KR20100044793A - 신경퇴행성 질환에서 ｃｄ44 접목 변이체들 - Google Patents

신경퇴행성 질환에서 ｃｄ44 접목 변이체들 Download PDF

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Abstract

환자에서 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법에는 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA)의 발현을 조절할 수 있는 시약이 포함된 조성물을 투여하는 것이 포함되고, 이때 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 군에서 선택된다. 또한, 환자에서 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 이 방법에는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 조절하는 시약을 포함한 조성물을 투여하는 것이 포함되며, 이때 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 동성성인 연속 아미노산 서열을 포함하는 군에서 선택된다.

Description

신경퇴행성 질환에서 ＣＤ44 접목 변이체들{CD44 SPLICE VARIANTS IN NEURODENRATIVE DISEASES}
관련 출원
본 출원은 2007년 7월 10일자로 출원된 미국 가출원 60/929,706의 이익을 청구하고, 이는 참고문헌으로 첨부된다.
CD44는 척추 동물 신체에 실질적으로 모든 세포에 의해 발현되는 타입 I 막통과 당단백질이다. CD44는 세포 추적(trafficking), 세포 이동, 세포 회귀(cell homing), 세포간 상호작용 및 세포-매트릭스 상호작용과 같은 다양한 프로세스에 관련된 것으로 보이는 세포 표면 흡착 분자다. CD44의 N-말단에는 분자의 세포외 리간드-결합 도메인이 포함된다. 다양한 리간드들이 CD44와 상호작용하는 것으로 알려져있다. 히알루론산(HA)이 CD44의 주요 리간드이나 (Miyake et al., J Exp Med 1990, 172:69- 75, Aruffo et. al., 세포 1990, 61: 1303-13, Peach et. al., J Cell Biol 1993, 122:257-64), 그러나, 추가적인 세포외 매트릭스 (ECM) 성분들 (가령, 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴 및 콘드로이틴 설페이트(Jalkanen et. al., J Cell Biol 1992, 116:817-25, Faassen et. al., J Cell Biol 1992, 116:521-31) 뿐만 아니라 비-ECM 성분들(점막 관 접착분자(mucosal vascular addressin), 세르글리신, 오스테오폰틴 및 클라스 II 불변 사슬(invariant chain)), E-와 L-셀렉틴(Dimitroff et. al., PNAS 2000, 97:13841-6 and Dimitroff et. al. , J Cell Biol 2001, 153:1277-86) 그리고 아그레칸(Fujimoto et. al., Int Immunol 2001, 13:359-66)도 CD44 수용체와 상호작용할 수 있다. 상처 치유, 조직 리모델링, 염증(자가 염증 포함), 형태형성, 및 발암과 같은 강력한 세포 이동 및 세포 증식 부위에서 두드러진 CD44 축적(때로 히알루론산과 함께)이 감지된다. CD44의 세포질 꼬리의 막근접(juxtamembrane) 부분은 악틴 링커 분자의 에즈린-라디신-모에신(ERM) 패밀리 구성부에 결합하여, 세포 표면 결합된 CD44와 악틴 세포골격사이에 연결을 제공하여 (Tsukita et. al., J Cell Biol 1994, 126: 391-401), CD44-의존성 세포 운동성을 위한 기반을 확립한다.
종에 따라, CD44 유전자 자리에는 약 20개 코딩 엑손이 포함된다. 예를 들면, 사람의 CD44 유전자에는 총 19개 엑손이 포함되나, 생쥐의 CD44 유전자에는 20개 엑손이 포함된다. CD44의 엑손은 두 종류로 세분될 수 있는데; 항상성(constant) 엑손과 가변성(variable) 엑손이다. 사람 및 생쥐의 항상성 엑손에는 5' 말단에 엑손 C1-C5가 포함되고, 3' 말단에 C6-C9이 포함되며, CD44 의 소위 항상성 부분을 인코드한다(Screaton et. al., PNAS 1992, 89: 12160-4; Tolg et. al., Neucleic Acids Res, 1993 21:1225-9; Screaton et. al., J Biol Chem 1993, 268: 12235-8). 가변성 엑손은 분자의 중앙에 위치하고, 사람의 경우 9개 엑손을 포함하고(엑손 V2-V10) 그리고 생쥐에서는 10개 엑손(엑손 V1-V10)을 포함한다. CD44의 가변 부분들을 가변성 엑손이 인코드한다. 세포에서 발현되는 주요 분자 종들은 CD44의 표준, 조혈 형(CD44s 또는 CD44H으로 명하기도 함)은 가장 짧은 CD44 형태로써, mRNA에 의해 인코드되고, 항상성 엑손만으로 구성된다. mRNA에 가변성 엑손의 상이한 조합들을 보유함으로써 무수한 CD44 접목 변이체가 결과된다 (CD44v, reviewed in Gunthert, Curr. Top Microbiol Immunol 1993, 184:47-63). 그러나, 이론적으로 이와 같은 방식으로 1,000개 이상의 개별 접목 변이체가 만들어질 수 있지만, 그리고 심지어 한 개 조직 또는 세포형에서 다중 접목 변이체가 공동-발현되는 경우에도, CD44는 주요 아형(isoform)을 유지한다(예를 들면,, Ni et. al., J. Lab. Clin. Med 2002, 139: 59-65; Bell et. al. MCB 1998, 18:5930-41). 다양한 환경과 조건하에, CD44의 접목 패턴도 종종 변경된다(예를 들면, Gunthert et. al., 세포 1991, 65:13-24; Heider et. al., J Cell Biol 1993, 120:227-33; Wielenga et. al., Cancer Res 1993, 53:4754-6). 추가 엑손을 포함하는 CD44 전사체들이 만들어 질 수 있으며; 예를 들면, 언스킵(unskipped) 엑손 V3, V5, V6 및 V7 활성화된 임파세포와 종양세포들의 전이성 변이체들에 의해 발현되는 것으로 알려져있다. (Naor et al, Crit Rev Clin Lab Sci, 2002, 39:527-79). CD44 접목변이체의 세포 선택이 결합 친화력의 주요 결정자이다(Lesley et. al., J Exp Med 1995 182:431-7, Stamenkovic et. al. Embo J 1991 10: 343-8, Van der Voort et al., Biochem Biophys Res Commun 1995 214: 135-144).
자가면역 질환과 같은 몇 가지 질환에서 다양한 CD44 접목 변이체의 발현이 연구되었고, 이와 같은 질환의 진단 및 치료 모두에 표적으로 제안되었다. CD44의 다양한 가변 부분에 대한 단클론성 항체 (mAbs)가 자가면역 질환에 잠재적 물질로 제시되었다. Reber et. al., 은 쥐 췌장 선암의 CD44V 표면 단백질의 전이-특이적 변이체에 대한 mAbs를 설명한다 (Reber et. al. Int J Cancer, 1990, 46:919-27). T-세포 증식을 저해하는 항-CD44 단클론성 항체는 다양한 자가면역 질환 (Rothman et. al. J Immunol. 1991 147:2493-9)의 치료로 제공되었다. 엑손 v6을 포함하는 CD44의 가변형에 특이적인 단클론성 항체도 임파종의 진단에 유용한 것으로 보고되었다 (Ristamaki et. al. Blood, 1994, 84:238-43). 또한, Haynes et. al. Arthritis Rheum, 1991, 34:1434-43,는 CD44 단백질, 펩티드 또는 유도체를 투여하여 다양한 자가면역 질환을 치료할 수 있다고 보고하였다. CD44는 발현 또한 항-종양 및 항-염증 치료법에 공지된 표적이다. 동물에서 실험으로 항체, 안티센스 올리고 및 CD44-가용성 단백질에 의한 CD44의 표적화로 다양한 신생물의 악성 활성이 상당히 감소되었다는 것을 보여주었다. CD44 발현에 대항되는 안티센스 전략 및 다양한 올리고뉴클레오티드-계 치료법이 개발되어 왔고, 예를 들면, US 6,150,162 및 US 5,990,299에서도 설명되고 있다.
CD44 및 이의 일부 접목 변이체들이 자가면역, 병인균 유도화된 신경 질환, 예를 들면 다발성 경화(MS) 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입 I (HTLV-I)-연합된 골수증/열대성 경직 하반신 마비(HAM/TSP)에 관련되어 있다는 일부 증거들이 있다. 생쥐 균주의 실험적 알러지성 뇌수막염(Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE))의 연구를 흔히 다발성 경화의 동물 모델로 삼는데, 이 연구에서, CD44를 염증 병소 주변 교세포상에 in vivo로 유도한다 (Haegel et. al., J Cell Biol. 1993, 122:1067-77). CD44V10 접목 변이체를 발현시키는 단핵 세포들이 EAE 생쥐의 척수에서 감지되었다. (Laman et. al., Mult Scler. 1998, 4:147-53). CD44V3-V10 cDNA로 백신 접종 받은 동물들은 허위 백신 접종을 받은 동물 또는 CD44s cDNA로 백신 접종 받은 동물과 비교하였을 때, 심각성이 상당히 감소된 EAE가 발생되었다(Garin et. al., J Neurol Sci. 2007, 258 :17-26). CD44에 대항되는 항체로 In vivo 처리하면 질병 부담에 영향을 주지 않지만, 가변성 부위 6, 7, 10(CD44V6, V7 및 VlO)을 포함하는 아형에 대항되는 항체로 복합 치료하면 질병 부담이 상당히 감소된다. (Laman et. al., Mult. Scler. 1998, 4:147-53).
인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입 I(HTLV-I)-연합된 골수증/열대성 경직 하반신 마비(HAM/TSP)는 HTLV-I 감염으로 기인되며, 강직성 반신마비 및 요실금, 그리고 혈관주위 HTLV-I-감염된 그리고 활성화된 CD4+ T-세포 침윤을 특징으로 한다. 엑손 V6 과 VlO (CD44V6/V10) 사이에 직접적인 연결을 포함하는 CD44 접목 변이체는 HAM/TSP 환자의 말초 혈액 단핵 세포에서 빈번하게 발현되는 것으로 발견되었다 (Matsuoka et. al., J Neuroimmunol. 2000, 102:1-7). 이와같은 발견들은 V6/V10-포함하는 임파세포가 질병의 초기 단계에서도 용이하게 CNS로 이동할 수 있다는 결론에 이르게 하였다. (Matsuoka et. al., J Neuroimmunol. 2000, 102:1-7).
“전형적인” 신경퇴행성 장애 (알츠하이머 질환(AD), 파킨슨 질환 (PD) 그리고 근위축성측생경화증(ALS))은 성인에서 개시되고, 만성적, 진행적 그리고 비가역적인 심각한 신체장애 질환이다. 추가적으로, 운동 신경 장애(MND), 예를 들면, 일차성 측삭경화증(PLS) 및 척수성 근위축증(SMA). 알츠하이머 질환(AD)을 포함하나 이에 한정되지 않은 비-자가면역 신경퇴행성 장애는 진행성 정신 및 인식 퇴보와 아밀로이드 플락의 형성, 신경원섬유, 신경교아종 및 뉴런 손실의 결과를 특징으로 한다. 이와 같은 질환은 유전적 그리고 우발적으로 형성 모두에서 발생되는데, 임상적 과정 및 병인적 특징은 상당히 유사하다. 현재까지 세가지 유전자가 확인되었는데, 돌연변이되었을 때, 알츠하이머 질환의 상염색체 우성(autosomal dominant) 형태의 원인이 된다. 이들 유전자는 아밀로이드 단백질 전구물질 (APP)과 두가지 구조적 그리고 기능적으로 연관된 단백질, 프레세니린-1 (PSl) 및 프레세니린-2 (PS2)를 인코드한다. 이들 세 가지 단백질중 임의의 것에 돌연변이는 알츠하이머 질환에서 아밀로이드 플락의 주요 성분이 되는 아밀로이드 β 펩티드 (Aβ), 40-42개 아미노산 길이의 펩티드를 생산하는 세포내 경로를 통하여 APP의 단백질 분해 프로세싱을 강화시킨다.
근위축성측생경화증(ALS)은 매년 ALS로 진단을 받은 100,000명당 한 두명에 영향을 미치는 진행성 치명적 신경 질환이다. 자발적 움직임을 제어하는 운동 신경 세포들이 점진적으로 퇴화될 때 ALS가 발생된다. 이와 같은 운동 뉴런의 손실로 뉴우런이 제어하는 근육이 약화되어 쇠약해지고, 마비와 결국 사망에 이르게 된다. 대부분의 ALS의 병인관계는 아직 알려지지 않고 있지만, 이 질병의 2%는 Cu/Zn 슈퍼옥시드 디스무타제 유전자(SODl)에 돌연변이 때문이다. 후자의 경우, 돌연변이 SODl는 알수 없는 독성의 유입에 의해 비-세포-자율성 운동 뉴런 치사를 유도한다. 단백질 미스폴딩, 미토콘드리아 이상기능, 산화 손상, 불완전한 엑손 운송, 흥분독성(excitotoxicity), 불충분한 생장 인자 시그날링 및 염증을 포함하는 몇 가지 기전의 복합에 의해 일어나는 것 같다. 운동 뉴런내에 손상은 질병 진행을 가속화시키는 염증 반응을 통하여 비-뉴런성 인접 세포들에 의해 발생되는 손상에 의해 강화된다. (Boillee et. al. neuron. 2006, 52:39-59, Pehar et. al., Neurode유전자r. Dis. 2005, 2:139-46).
파킨슨 질환 (PD)은 뇌의 흑질치밀부(substantia nigra pars compacta of the 뇌)에 도파민성 뉴런의 선택적 퇴행의 원인으로 인한 만성적 그리고 진행적 신경퇴행성 질환이며; 뉴런의 80%는 증상이 나타나기 전에 알려지지 않은 원인으로 죽는다. 증후에는 사지의 간헐적 떨림, 균형을 잘 못 잡으며, 첫 움직임이 곤란함 등이 포함된다.
일차성 측삭경화증(PLS)은 수의근(voluntary muscle)에 진행적 근육 쇠약을 특징으로 하는 희귀한 신경근 질환이다. 운동 뉴런 질환으로써, PLS는 항상 수의근 움직임을 조절하는 신경 세포들이 퇴행하고 죽게 될 때 발생하여, 수의근이 제어하는 근육을 쇠약하게 한다. 척수성 근위축증(SMA)은 다양한 장애에 사용되는 용어로, 모두 공통적으로 유전적 원인을 가지며, 척수 및 뇌간(brainstem)의 운동 뉴런의 상실로 쇠약이 나타난다.
고유 면역 시스템이 혈액 뇌 장벽을 통하여 T-세포와 임파세포의 침윤을 통하여 정상적인 뉴런 세포 구성분을 표적으로 하는 신경성 자가면역 질환 (다발성 경화와 같은)과 달리, 전통적인 신경퇴행성 장애에서, 뉴런은 원인모를 이유로 죽는다. 정통적인 신경퇴행성 질환에서 뉴런-신경교 상호작용 및 염증 과정의 역할이 제시되었다. 마크로와 미세아교세포들은 ALS 및 각 질환 모델에서 다단계 퇴행성 프로세스에 역할을 하는 것으로 제시되었다. 성상세포 및 미세아교세포의 활성화는 질환의 병인형성 초기에 일어나고, 이는 질환의 개시 및 촉진에 상당한 영향을 주는 것으로 보인다. (Di Giorgio et. al., Nat Neurosci. 2007;10:608-614; Esposito et. al. Exp Neurol. 2007; Kim et. al., Exp MoI Med. 2006;38:333-47).
알츠하이머 질환, 근위축성측생경화증 또는 파킨슨 질환에서 특정 CD44 변이체의 역할의 명백한 증거는 제공되지 못하였다. 생쥐 성상세포의 1차 배양물에서, CD44의 표면 발현과 mRNA 수준이 포르볼 에스테르)(PMA) 또는 종양 괴사 인자 알파+감마 인터페론으로 자극을 통하여 유도될 수 있다. 만들어진 CD44 전사체에는 엑손 v6 뿐만 아니라 더 큰 크기의 변이체를 포함한 추가 엑손을 포함한다. 그러나, 이와 같은 활성화가 신경퇴행성 질환의 과정에서 in vivo 또는 인간에서 일어나는지에 대해서는 알려지지 않았다(Haegel et. al, J Cell Biol, 1993, 122:1067- 77). CD44들의 국소화는 대조군 인간 개체의 뇌 부검 조직과 알츠하이머 환자의 뇌 조직의 면역조직화학검사로 조사되었다. 회백질에서, 원형질 및 섬유성 조직 모두의 일부 성상세포에 연합된 것이 발견되었다. 알츠하이머 질환 뇌에서, CD44 포지티브 성상세포의 수는 급격하게 증가되었다. CD44는 성상세포 프로세스의 중요한 흡착 분자일 수도 있다 (Akiyama et. al., Brain Res. 1993, 632:249-59). 그러나, 질환 진행에 CD44를 발현시키는 세포들이 참석하거나 신경퇴행을 예방하는데 도움이 되는지는 알려지지 않았다. 이들 질환에서 CD44 접목 변이체의 설명은 없었다.
CD44 접목 변이체들이 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방에 도움이 되는 지에 대해 확인할 필요가 있다.
환자에서 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA)의 발현을 조절할 수 있는 시약이 포함된 조성물을 이용하고, 이때 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 군에서 선택된다. 또한, 환자에서 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 이 방법에는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 조절하는 시약을 포함한 조성물을 투여하는 것이 포함되며, 이때 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 동성성인 연속 아미노산 서열을 포함하는 군에서 선택된다.
