KR20100024395A - 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제의 개선된 변이체 - Google Patents

바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제의 개선된 변이체 Download PDF

Info

Publication number
KR20100024395A
KR20100024395A KR1020097024818A KR20097024818A KR20100024395A KR 20100024395 A KR20100024395 A KR 20100024395A KR 1020097024818 A KR1020097024818 A KR 1020097024818A KR 20097024818 A KR20097024818 A KR 20097024818A KR 20100024395 A KR20100024395 A KR 20100024395A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
asp
ala
val
asn
Prior art date
Application number
KR1020097024818A
Other languages
English (en)
Inventor
볼프강 엘레
닐람 에스 아민
Original Assignee
다니스코 유에스 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다니스코 유에스 인크. filed Critical 다니스코 유에스 인크.
Publication of KR20100024395A publication Critical patent/KR20100024395A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체는 유리하게는 개선된 효소 성능을 나타낸다. 적합한 변이체에는 효소의 표면 상에 변경된 전하 분포를 가진 것 또는 변경된 활성 부위 잔기를 가진 것이 포함된다. 구조적 모델링은 변형 아미노산이 예를 들어, 좀더 활성인 알파 아밀라아제에서 발견되는 잔기에 상응하도록 아미노산 변형을 선택하는 것을 통지할 수 있다. 변이체를 포함하는 조성물은 표면 세정, 직물 세탁, 발호, 전분 처리, 예를 들어, 액화 및 당화, 및 균막 가수분해 다양한 기질 제거 방법에 유용하다.

Description

바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제의 개선된 변이체 {IMPROVED VARIANTS OF THE BACILLUS LICHENIFORMIS ALPHA-AMYLASE}
서열 목록
본원에는 전체가 참조로서 인용되는 SEQ ID NO: 1 ~ 30 을 포함하는 서열 목록이 또한 첨부된다.
폴리펩티드가 바실러스 (Bacillus) α-아밀라아제, 특히 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) α-아밀라아제로부터 변형된, 아밀라아제 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 기재되어 있다.
전분은 아밀로오스 (15-30% w/w) 와 아밀로펙틴 (70-85% w/w) 의 혼합물로 이루어진다. 아밀로오스는 분자량 (MW) 이 약 60,000 내지 약 800,000 인 α-1,4-연결 글루코오스 단위의 선형 사슬로 이루어진다. 아밀로펙틴은 동일한 1,4-연결 글루코오스 단위 뿐 아니라, 매 24 내지 30 개의 글루코오스 단위마다 α-1,6 분지점을 함유하는 분지 중합체이고; 이의 MW 는 108 정도로 클 수 있다.
농축된 덱스트로오스 시럽 형태의, 전분으로부터의 당은 현재 (1) α-아밀라 아제로 고체 전분의 약 7 - 10 의 평균 중합도를 갖는 덱스트린으로의 액화 (또는 점도 감소), 및 (2) 수득된 액화 전분 (즉, 전분 가수분해물) 의 아밀로글루코시다아제 (또한 글루코아밀라아제로 불림) 로의 당화를 포함하는 효소 촉매 방법에 의해 생성된다. 수득된 시럽은 글루코오스 함량이 높다. 시판되는 대부분의 글루코오스 시럽은 그 후에 이소시럽 (isosyrup) 으로 알려진 덱스트로오스/프룩토오스 혼합물과 효소적으로 이성화된다.
α-아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 는 내부 α-1,4-글루코시드 결합을 랜덤하게 분할하여 전분, 글리코겐, 및 관련 다당류를 가수분해한다. 상기 효소는 당 액화, 직물 발호 (textile desizing), 제지 및 펄프 산업에서의 전분 변형, 곡물 가공, 제빵 및 양조를 비롯한 다수의 중요한 상업적 적용을 갖는다. α-아밀라아제는 또한 자동 식기세정 세제 및 표백제를 포함하는 제형을 비롯한 빨래 세제 제형에서 세정 동안 전분성 오염을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
α-아밀라아제는 다양한 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 공급원으로부터 단리된다. 산업적으로는, 많은 중요한 α-아밀라아제는 얼마간은 아밀라아제를 성장 배지로 분비하는 바실러스 (Bacillus) 의 높은 역량 때문에 바실러스 (Bacillus) 종, 예를 들어 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 로부터 단리된다. B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제는 경제적으로 생성될 수 있더라도, 상기 효소는 심지어 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제가 상기 α-아밀라아제와 유의한 구조적 상동성을 공유함에도 불구하고, 일부 적용에서 기타 α-아밀라아제 만큼 수행하지 않는다. 따라서, 특히 세제 제형 또는 기타 세정 제형으로 제형화되는 경우 우수한 성능을 가진 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제에 대한 필요성이 있다.
요약
B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체는 세정 제형에서 높은 성능을 가지며 제공된다. 상기 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체는 α-아밀라아제를 사용하는 다양한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
SEQ ID NO: 1 의 변이체가 SEQ ID NO: 1 과 비교해 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하고 (Van den Elzen,P., Pen,J., Hoekema,A., Sijmons,P.C., Van, Ooyen,A.J.J., Rietveld,K. and Quax,W., Transgenic plants having a modified carbohydrate content 특허: EP 0479359-A 08-APR-1992; GIST-BROCADES N.V.; MOGEN INTERNATIONAL N. V), 코딩된 변이체가 α-아밀라아제 활성을 나타내는, SEQ ID NO: 1 의 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공하는 것이 목적이다. 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 SEQ ID NO: 2 에 언급된 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제의 아미노산 잔기에 해당하는 아미노산 잔기를 포함하는 코딩된 변이체를 산출할 수 있다 (Tsukamoto,A., Kimura,K., Ishii,Y., Takano,T. and Yamane,K., Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic Bacillus sp. #707 and structural similarity to liquefying type alpha-amylases Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1), 25-31 (1988)). 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 코딩된 변이체의 표면에 위치하는 하전 잔기 또는 활성 부위 아미노산 잔기에 이뤄질 수 있다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 위치 1 에서의 잔기 이외의 아미노산 잔기에 이뤄진다. 변이체는 잔기 2 에서 105 및 잔기 208 에서 396 까지 확장되는 도메인 A, 잔기 106 에서 207 까지 확장되는 도메인 B, 및 잔기 397 에서 C 말단까지 확장되는 도메인 C 를 포함할 수 있다. 변이체는 도메인 A, B 또는 C 에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 변이체는 2 개 이상, 5 개 이상, 10 개 이상, 11 내지 30 개, 또는 11 내지 70 개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 총 수는 1 내지 30, 또는 1 내지 50, 또는 1 내지 70, 또는 그 사이의 임의의 정수일 수 있다. 일부 구현예에서, 변이체는 SEQ ID NOS: 3-15 (SEQ ID NO: 3 은 변이체에 대한 모체이다) 의 아미노산 서열 중 하나를 갖는다. 변이체는 하기 아미노산 치환, 삽입 또는 결실 중 하나 이상을 포함할 수 있다: K23N; Q26R; A33K; T49A; A52N; H68N; E82Q; K88N; H91K; R93N; D94G; D114L; T116R; D121N; A123N; D124N; R127Q; V128E; I129V; H133Y; L134T; K136E; H140Y; H142D; S148N; Y150H; D152N; H156R; T163V; E167Q; K170R; 위치 172 에서의 N 삽입; Q178R; A181G; S187D; N188T; N190F; K213R; R214N; E222T; F238Y; E250S; K251A; E255N; Y262F; Q264K; H293Y; T297K; R305Q; K306N; K319H; G332E; Q333E; S334A; Q340E; T341E; TKGDSQREI 에서 IPTHGV--- 로의 잔기 369-377 의 삽입 또는 결실 (여기서 실선은 결실을 나타냄); K389E; K392Q; Q393K; A398R; H400N; D416N; V419H; R437W; N444K; E447Q; H450S; E458G; E469N; 또는 H471S.
또다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 상기 핵산을 포함하는 벡터가 또한 제공되며, 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 숙주 세포는 박테리아 또는 진균을 포함하나 이에 제한되지 않는 미생물일 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 또는 S. 뮤리너스 (S. murinus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 (Gram) 양성 박테리아; 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 인 그람 음성 박테리아일 수 있다.
또다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제와 비교하여 하나 이상의 변형된 속성을 갖는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체의 제조 방법을 제공하는 것이다: (1) 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 구조를, 상기 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제에 비해 하나 이상의 바람직한 속성을 갖는 모델 α-아밀라아제와 비교하는 단계, (2) 모델 α-아밀라아제와 구조적으로 보존된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 하나 이상의 아미노산 또는 구조 영역을 확인하는 단계; (3) 상기 단계 (2) 에서 확인된 아미노산 잔기 또는 구조 영역이 변형된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체를 구축하는 단계; 및 (4) 변이체를 시험하여, 하나 이상의 바람직한 속성이 변이체에 부여되었는지의 여부를 확인하는 단계. 하나의 구현예에서, 모델 α-아밀라아제는 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제이다.
또다른 목적은 상기 변이체를 포함하는 수동 또는 자동 식기세정 조성물을 제공하는 것이다. 수동 또는 자동 식기세정 조성물은 계면활성제, 세제 강화제, 복합 작용제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제 (suds suppressor), 부식방지제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 히드로트롭, 변색 억제제 및 향수 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 식기 세정 방법은 수동 또는 자동 식기세정 조성물을 식기를 세정하는데 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또다른 목적은 상기 변이체를 포함하는 세제 첨가제를 제공하는 것이다. 세제 첨가제를 포함하는 세탁 세제는 계면활성제, 세제 강화제, 복합 작용제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 부식방지제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 히드로트롭, 형광 증백제 (optical brightener), 직물 컨디셔너, 및 향수 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 세제 첨가제는 세탁 또는 식기세정에 사용될 수 있다. 세제 첨가제는 임의로 비-분진 과립, 미립, 안정화된 액체 또는 보호된 효소의 형태일 수 있다. 세제 첨가제는 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 덱시리보뉴클레아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀룰라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함할 수 있다. 아밀라아제는 또다른 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 또는 글루코아밀라아제일 수 있다.
또다른 목적은 상기 세제 첨가제 또는 상기 변이체를 포함하는 세제 조성물을 제공하는 것이다. 세제 조성물은 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀룰라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함할 수 있다.
또한 또다른 목적은 수용액 중에 상기 변이체, 및 임의로 또다른 효소를 포함하는 직물 발호 조성물을 제공하는 것이다. 직물 발호 방법은 발호 조성물을 직물을 발호하는데 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또다른 목적은 수용액 중에 상기 변이체를 포함하는 전분 가공 조성물을 제공하는 것이다. 전분 가공 조성물은 글루코아밀라아제, 이소아밀라아제, 풀룰라나아제, 파이타아제 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 전분 가공 방법은 상기 조성물을 전분을 가공하는데 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또다른 목적은 용액 또는 젤 중에 상기 변이체, 및 임의로 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 프로테아제, 펙티나아제, 항균제, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 균막 (biofilm) 가수분해 조성물을 제공하는 것이다. 균막 가수분해 방법은 상기 조성물을 균막을 처리하는데 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또다른 목적은 용액 중에 변이체를 포함하는 전분 당화 조성물을 제공하는 것이다. 전분 당화 방법은 상기 조성물을 전분을 당화시키는데 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또다른 목적은 용액 중에 상기 변이체를 포함하는 전분 액화 조성물을 제공하는 것이다. 전분 액화 방법은 상기 조성물을 전분을 액화시키는데 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함한다.
또다른 목적은 용액 또는 젤 중에 상기 변이체를 포함하는 제빵 조성물을 제공하는 것이다. 제빵 방법은 상기 제빵 조성물을 제빵되는 물질에 적용하는 것을 포함한다.
첨부 도면은 본 명세서에 인용되고, 이의 일부를 구성하며, 구현예를 설명한다. 도면에서:
도 1 은 PURASTAR® OxAm (Danisco US Inc., Genencor Division; 이전의 Genencor International, Inc.) 에 사용되는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 및 B. 서브틸러스 종 (B. subtilus sp.) 번호 707 α-아밀라아제 (Swissprot Accession No. P19571) 사이의 3D 구조 배열을 나타낸다. 구조 배열에는 활성 부위에 결합되는 것으로 보여지는 기질 유사체 Acarbose (억제제) 가 포함된다. α-아밀라아제의 A-도메인은 기질의 오른쪽에 배열된 구조의 중간에 위치하고, B-도메인은 기질의 왼쪽에 대해 왼쪽면에 위치하고, C-도메인은 사진의 오른쪽을 차지한다.
도 2 는 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 (Accession No. CAA01355; 윗줄) 및 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제 (Swissprot Accession No. P19571; 아랫줄) 사이의 서열 배열을 나타낸다. 동일한 잔기는 밑줄에 별표로 표시한다.
도 3 은 12 가지 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이 체에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 수, 일반 유형 및/또는 도메인 위치를 나타낸다.
도 4 는 OxAm 모체 및 변이체의 발현에 사용되는 플라스미드 pHPLT-OxAm 의 도식을 나타낸다.
도 5 는 배양 배지 M1 또는 M2 에서 성장된 OxAm 및 OxAm 변이체 (V2, V3, 및 V5) 의 세정 활성을 나타낸다.
도 6 은 배양 배지 M1 에서 성장된 OxAm 및 OxAm 변이체 (V1, V2, V3, V5, V6, 및 V9) 의 세정 활성을 나타낸다.
상세한 설명
B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체는 세정 제형, 예컨대 자동 식기세정 세제 및 표백제를 함유하는 제형을 비롯한 세탁 세제 제형으로, 우수한 성능을 가지고 제공된다. 특히, 본 변이체는 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제보다 높은 특이적 활성을 갖는다. 다음은 수행될 수 있는 방식에 대한 상세한 사항 뿐 아니라 이에 의해 제조되는 α-아밀라아제 변이체에 대한 조성물 및 용도를 제공한다.
1. 정의 및 약어
본 상세한 설명에 따르면, 하기 약어 및 정의를 적용한다. 본원에 사용되는 바와 같은 단수형에는 문맥상 다르게 명확하게 제시되지 않는 경우 복수형 참조가 포함되는 것으로 유념해야만 한다. 그러므로, 예를 들어, "효소" 에 대한 참조에는 다수의 이러한 효소가 포함되며, "제형" 에 대한 참조에는 당업자에게 공 지된 하나 이상의 제형 및 이의 등가물, 등에 대한 참조가 포함된다.
다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학적 용어는 당업자에게 통상 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 이하에 제공된다.
1.1. 정의
"아밀라아제" 는 무엇보다도, 전분 분해를 촉매화할 수 있는 효소를 의미한다. "아밀라아제" 는 임의의 아밀라아제, 예컨대 글루코아밀라아제, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 및 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 및 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 와 같은 바실러스 종 (Bacillus sp.) 의 야생형 α-아밀라아제가 포함된다. 아밀라아제는 전분 내의 α-D-(1→4) O-글리코시드 연결을 분할하는 가수분해효소이다. 일반적으로, α-아밀라아제 (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-글루칸 글루카노히드롤라아제) 는 전분 분자 내의 α-D-(1→4) O-글리코시드 연결을 랜덤하게 분할하는 내부-작용 효소로서 정의된다. 대조적으로, 외부-작용 녹말가수분해 효소, 예컨대 β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2; α-D-(1→4)-글루칸 말토히드롤라아제) 및 말토오스 생성 α-아밀라아제 (EC 3.2.1.133) 와 같은 일부 생성물-특이적 아밀라아제는 기질의 비-환원 말단으로부터 전분 분자를 분할한다. β-아밀라아제, α-글루코시다아제 (EC 3.2.1.20; α-D-글루코시드 글루코히드롤라아제), 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-글루칸 글루코히드롤라아제), 및 생성물-특이적 아밀라아제는 전분으로부터 특정 길이의 말토-올리고당을 생성할 수 있다.
"α-아밀라아제 변이체", "α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드", 및 "변이체 효소" 는 야생형 α-아밀라아제의 아미노산 서열이 개질된 아미노산 서열을 갖는 α-아밀라아제 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "모 효소," "모 서열", "모 폴리펩티드", "야생형 α-아밀라아제 단백질", 및 "모 폴리펩티드" 는 α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드에 기초하는 효소 및 폴리펩티드를 의미할 것이다. 야생형 α-아밀라아제는 자연적으로 발생한다. 본 명세서의 목적에 있어서, PURASTAR® OxAm 에 사용되는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제가 "야생형" α-아밀라아제로 고려된다. 즉, "B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체" 에는 PURASTAR® OxAm 에 사용되는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제가 특이적으로 배제된다. "PURASTAR® OxAm," "PURASTAR®" 및 "OxAm" 은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "α-아밀라아제 변이체" 에는 또한 신호 서열의 아미노산 잔기 또는 성숙 단백질의 첫번째 잔기에서만 오직 야생형 α-아밀라아제와 상이한 α-아밀라아제가 특이적으로 배제된다. 즉, 본 명세서의 목적에 있어서, 성숙 α-아밀라아제 변이체의 서열은 첫번째 잔기 외의 위치에서 성숙 야생형 α-아밀라아제의 서열과 상이하다.
"변이체" 는 폴리펩티드와 핵산을 모두 말한다. 용어 "변이체" 는 용어 "돌연변이체" 와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 변이체에는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 중의 하나 이상의 위치에서, 삽입, 치환, 전환, 절단 및/또는 역위가 각각 포함된다. 변이체 핵산에는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열이 포함될 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열은 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건하에서 (예를 들어, 50℃ 및 0.2X SSC {1X SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 나트륨 시트레이트, pH 7.0}) 혼성화할 수 있는 서열과 상보적이다. 더욱 특히, 용어 변이체는 본원에 제시된 뉴클레오티드 서열에 높은 엄격함 조건하에서 (예를 들어, 65℃ 및 0.1X SSC) 혼성화할 수 있는 서열과 상보적인 서열을 포함한다.
"단리된" 은 서열이 자연적으로 관련되고 자연에서 발견되는 하나 이상의 다른 성분이 서열에 적어도 실질적으로 없는 것을 의미한다.
"정제된" 은 물질이 비교적 순수한 상태, 예를 들어, 약 90% 이상의 순수, 약 95% 이상의 순수, 또는 약 98% 이상의 순수한 상태인 것을 의미한다.
"열안정성" 은 효소가 참조 효소보다 더욱 열안정성인 것을 의미한다. 본 출원에서, α-아밀라아제 변이체는, 변이체가 예를 들어, 동일한 온도, 기질 농도, 등의 동일한 실험 조건 하에서 특정 시간 간격 후 비교적 높은 효소 활성을 갖는 경우, 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제보다 더욱 열안정성이다. 대안적으로는, 더욱 열안정성인 효소는 시차 주사 열량계에 의해 측정되는 참조 효소에 비해 좀더 높은 열용량을 갖는다.
"pH 범위" 는 효소가 활성을 나타내는 pH 값을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은, "pH 안정한" 은 효소가 특정 pH 에서 참조 효소보다 더욱 안정한 것을 의미한다. 본 출원에서, α-아밀라아제 변이체는, 변이체가 동일한 실험 조건, 예를 들어 동일 pH, 등 하에서 특정 시간 간격 후 비교적 높은 활성을 갖는 경우, 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제보다 더욱 pH 안정성이다.
본원에 사용되는 바와 같은, "음식" 에는 제조된 음식 뿐 아니라, 음식 성분, 예컨대 가루가 모두 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은, "음식 성분" 에는 기능 음식 또는 식품류인 제형 또는 이에 첨가될 수 있는 제형이 포함될 것이고, 예를 들어, 산성화 또는 유화를 필요로 하는 다양한 생성물에 낮은 수준으로 사용되는 제형이 포함된다. 음식 성분은 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 또는 고체의 형태일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "기능 음식" 은 영양 효과 및/또는 미감 만족을 제공할 수 있을 뿐 아니라, 또한 소비자에게 추가의 이로운 효과를 전달할 수 있는 음식을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은, "아미노산 서열" 은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질" 과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "펩티드" 와 동의어이고, 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열" 은 용어 "효소" 와 동의어이다.
본원에 사용되는 바와 같은, "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열" 은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 상동, 분절 및 유도체를 말한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈성 또는 합성 또는 재조합 기원일 수 있고, 센스 또는 안티-센스 가닥을 나타내는 지의 여부와는 관계없이 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "뉴클레오티드 서열" 에는 게놈성 DNA, cDNA, 합성 DNA, 및 RNA 가 포함된다.
"상동 (homologue)" 은 대상 아미노산 서열 및 대상 뉴클레오티드 서열과 특정 정도의 일치성 또는 "상동성 (homology)" 을 갖는 실재 (entity) 를 의미한다. "상동 서열" 에는 대상 서열과 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90% 일치하는, 특히 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열이 포함된다. 전형적으로, 상동은 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 잔기를 포함할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은, "혼성화" 에는 핵산 가닥을 염기 짝짓기를 통해 상보성 가닥과 연결시키는 방법 뿐 아니라, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 기술로 수행되는 바와 같은 증폭 방법이 포함될 것이다. α-아밀라아제 변이체 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 이종이량체 (heteroduplex) 또는 RNA/DNA 공중합체로 존재할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, "공중합체" 는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함하는 단일 핵산 가닥을 말한다. α-아밀라아제 변이체 핵산은 심지어 발현을 추가로 증가시키기 위해 최적화된 코돈일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "합성" 화합물은 시험관 내 화학 또는 효소 합성에 의해 제조된다. 이것에는 메탄올자화균 피치아 (Pichia), 한세눌라 (Hansenula), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 또는 기타 선택되는 발현 균주와 같은 숙주 유기체에 대한 최적 코돈을 사용하여 제조된 α-아밀라아제 변이체 핵산이 포함되나 이에 제한되 지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은, "형질전환된 세포" 에는 재조합 DNA 기술을 사용하여 형질전환된 세포가 포함된다. 형질전환은 전형적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 세포 내에 삽입하여 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열일 수 있다 (즉, 변형되는 세포에 대해 자연적이지 않은 서열, 예컨대 융합 단백질을 코딩하는 서열임).
본원에 사용되는 바와 같은, "작동가능하게 연결된" 은 기재된 성분이 의도되는 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 상용성인 조건하에서 달성되는 방식으로 연결된다.
본원에 사용되는 바와 같은, "생물학적으로 활성인" 은 자연 발생적 서열과 유사한 구조, 조절 또는 생화학적 기능 (그러나 반드시 동일한 정도는 아님) 을 갖는 서열을 말한다.
1.2. 약어
다르게 정의되지 않는다면 하기 약어가 적용된다:
AE 알코올 에톡실레이트
AEO 알코올 에톡실레이트
AEOS 알코올 에톡시술페이트
AES 알코올 에톡시술페이트
AFAU 산 진균류 α-아밀라아제 단위
AGU 글루코아밀라아제 활성 단위
AOS α-올레핀술포네이트
AS 알코올 술페이트
BAA 박테리아 α-아밀라아제
cDNA 상보성 DNA
CMC 카르복시메틸셀룰로오스
DE 덱스트로오스 당량
DNA 데옥시리보핵산
DP3 3 개의 서브단위로의 중합도
DPn n 개의 서브단위로의 중합도
DS 건조 고체
DTMPA 디에틸렌트리아민펜타아세트산
EC 효소 분류를 위한 효소 위원회
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
EDTMPA 에틸렌디아민테트라메틸렌포스폰산
EO 에틸렌 옥시드
F&HC 섬유 & 생활 캐어
HFCS 고 프룩토오스 옥수수 시럽
HFSS 고 프룩토오스 전분계 시럽
IPTG 이소프로필 β-D-티오갈락토시드
LAS 선형 알킬벤젠술포네이트
LU 리파아제 유닛
MW 분자량
nm 나노미터
NOBS 노나노일옥시벤젠술포네이트
NTA 니트릴로아세트산
PCR 폴리머라아제 연쇄 반응
PEG 폴리에틸렌글리콜
pi 등전위점
ppm 백만당 부
PVA 폴리(비닐 알코올)
PVP 폴리(비닐피롤리돈)
RAU 참조 아밀라아제 유닛 (Reference Amylase Units)
RMS 루트 평균 제곱
RNA 리보핵산
SAS 2차 알칸 술포네이트
1X SSC 0.15 M NaCl, 0.015 M 나트륨 시트레이트, pH 7.0
SSF 자극성 당화 및 발효
TAED 테트라아세틸에틸렌디아민
TNBS 트리니트로벤젠술폰산
w/v 중량/부피
w/w 중량/중량
wt 야생형
μL 마이크로리터
2. α- 아밀라아제 변이체
본원의 α-아밀라아제 변이체는 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제로부터 제작된다. 본 발명의 변이체는 향상된 특이적 활성, pH 프로파일, 열안정성, 온도 범위 프로파일, 칼슘 이온 요구성, 또는 기타 향상된 특징을 가질 수 있다. 변이체는 일반적으로 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 아미노산 서열의 하나 이상의 변형을 포함한다. A 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 의 임의의 자연 발생적 균주로부터 단리될 수 있다.
본 명세서의 목적에 있어서, 아미노산 치환은 예를 들어 M15T 로 지정될 수 있다. "M15T" 는 위치 15 에서의 메티오닌 (M) 잔기가 트레오닌 (T) 잔기로 치환된 것을 의미한다 (여기서, 아미노산은 당업계에 통상 공지된 1 글자 단어 약어로 지정됨).
야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 단백질 조작은 개선된 속성을 가질 수 있는 변이체 α-아밀라아제를 발생시킨다. 하나의 양상에서, 변이체 효소의 하나 이상의 아미노산 잔기는 랜덤하게 변형되고, 변형 효과는 변이체의 숙주 세포 발현 후 변이체의 성능 특성의 후속 분석 후에 측정된다. 또다른 양상에서, 변이체의 아미노산 서열에 대한 변형은 지침으로서 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제와 매우 유사한 구조를 가진 "모델" α-아밀라아제를 사용하여 조직적으로 만들어져, 변형 효과를 예상할 수 있다. 하나의 구현예에서, 모델 α-아밀라아제는 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제에 비해 개선되거나 바람직한 하나 이상의 특성을 갖는다. 예를 들어, 모델 α-아밀라아제는 보다 높은 특이적 활성, pH 의존성, 안정성, 저장성, 또는 칼슘 결합 항상성을 가질 수 있고, 또는 특히 유용한 기질 특이성 등을 가질 수 있다.
모델 α-아밀라아제가 변이체 α-아밀라아제의 아미노산 변화 디자인의 지침으로 사용되는 경우, 모델 α-아밀라아제의 잔기가 효소 성능에 기여한다는 것을 자세히 알 필요는 없다. 대신, 하나 이상의 아미노산, 심지어 전체 세트의 아미노산이, 모델 α-아밀라아제의 상응하는 아미노산(들) 에 대해 변이체 α-아밀라아제에서 변형된다. 이 경우 "상응하는" 아미노산은 1 차 아미노산 서열의 통상적인 배열에 의해 결정되는 것이 아니고, 2 가지 효소의 폴리펩티드 백본의 3D 구조 배열에 의해 결정된다. 그러므로 변이체에서 변형되는 아미노산은 예를 들어 효소 표면 상의 하전 잔기, 활성 부위 잔기, 또는 모델 효소에 독특한 특정 2 차 구조 요소에 기여하는 잔기로서 선택될 수 있다. 변형되는 잔기는 또한 2 가지 효소 사이에 보존된 3D 구조, 특히 보존된 2 차 구조 요소 (예를 들어, α-나선, β-평판, 회전) 를 해치지 않을 변형에 근거해서 선택될 수 있다.
예를 들어, 효소 표면 상의 전하 아미노산의 분포를 변화시키는 것은 효소의 속성을 변경시킬 수 있음이 알려져 있다. 예를 들어, [Russell et al., "Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge," Nature 328: 496-500 (1987)] 참조. 마찬가지로 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 표면 상의 하나 이상의 잔기는 변이체 α-아밀라아제의 효소 속성을 변경하도록 변형될 수 있으며, 변형 선택은 모델 α-아밀라아제의 표면 전하 분포에 의해 지도될 수 있다. 상기 목적을 위해, "표면 전하" 는 용매에 적어도 부분적으로 노출된 아미노산의 전하 측쇄에 의해 기여된다.
도 1 은 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 (RCSB Protein Data Bank, 접근 번호 PDB ID No. 1BLI 참조; 또한 GenBank Accession No. CAA01355 참조) 와 대표적 모델 α-아밀라아제, B. 서브틸러스 종 (B. subtilus sp.) 번호 707 α-아밀라아제의 3D 구조 배열을 보여준다. [Berman et al., "The Protein Data Bank," Nucl. Acids Res. 28: 235-242 (2000)] 참조. 분석을 위해, 접근 번호 PDB ID No. 1BLI 로 제시된 3D 구조를 성립하는데 사용된 서열로부터 3 개의 아미노산을 변형시켜 (즉 M15T, W138Y, 및 M197T), 구조는 PURASTAR® OxAm 에 사용되는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아와 동일할 것이다. B. 서브틸러스 종 (B. subtilus sp.) 번호 707 α-아밀라아제의 3D 구조는 RCSB Protein Data Bank 에서 접근 번호 PDB ID No. 1WPC (또한 Swissprot Accession No. P19571 참조) 로서 접근하였다.
