KR20100052355A

KR20100052355A - 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법 그리고 이에 사용되는 장치

Info

Publication number: KR20100052355A
Application number: KR1020080111326A
Authority: KR
Inventors: 김대중; 김진환
Original assignee: 메디스커브 주식회사
Priority date: 2008-11-10
Filing date: 2008-11-10
Publication date: 2010-05-19
Also published as: JP5445794B2; JP2012508008A; WO2010053324A2; WO2010053324A3; US20110217727A1

Abstract

본 발명의 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법은, 자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서, 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 자성물질을 복수개 준비하는 단계와, 상기 자성물질을 살아 있는 세포 내에 제공하되, 한 개의 살아 있는 세포를 기준으로 상기 자성물질을 복수개 제공하는 단계와, 상기 살아있는 세포에 집속된 자기장을 인가하여 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 단계와, 상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 복수개의 자성물질들이 배열되도록 하는 단계와, 상기 자성물질들이 배열된 패턴을 확인하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법은, 자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서, 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 자성물질을 복수개 준비하는 단계와, 상기 자성물질을 살아 있는 세포 내에 제공하되, 한 개의 살아 있는 세포를 기준으로 상기 자성물질을 복수개 제공하는 단계와, 상기 자성물질과 결합하여 상기 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 이미지화할 수 있는 표지물질을 살아 있는 세포 내에 제공하는 단계와, 상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하여 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 단계와, 상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 복수개의 자성물질들이 배열되도록 하는 단계와, 상기 자성물질들이 배열된 패턴을 이미지화할 수 있는 상기 표지물질의 이미지 화된 패턴을 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 살아 있는 세포내에 도입된 자성물질에 자기장을 인가하여 자성물질이 자력선 방향으로 패턴을 형성하게 하고, 이러한 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 표지물질을 사용하여 이미지화할 수 있다.

자성물질, 자력선 방향, 패턴, 패턴의 이미지화, 모니터

Description

살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법 및 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법 그리고 이에 사용되는 장치{METHOD OF MAKING PATTERNS OF MAGNETIC MATERIALS IN LIVE CELLS, METHOD OF IMAGING PATTERNS OF MAGNETIC MATERIALS AND APPARATUS PROVIDED WITH THEREFOR}

본 발명은 살아있는 세포내에서 자력선 방향으로 자화되는 자성물질의 패턴을 형성하는 방법 및 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법 그리고 이에 사용되는 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 살아있는 세포내에서 자성물질에 자기장을 인가하여 자성물질이 자력선 방향으로 패턴을 형성하게 하고, 표지물질을 이용하여 이러한 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법 및 이에 사용되는 장치에 관한 것이다.

세포는 사람을 포함하는 유기체의 기본 구조이며 활동 단위이다. 살아있는 세포는 세포질(cytoplasm)과 다양한 세포 소기관들(subcellular organelles), 예를 들어 핵(nucleus), 핵인(nucleolus), 골지체(Golgi apparatus), 소포체(endoplasmic reticulum), 미토콘드리아(mitochondria), 엔도좀(endosome), 퍼옥시좀(peroxisome), 라이소좀(lysosome), 세포골격(cytoskeleton) 등으로 구성된 복 잡한 구조를 갖는다.

살아있는 세포의 생명현상은 이와 같은 세포 소기관들과 세포 소기관들을 구성하거나 세포 소기관에 존재하는 다양한 세포내 물질들(cellular components), 예를 들어 단백질(proteins), 핵산(nucleic acids), 당(polysaccharide), 지질(lipids) 등의 고분자 화합물과, 아미노산(amino acids), 뉴클레오티드(nucleotides), 인산(phosphoric acids), 비타민(vitamins), 아민(amines), 기타 저분자 유기 화합물(organic compounds) 등의 저분자 화합물(small molecules)에 의해 조절되고 유지된다.

세포의 세포질은 점탄성(viscoelasticity)과 요변성(thixotropy) 특성을 갖는 겔유사(gel-like) 물질로 알려져 있고(Luby-Phelps, et al. Probing the structure of cytoplasm. J. Cell Biol. (1986) 102, 2015-2022), 세포질은 물보다 약 4배 가량 높은 액상 점성(fluid phase viscosity)를 갖는 것으로 알려져 있다. 또한, 세포질에 녹아 있는 거대분자들의 크기에 따라 자유 확산(free diffusion)을 제한하는 장벽을 갖는 것으로 알려져 있다(Luby-Phelps, et al. Probing the structure of cytoplasm. J. Cell Biol. (1986) 102, 2015-2022). 상기 세포내 장벽은 필라멘트성 그물 세공(filamentous meshwork)으로 이루어졌을 것으로 추정되며, 그물 세공의 평균 세공(pore) 크기는 30~40 nm일 것으로 추산되고 있다(Luby-Phelps, et al. Probing the structure of cytoplasm. J. Cell Biol. (1986) 102, 2015-2022).

이와 같은 세포질의 특성에 기인하여 단백질 중합체(oligomeric proteins), 다효소 복합체(multi-enzyme complexes), mRNA 등을 포함하는 긴 사슬 폴리머(long chain polymer), 리보솜, 바이러스 등은 매우 느리게 움직이거나 거의 움직이지 않을 것으로 추산되어, 반경이 25-30 nm 이상인 입자들은 거의 움직이지 못하는 것으로 보고되고 있다(Luby-Phelps, et al. Probing the structure of cytoplasm. J. Cell Biol. (1986) 102, 2015-2022; Arrio-Dupont, et al. Translational diffusion of globular proteins in the cytoplasm of cultured muscle cells. Biophys. J. (2000) 78, 901-907; Luby-Phelps, et al. Hindered diffusion of inert tracer particels in the cytoplasm of mouse 3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 4910-4913; Weiss, et al. Anomalous subdiffusion is a measure for cytoplasmic crowding in living cells. Biophys. J. (2004) 87, 3518-3524).

전통적으로 세포의 구조와 세포내 물질들의 기능을 연구하기 위하여 생물학에서는 다양한 방법들이 사용되어 왔으며, 특히 다양한 생명 현상이 일어나는 중요한 부분인 세포질의 특성과 구조를 연구하기 위하여 광학적 도구로서 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope), 공초점현미경(Confocal Microscope), 형광현미경(Fluorescence Microscope) 또는 광학현미경(Light Microscope) 등이 사용되어 왔다.

이와 관련하여 세포질의 물리적 특성을 규명하기 위한 노력의 일환으로서 자성물질을 사용한 세포질의 점탄성 측정(Crick, et. al. The physical properties of cytoplasm: a study by means of the magnetic particle method. Exp. Cell Res. (1950) 1, 505-533), 세포질의 액틴 필라멘트 용액의 유변성(rheology) 측정(Ziemann, et. al. Local measurements of the viscoelastic moduli of entangled actin networks using an oscillating magnetic bead micro-rheometer. Biophys. J. (1994) 66, 2210-2216) 등의 사례가 있으나, 자성물질을 이용하여 세포의 움직임을 추적하거나, 자성물질의 움직임을 이용한 세포내 구조와 대사과정을 규명하고 세포질의 생물학적 특성을 규명하기 위한 노력은 저조하였다.