CD44 접목 변이체를 이용하여 환자에서 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방한다.
구체예의 예시적인 설명은 첨부된 도면을 참고하여 설명한다. 도면에서, 하나 이상의 도면에서 나타나는 동일한 구조, 요소 또는 부분들은 이들이 나타나는 모든 도면에서 동일한 번호를 붙인다. 도면에 나타난 성분들 및 특징은 편의와 명백함을 위해 제공하는 것이며, 일정 비율로 반드시 나타내지 않았다. 도면은 하기와 같다.
도 1은 CD44의 게놈 구조를 도식적으로 설명한다;
도 2는 V3 변이체 엑손과 항상성 엑손 C5 및 C6와 V3 변이체 엑손의 접목 졍션의 뉴클레오티드 및 단백질 서열을 도식적으로 설명한다;
도 3은 V6 변이체 엑손과 항상성 엑손 C5 및 C6와 V6 변이체 엑손의 접목 졍션의 뉴클레오티드 및 단백질 서열을 도식적으로 설명한다;
도 4는 V7 변이체 엑손과 항상성 엑손 C5 및 C6와 V7 변이체 엑손의 접목 졍션의 뉴클레오티드 및 단백질 서열을 도식적으로 설명한다;
도 5는 V10 변이체 엑손과 항상성 엑손 C5 및 C6와 V10 변이체 엑손의 접목 졍션의 뉴클레오티드 및 단백질 서열을 도식적으로 설명한다;
도 6은 AD 환자의 해마(hippocampal) 부분을 CD44V6 항체로 면역조직화학적 착색을 설명한다;
도 7은 일부 구체예에 따라 다양한 CD44 변이체들의 mRNA 발현에 siRNA의 효과를 설명한다; 그리고
도 8은 일부 구체예에 따라 다양한 CD44 변이체들의 mRNA 발현에 SME의 효과를 설명한다.
발명의 요약
다음의 구체예와 이의 측면들은 실시예와 설명으로 제공되는 시스템, 도구 및 방법과 접목하여 설명되나 이로 그 범위를 한정시키는 것은 아니다. 다양한 구체예에서, 상기 설명된 문제점들중 하나 또는 그 이상이 감소되거나 제거되었으며, 다른 구체예들은 다른 장점들 및 개선점에 대한 것들이다.
일부 구체예에 따르면, CD44 접목 변이체를 제공하는데, 근위축성측생경화증(ALS) 및 알츠하이머 질환 (AD)과 같은 전통적인 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 환자들로부터 구한 생물학적 샘플에서 이들 발현이 상승되었다. 제공된 CD44 접목 변이체중, 단일 변이체 엑손을 포함하는 변이체들중 일부는 기존에 설명되지 않은 신규한 변이체들이다. 신경퇴행성 질환의 치료 및 진단에 유용할 수 있는 CD44 폴리펩티드, 이를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이에 대응하는 항체 및 올리고뉴클레오티드를 추가 제공한다.
일부 구체예에 따르면, 환자에서 신경퇴행성 질환을 진단하거나 모니터하는 방법도 제공되는데; 이 방법은 환자의 생물학적 샘플에서 핵산의 발현 수준을 감지하고; 이때 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속(continous) 뉴클레오티드 서열 또는 임의 복합 서열을 포함한다. 추가 구체예에 따르면, SEQ ID NO: 1의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:1의 좌표 1-1212에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 766-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의 복합이 포함된다. SEQ ID NO:3의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:3의 좌표 1-1215에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-696 에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 5의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:5의 좌표 1-1218에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-696 에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:7의 좌표 1-1290에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 844-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다.
추가 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의 복합이 포함될 수 있다.
다른 추가적 구체예에 따르면, 생물학적 샘플에는 세포, 조직, 생물학적 유체, 또는 이의 임의 복합이 포함될 수 있다.
추가 구체예에서, 핵산의 발현수준은 핵산에 의해 인코드된 리보핵산 (RNA)의 발현 수준을 결정하여 감지할 수 있다. 이 방법에는 핵산에 의해 발현되는 RNA 수준을 감지하기 전에 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리시키는 것이 추가 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, RNA의 발현수준은 중합효소 쇄 반응 (PCR), 역-전사효소-PCR (RT-PCR), 노던 블랏, 실시간 PCR, 또는 이의 임의 복합 방법에 의해 감지될 수 있다. RNA의 발현수준은 올리고뉴클레오티드에 하이브리드 반응으로 감지될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에는 데옥시리보핵산 (DNA), RNA, 상보적 데옥시리보핵산 (cDNA), 게놈 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 임의 복합이 포함될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 환자에서 신경퇴행성 질환을 진단 또는 모니터하는 방법이 제공되는데; 이 방법은 환자의 생물학적 샘플내에 폴리펩티드의 발현을 감지하는 것이 포함되고, 이때 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 동성성인 연속 아미노산 서열을 포함하는 군에서 선택된다. 추가 구체예에 따르면, SEQ ID NO: 2의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:2의 좌표 1-403에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 256-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 4의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:4의 좌표 1-404에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 6의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:6의 좌표 1-405에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO:8의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:8의 좌표 1-429에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 282-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다.
추가 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다.
다른 추가적 구체예에 따르면, 생물학적 샘플에는 세포, 조직, 생물학적 유체, 또는 이의 임의 복합이 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, 감지는 폴리펩티드와 이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는데 적합한 항체의 면역-복합체를 감지하는 것이 포함될 수 있다. 면역-복합체의 감지 방법에는 웨스턴-블랏, 면역조직화학, 면역세포화학, 효소 연결된 면역흡착 검사 (ELISA), 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다. 항체에는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA)의 발현을 조절할 수 있는 시약을 포함하는 조성물을 투여하는 것이 포함되며, 이때 핵산에는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, SEQ ID NO: 1의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:1의 좌표 1-1212에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 766-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO:3의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:3의 좌표 1-1215에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 5의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:5의 좌표 1-1218에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-696 에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:7의 좌표 1-1290에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 844-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다.
추가 구체예에 따르면, 투여는 환자, 환자의 세포, 환자의 조직 또는 이의 임의의 복합에 투여하는 것이 포함될 수도 있다. 조절에는 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 감쇠(attenuating), 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 증가, 또는 이 두가지 모두가 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, 시약에는 상기 핵산과 하이브리드될 수 있는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드에는 데옥시리보핵산 (DNA), RNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다. siRNA에는 상보적인 제 2 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드되는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이때 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열의 최소 15개 뉴클레오티드 연속 스팬(span)이다.
추가 구체예에 따르면, 리보핵산의 발현을 조절할 수 있는 시약에는 소분자 엔티티(SME)가 포함될 수 있다. 소분자 엔티티에는 ERK-MAP 키나제 경로의 조절물질, PKC 키나제의 조절물질 및 이와 유사한 것들이 포함될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 추가 방법이 제공되는데, 이 방법에는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 시약을 포함하는 조성물의 투여가 포함되는데, 이때 폴리펩티드의 서열은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
추가 구체예에 따르면, SEQ ID NO: 2의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:2의 좌표 1-403에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 256-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 4의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:4의 좌표 1-404에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 6의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:6의 좌표 1-405에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO:8의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:8의 좌표 1-429에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 282-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다.
추가 구체예에 따르면, 투여는 환자, 환자의 세포, 환자의 조직 또는 이의 임의의 복합에 투여하는 것이 포함될 수도 있다. 조절에는 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 감쇠(attenuating), 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 증가, 또는 이 두가지 모두가 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, 시약에는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하도록 조정된 항체가 포함된다. 항체에는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는데, 이 뉴클레오티드의 서열에는 SEQ ID NO: 3이 포함된다. 분리된 폴리뉴클레오티드 분자의 보체를 추가 제공하는데, 이때 보체 및 폴리뉴클레오티드는 100% 상보적이다. 다른 구체예에 따르면, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도된 제1 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이때 제 1 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속성 제1 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도된 제2 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이때 제 2 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 또한 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도된 제 3 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이때 제 3 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
추가 구체예에서, SEQ ID NO: 3의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리펩티드를 인코드할 수 있는데, 이 폴리펩티드의 서열에는 SEQ ID NO:4가 포함된다. SEQ ID NO:4의 폴리펩티드로부터 유도된 제1 펩티드가 제공되는데, 이때 제 1 펩티드에는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속성 제1 아미노산 서열이 포함된다. SEQ ID NO:4의 폴리펩티드로부터 유도된 제2 펩티드가 제공되는데, 이때 제 2 펩티드에는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속성 제2 아미노산 서열이 포함된다. SEQ ID NO:4의 폴리펩티드로부터 유도된 제3 펩티드가 제공되는데, 이때 제 3 펩티드에는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 아미노산 서열이 포함된다. 일부 구체예에 따르면, 폴리펩티드 발현은 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 상승되었다. 폴리펩티드는 CD44 변이체다. 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합이 포함된다.
일부 구체예에 따르면, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는데, 이 뉴클레오티드의 서열에는 SEQ ID NO: 5가 포함된다. 분리된 폴리뉴클레오티드 분자의 보체를 추가 제공하는데, 이때 보체 및 폴리뉴클레오티드는 100% 상보적이다. 다른 구체예에 따르면, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도된 제1 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이때 제 1 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속성 제1 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도된 제2 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이때 제 2 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 또한 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도된 제 3 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 이때 제 3 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
추가 구체예에서, SEQ ID NO: 5의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리펩티드를 인코드할 수 있는데, 이 폴리펩티드의 서열에는 SEQ ID NO:6이 포함된다. SEQ ID NO:6의 폴리펩티드로부터 유도된 제1 펩티드가 제공되는데, 이때 제 1 펩티드에는 SEQ ID NO:6의 아미노산 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속성 제1 아미노산 서열이 포함된다. SEQ ID NO:6의 폴리펩티드로부터 유도된 제2 펩티드가 제공되는데, 이때 제 2 펩티드에는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속성 제2 아미노산 서열이 포함된다. SEQ ID NO:6의 폴리펩티드로부터 유도된 제3 펩티드가 제공되는데, 이때 제 3 펩티드에는 SEQ ID NO:6의 아미노산 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 아미노산 서열이 포함된다. 일부 구체예에 따르면, 폴리펩티드 발현은 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 상승되었다. 폴리펩티드는 CD44 변이체다. 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합이 포함된다.
일부 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환을 진단하기 위한 키트를 제공하는데, 키트는 생물학적 샘플내에 핵산의 발현을 감지할 수 있는 최소 한 가지 시약을 포함하고, 이때 핵산에는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 추가 구체예에서 따르면, SEQ ID NO: 1의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:1의 좌표 1-1212에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 766-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO:3의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:3의 좌표 1-1215에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 5의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:5의 좌표 1-1218에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:7의 좌표 1-1290에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 844-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. 추가 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다. 생물학적 샘플에는 세포, 조직, 체액, 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, 최소 한 가지 시약에는 핵산 또는 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA) 분자와 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에는 DNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환을 진단하기 위한 키트를 제공하는데, 키트는 생물학적 샘플내에 폴리펩티드의 발현을 감지할 수 있는 최소 한 가지 시약을 포함하고, 이때 폴리펩티드에는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열을 포함한다.
추가 구체예에 따르면, SEQ ID NO: 2의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:2의 좌표 1-403에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 256-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 4의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:4의 좌표 1-404에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO: 6의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:6의 좌표 1-405에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. SEQ ID NO:8의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:8의 좌표 1-429에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 282-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. 추가 구체예에 따르면, 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다. 생물학적 샘플에는 세포, 조직, 체액, 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다.
추가 구체예에 따르면, 최소 한 가지 시약에는 폴리펩티드와 특이적으로 상호작용하여, 감지가능한 면역-복합체를 형성하는데 적합한 항체가 포함된다. 항체에는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 또는 이의 임의의 복합체가 포함될 수 있다.
상기에서 설명한 예시적 측면과 구체예에 추가하여, 추가 측면 및 구체예는 도면과 다음의 상세한 설명을 참고하면 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
다음의 명세서에서, 본 발명의 다양한 측면들을 설명할 것이다. 설명을 목적으로, 특정 배치 및 상세한 설명은 본 발명의 완전한 이해를 위하여 제공된다. 그러나, 당업자는 본 발명을 여기에서 제시하는 상세한 설명없이도 실행될 수 있음을 명백하게 이해할 것이다. 또한, 공지된 특징은 본 발명을 분명하게 하기 위하여 생략하거나 단순화시킬 수도 있다.
일부 구체예에 따르면, CD44 접목 변이체가 제공되는데, 이들의 발현은 근위축성측생경화증(ALS) 및 알츠하이머 질환 (AD)와 같은 정통적인 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 환자들로부터 수득한 생물학적 샘플에서 상향 조절된다. 또한, CD44 폴리펩티드, 이를 인코드하는 폴리뉴클레오티드, 이에 대한 항체 및 올리고뉴클레오티드도 제공하는데, 이들은 신경퇴행성 질환의 치료 및 진단에 유용할 수 있다.
다음은 명세서를 통하여 이용되는 용어들로써, 다양한 구체예에 따라 다음과 같은 의미로 이해되어야 한다:
여기에서 언급된 바와 같이, 용어 “CD44 유전자”는 CD44의 유전자 서열 및/또는 유전자 구조를 말하는 것으로 도 1A에서 도식적으로 설명된다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44 변이체들 코딩 서열들” 또는 “CD44 변이체들” 또는 “CD44 접목 변이체 전사체”와 호환되는 것으로써, 용어 “CD44 접목 변이체 핵산 서열들”는 하나 또는 그 이상의 CD44 접목 변이체를 말하는 것으로 하기에서 상세하게 설명된다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44 접목 변이체 V3 핵산 코딩 서열” 또는 “CD44V3” 또는 “CD44V3 전사체” 또는 “CD44V3 코딩 서열” 또는 “CD44 접목 변이체 V3”와 호환되는, 용어 “CD44 접목 변이체 V3 핵산 코딩 서열”는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 서열을 가지는 핵산 분자, 최소 20개 뉴클레오티드 길이의 상기 핵산 분자의 단편(하기 참고) 및 서열에 최소 90% 상동성(하기 참조)를 가지는 핵산 분자를 말한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지의 CD44 전사체의 자연적 생성, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열들을 포함한다. 도 1B에 나타낸 바와 같은 CD44V3에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V3 그리고 항상성 엑손 C6이 포함되며, 좀더 바람직하게는 항상성 엑손 C1-C5, C6-C9 뿐만아니라 CD44 유전자의 가변성 엑손 V3도 포함된다. 도 2A에는 변이체 엑손 V3의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 2B는 항상성 엑손 C5와 변이체 엑손 V3 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 2C는 변이체 엑손 V3 와 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44 접목 변이체 V6 핵산 코딩 서열” 또는“CD44V6” 또는 “CD44V6 전사체” 또는 “CD44V6 코딩 서열” 또는 “CD44 접목 변이체 V6”과 호환되는 용어 “CD44 접목 변이체 V6 핵산 코딩 서열”은 SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열을 가지는 핵산 분자, 최소 20개 뉴클레오티드 길이의 상기 핵산 분자의 단편(하기 참고) 및 서열에 최소 90% 상동성(하기 참조)를 가지는 핵산 분자를 말한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지의 CD44 전사체의 자연적 생성, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열들을 포함한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지된 CD44 전사체의 신규한, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열을 포함한다. 도 1C에 나타낸 바와 같은 CD44V6에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V6 그리고 항상성 엑손 C6이 포함되며, 좀더 바람직하게는 항상성 엑손 C1-C5, C6-C9 뿐만아니라 CD44 유전자의 가변성 엑손 V6도 포함된다. 도 3A에는 변이체 엑손 V6의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 3B는 항상성 엑손 C5와 변이체 엑손 V6 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 3C는 변이체 엑손 V6 와 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44 접목 변이체 V7 핵산 코딩 서열” 또는“CD44V7” 또는 “CD44V7 전사체” 또는 “CD44V7 코딩 서열” 또는 “CD44 접목 변이체 V7”과 호환되는 용어 “CD44 접목 변이체 V7 핵산 코딩 서열”은 SEQ ID NO: 5에 나타낸 서열을 가지는 핵산 분자, 최소 20개 뉴클레오티드 길이의 상기 핵산 분자의 단편(하기 참고) 및 서열에 최소 90% 상동성(하기 참조)를 가지는 핵산 분자를 말한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지의 CD44 전사체의 자연적 생성, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열들을 포함한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지된 CD44 전사체의 신규한, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열을 포함한다. 도 1D에 나타낸 바와 같은 CD44V7에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V7 그리고 항상성 엑손 C6이 포함되며, 좀더 바람직하게는 항상성 엑손 C1-C5, C6-C9 뿐만아니라 CD44 유전자의 가변성 엑손 V7도 포함된다. 도 4A에는 변이체 엑손 V7의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 4B는 항상성 엑손 C5와 변이체 엑손 V7 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 4C는 변이체 엑손 V7 와 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44 접목 변이체 V10 핵산 코딩 서열” 또는“CD44V10” 또는 “CD44V10 전사체” 또는 “CD44V10 코딩 서열” 또는 “CD44 접목 변이체 V10”과 호환되는 용어 “CD44 접목 변이체 V10 핵산 코딩 서열”은 SEQ ID NO: 7에 나타낸 서열을 가지는 핵산 분자, 최소 20개 뉴클레오티드 길이의 상기 핵산 분자의 단편(하기 참고) 및 서열에 최소 90% 상동성(하기 참조)를 가지는 핵산 분자를 말한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지의 CD44 전사체의 자연적 생성, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열들을 포함한다. 이 분자는 고유의 그리고 공지된 CD44 전사체의 신규한, 선택적 접목 변이체를 코딩하는 서열을 포함한다. 도 1E에 나타낸 바와 같은 CD44V10에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V10 그리고 항상성 엑손 C6이 포함되며, 좀더 바람직하게는 항상성 엑손 C1-C5, C6-C9 뿐만아니라 CD44 유전자의 가변성 엑손 V10도 포함된다. 도 5A에는 변이체 엑손 V10의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 5B는 항상성 엑손 C5와 변이체 엑손 V10 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다. 도 5C는 변이체 엑손 V10 와 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 뉴클레오티드 서열을 나열하고 있다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44 변이체들 산물” 또는 “CD44 변이체들 단백질” 또는 “CD44 변이체들 펩티드”과도 호환되는, 용어 “CD44 접목 변이체 산물”는 하기에서 설명하게 되는 하나 또는 그 이상의 CD44 접목 변이체 산물을 말한다.