배열 알고리즘, 예컨대 BRAGI (Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH) 또는 PyMOL (DeLano Scientific LLC) 은 2 개 효소의 3D 구조 사이에 최적 핏을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 프로그램은 원자 위치의 공간 거리의 루트 평균 제곱 (RMS) 편차를 최소화하기 위해 2 개 분자의 백본 원자를 반복하여 배열한다. 단백질 서열 배열로부터의 대표적 산출물은 도 2 에서 제시되고, 이것은 아랫줄에 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 서열 (GenBank Accession No. CAA01355) 및 윗줄에 B. 서브틸러스 종 (B. subtilus sp.) 번호 707 α-아밀라아제 (Swissprot 접근 번호 P19571) 를 보여준다. 2 개 서열 사이의 선 내의 별표는 동일한 3D 구조를 실질적으로 채택하는 백본 원자를 함유하는 잔기를 표시한다. 2 가지 효소는 α-나선, β-평판, 회전, 등과 같은 효소의 2 차 구조에서 강한 구조적 보존성을 보인다. 전체 분자에 대해, 효소 간의 편차의 RMS 는 0.55 Å 으로, 이것은 2 가지 효소의 결정 구조 측정에서 에러 한계의 절반 미만이다. 도 2 에서 제시되는 바와 같이, 93% 의 잔기가 2 가지 효소 사이에서 동일한 3D 구조를 채택하며, 이것은 2 가지 효소 사이의 1 차 서열에서의 % 동일성 (동일한 잔기는 강조되어 있음) 을 초과한다. 본 명세서의 목적을 위해, 동일한 3D 구조를 채택하는 잔기는 "구조적으로 보존되고," "구조적으로 본존된" 잔기는 2 개 구조 내에서 "상응하는" 잔기이다.
변이체 α-아밀라아제의 잔기는 3 가지 구조 도메인 중 하나에 속하는 것으로서 분류될 수 있고, 본원에서 도메인 A, B 및 C 라고 불린다. 본 명세서의 목적을 위해, 도메인 A 는 잔기 2 에서 105 및 잔기 208 에서 396 까지 확장되고; 도메인 B 는 잔기 106 에서 207 까지 확장되고; 도메인 C 는 잔기 397 에서 단백질 의 C 말단까지 확장된다. 아미노산은 또한 활성화 부위 잔기로서 분류될 수 있다. 활성화 부위 잔기는 적어도 위치 49, 52, 163, 167, 170, 172, 187, 188, 190, 238, 262, 264, 293, 297, 및 332-334 에 위치한다. 잔기 "위치" 는 도 2 중의 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 서열에 묘사된 바와 같이 넘버링된다.
변이체 α-아밀라아제에서, 하나 이상의 아미노산은 모델 α-아밀라아제에서 상응하는 아미노산에 대해 변형될 수 있다. 변형은 도메인에 의해 군집될 수 있고/있거나 효소의 표면 상에 하전되고 존재하는 아미노산에 의해 군집될 수 있다. 대안적으로는 또는 또한, 하나 이상의 활성 잔기에 변형이 이뤄질 수 있다. 상기 방식으로, 다중 아미노산 변형을 만드는 것이 가능하고, 이때 변형은 변이체 α-아밀라아제의 성능 특성에 예측가능한 효과를 갖는다. 예를 들어, 변이체는 모델 α-아밀라아제의 상응하는 잔기에 대해 변경된 하나 이상의 도메인에서 모든 표면 하전 잔기를 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, 변이체는 삽입 또는 결실된 잔기를 가질 수 있고, 예를 들어, 루프는 변이체의 폴리펩티드 백본이 모델 α-아밀라아제의 구조를 더욱 밀접하게 닮도록 삽입 또는 결실될 수 있다. 따라서, 변이체는 변이체가 α-아밀라아제 활성을 보유한다면 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70 개의 (또는 그 사이의 임의의 정수 값의) 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 변이체의 표면 전하는 또한 임의의 수로 변경될 수 있다. 예를 들어, 효소 표면 상의 양전하 아미노산 잔기의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 로 감소될 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 무엇보다도 변이체의 등전위점 (pI) 을 변경하기 위한 것으로 예상된다. 변이체의 다른 특징은 하기 기재된 바와 같이 야생형 효소와 상이할 수 있다.
따라서, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체의 제조 방법이 제공되며, 상기 변이체는 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제에 비해 하나 이상의 변경된 속성을 갖는다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) 야생형 α-아밀라아제를, 상기 야생형 α-아밀라아제에 비해 하나 이상의 바람직한 속성을 갖는 모델 α-아밀라아제의 구조와 비교하는 단계; (2) 모델 α-아밀라아제와 구조적으로 보존된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 하나 이상의 아미노산 또는 구조 영역을 확인하는 단계; (3) 상기 단계 (2) 에서 확인된 아미노산 잔기 또는 구조적 부분이 변형된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체를 구축하는 단계; 및 (4) 수득된 변이체 α-아밀라아제를 시험하여, 하나 이상의 바람직한 속성이 변이체 α-아밀라아제에 부여되었는지의 여부를 확인하는 단계.
상기 방법의 단계 (2) 에서 확인되는 구조는 하나의 아미노산 잔기로 구성될 수 있으나, 구조는 또한 효소의 하나 이상의 A, B, 또는 C 도메인 및/또는 활성화 부위에 위치하는 하나 초과의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 하나 초과의 아미노산은 여러 아미노산의 잔기가 예를 들어 변이체 α-아밀라아제로부터 첨가 또는 결실되는 곳에서처럼 연속될 수 있다. 아미노산 잔기 또는 구조 영역의 변형은 전형적으로 문제의 모 효소를 코딩하는 DNA 서열의 적합한 변형에 의해 달성된다. 변형은 아미노산 잔기 또는 구조 부분의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다.
하나의 구현예에서, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 하기 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다: K23N; Q26R; A33K; T49A; A52N; H68N; E82Q; K88N; H91K; R93N; D94G; D114L; T116R; D121N; A123N; D124N; R127Q; V128E; I129V; H133Y; L134T; K136E; H140Y; H142D; S148N; Y150H; D152N; H156R; T163V; E167Q; K170R; 위치 172 에서의 N 삽입 (즉, 172+N); Q178R; A181G; S187D; N188T; N190F; K213R; R214N; E222T; F238Y; E250S; K251A; E255N; Y262F; Q264K; H293Y; T297K; R305Q; K306N; K319H; G332E; Q333E; S334A; Q340E; T341E; TKGDSQREI 에서 IPTHGV--- 로의 위치 369-377 에서의 잔기의 치환 또는 결실 (여기서 실선은 결실을 나타냄); K389E; K392Q; Q393K; A398R; H400N; D416N; V419H; R437W; N444K; E447Q; H450S; E458G; E469N; 또는 H471S. 예를 들어 "K23N," 은 도 2 의 아랫줄에 제시된 서열을 갖는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 위치 23 에서의 리신 (K) 잔기가 변이체에서의 아스파라긴 (N) 잔기로 치환된 것을 의미한다.
α-아밀라아제 변이체는 또한 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 에 대해 내생이 아닌 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질, 또는 "잡종" 또는 "키메라 단백질," 일 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리펩티드 서열은 발현된 단백질의 정제를 용이하게 한다. 또다른 구현예에서, 이종 서열은 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 외의 상이한 속 또는 종으로부터 유래된 α-아밀라아제 폴리펩티드이다. 예를 들어, α-아밀라아제 변이체는 B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) 와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 또다른 바실러스 (Bacillus) α-아밀라아제의 신호 펩티드에 연결된 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체를 포함할 수 있다.
2.1. α- 아밀라아제 변이체 특징
효소 변이체는 핵산 및 폴리펩티드 서열, 상기 기재된 이의 3 차 구조, 및/또는 이의 특이적 활성에 의해 특징지어 질 수 있다. α-아밀라아제 변이체의 부가적인 특징에는 안정성, 칼슘 이온 (Ca2 +) 의존성, pH 범위, 산화 안정성 및 열안정성이 포함된다. 하나의 양상에서, 세정 제형 중의 α-아밀라아제 변이체는 보다 높은 특이적 활성을 가지며, 이것은 당업계에 공지된 표준 검정법을 사용하여 평가될 수 있다. 또다른 양상에서, 돌연변이는 특히 고온 (즉, 70 내지 120℃) 및/또는 극 pH (즉, pH 4.0 내지 6.0 또는 pH 8.0 내지 11.0), 및/또는 60 ppm 미만의 칼슘 농도에서 개선된 성능 특성을 나타낸다.
변경된 Ca2 + 안정성은 Ca2 + 고갈 (depletion) 하에서 효소의 안정성이 개선되었다는 것, 즉, 증가되거나 감소되었다는 것을 의미한다. 중요한 돌연변이에는 특히 고 pH (즉, pH 8.0 내지 10.5) 에서 Ca2 + 안정성을 변형시키는 것, 특히 Ca2 + 안정성을 개선시키는 것이 포함된다.
추가의 양상에서, 중요한 돌연변이는 세정 조성물에서 사용하기 위해, 특히 10 내지 60℃, 특히 20 내지 50℃, 더욱 특히 30 내지 40℃ 의 온도에서 변경된 특이적 안정성을 나타낸다. 제빵 제품에 있어서, 중요한 돌연변이는 좀더 높은 온도 범위에서 변경된 특이적 활성을 나타낼 수 있다.
α-아밀라아제 변이체는 또한 모 α-아밀라아제에 비해 변경된 산화 안정성, 특히 좀더 높은 산화 안정성을 가질 수 있다. 예를 들어, 증가된 산화 안정성은 세제 조성물에서 유리하고, 감소된 산화 안정성은 전분 당화용 조성물에서 유리할 수 있다.
변이체 α-아밀라아제는 야생형 α-아밀라아제보다 열안정성일 수 있다. 이러한 α-아밀라아제 변이체는 제빵 또는 승온을 필요로 하는 기타 방법에 사용하는데 유리하다. 예를 들어, 열안정성 α-아밀라아제 변이체는 약 55℃ 내지 약 80℃ 이상의 온도에서 전분을 분해할 수 있다. 열안정성 α-아밀라아제 변이체는 약 95 ℃ 이하의 온도에 노출 후에 활성을 유지할 수 있다.
본원에 기재된 α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 또한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상, 특히 약 55℃ 내지 약 95℃ 이상, 특히 약 80℃ 의 승온에서 모 효소에 비해 반감기를 확장시키는 돌연변이를 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, α-아밀라아제 변이체는 80℃ 이상에서 약 1 내지 10 분 동안 가열될 수 있다.
α-아밀라아제 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 외-특이성 지표에 의해 측정된 외-특이성을 가질 수 있다. α-아밀라아제 변이체에는 임의로 동일한 조건 하에서 측정되는 경우 이들이 유래되었던 모 효소 또는 폴리펩티드와 비교하여, 더 높은 또는 증가된 외-특이성을 갖는 것이 포함된다. 그러므로, 예를 들어, α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드에 비해 외-특이성 지표 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 500%, 1000%, 5000%, 10,000% 이상을 가질 수 있다.
하나의 양상에서, 핵산에 의해 코딩되는 α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 모 서열과 동일한 pH 안정성을 갖는다. 또다른 양상에서, 변이체는 효소의 최종 상업적 목적을 위해 pH 범위를 원하는 영역으로 옮기거나 더 큰 pH 안정성 범위를 부여하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 변이체는 약 pH 5.0 내지 약 pH 10.5 에서 전분을 분해할 수 있다. α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 동일한 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교해 더 긴 반감기 또는 더 높은 활성 (검정법에 따라) 를 가질 수 있고, 또는 α-아밀라아제 변이체는 모 폴리펩티드와 동일한 활성을 가질 수 있다. α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드는 또한 동일한 pH 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 이상의 반감기를 가질 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로는, 효소 변이체는 동일한 pH 조건 하에서 모 폴리펩티드와 비교해 보다 높은 특이적 활성을 가질 수 있다.
또다른 양상에서, 본원에 언급된 α-아밀라아제 변이체 중 임의의 것을 코딩하는 서열에 상보적인 핵산이 제공된다. 부가적으로 보체에 혼성화될 수 있는 핵산이 제공된다. 또다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 서열은 합성 서열이다. 여기에는 메탄올자화성 효모 피치아 (Pichia) 및 한세눌라 (Hansenula) 와 같은 숙주 유기체에서의 발현을 위한 최적 코돈을 사용하여 제작된 서열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
3. α- 아밀라아제 변이체의 생성
본원에 기재된 방법, 또는 당업계에 공지된 임의의 대안적인 방법에 의해 제조된 효소 변이체를 코딩하는 DNA 서열은 적합한 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 임의로 억제자 유전자 또는 다양한 활성자 유전자를 코딩하는 조절 서열을 전형적으로 포함하는 발현 벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.
3.1. 벡터
α-아밀라아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 벡터가 도입되게 되는 숙주 세포에 따라 다를 것이다. 그러므로, 벡터는 자발적 복제 벡터, 즉, 염색체외 실재로서 존재하는 벡터, 염색체 복제와 독립적인 복제, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체외 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 대안적으로는, 벡터는 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포 게놈에 통합되고 통합된 염색체(들) 과 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 통합된 유전자는 또한 항생제 선별 또는 기타 선별압에 의해 제작된 증폭가능 구축물, 예컨대 필수 조절 유전자의 사용 또는 필수 대사 경로 유전자의 용량 효과를 통한 상보성에 의해 염색체에서 유전자의 다중 카피를 제작하기 위해 증폭될 수 있다.
전형적으로 발현 벡터에는 클로닝 벡터의 성분, 예를 들어, 선별 목적을 위해, 선별된 숙주 유기체 및 하나 이상의 표현형적으로 검출가능한 마커 중 벡터의 자동 복제를 허용하는 요소가 포함된다. 통상 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호 및 임의로, 억제자 유전자 또는 하나 이상의 활성자 유전자를 코딩하는 조절 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 하나의 양상에서, 사용된 모든 신호 서열은 효소 수집 및 임의로 정제를 용이하게 하기 위한 세포 배양 배지에 대한 물질을 표적한다. α-아밀라아제 변이체, 프로모터, 종결자 및 기타 요소 각각을 코딩하는 DNA 구축물을 라이게이션 시키는데, 그리고 이들을 복제에 필요한 정보를 담고 있는 적합한 벡터내로 도입하는데 사용되는 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989 및 3rd ed., 2001 참조).
벡터에서, DNA 서열은 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포에 상동 또는 이종인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. α-아밀라아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열의 전사를, 특히 박테리아 숙주에서 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예는, E. 콜라이 (E. coli) 의 lac 오페론의 프로모터, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 (Streptomyces coelicolor) 아가라아제 유전자 dagA 또는 celA 프로모터, 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) α-아밀라아제 유전자 (amyL) 의 프로모터, 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus) 말토오스 생성 아밀라아제 유전자 (amyM) 의 프로모터, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) α-아밀라아제 (amyQ) 의 프로모터, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자의 프로모터 등이다. 진균류 숙주에서의 전사를 위해, 유용한 프로모터의 예는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 아스파르트산 프로테이나아제, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 중성 α-아밀라아제, A. 니게르 (A. niger) 산 안정성 α-아밀라아제, A. 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제, 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파아제, A. 오리자에 (A. oryzae) 알칼리성 프로테아제, A. 오리자에 (A. oryzae) 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 또는 A. 니둘란스 (A. nidulans) 아세타미다아제를 코딩하는 유전자로부터 유래된 것들이다. α-아밀라아제 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 E. 콜라이 (E. coli) 와 같은 박테리아 종에서 발현되는 경우, 적합한 프로모터는, 예를 들어 T7 프로모터 및 파지 람다 프로모터를 비롯한 박테리오파지 프로모터로부터 선택될 수 있다. 효모 종에서의 발현에 적합한 프로모터의 예에는 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 의 Gal 1 및 Gal 10 프로모터 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 에서의 발현을 위해, CBHII 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
또한 발현 벡터는 적합한 전사 종결자 및, 진핵생물에서는 α-아밀라아제 변이체를 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 종결 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 동일한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 벡터는 의문의 숙주 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, pICatH, 및 pIJ702 의 복제 기원이다.
또한 벡터는 선별가능 마커, 예를 들어, 숙주 세포에서 결점을 보완하는 생성물을 생성하는 유전자, 예컨대 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 또는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 로부터의 dal 유전자, 또는 항생제 내성 예컨대, 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 게다가, 벡터는 amdS, argB, niaD 및 xxsC 와 같은 아스페르길루스 (Aspergillus) 선별 마커를 포함할 수 잇으며, 마커는 하이그로마이신 내성을 부여하거나, 선별은 당업계에 공지된 바와 같은 공동-형질전환에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 91/17243 참조.
3.2. 변이체 발현 및 숙주 유기체
세포내 발현 또는 고체 상태 발효가 일부 양상에서 유리할 수 있으나 (예를 들어, 숙주 세포로서 특정 박테리아 또는 진균을 사용하는 경우), 일반적으로, 변이체의 발현은 세포외적이고, 배양 배지 내로 이루어진다면 유리하다. 일반적으로, 본원에 언급된 바실러스 (Bacillus) α-아밀라아제는 배양 배지 내로 발현된 프로테아제의 분비가 가능한 신호 서열을 포함한다. 원하는 경우, 상기 신호 서열은 각 신호 서열을 코딩하는 DNA 서열의 치환에 의해 편리하게 달성되는, 상이한 신호 서열에 의해 대체될 수 있다. 신호 서열은 전형적으로는 3 개의 도메인, N-말단 도메인, H-도메인, 및 C-말단 도메인을 갖는 것을 특징으로 하고, 길이 가 18 내지 35 개의 잔기 범위이다.
성숙 단백질은 또다른 바실러스 종 (Bacillus sp.) 으로부터 또는 모 서열과 동일한 종으로부터 유래되는 전-단백질에 대한, 처음에는 융합 단백질의 형태일 수 있다. B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 에서 단백질을 분비하기 위해, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 신호 펩티드가 종종 사용되지만; 기타 바실러스 (Bacillus) α-아밀라아제로부터의 신호 단백질이 또한 치환될 수 있다.
DNA 구축물 또는 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포는, 유리하게는 α-아밀라아제 변이체의 재조합 생성에 숙주 세포로서 사용된다. 세포는 편리하게는 숙주 염색체 내에 DNA 구축물 (하나 이상의 카피) 을 통합하여, 변이체를 코딩하는 DNA 구축물로 형질전환될 수 있다. 상기 통합은 일반적으로는 DNA 서열이 세포내에 안정적으로 유지되는 것 같다면 유리한 것으로 고려된다. 숙주 염색체 내로의 DNA 구축물의 통합은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 상동 또는 이종 재조합에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로는, 세포는 상이한 유형의 숙주 세포와 관련해 상기 기재된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
적합한 박테리아 숙주 유기체의 예는 그람 양성 박테리아 종, 예컨대 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 메가테리움 (B. megaterium), 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 를 비롯한 바실라세아에 (Bacillaceae); 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종, 예컨대 S. 뮤리너스 (S. murinus); L. 락티스 (L. lactis) 와 같은 락토코쿠스 종 (Lactococcus spp.) 을 비롯한 락트산 박테리아 종; L. 류테리 (L. reuteri) 를 비롯한 락토바실러스 종 (Lactobacillus spp.); 류코노스토크 종 (Leuconostoc spp.); 페디오코쿠스 종 (Pediococcus spp.); 및 스트렙토코쿠스 종 (Streptococcus spp.) 이다. 대안적으로는, E. 콜라이 (E. coli) 를 비롯한 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae), 또는 슈도모나다세아에 (Pseudomonadaceae) 에 속하는 그람 음성 박테리아 종의 균주가 숙주 유기체로서 선택될 수 있다.
적합한 효모 숙주 유기체는 효모 종, 예컨대 피샤 종 (Pichia sp.), 한세눌라 종 (Hansenula sp.), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로위니아 (Yarrowinia) 종, S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 를 비롯한 사카로마이세스 (Saccharomyces) 의 종 또는 S. 폼베 (S. pombe) 와 같은 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 에 속하는 종과 같으나 이에 제한되지 않는 생물공학적으로 관련된 효모 종으로부터 선택될 수 있다. 메틸영양 효모 종의 균주 피샤 파스토리스 (Pichia pastoris) 는 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 대안적으로는, 숙주 유기체는 한세눌라 (Hansenula) 종일 수 있다. 사상 진균 중 적합한 숙주 유기체에는 아스페르길루스 (Aspergillus) 의 종, 예를 들어, A. 니게르 (A. niger), A. 오리자에 (A. oryzae), A. 투비겐시스 (A. tubigensis), A. 아와모리 (A. awamori), 또는 A. 니둘란스 (A. nidulans) 가 포함된다. 대안적으로는, 푸사리움 (Fusarium) 종, 예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 또는 리조무코르 (Rhizomucor) 종, 예컨대 R. 미에헤이 (R. miehei) 의 균주가 숙주 유기체로서 사용될 수 있다. 기타 적합한 효모에는 테르모마이세스 (Thermomyces) 및 무코르 (Mucor) 종이 포함된다. 진균 세포는 당업계에 공지된 방식으로 원형질체 형성 및 원형질체 형질전환 후 세포벽의 재생을 포함하는 방법에 의해 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주 세포의 형질전환에 적합한 절차에는 예를 들어 EP 238023 에 기재된 것이 포함된다.
또다른 추가의 양상에서, α-아밀라아제 변이체의 제조 방법은 변이체의 생성에 도움이 되는 조건하에서 상기 기재된 숙주 세포를 배양하고, 세포 및/또는 배양 배지로부터 효소를 회수하는 것을 포함하여 제공된다. 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 문제의 숙주 세포를 성장시키고 α-아밀라아제 변이체의 발현을 수득하는데 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지 및 배지 성분은 시판 공급처에서 입수가 가능하거나, 공개된 처방에 따라 (예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 의 카달로그에 기재된 바와 같이) 제조할 수 있다. 예시적인 배양 배지에는 하기 제공되는 실시예에서 사용되었던 삼천 리터 (3,000 L) 교반 탱크 발효기에서 수행되는 공급식-배치 발효용 배지가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 사용된 배지는 사용되는 숙주 세포에 가장 적합한 것, 예를 들어 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 를 배양하기 위해 하기 논의되는 배지일 것이다. 이러한 경우 성장 배지는 유기 화합 물의 공급원으로서 옥수수 침지 고체 및 대두분과 함께 나트륨, 칼륨, 포스페이트, 마그네슘 및 술페이트의 공급원으로서 무기 염 및 미량 원소로 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 탄수화물 공급원, 예컨대 글루코오스는 또한 초기 배지의 일부이다. 배양이 스스로 성립되고 성장하기 시작하면, 배양을 지속시키기 위해 탱크 내에서 탄수화물을 당업계에 공지된 바와 같이 측정한다. 예를 들어 비색계 검정법을 사용하여 효소 적정 농도를 측정하기 위해 일정한 간격으로 발효기로부터 샘플을 제거한다. 측정에 따라 효소 생산 속도가 증가하는 것이 멈출 때 발효 공정을 중단한다.
숙주 세포로부터 분비된 α-아밀라아제 변이체는 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 분리하고, 암모늄 술페이트와 같은 염에 의해 배지의 단백질 성분을 침전시킨 후, 크로마토그래피 절차, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 사용하는 것을 포함하는, 잘 공지된 절차에 의해 배양 배지로부터 편리하게 회수될 수 있다.
숙주 세포는 α-아밀라아제 변이체 단백질의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 단백질의 발현은 지속적으로 생성되거나, 발현 개시에 대한 자극을 필요로 하는 유도성인 식으로 구조적일 수 있다. 유도성 발현의 경우, 단백질 생성은 예를 들어, 배양 배지에 유도자 성분을 (예를 들어 덱사메타손 또는 IPTG 또는 Sepharose) 첨가하여 필요할 때 개시될 수 있다. 또한 폴리펩티드는 TnT™ (Promega) 토끼 망상적혈구 시스템과 같은, 시험관 내 무세포 시스템에서 재조합적으로 생성될 수 있다.
α-아밀라아제 변이체를 발현하는 숙주는 또한 호기성 조건 하에서, 숙주에 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 교반 또는 진탕과 통기의 조합이 제공될 수 있으며, 숙주의 요구 및 바람직한 α-아밀라아제 변이체의 생성에 따라, 숙주에 적합한 온도, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 75℃ 에서 생성된다. 배양은 약 12 내지 약 100 시간 이상 (및 그 사이의 임의의 시간 값) 또는 더욱 특히 24 내지 72 시간에서 일어날 수 있다. 전형적으로는, 배양 브로스의 pH 는 약 5.5 내지 약 8.0 이며, 또한 α-아밀라아제 변이체의 제조에 관해 숙주 세포가 필요로 하는 배양 조건에 따라 다를 수 있다.
4. α- 아밀라아제 변이체의 정제
발효, 분리 및 농축 기술이 당업계에 잘 알려져 있으며, 농축된 α-아밀라아제 변이체 함유 용액을 제조하기 위해 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 발효 후, 발효 브로스를 수득하고, 잔류 생 발효 물질을 비롯한 미생물 세포 및 다양한 현탁 고체를, 아밀라아제 용액을 수득하기 위해 통상적인 분리 기술에 의해 제거한다. 여과, 원심분리, 초여과, 회전 진공 드럼 여과, 초여과, 원심분리 후 초여과, 추출 또는 크로마토그래피, 등이 일반적으로 사용된다.
미농축 용액의 사용은 정제된 α-아밀라아제 변이체 함유 침전물을 수집하기 위해 인큐베이션 시간을 증가시켜야 할 필요가 있으므로, 회수를 최적화하기 위해 α-아밀라아제 변이체 함유 용액을 농축하는 것이 바람직하다. 용액은 원하는 효소 수준이 달성될 때까지 통상적인 농축 기술을 사용하여 농축될 수 있다. 효소 변이체 함유 용액의 농축은 상기 논의된 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 회전 진공 증발 및/또는 초여과가 사용된다. 대안적으로는 초여과가 사용될 수 있다.
정제를 목적으로 하는 "침전제" 는 그의 성분이 고체 형태의 농축된 효소 변이체 용액으로부터 α-아밀라아제 변이체를 침전시키는데 유효한 화합물을 의미한다 (즉 특성이 결정질, 비결정질 또는 둘의 혼화물일 수 있는지의 여부와는 관계없다). 침전은 예를 들어, 금속 할라이드 침전제를 사용하여 수행될 수 있다. 금속 할라이드 침전제에는 알칼리 금속 클로라이드, 알칼리 금속 브로마이드 및 상기 금속 할라이드의 2 가지 이상의 혼화물이 포함된다. 금속 할라이드는 염화나트륨, 염화칼륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨 및 상기 금속 할라이드의 2 가지 이상의 혼화물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 금속 할라이드에는 염화나트륨 및 염화칼륨이 포함되고, 특히 염화나트륨의 경우, 이것은 또한 방부제로서 사용될 수 있다.
금속 할라이드 침전제는 α-아밀라아제 변이체를 침전시키는데 유효한 양으로 사용된다. 효소 변이체의 침전에 유효한 금속 할라이드의 적어도 유효한 양 및 최적 양 뿐 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 α-아밀라아제 변이체의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 통상의 시험 후에 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
일반적으로, 약 5% w/v (중량/부피) 이상 내지 약 25% w/v 의 금속 할라이드를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 8% w/v 이상임). 일반적으로, 약 25% w/v 이하의 금속 할라이드를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 20% w/v 이하임). 금속 할라이드 침전제의 최적 농도는 그 중에서도, 특이적 α-아밀라아제 변이체의 특성 및 농축 α-아밀라아제 변이체 용액에서의 그의 농도에 따라 다를 것이다.
효소의 침전에 영향을 주는 또다른 대안은 농축 효소 변이체 용액에 첨가될 수 있는 유기 화합물을 사용하는 것이다. 유기 화합물 침전제의 예에는 4-히드록시벤조산, 4-히드록시벤조산의 알칼리 금속 염, 4-히드록시벤조산의 알킬 에스테르, 및 2 가지 이상의 상기 유기 화합물의 혼화물이 포함될 수 있다. 상기 유기 화합물 침전제의 첨가는 금속 할라이드 침전제의 첨가 전, 이와 동시에 또는 그 후에 일어날 수 있고, 두 가지 침전제인 유기 화합물 및 금속 할라이드의 첨가는 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 추가의 기재를 위해 예를 들어, Genencor 의 미국 특허 제 5,281,526 호를 참조한다.
