KR20100044363A - Bioactive glass nanofiber with protein adhesive type and a preparation method thereof - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A protein adhesive type bioactive glass nano fiber and a preparation method thereof are provided to modify the surface with a hybrid material of a biopsy protein controlling cells and biological responses to use the nano fiber to regenerate brain and tooth tissues. CONSTITUTION: A protein adhesive type bioactive glass nano fiber includes a bioactive glass nano fiber matrix and a hybrid material consisting a cell adhesiveness protein-calcium phosphate group crystal. The bioactive glass nano fiber matrix is formed in a standard glass structure of SiO_2-CaO or SiO_2-CaO-P_2O_5. The diameter of the bioactive glass nanofiber matrix is 10~900 nanometers. The cell adhesiveness protein is selected from the group consisting fibronectin, collagen, laminin, and others. The calcium phosphate group crystal is a hydroxyapatite.

Description

단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 및 이의 제조방법{BIOACTIVE GLASS NANOFIBER WITH PROTEIN ADHESIVE TYPE AND A PREPARATION METHOD THEREOF}Protein-bound bioactive glass nanofibers and a method of manufacturing the same {BIOACTIVE GLASS NANOFIBER WITH PROTEIN ADHESIVE TYPE AND A PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 세포의 부착 및 증식을 돕고 조직재생 능력이 향상되어 골 및 치아조직의 재생을 위한 바이오 소재로서 이용 가능한 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a protein-binding bioactive glass nanofiber and a method for manufacturing the same, which can be used as a biomaterial for regenerating bone and dental tissues by assisting cell attachment and proliferation and improving tissue regeneration ability.

지난 수십 년 동안 인체의 손상된 경조직 및 연조직을 대체하기 위한 연구가 다각적으로 진행되고 있다. 이러한 연구와 관련하여 임상학적으로 금속 보철, 알루미나 힙 조인트 및 생체활성 세라믹 등이 대체물질로서 사용가능하다고 알려져 있다[G.Heimk e, Angew. Chem. Int. Ed. 1, 111 (1989); L.L.Hench and J.M.Polak, Science 295, 1014 (2002); H.-W.Kim, H.-E.Kim, and J.C.Kno wles, Adv. Funct. Mater. 16, 1529 (2006)].Over the last few decades, research on replacing damaged hard and soft tissues of the human body has been diversified. In connection with this research, it is known clinically that metal prostheses, alumina hip joints and bioactive ceramics can be used as substitutes [G. Heimk e, Angew. Chem. Int. Ed . 1, 111 (1989); LL Hench and JMPolak, Science 295, 1014 (2002); H.-W.Kim, H.-E.Kim, and JCKno wles, Adv. Funct. Mater . 16, 1529 (2006).

조직과의 친화성을 증대시키기 위해 경조직이나 연조직과 형태학적으로 유사한 나노섬유 형태를 갖는 대체 물질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.In order to increase affinity with tissues, research into alternative materials having nanofiber forms that are morphologically similar to hard or soft tissues is being actively conducted.

대한민국 특허등록 제10-0621569호는 조직재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와 마이크로 섬유의 복합 지지체를 언급하고 있다. 구체적으로, 생 리활성 고분자로부터 얻어진 나노섬유가 이차원 또는 삼차원 구조의 네트워크 형태로 이루어지며, 생체 조직이 삼차원으로 재생됨과 동시에 나노섬유를 복원하여 공극률을 향상시켜 세포의 부착성 및 증식률을 높일 수 있다고 제시하고 있다.Korean Patent Registration No. 10-0621569 refers to a composite support of nanofibers and microfibers in biomimetic form for inducing tissue regeneration. Specifically, the nanofibers obtained from the bioactive polymers are formed in the form of a network of two-dimensional or three-dimensional structure, and biological tissues can be regenerated in three dimensions, and at the same time, the nanofibers can be restored to improve the porosity to increase cell adhesion and proliferation rate. Suggesting.

대한민국 특허등록 제10-0762928호는 견 섬유에서 세리신을 제거하여 얻어진 견 피브로인의 나노섬유가 부직포 형태로 되어 있는 골조직유도 재생용 차폐막을 언급하고 있다. Republic of Korea Patent Registration No. 10-0762928 refers to the bone tissue-induced regeneration shielding membrane in which the nanofiber of the silk fibroin obtained by removing sericin from the silk fiber is in the form of nonwoven fabric.

또한 미합중국 특허공개 제2005-226904호는 조직공학용 섬유 복합재를 제시하면서, 상기 복합재가 나노 수준의 기공을 가지는 실리카와 티타니아 등의 산화물과 생분해성 고분자를 포함하여 섬유 형태로 제조가 가능하다고 제시하고 있다.In addition, U.S. Patent Publication No. 2005-226904 proposes a fiber composite for tissue engineering, and suggests that the composite can be manufactured in a fiber form including oxides and biodegradable polymers such as silica and titania having nano-level pores. .

그러나 전술한 바의 나노섬유 형태의 대체 물질은 세포 부착 리간드가 없거나 소수성을 나타내 초기 세포 부착이 어렵거나, 생체 세라믹과 같이 생체 활성 소재에 비해 생물학정 특성이 낮아 조직 재생에 한계가 있다.However, as described above, the nanofiber-type substitute material has no cell attachment ligand or exhibits hydrophobicity, thus making it difficult for initial cell attachment, or lower biotissue properties than bioactive materials such as bioceramics, thereby limiting tissue regeneration.

부연하면, 대체 물질이 생체 내(in vivo) 임플란트되는 경우 이들의 생화학적 계면(biointerface) 특성이 초기 단백질 흡착, 세포 부착, 외부세포 매트릭스 합성 및 조직-재료 등 일련의 생리학적 반응에 영향을 준다고 보고되고 있다[J.E.Ellingsen and S.P .L yngstadaas, Bio-Implant Interface, CRC Press, Boca Raton (2003)]. 이러한 관점에서 대체 물질과 세포 간 계면 특성의 제어가 조직 재생을 위한 재료의 설계에 중요하게 대두되었다.In other words, when substitutes are implanted in vivo , their biochemical interface properties affect a range of physiological responses, including initial protein adsorption, cell adhesion, extracellular matrix synthesis, and tissue-material. Have been reported (JEEllingsen and SP.L yngstadaas, Bio-Implant Interface, CRC Press, Boca Raton (2003)). In this respect, control of interfacial properties between alternative materials and cells has emerged as an important factor in the design of materials for tissue regeneration.

최근 조직 특이성을 가진 대체 물질과 세포간의 계면 특성 제어를 통해 조직 재생능을 향상시킬 수 있다는 연구가 보고된 바 있다[B.D.Ratner and S.J.Bryant, Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41 (2004); D.A.Puleo and A.Nanci, Biomater. 20, 2311 (1999); K.Anselme, Biomater. 21, 667 (2000); M.Uchida, A.Oyane, H.M.Kim, T.K okubo, and A.Ito, Adv. Mater. 16, 1071 (2004)]. 따라서 조직 재생을 위한 대체 물질의 연구에 있어 그 형태 뿐만 아니라 대체 물질의 재료 특성 자체도 매우 중요하게 인식되고 있다.Recently, research has been reported to improve tissue regeneration by controlling interfacial properties between alternative substances with tissue specificity [BDRatner and SJBryant, Annu. Rev. Biomed. Eng . 6, 41 (2004); DAPuleo and A. Nanci, Biomater . 20, 2311 (1999); K. Anselme, Biomater . 21, 667 (2000); M. Uchida, A. Oyane, HMKim, TK okubo, and A. Ito, Adv. Mater. 16, 1071 (2004). Therefore, in the research of alternative materials for tissue regeneration, not only the form but also the material properties of the replacement materials are recognized as very important.

이미 언급한 바와 같이 대체 물질로서 생체활성 세라믹이 광범위하게 사용되고 있으며, 이러한 생체활성 세라믹으로는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HAp, Ca10(PO46(OH)2)가 가장 널리 알려져 있다. 상기 하이드록시아파타이트는 인체의 뼈나 치아의 주성분과 구조가 동일하여 생체친화성이 우수하여 뼈나 피부속의 임플란트가 주변의 생체조직과 쉽게 융화될 수 있다.As already mentioned, bioactive ceramics are widely used as substitute materials, and hydroxyapatite, HAp, and Ca 10 (PO 46 (OH) 2 ) are most widely known as such bioactive ceramics. Apatite has the same structure as the main component of bones and teeth of the human body, so the biocompatibility is excellent, and the implants in the bones or skin can be easily integrated with the surrounding biological tissues.