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44V3 단백질” 또는 “CD44V3 펩티드”와 호환할 수 있는, 용어 “CD44V3 산물”는 CD44V3 코딩 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다. “폴리펩티드”는 펩티드 또는 단백질, 뿐만 아니라 글리코펩티드 또는 글리코단백질과 같은 화학적으로 변형된 아미노산(하기 참조)을 가지는 펩티드 또는 단백질을 말한다. CD44V3 산물의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 나타내었다. CD44V3의 C5-V3-C6의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2의 좌표 214-274에 상응한다. 도 2A는 변이체 엑손 V3의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2B는 항상성 엑손 C5 및 변이체 엑손 V3 사이의 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2C는 변이체 엑손 V3과 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. “CD44V3 산물”에는 상기 아미노산 서열에 유사한 것(하기 참조)도 포함되고 뿐만 아니라 이 서열의 최소 6개 아미노산을 가지는 단편들도 포함되는데, 이때 하나 또는 그 이상의 아미노산들은 추가, 결손, 치환(하기 참고) 또는 화학적으로 변형된다(하기 참조).
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44V6 단백질” 또는 “CD44V6 펩티드”와 호환할 수 있는, 용어 “CD44V6 산물”는 CD44V6 코딩 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다. “폴리펩티드”는 펩티드 또는 단백질, 뿐만 아니라 글리코펩티드 또는 글리코단백질과 같은 화학적으로 변형된 아미노산(하기 참조)을 가지는 펩티드 또는 단백질을 말한다. CD44V6 산물의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 나타내었다. CD44V6의 C5-V6-C6의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4의 좌표 214-275에 상응한다. 도 3A는 변이체 엑손 V6의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 3B는 항상성 엑손 C5 및 변이체 엑손 V6 사이의 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 3C는 변이체 엑손 V6과 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. “CD44V6 산물”에는 상기 아미노산 서열에 유사한 것(하기 참조)도 포함되고 뿐만 아니라 이 서열의 최소 6개 아미노산을 가지는 단편들도 포함되는데, 이때 하나 또는 그 이상의 아미노산들은 추가, 결손, 치환(하기 참고) 또는 화학적으로 변형된다(하기 참조).
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44V7 단백질” 또는 “CD44V7 펩티드”와 호환할 수 있는, 용어 “CD44V7 산물”는 CD44V7 코딩 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다. “폴리펩티드”는 펩티드 또는 단백질, 뿐만 아니라 글리코펩티드 또는 글리코단백질과 같은 화학적으로 변형된 아미노산(하기 참조)을 가지는 펩티드 또는 단백질을 말한다. CD44V7 산물의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6에 나타내었다. CD44V7의 C5-V7-C6의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6의 좌표 214-276에 상응한다. 도 4A는 변이체 엑손 V7의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4B는 항상성 엑손 C5 및 변이체 엑손 V7 사이의 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4C는 변이체 엑손 V7과 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. “CD44V7 산물”에는 상기 아미노산 서열에 유사한 것(하기 참조)도 포함되고 뿐만 아니라 이 서열의 최소 6개 아미노산을 가지는 단편들도 포함되는데, 이때 하나 또는 그 이상의 아미노산들은 추가, 결손, 치환(하기 참고) 또는 화학적으로 변형된다(하기 참조).
여기에서 언급된 바와 같이, “CD44V10 단백질” 또는 “CD44V10 펩티드”와 호환할 수 있는, 용어 “CD44V10 산물”는 CD44V10 코딩 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이다. “폴리펩티드”는 펩티드 또는 단백질, 뿐만 아니라 글리코펩티드 또는 글리코단백질과 같은 화학적으로 변형된 아미노산(하기 참조)을 가지는 펩티드 또는 단백질을 말한다. CD44V10 산물의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8에 나타내었다. CD44V10의 C5-V10-C6의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8의 좌표 214-300에 상응한다. 도 5A는 변이체 엑손 V10의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 5B는 항상성 엑손 C5 및 변이체 엑손 V10 사이의 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 5C는 변이체 엑손 V10과 항상성 엑손 C6 사이에 졍션 브릿지의 아미노산 서열을 나타낸다. “CD44V10 산물”에는 상기 아미노산 서열에 유사한 것(하기 참조)도 포함되고 뿐만 아니라 이 서열의 최소 6개 아미노산을 가지는 단편들도 포함되는데, 이때 하나 또는 그 이상의 아미노산들은 추가, 결손, 치환(하기 참고) 또는 화학적으로 변형된다(하기 참조).
상동체(Homologue)는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8중 임의의 서열에 최소 90% 상동인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말하거나 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8의 임의 서열중 최소 6개 아미노산의 단편에 최소 90% 상동인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말한다. 상동체와 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 의 임의의 서열 또는 이의 단편 사이에 아미노산 서열 변이는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8의 임의의 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가, 결손, 치환 또는 화학적 변형으로 인하여 발생한다. 상동체에는 치환이 포함되는데, 이때 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다.
“핵산 분자” 또는 “핵산” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 DNA (데옥시리보핵산) 뉴클레오티드, RNA (리보핵산) 뉴클레오티드 또는 이들 두 가지 타입의 복합으로 구성된 단일-가닥 또는 이중-가닥 폴리머를 말하며, 그리고 자연 뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
“아미노산 서열”은 20가지 자연 생성 아미노산, 화학적으로 변형된(하기 참조) 또는 합성 아미노산으로 구성된 서열을 말한다.
“보존적 치환”은 한 분류내 아미노산이 동일한 분류에 속하는 아미노산으로 치환되는 것을 말하는데, 이때 분류는 공통의 물리-화학적 아미노산 측쇄 성질 및 표준 Dayhoff 빈도 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정된 바와 같이, 천연에서 볼 수 있는 상동성 단백질에 고치환 빈도로 정의된다. 아미노산의 6가지로 일반적으로 분류되고, Class I (Cys); Class II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Class III (Asn, Asp, Gln, Glu); Class IV (His, Arg, Lys); Class V (He, Leu, Val, Met); 그리고 Class VI (Phe, Tyr, Trp)가 포함된다. 예를 들면, Asp는 Class III의 잔기 가령, Asn, Gln, 또는 Glu으로 치환되는 것이 보존성 치환이다.
“비-보존성 치환”은 한 분류의 아미노산이 다른 분류에 속하는 아미노산으로 치환되는 것을 말하는데, 예를 들면, Ala(Class II)이 Class III 잔기, 예를 들면, Asp, Asn, Glu, 또는 Gln으로 치환되는 것을 말한다.
“화학적으로 변형된”은 아미노산 잔기들중 최소 하나가 자연적 프로세스 예를 들면, 프로세싱 또는 다른 전사후 변형에 의해 또는 당분야에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형된 산물 (단백질)을 말한다. 다수의 공지된 변형 방법으로 일반적으로, 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), 아미드화(amidation), ADP-리보실화(ribosylation), 글리코실화(glycosylation), 글리코사미노글리칸화(glycosaminoglycanation), GPI 앵커 형성(anchor formation), 지질 또는 지질 유도체에 공유적 부착, 메틸화(methylation), 미리스틸화(myristlyation), 페길화(pegylation), 프레닐화(prenylation), 포스포릴화(phos-phorylation), 유비퀴티닌화(ubiqutination) 또는 임의 유사한 과정이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다.
“최적 배열(Optimal alignment)”은 최대 상동성 비율 수치를 제공하는 배열로 정의한다. 디폴트 변수들의 셋업을 이용한 국소 배열 프로그램 LALIGN과 같은 상업적으로 이용할 수 있는 다양한 서열 분석 프로그램을 이용하여 이와 같은 배열을 실행할 수 있다.
두 세트의 아미노산 또는 핵산 서열들에 대해 “최소 90% 상동성을 가지는”이란 서열들을 최적으로 배열하였을 때 두 서열들에서 동일한 잔기들의 비율을 말한다. 따라서, 최소 90% 아미노산 서열 상동성은 두 개 또는 그이상의 최적으로 배열된 폴리펩티드 서열들에서 최소 90%의 아미노산이 동일하다는 것을 의미한다; 그러나, 이와 같은 정의에는 변이체들이 변이되는 원천 핵산 서열 또는 원천 단백질 서열과 100% 동일한 서열은 명시적으로 배제된다.
“변이체 핵산 서열을 가지는 분리된 핵산 분자” 및 “분리된 폴리뉴클레오티드 분자”는 변이체 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 말한다. 분리된 핵산 분자에는 독립적 삽입체로써의 변이체 코딩 서열을 포함하나 이에 국한시키지 않으며; 융합 단백질을 함께 인코드하는 추가 코딩 서열에 융합된 변이체 코딩 서열 (이때 변이체 코딩 서열은 우성 코딩 서열(예를 들면, 추가 코딩 서열은 단일 펩티드를 코드할 수 있음)을 포함할 수 있고; 변이체 코딩 서열은 인트론 또는 프로모터 및 종료 요소 제어 요소와 복합하거나 적절한 숙주에서 코딩 서열의 발현에 효과적인 5' 및/또는 3' 비해독 부분과 복합될 수 있으며; 또는 벡터가 될 수도 있는데, 이때 변이체 단백질 코딩 서열은 이형성이다.
“발현벡터”는 이형 DNA 단편이 결합하여 이질 세포에서 이를 발현시킬 수 있는 능력을 가진 벡터를 말한다. 많은 진핵 및 원핵 발현벡터가 공지되어 있고 및/또는 상업적으로 이용가능하다. 적절한 발현벡터 선택은 당분야 당업자의 지식 범위내에 있다.
“올리고뉴클레오티드”는 리보-핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 이의 모방체의 단일 가닥 또는 이중-가닥 올리고머 또는 폴리머를 말한다. 이 용어에는 자연 생성 염기, 슈가 및 공유적 뉴클레오시드간 링키지(예를 들면, 기본골격)으로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 기능적으로는 자연 발생 부분과 유사한, 비-자연적 발생 부분을 가지는 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
“결손”은 자연 생성 서열과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기들이 없는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 변화를 말한다.
“삽입” 또는 “추가”는 자연 생성 서열과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기들이 추가되는 결과를 가지는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 변화를 말한다.
“치환”은 자연 생성 서열과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 대체되는 것을 말한다. 아미노산 서열들에서, 치환은 보존성 또는 비-보존성일 수 있다.
“항체”는 IgG, IgM, IgD, IgA, 및 IgE 항체 중 임의의 항체를 말한다. 정의에는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체가 포함된다. 이 용어는 전체 항체 또는 항-변이체 산물의 항원-결합 도메인, 예를 들면, scFv, Fab, F(ab')2, Fc 부분이 없는 다른 항체들, 단일쇄 항체, 이중특이적 항체, 이량체항체(diabodies), 항체의 가변성 항원-결합 도메인만으로 구성된 다른 단편들 및 전체 항체의 항원-결합 특징을 실질적으로 보유하는 이와 유사한 것들을 포함하는 항체의 단편들을 말한다.
“항진제(Agonist)”는 CD44 변이체 산물의 효과를 모방한 분자 또는 CD44 변이체 산물과 비교하였을 때 강화된 활성을 가지는 분자 또는 변이체 자체에 의해 유도된 것과 비교하였을 때, 변이체 산물의 생물학적 활성 기간이 증가 또는 연장되는 분자를 말한다. 기전은 수용체에 결합하는 것과 같이, 생물학적 분자의 활성의 연장; 분자의 생명의 연장; 표적에 대한 분자의 활성 증가; 분자의 분해 또는 단백질분해의 저해 및 기타 등등에 공지된 임의 기전일 수 있다. 항진제는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 이의 유사체 또는 임의 분자일 수 있고, 이들은 변이체 산물의 활성을 양성적으로 조절할 수 있다.
“길항제”는 CD44 변이체 산물의 생물학적 활성의 지속을 저해하는 또는 짧아지게 하는 분자를 말한다. 이는 수용체의 차단, 활성 부위의 차단, 결합 부위상에 경쟁, 분해 강화 및 이와 유사한 생물학적 분자를 저해 또는 비활성화시키는 것으로 공지된 임의 기전에 의해 수득될 수 있을 것이다. 길항제는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 또는 이의 유도체들 또는 임의의 다른 분자들이 될 수 있고, CD44 변이체 산물의 활성을 음성적으로 조절할 수 있다.
“생물학적 샘플” - 다양한 구체예 및 실시예에 이용된 생물학적 샘플은 임의의 적절한 신체로부터 유도된 샘플이 될 수 있다. 샘플에는 전혈(whole blood), 말초 혈액 단세포, 백혈구와 같은 유체 샘플들이 포함된다. 샘플에는 다양한 세포와 조직들이 포함될 수 있다. 샘플에는 고정된 및/또는 침지된(embedded) 조직 부분들이 포함된다. 샘플은 새로 추출된 것이거나 냉동된 것일 수도 있다. 샘플은 살아있는 또는 죽은 개체로부터 수득될 수도 있고, 사람, 생쥐 및 쥐와 같은 임의 유기체로부터 수득될 수도 있다.
“질환을 치료하는”은 질환과 연관된 증상을 감소시키거나, 중증도를 줄이거나 또는 질환을 치료하거나 또는 질환의 발생을 저해시키는데 효과적인 최소 한 가지 시약/물질이 포함된 조성물을 투여하는 것을 말한다.
여기에서 언급된 바와 같이, 용어 “조정하다(modulate)”는 핵산 및/또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성에 영향을 주는(변화시키는) 것을 말한다. 용어 “조정(modulating)”은 핵산 및/또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 증가 및/또는 감쇠(하향 조절)을 말한다.
“감지(Detection)”, “진단(Diagnosis)”은 질환, 징후, 장애, 병리학적 또는 정상 상태의 감지; 질환, 징후, 장애, 병리학적 상태의 분류; 질환, 징후, 장애, 병리학적 상태의 중증도 결정; 질환, 징후, 장애, 병리학적 상태 진행의 결정; 결과의 예측 및/또는 회복 전망을 말한다.
“프로브(probe)” 변이체 코딩 서열, 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 핵산 분자, 샘플내 다른 유사한 서열들의 존재를 감지하는데 이용된다. 감지는 프로브와 검사된 서열간에 하이브리드 반응 복합체의 확인으로 실시된다. 일부 구체예에서, 프로브는 고형 서포트 또는 감지가능한 라벨에 부착될 수 있다. 프로브는 일반적으로 단일 가닥일 것이고, 10개 내지 100개 뉴클레오티드 사이에 있을 것이다. 프로브의 특정 성질은 특정 용도에 따라 달라질 수 있으며, 당업자의 능력 범위내에서 바로 결정할 수 있다.
“프라이머 쌍(primer pair)” 두 개의 핵산 분자의 쌍 (“프라이머들”), 이들 각각은 폴리메라제 또는 전사효소에 의한 주형-유도된 중합반응을 준비시키는 기능을 할 수 있고, 프라이머들은 프라이머 하이브리드 반응 부위간에 위치한 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 중합반응( 및 증폭반응)을 지도하기 위한 방식으로 이중 가닥의 핵산 서열(“주형”)의 반대 서열에 하이브리드된다. 이와 같은 프라이머 쌍은 잘 공지된 중합효소 쇄 반응 (PCR)에 이용된다. 프라이머 쌍의 디자인은 당분야에 잘 공지되어 있고, 그리고 증폭되는 특정 서열에 따라 달라진다. 일반적으로, 프라이머들은 단일-가닥이며, 길이는 10 내지 40개 염기이며, 50개 내지 2000개 염기 범위로 서로 떨어져 위치한 주형 서열에 하이브리드된다.
“브릿지 졍션(bridging junction)”과 호환되는 “접목 졍션(Splice junction)”은 접목이 발생되는 뉴클레오티드 부분을 말한다. 이는 프로세스된 전사체의 서열내 엑손이 이의 측면 엑손에 연결되는 부위가 된다.
“하이브리드 반응(Hybridization)” 또는 “핵산 하이브리드 반응”은 단일 가닥의 핵산 분자와 보체 핵산 분자가 하나의 분사로 복합되는(상호작용) 과정을 말한다.