일반적으로, 유기 화합물 침전제는 4-히드록시벤조산의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 또는 칼륨염, 및 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 12 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 유기 화합물 침전제는 예를 들어 4-히드록시벤조산의 선형 또는 분지형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 10 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물일 수 있다. 적합한 유기 화합물에는 4-히드록시벤조산의 선형 알킬 에스테르 (여기서 알킬기는 탄소수가 1 내지 6 임), 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물이 포함된다. 4-히드록시벤조산의 메틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 프로필 에스테르, 4-히드 록시벤조산의 부틸 에스테르, 4-히드록시벤조산의 에틸 에스테르 및 상기 유기 화합물의 2 가지 이상의 혼련물이 또한 사용될 수 있다. 부가적인 유기 화합물에는 또한 4-히드록시벤조산 메틸 에스테르 (메틸 파라벤 (PARABEN) 으로 불림) 및 4-히드록시벤조산 프로필 에스테르 (프로필 파라벤 (PARABEN) 으로 불림) (또한 둘다 아밀라아제 방부제임) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기 화합물 침전제의 첨가는 pH, 온도, α-아밀라아제 변이체 농도, 침전제 농도, 및 인큐베이션 시간에 대해 침전 조건의 높은 융통성의 장점을 제공한다.
유기 화합물 침전제는 금속 할라이드 침전제에 의해 효소 변이체의 침전을 개선하기에 유효한 양으로 사용된다. 유기 화합물 침전제의 적어도 유효한 양 및 최적 양 뿐 아니라, 인큐베이션 시간, pH, 온도 및 효소 변이체의 농도를 비롯한 최대 회수를 위한 침전 조건의 선택은, 통상의 시험 후에 본 명세서의 견지에서, 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
일반적으로, 약 0.01% w/v 이상의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 0.02% w/v 이상임). 일반적으로, 약 0.3% w/v 이하의 유기 화합물 침전제를 농축 효소 변이체 용액에 첨가한다 (통상 약 0.2% w/v 이하임).
금속 할라이드 침전제, 및 하나의 양상에서, 유기 화합물 침전제를 함유하는 농축 효소 변이체 용액은, 필요한 경우 정제되는 효소 변이체에 따라 pH 가 조정된다. 일반적으로, pH 는 아밀라아제의 등전위점 (pI) 근처의 수준으로 조정된 다. 예를 들어, pH 는 등전위점 (pI) 약 2.5 pH 단위 미만 내지 등전위점 약 2.5 pH 단위 초과의 범위의 pH 로 조정될 수 있다. 설명하자면, α-아밀라아제 변이체가 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 유래인 경우, 농축 효소 변이체 용액은 통상 pH 약 5.5 내지 9.7, 특히 pH 약 6.5 내지 9.0 로 조정된다. 변이체의 pI 가 야생형의 pI 와 상이한 경우 pH 가 따라서 조정될 수 있다.
정제된 효소 변이체 침전물을 수득하기에 필요한 인큐베이션 시간은 특이적 효소 변이체의 특성, 효소의 농도, 및 특이적 침전제(들) 및 그의 농도에 따라 다르다. 일반적으로, 효소 변이체를 침전시키는데 유효한 시간은 약 1 내지 약 30 시간이고; 통상 이것은 약 25 시간을 초과하지 않는다. 유기 화합물 침전제의 존재하에서, 인큐베이션 시간은 여전히 약 10 시간 미만으로, 대부분의 경우는 심지어 약 6 시간으로 감소될 수 있다.
일반적으로, 인큐베이션 동안의 온도는 약 4℃ 내지 약 50℃ 이다. 통상, 상기 방법은 약 10℃ 내지 약 45℃, 특히 약 20℃ 내지 약 40℃ 의 온도에서 수행된다. 침전 유도를 위한 최적 온도는 사용되는 용액 조건 및 효소 변이체 또는 침전제(들) 에 따라 다르다.
정제 효소 변이체 침전물의 전체적인 회수 및, 방법이 수행되는 효율은 효소 변이체, 첨가된 금속 할라이드 및 첨가된 유기 화합물을 포함하는 용액을 진탕하여 향상된다. 진탕 단계는 금속 할라이드와 유기 화합물의 첨가 동안, 및 연이은 인큐베이션 기간 동안에 수행된다. 적합한 진탕법에는 기계적 교반 또는 쉐이킹, 강한 진탕 또는 임의의 유사한 기술이 포함된다.
인큐베이션 기간 후, 그 다음 정제된 효소 변이체를 분리된 안료 및 기타 불순물로부터 분리하고, 통상의 분리 기술, 예컨대 여과, 원심분리, 정밀여과, 회전 진공 여과, 초여과, 압축 여과, 십자 막 정밀여과, 십자 흐름 막 정밀여과, 등에 의해 수집한다. 십자 막 정밀여과가 사용되는 하나의 방법일 수 있다. 정제된 효소 변이체 침전물의 추가 정제는 침전물을 물로 세정하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 정제된 효소 변이체 침전물을 금속 할라이드 침전제를 함유하는 물, 또는 예를 들어 금속 할라이드와 유기 화합물 침전제를 함유하는 물로 세정한다.
배양 동안, 열안정성 아밀라아제가 배양 브로스에 세포외적으로 축적된다. 바람직한 α-아밀라아제 변이체의 단리 및 정제를 위해, 배양 브로스를 원심분리 또는 여과하여 세포를 제거하고, 산출된 무세포 액체는 효소 정제에 사용된다. 하나의 구현예에서, 무세포 브로스를 약 70% 포화 암모늄 술페이트를 사용하여 염석 (salting out) 에 적용하고; 그 다음 70% 포화-침전 분획을 완충액에 용해하고, Sephadex G-100 컬럼과 같은 컬럼에 적용하고, 용리하여 효소 변이체 활성 분획을 회수한다. 추가 정제를 위해, 통상의 절차, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
정제된 효소 변이체는 효소 변이체가 일반적으로 이용되는 모든 적용에 유용하다. 예를 들어, 이들은 세탁 세제 및 오염 제거제, 식품 산업, 전분 가공 및 제빵, 및 소화 보조제로서 약학 조성물에 사용될 수 있다. 이들은 액체 (용액, 슬러리) 또는 고체 (과립, 분말) 인 최종 생성물로 제조될 수 있다.
대안적으로는, 효소 생성물은 회수될 수 있고, 효소의 추가 정제 없이 여과 또는 원심분리에 의해 세포 및 세포 데브리스를 제거하기 위해 플록킹제 (floccing agent) 가 배지에 첨가된다.
상기된 방법에 의해 제조되고 정제되는 α-아밀라아제 변이체는 다양한 유용한 산업적 적용에 사용될 수 있다. 변이체는 섬유 & 생활 캐어 (F&HC) 와 관련된 적용을 용이하게 하는 가치있는 속성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 세척, 식기 세정 및 경질-표면 세정 세제 조성물 중의 성분으로서 사용될 수 있다. 변이체는 또한 전분으로부터 감미제 및 에탄올의 제조에, 및/또는 직물 발호에 유용하다. 변이체 α-아밀라아제는 특히 예를 들어, WO 2005/111203 및 미국 공개 출원 번호 2006/0014265 (Genencor International, Inc.) 에 기재되는 바와 같은 전분 액화 및/또는 당화 공정을 비롯한 전분-전환 공정에서 특히 유용하다. α-아밀라아제 변이체의 이러한 다양한 용도는 하기에 더욱 상세히 기재된다.
5. 세정 및 식기세정 조성물 및 용도
본원에 논의된 α-아밀라아제 변이체는 예를 들어 식기 세정 또는 기타 세정 조성물에 사용하기 위해 세제 조성물로 제형화될 수 있다. 이들은 젤, 분말 또는 액체일 수 있다. 조성물은 α-아밀라아제 변이체를 단독으로, 기타 녹말가수분해 효소, 기타 세정 효소, 및 세정 조성물에 통상인 기타 성분을 포함할 수 있다. 그러므로, 식기세정 세제 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양쪽이온성이거나 이러한 유형의 혼합물일 수 있다. 세제는 저-발포 내지 비-발포의 에톡실화 프로폭실화 직쇄 알코올과 같은 비이온성 계면활성제 0% 내지 약 90 중량% 를 함유할 수 있다.
세제 적용에서, α-아밀라아제 변이체는 통상 프로필렌 글리콜 함유 액체 조성물에 사용된다. α-아밀라아제 변이체는 예를 들어 10% 염화칼슘을 함유하는 프로필렌 글리콜 용액 25% 부피/부피에 순환시켜 프로필렌 글리콜에 가용화된다.
세제 조성물은 무기 및/또는 유기 유형의 세제 강화제 염을 함유할 수 있다. 세제 강화제는 인-함유 및 비-인-함유 유형으로 다시 나뉠 수 있다. 세제 조성물은 통상 세제 강화제 약 1% 내지 약 90% 를 함유한다. 인-함유 무기 알칼리 세제 강화제의 예에는, 존재하는 경우, 수용성 염, 특히 알칼리 금속 파이로포스페이트, 오르토포스페이트, 및 폴리포스페이트가 포함된다. 인-함유 유기 알칼리 세제 강화제의 예에는, 존재하는 경우, 포스포네이트의 수용성 염이 포함된다. 비-인-함유 무기 강화제의 예에는, 존재하는 경우, 수용성 알칼리 금속 카르보네이트, 보레이트 및 실리케이트 뿐 아니라 다양한 유형의 수불용성 결정형 또는 무정형 알루미노 실리케이트가 포함되며, 이 중 제올라이트가 가장 잘 알려진 대표 물질이다.
적합한 유기 강화제의 예에는 알칼리 금속; 암모늄 및 치환된 암모늄; 시트레이트; 숙시네이트; 말로네이트; 지방산 술포네이트; 카르복시메톡시 숙시네이트; 암모늄 폴리아세테이트; 카르복실레이트; 폴리카르복실레이트; 아미노폴리카르복실레이트; 폴리아세틸 카르복실레이트; 및 폴리히드록시술포네이트가 포함된다.
기타 적합한 유기 강화제에는 강화 특성을 갖는 것으로 알려진 고급 분자량 중합체 및 공중합체, 예를 들어 적합한 폴리아크릴산, 폴리말레산 및 폴리아크릴산/폴리말레산 공중합체, 및 그의 염이 포함된다.
세정 조성물은 염소/브롬-유형 또는 산호-유형의 표백제를 함유할 수 있다. 무기 염소/브롬-유형 표백제의 예는 리튬, 나트륨 또는 칼슘 하이포클로라이트, 및 하이포브로마이트 뿐 아니라 염소화 트리나트륨 포스페이트이다. 유기 염소/브롬-유형 표백제의 예는 헤테로환형 N-브로모- 및 N-클로로-이미드, 예컨대 트리클로로이소시아누산, 트리므로모이소시아누산, 이브로모이소시아누산, 및 디클로로이소시아누산, 및 칼륨 및 나트륨과 같은 수용성 양이온과의 이의 염이다. 히단토인 화합물이 또한 적합하다.
세정 조성물은 산소 표백제를, 예를 들어 무기 과산의 형태, 임의로 표백 전구체로, 또는 퍼옥시 산 화합물로서 함유할 수 있다. 적합한 퍼옥시 표백제 화합물의 전형적인 예는 알칼리 금속 퍼보레이트 (테트라히드레이트 및 모노히드레이트 모두), 알칼리 금속 퍼카르보네이트, 퍼실리케이트 및 퍼포스페이트이다. 예시적인 활성화제 물질에는 테트라아세틸에틸렌디아민 (TAED), 및 글리세롤 트리아세테이트가 포함된다. 효소 표백 작용 시스템은 또한 예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 2005/056783 에 기재된 바와 같이 예를 들어, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트, 글리세롤 트리아세테이트 및 퍼히드롤라아제와 같이 존재할 수 있다.
세정 조성물은 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산 또는 붕산 유도체 (예를 들어, 방향족 보레이트 에스테르) 와 같은 폴리올과 같은 효소(들) 에 대한 통상의 안정화제를 사용하여 안정화될 수 있다. 세정 조성물은 또한 기타 통상의 세제 성분, 예를 들어 해교제 (deflocculant) 물질, 충전제 물질, 발포 억제제, 부식방지제, 오염 현탁화제, 격리제, 오염 재침작 방지제, 탈수제, 염료, 살균제, 형광제, 증점제 및 향수를 함유할 수 있다.
마지막으로, α-아밀라아제 변이체는 통상의 식기세정 세제에, 예를 들어, 본원에 기재된 α-아밀라아제 변이체가 하기 열거되는 특허 및 공개 출원 내의 임의의 α-아밀라아제 대신 또는 이에 더해 사용되는 것을 고려하여, 하기 특허 공보에 기재된 세제 중 임의의 것에 사용될 수 있다: CA 2006687, GB 2200132, GB 2234980, GB 2228945, DE 3741617, DE 3727911, DE 4212166, DE 4137470, DE 3833047, DE 4205071, WO 93/25651, WO 93/18129, WO 93/04153, WO 92/06157, WO 92/08777, WO 93/21299, WO 93/17089, WO 93/03129, EP 481547, EP 530870, EP 533239, EP 554943, EP 429124, EP 346137, EP 561452, EP 318204, EP 318279, EP 271155, EP 271156, EP 346136, EP 518719, EP 518720, EP 518721, EP 516553, EP 561446, EP 516554, EP 516555, EP 530635, EP 414197, 및 미국 특허 제 5,112,518 호, 미국 특허 제 5,141,664 호, 및 미국 특허 제 5,240,632 호.
6. 세탁 세제 조성물 및 용도
구현예에 따르면, 하나 이상의 α-아밀라아제 변이체는 전형적으로 세제 조성물의 성분일 수 있다. 이처럼, 이것은 비분진 과립, 안정화된 액체, 또는 보호된 효소의 형태로 세제 조성물에 포함될 수 있다. 비분진 과립은 미국 특허 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 기재되는 바와 같이 제조될 수 있고, 임의로 당업계에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실 화 지방 알코올 (여기서 알코올의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 있음); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 특허 번호 1483591 에 제시된다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 수립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 기타 효소 안정화제는 당업계에 잘 알려져 있다. 보호된 효소는 예를 들어 US 5,879,920 (Genencor Int'l, Inc.) 또는 EP 238216 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다. 폴리올은 단백질의 안정화제 뿐 아니라, 단백질 가용성 개선용으로서 인지되어 왔고, 예를 들어, [Kaushik et al., "Why is trehalose an exceptional protein stabilizer? An analysis of the thermal stability of proteins in the presence of the compatible osmolyte trehalose" J. Biol. Chem. 278: 26458-65 (2003)] 및 여기에 언급된 참조; 및 [M. Conti et al., "Capillary isoelectric focusing: the problem of protein solubility," J. Chromatography 757: 237-245 (1997)] 를 참조한다.
세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어 젤, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는, 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있고, 또한 약 30% 물만을 함유하는 컴팩트 젤 유형의 형태일 수 있다.
세제 조성물은 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 이들 각각은 음이온성, 비이온성, 양이온성 또는 양쪽이온성일 수 있다. 세제는 통상 0% 내지 약 50% 의 음이온성 계면활성제, 예컨대 선형 알킬벤젠술포네이트 술포네이트 (LAS); α-올레핀술포네이트 (AOS); 알킬 술페이트 (지방 알코올 술페이트) (AS); 알코올 에톡시술페이트 (AEOS 또는 AES); 2차 알칸술포네이트 (SAS); α-술포 지방산 메틸 에스테르; 알킬- 또는 알케닐숙신산; 또는 비누를 함유할 것이다. 조성물은 또한 0% 내지 약 40% 의 비이온성 계면활성제, 예컨대 알코올 에톡실레이트 (AEO 또는 AE), 카르복실화 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 또는 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 (예를 들어 WO 92/06154 에 기재된 바와 같음) 를 함유할 수 있다.
세제 조성물은 부가적으로는 하나 이상의 기타 효소, 예컨대 리파아제, 큐티나아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 및/또는 락카아제를 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
세제는 약 1% 내지 약 65% 의 세제 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층 실리케이트 (예를 들어, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다. 세제는 또한 미강화 (unbuilt), 즉 본질적으로 세제 강화제가 없는 것일 수 있다. 효소는 효소의 안정성과 상용성인 임의의 조성물로 사용될 수 있다. 효소는 일반적으로 공지 된 형태의 캡슐화, 예를 들어, 히드로겔 내에 과립화 또는 격리에 의해 유해한 성분에 대해 보호될 수 있다. 효소, 및 구체적으로 α-아밀라아제는 전분 결합 도메인의 유무와 관계없이, 세탁 및 식기세정 적용 뿐 아니라, 표면 세정제 및 전분 또는 바이오매스로부터의 에탄올 생성을 위한 조성물에 사용될 수 있다.
세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예에는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리카르복실레이트, 예컨대 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체가 포함된다.
세제는 과산 (peracid)-형성 표백 활성화제, 예컨대 TAED 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트 (NOBS) 와 임의로 조합되는, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트와 같은 H2O2 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 대안적으로는, 표백 시스템은 예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 효소 표백 시스템, 예를 들어, 퍼히드롤라아제, 예컨대 WO 2005/056783 에 기재된 것일 수 있다.
세제 조성물의 효소는 통상의 안정화제, 예를 들어 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤; 당 또는 당 알코올; 락트산; 붕산 또는 붕산 유도체, 예컨대, 방향족 보레이트 에스테르를 사용하여 안정화될 수 있고; 조성물은 예를 들어, WO 92/19709 호 및 WO 92/19708 호에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.
또한 세제는 기타 통상의 세제 성분, 예컨대 예를 들어, 점토를 비롯한 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 부식방지제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 변색 억제제, 형광 증백제, 또는 향수를 함유할 수 있다. pH (사용 농도로 수용액에서 측정됨) 는 통상 중성 또는 알칼리성, 예를 들어 pH 약 7.0 내지 약 11.0 이다.
α-아밀라아제 변이체는 세제에 통상 사용되는 농도로 혼입될 수 있다. 현재, 세제 조성물에, α-아밀라아제 변이체가 액체 리터 당 α-아밀라아제 변이체 0.00001-1.0 mg (순소 효소 단백질로서 계산됨) 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다. α-아밀라아제 변이체를 포함하는 세제 조성물의 특정 형태는 하기를 포함하는 것으로 제형화될 수 있다:
(1) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로서 계산됨) 약 7% 내지 약 12%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C12 -18 알코올, 1-2 에틸렌 옥시드 (EO)) 또는 알킬 술페이트 (예, C16 -18) 약 1% 내지 약 4%; 알코올 에톡실레이트 (예, C14 -15 알코올, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 14% 내지 약 20%; 가용성 실리케이트 약 2 내지 약 6%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 15% 내지 약 22%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 0% 내지 약 6%; 나트륨 시트레이트/시트르산 (예, C6H5Na3O7/C6H8O7) 약 0% 내지 약 15%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO3H2O) 약 11% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 6%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 및 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소로서 계산됨) 0.0001-0.1% 단백질; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제, 광표백제) 0-5%.
(2) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 11%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C12 -18 알코올, 1-2 EO) 또는 알킬 술페이트 (예, C16 -18) 약 1% 내지 약 3%; 알코올 에톡실레이트 (예, C14 -15 알코올, 7 EO) 약 5% 내지 약 9%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 15% 내지 약 21%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 24% 내지 약 34%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 약 4% 내지 약 10%; 나트륨 시트레이트/시트르산 (예, C6H5Na3O7/C6H8O7) 0% 내지 약 15%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-6%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.
(3) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 5% 내지 약 9%; 알코올 에톡실레이트 (예, C12 -15 알코올, 7 EO) 약 7% 내지 약 14%; 지방산으로서 비누 (예, C16 -22 지방산) 약 1 내지 약 3%; 나트륨 카르보네이트 (Na2CO3 으로서) 약 10% 내지 약 17%; 가용성 실리케이트 약 3% 내지 약 9%; 제올라이트 (NaAlSiO4 로서) 약 23% 내지 약 33%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 0% 내지 약 4%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO3H2O) 약 8% 내지 약 16%; TAED 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 (예, EDTMPA) 0% 내지 약 1%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 0-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.
(4) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 12%; 알코올 에톡실레이트 (예, C12 -15 알코올, 7 EO) 약 10% 내지 약 25%; 나트륨 카르보네이트 (Na2CO3 으로서) 약 14% 내지 약 22%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 25% 내지 약 35%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 0% 내지 약 10%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PVP, PEG) 1-3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.
(5) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알코올 에톡실레이트 (예, C12 -15 알코올, 7 EO 또는 C12-15 알코올, 5 EO) 약 12% 내지 약 18%; 지방산으로서 비누 (예, 올레산) 약 3% 내지 약 13%; 알케닐숙신산 (C12 -14) 0% 내지 약 13%; 아미노에탄올 약 8% 내지 약 18%; 시트르산 약 2% 내지 약 8%; 포스포네이트 0% 내지 약 3%; 중합체 (예, PVP, PEG) 0% 내지 약 3%; 보레이트 (예, B4O7) 0% 내지 약 2%; 에탄올 0% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 8% 내지 약 14%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 분산제, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.
(6) 하기를 포함하는 수성 구성 액체 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 21%; 알코올 에톡실레이트 (예, C12 -15 알코올, 7 EO, 또는 C12 -15 알코올, 5 EO) 3-9%; 지방산으로서 비누 (예, 올레산) 약 3% 내지 약 10%; 제올라이트 (NaAlSiO4 로서) 약 14% 내지 약 22%; 칼륨 시트레이트 약 9% 내지 약 18%; 보레이트 (예, B4O7) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합체 (예, PEG, PVP) 0% 내지 약 3%; 부착 중합체 (예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체); 몰비 25:1, MW 3800) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 분산제, 비누거품 억제제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.
(7) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 지방 알코올 술페이트 약 5% 내지 약 10%; 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서 비누 0-3%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 5% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 20% 내지 약 40%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 약 2% 내지 약 8%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO3H2O) 약 12% 내지 약 18%; TAED 약 2% 내지 약 7%; 중 합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.
(8) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 8% 내지 약 14%; 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 약 5% 내지 약 11%; 지방산으로서 비누 0% 내지 약 3%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 4% 내지 약 10%; 가용성 실리케이트 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 30% 내지 약 50%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 약 3% 내지 약 11%; 나트륨 시트레이트 (예, C6H5Na3O7) 약 5% 내지 약 12%; 중합체 (예, PVP, 말레산/아크릴산 공중합체, PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 비누거품 억제제, 향수) 0-5%.
(9) 하기를 포함하는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 6% 내지 약 12%; 비이온성 계면활성제 약 1% 내지 약 4%; 지방산으로서 비누 약 2% 내지 약 6%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 14% 내지 약 22%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 18% 내지 약 32%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 약 5% 내지 약 20%; 나트륨 시트레이트 (예, C6H5Na3O7) 약 3% 내지 약 8%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO3H2O) 약 4% 내지 약 9%; 표백 활성화제 (예, NOBS 또는 TAED) 약 1% 내지 약 5%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 2%; 중합 체 (예, 폴리카르복실레이트 또는 PEG) 약 1% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 향수) 0-5%.
(10) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 15% 내지 약 23%; 알코올 에톡시술페이트 (예, C12 -15 알코올, 2-3 EO) 약 8% 내지 약 15%; 알코올 에톡실레이트 (예, C12 -15 알코올, 7 EO, 또는 C12 -15 알코올, 5 EO) 약 3% 내지 약 9%; 지방산으로서 비누 (예, 라우르산) 0% 내지 약 3%; 아미노에탄올 약 1% 내지 약 5%; 나트륨 시트레이트 약 5% 내지 약 10%; 하이드로트롭 (예, 나트륨 톨루엔술포네이트) 약 2% 내지 약 6%; 보레이트 (예, B4O7) 0% 내지 약 2%; 카르복시메틸셀룰로오스 0% 내지 약 1%; 에탄올 약 1% 내지 약 3%; 프로필렌 글리콜 약 2% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 중합체, 분산제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.
(11) 하기를 포함하는 수성액 세제 조성물: 선형 알킬벤젠술포네이트 (산으로 계산됨) 약 20% 내지 약 32%; 알코올 에톡실레이트 (예, C12 -15 알코올, 7 EO, 또는 C12 -15 알코올, 5 EO) 6-12%; 아미노에탄올 약 2% 내지 약 6%; 시트르산 약 8% 내지 약 14%; 보레이트 (예, B4O7) 약 1% 내지 약 3%; 중합체 (예, 말레산/아크릴산 공중합체, 부착 중합체, 예를 들어, 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체) 0% 내지 약 3%; 글리세롤 약 3% 내지 약 8%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 하이드로트롭, 분산제, 향수, 형광 증백제) 0-5%.
(12) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: 음이온성 계면활성제 (선형 알킬벤젠술포네이트, 알킬 술페이트, α-올레핀술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알칸술포네이트, 비누) 약 25% 내지 약 40%; 비이온성 계면활성제 (예, 알코올 에톡실레이트) 약 1% 내지 약 10%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 8% 내지 약 25%; 가용성 실리케이트 약 5% 내지 약 15%; 나트륨 술페이트 (예, Na2SO4) 0% 내지 약 5%; 제올라이트 (NaAlSiO4) 약 15% 내지 약 28%; 나트륨 퍼보레이트 (예, NaBO3·4H2O) 0% 내지 약 20%; 표백 활성화제 (TAED 또는 NOBS) 약 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 미량 성분 (예, 향수, 형광 증백제) 0-3%.
(13) 상기 조성물 1)- 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (여기서 선형 알킬벤젠술포네이트 모두 또는 이의 일부는 (C12-C18) 알킬 술페이트로 대체됨).
(14) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C12-C18) 알킬 술페이트 약 9% 내지 약 15%; 알코올 에톡실레이트 약 3% 내지 약 6%; 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드 약 1% 내지 약 5%; 제올라이트 (예, NaAlSiO4) 약 10% 내지 약 20%; 층화 디실리케이트 (예, SK56, Hoechst 사 제조) 약 10% 내지 약 20%; 나트륨 카르보네이트 (예, Na2CO3) 약 3% 내지 약 12%; 가용성 실리케이트 0% 내지 약 6%; 나트륨 시트레이트 약 4% 내지 약 8%; 나트륨 퍼카르보네이트 약 13% 내지 약 22%; TAED 약 3% 내지 약 8%; 중합체 (예, 폴리카 르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 5%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 광표백제, 향수, 비누거품 억제제) 0-5%.
(15) 하기를 포함하는 600 g/L 이상의 벌크 밀도를 갖는 과립으로서 제형화된 세제 조성물: (C12-C18) 알킬 술페이트 약 4% 내지 약 8%; 알코올 에톡실레이트 약 11% 내지 약 15%; 비누 약 1% 내지 약 4%; 제올라이트 MAP 또는 제올라이트 A 약 35% 내지 약 45%; 나트륨 카르보네이트 (Na2CO3 으로서) 약 2% 내지 약 8%; 가용성 실리케이트 0% 내지 약 4%; 나트륨 퍼카르보네이트 약 13% 내지 약 22%; TAED 1-8%; 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 0% 내지 약 3%; 중합체 (예, 폴리카르복실레이트 및 PVP) 0% 내지 약 3%; 효소 (순수 효소 단백질로서 계산됨) 0.0001-0.1%; 및 미량 성분 (예, 형광 증백제, 포스포네이트, 향수) 0-3%.
(16) 상기 1) - 15) 에 기재된 바와 같은 세제 제형 (이것은 안정화되거나 캡슐화된 과산을 부가적인 성분 또는 이미 구체화된 표백 시스템에 대한 치환제로서 함유함).
(17) 상기 1), 3), 7), 9), 및 12) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (여기서 퍼보레이트는 퍼카르보네이트로 대체됨).
(18) 상기 1), 3), 7), 9), 12), 14), 및 15) 에 기재된 바와 같은 세제 조성물 (이것은 부가적으로 망간 촉매를 함유함).
(19) 선형 알콕실화 1차 알코올과 같은 액체 비이온성 계면활성제, 강화제 시스템 (예, 포스페이트), 효소(들), 및 알칼리를 포함하는 비-수성 세제 액체로서 제형화된 세제 조성물. 또한 세제는 음이온성 계면활성제 및/또는 표백 시스템을 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제는 세제 조성물에 도입될 수 있고, 가정용 및/또는 산업용 직물/세탁물에 존재하는 균막을 제거/세정하는데 사용될 수 있다.
세제 조성물은 예를 들어 오염된 섬유의 예비 처리에 적합한 세탁 첨가 조성물 및 린스가 첨가된 섬유 유연제 조성물을 비롯한 손세탁 또는 세탁기 세탁 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 일반적인 가정용 경질표면 세정 작업에 사용하기 위한 세제 조성물로서 제형화되거나, 수동 식기세정 또는 식기세척기 작업을 위해 제형화될 수 있다.
특정 양상에서, 세제 조성물은 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제, 하나 이상의 α-아밀라아제 변이체 및 하나 이상의 기타 세정 효소, 예컨대 프로테아제, 리파아제, 큐티나아제, 카르보히드라아제, 셀룰라아제, 펙티나아제, 만난나아제, 아라비나아제, 갈락타나아제, 자일라나아제, 옥시다아제, 락카아제, 및/또는 퍼옥시다아제, 및/또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일반적으로 선택된 효소의 특성은 선택되는 세제와 상용성이어야만 하고 (예, pH-최적화, 기타 효소 및 비-효소 성분과의 상용성, 등), 효소는 효과적인 양으로 존재해야만 한다.
