KR20100050580A - 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성을 갖는 환자에 있어서 종양세포 성장을 억제, 예방, 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성을 갖는 환자에 있어서 종양세포 성장을 억제, 예방, 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 내성을 나타내는 환자에 있어서 종양 세포 성장을 억제, 예방 또는 감소시키기 위한 방법과 조성물이 제공된다. GP88/PCDGF 성장 인자 수준이 증가한다는 것은 종양형성성과 항에스트로겐 요법의 약리적 효과에 대해 내성이라는 표시이다. 본 발명의 방법과 조성물은 항에스트로겐 요법에 내성을 나타내는 환자에 있어서 암의 재발을 치료 또는 방지하는데 유용하다.

Description

항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성을 갖는 환자에 있어서 종양세포 성장을 억제, 예방, 또는 감소시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING, PREVENTING, OR REDUCING TUMOR CELL GROWTH IN PATIENTS RESISTANT TO THE ANTINEOPLASTIC EFFECTS OF ANTIESTROGEN THERAPY}
본 출원은 포기된 1997년 5월 23일자 미국특허출원 제 08/863,079호의 일부 계속출원인 1997년 12월 16일자 미국특허출원 제 08/991,862호의 분할출원인 1999년 12월 8일자 미국특허출원 제 09/456,886호의 일부계속출원인 2001년 6월 15일자 미국특허출원 제 09/880,842호의 일부계속출원이다.
다세포 생명체에 있어서 세포의 증식과 분화는 고도로 조절된 프로세스이다. 암세포의 현저한 특징은 이 프로세스에 대한 제어가 이루어지지 않아서; 증식과 분화가 조절되지 않아 무절제한 성장이 초래된다는 것이다. 정상 세포와 종양 세포간의 이러한 차이점을 보다 잘 이해하기 위해 많은 연구 노력이 행해져왔다. 이러한 연구 분야중 한가지는 성장 인자, 보다 구체적으로는 자분비성 (autocrine)성장 촉진에 대한 것이다.
성장 인자는 성장, 분화, 이동 및 유전자 발현과 관련한 메세지들을 세포에 전달하는 폴리펩타이드이다. 일반적으로, 성장 인자는 한 세포에서 생산되어 다른 세포에 작용함으로써 증식을 촉진시킨다. 그러나, 어떠한 악성 세포들은 배양중에 자분비성 성장 메카니즘에 보다 많이 또는 절대적으로 의존하는 것으로 입증되었다. 이와 같은 자분비성 거동을 나타내는 악성 세포들은 다른 세포들에 의한 성장 인자 생산 조절을 회피하므로 그의 성장이 조절되지 않게된다.
자분비성 성장 조절에 대한 연구는 세포성장 메카니즘에 대한 이해를 촉진시켜 암의 진단과 치료에 중대한 진전을 가능케해준다. 이러한 목적을 위해, 인슐린-유사 성장 인자 ("IGF1" 및 "IGF2"), 가스트린-방출 펩타이드 ("GRP"), 형질전환 성장 인자 알파 및 베타 ("TGF-a" 및 "TGF-b") 및 상피세포 성장 인자 ("EGF")를 비롯한 몇가지 성장 인자들이 연구되어 왔다.
본 발명은 최근 발견된 성장 인자에 대한 것이다. 이 성장 인자는 고도로 종양형성성인 (tumorigenic) "PC 세포", 즉 기형종 (teratoma) 유래의 지방생성 세포주 1246으로부터 분리된 인슐린-비의존성 변이체의 배양배지에서 최초로 발견되었다. 이하에서는 이 성장 인자를 "GP88/PCDGF"이라 칭한다. GP88/PCDGF이 정제 및 구조적으로 특징화되었다. GP88/PCDGF의 아미노산 서열 분석 결과 GP88/PCDGF은 마우스 그래뉼린/에피쎌린 전구체와 유사한 아미노산 서열을 갖는 것으로 나타났다.
그래뉼린/에피쎌린 ("grn/epi")은 6kDa의 폴리펩타이드로서 이중 시스테인이 풍부한 폴리펩타이드의 신규한 패밀리에 속한다. 미국특허 제 5,416,192호 (Shoyab 등)는 6kDa 에피쎌린, 특히 에피쎌린 1과 에피쎌린 2에 관한 것이다. Shoyab에 따르면, 두가지 에피쎌린 모두 공통적인 63.5 kDa의 전구체에 의해 코딩되는데, 이 전구체는 합성되자마자 더 작은 형태로 프로세싱됨으로 해서, 생물학적 시료중에서 발견되는 자연적인 산물은 오직 6 kDa 형태라는 것이다. Shoyab 등은 에피쎌린 전구체가 생물학적을 불활성이라고 개시하고 있다.
Shoyab 등의 설명과 반대로, 본 발명자는 이 전구체가 합성되자마자 늘 프로세싱되는 것은 아니라는 것을 입증하였다. 본 발명자에 의해 부분적으로 수행된 연구에 따르면 이 전구체 (즉, GP88/PCDGF)는 실제로 N-링크된 탄수화물 부분이 20 kDa인 88 kDa 당단백질로서 분비되는 것으로 입증되었다. GP88/PCDGF의 N-말단 서열 분석 결과 GP88/PCDGF은 grn/epi 전구체의 아미노산 17에서 시작하는 것으로 나타났는데, 이는, 이 전구체 cDNA로부터 연역된 단백질 서열로부터의 최초의 17 아미노산이 막 국소화 또는 분비를 표적화하는데 적합한 시그널 펩타이드에 대응함을 입증하는 것이다. Shoyab 등의 교시와는 달리, GP88/PCDGF은 생물학적으로 활성적이며 성장 촉진 활성, 특히, 프로듀서 세포의 자분비성 성장 인자로서 활성을 갖는다.
유방암은 전세계적으로 여성의 질병과 사망의 중요한 원인이다. 에스트로겐은 생체내( in vivo ) 및 시험관내(in vitro)에서 에스트로겐 수용체 양성 (ER+) 인간 유방암 세포 성장의 주요한 자극제인 것으로 알려져 있다. 비록 초기에 에스트로겐이 유방 종양의 확립과 증식에 필요하기는 하지만, 유방암 경과 중, 에스트로겐-비의존성 종양의 발달은 낮은 예후를 가리키는 것이다. 유방암 세포에 있어서 에스트로겐의 유사분열촉진 (mitogenic) 효과가, 에스트로겐에 의해 조절되는 성장 인자를 비롯한 자분비성 성장 인자에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 추정되어왔다. 따라서, 에스트로겐-응답성 유전자, 특히, 성장 인자를 코딩하는 유전자를 동정 및 특징화하는 것은 유방암 세포에 있어서 에스트로겐의 효과를 이해하는데 크게 기여할 것이다.
타목시펜 시트레이트 ("타목시펜")은 유방암으로 고통받는 환자들에게 흔히 처방되는 비스테로이드성 항에스트로겐으로서 그 강력한 항에스트로겐 및 항신생조직 특성이 입증된 바 있다. 미국특허 제 4,536,516호 참조. 타목시펜은 에스트로겐 수용체에 대한 결합을 두고 에스트로겐과 경쟁하는 에스트로겐 수용체 안타고니스트이다. 다른 항에스트로겐으로는 랄록시펜, 아로마타제 저해제 (예컨대, Arimidex
Figure pat00001
(아나스트로졸), Femera
Figure pat00002
) 및 에스트로겐 수용체 다운-레귤레이터 (예컨대 Falsodex
Figure pat00003
)을 들 수 있다. 타목시펜의 항에스트로겐 효과는 표적 조직의 결합 부위를 두고 에스트로겐과 경쟁하는 그의 능력에 관계된 것일 수 있다. 아로마타제 저해제와 같은 다른 항에스트로겐들은 이용가능한 에스트로겐의 양을 억제하거나 감소시킨다. 예컨대, 아로마타제 저해제는 안드로겐이 에스트로겐으로 전환되는 것을 방지함으로써, 이용가능한 에스트로겐의 양을 감소시킨다. 에스트로겐 수용체 다운 레귤레이터는 세포상의 에스트로겐 수용체의 수를 감소시키거나 억제한다.
타목시펜은 현재 AstraZeneca사와 Barr Laboratories사가 Nolvadex
Figure pat00004
이라는 상표명으로 10 mg 짜리와 20 mg 짜리 타블렛으로 판매하고 있으며, 전이성 유방암, 유방암의 보조 치료제, 인 시투 (in situ) 도관성 암종 및 유방암 위험이 높은 여성에 있어서 유방암 발병을 감소시키는 용도로 사용되고 있다. 따라서, 타목시펜은 여러가지 암 및 특히 유방암을 치료하는데 사용될 수 있다.
그러나 타목시펜 투여는 환자에게 잠재적으로 심각한 위험을 수반한다. 예컨대, 타목시펜 투여는 난소암 위험의 증가와 연관이 있다. 뿐만 아니라, 어떤 환자들은 타목시펜이 의도하는 유리한 효과에 내성을 나타낸다. 따라서, 타목시펜의 잇점에 대해 내성을 나타내는 환자들에게 타목시펜을 투여하는 것은, 난소암의 위험성을 증가시킬 뿐만 아니라, 환자가 보다 효과적인 치료를 받는 기회를 지연시키거나 박탈함으로써, 환자에게 불필요한 위해를 가하는 것이다.
따라서, 타목시펜 투여는 타목시펜 치료로 효험을 보는 환자들에게로 제한되어야 한다. 따라서, 이러한 치료 코스를 실시하기에 앞서서 어떤 환자가 타목시펜 투여의 항신생조직 효과에 대해 민감할지 또는 저항적일지를 정확히 판단하는 것은 가치있는 진단 도구가 될 것이다.
이 기술분야는 현재 환자에 있어서의 에스트로겐 수용체의 부재가 타목시펜 내성에 대응한다고 가르치고 있다. 타목시펜 요법에 대해 환자가 내성적일지 또는 응답적일지를 예측하려는 시도에서 암 환자들에 대해 일상적으로 에스트로겐 수용체의 존재 여부가 테스트된다. 현행 테스트에 기초해서, 에스트로겐 수용체의 존재에 대해 양성으로 테스트된 암 환자들 ("ER+" 또는 "에스트로겐 수용체 양성 환자")에 대해서는 대체로 타목시펜이 처방된다.
그러나, ER+ 환자들중 상당수가 실제로는 타목시펜에 대해 내성적이다. 따라서, ER+ 환자들에 대해 일상적으로 처방되는 타목시펜이 실제로는 해로울 수 있고, 환자에 있어서 난소암이나 기타 다른 형태의 암에 대한 위험성을 증가시킬 수 있다.
본 발명자는 정상 세포에서는 정밀하게 조절되는 형식으로 발현되는 어떤 당단백질 GP88/PCDGF이, 정상 세포로부터 유래된 고도의 종양형성 세포에서는 과발현되어 조절되지 못한다는 것과, GP88/PCDGF이 종양형성 세포에 꼭 필요한 성장 자극제로서 작용한다는 것, 그리고 종양형성 세포에서의 GP88/PCDGF의 발현 또는 작용의 억제가 과형성 세포의 종양형성 특성의 억제로 이어진다는 것을 예기치 못하게 발견하였다. 뿐만 아니라, 어떤 세포 중의 GP88/PCDGF의 수준이 그 세포의 종양형성성 (tumorigenicity)과 직접적으로 상관이 있음도 발견하였다.
본 발명자는 또한 예기치 못하게도, GP88/PCDGF 발현 수준이 환자가 타목시펜과 같은 항에스트로겐 화합물의 약물학적 효과에 내성적일지 아닐지를 나타낼 수 있다는 것도 발견하였다. 유방암 환자에 있어서 종양 세포들의 에스트로겐 수용체 상태는, 그 유방암 환자에 있어서 타목시펜이 적합하거나 바람직한 치료 코스인지를 판단하는데 있어서 충분한 정보를 제공해주지 못한다. 본 발명은 환자가 타목시펜 내성일지를 판단하기 위한 보다 정확한 도구를 제공해 주며 따라서, 이는 암 치료에 중대한 진전을 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예들은, 환자의 세포를 함유하는 생물학적 시료를 수득하고, 샘플 세포 중에 GP88/PCDGF를 검출하여, 시료 중 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포의 수를 측정한 다음, 상기 생물학적 시료 중 총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포의 비율을 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는, 종양형성성의 진단 방법을 제공한다. 상기 비율은 종양형성성의 지표가 된다.
본 발명은 또한 어떤 환자가 항에스트로겐의 항신생조직 효과에 내성적인지 여부를 측정하는 방법도 제공한다. 특히 바람직한 구체예에서는, GP88/PCDGF을 환자의 세포를 함유하는 생물학적 시료에서 검출하여, 시료 중의 GP88/PCDGF의 양을 측정한다. 생물학적 시료 중의 GP88/PCDGF의 양은 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대한 내성의 지표이다. 또 다른 바람직한 구체예에서는, 생물학적 시료 중의 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포의 수를 측정해서 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포의 수 대 생물학적 시료 중의 총 세포수의 비율을 산출한다. 이 비율은 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대한 내성의 지표가 된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 또한 종양형성성을 진단하여 항에스트로겐의 항신생조직 효과에 대해 환자가 내성인지를 판단하기 위한 키트도 제공한다. 이러한 키트는 용기와 GP88/PCDGF를 검출하기 위한 화합물 또는 화합물들 (예컨대, 항GP88/PCDGF 항체 및 항GP88/PCDGF 뉴클레오타이드 프로브)을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 한가지 바람직한 구체예에 따라, 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF의 양을 측정하여 시료 중의 GP88/PCDGF의 양이 약 5% 미만인 경우에는 그 환자에게 항에스트로겐 치료제를 투여한다. 또는, 생물학적 시료 중의 GP88/PCDGF의 양이 약 10% 미만인 경우에는 에스트로겐 수용체 양성 환자에게 항에스트로겐 치료제를 투여한다. 또 다른 바람직한 구체예에서는, 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF 양성 세포의 백분율을 측정해서, 생물학적 샘풀 중의 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포의 백분율이 약 5% 미만인 경우에는, 암을 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 항에스트로겐 치료제를 그 환자에게 투여한다. 또는, 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포의 백분율이 약 10% 미만인 경우에는, 에스트로겐 수용체 양성 환자에게 항에스트로겐 치료제를 투여한다.
본 발명은 세포들이 GP88/PCDGF의 변형된 발현이나, GP88/PCDGF에 대해 변형된 응답을 나타내는 암과 같은 질병을 진단 및 치료하기 위한 조성물을 제공하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 "변형된 발현 (altered expression)"이라는 용어가 사용되는 경우는 대응하는 정상세포나 주변의 말초 세포와 비교할 때 mRNA나 단백질의 수준에 기초해서, GP88/PCDGF이 적어도 두배, 때로는 10배 이상 증가발현 또는 과발현됨을 의미하는 것이다. "변형된 발현"이라는 용어는 또한 그 발현이 조절되지 않거나 계속됨을 의미하기도 하며 반드시 발현이 증가되는 경우로만 한정되는 것은 아니다. GP88/PCDGF에 대한 증가되거나 변형된 "응답 (response)"이라는 용어는 GP88/PCDGF로 인한 여하한 생물학적 기능 (예컨대, 성장, 분화, 바이러스 감염서)의 증가가 GP88/PCDGF의 변형된 발현과 동일하거나 동등한 조건을 야기시키는 조건인 경우에 사용된다.
"신생조직형성 (neoplasia)"이란 본래의 성장 자극 부재시에도 지속되는 비정상 세포 또는 종양 세포의 성장을 가리킨다. "항신생조직 효과 (anti-neoplastic effect)"라는 용어는 신생조직형성을 역전시키거나 또는 저해시키는 특성을 가리킨다. "암"이라는 용어는 비정상적인 세포성장에 의해 야기되는 여하한 질병을 지칭하는 것으로, 유방암, 남소암, 신장암, 골암, 췌장암, 고환암, 간암, 뇌암 및 피부암으로 한정되는 것은 아니다. "종양형성성 (tumorigenicity)"이라는 용어는 세포나 조직이 신생조직형성 특성을 나타내는 정도를 가리키는 용어이다.
본 명세서에서 "ER"은 달리 언급되지 않는 한, 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor)을 가리킨다. "PR"은 달리 언급되지 않는 한, 프로제스테론 수용체 (progesterone receptor)를 가리킨다.
"GP88/PCDGF 양성 세포" 또는 "GP88/PCDGF 염색된 세포"라 함은 GP88/PCDGF이 검출된 세포들을 가리킨다. 본 명세서에서, "GP88/PCDGF 음성 세포"란 GP88/PCDGF이 검출되지 않은 세포들을 가리킨다. 어떤 세포가 GP88/PCDGF 양성인지 음성인지는, 부분적으로는 검출방법 (즉, 면역염색, 인 시투 하이브리다이제이션, 영상법)의 감도에 의존할 수 있다. "총 세포수"라 함은 생물학적 시료 중에서 분석된 세포의 총수를 의미하며 생물학적 시료의 특정 부분에 존재하는 세포들 모두 또는 일부를 포함할 수 있다.
"생물학적 시료"이라는 용어는 척추동물의 몸으로부터 나온 물질을 가리키는 것으로 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 유두 흡입물, 뇌척수액, 간, 신장, 유방, 뼈, 골수, 고환 또는 난소 및 뇌, 결장 및 폐를 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서, 항에스트로겐 요법에 "내성을 갖는" 환자는 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 무응답이거나 또는 감소되거나 제한적인 응답을 하는 환자를 가리킨다.
