희석 DNA를 순서대로 첨가하였다. 혼합 후, 샘플을 PCR 장치에 놓아두었고, 다음의 PCR 프로그램을 사용하였다:

시간	온도	단계
10 초	94℃	단계 1
10 초	50℃	단계 2
10 초	74℃	단계 3

상술한 바와 같이 분석하기 위해, PCR 반응의 생성물을 8% PAGE 겔 위에 부하하였다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 유리 비이드의 존재 하에서의 PCR반응 중에 PCR 생성물의 시각화를 위해 필요할 것으로 예측된다.

실시예 19

실시간 PCR

DNA 및 cDNA 핵산 서열의 검출 및 정량화는 범죄 과학, 의학, 약물 개발 및 분자 생물학 연구를 포함하는 광범위한 적용분야에 대해 중요하다.

실시간 PCR은, 아가로스 겔 내의 에티디움 브로마이드의 시각화에 의존하는 공지의 PCR의 종점 검출(endpoint detection)에 대조적인 각 PCR 사이클 중에(즉, 실시간으로) 앰플리콘 생성물의 지표로서, PCR 반응 중에 방출되는 형광을 관측한다.

실시간 PCR은 그것의 높은 감도로 인해 특히 극소량의 DNA 또는 cDNA의 검출 및 정량화에 특히 관련된다. 감도 및 재현성을 개선하는 것 및 실시간 PCR을 위해 필요한 반응 체적을 감소시키는 것은 고가의 샘플을 절약하는데 도움이 된다.

이 실시예는 본 실시예의 부화 나노구조 조성물이 실시간 PCR 반응의 감도 및 반응체적에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

감도 시험

실시간 PCR 반응은 어플라이드 바이오시스템 7300 PCR 시스템(Applied Biosystem 7300 PCR System) 상에서 SYBR Green 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 반응들은 96개의 웰 플레이트(Corning, NY) 상에서 수행할 수 있다. 프라이머 서열은 하기와 같다:

포워드 프라이머: CACCAGACTGACTCCTCATT 서열번호:3

리버스 프라이머: CCTGTTGCTGCACATATTCC 서열번호:4

각각 12개로 된 2세트의 샘플을 후에 상술되는 바와 같이 제조될 수 있다. 그 중 하나는 뉴클레아제 무함유 물을 이용한 것이고, 다른 하나는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 것이다. 각 세트당 13배의 혼합물이 조제될 수 있다. 상기 샘플은 하기의 프로토콜에 따라 조제될 수 있다:

성분	μl/웰	13개의 반응 당 푸울(μl)
포워드 프라이머	0.5	6.5
리버스 프라이머	0.5	6.5
ABI SYBR 그린 혼합물	10	130
물 또는 GENC	6	78

상기 cDNA 샘플은 물이나 GENC 내에서 1:5 내지 1:2560의 범위 사이에서 연속적으로 희석될 수 있다(총 10개의 희석). 1:5의 희석은 3 μl의 원형 cDNA +12μl의 H₂O 또는 GENC를 이용하여 조제할 수 있다. 후속되는 희석은 7.5 μl의 샘플 및 7.5 μl의 H₂O 또는 GENC를 이용하여 조제될 수 있다.

17 μl의 혼합물을 3 μl의 cDNA 샘플에 첨가할 수 있다. 각 세트 내에서의 제1의 반응은 희석되지 않은 cDNA 샘플일 수 있다.

표준형 곡선은 선택된 레벨(역치 사이클(C_t))을 초과하는 형광을 위해 요구되는 PCR 사이클의 개수 대 희석된 샘플에 대한 대응하는 Log cDNA 농도로서 작도될 수 있다. 이 표준형 곡선은 공정의 반응 효율인 선형성의 측정치이다.

해리(dissociation) 곡선은 희석된 샘플을 위한 각각의 표준형 곡선의 반응에 대해 작도될 수 있다.

표준형 곡선 및 해리 곡선의 양자는 자동 기준치 결정(automatic baseline determination)을 이용하여 작도될 수 있다. 표준형 곡선만은 0.2의 수작업에 의한 배경 절단(manual background cut-off)에서 그리고 각 세트로부터의 동일하거나 동일하지 않은 이상치(outlier values)를 제거한 후에 작도될 수 있다

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에서 물에 비해 더 높은 회기값(regression value)이 존재할 것으로 예측된다. 이와 같은 결과는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재가 더 광범위한 동적 농도 범위에 대해 더 정확한 양적 평가를 제공한다는 것을 나타낼 수 있다. 또 동적 범위 및 증폭 효율이 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 더욱 높아질 것으로 예측된다.

체적 실험

하기는 물 대신 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 실시간 PCR 반응의 실행이 감도를 유지하면서도 더 낮은 반응 체적을 가능하게 할 가능성을 실험하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

모든 물질들은 감도를 측정하기 위해 위에서 사용된 것과 동일한 것일 수 있다. cDNA 샘플은 1:80로 희석시킬 수 있다.

다음의 반응 체적이 시험될 수 있다: 5μl, 10μl 및 15μl. 3종의 체적 세트들의 각각은 일련의 8개의 반응을 포함한다: GENC를 구비하거나 구비하지 않는 3중의 반응 및 하나의 음성 대조(음의 주형). 반응 체적의 감소 이외에도, SYBR green 용액과 용매(물 또는 GENC)의 비율이 후술되는 바와 같이 변화될 수 있다.

성분	표준 20　μl 반응	체적 시험을 위한 20　μl 반응	5　μl의 체적 시험 푸울 30μl	10　μl의 체적 시험 푸울 60 μl	15 μl의 체적 시험 푸울 80 μl
포워드 프라이머	0.5	0.5	0.75	1.5	2
리버스 프라이머	0.5	0.5	0.75	1.5	2
ABI SYBR green 혼합물	10	5	7.5	15	20
물/GENC	6	11	16.5	33	44
cDNA 샘플	3	3	4.5	9	12

각 체적 시험을 위한 푸울(pools)은 표시된 바와 같이 물 또는 GENC 내에서 준비될 수 있고, 소망의 체적으로 반응 웰 내에 분할 공급될 수 있다. 모든 결과는 0.2의 배경 절단치로 독출할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 수행된 반응이 더 재현가능성이 우수할 것으로 예측된다.

실시예 20

초음파 시험

이 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 초음파 공명장치 내에서 일련의 초음파 시험하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 증류수 내에서의 초음파 속도의 측정은 ResoScan® 연구 시스템(Heidelberg, Germany)을 이용하여 수행될 수 있다.

검정( Calibration )

ResoScan®연구 시스템의 쌍방의 셀에 0.005　% Tween이 보충된 표준수가 충만되고, 20℃에서 등온측정 중에 측정될 수 있다. 쌍방의 셀들 사이의 초음파 속도의 차이는 이하에서 상술되는 바와 같이 등온측정 시의 0의 값으로서 사용될 수 있다.

등온 측정

ResoScan® 연구 시스템의 셀 1을 기준으로서 사용하고, 증류수로 충만시킬 수 있다. 셀 2는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물로서 충만시킬 수 있다. 절대 초음파 속도는 20℃에서 측정될 수 있다. 실험값들을 비교할 수 있도록 하기 위해, 상기 초음파 속도들을 20.000　℃까지 교정할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 대해 측정된 절대 초음파 속도는 증류수에 대해 측정된 절대 초음파 속도에 비해 더 빠를 것으로 예측된다.

실시예 21

칩에 대한 RNA 의 하이브리드화

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하 및 비존재 하에서의 DNA 칩에 대한 RNA 샘플들 사이의 하이브리드화의 강도를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

GEArray Q Series Human Signal Transduction PathwayFinder Gene Array: HS-008가 사용될 수 있다.

RNA는 Rneasy 키트(QIAGEN)를 사용하여 인간 임파구로부터 추출될 수 있다. 상기 RNA는 GEArray AmpoLabeling-LPR 키트(카탈로그 번호 L-03)를 사용하여 제작사의 프로토콜에 따라 표지될 수 있다.

어레이에 대한 RNA 샘플의 하이브리드화는 제조회사의 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 본질적으로 막을 탈이온수 내에서 5분간 예비습윤시킨 다음 60℃에서 2시간 동안 예열된 GEAhyb 하이브리드화 용액(GEArray) 내에서 배양할 수 있다. 표지 RNA를 상기 하이브리드화 용액에 첨가한 다음 60℃에서 밤새 방치하여 상기 막과 하이브리드화시킨다. 상기 막은 세정 후에 오토레디오그래피를 위해 2초 또는 10초간 X선 필름에 노출시킬 수 있다.

DNA 칩에 대한 하이브리드화는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 증대될 것으로 예측된다. 이것은 동일 노출시간 후의 신호 강도를 관측하는 것에 의해 입증될 수 있다.

실시예 F21

완충 능력

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 완충 능력에 미치는 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

수산화나트륨 및 염산을 50 ml의 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 첨가하고, 하기의 프로토콜에 따라 Ph가 측정될 수 있다.

수산화나트륨 적정: 1 μl 내지 15 μl의 1M 수산화나트륨을 첨가한다.

염산 적정: 1 μl 내지 15 μl의 1M 염산을 첨가한다.

RO수에 대해 필요한 동일 pH 수준에 도달하기 위해 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 더 많은 양의 수산화나트륨 또는 염산이 필요할 것으로 예측된다. 이와 같은 결과는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 완충 능력을 가지는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 22

용매 능력

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 물에는 용해되지 않는 것으로 알려져 있는 다이제인(Daidzein)-다우노마이신(daunomycin) 복합체(CD- Dau), 다우노루비신(Daunrubicine)(세루비딘 히드로클로라이드; Cerubidine hydrochloride), 및 다이제인의 t-boc 유도체(tboc-Daid)를 용해하는 능력을 조사하기 위한 다양한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

CD - Dau 의 안정화

필요 농도: 3mg/ml GENC.

특성: 상기 물질은 DMSO, 아세톤, 아세토니트릴 내에서 용해된다.

특성: 상기 물질은 EtOH 내에서 용해된다.

5종의 상이한 유리 바이얼을 준비할 수 있다.

(i) 5mg CD-Dau + 1.2ml GENC.

(ii) 1.8mg CD-Dau + 600μl 아세톤.

(iii) 1.8mg CD-Dau + 150μl 아세톤 + 450μl GENC (25% 아세톤).

