KR20100044175A - 효모 세포 세트, 표적 후보 분자 동정 방법, 작용 기작 해석 방법 및 스크리닝 방법 - Google Patents

효모 세포 세트, 표적 후보 분자 동정 방법, 작용 기작 해석 방법 및 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

약물 감수성이 현저하게 향상된 효모 유전자 파괴주 세트를 제공한다. 본 발명의 효모 세포 세트는 2종류 이상의 효모 세포로 이루어진 효모 세포로서, 상기 2종류 이상의 효모 세포 각각은 서로 다른 유전자 중 적어도 1종류를 결손 또는 변이시키고, 또한 상기 2종류 이상의 효모 세포 전부는, 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류를 발현 제어한 약물 고 감수성 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트이다.

Description

효모 세포 세트, 표적 후보 분자 동정 방법, 작용 기작 해석 방법 및 스크리닝 방법{Set of yeast cells, method of identifying target candidate molecule, method of analyzing action mechanism and screening method}
본 발명은 효모 세포 세트 및 표적 후보 분자 동정 방법, 작용 기작 해석 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
피검 물질이 세포에 작용하는 메카니즘 및 그 표적 분자의 동정은 게놈 구조가 명확해진 현재에도 어려운 과제 중 하나이다. 최근 DNA 마이크로 어레이 등의 포스트 게놈 기술이 진전됨에 따라 피검 물질의 작용을 게놈 와이드로 해석하는 시도가 이루어지고 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 그 중에서 많은 인간 상동 유전자를 가지고 유전학적 수법을 사용할 수 있는 출아 효모인 사카로미세스·세레비지에(S.cerevisiae, 이하 「효모」로 칭하기도 한다)는 피검 물질의 작용 메카니즘 해명에 유용한 도구라고 생각되어 왔다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조).
최근 효모의 모든 유전자 약 6000 종류를 1 종류씩 파괴하는 프로젝트가 완료되어(예를 들면, 비특허문헌 3 참조), 이러한 효모를 사용한 시스템이 주목받고 있다. 상기 프로젝트의 결과, 효모 게놈상에 존재하는 약 6000 종류의 유전자 중 약 1200개의 유전자는 생존에 필수인 유전자, 즉 이들 유전자를 하나라도 파괴하면 해당 효모가 죽게 되는 유전자(필수 유전자)라는 것이 명백해졌다. 한편 나머지 약 4800개 유전자는 그 유전자 중 하나를 파괴하여도 해당 효모를 통상의 배지 중에서 증식시킬 수 있어 해당 효모가 죽지 않는 유전자(비 필수 유전자)라는 것이 명백해졌다.
예를 들면 어느 한 피검 물질을 약 4800개 종류의 비필수 유전자를 파괴한 주 각각에 작용시켰을 때 특이적으로 그 피검 물질의 영향을 받는 비필수 유전자 파괴주가 있으면, 그 유전자가 그 피검 물질의 작용과 관련되어 있다는 것을 알 수 있다. 여기에서 비필수 유전자란, 유전자를 파괴(2배체 세포의 경우에는 2개의 대립 유전자 모두를 파괴, 1배체 세포의 경우에는 1개의 유전자를 파괴)해도 세포를 증식시킬 수 있는 유전자를 말한다. 실제로 이 원리를 사용한 피검 물질의 작용 기작 해석법이 차례차례 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 4∼7 참조). 또 여러가지 피검 물질에 대해서 피검 물질의 감수성 주를 프로파일링하여 이들을 비교함으로써 타겟주를 알 수 없는 피검 물질의 작용점이 보이게 될 가능성이 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 7 참조).
상기와 같은 목적으로 사용되는 효모주는 일반적으로 넉아웃 효모(Yeast knockout strain; YKO)로 불리며, YKO 콜렉션으로 시판되어 있다.
효모 세포는 자연계에서 여러가지 저분자 화합물에 노출되면 생존하기 위해 효모 세포에게 독이 되는 저분자 화합물로부터 몸을 지키는 구조를 갖추고 있다. 예를 들면 세포 내에 저분자 화합물이 들어온 경우, 이것을 세포 밖으로 배출하는 펌프(이하, 「트랜스포터」라고 하기도 한다)를 작용시켜 저분자 화합물로부터 몸을 지킨다. 또 효모 세포에서는 세포막의 조성이 포유류 세포와 다르다. 구체적으로는 콜레스테롤 대신에 에르고스테롤이 포함되어 있기 때문에 효모 세포에서의 저분자 화합물의 세포막 투과성은 포유류 세포에 비해 현저하게 저하되어 있다. 이러한 발달된 구조에 의해 효모 세포는 포유류 세포에 비해 일반적으로 약물(저분자 화합물)의 영향을 받기 어려운 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 약물에 따라서는 그 작용 농도의 차이가 100배 정도인 경우도 있다.
이와 같이 효모 세포에서 약물 감수성이 낮은 것은, YKO를 사용한 평가 방법을 많은 약물에 적용할 때에 큰 장벽이 되고 있다.
효모 세포의 약물 감수성을 향상시키는 방법으로서, ABC(ATP Binding Cassette) 트랜스포터인 Pdr5p의 발현을 유도하는 전사 인자 Pdrlp 및 Pdr3p의 발현을 억제하는 방법이 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 8 참조). 또 효모 세포막의 구성 성분인 에르고스테롤을 합성하는 경로의 효소 Erg6p의 발현을 억제함으로써 약물 투과성이 상승하여 효모의 약물 감수성이 높아지는 것으로 알려져 있다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).
특허문헌1:국제공개제2006/046694호팜플렛
비특허문헌 1: Huels et al, 2002, Drug Discovery Today, 7(suppl.): 119-124. 비특허문헌 2: Simon and Bedalov, Nat Rev Cancer, 2004, 4: 481-92. 비특허문헌 3: Giaever et al, Nature 2002 418: 387-91. 비특허문헌 4: Giaever et al, Nat Genet, 1999, 21: 278-83. 비특허문헌 5: Giaever et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 793-798. 비특허문헌 6: Lum et al, Cell, 2004, 116: 121-37. 비특허문헌 7: Parsons et al, Nat Bio Technol, 2004, 22: 62-9. 비특허문헌 8: Delaveau et al, Mol Gen Genet., 1994, 244(5), 501-11.
본 발명의 과제는, 약물 감수성이 현저하게 향상된 효모 유전자 파괴주 세트를 제공하는 것이다. 또 본 발명의 다른 과제는, 약물 감수성이 현저하게 향상된 효모 유전자 파괴주 세트를 사용한 고감도 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법, 작용 기작 해석 방법 및 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 종래의 효모 유전자 파괴주 세트에 포함된 각각의 효모 세포에 대해 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1 종류를 더 발현 제어함으로써 본 발명의 과제를 해결할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명의 구체적 수단은 이하와 같다.
본 발명의 제1 태양은, 2종류 이상의 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트로서, 상기 2종류 이상의 효모 세포 각각이 서로 다른 유전자 중 적어도 하나의 유전자를 결손 또는 변이시키고, 또한 상기 2종류 이상의 효모 세포 전부가 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류를 발현 제어한 약물 고감수성 효모 세포인 효모 세포 세트이다.
상기 약물 감수성 관련 유전자는 트랜스포터 관련 유전자 및 에르고스테롤 합성 관련 유전자에서 선택되는 적어도 1종류인 것이 바람직하다
또 상기 트랜스포터 관련 유전자가 PDR1 및 PDR3인 것이 바람직하고, 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자가 ERG6 또는 ERG3인 것도 또한 바람직하다.
또 상기 트랜스포터 관련 유전자는, 상기 트랜스포터 관련 유전자의 결손에 의해 발현 제어되고, 또한 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자는 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자의 전사 조절에 의해 발현 제어되는 것이 바람직하다.
나아가 상기 효모 세포는 2배체여도 좋다.
본 발명의 제2 태양은, 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 적어도 1종류의 효모 세포와 상기 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정을 포함한 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법이다.
본 발명의 제3 태양은, 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 적어도 1종류의 효모 세포와 상기 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 대립 유전자의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제2 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정을 포함한 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법이다.
본 발명의 제4 태양은, 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 적어도 1종류의 효모 세포와 상기 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제2 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정을 포함한 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법이다.
본 발명의 제5 태양은, 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석하는 방법으로서, 상기 표적 후보 분자 동정 방법에 의해 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 공정과, 상기 표적 후보 분자의 기능을 동정하는 공정과, 상기 표적 후보 분자의 기능에 기초하여 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석하는 공정을 포함한 피검 물질의 작용 기작 해석 방법이다.
본 발명의 제6 태양은, 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 상기 목적으로 하는 분자를 전사 산물 또는 번역 산물로 하는 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정을 포함한 스크리닝 방법이다.
본 발명의 제7 태양은, 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 대립 유전자의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제2 유전자와 상기 목적으로 하는 분자를 전사 산물 또는 번역 산물로 하는 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정을 포함한 스크리닝 방법이다.
본 발명의 제8 태양은, 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제2 유전자와 상기 목적으로 하는 분자를 전사 산물 또는 번역 산물로 하는 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정을 포함한 스크리닝 방법이다.