그러나 이러한 하이드록시아파타이트는 고분자들에 비해 복잡한 삼차원적 구조, 즉 나노섬유 등의 형태로 제조하는데 매우 제한적이어서 세포 부착 후 증식이나 분화를 증진시키는데 한계가 있다.However, such hydroxyapatite is very limited to manufacture in the form of a complex three-dimensional structure, that is, nanofibers, compared to the polymers, there is a limit to enhance the proliferation or differentiation after cell attachment.

이에 본 발명자들은 삼차원적 구조로 제작되며, 초기 세포 부착성이 높고 부착된 세포의 증식률을 높일 수 있도록 다각적으로 연구를 수행한 결과, 지지체로서 생체활성유리 나노섬유 형태로 제조하고, 그 표면을 하이드록시아파타이트와 같은 무기물로 처리하되, 초기 세포 부착능을 높이기 위해 세포 부착성 단백질을 함께 사용한 대체 물질을 개발하게 되었다.Thus, the inventors made a three-dimensional structure, and as a result of conducting various studies to increase the initial cell adhesion and increase the proliferation rate of the attached cells, the present invention was prepared in the form of bioactive glass nanofibers as a support, and the surface thereof was hydrated. Treatment with minerals such as roxiapatite has led to the development of alternatives that combine cell adhesion proteins to increase initial cell adhesion.

본 발명의 목적은 세포의 부착 및 증식을 돕고 조직재생 능력이 향상되어 골 및 치아조직의 재생을 위한 바이오 소재로서 이용 가능한 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide protein-bound bioactive glass nanofibers and a method for preparing the same, which can be used as biomaterials for regenerating bone and dental tissues by assisting cell attachment and proliferation and improving tissue regeneration ability.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 포함하는 조직재생 재료를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a tissue regeneration material comprising the protein-bound bioactive glass nanofibers.

상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 In order to solve the above object, the present invention

생체활성유리 나노섬유 매트릭스; 및Bioactive glass nanofiber matrix; And

상기 매트릭스 상에 코팅되며, 세포 부착성 단백질-인산칼슘계 결정으로 이루어진 하이브리드 물질Hybrid material coated on the matrix and consisting of cell-adhesive protein-calcium phosphate crystals

을 포함하는 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 제공한다.It provides a protein-bound bioactive glass nanofiber comprising a.

또한 본 발명은 Also,

생체활성유리를 성형하여 나노섬유 매트릭스를 제조하는 단계;Molding a bioactive glass to prepare a nanofiber matrix;

상기 나노섬유 매트릭스를 세포 부착성 단백질, 칼슘 이온 용액, 및 인산 이온 용액이 혼합된 하이브리드 물질용 혼합 용액과 접촉시키는 단계; 및Contacting the nanofiber matrix with a mixed solution for a hybrid material in which cell adherent protein, calcium ion solution, and phosphate ion solution are mixed; And

상기 나노섬유 매트릭스 표면을 세포 부착성 단백질 및 인산칼슘계 결정으로 이루어진 하이브리드 물질로 코팅시키는 단계; Coating the surface of the nanofiber matrix with a hybrid material consisting of cell adhesion protein and calcium phosphate crystals;

를 포함하는 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing a protein-bound bioactive glass nanofiber comprising a.

또한 본 발명은 상기 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 포함하는 조직재생 재료를 제공한다. In another aspect, the present invention provides a tissue regeneration material comprising the protein-bound bioactive glass nanofibers.

본 발명에 따라 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는 표면이 뼈의 무기물 성분인 인산칼슘계 결정 뿐 아니라 세포 및 생체 반응을 조절하는 생체 단백질의 하이브리드 물질로 개질되어 있어, 종래 나노섬유 부직포에 비해 세포의 부착 및 증식을 돕고 조직재생 능력이 향상되어 골 및 치아조직의 재생을 위한 바이오 소재로서 이용 가능하다.Protein-binding bioactive glass nanofibers prepared according to the present invention are modified with a hybrid material of not only calcium phosphate-based crystals, which are inorganic constituents of bone, but also biological proteins that control cells and biological responses. Compared to the cell adhesion and proliferation and improved tissue regeneration ability can be used as a bio material for the regeneration of bone and dental tissue.

이와 같이 제조된 나노섬유는 친수성 리간드일 뿐만 아니라 세포 친화도가 높은 인산칼슘계 결정으로 코팅되어, 우수한 물리화학적 및 생물학적 특성을 갖도록 그 표면이 개질된다. 그 결과 나노 섬유막의 표면에 초기 세포의 부착을 증가시킬 수 있어 세포의 증식과 분화를 활성화할 수 있게 된다. The nanofibers thus prepared are coated with calcium phosphate crystals having high cell affinity as well as hydrophilic ligands, and the surfaces thereof are modified to have excellent physicochemical and biological properties. As a result, the adhesion of early cells to the surface of the nanofibrous membrane can be increased, thereby activating proliferation and differentiation of cells.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에 따른 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는 생체활성유리로 이루어진 나노섬유 매트릭스의 표면을 코팅에 의해 세포 부착성 단백질-인산칼슘계 결정으로 이루어진 하이브리드 물질로 개질한 것을 의미한다.Protein-bound bioactive glass nanofiber according to the present invention means that the surface of the nanofiber matrix made of bioactive glass is modified with a hybrid material made of cell-adhesive protein-calcium phosphate crystals by coating.

상기 생체활성유리는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 것이면 어느 것이든 가능하며, 대표적으로, SiO2-CaO 또는 SiO2-CaO-P2O5의 기 본적 유리구조로 이루어진 것이 사용 가능하다.The bioactive glass is not particularly limited in the present invention, and any of those known in the art may be used. Typically, the bioactive glass may be formed of a basic glass structure of SiO 2 -CaO or SiO 2 -CaO-P 2 O 5 . Can be used

상기 생체활성유리는 나노섬유로 이루어지며, 다양한 분야에 이용될 수 있도록 부직포(nonwoven) 형태로 제조된 것을 사용한다. 이러한 생체활성유리 나노섬유는 나노 섬유란 구조적 특성을 통해 외부 용액과의 빠른 반응속도로 인해 보다 우수한 생체활성을 나타낸다. 또한 높은 공극률 및 표면적 특성에 의해 세포가 잘 부착될 뿐만 아니라 부착된 세포의 성장 및 증식이 효과적으로 이루어진다.The bioactive glass is made of nanofibers, and uses a nonwoven fabric that can be used in various fields. Such bioactive glass nanofibers exhibit better bioactivity due to their fast reaction rate with external solutions through the structural properties of nanofibers. In addition, the high porosity and surface area properties make the cells adhere well as well as the growth and proliferation of the attached cells.

상기 나노 섬유는 그 직경이 수 내지 수백 나노미터가 될 수 있으며, 기계적 및 화학적 물성뿐만 아니라 세포와의 부착성이나 생체 활성 등을 고려할 때 10 내지 900nm인 것이 바람직하다. 만약 그 직경이 상기 범위 미만이면 기계적 물성이 저하되어 세포 성장이나 증식이 이루어지는 동안 충분히 세포를 지지할 수 없고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 기공이 커져 세포 부착이 어려워지므로, 상기 범위 내에서 적절히 사용한다.The nanofibers may have a diameter of several hundreds to hundreds of nanometers, and are preferably 10 to 900 nm in consideration of mechanical and chemical properties as well as adhesion to cells and bioactivity. If the diameter is less than the above range, the mechanical properties are deteriorated and the cells cannot be sufficiently supported during cell growth or proliferation. On the contrary, if the diameter exceeds the above range, the pores become large and the cell adhesion becomes difficult. do.

특히 본 발명에 따른 생체활성유리 나노섬유는 그 표면이 초기 세포 부착 속도가 빠른 세포 부착성 단백질(cell adhesion protein)과 친수성의 생체적합성 무기물인 인산칼슘계 결정으로 이루어지는 하이브리드 물질로 개질된다.In particular, the bioactive glass nanofiber according to the present invention is modified with a hybrid material whose surface is composed of a cell adhesion protein having a high initial cell adhesion rate and a calcium phosphate-based crystal which is a hydrophilic biocompatible inorganic material.