프로테아제: 적합한 프로테아제에는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 가공된 돌연변이체가 포함된다. 프 로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 예를 들어, 알칼리성 미생물 프로테아제, 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 바실러스 종 (Bacillus sp.) 으로부터 유래된 것들, 예를 들어, 서브틸리신 노보 (Novo), 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 309 (예를 들어 미국 특허 제 6,287,841 호 참조), 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 168 (예를 들어, WO 89/06279 참조) 이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신 (예, 돼지 또는 소 기원), 및 푸사리움 (Fusarium) 프로테아제 (예를 들어, WO 89/06270 및 WO 94/25583 참조) 이다. 유용한 프로테아제의 예에는 또한 WO 92/19729 및 WO 98/20115 에 기재된 변이체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 시판되는 프로테아제 효소에는 하기가 포함된다: Alcalase®, Savinase®, Esperase®, 및 Kannase™ (Novozymes, 이전의 Novo Nordisk A/S); Maxatase®, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect®, Purafect OxP™, FN2™, 및 FN3™ (Danisco US Inc., Genencor Division; 이전에 Genencor International, Inc. 로 공지됨).
리파아제: 적합한 리파아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질된 또는 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 리파아제의 예에는 후미콜라 (Humicola) (동의어 테르모마이세스 (Thermomyces)), 예를 들어, H. 라누기노사 (H. lanuginosa) (T. 라누기노수스 (T. lanuginosus)) (예를 들어, EP 258068 및 EP 305216 참조) 및 H. 인솔렌스 (H. insolens) (예를 들어, WO 96/13580 참조) 로부터의 리파아제; 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파아제 (예를 들어, P. 알칼리게네스 (P. alcaligenes) 또는 P. 슈도알칼리게네스 (P. pseudoalcaligenes); 예를 들어, EP 218 272 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) (예를 들어, EP 331 376 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) (예를 들어, GB 1,372,034 참조), P. 플루오레센스 (P. fluorescens), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 균주 SD 705 (예를 들어, WO 95/06720 및 WO 96/27002 참조), P. 위스콘시넨시스 (P. wisconsinensis) (예를 들어, WO 96/12012 참조); 바실러스 리파아제 (예를 들어, B. 서브틸리스 (B. subtilis); 예를 들어, Dartois et al. Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360 (1993) 참조), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) (예를 들어, JP 64/744992 참조), 또는 B. 푸밀러스 (B. pumilus) (예를 들어, WO 91/16422 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 제형에 사용하기 위해 고려되는 부가적인 리파아제 변이체에는 예를 들어: WO 92/05249, WO 94/01541, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, EP 407225, 및 EP 260105 에 기재된 것들이 포함된다. 일부 시판되는 리파아제 효소에는 Lipolase® 및 Lipolase® Ultra (Novozymes, 이전의 Novo Nordisk A/S) 가 포함된다.
폴리에스테라아제: 적합한 폴리에스테라아제에는 WO 01/34899 (Genencor International, Inc.) 및 WO 01/14629 (Genencor Interntional, Inc.) 에 기재된 것들이 포함되나 이에 제한되지는 않고, 본원에 논의된 기타 효소와 임의의 조합으로 포함될 수 있다.
아밀라아제: 조성물은 기타 α-아밀라아제, 예컨대 비-변이체 α-아밀라아제 와 조합될 수 있다. 이들에는 시판 아밀라아제, 예컨대 Duramyl®, Termamyl™, Fungamyl® 및 BAN™ (Novozymes, 이전의 Novo Nordisk A/S); Rapidase® 및 Purastar® (Danisco US Inc., Genencor Division; 이전의 Genencor International, Inc.) 가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
셀룰라아제: 셀룰라아제가 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 셀룰라아제에는 박테리아 또는 진균 기원의 것들이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라아제에는 바실러스 (Bacillus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 후미콜라 (Humicola), 푸사리움 (Fusarium), 티에라비아 (Thielavia), 아크레모니움 (Acremonium) 속으로부터의 셀룰라아제, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,435,307 호; 제 5,648,263 호; 제 5,691,178 호; 제 5,776,757 호; 및 WO 89/09259 에 기재된 후미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila) 및 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 으로부터 생성된 진균 셀룰라아제가 포함된다. 사용하기 위해 고려되는 예시적인 셀룰라아제는 직물에 대한 색조 관리 이점을 갖는 것들이다. 이러한 셀룰라아제의 예는 예를 들어 EP 0495257; EP 531 372; WO 99/25846 (Genencor International, Inc.), WO 96/34108 (Genencor International, Inc.); WO 96/11262, WO 96/29397, 및 WO 98/08940 에 기재된 셀룰라아제이다. 기타 예는 셀룰라아제 변이체, 예컨대 WO 94/07998; WO 98/12307; WO 95/24471; PCT/DK98/00299; EP 531315 (Novo Nordisk); 미국 특허 번호 5,457,046; 5,686,593; 및 5,763,254 에 기재된 것들이다. 시판되는 셀룰라아 제에는 Celluzyme® 및 Carezyme® (Novozymes, 이전의 Novo Nordisk A/S); Clazinase™ 및 Puradax HA® (Danisco US Inc., Genencor Division; 이전에 Genencor International, Inc. 로 공지됨); 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 가 포함된다.
퍼옥시다아제/옥시다아제: 본 조성물에 사용하기 위해 고려되는 적합한 퍼옥시다아제/옥시다아제에는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것이 포함된다. 화학적으로 개질되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다아제의 예에는 코프리누스 (Coprinus), 예를 들어, C. 시네레우스 (C. cinereus) 로부터의 퍼옥시다아제, 및 이의 변이체와 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257 에 기재된 것이 포함된다.
세제 효소(들) 은 하나 이상의 효소를 함유하는 별도의 첨가제를 첨가하거나, 이들 효소 모두를 포함하는 조합 첨가제를 첨가하여 세제 조성물에 포함될 수 있다. 세제 첨가제, 즉, 별도의 첨가제 또는 조합 첨가제는 예를 들어 과립, 액체, 슬러리 등으로 제형화될 수 있다. 적합한 과립 세제 첨가제 제형에는 비분진 과립이 포함된다.
비분진 과립은 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,106,991 호 및 제 4,661,452 호에 기재된 것들로서 제조될 수 있고, 당업계에 공지된 방법에 의해 임의로 코팅될 수 있다. 왁스성 코팅 물질의 예는 평균 몰 중량이 1,000 내지 20,000 인 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (예, 폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 에톡실화 지방 알코올 (여기서 알코올 의 탄소수는 12 내지 20 이고, 15 내지 80 개의 에틸렌 옥시드 단위가 있음); 지방 알코올; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 막-형성 코팅 물질의 예는 예를 들어, GB 1483591 에 제시된다. 액체 효소 제제는 예를 들어, 수립된 방법에 따라 프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 당 또는 당 알코올, 락트산 또는 붕산을 첨가하여 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238216 에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바, 정제, 젤, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체일 수 있다. 액체 세제는 전형적으로 약 70% 이하의 물 및 0% 내지 약 30% 의 유기 용매를 함유하는 수성일 수 있다. 또한 약 30% 이하의 물만을 함유하는 컴팩트 젤 유형의 형태일 수 있다. 세제 조성물은 반-극성 (semi-polar), 음이온성, 양이온성 또는 양쪽이온성, 또는 이의 임의의 조합을 비롯한 비-이온성일 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 전형적으로 0.1 중량% 내지 60 중량% 의 수준으로 존재한다.
포함되는 경우 세제는 전형적으로 약 1% 내지 약 40% 의 음이온성 계면활성제, 예컨대 선형 알킬벤젠술포네이트, α-올레핀술포네이트, 알킬 술페이트 (지방 알코올 술페이트), 알코올 에톡시술페이트, 2차 알칸술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산, 또는 비누를 함유할 것이다.
포함되는 경우 세제는 통상 약 0.2% 내지 약 40% 의 비-이온성 계면활성제, 예컨대 알코올 에톡실레이트, 노닐페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민옥시드, 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴 리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실-N-알킬 유도체 ("글루카미드") 를 함유할 것이다.
세제는 0% 내지 약 65% 의 세제 강화제 또는 복합제, 예컨대 제올라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTMPA), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 가용성 실리케이트 또는 층 실리케이트 (예를 들어, SKS-6, Hoechst 사 제조) 를 함유할 수 있다.
세제는 하나 이상의 중합체를 포함할 수 있다. 예는 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(비닐 알코올) (PVA), 폴리(비닐피리딘-N-옥시드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리카르복실레이트 (예를 들어 폴리아크릴레이트, 말레산/아크릴산 공중합체) 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체이다.
세제는 과산-형성 표백 활성화제 (예를 들어, 테트라아세틸에틸렌디아민 또는 노나노일옥시벤젠술포네이트) 와 조합될 수 있는, 퍼보레이트 또는 퍼카르보네이트와 같은 H2O2 공급원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 함유할 수 있다. 대안적으로는, 표백 시스템은 퍼옥시산 (예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산) 을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 효소 표백 시스템일 수 있다.
세제 조성물의 효소는 통상적인 안정화제, 예를 들어, 폴리올 (예, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 또는 당 알코올, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체 (예, 방향족 보레이트 에스테르), 또는 페닐 붕산 유도체 (예, 4-포르밀페닐 붕산) 를 사용하여 안정화될 수 있다. 조성물은 WO 92/19709 및 WO 92/19708 에 기재된 바와 같이 제형화될 수 있다.
또한 세제는 기타 통상의 세제 성분, 예컨대 예를 들어, 점토를 비롯한 섬유 유연제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 부식방지제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 형광 증백제, 히드로트롭, 변색 억제제, 또는 향수를 함유할 수 있다.
현재 세제 조성물에, 효소 변이체가 세정액 1 리터 당 효소 단백질 약 0.01 내지 약 100 mg, 특히 세정액 1 리터 당 효소 단백질 약 0.05 내지 약 5.0 mg, 또는 심지어 더욱 특히 세정액 1 리터 당 효소 단백질 0.1 내지 약 1.0 mg 에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다는 것이 고려된다.
6.1. 세제 조성물 평가 방법
수많은 α-아밀라아제 세정 검정법이 존재한다. 세정 시험의 예시적인 설명에는 하기가 포함된다. "천조각" 은 오염물이 적용되는 섬유와 같은 물질의 조각이다. 물질은 예를 들어, 면, 폴리에스테르 또는 천연 및 합성 섬유의 혼합물로 만들어진 섬유일 수 있다. 대안적으로는, 물질은 또한 여과지 또는 니트로셀룰로오스와 같은 종이, 또는 도자기, 금속 또는 유리와 같은 경질 물질 조각일 수 있다. α-아밀라아제에 있어, 오염물은 전분 기재이지만, 혈액, 우유, 잉크, 풀, 차, 와인, 시금치, 육즙, 초콜렛, 달걀, 치즈, 점토, 안료, 오일, 또는 이들 화합물의 혼합물이 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, α-아밀라아제 변이체는 BMI (blood/milk/ink; 혈액/우유/잉크) 검정법으로 시험된다.
"소형 천조각" 은 예를 들어 단일 구멍 펀치 장치로 절단되거나, 주문 제작된 96 개 구멍 펀치 장치로 절단된 천조각의 한 구획으로, 여기서 다수개의 구멍 펀치의 패턴은 표준 96 웰 마이크로역가 플레이트에 매칭되고, 그렇지 않으면 구획은 천조각으로부터 제거된다. 천조각은 직물, 종이, 금속, 또는 기타 적합한 물질일 수 있다. 소형 천조각에는 24, 48 또는 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰에 두기 전 또는 둔 후 오염물을 고정시킬 수 있다. 소형 천조각은 또한 작은 조각의 물질에 오염물을 적용시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 소형 천조각은 직경이 5/8" 또는 0.25" 인 오염물이 있는 섬유 조각일 수 있다. 주문 제작된 펀치는 96 개의 천조각을 96 웰 플레이트의 모든 웰에 동시에 전달하는 방법으로 고안된다. 상기 장치는 단순히 동일한 96 웰 플레이트를 여러 번 적재하여 웰 당 1 개 초과의 천조각을 전달할 수 있다. 다수개의 구멍 펀치 장치는 천조각을 24 웰, 48 웰, 및 96 웰 플레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 포맷 플레이트에 동시에 전달할 것으로 생각될 수 있다. 또다른 고려되는 방법에서, 오염된 시험 플랫폼은 오염 성분으로 코팅되는 금속, 플라스틱, 유리, 도자기 또는 기타 적합한 물질로 제조된 비이드일 수 있다. 그 다음 하나 이상의 코팅된 비이드를 적합한 완충액 및 효소를 함유하는 96, 48, 또는 24 웰 플레이트 또는 더 큰 포맷의 웰에 넣는다. 이 경우, 상청액을 직접 흡광도 측정에 의해 또는 2 차 색 전개 반응 후 방출된 오염물에 대해 시험할 수 있다. 방출된 오염물의 분석은 또한 질량 스펙트럼 분석에 의해 수행될 수 있을 것이다.
하나의 구현예에서, 오염물의 고정화도를 조절할 수 있게 하는 처리 프로토콜을 제공한다. 그 결과, 예를 들어, 시험되는 효소의 부재하에 세정되는 경우 오염물의 양을 달리 방출하는 천조각을 제조하는 것이 가능하다. 고정된 천조각의 사용은 세정 검정법에서 신호-대-잡음 (signal-to-noise) 비의 현저한 개선을 가져온다. 게다가, 고정화도를 다르게 함으로써, 다양한 세정 조건하에서 최적 결과를 산출하는 오염물을 발생시킬 수 있다.
다양한 유형의 물질에 대해 공지된 "강도" 의 오염물을 갖는 천조각이 시판되고/되거나 (EMPA, St. Gallen, Switzerland; Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; 또는 Center for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands), 당업자에 의해 제조될 수 있다 (Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280-286 (1982)). 기타 시험 천조각은 예를 들어, 혈액/우유/잉크 (BMI) 오염물, 시금치, 풀, 또는 초콜렛/우유/그을음을 함유하는 면-함유 섬유를 포함할 수 있다. 예를 들어, BMI 오염물은 면에 0.0003% 내지 0.3% 과산화수소로 고정될 수 있다. 기타 조합에는 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 풀 또는 시금치, 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 젤라틴 및 코마시 오염물, 또는 0.001% 내지 1% 글루타르알데하이드로 고정된 초콜렛, 우유 및 그을음이 포함된다.
천조각은 또한 효소 및/또는 세제 제형으로의 인큐베이션 동안 진탕될 수 있다. 세정력 데이터는 웰, 특히 96 웰 플레이트 내 천조각의 배향 (수평 대 수직) 에 따라 다르다. 이것은 혼합이 인큐베이션 기간 동안 불충분하였다는 것 을 나타낼 것이다. 인큐베이션 동안 충분한 진탕을 확보하기 위해 다수의 방법이 있다 하더라도, 마이크로역가 플레이트가 2 개의 알루미늄 플레이트 사이에 샌드위치된 플레이트 홀더가 구축될 수 있다. 이것은 예를 들어, 접착 플레이트 봉합제를 웰에 둔 다음, 2 개의 알루미늄 플레이트를 임의의 유형의 적합한, 시판되는 집게로 96 웰 플레이트에 집는 정도로 간단할 수 있다. 그 다음 이것은 시판 인큐베이터 쉐이터에서 고정시킬 수 있다. 쉐이커를 약 400 rpm 로 설정하면 매우 효과적으로 혼합되면서, 이 동안 누출 또는 교차-오염이 홀더에 의해 효과적으로 방지된다.
트리니트로벤젠술폰산 (TNBS) 이 세정액 중의 아미노기의 농도를 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 천조각으로부터 제거되었던 단백질 양의 측정으로서 담당할 수 있다 (예를 들어, Cayot and Tainturier, Anal. Biochem. 249: 184-200 (1997) 참조). 그러나, 세제 또는 효소 샘플이 통상적이지 않게 소형 펩티드 분절을 형성하는 경우 (예를 들어, 샘플 중의 펩티다아제의 존재로부터), 더 큰 TNBS 신호, 즉, 더 큰 "잡음" 을 수득할 것이다.
잉크 방출에 근거하는 혈액/우유/잉크의 세정력 측정을 위한 또다른 수단은 세정액의 흡광도를 측정하여 정량화될 수 있다. 흡광도는 350 내지 800 nm 의 임의의 파장에서 측정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 파장은 410 nm 또는 620 nm 에서 측정된다. 세정액은 또한 풀, 시금치, 젤라틴 또는 코마시 오염물을 함유하는 오염물에 대한 세정력을 측정하기 위해 시험될 수 있다. 이러한 오염물에 대한 적합한 파장에는 시금치 또는 풀에 대해서는 670 nm 및 젤라틴 또는 코 마시에 대해서는 620 nm 가 포함된다. 예를 들어, 세정액의 분취물 (예를 들어, 전형적으로 96 웰 마이크로플레이트로부터 100-150 μL) 을 제거하고, 큐벳 또는 다수개의 웰 마이크로플레이트에 넣는다. 그 다음 이것을 분광광도계에 넣고, 적합한 파장에서 흡광도를 판독한다. 또한 시스템은 예를 들어, 옷감, 플라스틱 또는 도자기와 같은 적합한 물질 상에 혈액/우유/잉크 오염물을 사용하는 식기 세정을 위한 적합한 효소 및/또는 세제 조성물을 측정하는데 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, BMI/면 천조각에 30 분 동안 25℃ 에서 0.3% 과산화수소를 적용하거나 BMI/면 천조각에 30 분 동안 60℃ 에서 0.03% 과산화수소를 적용하여, 면에 BMI 오염물을 고정하였다. BMI/면 천조각으로부터 대략 0.25" 의 소형 천조각을 절단하고, 96 웰 마이크로역가 플레이트의 웰에 넣었다. 각 웰 내에, 세제 조성물과 변이체 단백질과 같은 효소의 공지된 혼합물을 넣는다. 접착 플레이트 봉합제를 마이크로역가 플레이트의 상부에 둔 후, 마이크로역가 플레이트에 알루미늄 플레이트를 집어놓고 대략 250 rpm 에서 약 10 내지 60 분 동안 오비탈 쉐이커에서 진탕한다. 마지막에, 상청액을 신규 마이크로역가 플레이트 중의 웰로 옮기고, 620 nm 에서의 잉크의 흡광도를 측정한다. 이것은 0.01% 글루타르알데하이드를 시금치/면 천조각 또는 풀/면 천조각에 30 분 동안 25℃ 에서 적용하여 면에 고정된 시금치 오염물 또는 풀 오염물로 유사하게 시험할 수 있다. 초콜렛, 우유, 및/또는 그을음 오염물로 동일한 시험을 수행할 수 있다.
7. 균막 제거 조성물 및 용도
조성물은 주요 효소 성분으로서 하나의 α-아밀라아제 변이체, 예를 들어, 균막 제거에 사용하기 위한 1 성분 조성물을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 조성물은 균막을 제거하기 위해 다중 효소 활성, 예컨대 다중 아밀라아제, 또는 아미노펩티다아제, 아밀라아제 (β- 또는 α- 또는 글루코-아밀라아제), 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 및/또는 자일라나아제를 비롯한 효소의 칵테일, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 부가적인 효소(들) 은 속 아스페르길루스 (Aspergillus), 예를 들어, A. 아큘레아투스 (A. aculeatus), A. 아와모리 (A. awamori), A. 니게르 (A. niger) 또는 A. 오리자에 (A. oryzae); 또는 트리코데르마 (Trichoderma); 후미콜라 (Humicola), 예를 들어 H. 인솔렌스 (H. insolens); 또는 푸사리움 (Fusarium), 예를 들어, F. 박트리디오이데스 (F. bactridioides), F. 세레알리스 (F. cerealis), F. 크룩웰렌스 (F. crookwellense), F. 쿨모룸 (F. culmorum), F. 그래미네아룸 (F. graminearum), F. 그래미눔 (F. graminum), F. 헤테로스포룸 (F. heterosporum), F. 네군디 (F. negundi), F. 옥시스포룸 (F. oxysporum), F. 레티쿨라툼 (F. reticulatum), F. 로세움 (F. roseum), F. 삼부시눔 (F. sambucinum), F. 사르코크루움 (F. sarcochroum), F. 술푸레움 (F. sulphureum), F. 토룰로세움 (F. toruloseum), F. 트리코테시오이데스 (F. trichothecioides), 또는 F. 베네나툼 (F. venenatum) 에 속하는 미생물에 의해 생성될 수 있다.
α-아밀라아제 변이체 포함 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있고, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 예를 들어, α-아밀라아제 변이체 함유 조성물은 과립 또는 미세과립의 형태일 수 있다. 조성물에 포함되는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 따라 안정화될 수 있다.
예는 폴리펩티드 조성물의 용도의 하기에 제시된다. α-아밀라아제 변이체 함유 조성물의 투여량 및 조성물이 사용되는 기타 조건은 당업계에 공지된 방법에 근거해 측정될 수 있다. α-아밀라아제 변이체는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 또는 이의 변이체와 함께 조성물에 사용하기 위해 추가로 고려된다.
하나의 양상은 균막의 분해 및/또는 제거이다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "분해" 는 균막 내의 각 미생물 세포와 함께 접촉 및 결합되는 균막 매트릭스 중의 다당류의 가수분해로서 이해되며, 이렇게 하여 미생물 세포는 균막으로부터 방출 및 제거될 수 있다. 균막은 표면에 존재할 수 있고, 균막의 분해는 예를 들어, 표면을 α-아밀라아제 변이체 및 임의로 균막의 분해를 담당하는 하나 이상의 기타 효소 (예컨대 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 그러나 이에 제한되지는 않음) 를 포함하는 수성 매질에 담금, 이로 덮음 또는 이를 뿌림에 의해, 표면에 접촉시켜 달성될 수 있다. 조성물은 점액질, 예를 들어 펄프 및 제지 산업에서의 거품이 이는 물을 가수분해하는데 사용될 수 있다.
α-아밀라아제 변이체는 0.0001 내지 10,000 mg/L, 0.001 내지 1000 mg/L, 0.01 내지 100 mg/L, 또는 심지어 0.1 내지 10 mg/L 의 양으로 존재할 수 있다. 부가적인 효소 및 효소 변이체는 유사한 양으로 또는 적은 양으로 존재할 수 있다. 공정은 약 주위 온도 내지 약 70℃ 의 온도에서 적합하게는 수행될 수 있다. 적합한 온도 범위는 약 30℃ 내지 약 60℃, 예를 들어, 약 40℃ 내지 약 50℃ 이다.
균막의 가수분해에 적합한 pH 는 약 3.5 내지 약 8.5 이다. 특히 적합한 pH 범위는 약 5.5 내지 약 8, 예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5 이다. 효소 변이체가 균막을 효과적으로 제거하기 위한 접촉 시간 또는 반응 시간은 균막 특성 및 효소 변이체 단독 또는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 효소와 조합으로 표면에 처리되는 빈도에 따라, 고려가능하게 다를 수 있으나, 적합한 반응 시간은 약 0.25 내지 약 25 시간이다. 특히 적합한 반응 시간은 약 1 내지 약 10 시간, 예를 들어 약 2 시간이다.
부가적인 효소가 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 기타 α-아밀라아제를 비롯한 기타 아밀라아제, 리파아제, 프로테아제, 및/또는 펙티나아제가 포함되나 이에 제한되지 않는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제 및 α-아밀라아제 변이체와 조합될 수 있다. 효소는 항균제, 예컨대 효소성 또는 비 효소성-살생물제와 추가로 조합될 수 있다. 효소성 살생물제는 예를 들어, 산화환원효소, 예를 들어, 락카아제 또는 퍼옥시다아제, 특히 할로퍼옥시다아제, 및 임의로 증강제, 예컨대 특허 출원 WO 97/42825 및 DK 97/1273 에 기재된 바와 같은 알킬 실린게이 트를 포함하는 조성물일 수 있다.
균막이 제거되는/거나 씻겨내어 지는 표면은 정의상 미생물에게 본질적으로 비-투과성인 임의의 표면에 관련된 경질 표면일 수 있다. 예는 임의로 예를 들어, 페인트, 에나멜, 중합체 등으로 코팅될 수 있는 금속, 예를 들어, 스테인레스 스틸 합금, 플라스틱/합성 중합체, 고무, 보드, 유리, 목재, 종이, 직물, 콘크리트, 바위, 대리석, 석고 및 도자기 물질로부터 제조된 표면이다. 따라서, 표면은 급수 시스템, 음식 가공 시스템, 냉각 시스템, 화학약품 가공 시스템 또는 약제 가공 시스템, 또는 목재 가공 산업, 예컨대 펄프 및/또는 제지 산업과 같은 수용액을 보유, 이송, 가공 또는 이와 접촉하는 시스템의 일원일 수 있다. 따라서, 효소 변이체 및 효소 변이체 함유 조성물은 통상의 제자리-세정 (cleaning-in-place: C-I-P) 시스템에 유용하다. 표면은 파이프, 탱크, 펌프, 막, 필터, 열 교환기, 원심분리, 증발기, 믹서, 스프레이 타워, 밸브 및 반응기와 같은 시스템 유닛의 일원일 수 있다. 또한 표면은 오염된 내시경, 보철 장치 또는 의료 이식물과 같은 의료 과학 및 산업에 사용되는 기구의 일부일 수 있거나 일부이다.
균막 제거용 조성물은 또한 금속 표면, 예를 들어, 파이프라인이 미생물 균막에 의해 공격당했을 때 발생하는 소위 생물-부식을 방지하기 위한 것을 위해 고려된다. 조성물은 균막을 분해하여 균막의 미생물 세포가 그것이 부착하고 있는 금속 표면을 부식시키는 균막 환경을 만드는 것을 방지한다.
7.1. 경구 케어 조성물
항-균막 조성물에 대한 또다른 적용에는 경구 케어가 포함된다. 그러므 로 표면에는 치태가 있는 치아가 포함된다. 따라서, 변이체 효소는 인간 또는 동물 치아에 존재하는 플라크의 분해용으로 효소 변이체를 포함하는 의약의 제조를 위한 조성물 (예를 들어 치약) 및 방법에 사용될 수 있다. 추가의 용도는 점막으로부터의 균막, 예컨대 낭성 섬유증 환자의 폐 내 균막의 분해이다. 표면은 또한 생물학적 기원의 기타 피부, 예를 들어, 피부, 치아, 모발, 손발톱 등일 수 있거나, 또는 오염된 콘택트 렌즈일 수 있다.
경구 케어 조성물에 유용한 기타 효소에는 경구 케어 조성물 중의 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제; 덱스트라나아제; 뮤타나아제; 옥시다아제, 예컨대 글루코오스 옥시다아제, L-아미노산 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 WO 95/10602 에 기재된 코프리누스 종 (Coprinus sp.) 퍼옥시다아제 또는 락토퍼옥시다아제; 할로퍼옥시다아제, 특히 커뷸라리아 종 (Curvularia sp.), 특히 C. 베르루큘로사 (C. verruculosa) 및 C. 이나에콸리스 (C. inaequalis) 유래의 할로퍼옥시다아제; 락카아제; 프로테아제, 예컨대 파파인; 산성 프로테아제 (예를 들어, WO 95/02044 에 기재된 산성 프로테아제); 엔도글루코시다아제; 리파아제; 아밀로글루코시다아제를 비롯한 아밀라아제, 예컨대 AMG™ (Novozymes, 이전의 Novo Nordisk A/S); 항-미생물 효소, 및 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 경구 케어 생성물은 미국 특허 제 6,207,149 호에 기재된 바와 같은 전분 결합 도메인을 임의로 포함할 수 있다.
경구 케어 조성물은 임의의 적합한 물리적 형태 (즉, 분말, 페이스트, 젤, 액체, 연고, 정제 등) 일 수 있다. "경구 케어 조성물" 에는 충치를 방지하고, 치태 및 치석의 형성을 방지하고, 치태 및 치석을 제거하고, 치과적 질환을 방지 및/또는 치료하는 등에 의해, 인간 및 동물의 구강의 경구 위생을 유지하거나 증가시키기 위해 사용될 수 있는 조성물이 포함된다. 경구 케어 조성물은 또한 틀니, 의치 등을 세정하기 위한 제품도 포함한다. 이러한 경구 케어 조성물의 예에는 치약, 치과용 크림, 젤 또는 가루치약, 가글액, 양치 전- 또는 후 린스 제형, 츄잉검, 마름모꼴 정제, 및 캔디가 포함된다. 치약 및 치아용 젤에는 전형적으로 연마 광택 물질, 발포제, 풍미제, 휴멕턴트 (humectant), 결합제, 증점제, 감미제, 미백/탈색/염색 제거제, 물, 및 임의로 효소가 포함된다. 플라크-제거액을 비롯한 구강청정제는 전형적으로 물/알코올 용액, 풍미, 휴멕턴트, 감미제, 발포제, 색소 및 임의로 효소를 포함한다.