(iv) 1.8mg CD-Dau + 600μl 10% ^*PEG (폴리에틸렌 글리콜).

(v) 1.8mg CD-Dau + 600μl 아세톤 + 600μl GENC.

상기 샘플들을 와류시키고, 분광광도계 측정을 수행할 수 있다. 바이얼 (ii), (iii) 및 (v)는 개방 상태로 방치하여 아세톤을 증발시킬 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 CD-Dau 용해 능력을 평가하기 위해 CD-Dau의 용매를 비교할 수 있다.

다우노루비신( Daunorubicine )( 세루비딘 히드로클로라이드 )의 안정화

필요 농도: 2mg/ml

2mg의 다우노루비신 +1ml의 GENC를 제1의 바이얼 내에 준비하고, 2mg의 다우노루비신 + 1ml의 RO수를 제2의 바이얼 내에 준비할 수 있다. 상기 물질은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 RO수의 양방에서 모두 용이하게 용해될 것으로 예측된다.

t- boc 의 안정화

필요 농도: 4mg/ml

1.14ml의 EtOH를 18.5 mg의 t-boc(유상 물질(oily material))을 함유하는 제1의 바이얼에 첨가할 수 있다. 다음에 이것을 2개의 바이얼로 나누고, 1.74 ml의 GENC 또는 RO수를 이들 바이얼에 첨가하여 그 용액이 25 % EtOH를 포함하도록 할 수 있다. 분광광도계의 측정 후, 용액의 용매를 증발시키고, 본 실시예의 나노구조 조성물을 양방의 바이얼에 첨가하여 각 바이얼의 최종 체적이 2.31 ml가 되게 할 수 있다. 상기 2개의 바이얼 내의 용액을 하나의 깨끗한 바이얼에 합치고, 진공 상태 하에서 출하를 위해 포장할 수 있다.

본 실시예의 나노구조 조성물을 첨가하고, 용매를 가열에 의해 증발시킨 후의 상기 물질은 본 실시예의 나노구조 조성물 내에서 용해될 것으로 예측된다.

실시예 23

용매 능력

본 실시예는 본 실시예의 나노구조 조성물이 물에 25 mg/ml의 농도에서 용해되지 않는 것으로 알려져 있는 2종의 허브 물질(herbal materials)인 AG-14A 및 AG-14B을 용해하는 능력을 조사하기 위한 2가지 예언적 실험을 기술한다.

실험 1

2.5 mg의 각 물질(AG-14A 및 AG-14B)을 본 실시예의 나노구조 조성물 단독 내에 희석시키거나 또는 본 실시예의 나노구조 조성물 75% 및 에탄올 25%를 포함하는 용액 내에 희석시켜 4개의 튜브 각각의 분말의 최종 농도가 2.5 mg/ml가 되도록 할 수 있다. 이들 튜브를 와류시키고, 50℃의 온도로 가열하여 에탄올을 증발시킬 수 있다.

RO수의 현탁물은 응집물을 형성하는데 비해 본 실시예의 나노구조 조성물 내의 AG-14B의 현탁물은 응집되지 않을 것으로 예측된다. 또, 본 실시예의 나노구조 조성물은 AG-14A 및 AG-14B를 응집하지 않을 것을 예측된다.

실험 2

5 mg의 AG-14A 및 AG-14B를 62.5μl EtOH + 187.5μl의 본 실시예의 나노구조 조성물 내에서 희석시킬 수 있다. 추가의 62.5μl의 본 실시예의 나노구조 조성물을 첨가할 수 있다. 이들 튜브를 와류시키고, 50℃까지 가열하여 에탄올을 증발시킬 수 있다.

본 실시예의 나노구조 조성물의 첨가전의 EtOH 내의 현탁액은 AG-14A 및 AG-14B를 용해시킬 것으로 예측된다.

실시예 24

용매 능력

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 세포독성 펩티드를 용해하는 능력을 조사하기 위한 2가지 예언적 실험을 기술한다. 더욱, 본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 펩티드의 세포독성 활성에 영향을 미치는지의 여부를 확인하기 위해 Skov-3 세포에 미치는 펩티드의 효과를 측정하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

다음의 펩티드를 사용할 수 있다: 펩티드 X, X-5FU, NLS-E, Palm- PFPSYK (CMFU), PFPSYKLRPG-NH₂, NLS-p2-LHRH 및 F-LH-RH-palm kGFPSK), 이들 펩티드는 모두 물에 용해되지 않는 펩티드로 알려져 있다. 이들 7개의 모든 펩티드를 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에 0.5 Mm로 용해시킬 수 있다. 다음에 분광광도계 측정을 수행할 수 있다.

Skov-3 세포를 맥코이(McCoy) 5A 배지 내에서 배양하고, 96개의 웰 플레이트에서 웰 당 1500개의 세포의 농도로 희석시킬 수 있다. 24 시간 후, 2 μl(0.5 mM, 0.05 mM 및 0.005 mM)의 펩티드 용액을 1ml의 맥코이 5A 배지 내에서 희석시켜, 최종 농도가 각각 10^-6 M, 10^-7 M 및 10^-8 M이 되도록 할 수 있다. 각 처리는 복수회(예, 9회) 반복할 수 있다. 각 플레이트에는 3개의 농도의 2종의 펩티드 및 6개의 웰의 대조처리가 수용된다. 90 μl의 맥코이의 5A 배지 + 펩티드가 상기 세포에 첨가될 수 있다. 1 시간 후, 10 μl의 FBS를 첨가할 수 있다(경쟁 방지용). 세포들은 24 시간 후 및 48 시간 후에 크리스털 바이올렛에 기초한 생사판별분석을 통해 정량화될 수 있다. 이 염료는 DNA를 염색한다. 가용화 시킨 후, 단일층에 의해 흡수된 염료의 양을 플레이트 독출장치에 의해 정량화할 수 있다.

상기 펩티드들은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 희석될 것이 예측되고, 또 용해된 펩티드는 세포독성 활성을 포함할 것이 예측된다.

실시예 25

용매 능력

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 레티놀을 용해하는 능력을 조사하기 위한 2가지 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

레티놀은 하기의 조건 하에서 GENC에 용해될 수 있다:

EtOH 및 GENC 내의 1 % 레티놀(0.01 g/1 ml).

EtOH 및 GENC 내의 0.5 % 레티놀(0.005 g/1 ml).

EtOH 및 GENC 내의 0.5 % 레티놀(0.125 g/1 ml).

EtOH 및 GENC 내의 0.25 % 레티놀(0.0625 g/25 ml). 최종 EtOH농도: 1.5%.

상기 레티놀은 산성의 부화된 나노구조 조성물보다 알칼리성의 부화된 나노구조 조성물 내에서 용이하게 용해될 것으로 예측된다.

실시예 26

용매 능력

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 40 mg/ml의 최종 농도에서 물질 X를 용해하는 능력을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

실험 1

이 실험은 GENC 및 DMSO의 용해도에 관한 것이다. 제1의 시험관에서 25 μl의 GENC가 1 mg의 물질 "X"에 첨가될 수 있다. 제2의 시험관에서, 25 μl의 DMSO 가 1 mg의 물질 "X"에 첨가될 수 있다. 양방의 시험관을 와류시키고, 60℃로 가열하고, 쉐이커 상에서 1시간 동안 쉐이킹을 가한다. 바이얼 내의 물질 "X"의 용매를 평가 및 비교할 수 있다.

실험 2

본 실험은 DMSO의 환원 및 상기 물질의 상이한 용매 내에서의 시간 경과에 따른 안정성/속도론의 시험에 관한 것이다.

각각 25μl의 총 반응체적을 포함하는 6개의 상이한 시험관이 분석될 수 있다:

(i) 1 mg "X" + 25μl GENC (100 %).

(ii) 1 mg "X" + 12.5μl DMSO + 12.5μl GENC (50 %).

(iii) 1 mg "X" + 12.5μl DMSO + 12.5μl GENC (50 %).

(iv) 1 mg "X" + 6.25μl DMSO + 18.75μl GENC (25 %).

(v) 1 mg "X" + 25μl GENC + 스쿠로스 (10 %). 이 스쿠로스는 0.1g 스쿠로스 + 1ml GENC이다.

(vi) 1 mg + 12.5μl DMSO + 12.5μl의 본 발명의 다양한 예시적 실시예에 따른 탈수된 부화된 나노구조 조성물(50 %). 이 탈수된 부화된 나노구조 조성물은 60℃에서 90분간 GENC를 탈수하는 것에 의해 얻을 수 있다.

모든 시험관은 와류되고, 60℃로 가열되고, 1시간 동안 쉐이킹될 수 있다.

바이얼 내의 물질 "X"의 용매를 평가 및 비교할 수 있다.

실험 3

본 실험은 DMSO의 환원 및 상기 물질의 상이한 용매 내에서의 시간 경과에 따른 안정성/속도론의 시험에 관한 것이다.

1mg의 물질 "X" + 50μl의 DMSO가 유리관 내에 주입될 수 있다. 50μl의 GENC를 상기 유리관 내에 적정(수초마다 5μl씩)될 수 있고, 다음에 500μl의 GENC용액(9 % DMSO + 91 % GENC)을 첨가할 수 있다.

제2의 유리관 내에, 1mg의 물질 "X" + 50μl의 DMSO가 주입될 수 있다. 50μl의 RO를 상기 유리관 내에 적정(수초마다 5μl씩)될 수 있고, 다음에 500μl의 RO용액(9 % DMSO + 91 % GENC)을 첨가할 수 있다.

바이얼 내의 물질 "X"의 용매를 평가 및 비교할 수 있다.

실시예 27

용매 능력

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 SPL 2101 및 SPL 5217을 30 mg/ml의 최종 농도로 용해하는 능력을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

SPL 2101은 그 최적의 용매(에탄올) 내에서 용해될 수 있고, SPL 5217은 그 최적의 용매(아세톤) 내에서 용해될 수 있다. 상기 2개의 화합물은 유리 바이얼 내에 투입될 수 있고, 어둡고 차가운 분위기 내에 유지할 수 있다. 데시케이터 내에서 장시간 동안 용매의 증발이 수행될 수 있고, 용매의 모든 흔적이 소멸될 때까지 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 이 조성물들을 용액에 첨가할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 SPL 2101 및 SPL 5217을 용해시킬 것으로 예측된다.