"항에스트로겐 요법"이라는 용어는 에스트로겐 또는 에스트로겐 유사체의 기능의 생성을 방지하거나 기능을 간섭하는 화합물을 투여하는 것을 가리킨다. 본 명세서에서는 항에스트로겐 요법에 사용되는 화합물의 예를 "항에스트로겐(antiestrogens)"이라 칭하며, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해제 (예컨대, Arimidex
Figure pat00005
, Femera
Figure pat00006
) 및 에스트로겐 수용체 다운-레귤레이터 (예컨대, Faslodex
Figure pat00007
)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 "GP88/PCDGF"이라는 용어는 세포 추출물과 세포외액 중의 에피쎌린/그래뉼린 전구체를 의미하며, 마우스와 인간으로부터 유래된 도 8 또는 도 9에 포함된 아미노산 서열에 대응하는 GP88/PCDGF 뿐만 아니라, 다른 종의 GP88/PCDGF도 의미하는 것이다. 또한, 이 용어는 당단백질이나 기타 변형된 구조를 포함하는 탄수화물 부분과 같은 부가적인 성분들을 갖는 그의 기능성 유도체도 포함한다. "GP88"과 "PCDGF"라는 용어는 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용된다. 또한, GP88/PCDGF이라는 용어는 상기한 서열에 존재하는 아미노산을 적어도 10개 갖는 폴리펩타이드 단편을 가리키는 것이기도 하다. 이 길이의 서열들은 항원으로서도 유용하고, 전체 단백질의 다양한 에피토프에 특이적인 항체를 생산하기 위한 캐리어와의 면역원성 컨쥬게이트를 만드는데도 유용하다. 이러한 폴리펩타이드는 이러한 항체를 스크리닝하는데 유용하며 생물학적 체액 중의 GP88/PCDGF의 검출을 위한 방법에 사용되는데도 유용하다. 본 발명이 속한 기술분야에서는 이 펩타이드들이 보다 큰 단백질에 대한 항체들을 만드는데 유용하다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 12-19 아미노산 길이의 펩타이드들이 완전한 길이의 GP88/PCDGF을 인식하는 항체를 개발하는데 성공적으로 사용된 것으로 나타났다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된채 존재할 수 있다. 예컨대, 이것은 글루타치온 트랜스페라제, 폴리-히스티딘, 녹색 형광 단백질, myc tag, 또는 기타 태그 화합물 (예컨대, 바이오틴)과 같은 하나 이상의 펩타이드 결합을 통해 하나 이상의 다른 폴리펩타이드들과 융합될 수 있다.
이 폴리펩타이드는 GP88/PCDGF 또는 그의 기능적 유도체에 대한 항체를 재생 또는 테스트하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있는 항원학적으로 독특한 결정인자 또는 에피토프을 포함 할 만큼 충분히 크다.
그 한가지 구체예는 다른 포유류의 펩타이드를 실제로 함유하지 않는 폴리펩타이드를 들 수 있다. 본 발명의 GP88/PCDGF은 세포, 조직 또는 생물학적 체액으로부터 생화학적으로 또는 면역화학적으로 정제될 수 있다. 또한, 이 폴리펩타이드는 원핵생물이나 진핵생물의 발현계와 숙주세포에서 재조합 수단에 의해 만들어질 수도 있다.
GP88/PCDGF의 "단편"이라 함은 보다 이 분자의 서브세트로서 보다 짧은 펩타이드를 지칭하는 것이다. 이것은 예컨대 마우스 GP88/PCDGF의 경우 K19T와 S14R, 사람의 GP88/PCDGF의 경우 E19V와 A14R (각각 쥐의 K19T와 S14R에 해당)과 같은 대역에 대응하나 이에 한정되는 것은 아니다.
GP88/PCDGF의 "변이체 (variant)"라 함은 그의 전체 펩타이드나 또는 단편과 실질적으로 유사한 분자를 가리킨다. 변이 펩타이드는 이 기술분야의 공지방법을 이용하여 변이 펩타이드의 직접 화학합성법으로 만들 수 있다.
또는, 합성된 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 DNA를 변형시킴으로써 이 펩타이드의 아미노산 서열 변이체들을 만들수도 있다. 이러한 변이체로는 예컨대, GP88/PCDGF의 아미노산 서열 중에서 잔기를 결실, 삽입, 또는 치환하는 것을 포함한다. 최종 구조물이 소망하는 활성을 갖기만 한다면, 최종 구조물을 얻기 위해 결실, 삽입 및 치환을 어떠한 조합으로든 행할 수 있다. 변이 펩타이드를 코딩하는 DNA에서 행해질 돌연변이는 리딩 프레임을 변경해서는 아니되며 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적인 대역을 만들지 않는 것이 좋다. 유전자 수준에서 이들 변이체들은 이 펩타이드를 코딩하는 DNA중의 뉴클레오타이드의 위치 지향적인 (site directed) 돌연변이 (8)에 의해 만들어지기 때문에, 변이체를 코딩하는 DNA를 생산한 후, 재조합 세포 배양체 중에서 그 DNA를 발현시킨다. 이러한 변이체는 대체로 비변이 펩타이드와 동일한 품질의 생물학적 활성을 나타낸다.
GP88/PCDGF 단백질의 "유사체 (analog)"라 함은 GP88/PCDGF 분자 전체 또는 그 단편과 실질적으로 유사한 비-자연적인 분자를 가리킨다.
본 발명의 항체들 (중화 및 기타 항체)은 암 또는 GP88/PCDGF의 발현 증가를 나타내는 다른 세포 질환을 치료하는데 이용되는 것이 바람직하다.
"중화(neutralizing)"라는 용어는, 세포 증식 촉진, 세포 생존 증가, 세포괴사 (apoptosis) 차단, 또는 실험 동물과 인간에서의 종양 성장을 유도하는 GP88/PCDGF의 능력을 비롯한 (그러나 이러한 능력들로 한정되지 않음) GP88/PCDGF의 일반적인 생물학적 활성을 억제 또는 차단하는 능력을 그 항체가 가졌다는 뜻이다. 항GP88/PCDGF 항체의 유효량을 인간을 비롯한 동물에게 다양한 경로를 통해 투여한다. 또 다른 구체예에서, 항GP88/PCDGF 항체는 비제한적인 예로서 암과 같은 질병에서 일어나는 바와 같이 GP88/PCDGF의 변형된 (증가된) 발현을 나타내는 세포들을 검출하여, 그 성장이 GP88/PCDGF에 의존하며 GP88/PCDGF 길항 요법에 응답할 병든 세포들을 동정하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서는, 세포독성 인자나 안티센스 올리고뉴클레오타이드들과 같은 화합물을 GP88/PCDGF에 응답하거나 이를 발현하는 세포들에게 전달하는데 항GP88/PCDGF 항체들을 이용한다.
본 명세서에 포함된 내용을 참고로 당업자라면 그의 재량에 따라 본 발명의 내용을 특정한 문제나 환경에 적용시킬 수 있을 것이다. 본 명세서의 일부로서 포함된 첨부 도면은 본 발명의 구체예들을 도시한 것으로 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이다. 본 발명의 생성물의 예 및 그의 사용 방법은 실시예에 나타내었다.
다음에 제시되는 바람직한 구체예를 참고로 더욱 상세히 설명하며, 이들은 다음의 실시예와 함께 본 발명의 기본개념을 이해하는데 도움이 될 것이다.
GP88 / PCDGF 의 생물학적 활성
본 발명은 GP88/PCDGF의 변형된 (증가된) 발현과 연관된 질병을 치료 및 진단하는데 유용한 항종양 및 항바이러스성 조성물과 GP88/PCDGF에 관한 것이다. 달리 말하면 본 발명은 GP88/PCDGF에 대한 응답성 증가와 연관이 있는 질병들을 치료 및 진단하는데 이용될 수 있다. 세가지 세포주로 구성된 쥐 모델 시스템을 이용하여, 본 발명자는 GP88/PCDGF를 과발현시키는 세포들이 종양을 형성함을 입증하였다. 모세포주 (parent cell line) 1246은 인슐린에 의한 엄격한 조절하에서 소정의 배지 중에서 증식하여 지방생성 세포 (adipocyte)로 분화하는 C3H 마우스 지방생성 세포주이다. 1246 세포는 높은 세포밀도로 주입된 경우에조차도 유전적 동계 (syngeneic) 동물 (C3H 마우스)에서 종양을 형성하지 못한다. 인슐린 비의존성 세포주인 1246-3A는 무-인슐린 배지에서 유지된 1246 세포로부터 분리한 것이다. 유전적 동계 마우스에 106개를 피하주사한 경우 1246-3A 세포는 분화능력을 상실해서 종양을 만들지 못한다. 고도로 종양형성성인 PC 세포주는 1246-3A 세포로부터 in vitro-in vivo 셔틀 기술을 이용하여 개발하였다. PC 세포는 104 개의 세포들을 유전적 동계 마우스에 주사한 경우 종양을 형성하였다.
GP88/PCDGF은 비-종양형성성 인슐린-의존성 모세포주에 비해 인슐린-비의존성 종양형성성 세포주에서 과발현된다. 뿐만 아니라, GP88/PCDGF의 과발현 정도는 이들 세포의 종양형성성과 비례적으로 관련이 있으며 이는 GP88/PCDGF이 종양형성성에 있어서 중요함을 최초로 입증하는 것이다 (도 1). 도 1을 참조로 보면, GP88/PCDGF은 세포에 의해 합성될 뿐만 아니라 배양 배지내로 분비되기 때문에, GP88/PCDGF의 수준은 세포 용해물과 배양 배지 (CM) 중에서 측정되었다. 모든 세포들이 2% 소의 태아 혈청이 보강된 DME/F12 영양 배지 중에서 배양되었다. 세포들이 고점성에 이르도록 다 자라면 배양 배지 (CM)을 수거하고 디터전트를 함유하는 완충액 중에서 인큐베이션시킨 다음 10,000 x g로 원심분리시킴으로써 세포 용해물 (cell lysate)을 준비하였다. 세포 용해물 및 조건 배지를 세포 수에 의해 노말라이즈시켰다. 세포 용해물과 조건 배지로부터의 시료들을 후술하는 바와 같이, 항GP88/PCDGF 항체를 이용하여, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 분석하였다.
중화 항체의 개발에 의해, 종양발생에 있어서 GP88/PCDGF의 핵심적인 역할을 확인할 수 있었다. 마우스 GP88/PCDGF의 K19T 대역에 지향된 항GP88/PCDGF 항체을 배양 배지에 첨가하자, 고도로 종양형성성인 PC 세포의 성장이 투여량 의존 형식으로 억제되었다 (도 2). 도 2와 관련해서, 인간 피브로넥틴 ( 2 μg/ml)와 인간 트랜스페린 (10μg/ml)이 보강된 DME/F12 배지 중에서 2 x 104 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에서 PC 세포들을 배양하였다. 세포들이 서로 달라붙은 후 항GP88/PCDGF IgG 분획을 농도를 증가시키면서 상기 웰에 첨가하였다. 대조군 세포는 동 농도의 비-면역원성 IgG로 처리하였다. 이틀 후, 3H-티미딘 0.25 mCi를 웰 당 6시간 동안 첨가하였다. 이어서 세포들을 수확하여 DNA내로 인코포레이션된 3H-티미딘을 세포 증식 척도로서 계수하였다.
또한, GP88/PCDGF의 발현은 PC 세포에서의 안티센스 GP88/PCDGF cDNA에 의해서 특이적으로 억제된 경우, GP88/PCDGF의 생산이 감소되었고 이들 PC 세포들은 유전적 동계 C3H 마우스에 있어서 더 이상 종양을 형성시키지 못하였다. 게다가, 이들 PC 세포들은 인슐린에 대한 응답성도 회복하였다. 도 3과 표 1 및 표 2에 있어서, C3H 암컷 마우스에게 106개의 안티센스 GP88/PCDGF 트랜스펙션된 PC 세포 (후술하는 바와 같음) 또는 106개의 텅빈 벡터 트랜스펙션된 PC 세포를 피하주사하였다. 사진은 세포를 주사한지 45일째 찍은 것이다. 그 결과 안티센스 GP88/PCDGF PC 세포가 주사된 마우스들에서는 종양이 발달되지 않아서, 대조군으로서 사용된 텅빈 벡터 트랜스펙션된 PC 세포가 주사된 마우스와 대조를 이루었다.
GP88/PCDGF 안티센스 트랜스펙션된 세포들, 대조군 트랜스펙션된 세포 및 PC 세포들의 종양형성 특성 비교
주입된 세포 평균적인 종양 검출일 종양이 있는 마우스 수 종양의 평균 중량 (g)
PC 15 ±3.0 5/5 9.0 ±3.2
P14 15 ±3.7 5/5 7.8 ±2.7
ASGP88/PCDGF --- 0.5 ---
PC: 대조군 비-트랜스펙션된 세포
P-14: 텅빈 벡터 대조군 트랜스펙션된 PC 세포
ASGP88/PCDGF: GP88/PCDGF 안티센스 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 PC 세포
종양들을 절제하여 45일에 칭량하였다 --- 종양형성이 나타나지 않음.
1246, PC 세포 및 GP88/PCDGF 안티센스 세포들의 특성 비교
1246 세포 PC 세포 안티센스 GP88/PCDGF 세포
성장 및 분화에 있어서 인슐린 응답성 성장 분화 부족에 있어서 인슐린 비의존성 성장 (분화)에 있어서 인슐린 응답성 복구
인슐린-관련 인자의 자분비성 생산
세포표면 인슐린 수용체 발현정도가 높음 세포표면 인슐린 수용체 발현정도가 매우 낮음 세포표면 인슐린 수용체 발현 정도 상승함
GP88/PCDGF 발현 낮음 GP88/PCDGF 발현이 구조적으로 높음 GP88/PCDGF 발현이 안티센스에 의해 저해됨
혈청에 의해 GP88/PCDGF 발현이 저해됨 혈청에 의해 저해되지 않음
인슐린에 의해 GP88/PCDGF 발현이 조절됨 GP88/PCDGF 발현이 구조적임 내인성 GP88/PCDGF 발현을 위한 인슐린 조절 복구
비-종양형성성 고도로 종양형성성 비-종양형성성
GP88/PCDGF의 발현 비교결과 종양 중의 in vivo GP88 / PCDGF 수준이 정상 조직에서보다 극적으로 더 높아진 것으로 나타났다 (도 4). C3H 마우스에게 106 PC 세포들을 주사하였다. 종양산생 마우스들을 안락사시켰다. 종양, 지방 패드 및 연결조직들을 수거하였다. 도 1과 관련하여 전술한 디터전트를 함유하는 완충액에서 인큐베이션시킴으로써 세포 용해물을 준비하였다. 조직 추출물의 단백질 농도를 측정하고, 각 시료에 대한 단백질의 동량을 SDS-PAGE, 이어서 항GP88/PCDGF 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석함으로써 조직 추출물중의 GP88/PCDGF의 함량을 측정하였다. 그 결과 종양 추출물 중의 GP88/PCDGF의 수준이 주변 연결조직과 지방조직에 비해 적어도 10배 이상 더 높은 것으로 나타났다.
*정상적인 세포 (1246 세포, 섬유아세포)에서는, GP88/PCDGF의 발현이 특히 인슐린에 의해 조절되며 소의 태아 혈청에 의해 저해된다. 종양형성 세포에 있어서는, 정상적인 성장의 조절 손실이 GP88/PCDGF의 증가된 발현과 성장에 대한 GP88/PCDGF의 의존성 획득으로 이어진다. 따라서, GP88/PCDGF 발현의 억제 및/또는 작용을 억제하는 것은 종양형성을 억압하는 효과적인 접근방법이다. 생검재료 중 상승된 GP88/PCDGF 발현의 검출은 GP88/PCDGF 억제요법에 응답적인 종양의 진단적 분석법을 제공해준다.
GP88/PCDGF은 또한 인간의 암에 있어서 종양유도 인자이기도 하다. 1246-3A 세포주에서 보여지는 바와 같이, 인슐린 (또는 IGF-I)에 대한 응답성 상실 및 악성종양 발생빈도 증가는 유방암을 비롯한 사람의 몇몇 종류의 암과 관련해서 잘 문서화되어 있다. 특히, 유방암종은 인슐린/IGF-I 자분비성 루프 (loop)의 획득을 수반하는데 이것은 전술한 마우스 모델 시스템에 있어서 종양형성 특성의 발달의 출발점이기도 하다. 뿐만 아니라, GP88/PCDGF 발현은 인간의 유방암종에서도 증가된다. 더욱 구체적으로, 도 5와 관련해서, 인간의 GP88/PCDGF은 에스트로겐 수용체 양성 및 에스트로겐 수용체 음성 인슐린/IGF-1 비의존성인 심각한 악성 세포에서도 고도로 발현되었다. 또한, GP88/PCDGF은 유선상피세포에 있어서 강력한 성장 인자이다 (도 6). 도 5의 데이타는 10% 소의 태아 혈청 (FBS)가 보강된 DME/F12 배지에서 MCF7, MDA-MB-453 및 MDA-MB-468 세포들을 배양함으로써 얻어졌다. RNAzol 법에 의해 각각의 세포주로부터 RNA를 추출하여 폴리-A+ RNA를 제조하였다. 32P-라벨링된 GP88/PCDGF cDNA 프로브를 이용하여 각 세포주에 대해 폴리-A+ RNA 3 μg으로 노던 블롯 분석을 행하여 GP88/PCDGF mRNA 발현을 평가하였다.
설치류의 세포 또는 조직 (마우스와 래트)에서의 GP88/PCDGF mRNA 발현의 노던 블롯 분석을 위해, 본 발명자들은 뉴클레오타이드 551 내지 862 (아미노산 서열 160 내지 270에 해당)의 311 bp 길이의 마우스 GP88/PCDGF cDNA 프로브를 이용하였다. 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 여러가지 방법 (Sambrook, Molecular Biology manual: 35)에 의해 RNA를 추출할 수 있다. 선택된 방법은 구아니디늄 이소티오시아네이트와 페놀-클로로포름에 의한 일단계 추출로 구성된, RNAzol (Cinnabiotech사) 또는 Triazol (Gibco-BRL사) 용액을 이용하여 RNA를 추출하는 것이었다.
인간 세포주에서의 GP88/PCDGF mRNA 발현을 노던 블롯 분석하기 위해, 인간 GP88/PCDGF의 뉴클레오타이드 1002 내지 1674 (아미노산 서열 334-558에 대응)에 대응하는 672 bp의 인간의 GP88/PCDGF cDNA 프로브를 개발하였다. 바람직한 구체예에서 사용된 노던 블롯 분석의 상세한 설명을 위해서는 실시예 8을 참고하기 바람.