연마 광택 물질은 또한 경구 케어 조성물 내에 혼입될 수 있다. 따라서, 연마 광택 물질에는 알루미나 및 그의 수화물, 예컨대 α-알루미나 트리히드레이트; 마그네슘 트리실리케이트; 마그네슘 카르보네이트; 카올린; 알루미노실리케이트, 예컨대 하소 알루미늄 실리케이트 및 알루미늄 실리케이트; 칼슘 카르보네이트; 지르코늄 실리케이트; 및 또한 분말 플라스틱, 예컨대 폴리비닐 클로라이드; 폴리아미드; 폴리메틸 메타크릴레이트; 폴리스티렌; 페놀-포름알데하이드 수지; 멜라민-포름알데하이드 수지; 우레아-포름알데하이드 수지; 에폭시 수지; 분말 폴리에틸렌; 실리카 제로겔; 히드로겔 및 아에로겔 등이 포함될 수 있다. 또한 연마제로서 적합한 것은 칼슘 파이로포스페이트; 수-불용성 알칼리 메타포스페이트; 2칼슘 포스페이트 및/또는 이의 디히드레이트, 2칼슘 오르토포스페이트; 3칼슘 포 스페이트; 미립자 히드록시아파타이트 등이다. 또한 이러한 성분의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 경구 케어 조성물에 따라, 연마 생성물은 약 0 중량% 내지 약 70 중량%, 예를 들어, 약 1 중량% 내지 약 70 중량% 로 존재할 수 있다. 치약에 있어서, 연마 물질 함량은 전형적으로 최종 치약 내에 10 중량% 내지 70 중량% 의 범위로 있다.
휴멕턴트는 예를 들어 치약으로부터 수분 손실을 방지하기 위해 사용된다. 경구 케어 조성물에 사용하기 위한 적합한 휴멕턴트에는 글리세롤; 폴리올; 소르비톨; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 프로필렌 글리콜; 1,3-프로판디올; 1,4-부탄디올; 수소화된 일부 가수분해된 다당류 등 및 이의 혼합물이 포함된다. 휴멕턴트는 일반적으로 치약 내에 0 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 5 중량% 내지 약 70 중량% 로 존재한다.
실리카, 전분, 트래거캔스 검, 잔탄 검, 아이리쉬 모스 (Irish moss) 추출물, 알기네이트, 펙틴, 셀룰로오스 유도체, 예컨대 히드록시에틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스, 폴리아크릴산 및 이의 염, 폴리비닐피롤리돈을, 치약 제품의 안정화를 돕는 적합한 증점제 및 결합제의 예로서 언급할 수 있다. 증점제는 치약 크림 및 젤에 최종 생성물의 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량% 의 양으로, 결합제는 최종 생성물의 약 0.01 중량% 내지 약 10 중량% 의 범위로 존재할 수 있다.
발포제로서 비누, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양쪽이온성 및/또는 쯔피터성 계면활성제가 사용될 수 있다. 이들은 최종 생성물의 0 중량% 내지 약 15 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 13 중량%, 또는 심지어 약 0.25 중량% 내지 약 10 중량% 의 수준으로 존재할 수 있다. 계면활성제는 본 효소에 비활성 영향을 주지 않는 범위로만 오직 적합하다. 계면활성제에는 지방 알코올 술페이트, 술폰화 모노-글리세라이드 또는 탄소수 10 내지 20 의 지방산의 염, 지방산-알부멘 농축 생성물, 지방산 아미드 및 타우린의 염 및/또는 이세티온산의 지방산 에스테르의 염이 포함된다.
적합한 감미제에는 제형에 사용하기 위한 사카린이 포함된다. 스피아민트와 같은 풍미는 종종 적은 양으로, 예컨대 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 특히 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 로 존재한다. 미백/탈색제에는 H2O2 가 포함되며 최종 생성물의 중량으로 계산된 약 5% 미만, 또는 약 0.25% 내지 약 4% 의 양으로 첨가될 수 있다. 미백/탈색제는 산화환원효소와 같은 효소일 수 있다. 적합한 치아 탈색제의 예는, 예컨대 WO 97/06775 (Novo Nordisk A/S) 에 기재된다. 물은 통상 예를 들어, 치약을 유동가능한 형태로 산출하는 양으로 첨가된다. 수용성 항-박테리아제, 예컨대 클로로헥시딘 디글루코네이트, 헥세티딘, 알렉시딘, Triclosan®, 4 차 암모늄 항-박테리아 화합물 및 아연, 구리, 은 및 주석과 같은 특정 금속 이온의 수용성 공급원 (예를 들어, 아연, 구리 및 염화 주석 및 은 니트레이트) 이 또한 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 부가적인 화합물에는 불소 공급원, 염료/색소, 방부제, 비타민, pH-조절제, 항-충치제, 민감성 감소제 (desensitizing agent) 등이 포함된다.
효소는 또한 상기 기재된 경구 케어 조성물에 유용하다. 효소는 구강 세정에 사용되는 경우 여러 이점을 제공한다. 프로테아제는 치아 표면에 흡착되고 생성되는 플라크의 첫번째 층인 박피를 형성하는 침 단백질을 분해한다. 프로테아제는 리파아제와 함께 박테리아 세포벽 및 막의 구조 성분을 형성하는 단백질 및 지질을 분해함으로써 박테리아를 파괴한다. 덱스트라나아제 및 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 카르보히드로라아제는 박테리아 부착을 위한 매트릭스를 형성하는 박테리아에 의해 생성된 유기 골격 구조를 분해한다. 프로테아제 및 아밀라아제는 플라크 형성을 방해할 뿐 아니라, 또한 광물화를 방해하는 칼슘을 결합하는 탄수화물-단백질 복합체를 파괴하여 치석의 발달을 방해한다.
치약은 전형적으로 하기 성분 (최종 치약 조성물의 중량% 로): 마모 물질 약 70% 까지; 휴멕턴트: 0% 내지 약 80%; 증점제: 약 0.1% 내지 약 20%; 결합제: 약 0.01% 내지 약 10%; 감미제: 약 0.1% 내지 약 5%; 발포제: 0% 내지 약 15%; 미백제: 0% 내지 약 5%; 및 효소: 약 0.0001% 내지 약 20% 를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 치약의 pH 는 약 6.0 내지 약 8.0 이고: 약 10% 내지 약 70% 마모 물질; 0% 내지 약 80% 휴멕턴트; 0.1% 내지 약 20% 증점제; 0.01% 내지 약 10% 결합제; 약 0.1% 내지 약 5% 감미제; 0% 내지 약 15% 발포제; 0% 내지 약 5% 미백제; 및 약 0.0001% 내지 약 20% 효소를 포함한다. 상기 효소에는 α-아밀라아제 변이체 단독 또는 2,6-β-D-프룩탄 히드롤라아제와 같은 기타 효소와의 조합, 및 임의로 상기 언급된 기타 유형의 효소가 포함된다.
구강청정제는 전형적으로 하기 성분 (최종 구강청정제 조성물의 중량% 로): 0% 내지 약 20% 휴멕턴트; 0% 내지 약 2% 계면활성제; 0% 내지 약 5% 효소; 0% 내지 약 20% 에탄올; 0% 내지 약 2% 기타 성분 (예를 들어, 풍미, 감미제 활성 성분, 예컨대 불소) 을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 약 0% 내지 약 70% 물을 함유할 수 있다. 구강청정제 조성물은 약 6.0 내지 약 7.5 의 pH 범위로 적합한 완충액, 예를 들어 나트륨 시트레이트 또는 포스페이트로 완충될 수 있다. 구강청정제는 비-희석 형태일 수 있다 (즉, 사용전에 희석되어야만 함). 경구 케어 조성물은 경구 케어 업계에 공지된 임의의 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
8. 전분 가공 조성물 및 용도
또다른 양상에서, 개시된 α-아밀라아제 변이체를 가진 조성물은 전분 액화 및/또는 당화에 이용될 수 있다. 전분 가공은 감미제의 제조, 연료용 에탄올 또는 음료 에탄올 (즉, 알코올 음료) 제조, 음료 제조, 바람직한 유기 화합물 예를 들어, 시트르산, 이타콘산, 락트산, 글루콘산, 케톤, 아미노산, 항생제, 효소, 비타민 및 호르몬의 제조에 유용하다. 전분을 과당 시럽으로 전환하는 것은 통상적으로 3 가지 연속 효소 공정, 즉, 액화 공정, 당화 공정, 및 이성체화 공정으로 이루어진다. 액화 공정 동안, 변이체 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제는 전분을 약 5.5 내지 약 6.2 의 pH 및 약 95℃ 내지 약 160℃ 의 온도에서 대략 2 시간 동안 덱스트린으로 분해한다. 이러한 조건하에서 최적의 효소 안정성을 확보하기 위해, 약 1 mM 의 칼슘을 첨가한다 (40 ppm 자유 칼슘 이온). 기타 α-아밀라아제 변이체는 상이한 조건을 필요로 할 수 있다.
액화 공정 후, 덱스트린은 글루코아밀라아제 (예를 들어, AMG™) 및 임의로 탈분지화 효소, 예컨대 이소아밀라아제 또는 풀룰라나아제 (예를 들어, Promozyme®) 를 첨가하여 덱스트로오스로 전환될 수 있다. 본 단계 전, pH 는 고온 (95℃ 초과) 을 유지하면서 약 4.5 미만의 값으로 감소되고, 액화 α-아밀라아제 변이체 활성은 변성된다. 온도는 60℃ 로 저하되고, 글루코아밀라아제 및 탈분지 효소가 첨가될 수 있다. 당화 공정은 전형적으로 약 24 내지 약 72 시간 동안 진행된다.
당화 공정 후, pH 는 약 6.0 내지 약 8.0 (예를 들어, pH 7.5) 의 범위의 값으로 증가되고, 칼슘이 이온 교환에 의해 제거된다. 그 다음 덱스트로오스 시럽은 예를 들어, 고정화 글루코오스 이소머라아제 (예컨대 Sweetzyme®) 을 사용하여 고 과당 시럽으로 전환된다.
α-아밀라아제 변이체는 상기 액화 공정을 수행하기 위한 하나 이상의 효소적 개선을 제공할 수 있다. 예를 들어, 변이체 α-아밀라아제는 더 높은 활성을 가질 수 있거나, 칼슘 필요성을 감소시킬 수 있다. 자유 칼슘의 첨가는 α-아밀라아제 변이체의 고 안정성을 적절하게 확보하는데 필요하지만, 자유 칼슘은 글루코오스 이소머라아제의 활성을 강하게 억제한다. 따라서, 값비싼 유닛 작업에 의해, 자유 칼슘 수준이 3 ~ 5 ppm 미만으로 감소하는 범위로 제거될 필요가 있다. 이러한 작업을 피할 수 있다면 비용 감소가 수득될 수 있고, 액화 공정은 자유 칼슘 이온의 첨가 없이 수행될 수 있을 것이다. 그러므로, 칼슘 이온을 필요로 하지 않거나 칼슘에 대한 요구성이 감소된 α-아밀라아제 변이체가 특히 유리하다. 예를 들어, 저 농도의 유리 칼슘 (<40 ppm) 에서 안정하고 고도로 활성인 적은 칼슘-의존성 α-아밀라아제 변이체는 조성 및 절차에 이용될 수 있다. 이러한 α-아밀라아제 변이체는 약 4.5 내지 약 6.5 의 범위 (예를 들어, 약 4.5 내지 약 5.5 의 범위) 의 pH 에서 최적 pH 를 가져야만 한다. α-아밀라아제 변이체는 특이적 가수분해를 제공하기 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 다양한 활성 스펙트럼을 가진 "칵테일" 을 제공하기 위해 기타 아밀라아제와 조합될 수 있다.
가공되는 전분은, 예를 들어 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99.5% 이상 순수한 고도로 정제된 전분 품질일 수 있다. 대안적으로는, 전분은 비-전분 분획, 예컨대 배 (germ) 잔류물 및 섬유질을 비롯한 제분된 전체 곡물을 포함하는 물질을 함유하는 좀더 미정제된 전분일 수 있다. 원료, 예컨대 전체 곡물을, 구조를 개방하기 위해 밀링하고 추가 공정이 가능하다. 2 가지 밀링 공정: 습식 및 건식 밀링이 적합하다. 또한, 옥수수 가루 및 밀링된 옥수수 가루가 적용될 수 있다. 건식 밀링된 곡물은 전분 외에도 유의한 양의 비-전분 탄수화물 화합물을 포함할 것이다. 이러한 이질적 물질이 제트 쿠킹에 의해 가공되는 경우 종종 오직 전분의 부분적 젤라틴화가 달성된다. 따라서, 미젤라틴화된 전분에 대해 높은 활성을 갖는 α-아밀라아제 변이체가 액화 및/또는 당화 제트 쿠킹된 건식 밀링된 전분을 포함하는 공정에 유리하게 적용된다.
액화 단계 동안 우세한 가수분해 활성을 갖는 변이체 α-아밀라아제는 유리하게는 당화 단계의 효율 (WO 98/22613 (Novo Nordisk A/S) 참조) 및, 당화 단계 동안 글루코아밀라아제에 대한 필요성을 증가시킨다. 글루코아밀라아제는 유리하게는 0.5 글루코아밀라아제 활성 유닛 (AGU)/g DS (즉, 건조 고체 g 당 글루코아밀라아제 활성 유닛) 이하, 또는 심지어 미만의 양으로 존재한다. 글루코아밀라아제는 아스페르길루스 종 (Aspergillus sp.), 탈라로마이세스 종 (Talaromyces sp.), 파키키토스포라 종 (Pachykytospora sp.), 또는 트라메테스 종 (Trametes sp.) 중의 균주로부터 유래될 수 있고, 예는 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 탈라로마이세스 에메르소니이 (Talaromyces emersonii), 트라메테스 신굴라타 (Trametes cingulata), 또는 파키키토스포라 파피라세아 (Pachykytospora papyracea) 이다. 하나의 구현예에서, 방법은 또한 WO 98/22613 에 기재된 유형의 탄수화물-결합 도메인의 사용을 포함한다.
또다른 양상에서, 공정은 젤라틴화 또는 과립 전분의 슬러리의 가수분해, 특히 상기 과립 전분의 초기 젤라틴화 온도 미만의 온도에서 과립 전분의 가용성 전분 가수분해물로의 가수분해를 포함한다. α-아밀라아제 변이체와 접촉되는 것 외에도, 전분은 진균류 α-아밀라아제 (EC 3.2.1.1) 및, β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2), 및 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3) 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소와 접촉될 수 있다. 구현예에서, 추가의 또다른 녹말가수분해 효소 또는 탈분지 효소, 예컨대 이소아밀라아제 (EC 3.2.1.68), 또는 풀룰라나아제 (EC 3.2.1.41) 가 α-아밀라아제 변이체에 첨가될 수 있다.
하나의 구현예에서, 공정은 초기 젤라틴화 온도 미만의 온도에서 수행된다. 이러한 공정은 종종 30℃ 이상, 31℃ 이상, 32℃ 이상, 33℃ 이상, 34℃ 이상, 35℃ 이상, 36℃ 이상, 37℃ 이상, 38℃ 이상, 39℃ 이상, 40℃ 이상, 41℃ 이상, 42℃ 이상, 43℃ 이상, 44℃ 이상, 45℃ 이상, 46℃ 이상, 47℃ 이상, 48℃ 이상, 49℃ 이상, 50℃ 이상, 51℃ 이상, 52℃ 이상, 53℃ 이상, 54℃ 이상, 55℃ 이상, 56℃ 이상, 57℃ 이상, 58℃ 이상, 59℃ 이상, 또는 60℃ 이상에서 수행된다. 공정이 수행되는 pH 는 약 3.0 내지 약 7.0, 약 3.5 내지 약 6.0, 또는 약 4.0 내지 약 5.0 의 범위일 수 있다. 하나의 양상에는, 예를 들어 32℃ 근처의 온도, 예컨대 30 내지 35℃ 에서 에탄올을 생성하는 효모로의 발효를 포함하는 공정이 고려된다. 또다른 양상에서, 공정은 예컨대 30 내지 35℃ 의 온도에서, 예를 들어, 32℃ 근처에서 에탄올을 생성하는 효모, 또는 원하는 유기 화합물을 생성하는 또다른 적합한 발효 유기체로의 동시 당화 및 발효를 포함한다. 상기 발효 공정에서, 에탄올 함량은 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 또는 약 16% 이상 에탄올에 달한다.
임의의 상기 양상에서 사용되는 전분 슬러리는 약 20% 내지 약 55% 건조 고체 과립 전분, 약 25% 내지 약 40% 건조 고체 과립 전분, 또는 약 30% 내지 약 35% 건조 고체 과립 전분을 가질 수 있다. 효소 변이체는 가용성 전분을 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 양으로 과립 전분의 가용성 전분 가수분해물로 전환시킨다.
또다른 구현예에서, α-아밀라아제 변이체는, 제트 쿠킹에 의한 젤라틴화를 비롯하여, 이에 제한되지 않는 젤라틴화 전분의 액화 또는 당화 공정에 사용된다. 공정은 발효 생성물, 예를 들어 에탄올을 생성하기 위한 발효를 포함할 수 있다. 발효에 의한 전분-함유 물질로부터 에탄올을 생성하기 위한 이러한 공정은: (i) 상기 전분-함유 물질을 α-아밀라아제 변이체로 액화시키는 단계; (ii) 수득된 액화 매시 (mash) 를 당화시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii) 에서 수득된 물질을 발효 유기체의 존재하에서 발효시키는 단계를 포함한다. 임의로 공정은 추가로 에탄올의 회수를 포함한다. 당화 및 발효 공정은 동시 당화 및 발효 공정 (SSF) 으로서 수행될 수 있다. 발효 동안, 에탄올 함량은 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 예컨대 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 예컨대 약 16% 이상 에탄올에 달한다.
상기 양상의 공정에서 가공되는 전분은 특히 덩이줄기, 뿌리, 줄기, 콩류, 곡류 또는 전체 곡물로부터 수득될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 과립 전분은 옥수수, 옥수수속 (cobs), 밀, 보리, 귀리, 밀로, 사고, 카사바, 타피오카, 사탕수수, 쌀, 완두, 콩, 바나나, 또는 감자로부터 수득될 수 있다. 특히 고려되는 것은 왁스성과 비-왁스성 유형의 옥수수 및 보리 모두이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "액화" 또는 "액화하다" 는 전분이 좀더 짧은 사슬 및 덜 점성인 덱스트린으로 전환되는 공정을 의미한다. 일반적으로, 상기 공정에는 α-아밀라아제 변이체의 첨가와 동시에 또는 차후에 전분의 젤라틴화가 포함된다. 부가적인 액화 유도 효소가 임의로 첨가될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "일차 액화" 는 슬러리의 온도가 젤라틴화 온도까지 또는 그 근처로 상승될 때의 액화 단계를 말한다. 온도 상승과 수반하여, 슬러리는 90~150℃, 예를 들어, 100~110℃ 의 온도까지의 열 교환기 또는 제트를 통해 보내진다. 열 교환 또는 제트 온도에 대한 적용과 수반하여, 슬러리는 상기 온도에서 3~10 분 동안 유지된다. 상기 90~150℃ 에서의 슬러리의 유지 단계가 일차 액화이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "이차 액화" 는 슬러리가 대기 온도로 냉각되는 경우, 일차 액화 (90~150℃ 까지 가열) 에 수반된 액화 단계를 말한다. 상기 냉각 단계는 30 분 내지 180 분, 예를 들어, 90 분 내지 120 분일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "이차 액화의 분" 은 이차 액화의 시작으로부터 경과된 시간, 덱스트로오스 당량 (Dextrose Equivalent: DE) 이 측정되는 시간을 말한다.
또다른 양상에는 α-아밀라아제 변이체를 포함하는 조성물에서의 β-아밀라아제의 부가적인 용도가 고려되고, β-아밀라아제 (EC 3.2.1.2) 는 외-작용 말토오즈 생성 아밀라아제로, 이것은 아밀로오스, 아밀로펙틴, 및 관련 글루코오스 중합체 중의 1,4-α-글루코시드 연결을 가수분해시켜, 말토오스를 방출시킨다. β-아밀라아제는 다양한 식물 및 미생물로부터 단리되었다 (Fogarty et al., PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, Vol. 15, pp. 112-115, 1979). 이러한 β-아밀라아제는 40℃ 내지 65℃ 의 범위에 최적 온도, 및 약 4.5 내지 약 7.0 의 범위에 최적 pH 를 갖는 것을 특징으로 한다. 고려되는 β-아밀라아제에는 보리 Spezyme® BBA 1500, Spezyme® DBA, Optimalt™ ME, Optimalt™ BBA (Danisco US Inc., Genencor Division; 이전에 Genencor International, Inc. 로 공지됨); 및 Novozym™ WBA (Novozymes A/S) 로부터의 β-아밀라아제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
조성물에 사용되는 것으로 고려되는 또다른 효소는 글루코아밀라아제 (EC 3.2.1.3) 이다. 글루코아밀라아제는 미생물 또는 식물로부터 유래된다. 예시적인 글루코아밀라아제는 진균류 또는 박테리아 기원의 것이다. 예시적인 박테리아 글루코아밀라아제는 아스페르길루스 (Aspergillus) 글루코아밀라아제, 특히 A. 니게르 (A. niger) G1 또는 G2 글루코아밀라아제 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3(5): 1097-1102), 또는 이의 변이체, 예컨대 WO 92/00381 및 WO 00/04136 에 기재됨; A. 아와모리 (A. awamori) 글루코아밀라아제 (WO 84/02921); A. 오리자에 (A. oryzae) 글루코아밀라아제 (Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4): 941-949), 또는 이의 변이체 또는 분절이다.
다른 고려되는 아스페르길루스 (Aspergillus) 글루코아밀라아제 변이체에는 열 안정성: G137A 및 G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9: 499-505); D257E 및 D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301: 275-281); 디술피드 결합, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35: 8698-8704); 및 위치 A435 및 S436 에 Pro 잔기를 도입 (Li et al. (1997) Protein Eng. 10: 1199-1204) 을 향상시키는 변이체가 포함된다. 다른 고려되는 글루코아밀라아제에는 탈라로마이세스 (Talaromyces) 글루코아밀라아제, 특히 T. 에메르소니이 (T. emersonii) (WO 99/28448), T. 레이세타 누스 (T. leycettanus) (미국 특허 번호 RE 32,153), T. 듀폰티 (T. duponti), 또는 T. 테르모필릭스 (T. thermophilics) (미국 특허 번호 4,587,215) 로부터 유래된 것이 포함된다. 고려되는 박테리아 글루코아밀라아제에는 속 클로스트리듐 (Clostridium), 특히 C. 테르모아밀로라이티쿰 (C. thermoamylolyticum) (EP 135138) 및 C. 테르모히드로술푸리쿰 (C. thermohydrosulfuricum) (WO 86/01831) 으로부터의 글루코아밀라아제가 포함된다. 적합한 글루코아밀라아제에는 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 유래의 글루코아밀라아제, 예컨대 WO 00/04136 의 SEQ ID NO: 2 에 제시된 아미노산 서열에 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 심지어 90% 상동성을 갖는 글루코아밀라아제가 포함된다. 또한 적합한 것은 시판 글루코아밀라아제, 예컨대 AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER 및 AMG™ E (Novozymes); OPTIDEX® 300 (Danisco US Inc., Genencor Division; 이전에 Genencor International, Inc. 로 공지됨); AMIGASE™ 및 AMIGASE™ PLUS (DSM); G-ZYME® G900 (Enzyme Bio-Systems); 및 G-ZYME® G990 ZR (A. 니게르 (A. niger) 글루코아밀라아제 및 저 프로테아제 함량) 이다. 글루코아밀라아제는 0.02-2.0 AGU/g DS, 또는 0.1-1.0 AGU/g DS, 예를 들어 0.2 AGU/g DS 의 양으로 첨가될 수 있다.
부가적인 효소 변이체는 또한 조성물에 포함되는 것으로 고려된다. 2 개 이상의 α-아밀라아제 변이체는 단독으로 또는 본원에 논의된 기타 효소와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세번째 효소는 또다른 α-아밀라아제 (예를 들어, 효모 α-아밀라아제) 또는 또다른 α-아밀라아제 변이체일 수 있다. 이들 은 바실러스 (Bacillus) α-아밀라아제 또는 비-바실러스 (non-Bacillus) α-아밀라아제일 수 있다.
임의로 첨가될 수 있는 또다른 효소는 탈분지화 효소, 예컨대 이소아밀라아제 (EC 3.2.1.68) 또는 풀룰라나아제 (EC 3.2.1.41) 이다. 이소아밀라아제는 아밀로펙틴 중의 α-1,6-D-글루코시드 분지 연결 및 β-제한 덱스트린을 가수분해하고, 플루란을 공격하는 이소아밀라아제의 무능에 의해, 그리고 α-제한 덱스트린에 대한 제한된 작용에 의해 풀룰라나아제와 구별될 수 있다. 탈분지화 효소는 당업자에게 잘 알려진 유효량으로 첨가될 수 있다.
공정의 생성물의 정확한 조성은 적용되는 효소의 조합 뿐 아니라 가공되는 과립 전분의 유형에 따라 다르다. 가용성 가수분해물은 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95.0% 이상, 약 95.5% 이상, 약 96.0% 이상, 약 96.5% 이상, 약 97.0% 이상, 약 97.5% 이상, 약 98.0% 이상, 약 98.5% 이상, 약 99.0% 이상 또는 약 99.5% 이상의 순도를 가진 말토오스일 수 있다. 대안적으로는, 가용성 전분 가수분해물은 글루코오스일 수 있고, 또는 전분 가수분해물은 94.5% 이상, 95.0% 이상, 95.5% 이상, 96.0% 이상, 96.5% 이상, 97.0% 이상, 97.5% 이상, 98.0% 이상, 98.5% 이상, 99.0% 이상 또는 99.5% 이상의 DX (총 가용화된 건조 고체의 글루코오스 %) 를 갖는다. 하나의 구현예에서, 아이스 크림, 케이크, 캔디, 과일 통조림의 제조 방법은 글루코오스, 말토오스, DP3 및 DPn 의 혼합물을 함유하는 특정 시럽을 사용한다.
2 가지 밀링 공정, 즉 습식 밀링 및 건식 밀링이 적합하다. 건식 밀링에 서, 전체 커넬 (kernel) 이 밀링되고 사용된다. 습식 밀링은 배 및 거친가루 (전분 과립 및 단백질) 를 양호하게 분리하고, 전분 가수분해물이 시럽 제조에 사용되는 위치에 사용된다. 건식 및 습식 밀링 모두 전분 가공 업계에 잘 알려져 있으며, 기재된 조성물 및 방법으로의 사용에 동등하게 고려된다. 공정은 잔존물 (retentate) 이 효소, 생 (raw) 전분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물 (permeate) 이 가용성 전분 가수분해물인 초여과 시스템에서 수행될 수 있다. 또다른 방법은 잔존물이 효소, 생 전분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 가용성 전분 가수분해물인 초여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다. 또한 고려되는 것은 잔존물이 효소, 생 전분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 가용성 전분 가수분해물인 미세여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다.
이와 관련하여, 공정의 가용성 전분 가수분해물은 고 과당 전분계 시럽 (HFSS), 예컨대 고 과당 옥수수 시럽 (HFCS) 으로의 전환에 적용된다. 상기 전환은 글루코오스 이소머라아제, 특히 고체 지지체에 고정된 효소를 사용하여 달성될 수 있다. 고려되는 이소머라아제는 시판 제품 Sweetzyme®, IT (Novozymes A/S); G-zyme® IMGI, 및 G-zyme® G993, Ketomax®, G-zyme® G993, G-zyme® G993 액체, 및 GenSweet® IGI 를 포함한다.
또다른 양상에서, 생성된 가용성 전분 가수분해물은 연료 또는 에탄올 음료의 생성을 산출한다. 세번째 양상의 공정에서, 발효는 과립 전분 슬러리의 가수분해와 동시에 또는 별도로/연속으로 수행될 수 있다. 발효가 가수분해와 동 시에 수행되는 경우, 온도는 30℃ 내지 35℃, 특히 31℃ 내지 34℃ 일 수 있다. 공정은 잔존물이 효소, 생 전분, 효모, 효모 영양분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 에탄올 함유 액체인 초여과 시스템에서 수행될 수 있다. 또한 고려되는 것은 잔존물이 효소, 생 전분, 효모, 효모 영양분 및 물의 존재하에서 재순환 하에서 유지되고, 투과물이 에탄올 함유 액체인 초여과 막을 가진 연속 막 반응기에서 수행되는 공정이다.
공정의 가용성 전분 가수분해물은 또한 처리된 전분을 발효 생성물, 예컨대, 시트르산, 모노나트륨 글루타메이트, 글루콘산, 나트륨 글루코네이트, 칼슘 글루코네이트, 칼륨 글루코네이트, 글루코노 델타 락톤, 또는 나트륨 에리트로보레이트로 발효시키는 것을 포함하는 발효 생성물의 제조에 사용될 수 있다.
α-아밀라아제 변이체의 녹말 가수분해 활성은 기질로서 감자 전분을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 방법은 효소에 의한 개질된 감자 전분의 분해에 기반하며, 반응에는 전분/효소 용액의 샘플을 요오드 용액과 혼합하는 것이 뒤따른다. 처음으로, 검정빛이 도는 청색 색조가 형성되나, 전분이 분해되는 동안 청색 색조는 옅어지고 점차 붉은빛이 도는 갈색으로 변하고, 이것을 착색된 유리 표준과 비교한다.