또 본 발명의 제2∼제8 태양에서의 상기 표현형의 변화는 치사 또는 증식 억제인 것이 바람직하다.
나아가, 상기 효모 세포를 선택하는 공정이, (1)상기 피검 물질 비 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 콘트롤 곡선의 함수 F(t)와, 상기 피검 물질 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 테스트 곡선의 함수 G(t)를 입수하는 공정과, (2)식(F(t)-G(t))의 적분값을 산출하여 영역값을 얻는 공정과, (3)상기 영역값을 토대로 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정을 포함한 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 약물 감수성이 현저하게 향상된 효모 유전자 파괴주 세트를 제공할 수 있다. 또 본 발명에 의하면, 약물 감수성이 현저하게 향상된 효모 유전자 파괴주 세트를 사용한 고감도 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법, 작용 기작 해석 방법 및 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 MATa형 배리어 프리 YDS의 제작 순서를 도시한 개략도이다.
도 2는 MATα형 배리어 프리 YDS의 제작 순서를 도시한 개략도이다.
도 3은 MATa형 슈퍼 배리어 프리 YDS의 제작 순서를 도시한 개략도이다.
도 4는 약물 감수성 관련 유전자 파괴주의 로바스타틴에 대한 감수성을 도시한 그래프이다.
도 5는 약물 감수성 관련 유전자 파괴주의 라파마이신에 대한 감수성을 도시한 그래프이다.
본 발명의 효모 세포 세트는 2종류 이상의 효모 세포로 이루어지고, 상기 2종류 이상의 효모 세포 각각이 서로 다른 유전자 중 적어도 1종류를 결손 또는 변이시키고, 또한 상기 2종류 이상의 효모 세포의 전부가 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류를 발현 제어한 약물 고 감수성 효모 세포임을 특징으로 한다.
상기 구성의 효모 세포 세트는, 약물 감수성이 현저하게 향상된 효모 유전자 파괴주 세트이다.
본 발명의 효모 세포 세트는 2종류 이상의 효모 세포로 이루어지는데, 후술하는 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법에서, 보다 효율적으로 보다 고정밀도로 표적 후보 분자를 동정 가능하다는 점에서 1000종류 이상의 효모 세포로 이루어진 것이 바람직하고, 2000종류 이상의 효모 세포로 이루어진 것이 보다 바람직하고, 3000종류 이상의 효모 세포로 이루어진 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서의 2종류 이상의 효모 세포에서는, 각각의 효모 세포가 서로 다른 유전자 중 적어도 1종류를 결손 또는 변이시키고 있다. 이와 같은 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트를 사용함으로써 후술하는 것처럼 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정할 수 있다.
본 발명에서의 효모 세포는 1배체여도 좋고 2배체여도 좋은데, 2배체인 경우 필수 유전자에서는 대립 유전자의 한 쪽을 결손 또는 변이시키는 것이 바람직하다. 이 경우에는 필수 유전자에 대해서도 전사 산물 또는 번역 산물을 표적 후보 분자로 동정할 수 있다. 또 비 필수 유전자에서는 대립 유전자의 양쪽을 결손 또는 변이시키는 것도 바람직하다.
본 발명에서의, 2종류 이상의 효모 세포로 이루어지고 상기 2종류 이상의 효모 세포 각각의 효모 세포가 서로 다른 유전자 중 적어도 1종류를 결손 또는 변이시키는 효모 세포 세트는, 예를 들면 Science 2001, 294, 2364-2368에 기재된 방법으로 제작할 수 있다. 또 인비트로젠사제 #95401.H2 및 오픈 바이오 시스템사제 #YSC1066으로서 입수할 수 있다.
본 발명의 효모 세포 세트에 포함된 모든 효모 세포는, 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 발현 제어된 높은 약물 감수성 효모 세포로 되어 있다.
본 발명의 약물 감수성 관련 유전자란, 효모 세포의 약물 감수성을 직접적 또는 간접적으로 제어 가능한 유전자로서, 발현 억제 또는 발현 과잉에 의해 죽지 않은 한 어떠한 유전자이든 상관없다. 예를 들면, 세포 내로부터의 약물 배출에 관여하는 유전자, 세포막의 약물 투과성에 관여하는 유전자, 스트레스 응답에 관여하는 유전자 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 트랜스포터 관련 유전자, 에르고스테롤 합성 관련 유전자, 스트레스 응답 관련 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 약물 감수성 관련 유전자로서는, 약물 감수성의 보다 효과적인 향상이라는 점에서 트랜스포터 관련 유전자 및 에르고스테롤 합성 관련 유전자에서 선택되는 적어도 1종류인 것이 바람직하고, 트랜스포터 관련 유전자 및 에르고스테롤 합성 관련 유전자 모두인 것이 더욱 바람직하다.
또 본 발명에서의 약물 감수성 관련 유전자로서는 동종의 유전자를 2종류 이상 사용할 수도 있다.
본 발명에서의 트랜스포터란, 세포막에 존재하는 막 단백질로서 수송 기질의 세포막 통과에 관여하는 단백질을 말한다. 트랜스포터에는 ATP의 가수분해 에너지를 이용하여 수송하는 ABC 트랜스포터와, ATP의 가수분해 에너지를 이용하지 않고 수송하는 SLC 트랜스포터가 있는데, 본 발명에서는 ABC 트랜스포터인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 트랜스포터 관련 유전자로서는, 예를 들면 트랜스포터를 구성하는 단백질을 코딩하는 유전자, 트랜스포터 유전자의 전사 인자를 코딩하는 유전자, 트랜스포터의 활성을 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자, 트랜스포터의 세포막 표면으로의 발현을 제어하는 유전자 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 트랜스포터 관련 유전자가 ABC 트랜스포터의 1종인 pdr5p를 코딩하는 PDR5 유전자에 관련된 유전자인 것이 바람직하다. PDR5 관련 유전자 중에서도 PDR1 및 PDR3인 것이 보다 바람직하다.
여기에서 PDR1 및 PDR3은 PDR5 유전자의 마스터 전사 인자인 pdrlp와 prd3p를 각각 코딩하는 유전자를 의미한다.
효모 세포에서의 pdrlp 및 prd3p로서는, 예를 들면 효모가 사카로미세스·세레비지에인 경우, GenBank Accession No.CAA96713 및 GenBank Accession No.CAA84822로서 주지의 아미노산 서열을 가진 것을 들 수 있다.
또 에르고스테롤 합성 관련 유전자로서는, 예를 들면 에르고스테롤 합성 효소 단백질을 코딩하는 유전자, 에르고스테롤 합성 효소의 전사 인자를 코딩하는 유전자, 에르고스테롤 합성 효소의 활성을 제어하는 유전자 등을 들 수 있다
본 발명에서는, 에르고스테롤 합성 관련 유전자가 에르고스테롤 합성 효소 단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하다. 에르고스테롤 합성 효소 단백질을 코딩하는 유전자로서는, 효모가 사카로미세스·세레비지에인 경우 ERG6 또는 ERG3인 것이 바람직하고 ERG6인 것이 더욱 바람직하다. 여기에서 ERG6 및 ERG3은 각각 에르고스테롤 합성 효소 중 하나인 erg6p 및 erg3p를 코딩하는 유전자이다. 본 발명에서의 erg6p 및 erg3p로서는, 예를 들면 GenBank Accession No.CAA89944, CAA97586으로서 주지의 아미노산 서열을 가진 것을 들 수 있다.
또 스트레스 응답 관련 유전자로서는, 예를 들면 YAP1(GenBank Accession No.CAA89945) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 약물 감수성 관련 유전자가 발현 제어되어 있다는 것은, 상기 약물 감수성 관련 유전자의 일부 또는 전부가 결손되어 있는 것, 또는 상기 약물 감수성 관련 유전자가 전사 조절에 의해 발현 제어되어 있는 것을 의미한다.
약물 감수성 관련 유전자의 일부가 결손되어 있다는 것은, 약물 감수성 관련 유전자가 코딩하는 단백질이 그 기능을 발휘할 수 없는 상태가 될 정도로 그 유전자 서열 일부를 결손시킨 것을 의미한다. 또 기능을 발휘할 수 없는 상태란, 약물에 대한 감수성이 상승될 정도로 기능이 억제된 상태이면 된다.
또 본 발명에서, 상기 약물 감수성 관련 유전자의 전사 제어에 의한 발현 제어는, 약물 감수성 관련 유전자가 유도 가능하게 발현 억제되어 있는 것이 바람직하다. 약물 감수성 관련 유전자가 유도 가능하게 발현 억제되어 있다는 것은, 발현이 억제된 상태와 발현이 유도된 상태가 외부 인자에 의해 조절 가능하다는 것을 말한다. 「발현이 억제된 상태」란, 약물 감수성이 상승될 정도로 약물 감수성 관련 유전자의 발현이 억제되어 있으면 되고, 예를 들면 약물 감수성 관련 유전자의 발현량이 야생주 또는 비 개변이주(非改變株)의 10% 이하로 저하된 상태가 바람직하다. 또 「발현이 유도된 상태」란, 예를 들면 약물 감수성 관련 유전자의 발현량이 야생주 또는 비 개변이주와 같은 정도까지 유도된 상태가 바람직하고, 야생주 또는 비 개변이주에서의 발현량의 80% 이상으로 유도된 상태가 더욱 바람직하다. 약물 감수성 관련 유전자의 발현량은, 예를 들면 노던 블로팅, RT-PCR 등 주지의 기술을 사용하여 확인할 수 있다.