한편, 세포내 구조와 대사과정을 이해하기 위한 다른 노력의 일환으로서, 특정물질을 형광 표지한 후 현미경 관찰을 수행하는 형광 프로브 기술(Lippincott-Schwartz, et al. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2001) 2, 444-456; Zhang, et al. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2002) 3, 906-918)이 개발되어 사용되고 있다. 형광 프로브 기술은 세포를 파쇄하지 않고 세포 내에서 특정 물질의 위치를 파악할 수 있다는 장점이 있으나, 세포 내에서 일어나는 다양한 생명현상 및 대사과정의 규명과, 신호 전달(Signal transduction) 등에 관여하는 물질을 추적하는 데에는 한계가 있다는 단점이 있다. 또한, 최근 들어 다양한 유형의 나노입자/나노크리스탈들을 이용하는 형광 프로브 기술(Chan, et al. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. (2002) 13, 40-46; Berry & Curtis. Functionalization of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. J. Phys. D Appl. Phys. (2003) 36, R198-R206; Rudin & Weissleder. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. (2003) 2, 123-131; Alivisatos. The use of nanocrystals in biological detection. Nat. Biotechnol. (2004) 22, 47-52)과, 세포 표지 및 세포 소기관 트래킹 기술(Derfus, et al. Intracellular delivery of quantum dots for live cell labeling and organelle tracking. Adv. Mater. (2004) 16, 961-966)도 시도되고 있으나, 상기와 같은 단점을 그대로 갖고 있다.

이러한 문제점들에 대한 대안으로 자성물질이 주목을 받고 있는데, 자성물질은 연구용 및 의학용으로의 사용이 시도되고 있다(Alexiou, et al. Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting. Cancer Res. (2000) 60, 6641-6648; Lewin, et al. Tat peptide-derived magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. (2000) 18, 410-414; Berry & Curtis. Functionalization of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. J. Phys. D Appl. Phys. (2003) 36, R198-R206; Beckmann, et al. Magnetic resonance imaging in drug discovery: lessons from disease areas. Drug Discov. Today (2004) 9, 35-42; Kelloff, et al. The progress and promise of molecular imaging probes in oncologic drug development. Clin. Cancer Res. (2005) 11, 7967-7985). 예를 들어, 세포의 분리나 세포 파쇄액으로부터 특정 물질을 분리하는 용도로 자성물질의 사용이 시도되고 있다(Saiyed, et al. Application of magnetic techniques in the field of drug discovery and biomedicine. BioMagnetic Res. Technol. (2003) 1, 2). 그러나, 자성물질을 효율적으로 세포 내로 도입하여 조작함으로써 그 움직임을 관찰하고 세포 내 구조와 대사과정을 규명하려는 연구는 아직 미숙한 수준이다. 왜냐하면, 세포질 자체의 특성과 사용되는 자성물질의 이동성 한계 때문이다.

이와 관련하여 세포 표면 위에 있는 자성물질의 움직임을 이용하여 세포 표면 수용체(Cell Surface Receptors)의 물리적 특성을 측정하거나(미국 특허 제5,486,457호), 세포내에서 자기장에 의한 자성물질의 움직임을 이용하여 세포질의 점성을 측정하거나(Gehr, et. al. Magnetic particles in the liver: a probe for intracellular movement. Nature (1983) 302, 336-338; Valberg, PA. Magnetometry of ingested particles in pulmonary macrophages. Science (1984) 224, 513-516; Valberg & Feldman. Magnetic particle motions within living cells: measurement of cytoplasmic viscosity and motiel activity. Biophys. J. (1987) 52, 551-561; Andreas, et. al. Measurement of Local Viscoelasticity and Forces in Living Cells by Magnetic Tweezers, Biophys. J. (1999) 76, 573-579), 세포내 특정 부분으로 자성물질을 이동시키려고 한 시도(Gao, et al. Intracellular spatial control of fluorescent magnetic nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. (2008) 130, 3710-3711)가 보고된 바 있으나, 자성물질을 효율적으로 세포 내로 도입하여 그 움직임을 적절히 조작하고 모니터링하는 관점에서는 만족스러운 것들이 아니었다.

구체적으로, 대식세포(Macrophage) 계열을 제외한 HeLa 등의 일반적인 세포의 초기 엔도좀(Early Endosome)의 직경은 보통 200 내지 300 nm이고(Lodish 등 전게서, 727쪽; Brandhorst, et. al. Homotypic fusion of early endosomes: SNAREs do not determine fusion specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103, 2701-2706), 후기 엔도좀(Late Endosome)의 직경은 평균 750 nm이므로(Ganley, et. al. Rab9 GTPase regulates late endosome size and requires effector interaction for its stability. Mol. Biol. Cell (2004) 15, 5420-5430), 매우 큰 직경의 자성물질을 세포내로 도입하는 것은 어렵다. 반면에 광학현미경의 해상도는 대략 200 nm이므로 수 내지 수십 nm의 작은 직경을 갖는 자성물질은 독립적으로 떨어져 있을 경우 세포내에서 그 위치를 판별하기 매우 어렵다. 예를 들어, 세포 내의 소기관 중 구체모양을 띄는 엔도좀, 라이소좀 등의 소포체는 광학현미경 상에서 세포 내에 산발적으로 흩어진 흑점의 형태로 보일 수 있기 때문에 흑점 형태로 관찰되는 크기가 작은 자성입자를 세포 내에서 세포소기관과 구별하여 모니터링하는 것은 매우 어렵다.

이에 본 발명자들은 자성물질을 살아있는 세포 내에 도입하고 자기장의 인가에 의해 자력선 방향으로 자성물질이 살아 있는 세포 내에서 패턴을 형성하는 방법 및 이러한 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법과 이에 사용되는 장치를 발명하기에 이르렀다.

본 발명은 살아 있는 세포내에 도입된 자성물질이 자기장에 의한 자화방향으로 패턴을 형성하도록 하는 방법 및 이러한 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법 그리고 이에 사용되는 장치를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 살아 있는 세포내에 도입된 자성물질에 자기장을 인가하여 자성물질이 자력선 방향으로 패턴을 형성하게 하고, 이러한 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 표지물질로서 이미지화하는 방법을 제공함으로써 살아 있는 세포 내 구조 및 물질의 대사과정을 쉽게 모니터할 수 있는 기술을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법은,

자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서, 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 자성물질을 복수개 준비하는 단계와,

상기 자성물질을 살아 있는 세포 내에 제공하되, 한 개의 살아 있는 세포를 기준으로 상기 자성물질을 복수개 제공하는 단계와,

상기 살아있는 세포에 집속된 자기장을 인가하여 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 단계와,

상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 복수개의 자성물질들이 배열되도록 하는 단계와,

상기 자성물질들이 배열된 패턴을 확인하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법은,

상기 자성물질과 결합하여 상기 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 이미지화할 수 있는 표지물질을 살아 있는 세포 내에 제공하는 단계와,

상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하여 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 단계와,

상기 자성물질들이 배열된 패턴을 이미지화할 수 있는 상기 표지물질의 이미지화된 패턴을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 자성물질은 자기장에 의해 자화될 수 있는 물질로 구성되어야 하며, 철, 망간, 크롬, 니켈, 코발트 및 아연 등의 1주기 전이금속, 이들 전이금속의 산화물, 황화물, 인화물 및 이들 전이금속들의 합금, 그리고 이들 전이금속들의 합금의 산화물, 황화물 및 인화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전이금속 화합물이거나 이들을 포함하는 조성물일 수 있다.

바람직하게는, 상기 자성물질은 마그네타이트(Fe₃O₄), 마그헤마이트(gamma-Fe₃O₄), 코발트 페라이트(CoFe₂O₄), 망간 옥사이드(MnO), 망간 페라이트(MnFe₂O₄), 아이언-플래티늄합금(Fe-Pt alloy), 코발트-플래티늄 합금(Co-Pt alloy) 및 코발트(Co)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 또는 적어도 2개의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 자성물질은 1 내지 1,500nm의 직경을 가진다. 바람직하게는 상기 자성물질은 20 내지 350nm의 직경을 가진다

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 자성물질은 40 emu(electromagnetic unit)/g 이상의 포화자기화(Saturation Magnetization)를 갖는 것이 바람직하며, 초상자성(Superparamagnetism) 또는 강자성(Ferromagnetism)의 특성을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 살아 있는 세포 내에 제공된 상기 자성물질은 광학현미경에 의해 흑점(Black dot)의 형태로 관찰될 수 있으며, 상기 흑점은 150 내지 3,000nm 이상의 직경을 가진다. 광학현미경의 이론적 해상도가 약 200 nm이므로(Lodish, et. al. Molecular Cell Biology 4th ed. W.H. Freedman and company, (2000) 140-141), 상기 흑점은 300 내지 1,500 nm 이상의 직경을 가지는 것이 바람직하다. 상기 흑점은 단일한 자성물질로 구성될 수도 있고 다수의 자성물질들이 위치적으로 서로 인접한 형태로 구성될 수도 있다.