도 6과 관련해서, 마우스의 유선 상피세포주 C57MG의 성장에 미치는 GP88/PCDGF의 농도 증가에 따른 성장촉진 효과를 입증하기 위해, PC 세포 조건배지 (위) 및 곤충 세포에서 발현된 재조합 GP88/PCDGF (아래)로부터 정제된 GP88/PCDGF의 농도를 증가시키면서 C57MG 세포들을 배양시켰다.
IGF-1 자분비성 생성물과 증가된 악성간의 상관관계는 신경교아종, 기형암종 및 유방암종에 대해서도 잘 확립되어 있다. 암에 있어서, GP88/PCDGF 발현은 비-종양형성성 인체 섬유아세포와 기타 인간세포주에 비교할 때 인간 종양에서도 증가된다. GP88/PCDGF은 유선암종 세포의 성장을 촉진한다.
항 GP88 / PCDGF 항체
본 발명은 GP88/PCDGF의 증가된 발현과 연관된 질병을 치료 및 진단하기 위한 조성물을 제공한다. 이것은 또한 GP88/PCDGF의 증가된 응답성과 연관이 있는 질병을 치료 및 진단하는데도 적용될 것이다. 본 발명의 조성물들은 GP88/PCDGF의 생물학적 활성을 중화시키는 항GP88/PCDGF 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 GP88/PCDGF 에피토프에 특이적인 항체 및 세포, 세포나 조직 추출물, 배양배지 또는 생물학적 체액 중에서 GP88/PCDGF 분자, 그의 기능적 유도체 또는 상이한 동물종으로부터의 동족체의 존재여부를 검색하거나 또는 존재할 경우 그 양이나 농도를 측정하는데 있어서 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 항체를 이용하여 특정 부위에 대한 세포독성 분자를 표적화할 수 있다.
항체 개발을 위한 항원으로서의 용도를 위해, 재조합 형태 또는 그의 기능적 유도체 형태로 생산 또는 발현된, 바람직하게는 9개 이상의 아미노산을 갖는 GP88/PCDGF 단백질을 얻어서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 생산을 위해 동물을 면역하는데 이용하였다. 항체는 만약 그 항체가 그 분자와 반응하여서 그 분자가 항체에 결합할 수 있다면 그 분자에 결합할 수 있다고 말할 수 있다. 그 특이 반응은 항원이 그의 대응하는 항체와는 고도로 선택적인 방식으로 반응하나, 다른 항원에 의해 야기될 수 있는 다른 여러가지 항체와는 반응하지 않으리라는 것을 의미한다.
본 명세서에서 항체라는 용어는 인간 및 비-인간 폴리클로날 항체, 인간 및 비-인간 모노클로날 항체 (mAbs), 키메라 항체, 항이디오타잎 항체 (항IdAb) 및 인간화 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 폴리클로날 항체들은 계란으로부터 또는 항원으로 면역화된 동물들의 혈청으로부터 유도된 항체 분자의 이종 집단이다. 모노클로날 항체 ("mAbs")는 특정 항원에 대한 실질적으로 동종 (homogeneous) 항체들의 집단이다. mAbs는 이 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대 미국특허 제 4,376,110호)에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 여하한 서브클래스를 비롯한 면역학적 클래스에 속하는 것일 수 있다. GP88/PCDGF에 대한 인간 및 비-인간 항체를 생산하는 하이브리도마는 in vitro 또는 in vivo에서 배양될 수 있다. mAbs를 대량생산하기 위해서는, in vivo에서 생산하는 것이 현재로서 바람직한 방법이다. 간단히 설명하면, 각각의 하이브리도마로부터의 세포들을 프리스탄 프라임시킨 Balb/c 마우스 또는 누드 마우스에게 복강주사하여 전술한 mAbs를 고농도로 함유하는 복수액을 얻는다. mAbs는 당업자들에게 잘 알려진 표준 크로마토그래피법을 이용하여 배양상등액이나 상기한 복수액으로부터 정제시킬 수 있다.
인간의 GP88/PCDGF에 대한 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 동물들로부터의 임파구를 이용하여 생산된 하이브리도마는 마우스 면역글로불린 대신 인간의 면역글로불린을 생산할 것이다.
대부분의 모노클로날 항체들이 쥐와 다른 비-인간 생물로부터 유래하기 때문에, 인간에 투여된 설치류 mAbs의 면역원성, 이펙터 기능의 저조한 소집력 및 혈청으로부터의 급속한 소실로 인해, 이들의 임상적 효과가 제한될 수 있다. 이러한 문제점을 피하기 위해, 쥐의 항체의 항원-결합 특성을 인간화 (humanization)이라는 프로세스를 통해 인간 항체에 부여할 수 있다. 인간화 항체는 인간 항체 구조내로 이식된 부모쥐의 mAb의 6개의 상보성-결정 대역 (CDRs: complementarity-determining regions)에 대한 아미노산 서열을 함유한다. 인간화 항체 중의 낮은 비-인간 서열 함량 (약 5%)은 인간에 있어서 혈청 반감기를 연장시키고 면역원성을 감소시키는데 있어 모두 효과적인 것으로 입증되었다. 모노클로날 항체의 인간화를 위해 일가 (monovalent) 파지 디스플레이와 복합적 라이브러리 전략을 이용하는 방법들은 이제 여러가지 항체를 인간화하는데 광범하게 적용되며 당업자들에게 잘 알려져 있다. 전술한 바와 같이 트랜스제닉 동물들을 이용하여 개발된 이들 인간화 항체들과 인간 항체들은 암을 비롯한 (그러나 암에 국한되지 않음) 여러가지 질병의 치료제로서 매우 유용하다.
당업자에게 잘 알려진 도트 블롯과 표준 면역분석법 (EIA 또는 ELISA)을 비롯한 몇가지 면역분석법에 의해, GP88/PCDGF에 특이적인 항체 존재 하에 하이브리도마 상등액과 혈청을 스크리닝한다. 일단 상등액이 목적하는 항체를 갖는 것으로 확인되면, 항체가 결합하는 항원의 크기를 동정하기 위해 웨스턴 블롯법으로 더욱 스크리닝한다. 당업자라면 목적하는 폴리클로날 항체 또는 mAb를 얻기 위해 과도한 실험을 하지 않고도 이러한 하이브리도마를 제조 및 스크리닝하는 방법을 알 것이다.
키메라 항체들은 여러가지 동물종으로부터 유래된 다양한 부분을 갖는다. 예컨대, 키메라 항체는 쥐의 mAb로부터 다양한 영역과 인간 면역글로불린 불변부를 가질 수 있다. 키메라 항체와 그의 제조방법 역시 당업자에게 잘 알려져 있다.
항이디오타잎 항체 ("항IdAb")란 항체의 항원-결합 부위와 일반적으로 연관된 독특한 결정인자를 인식하는 항체이다. 항IdAb는 동일 종 및 동일 유전형의 동물 (예컨대 마우스 스트레인)을, 동일 종의 항IdAb가 제조되는 mAb와 동일한 소스의 mAb로 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 이들 이디오타잎 결정인자 (항IdAb)에 대한 항체를 생산함으로써, 면역화 항체의 이디오타잎 결정인자를 인식하고 그에 응답할 것이다. 항IdAb는 또한 면역원으로서 사용될 수 있기 때문에 소위 항항IdAb를 생산하는 다른 동물에서도 면역 응답을 이끌어낼 수 있다. 항항IdAb는 항IdAb를 유도하는 본래의 mAb와 에피토프적으로 동일한 것일 수 있다. 따라서, mAb의 이디오타잎 결정인자에 대한 항체들을 이용함으로써, 동일한 특이성의 항체들을 발현하는 다른 클론들을 동정하는 것이 가능하다.
따라서, GP88/PCDGF에 대해 생산된 mAbs는 적절한 동물에서 인간 및 비-인간 항IdAbs를 유도하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역화 마우스로부터의 비장 세포들을 이용하여 인간 또는 비-인간 항Id mAbs를 분비하는 하이브리도마를 생산할 수 있다. 또한, 항Id mAbs는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin)이나 소의 혈청 알부민 (BSA: bovine serum albumin)과 같은 캐리어에 커플링되어 부가적인 마우스를 면역하는데 이용될 수 있다. 이러한 마우스들로부터 얻어진 혈청은 GP88/PCDGF 폴리펩타이드 에피토프에 특이적인 본래의 mAb의 결합 특성을 갖는 인간 또는 비-인간 항항IdAb를 함유할 것이다. 따라서, 항Id mAbs는 그 자신의 고유한 이디오타잎 에피토프나, 평가되는 에피토프와 구조적으로 유사한 이디오타잎을 갖는다.
항체라는 용어는 완전한 분자 전체 뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 그의 단편, 예컨대, Fab 및 F(ab')2도 포함한다. Fab와 F(ab')2 단편은 본래 항체의 Fc 단편이 결여되어 있으며, 순환시 보다 빨리 소실되고 완전한 항체에 비해 덜 비-특이적인 조직 결합성을 가질 수 있다. 이러한 단편들은 일반적으로 파파인 (Fab 단편 제조를 위해)과 펩신 (F(ab')2 단편 제조를 위해)과 같은 효소들을 이용하여 단백질분해 절단법에 의해 생산된다. 본 발명에서 유용한 Fab 와 F(ab')2 및 항체의 기타 단편들도, 완전한 항체 분자에 대해 설명된 방법에 따라, GP88/PCDGF의 검출이나 정량 및 GP88/PCDGF 발현과 관련된 질병 상태의 치료에 이용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라, in vitro에서 GP88/PCDGF 활성을 중화시키는 항체들을 이용하여 in vivo 에서 GP88/PCDGF 활성을 중화시킴으로써 암 및 바이러스 감염과 같이 (그러나 이에 국한되지 않음) 증가된 GP88/PCDGF 발현 또는 GP88/PCDGF에 대한 증가된 응답성과 연관된 질병을 치료할 수 있다. 증가된 GP88/PCDGF 발현과 연관이 있는 질병을 앓고 있는 대상자, 바람직하게는 인간 대상자를 GP88/PCDGF에 대한 항체로 치료한다. 이러한 치료는 다른 항암 또는 항바이러스 요법과 연합적으로 수행될 수 있다. 전형적인 치료법은 GP88/PCDGF에 특이적인 항체의 유효량을 1주 또는 수주일간 한달 내지 6개월간 투여하는 것이다. 본 발명의 항체는 그의 의도된 목적을 달성케하는 어떠한 수단으로는 투여될 수 있다. 예컨대, 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내 및 경구투여와 같은 다양한 경로로 투여될 수 있으며 상기 투여경로로 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여는 볼러스 주입 또는 점진적인 관류에 의해 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 멸균수용액 또는 비수성용액, 현탁액 및 유제가 포함되며 이들은 기술분야에 알려진 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 타블렛 및 캡슐과 같은 약학적 조성물 역시 상법에 따라 제조될 수 있다. 투여량은 대상자의 연령, 성별 및 체중, 병용 요법 (있다면)의 종류, 치료빈도 및 소망하는 효과의 특성에 따라 달라질 것이다. 아래에 제공되는 유효량 범위는 본 발명을 한정하려는 의도가 아니라 단지 바람직한 투여범위를 제시하려는 의도일 뿐이다. 그러나, 가장 바람직한 투여량 범위는 당업자가 잘 이해하고 결정할 수 있듯이 각 대상자마다 적당히 맞추는 것이 좋다. 각각의 치료시 요구되는 총 투여량은 복수 투여 또는 단일 투여에 의해 투여될 수 있다. 항체 유효량은 약 0.01 μg 내지 약 100 mg/kg 체중이며 바람직하게는 약 10 μg 내지 약 50 mg/kg인 것이 좋다. 항체는 단독으로 투여되거나 또는 동일 질병 치료를 위하여 다른 요법과 병용하여 투여될 수도 있다.
본 발명에 따라 그리고 중화 항체와 관련하여, GP88/PCDGF의 생물학적 활성을 억제할 필요가 있는 모든 치료분야, 심지어는 GP88/PCDGF 세포 표면 수용체의 과발현이 있고 그로 인해 그의 생물학적 활성이 증가된 경우, 또는 GP88/PCDGF 시그널링 경로나 수용체의 변경으로 인해 시그널링 경로가 항상 "턴온(turned on)" 상태인 경우를 비롯하여, GP88/PCDGF 발현에 반드시 변화가 있는 것이 아닌 경우에조차 GP88/PCDGF 중화 항체를 사용할 수 있다. 성장 인자 및 성장 인자 수용체에 대한 중화 항체들이, 그의 증식이 이들 성장 인자에 의존성인 세포들의 성장을 억제하는데 성공적으로 이용되어왔다. 이것은 인간 유방암종 세포에서의 IFG-I 수용체와 폐암에서의 봄베신의 경우가 그렇다. GP88/PCDGF에 대한 항체는 또한 톡신, 온코톡신, 미토톡신 및 면역독신과 같은 세포독성 시약, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같은 화합물 (그러나 이에 국한되지 않음)을 전달하여, GP88/PCDGF를 발현하거나 이에 응답하는 세포들로 이들을 특이적으로 표적화시키는데도 이용될 수 있다 (30).
항원으로 하여금 GP88/PCDGF에 대한 중화 항체를 발달시킬 수 있는 항 대역은 마우스 GP88/PCDGF에서는 K19T, 인간 GP88/PCDGF에서는 E19V라 정의된 19개짜리 아미노산 대역으로서, 이것은 에피쎌린/그래뉼린 6 kDa 반복체사이에 위치하는 것이 아니라, 이들 반복체 사이, 구체적으로는 가변부로 여겨지는 그래뉼린 A (에피쎌린 1)과 그래뉼린 C (5) 사이에 위치한다 (도 10 참조). 어떠한 특정 이론에 구애됨이 없이, GP88/PCDGF의 생물학적 활성에 중요한 역할을 하는 대역은 에피쎌린 반복체 외부에 있는 것으로 믿어진다.
본 발명에서 유용한 항체 또는 항체 단편은 GP88/PCDGF 단백질을 발현하는 세포의 존재여부를 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는데 이용될 수도 있다. 이것은 형광 현미경, 유속 세포분석법, 또는 형광 검출을 이용하여 형광적으로 항체를 표지시키는 면역형광기술 (후술됨)에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 항체들과 폴리펩타이드의 반응은 기술분야에 잘 알려진 면역분석법으로 검출될 수 있을 것이다.
본 발명의 항체들은 광현미경, 면역형광 또는 면역전자 현미경과 함께, 조직 시료 또는 생검재료 중 GP88/PCDGF을 in situ 검출하는데 조직학적으로 이용될 수 있다. in situ 검출은 환자로부터 조직학적 표본을 떼어내서 적절히 표지시킨 본 발명의 항체를 적용함으로써 달성될 수 있다. 항체 (또는 단편)은 생물학적 시료에 대해 표지된 항체 (또는 단편)을 적용 또는 오버레이시킴으로써 제공되는 것이 바람직하다. 이러한 절차를 이용함으로써, GP88/PCDGF 단백질의 존재여부를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 시험 조직 중에서의 그의 분포상황도 파악할 수 있다. 본 발명을 이용함으로써, 당업자들은 in situ 에서의 상기한 성과를 위해 다양한 조직학적 방법 (예컨대 염색법)을 변형사용할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
GP88/PCDGF에 대한 분석은 일반적으로 갓 수확된 생물학적 체액, 조직 추출물과 같은 생물학적 시료나, 배양된 세포 또는 그들의 배양배지를 GP88/PCDGF 단백질을 검색하고 항체를 검출할 수 있는, 검출가능하게 표지된 항체 존재 하에 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 인큐베이팅시키는 것을 포함하여 이루어진다.
생물학적 시료는 니트로셀룰로스나 세포 또는 세포 입자나 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 다른 고체 지지체와 같은 고상 지지체 또는 담체를 이용하여 처리될 수 있다. 이이서 지지체를 세정한 후 검출가능하게 표지된 항GP88/PCDGF 항체를 이용하여 처리한다. 그 후 미결합 항체를 제거하기 위해 지지체를 씻어낸다. 상기 지지체 상에 결합된 라벨의 양을 상법에 따라 측정할 수 있다. 고상 지지체의 경우 유리, 폴리스티렌 폴리프로필렌, 나일론, 개질 셀룰로스, 또는 폴리아크릴아미드와 같은 항원이나 항체 결합가능한 여하한 지지체일 수 있다.
공지 방법에 따라, GP88/PCDGF 단백질에 대한 주어진 로트 항체의 결합 활성을 측정할 수 있다. 당업자라면 통상적인 실험을 이용함으로써 매 측정시마다 작동가능한 최적의 분석 조건을 결정할 수 있을 것이다.
GP88/PCDGF 단백질 또는 그의 기능적 유도체 및 그 단백질에 대한 특이적인 항체의 검출은 효소결합 면역분석법 (ELISA: enzyme linked immunoassays) 또는 방사능면역분석법 (RIA: radioimmunoassays)와 같은 기술분야에 잘 알려진 다양한 면역분석법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 분석법은 기술분야에 잘 알려져 있으며 당업자라면 본 발명의 항GP88/PCDGF 항체와 GP88/PCDGF 단백질을 이용하여 이러한 분석법을 어떻게 수행할지를 쉽게 알 수 있을 것이다.
이러한 면역분석법은 혈청이나 다른 생물학적 시료, 예컨대 조직, 세포, 세포 추출물 또는 생검재료 중에서 GP88/PCDGF 단백질을 검출 및 정량하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서는, 암이나, GP88/PCDGF의 증가된 발현과 관련된 다른 질환을 진단하기 위한 수단으로서 GP88/PCDGF의 농도를 조직 표본 중에서 측정한다.