약물 감수성 관련 유전자의 발현량을 조절하는 방법으로서는, 약물 감수성 관련 유전자의 전사를 조절하는 방법을 들 수 있다. 약물 감수성 관련 유전자의 전사를 조절하는 방법으로서는, 주지의 방법을 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 테트라시클린 유전자 발현 유도계를 사용하는 방법 및 유도 가능한 프로모터를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 유도 가능한 프로모터를 사용한 약물 감수성 관련 유전자의 전사 조절 방법으로서는, 예를 들면 국제공개 제2006/046694호에 기재된 방법을 들 수 있다.
본 발명에서는, 약물 감수성과 제작 가능한 약물 고 감수성 효모주의 종류라는 면에서, 상기 약물 감수성 관련 유전자의 발현 제어가 상기 트랜스포터 관련 유전자의 결손에 의한 발현 제어이고, 또한 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자의 전사 조절에 의한 발현 제어인 것이 바람직하다.
본 발명에서, 약물 감수성 관련 유전자가 유도 가능한 프로모터에 의해 전사 조절되는 경우, 약물 감수성 관련 유전자에 추가하여 형질 전환된 효모 세포주를 선택하기 위한 마커 유전자도 상기 프로모터에 의해 전사 조절되는 것이 바람직하다. 이로써 본 발명의 효모 세포 세트를 사용한 바이오 어세이에서 마커 유전자의 영향을 효과적으로 배제할 수 있다.
상기 마커 유전자로서는 KanMX6, MPR1, PPR1+ 등 주지의 마커 유전자를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 선택 효율의 면에서 PPR1+인 것이 바람직하다.
특히 본 발명에서의 약물 고 감수성 효모 세포로서는, 상기 PDR1 유전자 및 PDR3 유전자 모두가 결손된 상태에 있고, 또한 상기 ERG6 유전자가 유도 가능하게 발현 억제되어 있는 상태에 있는 효모 세포인 것이 보다 바람직하다. 이로써 보다 높은 약물 감수성을 가진 효모 세포로 할 수 있다. 또 양호한 접합 효율에 의해 보다 많은 약물 고감수성 효모 세포주를 제작할 수 있게 된다.
본 발명의 효모 세포 세트가 1배체 효모 세포로 이루어진 경우, 효모 세포의 성(접합형)은 a형 또는 α형이 된다. 성이 a형인 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트는, 예를 들면 Science, 2001, 294, 2364-2368.에 기재된 방법에 의해 제작할 수 있다. 한편, 성이 α형인 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트는, 예를 들면 상기 MATa 유전자를 가진 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트의 제작시에 마커 유전자로서 URA3 유전자를 사용하고 5-FOA(5-Fluoroorotic acid)를 사용한 대항 선택을 함으로써 제작할 수 있다. 즉 5-FOA는 URA3 유전자의 유전자 산물에 의해 독성 화합물로 변환되기 때문에 배지에 5-FOA를 첨가함으로써 URA3 유전자를 발현하는 세포만을 선택적으로 제외할 수 있다.
본 발명에서의 1배체의 효모 세포의 선택에서는, 선택 배지에 의한 선택을 적어도 2회 하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 싱글 콜로니를 선택하는 조작을 적어도 1회 하는 것이 보다 바람직하다. 이로써 야생형 유전자를 가진 2배체 효모 세포의 혼입을 보다 효과적으로 막을 수 있다.
본 발명에서는, 2배체 효모 세포의 제작 효율의 관점에서 마커 유전자로서 URA3 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 MFA1 프로모터에 의해 전사 제어되는 URA3 유전자를 도입함으로써 a형의 효모 세포 특이적으로 URA3 유전자가 발현되어 우라실을 포함하지 않은 (Ura-)의 배지에 의해 a형의 효모 세포를, 또 5-FOA를 포함한 배지에 의해 α형의 효모 세포를 선택할 수 있다. 즉, a형의 효모 세포 세트를 제작하는 공정에서 α형의 효모 세포 세트를 동시에 제작할 수 있다.
또 프로모터로서 MFA1 대신에 MFα1 프로모터를 사용함으로써 동일하게 하여 α형의 효모 세포 세트를 만드는 과정에서 a형의 효모 세포 세트를 만들 수 있다.
본 발명의 효모 세포 세트는, 예를 들면 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 발현 제어된 파트너주를 제작하고 이것을 기존 효모 유전자 파괴주(YKO) 세트에 포함되는 각각의 효모 세포주와 교배시킴으로써 제작할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 ERG6이 유도 가능하게 발현 제어되어 있기 때문에 보다 효율적으로 약제 고 감수성 효모 세포를 제작할 수 있다.
상기 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 발현 제어된 파트너주는, 예를 들면 PCR에 의한 효율적 유전자 파괴 대립 유전자의 작제법(Baudin A et.al., Nucl.Acid Res., 1993, 21, 3329-3330.)에 기재된 방법을 사용함으로써 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 파괴된 파트너주로서 제작할 수 있다.
또 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 유도 가능하게 발현 억제된 파트너주는, 예를 들면 국제공개 제2006/046694호에 기재된 방법으로 제작할 수 있다.
또 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 발현 제어되고 또 다른 유전자 변이를 가진 효모 세포주는, 예를 들면 Science.2001 Dec 14; 294(5550): 2364-2368(토론토 대학의 Boone 등에 의한 Synthetic Genetic Array(SGA)법의 논문)에 기재된 방법에 준하여 수행할 수 있다.
2배체의 효모 세포는, 1배체의 효모 세포를 교배시킴(접합시킴)으로써 제작할 수 있다. 예를 들면, 비필수 유전자의 대립 유전자의 양쪽을 결손 또는 변이시키는 호모 결손 2배체로 이루어진 약물 고감수성 효모 세포는, 마커 유전자로서 URA3 유전자를 사용하여 비필수 유전자를 결실(deletion)시킨 a형의 효모 세포와 α형의 효모 세포를 상기와 같이 동시에 제작하고 이들을 접합함으로써 제작할 수 있다.
또 필수 유전자에서의 대립 유전자의 한 쪽을 결손 또는 변이시키는 헤테로 결손 2배체로 이루어진 약물 고감수성 효모 세포는, 예를 들면 이하와 같이 제작할 수 있다. 결손 또는 변이시키는 상기 필수 유전자를 플라스미드로 하여 약물 고감수성이 아닌 헤테로 결손 2배체 효모 세포주에 도입한 후 포자 형성시킨다. 형성된 포자로부터 상기 필수 유전자를 결손시키고 또한 상기 플라스미드를 가진 1배체 효모 세포주를 선택한다. 선택한 1배체 효모 세포주를 상기 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류가 파괴된 파트너주와 접합, 포자를 형성한 후, 예를 들면 a형 효모 세포주를 선택한다. 선택한 효모 세포주를 다시 상기 파트너주와 접합하여 2배체 세포주로 한 후, 도입한 플라스미드를 제거함으로써 제작할 수 있다.
상기 제작 방법에서의 구체적인 조작 방법은, 예를 들면 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harber Laboratory Course Manual, 2000 Edition 등에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.
본 발명의 제1 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법은, 상기 효모 세포 세트에 포함된 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 변이되는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정을 포함한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제1 표적 후보 분자 동정 방법이 상기 구성이기 때문에, 종래에는 동정 불가능했던 저농도의 약물을 사용한 경우라 해도 보다 높은 정밀도로 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정할 수 있다.
본 발명에서는 상술한 효모 세포 세트에서 선택되는 적어도 1종류의 효모 세포를 피검 물질과 접촉시킨다. 상기 효모 세포의 종류수는 특별히 제한은 없지만 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 정밀도와 효율의 면에서 가능한 한 많은 쪽이 바람직하다. 예를 들면, 바람직하게는 1000종류 이상, 보다 바람직하게는 3000종류 이상으로 함으로써 보다 고정밀도로 보다 효율적으로 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정할 수 있다.
상기 피검 물질로서는 효모 세포와 접촉시킬 수 있는 한 어떠한 물질을 사용해도 좋다. 피검 물질로서는, 예를 들면 천연 유래 저분자 화합물, 천연 유래 고분자 화합물, 합성 저분자 화합물, 합성 고분자 화합물, 펩티드, 단백질, 다당류, 핵산 등을 들 수 있다.
상기 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 방법에는 특별히 제한은 없으며, 예를 들면 효모 세포의 배양액에 피검 물질의 용액을 첨가함으로써 수행할 수 있다.
상기 표현형의 변화로서는, 세포수, 콜로니의 크기, 형태, 색 등 식별 가능하다면 어떠한 표현형의 변화여도 좋지만, 검출 효율의 측면에서 치사 또는 증식 억제가 바람직하다.