한편, 상기 자성물질이 RITC(Rhodamine B isothiocyanate) 또는 FITC(fluoresceine isothiocyanate) 등과 같은 형광성을 포함할 경우, 세포내에 존재하는 상기 자성물질은 형광현미경 하에서 고유의 형광을 나타내는 형광점(Fluorescence Dot)의 형태로 관찰될 수 있으며, 형광현미경을 이용하여 관찰할 경우 상기 형광점은 상기 자성입자의 직경보다 더 크게 보일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 흑점은 상기 살아 있는 세포 내에 복수개로 존재한다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 살아있는 세포에 집속된 자기장을 인가할 때 자기장의 인가방향은 상기 살아 있는 세포가 놓여 있는 바닥면에 대해 수평방향으로 인가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하는 것은 자기장 인가 장치에 의해 수행되며, 상기 자기장 인가 장치는 살아 있는 세포가 수용된 용기를 고정하며 자기장의 세기를 강화하기 위한 비자화성 자성체로 이루어진 원통형 코어, 또는 상기 용기를 지지하는 복수 개의 연장부가 설치된 자기장 구배 증대수단을 구비하여 자기장을 상기 용기에 대해 집중시키고 상기 용기의 특정 방향으로 상기 자성물질을 이동 및 유지시키는 힘을 강화시켜 줌으로써 상기 자성물질의 자력선 방향으로의 자화를 용이하게 할 수 있다. 또한, 상기 영구자석 또는 전자석은 세포에 근접시켜 위치시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴을 확인하고, 상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴이 중첩(co-localization)되는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 표지물질은 매개자(mediator)를 이용하여 상기 자성물질에 표지될 수 있다. 상기 매개자는 하나 또는 복수개의 링커물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 매개자는 2개의 링커물질로 구성할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 매개자를 이용하여 상기 표지물질을 상기 자성물질에 표지하는 것은 상기 자성물질과 상기 표지물질을 살아 있는 세포 내에 제공하기 전에 수행될 수 있다.

대안으로, 상기 매개자를 이용하여 상기 표지물질을 상기 자성물질에 표지하는 것은, 상기 자성물질과 상기 표지물질을 각각 살아 있는 세포 내에 제공한 후 상기 매개자에 의해 살아 있는 세포 내에서 상기 자성물질에 상기 표지물질이 표지되어 수행될 수도 있다. 상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴이 중첩되는 것으로 확인되는 경우, 상기 매개자를 구성하는 링커물질들은 살아 있는 세포 내에서 결합하는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예의 방법에 있어서, 상기 매개자를 구성하는 링커물질로는 단백질(proteins), 핵산(nucleic acids), 당(polysaccharide), 지질(lipids) 등의 고분자 화합물과, 아미노산(amino acids), 뉴클레오티드(nucleotides), 인산(phosphoric acids), 비타민(vitamins), 아민(amines), 기타 저분자 유기 화합물(organic compounds) 등의 저분자 화합물(small molecules) 등을 포함한다.

한편, 본 발명의 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법에 사용되는 장치는,

살아 있는 세포들을 배양하는 용기로서, 자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서, 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 복수개의 자성물질과, 상기 자성물질과 결합하여 상기 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 이미지화할 수 있는 표지물질이 제공되는 살아 있는 세포들을 배양하는 용기와,

상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하는 자기장 인가 장치로서, 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 자기장 인가 장치와,

상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 배열된 복수개의 자성물질들의 패턴 및/또는 상기 자성물질들의 배열된 패턴을 이미지화할 수 있는 상기 표지물질의 이미지화된 패턴을 모니터하는 장치를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 장치에 있어서, 상기 모니터 장치는 상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴이 중첩(co-localization)되는지 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예의 장치에 있어서, 상기 자기장 인가 장치는 살아 있는 세포가 수용된 용기를 고정하며 자기장의 세기를 강화하기 위한 비자화성 자성체로 이루어진 원통형 코어, 또는 상기 용기를 지지하는 복수 개의 연장부가 설치된 자기장 구배 증대수단을 구비하는 것을 특징으로 한다. 이로써 본 발명의 장치는 자기장을 상기 용기에 대해 집중시키고 상기 용기의 특정 방향으로 상기 자성물질을 이동 및 유지시키는 힘을 강화시켜 줌으로써 상기 자성물질의 자력선 방향으로의 자화패턴 형성을 용이하게 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 살아 있는 세포내에 도입된 자성물질에 자기장을 인가하여 자성물질이 자력선 방향으로 패턴을 형성하게 하고, 이러한 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 표지물질을 사용하여 이미지화할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 살아 있는 세포내에 도입된 자성물질의 자력선 방향으로의 패턴을 표지물질로서 이미지화하는 방법을 제공함으로써 살아 있는 세포 내 구조 및 물질의 대사과정을 쉽게 모니터할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예

실시예 1

자성물질의 합성

(1) 자성입자의 합성

세포내에서 자기장에 의해 패턴을 형성할 수 있는 자성물질의 일실시예로, 몰데이 등의 방법(Molday, et. al. Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells. J. Immunol. Meth. (1982) 52, 353-367)을 변형하여 자성입자를 다음과 같이 합성하여 사용하였다.

온도조절과 초음파 강도 조절이 가능한 수조형 초음파세척기(고도기연, model No. JAC 2010)에 50 ml 코니컬 튜브(SPL Lifesciences(경기도 포천시 소재), 제품번호 50050)를 위치시키고 10 ml의 50% (w/w) 덱스트란(Fluka, Cat. No. 31389, 평균 분자량 40000) 수용액을 넣는다.

상기 튜브 속에 실험실용 교반기[풍림상사(서울시 종로구 장사동 소재), 모델번호 PL-S10]와 연결된 프로펠러를 장착한 후 10 ml의 1.51g FeCl₃.6H₂O(Sigma, Cat. No. 236489)과 0.64g FeCl₂.4H₂O(Sigma, Cat. No. 220299) 수용액을 한 방울씩 넣으며 약 2,000 r.p.m.의 속도로 교반한다. 이 과정에서 초음파를 가할 수도 있다.

교반하면서 용액의 pH가 10.5에 이를 때까지 7.5% (v/v) NH₄OH로 한 방울씩 첨가한다. 이 과정에서 수조의 온도를 40 내지 65℃로 조절할 수 있다.

용액의 pH가 10.5에 이르면 미리 온도를 65 내지 90℃로 맞추어 둔 수조에 15분간 중탕한다.

중탕이 끝난 용액은 상온에서 천천히 온도가 내려가도록 정치시켜 둔다.

원심분리기[한일과학산업주식회사(인천시 계양구 작전동 소재), 제품번호 MF-80]를 사용하여 600 x g에서 5분간씩 총 3회의 원심분리를 진행하여 침전물을 제거한 후 상층액을 모아서 다시 2,000 x g에서 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한다.