세포 부착성 단백질은 기질에 부착되기 위한 부착성 리간드를 갖고 있어 생체활성유리 나노섬유 표면에 부착되어 초기 세포성 반응을 자극시켜 재생하고자 하는 세포가 잘 부착되고, 부착된 세포가 잘 성장할 수 있도록 한다. 부연하면, 세포 부착성 단백질, 즉 세포외 기질(extracellular matrix)에서 발견되는 단백질은 서로 다른 세포들을 연결해주고 이들의 이동과 신호 전달을 매개하는 기능을 할 뿐 만 아니라 살아있는 세포 조직을 구성하는 세포 사이의 접착제 역할을 한다. 그 결과 종래 생체활성유리 나노섬유의 낮은 세포 부착성, 세포 성장률 및 생체 적합성의 문제를 해소할 수 있다.Cell-adhesive proteins have adherent ligands for attachment to the substrate, which are attached to the surface of the bioactive glass nanofibers to stimulate the initial cellular response so that the cells to be regenerated can adhere well and the attached cells can grow well. . In other words, cell adhesion proteins, ie proteins found in the extracellular matrix, not only function to connect different cells and mediate their migration and signal transduction, but also between the cells that make up living cell tissue. Acts as an adhesive. As a result, the problems of low cell adhesion, cell growth rate and biocompatibility of the conventional bioactive glass nanofibers can be solved.

이러한 세포 부착성 단백질은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 세포 부착능을 높일 수 있다고 공지된 단백질이면 어느 것이든 가능하다. 바람직하기로, 상기 세포 부착성 단백질로는 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 트롬보스폰딘 1, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 골 시알로프로틴, 연골 기저 단백질, 피브리노겐, 피브린, 피불린, 뮤신, 엔탁틴, 오스테오폰틴, 플라스미노겐, 리스트릭틴, 세르글리신, SPARC/오스테오넥틴, 베르시칸, 폰 빌리브란트 인자, 카드헤린, 코넥신, 및 셀렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이 가능하며, 바람직하기로는 피브로넥틴을 사용한다.The cell adhesion protein is not particularly limited in the present invention, and any protein known in the art to increase cell adhesion may be used. Preferably, the cell adhesion protein may include fibronectin, collagen, laminin, thrombospondin 1, vitronectin, elastin, tenascin, agrecan, agrin, bone sialoprotein, cartilage base protein, fibrinogen, fibrin, Selected from the group consisting of fibulin, mucin, entaxin, osteopontin, plasminogen, listritin, serglycine, SPARC / osteonectin, versican, von Willibrand factor, cadherin, connexin, and selectin One type is possible, Preferably fibronectin is used.

그러나 상기 세포 부착성 단백질은 자체 안정성이 낮아 유체 내 쉽게 방출되는 문제가 발생하는데, 이는 미네랄 성분인 인산칼슘계 결정과의 하이브리드화로 해소된다. However, the cell-adhesive protein has a low self stability and is easily released in the fluid, which is solved by hybridization with a calcium phosphate-based crystal which is a mineral component.

즉, 하이브리드 물질 중 또 다른 조성인 인산칼슘계 결정은 조직세포의 유착과 증식을 도모하고, 분화된 세포의 기능이 보전되며, 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 유화되어 염증 반응을 유발하지 않는 생체적합성 인산칼슘계 무기물이 형성되도록 한다.In other words, calcium phosphate-based crystals, another composition of the hybrid material, promote adhesion and proliferation of tissue cells, preserve the function of differentiated cells, and biocompatibility that emulsifies well with surrounding tissues even after transplantation to induce an inflammatory response. Allow calcium phosphate-based minerals to form.

상기 인산칼슘계 결정은 본 발명에서 한정하지 않으며 이 분야에서 공지된 바의 인산칼슘계 무기물이 사용된다. 대표적으로 하이드록시아파타이트, 옥시아파 타이트, 트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 육인산사칼슘, 칼슘메타포스페이트 등이 가능하며, 바람직하기로는 하이드록시아파타이트를 사용한다. 이러한 인산칼슘계 결정의 종류는 칼슘 이온 및 인산 이온의 농도, 처리 조건 또는 처리 시간을 조절하여 결정할 수 있다.The calcium phosphate-based crystals are not limited in the present invention, and calcium phosphate-based inorganic materials as known in the art are used. Typically, hydroxyapatite, oxiapatite, tricalcium phosphate, monocalcium phosphate, tetracalcium phosphate, calcium metaphosphate, and the like are preferable, and hydroxyapatite is preferably used. The type of calcium phosphate crystal can be determined by adjusting the concentration of calcium ions and phosphate ions, treatment conditions or treatment time.

이때 나노 섬유막 표면에 코팅되는 인산칼슘계 결정은 그 직경이 3 nm 내지 100 nm 이다. 만약 인산칼슘계 결정의 직경이 상기 범위 미만이면 초기에 세포가 부착되기 전 결정이 분리되거나 생분해되어 친수성 리간드로 작용하기 어렵고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 나노 섬유막의 다공성이 저하되는 문제점이 있다. At this time, the calcium phosphate-based crystals coated on the surface of the nanofiber film have a diameter of 3 nm to 100 nm. If the diameter of the calcium phosphate-based crystals is less than the above range, the crystals are separated or biodegraded before the cells are initially attached, and thus, it is difficult to act as a hydrophilic ligand.

바람직하기로 인산칼슘계 결정은 Ca/P의 몰비가 1/1.50 내지 1/1.75, 더욱 바람직하기로는 Ca/P 몰비는 1.67이 되도록 한다. 표면 개질시 칼슘이온 및 인산이온의 농도, 처리조건 또는 처리시간을 조절하여 인산칼슘계 결정의 Ca/P 몰비가 상기 범위 내에서 조절 되도록 나노 섬유막을 표면 개질한다. 만약 인산칼슘계 결정의 몰비가 상기 범위 미만이면 체내에서 인산칼슘계 결정이 빨리 생분해되는 문제점이 있다. 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 생체적합성이 저하되는 문제점이 있다. Preferably, the calcium phosphate-based crystal has a molar ratio of Ca / P of 1 / 1.50 to 1 / 1.75, more preferably Ca / P molar ratio of 1.67. During surface modification, the nanofibrous membrane is surface-modified so that the Ca / P molar ratio of calcium phosphate-based crystals is adjusted within the above range by adjusting the concentration of calcium ions and phosphate ions, treatment conditions or treatment time. If the molar ratio of the calcium phosphate crystal is less than the above range, there is a problem that the calcium phosphate crystal is rapidly biodegraded in the body. On the contrary, if the above range is exceeded, there is a problem that the biocompatibility is lowered.

이러한 세포 부착성 단백질과 인산칼슘계 결정을 포함하는 하이브리드 물질로 생체활성유리 나노섬유를 코팅함에 따라, 그 표면이 뼈의 무기물 성분인 인산칼슘계 결정 뿐만 아니라 세포 및 생체 반응을 조절하는 세포 부착성 단백질의 융합층으로 개질되어 있기 때문에, 기존의 나노섬유 매트릭스와 비교하여 세포의 부착 및 증식을 돕고 조직재생 능력을 향상시킬 수 있다. 또한 향후 골 조직 및 치아 조직의 재생을 돕는 새로운 바이오 소재로 유용하게 사용이 가능하다.As the bioactive glass nanofibers are coated with a hybrid material containing such cell-adhesive protein and calcium phosphate-based crystals, the surface of the cell-adhesive agent modulates not only calcium phosphate-based crystals, the inorganic component of bone, but also cellular and biological responses. Since it is modified with a fusion layer of proteins, it is possible to help cell adhesion and proliferation and improve tissue regeneration ability as compared to the conventional nanofiber matrix. In addition, it can be usefully used as a new bio material to help regeneration of bone tissue and dental tissue in the future.

본 발명에 따른 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는 전술한 바의 효과를 확보하기 위해 생체활성유리 나노섬유 매트릭스:하이브리드 물질을 100:1 내지 1:10 의 중량비로 포함한다. 만약 상기 생체활성유리 나노섬유 매트릭스에 대한 하이브리드 물질의 함량이 너무 과도하더라도 효과상의 큰 증대가 없어 비경제적이며, 이와 반대로 너무 적으면 충분한 세포 증식이 이루어지지 않아 조직 재생이 어려워진다.Protein-bound bioactive glass nanofibers according to the present invention comprises a bioactive glass nanofiber matrix: hybrid material in a weight ratio of 100: 1 to 1:10 in order to secure the effects described above. If the content of the hybrid material for the bioactive glass nanofiber matrix is too excessive, there is no significant increase in effect, which is uneconomical. On the contrary, if the amount is too small, sufficient cell proliferation is not achieved and tissue regeneration becomes difficult.