실시예 28

용매 성능

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 탁솔(Taxol)(파클리탁셀(Paclitaxel))을 0.5Mm의 최종농도로 용해하는 능력을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

0.5mM의 탁솔 용액(0.0017g/4ml)이 DMSO 내에서 조제되거나 17 %의 EtOH를 구비하는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 조제될 수 있다. 분광광도계를 이용하여 흡광도가 검출될 수 있다.

약 150,000개의 293T 세포가 3 ml의 DMEM 배지를 구비하는 6개의 웰 플레이트에 접종될 수 있다. 각 처리물질은 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 DMEM 배지 내에서 배양될 수 있다. (본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 용해되거나 DMSO에 용해된) 탁솔을 1.666 μM(3ml의 배지 내의 10μl의 0.5mM 탁솔)의 최종 농도까지 첨가할 수 있다. 상기 세포는 탁솔을 이용한 24시간의 처리 후에 채집되고, 사멸 세포들을 검출하기 위해 트리판 블루(trypan blue) 용액을 이용하여 계수될 수 있다.

탁솔은 DMSO및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 양방에 용해될 것이고, 상기 탁솔은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에 용해된 후에 세포독성 효과를 포함할 것으로 예측된다.

실시예 29

용매 성능

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 0.08 % 에탄올의 존재 하에서 탁솔을 0.5 Mm의 최종 농도까지 용해하는 능력을 조사하기 위한 다른 예언적 실험을 기술한다.

0.5 mM의 탁솔 용액을 조제할 수 있다(0.0017g/4 ml). 탁솔은 에탄올 내에 용해될 수 있고, 용액 내에 40% 이하의 에탄올이 잔류할 때까지 RT 저속 용매교환 공정을 이용하여 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물로 교체될 수 있다. 상기 용매는 0.2 μm의 필터를 이용하여 멸균시킬 수 있다. 탁솔은 DMSO(0.5 mM) 내에서도 조제될 수 있다. 양방의 용액은 -20℃의 온도에 유지할 수 있다. 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정할 수 있다.

10 % FCS를 구비하는 100 μl의 RPMI에 기초한 배지를 구비하는 96개의 웰 플레이트 내에서 웰 당 약 2000개의 PC3 세포가 접종될 수 있다. 접종 24시간 후, 2μl, 1 μl 및 0.5 μl의 0.5 mM 탁솔을 1 ml의 RPMI 배지 내에서 희석하여 각각 1 μM, 0.5 μM 및 0.25 μM의 최종 농도가 되게 할 수 있다. 처리물 당 복수회(예, 8회 이상)의 복제가 수행될 수 있다. 탁솔의 첨가 24 시간 후에 크리스털 바이올렛 비색분석을 이용하여 세포 밀도를 정량화함으로써 세포 증식을 평가할 수 있다.

처리 24 시간 후, 세포를 PBS로 세척한 후 4 %의 파라포름알데히드로 고정시킬 수 있다. 크리스털 바이올렛을 첨가하고 실온에서 10분간 배양할 수 있다. 세포를 수회(예, 3회) 세척한 후, 50%의 에탄올 내에 100 M의 소디움 시트레이트를 포함하는 용액을 이용하여 세포로부터 색을 용출해낼 수 있다. 광학 밀도의 변화는 분광광도계 플레이트 독출장치를 이용하여 570 nm에서 독출할 수 있다. 세포의 생존능력은 공백(blank)을 제한 후의 대조 광학밀도(이것을 100%으로 봄)의 백분율로서 표현할 수 있다.

탁솔은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에 용해될 것이 예측되고, DMSO 내에 용해된 탁솔과 인간 전립선 암세포주 상의 인비트로 세포 생존능력/세포독성은 유사성을 보일 것으로 예측된다.

실시예 30

용매 성능

본 실시예는 저속 용매 교환공정을 이용하여 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 3.6 mg/ml의 농도에서 불용성인 세팔로스포린을 용해하는 능력을 조사하고, 또 pUC19 플라스미드를 함유하는 앰피실린(Amp) 내성을 이용하여 트랜스폼된 대장균 DH5α에 미치는 생물활성을 평가하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

25 mg의 세팔로스포린을 5 ml의 유기용매인 아세톤(5 mg/ml)에 용해시킬 수 있다. 상기 유기용매를 GENC와 교체하는 공정은 30℃로 설정된 멀티블록 가열장치 상에서, 데시케이터 및 후드 내에서 수행될 수 있다. 유기용매의 농도는 하기의 식에 따라 계산할 수 있다:

화학천칭( Analytical Balance )

% 아세톤 ml 1-0.1739X = 중량 측정값

% EtOH ml 1-0.2155X = 중량 측정값

굴절계

% 아세톤 ml 0.0006X + 1.3328 = 굴절율(RI) 값

% EtOH ml 0.0006X + 1.3327 = 굴절율(RI) 값

상기 용액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 신중하게 여과할 수 있다. 용액에 대한 분광광도계의 독출은 여과공정의 전후에 수행될 수 있다.

pUC19 플라스미드(앰피실린 내성)을 함유하는 DH5α 대장균을 100 μg/ml의 앰플리신이 보충된 액체 LB 배지 내에서 37℃ 및 220 rpm에서 밤새 배양할 수 있다. 100 μL의 철야 스타터(overnight starter)는 하기와 같이 새로운 액체 LB 내에서 재접종될 수 있다:

(i) 100 μl GENC를 구비하는 3개의 시험관: (2번째 실험에서만) 및 무항생제(양방의 실험).

(ii) 10 μl의 세팔로스포린 원료 용액(50 μg/ml)을 구비하는 3개의 시험관.

(iii) 100 μl의 세팔로스포린 원료 용액(5 μg/ml)을 구비하는 3개의 시험관.

박테리아는 37℃ 및 220 rpm에서 배양될 수 있다. TECAN SPECTRAFlour Plus를 이용하여 590 nm의 필터를 구비하는 96개의 웰을 가지는 투명 플레이트를 이용하여 매시간마다 순차적인 OD 독출이 수행되었다.

세팔로스포린은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 상당히 희석된 후에도 생물학적 이용가능성을 가짐과 동시에 박테리아 성장 억제제로서 생물활성을 가질 것으로 예측된다.

실시예 31

안정화 효과

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 단백질의 안정화에 미치는 효과를 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

시판되는 Taq 폴리머라아제 효소(예, Peq-lab 및 Bio-lab)를 이중증류수(ddH₂O (RO)) 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서의 활성을 결정하기 위해 PCR 반응에서 검토할 수 있다. 상기 효소는 1시간 내지 2.5시간의 상이한 온도범위에서 95℃의 온도까지 가열될 수 있다.

2가지 유형의 반응을 수행할 수 있다: "물 단독 반응(water only)"-이 반응에서는 효소와 물만을 비등시킨다; "모두 포함 반응(all inside)"-이 반응에서 모든 반응 성분(효소, 액체, 완충액, dNTPs, 게놈 DNA 및 프라이머)들을 비등시킨다.

비등 후, 필요한 모든 추가의 반응 성분들을 PCT관에 첨가하고, 통상적인 PCR 프로그램이 약 30사이클로 설정될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 모든 성분들이 열적 스트레스를 받는 조건 및 효소만이 열적 스트레스를 받는 조건의 양 조건 하에서 효소를 가열로부터 보호할 것으로 예측된다.

실시예 32

안정화 효과

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 단백질의 안정화에 미치는 효과를 조사하기 위한 다른 예언적 실험을 기술한다. 이를 위해, Peq-lab 및 Bio-lab을 이용한 실험이 기술된다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

PCR 반응은 하기와 같이 설정될 수 있다:

Peq - lab 샘플

20.4 μl의 GENC 또는 증류수(역삼투수, RO)

0.1 μl의 Taq 폴리머라아제(Peq-lab, Taq DNA 폴리머라아제, 5 U/μl)

샘플들은 95℃의 일정한 온도의 PCR 장치 내에 설치될 수 있다. 배양시간은 60, 75 또는 90분으로 할 수 있다. 각 배양 시간에 대해 하나씩 3개의 샘플이 준비될 수 있다.

Taq 효소의 비등 후에 하기의 성분들을 첨가할 수 있다:

2.5 μl의 10X 반응 완충액 Y (Peq-lab)

0.5 μl의 dNTPs 10mM (Bio-lab)

1 μl의 프라이머 GAPDH 혼합물 10 pmol/μl

0.5 μl의 게놈 DNA 35 μg/μl

Biolab 샘플

18.9 μl의 GENC 또는 RO수.

0.1 μl의 Taq 폴리머라아제(Bio-lab, Taq 폴리머라아제, 5 U/μl)

샘플들은 95℃의 일정한 온도의 PCR 장치 내에 설치될 수 있다. 배양시간은 60, 75, 90, 120 및 150분으로 할 수 있다. 각 배양 시간에 대해 하나씩 5개의 샘플이 준비될 수 있다.

Taq 효소의 비등 후에 하기의 성분들을 첨가할 수 있다:

2.5 μl의 TAQ 10X 완충액 Mg-무함유(Bio-lab)

1.5 μl의 MgCl₂ 25 mM (Bio-lab)

0.5 μl의 dNTPs 10mM (Bio-lab)

1 μl의 프라이머 GAPDH 혼합물 (10 pmol/μl)

0.5 μl의 게놈 DNA (35 μg/μl)

각 처리물(RO수 또는 GENC), 양성 대조 및 음성 대조가 제조될 수 있다. 양성 대조는 효소를 비등시키지 않은 것이고, 음성 대조는 효소를 비등시키지 않음과 동시에 반응에 DNA가 없는 것으로 할 수 있다. PCR 혼합물은 대조 반응을 위해 비등시킨 taq 분석물에 대해서도 조제될 수 있다.

PCR 프로그램

(i) 94℃, 2분간 변성

(ii) 94℃, 30초간 변성

(iii) 60℃, 30 초간 어닐링

(iv) 72℃, 30초간 연신

단계 (ii)-(iv)을 30회 반복

(v) 72℃, 10분간 연신

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 양방의 효소를 열 스트레스로부터 보호할 것으로 예측된다.

실시예 33

가열에 의해 탈수된 다중 PCR 혼합물

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 다중 PCR 시스템 내의 적용성을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 본 실시예에서 "GENC"로 약칭되는 "기체 부화된 나노구조 조성물"과 상호교환적인 의미를 가진다.