표현형이 치사 또는 증식 억제로 변화된 효모 세포를 선택하는 방법으로서는, 예를 들면 효모 세포의 배양액 중에서의, 피검 물질 비 존재하의 세포 수에 대한 피검 물질 존재하의 세포 수의 비율을 평가함으로써 선택하는 방법을 들 수 있다. 이와 같은 평가는 배양액 중의 세포 수를 실측함으로써 수행해도 좋고, 세포수를 대체하는 지표를 설정하여 이것을 정량화함으로써 수행해도 좋다. 세포수를 대체하는 지표로서는, 예를 들면 글루코스 소비량, 배양액의 탁도, 세포 면적, 형광 강도 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 정밀도와 간결성의 측면에서 배양액의 탁도인 것이 바람직하다. 배양액의 탁도는, 예를 들면 600㎚∼660㎚의 흡광도를 측정함으로써 구할 수 있다.
세포수를 대체하는 지표를 정량화하는 방법으로서는, 예를 들면 소정의 배양 시간 경과 후의 상기 지표를 측정하는 방법이나, 상기 지표를 시간의 흐름에 따라 측정하여 지표의 변화 속도를 평가하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 상기 효모 세포를 선택하는 공정이, (1)피검 물질 비 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 콘트롤 곡선의 함수 F(t)와, 피검 물질 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 테스트 곡선의 함수 G(t)를 입수하는 공정과, (2)식(F(t)-G(t))의 적분값을 산출하여 영역값을 얻는 공정과, (3)상기 영역값을 기초로 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정을 포함한 것이 바람직하다. 이로써 보다 높은 정밀도와 보다 양호한 재현성으로 표현형이 변화된 효모 세포를 선택할 수 있다.
또 본 발명에서는 정밀도와 재현성 측면에서 상기 (2)의 영역값을 얻는 공정이, 소정 시간 내에서의 식(F(t)-G(t))의 적분값을 산출하여 영역값을 얻는 공정인 것이 바람직하고, 소정 시간 내에서의 식(F(t)-G(t))의 적분값을 소정 시간에 의해 더 나누어 영역값을 얻는 공정인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서 상기 함수 F(t)는, 예를 들면 세포수의 지표를 시간의 흐름에 따라 측정하고 세포수의 지표의 시간의 흐름에 따른 변화를 직선에 가깝게 함으로써 구할 수 있다. 또 동일하게 하여 상기 함수 G(t)를 구할 수 있다.
상기 영역값을 얻는 공정에 대해서는, 예를 들면 일본특개 2006-141298호 공보에 기재된 사항을 본 발명에서도 바람직하게 적용할 수 있다.
상기 선택된 효모 세포가 결손 또는 변이되어 있는 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정에서는, 선택된 효모 세포가 가진 유전자를 PCR 등을 사용한 주지의 방법으로 결손 또는 변이되어 있는 유전자로 동정할 수 있다. 또 본 발명에서의 효모 세포로서, 결손 또는 변이되어 있는 유전자가 사전에 동정되어 있는 효모 세포주를 사용함으로써 선택된 효모 세포로부터 해당 유전자를 용이하게 동정할 수 있다.
상기 제1 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정에서는, 예를 들면, 제1 유전자의 변이가 전사 산물 또는 번역 산물의 기능을 감소시키고 약화시킨 변이인 경우에, 제1 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정할 수 있다.
제1 유전자의 변이로서 전사 산물 또는 번역 산물의 기능을 감소시키고 약화시킨 변이를 가진 효모 세포주로서는, 예를 들면 제1 유전자의 변이에 의해 온도 감수성이 된 효모 세포주나, 제1 유전자의 발현이 불완전하게 억제된 효모 세포주를 들 수 있다.
또 본 발명의 제2 및 제3 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법은, 상기 효모 세포 세트에 포함된 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 대립 유전자의 관계에 있는 유전자 또는 상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제2 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정을 포함한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제2 및 제3 표적 후보 분자 동정 방법이 상기 구성이기 때문에, 종래에는 동정 불가능했던 저농도의 약물을 사용한 경우라 해도 보다 높은 정밀도로 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정할 수 있다.
본 발명의 제2 및 제3 표적 후보 분자 동정 방법에서, 상기 제1 표적 분자 동정 방법과 공통된 공정에 대해서는 제1 표적 분자 동정 방법에서 설명한 사항을 그대로 적용할 수 있다.
상기 제1 유전자와 대립 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정에서는, 예를 들면, 상기 제1 유전자가 필수 유전자이고 효모 세포주가 2배체인 경우, 상기 제1 유전자와 대립 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정할 수 있다.
또 상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정에서는, 예를 들면 상기 제1 유전자가 비필수 유전자이고 효모 세포주가 1배체 또는 2배체인 경우 상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정할 수 있다.
여기에서 합성 치사란, 세포 중의 여러 종류의 유전자를 동시에 파괴하면 죽게 되는 성질을 말한다. 또 합성 치사에 이르는 유전자의 조합을 합성 치사의 관계에 있다고 한다. 또 대립 관계에 있는 유전자란, 2배체 세포에서 각각의 유전자가 상동의 유전자좌에 속한 유전자로서, 다른 유전자 변이를 가진 관계에 있는 것을 말한다.
또 상기 제2 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정에서는, 예를 들면 상기 제1 유전자가 결손되어 있는 경우에는 상기 제2 유전자의, 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정할 수 있다.
본 발명에서는, 예를 들면 비필수 유전자 파괴주를 사용하고 합성 치사(synthetic lethal)를 이용하여 피검 물질에 영향을 받는 유전자 및 단백질 중 적어도 한쪽을 동정할 수 있다.
예를 들면, 각각 비필수 유전자인 유전자A 또는 유전자B의 파괴주는 생육 가능하지만, 유전자 A 및 유전자 B가 동시에 파괴된 주는 죽게 되는 경우가 있다. 이 때 유전자 A와 유전자 B는 합성 치사의 관계에 있다고 볼 수 있다. 그리고 예를 들면 유전자 B의 파괴주에 대해 유전자 A의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 저해하는 피검 물질을 작용시키면, 그 피검 물질의 농도가, 유전자 B를 파괴하지 않는 주의 생육을 완전히는 저해하지 않는 농도라 해도 유전자 B의 파괴주에서는 생육 저해 또는 치사가 되는 농도인 것이 기대된다. 이 원리를 응용하여 피검 물질을 비필수 유전자 파괴주에 작용시켰을 때 생육 저해 또는 치사가 되는 주를 동정하면, 그 주에서 파괴되어 있는 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자가 명확해진다. 즉 피검 물질의 표적 유전자가 동정된다. 그리고 해당 합성 치사의 관계에 있는 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽이 그 피검 물질의 표적 후보 분자가 된다고 생각된다(Hartwell et al, Science, 1997, 278: 1064-8, Parsons et al, Nat Biotechnol, 2004, 22: 62-9).
또 어느 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자가 알려져 있지 않은 경우라 해도 주지의 것인 다수의 비필수 유전자 파괴주에 대한 작용을 망라적으로 해석함으로써 피검 물질의 표적 유전자 및 표적 분자 중 적어도 한쪽을 추정할 수도 있다. 예를 들면, 이미 표적 분자가 명백해진 물질을 다수의 비필수 유전자 파괴주에 작용시켜 망라적으로 감수성 패턴을 취득해 놓는다. 이 작업을 표적 분자가 명백해진 여러 개의 물질에 대해서 수행하여 감수성 패턴의 세트를 취득한다. 다음으로 표적 후보 분자의 알려져 있지 않은 피검 물질을 다수의 비필수 유전자 파괴주에 작용시켜 망라적으로 감수성 패턴을 취득하고, 먼저 취득한 여러 개의 물질의 감수성 패턴과 비교한다. 그 결과 피검 물질에 의해 얻어진 감수성 패턴과 일치 또는 유사한 감수성 패턴을 나타내는 물질이 존재하면, 피검 물질의 표적 후보 분자가 해당 물질의 표적 후보 분자와 동일하다고 생각할 수 있다.
나아가 예를 들면 어느 특정한 대사 경로에 존재하는 유전자군의 파괴주가 특이적으로 감수성을 나타낸 경우, 그 대사 경로 그 자체 또는 대사적으로 밀접한 관계가 있는 경로에 존재하는 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽이 표적 후보 분자가 된다.
또 필수 유전자에 대해서 2개 있는 대립 유전자 중 1개가 파괴된 주(이하, 「헤테로 결손주」라고 칭하기도 한다)를 사용하여 피검 물질에 영향을 받는 유전자 및 단백질 중 적어도 한쪽을 검출할 수 있다. 여기에서 필수 유전자란, 2개의 대립 유전자 모두를 파괴하면 세포를 증식시킬 수 없어 죽어버리는 유전자를 말한다. 또 효모의 모든 유전자 약 6000종 중 약 1200종의 유전자는 필수 유전자이다.
예를 들면, 필수 유전자인 유전자C의 헤테로 결손주에 대해, 유전자C의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 저해하는 피검 물질을 작용시키면, 유전자C의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽의 기능이 저하되는 결과, 피검 물질에 대해 특이적인 감수성을 나타낸다(Drug-induced haploinsufficiency; Giaever et al, Nature genetics, 1999, 2L278-283). 이 원리를 응용하여 피검 물질을 헤테로 결손주에 작용시켰을 때 죽게 되는 주를 동정하면, 그 주에서 파괴되어 있는 유전자가 명확해진다. 그리고 해당 헤테로 결손주에서 파괴되어 있는 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽이 그 피검 물질의 표적 후보 분자가 된다고 생각된다.