이때 상기 하이브리드 물질을 이루는 세포 부착성 단백질 : 인산칼슘계 결정은 1:107 내지 1:100 의 중량비로 사용한다. 만약 세포 부착성 단백질의 함량이 너무 과도하면 세포 부착은 용이하나 낮은 안정성으로 인해 세포 증식율이 낮아질 우려가 있고, 이와 반대로 인산칼슘계 결정의 함량이 너무 과도하면 상대적으로 세포 부착성 단백질의 낮은 함량으로 초기 세포 부착율이 낮아 세포 증식이 낮아질 우려가 있다.At this time, the cell adhesion protein: calcium phosphate-based crystal constituting the hybrid material is used in a weight ratio of 1:10 7 to 1: 100. If the content of the cell adhesion protein is excessive, the cell adhesion is easy but the cell growth rate may be lowered due to the low stability. On the contrary, if the content of calcium phosphate-based crystal is too excessive, the content of the cell adhesion protein may be relatively low. There is a fear that the cell proliferation is low because the initial cell adhesion rate is low.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 생체활성유리 나노 섬유는 피브로넥틴과 하이드록시아파타이트 결정으로 이루어진 하이브리드 물질로 개질된다. 상기 피브로넥틴은 초기 세포 부착성이 우수하여 조직 재생을 위한 세포의 초기 유착 속도가 매우　빠르며, 화학적 및 결정학적으로 무기 조직과 유사한 하이드록시아파타이트 결정으로 인해 부착된 세포의 안정성이 향상되어 결과적으로 세포의 증식율을 높일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the bioactive glass nanofibers are modified with a hybrid material consisting of fibronectin and hydroxyapatite crystals. The fibronectin has excellent initial cell adhesion, so the initial adhesion rate of cells for tissue regeneration is very fast, and the stability of attached cells is improved due to hydroxyapatite crystals that are chemically and crystallographically similar to inorganic tissues. Proliferation rate can be increased.

이와 같은 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는Such protein-bound bioactive glass nanofibers

생체활성유리를 성형하여 나노섬유 매트릭스를 제조하는 단계;Molding a bioactive glass to prepare a nanofiber matrix;

상기 나노섬유 매트릭스를 세포 부착성 단백질, 칼슘 이온 용액, 및 인산 이온 용액이 혼합된 하이브리드 물질용 혼합 용액과 접촉시키는 단계; 및Contacting the nanofiber matrix with a mixed solution for a hybrid material in which cell adherent protein, calcium ion solution, and phosphate ion solution are mixed; And

상기 나노섬유 매트릭스 표면을 인산칼슘계 결정으로 코팅하는 단계; 를 거쳐 제조된다.Coating the surface of the nanofiber matrix with calcium phosphate-based crystals; It is manufactured through.

이하 각 단계별로 더욱 상세히 설명한다.Each step will be described in more detail below.

먼저, 생체활성유리를 성형하여 나노섬유 매트릭스를 제조한다.First, bioactive glass is molded to prepare a nanofiber matrix.

상기 나노섬유 매트릭스는 당업계에서 공지된 방법에 의해 제조가능하며, 부직포 형태로 제조하는 것이 바람직하며, 대표적으로 드로잉(drawing), 템플레이트 합성(template synthesis), 상분리(phase separation), 자기 조합(self assembly), 전기방사(electrospinning) 방법 등이 가능하다. 바람직하기로는 전기방사 방법을 수행하며, 일예로 본 발명자가 특허출원한 등록특허 10-0791518호에 제시된 방법을 채택하여 사용한다.The nanofiber matrix may be prepared by a method known in the art, preferably in the form of a nonwoven fabric, and typically, drawing, template synthesis, phase separation, self assembly, electrospinning, and the like. Preferably, the electrospinning method is performed, and as an example, the method disclosed in Patent Application No. 10-0791518 filed by the inventor is adopted.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체활성유리 나노섬유 매트릭스는 유리 전구체로 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS), 질산칼슘, 및 트리에틸 포스페이트를 혼합하고, 얻어진 혼합물과 산을 포함하는 에탄올 수용액에 첨가하여 졸을 제조하고, 이를 숙성시켜 겔을 제조한 후, 적절한 조건으로 전기방사시켜 나노섬유 부직포를 제조한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the bioactive glass nanofiber matrix is mixed with tetraethyl orthosilicate (TEOS), calcium nitrate, and triethyl phosphate as a glass precursor, and obtained in an ethanol aqueous solution containing a mixture and an acid. It is added to prepare a sol, aged to prepare a gel, and then electrospun under appropriate conditions to prepare a nanofiber nonwoven fabric.

이때 적절한 조건이란 전장의 세기, 전장 거리, 방사속도 등을 조절하여 형 성된 나노섬유가 미세구조상으로 볼때 비드(bead)가 없이 섬유형이 잘 발달되는 조건을 말한다. Appropriate conditions are conditions under which fiber types are well developed without beads (beads) when the nanofibers formed by controlling the strength of the electric field, the electric field distance, and the spinning speed are microstructured.

다음으로, 세포 부착성 단백질과 인산칼슘계 결정 형성용 용액을 혼합하여 하이브리드 물질용 혼합 용액을 제조한다.Next, a cell adhesion protein and a solution for forming calcium phosphate crystals are mixed to prepare a mixed solution for a hybrid material.

상기 인산칼슘계 결정 형성용 용액은 칼슘 이온 용액과 인산 이온 용액을 혼합하여 제조하며, 이렇게 제조된 용액은 나노 섬유막의 표면의 -OH기에 칼슘과 인이 석출되어 인산칼슘 핵을 형성하고, 결정으로 성장된다. 이때 칼슘 이온 용액 및 인산 이온 용액의 농도에 따라 형성되는 인산칼슘계 결정의 Ca/P 몰비 조절이 가능하다.The calcium phosphate-based crystal forming solution is prepared by mixing a calcium ion solution and a phosphate ion solution, and the solution prepared as described above forms calcium phosphate nuclei by depositing calcium and phosphorus at the -OH group on the surface of the nanofibrous membrane. Is grown. At this time, it is possible to control the Ca / P molar ratio of the calcium phosphate-based crystals formed according to the concentration of the calcium ion solution and the phosphate ion solution.

상기 칼슘 이온 용액은 당업계에 공지된 칼슘원을 용매, 바람직하게는 물에 용해한 것을 사용할 수 있다. 일예로, 칼슘원으로 염화칼슘, 수산화칼슘, 아세트산칼슘, 질산칼슘 또는 인산수소칼슘을 사용할 수 있다. The calcium ion solution may be used by dissolving a calcium source known in the art in a solvent, preferably water. For example, calcium chloride, calcium hydroxide, calcium acetate, calcium nitrate or calcium hydrogen phosphate can be used as the calcium source.

상기 칼슘 이온 용액은 칼슘 이온의 농도가 10 mM 내지 1000 mM인 것이 바람직하다. 만약 칼슘 이온의 농도가 상기 범위 미만이면 나노섬유 표면에 칼슘 석출이 미미하고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 용액 내에서 인산 이온과 결정을 형성하여 침전물이 형성되어 나노 섬유 표면에 결정이 형성되지 못하는 문제점이 있다. The calcium ion solution preferably has a concentration of calcium ions of 10 mM to 1000 mM. If the concentration of calcium ions is less than the above range, the calcium precipitates on the surface of the nanofibers are insignificant. On the contrary, if the concentration of the calcium ions exceeds the above range, precipitates are formed by forming crystals with phosphate ions in the solution. There is a problem.

상기 인산 이온 용액은 당업계에 공지된 인산원을 용매, 바람직하게는 물에 용해한 것을 사용할 수 있다. 일예로, 인산원으로 인산수소나트륨, 인산, 인산이수소나트륨, 인산일암모늄 또는 인산이암모늄을 사용할 수 있다.The phosphate ion solution may be one obtained by dissolving a phosphoric acid source known in the art in a solvent, preferably water. For example, sodium hydrogen phosphate, phosphoric acid, sodium dihydrogen phosphate, monoammonium phosphate or diammonium phosphate may be used as the phosphoric acid source.