인간 CD44 유전자 구조을 도식적으로 설명하는 도 1을 참고로 한다. 도 1A는 사람 CD44 유전자의 구조를 설명하는데, 9개 가변성 엑손 (■, V2-10로 표시함)과 항상성 엑손 (□, Cl-5 및 C6-10으로 표시함)으로 구성된다. 도 1B는 CD44 변이체 전사체 CD44V3의 구조를 도식적으로 설명하는데, 항상성 엑손에 추가하여, 가변성 엑손 3을 포함한다. 도 1C는 CD44 변이체 전사체 CD44V6의 구조을 도식적으로 설명하는데, 항상성 엑손에 추가하여, 가변성 엑손 6을 포함한다. 도 1D는 CD44 변이체 전사체 CD44V7의 구조를 도식적으로 설명하는데, 항상성 엑손에 추가하여, 가변성 엑손 7을 포함한다. 도 1E는 CD44 변이체 전사체 CD44V10의 구조를 도식적으로 설명하는데, 항상성 엑손에 추가하여, 가변성 엑손 10을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, RNA 샘플은 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 개체(환자) 또는 동물 모델, 가령, 신경퇴행성 질환의 모델로 이용되는 전이유전자 생쥐의 생물학적 샘플로부터 추출할 수 있다. 추출된 RNA에는 전체 RNA 또는 mRNA를 포함할 수 있다. 추출된 RNA는 역전사되거나 PCR 증폭 반응에 이용될 수 있다. PCR 증폭 반응에는 프라이머를 추가 포함될 수 있는데, 이의 뉴클레오티드 서열은 CD44 유전자의 다양한 변이체 엑손내 부분, CD44 유전자의 다양한 항상성 엑손내 부분, 항상성 및 가변성 엑손을 연결하는 졍션의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부분, 또는 이의 임의의 복합 부분들로부터 유도될 수 있다. 생성된 PCR 산물을 분석하고, 이들 서열을 결정할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 다양한 CD44 전사체들이 확인될 수 있는데, 다른 것들을 포함하여 기존에 설명되지 않은 신규한 CD44 접목 변이체 전사체가 포함될 수 있다.
또한, RNA 샘플은 신경퇴행성 질환 (환자)으로 진단을 받은 개체 뿐만 아니라 신경퇴행성 질환으로 진단을 받지 않았지만 성별 및 나이가 일치되는 개체 (정상 대조군)로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다. 추출된 RNA에는 총 RNA 또는 mRNA가 포함될 수 있다. 추출된 RNA는 역전사되거나 PCR 증폭 반응에 이용될 수 있다. PCR 증폭 반응에는 프라이머를 추가 포함될 수 있는데, 이의 뉴클레오티드 서열은 CD44 유전자의 다양한 변이체 엑손내 부분, CD44 유전자의 다양한 항상성 엑손내 부분, 항상성 및 가변성 엑손을 연결하는 졍션의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부분, 또는 이의 임의의 복합 부분들로부터 유도될 수 있다. 환자의 생물학적 샘플 및 정상 대조군 개체로부터 수득된 생성된 PCR 산물을 분석하고, 이들 서열을 결정할 수 있다. PCR 산물에는 CD44 전사체를 포함하는데, 여기에는 당분야에 기존에 설명되지 않은 신규한 CD44 접목 변이체 전사체들이 포함된다. 또한, 다양한 CD44 전사체들을 나타내는 다양한 PCR 산물의 발현 수준은 환자 및 정상 대조군에서 얻은 샘플간에 비교할 수 있다.
다양한 CD44 변이체 전사체의 발현 수준과 상이한 샘플간에 발현 수준의 비교는 당분야에 공지된 방법들에 의해 결정될 수 있는데, 예를 들면, 반 정량적 역 전사(RT)-PCR, 실시간 PCR, 및 이와 유사한 것들이다. 예를 들면, 이와 같은 비교에는 정상 대조군에서 수득한 샘플과 비교하였을 때 환자로부터 수득된 샘플내 특정 접목 변이체들의 독점적 발현이 포함된다. 예를 들면, 이와 같이 정상 대조군으로부터 얻은 샘플과 비교하였을 때, 환자로부터 수득된 샘플내 특정 접목 변이체의 발현 수준의 상승(상향 조절)이 나타날 수 있다. 예를 들면, 이와 같이 정상 대조군으로부터 얻은 샘플과 비교하였을 때, 환자로부터 수득된 샘플내 특정 접목 변이체의 발현 수준의 감소(하향 조절)이 나타날 수 있다. 예를 들면, 이와 같이 정상 대조군으로부터 얻은 샘플과 비교하였을 때, 환자로부터 수득된 샘플내 특정 접목 변이체의 발현 수준의 변화가 관찰되지 않을 수도 있다. 예를 들면, 이와 같이 환자로부터 수득된 샘플과 비교할 때 정상 대조군에서 수득된 샘플내 특정 접목 변이체의 배타적 발현이 나타날 수 있다.
일부 예시적인 구체예에 따르면, 총 RNA는 알츠하이머 질환 (AD 환자)로 진단을 받은 개체의 사후 해마 뿐만 아니라 질환으로 진단을 받지 않은 나이와 성별이 일치하는 개체(정상 대조군)로부터 얻은 해마 샘플로부터 추출한다. 하기 실시예 1에서 설명되는 바와 같이 RNA는 역전사되고, PCR 증폭 반응에 이용된다. PCR 에는 프라이머를 추가 포함될 수 있는데, 이의 뉴클레오티드 서열은 CD44 유전자의 다양한 변이체 엑손내 부분, CD44 유전자의 다양한 항상성 엑손내 부분, 항상성 및 가변성 엑손을 연결하는 졍션의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부분, 또는 이의 임의의 복합 부분들로부터 유도될 수 있다. 예시적인 프라이머 서열들을 하기 실시예 1에서 나열하고 있다. 따라서 수득된 생성 PCR 산물들의 분석에서 몇 가지 CD44 접목 변이체를 나타내는데, 이들의 발현은 정상 대조군에서 수득된 샘플과 비교하였을 때 환자에서 얻은 샘플에서 상향조절된다. 특히, 몇가지 CD44 접목 변이체가 확인되었는데, 이들에는 CD44의 항상성 엑손에 인접한 넌스킵(non-skipped) 단일 변이체 엑손을 포함하며, 정상 대조군에 비교하여 AD 환자에서 상당히 발현이 증가된 것으로 나타났다. 따라서, 확인된 CD44 접목 변이체에는 CD44V3, CD44V6, CD44V7 및 CD44V10이 포함된다. 하기 실시예 2에서 설명하게 되는 실시간 PCR 실험에서 CD44V3, CD44V6, 및 CD44V10 접목 변이체는 정상 대조군과 비교하였을 때, AD 환자에서 각각 약 7.17배, 7.02배 그리고 18.15배 발현이 상향 조절된 것으로 나타났다. 추가로, CD44의 아형(isoform)인 CD44S는 정상 대조군과 비교하였을 때, AD 환자에서 약 4.95배 상향 조절되었다.
추가 구체예에 따르면, 하기 실시예 3에서 추가 설명될 AD 유사 병인의 모델로 이용될 수도 있는 APP751 유전자전이 생쥐로부터 총 RNA를 추출한다. 해마 조직의 RNA를 7-7.5 월령의 암컷 APP751 유전자전이 생쥐와 비-유전자전이된 한배 새끼로부터 분리한다. 하기에서 실시예 3에서 추가 설명되는 바와 같이, RNA는 역전사되고, PCR 증폭 반응에 이용된다. 그 결과 비-유전자전이 생쥐 대조군과 비교하였을 때, APP751 유전자전이 생쥐내 V7-C10 졍션을 가지는 전사체를 인코드하는 mRNA의 발현이 7.2배 증가되었다. 동일한 조건하에, CD44S의 발현 수준은 16% 증가되었다. APP751 유전자전이 생쥐 (실시예 3에서 설명된)에서 CD44V7 발현의 상향 조절과 AD 환자 뇌에서 CD44V7의 발견 (실시예 1에서 설명됨)으로 AD 병리에 CD44V7의 관련, 예를 들면, Aβ 하류 축적(downstream of accumulation), 특정 뇌 부분에 이의 축적은 AD의 특징중에 하나이다.
일부 구체예에서, 그리고 도 1B에서 도식적으로 설명된 것과 같이, 접목 변이체 CD44V3 전사체에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V3 그리고 항상성 엑손 C6이 포함된다. 좀더 적절하게는, 접목 변이체 CD44V3 전사체에는 항상성 엑손 C1-C5, 변이체 엑손 3 및 항상성 엑손 C6-C9이 포함된다. 디폴트 변수들 및 CD44V3의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 인간의 발현된 서열들의 공개 데이터베이스상에 Blast 조사로 임의 공지된 mRNA에 상동성이 없는 단일 EST (수탁번호 DA283531)가 결과된다. CD44V3의 C5-V3-C6의 뉴클레오티드 서열 (도 2A-C에서 설명된 것과 같이, 그리고 SEQ ID NO: 1의 좌표 639-822)을 이용한 유사한 Blast 조사로 유사한 결과를 얻었다.
일부 구체예에서, 그리고 도 1C에서 도식적으로 설명된 것과 같이, 접목 변이체 CD44V6 전사체에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V6 그리고 항상성 엑손 C6이 포함된다. 좀 더 적절하게는, 접목 변이체 CD44V6 전사체에는 항상성 엑손 C1-C5, 변이체 엑손 6 및 항상성 엑손 C6-C9이 포함된다. 디폴트 변수들 및 CD44V6의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 인간의 발현된 서열들의 공개 데이터베이스상에 Blast 조사로 임의 유사한 EST 또는 mRNA 서열이 결과되지 않는다. CD44V6의 C5-V6-C6의 뉴클레오티드 서열 (도 3A-C에서 설명된 것과 같이, 그리고 SEQ ID NO: 3의 좌표 639-825)을 이용한 유사한 Blast 조사로 동일한 분자에 C5V6 및 V6C6 모두의 뉴클레오티드 서열 복합을 포함하는 mRNA 또는 EST는 발견되지 않은 것으로 나타났다. 따라서, CD44V6는 기존에 설명되지 않은 CD44 유전자의 신규한 접목 변이체다. Guriec et al. (Breast Cancer Res Treat. 1997 44:261-8)는 V6 만을 언급했으며, V6-C6 부분만 점검하고, V6와 연결된 다른 부분은 점검하지 않았다.
일부 구체예에서, 그리고 도 1D에서 도식적으로 설명된 것과 같이, 접목 변이체 CD44V7 전사체에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V7 그리고 항상성 엑손 C6이 포함된다. 좀 더 적절하게는, 접목 변이체 CD44V7 전사체에는 항상성 엑손 C1-C5, 변이체 엑손 7 및 항상성 엑손 C6-C9이 포함된다. 접목 변이체 CD44V7 전사CD44V7의 C5-V7-C6 부분 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 좌표 639-828에 상응한다. 디폴트 변수들 및 CD44V7의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 인간의 발현된 서열들의 공개 데이터베이스상에 Blast 조사로 임의 유사한 EST 또는 mRNA 서열이 결과되지 않았고, 즉, 동일 분자상에 C5V7 및 V7C6 브릿지를 모두 포함하는 mRNA는 발견되지 않았다.
일부 구체예에서, 그리고 도 1E에서 도식적으로 설명된 것과 같이, 접목 변이체 CD44V10 전사체에는 최소 항상성 엑손 C5, 변이체 엑손 V10 그리고 항상성 엑손 C6이 포함된다. 좀 더 적절하게는, 접목 변이체 CD44V10 전사체에는 항상성 엑손 C1-C5, 변이체 엑손 10 및 항상성 엑손 C6-C9이 포함된다. 디폴트 변수들 및 CD44V10의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 인간의 발현된 서열들의 공개 데이터베이스상에 Blast 조사로 한 가지 mRNA(EF58137)과 두 개 EST(CD641177 및 AW995521)이 결과된다. CD44V10의 C5-V10-C6의 뉴클레오티드 서열 (도 5A-C에서 설명된 것과 같이, 그리고 SEQ ID NO: 7의 좌표 639-900)을 이용한 유사한 Blast 조사에서 유사한 결과를 얻었다.
추가 예시적 구체예에 따르면, 그리고 하기 실시예 4에서 추가 상세하게 설명한 것과 같이, 총 RNA를 ALS로 진단을 받은 개체(ALS 환자)의 사후 해마 뿐만 아니라 질환으로 진단을 받지 않은 나이와 성별이 일치하는 개체(정상 대조군)로부터 얻은 해마 샘플로부터 추출한다. RNA는 역전사되고, PCR 증폭 반응에 이용된다. PCR 에는 프라이머를 추가 포함될 수 있는데, 이의 뉴클레오티드 서열은 CD44 유전자의 다양한 변이체 엑손내 부분, CD44 유전자의 다양한 항상성 엑손내 부분, 항상성 및 가변성 엑손을 연결하는 졍션의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부분, 또는 이의 임의의 복합 부분들로부터 유도될 수 있다. 따라서 수득된 생성 PCR 산물들의 분석에서 몇 가지 CD44 접목 변이체를 나타내는데, 이들의 발현은 정상 대조군에서 수득된 샘플과 비교하였을 때 환자에서 얻은 샘플에서 상향조절된다. 특히, 몇가지 CD44 접목 변이체가 확인되었는데, 이들에는 CD44의 항상성 엑손에 인접한 넌스킵(non-skipped) 단일 변이체 엑손을 포함하며, 정상 대조군에 비교하여 ALS 환자에서 상당히 발현이 증가된 것으로 나타났다. 따라서, 확인된 CD44 접목 변이체에는 CD44V3, CD44V6, CD44V7 및 CD44V10이 포함된다.
확인된 CD44 변이체 전사체들, 가령, CD44V3, CD44V6, CD44V7 및 CD44V10, 그리고 이들의 각 단백질 산물들은 고유 아교세포(미세아교세포 또는 성상세포)에 의해 또는 보호성 또는 유해성이 될 수도 있는 T-임파세포와 같은 염증 세포의 침윤에 의해 중재될 수 있는 염증 프로세스에 관여하고, 그리고 일부 엑손의 넌-스킵핑으로 되는 질병의 과정에서 자극받는다. 접목 변이체의 선택은 종 및 질병 특이적인 것으로 보인다.
일부 구체예에 따르면, 다양한 CD44 변이체 단백질의 서열들로부터 유도된 펩티드들은 다양한 수단, 예를 들면, 화학적 합성 및/또는 재조합 방법에 의해 준비될 수 있고, 이들 펩티드에 대항되는 특정 항체들의 생산을 위한 항원으로 이용될 수도 있다. 따라서 준비된 항체들에는 다클론성 및 단클론성 항체가 포함될 수 있고, 다양한 CD44 변이체 단백질을 특이적으로 인지할 수도 있다. 항체의 준비 및 정제는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 실행할 수 있다. 다양한 CD44 변이체 단백질을 특이적으로 인지하고, 이에 결합하는 항체는 당분야에 공지된 다른 CD44 변이체 단백질과 비교하였을 때 최소 2배 이상의 더 높은 친화력을 나타낸다(이는 여기 설명된 임의 구체예에서 설명되지 않음). 결합 특이성은 당업자에 잘 알려진 다양한 방법에 의해 평가될 수 있는데, 예를 들면, 결합 검사, 생물학적 검사 그리고 이의 임의의 복합 방법이 된다.
일부 구체예에 따르면, CD44V3 산물, CD44V6 산물, CD44V7 산물, CD44S 산물 및 CD44V10 산물과 같은 여기에서 설명된 다양한 CD44 변이체 산물들의 서열로부터 유도된 펩티드들은 고형상 합성에 의해 화학적으로 합성될 수도 있고(Merrifield, J. 1964, Biochemistry, 3:1385-90) 그리고 CD44 변이체 단백질을 특이적으로 인지할 수 있는 항체의 생산에 이용될 수 있다. 항체에는 예를 들면, 다클론성 항체 및/또는 단클론성 항체가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 CD44 변이체 산물의 서열로부터 유도된 펩티드는 가변성 엑손 및 항상성 엑손 사이 졍션에 상응하는 부분들로부터 수득할 수 있다. CD44V3 단백질로부터 유도된 펩티드에는 예를 들면, 엑손 C5과 V3 ( SEQ ID NO: 2에서 아미노산 214-233, 그리고 도 2B)를 연결하는 아미노산 서열에 상응하는 졍션 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단백질로부터 유도된 펩티드에는 엑손 V3과 C6( SEQ ID NO: 2에서 아미노산 256-275, 그리고 도 2C)를 연결하는 아미노산 서열에 상응하는 졍션 부분을 포함할 수 있다. CD44V6 단백질로부터 유도된 펩티드에는 예를 들면, 엑손 C5과 V6 ( SEQ ID NO: 4에서 아미노산 214-233, 그리고 도 3B)를 연결하는 아미노산 서열에 상응하는 졍션 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, CD44V6 단백질로부터 유도된 펩티드에는 엑손 V6과 C6 ( SEQ ID NO: 4에서 아미노산 257-276, 그리고 도 3C)를 연결하는 아미노산 서열에 상응하는 졍션 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, CD44V10 단백질로부터 유도된 펩티드에는 엑손 C5과 V10 ( SEQ ID NO: 8에서 아미노산 214-233, 그리고 도 5B)를 연결하는 아미노산 서열에 상응하는 졍션 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면, CD44V10 단백질로부터 유도된 펩티드에는 엑손 V10과 C6 ( SEQ ID NO: 8에서 아미노산 282-301, 그리고 도 5C)를 연결하는 아미노산 서열에 상응하는 졍션 부분을 포함할 수 있다. 이와 같은 펩티드들로 면역주사를 맞은 생쥐의 비장세포를 골수종 세포에 융합시키고, 특이적 단백질 Abs를 생산하는 하이브리도마는 CD44 변이체를 인코드하는 재조합 구조체로 안정적으로 형질감염된 Namalwa Burkitt's 임파종 세포주에 결합하나, 형질감염안된 또는 CD44-형질감염된 대조군 세포에는 결합하지 않는 세포들의 상층액의 능력을 테스트함으로써 선별될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 다양한 CD44 접목 변이체 단백질에 특이적으로 반응하고, 이를 인지하는 특정 항체와 같은 시약들을 신경퇴행성 질환의 진단에 이용할 수 있다. 다양한 CD44 접목 변이체 단백질의 발현 분석은 테스트할 개체로부터 수득된 다양한 생물학적 샘플 상에서 실시할 수 있다. 이와 같은 샘플에는 혈장 샘플, 조직 샘플 및 이와 유사한 것들이 포함될 수 있다. 샘플 분석을 이용하여 다양한 CD44 변이체 단백질의 존재(presence), 존속(existence) 뿐만 아니라 발현 수준을 결정할 수 있다. 분석에는 샘플에서 단백질 발현을 결정하는데 이용되는 다양한 잘 알려진 방법이 포함되는데, 예를 들면, 웨스턴-블랏팅, 효소 연결된 면역흡착 검사(ELISA), 방사 면역 측정(RIA), 및 이와 유사한 것이 된다. CD44 변이체 단백질의 존재 및/또는 발현 수준은 공지의 사전 계산된 대조군과 비교하고, 테스트된 개체와 대조군 사이에 발현 차이는 질환의 존재 뿐만 아니라 질환의 진행 수준을 나타낼 수 있다.