또한 비필수 유전자 파괴주를 사용하여 피검 물질에 의한 증식 억제에 대한 특이적인 내성화를 이용하여 피검 물질에 영향을 받는 유전자 및 단백질 중 적어도 한가지를 검출할 수 있다. 예를 들면, 피검 물질이 어느 단백질에 의해 수식을 받았을 때에만 독성을 발휘할 경우, 그 수식을 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 결손시킨 주에서는 독성은 발휘되지 않는다. 이 경우, 이 유전자 파괴주는 피검 물질에 대해 특이적인 내성을 나타내게 된다.
여기에서 수식이란, 예를 들면 피검 물질의 효소적인 화학 수식, 피검 물질과 단백질의 결합에 의한 독성 복합체 생성 등을 들 수 있다. 전자의 예로서는, URA3 유전자 산물에 의한 5-FOA의 5-FU로의 변환을 들 수 있어 URA3 유전자 결손에 의해 5-FOA내성이 부여된다. 또 후자의 예로서는 라파마이신의 FPR1단백질로의 결합 등을 들 수 있고, FPR1 유전자 결손에 의해 라파마이신 내성이 부여된다(Heitman J,et al.(1991)FK 506-binding protein proline rotamase is a target for the immunosuppressive agent FK 506 in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA 88(5): 1948-52).
예를 들면, 비필수 유전자인 유전자 D의 파괴주에 대해서 유전자 D의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 저해하는 피검 물질을 작용시키면, 그 피검 물질의 농도가 야생주의 생육이 저해되는 농도라 해도 해당 파괴주의 생육이 저해되지 않는 경우가 있다. 이 원리를 응용하여 피검 물질을 비필수 유전자 파괴주에 작용시켰을 때 생육이 저해되지 않는 주를 동정하면, 그 주에서 파괴되어 있는 유전자가 명확해진다. 그리고 해당 비필수 유전자 파괴주에서 파괴되어 있는 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽이, 그 피검 물질의 표적 후보 분자 또는 표적 후보 분자와 동일한 정보 전달 경로에 존재하는 분자가 된다고 생각할 수 있다(Heitman et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 1948-52).
본 발명의 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석하는 방법은, 상기 표적 후보 분자 동정 방법에 의해 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 공정과, 상기 표적 후보 분자의 기능을 동정하는 공정과, 상기 표적 후보 분자의 기능으로부터 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석하는 공정을 포함하여 구성된다. 이로써 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작의 해석을 효율적 및 고정밀도로 수행할 수 있다.
상기 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 공정에 대해서는 상기 피검 물질의 표적 후보 분자 동정 방법에서 설명한 사항을 그대로 적용할 수 있다.
또 상기 표적 후보 분자의 기능을 동정하는 방법은, 예를 들면 표적 후보 분자를 코딩하는 유전자의 유전자 서열을, 그 기능이 이미 알려진 유전자 서열과 그 상동성을 비교함으로써 수행할 수 있다.
나아가 동정된 표적 분자의 기능에 기초하여 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석할 수 있다. 예를 들면, 표적 분자의 기능이 특정 효소의 저해 작용인 경우에는 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작은 해당 효소의 저해라고 추정할 수 있다.
본 발명의 제1 스크리닝 방법은, 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함되는 적어도 1종류의 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제1 유전자와 상기 표적 후보 분자의 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정을 포함한 것을 특징으로 한다. 이로써 보다 효율적으로 보다 고정밀도로 유전자 산물인 표적 후보 분자와 특이적으로 작용하는 물질을 스크리닝할 수 있다.
또 본 발명의 제2 및 제3 스크리닝 방법은, 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 효모 세포 세트에 포함된 적어도 1종류의 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정과, 상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정과, 상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정과, 제1 유전자와 대립 유전자의 관계에 있는 유전자 또는 상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정과, 상기 제2 유전자와 상기 표적 후보 분자의 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정을 포함한 것을 특징으로 한다. 이로써 보다 효율적으로 보다 고정밀도로 유전자 산물인 표적 후보 분자와 특이적으로 작용하는 물질을 스크리닝할 수 있다
여기에서 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질로서는 천연 유래의 저분자 화합물, 천연 유래의 고분자 화합물, 합성 저분자 화합물, 합성 고분자 화합물, 펩티드, 단백질, 다당류, 핵산 등을 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, 이미 기술한 표적 후보 분자 동정 방법과 동일하게 하여 피검 물질이 그 기능에 영향을 주는 분자의 유전자를 동정할 수 있다. 또 동정된 유전자와 스크리닝의 표적 후보 분자의 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택함으로써 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질을 피검 물질 중에서 스크리닝할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데 본 발명은 이들 실시예로 한정되지 않는다.
(실시예 1)
<파트너주의 제작>
(1)PDR1 유전자와 PDR3 유전자가 파괴된 파트너주의 제작
PCR에 의한 효율적 유전자 파괴 대립 유전자의 제작법(Baudin A. et al. (1993) Nucl. Acid Res.21: 3329-3330)에 기재된 방법을 사용하여 이하와 같이 하여 PDR1 유전자와 PDR3 유전자가 파괴된 파트너주를 제작하였다.
BY4741주(MATa)의 PDR3 유전자 좌위를 LEU2 유전자에서 치환함으로써 PDR3 유전자를 파괴하였다(이하, KE383이라고 한다). 또 BY4742주(MATα)의 PDR1 유전자 좌위를 HIS3 유전자로 치환함으로써 PDR1 유전자를 파괴하였다(이하, KE384라고 한다). KE383주와 KE384주를 교배하여 포자 형성시켜 PDR1과 PDR3이 파괴되고 또한 Δmet15이고 MATa형인 주를 제작하였다(이하, KE445라고 한다).
(2)MFA1프로모터에 의해 발현 유도되는 URA3 유전자의 CAN1 영역으로의 도입
우선, 출아 효모 S.cerevisiae S288C(야생주)의 게놈 DNA를 템플리트로 하고, (A) CAN1유전자에 인접한 5'비번역 영역 약 450 염기쌍을 포함한 유전자 단편, (B) MFA1유전자의 프로모터 영역 약 400 염기쌍을 포함한 유전자 단편, (C) URA3유전자의 번역 영역 전체 길이를 포함한 약 800 염기쌍의 유전자 단편, (D) CAN1유전자에 인접한 3'비번역 영역 약 300 염기쌍을 포함한 유전자 단편을 각각 PCR법으로 증폭하였다. 다음으로 (A)단편과 (B)단편 및 (C)단편과 (D)단편을 각각 PCR법으로 연결 증폭하여 (E)단편 및 (F)단편을 얻었다. 마지막으로 (E)단편과 (F)단편을 PCR법으로 연결 증폭하여 MFAl-URA3 마커를 포함한 약 2000 염기쌍의 (G)단편을 얻었다. 이 (G)단편을 사용하여 플라스미드를 구축하였다. 이 플라스미드를 상기 KE445주에 도입하여 CAN1 유전자가 상기 (G)단편에 의해 치환된 효모 세포주를 제작하였다.
상기 단편의 PCR법에 의한 증폭으로 사용한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pct00001
상기에 의해 구축한 효모 세포주에서 MFAl-URA3 마커가 작용하는 것을 확인한 바, 접합형이 MATα인 경우에는 우라실 요구성이고, MATa인 경우에는 우라실 요구성이 소실되는 것을 확인할 수 있었다. 이 MATα주를 배리어 프리 YKO 제작을 위한 파트너주(이하, KE458이라고 한다)로 하였다.
<MATa형 배리어 프리 YKO>
10배 희석한 파트너주(50㎖ 튜브 중의 KE458에 10㎖의 YPAD를 넣어 3∼7일간 정치 배양한 것)의 각 60㎕를 MultiMek(384웰 대응 분주기: Beckman Coulter사제)를 사용하여 384웰 플레이트에 심었다. 여기에 384웰 플레이트 중에 1웰당 1주로서 배양되어 있는 YKO주(인비트로젠사제, 95401.H2) 5㎕를, MultiMek을 사용하여 첨가하고 25℃에서 2일간 배양하였다. 이 플레이트를 3000rpm, 2분간 원심 분리하고 MultiMek을 사용하여 상층액을 버리고 멸균수 20㎕를 추가하여 현탁시켰다. 이 현탁액으로부터 5㎕를 취해 멸균수 60㎕와 혼합함으로써 희석하였다. 그 희석액의 5㎕를 60㎕의 2배체 선택 배지(SD-(Ura+,Met+)/G418)에 첨가하고 30℃에서 1∼3일간 배양함으로써 2배체 세포만을 생육시켰다. 플레이트를 원심 분리하며(3000rpm, 2분간), MultiMek을 사용하여 상층액을 버리고 멸균수 20㎕ 추가하여 현탁시켰다. 이 현탁액의 10㎕를 분주 로봇 ShotMaster3000(무사시 엔지니어링제, 96spots/plate)을 사용하여 한천 Spo 배지상에 스팟팅시키고 25℃에서 약 1주일 배양함으로써 포자 형성시켰다.