상기 인산 이온 용액은 인산 이온의 농도가 10 mM 내지 1000 mM인 것이 바람직하다. 만약 인산 이온의 농도가 상기 범위 미만이면 나노 섬유 표면에 인 석출이 미미하고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 용액 내에서 칼슘 이온과 결정을 형성하여 침전물이 형성되어 나노 섬유 표면에 결정이 형성되지 못하는 문제점이 있다. The phosphate ion solution preferably has a concentration of phosphate ions of 10 mM to 1000 mM. If the concentration of phosphate ions is less than the above range, phosphorus precipitation is insignificant on the surface of the nanofibers. On the contrary, if the concentration of the phosphate ions exceeds the above ranges, calcium ions and crystals are formed in the solution to form precipitates that do not form crystals on the surface of the nanofibers. There is a problem.

다음으로, 이전 단계에서 제조된 나노섬유 매트릭스에 상기에서 제조된 하이브리드 물질용 혼합 용액을 접촉시킨다.Next, the mixed solution for the hybrid material prepared above is contacted with the nanofiber matrix prepared in the previous step.

이러한 접촉은 공지된 여러 방법이 가능하며, 바람직하기로 코팅법으로 수행한다. 상기 코팅은 본 발명에서 특별히 제한되지 않으며, 유동코팅법(flow coating), 스핀코팅법(spin coating), 딥코팅법(dip coating), 바코팅법(bar coating) 등 다양한 방법에 의해 형성될 수 있으며, 바람직하기로 딥코팅법을 사용한다. This contact is possible in a number of known ways, preferably by coating. The coating is not particularly limited in the present invention, and may be formed by various methods such as a flow coating method, a spin coating method, a dip coating method, a bar coating method, and the like. The dip coating method is preferably used.

이러한 단계를 거쳐 제조된 본 발명에 따른 나노섬유의 표면에 세포 부착성 단백질이 부착됨과 동시에 칼슘 및 인산이 접촉된다.The cell adhesion protein is attached to the surface of the nanofiber according to the present invention prepared through these steps, and calcium and phosphoric acid are contacted at the same time.

다음으로, 상기 접촉된 인산 용액과 칼슘 용액으로부터 인산칼슘계 결정을 결정 상태로 성장시켜 생체활성유리 나노섬유의 표면에 균일하게 코팅되도록 한다. 이때 상기 인산칼슘계 결정의 성장은 체내의 온도 및 pH와 유사한 조건, 즉 36.5 내지 37.5 ℃에서 3 내지 72시간 동안 생체모방적 제조공정에 의해 실시되는 것이 바람직하다. Next, calcium phosphate-based crystals are grown in a crystalline state from the contacted phosphate solution and calcium solution so as to be uniformly coated on the surface of the bioactive glass nanofibers. At this time, the growth of the calcium phosphate-based crystals is preferably carried out by a biomimetic manufacturing process for 3 to 72 hours at conditions similar to the temperature and pH of the body, that is, 36.5 to 37.5 ℃.

이와 같이 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는 친수성 리간드인 세포 부착성 단백질 뿐만 아니라 세포 친화도가 높은 인산칼슘계 결정으로 코팅되어, 우수한 물리화학적 및 생물학적 특성을 갖도록 그 표면이 개질된다. 그 결과 나노 섬유의 표면에 초기 세포의 부착을 증가시킬 수 있어 세포의 증식과 분화를 활성화할 수 있고, 바이오 소재 분야에 적용되어 골 조직뿐만 아니라 치아 조직의 재생에 사용된다. The protein-bound bioactive glass nanofibers prepared as described above are coated with calcium phosphate-based crystals having high cell affinity as well as cell adhesion protein, which is a hydrophilic ligand, and the surface is modified to have excellent physicochemical and biological properties. As a result, it is possible to increase the adhesion of early cells to the surface of the nanofibers, thereby activating the proliferation and differentiation of cells, and applied to the biomaterials field is used for the regeneration of not only bone tissue but also dental tissue.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.

실시예 1Example 1

(1) 생체활성유리 나노섬유 매트릭스의 제조(1) Preparation of Bioactive Glass Nanofiber Matrix

유리 전구체로 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 질산칼슘, 그리고 트리에틸 포스페이트를 각각 0.7:0.25:0.05의 몰비율이 되도록 각각 100g을 혼합하여 전구체 용액을 제조하였다. 상기 전구체 용액을 HCl (1N) 1g을 포함하는 물-에탄올 혼합물 (몰비 = 1:1) 1000ml와 혼합한 다음, 25℃에서 하룻 동안 교반후, 다시 50℃에서 이틀 동안 숙성시켜 겔을 제조하였다.A precursor solution was prepared by mixing 100 g of tetraethyl orthosilicate (TEOS), calcium nitrate, and triethyl phosphate as a glass precursor to a molar ratio of 0.7: 0.25: 0.05, respectively. The precursor solution was mixed with 1000 ml of a water-ethanol mixture (molar ratio = 1: 1) containing 1 g of HCl (1N), stirred at 25 ° C. for one day, and then aged at 50 ° C. for two days to prepare a gel.

상기 제조된 겔을 10 % 폴리비닐-부티랄(PVB)과 1:2의 중량비로 혼합한 다음, 10ml을 취해 주사기에 넣고, 1 kV/㎝의 DC 전기장 강도 및 0.5 ㎖/h의 주입 속도 하에서 금속컬렉터에 주입한 다음, 전기 방사시켜 나노섬유 매트릭스를 제조하였다. 이어 700℃에서 5시간 동안 공기 중에서 열처리하여 생체활성유리 나노섬 유(BGNF)를 제조하였다.The prepared gel was mixed with 10% polyvinyl-butyral (PVB) in a weight ratio of 1: 2, and then, 10 ml was taken and placed in a syringe, under a DC electric field strength of 1 kV / cm and an injection rate of 0.5 ml / h. The nanofiber matrix was prepared by injection into a metal collector and then electrospinning. Subsequently, heat-treated in air at 700 ° C. for 5 hours to prepare bioactive glass nanofibers (BGNF).

(2) 하이브리드 물질용 혼합 용액 제조(2) Preparation of Mixed Solution for Hybrid Materials

칼슘 및 인산 이온의 농도가 각각 2.5 mM과 1 mM인 용액을 제조하고(50 mM Tris/HCl 완충 용액, pH=7.4), 피브로넥틴(인간 혈장으로부터 분리, 시그마사) 50 g/ml을 혼합하여 혼합 용액을 제조하였다.Prepare solutions with concentrations of 2.5 mM and 1 mM of calcium and phosphate ions, respectively (50 mM Tris / HCl buffer solution, pH = 7.4), and mix and mix 50 g / ml fibronectin (isolated from human plasma, Sigma) The solution was prepared.

(3) 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조(3) Preparation of protein-bound bioactive glass nanofibers

상기 (2)에서 제조된 혼합 용액 10 ml을 37℃로 조절하고, 여기에 생체활성유리 나노섬유 매트릭스(5 g)를 3일 동안 침지하여 하이드록시아파타이트 결정을 성장시켰다. 이어서, 상기 매트릭스를 꺼낸 후 세척하고, 진공 하에 건조하여 피브로넥틴-하이드록시아파타이트 하이브리드된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 제조하였다.10 ml of the mixed solution prepared in (2) was adjusted to 37 ° C., and hydroxyapatite crystals were grown by immersing the bioactive glass nanofiber matrix (5 g) for 3 days. Subsequently, the matrix was taken out, washed, and dried under vacuum to prepare fibronectin-hydroxyapatite hybridized protein-bound bioactive glass nanofibers.

비교예 1Comparative Example 1

피브로넥틴을 사용하지 않은 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 하이드록시아파타이트 결정으로 개질된 생체활성유리 나노섬유를 제조하였다.Except that fibronectin was not used, the same procedure as in Example 1 was performed to prepare bioactive glass nanofibers modified with hydroxyapatite crystals.

실험예 1: 모폴로지 특성 분석Experimental Example 1: Analysis of Morphology

상기 실시예 1에서 제조된 나노섬유 매트릭스를 이용하여 배양 시간에 따른 미세 구조 변화를 알아보기 위해 하기 분석을 수행하고, 얻어진 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.Using the nanofiber matrix prepared in Example 1, the following analysis was carried out to determine the microstructure change with the incubation time, and the obtained results are shown in FIGS. 1 to 5.