일부 예시적인 구체예에 따르면, AD 환자 뇌의 해마 조직의 면역조직화학적 분석을 하기 실시예 5에서 상세히 설명하는 것과 같이 실행한다. AD 환자' 뇌 조직의 면역조직화학적 착색을 위한 CD44S, CD44V3, CD44V6 또는 CD44V10에 대한 특이적 항체를 이용하였다. 면역조직화학 착색으로 다양한 CD44 아형의 세포 및 하류 세포의 차등 국소화가 결과된다. 실시예 5에서 설명되는 것과 같이, CD44S는 주로 성상세포 및 노쇠한 플락내에서 발견되고, CD44V6 및 CD44V10 착색은 리포퓨신(lipofuscsin) 자가형광(autofluorescence) 부분이 중복되는 부핵체 부위 뉴런에서 발견된다. CD44V3 착색은 성상세포 및 뉴런 부핵체(paranuclear) 부위 모두에서 발견된다. 리포푸신(Lipofuscin)은 산화된 단백질 및 지질분해 잔기의 리소좀 복합체로써, 늙은 뉴런내에 축적된다. 이 결과는 CD44S와는 대조적으로, 뉴런에서 발현되는 CD44 변이체 단백질은 병리생리학적 프로세스에 직접적인 역할을 하여, 신경 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것이 설명된다. 예를 들면, CD44 변이체들은 뉴런에서 APP 전구물질 단백질로부터 Aβ의 세포내 프로세싱에 신규한 기능을 가질 수도 있다. 예를 들면, CD44 변이체들 가령, CD44V3, CD44V6, CD44V7 및 CD44V10는 오랫동안 생존한 단백질 및 기관의 분해, 세포 리모델링 및 영양 결핍 동안의 생존시 관여하는 주요 경로인 자식작용(autophagy)에 관여할 것이다. 자식작용은 응집-경향의 α-시누클레인(synuclein) (Ravikumar Nat. Genet. 2004, 36: 585-95) 및 헌팅틴(huntingtin) (Shibata J. Biol. Chem. 2006, 281: 14474-85)의 세포내 분해에 관련된다. 자식성공포(Autophagic vacuoles)는 AD 뇌의 이영양성 신경돌기(dystrophic neurites)에서 이미 확인되었고, Aβ 생산을 위한 부위일 것이다(Yu et at J. Cell Biol. 2005, 171: 87- 98). 자식작용은 최근에 AD 생쥐 모델에서 Aβ 축적, 세포외 Aβ 침착 및 뉴런 분해에 중용한 예방적 역할을 하는 것으로 보였다.(Pickford et al J Clin Invest. 2008, 118: 2190-99). 도 6A 및 도 6B은 CD44V6 와 CD44V10 항체로 AD 환자의 해마 부분의 전형적인 착색을 각각 설명한다. 도 6A에서 볼 수 있는 것과 같이, 다양한 뉴런 세포 예를 들면, 뉴런 세포 2A-F는 해마 부분(4)내에서 확인될 수 있을 것이다. 세포 2F로 구체화된 것과 같이, 세포들이 착색될 것이며, 이는 전형적으로 포지티브하게 착색된 뉴런이다. 도 6A의 우측 하단 (패널 6)은 예시적으로 포지티브하게 착색된 세포 (8)의 확대 그림으로, 세포 핵(10)은 착색되지 않고, 부핵체 및 세포질 부분(12)은 이들 세포 격실에서 발현되는 CD44V6의 산물인 CD44V6 항체로 포지티브하게 착색된다. 도 6B에서 볼 수 있는 것과 같이, 다양한 뉴런 세포, 예를 들면, 뉴런 세포 12A-F는 해마 부분(14)내에서 착색될 수 있다. 세포들은 세포 12F에 의해 착색될 수 있는데, 이는 전형적으로 포지티브하게 착색된 뉴런이다. 도 6B 의 우측 하단 (패널 16)은 예시적으로 포지티브하게 착색된 세포 (18)의 확대 그림으로, 세포 핵(20)은 착색되지 않고, 부핵체 및 세포질 부분(222)은 이들 세포 격실에서 발현되는 CD44V10의 산물인 CD44V10 항체로 포지티브하게 착색된다. 전체적으로, 착색 결과는 뉴런 세포질의 강한 착색을 보여주고, 따라서, 이는 CD44 변이체 산물이 발현되는 뉴런 격실이다.
일부 구체예에 따르면, AD 및 ALS와 같은 신경퇴행성 질환의 존재 및/또는 진행 수준을 진단하는 정성적인 방법(qualitative method)을 제공한다. 이 방법에는 다양한 CD44 접목 변이체 단백질, 가령 CD44V3 단백질, CD44V6 단백질, CD44V10 단백질, 또는 이의 임의의 복합물에 특이적으로 반응하고 인지하는 시약을 이용하는 것이 포함될 수 있다. 이와 같은 시약에는 예를 들면, 다양한 CD44 변이체 단백질을 개별적으로 인지하는 특이적 단클론성 및/또는 다클론성 항체가 포함될 수 있다. CD44 변이체 단백질, 가령, CD44V3 단백질, CD44V6 단백질 및/또는 CD44V10 단백질의 존재를 테스트될 개체에서 수득된 조직, 유체 시료, 세포 및 이와 유사한 생물학적 샘플에서 테스트할 수 있다. CD44 접목 변이체 단백질, 가령, CD44V3 단백질, CD44V6 단백질 및/또는 CD44V10 단백질의 존재는 생물학적 샘플로부터 수득된 조직 단편 및/또는 단백질 추출물상에서 실시하는 면역조직화학 및/또는 웨스턴-블랏 분석에 의해 테스트될 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, 다양한 CD44 접목 변이체 단백질, 가령 CD44V3 단백질, CD44V6 단백질, CD44V10 단백질, 또는 이의 임의의 복합의 발현(존재)이 감지되면 테스트된 개체에 신경퇴행성 질환이 있다는 것을 암시할 수 있다. 또한, 여기에서 설명하는 것과 같은 정량적인 방법은 정성적 방법으로도 이용될 수 있다. 정량적 방법(quantitative method)에서 테스트된 개체내 CD44V3 단백질, CD44V6 단백질, CD44V10 단백질 또는 이의 임의의 복합의 발현 수준을 이들 단백질의 공지 계산된 발현 수준과 비교한다. CD44 접목 변이체 단백질, 가령, CD44V3 단백질, CD44V6 단백질, CD44V10 단백질의 발현 수준을 정량함으로써, 신경퇴행성 질환의 진행 상태를 유추할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 다양한 CD44 접목 변이체 단백질에 대항하여 특이적으로 반응하고 이를 인지하는 특이적 항체와 같은 시약을 신경퇴행성 질환의 개시 또는 진행의 치료로 이용할 수 있다. 치료를 요하는 환자에서 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법에는 CD44 접목 변이체 단백질, 가령 CD44V3 단백질, CD44V6 단백질, CD44V10 단백질, 또는 이의 임의의 복합에 대항하는 특이적 항체와 같은 시약의 효과량을 이를 요하는 환자에 투여하는 것도 포함된다. 특이적 항체와 같은 시약은 CD44 접목 변이체의 활성 또는 발현을 하향조절하여, 신경퇴행성 질환을 치료한다.
일부 구체예에 따르면, 다양한 생물학적 샘플에서 CD44V3, CD44V6, CD44V7 및 CD44V10 확인, 특징화, 감지 및 발현의 정량에 이용할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 분자에는 DNA 또는 RNA 핵산 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 프로브, 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 이의 임의의 복합가 포함되는데, 이들의 뉴클레오티드 서열은 CD44V3 (SEQ ID NO: 1) 및/또는 CD44V6 (SEQ ID NO: 3) 및/또는 CD44V7 (SEQ ID NO: 5) 및/또는 CD44V10 (SEQ ID NO: 7) 전사체의 뉴클레오티드 서열의 최소 한 부분에 하이브리드될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 분자에는 핵산 프로브가 포함될 수 있다. 적절한 핵산 프로브에는 100-200 뉴클레오티드가 포함되며, 이와 같은 프로브는 다양한 생물학적 계에 CD44 접목 변이체의 확인 및 발현의 정량화에 이용될 수 있다. CD44 접목 변이체의 확인 및 발현의 정량화를 위한 프로브의 이용은 CD44 접목 변이체와 프로브의 특이적 하이브리드 반응에 의존하는 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 이와 같은 방법에는 예를 들면, 노던 블랏 분석 및 RNA in-situ 하이브리드 반응이 포함될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자에는 프라이머 쌍이 포함된다. 프라이머 쌍은 당분야에 잘 공지된 역 전사체효소 중합효소 쇄 반응 (RT-PCR)와 같은 방법에서 다양한 CD44 접목 변이체의 mRNA의 감지 및 발현의 양을 평가하는데 이용될 수 있는 길이(10-30개 뉴클레오티드)의 두 개의 짧은 올리고뉴클레오티드 분자이다. 이 방법에서, 생물학적 샘플로부터 추출된 RNA 분자들은 역 전사효소에 의해 DNA로 역 전사된다. 생성된 DNA 분자를 특이적 프라이머 쌍과 함께 PCR 반응에서 주형으로 이용하고, 이 DNA 분자의 서열은 개별 CD44 접목 변이체 부분의 최소 일부에 동일하거나 상보적이다. 증폭 반응시에 특이적 CD44 접목 변이체가 발현되면(이의 mRNA가 생물학적 샘플에서 발견된다는 것을 의미한다), PCR 산물이 관찰되며, 이 수준을 정량할 수 있을 것이다. 상기에서 설명하는 각 다양한 CD44 접목 변이체의 경우, 최소 한 가지 특이적 프라이머 쌍을 고안하고 준비할 수 있을 것이다. 프라이머 쌍의 서열은 바람직하게는 접목 변이체의 각 독특한 서열 부분으로부터 유도된다. 각 접목 변이체의 독특한 서열 부분은 가장 바람직하게는 항상성 부분과 변이체 엑손을 연결하는 졍션 부분(접목 졍션)에 바로 인접한다. 이와 같은 목적으로 이용될 수 있는 예시적 특이적 프라이머 쌍 서열들을 하기 실시예 1과 3에 나열한다.
일부 구체예에 따르면, 하기 실시예 1과 3에 나열한 것과 같은, 특이적으로 다양한 CD44 접목 변이체를 인지할 수 있는 특이적 프로브 및 프라이머 쌍과 같은 올리고뉴클레오티드를 신경퇴행성 질환의 진단에 이용할 수 있다. 다양한 CD44 접목 변이체의 발현 분석은 테스트할 개체로부터 수득한 생물학적 샘플상에서 실시할 수 있다. 이와 같은 샘플에는 혈장 샘플, 조직 샘플 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 다양한 CD44 변이체들의 존재, 존속 및 발현 수준을 결정하는데 샘플 분석을 이용할 수 있다. 이와 같은 분석에는 샘플에서 전사체의 발현을 결정하는데 이용되는 다양한 공지의 방법들, 가령, RT-PCR, RT-실시간 PCR, 노던 블랏, In-situ 하이브리드 반응 및 이와 유사한 것들이 포함된다. CD44 변이체 전사체의 존재 및/또는 발현 수준은 공지의 미리 계산된 대조준의 것과 비교하고, 테스트된 개체와 대조군간에 발현 차이는 질환의 존재 뿐만 아니라 질환 진행 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기에서 설명한, 그리고 실시예 1-2에서 설명된 것과 같이, 다양한 CD44 전사체 가령, CD44S, CD44V3, CD44V6 및/또는 CD44V10의 발현 수준은 대조군의 뇌와 비교하여 AD 환자의 뇌에서 상당히 상승된다. 예를 들면, CD44V3 및 CD44V6 전사체 발현는 대조군과 비교하여 AD 환자에서 약 7배 증가된다. 예를 들면, CD44V10 발현은 대조군과 비교하여 AD 환자에서 약 18배 증가된다.