9. 직물 발호 조성물 및 용도
또한 고려되는 것은 하나 이상의 α-아밀라아제 변이체를 사용하는 섬유의 처리 조성물 및 방법 (예를 들어, 직물을 발호하기 위함) 이다. α-아밀라아제 변이체는 당업계에 잘 알려진 (예를 들어 미국 특허 번호 제 6,077,316 호 참조) 임의의 섬유-처리 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 양상에서 섬유의 촉감 및 외양은 용액에서 섬유를 효소 변이체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 향상된다. 하나의 양상에서, 섬유는 압력하에서 용액으로 처리된다.
하나의 양상에서, 효소는 직물의 방적 동안 또는 그 후, 또는 발호 단계, 또는 하나 이상의 부가적인 섬유 가공 단계 동안 적용된다. 직물의 방적 동안, 실은 고려가능한 기계적 스트레인에 노출된다. 기계 베틀에서 방적하기 전, 날실은 종종 직물의 강도를 증가시키고 파손을 방지하기 위해 사이징 (sizing) 전분 또는 전분 유도체로 코팅된다. α-아밀라아제 변이체는 이러한 사이징 전분 또는 전분 유도체를 제거하기 위해 적용될 수 있다. 직물이 방적된 후, 섬유는 발호 단계를 거칠 수 있다. 이것은 하나 이상의 부가적인 직물 가공 단계가 뒤따를 수 있다. 발호는 직물로부터 사이즈를 제거하는 작용이다. 방적 후, 사이즈 코팅은 균질하고 워터-프루프 결과를 보증하기 위해 섬유의 추가 가공 전에 제거되어야만 한다. 또한 제공되는 것은 효소 변이체의 작용에 의해 사이즈의 효소적 가수분해를 포함하는 발호 방법이다.
α-아밀라아제 변이체는 단독으로 또는 세제 첨가제로서, 예를 들어, 수용성 조성물에 면-함유 섬유를 비롯한 섬유 발호를 위한 기타 발호 화학 시약 및/또는 발호 효소와 함께 사용될 수 있다. α-아밀라아제 변이체는 또한 인디고-염색 데님 섬유 및 의류에 스톤워시 룩 (stonewashed look) 을 생성하기 위한 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 의복 제작을 위해, 섬유는 의복 또는 의류로 절단 및 재봉될 수 있고, 차후에 마감된다. 특히, 데님 청바지의 제조를 위해, 상이한 효소 마감 방법이 개발되고 있다. 데님 의류 마감은 통상적으로, 섬유에 유연성을 부여하고 연이은 효소 마감 단계에 면을 좀더 접근가능하게 하기 위해 의류를 녹말가수분해 효소의 작용에 적용시키는 동안, 효소 발호 단계로 시작된다. α-아밀라아제 변이체는 데님 의류 마감 (예를 들어, "바이오-스토닝 (bio-stoning) 공정"), 효소 발호 및 섬유에 유연성을 부여, 및/또는 마감 공정 방법에 사용될 수 있다.
10. 제빵 및 식품 제조용 조성물 및 방법
제빵 및 식품 제조를 위한 가루의 상업적 및 가정에서의 사용을 위해, 가루 중의 α-아밀라아제 활성의 적합한 수준을 유지하는 것이 중요하다. 너무 높은 활성 수준은 끈적이고/이거나 설익고 상품가치가 없는 생성물을 야기할 수 있으나, 불충분한 α-아밀라아제 활성을 가진 가루는 적합한 효모 작용에 충분한 당을 함유하지 않아, 푸석푸석한 빵을 산출할 수 있다. 따라서, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체는 그 자체 또는 또다른 α-아밀라아제(들) 과 조합으로, 가루 중의 내생 α-아밀라아제 활성 수준을 증대시키기 위해 가루에 첨가될 수 있다. α-아밀라아제는 전형적으로 예를 들어 30-90℃, 50-80℃, 55-75℃, 또는 60-70℃ 의 범위 내의 전분의 존재하에서 최적인 온도를 갖는다. 최적 온도는 pH 5.5 에서 가용성 전분 1% 용액에서 측정될 수 있다.
제빵에서의 곡물 및 기타 식물 생성물의 사용에 더해, 보리, 귀리, 밀과 같은 곡물 뿐 아니라, 옥수수, 홉 및 쌀과 같은 식물 성분이 양조에 (산업용 및 가정용 양조 모두) 사용된다. 양조에 사용되는 성분들은 엿기름으로 만들지 않거나 또는 엿기름으로 만들 수 있으며, 즉, 엿기름을 만드는 것은 부분적 발아로 인한 α-아밀라아제를 비롯한 효소의 수준 증가를 의미한다. 성공적인 양조를 위해서는, 발효를 위한 적당한 수준의 당을 보장하기 위해 적절한 수준의 α-아밀라아제 효소 활성이 필요하다. 따라서 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체는 그 자체 또는 또다른 α-아밀라아제(들) 과 조합으로, 양조에 사용되는 성분에 첨가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "가루" 는 갈거나 또는 분쇄한 곡물 낟알을 의미한다. 용어 "가루" 는 또한 분쇄하거나 또는 짓이긴 사고 (Sago) 또는 덩이줄기 산물을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 가루는 또한 갈거나 또는 짓이긴 곡물 또는 식물성 물질에 추가 성분들을 함유할 수 있다. 한정하려는 의도는 아니지만, 추가 성분의 예는 팽창제이다. 곡물 낟알에는 밀, 귀리, 호밀 및 보리가 포함된다. 덩이줄기 생성물에는 타피오카 가루, 카사바 가루 및 커스터드 가루가 포함될 수 있다. 용어 "가루" 에는 또한 분쇄 옥수수 가루, 흰옥수수 가루 (maize-meal), 쌀가루, 통밀가루, 셀프 라이징 가루 (self-rising flour), 타피오카 가루, 카사바 가루, 분쇄한 쌀, 강화 밀가루 및 커스터드 가루가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "스톡" 은 압착되거나 또는 부서진 곡물 및 식물 성분을 의미한다. 예를 들어, 맥주 제조에 사용되는 보리는 발효를 위한 엿기름 제조에 적당한 일관성을 제공하기 위해 분쇄되거나 또는 압착된 곡물이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "스톡" 에는 압착되거나 또는 거칠게 분쇄된 형 태의 임의의 상기 언급한 유형의 식물 및 곡물이 포함된다. 본원에 기재된 방법은 가루 및 스톡 모두에서의 α-아밀라아제 활성 측정에 사용될 수 있다.
B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체는 단독으로 또한 또다른 아밀라아제와 조합으로 제빵 제품이 딱딱해지는 것, 즉 제빵 제품의 속이 굳는 것을 방지 또는 지연시키기 위해 추가로 첨가될 수 있다. 딱딱함 방지 (anti-staling) 를 위한 아밀라아제의 양은 전형적으로 가루 kg 당 효소 단백질 0.01 내지 10 mg, 예를 들어, 1 내지 10 mg/kg 의 범위일 것이다. B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체와 조합으로 사용될 수 있는 부가적인 딱딱함 방지를 위한 아밀라아제에는 엔도-아밀라아제, 예를 들어, 바실러스 (Bacillus) 유래의 박테리아 엔도-아밀라아제가 포함된다. 부가적인 아밀라아제는 말토오스 생성 α-아밀라아제 (EC 3.2.1.133), 예를 들어, 바실러스 (Bacillus) 유래의 것일 수 있다. Novamyl® 는 B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus) 균주 NCIB 11837 유래의 말토오스 생성 α-아밀라아제이며, [Christophersen et al., Starch, 50(1): 39-45 (1997)] 에 기재되어 있다. 딱딱함 방지를 위한 엔도-아밀라아제의 다른 예에는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) 또는 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 와 같은 바실러스 (Bacillus) 로부터 유래되는 박테리아 α-아밀라아제가 포함된다. 딱딱함 방지를 위한 아밀라아제는 식물 (예컨대, 대두) 또는 미생물 기원 (예컨대, 바실러스 (Bacillus)) 유래의 β-아밀라아제와 같은 엑소-아밀라아제일 수 있다.
B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체를 포함하는 제 빵 조성물은 추가로 포스포리파아제를 함유할 수 있다. 포스포리파아제는 인지질로부터 지방산을 제거하여 리소-인지질을 형성하는 A1 또는 A2 활성을 가질 수 있다. 이는 리파아제 활성, 즉 트리글리세리드에 대한 활성을 갖거나 또는 갖지 않을 수 있다. 포스포리파아제는 전형적으로 30 내지 9O℃, 예를 들어, 30 내지 70℃ 범위의 최적 온도를 가질 수 있다. 첨가되는 포스포리파아제는 동물 기원, 예를 들어, 췌장 (예를 들어, 소 또는 돼지 췌장), 뱀독 또는 벌독 기원의 것일 수 있다. 대안적으로, 포스포리파아제는 미생물 기원, 예를 들어, 사상 진균류, 효모 또는 박테리아, 예컨대 하기의 속 또는 종 기원의 것일 수 있다: 아스페르길루스, A. 니게르 (A. niger); 딕티오스텔리움 (Dictyostelium), D. 디스코이데움 (D. discoideum); 무코르 (Mucor), M. 자바니쿠스 (M. javanicus), M. 무세도 (M. mucedo), M. 서브틸리시무스 (M. subtilissimus); 네우로스포라 (Neurospora), N. 크라사 (N. crassa); 리조무코르 (Rhizomucor), R. 푸실러스 (R. pusillus); 리조푸스 (Rhizopus), R. 아리주스 (R. arrhizus), R. 자포니쿠스 (R. japonicus), R. 스톨로니퍼 (R. stolonifer); 쉐로티니아 (Sclerotinia), S. 리베르티아나 (S. libertiana); 트리코피톤 (Trichophyton), T. 루브룸 (T. rubrum); 웨트젤리니아 (Whetzelinia), W. 스클레로티오룸 (W. sclerotiorum); 바실러스, B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 서브틸리스 (B. subtilis); 시트로박터 (Citrobacter), C. 프룬디이 (C. freundii); 엔테로박터 (Enterobacter), E. 아에로게네스 (E. aerogenes), E. 클로아카에 (E. cloacae); 에드워드시엘라 (Edwardsiella), E. 타르다 (E. tarda); 에르위니아 (Erwinia), E. 헤르비콜라 (E. herbicola); 에스케리키아 (Escherichia), E. 콜라이 (E. coli); 클레브시엘라 (Klebsiella), K. 뉴모니아 (K. pneumoniae); 프로테우스 (Proteus), P. 불가리스 (P. vulgaris); 프로비덴시아 (Providencia), P. 스투아르티이 (P. stuartii); 살모넬라 (Salmonella), S. 티피무리움 (S. typhimurium); 세라티아 (Serratia), S. 리퀘파시엔스 (S. liquefasciens), 세라티아 마르세센스 (S. marcescens); 시겔라 (Shigella), S. 플렉스네리 (S.flexneri); 스트렙토마이세스 (Streptomyces), S. 비올레세오루베르 (S. violeceoruber); 예르시니아 (Yersinia), Y. 엔테로콜리티카 (Y. enterocolitica); 푸사리움 (Fusarium), F. 옥시스포룸 (F. oxysporum) (예를 들어, 균주 DSM 2672).
포스포리파아제는 제빵 후 초기의 기간, 특히 처음 24 시간 동안 빵의 부드러움을 개선하는 양만큼 첨가된다. 포스포리파아제의 양은 전형적으로 가루 kg 당 효소 단백질 0.01 내지 10 mg, 예를 들어, 0.1 내지 5 mg/kg 의 범위일 것이다. 즉, 포스포리파아제 활성은 일반적으로 20 내지 1000 리파아제 유닛 (Lipase Unit: (LU))/가루 kg 의 범위일 것이다 (여기서 리파아제 유닛, Lipase Unit 은 30℃; pH 7.0 에서, 유화제로서의 아라비아 검 및 기질로서의 트리부티린의 존재 하에 분 당 1 μmol 의 부티르산을 방출하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다).
반죽 조성물은 일반적으로 굵은 밀가루 또는 밀가루 및/또는 기타 유형의 굵은 가루, 가루 또는 전분, 예컨대 옥수수 가루, 옥수수 전분, 굵은 호밀 가루, 호밀 가루, 귀리 가루, 오트밀, 대두 가루, 굵은 사탕수수 가루, 굵은 감자 가루, 감 자 가루 또는 감자 전분을 함유할 수 있다. 반죽은 새로 만든 것이거나, 냉동된 것이거나 또는 반만 구운 (par-baked) 것일 수 있다. 반죽은 일반적으로 발효된 반죽 또는 발효시킬 반죽일 수 있다. 반죽은 화학물 발효제, 예를 들어, 중탄산나트륨의 첨가 또는 발효소 (발효 반죽) 의 첨가와 같은 여러가지 수단으로 발효될 수 있다. 또한 반죽은 적합한 효모 배양물, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) (제빵 효모) 의 배양물, 예를 들어, S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 의 시판 균주를 첨가하여 발효될 수 있다.
반죽은 또한 기타 통상적인 반죽 성분, 예를 들어, 단백질, 예컨대 분유, 글루텐 및 대두; 달걀 (예를 들어, 달걀 전체, 노른자 또는 흰자); 산화제, 예컨대 아스코르브산, 칼륨 브로메이트, 칼륨 요오데이트, 아조디카르본아미드 (ADA) 또는 암모늄 퍼술페이트; 아미노산, 예컨대 L-시스테인; 당; 염, 예컨대 염화나트륨, 칼슘 아세테이트, 나트륨 술페이트 또는 칼슘 술페이트를 포함할 수 있다. 반죽은 지방, 예를 들어, 트리글리세리드, 예컨대 과립화된 지방 또는 쇼트닝을 함유할 수 있다. 반죽은 추가로 유화제, 예컨대 모노- 또는 디글리세리드, 모노- 또는 디글리세리드의 디아세틸 타르타르산 에스테르, 지방산의 당 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 모노글리세리드의 락트산 에스테르, 모노글리세리드의 아세트산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 리소레시틴을 함유할 수 있다. 특히, 반죽은 유화제의 첨가 없이 제조가 가능하다.
임의로, 부가적인 효소는 딱딱함 방지를 위한 아밀라아제 및 포스포리파아제와 함께 사용될 수 있다. 부가적인 효소는 제 2 의 아밀라아제, 예컨대 아밀로 글루코시다아제, β-아밀라아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제일 수 있거나, 또는 부가적인 효소는 펩티다아제, 특히 엑소펩티다아제, 트랜스글루타미나아제, 리파아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 특히 펜토사나아제, 예컨대 자일라나아제, 프로테아제, 단백질 디술피드 이소머라아제, 예를 들어, WO 95/00636 에 개시된 단백질 디술피드 이소머라아제, 예를 들어, 글리코실트랜스퍼라아제, 분지화 효소 (1,4-α-글루칸 분지화 효소), 4-α-글루카노트랜스퍼라아제 (덱스트린 글리코실트랜스퍼라아제) 또는 옥시도리덕타아제, 예를 들어, 퍼옥시다아제, 락카아제, 글루코오스 옥시다아제, 피라노오스 옥시다아제, 리폭시게나아제, L-아미노산 옥시다아제 또는 탄수화물 옥시다아제일 수 있다. 부가적인 효소(들) 은 포유류 및 식물 기원, 및 특히 미생물 (박테리아, 효모 또는 진균) 기원을 비롯한 임의의 기원의 것일 수 있으며, 당업계에 통상적인 기술로 수득할 수 있다.
자일라나아제는 전형적으로 미생물 기원, 예를 들어, 박테리아 또는 진균, 예컨대 아스페르길루스 (Aspergillus) 균주, 특히 A. 아쿨레아투스 (A. aculeatus), A. 니게르 (A. niger) (WO 91/19782 참조), A. 아와모리 (A. awamori) (예를 들어, WO 91/18977) 또는 A. 투비겐시스 (A. tubigensis) (예를 들어, WO 92/01793); 트리코데르마 (Trichoderma) 의 균주, 예를 들어 T. 리세이 (T. reesei) 또는 후미콜라 (Humicola) 의 균주, 예를 들어, H. 인솔렌스 (H. insolens) (예를 들어, WO 92/17573) 로부터 유래되는 것일 수 있다. Pentopan® 및 Novozym 384® 는 트리코데르마 리세이 (Trichoderma reesei) 가 생산하는, 시판되는 자일라나아제 제제이다. 아밀로글루코시다아제는 A. 니게르 (A. niger) 아밀로글루코시다아제 (예컨대 AMG®) 일 수 있다. 기타 유용한 아밀라아제 생성물에는, Grindamyl® A 1000 또는 A 5000 (Grindsted Products, Denmark) 이 포함된다. 글루코오스 옥시다아제는 진균 글루코오스 옥시다아제, 특히 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 글루코오스 옥시다아제 (예컨대, Gluzyme®) 일 수 있다. 예시적 프로테아제는 Neutrase® 이다. 예시적 리파아제는 테르모마이세스 (Thermomyces) (후미콜라 (Humicola)), 리조무코르 (Rhizomucor), 칸디다 (Candida), 아스페르길루스 (Aspergillus), 리조푸스 (Rhizopus), 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 의 균주, 특히 테르모마이세스 라누기노수스 (Thermomyces lanuginosus) (후미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa)), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei), 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 리조푸스 델레마르 (Rhizopus delemar) 또는 리조푸스 아리주스 (Rhizopus arrhizus) 또는 슈도모나스 세파시아 (Pseudomonas cepacia) 로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 리파아제는 WO 88/02775 에 기재된 바와 같이 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 로부터 유도된 리파아제 A 또는 리파아제 B 일 수 있고, 또는 리파아제는 예를 들어 EP 238,023 에 기재된 바와 같이 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 로부터, 또는 예를 등러 EP 305,216 에 기재된 바와 같이 후미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 로부터, 또는 예를 들어 EP 214,761 및 WO 89/01032 에 기재된 바와 같이 슈도모나스 세파시아 (Pseudomonas cepacia) 로부터 유도될 수 있다.
공정은 예를 들어 부드럽거나 또는 바삭바삭한 특징의, 또는 백색, 밝은색 또는 어두운색 유형의 반죽으로 제조된 임의의 종류의 제빵 제품에 이용될 수 있다. 예는 빵, 특히, 정백된, 정백되지 않은 또는 호밀빵 (전형적으로 덩어리 또는 롤 형태), 프렌치 바게트형 빵, 피타빵, 토티야, 케이크, 팬케이크, 비스킷, 쿠키, 파이 크러스트, 크리스피빵, 찐빵, 피자 등이다.
또다른 구현예에서, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체는 딱딱함 방지를 위한 아밀라아제, 포스포리파아제 및 인지질과 함께 가루를 포함하는 프리믹스에서 사용될 수 있다. 프리믹스는 기타 반죽 개선 및/또는 빵 개선 첨가제, 예를 들어 상기에 언급된 효모를 비롯한 임의의 첨가제를 함유할 수 있다. 하나의 양상에서, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체는 제빵 첨가제로서 사용하기 위한, 딱딱함 방지를 위한 아밀라아제 및 포스포리파아제를 포함하는 효소 제제 성분이다.
효소 제제는 임의로 과립 또는 응집된 분말의 형태이다. 상기 제제는 입자의 95% (중량비) 이상이 25 내지 500 μm 의 범위인 좁은 입자 크기 분포를 가질 수 있다. 과립 또는 응집된 분말은 통상적인 방법, 예를 들어, 유동층 과립제조기에서의 담체 상에 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체를 분사하여 제조될 수 있다. 담체는 적합한 입자 크기를 가진 미립자성 코어로 이루어질 수 있다. 담체는 가용성이거나 또는 불용성이며, 예를 들어 염 (예컨대, NaCl 또는 나트륨 술페이트), 당 (예컨대, 수크로오스 또는 락토오스), 당 알코올 (예컨대, 소르비톨), 전분, 쌀, 옥수수 그릿츠 또는 대두일 수 있다.
또다른 양상은 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체를 포함하는 입자, 즉 α-아밀라아제 입자의 외피형성에 관한 것이다. 외피형성된 α-아밀라아제 입자를 제조하기 위해, 효소는 α-아밀라아제 입자 전부를 현탁시키기에 충분한 양으로 식품 등급의 지질과 접촉시킨다. 본원에 사용된 바와 같은, 식품 등급의 지질은 물에는 불용성이나, 탄화수소 또는 디에틸 에테르와 같은 무극성 유기 용매에는 가용성인 임의의 자연 유기 화합물일 수 있다. 적합한 식품 등급의 지질에는 포화 또는 불포화성인 지방 또는 오일 형태의 트리글리세리드가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 포화 트리글리세리드를 구성하는 지방산 및 그의 조합의 예에는 부티르산 (유지방으로부터 유도됨), 팔미트산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨) 및/또는 스테아르산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨) 이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 불포화 트리글리세리드를 구성하는 지방산 및 그의 조합의 예에는 팔미톨레산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨), 올레산 (동물 및 식물 지방으로부터 유도됨), 리놀레산 (식물 오일로부터 유도됨), 및/또는 리놀렌산 (평지씨 오일로부터 유도됨) 이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 기타 적합한 식품 등급의 지질에는 상기 논의된 트리글리세리드로부터 유도된 모노글리세리드 및 디글리세리드, 인지질 및 당지질이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
특히 액체 형태인 식품 등급의 지질은, 지질 물질이 α-아밀라아제 입자의 대부분, 예를 들어 100% 의 표면 중 적어도 일부를 덮도록 하는 방식으로 α-아밀라아제 입자의 분말 형태와 접촉한다. 따라서, 각각의 α-아밀라아제 입자는 지질 내에 개별적으로 갇힌다. 예를 들어, α-아밀라아제 입자의 전부 또는 실질적으로 전부에 얇고, 연속적인 지질 외피막이 제공된다. 이는, 먼저 용기에 일정량의 지질을 붓고, 이후 지질이 각각의 α-아밀라아제 입자의 표면을 완전히 적시도록 α-아밀라아제 입자를 슬러리화함으로써 달성될 수 있다. 짧은 기간의 교반 후, 그의 표면에 상당량의 지질을 보유하는, 외피형성된 α-아밀라아제 입자를 회수한다. α-아밀라아제 입자에 적용된 코팅의 두께는 사용되는 지질의 유형 선택 및 원하는 경우 더 두꺼운 막을 수득하기 위해 조작을 반복하여 제어될 수 있다.
적재된 전달 비히클의 저장, 취급 및 혼입은 패키지화된 믹스를 수단으로 하여 달성될 수 있다. 패키지화된 믹스는 외피형성된 α-아밀라아제를 포함할 수 있다. 그러나, 패키지화된 믹스는 추가로 제조사 또는 제빵사의 필요에 따라 추가적인 성분들을 함유할 수 있다. 외피형성된 α-아밀라아제를 반죽에 혼입시킨 후, 제빵사는 제품에 대한 일반적인 제조 공정을 계속해 나간다.
α-아밀라아제의 외피형성의 장점은 두 가지가 있다. 우선은, 식품 등급의 지질이 열로 분해되기 쉬운 효소를 위해 제빵 공정 동안 열변성으로부터 보호해 준다. 결과적으로, 상기 발효 및 제빵 단계 동안 α-아밀라아제가 안정화되고 보호되며, 이것이 폴리글루칸에서의 글루코시드 연결을 가수분해하여, 최종 제빵 제품에서 보호막으로부터 유리된다. 적재된 전달 비히클은 또한 활성 효소를 제빵 제품으로 서서히 방출시킨다. 즉, 제빵 공정 후, 활성 α-아밀라아제는 딱딱해지는 것을 방해하는 속도로 보호 코팅으로부터 연속적으로 방출되어 딱딱해 지는 메카니즘의 속도를 감소시킨다.
일반적으로, α-아밀라아제 입자에 적용되는 지질의 양은, 지질의 특성, α-아밀라아제 입자에 적용되는 방식, 처리할 반죽 혼합물의 조성 및 수반되는 반죽 혼합 조작의 세기에 따라 다르게, α-아밀라아제의 총 중량의 수 퍼센트로부터 상기 중량의 몇 배에 이르기까지 가변적일 수 있다.
적재된 전달 비히클, 즉 지질-외피형성 효소를 제빵 제품의 유효기간 연장에 유효한 양으로 제빵 제품 제조에 사용되는 성분에 첨가한다. 제빵사는 원하는 딱딱함 방지 효과 달성에 필요한, 상기 논의된 바와 같이 제조되는 외피형성 α-아밀라아제의 양을 계산한다. 필요한 외피형성 알파-아밀라아제의 양은 외피형성 효소의 농도 및 특정화된 가루의 α-아밀라아제 비율을 기준으로 계산된다. 이미 논의된 바와 같이 딱딱함 방지에서 관찰가능한 개선은 α-아밀라아제 농도와 비례하여 대응하지는 않으며, 다만 상기 특정 최소 수준,α-아밀라아제 농도에 있어서의 큰 증가가 약간의 추가적인 개선을 제공할 뿐이지만, 넓은 범위의 농도가 유효하다는 것을 발견했다. 특정 제빵 제조에 실제로 사용되는 α-아밀라아제 농도는, 제빵사가 측정하기 어려운 의도치 않은 오차에 대한 안도감을 제빵사에게 제공하기 위해 필요한 최소값보다 훨씬 더 큰 것일 수 있다. 효소 농도의 하한은 제빵사가 달성하고자 하는 딱딱함 방지 효과의 최소값에 따라 결정된다.
제빵 제품의 제조 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: a) 지질-코팅된 α-아밀라아제 입자를 제조하는 단계, 여기서 실질적으로 100 % 의 α-아밀라아제 입자가 코팅됨; b) 가루를 함유하는 반죽을 혼합하는 단계; c) 혼합 전에 지질-코팅 된 α-아밀라아제를 반죽에 첨가하는 것을 완료하고, 혼합을 종료한 후 α-아밀라아제에서 지질 코팅을 제거하는 단계; d) 반죽을 가공하는 단계; 및 e) 반죽을 베이킹하여 제빵 제품을 제공하는 단계, 여기서 α-아밀라아제는 혼합, 가공 및 베이킹 단계 동안 불활성화되며, 제빵 제품에서는 활성임.
외피형성된 α-아밀라아제는 혼합 싸이클 동안, 예를 들어 혼합 사이클의 종료 즈음에 반죽에 첨가될 수 있다. 외피형성된 α-아밀라아제는 반죽 전체에 외피형성된 α-아밀라아제를 충분히 분포할 수 있게하는 혼합 단계 중 한 시점에 첨가되나, 혼합 단계는 상기 보호 코팅이 α-아밀라아제 입자(들) 로부터 벗겨지기 전에 종료된다. 반죽의 유형 및 부피 및 혼합기 작용 및 속도에 따라서, 1 분 내지 6 분 또는 그 이상의 어느 시점이든 반죽에 외피형성된 α-아밀라아제를 혼합시키기 위해 필요할 수 있으나, 2 내지 4 분일 때가 평균이다. 따라서, 몇가지 변수가 정확한 과정을 결정할 수 있다. 먼저, 외피형성된 α-아밀라아제의 양은 외피형성된 α-아밀라아제가 반죽 믹스를 통틀어 퍼질 수 있을 만큼 충분한 전체 부피를 갖춰야 한다. 외피형성된 알파-아밀라아제 제제가 고도로 농축된 경우, 외피형성된 α-아밀라아제를 반죽에 첨가하기 전에 부가적인 오일을 프리믹스에 첨가해야 할 수도 있다. 요리법 및 제조 공정에는 특정한 개질이 필요할 수도 있다. 그러나, 일반적으로 빵 반죽 제형물에 특정화된 오일 25% 가 반죽에 계속 남고, 혼합 싸이클의 종료 즈음에 첨가되는 경우 농축된 외피형성된 알파-아밀라아제에 대한 담체로서 사용되는 경우에, 좋은 결과가 달성될 수 있다. 빵 또는 기타 제빵 제품에서, 지방 함량이 극히 낮은 요리법 (예컨대, 프랑스 스타일 빵) 의 경우, 건조 가루 중량의 약 1% 의 외피형성된 α-아밀라아제 혼합물이면 외피형성된 α-아밀라아제와 반죽을 적절히 혼합하기에 충분하다는 것을 발견했지만, 작업이 가능한 백분율 범위는 매우 넓고, 제형물, 최종 생산물 및 제빵사 개인의 필요에 따른 생산 방법론에 따라 다르다. 두번째로, 외피형성된 α-아밀라아제 현탁액은 반죽으로의 완전한 혼합을 위해 혼합 싸이클에서 충분히 머무르는 시간으로 믹스에 첨가해야 하나, 과도한 기계적인 작용이 외피형성된 α-아밀라아제 입자의 많은 부분에서 보호용 지질 외피를 벗겨낼 정도로 일찍 첨가하지는 않도록 한다.