주사전자현미경 분석Scanning Electron Microscope Analysis

도 1은 실시예 1에서 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조시 시간에 따른 미네랄화도를 보여주는 주사전자현미경(SEM) 사진이다.1 is a scanning electron microscope (SEM) photograph showing the degree of mineralization with time during the preparation of protein-bound bioactive glass nanofibers in Example 1. FIG.

도 1을 참조하면, 생체활성유리 나노섬유 매트릭스는 직경이 약 320nm의 나노섬유로 제조되며, 시간이 지남에 따라 미네랄화 정도가 증가함을 알 수 있다. 구체적으로, 3시간 이후(도 1의 b) 결정이 성장되어 작은 결정 입자가 나노섬유 표면에 형성되기 시작하면서, 약 18시간 이후 (도 1의 c) 입자 크기가 상당히 진행되고, 3일 후(도 1의 d) 나노섬유의 표면을 완전히 덮고 있음을 알 수 있다. Referring to FIG. 1, the bioactive glass nanofiber matrix is made of nanofibers having a diameter of about 320 nm, and it can be seen that the degree of mineralization increases with time. Specifically, after 3 hours (b in FIG. 1), the crystals grow and small crystal grains start to form on the surface of the nanofiber, and after about 18 hours (c in FIG. 1), the particle size significantly progresses, and after 3 days ( It can be seen that d) completely covers the surface of the nanofiber of FIG. 1.

투과전자현미경(TEM) 분석Transmission Electron Microscopy (TEM) Analysis

도 2는 실시예 1에서 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조시 시간에 따른 미네랄화를 보여주는 투과전자현미경(TEM) 사진이다.Figure 2 is a transmission electron microscope (TEM) picture showing the mineralization over time when the protein-bound bioactive glass nanofibers prepared in Example 1.

도 2를 참조하면, 3시간 배양 이후(도 2의 a) 생체활성유리 나노섬유 매트릭스의 표면에 구형의 미네랄이 형성되고, 18시간 배양 이후 (도 2의 b) 상기 미네랄화된 생성물이 바늘형(needle-like)으로 형성되며, 3일 후(도 2의 c) 생체활성유리 나노섬유 표면 전체를 뒤덮음을 알 수 있다.Referring to FIG. 2, after 3 hours of incubation (a of FIG. 2), a spherical mineral is formed on the surface of the bioactive glass nanofiber matrix, and after 18 hours of incubation (b of FIG. 2), the mineralized product is needle-shaped. It is formed as a needle-like, it can be seen that after 3 days (c in Figure 2) covering the entire surface of the bioactive glass nanofibers.

제한시야 전자회절(SAED:selected area electron diffraction)패턴 분석Selected Area Electron Diffraction (SAED) Pattern Analysis

도 3은 실시예 1에서 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조시 매트릭스 상에 3일 동안 결정 성장 시킨 후 상기 결정의 제한시야 전자회절 패턴을 보여준다.Figure 3 shows the limited-field electron diffraction pattern of the crystal after three days of crystal growth on the matrix when manufacturing protein-bound bioactive glass nanofibers in Example 1.

도 3을 참조하면, 상기 결정은 하이드록시아파타이트로,(211) 및 (002)에서 결정 격자가 나타나 무정형이 아닌 결정형임을 알 수 있다.Referring to FIG. 3, the crystal is a hydroxyapatite, and crystal lattice appears at 211 and 002, indicating that the crystal is not amorphous.

고성능 투과전자현미경 분석High performance transmission electron microscope analysis

도 4는 실시예 1에서 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 매트릭스에 형성된 하이드록시아파타이트 결정의 (002)면에 대한 0.344nm의 스페이싱(spacing)의 격자평면 이미지를 보여준다. 4 shows a lattice plane image of spacing of 0.344 nm with respect to the (002) plane of the hydroxyapatite crystal formed on the protein-bound bioactive glass nanofiber matrix prepared in Example 1. FIG.

이러한 격자 스페이싱은 0.82 nm 및 0.388nm에서 관찰되었고, 이는 하이드록시아파타이트 결정의 격자면과 일치한다. 이는 무정형의 칼슘 포스페이트가 나노섬유 매트릭스의 미네랄화가 진행됨에 따라 하이드록시아파타이트로 전환되고, 이러한 전환은 피브로넥틴이 존재하더라도 미네랄화도가 증가함을 의미한다.This lattice spacing was observed at 0.82 nm and 0.388 nm, which coincides with the lattice plane of hydroxyapatite crystals. This means that the amorphous calcium phosphate is converted to hydroxyapatite as the mineralization of the nanofiber matrix proceeds, which means that the degree of mineralization is increased even in the presence of fibronectin.

면역 분석Immune analysis

생체활성유리 나노섬유 매트릭스 표면에 피브로넥틴과 하이드록시아파타이트로 개질됨을 확인하기 위해, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하되 금으로 면역표지된 피브로넥틴을 사용하여 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 제조하였다.To confirm the modification of the bioactive glass nanofiber matrix surface with fibronectin and hydroxyapatite, protein-binding bioactive glass nanofibers were prepared in the same manner as in Example 1, but using fibronectin immunolabeled with gold.

도 5는 금으로 면역표지된 피브로넥틴을 사용하여 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 매트릭스에 존재하는 피브로넥틴-하이드록시아파타이트를 보여주는 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing fibronectin-hydroxyapatite present in a protein-bound bioactive glass nanofiber matrix prepared using fibronectin immunolabeled with gold.

도 5를 참조하면, 미네랄화된 영역 내 구형의 금(Au) 입자(∼10 nm, 화살표)가 분포되어 있고, 이는 생체활성유리 표면에 피브로넥틴과 하이드록시아파타이트가 하이브리드화되어 존재함을 의미한다.Referring to FIG. 5, spherical Au particles (˜10 nm, arrows) are distributed in the mineralized region, which means that fibronectin and hydroxyapatite are hybridized on the surface of the bioactive glass. .

FT-IR 분석FT-IR analysis

도 6은 실시예 1 및 비교예 1에서 36시간 결정 성장 후 제조된 생체활성유리 나노섬유의 FI-IR 스펙트럼이다. 이때 □는 유리와 관련된 피크이고, ??: 포스페이트기, ●: 하이드록시기, 및 ■: 카보네이트 관련기이며, 점선은 아마이드기와 관련된 피크를 나타낸다.FIG. 6 is a FI-IR spectrum of bioactive glass nanofibers prepared after 36 hours of crystal growth in Example 1 and Comparative Example 1. FIG. Where? Is the peak associated with the glass, ??: the phosphate group, ●: the hydroxyl group, and ■: the carbonate related group, and the dotted line represents the peak associated with the amide group.

도 6을 참조하면, 실시예 1 및 비교예 1의 나노섬유 매트릭스는 하이드록시아파타이트 관련 밴드인 P=O 및 O-H 피크가 관찰됨을 알 수 있다. 그러나 실시예 1에서 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 경우 비교예 1에서 보이지 않는 아마이드 밴드가 관찰됨을 알 수 있다. 이러한 결과는 뼈 미네랄 성분인 하이드록시아파타이트와 세포 부착성 단백질인 피브로넥틴이 하이브리드화되고 생체활성유리 나노섬유를 성공적으로 개질함을 의미한다.Referring to FIG. 6, the nanofiber matrices of Example 1 and Comparative Example 1 show that P = O and O—H peaks, which are hydroxyapatite related bands, are observed. However, in the case of the protein-bound bioactive glass nanofibers prepared in Example 1, it can be seen that an amide band not seen in Comparative Example 1 was observed. These results indicate that hydroxyapatite, a bone mineral component, and fibronectin, a cell adhesion protein, hybridize and successfully modify bioactive glass nanofibers.

실험예 2: 결정 성장 시간에 따른 농도 변화Experimental Example 2 Concentration Change According to Crystal Growth Time

배지 내 이온농도에 따른 미네랄화도를 측정하여 도 7에 나타내었다,The mineralization degree according to the concentration of ions in the medium is measured and shown in FIG.

도 7은 실시예 1 및 비교예 1의 생체활성유리 나노섬유 제조시 시간에 따른 배지 내 Ca, P 및 Si 농도 변화를 보여주는 그래프이다.FIG. 7 is a graph showing changes in Ca, P and Si concentrations in a medium with time when bioactive glass nanofibers of Example 1 and Comparative Example 1 were prepared.