결합되지 않은 덱스트란을 제거하기 위하여 Amicon Ultracel-100K(Millipore, Cat. No. UFC910024)를 사용하여 탁상용 원심분리기(한일과학산업, 모델명 Combi 514K)에서 3,900 r.p.m.으로 20분간 원심분리한 후 자성입자를 정제수, 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline) 또는 2M 탄산나트륨(sodium carbonate)(Na₂CO₃) 용액(pH 11)에 부유하였다. 이 외에도 Sephacryl S-300을 이용 한 젤 필트레이션 크로마토그래피(Gel filtration chromatography) 방법으로 덱스트란을 제거할 수 있다.

도1은 상기 방법으로 합성된 자성입자의 주사전자현미경 사진이며, 도2는 상기 방법을 변형하여 덱스트란을 첨가하지 않고 합성된 자성입자의 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope) 사진이다.

(2) 자성입자의 표면개질

상기 (1)의 방법으로 합성된 자성입자의 표면을 스트렙타비딘(Streptavidin) 또는 형광단백질 등의 단백질로 개질하기 위하여 당업계에 잘 알려진 방법(March, et. al. A Simplified method for cyanogen bromide activation of agarose for affinity chromatography. Anal. Biochem. (1974) 60, 149-152; Cuatrecasas, P. Protein purification by affinity chromatography. J. Biol. Chem. (1970) 245, 3059-3065)을 변형하여 사용하였다. 자성입자의 표면개질 과정은 다음과 같다.

자성입자의 표면에 노출된 수산화기(hydroxy group)를 활성화시키기 위하여 케미컬 후드 안에서 상기 (1)의 과정에서 준비된 바와 같은 2M 탄산나트륨(sodium carbonate)(Na₂CO₃) 용액(pH 11)에 부유된 자성입자에, 전체 반응 부피의 2%에 해당하는 부피로 5M의 CNBr 용액[2g 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)를 1ml의 아세토니트릴(acetonitril)에 녹인 용액]을 첨가하였다.

반응을 느리게 하기 위하여 4 내지 20℃의 비교적 낮은 온도에서 8 내지 12 분간 반응시키고, 미반응한 CNBr(cyanogen bromide)은 당업계에 잘 알려진 투석, 원심분리, HGMS 기술(High gradient magnetic separation, 미국특허 제4,247,398호; Melville, et. al. Direct magnetic separation of red cells from whole blood. Nature (1975) 255, 706) 또는 한외여과(Ultrafiltration) 등의 방법으로 제거하였다.

미반응 CNBr이 제거된 활성화된 자성입자를 인산완충용액 또는 0.1M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate) 용액에 부유시킨 후, 10 내지 200 mg/ml 농도로 인산완충용액에 희석된 단백질 용액과 섞어 4℃에서 14시간 동안 반응시키서 자성입자의 표면이 단백질에 의해 개질되도록 한다. 이때 단백질의 최종 농도는 0.1 내지 100 mg/ml이 되도록 한다. 바람직하게는 반응하는 단백질의 최종 농도가 1 내지 10 mg/ml이 되도록 한다.

단백질에 의한 자성입자 표면의 개질반응을 종결시키기 위하여 글라이신을 참가하되, 글라이신의 최종 농도가 상기 단백질의 최종 농도의 5 내지 50배가 되도록 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 바람직하게는 글라이신의 최종 농도가 상기 단백질의 최종 농도의 10 내지 25배가 되도록 첨가한다.

미반응한 단백질과 글라이신은 당업계에 잘 알려진 원심분리 또는 HGMS 등의 방법으로 제거하였다.

상기 방법으로 자성입자의 표면을 스트렙타비딘으로 개질하여 스트렙타비딘-자성입자를 제작하였으며, 자성입자의 표면을 당업계에 널리 알려진 형광단백질 중의 하나인 EGFP(Enhanced green fluorescence protein)로 개질하여 EGFP-자성입자 를 제작하였다.

상기 방법으로 자성입자의 표면이 단백질로 개질되었는지 여부는 SDS-불연속 전기영동법(SDS-discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE )에 의하여 확인할 수 있다.

이 외에도 본 발명에서 사용가능한 단백질로 표면이 개질된 자성입자는 당업계에 잘 알려진 방법(미국특허 제5,665,582호; 미국특허공개 제2003/0092029A1호)으로 직접 제작하거나, 자성입자를 제작판매하고 있는 회사로부터 구입하여 사용할 수 있다.

실시예 2

세포 내에 도입된 자성물질의 자력선 방향으로의 패턴 형성

HeLa 세포(ATCC에서 구입, Cat. No. CCL-2)를 96-웰 플레이트에 5,000개 세포/웰(cells/well) 단위로 계대배양(subculture)하여, 37℃, 5% CO₂배양기에서 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Invitrogen에서 구입)을 함유한 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.

다음날, 실시예 1에서 합성한 자성물질에 최종 농도 0.1 mM이 되도록 단백질 전달 도메인(Protein Transduction Domain)을 갖는 펩타이드 (PKKKRKVGLFGAIAGFIENGWEGMIDG)를 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시킨 후, HGMS 방법을 사용하여 결합하지 않은 단백질 전달 도메인을 제거하였다. 본 발명의 실시 예에서 단백질 전달 도메인으로는 상기 서열 이외에도 당업계에 잘 알려진 단백질 전달 도메인을 사용할 수 있고, 또한 페너트라틴(Penetratin)이라고 지칭되기도 하는 펩타이드를 사용할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 이해할 것이다.

다음으로, 배양된 HeLa 세포를 1 x D-PBS로 세척한 후 상기 자성물질과 단백질 전달도메인이 함유된 OPTI MEM I (Invitrogen에서 구입) 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다.

다음날, 자성물질이 처리된 세포를 OPTI-MEM I (Invitrogen에서 구입, Cat.No. 31985-070) 배지를 이용하여 2회 세척한 후, OPTI-MEM I 배지가 들어있는 상태에서 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 영구자석 또는 전자석을 이용하여 자기장을 걸어 주었다(대한민국특허 제10-0792594호; 대한민국특허 제10-0862368호; 미국특허 제4,247,398호).

자성물질이 세포 내에서 자기장에 의하여 움직일 수 있기 위해서는 세포질의 점도와 세포내 구조로 인하여 수용액 속에 존재할 때보다 더욱 큰 자기력을 받아야 한다.

세포 내에서 자성물질이 받는 자기력(Magnetic force)은 자성물질의 자화도(Magnetization)와 자기장의 자속밀도(magnetic flux density)에 비례한다. 자기장의 자속밀도는 자석을 구성하는 금속 물질의 포화 자기도에 의하여 영향을 받으므로, 높은 자속밀도를 만들기 위해서는 포화 자기도가 큰 금속을 사용하여 자석을 만들어야 한다.

또한, 자속밀도는 자석으로부터 세포사이의 거리의 제곱에 반비례므로, 가급적 높은 자속밀도를 세포내에 존재하는 자성물질에 가하기 위해서는 가급적 세포와 자석과의 거리를 가깝게 해야 한다.

이와 관련하여 도3에는 본 발명의 일실시예에서 사용되는 자기장 인가장치(대한민국특허 제10-0792594호 참조)가 도시되어 있다. 상기 자기장 인가장치에는 다수의 웰(152)이 형성된 웰 플레이트(150)를 수용하기 위한 통체(100)와, 웰 플레이트(150)를 고정하며 비자화성 자성체로 이루어진 자기장의 세기를 강화하기 위한 코어(140)가 설치되어 있다. 도시하지는 않았으나, 상기 통체(100)의 주위로 수회 내지 수십만회 권선되어 전원의 공급시 웰 플레이트(150)를 포함하는 영역에 자기장을 형성하기 위한 코일과, 코일에 전원을 공급하기 위한 전원공급장치도 제공된다. 상기 코어(140)는 전류가 흐르는 동안만 자화될 수 있는 비자화성 자성체로 구성하며, 이러한 코어(140)의 설치에 의해 자기장이 코어(140) 측으로 집중되는 현상이 발생하여 코어(140) 근방의 자기장의 세기를 높이게 된다. 따라서, 코어(140)를 설치함에 따라 자기장이 코어(140) 측으로 집중되고, 이와 같이 자기장의 세기가 급격하게 강해지면, 웰플레이트(150) 내에 존재하는 자성물질의 이동 및 유지시키는 힘을 강화시켜 줌으로써 상기 자성물질의 자력선 방향으로의 자화패턴 형성을 용이하게 할 수 있다.