또다른 구현예에서, 박테리아 α-아밀라아제 (BAA) 는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체를 포함하는 지질로 코팅된 입자에 첨가된다. BAA 는 그의 과도한 열안정성 및 완전히 구워진 빵조각에 남아있는 활성 때문에, 빵을 점착성이 있는 덩어리로 감소시키나, BAA 를 지질 코팅된 입자에 혼입시켰을 때, 심지어는 매우 낮은 BAA 투여 수준에서도 실질적인 부가적인 딱딱함 방지 보호가 수득된다. 예를 들어, 가루 100 파운드 당 150 RAU (Reference Amylase Units; 기준 아밀라아제 단위) 의 BAA 투여량이 유효하다는 것을 발견했다. 하나의 구현예에서, 약 50 내지 2000 RAU 의 BAA 는 지질 코팅된 효소 생성물에 첨가된다. 이러한 낮은 BAA 투여 수준은, 효소가 전분과의 자유로운 접촉을 유지하도록 하는 보호 코팅의 능력과 더불어서 (수증기가 그 코팅으로부터 효소를 무작위로 방출하는 경우는 제외하고) BAA 의 부정적인 부작용없이 매우 높은 수준의 딱딱함 방지 활성 달성을 돕는다.
의도된 용도의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않고 동일물을 사용하는 조성물 및 방법에 다양한 개질 및 변형이 이뤄질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 청구의 범위 및 이의 등가물의 범주 내에 있는 개질 및 변형이 제공된다.
실시예 1
효소 표면 상의 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 활성 부위 잔기 또는 하전 잔기를 고-성능 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제 중의 상응하는 잔기를 닮도록 변형하여 필적가능하게 높은 성능을 갖는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체를 산출할 것이다. 이를 위해, B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 3D 구조와 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제의 3D 구조를 비교하여 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체를 디자인하였다. 구체적으로, BRAGI 소프트웨어를 사용하여, 도 1 에 제시된 배열을 생성하였다. BRAGI 로의 모델링은 아미노산 변형이 변이체 효소의 보존된 2 차 및 3 차 구조 요소를 유의하게 변경하지 않았음을 확인시켜주었다.
모델 성립은 RCSB 단백질 데이터 뱅크 PDB ID No. 1BLI 로부터 접근된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 3D 구조를 사용하여 시작되었다. 상기 α-아밀라아제는 하기 실시예 1.1 에 묘사되는 아미노산 서열을 가지며, 여기서 서열은 돌연변이 M15T, W138Y, 및 M197T 를 도입하기 위해 변경 된다. 이러한 방식으로, 시작하는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제는 PURASTAR® OxAm 중의 α-아밀라아제, 또는 "Purastar α-아밀라아제" 와 동일한 서열을 갖는다. PURASTAR® OxAm 은 표백제-함유 세제 제형을 위한 산화적으로 안정한 α-아밀라아제이다.
실시예 1.1. PURASTAR ® OxAm α- 아밀라아제의 서열 ( SEQ ID NO 3):
Figure 112009073197549-PCT00001
실시예 2
PURASTAR® α-아밀라아제는 효소 표면 상의 활성 부위 잔기 및/또는 하전/비하전 잔기에, 특정 도메인 중의 서열 변형을 디자인하기 위해 추가 모델링을 위한 근거로서 사용되었다. 상기 접근법을 사용하여 디자인된 12 가지 대표적인 변이체 α-아밀라아제를 하기 표 1 에 요약한다. 각 경우, 변이체에 대한 아미노산 변형은 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제에서 상응하는 잔기에 대한 잔기를 변화시킨다. 아미노산 전하의 총 수 및 효소의 전체 전하에 대한 변화 효과가 표의 마지막 열에 제시된다. α-아밀라아제의 3D 구조로부터, 전하에 영향을 주는 모든 변형이 효소 표면에 위치한 아미노산에 대한 것임을 알 수 있다. 도 3 은 변형을 요약하며, 여기서 변형 그룹은 지시되는 바와 같이 도메인 A, B, 및/또는 C 내의 활성 부위 및/또는 하전 잔기에 이뤄진다.
[표 1]
Figure 112009073197549-PCT00002
Figure 112009073197549-PCT00003
실시예 3
3 가지 활성 부위 변이체를, 각각 활성 부위 잔기에 다양한 변화를 주어 모델링하였다. 활성 부위 변이체 1 은 10 개 활성 부위 잔기 변형 (도 1 참조) 을 가지고 있다 (모두 도메인 A 에 있음). 활성 부위 변이체 2 는 7 개 활성 부위 잔기 변형을 가지고 있다 (모두 도메인 B 에 있음) (도 1 참조). 활성 부위 변이체 3 은 변이체 1 및 2 로부터의 아미노산 변형을 조합한다. 변이체 1, 2 및 3 의 완전한 서열은 하기에 제시된다.
실시예 3.1. 활성 부위 변이체 1 (도메인 A) (SEQ ID NO: 4)
Figure 112009073197549-PCT00004
실시예 3.2. 활성 부위 변이체 2 (도메인 B) (SEQ ID NO: 5)
Figure 112009073197549-PCT00005
실시예 3.3. 활성 부위 변이체 3 (도메인 A 및 B) (SEQ ID NO: 6)
Figure 112009073197549-PCT00006
Figure 112009073197549-PCT00007
실시예 4
또한 변이체를 효소 표면의 전하 분포에는 영향을 주나 활성 부위 잔기의 조성에는 영향을 주지 않는 변형을 포함하도록 모델링하였다. 전하 변이체 4 는 도메인 A 에 하전 잔기에 대한 변형을 가지고 있으며, 전하 변이체 5 는 도메인 B 에 하전 잔기에 대한 변형을 가지고 있으며, 전하 변이체 6 은 도메인 C 에 하전 잔기에 대한 변형을 가지고 있다. 전하 변이체 7 은 변이체 4, 5, 및 6 에서 만들어진 모든 변화를 가지고 있다. 변이체 4 내지 7 의 완전한 서열은 하기에 제시된다.
실시예 4.1. 전하 변이체 4 (도메인 A) (SEQ ID NO: 7)
Figure 112009073197549-PCT00008
실시예 4.2. 전하 변이체 5 (도메인 B) (SEQ ID NO: 8)
Figure 112009073197549-PCT00009
실시예 4.3. 전하 변이체 6 (도메인 C) (SEQ ID NO: 9)
Figure 112009073197549-PCT00010
실시예 4.4. 전하 변이체 7 (모든 도메인) (SEQ ID NO: 10)
Figure 112009073197549-PCT00011
실시예 5
또한 변이체를 다양한 도메인 내의 표면 전하 및 활성 부위 잔기의 변형의 다양한 조합을 포함하도록 모델링하였다. 변이체 8 은 도메인 B 에 대한 모든 변형을 가지고 있으며, 변이체 9 는 도메인 B 에 대한 모든 변형 및 도메인 A 에서의 활성 부위 변화를 가지고 있으며, 변이체 10 은 모든 도메인에서의 하전 잔기에 대한 변형 및 도메인 A 및 B 에서의 활성 부위 변화를 가지고 있다. 변이체 11 은 효소의 표면 전하, 활성 부위, 및 도메인 B 에 대한 모든 변형을 가지고 있다. 변이체 12 는 도메인 A 및 B 에 대한 모든 전하 변화, 도메인 A 및 B 에 대한 모든 활성 부위 변화, 및 R437W 치환을 가지고 있다. 변이체 8 내지 12 의 완전한 서열은 하기에 제시된다.
실시예 5.1. 변이체 8 (모든 도메인 B 변형) (SEQ ID NO: 11)
Figure 112009073197549-PCT00012
Figure 112009073197549-PCT00013
실시예 5.2. 변이체 9 (모든 도메인 B 변형 및 도메인 A 활성 부위 변형) (SEQ ID NO: 12)
Figure 112009073197549-PCT00014
실시예 5.3. 변이체 10 (모든 전하 변형 및 도메인 A 및 B 에서의 활성 부위 변형) (SEQ ID NO: 13)
Figure 112009073197549-PCT00015
실시예 5.4. 변이체 11 (모든 전하 변화, 활성 부위 변화, 및 도메인 B 변화) (SEQ ID NO: 14)
Figure 112009073197549-PCT00016
실시예 5.5. 변이체 12 (모든 도메인 A 및 B 전하 변화, 도메인 A 및 B 활성 부위 변화, 및 R437W ) (SEQ ID NO: 15)
Figure 112009073197549-PCT00017
실시예 6
OxAm 변이체를 함유하는 발현 벡터의 구축
본 실시예에서는 발현 벡터를 구축하는 방법을 설명한다.
12 가지 OxAm 변이체에 대한 합성 유전자를 [GeneArt, Inc. (Toronto, Canada)] 에 의해 합성하고 PCR-Script 플라스미드 내에 클로닝하였다. 유전자 구축물을 0.2 μg/μL 의 플라스미드 DNA 로서 수득하였다. 변이체 1, 5, 6, 7, 8, 10, 11 및 12 에 대한 유전자를 하기 프라이머를 사용하여, PureTaq 비이드 (Amersham) 를 사용하여 GeneArt PCR-Script 플라스미드로부터 증폭시켰다:
Figure 112009073197549-PCT00018
변이체 2, 3, 및 4 에 대한 유전자를 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다:
Figure 112009073197549-PCT00019
PCR 조건은 하기와 같다: 95℃ 에서 2 분 동안, 1X, 이후 95℃ 1 분, 52℃ 1 분, 72℃ 1 분 30 초의 30 사이클, 이후 72℃ 에서 7 분. 모든 PCR 생성물을 Qiagen Qiaquick 컬럼을 사용하여 정제하고, 50μL 의 milliQ 물에 재현탁시켰다. 50μL 의 용리된 DNA 를 HpaI (Roche) 로 절단하고, 정제하고, 90μL 의 milliQ 물에 재현탁시켰다. 이어서 재현탁된 DNA 를 100μL 최종 부피 반응물 중 PstI (Roche) 로 절단하고, 정제하고, 30μL 의 milliQ 물에 재현탁시켰다. 2μL 의 용리된 DNA 를 1 μL 의 B. 서브틸리스 (B. subtilis) 벡터 pHPLT (10-20 ng/μL) 로 라이게이션하였다. 벡터 pHPLT 는 미국 특허 제 6,566,112 호에 기재되어 있다.
라이게이션 혼합물을 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 (유전자형: ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, amyE::xylRPxylAcomK-ermC) 적격 세포 내로 형질전환시켰다. WW 120 세포는, 자일로오스 유도성 프로모터 하에 놓여 DNA 결합 및 섭취에 대한 적격성을 유도하는데 자일로스를 사용할 수 있는 다능 유전자를 갖는다 (comK). 20μL 의 물에 콜로니를 재현탁시키고 2μL 의 세포와 25μL 반응물 중 0.5μL 의 pHPLT-F1 및 R1 프라이머를 사용하여 형질전환체에 PureTaq 비이드 (Amersham) 를 사용하는 콜로니 PCR 을 수행하였다:
Figure 112009073197549-PCT00020
pHPLT-seqF1 및 seqR1 프라이머 (Sequetech) 를 사용하여 각 구축물을 서열분석하였다:
Figure 112009073197549-PCT00021
각 변이체에 대한 단일 콜로니를, 4 mL 의 Luria Broth (LB) +10 ppm 네오마이신에서 성장시키고 글리세롤 저장액으로 보관하였다.
단백질 발현을 위해, OxAm 변이체에 대한 유전자를 가지고 있는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 WW 120 세포를 10 μg/mL 네오마이신을 함유하는 25 mL 의 배양 배지 1 (M1) 및 2 (M2) (하기 기재됨) 내에 접종시키고, 약 64 시간 동안 37℃, 250 rpm 에서 배양하였다. 2 mL 의 배양물을 25,000 x g 에서 원심분리시키고, 상청액을 수집하고, 여과하고 0℃ 내지 4℃ 에 저장하였다. M1 은 주 질소 공급원으로서 우레아, 주 탄소 공급원으로서 글루코오스를 함유하고, 원기완성한 세포 성장을 위해 1% 소이톤이 보충된 MOPs 완충액 기재의 풍부한 반-한정 배지였다. M2 는 소이톤이 결핍되고, 글루코오스를 적게 함유하고, 3.5% Maltrin-150 (Grain Processing Corp., Iowa) 이 보충된 것을 제외하고는 배양 배지 1 과 유사하다.
실시예 7
변이체 세정력
본 실시예는 본원에 기재된 변이체의 성능 특성을 시험한다.
정량적 단백질 측정을 위해서, 30 μL 의 OxAm 야생형 및 변이체 배양물을 10% 아크릴아미드 젤 (MES 완충액) 상에 러닝하고, Coomassie Blue R250 염료로 염색한 후, 표준으로서 정제된 OxAm 단백질의 샘플을 포함시켜 Scion Image 소프트웨어 (Scion Corp., Frederick, MD, version Beta 4.03) 를 사용하여 정량화하여 분석하였다.
OxAm 및 OxAm 변이체의 얼룩 제거 성능을 측정하기 위해, CS-26 옥수수 전분 착색 천조각 (TestFabrics Inc., West Pittiston, PA) 을 0.25 인치로 절단하고 96 웰 플레이트에 첨가하였다. IEC"A" 세제 (표준 비-포스페이트 세제) 를 8 g/L 의 농도로 신선하게 제조하고 여과하였다. 150 ppm 의 물 경도를 세제에 첨가하였다. 상기 세제 혼합물의 200 μL 분취물을 천조각에 첨가한 후, OxAm 모체 및 변이체 단백질 샘플을, 0.5 및 2 ppm 농도를 산출하도록 첨가하였다. 플레 이트를 교반하고 20℃ 에서 60 분 동안 750 rpm 에서 Eppendorf Thermomixer 세트로 인큐베이션하였다. 150 μL 의 분취물을 새로운 플레이트에 옮기고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 488 nm 에서 광학 밀도를 측정하였다.
상기 기재된 바와 같은 얼룩 제거력에 대한 천조각 세정 검정법 (Cleaning Swatch Assay for Stain Removal Performance) 을 사용하여 pH 10.4 에서 OxAm 모체 및 OxAm 변이체 단백질의 얼룩 제거 성능을 측정하기 위해 실험을 수행하였다. 도 5 는 배양 배지 1 (M1) 또는 배양 배지 2 (M2) 에서 성장한 OxAm 변이체 V2, V3, 및 V5 의 성능을 나타내고, OxAm 모체 및 Stainzyme (Sz) 와 비교하여 보여준다. 도 6 은 배양 배지 1 (M1) 에서 성장한 OxAm 변이체 V1, V2, V3, V5, V6, 및 V9 의 성능을 나타내고, 동일한 조건에서 성장한 OxAm 모체 및 Stainzyme (Sz) 와 비교하여 보여준다. pH 10.4 및 2O℃ 에서 60 분 인큐베이션 후 CS-26 천조각으로부터의 색상 방출에 의해 세정 활성을 측정하였다.
상기 언급된 모든 문헌은 모든 목적을 위해 전체가 참조로서 본원에 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc., Genencor Division Aehle, Wolfgang Amin, Neelam S. <120> Improved Variants of the Bacillus licheniformis Alpha-Amylase <130> 30982WO-2 <140> PCT/US2008/006768 <141> 2008-05-28 <150> US 60/924,746 <151> 2007-05-30 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 1 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Ser Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 3 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 3 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Tyr Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 4 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 4 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Tyr Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe Tyr Ala Ala Ser Lys Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Glu Glu Ala Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 5 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 5 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Tyr Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp 195 200 205 Val Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu 245 250 255 Met Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro 275 280 285 Leu His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp 290 295 300 Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys 305 310 315 320 Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu 325 330 335 Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr 355 360 365 Gly Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys 370 375 380 Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln 385 390 395 400 His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly 405 410 415 Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly 420 425 430 Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu 435 440 445 Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn 450 455 460 Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile 465 470 475 480 Tyr Val Gln Arg <210> 6 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 6 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Tyr Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp 195 200 205 Val Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu 245 250 255 Met Phe Thr Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro 275 280 285 Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Ala Ser Lys Gln Gly Gly Gly Tyr Asp 290 295 300 Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys 305 310 315 320 Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Glu Glu Ala Leu 325 330 335 Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr 355 360 365 Gly Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys 370 375 380 Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln 385 390 395 400 His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly 405 410 415 Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly 420 425 430 Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu 435 440 445 Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn 450 455 460 Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile 465 470 475 480 Tyr Val Gln Arg <210> 7 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 7 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu Arg Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Gln Leu Gln Ser Ala Ile Asn Ser Leu Lys Ser Asn Gly Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Tyr Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Arg Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Thr Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly Lys Asn Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Gln Asn Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu His Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile 370 375 380 Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val 405 410 415 Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala 420 425 430 Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp 435 440 445 Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp 450 455 460 Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg 465 470 475 480 <210> 8 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 8 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Ile Ser Gly Glu Tyr Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp 405 410 415 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr 435 440 445 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 9 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 9 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val 115 120 125 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Tyr Thr His Phe His Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile 370 375 380 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Ser Ser His Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ala Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly Gln Thr 435 440 445 Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Pro Val Val Ile Asn Ser 450 455 460 Glu Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr 465 470 475 480 Val Gln Arg <210> 10 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 10 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu Arg Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Gln Leu Gln Ser Ala Ile Asn Ser Leu Lys Ser Asn Gly Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Ile Ser Gly Glu Tyr Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Arg Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Thr Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly Lys Asn Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Gln Asn Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu His Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile 370 375 380 Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn Ser Ser His 405 410 415 Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala 420 425 430 Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly Gln Thr Trp Ser Asp 435 440 445 Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp 450 455 460 Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg 465 470 475 480 <210> 11 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> SITE <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu Xaa Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp 195 200 205 Val Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu 245 250 255 Met Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro 275 280 285 Leu His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp 290 295 300 Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys 305 310 315 320 Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu 325 330 335 Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr 355 360 365 Gly Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys 370 375 380 Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln 385 390 395 400 His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly 405 410 415 Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Phe Ala Leu Ile Thr Asp Gly 420 425 430 Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu 435 440 445 Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn 450 455 460 Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile 465 470 475 480 Tyr Val Gln Arg <210> 12 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 12 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp 195 200 205 Val Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu 245 250 255 Met Phe Thr Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro 275 280 285 Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Ala Ser Lys Gln Gly Gly Gly Tyr Asp 290 295 300 Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys 305 310 315 320 Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Glu Glu Ala Leu 325 330 335 Glu Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr 355 360 365 Gly Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys 370 375 380 Ile Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln 385 390 395 400 His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly 405 410 415 Asp Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly 420 425 430 Pro Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu 435 440 445 Thr Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn 450 455 460 Ser Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile 465 470 475 480 Tyr Val Gln Arg <210> 13 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 13 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu Arg Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Gln Leu Gln Ser Ala Ile Asn Ser Leu Lys Ser Asn Gly Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Ile Ser Gly Glu Tyr Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp 195 200 205 Val Ala Ala Glu Ile Arg Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Thr Leu 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly Lys Asn 245 250 255 Met Phe Thr Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro 275 280 285 Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Ala Ser Lys Gln Gly Gly Gly Tyr Asp 290 295 300 Met Gln Asn Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu His 305 310 315 320 Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Glu Glu Ala Leu 325 330 335 Glu Ser Thr Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn Ser Ser 405 410 415 His Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly Gln Thr Trp Ser 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 465 470 475 480 Arg <210> 14 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 14 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu Arg Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Gln Leu Gln Ser Ala Ile Asn Ser Leu Lys Ser Asn Gly Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp 195 200 205 Val Ala Ala Glu Ile Arg Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Thr Leu 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly Lys Asn 245 250 255 Met Phe Thr Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu 260 265 270 Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro 275 280 285 Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Ala Ser Lys Gln Gly Gly Gly Tyr Asp 290 295 300 Met Gln Asn Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu His 305 310 315 320 Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Glu Glu Ala Leu 325 330 335 Glu Ser Thr Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn Ser Ser 405 410 415 His Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly Gln Thr Trp Ser 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 465 470 475 480 Arg <210> 15 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 15 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro 1 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu Arg Asn Asp Ser Ala Tyr Leu 20 25 30 Lys Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Gly Gln Leu Gln Ser Ala Ile Asn Ser Leu Lys Ser Asn Gly Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr 100 105 110 Glu Leu Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu 115 120 125 Ile Ser Gly Glu Tyr Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Gly Ser Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe 145 150 155 160 Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 165 170 175 Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Thr Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val 195 200 205 Ala Ala Glu Ile Arg Asn Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Thr Leu Gln 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Phe 225 230 235 240 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly Lys Asn Met 245 250 255 Phe Thr Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Gln Phe Tyr Ala Ala Ser Lys Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met 290 295 300 Gln Asn Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu His Ser 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Glu Glu Ala Leu Glu 325 330 335 Ser Thr Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile 370 375 380 Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val 405 410 415 Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala 420 425 430 Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp His Asp 435 440 445 Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp 450 455 460 Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg 465 470 475 480 <210> 16 <211> 1539 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 16 atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60 ttgctgcctc attctgcagc ttcagcagca aatcttaatg ggacgctgat gcagtatttt 120 gaatggtaca tgcccaatga cggccaacat tggaagcgtt tgcaaaacga ctcggcatat 180 ttggctgaac acggtattac tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa 240 gcggatgtgg gctacggtgc ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg 300 acggttcgga caaagtacgg cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa aagtcttcat 360 tcccgcgaca ttaacgttta cggggatgtg gtcatcaacc acaaaggcgg cgctgatgcg 420 accgaagatg taaccgcggt tgaagtcgat cccgctgacc gcaaccgcgt aatttcagga 480 gaacacctaa ttaaagcctg gacacatttt cattttccgg ggcgcggcag cacatacagc 540 gattttaaat ggcattggta ccattttgac ggaaccgatt gggacgagtc ccgaaagctg 600 aaccgcatct ataagtttca aggaaaggct tgggattggg aagtttccaa tgaaaacggc 660 aactatgatt atttgatgta tgccgacatc gattatgacc atcctgatgt cgcagcagaa 720 attaagagat ggggcacttg gtatgccaat gaactgcaat tggacggttt ccgtcttgat 780 gctgtcaaac acattaaatt ttcttttttg cgggattggg ttaatcatgt cagggaaaaa 840 acggggaagg aaatgtttac ggtagctgaa tattggcaga atgacttggg cgcgctggaa 900 aactatttga acaaaacaaa ttttaatcat tcagtgtttg acgtgccgct tcattatcag 960 ttccatgctg catcgacaca gggaggcggc tatgatatga ggaaattgct gaacggtacg 1020 gtcgtttcca agcatccgtt gaaatcggtt acatttgtcg ataaccatga tacacagccg 1080 gggcaatcgc ttgagtcgac tgtccaaaca tggtttaagc cgcttgctta cgcttttatt 1140 ctcacaaggg aatctggata ccctcaggtt ttctacgggg atatgtacgg gacgaaagga 1200 gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt aaaagcgaga 1260 aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc accatgacat tgtcggctgg 1320 acaagggaag gcgacagctc ggttgcaaat tcaggtttgg cggcattaat aacagacgga 1380 cccggtgggg caaagcgaat gtatgtcggc cggcaaaacg ccggtgagac atggcatgac 1440 attaccggaa accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg agagtttcac 1500 gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt caaagatga 1539 <210> 17 <211> 1554 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 17 atgaaaatga gaacaggaaa aaagggtttt ttaagtattt tattagcgtt cttattggtg 60 attacttcaa taccgtttac tttagtagat gtagaagcac atcataacgg tacgaacggg 120 acaatgatgc aatactttga atggtatcta cctaatgacg gaaatcattg gaatcgatta 180 aactctgatg cgagtaacct taaaagcaaa gggattacag cggtgtggat tcctccagca 240 tggaagggcg cttctcaaaa tgacgtagga tacggagcct atgacctgta tgatctggga 300 gaatttaatc aaaaaggtac cgtccgtaca aaatatggaa cacgtagtca gttacaagct 360 gcggtaacct ccttaaaaaa taatggaatt caagtatatg gtgacgttgt tatgaatcac 420 aaaggtggcg cagacgctac tgaaatggta agggccgttg aagtgaatcc caataaccgt 480 aaccaagaag tgactggtga atataccatt gaagcttgga ctagatttga ttttccaggg 540 cgaggaaata ctcattctag ctttaaatgg agatggtatc attttgatgg tgtggattgg 600 gatcagtcac gtagactgaa caatcgcatc tataaattta gaggtcatgg caaagcttgg 660 gattgggaag ttgatacgga aaatggtaat tatgattatt taatgtacgc tgatattgat 720 atggatcacc cagaagtagt aaatgaatta agaaattggg gtgtttggta cacaaacaca 780 ttaggactcg atggatttag aatagatgcg gttaaacata taaagtatag ctttacgcgc 840 gattggatta atcacgttag aagtgcaaca ggtaaaaata tgtttgcggt tgctgagttt 900 tggaagaatg atttaggtgc aattgaaaac tatctgcaga aaacaaactg gaaccattca 960 gtctttgatg tgccgttaca ttataatctt tataatgcat caaaaagcgg agggaactat 1020 gatatgcgaa acatatttaa tggaacggtt gttcaacgac atccaagtca tgctgtaaca 1080 tttgttgata atcatgattc gcagcctgaa gaagcattag aatcttttgt tgaagaatgg 1140 tttaaaccat tagcgtatgc gcttacatta acgcgtgaac aaggataccc ttctgtattt 1200 tacggagatt attatgggat tccaacacat ggagtgccag caatgagatc aaaaatcgat 1260 ccgattttag aagcacgtca aaagtatgca tacggaaaac aaaatgatta cttagaccat 1320 cataatatca ttggttggac gcgtgaaggg aatacagcac accccaattc aggtctagct 1380 accatcatgt ctgatggagc gggtggaagt aagtggatgt ttgttgggcg taataaggct 1440 ggtcaagtat ggagtgatat tacaggaaac cgtacaggta cggttacaat caatgcagac 1500 ggttggggca atttctctgt gaatggaggg tcagtttcta tttgggtcaa caaa 1554 <210> 18 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 18 gcgaatctga atggcacgct gatgcagtat tttgaatggt atacgccgaa cgatggccaa 60 cattggaaac gccttcaaaa cgatagcgcc tatctggcag aacatggaat cacagcagtt 120 tggattccgc cggcatataa aggaacaagc caagcggatg tcggctatgg agcgtatgat 180 ctgtatgacc tgggcgaatt tcatcaaaaa ggcacggtcc ggacgaaata tggcacaaaa 240 ggcgaacttc agagcgctat caaaagcctt catagccggg acatcaacgt ctatggcgat 300 gtcgtcatca atcataaagg cggagcggat gctacagaag atgtcacagc ggtcgaagtt 360 gatccggcgg atagaaacag agtcatcagc ggcgaacatc tgatcaaagc gtatacacat 420 tttcattttc cgggcagagg cagcacatat agcgacttta aatggcattg gtatcatttt 480 gatggcacgg attgggatga aagcagaaaa ctgaaccgga tctataaatt tcagggcaaa 540 gcgtgggatt gggaagtcag caacgaaaac ggcaactatg actatctgac gtatgccgac 600 atcgattatg accatccgga tgtcgccgcc gaaattaaaa gatggggcac gtggtatgcc 660 aatgaacttc agctggatgg ctttagactg gatgccgtca aacatatcaa attcagcttt 720 cttcgggact gggtcaacca tgtcagagaa aaaacgggca aagaaatgtt tacggtcgcc 780 gaatattggc aaaatgatct gggcgccctg gaaaactatc tgaacaaaac gaactttaac 840 catagcgtct ttgacgtccc gcttcattat caatttcatg ccgccagcac acaaggcggc 900 ggatatgaca tgagaaaact gctgaacgga acggtcgtta gcaaacatcc gctgaaaagc 960 gtcacgtttg tcgataacca tgacacacaa ccgggacaat cactggaaag cacggtccag 1020 acatggttta aaccgctggc gtatgccttt atcctgacga gagaatcagg atatccgcag 1080 gtcttttatg gcgatatgta tggcacgaaa ggagatagcc aaagagaaat cccggcgctg 1140 aaacataaaa tcgaaccgat cctgaaagcc agaaaacagt atgcctatgg cgcccagcat 1200 gactattttg accatcatga catcgtcggc tggacaagag