하기의 성분들을 포함할 수 있는 표준 PCR 혼합물이 조제될 수 있다(예를 들면, KCl 완충액, dNTPs, Taq, BPB):

첨가제(최종 농도): 스쿠로스(150mM, 200mM)

Taq 효소: Biolab

인간 인슐린 유전자에 대항하는 프라이머(내부통제(internal control))

인간 게놈 DNA (내부통제)

상기 샘플들은 GENC 또는 RO수가 증발될 때까지 오븐 내에서 열에 의해 탈수될 수 있다.

재수화(rehydration)는 (A) RO수 또는 GENC에 대해, 이중 증류수만을 이용하는 방법 또는 (B) RO수 및 GENC에 대해(다중에 대해), PBFDV DNA 단편의 EGD-프라이머 혼합물을 이용하는 방법에 의해 수행할 수 있다.

반응의 충실성을 유지하는 상태에서 완전한 PCR 혼합물을 가열탈수하고, 이것을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 재수화가 가능한 것으로 예측된다. 이 방법은 다목적 PCR 반응을 위한 내부통제로서 사용할 수 있다. 그 특성은 PCR 반응이 하나의 샘플에 기초하여 정확하게 수행되는 것을 확실시하는 것이다.

실시예 34

PCR 의 미세 체적

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 소체적 PCR 반응에의 적용성을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

MVP는 2μl의 최종 체적에서 수행될 수 있다. 표적 DNA는 예를 들면 PDX 유전자를 포함하는 플라스미드일 수 있다. 혼합물이 조제될 수 있고, 2μl의 완전한 혼합물(DNA, 프라이머 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 혼합물)이 튜브 내에 분취될 수 있고, PCR이 수행될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 PCR에서 미량반응 체적으로 참여할 것으로 예측된다.

실시예 35

정량적 PCR

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 정량적 PCR 반응(QPCR)에의 적용성을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. QPCR은 복수의 DNA 표적(플라스미드 및 게놈) 및 유전자 표적(베타 액틴, PDX, PCT 등)에 대항하는 사이버 그린(Syber Green)을 이용하여 수행될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 PDX 플라스미드의 QPCR는 능숙하고, 프라이머-다이머(primer-dimer)가 형성되지 않는 상태에서 기하급수(효율성 101%, 기하급수적 기울기)적인 증폭을 이용한다.

실시예 36

살균성 활성제의 분산

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내의 살균성 활성제의 분산을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

살균 조성물(티몰, 메틸 살리실레이트, 멘톨 및 유칼립톨)을 포함하는 스트립을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 RO수의 양방에 용해시켜, 그 용매 특성을 비교할 수 있다.

물질

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물, RO수, Listerine™ (Pocket Pak) 스트립(Pfizer Consumer Healthcare, New Jersey).

방법

살균 조성물을 포함하는 스트립을 포장으로부터 꺼내서 반으로 자른다. 각각의 반쪽을 5 ml의 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 또는 RO수를 구비하는 바이얼 내에 투입할 수 있다. 양방의 바이얼을 수초간 쉐이킹한 다음 수분간 정치시킬 수 있다. 상기 바이얼을 육안 검사하여 스트립들이 완전히 용해되었는지를 확인한다. OD는 USB 2000 분광광도계(스캔 180-850nm)를 이용하여 t=0 및 t=2시간에서 측정될 수 있다.

배양 후, 상기 스트립에 존재하는 살균 조성물은 RO수에 비해 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 사용하여 시간이 경과됨에 따라 더욱 미세한 미셀(micelles)을 생성할 것으로 예측된다. 또한 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에서는 상분리가 존재하지 않거나 낮을 것으로 예측된다.

실시예 37

소수성 특성

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 소수성 특성을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

물질

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물, 착색제(예, 페놀 브로마이드 블루), 및 국제특허공개 WO2007/077562에 개시된 플라스틱 장치와 같은 플라스틱 장치. 이 국제특허공개의 내용은 본 명세서에 참조로서 도입되었다. 상기 장치는 소수성 플라스틱 수지로 제작된 상측실 및 하측실을 포함한다. 상측실 및 하측실은 소수성 모세관의 작용을 하는 극세의 경로가 4개의 상측실과 하나의 하측실의 사이를 연결하도록 주조성형된다. 이들 소수성 모세관은 전형적인 막 또는 기타 생물학적 장벽을 모사한 것이다.

방법

상기 색 혼합물은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 또는 물을 이용하여 1:1로 희석될 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 10 ml 액적+색 조성물을 제1의 플라스틱 장치의 4개의 상측실 내에 투입할 수 있다. 동시에, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 500 ml의 액적을 상기 플라스틱 장치의 상기 상측실의 직상부의 하측실 내에 투입할 수 있다.

유사하게, 10 ml의 수액적+색 조성물을 제2의 플라스틱 장치(제1의 장치와 유사한 장치)의 4개의 상측실 내에 투입할 수 있다. 동시에, 500 ml의 수액적을 상기 상측실의 직상부의 하측실 내에 투입할 수 있다. 각 플라스틱 장치 내의 염료는 상기 액적의 투입 15분 후에 분석될 수 있다.

물과 색 혼합물을 포함하는 플라스틱 장치의 하측실은 깨끗하고, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 색 혼합물을 포함하는 플라스틱 장치의 하측실은 색을 표출할 것으로 예측된다. 이와 같은 결과는 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 소수성 모세관을 통한 유동이 가능한 바와 같이 소수성 특성을 포함하는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 38

저온보호

본 실시예는 표준 저온보호 용액을 구비한 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 냉동 및 해종 후의 정자의 질에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

정자의 운동성은 광학 현미경 하에서 헬버(Helber)의 소형 카메라를 이용하여 운동성 정자 세포의 수를 세는 것에 의해 측정될 수 있다. 정자의 생존능력은 염색, 예를 들면 에오신 니그로진(Eosine　Nigrozine) 염색에 의해 측정될 수 있다. 정자의 DNA 단편화는 정자 크로마틴 구조 분석(Sperm Chromatin Structural Assay; SCSA)에 의해 측정될 수 있다. 정자가 난자를 수정하는 능력은 운동성 정자 세포소기관 형태 검사(motile sperm organelle morphology examination; MSOM)에 의해 측정될 수 있다. MSOM은 문헌에서 생식능력이 있는 세포의 마아커의 역할을 하는 것으로 나타나는 특이적 정상 형태 및 진행성 운동성을 가지는 정자 세포의 수를 조사한다.

저온보호 완충액은 TRIS 완충액, 난황 및 글리세롤를 포함하는 표준 저온보호 완충액(예, TES 완충액)일 수 있다. 이와 같은 저온보호 완충액은 시판되는 것을 구입할 수 있다(Irvine scientific, Santa Anna, California).

정자 샘플은 저수정율의 남성 지원자로부터 입수하여, 예를 들면 점진적 온도 강하 프로그램을 이용하는 PLANER KRYO-10 장치 내에서 냉동시킬 수 있다. 이들 샘플은 TES(50% 정액, 50% TES) 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물(50% 정액, 25% TES 및 25%의 부화된 나노구조 조성물)의 존재 하에서 냉동시킬 수 있다. 냉동된 정액은 약 2일 후에 분석을 위해 해동시킬 수 있다. 해동 후의 2종의 완충액이 정액의 질에 미치는 보호 효과를 비냉동된 자연 상태의 동일 정액과 비교할 수 있다. 이 실험은 복수회(예, 3회 이상) 반복할 수 있다.

높은 백분율의 정상 세포 생존 상태에서 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 냉동 혼합물에 대해 정자 운동성, 생존능력 및 DNA 단편화의 증진이 예측된다.

실시예 39

일렉트로컴피턴트 세포( Electrocompetent Cells )의 트랜스포메이션 효율

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 일렉트로컴피턴트 세포의 트랜스포메이션 효율에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

일렉트로컴피턴트 세포는 물성분(H₂0)이 다양한 단계로 또 다양한 조합으로 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 의해 치환되는 표준 프로토콜에 따라 조제될 수 있다.

대장균 세포는 대수 증식기(logarithmic phase)까지 부화 배지(rich media) 내에서 증식된 후 원심분리에 의해 채취될 수 있다. 이 부화 배지는 LB 배양액의 것보다 고농도의 아미노산, 비타민, 무기질 및 미량의 미네랄을 제공하는 부화 영양소 베이스를 가진다. 이 배지는 pH의 하락을 방지하고 포스페이트의 공급원을 제공하기 위해 포타슘 포스페이트를 이용하여 pH 7.2±0.2에서 완충될 수 있다. 이와 같은 개질에 의해 LB에 의해 달성될 수 있는 것보다 높은 세포 수율이 가능해진다.

상기 펠릿들은 표준 냉각수 내에서 복수회(예, 3회) 세척되고, 10%의 글리세롤(표준)을 함유하는 물이나 2, 5, 또는 10%의 글리세롤을 함유하는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 재현탁되고, -80℃에서 냉동될 수 있다.

전기천공이 물에 희석된 pUC 플라스미드 DNA를 이용하여 표준 조건 하에서 수행될 수 있고, 박테리아는 콜로니의 계수(counting)를 위해 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에 투입될 수 있다. 콜로니는 다음날 계수되어, 트랜스포메이션 효율이 결정될 수 있다.

본 발명의 부화된 나노구조 조성물의 희석물 내에서의 일렉트로컴피턴트 박테리아의 재현탁은 트랜스포메이션 효율을 증대시킬 것으로 예측된다.

실시예 40

케미컬리 컴피턴트 세포( Chemically Competent Cells ) 내의 DNA 흡수

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 다양한 케미컬리 컴피턴트 세포에 의한 DNA 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

pUC 플라스미드 DNA는 물이나 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서 1:10으로 희석될 수 있고, 예를 들면 열충격법(heat shock method)을 이용하여 박테리아 균주 XL1 Blue의 트랜스포메이션을 위해 사용될 수 있다. 얼음 위에서 10분간 배양 후, 박테리아와 함께 DNA는 42℃에서 30초간 배양되고, 콜로니의 계수를 위해 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에 투입될 수 있다. 콜로니는 다음날 계수되어, 트랜스포메이션 효율이 결정될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내의 DNA의 희석은 컴피턴트 세포에 의한 DNA 흡수를 향상시킬 것으로 예측된다.