일부 구체예에 따르면, 환자에서 신경퇴행성 질환 (가령, ALS, AD, PD)을 진단 또는 모니터하는 방법을 추가 제공하는데, 이 방법에는 환자의 생물학적 샘플내에 핵산의 발현 수준을 감지하는 것이 포함되며, 이때 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합을 포함한다. 생물학적 샘플에서 세포, 조직, 생물학적 유체, 또는 이의 임의의 복합이 포함될 수 있다. 발현수준은 생물학적 샘플로부터 분리된 핵산에 의해 인코드되는 RNA의 발현 수준을 결정하여 감지할 수 있다. RNA 발현수준의 감지에는 PCR, RT-PCR, 노던 블랏, 실시간 PCR, 및 이와 유사한 방법 또는 DNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 및 기타의 올리고뉴클레오티드에 RNA의 하이브리드를 감지하는데 이용될 수 있는 이의 임의의 복합과 같은 다양한 방법이 포함된다. 예를 들면, 진단 방법에는 환자의 생물학적 샘플내에 폴리펩티드 발현 수준을 감지하는 것이 포함되는데, 이때 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 폴리펩티드와 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는데 적합한 항체의 면역-복합체를 웨스턴-블랏, 면역조직화학, 면역세포화학, 효소 연결된 면역흡착 검사 (ELISA), 및 이와 유사한 또는 이의 임의의 복합을 포함하나 이에 국한되지 않은 방법에 의해 감지하는 것이 포함될 수 있다. 예를 들면, AD, ALS 및 파킨슨 질환과 같은 신경퇴행성 질환의 존재의 진단 및/또는 진행 수준을 진단하는 정성적 방법에는 다양한 CD44 접목 변이체 전사체, 예를 들면, CD44S 전사체, CD44V3 전사체, CD44V6 전사체, CD44V7 전사체 CD44V10 전사체, 또는 이의 임의의 복합을 인지하는 올리고뉴클레오티드의 이용이 포함된다. 올리고뉴클레오티드에는 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 실시예 1과 3에서 나열한 것과 같은 프라이머 쌍이 포함될 수 있다. CD44 변이체 전사체, 예를 들면 CD44V3 전사체, CD44V6 전사체, CD44V7 전사체, CD44S 전사체, 및/또는 CD44V10 전사체의 존재는 테스트되는 환자에서 수득한 생물학적 샘플에서 테스트될 수 있다. CD44 접목 변이체 전사체, 가령 CD44V3 전사체, CD44V6 전사체, CD44V7 전사체, CD44V10 전사체 또는 이의 임의의 복합의 존재는RT-PCR 분석, RT-실시간 PCR 분석, 및 이와 유사한 방법으로 생물학적 샘플에서 수득한 RNA 추출물상에서 테스트될 수 있다. 다양한 CD44 접목 변이체 전사체, 가령, CD44V3 전사체, CD44V6 전사체, CD44V10 전사체, CD44S, CD44V7, 또는 이의 임의의 복합의 발현(존재)이 감지된다는 것은 테스트된 개체가 신경퇴행성 질환을 가진다는 것을 의미할 수 있다. 또한, 여기에서 정성법으로 설명된 방법은 정량법으로도 이용할 수 있다. 정량법에서, 테스트된 개체에서 CD44V3 전사체, CD44V6 전사체, CD44V6 전사체, CD44V 10 전사체, CD44S, 또는 이의 임의의 복합의 발현 수준은 예를 들면, RT-PCR, 방법 또는 실시간 PCR 방법으로 결정하여, 이들 전사체의 이미 공지 계산된 발현 수준과 비교한다. CD44 접목 변이체 전사체 가령, CD44V3 전사체 및/또는 CD44V6 전사체, CD44V6 전사체, 및/또는 CD44V10 전사체, 및/또는 CD44S 전사체의 발현 수준을 정량하여, 신경퇴행성 질환의 진행 상태를 유추할 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 당분야에 공지된 다양한 방법, 시약 및 기술들을 다양한 CD44 변이체 전사체, 가령, CD44V3, CD44V6 및/또는 CD44V10의 발현 수준에 영향을 주는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 기술에는 CD44 변이체 전사체, CD44V3, CD44V6 및/또는 CD44V10에 상보적인 서열을 일부 가질 수 있는 핵산 분자(통상 올리고뉴클레오티드의 형태)의 이용이 포함된다. 이와 같은 핵산 분자에는 예를 들면, 작은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 예를 들면, 당분야에 잘 공지된 siRNA에는 두 개 뉴클레오티드 3'-오버행(overhangs)을 특징으로 하는 염기쌍 구조를 가지는 짧은 뉴클레오티드 서열(약 21-23개 뉴클레오티드)이 포함될 수 있다. (Tuschl and Borkhardt, Molecular Intervent. 2002, 2(3):158-67). 동물 세포내로 siRNAs의 도입으로 siRNA가 직접적으로 대항하는 유전자의 강력하고, 장기-지속적, 특이적 전사후 접목을 결과한다(Caplen et. al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2001, 98:9742-7; Elbashir et. al., Nature. 2001, 411:494-8; Elbashir et al., Genes Dev. 2001, 15:188- 200; Elbashir et. al., EMBO J. 2001, 20:6877-88). siRNA를 이용하기 위한 방법 및 조성물은 예를 들면, U.S. Pat. No. 6,506,559에서 설명한다. in vitro 시스템으로부터 길이가 21-23개 뉴클레오티드인 siRNA의 생산 방법 및 세포 또는 유기체내에서 유전자의 mRNA를 간섭하기 위하여 siRNA를 이용하는 것에 대해서는 WO0175164에서 설명한다. siRNA는 적절한 발현 시스템을 이용하여 포유류 세포내 in vivo에서 만들 수도 있다. 예를 들면, 포유류 세포에서 작은 간섭 RNA(siRNA)의 합성하는 벡터 시스템(pSUPER으로 명명된)이 보고되었다 (Brummelkamp et. al., 2002, Science 296: 550-3). 실시예 6에서 설명된 것과 같이(그 안에 표 5), CD44V3, 및/또는 CD44V6 및/또는 CD44V10 및/또는 CD44S와 같은 다양한 CD44 변이체 전사체에 대항하는 siRNA 서열들은 여기 상기에서 설명된 임의의 방법에 의해 준비될 수 있다. siRNA는 당분야에 임의 공지된 방법으로 투여될 수 있다 (Meade et. al., Adv Drug Deliv. Rev, 2007에서 설명하는 것과 같은 방법). siRNA는 CD44V3, CD44V6, CD44V10, CD44S 및 이의 임의의 복합의 발현의 성공적인 접목을 보장하기 위해 다양한 CD44 변이체 전사체의 mRNA의 다양한 서열 부분들에 대항할 수 있다. 실시예 6에서 상세하게 설명하고, 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이, 다양한 CD44 변이체들의 mRNA의 발현 수준은 특이적 siRNA 분자의 이용으로 감쇠될 수 있다. 실시예 6에서 설명된 것과 같이, 세 가지 siRNA 분자들이 각 CD44S, CD44V3, CD44V3 및 CD44V10 변이체들에 대응하도록 고안되었다. siRNA 분자를 세포내로 도입시키고, CD44의 mRNA, 및 단백질의 발현 수준을 RT-PCR로 감지하였다. 다양한 CD44 전사체의 mRNA 발현 상에 다양한 siRNS 분자의 효과를 보여주는 도 7을 참고한다. 도 7의 패널 I은 상이한 실험 조건("-RT" - 반응에서 역전사효소 없음; "NT"- 형질감염안된 세포; "NR" - 관련 없는 siRNA; CD44V3 siRNA #l-#3 - 표 6에 나열된 각 서열의 siRNA 분자)하에 CD44V3 전사체의 발현 수준을 아가로즈 팩토그램(pictogram)을 나타낸 것이다. 도 7, 패널 I에서 볼 수 있는 바와 같이, 최소 두 개의 siRNA 존재시 CD44V3의 발현 수준은 상당히 감소되고, 반면 대조군 유전자 악틴과 CD44S의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 도 7의 패널 II는 상이한 실험 조건("-RT" - 반응에서 역전사효소 없음; "NT"- 형질감염안된 세포; "NR" - 관련 없는 siRNA; CD44V6 siRNA #l-#3 - 표 6에 나열된 각 서열의 siRNA 분자)하에 CD44V3 전사체의 발현 수준을 아가로즈 팩토그램(pictogram)을 나타낸 것이다. 도 7, 패널 II에서 볼 수 있는 바와 같이, 최소 두 개의 siRNA 존재시 CD44V6의 발현 수준은 상당히 감소되고, 반면 대조군 유전자 악틴과 CD44S의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 도 7의 패널 III은 상이한 실험 조건("-RT" - 반응에서 역전사효소 없음; "NT"- 형질감염안된 세포; "NR" - 관련 없는 siRNA; CD44V10 siRNA #l-#3 - 표 6에 나열된 각 서열의 siRNA 분자)하에 CD44V3 전사체의 발현 수준을 아가로즈 팩토그램(pictogram)을 나타낸 것이다. 도 7, 패널 III에서 볼 수 있는 바와 같이, 최소 두 개의 siRNA 존재시 CD44V10의 발현 수준은 상당히 감소되고, 반면 대조군 유전자 악틴과 CD44S의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 실시예 6의 표 7에서 제시한 정량 분석에서 siRNA 분자는 다양한 CD44 변이체들의 mRNA 발현을 상당히 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다.
안티센스 기술은 일반적으로 표적(DNA 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자가 포함될 수 있음)의 발현을 감쇠 및/또는 저해시키는데 이용되고 그리고 RNA-RNA 상호작용 상호작용, RNA-DNA 상호작용, 삼중 헬릭스 상호작용, 리보자임 및 RNase-H 중재된 효과와 연관된다. 안티센스 핵산 분자 (가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 통상 단일 가닥의 핵산 분자이고, RNA 또는 DNA(표적)내 상보적 염기와 하이브리드되면, 특이적 유전자, mRNA 분자 및 이와 유사한 것을 포함하는 표적의 발현을 감쇠 및/또는 저해시킬 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 세포내에서 발현을 위한 재조합 유전자에 의해 인코드되거나 합성에 의해 준비될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드의 비-제한적 예로써 포스포로티오에이트, 포스포로트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈가 링키지 또는 단쇄 이형방향족 또는 이형고리 인터슈가 링키지를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 질소 링커 또는 질소를 포함하는 군을 이용하여 올리고뉴클레오티드 모방체를 준비할 수도 있다. 또한, 포스포아미데이트 및 포스포로티오아미데이트 올리고머 화합물 및 몰포리노 백본(morpholino backbone) 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드고 포함된다. 펩티드-핵산 (PNA) 백본을 이용할 수도 있는데, 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 백본은 폴리아미드 백본으로 대체될 수 있고, 염기는 폴리아미드 백본에 바로 결합되거나 또는 아자(aza) 질소 원자에 간접적으로 결합된다. 다른 합성 올리고뉴클레오티드에는 2' 위치에서 다음중 하나를 포함하는 치환된 슈가 모이어트를 포함할 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, O(CH2)nH2 또는 O(CH2)nH3 (이때 n은 1 내지 10이며); C1 내지 C10 저가 알킬, 치환된 저가 알킬, 알카릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--; S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N2; NH2; 이형고리알킬; 이형고리알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실일; 형광 모이어티; RNA 절단기; 리포터 기; 삽입기(intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약리역학 및/또는 약동학 성질을 개선시키는 기; 그리고 유사한 성질을 가지는 다른 치환체. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토퓨라노실 기 대신 사이클로부틸 또는 다른 카르보사이클과 같은 슈가 모방체를 가질 수도 있다. 안티센스 분자, 가령, 다양한 CD44 변이체 전사체, 가령 CD44V3, 및/또는 CD44V6 및/또는 CD44V10에 대응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 준비할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 CD44V3, CD44V6, CD44V10, 및 이의 임의의 복합의 발현을 성공적으로 감쇠/침묵시키기 위해 다양한 CD44 변이체 전사체의 mRNA의 다양한 서열 부분에 바로 대응할 수 있다. 선호적인 세포 조건하에(Du L. et al, PNAS, 2007,104:6007-12; Hua et. al., PIoS Biol. 2007,5:e73에서 설명하는 것과 같이 최적의 온도와 버퍼링 조건을 포함) 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한다.
일부 구체예에 따르면, CD44 변이체 전사체 서열들, 가령, CD44V3, CD44V6, CD44V7, CD44S 및/또는 CD44V10의 다양한 부분에 바로 대응하고, 이들 전사체의 발현을 감쇠(하향 조절)하도록 고안된 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있다. 예를 들면, 실시예 6과 상기에서 설명한 것과 같이 올리고뉴클레오티드에는 siRNA 분자가 포함될 수 있다. 따라서, 환자에서 신경퇴행성 질환 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법에는 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 감쇠시킬 수 있는 시약을 포함하는 조성물을 투여하는 것이 포함되는데, 이때 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합으로 구성된 군에서 선택된다. 시약에는 이 핵산에 하이브리드할 수 있는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드에는 DNA, RNA, siRNA, 또는 이의 임의의 복합이 포함된다. 예를 들면, 시약에는 하나 또는 그 이상의 SMEs, 가령, ERK MAP-키나제 경로 조절물질, PKC 조절물질, 및 이와 유사한 것들이 포함된다. 예를 들면, 이 방법에는 다양한 CD44 변이체들, 가령 CD44V3, CD44V6, CD44V7, CD44S 및/또는 CD44V10의 RNA(mRNA)를 표적으로 하는 안티센스 핵산 및/또는 siRNA를 신경퇴행성 질환자, 환자 세포 또는 기관으로 도입시키고; 올리고뉴클레오티드와 다양한 CD44 접목 변이체의 표적 mRNA의 상호작용을 돕는 환경하에 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포 또는 유기체를 유지시키고; 다양한 CD44 접목 변이체 가령, CD44V3, CD44V6, CD44V7 CD44V10, CD44S, 또는 이의 임의의 복합의 표적의 발현이 하향 조절된 것을 입증하고 그리고 이에 의해 신경퇴행성 질환을 치료하는 것이 포함될 수 있다.
일부 구체예에 따르면, 소분자 엔티티(SME)는 다양한 CD44 접목 변이체의 활성 및/또는 발현에 영향(조절)을 주는 것으로 확인될 수 있다. 소분자 엔티티에는 CD44 접목 변이체와 상호작용하여, CD44 변이체와 이의 생리학적 관련 리간드와의 상호작용을 파괴할 수 있는 임의 분자 또는 물질이 포함될 수 있다. 예를 들면, SME를 물질을 확인하기 위해 당분야에 공지된 적절한 하드웨어 및 소프트웨어르 이용하여 인실리코(in silico)로 개발될 수도 있다. 예를 들면, SME은 CD44 접목 변이체와 상호작용할 수 있는 분자 엔티티에 대한 화학적 라이브러리의 in-vitro 및 in vivo 스크리닝에 의해 개발될 수 있다. 예를 들면, CD44 접목 변이체, 가령, CD44V3, CD44V6 및/또는 CD44V10와 생리학적 리간드 히알루론산 및 이의 유도체와의 결합은 SME 존부하에 평가될 수 있다. 유사하게, CD44V3, CD44V6 및/또는 CD44V10는 예상 SME 존부하에 테스트될 수 있다. 따라서, 확인된 SME는 다양한 CD44 접목 변이체의 활성 및/또는 발현에 영향(조절)을 주는데 이용될 수 있다. 예를 들면, SME는 CD44 접목 변이체의 길항제로 이용될 수 있다. 예를 들면, SME는 CD44 접목 변이체의 항진제로 이용될 수 있다. SME 는 다양한 CD44 변이체들의 발현에 직간접적으로 영향(조정)을 줄 수 있는 임의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, SME는 다양한 CD44 변이체들의 발현 수준을 감소(감쇠) 및/또는 증가시키는데 직간접적으로 이용되는 저해물질 및/또는 활성 물질을 포함할 수 있다.
예를 들면, ERK MAP-키나제 경로는 CD44 선택적 접목 조정에 관여하는 것으로 확인되었다(Weg-Remers et. al., EMBO J. 2001, 20:4194-203). 일부 구체예에 따르면, 뉴런 기원 세포상에 CD44 선택적 접목에 EPK 경로의 관련성에 대해 실시예 7에서 설명하며 도 8에서 보여준다. 배아 척수 운동 뉴런 및 신경아 세포종 세포의 융합으로부터 유도된 생쥐 세포를 도말하고, 그리고 처리하지 않고 방치하거나 MEK 저해물질 UO126으로 처리하였다. CD44 변이체들의 mRNA 발현 수준은 RT-PCR로 감지하였다. 도 8에서 볼 수 있는 것과 같이, UO126에 의한 ERK-MAPK 경로의 조정(저해)으로 CD44 변이체 엑손 접목이 상당히 감소하게 된다. 도 8, 패널 A에서 볼 수 있는 것과 같이, CD44S의 mRNA 수준은 저해물질(U0126) 존재하에서도 변화되지 않는다. 도 8, 패널 B에서 볼 수 있는 것과 같이, CD44V3의 mRNA 수준은 저해물질 없는 경우, CD44V3의 발현 수준("-", 중간 라인)과 비교하였을 때, 저해물질 존재하에 감소("+", 우측 라인)되었다. 도 8, 패널 C에서 볼 수 있는 것과 같이, CD44V7의 mRNA 수준은 저해물질 없는 경우, CD44V7의 발현 수준("-", 중간 라인)과 비교하였을 때, 저해물질 존재하에 감소("+", 우측 라인)되었다. 도 8, 패널 D에서 볼 수 있는 것과 같이, CD44V5의 mRNA 수준은 저해물질 없는 경우, CD44V5의 발현 수준("-", 중간 라인)과 비교하였을 때, 저해물질 존재하에 감소("+", 우측 라인)되었다. 도 8, 패널 E에서 볼 수 있는 것과 같이, CD44V10의 mRNA 수준은 저해물질 없는 경우, CD44V10의 발현 수준("-", 중간 라인)과 비교하였을 때, 저해물질 존재하에 감소("+", 우측 라인)되었다. 추가로, 도 8, 패널 F는 대조군인데, 대조군 유전자, 악틴의 발현 상에 저해물질 U0126의 효과가 없음을 설명한다. 또한 패널 A-F의 우측 라인은 RT 효소 없이("-RT") 실행한 네가티브 대조군이다. 따라서, ERK 경로를 조정하는 것으로 알려진 소분자들을 뉴런 세포에서 CD44 선택적 접목의 조절에 이용할 수 있을 것이다.
환자의 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 목적으로, 다양한 CD44 접목 변이체의 발현 및/또는 활성을 조절(하향 조절(감쇠) 및/또는 증가)시키도록 고안된 상기에서 설명하는 시약, 예를 들면, siRNA 분자를 환자에 그 자체로 제공하거나 또는 약리학적으로 수용가능한 캐리어 및 부형제와 혼합한 약학 조성물의 형태로 제공될 수 있다. siRNA 분자는 환자의 세포, 조직, 및 이와 유사한 것에 추가 도입될 수 있다. 시약 및/또는 이를 포함하는 약학 조성물은 임의 공지된 투약 경로에 의해 제공될 수 있다. 시약은 팩 또는 키트와 같은 분배 장치로 제공될 수도 있다. 또한, 시약은 다른 다양한 활성 성분들과 복합하여 투여될 수도 있다.
다양한 CD44 접목 변이체 및 CD44 접목 변이체 산물의 발현을 감지하고, 정량화하도록 고안된 상기에서 설명하는 시약은 키트 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 키트에는 신경퇴행성 질환을 진단하는 키트가 포함될 수 있다. 키트에는 생물학적 샘플에서 핵산 발현을 감지할 수 있는 최소 한 가지 시약이 포함될 수 있는데, 이때, 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, 또는 이의 임의의 복합을 포함할 수 있다. 시약은 예를 들면 핵산 또는 핵산에 의해 인코드된 RNA 분자와 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트에는 생물학적 샘플내에 폴리펩티드의 발현을 감지할 수 있는 최소 한 가지 시약을 포함하는데, 이때 폴리펩티드에는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, 또는 이의 임의의 복합을 포함할 수 있다. 시약은 폴리펩티드와 특이적으로 상호작용하여 감지가능한 면역-복합체를 형성하는 항체를 포함할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 재조합 구조체 예를 들면, 다양한 CD44 접목 변이체의 코딩 서열들, 가령 CD44V3 코딩 서열 또는 CD44V6 코딩 서열 또는 CD44V7 코딩 서열 또는 CD44V10 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 준비할 수 있다. 구조체에는 CD44 접목 변이체의 뉴클레오티드 서열이 전방 또는 역 방향으로 삽입된 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 구조체에는 프로모터와 같은 조절 서열들이 포함될 수 있다. 구조체에는 또한 CD44 접목 변이체 뉴클레오티드 서열의 전 또는 후에 삽입될 수 있는 다양한 비-관련 단백질 및/또는 펩티드의 추가 코딩 서열이 포함될 수 있다. 벡터내로 도입된 CD44 접목 변이체의 뉴클레오티드 서열은 CD44 접목 변이체 전사체의 전체 완전한 길이의 코딩 서열이거나 또는 일부 부분 서열만 포함될 수 있다. 재조합 구조체의 벡터 및 이의 구조체의 선택은 당분야에 임의 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 재조합 구조체는 다양한 생물계에서 실험, 진단 및/또는 치료 목적으로 다양한 CD44 접목 변이체, 가령, CD44V3, CD44V6, 또는 CD44V7 및/또는 CD44V10의 발현을 유도하는데 이용될 수 있다.