특정 유형의 암의 존재여부와 악성 정도는 GP88/PCDGF 단백질의 수준 증가와 "비례적"이다. 본 명세서에서 "비례적"이라는 용어는 상기 단백질과 암의 악성특성 사이에 직선관계나 일정한 관계로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 따른 "비례적"이라는 용어는, 당업자가 쉽게 측정할 수 있는 단백질 농도 범위에서, GP88/PCDGF 단백질의 증가된 수준이 암이나, GP88/PCDGF의 증가된 발현과 연관된 다른 질병의 악성 특성의 외관, 재발생 또는 디스플레이와 관계가 있다는 것을 가리키도록 의도된 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 GP88/PCDGF의 항암 또는 항바이러스 약물이나 제제가 GP88/PCDGF의 발현 또는 생산을 억제하는 능력을 측정함으로써 상기 약물 또는 제제의 효능을 평가하는데 관한 것이다. 본 발명의 항체들은 상기한 면역분석법 중 하나에서 상기한 면역분석법들 중 하나에서 GP88/PCDGF 단백질의 양을 측정하는데 사용될 수 있다는 점에서, 항암 또는 항바이러스 약물을 평가하기 위한 방법에 유용하다. 다른 한편, 생성된 GP88/PCDGF 단백질의 양을 본 명세서에 설명된 바이오분석법 (세포증식 분석법)에 의해서 측정한다. 더욱 정밀한 평가를 위해 바이오분석법과 면역분석법을 병용할 수도 있다.
또 다른 구체예는, 바람직하게는 RNS-DNA 하이브리다이제이션 분석법을 이용함으로써, 조직이나 생물학적 체액 중에서 GP88/PCDGF이나 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는, 존재하는 mRNA 서열의 양을 측정하는데 기초해서 암 또는 GP88/PCDGF 발현의 증가와 관련된 기타 질병을 진단하기 위한 분석법에 관한 것이다. 특정 암의 존재 및 그의 악성 정도는 존재하는 그러한 mRNA의 양에 비례한다. 그러한 분석을 위해, mRNA의 소스는 생검재료와 그 주변조직으로 한다. mRNA의 양을 측정하는 바람직한 기술은 상보적인 염기 서열의 DNA를 이용하는 하이브리다이제이션 분석법이다.
또 다른 관련된 구체예는 어떠한 조직 생검재료에 대해, 항GP88/PCDGF 중화 항체를 이용한 치료가 그 조직의 성장이나 다른 생물학적 활성을 저해하는지 여부를 측정하는데 기초해서, 암이나 GP88/PCDGF 응답성의 증가와 관련된 다른 질병을 진단하기 위한 분석법에 관한 것이다.
또 다른 관련 구체예는 GP88/PCDGF에 대한 mRNA의 발현 억제 효능을 측정하는 단계를 포함하는 것으로 이루어지는, 항암 또는 항바이러스 약물 또는 제제의 효능을 측정하는 방법이다. 마찬가지로 이러한 방법은 GP88/PCDGF mRNA의 생산을 저해하는 상기 제제의 능력을 측정함으로써, GP88/PCDGF 길항제제의 효능을 동정 또는 평가하는데 이용될 수 있다.
핵산 분석법, 특히 하이브리다이제이션 분석법은 핵산분자의 크기, 서열 또는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 대한 민감성과 같은 여하한 특성에 기초하는 것일 수 있다. 이러한 분석법의 민감성은 관찰자에게 검출이 보고되거나 시그널링되는 방식을 변경시킴으로써 증가될 수 있다. 효소, 방사능동위원소, 형광, 화학적 표지 및 개질 염기를 비롯한 매우 광범한 표지들이 집중적으로 개발되어 당업자에게 이용되어왔다.
검출을 위한 핵산의 민감성 제한성을 극복하기 위한 한가지 방법은 분석을 행하기에 앞서 그 핵산을 선택적으로 증폭시키는 것이다. 이 방법은 "폴리머라제 연쇄반응" 또는 PCR (미국특허 제 4,683,202호 및 4,582,788호)이라 칭해진다. PCR 반응은 특정 핵산 서열의 농도를 선택적으로 증가시키는 방법을 제공하며, 그 서열이 미리 정제되지 않아서 특정 시료 중에 한개의 카피만 존재하는 경우에도 가능하다.
GP88 / PCDGF 안티센스 성분
본 발명은 또한 GP88/PCDGF 안티센스 성분도 제공한다. 세포 중의 안티센스 RNA의 연속적인 발현은 20개를 초과하는 유전자 발현을 저해시키는 것으로 나타났으며 그 리스트는 계속 늘어나고 있다. 안티센스 효과에 대한 가능한 메카니즘은 번역 차단 또는 스플라이싱 방지로서 이들 두가지 모두 in vitro 에서 관찰된 바 있다. 스플라이싱을 간섭함으로써 인트론 서열을 이용할 수 있으며, 이것은 분명 덜 보존적이고, 그에 따라 보다 특이성이 높아, 어떤 종의 유전자 산물의 발현은 억제하나, 다른 종에서의 그의 동족체의 발현은 억제하지 못할 것이다.
안티센스 성분 (antisense component)라는 용어는 그를 코딩하는 DNA 서열 뿐만 아니라 RNA 서열에도 대응하며, 이것은 그 안티센스 RNA가 특이적인, 특정 mRNA 분자에 충분히 상보적임으로 해서, 안티센스 RNA와 mRNA 사이에 분자 하이브리다이제이션을 일으켜 mRNA 번역이 억제된다. 이러한 하이브리다이제이션은 in vivo 조건 하에서 일어날 수 있다. 안티센스 RNA의 작용은 세포중 유전자 발현의 특이적인 억제를 야기시킨다.
본 발명에 따르면, GP88/PCDGF cDNA에 대한 DNA 안티센스로 종양형성 세포를 트랜스펙션시키면 내인성 (endogenous) GP88/PCDGF 발현이 억제되어, 안티센스 cDNA 트랜스펙션된 세포의 종양형성성이 억제된다. 이러한 안티센스 DNA는, 안티센스 RNA가 GP88/PCDGF 유전자 (또는 mRNA)에 하이브리다이즈하여 그 작용이 스플라이싱, 전사 또는 번역 중 어느 수준에서 이루어지던지와 관계없이 GP88/PCDGF 유전자 발현을 저해할 수 있도록, GP88/PCDGF 유전자에 대해 충분한 상보성을 갖는 약 18-30개의 뉴클레오타이드를 가져야 한다. 억제 정도는 본 명세서의 설명을 참조하면 당업자가 과도한 시험 없이 쉽게 인식할 수 있으며 바람직하게는 그의 증식이 GP88/PCDGF의 발현에 의존하는 세포들의 성장을 억제하는데 충분한 것이 좋다. 당업자라면 안티센스 RNA 접근이 특정 유전자 발현을 차단하는데 사용가능한 여러가지 공지 메카니즘 중 일례에 불과하다는 것을 잘 알 것이다.
본 발명의 안티센스 성분들은 코딩 서열, 3' 또는 5' 미번역 대역, 또는 다른 인트론 서열을 비롯한 표적 GP88/PCDGF cDNA의 여하한 몇몇 부분들이나, 또는 GP88/PCDGF mRNA에 하이브리다이즈될 수 있다. 당업자가 쉽게 결정할 수 있듯이, 본 발명에 의해 요구되는 상동성의 최소량은 바람직하게는 mRNA 분자의 기능과 다른 비관련 유전자들의 발현에 영향을 미침이 없이, GP88/PCDGF DNA나 mRNA에 대한 하이브리다이제이션과, DNA의 전사 억제, mRNA의 번역 또는 기능 억제를 일으키는데 충분한 양이다.
안티센스 RNA는 레트로바이러스 벡터와 플라스미드를 비롯한 벡터를 통해, 숙주 세포에서 안티센스 RNA의 발현을 야기시키는 프로모터를 비롯한 적절한 조절 서열과 함께 안티센스 RNA를 코딩하는 DNA가 주입된 세포내로 형질전환이나 트랜스펙션에 의해 전달된다. 안티센스 방향으로 GP88/PCDGF cDNA 단편들을 함유하는 여러가지 안티센스 발현 벡터의 안정한 트랜스펙션이 수행되어왔다. 레트로바이러스 벡터를 이용해서도 안티센스 성분들을 세포내로 전달할 수 있다. 전달을 또한 리포좀에 의해서도 달성할 수 있다.
in vivo 요법을 위한 안티센스 기술 목적을 위해, 현재 바람직한 방법은, 발현 벡터 내로 제작된 안티센스 cDNA 단편을 안정하게 트랜스펙션하는 대신, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이다. 길이가 15-30 염기이고 코딩 서열, 3' 또는 5' 미번역 대역 또는 기타 인트론 서열을 비롯한 표적 GP88/PCDGF cDNA의 몇몇 부분이나 또는 GP88/PCDGF mRNA에 대해 하이브리다이즈할 수 있는 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 바람직하다. GP88/PCDGF에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열은 바람직하게는 가장 강력한 안티센스 효과를 갖는 것으로 선택하는 것이 좋다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열에 대한 표적 부위를 좌우하는 인자는 올리고뉴클레오타이드의 길이, 결합 친화도 및 표적 서열에 대한 접근성과 관련이 있다. 서열은 GP88/PCDGF 단백질 번역 및 GP88/PCDGF 관련 표현형의 억제, 예컨대, 배양중 세포에서의 세포분화의 억제를 측정함으로써, 그의 안티센스 활성의 강도에 대해 서열들을 in vitro 에서 스크리닝할 수 있다. 일반적으로, RNA (5' 및 3' 미번역 부분, AUG 개시, 코딩, 스플라이스 정션 및 인트론)의 대부분은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 표적화시킬 수 있는 것으로 알려져있다.
바람직한 GP88/PCDGF 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안정하고, 뉴클레아제 (올리고뉴클레오타이드를 잠재적으로 분해할 수 있는 효소)에 대한 복원력이 높고, 비독성 투여량으로, 병에 걸린 조직과 교통할 수 있을 정도로 적절한 약동학은 가지며, 막을 통과할 수 있는 것들이다.
포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용할 수 있다. 헤테로사이클 또는 슈가의 변형 뿐만 아니라 포스포디에스터 결합의 변형은 효율증가를 가져온다. 포스포디에스테르 결합의 변형의 경우, 포스포로티오에이트를 사용할 수 있다. N3'-N5' 포스포라미데이트 결합이 뉴클레아제에 대해 올리고뉴클레오타이드를 안정화시키고 RNA에의 결합을 증가시키는 것으로 설명되어 왔다. 펩타이드 핵산 (PNA: peptide nucleic acid) 결합은 리보스 및 포스포디에스테르 백본의 완벽한 대체물이며 뉴클레아제에 대해 안정하므로 RNA에 대한 결합 친화도를 증가시키고 RNAse H에 의해 절단되지 않게 한다. 그의 기본적인 구조는 그 구조를 안티센스 성분으로서 최적화시킬 수 있게 해주는 변형에 순응적이다. 헤테로사이클의 변형과 관련해서, 어떤 헤테로사이클 변형은 RNAse H 활성을 간섭하지 않은채 안티센스 효과를 증대시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 변형예는 C-5 티아졸 변형이다. 마지막으로, 슈가의 변형 역시 고려해 볼 수 있다. 2'-O-프로필 및 2'-메톡시에톡시 리보스 변형은 세포배양기, 그리고 in vivo 에서 뉴클레아제에 대해 올리고뉴클레오타이드를 안정화시킨다. c-raf-1에 표적화된 이러한 유형의 올리고뉴클레오타이드를 이용한 세포 배양 및 in vivo 종양 실험은 강도의 증강을 보였다.
전달 경로는 전술한 기준에 따라 측정했을 때 최고의 안티센스 효과를 제공하는 것으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 in vitro 세포 배양 및 in vivo 종양 성장 분석결과 음이온성 리포좀, 레트로바이러스 벡터 및 직접 전달에 의해 매개된 전달방식이 효과적인 것으로 나타났다. 또 다른 가능한 전달형식은 종양세포에 대한 세포 표면 마커에 항체를 이용하여 표적화시키는 것이다. 이 목적을 위해 GP88/PCDGF 또는 그의 수용체에 대한 항체를 이용할 수 있다.
재조합 GP88 / PCDGF
본 발명은 또한 실질적으로, 다른 포유류의 DNA 서열 없이, 재조합 GP88/PCDGF 폴리펩타이드 또는 그의 기능적 유도체를 발현하기 위한 DNA 발현계에 관한 것이기도 하다. 이러한 DNA는 이중 또는 단일사슬일 수 있다. 이 DNA 서열은 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 하이브리다이즈할 수 있도록 약 20개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 것이 바람직하다. 하이브리다이제이션에 대한 특이성을 보다 증가시키기 위해, GP88/PCDGF 단백질 또는 그의 동족체나 기능적 유도체를 코딩하는 것 이외의 다른 서열에 하이브리다이제이션하지 않는 것으로 특징지어지는, 적어도 50개의 뉴클레오타이드 길이인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 DNA 분자, 발현가능한 비히클 또는 벡터 뿐만 아니라, 상기 비히클에 의해 트랜스펙션 또는 형질전환되어 상기 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 숙주에 관한 것이기도 하다. 이러한 숙주는 원핵생물, 바람직하게는 세균, 또는 진핵생물, 바람직하게는 효모나 포유동물 세포일 수 있다. 바람직한 벡터계는 곤충 세포에서 발현된 배큘로바이러스를 함유하는 것이다. 이 DNA는 형질전환, 형질유도, 트랜스펙션, 감염 또는 기타 관련 공지기술에 의해 숙주 생명체내로 인코포레이션될수 있다. GP88/PCDGF 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA와 mRNA에 더해, 본 발명은 또한 핵산 서열의 발현법을 제공한다. 뿐만 아니라, 유전자 서열과 올리고뉴클레오타이드는 전술한 폴리펩타이드 GP88/PCDGF에 대한 서열 상동성을 갖는 부가적인 폴리펩타이드를 동정 및 클로닝하는 것을 가능케 해준다.
발현 벡터는 벡터 내로 클로닝됨으로 해서 폴리펩타이드나 단백질을 생산하는 DNA (또는 cDNA)를 발현시킬 수 있는 것을 말한다 (적절한 전사 및/또는 번역 제어 서열 존재로 인해). 클로닝된 서열의 발현은 발현 벡터가 적절한 숙주 세포내로 도입되면 일어난다. 원핵 발현 벡터가 사용될 경우, 적절한 숙주 세포는 클로닝된 서열을 발현할 수 있는 것이면 어떠한 원핵 세포이든 무방하다. 마찬가지로, 진핵 발현계가 사용될 경우에는, 클로닝된 서열을 발현할 수 있는 것이면 어떠한 진핵 세포이든 무방하다. 예컨대, 배큘로바이러스 벡터를 이용하여 GP88/PCDGF cDNA를 클로닝한 후 이어서 숙주 세포에서 cDNA를 발현할 수 있다.
적절한 말단을 제공하기 위해 접합, 제한효소 절단용 블런트-말단화 또는 스태거드 말단화, 적절하게 코히시브 말단 채우기, 바람직하지 못한 결합을 방지하기 위한 알칼라인 포스파타제 처리 및 적절한 효소 리가제를 이용한 접합을 비롯한 통상적인 기술에 따라 GP88/PCDGF 폴리펩타이드 또는 그의 유도체를 코딩하는 DNA 서열을 벡터 DNA와 재조합시킬 수 있다. 이러한 조작 기술은 문헌에 잘 나타나있다 (35).
어떤 핵산 분자는 그것이 전사 및 번역 조절 정보를 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 그러한 서열이 그 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 링크되면 그 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 작동가능한 링크는 조절 DNA 서열과 발현시키고자 하는 DNA 서열이 유전자 발현을 가능케하는 방식으로 연결되어 있는 링크를 말한다. 유전자 발현에 필요한 조절 대역의 정밀한 특성은 생물체마다 달라질 수 있으나 일반적으로, 프로모터 대역을 포함하여, 이것은 원핵생물에서는 프로모터 (RNA 전사 개시를 명령함) 뿐만 아니라 RNA로 전사될 경우 단백질 합성 개시를 신호할 DNA 서열도 포함한다. 이러한 대역은 보통은 전사 개시, TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열과 같은 번역 등과 관련된 5' 비-코딩 서열을 포함할 것이다.
소망될 경우, 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 3' 비-코딩 대역을 설명된 방법에 의해 얻을 수 있다 (cDNA 라이브러리 또는 PCT 증폭에 적절한 스크리닝). 이 대역은 종결 및 폴리아데닐화와 같은 전사 종결 조절 서열의 존재 하에 유지될 수 있다. 따라서, 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 본래 근접하게 3' 대역을 유지시킴으로써, 전사 종결 시그널이 제공될 수 있다. 전사 종결 시그널이 제공되지 않거나 발현 숙주세포내에서 만족스럽게 기능하지 않을 경우에는 다른 유전자로부터의 3' 대역으로 대체시킬 수 있다.
프로모터 대역 서열과 GP88/PCDGF 코딩 서열과 같은 두개의 DNA 서열들은 서열들간의 링크 특성이 프레임-쉬프트 돌연변이의 도입을 야기시키지 않거나 또는 폴리펩타이드 유전자 서열의 전사를 명령하는 프로모터 서열의 능력을 간섭할 경우 작동적으로 링크되어 있다고 칭해진다.
프로모터 서열은 원핵, 진핵 또는 바이러스성일 수 있다. 적절한 프로모터는 유도가능하고, 억제적이며 보존적인 것이다. 적절한 원핵 프로모터의 예가 검토된다.
진핵 프로모터로는 마우스 메탈로시오네인 I 유전자, 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, 유전자 gal4 프로모터, SV40 조기 (early) 프로모터, 마우스 유선종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 및 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 강력한 프로모터들이 바람직하다. 이러한 프로모터의 예로는 T3, SP6 및 T7 폴리머라제를 인식하는 것들, 박테리오파지 람다의 PL 프로모터, recA 프로모터, 마우스 메탈로시오네인 I 유전자의 프로모터, SV40 프로모터 및 CMV 프로모터가 포함된다.
진단 방법
본 발명은 또한 종양형성성을 판단하기 위한 GP88/PCDGF 진단방법을 제공하며 또한, 대상 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성이 있는지를 결정하기 위한 진단방법도 제공한다. 전술한 바와 같이, GP88/PCDGF의 상승된 수준은 종양형성성이 증가되었음을 가리키는 것이다. 또한, 본 발명자들은 GP88/PCDGF의 증가가 항에스트로겐의 항신생조직 효과에 대한 내성의 지표임을 예기치않게 발견하였다.