실시예 41

인간 세포 내에서의 DNA 흡수

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 본 실시예는 초대 인간 세포 배양물 내에서의 DNA 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

인간 골수 초대세포를 Mem-알파 20% 소의 태아 혈청 내에서 배양하고, 세포의 배양 약 20시간 전에 80%의 융합성을 가지도록 투입될 수 있다. 세포는 녹색 형광 단백질(GFP) 구축물을 이용하여 표준 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen™ 트랜스펙션 공정에 의해 트랜스펙션될 수 있다. 상기 트랜스펙션은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 대조 실험의 리포펙타민 2000의 12.5%의 혼합물을 이용하여 반복될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물과 리포펙타민 2000의 조합은 초대세포의 트랜스펙션 효율을 증대시킬 것으로 예측된다.

실시예 42

항생제의 흡수

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 항생제의 콜로니 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

박테리아 콜로니를 항생제의 존재 하 및 부재 하의 펩톤/한천 플레이트 상에서 성장시킬 수 있다. 이 목적을 위해, 고초균(Bacillus subtilis) 박테리아 콜로니를 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하 및 부재 하에서 사전 성장시킨 후, 10 g/l의 펩톤을 구비하는 0.5%의 한천 상에 투입시킬 수 있다. 박테리아 콜로니도 또한 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 조제에 사용된 것과 동일한 원료 분말과 혼합된 역삼투수의 존재 하에서 사전 성장시킨 후, 10 g/l의 펩톤을 구비하는 0.5%의 한천 상에 투입시킬 수 있다. T 균주 박테리아 콜로니는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하 및 부재 하에서 사전 성장시킬 후, 동일한 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration; MIC)의 스트렙토마이신의 존재 하 및 부재 하에서 5 g/l의 펩톤(본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 조제된 것)을 구비하는 1.75%의 한천 상에 투입시킬 수 있다.

상기 박테리아 콜로니는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 더 클 것으로 예측된다. 또, 상기 박테리아 콜로니는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 대조 플레이트에 비해 다른 패턴을 보일 것으로 예측된다. 또, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 역삼투수에 비해 더 빠른 박테리아 성장을 유발하고, 분말이 보충된 역삼투수는 더 느린 성장을 표출할 것으로 예측된다. 또, 상기 스트렙토마이신과 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 조합은 콜로니의 크기를 감소시킬 것으로 예측된다.

실시예 43

박테리아 성장 및 발광

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 박테리아의 성장 및 포토루미네슨스(photo-luminescence)에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

생물발광 비브리오 하베이(Vibrio Harveyi) 박테리아(예, BB120 균주)를 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 포함하는 배지나 증류수를 포함하는 배지 내에서 성장시킬 수 있다. 발광 측정 및 탁도 측정은 표준 ELISA 독출장치를 이용하여 수행할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 비브리오 박테리아의 성장 및 발광 유전자의 발현을 증대시킬 것으로 예측된다.

실시예 44

스킨 크림의 흡수

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 인비보에서 피부 크림 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

여드름이 있는 환자에게 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하 및 부재 하에서 시판되는 스킨 크림(예, Clearasil, Alleon Pharmacy)을 국소 투여할 수 있다. 상기 크림의 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 희석은 1:1의 비율이 될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 스킨 크림에 대한 치료적 이익은 자외광 페이셜 스테이지(Facial Stage)(일본의 Moritex사로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)에 의해 측정될 수 있다. 스킨 크림은 환자에게 하루 1회씩 수일간(예, 3일간) 사용할 수 있다.

여드름의 개수는 스킨 크림 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 조합을 이용하여 치료한 후 급속히 감소될 것으로 예측된다.

실시예 45

인간 하이브리도마의 단리

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 모노클로날 항체 생성(하이브리도마의 단리)의 제1단계에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

세포 성장을 위한 시약

RPMI 1640(이스라엘의 Beit-HaEmek으로부터 분말 형태로 시판되는 것)을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이나 역삼투에 의해 정수된 대조수 내에서 재구성할 수 있다. 재구성 후, 제조회사의 추천에 따라 소디움 바이카보네이트를 배지에 첨가하고, pH를 7.4로 조절할 수 있다. 이 배양물 배지에 10%의 소의 태아 혈청, L-글루타민(4 mM), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL), MEM-비타민(0.1 mM), 비필수 아미노산(0.1mM) 및 소디움 피루베이트(sodium pyruvate)(1mM)(이들 모두는 GIBCO BRL, Life Technologies로부터 시판됨)를 첨가할 수 있다. HCF는 OriGen로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 모든 보충제는 액상, 수성 형태로 구입하여 시험 배지 및 대조 배지 내에 희석될 수 있다. 8-아자구아닌(Azaguanine), HT 및 HAT(Sigma사로부터 구입할 수 있음)는 분말 형태로부터 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 도는 대조 RPMI을 이용하여 재구성할 수 있다.

화학적 시약

분말의 PBS(GIBCO BRL, Life Technologies으로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이나 대조수를 이용하여 재구성할 수 있다. 플레이크상(Flaked)의 PEG-1500(Sigma로부터 신판되는 것을 구입할 수 있음)은 살균 PBS(50% w/v)의 양쪽 형태를 이용하여 재구성할 수 있고; 액체 PEG의 pH는 약 7까지 조절할 수 있고, 필터 살균이 가능하다. 행크스 평형염 용액은 Beit-HaEm으로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. ELISA 플레이트 코팅용 카보네이트-바이카보네이트 완충액(0.05 M, pH=9.6), OPD(0.4 mg/mL로 사용이 가능함) 및 포스페이트-시트레이트 완충액(0.05 M, pH=5.0)은 Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.

항체

염소 항인간 IgM 및 HRP-접합된 염소 항인간 IgM는 Jackson ImmunoResearch로부터 시판되는 것을 구입할 수 있고, 표준 인간 IgM는 Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.

융합

인간 말초형 단핵 세포(PBMC) 및 융합 파트너(MFP-2) 세포를 혼합 및 펠레트화 하기 전에 혈청을 함유하지 않은 배지 내에서 복수회(예, 4회) 세척할 수 있다. 37℃의 온도로 예열된 300 μl의 PEG-1500를 상기 세포 혼합물(약 10-200 x 10⁶개의 세포)에 첨가하고, 일정한 쉐이킹 하에서 3분간 배양할 수 있다. 다음에, PEG를 행크스 평형 염용액 및 완전 RPMI과의 세포 혼합물에 의해 희석시킬 수 있다. 얻어진 세포 현탁액에 소의 태아 혈청(10%) 및 HT(x2)를 첨가할 수 있다. 이 공정에서 생성된 하이브리도마를 96개의 웰 플레이트 내에서 HAT선택을 구비하는 완전 RPMI을 이용하여 배양할 수 있다. 항체의 상징액의 검사는 하이브리도마 세포가 웰의 약 1/4을 점유할 때 개시할 수 있다.

샌드위치 ELISA

샌드위치 ELISA를 사용하여 IgM에 대한 하이브리도마 상징액을 검사할 수 있다. 포착용 항체(예, 염소 항인간 IgM)는 카보네이트/바이카보네이트 완충액 내에서 조제하고, 100ng/100μl/웰의 농도로 96개의 웰 플레이트에 가할 수 있다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 배양할 수 있다.

하기의 단계는 실온에서 수행될 수 있다. PBS 내에 0.3% 용해된 분유를 이용한 블로킹 1시간 후에, 하이브리도마의 상징액을 1.5시간 동안 첨가할 수 있다. PBS 내에 1:500의 비율로 희석된 인간 혈청을 양의 대조로서 사용할 수 있다. 하이브리도마 성장 배지를 음의 대조로서 사용할 수 있다. 2차 항체(예, HRP-접합된 염소 항-인간 IgM)를 1:5000의 농도의 블로킹 용액 내에서 조제하고, 1시간 동안 배양할 수 있다. 비색반응을 생성하기 위해, 상기 플레이트를 0.03 %의 H₂O₂를 함유하는 포스페이트-시트레이트 완충액 내에서 OPD를 이용하여 배양할 수 있다. 색 반응은 약 15분 후 10 %의 염산을 이용하여 중단시킬 수 있다. 반응의 독출 및 기록은 492 nm 파장의 필터를 사용하는 Multiscan-Ascent 상에서 수행할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 안정화의 영향에 기인되어 대조에 비해 더욱 일관성 있는 하이브리도마의 생산의 생산을 가능하게 할 것으로 예측된다. 또, 인간 모노클로날 항체를 분비하는 안정한 하이브리도마 클론을 생성 및 단리하는 공정은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에서 향상될 것으로 예측된다.

실시예 46

인간 하이브리도마의 클론화

모노클로날 항체 생산에서의 관련 하이브리도마의 단리 후의 다음 단계는 클론화에 의한 안정화 단계이다. 본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 인간 하이브리도마의 클론화에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

클론화

하이브리도마의 클론화는 표준 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 제한된 수(약 10⁴개)의 세포를 96개의 웰 플레이트의 상측 열을 가로질러 순차적으로 희석시키고, 다음에 제1열의 내용물을 나머지 8개의 열보다 낮게 희석시킬 수 있다. 이 방식으로, 플레이트의 우측하단을 향하는 웰들은 단일의 세포를 가지는 경향이 있다.

IgM 함량의 조사

샌드위치 ELISA를 이용하여 IgM에 대한 하이브리도마 상징액을 검사할 수 있다. 포착하는 항체(예, 염소 항인간 IgM)는 카보네이트/바이카보네이트 완충액 내에서 조제되고, 100 ng/100 μL/웰의 농도로 96개의 웰 플레이트에 가해질 수 있다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 배양할 수 있다.

하기의 단계는 실온에서 수행될 수 있다. PBS 내에 0.3% 용해된 분유를 이용한 블로킹 1시간 후에, 하이브리도마의 상징액을 1.5시간 동안 첨가할 수 있다. PBS 내에 1:500의 비율로 희석된 인간 혈청을 양의 대조로서 사용할 수 있다. 하이브리도마 성장 배지를 백그라운드를 위해 그리고 음의 대조로서 사용할 수 있다. 2차 항체(예, HRP-접합된 염소 항-인간 IgM)를 1:5000의 농도의 블로킹 용액 내에서 조제하고, 1시간 동안 배양할 수 있다. 비색반응을 생성하기 위해, 상기 플레이트를 0.03 %의 H₂O₂를 함유하는 포스페이트-시트레이트 완충액 내에서 OPD를 이용하여 배양할 수 있다. 색 반응은 약 15분 후 10 %의 염산을 이용하여 중단시킬 수 있다. 반응의 독출 및 기록은 492 nm 파장의 필터를 사용하는 Multiscan-Ascent 상에서 수행할 수 있다.