한천 Spo 배지상에 스팟팅된 포자를, 1회용 96핀 리플리케이터(Cat#473245, Nunc제)로 묶어 96웰 둥근 바닥 플레이트에 들어간 20㎕의 멸균수 중에 현탁시켰다. 이 현탁액 10㎕를 MATa선택 한천 배지(SD-(Met+)/G418/canavanine) 위에 스팟팅하고 30℃에서 7∼10일간 배양함으로써 MATa 유전자의 접합형을 가진 1배체 세포 콜로니를 생육시켰다. 생육된 주를 1회용 96핀 리플리케이터로 묶어 100㎕의 MATa선택 액체 배지중에 현탁시키고 25℃에서 2∼7일간 배양하였다. 그 후, 분주 로봇ShotMaster3000으로 384웰 플레이트로 옮겨 심었다.
상기에서 얻어진 주에 대해서 시클로헥시미드 감수성을 조사했을 때 배리어 프리화되어 있다면 생육할 수 없는 50ng/㎖에서 생육 가능한 주가 존재하는 것으로 판명되었다. 이들 주에 대해서 PCR에 의한 게놈 DNA 체크를 했을 때 MATa/MATa의 2배체 세포로서, PDR1 또는 PDR3의 야생형 유전자가 적어도 하나 포함되어 있다는 것이 판명되었다. 이들 2배체 세포를 제거하기 위해 모든 주에 대해서 시클로헥시미드 감수성을 조사하여 50ng/㎖에서 생육할 수 없는 주를 선택하였다.
이로써 PDR1 유전자와 PDR3 유전자가 파괴되어 MATa 유전자를 가진 효모 세포 3111주로 이루어진 효모 유전자 파괴주 세트(MATa형 배리어 프리YKO)의 제작에 성공하였다(도 1).
(실시예 2)
<MATα형 배리어 프리 YKO의 제작>
실시예 1에서 MATa 유전자를 가진 효모 세포를 선택하는 대신에 5-FOA(5-fluoroorotic acid)를 사용한 카운터 셀렉션을 한 것 외에는 실시예 2와 동일하게 하여 MATα유전자를 가진 효모 유전자 파괴주 세트를 제작하였다. 구체적으로는, MATa 선택 한천 배지(SD-(Met+)/G418/canavanine) 대신에 MATα 선택 한천 배지(SD-(Met+,Ura+)/G418/canavanine/5FOA)를 사용함으로써 PDR1 유전자와 PDR3 유전자가 파괴되어 MATα유전자를 가진 효모 세포 1374주로 이루어진 효모 유전자 파괴주 세트(MATα형 배리어 프리YKO)의 제작에 성공했다(도 2).
(실시예 3)
<파트너주의 제작>
(1)GAL10프로모터에 의해 제어되는 ERG6 유전자의 도입
ERG6 유전자의 조절 영역에 GAL10 프로모터가 삽입된 파트너주를 제작하기 위해 이하의 유전자 단편을 제작하였다.
우선 GAL10 프로모터는 효모 게놈 DNA를 주형으로 하여 GAL10 유전자와 인접한 GAL1 유전자간의 영역에 프라이머(서열 번호9, 서열 번호10)를 설계하고 PCR에 의해 증폭시켰다. 또 유전자 도입시의 마커 유전자로서 분열 효모의 L―아제티딘-2―카본산 내성 유전자 PPR1+를 GAL10프로모터 뒤에 연결하였다. 또한 ERG6의 ORF의 5'쪽 영역에 프라이머(서열 번호11, 서열 번호12)를 설계하고, 효모 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭시킨 프래그먼트를 GAL10 프로모터 앞에 반대 방향으로 연결하였다. 또 YML007C-A를 포함한 ERG6 프로모터 영역에도 프라이머(서열 번호13, 서열 번호14)를 설계하고, PCR로 증폭시킨 프래그먼트를 ppr1+ 유전자 뒤에 반대 방향으로 연결하였다. 이 프래그먼트를 상술한 배리어 프리 파트너주 KE458에 도입하여 염색체상의 ERG6 유전자의 5'비번역 영역에 바르게 삽입된 주를 제작하였다. 이로써 GAL1 프로모터에 의해 ERG6 유전자가 제어되는 주가 제작되었다. 이것을 친주(親株)(BY4741)에 대해 백크로스를 수행하여 슈퍼 배리어 프리 YKO제작용 파트너주(이하, KE513이라고 한다)로 하였다.
KE513주의 구축에 사용한 PCR 프라이머의 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pct00002
<MATa형 슈퍼 배리어 프리 YKO의 제작>
10배 희석한 파트너주(50㎖ 튜브 중의 KE513에 10㎖의 YPAD를 넣어 3∼7일간 정치 배양한 것)의 각 60㎕를, MultiMek를 사용하여 384웰 플레이트에 심었다. 여기에 384웰 플레이트중에 1웰당 1주로서 배양되어 있는 YKO주(인비트로젠사제, 95401.H2) 5㎕를, MultiMek을 사용하여 첨가하고 25℃에서 2일간 배양하였다. 이 플레이트를 3000rpm, 2분간 원심 분리하고 MultiMek을 사용하여 상층액을 버리고 멸균수 20㎕를 추가하여 현탁시켰다. 이 현탁액으로부터 5㎕를 취해 멸균수 60㎕와 혼합함으로써 희석하였다. 그 희석액의 5㎕를 60㎕의 2배체 선택 배지(SD-(Ura+,Met+)/G418)에 첨가하고, 30℃에서 1∼3일간 배양함으로써 2배체 세포만을 생육시켰다. 플레이트를 원심 분리하고(3000rpm, 2분간) MultiMek을 사용하여 상층액을 버리고 멸균수 20㎕ 추가하여 현탁시켰다. 이 현탁액의 10㎕를 분주 로봇ShotMaster3000(무사시 엔지니어링제, 96spots/plate)을 사용하여 한천 Spo배지(포자 형성용 한천 배지) 위에 스팟팅하고 25℃에서 약 1주일 배양함으로써 포자 형성시켰다.
한천 Spo 배지상에 스팟팅된 포자를 1회용 96핀 리플리케이터(Cat#473245, Nunc제)로 묶어 96웰 둥근 바닥 플레이트에 들어간 20㎕의 멸균수 중에 현탁시켰다. 이 현탁액의 10㎕를 MATa 선택 한천 배지(SG-(Met+)/G418/canavanine/AZC) 위에 스팟팅하고 30℃에서 7∼10일간 배양함으로써 MATa 유전자의 접합형을 가진 1배체 세포 콜로니를 생육시켰다.
출현한 콜로니군 전체를 96핀 리플리케이터로 묶는 대신에 출현한 콜로니를 1주당 하나씩 이쑤시개로 골라내어 새로운 MATa선택 한천 배지에 이어서 심어 30℃에서 7일간 배양하였다. 생육된 주를 1회용 96핀 리플리케이터로 묶고 100㎕의 MATa선택 액체 배지중에 현탁시켜 25℃에서 2∼7일간 배양하였다. 그 후 분주 로봇ShotMaster3000으로 384웰 플레이트에 옮겨 심었다. 이들 주는 전부 25ng/㎖의 시클로헥시미드 존재하에서 생육할 수 없었다.
이상에 의해 PDR1 유전자와 PDR3 유전자가 파괴되고 ERG6 유전자의 발현이 GAL10 프로모터에 의해 제어되어 MATa 유전자를 가진 효모 세포 4044주로 이루어진 효모 유전자 파괴주 세트(MATa형 슈퍼 배리어 프리YKO)의 제작에 성공하였다(도 3).
또 싱글 콜로니를 선택하는 조작을 함으로써 원래 존재 비율이 낮은 데도 불구하고 증식 스피드가 빠른 2배체 효모 세포의 혼입을 효과적으로 방지할 수 있다는 것을 알 수 있다.
(실시예 4)
<2배체 배리어 프리 YKO의 제작>
상기 실시예 1에서 제작한 MATa형 배리어 프리 YKO의 효모와, 상기 실시예 2에서 제작한 대응하는 비필수 유전자를 파괴한 MATα형 배리어 프리 YKO의 효모를 교배시킴으로써 비필수 유전자를 파괴한 2배체 효모 유전자 파괴주 세트(2배체 배리어 프리 YKO)를 제작하였다.
(실시예 5)
<로바스타틴에 대한 감수성의 평가>
상기 제작한 배리어 프리 YKO(BF-YKO) 및 슈퍼 배리어 프리 YKO(SBF-YKO)의 약물 감수성을 확인하기 위해 친주 및 파트너주를 사용하여 로바스타틴에 의한 증식 억제 효과에 대한 효모의 감수성 변화를 조사하였다.
96웰 플레이트에, 로바스타틴(Sigma-aldrich사, #M2147)의 농도가 0.39μM∼100μM의 농도 범위가 되도록 로바스타틴 용액을 추가하였다. 거기에 YPAD 중에서 실온에서 2일간 정치 배양한 친주(WT:BY4742, Open biosystems사, #YSC1049), 배리어 프리용 파트너주(BF:KE458), 및 슈퍼 배리어 프리용 파트너주(SBF:KE513)를, 최종 세포수가 2000배 희석이 되도록 첨가하고 30℃에서 정치 배양하였다.