다양한 예시적 측면과 구체예가 상기에서 설명되었지만, 당업자는 특정 변형, 순열변경, 추가 및 하위 복합을 인지할 수 있을 것이다. 따라서, 다음의 청구범위는 이와 같은 모든 변형, 순열 치환, 추가, 하위 복합을 포함하는 것으로 해석하며, 이들 모두 본 발명의 영역에 속한다.
실시예 1 - AD 환자 및 정상 대조군에서 CD44V3, CD44V6 및 CD44V10의 발현
AD 환자와 정상 대조군 (EZ RNA 키트, Beit Haemek)의 부검으로부터 분리한 냉동 해마 샘플로부터 총 RNA를 추출하였다. 그 다음 RNA는 반정량 RT-PCR 분석에 이용하였다. 첫째, RNA를 역전사 반응을 받도록 하였다. 역전사 반응은 5 U Superscript II 역전사효소(Invitrogen)로 실시하였다. 반응 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. PCR 단계는 200 μM dNTPs, 1.25U Thermoprime Plus DNA 중합효소(AB 유전자) 및 0.5 mM 프라이머를 포함하는 반응 용적 20㎕에서 RT 반응물 1㎕를 이용하여 미소프로세스-제어된 인큐베이터에서 실시하였다:
V3_F: 5'-TGACCACACAAAACAGAACCA -3'
C6_R: 5'-CCCATGTGAGTGTCCATCTG -3'
C5_F: 5'-GAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC -3'
V6_R: 5'-GGGTAGCTGTTTCTTCCGTTG -3'
C5V10_F: 5'-GACAGAATCCCTGCTACCAATAGG -3'
V10C6_R: 5'-GGAATGTGTCTTGGTCTCCTGAT -3'
증폭을 위해 42회 사이클이 실행되었고, 각 사이클은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 구성된다. 추가로, 악틴용 프라이머가 결과의 표준화를 위해 PCR 반응에 포함된다. 증폭 산물은 아가로즈 겔(QIAquick gel extraction kit, Qiagen)로부터 정제하여, PCR 반응에 이용된 프라이머중 하나를 이용하여 서열화하였다. 사람 RefSeq 및 게놈 데이터베이스(NCBI) 상에 실행된 BlastN 알고리즘을 이용하여 서열 데이터를 분석하였다.
반-정량 RT-PCR의 결과를 표 1에 요약하였다. 표 1의 좌측 컬럼에서 변이체 엑손의 동정(확인) 및 서열화에 의해 확인된 것과 같이, 연결은 항상성 엑손에 연결된다는 것을 나타낸다. 다양한 PCR 산물들의 발현 수준은 아가로즈 겔상에서 관찰된 관련 밴드 강호에 의해 결정된다. 상대적 발현 수준은 + 사인 (1, 2, 3)으로 나타내는데, 각각 약한 발현, 중간 발현 또는 강한 발현을 나타낸다. 0은 관찰된 밴드가 없는(발현이 없다는 것을 의미) 것을 말하며, ND는 실행안된 반응을 나타낸다.
Figure pct00001
실시예 2 - 실시간 PCR 에 의한 정상 대조군과 비교하였을 때, AD 의 뇌에서 CD44S, CD44V3 , CD44V6 및 CD44V10 의 발현
EZ RNA 키트 (Beit Haemek)를 이용하여 AD 환자 (n=10) 및 정상 대조군 (n=10)의 부검으로부터 분리된 냉동 해마 샘플로부터 총 RNA를 추출한다. 총 RNA의 농도는 나노드롭 1000 기계를 이용하여(Thermo Scientific) 측정한다. 각 샘플로부터 1.5 μg의 RNA는 제조업자의 지시에 따라 Bioscript 역전사효소(Bioline)를 이용하여 역전사시킨다. 반응 혼합물은 42℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 플래티늄 SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) 시약을 500 nM 프라이머와 함께 qPCR을 위해 이용한다. qPCR 반응의 선형을 확인하고, Ct 실험치를 상대적 발현치로 변환하기 위해 각 프라이머 쌍에 대해 표준 곡선을 실행한다(cDNA 풀의 6가지 농도를 이중으로). 실시간 PCR 사이클 프로그램은 다음과 같다: 50℃, 2분, 95℃, 2분, 그 다음 95℃ 15 초 및 60℃ 34초를 40사이클. 모든 qPCR 반응은 Applied Biosystems 7500 실시간 PCR 시스템(ABI) 상에서 실시한다.
데이터는 나이와 성별을 일치시킨 정상 대조군과 비교하였을 때, AD 환자에서 CD44S, CD44V3, CD44V6, CD44V10의 발현이 상당히 증가되었음을 나타낸다.
AD 환자와 정상 대조군에서 GAPDH의 비율로써 CD44S와 CD44 변이체들
변이체 AD 정상 AD/정상비율 P값(t-test)
CD44S 2.33 0.47 4.95 0.035
V3 1.22 0.2 7.17 0.008
V6 3.65 0.52 7.02 0.002
V10 8.35 0.46 18.15 0.007
실시예 3 -APP 751 유전자전이 생쥐 및 정상 대조군에서 CD44V7의 발현
AD-유사 병리학에서 CD44V7 변이체의 발현을 특징화시키기 위하여, 뮤린 Thy-1 프로모터의 제어하에 London (V717I) 및 Swedish (K670M/N671L) 돌연변이(이 두 돌연변이는 가족성 AD와 연관이 있는 것으로 밝혀졌다)를 포함하는 인간 APP751를 발현시키는 hAPP 생쥐를 이용하였다. APP751 생쥐는 4-6월령에서 신피질 및 해마에 아밀로이드 플락을 발달시키고, 6월령에서 기억 부족이 시작되는 것을 보여준다. 해마 조직을 7-7.5 월령의 암컷 APP751 유전자전이 생쥐 및 유전자전이 안된 새끼로부터 분리한다. RNA는 EZ-RNA (Beit Haemek)을 이용하여 추출한다. 동량의 총 RNA는 5 U의 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 역전사시킨다.
반응 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 반-정량적 PCR 단계를 200 μM dNTPs, 1.25U Thermoprime Plus DNA 중합효소(Larova) 및 하기 리스트의 0.5 μM 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 용적 20㎕에서 RT 반응물 1㎕를 이용하여 실시하였다:
C3F: 5'-TCTGTGCAGCAAACAACACA
C6R: 5'-CCCATGTGAGTGTCCATCTG
V7F: 5'- TGTTTCCTGGACAGATTTCTTCG
Actin F: 5'-CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG
Actin R: 5 ' -CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT
PCR을 위한 단계 사이클 프로그램에는 94℃ 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장의 사이클을 CD44V7의 경우 42회 사이클, CD44S 증폭의 경우 32회 사이클 또는 기준 유전자로 이용된 베타-악틴의 경우 25회 사이클이 포함된다. 아가로즈 겔상에 이동된 PCR 산물의 밴드 강도는 TotalLab 소프트웨어를 이용하여 정량한다. 유전자 전이 안된 생쥐와 비교하였을 때, APP751 생쥐에서 V7-C10 졍션을 가지는 전사체를 포함하는 mRNA의 발현이 7.2배 증가된다. 유사한 조건하에 CD44S는 16% 증가된다.
실시예 4 - ALS 환자와 정상 대조군의 요수(lumbar cord) 및 운동 피질에서 CD44V3, CD44V6 및 CD44V10의 발현
사람 뇌와 Spinal Fluid Resource Centre (CA, USA)로부터 조직을 구하였다. ALS 환자와 성별 및 나이가 일치되는 정상 대조군의 요수 및 운동 피질로부터 RNA를 추출한다. 실시예 1에서 설명하는 것과 같이 반-정량 RT-PCR 반응에 RNA를 이용한다. ALS 환자 및 정상 대조군의 운동 피질 및 요수에서 수득한 RNA 샘플상에서 실행한 반-정량 RT-PCR의 결과를 표 3에 제공한다. 표 3의 좌측 컬럼은 서열화로 입증된 바와 같이 변이체 엑손의 확인과 항상성 엑손에 연결 브릿지를 나타낸다. 다양한 PCR 산물의 발현 수준은 아가로즈 겔상에서 관찰된 상대적 밴드 강도로 결정하였다. 상대적 발현 수준은 + 사인 (1, 2, 3)으로 나타내는데, 각각 약한 발현, 중간 발현 또는 강한 발현을 나타낸다. 0은 관찰된 밴드가 없는(발현이 없다는 것을 의미) 것을 말하며, ND는 실행안된 반응을 나타낸다.
Figure pct00002
실시예 5 - AD 환자의 뇌에서 CD44 접목 변이체의 면역세포화학적 분석
포르말린 고정된, 파라핀 침잠된 해마 조직(Netherland 뇌 은행)으로부터 8 μm 단편을 준비한다. 이용된 1차 항체는 CD44 (HCAM, 쥐 클론 IM7, Santa Cruz), CD44V3 (생쥐 단클론성 vff-327, ABcam), CD44V6 (토끼 다클론성, Chemicon) 그리고 CD44V10 (토끼 다클론성, Chemicon)이다. 이용된 2차 항체는 HRP, 폴리머-강화된(Envision, Dako), 기질: DAB에 콘쥬게이트된 관련 종에 대항하는 것이다. 네가티브 대조군은 1차 항체와 동일한 단백질 농도에서 비-면역 토끼 혈청에 토끼 다클론 항체에 대한 이소타입 일치된 혈청 대조군이며, 생쥐 항체의 경우 다중 이소타입 대조군 (Dako)이다. 쥐 항체의 경우 1차 항체와 동일한 단백질 농도에서 일치된 이소타입 대조군이다. 표 4는 면역조직화학 착색 결과를 나타낸다.
면역조직화학 착색에서 상이한 세포 및 하위 세포 국소화(localizations)가 나타난다. CD44s는 주로 성상세포와 노쇠한 플락내에 발견되고, CD44 변이체들 착색은 세포질내 부핵체 부분의 뉴런에서 발견된다.
CD44S와 변이체 단백질의 세포 국소화
항원 평가 부위 세포 국소화
CD44S 해마체* 1. 플락, 해마에 인접한 구피질(paleocortex) 착색. 노쇠한 플락을 닮은 강력한 면역반응성 섬유를 가진 뚜렷한 지역이 존재한다. 플락내에 뉴런 신경체(somata)가 책색되나 다른 위치에서는 드물다. 2. 성상세포에 대해 전형적인 혈관주위 착색과 함께 백색질(white matter)은 확산적으로 착색된다.
CD44V3 해마체 1. 뉴런; 세포내 세포질-리포퓨젼의 부위와 겹침 2. 성상세포, 주로 백색질
CD44V6 해마체 1. 뉴런; 세포내 세포질-리포퓨젼과 겹침 2. 백색질 착색(성상세포)
CD44V10 해마체 뉴런: 세포내-세포질-리포퓨젼과 겹침
* 해마체 형성과 해마이행부(subiculum) 및 속후각겉질(entorhinal cortex)과 같은 인접 구조들이 포함된다.
실시예 6 - siRNA 실험- 사람 세포에서 CD44 발현의 녹다운
이미 확립된 변수들을 이용하여 다양한 CD44 변이체들에 대응하는 다양한 siRNA 분자를 고안하고, 이들 서열은 하기 표 5에 나타낸다. HeLa 세포(하루전에 6-웰 플레이트에 15x104 세포를 도말한다)에 제조업자의 지시에 따라 Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen)를 이용하여 10nM의 최종 농도에서 다양한 siRNA(IDT)로 형질감염시켰다. 네가티브 대조군으로, 세포를 감염시키기 않거나(NT) 또는 5' 단부에서 TYE 562으로 라벨된 관련없는, (임의 공지의 사람 mRNA에 임의 유의적인 상동성을 가지지 않는) siRNA(NR)으로 형질감염시켰다. CD44V6 siRNA으로 형질감염된 세포는 감염후 24시간 동안 혈청을 제공하지 않고, 추가 8시간 동안 혈청을 제공한다(Cheng et al., Genes Dev. (2006) 20:1715-20에서 설명된 것과 같음). 포지티브 대조군으로, 이 변이체의 경우, Cheng et al.,에 의해 이용된 siRNA 서열을 기준으로 이용하였다(siRNA #2).
EZ-RNA (Beit Haemek)을 이용하여 형질감염후 48시간에 Hela 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 동량의 총 RNA는 5 U of Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 역전사시킨다. 반응 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 반-정량적 PCR 단계를 200 μM dNTPs, 1.25U Thermoprime Plus DNA 중합효소(Larova) 및 하기 리스트의 0.5 μM 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 용적 20㎕에서 RT 반응물 1㎕를 이용하여 마이크로프로세서-제어된 인큐베이터에서 실시하였다:
C3F: S'-TCTGTGCAGCAAACAACACA
C6R: 5'-CCCATGTGAGTGTCCATCTG
V3R: 5'-AGCCTGCTGAGATGGTATTTGA
V6R: 5'-GGGTAGCTGTTTCTTCCGTTG
VlOR: 5'-TCTTCCACCTGTGACATCATTC
Actin F: 5'-CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG
Actin R: 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT
PCR을 위한 단계 사이클 프로그램에는 94℃ 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장의 사이클을 V3, V6, V10 증폭의 경우 42회 사이클, CD44S 증폭의 경우 32회 사이클 또는 기준 유전자로 이용되는 베타-악틴의 경우 25회 사이클이 포함된다. 데이터의 추가 정량을 위해, 밴드 강도는 TotalLab 소프트웨어를 이용하여 정량한다. 정량화 결과는 표 6에 나타내는데, 비-형질감염된 세포(NT)에 대해 표준화시킨, CD44 변이체와 베타-악틴(대조군 유전자)사이에 비율을 보여준다.
mRNA 발현수준 of CD44S, CD44V3, CD44V6 및 CD44V10의 mRNA 발현 수준에서 상당한 감소(>80%)가 관찰되었는데, 이는 각 CD44 아형(isoform)에 대한 최소 한 가지 siRNA의 공동 발현의 결과이다.