또한, 도4에는 본 발명의 일실시예에서 사용되는 또 다른 형태의 자기장 인가장치(대한민국특허 제10-0862368호 참조)가 도시되어 있다. 상기 자기장 인가장 치(1000a)에는 다수의 웰(152)이 형성된 웰 플레이트(150)를 수용하기 위한 통체(100)와, 상기 통체(100)의 밑면에 대해 위쪽 방향으로 돌출되고, 웰 플레이트(150)를 지지하는 복수 개의 연장부로 구성된 자기장 구배증대 수단(144)이 설치되어 있다. 도시하지는 않았으나, 상기 통체(100)의 주위로 수회 내지 수십만회 권선되어 전원의 공급시 웰 플레이트(150)를 포함하는 영역에 자기장을 형성하기 위한 코일과, 코일에 전원을 공급하기 위한 전원공급장치도 제공된다. 상기 자기장 구배증대 수단(144)은 복수 개의 연장부에 의해 자기장 구배를 증대시켜 웰플레이트(150)의 웰(152) 내의 자성물질의 이동 및 유지시키는 힘을 강화시켜 줌으로써 상기 자성물질의 자력선 방향으로의 자화패턴 형성을 용이하게 할 수 있다.

자기장을 걸어준 상태로 1X D-PBS(Welgene, Cat.No. LB001-02)로 1회 세척하였고, 37% 포름알데히드(Sigma에서 구입)를 1X D-PBS로 10배 희석하여 3.7% 포름알데히드 용액을 만들었다. 상기 포름알데히드 용액으로 5분 동안 세포에 처리하여 세포를 고정하였다. 상기 세포 고정 후 세포를 1X D-PBS로 3회 세척한 후, 현미경 관찰을 수행하였다.

본 실시예에서는 대물렌즈 Uplan Apo 40X/0.85가 장착된 올림푸스사의 형광현미경 FV1000을 이용하여 세포의 투과광 이미지를 얻어 그 결과를 도5에 예시하였다. 자기장을 걸어주지 않은 세포에서는 세포의 핵 주변에서 자성입자는 확인되지만, 자력선 방향으로의 패턴은 관찰되지 않는 것으로 확인되었다(도5의 (A)). 한편, 자기장을 세포에 대하여 수직방향으로 걸어준 세포에서도 세포의 핵 주변에서 자성입자는 확인되었으나, 자력선 방향으로의 패턴은 관찰되지 않는 것으로 확인되 었다(도5의 (B)). 반면에, 자기장을 세포에 대하여 수평방향으로 걸어준 세포에서는 자력선 방향으로 자성입자가 패턴을 형성하는 것을 뚜렷이 관찰할 수 있었다(도5의 (C)). 이와 같은 결과는 세포내에서 유도 자화(induced magnetization)에 의하여 자성물질이 자력선 방향으로 패턴을 형성함을 의미한다.

세포 내의 소기관 중 구체모양을 띄는 엔도좀, 라이소좀 등의 소포체는 광학현미경상에서 세포 내에 산발적으로 흩어진 흑점의 형태로 보일 수 있다. 따라서, 자성물질이 자력선 방향으로 패턴을 형성하는 것을 확인하기 위해서는 복수의 자성물질들이 한 개의 세포에 효율적으로 전달되어야 하며, 집속된 자기장의 자력선 다발(bundle)이 세포에 대해 일정 방향으로 통과할 수 있어야 한다. 본 발명의 실시예에서는 흑점이 자력선 방향으로 배열되어 패턴을 형성하는 것을 확인할 수 있어 구체모양의 세포 내 소기관과 확연히 구별할 수 있었다.

실시예 3

프러시안 블루 염색을 이용한 세포 내에 도입된 자성물질의 자력선 방향 패턴 확인

도5에 도시된 바와 같이 투과광 현미경으로 관찰되는 검은색 점들이 자성물질임을 확인하기 위하여 프러시안 블루 염색 (Prussian Blue Staining)을 시행하였다. 프러시안 블루 염색은 세포 내에 전달된 산화철 성분의 자성입자(iron oxide magnetic nanoparticle)를 특이적으로 염색하여 관찰하는데 사용된다(Frank, J. A., Miller, B. R., Arbab, A. S., Zywicke, H. A., Jordan, E. K., Lewis, B. K., Bryant, L. H., & Bulte, J. W. M. (2003) Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents. Radiology 228: 480-487). 자성물질이 전달된 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 자기장을 걸어주고 3시간 후, 세포를 포름알데히드로 고정하였다. 그리고, 프러시안 블루 염색 전에 세포를 광학현미경으로 관찰하였고, 프러시안 블루 염색 후 동일한 시야(field)에서 세포를 광학현미경으로 관찰하였다. 프러시안 블루 염색은 프러시안 블루 아이언 스테인 키트[Prussian Blue Iron Stain Kit (Polysciences에서 구입, Cat. No. 24199)]를 이용하여 수행하였다.

본 실시예에서는 대물렌즈 LUCPlan F1 60X가 장착된 올림푸스사의 IX51 도립현미경(Olympus IX51 inverted system microscope equipped with DP70 CCD camera, Japan)을 이용하여 세포의 투과광 이미지를 얻었다. 도6에서 확인되는 바와 같이, 자기장을 걸어준 세포에서는 자성물질의 패턴이 자화 방향(화살표 방향)으로 형성되어 광학현미경으로 관찰되었으며, 이와 같은 패턴은 프러시안 블루 염색에 의해서 특이적으로 염색되는 것으로 확인되었다. 따라서, 자기장을 걸어줌에 의해 형성되는 패턴은 세포 내로 전달된 자성물질에 의한 것임을 확인하였다. 자기장을 걸어주지 않은 세포에서는 세포 내로 전달된 자성물질이 프러시안 블루 염색에 의하여 염색되는 것이 관찰되었으나, 자력선 방향으로 형성된 패턴은 보이지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 4

세포 내에 도입된 자성물질의 자력선 방향 변화에 따른 패턴 변화 관찰

자력선 방향의 변화에 따른 자성물질의 패턴 변화를 다음과 같이 확인하였다. 자성물질이 전달된 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 실시예 2에서와 같이 세포가 살아 있는 상태에서 자기장을 인가한 후, 세포를 고정하였다.

본 실시예에서는 대물렌즈 Plan-Neofluar 20X가 장착된 Zeiss사의 LSM510 META NLO 현미경을 이용하여 세포의 형광 및 투과광 이미지를 얻었다. 도7에서 확인되는 바와 같이, 자기장을 걸어주면 세포내에서 자성입자의 패턴이 자력선 방향(화살표 방향)으로 형성되는 것이 관찰되었으며, 이와 같은 패턴은 자기장의 방향에 따라 재형성되는 것을 확인하였다.

실시예 5

형광표지된 자성물질의 자력선 방향으로의 형광 패턴 관찰

형광 표지된 자성물질의 자화방향 패턴이 형광물질에 의해 이미지화되는 것을 관찰하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 96-웰 플레이트(Greiner에서 구입, Cat. No. 655090)에 HeLa 세포(ATCC에서 구입, Cat. No. CCL-2)를 4,000개 세포/웰(cells/well) 단위로 계대배양(subculture)하였다. 다음날, 배양된 HeLa 세포에 자성물질을 다음과 같은 과정에 따라 처리하였다:

1) 스트렙타비딘-자성입자를 비오틴-SS-FITC(biotin-SS-FITC)와 혼합하여 반응시켜, 자성입자를 형광표지시켰다;

2) 상기 반응 30분 경과 후, 혼합액을 당업계에서 알려진 자성물질 분리방 법, 예를 들어 HGMS 기술(High gradient magnetic separation)을 이용하여 정제하였다;

3) 정제된 형광표지된 자성입자를 실시예 2에서와 같이 세포에 처리하고, 자기장을 걸어준 후, 포름알데히드 용액으로 세포를 고정하였다.