항에스트로겐 요법은 에스트로겐의 기능이나 합성을 방해 또는 저해한다. 예컨대, 타목시펜은 에스트로겐이 그의 수용체와 결합하는 것을 방해한다. 아나스트로졸과 같은 아로모타제 저해제는 안드로겐이 에스트로겐으로 전환되는 것을 촉매함으로써 에스트로겐 수준을 감소시킨다.
특정 이론에 구애될 의사 없이, 본 발명자들은 GP88/PCDGF 수준 증가가 세포를 에스트로겐 의존적 성장으로부터 에스트로겐 비의존적 성장으로 변환시키는데 기여한다고 믿는다. 에스트로겐 비의존적 세포들은 에스트로겐의 존재여부에 대해 둔감 (insensitive) 하며 따라서, 항에스트로겐 요법에 대해 영향을 받지 않는다. 이전에는, 에스트로겐 수용체의 존재가 항에스트로겐 요법에 대한 내성을 위한 진단 마커로서 필수적으로 사용되었다. 그러나 GP88/PCDGF 수준이 증가하고 세포가 에스트로겐에 비의존적으로 성장할수록, 에스트로겐 수용체의 존재여부는 그 환자가 항에스트로겐 요법에 응답적일지를 가리는데 충분치 않게 된다. GP88/PCDGF의 수준, 그리고 우발적이든 이론적이든, 에스트로겐 비의존성은 에스트로겐 수용체의 존재여부보다, 어떤 환자가 항에스트로겐 요법에 대해 내성적일지 또는 응답적일지를 보다 정확하고, 보다 조기에, 그리고 보다 신뢰할 수 있게 판단해줄 수 있는 진보된 진단 마커역할을 한다. 전술한 바와 같이, 이 새로운 진단 마커는 타목시펜과 같은 항에스트로겐제의 잘 알려진 난소암 발병 성향, 특히, 본 발명까지, 알수 없는 이유로 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성을 나타내는 환자들의 경우 특히 더 가치있는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 어떤 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성이 있는지를 판단하는 방법에 관한 것이다. 환자로부터 얻어진 생물학적 시료(들)에서 GP88/PCDGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드나 GP88/PCDGF 단백질을 검출하여, 시료 중의 GP88/PCDGF 양성 세포의 수와 총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 세포의 비율을 측정한다. 총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성세포의 비율은 그 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성이 있는지를 가리킨다. 다른 한편, 생물학적 시료 중의 GP88/PCDGF의 양은 생물학적 시료에서 GP88/PCDGF를 검출하여 공지량의 GP88/PCDGF 단백질 또는 핵산 검출에 의해 만들어진 표준 곡선으로부터 GP88/PCDGF의 양을 외삽함으로써 ("표준 곡선 기술") 구할 수 있다. 표준 곡선 기술은 이산적인 세포수에서 GP88/PCDGF를 검출하기가 쉽지 않은 생물학적 시료에서 GP88/PCDGF의 양을 측정하는데 바람직한 방법이다. 예컨대, 생물학적 체액 (예컨대, 혈청 또는 뇌척수액) 중 GP88/PCDGF의 양을 이 표준곡선 기술을 이용해서 결정할 수 있다. 생물학적 시료 중의 GP88/PCDGF의 양은 그 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성인지를 가리킨다.
바람직한 생물학적 시료로는 혈액, 뇌척수액, 혈청, 혈장, 소변, 유두 흡입물, 간, 신장, 유방, 뼈, 골수 도말 표본, 고환, 뇌, 난소, 피부 또는 폐를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료의 크기, 형상, 조직종류는 어떤 것이든 무방하며 세포들 및/또는 세포 종류도 여러 가지일 수 있다. 생물학적 시료는 비종양형성성 세포와 종양형성성 세포들을 포함할 수 있다. 비-종양형성성 세포로는 정상적인 조직, 말초조직, 양성 소엽암종, 상피비후증 및 기타 양성 병변으로부터의 기질세포나 상피세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료는 세포나 조직을 함유하는 생물학적 체액을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, GP88/PCDGF 단백질은 항GP88/PCDGF 항체를 이용하는 면역염색 (예컨대, 면역조직화학적 염색), 웨스턴 블롯, 크로마토그래피, 마이크로어레이, 세포 소터 (cell sorter)를 비롯한 모든 적당한 방법에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, 적절한 검출시스템에서 사용할 수 있도록 항 GP88/PCDGF 항체를 표지시키는 것이 좋다 (예컨대 형광 염료, 바이오틴, 효소, 방사능동위원소, 형광 및 화학적 표지). GP88/PCDGF 단백질이나 그의 기능적 유도체의 검출은 또한 여러 가지 진단 영상기법에 의해 수행될 수도 있다. "진단 영상"이라는 용어는 영상 시스템 (예컨대 자기공명영상화, 초음파등)에서 마커 단백질이나 핵산의 검출을 위해 표지된 분자를 사용하는 모든 유형의 질병 진단 기술을 의미한다. 방사능표지된 모노클로날 항체를 이용하는 항체 영상화는 여러 가지 암 (예컨대 결장, 전립선, 폐 및 난소암)을 진단하는데 이용될 수 있다. 진단 영상시스템의 예로는 암 진단을 위해 신체를 스캐닝 또는 영상화하는데 현재 이용되고 있는 OncoScint
Figure pat00008
모노클로날 항체 영상시스템을 들 수 있다. 모노클로날 항체는 생물학적 시료 중에서 GP88/PCDGF을 특이적으로 검출하여 GP88/PCDGF 양성 세포의 총수 또는 GP88/PCDGF의 양을 측정하기 위해 MRI 또는 초음파와 같은 통상적인 스캐닝 기술에서 이용될 수 있다.
GP88/PCDGF 핵산은 항GP88/PCDGF 핵산 (예컨대 GP88/PCDGF cDNA 프로브)을 이용함으로써 여하한 종류의 적절한 검출분석법 (예컨대, in situ 하이브리다이제이션, 형광 in situ 하이브리다이제이션, 역전사효소-폴리머라제 연쇄반응, 노던 블롯, 서던 블롯, 사우스웨스턴 블롯, RNAse 보호분석, 마이크로어레이)에 의해 안티센스 GP88/PCDGF 핵산으로 검출될 수 있다. 바람직하게는, 항GP88/PCDGF 핵산이 예컨대 효소, 방사능 동위원소, 형광 또는 화학적 표지를 이용하여 표지되는 것이 좋다.
GP88/PCDGF 양성 세포는 당업자에게 잘 알려진 여하한 공지방법 (예컨대, 현미경 검사, MRI, 초음파, FACS 분석, 루미넥스 검출, 항체 마이크로어레이, 디지털 스캐너 및 세포 소터 시스템)에 의해 계수될 수 있다. 예컨대, 생물학적 시료 중의 GP88/PCDGF 양성 세포의 수는 Ki-67 인덱스와 유사한 방식으로 GP88/PCDGF 인덱스를 수립함으로써 판정할 수 있다. Ki-67은 조직의 증식속도의 지표가 되는 DNA 폴리머라제 마커이다. Ki-67 양성세포의 수를 측정해서, 계수된 1000개 세포당 Ki-67 양성 염색 세포의 백분율로서 표시한다. 바람직하게는, GP88/PCDGF 에 대해 양성으로 염색된 세포들을 계수하여, 계수된 세포 1000개당 GP88/PCDGF 양성 염색 세포의 백분율로서 표현하는 것이 좋다. 그러나, 여하한 수의 세포도 계수할 수 있다. 예컨대, 환자로부터의 보다 대표적인 세포 시료를 얻기 위해서는 1000개를 초과하는 세포를 계수하는 것이 바람직하다. 1000개 미만의 세포를 계수하는 것은, 시료가 다양한 세포 종류를 대표하는 것으로 나타나서 제한된 양의 시료만 분석에 이용될 수 있을 경우 바람직하다.
대상 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성인지를 판정하는 방법으로서, 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF 염색 강도 및 GP88/PCDGF 존재를 다음과 같이 점수매기는 것이 바람직하다: GP88/PCDGF 양성 세포가 5% 미만인 경우는 음성; GP88/PCDGF 양성 세포가 약 10-25%이면 약한 양성 (1+); GP88/PCDGF 양성 세포가 약 25-50%이면 보통 양성 (+2); 그리고 GP88/PCDGF 양성 세포가 약 50%를 초과하면 강한 양성 (3+)이라고 점수를 매긴다. 각 점수에 대한 GP88/PCDGF 양성 세포 백분율은 생물학적 시료 풀 및/또는 GP88/PCDGF를 동정하는데 이용된 검출 기술 (예컨대, 면역염색, in situ 하이브리다이제이션, 형광 in situ 하이브리다이제이션 (FISH), 역폴리머라제 연쇄반응, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 사우쓰웨스턴 블롯 등)에 따라 재조정할 수 있다. 예컨대, 각 점수마다의 GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포의 백분율은 GP88/PCDGF 검출을 위해 보다 민감한 기술을 사용하거나 보다 큰 생물학적 시료 풀을 사용한 경우에는 하향조정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포 백분율이 적어도 5%, 보다 바람직하게는 10%, 가장 바람직하게는 25%이면 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성적이라고 할 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 에스트로겐 수용체 양성 환자에서 GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포의 백분율이 적어도 약 10%이면 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성적이라고 할 수 있다.
본 발명은 또한 환자로부터 생물학적 시료를 얻고, 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF를 코딩하는 GP88/PCDGF 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 검출한 다음, 시료 중 GP88/PCDGF 양성 또는 염색된 세포 수를 측정하여 주어진 시료 중의 총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포 비율을 구하는 것을 포함하여 이루어지는, 종양형성성 진단 방법도 제공한다. 총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포의 비율은 종양형성성의 지표가 된다. 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF의 검출은 바람직하게는 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성인지를 판정하기 위한 방법에 관한 상기 설명에 따라 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 공지기술인 표준 강도 스케일 기술에 따라 GP88/PCDGF 양성 세포의 백분율에 기초하여 GP88/PCDGF 염색 강도의 점수를 매긴다. 종양형성성을 진단하기 위한 방법으로서, 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF 염색 강도를 다음과 같이 점수 매기는 것이 바람직하다: GP88/PCDGF 염색 세포가 약 1% 미만이면 음성 또는 0으로 친다; GP88/PCDGF 염색 세포가 약 1-5%이면 GP88/PCDGF에 대해 약한 양성 (1+)으로 한다; GP88/PCDGF 염색 세포가 5-25%이면 보통 양성으로 한다(+2); GP88/PCDGF 염색 세포가 약 25%를 초과하면GP88/PCDGF에 대해 강한 양성으로 한다 (+3). 각 점수에 대한 GP88/PCDGF 염색 세포 백분율은 생물학적 시료 풀의 크기 및/또는 GP88/PCDGF를 동정하는데 이용된 검출 기술 (예컨대, 면역염색, in situ 하이브리다이제이션, 형광 in situ 하이브리다이제이션 (FISH), 역폴리머라제 연쇄반응, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 사우쓰웨스턴 블롯 등)에 따라 재조정할 수 있다. 예컨대, 각 점수마다의 염색 세포의 백분율은 GP88/PCDGF 검출을 위해 보다 민감한 기술을 사용하거나 보다 큰 생물학적 시료 풀을 사용한 경우에는 하향조정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따라, GP88/PCDGF 염색 세포 백분율이 약 1% 이상이면 종양형성성이 있다고 할 수 있다.
본 발명은 또한 대상 환자가 항에스트로겐 요법의 항신생조직 효과에 대해 내성이 있는지를 판정하거나 종양형성성을 진단하기 위한 키트에도 관련된다. 본 발명의 바람직한 키트는 용기와 GP88/PCDGF을 검출하기 위한 분자 (예컨대, 항GP88/PCDGF 항체, GP88/PCDGF cDNA 프로브, GP88/PCDGF 올리고머 프로브)를 포함한다. 키트는 또한 생물학적 시료를 in situ 하이브리다이제이션하거나 또는 면역염색시키기 위한 시약도 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키트는 효소-결합 면역분석법 ("ELISA")를 수행하기 위한 시약 (예컨대, 항GP88/PCDGF 항체, 표준 곡선 제작을 위한 컨쥬게이션되거나 되지 않은 재조합 GP88/PCDGF 및 검출용 기질)을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 GP88/PCDGF 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 역폴리머라제 연쇄반응법을 수행하기 위한 시약을 포함하기도 한다.
본 발명은 또한 예컨대 유방암과 같은 암의 치료 또는 예방법을 제공하는데, 이 상법은, 환자로부터 수득한 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF의 양 또는 GP88/PCDGF 양성 세포의 백분율을 측정한 다음, GP88/PCDGF 유방 조직 시료 중 GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포의 백분율이 약 5% 미만일 경우 유방암을 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 타목시펜을 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서는, 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포의 백분율이 약 10% 미만인 경우에는 타목시펜이나 다른 항에스트로겐 제제를 투여한다. GP88/PCDGF 양성 또는 염색 세포의 백분율이 5%를 초과하면, 항GP88/PCDGF 제제 (즉, 항GP88/PCDGF 항체 또는 안티센스 GP88/PCDGF 폴리뉴클레오티드의 사용)를 투여하여 항에스트로겐 제제에 대한 감수성을 복구할 수 있다. 암을 치료 또는 예방하는데 충분한 항에스트로겐의 양은 경우마다 적절히 결정된다. 항에스트로겐 제제 (예컨대, Nolvadex
Figure pat00009
, 랄록시펜, 아로마타제 저해제, 에스트로겐 수용체 다운레귤레이터등)를 환자에게 투여하는 것에 대한 지침은 의사들에게 잘 알려져있다.
본 발명은 또한 환자로부터 얻은 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF의 양을 측정한 다음, 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF의 양이 약 5%를 초과할 경우 암을 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 GP88/PCDGF 안타고니스트를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 암의 재발을 치료 또는 예방하는 방법도 제공한다. GP88/PCDGF 안타고니스트로는 항GP88/PCDGF 항체, 안티센스 GP88/PCDGF 폴리뉴클레오티드, 항GP88/PCDGF 소분자, 항GP88/PCDGF 수용체 항체, 세포독성 분자에 링크된 GP88/PCDGF 안타고니스트를 들 수 있으나 이에 국한되지 않는다. GP88/PCDGF 안타고니스트는 GP88/PCDGF의 생물학적 활성을 간섭함으로써 GP88/PCDGF을 증가된 수준으로 발현하는 세포에서 암을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 환자로부터 얻어진 생물학적 샘풀 중 GP88/PCDGF의 양을 측정하고 생물학적 시료 중 GP88/PCDGF의 양이 약 5%를 초과할 경우 암을 치료 또는 예방하는데 충분한 양으로 GP88/PCDGF 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 환자에 있어서 에스트로겐 둔감 세포의 성장을 억제, 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, GP88/PCDGF의 증가된 수준은 세포 성장을 에스트로겐 민감성에서 에스트로겐 비의존성으로 전환시킨다 (즉, 항에스트로겐 요법에 대한 내성). GP88/PCDGF 안타고니스트는 GP88/PCDGF의 생물학적 활성을 간섭함으로써 에스트로겐 비의존성 세포의 성장을 감소시킨다.
GP88/PCDGF 안타고니스트는 상기한 바 및 본 명세서에 참조된 미국특허 제 6,309,826호에 설명된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다. 한가지 구체예에서, 항GP88/PCDGF 안타고니스트는 항GP88/PCDGF 항체 또는 항체 단편이다. 항GP88/PCDGF 항체 또는 항체 단편은 동물 (예컨대 마우스, 토끼, 개), 인간으로부터 유래하거나 또는 적절한 기술에 의해 인간화될 수 있다. 환자로부터 얻어진 생물학적 시료는 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 유두 흡입물, 뇌척수액, 간, 신장, 유방, 뼈, 뇌, 결장, 폐, 고환 또는 난소 조직으로부터 유도된 물질을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상 환자에게 항에스트로겐 화합물과 GP88/PCDGF 안타고니스트의 컴비네이션을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는, 환자에 있어서, 에스트로겐 비의존성 종양 성장을 억제, 예방 또는 감소시키는 방법도 제공한다. GP88/PCDGF의 증가된 수준은 항에스트로겐 내성을 발달시키는데 기여하기 때문에, 항GP88/PCDGF 안타고니스트와 항에스트로겐의 공동 투여는 항에스트로겐 내성을 감소 또는 예방하고 항에스트로겐 요법의 효능을 증가시켜준다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 환자들은 항에스트로겐 요법에 저항인 종양을 갖는다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 환자들은 항에스트로겐 민감성 종양을 갖는다. 항에스트로겐 요법에 내성을 갖는 종양은 예컨대, 유방, 난소, 신장, 뼈, 췌장, 고환, 간, 뇌, 결장, 폐 및 피부 종양으로부터 유래할 수 있다. 항에스트로겐 요법에 내성인 종양들은 에스트로겐 비의존성 성장을 하고/하거나, GP88/PCDGF의 수준이 증가된 종양들이다. 본 발명은 또한 항에스트로겐 화합물과 GP88/PCDGF 안타고니스트를 포함하여 이루어지는, 환자에 있어서 에스트로겐 비의존성 종양의 성장을 억제, 예방 또는 감소시키기 위한 조성물도 제공한다.