그 후, 620㎚에서의 흡광도를 플레이트 리더(SUNRISE, 데칸사제)로 시간의 흐름에 따라 48시간째까지 측정하였다. 세포 증식 억제 활성의 산출에는 일본특개2006-141298호 공보에 기재된 영역 스코어법(ARS)를 사용하였다. ARS에서는 수치가 큰 쪽이 세포 증식 억제 활성이 높다는 것을 의미한다. 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4로부터, 친주(WT)에서는 로바스타틴 농도가 100μM이라도 약간의 세포 증식 억제 효과 밖에 나타내지 않는 데 반해 BF주에서는 50μM에서 최대의 억제 활성을 나타내고, 또 SBF주에서는 25μM에서 최대의 억제 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
또 영역 스코어가 약 10이 되는 로바스타틴 농도로 비교하면 WT주에 대해 BF주에서 8배, SBF주에서 16배의 고 감수성화가 달성된다는 것을 알 수 있다.
(실시예 6)
<슈퍼 배리어 프리 YKO를 사용한 로바스타틴 표적 분자의 동정 및 작용 기작 해석>
상기 제작된 4044주로 이루어진 슈퍼 배리어 프리 YKO(SBF-YKO)를 사용하여 로바스타틴의 표적 분자를 동정하였다. SBF-YKO의 각 주를 384웰 플레이트 12장에 1웰당 1주로 하여 순서를 맞춰 나열하여 심었다. 3∼7일간 정치 배양함으로써 모든 주의 세포수를 갖추었다. 이것을 196배 희석하여 세포 희석액으로 하였다.
한편, 3.9μM의 로바스타틴을 포함한 YPAD 배지 20㎕를 각각의 웰에 첨가한 384웰 플레이트와, 로바스타틴을 포함하지 않은 YPAD 배지 20㎕를 각각의 웰에 첨가한 384웰 플레이트를 준비하였다. 각각의 웰에 제작한 세포 희석액의 각 5㎕를 첨가하였다. 이 조작에 의해 세포 농도는 1000배 희석, 또 화합물 농도는 3.125μM가 되었다.
이것을 25℃에서 배양하고 배양 개시 후 약 22시간부터 48시간까지의 동안 플레이트 리더(SpectraMax340PC384, Molecular Devices사)를 사용하여 650㎚에서의 흡광도를 시간의 흐름에 따라 측정하였다. 얻어진 데이터로부터 영역 스코어(ARS)를 산출하여 감수성의 순위를 매겼다.
그 결과, 로바스타틴의 표적 분자인 HMG-CoA환원 효소를 코딩하는 유전자HMG1의 파괴주가 높은 감수성을 나타내는 주로서 발견되었다. S.cerevisiae에는 HMG1 이외에 같은 효소를 코딩하는 HMG2유전자가 존재하기 때문에 HMG1을 파괴하더라도 효모는 죽지 않지만, HMG2에 의해 생산되는 동 효소량은 HMG1의 그것과 비교하여 5분의 1 정도이고, HMG1 파괴주 중에 잔존한 동 효소를 저해하는 로바스타틴 농도는 HMG1 유전자를 가진 주와 비교하여 저하된다는 것은 용이하게 이해할 수 있다.
나아가 감수성이 가장 높은 유전자 파괴주로서 BTS1 파괴주가 발견되었다. BTS1은 파네실기 전이 효소를 코딩하고 있으며 스테롤 생합성 경로상에서 HMG1의 하류에 존재한다. BTS1 파괴주에서는 하류의 이벤트가 막혀 있으며 그 결과 HMG-CoA환원 효소의 저해 효과가 다른 주에 비해 강하게 나타난다는 것을 생각할 수 있다.
(실시예 7)
<배리어 프리 YKO를 사용한 로바스타틴 표적 분자의 동정 및 작용 기작 해석>
상기 제작된 3011주로 이루어진 배리어 프리 YKO(BF-YKO)를 사용하여 로바스타틴의 표적 분자를 동정하였다. BF-YKO의 각 주를 384웰 플레이트 12장에 1웰당 1주로 하여 순서를 맞춰 나열하여 심었다. 3∼7일간 정치 배양함으로써 모든 주의 세포수를 갖추었다. 이것을 196배 희석하여 세포 희석액으로 하였다.
한편 3.9μM, 7.8μM 또는 15.6μM의 로바스타틴을 포함한 YPAD 배지 20㎕를 각각의 웰에 첨가한 384웰 플레이트와, 로바스타틴을 포함하지 않은 YPAD 배지 20㎕를 각각의 웰에 첨가한 384웰 플레이트를 준비하였다. 각각의 웰에서 제작한 세포 희석액의 각 5㎕를 첨가하였다. 이 조작에 의해 세포 농도는 1000배 희석, 또 화합물 농도는 각각 3.125μM, 6.25μM 및 12.5μM이 되었다.
이것을 25℃에서 배양하고, 배양 개시 후 약 22시간 내지 48시간까지의 동안에 플레이트 리더(SpectraMax340PC384, Molecular Devices사)를 사용하여 650㎚에서의 흡광도를 시간의 흐름에 따라 측정하였다. 얻어진 데이터로부터 영역 스코어(ARS)를 산출하여 감수성의 순위를 매겼다.
그 결과, 로바스타틴의 표적 분자인 HMG-CoA환원 효소를 코딩하는 유전자HMG1의 파괴주는, 화합물 농도가 6.25μM 및 12.5μM인 경우에 감수성을 나타내는 주로서 발견할 수 있었다. 이로부터 배리어 프리 YKO를 사용함으로써 화합물 농도가 낮은 경우라 해도 로바스타틴의 표적 분자 탐색이 가능하다는 것을 알 수 있다.
(비교예 1)
<YKO 콜렉션을 사용한 로바스타틴 표적 분자의 동정 및 작용 기작 해석>
실시예 7에서 BF-YKO 대신에 시판 4847주로 이루어진 YKO(인비트로젠사, #95401.H2)를 사용한 것 외에는 실시예 7과 동일하게 하여 로바스타틴의 표적 분자를 동정하였다.
그 결과, 로바스타틴의 표적 분자인 HMG-CoA환원 효소를 코딩하는 유전자HMG1의 파괴주를, 화합물 농도가 3.125μM 및 12.5μM인 모든 경우에서 감수성을 나타내는 주로서 발견할 수 없었다. 또 BTS1 파괴주에 대해서도 마찬가지로 감수성을 나타내는 주로서 발견할 수 없었다.
(실시예 8)
<라파마이신에 대한 감수성 평가>
실시예 5와 같이 하여 배리어 프리 YKO(BF-YKO) 및 슈퍼 배리어 프리YKO(SBF-YKO)의 약물 감수성을 확인하기 위해 친주 및 파트너주를 사용하여 라파마이신에 의한 증식 억제 효과에 대한 효모의 감수성 변화를 조사하였다.
96웰 플레이트에, 라파마이신(Sigma-aldrich사, #R0395)의 농도가 O.2nM∼50nM의 농도 범위가 되도록 라파마이신 용액을 추가하였다. 거기로 YPAD 중에서 실온에서 2일간 정치 배양한 친주(WT:BY4741, Open biosystems사, #YSC1048), 배리어 프리주(BF:KE457), 및 슈퍼 배리어 프리주(SBF:KE477)를 최종 세포수가 1000배 희석이 되도록 첨가하고 30℃에서 정치 배양하였다.
그 후, 620㎚에서의 흡광도를 플레이트 리더(SUNRISE, 데칸사제)로 시간의 흐름에 따라 48시간째까지 측정하였다. 세포 증식 억제 활성의 산출에는, 일본특개2006-141298호 공보에 기재된 영역 스코어법(ARS)을 사용하였다. ARS에서는 수치가 큰 쪽이 세포 증식 억제 활성이 높다는 것을 의미한다. 결과를 도 5에 도시하였다.
도 5로부터, 친주(WT)와 BF주에서는 라파마이신 농도가 50nM에서 최대인 세포 증식 억제 효과를 나타내는 데 반해, SBF주에서는 6.25nM에서 최대의 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
또 영역 스코어가 약 10이 되는 라파마이신 농도로 비교하면 WT주에 대해 SBF주에서 8배의 고 감수성화가 달성된 것을 알 수 있다.
(실시예 9)
<슈퍼 배리어 프리 YKO를 사용한 라파마이신 표적 분자의 동정 및 작용 기작 해석>
실시예 6과 동일하게 하여 슈퍼 배리어 프리 YKO(SBF-YKO)를 사용하여 라파마이신의 표적 분자를 동정하였다. SBF-YKO의 각 주를 3∼7일간 정치 배양함으로써 모든 주의 세포수를 갖추었다. 이것을 196배 희석하여 세포 희석액으로 하였다.
한편, 1.25nM의 라파마이신을 포함한 YPAD 배지 20㎕를 각각의 웰에 첨가한 384웰 플레이트와, 라파마이신을 포함하지 않은 YPAD 배지 20㎕를 각각의 웰에 첨가한 384웰 플레이트를 준비하였다. 각각의 웰에서 제작한 세포 희석액의 각 5㎕를 첨가하였다. 이 조작에 의해 세포 농도는 1000배 희석, 또 화합물 농도는 1nM이 되었다.