IgM-생산 클론의 빈도수 또는 각 플레이트 내에서 생산된 항체량의 분포 사이에 통계학적으로 중요한 차이가 없는 것은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내의 하이브리도마 클론이 HCF를 첨가한 대조 배지 내의 것과 것을 나타내는 것일 수 있다. HCF를 첨가하지 않은 대조배지 내에서의 클론화가 부족한 것은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 불안정한 하이브리도마의 클론화 가능성을 향상시키는 것을 나타내는 것일 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내에서의 융합 후의 하이브리도마의 회수의 빈도가 향상되는 것도 향상된 클론화 가능성을 나타내는 것일 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 물리적인 세포 융합 효율을 향상시키는 것 또는 융합의 공정에서 생성된 하이브리도마를 안정화시키는 것에 의해 융합 공정을 개선할 것으로 예측된다.

실시예 47

증식

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 증식에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 이 예언적 실험은 인간 간엽(Mesenchymal) 세포에 대해 수행할 수 있다.

인간 간엽 줄기 세포의 증식은 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 배지 내에서 시험할 수 있다.

배지 조제

250 ml의 MEM 알파 배지를 RO수 또는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 2.5 g의 MEM 및 0.55 g의 NaHCO₃를 첨가하여 조제할 수 있다.

세포 배양물

세포는 20%의 소의 태아 혈청, 100u/ml의 페니실린 및 1mg/ml의 스트렙토마이신(참조예, Colter et al., 2001, PNAS 98:7841-7845)이 보충된 MEM α 내에 유지할 수 있다. 세포는 계수되고, 2가지 유형의 MEM α 배지 내에서 500개의 세포/ml의 농도까지 희석될 수 있다: RO수 및 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 배지. 세포는 각 웰 내에 50개의 세포를 구비하는 100μl의 배지를 갖춘 96개의 웰 플레이트 내에서 성장시킬 수 있다. 8일 후, 세포 증식을 크리스털 바이올렛 생존능력 분석에 의해 평가할 수 있다. 이 분석에서 염료는 DNA를 염색한다. 가용화 시킨 후, 단일층에 의해 흡수된 염료의 양을 플레이트 독출장치에 의해 590 nm에서 정량화할 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물은 세포의 증식을 증대시킬 것으로 예측된다.

실시예 48

인간 하이브리도마의 단리

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 인간 하이브리도마의 단리에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

물질

세포 성장을 위한 시약

세포 성장을 위한 배지 및 보충제는 GIBCO BRL, Life Technologies로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. RPMI 1640 및 DMEM는 분말 형태로 입수하여 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이나 증류수를 이용하여 재구성할 수 있다. 재구성 후, 소디움 바이카보네이트를 제조회사의 추천에 따라 배지에 첨가할 수 있고, 추가로 Ph를 조절하지 않을 수 있다. 상기 배지는 사용하기 전에 0.22 μm의 필터(Millipore)를 통과시킴으로써 필터-살균시킬 수 있다. 하이브리도마 세포의 성장을 위해, RPMI에 10%의 소의 태아 혈청, L-글루타민(4 mM), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL), MEM-비타민(0.1 mM), 비필수 아미노산(0.1 mM) 및 소디움 피루베이트(1 mM)를 보충할 수 있다. 모든 보충제들은 액체 형태로 제공될 수 있고, 제조회사로부터 판매된 형태 그대로 사용될 수 있다. 따라서, 이들 보충제는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이나 대조수 내에 희석시킬 수 있다. 대조수는 증류수에 기초한 배지(18.2 메가 옴 초고순도의 탈이온수)(증류수, UHQ PS, ELGA Labwater)일 수 있다. 8-아자구아닌(Azaguanine), HT 및 HAT(Sigma사로부터 구입할 수 있음)는 분말 형태로부터 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 도는 대조 RPMI을 이용하여 재구성할 수 있다. 인간 초대 섬유아세포 및 CHO 세포 성장을 위해 사용되는 DMEM에 10%의 소의 태아 혈청, L-글루타민산(4 mM), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL)을 보충할 수 있다. 하이브리도마 클론화 인자는 BioVeris로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.

화학 시약

분말의 PBS는 GIBCO BRL, Life Technologies로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. PEG-1450(P5402)는 Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있고, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 또는 대조수(50% w/v)에 기초한 살균 PBS를 이용하여 재구성될 수 있다. 상기 제제는 pH 7.2까지 조절될 수 있고, DMSO(v/v)(Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)를 10%까지 첨가할 수 있고, PEG 용액을 0.45 μm의 필터(Millipore로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)를 통과시키는 멸균 여과를 수행할 수 있다. 행크스 평형 염 용액은 이스라엘의 Biological Industries Beit-HaEmek LTD에서 시판하는 것을 구입할 수 있고, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 및 대조용으로서 사용될 수 있다. ELISA 플레이트 코팅용 카보네이트-바이카보네이트 완충액(0.05 M, pH=9.6), OPD(0.4 mg/mL로 사용이 가능함) 및 포스페이트-시트레이트 완충액(0.05 M, pH=5.0)은 Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.

항체

염소 항-인간 IgM/IgG 및 HRP-접합된 염소 항-인간 IgM/IgG는 Jackson ImmunoResearch로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다. 표준 인간 IgM/IgG는 Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.

세포

MFP-2, CHO 및 초대 인간 섬유아세포를 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 함유하는 배지 및 대조배지 내에서 1주간 유지하여, 세포가 실험 전에 배지에 적응될 수 있도록 할 수 있다. 또한, 융합 파트너 세포주 MFP-2는 HGPRT 마이너스 표현형을 유지하도록 소의 태아 혈청 및 첨가제 및 8-아자구아닌을 첨가한 RPMI 1640 내에서 유지할 수 있다. 초대 인간 섬유아세포는 ATCC로부터 얻고, DMEM 내에 유지될 수 있다. CHO 세포주는 DMEM 내에 유지될 수 있다. 모든 세포의 배양은 소의 태아 혈청, 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지로 구성되는 완전 배지 내에서 수행될 수 있다. MFP-2 세포주를 위해, 완전 배지 내에 비타민, 비필수 아미노산 및 피루베이트를 첨가할 수 있다.

방법

세포 융합

인간 말초혈 임파구를 가지는 하이브리도마의 생성을 위한 퓨소젠(fusogen)의 역할을 하는 PEG 1450을 이용한 화학적 융합기법[Kohler G, Milstein C (1975) Nature 256: 495-497]을 사용할 수 있다. PEG 1450은 전형적으로 PBS 내에서 10%의 DMSO를 첨가하여 조제될 수 있다. 본 실험을 위해, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용하여 PBS를 조제할 수 있고, 이것은 PEG/DMSO 용액의 조제에 이용될 수 있다; 대조 제제(control preparation)로서의 PEG를 대조수에 기초한 PBS 내에서 조제할 수 있다. 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 대조수에 비교하는 융합 실험을 위해, 시약을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 또는 소의 태아 혈청 및 보충제의 농축물을 제외한 대조수 내에서 조제할 수 있다. 또, PEG-1450을 이용한 융합 후에 행크스 평형 염(HBSS)(하기 참조) 내에서의 세포의 희석이 액체 형태의 HBSS(이스라엘의 Beit HaEmek으로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)를 제조회사로부터 입수한 그대로 이용하여 수행될 수 있다.

하이브리도마의 생산을 위해, 인간 말초형 단핵세포(PBMC)를 채혈된 40 mL의 전혈로부터 단리하고, Histopaque 1077(Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)을 이용하여 정제하고, 혈청을 함유하지 않는 대조수에 기초한 배지 내에서 4회 세척할 수 있다. MFP-2 융합 파트너 세포를 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 배지 또는 대조수에 기초한 배지 내에서 성장시킨 다음 혈청을 함유하지 않은 각 배지를 이용하여 복수회(예, 4회) 세척할 수 있다. 각 실험을 위해, 단일 배취의 PBMC을 2개의 등분으로 분할한다. 그 중 하나는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 위해 사용되고, 다른 하나는 대조수 융합을 위해 사용된다. 다음에, MFP-2와 PBMC를 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물에 기초한 배지 또는 혈청을 함유하지 않은 대조수에 기초한 배지 내에서 혼합한 다음 펠릿으로 성형할 수 있다. 다음에, 37℃의 온도까지 예열된 PEG-1450를 10-200x10⁶개의 혼합 세포에 대해 300 μL만큼 첨가할 수 있다. 상기 세포 혼합물은 PEG를 이용하여 수분(예, 3분) 간 일정한 쉐이킹 상태 하에서 배양할 수 있다. PEG는 행크스 평형 염 용액 및 완전 RPMI(본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 또는 대조수 내에서 조제됨)를 이용하여 세포 혼합물로부터 희석될 수 있다. 얻어진 세포 현탁물에 소의 태아 혈청(10%) 및 HT(x2)를 첨가할 수 있다. 이 공정에서 생성된 하이브리도마를 96개의 웰 플레이트(세포 밀도: 2x10⁶개의 임파구/웰) 내에서 HAT선택을 구비하는 완전 RPMI을 이용하여 배양할 수 있다. 면역글로블린 생산을 위한 상징액의 검사는 하이브리도마 세포가 웰의 약 1/4을 점유할 때 개시할 수 있다.

샌드위치 ELISA

샌드위치 ELISA를 사용하여 IgM/IgG의 하이브리도마 상징액을 검사할 수 있다. 포착용 항체(예, 염소 항인간 IgM/IgG)를 카보네이트/바이카보네이트 완충액 내에서 조제하고, 100 ng/100 μl/웰의 농도로 96개의 웰 플레이트에 가할 수 있다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 배양할 수 있다.

하기의 단계는 실온에서 수행하는 것이 바람직하다.