전술한 바와 같은 치료적 구체예에서처럼, 항에스트로겐 치료제의 예로는 타목시펜, Nolvadex
Figure pat00010
, 랄록시펜, 아로마타제 저해제, 에스트로겐 수용체 안타고니스트를 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, GP88/PCDGF 안타고니스트의 예로는 항GP88/PCDGF 항체, 안티센스 GP88/PCDGF 폴리뉴클레오티드, 항GP88/PCDGF 소분자, 항GP88/PCDGF 수용체 항체 및 세포독성 분자에 링크된 GP88/PCDGF 안타고니스트를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. GP88/PCDGF 안타고니스트는 상기한 바 및 본 명세서에 참조된 미국특허 제 6,309,826호에 설명된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다. 항에스트로겐 치료제를 환자에게 투여하는 것과 관련된 지침은 의사들에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 내용을 특정 문제나 조건에 적용하는 것은 본 명세서에 내용에 비추어 당업자의 재량에 따라 이루어질 것이다. 본 발명을 다음의 비제한적인 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은, 환자로부터 얻은 세포를 함유하는 생물학적 시료를 항-GP88/PCDGF 항체 또는 그 단편과 접촉시키는 단계와, 총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 세포들의 비율을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 시료의 GP88/PCDGF 존재 비율이 5%를 초과하면 종양성(tumorigenicity)임을 가리키는 것인, GP88/PCDGF-관련 종양성을 진단하기 위한 정보를 얻기 위한 GP88/PCDGF의 생체 외(ex vivo) 검출 방법을 제공한다.
도 1A는 1246, 1246-3A 및 PC 세포주에서의 GP88/PCDGF 단백질의 발현 수준을 비교한 도면이다. 2% 소의 태아 혈청 (FBS)이 보강된 DME-F12 배지에서 세포들을 배양하였다. 면역침전법과 항K19T 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 GP88/PCDGF 발현 수준을 측정하였다.
도 1B는 1246, 1246-3A 및 PC 세포주에서의 GP88/PCDGF mRNA의 발현 수준을 비교한 도면이다. RPL32에 대한 mRNA를 RNA 로딩을 위한 동량의 내부 대조군으로서 이용한다.
도 1C는 무혈청 배지와 혈청 함유 배지 중에서 1246 세포 (왼쪽 패널)와 PC 세포 (오른쪽 패널)에서의 GP88/PCDGF mRNA 발현을 비교한 것이다. 그 결과 1246 세포에서의 GP88/PCDGF 발현은 소의 태아 혈청 첨가에 의해 억제된 반면, 고도로 종양형성성인 PC 세포에서는 이러한 억제가 관찰되지 않은 것으로 나타났다.
도 2는 항GP88/PCDGF 중화 항체의 농도 증가에 따른 고도로 종양형성성인 PC 세포의 치료 효과를 도시한 도면이다.
도 3은 106개의 안티센스 GP88/PCDGF 트랜스펙션된 PC 세포 (아래)과 대조군 PC 세포로 트랜스펙션된 텅빈 벡터 (위)로 피하주사된 C3H 마우스를 도시한 것이다.
도 4는 C3H 마우스 종양 조직 및 정상적인 주변 조직에서의 in vivo GP88/PCDGF 발현 수준을 도시한 것이다.
도 5는 에스트로겐 수용체 양성 및 에스트로겐 수용체 음성 인간 유선 암종 세포주에서의 GP88/PCDGF mRNA 발현 수준을 도시한 것이다.
도 6은 GP88/PCDGF의 농도 증가가 마우스 유선 상피세포주 C57의 성장에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 7은 안티센스 방향 (antisense orientation)으로 GP88/PCDGF을 함유하는 시토메갈로바이러스 프로모터 조절된 발현 벡터에 의해 트랜스펙션된 PC 세포와 텅빈 벡터에 의해 트랜스펙션된 PC 세포의 성장 특성 및 종양형성 능력을 도시한 것이다.
도 8은 마우스의 GP88/PCDGF의 뉴클레오타이드와 연역된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 항GP88/PCDGF 항체 K19T 및 S14R을 일으키기 위해 항원으로서 사용된 펩타이드 대역에 밑줄 표시하였다. pCMV4 포유류 발현 벡터 중 안티센스 방향으로 클로닝된 대역은 괄호안에 나타내었다.
도 9A는 인간의 GP88/PCDGF cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 괄호 사이에 표시된 것들은 pcDNA3 포유류 발현계 내로 안티센스 방향으로 클로닝된 대역이다.
도 9B는 인간의 GP88/PCDGF의 연역된 아미노산 서열을 나타낸다. 항인간 GP88/PCDGF 중화 항체를 개발하기 위해 항원으로서 사용된 E19V 대역에 밑줄 표시했다. 이것은 마우스의 S14R 대역과 동등한 대역인 A14R도 가리킨다.
도 10은 그래뉼린 g, f, B, A, C, D 및 e (우측)으로 정의된 7과 1/2의 반복을 나타내도록 정렬된 마우스 GP88/PCDGF의 아미노산 서열을 도시한다. 이것은 항GP88/PCDGF 중화 항체를 발달시키기 위한 GP88/PCDGF 항체를 일으키는데 사용된 대역 K19T와 S14R이 변이체 대역으로 여겨지는 두개의 에피쎌린/그래뉼린 반복체 사이에서 발견된 것임을 보여준다. 우측에 표시된 것은 Bateman 등 (6)에 따른 반복체의 그래뉼린 분류이다. 그래뉼린 B와 그래뉼린 A는 Plowman 등의 1992 (5)에서는 각각 에피쎌린 2와 에피쎌린 1로 정의되어 있기도 하다.
도 11은 GP88/PCDGF 안티센스 cDNA를 발현 벡터 내로 클로닝시키는데 사용된 제한효소 부위를 나타내는 GP88/PCDGF cDNA 클론 및 pCMV4를 개략적으로 도시한 것이다.
도 12는 CCL-64 세포 상의 GP88/PCDGF 세포 표면 수용체에 대한 125I-rGP88/PCDGF의 가교를 도시한 것이다. 디석신이미딜 수베레이트 (DSS: disuccinimidyl suberate)와의 가교반응을 수행하였다. 반응 생성물을 7% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE로 분석하였다.
도 13은 3T3 섬유아세포, PC 세포 및 C57Mg 유선 상피세포상의 GP88/PCDGF 세포 표면 수용체에 대한 125I-rGP88/PCDGF의 가교를 도시한 것이다. 그 결과 이들 여러가지 세포주들은 CCL64 세포 (도 12) 상의 GP88/PCDGF 세포 표면 수용체의 분자량과 유사한 분자량을 갖는 GP88/PCDGF 세포 표면 수용체를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
도 14는 비-종양형성성 MCF 10A와 악성 (MCF7, MDA-MB-468) 인간 유선 상피 세포에서의 GP88/PCDGF 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 15는 인간의 유방암종, 에스트로겐 수용체 음성 MDA-MB-468 세포에서의 안티센스 GP88/PCDGF cDNA 트랜스펙션에 의해 GP88/PCDGF 발현이 저해됨을 보여준다.
도 16은 MCF-7 세포의 증식에 미치는 GP88/PCDGF의 효과를 도시한다. 도 16(A)는 17β-에스트라디올 (E2) 부재시 MCF-7 세포의 DNA 합성을 자극하는 GP88/PCDGF를 나타낸다. 도 16B는 E2 세포유사분열 효과를 특이적으로 저해하는 항GP88/PCDGF 항체를 도시한다. 이들 결과는 3회 측정치의 평균 ±SD로서 나타내었다.
도 17은 E2 세포유사분열 효과에 미치는 GP88/PCDGF 발현 억제 효과를 도시한 것이다. 도 17(A)는 MCF-7 세포에 있어서 안티센스 GP88/PCDGF cDNA 트랜스펙션에 의한 GP88/PCDGF 발현 억제를 도시한다. 도 17(B)는 MCF-7 세포에 있어서 GP88/PCDGF 발현 억제가 E2 세포유사분열 효과를 저해함을 도시한다.
도 18은 MCF-7에서의 GP88/PCDGF의 과발현이 E2 부재시 증식할 수 있고 타목시펜에 대해 내성을 갖는 세포를 야기시킬 수 있음을 보여준다. 도 18(A)는 O4 세포와 대조군 MCF-7C 세포에서의 GP88/PCDGF의 발현을 보여준다. 도 18(B)는 에스트로겐-결핍 PFMEM 배지에서의 O4 및 MCF-7 세포의 증식을 나타낸다. 도 18(C)는 MCF-7과 O4 세포의 타목시펜에 대한 응답을 비교한 것이다. 그 결과를 평균치 ±SD로서 나타내었다.
도 19는 MCF-7 세포에 있어서 GP88/PCDGF 시그널링 경로의 측정을 도시한다. 도 19(A)는 GP88/PCDGF의 세포유사분열 효과에 미치는 MAP 키나아제 저해제의 효과를 도시한다. 도 19(B)는 GP88/PCDGF에 의한 MAP 키나아제의 활성을 도시한다.
도 20은 MCF-7 세포에 있어서 사이클린 D1과 c-myc의 발현에 미치는 GP88/PCDGF의 효과를 도시한다. 도 20(A)는 GP88/PCDGF에 의한 사이클린 D1 발현의 촉진을 나타낸다. 도 20(B)는 c-myc 발현에 미치는 E2와 GP88/PCDGF의 효과를 도시한다.
도 21은 면역조직화학법 (IHC)에 의한 파라핀 포매 (paraffin embedded) 유방암 생검재료에 대한 항GP88/PCDGF 항체의 GP88/PCDGF 염색 강도를 나타낸다.
도 22는 도관성 침윤암종 (IDC: Invasive Ductal Carinoma) 종양에 있어서 에스트로겐 수용체 상태와 GP88/PCDGF 염색 강도 사이의 상관관계를 도시한다.
도 23은 GP88/PCDGF 염색 강도와 ER+ IDC 종양의 타목시펜 응답성 간의 상관관계를 도시한다. GP88/PCDGF 염색 강도가 증가할수록, 에스트로겐 수용체 양성 종양들은 항에스트로겐 요법에 대한 내성이 더 커진다.
실시예 1
PC -세포 유도된 성장 인자 GP88 / PCDGF 에 의한 인간 유방암 MCF -7 세포에 있어서의 에스트로겐 세포유사분열 효과의 매개.
에스트로겐-수용체 양성 세포에서 에스트로겐 대체 화합물인 17-β-에스트라디올 (E2)은 투여량 및 시간 의존적 방식으로 GP88/PCDGF 발현을 전사적으로 자극하였다. 본 발명자들은 여기서 MCF-7 세포에서 GP88/PCDGF가 에스트라디올 (E2)의 세포유사분열 효과를 매개함을 입증한다. GP88/PCDGF는 E2를 대체하여 DNA 합성을 자극한다. E2 세포유사분열 효과는 항GP88/PCDGF 중화 항체에 의해 투여량 의존 방식으로 저해되었다. 안티센스 트랜스펙션에 의한 MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF 발현 억제 역시 E2 세포유사분열효과를 억제하였다. 이와 대조적으로, MCF-7 세포에 있어서의 GP88/PCDGF의 과발현은 에스트로겐 부재하에서 증식할 수 있고 타목시펜 내성인 세포들을 야기시켰다. E2와 마찬가지로, GP88/PCDGF는 세포유사분열 활성화된 단백질 키나아제 활성을 자극하였다. GP88/PCDGF는 사이클린 D1 발현을 자극하는데 있어 E2를 대신할 수 있다. E2에 의한 사이클린 D1 자극은 항GP88/PCDGF 항체에 의해 50% 저해되었다. 이와 대조적으로, GP88/PCDGF는 c-myc 발현, 즉 E2의 또 다른 분자 표적을 자극하지 않았다. 본 발명자들은 자분비성 GP88/PCDGF가 사이클린 D1의 자극을 통해 E2 세포유사분열 효과를 매개한다고 결론지었다.
GP88/PCDGF 발현을 위한 인간 종양세포주의 스크리닝 결과 이것이 에스트로겐 수용체 음성 (ER-) 인간 유방암종에서 고도로 발현되는 것으로 나타났다. 안티센스 GP88/PCDGF cDNA 트랜스펙션에 의한 이들 세포에서의 GP88/PCDGF 발현 억제는 누드 마우스에 주입시 종양 크기와 종양 발현을 90% 억제하였다. 이러한 데이터는 종양 표현형의 유지에 있어서 GP88/PCDGF를 암시하는 것이다. 상기한 바와 같이, ER+ 세포에서, 에스트로겐 수용체 자극에 응답하여 생산된 GP88/PCDGF는 E2 세포유사분열 활성을 매개한다. GP88/PCDGF가 과발현되면, 이 세포들은 에스트로겐 비의존성이되어 항에스트로겐의 항신생조직 효과에 대해 내성적으로 된다.
결과
GP88/PCDGF는 에스트로겐 부재시 MCF -7 세포의 DNA 합성을 자극한다.
본 발명자들은 우선, GP88/PCDGF의 부가가 E2 부재시 유지되는 MCF-7세포의 DNA 합성을 자극하는지 여부를 조사하였다. 이 조건하에서, GP88/PCDGF의 내인성 생산을 매우 느렸다. 대조군의 경우 (E2와 GP88/PCDGF 부재하에 유지된 세포들) 10 ng/ml의 GP88/PCDGF에서 3H-티미딘 인코포레이션이 2배 증가한 것으로 관찰되었다 (도 16A). 도 16A는 E2 부재시 MCF-7의 DNA 합성을 GP88/PCDGF가 자극함을 도시한다. MCF-7 세포 (웰 당 105개 세포)를 DMEM과 Ham's F-12배지 플러스 5% FBS의 1:1 혼합물에 플레이팅하였다. 48시간 후, 배지를 PFMEM으로 갈아주고 24시간 후에는 무혈청 α-MEM 배지로 교체시켰다. 인간 GP88/PCDGF의 농도를 증가시켜가면서 배지에 3회 첨가하였다. 음성 및 양성 대조군으로서는 각각 EtOH 단독 (CON) 또는 10-9 M E2 (E2)를 이용하였다. 3H-티미딘 (1μCi/ml)을 24시간 후 5시간 동안 첨가하였다. 그 결과를 3회 측정치의 평균치 ±SD로서 나타내었다. 10-9M E2에 대해 관찰된 것과 유사하게, 4배 최대 자극이 100 ng/ml GP88/PCDGF (P<0.001)에서 관찰되었다. GP88/PCDGF는 또 다른 ER+ 세포주인 T47D의 DNA 합성을 자극하였다. 100 ng/ml GP88/PCDGF의 경우 2.9 ±0.3배의 DNA합성 자극이 관찰되었다.
E2 세포유사분열 효과는 세포를 항GP88/PCDGF 항체로 처리함으로써 억제된다. 이러한 결과와 E2가 MCF-7 세포에 있어서 GP88/PCDGF의 발현을 자극한다는 것에 기초하여, 본 발명자들은 내인성 GP88/PCDGF가 자분비성 루프를 통해 E2 세포유사분열 효과를 매개할 수 있는지를 측정하였다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 우선 MCF-7 세포에 의해 생산되는 GP88/PCDGF를 차단하는 항GP88/PCDGF 항체에 의한 처리가 E2 세포유사분열 활성을 억제할지를 시험하였다. 친화성-정제된 항인간 GP88/PCDGF 항체의 부가는 E2에 의해 자극된 세포의 성장을 투여량-의존 방식으로 억제하였다 (도 16B). 도 16B는 항GP88/PCDGF 항체가 E2 세포유사분열 효과를 특이적으로 저해함을 보여준다. MCF-7 세포를 10-9M E2 (E2) 단독으로 또는 친화성-정제된 항GP88/PCDGF 항체의 농도를 증가시켜가면서, 즉 50 μg/ml (Ab1), 100 μg/ml (Ab2), 200 μg/ml (Ab3) 및 300 μg/ml (Ab4)로 처리하였다. 10-9M E2와 300 μg/ml 예비면역 IgG (preIgG)로 처리된 세포들, 그리고 10ng/ml의 IGF-II (IGF) 단독으로 또는 300 μg/ml 항GP88/PCDGF 항체 (Ab+IGF)의 존재하에 처리된 세포들을 대조군으로서 사용하였다. 그 결과를 3회 측정치의 평균치 ±SD로 표시하였다. 300 μg/ml의 항GP88/PCDGF 항체의 경우 E2 세포유사분열 효과의 74% 억제가 관찰된 반면 (P<0.003), 유사한 농도의 비-면역 IgG는 아무 효과가 없었다. 이 항체 농도는 전혀 세포독성을 나타내지 않았다. GP88/PCDGF (200 ng/ml)를 첨가하자 항GP88/PCDGF 항체로 처리된 세포의 증식이 복구되었다. GP88/PCDGF 항체 효과의 특이성도 입증되었는데, 이는, 이것이 MCF-7 세포의 공지 성장자극제인 인슐린-유사 성장 인자-II의 자극효과를 억제할 수 있었기 때문이다. 이러한 결과는 GP88/PCDGF가 자분비 성장 인자로서 작용하여 MCF-7 세포에 있어서 E2의 세포유사분열효과를 매개함을 보여준다.
GP88/PCDGF 발현 억제는 E2의 존재 하에 MCF-7 세포의 성장을 억제한다. 본 발명자들은 다음으로 MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF 발현 억제가 과연 E2의 성장자극효과를 예방할지를 조사하였다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 GP88/PCDGF 발현이 안티센스 GP88/PCDGF cDNA 트랜스펙션에 의해 억제된 MCF-7 세포에 있어서의 E2 세포유사분열 효과를 시험하였다. 같은 수의 세포를 이용하여 준비된 시료를 웨스턴 블롯 분석함으로써, 두가지 대표적인 안티센스 클론인 As13과 As22 및 텅빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 MCF-7 세포 (MCF-7C)에 있어서 GP88/PCDGF 수준을 측정하였다 (도 17A). 도 17A는 MCF-7 세포에 있어서 안티센스 GP88/PCDGF cDNA 트랜스펙션에 의한 GP88/PCDGF 발현 억제를 도시한다. 안티센스 (As13 및 As22) 및 텅빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포 (MCF7-C) 내에서의 GP88/PCDGF 발현을 웨스턴 블롯 분석법으로 시험하였다. AS13 (레인 1), AS22 (레인 2) 및 MCF-7C 세포 (레인 3)을 PFMEM 중 10-9M E2로 처리하였다. 24시간 후에 조건 배지를 수거하여 GP88/PCDGF 발현 측정을 위해 같은 세포수 (4 x 106 세포)로 정상화시켰다. MCF-7C 세포들과 비교할 때, As13 세포들은 GP88/PCDGF 발현을 80% 억제한 반면, As22는 50% 억제하였다.