본 실시예에서는 대물렌즈 Uplan Apo 40X/0.85가 장착된 올림푸스사의 형광현미경 FV1000을 이용하여 세포의 형광 이미지와 투과광 이미지를 얻었다. 도8에 도시된 바와 같이, FITC로 형광 표지된 자성입자는 자기장을 걸어줌에 의해 형광 패턴이 자력선 방향(화살표 방향)으로 형성되는 것이 확인되었다. 그러나, 자기장을 걸어주지 않은 세포에서는 FITC 형광은 관찰되었으나, 특이적인 형광 패턴은 관찰되지 않았다. 따라서, 본 실시예에서는 세포 내에서 집속된 자기장 인가에 의해 형성된 복수의 자성입자들의 자화패턴이 표지물질인 형광물질에 의해 이미지화되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6

매개자를 이용하여 형광표지된 자성물질의 자력선 방향으로의 형광패턴 관찰

본 실시예에서는 표면이 개질된 자성물질에 형광물질이 직접 표지된 경우 뿐만아니라 표면이 개질된 자성물질에 매개자(mediator)를 이용하여 형광물질을 표지한 경우에도 자기장 인가에 의해 형성된 복수의 자성입자들의 자화패턴이 표지물질인 형광물질에 의해 이미지화되는지 여부를 관찰하였다. 그리고, 자성물질들이 형성하는 자력선 방향의 패턴과 중첩되는 형광 패턴이 형성되는지 여부도 확인하였 다.

매개자는 본 발명이 속하는 기술분야에서 사용가능한 것으로 인식되는 링커물질을 하나 또는 복수개 사용하여 구성할 수 있다. 이하에서는 일례로서 매개자를 2개의 링커물질로 구성한 것을 사용하여 실험을 수행하였다. 매개자를 이용하여 형광물질을 표면이 개질된 자성입자에 표지하는 것은 자성입자와 형광물질을 세포 내에 제공하기 전에 수행될 수도 있고, 자성입자와 형광물질을 각각 세포 내에 제공한 후 매개자에 의해 세포 내에서 표면이 개질된 자성입자에 형광물질이 표지되어 수행될 수도 있다.

매개자를 구성하는 링커물질의 하나로는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)의 치료제로 사용되고 있는 다사티닙(dasatinib) [Lombardo, L. J., Lee, F. Y., Chen, P., et al. Discovery of N-(2-chloro-6-methyl-phenyl)-2-(4-(4-(2-hydroxy-ethyl)-piperazin-1-yl)-2-methylpyrimidin-4-4ylamino)thiazole-5-carboxamide (BMS-354825), a dual Src/Abl kinase inhibitor with potent antitumor activity in preclinical assays. J. Med. Chem. 47, 6658-6661 (2004); Shah, N. P., Tran, C., Lee, F. Y. Chen, P., Norris, D., Sawyers, C. L. Oerriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor. Science 305, 399-401 (2004)]을 선택하였다. 또한, 매개자를 구성하는 또 다른 링커물질로는 전술한 링커물질인 다사티닙과 결합하는 SRC(GenBank Acc. No. NM_198291), 또는 SNF1LK(GenBank Acc. No. BC038504)을 사용하였다. 그리고 자성입자의 표면을 타사티닙으로 개질하기 위해 다사티닙-비오틴을 합성하였다.

다사티닙-비오틴(Dasatinib-biotin)은 도9의 개략도와 같이 합성하였다.

도9에 도시된 다사티닙-비오틴 합성과정을 설명하면 다음과 같다.

우선, 다사티닙-비오틴을 합성하기 위하여 우선, 2,3,5,6-테트라플루오로페닐 트리플루오로아세테이트(2,3,5,6-tetrafluorophenyl trifluoroacetate) 형태의 비오틴 링커를 합성하였다:

(1) 질소 대기상태에서 트리플루오로아세틱 앤하이드라이드(trifluoroacetic anhydride)에 녹여진 2,3,5,6-테트라플루오로페놀(2,3,5,6-tetrafluorophenol)에 BF₃ 에틸에테르(BF₃ ethylether)를 첨가하였다;

(2) 용매를 제거한 후 비오틴 링커 화합물을 TEA/DMF 혼합액에 녹여진 화합물 1과 커플링하여 화합물 2를 생산하였다.

그리고 나서, 다사티닙-비오틴(dasatinib-biotin)은 다음과 같이 합성하였다:

(1) 다사티닙은 THF와 DMF 혼합액에 녹인 후 트리에틸아민을 첨가한 후 냉각시켰다;

(2) 다사티닙 용액에 메탄설포닐 클로라이드(methanesulfonyl chloride)를 천천히 적가한 후 상온에서 하룻밤 동안 교반하였다;

(3) 반응액에 NaN₃를 넣고 섭씨 50℃에서 하룻밤 동안 교반하였다;

(4) 반응액을 감압농축한 후, 잔사를 컬럼크로마토그래피에 의해 정제하였다;

(5) 정제된 산물을 THF에 용해하고 과량의 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)을 첨가하여 상온에서 5시간 동안 교반하였다;

(6) 반응액에 물을 첨가하고 섭씨 70℃에서 하룻밤 동안 교합한 후, 감압 농축하였다;

(7) 잔사를 질소 대기상태에서 DMF에 용해시킨 후, 트리에틸아민(triethylamine)을 참가하였다;

(8) 화합물 2를 DMF에 용해하여 첨가한 후 상온에서 3일 동안 교반하였다;

(9) 반응액을 감압 농축한 후, MeOH/MC 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.

그리고 나서, 합성된 화합물은 NMR 및 LC-MS를 이용하여 확인하였다.

CSK cDNA (GenBank Acc. No. NM_004383.1)는 Open Biosystems사에서 구입하였다. 정지 코돈이 제거된 CSK ORF 클론을 제작하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. CSK ORF 증폭에 필요한 프라이머는 다음과 같고 코스모진텍(주)에서 구입하여 사용하였다: CSK-F 프라이머, 5'-GCA GGC TCC ACC ATG TCA GCA ATA CAG GCC GCC T-3'; CSK-R 프라이머, 5'-CAA GAA AGC TGG GTG CAG GTG CAG CTC GTG GGT TTT G-3'. CSK cDNA를 주형으로 사용하고, 상기 프라이머를 이용하여 다음과 같이 PCR 증폭을 수행하였다: 95℃, 5분, 1 사이클; 95℃, 0.5분, 50℃, 0.5분, 72℃, 2분, 10~30 사이클; 72℃, 7분 1 사이클. PCR 증폭에 사용된 DNA 중합효소는 Stratagene, Enzynomics, Cosmo Genetech, ELPIS Biotech 등에서 구입하여 제조사의 용법에 따라 사용하였다.