PBS 내에 0.3% 용해된 분유를 이용한 블로킹 1시간 후에, 하이브리도마의 상징액을 1.5시간 동안 첨가할 수 있다. PBS 내에 1:500의 비율로 희석된 인간 혈청을 양의 대조로서 사용할 수 있다. 하이브리도마 성장 배지를 백그라운드를 위해 그리고 음의 대조로서 사용할 수 있다. 2차 항체(예, HRP-접합된 염소 항-인간 IgM/IgG)를 1:5000의 농도의 블로킹 용액 내에서 조제하고, 1시간 동안 배양할 수 있다. 비색반응을 생성하기 위해, 상기 플레이트를 0.03 %의 H₂O₂를 함유하는 포스페이트-시트레이트 완충액 내에서 OPD를 이용하여 배양할 수 있다. 색 반응은 약 15분 후 10 %의 염산을 이용하여 중단시킬 수 있다. 반응의 독출 및 기록은 492 nm 파장의 필터를 사용하는 Multiscan-Ascent(Thermo Scientific으로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음) ELISA독출장치 상에서 수행할 수 있다. 모든 시약은 샌드위치 층을 제외하고 표준화될 수 있다. 샌드위치 층은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 또는 증류수에 기초한 하이브리도마 상징액으로 구성되는 것이 바람직하다.

클론화

200개의 세포로 된 선택된 클론을 10 mL의 배지 내에서 희석하고, 웰 당 평균 1-2개의 세포를 수용하도록 96개의 웰 플레이트(100 μL/웰)에 접종하였다. 세포들은 배양되고, 주기적으로 영양이 공급되고, 클론의 성장에 대한 현미경 관찰이 수행될 수 있다. 클론의 상징액은 이것이 웰의 1/4-1/2에 점유했을 때 분석할 수 있다. 클론화의 효율은 플레이트 당 생존능력이 있는 클론의 수로서 표현될 수 있다. 10%의 HCF(하이브리도마 클론화 인자)를 실험 설계에 따라 첨가할 수 있다.

세포 성장 분석

초대 세포주 및 불사화 세포주의 성장은 크리스털 바이올렛 염료 보유 분석을 이용하여 관측할 수 있다. 일정 수의 세포를 96개의 웰 플레이트 내에 복수회 반복하여 접종할 수 있다. 4%의 포름알데히드 내에서 고정시킴으로써 세포 성장을 중단시킬 수 있다. 고정된 세포는 0.5%의 크리스털 바이올렛을 이용하여 염색하고, 물을 이용하여 충분히 세척할 수 있다. 잔류 염료는 50% 에탄올(v/v) 내의 100 μL/웰의 0.1 M 소디움 시트레이트 내에서 추출할 수 있다. 웰의 흡광도는 예를 들면, Multiscan-Ascent 마이크로플레이트 독출장치 및 적절한 필터를 이용하여 550 nm에서 독출할 수 있다.

초대 인간 섬유아세포 배양물

약 20회 계대에서 출발하여, 인간 섬유아세포가 배양되고, 세포가 전형적인 섬유아세포의 형태를 나타내고 또 그 수가 최초의 접종수 이하로 떨어지지 않는 한 매주마다 계대배양될 수 있다. 계대의 수 및 개체수 배가(doublings) 계산수가 기록될 수 있다. 세포의 형태 및 생존능력이 현미경에 의해 관측될 수 있다.

데이터 분석

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물을 이용한 실험 및 대조 실험 사이의 융합 및 클론화의 효율상의 통계학적으로 중요한 차이를 카이이승 시험(Chi-square test)에 의해 측정할 수 있다. 초대 인간 섬유아세포를 이용한 성장시험의 결과는 언페어드 슈트던트 t-시험(unpaired Students' t-test)에 의해 분석할 수 있다. 통계적 p-값<0.05은 유의미한 것으로 간주될 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하에서 하기의 결과가 예측된다: 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 하이브리도마 형성의 효율 향상, 하이브리도마 서브클론의 수율 향상, 하이브리도마로부터 모노클로날 항체의 분비 향상, 세포 증식의 향상, 불사화 세포주의 빠른 성장 및 초대 인간 섬유아세포의 느린 성장.

실시예 49

줄기세포 성장

MSC는 오토/파라크라인 세포(auto/paracrine cells)[Caplan and Dennis 2006, J Cell Biochem 98(5): 1076-84]로서, 이 세포는 그 자신과 주변의 세포에 영향을 주는 인자를 분비하는 것으로 알려져 있다. 그레고리(Gregory) 등[Gregory, Singh et al. 2003, J Biol Chem. 2003 Jul 25;278(30):28067-78. Epub 2003 May 9]은 5개의 세포/cm² 농도로 배양된 MSC는 그 세포의 증식을 향상시키는 Wnt 시그널링 경로(signaling pathway)의 dickkpof1(DKK1)을 분비하는 것을 입증하였다. 극히 낮은 밀도로 접종된 고도의 증식 세포로부터의 20%의 배지를 첨가하는 것에 의해 유사한 효과를 얻을 수 있다.

이 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 간엽 줄기세포(MSCs)의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다.

세포 배양

인간 골수(BM) 세포는 승인된 프로토콜 하에서 성인 기증자로부터 입수할 수 있다. 이 세포들은 하기와 같이 배양할 수 있다. 배지의 성분은 이스라엘의 Biological Industries로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.

10 ml의 BM 흡인물(aspirates)을 19-70세의 남성 및 여성 기증자의 장골능(iliac crust)으로부터 채취할 수 있다. 단핵세포는 밀도 구배를 이용하여 단리시키고(ficoll/paque, Sigma로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음), 25 mM의 글루코오스를 함유함과 동시에 16%의 FBS(제품번호 CPB0183, Hyclone(Logan, Utah)에서 시판되는 것을 구입할 수 있음), 100 U/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스프렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민이 보충되는 αMEM 배지 내에서 재현탁시킬 수 있다. 세포들은 10cm의 배양접시(Corning, NY) 내에 투입하고, 5%의 가습 CO₂ 하에서 37℃에서 배양될 수 있다. 24시간 후, 비부착 세포들은 폐기하고, 부착 세포들은 PBS를 이용하여 철저하게 2회 세척할 수 있다. 세포들은 5일 내지 7일간 배양되고, 37℃에서 5분간 0.25%의 트립신 및 1 mM의 EDTA로 처리하여 채취하고, 50-100개의 세포/cm²의 밀도로 접종하고, 군집을 이루도록 배양할 수 있다.

상기 계대배양 후, 세포들을 50-100개의 세포/cm²의 밀도로 24개의 웰 플레이트 내에 접종하고, 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 또는 RO수에 기초하는 배지 내에서 배양할 수 있다. 이 배지는 분말 배지(예, 01-055-1A, Biological Industries(Beth Haemek, Israel)로부터 시판되는 것을 구입할 수 있음)를 이용하여 조제할 수 있다. 세포의 생존능력은 크리스털 바이올렛 분석을 통해 5일에 1회씩 총 20일간 분석할 수 있다. 기증자들 중 한 명의 세포를 6개의 웰 플레이트(3중) 내에 상기한 밀도로 접종하고, 혈구계를 이용하여 세포의 개수를 셀 수 있다.

본 실시예의 부화된 나노구조 조성물 내의 MSC의 성장속도는 적어도 낮은 세포 밀도에서도 향상될 수 있을 것으로 예측된다.

실시예 50

전기화학발광 반응

본 실시예는 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물이 전기화학발광(ECL) 검출 시스템에 미치는 영향을 조사하기 위한 예언적 실험을 기술한다. 본 공정은 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물의 존재 하 및 부재 하에서 면역페록시다아제 ECL 검출 시스템을 이용하여 HRP-접합 2차 항체를 검출하는 것을 포함할 수 있다.

ECL 시약의 조제:

원료 A

(i) DMSO(Fluca 0-9253)에 용해된 50 μl의 250 mM 루미놀(Sigma C-9008).

(ii) DMSO에 용해된 22 μl의 90 mM p-쿠마린산(Sigma C-9008).

(iii) 0.5 ml의 트리스(Tris) 1M, pH 8.5.

(iv) 4.428 ml의 H₂O (총 5 ml).

원료 B

(i) 3 μl의 H₂O₂.

(ii) 0.5 ml의 트리스 1M, pH 8.5.

(iii) 4.5 ml의 H₂O (총 5 ml).

하기의 ECL 시약의 공급원을 사용할 수 있다.

표준; 버전 1.0은 dH₂O가 모든 시약 및 완충액에 대해 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물로 대체된 것이고; 버전 1.1은 반응체적의 dH₂O가 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물로 대체된 것이다.

전세포 단백질 추출물을 주르캣 세포(Jurkat cells)로부터 생성할 수 있다. 이 단백질 추출물을 SDS-PAGE법으로 처리하고, 니트로셀룰로오스막 상의 단백질 블롯팅을 수행할 수 있다. ZAP70 단백질(자체적으로 조제된 폴리클로날 혈청 Ab)에 특이적인 항체는 1:30000(보통의 작업 희석도는 1:3000)의 희석도에서 막을 이용하여 배양할 수 있다. 상기 항체 면역반응 단백질 밴드는 HRP-접합된 2차 항체와의 반응 및 면역페록시다아제 ECL 검출 시스템을 이용한 현상(development)에 의해 시각화될 수 있다. 동일 체적의 원료 A 및 원료 B를 결합할 수 있고, 검출 혼합물을 5분간 평형화시킬 수 있다. 상기 검출 혼합물을 직접 블롯(blot)(단백질이 위쪽을 향함)에 첨가하고, 실온에서 3분간 배양할 수 있다. X선 필름을 니트로셀룰로오스막에 1분, 5분 및 10분간 노출시킬 수 있다.

상기 물을 본 실시예의 부화된 나노구조 조성물로 대체시키면 ECL 반응의 감도가 증대될 것으로 예측된다.

이상에서 본 발명은 특수한 실시예에 관련하여 기술하였으나, 본 기술분야의 전문가에게는 많은 변경, 개조 및 변화가 명백할 것이다. 따라서, 첨부한 청구범위의 정신 및 범위 내에 속하는 이들 모든 변경, 개조 및 변화는 본 발명에 포함시키고자 한다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 이들 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용되는 것까지도 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 포함된다. 추가로, 본 명세서에서 참고 문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능하다는 것을 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다. 각 절에 사용된 표제는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다.

국제특허출원 WO2007/077562, WO2007/077560, WO2007/077561, WO2007/077563, WO2008/081456 및 WO2008/081455의 교시는 본 발명의 범위로부터 배제된다.