그 결과, 라파마이신의 농도가 1nM인 경우에 라파마이신의 표적 분자인 TOR키나아제를 코딩하는 유전자TOR1의 파괴주가, 높은 감수성을 나타내는 주로서 발견되었다.
S.cerevisiae에는 TOR1 이외에 같은 효소를 코딩하는 TOR2 유전자가 존재하기 때문에 TOR1을 파괴해도 효모는 죽지 않지만 TOR1 파괴주 중에 잔존한 동 효소를 저해하는 라파마이신 농도는 TOR1 유전자를 가진 주와 비교하여 저하된다는 것은 용이하게 이해할 수 있다.
또 TOR2는 생존에 필수이므로 비필수 유전자의 파괴주의 세트인 SBF-YKO중에는 TOR2 파괴주는 존재하지 않으며 SBF-YKO를 사용한 검토에서는 TOR2 파괴주는 감수성주로서 발견되지 않았다.
(비교예 2)
<YKO콜렉션을 사용한 라파마이신 표적 분자의 동정 및 작용 기작 해석>
실시예 9에서 SBF-YKO 대신에 시판 4847주로 이루어진 YKO(인비트로젠사, #95401.H2)를 사용하고 화합물 농도를 10nM, 12.5nM 및 15nM로 한 것 외에는 실시예 9와 동일하게 하여 라파마이신의 표적 분자를 동정하였다.
그 결과, 라파마이신의 표적 분자인 TOR 키나아제를 코딩하는 유전자TOR1의 파괴주가 10nM, 12.5nM 및 15nM의 화합물 농도에서 감수성을 나타내는 주로서 발견되었다.
이상의 결과로부터, BF-YKO,SBF-YKO를 사용함으로써 저농도의 로바스타틴을 사용한 경우에도 표적 분자가 발견되는 것 및 작용 기작 예측이 가능한 것으로 나타났다. 특히 SBF-YKO를 사용함으로써 화합물 농도가 3.125μM의 저농도라 해도 표적 분자가 발견되는 것 및 작용 기작 예측이 가능한 것으로 나타났다. 또 SBF-YKO를 사용함으로써 YKO와 비교하여 1/10의 저농도의 라파마이신을 사용한 경우에도 표적 분자가 발견되는 것 및 작용 기작 예측이 가능한 것으로 나타났다.
본 발명의 효모 세포 세트는 고감도의 표적 후보 분자의 동정, 작용 기작의 해석, 스크리닝에 바람직하게 적용할 수 있어 산업상 매우 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Eisai Co., Ltd. <120> Yeast strain set and methods for identifying a target molecule, analysing an action mechanism and screening a target moleclule <130> CO-F03300-00 <160> 14 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 tagggcgaac ttgaagaata acc 23 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 gccacgttgc acactatcct gtgctatgcc tttttttttt tttgtt 46 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 caggatagtg tgcaacgtgg c 21 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 cttatatgta gctttcgaca tttctattcg atggctttg 39 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 5 atgtcgaaag ctacatataa g 21 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 atcaaaggta ataaaacgtc atatttagtt ttgctggccg catct 45 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 atatgacgtt ttattacctt tgat 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 8 acgaaaaatg agtaaaaatt atctt 25 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 gctctagagc tatagttttt tctccttgac 30 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 aaagcggccg cttatattga attttcaaaa att 33 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 11 gccctcgaga ttgtttagac cgatgacgt 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 12 aaactgcagg cagcataaga tgagtgaaa 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 13 gccgagctca aacagataag ggaaacttg 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 14 gccgagctct ttccggttcc catgacaaa 29

Claims (17)

  1. 2종류 이상의 효모 세포로 이루어진 효모 세포 세트로서, 상기 2종류 이상의 효모 세포 각각은 서로 다른 유전자 중 적어도 하나의 유전자를 결손 또는 변이시키고, 또한 상기 2종류 이상의 효모 세포 전부는 약물 감수성 관련 유전자 중 적어도 1종류를 발현 제어한 약물 고 감수성 효모 세포인 효모 세포 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약물 감수성 관련 유전자가 트랜스포터 관련 유전자 및 에르고스테롤 합성 관련 유전자에서 선택되는 적어도 1종류인 것을 특징으로 하는 효모 세포 세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 트랜스포터 관련 유전자가 PDR1 및 PDR3인 것을 특징으로 하는 효모 세포 세트.
  4. 제2항에 있어서, 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자가 ERG6 또는 ERG3인 것을 특징으로 하는 효모 세포 세트.
  5. 제2항에 있어서, 상기 트랜스포터 관련 유전자는 상기 트랜스포터 관련 유전자의 결손에 의해 발현 제어되고, 또한 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자는 상기 에르고스테롤 합성 관련 유전자의 전사 조절에 의해 발현 제어되는 것을 특징으로 하는 효모 세포 세트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 효모 세포는 2배체인 것을 특징으로 하는 효모 세포 세트.
  7. 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 방법으로서,
    제1항에 기재된 효모 세포 세트에 포함된 효모 세포와 상기 피검 물질을 접촉시키는 공정,
    상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    상기 선택된 효모 세포에서 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제1 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정,
    을 포함하는 표적 후보 분자 동정 방법.
  8. 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 방법으로서,
    제1항에 기재된 효모 세포 세트에 포함되는 효모 세포와 상기 피검 물질을 접촉시키는 공정,
    상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제1 유전자와 대립 유전자의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제2 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정,
    을 포함하는 표적 후보 분자 동정 방법.
  9. 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 방법으로서,
    제1항에 기재된 효모 세포 세트에 포함되는 효모 세포와 상기 피검 물질을 접촉시키는 공정,
    상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제2 유전자의 전사 산물 및 번역 산물 중 적어도 한쪽을 상기 피검 물질의 표적 후보 분자로 동정하는 공정,
    을 포함하는 표적 후보 분자 동정 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표현형의 변화는 치사 또는 증식 억제인 것을 특징으로 하는 표적 후보 분자 동정 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 효모 세포를 선택하는 공정이,
    (1)상기 피검 물질의 비 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 콘트롤 곡선의 함수 F(t)와, 상기 피검 물질의 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 테스트 곡선의 함수 G(t)를 입수하는 공정,
    (2)식(F(t)-G(t))의 적분값을 산출하여 영역값을 얻는 공정,
    (3)상기 영역값을 토대로 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 후보 분자 동정 방법.
  12. 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석하는 방법으로서,
    제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 표적 후보 분자 동정 방법에 의해 피검 물질의 표적 후보 분자를 동정하는 공정,
    상기 표적 후보 분자의 기능을 동정하는 공정,
    상기 표적 후보 분자의 기능에 기초하여 피검 물질의 효모 세포에 대한 작용 기작을 해석하는 공정,
    을 포함하는 피검 물질의 작용 기작 해석 방법.
  13. 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서,
    제1항에 기재된 효모 세포 세트에 포함되는 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정,
    상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    상기 선택된 효모 세포에서 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제1 유전자와 상기 목적으로 하는 분자를 전사 산물 또는 번역 산물로 하는 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정,
    을 포함하는 스크리닝 방법.
  14. 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서,
    제1항에 기재된 효모 세포 세트에 포함된 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정,
    상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제1 유전자와 대립 유전자의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제2 유전자와 상기 목적으로 하는 분자를 전사 산물 또는 번역 산물로 하는 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정,
    을 포함하는 스크리닝 방법.
  15. 목적으로 하는 분자의 기능에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법으로서,
    제1항에 기재된 효모 세포 세트에 포함된 효모 세포와 피검 물질을 접촉시키는 공정,
    상기 피검 물질과의 접촉에 의해 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    상기 선택된 효모 세포에서 결손 또는 변이된 유전자를 제1 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제1 유전자와 합성 치사의 관계에 있는 유전자를 제2 유전자로 동정하는 공정,
    상기 제2 유전자와 상기 목적으로 하는 분자를 전사 산물 또는 번역 산물로 하는 유전자가 일치하는 피검 물질을 선택하는 공정,
    을 포함하는 스크리닝 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표현형의 변화는 치사 또는 증식 억제인 스크리닝 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효모 세포를 선택하는 공정이,
    (1)상기 피검 물질의 비 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 콘트롤 곡선의 함수 F(t)와, 상기 피검 물질의 존재하에서의 세포 수에 관한 지표의 시간에 대한 테스트 곡선의 함수 G(t)를 입수하는 공정,
    (2)식(F(t)-G(t))의 적분값을 산출하여 영역값을 얻는 공정,
    (3)상기 영역값을 토대로 표현형이 변화된 효모 세포를 선택하는 공정,
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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JP7345122B2 (ja) * 2019-07-04 2023-09-15 国立大学法人 東京大学 抗真菌剤のスクリーニング方法、及び、真菌病原性発現阻害剤である抗真菌剤
CN112646811B (zh) * 2020-12-21 2022-09-06 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种适用于酵母多基因敲除的CRISPR/Cas9***及其构建方法和应用

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