이어서, DNA 합성에 미치는 E2의 효과를 이들 안티센스 및 대조군 MCF-7C 세포에서 조사하였다. [-3H] 티미딘 인코포레이션 분석 결과 MCF-7C 세포에 있어서의 E2 자극 효과는 GP88/PCDGF 발현의 억제정도와 관련하여 AS13과 AS22에서 감소된 것으로 나타났다 (도 17B). 도 17B는 MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF 발현 억제가 E2 세포유사분열 활성을 억제함을 도시한다. E2 세포유사분열 효과를 안티센스 및 대조군 MCF-7C 세포에서 시험하였다. AS13 (색칠된 막대), AS22 (빗금친 막대) 및 MCF-7C 세포 (색칠되지 않은 막대)를 10-9M E2 (E2), 100 ng/ml 재조합 GP88/PCDGF 또는 0.1% EtOH 단독 (대조군)으로 처리하였다. 전술한 바와 같이 3H-티미딘 인코포레이션을 측정하였다. 도면에서 그 결과를 평균치 ±SD로 나타내었다. AS13은 E2 효과를 가장 많이 억제한 것으로 나타났다. E2에 의해 매개된 DNA 합성은 MCF-7C 세포에서 관찰된 것에 비해 단지 As13에서는 25% (P<0.001), AS22에서는 60% (P<0.001)인 것으로 나타났다. GP88/PCDGF의 부가는 안티센스 클론의 증식을 E2 존재하에 배양된 대조군 MCF-7 세포에서 발견되는 수준까지 복구시켰다.
GP88/PCDGF의 과발현은 에스트로겐- 비의존성 및 타목시펜 내성을 야기시킨다.
상기 결과에 기초해서, 본 발명자들은 ER+ MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF의 구조적 과발현이 그의 에스트로겐 및 타목시펜 응답성에 미치는 효과를 조사하였다. 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 GP88/PCDGF cDNA를 함유하는 pcDNA3 발현 벡터를 이용하여 MCF-7 세포들을 트랜스펙션시켰다. O4라고 명명된 대표적인 클론을 비롯하여 몇몇 GP88/PCDGF 과발현 클론들이 수득되었다. 도 18A는 O4 세포들이, E2-결핍 배지 중에서 대조군인 MCF-7C 세포에 비해 GP88/PCDGF를 증가된 수준으로 생산함을 보여준다. 도 18A는 O4 세포와 대조군 MCF-7C 세포에서의 GP88/PCDGF 발현을 도시한다. O4와 텅빈 벡터 대조군 MCF-7 세포를 PFMEM에서 배양하였다. 조건 배지를 24시간 후에 수거하여 GP88/PCDGF 발현을 측정하였다.
O4 세포중의 티미딘 인코포레이션은 MCF-7C 세포에 비해 2.2배 더 높았으며 (P<0.01), 이는 O4 세포가 E2 부재하에서도 증식할 수 있음을 입증하는 것이다 (도 18B). 도 18B는 에스트로겐-결핍 PFMEM 배지에서 O4 및 대조군 MCF-7 세포의 증식을 나타낸다. 세포들을 에스트로겐-결핍 PFMEM 배지에 3회 플레이트시켰다. 세포들을 E2 부재하에 (대조군: Con) 유지시키거나 또는 24시간 동안 10-9M E2 또는 200 ng/ml GP88/PCDGF로 처리하였다. 이어서, 3H-티미딘을 첨가하여 DNA 합성을 측정하였다. 그 결과를 평균치 ±SD로 표시하였다. 뿐만 아니라, E2-결핍 배지에서의 O4세포의 경우와 GP88/PCDGF나 또는 E2로 처리된 MCF-7C 세포에 있어서의 티미딘 인코포레이션간에는 이렇다할 유의적인 차이가 없었다 (P>0.05). E2나 GP88/PCDGF를 O4 세포에 부가하는 것은 MCF-7C 세포에 비해 어떠한 유의적인 부가효과도 갖지 않았다. 장기간의 성장 분석시, MCF-7C 세포들은 E2 부재하에 성장하지 못한 반면, O4 세포들은 42시간만에 2배로 증식하여 E2 존재시 MCF-7C 세포가 36시간만에 두배로 증식한 것에 육박하였다. 이러한 데이터는 GP88/PCDGF 과발현이 E2 부재시 성장에 유리하다는 것을 가리키는 것이다.
이러한 결과에 기초해서, O4와 MCF-7C 세포들의 타목시펜-응답성을 조사하였다. 도 18C는 MCF-7과 O4 세포들의 타목시펜에 대한 응답성을 비교한 것이다. MCF-7C 세포 (색칠된 막대)와 O4 세포 (색칠되지 않은 막대)에게 10-9M E2를 단독으로 첨가하거나 또는 타목시펜의 농도를 증가시키면서 첨가하였다. 200 ng/ml의 인간 GP88/PCDGF 및 1 μM 타목시펜 (T+P)로 처리된 MCF-7 C 세포들도 시험하였다. 도 16에 대해 설명된 것처럼 DNA 합성을 측정하였다. 그 결과를 E2 단독으로 처리시킨 세포에서 DNA합성치의 백분율로서 표시하였다. 타목시펜은 MCF-7C 세포의 증식을 투여량-의존 방식으로 억제하였는데, 100 nM 타목시펜에서는 E2 효과를 60% 저해, 500 nM 타목시펜에서는 80% 저해, 1μM 타목시펜에서는 최대 90% 저해하였다 (도 18C). 이와 대조적으로, O4 세포들은 그의 증식이 100nM 타목시펜에 의해서는 전혀 영향을 받지 않은 반면, 500 nM 및 1μM 타목시펜에서는 E2 효과가 각각 20%와 55% 저해되는 것으로 나타나는 바와 같이, 타목시펜에 대해 현저하게 감소된 응답성을 나타내었다 (P<0.001). 흥미롭게도, MCF-7 세포에 GP88/PCDGF를 첨가하자 타목시펜 억제가 90%에서 38%로 감소되었다 (P<0.0001). 이러한 데이터는 GP88/PCDGF가 타목시펜 억제를 극복함과 MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF의 증가된 발현이 타목시펜 내성으로 이어짐을 보여주는 것이다.
예컨대 에스트로겐 수용체 발현, 에스트로겐 응답 요소의 E2에 의한 활성화 및 E2에 의한 프로게스테론 수용체 mRNA 발현의 자극과 같은, 에스트로겐 응답성과 관련된 다른 변수들의 상태를 트랜스펙션된 모든 세포에서 평가하였다. 안티센스, 대조군 및 GP88/PCDGF 과발현 세포들간의 이들 분석결과는 아무런 차이가 없었다 (데이터 나타내지 않음). 이러한 데이터는 안티센스 또는 과발현 세포에서 관찰된 E2 증식 응답의 변화가 ER 수나 기능의 전체적인 변화에 기인하는 것이라기 보다, GP88/PCDGF 발현 변화와 상관이 있음을 가리키는 것이다.
GP88/PCDGF는 세포유사분혈 활성화 단백질 키나제 (" MAP 키나제 : Mitogen Activating Protein Kinase) 경로를 통해, MCF-7 세포에서 DNA 합성을 자극한다.
다음으로, 본 발명자들은 E2와 비교하여, MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF에 의해 자극된 시그널 형질유도 경로를 시험하였다. E2는 세포 사이클 중 G1 페이즈를 통해 이러한 진전을 자극하는 것으로 나타났다. 기저의 몇몇 분자 표적이 조명되었다. E2는 MCF-7 세포에서 MAP 키나제 활성을 자극하는 것으로 알려졌다. 다운스트림, E2는 c-myc 경로와 D-형 사이클린/cdk 복합체를 활성화시킨다. 최근의 연구결과 c-myc와 사이클린 D1 경로는 유방암 세포에서 E2에 의해 독립적으로 활성화되는 것으로 추정되었다. 따라서, 본 발명자들은 GP88/PCDGF가 MCF-7 세포에서의 MAP 키나제, 사이클린 D1 및/또는 c-myc 경로를 E2를 대신하여 자극할 수 있는지를 조사하려고 하였다.
두가지 접근법이 MCF-7 세포에서의 GP88/PCDGF 활성의 매개에서의 MAR 키나제의 관련성을 보여주었다. 첫번째, DNA 합성에 미치는 GP88/PCDGF의 자극 효과는 투여량 의존 방식으로 MEK 저해제인 PD098059에 의해 저해되었다 (도 19A). 도 19A는 GP88/PCDGF의 세포유사분열 효과에 미치는 MAP키나제 억제제의 효과를 도시한다. MCF-7 세포들을 도 16에 설명된 바와 같이 배양하였다. 담체만 (대조군) 또는 100 ng/ml의 재조합 인간 GP88/PCDGF 단독 (P)만을 첨가하기에 앞서, 세포들을 10 μM (PD10) 또는 30 μM (PD30)의 PD098059로 60분간 전처리시켰다. 티미딘 인코포레이션 데이터를 평균치 ±SD로서 표시하였다. GP88/PCDGF 효과는 10 μM PD098059에 의해 거의 완전하게 회피되었다. 30 μM PD098059의 경우 완전한 저해가 관찰되었는데, 이 농도는 다른 계에서 MAP 키나제 활성을 완전히 저해한 것으로 알려졌다. 두번째로는, in vitro MAP 키나제 분석을 이용함으로써, 본 발명자들은 GP88/PCDGF (200ng/ml)가 MCF-7 세포에서의 MAP 키나제 활성을 3배 억제시킴을 입증하였다 (도 19B). 이 효과는 PD098059 (30μM)에 의해 회피되었다. 도 19B는 GP88/PCDGF에 의한 MAP 키나제의 활성화를 도시한다. 세포들을 24시간 동안 PFMEM 배지에서 배양한 다음 무혈청 α-MEM 배지에서 배양하였다. 시험된 시료들은 다음과 같았다: 0, 50 ng/ml 및 200 ng/ml의 인간 GP88/PCDGF로 10분간 처리된 MCF-7 세포들 (각각 레인 1-3); 200 ng/ml의 GP88/PCDGF와 30 μM PD098059로 10분간 처리된 MCF-7 세포들 (레인 4). 키나제 분석을 설명된 바와 같이 수행하였다. 포스포릴화 MBP 밴드의 강도를 덴시토미터 스캐닝에 의해 분석하였다. MAP 키나제 활성을 정상화하기 위한 내부 대조군으로서 MAP 키나제 (Erk1 및 Erk2)의 발현을 검토하는데 본래의 상등액과 같은 양을 이용하였다.
GP88/PCDGF는 MCF -7 세포에서 사이클린 D1 발현은 자극하지만 c- myc 발현은 자극하지 않는다.
사이클린 D1 발현에 미치는 GP88/PCDGF의 효과를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. GP88/PCDGF는 시간 의존적 방식으로 MCF-7 세포에서의 사이클린 D1 발현을 자극하여 5시간 후 미처리 대조군에 비해 최대 4배가 되었다 (도 20A). 사이클린 D1 자극 효과는 GP88/PCDGF 세포유사분열 효과의 억제의 경우와 동일한 방식으로 PD98095에 의해 회피되었다. 도 20A는 GP88/PCDGF에 의한 사이클린 D1 발현 촉진을 도시한다. MCF-7 세포들을 PFMEM 배지에서 3회 배양하고 1 μM 타목시펜으로 처리함으로써 싱크로나이즈시켰다. 200 ng/ml의 GP88/PCDGF이 단독으로 또는 30 μM PD98095와 함께 (윗쪽) 보강된 신선한 배지 또는 10-9M E2 (아래쪽)이 보강된 신선한 배지로 배지를 갈아주었다. 지정된 시간에 세포들을 용해시켜 항사이클린 D1 항체를 이용함으로써 60 μg의 총세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯 분석법으로 사이클린 D1 발현을 측정하였다. 시료들은 제 0시 (레인 1), 제 3시 (레인 2), 제 5시 (레인 3) 및 제 12시 (레인 4)에서 200 ng/ml GP88/PCDGF로 처리된 MCF-7 세포들; 제 5시 (레인 5)에 미처리 MCF-7 세포들; 제 5시 (레인 6)에 200 ng/ml GP88/PCDGF 및 PD08950으로 처리된 MCF-7 세포들; 및 제 0시, 제 3시 및 제 5시 (각각 레인 7-9)에 10-9M E2로 처리된 MCF-7 세포들이었다.
GP88/PCDGF에 의한 사이클린 D1 발현의 자극은 G1 페이즈 진행에 요구되는 pRb의 포스포릴화 및 발현의 증가를 엄격하게 수반하였다. GP88/PCDGF 처리 6시간 후, pRb는 과포스포릴화되었다. 24시간 후, 모든 pRb는 미처리 세포에 비해 단백질 발현이 5배 증가된 과-포스포릴화된 형태였다. 이 효과는 PD98095에 의해서도 차단되었다 (데이터 나타내지 않음).
이어서 본 발명자들은 MCF-7 세포에 있어서 에스트로겐 활성의 또 다른 표적인 c-myc 발현을 자극하는 E2와 GP88/PCDGF의 능력을 비교하였다. 도 20B에 도시된 바와 같이, E2 (10-9M)은 스테로이드-결핍 MCF-7 세포에 있어서의 c-myc 발현을 신속히 증가-자극시켜, 3시간만에 최대 4배까지 유도시켰다. E2에 의한 c-myc 유도 수준은 10시간도 넘게 지속되었다. 이와 대조적으로, GP88/PCDGF는 동일기간 동안, c-myc 단백질 발현에 대해 아무런 영향도 미치지 않았다 (도 20B). 도 20B는 c-myc 발현에 미치는 E2와 GP88/PCDGF의 효과를 도시한다. MCF-7 세포를 1 μM 타목시펜으로 처리함으로써 싱크로나이즈시켰다. 이어서 세포들을 소정 기간동안 10-9M E2 (윗쪽) 또는 200 ng/mlGP88/PCDGF (아랫쪽)으로 처리하였다. 60 μg의 총 세포 용해물과 항myc 폴리클로날 항체를 이용하여 c-myc 발현의 웨스턴 블롯 검출을 수행하였다.
GP88/PCDGF는 c-myc 발현을 유도하는 것이 아니라 사이클린 D1 발현을 유도하기 때문에, 본 발명자들은 내인성 GP88/PCDGF의 증가가 사이클린 D1 발현을 자극하는 E2의 능력과 관련있는지를 알아보고자 조사하였다. MCF-7 세포를 항GP88/PCDGF 중화 항체 (300 μg/ml)로 처리하자, 항체 처리 5시간 후에, E2에 의한 사이클린 D1의 자극이 52 ±8% 억제되었다. 이러한 억제정도는 항체 부가 후 12시간 동안 지속되었다. 이러한 데이터는 MCF-7 세포에서 사이클린 D1을 자극하는 E2의 능력이 적어도 부분적으로는, 내인적으로 생산된 GP88/PCDGF에 의해 매개됨을 가리키는 것이다.
토론
본 발명자들은 앞서 ER+ 인간 유선암종 세포가 GP88/PCDGF를 발현함과 E2가 GP88/PCDGF의 발현을 투여량 및 시간 의존적 방식으로 자극한다는 것을 보고한 바 있다. 본 발명자들은 여기서 GP88/PCDGF가 E2의 성장자극효과를 매개함을 입증하고자 한다. 본 발명자들은 GP88/PCDGF가 E2 부재하에 유지된 인간 유방암 세포 MCF-7과 T47D의 증식을 촉진함을 증명한다. 본 발명자들은 다음에는 항GP88/PCDGF 항체를 이용하여 GP88/PCDGF 자분비 경로를 차단하면 E2의 세포유사분열 효과가 억제됨을 보여줄 것이다. 이 효과는 이 항체가 IGF-II 세포유사분열 효과를 저해하지 못하기 때문에 GP88/PCDGF에 특이적인 것이다. E2의 세포유사분열 효과에 있어서 GP88/PCDGF의 개입은 안티센스 cDNA 트랜스펙션에 의한 GP88/PCDGF 발현 억제가 GP88/PCDGF 발현 억제 정도와 연관적으로 MCF-7 세포에 대한 E2의 세포유사분열 효과를 감소시킨다는 것을 나타냄으로써 더욱 입증되었다. 외인성 GP88/PCDGF의 부가는 이들 안티센스 세포들의 증식을 복구하였다. 이에 더해, MCF-7 세포에서 GP88/PCDGF의 증가된 발현은 E2 부재시 증식할 수 있고 타목시펜 내성인 세포들을 유도시켰다. ER 발현, 에스트로겐-응답성 성분-루시페라제 리포터 유전자의 활성화, 또는 프로게스테론 수용체 발현의 자극과 같은 E2 응답성의 다른 변수들의 변화가 없다는 사실은, 형질전환된 세포에서의 E2 세포유사분열 효과가 E2 수용체의 변화에 기인하는 것이 아니라, GP88/PCDGF 발현의 변화에 특이적으로 기인한다는 것을 나타내고 있다.
본 발명자들의 결과는 GP88/PCDGF가 사이클린 D1을 업레귤레이션하여 인간 유방암 세포에서 E2의 세포유사분열 효과를 매개한다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 가정을 뒷받침하는 것으로서, E2 억제된 사이클린 D1발현 자극은 항GP88/PCDGF 중화 항체를 이용하여 MCF-7 세포를 처리한지 5-12시간 이내에 52%까지 억제되었다. 결론적으로, 전술한 연구결과는 GP88/PCDGF를 적어도 부분적으로는 인간 유방암 세포주 MCF-7에 있어서 E2의 세포유사분열 효과의 신규한 메디에이터로서 자리매김해주는 것이다.
실시예 2
타목시펜 내성의 측정.