상기와 같이 증폭된 CSK ORF를 다음과 같은 프라이머로 재증폭하였다: attB1-F2 프라이머, 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTC CACCATG-3'; attB2-R2 프라이머, 5'-GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTG-3'. 상기 증폭된 CSK ORF의 PCR 산물을 주형으로 하고, attB1-F2 및 attB2-R2 프라이머를 이용하여 다음과 같이 PCR 증폭을 수행하였다: 95℃, 2분, 1 사이클; 95℃, 0.5분, 45℃, 0.5분, 72℃, 2분, 5~10 사이클; 95℃, 0.5분, 50℃, 0.5분, 72℃, 2분, 5~10 사이클; 72℃, 7분, 1 사이클. 상기와 같이 증폭된 CSK ORF의 PCR 산물을 전기영동하여 분리한 후, pDONR201 혹은 pDONR221 벡터(Invitrogen에서 구입)에 공지의 방법(Hartley, et al. (2000) DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795)으로 클로닝하여 정지 코돈이 제거된 CSK ORF 클론을 제작하였다. 완성된 CSK ORF 클론은 염기서열 분석에 의해 확인하였다.

정지 코돈이 제거된 SNF1LK (GenBank Acc. No. BC038504) ORF(open reading frame) 클론은 Open Biosystems사에서 구입하였다.

SNF1LK ORF 클론과 CSK ORF 클론은 다시 공지의 방법(Hartley, et al. (2000) DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795)에 의해 pCMV-DEST-EGFP 벡터를 이용하여 CMV-SNF1LK-EGFP 및 CMV-CSK-EGFP 발현 벡터로 클로닝하였다. pCMV-DEST-EGFP 벡터는 pcDNA3.1/Zeo(+) 벡터 (Invitrogen에서 구입, Cat. No. V860-20)에 attR1-ccdB-attR2 서열을 삽입하고, attR2 서열 뒤에 EGFP 유전자를 삽입하여 제작하였다.

HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 5,000~10,000 세포/웰 농도로 계대배양한 후 상기 준비된 발현 벡터 DNA를 형질도입하였다. DNA 형질도입은 공지의 방법, 일례 로 리포펙타민(lipofectamine)(Invitrogen에서 구입) 혹은 휴젠 6(Fugene 6)(Roche에서 구입)을 이용하여 수행할 수 있다. DNA가 형질도입된 세포에 다사티닙-비오틴이 코팅된 자성물질을 실시예 2에 기술된 방법으로 전달하고, NDGA (Nordihydroguaiaretic acid, Sigma에서 구입)를 최종 25~50μM이 되도록 처리하였다. 그리고, 실시예 2에 기술된 방법과 같이 자기장을 인가한 후, 현미경 관찰을 수행하였다.

본 실시예에서는 대물렌즈 Uplan Apo 40X0.85가 장착된 올림푸스사의 형광현미경 FV1000을 이용하여 세포의 형광 이미지를 얻었다. 도10a에 도시된 바와 같이, 표면이 개질된 자성물질에 매개자(다사티닙-CSK)를 이용하여 형광물질인 EGFP 단백질을 표지한 경우 자화방향(자력선 방향)으로 EGFP의 형광 패턴이 형성되는 것을 확인하였다. 그러나, 매개자가 없는 음성대조구로서 비오틴-자성입자 복합체(bio-MNP)를 사용한 경우, 이와 같은 EGFP의 형광 패턴이 확인되지 않았다.

또한, 도10b에 도시된 바와 같이, 표면이 개질된 자성물질에 매개자(다사티닙-SNF1LK)를 이용하여 형광물질인 EGFP 단백질을 표지한 경우 자화방향(자력선 방향)으로 EGFP의 형광 패턴이 형성되는 것을 확인하였다. 그러나, 매개자가 없는 음성대조구로서 비오틴-자성입자 복합체(bio-MNP)를 사용한 경우, 이와 같은 EGFP의 형광 패턴이 확인되지 않았다.

한편, 이와 같은 형광 패턴은 투과광 이미지에서 관찰되는 자성물질의 패턴과 중첩하여 나타났으며, 이는 표면이 개질된 자성물질에 형광물질이 매개자인 다사티닙-CSK 또는 다사티닙-SNF1LK에 의해 정확하게 표지되어 자화패턴을 이미지화 한 결과임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 살아 있는 세포내에 도입된 자성물질의 자력선 방향으로의 패턴을 표지물질로서 이미지화하는 방법을 제공함으로써 살아 있는 세포 내 구조 및 물질의 대사과정을 모니터하는데 응용할 수 있다. 예를 들어, 본 실시예에서는 링커물질인 다사티닙과 CSK 또는 다사티닙과 SNF1LK이 결합하여 매개자를 구성하는 점을 이용하여 형광물질을 자성물질에 표지하고 형광패턴을 관찰하였으나, 결합여부가 불분명한 링커물질들을 매개자로 구성할 경우 형광물질이 자성물질에 표지되는지 여부를 형광패턴의 형성여부와 자성물질의 자화패턴 및 형광 패턴의 중첩여부로 확인할 수 있고, 나아가서는 이를 이용하여 링커물질들의 세포내 대사에서의 반응 및 역할과 신호전달 과정 등을 모니터할 수 있는 것이다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

도1은 본 발명의 일실시예의 방법에 의해 합성된 자성입자의 주사전자현미경 사진이다.

도2는 본 발명의 일실시예의 방법에 의해 합성된 자성입자의 투과전자현미경사진이다.

도3은 본 발명의 일실시예의 방법 및 장치에 사용되는 자기장 인가장치의 대략적인 사시도이다.

도4는 본 발명의 일실시예의 방법 및 장치에 사용되는 또 다른 자기장 인가장치(자기장 구배 증대수단을 구비하는 것)의 대략적인 사시도이다.

도5는 자성물질이 도입된 HeLa 세포에 자기장을 걸어주지 않고 세포를 고정한 후 촬영한 투과광 현미경 사진(A)과, 자기장을 수직방향으로 걸어주고 세포를 고정한 후 촬영한 투과광 현미경 사진(B)과, 자기장을 수평방향으로 걸어주고 세포를 고정한 후 촬영한 투과광 현미경 사진(C)을 비교하여 도시하고 있다.

도6은 자성물질이 도입된 HeLa 세포에 자기장을 걸어주고 세포를 고정한 후 촬영한 광학 현미경 사진(자기장+)과, 자기장을 걸어주지 않고 세포를 고정한 후 촬영한 광학 현미경 사진(자기장-)을 비교하여 도시하고 있다. 왼쪽 이미지는 프러시안 블루 염색을 시행하기 전 세포의 투과광 이미지의 원색 사진이고, 오른쪽 이미지는 세포고정 후 프러시안 블루 염색을 시행하고 나서 촬영한 세포의 투과광 이미지의 원색 사진이다. 화살표는 수평방향의 자력선 방향을 가리킨다.

도7은 자기장의 방향에 따라 세포내에 도입된 자성물질이 패턴을 형성하는 것을 보여주는 형광/투과광 현미경 사진이다. 화살표는 자력선 방향을 가리킨다.

도8은 형광이 표지된 자성입자 복합체가 도입된 HeLa 세포에 자기장을 걸어주고 세포를 고정한 후 촬영한 형광 및 투과광 현미경 사진(자기장+)과, 자기장을 걸어주지 않고 세포를 고정한 후 촬영한 형광 및 투과광 현미경 사진(자기장-)을 비교하여 도시하고 있다.

도9는 다사티닙-비오틴 합성의 개략도이다.

도10a는 다사티닙-자성입자(Das-MNP) 복합체 또는 비오틴-자성입자(Bio-MNP) 복합체와 CSK-EGFP 발현벡터가 도입된 HeLa 세포에 자기장을 걸어준 경우의 형광 및 투과광 현미경 사진을 비교하여 도시하고 있다.

도10b는 다사티닙-자성입자(Das-MNP) 복합체 또는 비오틴-자성입자(Bio-MNP) 복합체와 SNF1LK-EGFP 발현벡터가 도입된 HeLa 세포에 자기장을 걸어준 경우의 형광 및 투과광 현미경 사진을 비교하여 도시하고 있다.