도 7을 참조하면, 실시예 1 및 비교예 1의 경우 Ca, P 및 Si 농도 변화 모두 유사한 경향을 나타냈다. 이러한 이온 농도 변화는 생체활성유리 나노섬유와 칼슘, 인 및 세포 부착 단백질을 포함하는 혼합 용액과의 계면에서의 공정과 관계한다. Referring to FIG. 7, in the case of Example 1 and Comparative Example 1, all of Ca, P, and Si concentrations showed similar trends. This ion concentration change relates to the process at the interface of the bioactive glass nanofibers with a mixed solution containing calcium, phosphorus and cell adhesion proteins.

Ca 농도는 혼합 용액 내에 Ca 이온의 용해가 일어나 초기에 Ca 농도가 증가 하고, 이후 결정화 공정의 진행에 의해 미네랄화가 진행되어 Ca 농도가 점진적으로 감소함을 나타냈다. 또한 P 농도의 경우 초기부터 24시간 까지 급격히 감소하다가 Ca 농도와 비슷한 방식으로 일정 농도를 유지하였다. 또한 Si 농도의 경우 시간에 따라 증가하는 경향을 보였으며(24시간까지), 그 이상에서는 일정 농도를 유지하였다.The Ca concentration showed that Ca ions were dissolved in the mixed solution to initially increase the Ca concentration, and then mineralization proceeded by the crystallization process, thereby gradually decreasing the Ca concentration. In addition, the P concentration rapidly decreased from the beginning to 24 hours, and then maintained a constant concentration in a manner similar to the Ca concentration. In addition, the concentration of Si showed a tendency to increase with time (up to 24 hours), and the concentration was maintained above.

실험예 3: 세포 배양(in vitro) 및 증식 실험Experimental Example 3: Cell Culture (In vitro) and Proliferation Experiment

세포 배양Cell culture

상기 실시예 1 및 비교예 1의 생체활성유리 나노섬유의 생체활성도를 알아보기 위해, 골형성 세포인 MG63 세포를 듀벨코 배지(DMEM)에 3X104 cells/cm2의 밀도로 접종한 후 37℃, 5 % CO2 분위기 하에 배양하여 세포의 형상을 관찰하였다. In order to determine the bioactivity of the bioactive glass nanofibers of Example 1 and Comparative Example 1, MG63 cells, which are bone forming cells, were inoculated at a density of 3 × 10 4 cells / cm 2 in DUBELCO medium (DMEM) and then at 37 ° C. , And cultured in a 5% CO 2 atmosphere to observe the shape of the cells.

도 8의 (a)는 실시예 1에서 제조된 피브로넥틴-하이드록시아파타이트가 하이브리드된 생체활성유리 나노섬유를 이용하여 골형성 세포인 MG63을 2시간 동안 배양한 후 그 표면을 보여주는 주사전자현미경 사진이고, (b)는 이의 확대사진이다.Figure 8 (a) is a scanning electron micrograph showing the surface after culturing for 2 hours MG63 bone cells using the bioactive glass nanofibers hybridized fibronectin-hydroxyapatite prepared in Example 1 , (b) is an enlarged picture of it.

또한 도 9는 비교예 1에서 제조된 하이드록시아파타이트가 존재하는 생체활성유리 나노섬유를 이용하여 골형성 세포인 MG63을 2시간 동안 배양한 후 그 표면을 보여주는 주사전자현미경 사진이다.In addition, Figure 9 is a scanning electron micrograph showing the surface after culturing for 2 hours MG63, a bone-forming cell using a bioactive glass nanofibers having a hydroxyapatite prepared in Comparative Example 1.

도 8 및 9를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 사용하여 세포를 배양한 경우, 상기 나노섬유스에 세포가 잘 부착되어 있으며, 세포 퍼짐 정도도 매우 우수함을 알 수 있다. 이러한 결과는 비교예 1과 같이 하이드록시아파타이트 단독으로 개질하는 것보다 초기 세포 부착 속도가 빠른 피브로넥틴과 함께 하이브리드화하여 개질하는 것이 조직 재생에 유리함을 의미한다.8 and 9, when the cells were cultured using the protein-bound bioactive glass nanofibers prepared according to the present invention, the cells are well attached to the nanofibers, and the degree of cell spreading is also excellent. Able to know. These results indicate that hybridization and modification with fibronectin, which has a faster initial cell attachment rate than modification with hydroxyapatite alone as in Comparative Example 1, is advantageous for tissue regeneration.

세포 증식Cell proliferation

세포의 부착 및 증식율은 미토콘드리아 활성도를 이용하는 시험법인 MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 법을 이용하였다. Adhesion and proliferation rate of the cells were evaluated using Thiozolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) method, which is a test method using mitochondrial activity.

이때 증식 실험은 MTS 분석킷트와 CCK-9 세포수 측정 키트를 이용하여 골형성 세포인 MG63 세포를 2시간 배양한 후 측정하였다. 실시예 1에서 제조된 나노 섬유막에 MG63 세포 배양액을 20,000 cells/mL 농도로 적가하고, 37 에서 2시간 및 5시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 나노 섬유막 표면에 부착된 세포를 MTS 용액과 배지를 혼합한 용액을 첨가하고 37 에서 3시간 동안 반응시킨 후 마이크로 플레이트 판독기를 이용하여 490 nm에서 OD 값을 측정하였다. The proliferation experiment was measured after culturing the MG63 cells, bone formation cells for 2 hours using the MTS assay kit and CCK-9 cell count measurement kit. The MG63 cell culture solution was added dropwise at a concentration of 20,000 cells / mL to the nanofiber membrane prepared in Example 1, and cultured at 37 and 2 hours and 5 hours. After removing the medium, the cells attached to the surface of the nanofibrous membrane were added with a mixture of the MTS solution and the medium, and reacted for 3 hours at 37. Then, the OD value was measured at 490 nm using a microplate reader.

도 10은 생체활성유리 나노섬유 매트릭스 단독, 피브로넥틴 흡착 나노섬유, 및 비교예 1, 실시예 1에서 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 이용하여 세포 증식 후 MTT 분석결과를 나타낸 그래프이다.(＊p<0.05, ＊＊p<0.01, n=4 ) Figure 10 is a graph showing the results of MTT analysis after cell proliferation using the bioactive glass nanofiber matrix alone, fibronectin adsorption nanofibers, and the protein-bound bioactive glass nanofibers prepared in Comparative Example 1, Example 1. ＊ p <0.05, ＊＊ p <0.01, n = 4)

도 10을 참조하면, 본 발명에 따른 나노섬유 매트릭스를 사용하여 세포를 증식하는 경우 다른 나노섬유들과 비교하여 세포 증식 정도가 현저히 차이남을 알 수 있다.Referring to FIG. 10, it can be seen that the cell proliferation is significantly different from that of other nanofibers when the cells are grown using the nanofiber matrix according to the present invention.

본 발명에 따른 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는 골 조직뿐만 아니라 치아 조직의 재생을 위한 바이오 소재로 사용된다.Protein-bound bioactive glass nanofibers according to the present invention are used as biomaterials for regeneration of dental tissues as well as bone tissues.

도 1은 실시예 1에서 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조시 시간에 따른 미네랄화도를 보여주는 주사전자현미경(SEM) 사진이다.1 is a scanning electron microscope (SEM) photograph showing the degree of mineralization with time during the preparation of protein-bound bioactive glass nanofibers in Example 1. FIG.

도 2는 실시예 1에서 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조시 시간에 따른 미네랄화를 보여주는 투과전자현미경(TEM) 사진이다.Figure 2 is a transmission electron microscope (TEM) picture showing the mineralization over time when the protein-bound bioactive glass nanofibers prepared in Example 1.

도 3은 실시예 1에서 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 제조시 매트릭스 상에 3일 동안 결정 성장 시킨 후 상기 결정의 제한시야 전자회절 패턴을 보여준다.Figure 3 shows the limited-field electron diffraction pattern of the crystal after three days of crystal growth on the matrix when manufacturing protein-bound bioactive glass nanofibers in Example 1.