본 발명자들은 ER 음성 유방암 세포에 있어서 안티센스 cDNA 트랜스펙션에 의한 GP88/PCDGF의 발현 억제가 종양형성성의 억제를 야기시킨다는 것을 보여주었으며, 이는, 유방암 세포의 종양형성 특성에 있어서 GP88/PCDGF 과발현의 중요성을 가리키는 것이다. 유방암은 특성상 이종적(異種的)이고 글랜드의 다양한 세포성 기능 컴파트먼트에 영향을 미치기 때문에, GP88/PCDGF의 발현을 위한 진전 모델의 다양한 단계를 대표하는 생검재료를 조사하는 것이 바람직하다. 종양 마커를 검출하는 것이 진단 또는 주요 치료시 유방암의 임상적 경과를 평가 및 예측하기 위한 바람직한 접근법이고 치료법을 선택하는데 있어서도 중요한 것으로 나타났다. 이러한 연구는 여성 건강과 직결되는데, 이는 이러한 연구결과가 유방암의 잠재적인 예후적 마커로서 신규한 성장 인자 GP88/PCDGF의 분석법을 제공해주기 때문이다.
GP88/PCDGF의 발현에 이어 친화성 정제된 항인간 GP88/PCDGF 항체를 이용하여 파라핀 포매된 생검재료로부터의 섹션을 면역조직화학 분석하였다 (도 21). 시험된 질병의 진전 단계는 양성 비후증 ---> 비정형 도관성 비후증 (ADH: atypical ductal hyperplasia) ---> (도관성 암종 in situ) DCIS ---> 침윤성 도관암종 (IDC: invasive ductal carcinoma) ---> 전이성 질환의 순이다. 유방암 경과중 발생하는 생물학적 변형과 유전자의 대표적인 선별마커도 함께 조사하였다.
조사된 질환의 매 단계(즉, 상포 비후증 및 피브로시스틱 변화, 비정형 도관성 비후증, 도관성 암종 in situ, 침윤성 도관암종; 및 전이성 유선암종)마다, GP88/PCDGF의 발현을 다른 마커, 예컨대 Ki-67 (증식 마커), p53 (종양 서프레서), ER/PR (응답성), cerbB2 발현 (성장 인자 수용체)와 같은 다른 마커에 대한 검출과 병용하여 측정하고 질병 정도, 단계 및 임사절 상태와 관련시켰다.
병변의 단계와 종류를 면역병인학적으로 측정하고, Ki-67 및 ER/PR 상태와 같은 기타 몇몇 예후적 마커를 조사함으로써 생검재료를 분류하였다. 그 결과, 저조한 예후로 종양에 대응하는 3점짜리 ER-/PR 도관성 암종의 상피세포 중에 GP88/PCDGF이 발현된 것으로 나타났다. 정상조직 또는 양성 소엽 암종의 상피 세포에서의 GP88/PCDGF발현은 음성적이었다.
방법
조직 준비. 4 μm 두께의 조직 섹션을 파라핀 블록으로부터 떼어내어 전기적으로 하전된 유리 슬라이드 위에 올렸다. 상기 섹션의 파라핀제거, 고정, 항원 리트리벌 및 재수화는 표준공정에 준하여 실시하였다.
항인간 GP88/PCDGF 항체의 준비: GP88/PCDGF 발현을 검색하기 위한 바람직한 방법은 친화성 정제된 항인간 GP88/PCDGF 항체를 이용하는 면역염색에 의한 것이다. 토끼 또는 마우스를, 본 발명자들의 실험실에서 발현 및 정제된 인간의 재조합 GP88/PCDGF으로 면역화시킴으로써 폴리클로날 또는 모노클로날 항인간 GP88/PCDGF 항체를 개발하였다. 폴리클로날 항체의 경우, 소듐 설페이트 침전 및 투석에 의해 항GP88/PCDGF IgG 단편을 토끼의 항혈청으로부터 준비하였다. 순수한 인간의 GP88/PCDGF를 CNBr 활성화 Sepharose에 커플링시켜 제조한 GP88/PCDGF 컨쥬게이션된 Sepharose 컬럼상에서 크로마토그래피에 의해 이 분획을 친화성 정제시켰다. 이 고순도 항체 분획을 SDS-PAGE 크로마토그래피에 의해 분석하자 IgG에 대응하는 단일 밴드를 함유하는 것으로 나타났고 면역염색에 의해, 고정 세포와 조직 섹션상에서 아무런 배경없이 매우 특이적인 염색을 제공하는 것으로 나타났다. 또는, 항GP88/PCDGF 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.
특정 항체와 함께 실온에서 습실 중 약 1시간 동안, 이어서 항GP88/PCDGF와 함께 인큐베이션시킴으로써 상기한 바와 같이 준비된 조직 섹션을 인큐베이션하여 면역염색을 수행하였다. 항체 결합은 바이오티닐화된 2차 항체 및 스트렙타비딘 퍼옥시다제 복합체 (Ventana 키트)와 함께 인큐베이션함으로써 검색하는 것이 바람직하다. 크로마토젠 전개는 3,3'-디아미노벤지딘 용액 (3% 과산화수소와 함께 0.25 mg/ml) 중에서 섹션을 침지시킴으로써 얻는 것이 바람직하다. 이어서 슬라이드를 바람직하게는 헤마톡실린으로 카운터 염색시키고, 커버를 벗긴다.
현미경 검사에 의해 면역염색 데이터의 분석을 수행하였다. 후술하는 바와 같이 공지방법을 이용하여 선별된 마커의 점수를 매겼다. 종래기술에서 염색강도를 점수매기는 방법으로 다음을 들 수 있다: 공통적으로 사용되는 방법에 의해 핵 염색을 등급화함으로써 ER 및 PR 상태 및 p53 돌연변이 형태의 존재여부를 결정한다 (<5% 핵염색 - 음성; 양성 염색은 약함 (1+)에서 보통 (2+)에서 강함 (3+)까지 강도가 매겨진다. c-erbB-2 염색은 막 염색의 존재여부 및 강도에 의해 평가되어 다음과 같이 등급화된다: <5% 염색 - 음성; 양성 염색은 약함 (1+)에서 보통 (2+)에서 강함 (3+)까지 강도가 매겨진다. 스트로멜리신-3 발현을 종양세포와 주변의 스트로마에서 별도로 등급화시키고, 바람직하게는 ER/PR, p53 및 c-erbB-2에 사용된 방법으로 점수매기는 것이 좋다. 염색 강도 등급화 방법은 GP88/PCDGF의 검출에 직접 응용가능하다.
본 발명자들의 결론은 정상조직과 양성 병변에서, 상피 세포들이 GP88/PCDGF을 염색하지 않음을 보여준다. 이와 대조적으로, ER-/PR- 침윤성 도관암종에서는, 상피 세포들이 GP88/PCDGF에 대해 매우 강력한 양성 염색을 나타내었다. GP88/PCDGF에 대해 양성인 상피세포들의 존재를 점수매겨서, 유방암의 다른 예후적 마커를 점수매기고 인덱싱하는데 일반적으로 사용되는 방법에 따라 점수매기고 등급화시킬 수 있다. 다음의 점수매기기 및 인덱싱 스케일이 GP88/PCDGF 염색을 평가하는데 사용되었다. 약 5% 미만의 염색은 음성; 약 10-25%의 양성 염색은 약함 (1+)에서 보통 (25-50% 양성 세포 (2+)) 내지 강함 (3+) (50%를 초과하는 양성 세포). 각 등급당 양성 세포의 백분율은 많은 시료를 분석한 경우에는 하향조정한다.
전술한 방법 및 생물학적 시료의 종류에 더해, 항에스트로겐 요법에 대한 응답을 예견하기 위한 GP88/PCDGF 발현의 검출은, 혈청이나 혈장, 소변 또는 유도 흡입물과 같은 생물학적 체액 중에서의 GP88/PCDGF 발현의 증가를 측정하는데까지 확장될 수 있다. 항에스트로겐 요법에 대한 응답을 예견하기 위한 GP88/PCDGF의 검출은 또한 모든 세포 추출물에 있어서 GP88/PCDGF 발현의 증가를 측정하는데까지 쉽게 확장될 수 있다.
검출 방법으로는 예컨대 항체를 효소 (예컨대 퍼옥시다제, 알카라인 포스파타제, 바이오틴등과 같은 비제한적인 예를 들 수 있음)나 또는 형광 태그에 직접 컨쥬게이션된 항체, 또는 컨쥬게이션된 2차 항체 (예컨대, 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 스트렙아비딘, 또는 형광 태그와 같은 비제한적인 예) 를 이용하는 것과 같은 효소결합 면역분석법을 들 수 있으나 이 방법으로 한정되지 않는다.
선별된 마커의 점수를 매기기 위한 바람직한 방법은 기술분야에 잘 알려져 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로 된 다음 문헌등에서 찾아볼 수 있다: (1) Ferno, M. (1998) Prognostic factors in breast cancer, Anticancer Research, 18,2167-2172; (2) Harbeck N.,Dettmar, P., Thomssen, C.,Henlselmann, B., Kuhn, W.,Ulm, K., Janicke, F., Hofler, H., Graeff, H., Schmitt, M.(1998), Prognostic impact of tumor biological factors on survival in node-negative breast cancer, Anticancer Res.18, 2187-2198 ; (3) Allred, D. C., Harvey, J. M., Berardo, M., Clark,G. M. (1998), Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis, Mod.Pathol 11, 155-168; and (4) Thor, A. D., Moore, D.H., Edgerton, S. M.,Kawasaki, E. S.,Reihsaus, E., Lynch, H. T., Marcus, J. N., Scwartz,L., Chen, L. C.,Mayall, B. H. (1992), Increased accumulation of the p53 suppressor gene product is an independent prognostic variable for breast cancer,J. Natl. Cancer.Inst., 84,845-855.
항 GP88 / PCDGF 항체를 이용한 GP88 / PCDGF 염색
유방암 환자로부터 파라핀 포매된 유방조직 생검재료를 면역조직화학적 기술을 이용하여 GP88/PCDGF 항체로 염색하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, 양성 병변은 GP88/PCDGF 염색을 나타내지 않은 반면 침윤성 도관암종 ("IDC") 시료들은 GP88/PCDGF 양성 세포를 강하게 염색시키는 것으로 나타났다. GP88/PCDGF 발현은 양성 병변에 비해 종양형성성 도관성 침윤암종에서 더 많다.
에스트로겐 수용체 양성 ( ER +) 및 에스트로겐 수용체 음성 ( ER -) 침윤성
도관암종 ( IDC ) 종양에 있어서 GP88 / PCDGF 염색 강도
IDC 종양의 생물학적 시료를 항GP88/PCDGF 항체로 면역염색하여 그의 에스트로겐 수용체 상태 (ER+ = 에스트로겐 수용체 양성, ER- = 에스트로겐 수용체 음성)와 GP88/PCDGF 염색 강도 등급에 따라 분류하였다 도 22에 도시된 바와 같이, GP88/PCDGF 염색 강도는 IDC 종양에 있어서 에스트로겐 수용체의 소실과 직접적으로 연관이 있다. 염색 강도 0에서는, 모든 IDC 종양 시료가 ER+ 인 것으로 분석되었다. 염색 강도 1에서는 IDC 종양의 80%는 ER+이고 20%는 ER-인 것으로 분석되었다. 염색 강도 2에서는 IDC 종양의 50%는 ER+이고, 나머지 50%는 ER-인 것으로 분석되었다. 염색강도 3에서는 IDC 종양의 IDC종양의 20%는 ER+이고 80%는 ER-였다. 따라서, GP88/PCDGF 염색 강도는 ER+ IDC 종양 백분율이 감소할수록 증가한다.
GP88 / PCDGF 염색 강도에 따라 분류된 ER + IDC 종양의 타목시펜 응답성
GP88/PCDGF 염색 강도의 증가는 세포가 성장하는데 있어서 에스트로겐 의존성을 상실하여 에스트로겐 비의존성이 되었음을 가리키는 것이다. 세포 성장은 에스트로겐과 같은 호르몬으로부터의 외부적 시그널에 의해 더 이상 조절되지 않고 GP88/PCDGF으로부터의 자분비성 성장 시그널에 의해 제어된다. 이전에는, 에스트로겐 수용체가 존재한다는 것은 그 세포가 항에스트로겐 요법에 응답할 수 있는지를 나타내는 것으로 여겨졌었다. 그러나, 세포 성장이 에스트로겐 의존성 성장 에스트로겐 비의존성으로 변환되면, 세포 성장 시그널이 구조적이 되어 에스트로겐 또는 항에스트로겐의 존재여부에 의해 제어되지 않기 때문에, 에스트로겐 수용체의 존재여부는 더 이상 항에스트로겐 요법이 효과적일지와 관련이 없어진다. 따라서, GP88/PCDGF 수준이 높은 (+2 또는 그 이상) 에스트로겐 수용체 양성 종양은 그 세포가 에스트로겐 수용체를 나타낼지라도 항에스트로겐 요법에 대해 내성적이다.
항에스트로겐 내성에 미치는 증가된 GP88/PCDGF 수준의 효과를 검사하기 위해, 타목시펜 치료에 내성을 보이는 환자와 타목시펜 치료에 응답하는 환자로부터 IDC 종양 시료를 수득하였다. 이 종양 시료를 전술한 바와 같이 항인간 GP88/PCDGF 항체로 면역염색시켰다. 도 23에 도시된 바와 같이, IDC 종양을 0 내지 3의 점수로 (x-축) 그의 GP88/PCDGF 염색 강도에 따라 분류하였다. 에스트로겐 수용체 양성 (ER+)인 총 IDC 종양의 백분율을 측정하여 y-축을 따라 타목시펜 응답성 (백색 막대) 또는 타목시펜 내성 (흑색 막대)으로 분류하였다. 염색 강도 등급 0에서는 모든 ER+ IDC 종양 (종양 총 수의 40%)이 타목시펜 응답성 환자로부터 유래하였다. 염색 강도 등급 1에서는 모든 ER+ IDC 종양이 (종양 총수의 60%)이 타목시펜 응답성 환자로부터 유래하였다. 그러나, 염색 강도가 1등급에서 2등급으로 이동함에 따라, 모든 ER+ IDC 종양 (종양 총수의 80%)은 타목시펜 내성 환자로부터 유래하였다. 염색 강도 등급 3에서는, 모든 ER+ 종양 (종양 총수의 30%)이 타목시펜 내성 환자로부터 나왔다. 따라서, ER+ IDC 종양조차 GP88/PCDGF 강도가 0등급에서 3등급으로 증가함에 따라 타목시펜 증가 효과에 대해 점점 더 내성적으로 되었다. 뿐만 아니라, 염색 강도가 1등급에서 2등급으로 증가할 경우, ER+ IDC 종양은 타목시펜 응답성으로부터 타목시펜 내성으로 완전히 이동하였다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 3등급에서 4등급으로부터의 타목시펜 내성 종양의 백분율이 후속적으로 감소하는 것은 GP88/PCDGF 수준이 증가함에 따라 에스트로겐 수용체 (즉, ER+ IDC 종양의 백분율)가 소실되는 것에 기인하는 듯 하다. 따라서, 도 23은 GP88/PCDGF의 수준을 증가시키면, 에스트로겐 수용체 소실 전에조차, 세포들이 항에스트로겐 요법 응답성 (0등급 및 1등급)으로부터 항에스트로겐 요법 내성 (2등급 및 3등급) 단계으로 이동됨을 나타내준다. 따라서, 에스트로겐 수용체의 존재여부를 판단하는 것에 비해, GP88/PCDGF는 환자가 항에스트로겐 요법에 응답할 것인지 또는 예기치 않게 그러한 요법에 의해 해를 입을 것인지에 대한 보다 정확하고 신뢰할만한 예후적 지표 역할을 한다.
상기 설명과 첨부된 도면은 어디까지나 본 발명의 특성과 장점을 달성케해주는본 발명의 설명을 위한 구체예로서 제공되는 것이다. 본 발명이 본 명세서 상세히 구현되고 설명된 예들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 본 발명의 정신과 범위에 부합하는 범위 내에서, 본 명세서에 굳이 설명되지 않은 수많은 변형, 변경, 치환 또는 동등한 수단들을 포함하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 다음에 첨부된 특허청구의 범위에 의해서만 한정되는 것이다.

Claims (12)

  1. 환자로부터 얻은 세포를 함유하는 생물학적 시료를 항-GP88/PCDGF 항체 또는 그 단편과 접촉시키는 단계; 및
    총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 세포들의 비율을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 시료의 GP88/PCDGF 존재 비율이 5%를 초과하면 종양성(tumorigenicity)임을 가리키는 것인,
    GP88/PCDGF-관련 종양성을 진단하기 위한 정보를 얻기 위한 GP88/PCDGF의 생체 외(ex vivo) 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직 시료인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 생검에 의해 얻어지는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군에서 선택된 물질을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-GP88/PCDGF 항체 또는 단편은 인간화된 것인 방법.
  6. 환자로부터 얻은 세포를 함유하는 생물학적 시료를 항-GP88/PCDGF 항체 또는 그 단편과 접촉시키는 단계; 및
    총 세포수에 대한 GP88/PCDGF 양성 세포들의 비율을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 시료의 GP88/PCDGF 존재 비율이 5%를 초과하면 유방암인 것을 나타내는 것인,
    유방암을 진단하기 위한 정보를 얻기 위한 GP88/PCDGF의 생체 외(ex vivo) 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직 시료인 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 생검에 의해 얻어지는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군에서 선택된 물질을 포함하는 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 항-GP88/PCDGF 항체 또는 단편은 인간화된 것인 방법.
  11. 항에스트로겐 화합물 및 GP88/PCDGF 안타고니스트를 함유하는 유방암 치료용 약학 조성물: 여기서, 상기 항에스트로겐 화합물은 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해제 및 에스트로겐 수용체 다운-레귤레이터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 GP88/PCDGF 안타고니스트는 GP88/PCDGF의 항체, 이 항체의 항원 결합 단편 및 안티센스 GP88/PCDGF 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  12. 항에스트로겐 화합물 및 GP88/PCDGF 안타고니스트를 함유하는 유방암 치료용 의약을 제조하기 위한 약학 조성물: 여기서, 상기 항에스트로겐 화합물은 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해제 및 에스트로겐 수용체 다운-레귤레이터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 GP88/PCDGF 안타고니스트는 GP88/PCDGF의 항체, 이 항체의 항원 결합 단편 및 안티센스 GP88/PCDGF 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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