Figure pct00003
다양한 CD44 변이체들상에 siRNA의 정량 분석
NT NR #1 #2 #3
CD44V3/악틴 1 1 0.05 0.16 1.47
CD44V6/악틴 1 1.4 0 0 1.1
CD44V10/악틴 1 1.2 1.61 0 0
실시예 7 - 뉴런 기원 세포에서 ERK-MAP 키나제의 저해물질에 의해 CD44 선택적 접목(alternative splicing)의 조절
뉴런 기원 세포에서 CD44 선택적 접목(alternative splicing)에 ERK 경로 관련성을 테스트하기 위하여, 배아 척수 운동 뉴런 및 신경아세포종 세포의 융합으로부터 유도된 생쥐 NSC-34 세포를 이용한다. NSC-34 세포 배양물(하루전날 6-웰 플레이트에 15X104 세포를 도말한다)를 처리하지 않고 방치하거나 또는 6시간 동안 10 μM의 MEK 저해물질 UO126 (Sigma)으로 처히하였다. EZ-RNA 키트 (Beit Haemek)를 이용하여 세포로부터 총 RNA를 분리시키고, 동량의 총 RNA는 5 U of Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 역전사시킨다. 반응 혼합물을 42℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 반-정량적 PCR 단계를 200 μM dNTPs, 1.25U Thermoprime Plus DNA 중합효소(ABgene) 및 하기 리스트의 0.5 μM 프라이머를 포함하는 반응 용적 20㎕에서 RT 반응물 1㎕를 이용하여 마이크로프로세서-제어된 인큐베이터에서 실시하였다:
C5F: 5'-GAGCACCCCAGAAAGCTACATT-3
C7R: 5'-CCAGAAGTTGTGGTCACTCCAC-3
V3R: 5'-ATCATCAATGCCTGATCCAGA-3
V5F: 5'-CCACAGCCTCCTTTCAATAACC-3
V7F: 5'-TGTTTCCTGGACAGATTTCTTCG-3
VlOF: 5'-TCTGGGTATTGAAAGGTGTAGCC-3
ActinF: 5' -CTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3
ActinR: 5'- CGTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3
PCR을 위한 단계 사이클 프로그램에는 94℃ 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장의 사이클을 V3, V6, V10 증폭의 경우 42회 사이클, CD44S 증폭의 경우 32회 사이클이 포함된다. 악틴 대조군 PCR은 결과의 표준화를 위해 실행한다. 도 8, 패널, B-E에서 볼 수 있는 것과 같이, U0126 에 의해 ERK 경로의 저해(우측 라인, "=")로 CD44 변이체 엑손 접목이 상당히 감소하였다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
SEQUENCE LISTINGS <110> Pinner Elhanan, Laudon Moshe, Zisapel Nava <120> CD44 Splice Variants in Neurodegenerative Diseases <130> P-9919-PC <150> US 60/929,706 <151> 2007-07-10 <160> 8 <210> 1 <211> 1212 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccagta cgtcttcaaa taccatctca gcaggctggg agccaaatga agaaaatgaa 720 gatgaaagag acagacacct cagtttttct ggatcaggca ttgatgatga tgaagatttt 780 atctccagca ccagagacca agacacattc caccccagtg gggggtccca taccactcat 840 ggatctgaat cagatggaca ctcacatggg agtcaagaag gtggagcaaa cacaacctct 900 ggtcctataa ggacacccca aattccagaa tggctgatca tcttggcatc cctcttggcc 960 ttggctttga ttcttgcagt ttgcattgca gtcaacagtc gaagaaggtg tgggcagaag 1020 aaaaagctag tgatcaacag tggcaatgga gctgtggagg acagaaagcc aagtggactc 1080 aacggagagg ccagcaagtc tcaggaaatg gtgcatttgg tgaacaagga gtcgtcagaa 1140 actccagacc agtttatgac agctgatgag acaaggaacc tgcagaatgt ggacatgaag 1200 attggggtgt aa 1212 <210> 2 <211> 403 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Ser Thr 210 215 220 Ser Ser Asn Thr Ile Ser Ala Gly Trp Glu Pro Asn Glu Glu Asn Glu 225 230 235 240 Asp Glu Arg Asp Arg His Leu Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ile Asp Asp 245 250 255 Asp Glu Asp Phe Ile Ser Ser Thr Arg Asp Gln Asp Thr Phe His Pro 260 265 270 Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly His Ser 275 280 285 His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro Ile Arg 290 295 300 Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu Ala 305 310 315 320 Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg Arg 325 330 335 Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn Ser Gly Asn Gly Ala Val 340 345 350 Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly Glu Ala Ser Lys Ser Gln 355 360 365 Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser Ser Glu Thr Pro Asp Gln 370 375 380 Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu Gln Asn Val Asp Met Lys 385 390 395 400 Ile Gly Val <210> 3 <211> 1215 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccatcc aggcaactcc tagtagtaca acggaagaaa cagctaccca gaaggaacag 720 tggtttggca acagatggca tgagggatat cgccaaacac ccagagaaga ctcccattcg 780 acaacaggga cagctggaga ccaagacaca ttccacccca gtggggggtc ccataccact 840 catggatctg aatcagatgg acactcacat gggagtcaag aaggtggagc aaacacaacc 900 tctggtccta taaggacacc ccaaattcca gaatggctga tcatcttggc atccctcttg 960 gccttggctt tgattcttgc agtttgcatt gcagtcaaca gtcgaagaag gtgtgggcag 1020 aagaaaaagc tagtgatcaa cagtggcaat ggagctgtgg aggacagaaa gccaagtgga 1080 ctcaacggag aggccagcaa gtctcaggaa atggtgcatt tggtgaacaa ggagtcgtca 1140 gaaactccag accagtttat gacagctgat gagacaagga acctgcagaa tgtggacatg 1200 aagattgggg tgtaa 1215 <210> 4 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Ile Gln 210 215 220 Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu Gln 225 230 235 240 Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg Glu 245 250 255 Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Gly Asp Gln Asp Thr Phe His 260 265 270 Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly His 275 280 285 Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro Ile 290 295 300 Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu 305 310 315 320 Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg 325 330 335 Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn Ser Gly Asn Gly Ala 340 345 350 Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly Glu Ala Ser Lys Ser 355 360 365 Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser Ser Glu Thr Pro Asp 370 375 380 Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu Gln Asn Val Asp Met 385 390 395 400 Lys Ile Gly Val <210> 5 <211> 1218 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccacag cctcagctca taccagccat ccaatgcaag gaaggacaac accaagccca 720 gaggacagtt cctggactga tttcttcaac ccaatctcac accccatggg acgaggtcat 780 caagcaggaa gaaggatggg agaccaagac acattccacc ccagtggggg gtcccatacc 840 actcatggat ctgaatcaga tggacactca catgggagtc aagaaggtgg agcaaacaca 900 acctctggtc ctataaggac accccaaatt ccagaatggc tgatcatctt ggcatccctc 960 ttggccttgg ctttgattct tgcagtttgc attgcagtca acagtcgaag aaggtgtggg 1020 cagaagaaaa agctagtgat caacagtggc aatggagctg tggaggacag aaagccaagt 1080 ggactcaacg gagaggccag caagtctcag gaaatggtgc atttggtgaa caaggagtcg 1140 tcagaaactc cagaccagtt tatgacagct gatgagacaa ggaacctgca gaatgtggac 1200 atgaagattg gggtgtaa 1218 <210> 6 <211> 405 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Thr Ala 210 215 220 Ser Ala His Thr Ser His Pro Met Gln Gly Arg Thr Thr Pro Ser Pro 225 230 235 240 Glu Asp Ser Ser Trp Thr Asp Phe Phe Asn Pro Ile Ser His Pro Met 245 250 255 Gly Arg Gly His Gln Ala Gly Arg Arg Met Gly Asp Gln Asp Thr Phe 260 265 270 His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly 275 280 285 His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro 290 295 300 Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu 305 310 315 320 Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg 325 330 335 Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn Ser Gly Asn Gly 340 345 350 Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly Glu Ala Ser Lys 355 360 365 Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser Ser Glu Thr Pro 370 375 380 Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu Gln Asn Val Asp 385 390 395 400 Met Lys Ile Gly Val 405 <210> 7 <211> 1290 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60 cagatcgatt tgaatataac ctgccgcttt gcaggtgtat tccacgtgga gaaaaatggt 120 cgctacagca tctctcggac ggaggccgct gacctctgca aggctttcaa tagcaccttg 180 cccacaatgg cccagatgga gaaagctctg agcatcggat ttgagacctg caggtatggg 240 ttcatagaag ggcacgtggt gattccccgg atccacccca actccatctg tgcagcaaac 300 aacacagggg tgtacatcct cacatccaac acctcccagt atgacacata ttgcttcaat 360 gcttcagctc cacctgaaga agattgtaca tcagtcacag acctgcccaa tgcctttgat 420 ggaccaatta ccataactat tgttaaccgt gatggcaccc gctatgtcca gaaaggagaa 480 tacagaacga atcctgaaga catctacccc agcaacccta ctgatgatga cgtgagcagc 540 ggctcctcca gtgaaaggag cagcacttca ggaggttaca tcttttacac cttttctact 600 gtacacccca tcccagacga agacagtccc tggatcaccg acagcacaga cagaatccct 660 gctaccaata ggaatgatgt cacaggtgga agaagagacc caaatcattc tgaaggctca 720 actactttac tggaaggtta tacctctcat tacccacaca cgaaggaaag caggaccttc 780 atcccagtga cctcagctaa gactgggtcc tttggagtta ctgcagttac tgttggagat 840 tccaactcta atgtcaatcg ttccttatca ggagaccaag acacattcca ccccagtggg 900 gggtcccata ccactcatgg atctgaatca gatggacact cacatgggag tcaagaaggt 960 ggagcaaaca caacctctgg tcctataagg acaccccaaa ttccagaatg gctgatcatc 1020 ttggcatccc tcttggcctt ggctttgatt cttgcagttt gcattgcagt caacagtcga 1080 agaaggtgtg ggcagaagaa aaagctagtg atcaacagtg gcaatggagc tgtggaggac 1140 agaaagccaa gtggactcaa cggagaggcc agcaagtctc aggaaatggt gcatttggtg 1200 aacaaggagt cgtcagaaac tccagaccag tttatgacag ctgatgagac aaggaacctg 1260 cagaatgtgg acatgaagat tggggtgtaa 1290 <210> 8 <211> 429 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly 20 25 30 Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala 50 55 60 Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly 65 70 75 80 Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser 100 105 110 Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp 115 120 125 Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr 130 135 140 Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu 145 150 155 160 Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp 165 170 175 Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp 195 200 205 Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Asn Arg 210 215 220 Asn Asp Val Thr Gly Gly Arg Arg Asp Pro Asn His Ser Glu Gly Ser 225 230 235 240 Thr Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Thr Ser His Tyr Pro His Thr Lys Glu 245 250 255 Ser Arg Thr Phe Ile Pro Val Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser Phe Gly 260 265 270 Val Thr Ala Val Thr Val Gly Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn Arg Ser 275 280 285 Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Phe His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr 290 295 300 Thr His Gly Ser Glu Ser Asp Gly His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly 305 310 315 320 Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu 325 330 335 Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala 340 345 350 Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys 355 360 365 Leu Val Ile Asn Ser Gly Asn Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser 370 375 380 Gly Leu Asn Gly Glu Ala Ser Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val 385 390 395 400 Asn Lys Glu Ser Ser Glu Thr Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu 405 410 415 Thr Arg Asn Leu Gln Asn Val Asp Met Lys Ile Gly Val 420 425

Claims (85)

  1. 환자에서 신경퇴행성 질환을 진단하거나 모니터하는 방법에 있어서, 환자의 생물학적 샘플내에서 핵산의 발현 수준을 감지하는 것을 포함하는데, 이때 핵산은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 생물학적 샘플은 세포, 조직, 생물학적 유체, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 발현 수준은 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA)의 발현 수준을 결정함으로써 감지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 핵산에 의한 RNA 발현 수준을 감지하기 전에 생물학적 샘플로부터 RNA를 분리하는 단계가 추가 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, RNA의 발현 수준은 중합효소 쇄 반응 (PCR), 역-전사효소-PCR (RT-PCR), 노던 블랏, 실시간 PCR, 또는 이의 임의의 복합 방법에 의해 감지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, RNA 발현 수준은 올리고뉴클레오티드에 하이브리드 반응으로 감지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 (DNA), RNA, 상보적 데옥시리보핵산 (cDNA), 게놈 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:1의 좌표 1-1212에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 766-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:3의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:3의 좌표 1-1215에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-696 에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 5의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:5의 좌표 1-1218에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-696 에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:7의 좌표 1-1290에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 844-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 환자에서 신경퇴행성 질환을 진단 또는 모니터하는 방법에 있어서, 이 방법은 환자의 생물학적 샘플내에 폴리펩티드의 발현을 감지하는 것이 포함되고, 이때 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 동성성인 연속 아미노산 서열을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:2의 좌표 1-403에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 256-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, SEQ ID NO: 4의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:4의 좌표 1-404에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서, SEQ ID NO: 6의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:6의 좌표 1-405에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, SEQ ID NO:8의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:8의 좌표 1-429에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 282-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 13 항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 13 항에 있어서, 생물학적 샘플은 세포, 조직, 생물학적 유체, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 13 항에 있어서, 감지는 폴리펩티드와 이 폴리펩티드에 특이적으로 결합하도록 개조된 항체의 면역-복합체를 감지하는 것이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 면역-복합체의 감지 방법에는 웨스턴-블랏, 면역조직화학, 면역세포화학, 효소 연결된 면역흡착 검사 (ELISA), 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 항체에는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 이 방법은 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA)의 발현을 조절할 수 있는 시약을 포함하는 조성물을 투여하는 것이 포함되며, 이때 핵산에는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:1의 좌표 1-1212에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 766-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:3의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:3의 좌표 1-1215에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO: 5의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:5의 좌표 1-1218에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-696 에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:7의 좌표 1-1290에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 844-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 투여는 환자, 환자의 세포, 환자의 조직 또는 이의 임의의 복합에 투여하는 것이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 23 항에 있어서, 조절에는 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 감쇠(attenuating) 및/또는 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 증가시키는 것이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 23 항에 있어서, 시약은 상기 핵산과 하이브리드될 수 있는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드에는 데옥시리보핵산 (DNA), RNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, siRNA에는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 제 2 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드되는 제 1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이때 제 1 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열의 최소 15개 뉴클레오티드 연속 스팬(span)인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 23 항에 있어서, 시약은 소분자 엔티티(SME)인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 소분자 엔티티는 ERK-MAP 키나제 경로의 조절물질, 조절PKC 경로의 조절물질 또는 이둘 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법에 있어서, 이 방법에는 폴리펩티드의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 시약을 포함하는 조성물의 투여가 포함되는데, 이때 폴리펩티드의 서열은 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:2의 좌표 1-403에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 256-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서, SEQ ID NO: 4의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:4의 좌표 1-404에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35 항에 있어서, SEQ ID NO: 6의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:6의 좌표 1-405에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 35 항에 있어서, SEQ ID NO:8의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:8의 좌표 1-429에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 282-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 35 항에 있어서, 투여는 환자, 환자의 세포, 환자의 조직 또는 이의 임의의 복합에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제 35 항에 있어서, 조절에는 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 감쇠(attenuating), 핵산에 의해 인코드된 RNA의 발현을 증가, 또는 이 두가지 모두가 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 35 항에 있어서, 시약에는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하도록 조정된 항체가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 항체에는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  45. 제 44 항에 있어서, 보체 및 폴리뉴클레오티드는 100% 상보적인 것을 특징으로 하는 분자.
  46. 제44항의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되고, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속성 제 1 뉴클레오티드 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 폴리뉴클레오티드.
  47. 제44항의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되고, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 뉴클레오티드 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
  48. 제44항의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되고, SEQ ID NO:3의 뉴클레오티드 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 뉴클레오티드 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
  49. 제 44 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자는 SEQ ID NO 4를 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  50. 제 49항의 폴리펩티드로부터 유도된 제1 펩티드에 있어서, 이때 제 1 펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속성 제1 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 펩티드.
  51. 제 49항의 폴리펩티드로부터 유도된 제 2 펩티드에 있어서, 이때 제 2 펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2 펩티드.
  52. 제 49항의 폴리펩티드로부터 유도된 제 3 펩티드에 있어서, 이때 제 3 펩티드는 SEQ ID NO:4의 아미노산 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 3 펩티드.
  53. 제 49 항에 있어서, 폴리펩티드 발현은 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 환자의 생물학적 샘플에서 조절되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  54. 제 49 항에 있어서, 폴리펩티드는 CD44 변이체인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  55. 제 49 항에 있어서, 신경퇴행성 질환에는 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA), 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 분리된 폴리뉴클레오티드.
  56. SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  57. 제 56 항에 있어서, 보체 및 폴리뉴클레오티드는 100% 상보적인 것을 특징으로 하는 분자.
  58. 제56항의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되고, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속성 제 1 뉴클레오티드 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 폴리뉴클레오티드.
  59. 제56항의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되고, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 뉴클레오티드 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2 폴리뉴클레오티드.
  60. 제56항의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 유도되고, SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 뉴클레오티드 서열이 포함하는 것을 특징으로 하는 제 3 폴리뉴클레오티드.
  61. 제 56 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자는 SEQ ID NO: 6를 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  62. 제 61항의 폴리펩티드로부터 유도된 제1 펩티드에 있어서, 이때 제 1 펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속성 제1 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 펩티드.
  63. 제 61항의 폴리펩티드로부터 유도된 제 2 펩티드에 있어서, 이때 제 2 펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속성 제 2 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2 펩티드.
  64. 제 61항의 폴리펩티드로부터 유도된 제 3 펩티드에 있어서, 이때 제 3 펩티드는 SEQ ID NO:6의 아미노산 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속성 제 3 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 3 펩티드.
  65. 제 61 항에 있어서, 폴리펩티드 발현은 신경퇴행성 질환으로 진단을 받은 환자의 생물학적 샘플에서 조절되는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  66. 제 61 항에 있어서, 폴리펩티드는 CD44 변이체인 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  67. 제 65 항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA) 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  68. 신경퇴행성 질환을 진단하기 위한 키트에 있어서, 이때 키트는 생물학적 샘플내에 핵산의 발현을 감지할 수 있는 최소 한 가지 시약을 포함하고, 이때 핵산에는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, 또는 이의 임의의 복합의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  69. 제 68 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:1의 좌표 1-1212에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:1의 좌표 766-822에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  70. 제 68 항에 있어서, SEQ ID NO:3의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:3의 좌표 1-1215에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:3의 좌표 769-825에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  71. 제 68 항에 있어서, SEQ ID NO: 5의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:5의 좌표 1-1218에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:5의 좌표 772-828에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  72. 제 68 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 최소 20개 뉴클레오티드에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열에는 SEQ ID NO:7의 좌표 1-1290에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 639-696에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; SEQ ID NO:7의 좌표 844-900에 최소 90% 상동성인 연속 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  73. 제 68 항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA) 또는 이의 임의의 복합으로 구성된 것을 특징으로 하는 키트.
  74. 제 68 항에 있어서, 최소 한 가지 시약은 핵산 또는 핵산에 의해 인코드된 리보핵산(RNA) 분자와 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  75. 제 74 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드은 DNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  76. 제 68 항에 있어서, 생물학적 샘플은 세포, 조직, 체액, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  77. 신경퇴행성 질환을 진단하기 위한 키트에 있어서, 키트는 생물학적 샘플내에 폴리펩티드의 발현을 감지할 수 있는 최소 한 가지 시약을 포함하고, 이때 폴리펩티드에는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, 또는 이의 임의의 복합의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  78. 제 77 항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:2의 좌표 1-403에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:2의 좌표 256-274에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  79. 제 77 항에 있어서, SEQ ID NO: 4의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:4의 좌표 1-404에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:4의 좌표 257-275에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  80. 제 77 항에 있어서, SEQ ID NO: 6의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:6의 좌표 1-405에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:6의 좌표 258-276에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  81. 제 77 항에 있어서, SEQ ID NO:8의 최소 10개 아미노산에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열에는 SEQ ID NO:8의 좌표 1-429에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 214-232에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; SEQ ID NO:8의 좌표 282-300에 최소 90% 상동성인 연속 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 복합이 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  82. 제 77 항에 있어서, 신경퇴행성 질환은 근위축성측생경화증(ALS), 파킨슨 질환 (PD), 알츠하이머 질환 (AD), 일차성 측삭경화증 (PLS), 척수성 근위축증 (SMA) 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  83. 제 77 항에 있어서, 최소 한 가지 시약에는 폴리펩티드와 특이적으로 상호작용하여, 감지가능한 면역-복합체를 형성하는데 적합한 항체가 포함되는 것을 특징으로 하는 키트.
  84. 제 83 항에 있어서, 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 또는 이의 임의의 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  85. 제 77 항에 있어서, 생물학적 샘플은 세포, 조직, 체액, 또는 이의 임의의 복합을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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