도 4는 실시예 1에서 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 매트릭스에 형성된 하이드록시아파타이트 결정의 (002)면에 대한 0.344nm의 스페이싱(spacing)의 격자평면 이미지를 보여준다. 4 shows a lattice plane image of spacing of 0.344 nm with respect to the (002) plane of the hydroxyapatite crystal formed on the protein-bound bioactive glass nanofiber matrix prepared in Example 1. FIG.

도 5는 금으로 면역표지된 피브로넥틴을 사용하여 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유 매트릭스에 존재하는 피브로넥틴-하이드록시아파타이트를 보여주는 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing fibronectin-hydroxyapatite present in a protein-bound bioactive glass nanofiber matrix prepared using fibronectin immunolabeled with gold.

도 6은 실시예 1 및 비교예 1에서 36시간 결정 성장 후 제조된 생체활성유리 나노섬유의 FI-IR 스펙트럼이다.FIG. 6 is a FI-IR spectrum of bioactive glass nanofibers prepared after 36 hours of crystal growth in Example 1 and Comparative Example 1. FIG.

도 7은 실시예 1 및 비교예 1의 생체활성유리 나노섬유 제조시 시간에 따른 배지 내 Ca, P 및 Si 농도 변화를 보여주는 그래프이다.FIG. 7 is a graph showing changes in Ca, P and Si concentrations in a medium with time when bioactive glass nanofibers of Example 1 and Comparative Example 1 were prepared.

도 8의 (a)는 실시예 1에서 제조된 피브로넥틴-하이드록시아파타이트가 하이브리드된 생체활성유리 나노섬유를 이용하여 골형성 세포인 MG63을 2시간 동안 배 양한 후 그 표면을 보여주는 주사전자현미경 사진이고, (b)는 이의 확대사진이다.FIG. 8 (a) is a scanning electron micrograph showing the surface of MG63 cells cultured for 2 hours using bioactive glass nanofibers hybridized with fibronectin-hydroxyapatite prepared in Example 1 for 2 hours. , (b) is an enlarged picture of it.

도 9는 비교예 1에서 제조된 하이드록시아파타이트가 존재하는 생체활성유리 나노섬유를 이용하여 골형성 세포인 MG63을 2시간 동안 배양한 후 그 표면을 보여주는 주사전자현미경 사진이다.FIG. 9 is a scanning electron micrograph showing the surface of MG63, which is a osteoblastic cell, using the hydroxyapatite prepared in Comparative Example 1 and culturing the MG63 cells for 2 hours.

도 10은 생체활성유리 나노섬유 매트릭스 단독, 피브로넥틴 흡착 나노섬유, 및 비교예 1, 실시예 1에서 제조된 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 이용하여 세포 증식 후 MTT 분석결과를 나타낸 그래프이다. Figure 10 is a graph showing the results of MTT analysis after cell proliferation using the bioactive glass nanofiber matrix alone, fibronectin adsorption nanofibers, and the protein-bound bioactive glass nanofibers prepared in Comparative Example 1, Example 1.

Claims (14)

생체활성유리 나노섬유 매트릭스; 및Bioactive glass nanofiber matrix; And 상기 매트릭스 상에 코팅되며, 세포 부착성 단백질-인산칼슘계 결정으로 이루어진 하이브리드 물질Hybrid material coated on the matrix and consisting of cell-adhesive protein-calcium phosphate crystals 을 포함하는 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.Protein-bound bioactive glass nanofibers comprising a. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 생체활성유리 나노섬유 매트릭스는 SiO2-CaO 또는 SiO2-CaO-P2O5의 기본적 유리구조로 이루어진 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The bioactive glass nanofiber matrix is a protein-binding bioactive glass nanofibers consisting of a basic glass structure of SiO 2 -CaO or SiO 2 -CaO-P 2 O 5 . 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 생체활성유리 나노섬유 매트릭스는 직경이 10 내지 900 nm인 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The bioactive glass nanofiber matrix is a protein-bound bioactive glass nanofibers having a diameter of 10 to 900 nm. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 세포 부착성 단백질은 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 트롬보스폰딘 1, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 골 시알로프로틴, 연골 기저 단백질, 피브리노겐, 피브린, 피불린, 뮤신, 엔탁틴, 오스테오폰틴, 플라스미노겐, 리스트릭틴, 세르글리신, SPARC/오스테오넥틴, 베르시칸, 폰 빌리브란트 인자, 카드헤린, 코넥신, 및 셀렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The cell adhesion protein may be fibronectin, collagen, laminin, thrombospondin 1, vitronectin, elastin, tenasin, agrecan, agrin, bone sialoprotein, cartilage basal protein, fibrinogen, fibrin, fibulin, mucin, Protein which is one selected from the group consisting of entaxin, osteopontin, plasminogen, listritin, serglycine, SPARC / osteonectin, versican, von Willibrand factor, caherin, connexin, and selectin Bonded bioactive glass nanofibers. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 인산칼슘계 결정은 하이드록시아파타이트인 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The calcium phosphate-based crystals are hydroxyapatite protein-bound bioactive glass nanofibers. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 인산칼슘계 결정은 입자 크기가 3 내지 100nm인 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The calcium phosphate-based crystals are protein-bound bioactive glass nanofibers having a particle size of 3 to 100nm. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유는 생체활성유리 나노섬유 매트릭스:하이브리드 물질을 100:1 내지 1:100 의 중량비로 포함하는 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The protein-bound bioactive glass nanofiber is a protein-bound bioactive glass nanofiber comprising a bioactive glass nanofiber matrix: hybrid material in a weight ratio of 100: 1 to 1: 100. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 하이브리드 물질은 세포 부착성 단백질:인산칼슘계 결정을 1:107 내지 1:100 의 중량비로 포함하는 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유.The hybrid material is a protein-bonded bioactive glass nanofibers comprising cell adhesion protein: calcium phosphate crystals in a weight ratio of 1:10 7 to 1: 100. 생체활성유리를 성형하여 나노섬유 매트릭스를 제조하는 단계;Molding a bioactive glass to prepare a nanofiber matrix; 상기 나노섬유 매트릭스를 세포 부착성 단백질, 칼슘 이온 용액, 및 인산 이온 용액이 혼합된 하이브리드 물질용 혼합 용액과 접촉시키는 단계; 및Contacting the nanofiber matrix with a mixed solution for a hybrid material in which cell adherent protein, calcium ion solution, and phosphate ion solution are mixed; And 상기 나노섬유 매트릭스 표면을 세포 부착성 단백질 및 인산칼슘계 결정으로 이루어진 하이브리드 물질로 코팅시키는 단계; Coating the surface of the nanofiber matrix with a hybrid material consisting of cell adhesion protein and calcium phosphate crystals; 를 포함하는 제1항의 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 제조방법.Method for producing a protein-bound bioactive glass nanofiber of claim 1 comprising a. 제9항에 있어서, 10. The method of claim 9, 상기 칼슘 이온 용액은 염화칼슘, 수산화칼슘, 아세트산칼슘, 질산칼슘 또는 인산수소칼슘을 사용하는 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 제조방법.The calcium ion solution is calcium chloride, calcium hydroxide, calcium acetate, calcium nitrate or calcium hydrogen phosphate manufacturing method of the protein-bound bioactive glass nanofibers. 제9항에 있어서, 10. The method of claim 9, 상기 칼슘 이온 용액은 칼슘 이온의 농도가 10 mM 내지 1000 mM인 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 제조방법.The calcium ion solution is a method of producing a protein-bound bioactive glass nanofibers, wherein the concentration of calcium ions is 10 mM to 1000 mM. 제9항에 있어서, 10. The method of claim 9, 상기 인산 이온 용액은 인산수소나트륨, 인산, 인산이수소나트륨, 인산일암모늄 또는 인산이암모늄을 사용하는 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 제조방법.The phosphate ion solution is a method of producing a protein-bound bioactive glass nanofibers using sodium hydrogen phosphate, phosphoric acid, sodium dihydrogen phosphate, monoammonium phosphate or diammonium phosphate. 제9항에 있어서, 10. The method of claim 9, 상기 인산 이온 용액은 인산 이온의 농도가 10 mM 내지 1000 mM인 것인 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유의 제조방법.The phosphate ion solution is a method of producing a protein-bound bioactive glass nanofibers in which the concentration of phosphate ions is 10 mM to 1000 mM. 제1항에 따른 단백질 결합형 생체활성유리 나노섬유를 포함하는 조직재생 재료. A tissue regeneration material comprising the protein-bound bioactive glass nanofibers according to claim 1.
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