SEQUENCE LISTING <110> Do-Coop Technologies Ltd. Gabbai, Eran <120> ENRICHED NANOSTRUCTURE COMPOSITION <130> 48012 <150> US <151> 2007-08-20 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 1 taatacgact cactataggg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 2 ggaaacagct atgaccatga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 caccagactg actcctcatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 cctgttgctg cacatattcc 20

Claims (73)

1. 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법으로서:
   (a) 상기 고체 분말을 가열하고, 그것에 의해 가열된 고체 분말을 제공하는 단계;
   (b) 상기 가열된 고체 분말을 기체 매체의 존재 하에서 상기 고체 분말보다 차가운 액체 내에 침지하는 단계; 및
   (c) 상기 고체 분말의 입자로부터 나노구조가 형성되도록 그리고 상기 기체 매체로부터 안정한 기체상이 형성되도록 선택된 전자기 방사에 의해 상기 차가운 액체, 상기 가열된 고체 분말 및 상기 기체 매체를 조사하는 단계를 포함하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 기체 매체가 개입되도록 하기 위해 상기 침지 단계 전에 상기 가열된 고체 분말을 상기 기체 매체에 통과시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 기체 매체가 개입되도록 하기 위해 상기 침지 단계 전에 상기 기체 매체를 상기 액체 내에 도입하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 기체 매체는 소수성 기체를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 기체 매체는 이산화탄소, 산소, 질소, 이산화황, 수소, 불소, 메탄, 헥산, 헥사플루오로에탄 및 공기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 분말은 마이크로 치수의 입자인 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 마이크로 치수의 입자는 결정질 입자인 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 나노구조는 결정질 나노구조인 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 액체는 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 분말은 강유전체 물질 및 강자성체 물질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 분말은 BaTiO₃, WO₃ 및 Ba₂F₉O₁₂.로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 분말은 히드록시아파타이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
13. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 분말은 미네랄, 세라믹 물질, 유리, 금속 및 합성 중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
14. 청구항 1에 있어서, 상기 전자기 방사는 무선주파수 범위인 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 전자기 방사는 연속파 전자기 방사인 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 전자기 방사는 변조된 전자기 방사인 것을 특징으로 하는 고체 분말로부터 나노구조 조성물을 생산하는 방법.
17. 액체, 나노구조들 및 안정한 또는 준안정한 기체상을 포함하는 나노구조 조성물로서, 상기 나노구조들 중의 적어도 하나는 나노 크기의 코어 물질 및 상기 코어 물질과 안정한 물리적 상태에 있는 정렬된 유체 분자의 인벨롭을 구비하는 나노구조 조성물.
18. 청구항 17에 있어서, 가해지는 여기 에너지에 반응하여 상기 기체를 방출할 수 있고, 상기 여기 에너지의 공급이 종료되었을 때 상기 기체를 포집할 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서, 비-대기 조건에서 조제되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
20. 청구항 17 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 기체 제트류의 존재 하에서 조제되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
21. 청구항 17 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체의 자연상태의 농도와 실질적으로 상이한 농도의 기체의 존재 하에서 조제되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
22. 청구항 17 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 대기의 온도보다 실질적으로 낮은 온도의 기체의 존재 하에서 조제되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
23. 청구항 17 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 분자의 인벨롭은 상기 액체로부터 구별될 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
24. 청구항 17 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코어 물질은 결정질인 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
25. 청구항 17 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체는 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
26. 청구항 17 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체상은 소수성 기체를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
27. 청구항 17 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체상은 이산화탄소, 산소, 질소, 이산화황, 수소, 불소, 메탄, 헥산, 헥사플루오로에탄 및 공기로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
28. 청구항 17 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체상은 상기 인벨롭 내에 존재하거나 상기 인벨롭에 부착되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
29. 청구항 17 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체상은 상기 코어 내에 존재하거나 상기 코어에 부착되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
30. 청구항 17 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기체상은 상기 나노구조들 사이의 액체 영역 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
31. 청구항 17 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 먼저 하나의 표면에 접촉되고, 다음에 소정의 세정 프로토콜에 의해 세정된 경우, 상기 조성물의 전기화학적 흔적이 상기 표면상에 보존되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
32. 청구항 17 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 상기 액체 자체의 제타 포텐셜보다 실질적으로 큰 제타 포텐셜을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
33. 청구항 17 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 액체의 비중 이하의 비중을 가지는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
34. 청구항 17 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 염료 용액과 혼합되었을 때, 상기 염료 용액의 스펙트럼 특성이 실질적으로 변화되는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
35. 청구항 17 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 물에 비해 향상된 초음파 속도를 특징으로 하는 나노구조 조성물.
36. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 박테리아 콜로니 팽창률의 증대를 촉진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
37. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 상기 파아지-박테리아 또는 바이러스-세포 상호작용을 촉진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
38. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 고체상 매트릭스에 대한 거대분자의 결합을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
39. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 DNA 분자를 적어도 부분적으로 디폴딩시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
40. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 효소 활성을 안정화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
41. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 생체물질에 대한 박테리아의 부착성을 변경시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
42. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 수지에 대한 핵산의 친화성 결합을 향상시키고, 겔 전기영동 분리를 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
43. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 컬럼의 성능을 증대시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
44. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 물에 비해 향상된 물질의 용해 능력 또는 물질의 분산 능력을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
45. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 물에 비해 향상된 완충 능력을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
46. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 핵산 증폭 공정의 효율을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
47. 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트로서,
    (a) 열안정성 DNA 폴리머라아제; 및
    (b) 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 폴리머라아제가 별도로 포장되어 있는 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트.
48. DNA 서열을 증폭하는 방법으로서:
    (a) 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 나노구조 조성물의 존재 하에서, 상기 DNA 서열상에 복수의 폴리머라아제 연쇄반응 사이클을 실행하고, 그 것에 의해 DNA 서열을 증폭하는 단계를 포함하는 DNA 서열을 증폭하는 방법.
49. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 실시간 폴리머라아제 연쇄반응의 효율을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
50. 실시간 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트로서:
    (a) 열안정성 DNA 폴리머라아제;
    (b) 이중사슬 DNA 검출 분자; 및
    (c) 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 실시간 폴리머라아제 연쇄반응을 위한 키트.
51. 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노구조 조성물이 고체 지지체의 존재 하에서 적어도 하나의 거대분자의 조작을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 나노구조 조성물.
52. 적어도 하나의 살균제 및 청구항 17 내지 청구항 35 중 어느 한 항의 나노구조 조성물을 포함하는 살균제 조성물.
53. 멸균이 필요한 개체에게 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 조성물을 살균에 유효한 양만큼 제공하는 단계, 및 그것에 의해 개체의 체표면을 살균하는 단계를 포함하는 개체의 체표면을 살균하는 방법.
54. 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 조성물을 물체에 접촉하는 단계, 및 그것에 의해 상기 물체를 살균하는 단계를 포함하는 물체를 살균하는 방법.
55. 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물 및 적어도 하나의 동결방지제를 포함하는 동결방지 조성물.
56. 세포 물질을 냉동보존하는 방법으로서:
    (a) 상기 세포 물질을 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포 물질을 냉동보존 온도에 노출시키고, 이것에 의해 상기 세포 물질을 냉동보존하는 단계를 포함하는 세포 물질을 냉동보존하는 방법.
57. 청구항 55의 동결방지 조성물을 포함하는 저온보존 용기.
58. 약학 조성물로서:
    (a) 활성 성분인 적어도 하나의 약학적 제제; 및
    (b) 상기 적어도 하나의 약학적 제제의 인비보 흡수를 향상시키도록 조제된, 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 약학 조성물.
59. 청구항 58의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계, 및 그것에 의해 상기 약학 조성물의 세포 내로의 인비보 흡수를 향상시키는 단계를 포함하는 약학 조성물의 세포 내로의 인비보 흡수를 향상시키는 방법.
60. 세포 융합 방법으로서, 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 세포들을 융합하는 단계, 및 그것에 의해 세포들을 융합하는 단계를 포함하는 세포 융합 방법.
61. 진핵세포를 배양하는 방법으로서, 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 세포들을 배양하는 단계, 및 그것에 의해 진핵세포를 배양하는 단계를 포함하는 진핵세포를 배양하는 방법.
62. 진핵세포 배양 배지 및 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 세포 배양 배지.
63. 제품으로서, 포장재료 및 이 포장재료 내에 수용되는 진핵세포의 배양을 위한 것으로 확인된 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 제품.
64. 제품으로서, 포장재료 및 이 포장재료 내에 수용되는 모노클로날 항체를 생성하기 위한 것으로 확인된 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 제품.
65. 모노클로날 항체의 생성 방법으로서, 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 배지 내에서 하이브리도마를 얻기 위해, 불사화 세포와 항체 생산 세포를 융합시키는 단계를 포함하는 모노클로날 항체의 생성 방법.
66. 세팔로스포린의 용해 또는 분산 방법으로서, 상기 물질의 용해 또는 분산을 허용하는 조건 하에서 상기 세팔로스포린을 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세팔로스포린의 용해 또는 분산 방법.
67. 검체를 검출하기 위한 키트로서:
    (a) 검출이 가능한 제제; 및
    (b) 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 검체를 검출하기 위한 키트.
68. 제품으로서, 포장재료 및 이 포장재료 내에 수용되는 검출이 가능한 부분의 검출을 향상시키기 위한 것으로 확인된 청구항 17 내지 청구항 35 중의 어느 하나의 나노구조 조성물을 포함하는 제품.
69. 기체의 리사이클링을 위한 장치로서, 나노구조 조성물 및 상기 나노구조 조성물을 여기시키기 위한 여기장치를 포함하고, 상기 나노구조 조성물은 상기 여기장치가 작동 중일 때 기체를 방출하고, 상기 여기장치가 비작동 중일 때 기체를 포집하는 기체의 리사이클링을 위한 장치.
70. 청구항 69의 장치를 포함하는 곤충을 유인하기 위한 장치.
71. 청구항 69의 장치를 포함하는 식물의 성장을 향상시키기 위한 장치.
72. 곤충 유인 방법으로서, 청구항 69의 장치의 여기장치를 기동하는 단계, 및 그것에 의해 상기 곤충을 유인하는 단계를 포함하는 곤충 유인 방법.
73. 식물의 성장을 향상시키는 방법으로서, 주간에 청구항 69의 장치의 여기장치를 기동하는 단계, 및 그것에 의해 식물의 성장을 향상시키는 단계를 포함하는 식물의 성장을 향상시키는 방법.
    

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