〈도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉

100: 통체 102: 중심공

140: 코어 142: 삽입홀

144: 자기장 구배 증대수단

150: 웰플레이트 152: 웰

190: 이동수단

192: 승강 축 194: 승강 안내부

1000a: 자기장 인가 장치

Claims

자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서, 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 자성물질을 복수개 준비하는 단계와,

상기 자성물질을 살아 있는 세포 내에 제공하되, 한 개의 살아 있는 세포를 기준으로 상기 자성물질을 복수개 제공하는 단계와,

상기 살아있는 세포에 집속된 자기장을 인가하여 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 단계와,

상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 복수개의 자성물질들이 배열되도록 하는 단계와,

상기 자성물질들이 배열된 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 자성물질은 철, 망간, 크롬, 니켈, 코발트 및 아연의 1주기 전이금속, 이들 전이금속의 산화물, 황화물, 인화물 및 이들 전이금속들의 합금, 그리고 이들 전이금속들의 합금의 산화물, 황화물 및 인화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전이금속 화합물이거나 이들을 포함하는 조성물인 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제2항에 있어서,

상기 자성물질은 마그네타이트(Fe₃O₄), 마그헤마이트(gamma-Fe₃O₄), 코발트 페라이트(CoFe₂O₄), 망간 옥사이드(MnO), 망간 페라이트(MnFe₂O₄), 아이언-플래티늄합금(Fe-Pt alloy), 코발트-플래티늄 합금(Co-Pt alloy) 및 코발트(Co)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 또는 적어도 2개의 혼합물을 포함하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 자성물질은 1 내지 1,500nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제4항에 있어서,

상기 자성물질은 20 내지 350nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 자성물질은 40 emu(electromagnetic unit)/g 이상의 포화자기화를 갖는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 살아 있는 세포 내에 제공된 상기 자성물질은 흑점 형태로 관찰되는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 흑점은 300 내지 1,500 nm 이상의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 흑점은 단일한 자성물질로 구성되거나 다수의 자성물질들이 위치적으로 서로 인접한 형태로 구성되는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제9항에 있어서,

상기 흑점은 상기 살아 있는 세포 내에 복수개로 존재하는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 살아있는 세포에 집속된 자기장을 인가할 때 자기장의 인가방향은 상기 살아 있는 세포가 놓여 있는 바닥면에 대해 수평방향으로 인가되는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하는 것은 자기장 인가 장치에 의해 수행되며, 상기 자기장 인가 장치는 살아 있는 세포가 수용된 용기를 고정하며 자기장의 세기를 강화하기 위한 비자화성 자성체로 이루어진 원통형 코어, 또는 상기 용기를 지지하는 복수 개의 연장부가 설치된 자기장 구배 증대수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 살아 있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 형성하는 방법.
자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서, 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 자성물질을 복수개 준비하는 단계와,

상기 자성물질을 살아 있는 세포 내에 제공하되, 한 개의 살아 있는 세포를 기준으로 상기 자성물질을 복수개 제공하는 단계와,

상기 자성물질과 결합하여 상기 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 이미지화할 수 있는 표지물질을 살아 있는 세포 내에 제공하는 단계와,

상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하여 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 단계와,

상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 복수개의 자성물질들이 배열되도록 하는 단계와,

상기 자성물질들이 배열된 패턴을 이미지화할 수 있는 상기 표지물질의 이미 지화된 패턴을 확인하는 단계를 포함하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴을 확인하고, 상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴이 중첩(co-localization)되는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항에 있어서,

상기 자성물질은 철, 망간, 크롬, 니켈, 코발트 및 아연의 1주기 전이금속, 이들 전이금속의 산화물, 황화물, 인화물 및 이들 전이금속들의 합금, 그리고 이들 전이금속들의 합금의 산화물, 황화물 및 인화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전이금속 화합물이거나 이들을 포함하는 조성물인 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 자성물질은 마그네타이트(Fe₃O₄), 마그헤마이트(gamma-Fe₃O₄), 코발트 페라이트(CoFe₂O₄), 망간 옥사이드(MnO), 망간 페라이트(MnFe₂O₄), 아이언-플래티늄 합금(Fe-Pt alloy), 코발트-플래티늄 합금(Co-Pt alloy) 및 코발트(Co)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 또는 적어도 2개의 혼합물을 포함하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 자성물질은 1 내지 1,500nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제17항에 있어서,

상기 자성물질은 20 내지 350nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 자성물질은 40 emu(electromagnetic unit)/g 이상의 포화자기화를 갖는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 살아 있는 세포 내에 제공된 상기 자성물질은 흑점 형태로 관찰되는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제20항에 있어서,

상기 흑점은 300 내지 1,500 nm 이상의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제20항에 있어서,

상기 흑점은 단일한 자성물질로 구성되거나 다수의 자성물질들이 위치적으로 서로 인접한 형태로 구성되는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제22항에 있어서,

상기 흑점은 상기 살아 있는 세포 내에 복수개로 존재하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 살아있는 세포에 집속된 자기장을 인가할 때 자기장의 인가방향은 상기 살아 있는 세포가 놓여 있는 바닥면에 대해 수평방향으로 인가되는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하는 것은 자기장 인가 장치에 의해 수행되며, 상기 자기장 인가 장치는 살아 있는 세포가 수용된 용기를 고정하며 자기장의 세기를 강화하기 위한 비자화성 자성체로 이루어진 원통형 코어, 또는 상기 용기를 지지하는 복수 개의 연장부가 설치된 자기장 구배 증대수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 표지물질은 매개자를 이용하여 상기 자성물질에 표지되는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제26항에 있어서,

상기 매개자는 하나 또는 복수개의 링커물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제27항에 있어서,

상기 매개자는 2개의 링커물질로 구성한 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제26항에 있어서,

상기 매개자를 이용하여 상기 표지물질을 상기 자성물질에 표지하는 것은 상 기 자성물질과 상기 표지물질을 살아 있는 세포 내에 제공하기 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
제27항에 있어서,

상기 매개자를 이용하여 상기 표지물질을 상기 자성물질에 표지하는 것은, 상기 자성물질과 상기 표지물질을 각각 살아 있는 세포 내에 제공한 후 상기 매개자에 의해 살아 있는 세포 내에서 상기 자성물질에 상기 표지물질이 표지되어 수행되는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법.
살아 있는 세포들을 배양하는 용기로서, 자기장에 의해 자력선 방향으로 자화되는 자성물질로서 나노단위로 입자화되고 표면이 개질된 복수개의 자성물질과, 상기 자성물질과 결합하여 상기 자력선 방향으로의 자성물질의 패턴을 이미지화할 수 있는 표지물질이 제공되는 살아 있는 세포들을 배양하는 용기와,

상기 살아 있는 세포에 집속된 자기장을 인가하는 자기장 인가 장치로서, 자력선 다발(bundle)이 상기 살아 있는 세포에 대해 일정 방향으로 통과하도록 하는 자기장 인가 장치와,

상기 살아 있는 세포 내에서 상기 자기장의 자력선 방향으로 배열된 복수개의 자성물질들의 패턴 및/또는 상기 자성물질들의 배열된 패턴을 이미지화할 수 있는 상기 표지물질의 이미지화된 패턴을 모니터하는 장치를 포함하는 살아있는 세포 내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법에 사용되는 장치.
제31항에 있어서,

상기 모니터 장치는 상기 자성물질의 패턴과 상기 표지물질의 이미지화된 패턴이 중첩되는지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법에 사용되는 장치.
제31항 또는 제32항에 있어서,

상기 자기장 인가 장치는 살아 있는 세포가 수용된 용기를 고정하며 자기장의 세기를 강화하기 위한 비자화성 자성체로 이루어진 원통형 코어, 또는 상기 용기를 지지하는 복수 개의 연장부가 설치된 자기장 구배 증대수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포내에서 자성물질의 패턴을 이미지화하는 방법에 사용되는 장치.