aaggagatag cagcgtcgct 1260 aattcaggac tggcagcgct gattacagat ggaccgggag gagcgaaaag aatgtatgtc 1320 ggcagacaaa atgccggaga aacgtggcat gatatcacgg gcaatagaag cgaaccggtc 1380 gtcattaata gcgaaggctg gggagaattt catgttaatg gcggcagcgt cagcatctat 1440 gttcaaaga 1449 <210> 19 <211> 1454 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 19 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggag cgagccaaaa cgacgttggc tatggcgcct 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaagatgtc acagcggtcg 360 aagttgatcc ggcggataga aacagagtca tcagcggcga acatctgatc aaagcgtata 420 cacattttca ttttccgggc agaggcagca catatagcga ctttaaatgg cattggtatc 480 attttgatgg cacggattgg gatgaaagca gaaaactgaa ccggatctat aaatttcagg 540 gcaaagcgtg ggattgggaa gtcagcaacg aaaacggcaa ctatgactat ctgacgtatg 600 ccgacatcga ttatgaccat ccggatgtcg ccgccgaaat taaaagatgg ggcacgtggt 660 atgccaatga acttcagctg gatggcttta gactggatgc cgtcaaacat atcaaataca 720 gctttcttcg ggactgggtc aaccatgtca gagaaaaaac gggcaaagaa atgtttacgg 780 tcgccgaatt ttggaaaaat gatctgggcg ccctggaaaa ctatctgaac aaaacgaact 840 ttaaccatag cgtctttgac gtcccgcttc attatcaatt ttatgccgcc agcaaacagg 900 gaggaggcta tgacatgaga aaactgctga acggaacggt cgttagcaaa catccgctga 960 aaagcgtcac gtttgtcgat aaccatgaca cacaaccgga agaagcactg gaaagcacgg 1020 tccagacatg gtttaaaccg ctggcgtatg cctttatcct gacgagagaa tcaggatatc 1080 cgcaggtctt ttatggcgat atgtatggca cgaaaggaga tagccaaaga gaaatcccgg 1140 cgctgaaaca taaaatcgaa ccgatcctga aagccagaaa acagtatgcc tatggcgccc 1200 agcatgacta ttttgaccat catgacatcg tcggctggac aagagaagga gatagcagcg 1260 tcgctaattc aggactggca gcgctgatta cagatggacc gggaggagcg aaaagaatgt 1320 atgtcggcag acaaaatgcc ggagaaacgt ggcatgatat cacgggcaat agaagcgaac 1380 cggtcgtcat taatagcgaa ggctggggag aatttcatgt taatggcggc agcgtcagca 1440 tctatgttca aaga 1454 210> 20 <211> 1457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 20 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggaa caagccaagc ggatgtcggc tatggagcgt 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaagatgtc acagcggtcg 360 aagttgatcc ggcggataga aacagagtca tcagcggcga acatctgatc aaagcgtata 420 cacattttca ttttccgggc agaggcagca catatagcga ctttaaatgg cattggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa caaccggatc tataaatttc 540 agggcaaagc gtgggattgg gaagtcgata cggaatttgg caactatgac tatctgacgt 600 atgccgacat cgattatgac catccggatg tcgccgccga aattaaaaga tggggcacgt 660 ggtatgccaa tgaacttcag ctggatggct ttagactgga tgccgtcaaa catatcaaat 720 tcagctttct tcgggactgg gtcaaccatg tcagagaaaa aacgggcaaa gaaatgttta 780 cggtcgccga atattggcaa aatgatctgg gcgccctgga aaactatctg aacaaaacga 840 actttaacca tagcgtcttt gacgtcccgc ttcattatca atttcatgcc gccagcacac 900 aaggcggcgg atatgacatg agaaaactgc tgaacggaac ggtcgttagc aaacatccgc 960 tgaaaagcgt cacgtttgtc gataaccatg atacacaacc gggacaatca ctggaaagca 1020 cggtccagac atggtttaaa ccgctggcgt atgcctttat cctgacgaga gaatcaggat 1080 atccgcaggt cttttatggc gatatgtatg gcacgaaagg agatagccaa agagaaatcc 1140 cggcgctgaa acataaaatc gaaccgatcc tgaaagccag aaaacagtat gcctatggcg 1200 cccagcatga ctattttgac catcatgaca tcgtcggctg gacaagagaa ggagatagca 1260 gcgtcgctaa ttcaggactg gcagcgctga ttacagatgg accgggagga gcgaaaagaa 1320 tgtatgtcgg cagacaaaat gccggagaaa cgtggcatga tatcacgggc aatagaagcg 1380 aaccggtcgt cattaatagc gaaggctggg gagaatttca tgttaatggc ggcagcgtca 1440 gcatctatgt tcaaaga 1457 <210> 21 <211> 1457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 21 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggag cgagccaaaa cgacgttggc tatggcgcct 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaagatgtc acagcggtcg 360 aagttgatcc ggcggataga aacagagtca tcagcggcga acatctgatc aaagcgtata 420 cacattttca ttttccgggc agaggcagca catatagcga ctttaaatgg cattggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa caaccggatc tataaatttc 540 agggcaaagc gtgggattgg gaagtcgata cggaatttgg caactatgac tatctgacgt 600 atgccgacat cgattatgac catccggatg tcgccgccga aattaaaaga tggggcacgt 660 ggtatgccaa tgaacttcag ctggatggct ttagactgga tgccgtcaaa catatcaaat 720 acagctttct tcgggactgg gtcaaccatg tcagagaaaa aacgggcaaa gaaatgttta 780 cggtcgccga attttggaaa aatgatctgg gcgccctgga aaactatctg aacaaaacga 840 actttaacca tagcgtcttt gacgtcccgc ttcattatca attttatgcc gccagcaaac 900 agggaggagg ctatgacatg agaaaactgc tgaacggaac ggtcgttagc aaacatccgc 960 tgaaaagcgt cacgtttgtc gataaccatg acacacaacc ggaagaagca ctggaaagca 1020 cggtccagac atggtttaaa ccgctggcgt atgcctttat cctgacgaga gaatcaggat 1080 atccgcaggt cttttatggc gatatgtatg gcacgaaagg agatagccaa agagaaatcc 1140 cggcgctgaa acataaaatc gaaccgatcc tgaaagccag aaaacagtat gcctatggcg 1200 cccagcatga ctattttgac catcatgaca tcgtcggctg gacaagagaa ggagatagca 1260 gcgtcgctaa ttcaggactg gcagcgctga ttacagatgg accgggagga gcgaaaagaa 1320 tgtatgtcgg cagacaaaat gccggagaaa cgtggcatga tatcacgggc aatagaagcg 1380 aaccggtcgt cattaatagc gaaggctggg gagaatttca tgttaatggc ggcagcgtca 1440 gcatctatgt tcaaaga 1457 <210> 22 <211> 1445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 22 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaccgcctg agaaacgata gcgcctatct gaaagaacat ggcatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggaa caagccaagc ggatgtcggc tatggagcgt 180 atgatctgta tgacctgggc gaattcaacc aaaaaggcac ggtcagaacg aaatatggca 240 cgaaaggcca acttcaaagc gccatcaaca gcctgaaaag caacggcatc aacgtctatg 300 gagatgtcgt catcaaccat aaaggcggag cggatgctac agaagatgtc acagcggtcg 360 aagttgatcc ggcggataga aacagagtca tcagcggcga acatctgatc aaagcgtata 420 cacattttca ttttccgggc agaggcagca catatagcga ctttaaatgg cattggtatc 480 attttgatgg cacggattgg gatgaaagca gaaaactgaa ccggatctat aaatttcagg 540 gcaaagcgtg ggattgggaa gtcagcaacg aaaacggcaa ctatgactat ctgacgtatg 600 ccgacatcga ttacgatcat ccggatgtcg ccgccgaaat tagaaattgg ggcacgtggt 660 atgccaatac gcttcagctg gatggcttta gactggatgc cgtcaaacat atcaaattca 720 gctttcttcg ggactgggtc aatcatgtca gaagcgccac gggcaaaaac atgtttacgg 780 tcgccgaata ttggcaaaat gatctgggcg ccctggaaaa ctatctgaac aaaacgaact 840 ttaaccatag cgtctttgac gtcccgcttc attatcaatt tcatgccgcc agcacacaag 900 gcggcggata tgatatgcaa aacctgctga acggaacggt cgttagcaaa catccgcttc 960 atagcgtcac gtttgtcgat aaccatgata cacaaccggg acaaagcctg gaaagcacgg 1020 tcgaagaatg gtttaaaccg ctggcgtatg cctttatcct gacgagagaa tcaggatatc 1080 cgcaggtctt ttatggcgac atgtatggca ttccgacaca tggagtcccg gcgctgaaac 1140 ataaaatcga accgatcctg gaagcgagac agaaatatgc ctatggcgcc cagcatgact 1200 attttgacca tcatgacatc gtcggctgga caagagaagg agatagcagc gtcgctaatt 1260 caggactggc agcgctgatt acagatggac cgggaggagc gaaaagaatg tatgtcggca 1320 gacaaaatgc cggagaaacg tggcatgata tcacgggcaa tagaagcgaa ccggtcgtca 1380 tcaattcaga aggctggggc gaatttcatg ttaatggcgg cagcgtcagc atctatgttc 1440 aaaga 1445 <210> 23 <211> 1454 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 23 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggaa caagccaagc ggatgtcggc tatggagcgt 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaatcc ggcgaacaga aaccaagaaa tcagcggcga atatctgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggaagca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cacggattgg gatgaaagca gaaaactgaa ccggatctat aaatttcggg 540 gcaaagcgtg ggattgggaa gtcagcaacg aaaacggcaa ctatgactat ctgacgtatg 600 ccgacatcga ttatgaccat ccggatgtcg ccgccgaaat taaaagatgg ggcacgtggt 660 atgccaatga acttcagctg gatggcttta gactggatgc cgtcaaacat atcaaattca 720 gctttcttcg ggactgggtc aaccatgtca gagaaaaaac gggcaaagaa atgtttacgg 780 tcgccgaata ttggcaaaat gatctgggcg ccctggaaaa ctatctgaac aaaacgaact 840 ttaaccatag cgtctttgac gtcccgcttc attatcaatt tcatgccgcc agcacacaag 900 gcggcggata tgacatgaga aaactgctga acggaacggt cgttagcaaa catccgctga 960 aaagcgtcac gtttgtcgat aaccatgata cacaaccggg acaatcactg gaaagcacgg 1020 tccagacatg gtttaaaccg ctggcgtatg cctttatcct gacgagagaa tcaggatatc 1080 cgcaggtctt ttatggcgat atgtatggca cgaaaggaga tagccaaaga gaaatcccgg 1140 cgctgaaaca taaaatcgaa ccgatcctga aagccagaaa acagtatgcc tatggcgccc 1200 agcatgacta ttttgaccat catgacatcg tcggctggac aagagaagga gatagcagcg 1260 tcgctaattc aggactggca gcgctgatta cagatggacc gggaggagcg aaaagaatgt 1320 atgtcggcag acaaaatgcc ggagaaacgt ggcatgatat cacgggcaat agaagcgaac 1380 cggtcgtcat taatagcgaa ggctggggag aatttcatgt taatggcggc agcgtcagca 1440 tctatgttca aaga 1454 <210> 24 <211> 1454 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 24 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggaa caagccaagc ggatgtcggc tatggagcgt 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaagatgtc acagcggtcg 360 aagttgatcc ggcggataga aacagagtca tcagcggcga acatctgatc aaagcgtata 420 cacattttca ttttccgggc agaggcagca catatagcga ctttaaatgg cattggtatc 480 attttgatgg cacggattgg gatgaaagca gaaaactgaa ccggatctat aaatttcagg 540 gcaaagcgtg ggattgggaa gtcagcaacg aaaacggcaa ctatgactat ctgacgtatg 600 ccgacatcga ttatgaccat ccggatgtcg ccgccgaaat taaaagatgg ggcacgtggt 660 atgccaatga acttcagctg gatggcttta gactggatgc cgtcaaacat atcaaattca 720 gctttcttcg ggactgggtc aaccatgtca gagaaaaaac gggcaaagaa atgtttacgg 780 tcgccgaata ttggcaaaat gatctgggcg ccctggaaaa ctatctgaac aaaacgaact 840 ttaaccatag cgtctttgac gtcccgcttc attatcaatt tcatgccgcc agcacacaag 900 gcggcggata tgacatgaga aaactgctga acggaacggt cgttagcaaa catccgctga 960 aaagcgtcac gtttgtcgat aaccatgata cacaaccggg acaaagcctg gaaagcacgg 1020 tccagacatg gtttaaaccg ctggcgtatg cctttatcct gacgagagaa tcaggatatc 1080 cgcaggtctt ttatggcgat atgtatggca cgaaaggaga tagccaaaga gaaatcccgg 1140 cgctgaaaca taaaatcgaa ccgatcctga aagccagaaa acagtatgcc tatggccgcc 1200 agaacgacta ttttgaccat catgacatcg tcggctggac gagagaagga aatagcagcc 1260 atgccaattc aggactggca gcgctgatta cagatggacc gggcggagca aaatggatgt 1320 atgtcggcag acaaaaagcg ggacaaacat ggagcgatat cacgggcaat agaagcggac 1380 cggtcgtcat taatagcgaa ggctggggca actttagcgt taatggcgga agcgtcagca 1440 tctatgtcca aaga 1454 <210> 25 <211> 1445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 25 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaccgcctg agaaacgata gcgcctatct gaaagaacat ggcatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggaa caagccaagc ggatgtcggc tatggagcgt 180 atgatctgta tgacctgggc gaattcaacc aaaaaggcac ggtcagaacg aaatatggca 240 cgaaaggcca acttcaaagc gccatcaaca gcctgaaaag caacggcatc aacgtctatg 300 gagatgtcgt catcaaccat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaatcc ggcgaacaga aaccaagaaa tcagcggcga atatctgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggaagca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cacggattgg gatgaaagca gaaaactgaa ccggatctat aaatttcggg 540 gcaaagcgtg ggattgggaa gtcagcaacg aaaacggcaa ctatgactat ctgacgtatg 600 ccgacatcga ttatgaccat ccggatgtcg ccgccgaaat tagaaattgg ggcacgtggt 660 atgccaatac gcttcagctg gatggcttta gactggatgc cgtcaaacat atcaaattca 720 gctttcttcg ggactgggtc aatcatgtca gaagcgccac gggcaaaaac atgtttacgg 780 tcgccgaata ttggcaaaat gatctgggcg ccctggaaaa ctatctgaac aaaacgaact 840 ttaaccatag cgtctttgac gtcccgcttc attatcaatt tcatgccgcc agcacacaag 900 gcggcggata tgatatgcaa aacctgctga acggaacggt cgttagcaaa catccgcttc 960 atagcgtcac gtttgtcgat aaccatgata cacaaccggg acaaagcctg gaaagcacgg 1020 tcgaagaatg gtttaaaccg ctggcgtatg cctttatcct gacgagagaa tcaggatatc 1080 cgcaggtctt ttatggcgac atgtatggca ttccgacaca tggagtcccg gcgctgaaac 1140 ataaaatcga accgatcctg gaagcgagac agaaatatgc ctatggccgc cagaacgact 1200 attttgacca tcatgacatc gtcggctgga cgagagaagg aaatagcagc catgccaatt 1260 caggactggc agcgctgatt acagatggac cgggcggagc aaaatggatg tatgtcggca 1320 gacaaaaagc gggacaaaca tggagcgata tcacgggcaa tagaagcgga ccggtcgtca 1380 tcaattcaga aggctggggc aactttagcg ttaatggcgg aagcgtcagc atctatgtcc 1440 aaaga 1445 <210> 26 <211> 1457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 26 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggaa caagccaagc ggatgtcggc tatggagcgt 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaaccc gaacaacaga aaccaagaag tcagcggcga atatacgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggcaaca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa caaccggatc tataaatttc 540 ggggcaaagg ctgggattgg gaagtcgata cggaatttgg caactatgac tatctgacgt 600 atgccgacat cgattatgac catccggatg tcgccgccga aattaaaaga tggggcacgt 660 ggtatgccaa tgaacttcag ctggatggct ttagactgga tgccgtcaaa catatcaaat 720 tcagctttct tcgggactgg gtcaaccatg tcagagaaaa aacgggcaaa gaaatgttta 780 cggtcgccga atattggcaa aatgatctgg gcgccctgga aaactatctg aacaaaacga 840 actttaacca tagcgtcttt gacgtcccgc ttcattatca atttcatgcc gccagcacac 900 aaggcggcgg atatgacatg agaaaactgc tgaacggaac ggtcgttagc aaacatccgc 960 tgaaaagcgt cacgtttgtc gataaccatg atacacaacc gggacaatca ctggaaagca 1020 cggtccagac atggtttaaa ccgctggcgt atgcctttat cctgacgaga gaatcaggat 1080 atccgcaggt cttttatggc gatatgtatg gcacgaaagg agatagccaa agagaaatcc 1140 cggcgctgaa acataaaatc gaaccgatcc tgaaagccag aaaacagtat gcctatggcg 1200 cccagcatga ctattttgac catcatgaca tcgtcggctg gacaagagaa ggagatagca 1260 gcgtcgctaa ttcaggactg gcagcgctga ttacagatgg accgggagga gcgaaaagaa 1320 tgtatgtcgg cagacaaaat gccggagaaa cgtggcatga tatcacgggc aatagaagcg 1380 aaccggtcgt cattaatagc gaaggctggg gagaatttca tgttaatggc ggcagcgtca 1440 gcatctatgt tcaaaga 1457 <210> 27 <211> 1457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 27 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaacgcctt caaaacgata gcgcctatct ggcagaacat ggaatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggag cgagccaaaa cgacgttggc tatggcgcct 180 atgatctgta tgacctgggc gaatttcatc aaaaaggcac ggtccggacg aaatatggca 240 caaaaggcga acttcagagc gctatcaaaa gccttcatag ccgggacatc aacgtctatg 300 gcgatgtcgt catcaatcat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaaccc gaacaacaga aaccaagaag tcagcggcga atatacgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggcaaca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa caaccggatc tataaatttc 540 ggggcaaagg ctgggattgg gaagtcgata cggaatttgg caactatgac tatctgacgt 600 atgccgacat cgattatgac catccggatg tcgccgccga aattaaaaga tggggcacgt 660 ggtatgccaa tgaacttcag ctggatggct ttagactgga tgccgtcaaa catatcaaat 720 acagctttct tcgggactgg gtcaaccatg tcagagaaaa aacgggcaaa gaaatgttta 780 cggtcgccga attttggaaa aatgatctgg gcgccctgga aaactatctg aacaaaacga 840 actttaacca tagcgtcttt gacgtcccgc ttcattatca attttatgcc gccagcaaac 900 agggaggagg ctatgacatg agaaaactgc tgaacggaac ggtcgttagc aaacatccgc 960 tgaaaagcgt cacgtttgtc gataaccatg acacacaacc ggaagaagca ctggaaagca 1020 cggtccagac atggtttaaa ccgctggcgt atgcctttat cctgacgaga gaatcaggat 1080 atccgcaggt cttttatggc gatatgtatg gcacgaaagg agatagccaa agagaaatcc 1140 cggcgctgaa acataaaatc gaaccgatcc tgaaagccag aaaacagtat gcctatggcg 1200 cccagcatga ctattttgac catcatgaca tcgtcggctg gacaagagaa ggagatagca 1260 gcgtcgctaa ttcaggactg gcagcgctga ttacagatgg accgggagga gcgaaaagaa 1320 tgtatgtcgg cagacaaaat gccggagaaa cgtggcatga tatcacgggc aatagaagcg 1380 aaccggtcgt cattaatagc gaaggctggg gagaatttca tgttaatggc ggcagcgtca 1440 gcatctatgt tcaaaga 1457 <210> 28 <211> 1448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 28 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaccgcctg agaaacgata gcgcctatct gaaagaacat ggcatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggag cgagccaaaa cgacgttggc tatggcgcct 180 atgatctgta tgacctgggc gaattcaacc aaaaaggcac ggtcagaacg aaatatggca 240 cgaaaggcca acttcaaagc gccatcaaca gcctgaaaag caacggcatc aacgtctatg 300 gagatgtcgt catcaaccat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaatcc ggcgaacaga aaccaagaaa tcagcggcga atatctgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggaagca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa caaccggatc tataaatttc 540 ggggcaaagc gtgggattgg gaagtcgata cggaatttgg caactatgac tatctgacgt 600 atgccgacat cgattatgac catccggatg tcgccgccga aattagaaat tggggcacgt 660 ggtatgccaa tacgcttcag ctggatggct ttagactgga tgccgtcaaa catatcaaat 720 acagctttct tcgggactgg gtcaatcatg tcagaagcgc cacgggcaaa aacatgttta 780 cggtcgccga attttggaaa aatgatctgg gcgccctgga aaactatctg aacaaaacga 840 actttaacca tagcgtcttt gacgtcccgc ttcattatca attttatgcc gccagcaaac 900 agggaggagg ctatgatatg cagaacctgc tgaatggaac ggtcgttagc aaacatccgc 960 ttcatagcgt cacgtttgtc gataaccatg acacacaacc ggaagaagca ctggaaagca 1020 cggtcgaaga atggtttaaa ccgctggcgt atgcctttat cctgacgaga gaatcaggat 1080 atccgcaggt cttttatggc gacatgtatg gcattccgac acatggagtc ccggcgctga 1140 aacataaaat cgaaccgatc ctggaagcga gacagaaata tgcctatggc cgccagaacg 1200 actattttga ccatcatgac atcgtcggct ggacgagaga aggaaatagc agccatgcca 1260 attcaggact ggcagcgctg attacagatg gaccgggcgg agcaaaatgg atgtatgtcg 1320 gcagacaaaa agcgggacaa acatggagcg atatcacggg caatagaagc ggaccggtcg 1380 tcatcaattc agaaggctgg ggcaacttta gcgttaatgg cggaagcgtc agcatctatg 1440 tccaaaga 1448 <210> 29 <211> 1448 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 29 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaccgcctg agaaacgata gcgcctatct gaaagaacat ggcatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggag cgagccaaaa cgacgttggc tatggcgcct 180 atgatctgta tgacctgggc gaattcaacc aaaaaggcac ggtcagaacg aaatatggca 240 cgaaaggcca acttcaaagc gccatcaaca gcctgaaaag caacggcatc aacgtctatg 300 gagatgtcgt catcaaccat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaaccc gaacaacaga aaccaagaag tcagcggcga atatacgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggcaaca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa caaccggatc tataaatttc 540 ggggcaaagg ctgggattgg gaagtcgata cggaatttgg caactatgac tatctgacgt 600 atgccgacat cgattatgac catccggatg tcgccgccga aattagaaat tggggcacgt 660 ggtatgccaa tacgcttcag ctggatggct ttagactgga tgccgtcaaa catatcaaat 720 acagctttct tcgggactgg gtcaatcatg tcagaagcgc cacgggcaaa aacatgttta 780 cggtcgccga attttggaaa aatgatctgg gcgccctgga aaactatctg aacaaaacga 840 actttaacca tagcgtcttt gacgtcccgc ttcattatca attttatgcc gccagcaaac 900 agggaggagg ctatgatatg cagaacctgc tgaatggaac ggtcgttagc aaacatccgc 960 ttcatagcgt cacgtttgtc gataaccatg acacacaacc ggaagaagca ctggaaagca 1020 cggtcgaaga atggtttaaa ccgctggcgt atgcctttat cctgacgaga gaatcaggat 1080 atccgcaggt cttttatggc gacatgtatg gcattccgac acatggagtc ccggcgctga 1140 aacataaaat cgaaccgatc ctggaagcga gacagaaata tgcctatggc cgccagaacg 1200 actattttga ccatcatgac atcgtcggct ggacgagaga aggaaatagc agccatgcca 1260 attcaggact ggcagcgctg attacagatg gaccgggcgg agcaaaatgg atgtatgtcg 1320 gcagacaaaa agcgggacaa acatggagcg atatcacggg caatagaagc ggaccggtcg 1380 tcatcaattc agaaggctgg ggcaacttta gcgttaatgg cggaagcgtc agcatctatg 1440 tccaaaga 1448 <210> 30 <211> 1445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 30 cagcagcgaa tctgaatggc acgctgatgc agtattttga atggtatacg ccgaacgatg 60 gccaacattg gaaccgcctg agaaacgata gcgcctatct gaaagaacat ggcatcacag 120 cagtttggat tccgccggca tataaaggag cgagccaaaa cgacgttggc tatggcgcct 180 atgatctgta tgacctgggc gaattcaacc aaaaaggcac ggtcagaacg aaatatggca 240 cgaaaggcca acttcaaagc gccatcaaca gcctgaaaag caacggcatc aacgtctatg 300 gagatgtcgt catcaaccat aaaggcggag cggatgctac agaacttgtc agagcggtcg 360 aagtcaatcc ggcgaacaga aaccaagaaa tcagcggcga atatctgatc gaagcgtata 420 cgtattttga ctttccgggc agaggaagca cacatagcaa ctttaaatgg cgctggtatc 480 attttgatgg cgtcgattgg gatcaaagca gacgcctgaa ccggatctat aaatttcggg 540 gcaaagcgtg ggattgggaa gtcgatacgg aatttggcaa ctatgactat ctgacgtatg 600 ccgacatcga ttatgaccat ccggatgtcg ccgccgaaat tagaaattgg ggcacgtggt 660 atgccaatac gcttcagctg gatggcttta gactggatgc cgtcaaacat atcaaataca 720 gctttcttcg ggactgggtc aatcatgtca gaagcgccac gggcaaaaac atgtttacgg 780 tcgccgaatt ttggaaaaat gatctgggcg ccctggaaaa ctatctgaac aaaacgaact 840 ttaaccatag cgtctttgac gtcccgcttc attatcaatt ttatgccgcc agcaaacagg 900 gaggaggcta tgatatgcag aacctgctga atggaacggt cgttagcaaa catccgcttc 960 atagcgtcac gtttgtcgat aaccatgaca cacaaccgga agaagcactg gaaagcacgg 1020 tcgaagaatg gtttaaaccg ctggcgtatg cctttatcct gacgagagaa tcaggatatc 1080 cgcaggtctt ttatggcgac atgtatggca ttccgacaca tggagtcccg gcgctgaaac 1140 ataaaatcga accgatcctg gaagcgagac agaaatatgc ctatggcgcc cagcatgact 1200 attttgacca tcatgacatc gtcggctgga caagagaagg agatagcagc gtcgctaatt 1260 caggactggc agcgctgatt acagatggac cgggcggagc aaaatggatg tatgtcggca 1320 gacaaaatgc cggacaaacg tggcatgata tcacgggcaa tagaagcgaa ccggtcgtca 1380 tcaattcaga aggctggggc gaatttcatg ttaatggcgg cagcgtcagc atctatgttc 1440 aaaga 1445 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 31 ctcttcgcta ttacgccagc tg 22 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 32 gctatgacca tgattacgcc aag 23 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 33 gccattcagg ctgcgcaact gt 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 34 tgcttccggc tcgtatgttg tg 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 35 tacatatgag ttatgcagtt tg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 36 gttatgagtt agttcaaatt cg 22 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 37 ggaggagaat catgaaac 18 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 38 ttatccttta ccttgtctc 19 <210> 39 <211> 480 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 39 Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly 1 5 10 15 Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His 20 25 30 Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln 35 40 45 Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe 50 55 60 His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly 85 90 95 Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val 100 105 110 Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly 115 120 125 Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg Gly 130 135 140 Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr 145 150 155 160 Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly 165 170 175 Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr 180 185 190 Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu 195 200 205 Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly 210 215 220 Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp 225 230 235 240 Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val 245 250 255 Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn 260 265 270 Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln 275 280 285 Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu 290 295 300 Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe 305 310 315 320 Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val 325 330 335 Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu 340 345 350 Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly 355 360 365 Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile 370 375 380 Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val 405 410 415 Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala 420 425 430 Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp 435 440 445 Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp 450 455 460 Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg 465 470 475 480 <210> 40 <211> 480 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 40 Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asn Asp Gly 1 5 10 15 Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser Asn Leu Lys Ser Lys 20 25 30 Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Ala Ser Gln 35 40 45 Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe 50 55 60 Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser Gln Leu 65 70 75 80 Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly Ile Gln Val Tyr Gly 85 90 95 Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Met Val 100 105 110 Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn Gln Glu Val Thr Gly 115 120 125 Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly 130 135 140 Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp Gly Val 145 150 155 160 Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Arg 165 170 175 Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His Pro Glu Val 195 200 205 Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn Thr Leu Gly 210 215 220 Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Phe 225 230 235 240 Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly Lys Asn Met 245 250 255 Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Ile Glu Asn 260 265 270 Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg His Pro Ser His Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu Ala Leu Glu 325 330 335 Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Thr Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser Lys Ile Asp Pro Ile 370 375 380 Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys Gln Asn Asp Tyr Leu 385 390 395 400 Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn Thr Ala His 405 410 415 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala Gly Gly Ser 420 425 430 Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val Trp Ser Asp 435 440 445 Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp Gly Trp 450 455 460 Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp Val Asn Lys 465 470 475 480

Claims (52)

  1. SEQ ID NO: 1 의 변이체가 SEQ ID NO: 1 과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하고, 코딩된 변이체가 α-아밀라아제 활성을 나타내는, SEQ ID NO: 1 의 변이체를 코딩하는 단리된 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 SEQ ID NO: 2 에 언급된 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 코딩된 변이체를 산출하는 핵산.
  3. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이, 코딩된 변이체의 표면 상에 위치하는 하전 잔기에 이뤄지는 핵산.
  4. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이, 활성 부위 아미노산 잔기에 이뤄지는 핵산.
  5. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이, 위치 1 에서의 잔기 이외의 아미노산 잔기에 이뤄지는 핵산.
  6. 제 1 항에 있어서, 변이체가 잔기 2 에서 105 및 잔기 208 에서 396 까지 확 장되는 도메인 A, 잔기 106 에서 207 까지 확장되는 도메인 B 및 잔기 397 에서 상기 코딩된 변이체의 C 말단까지 확장되는 도메인 C 를 포함하는 핵산.
  7. 제 6 항에 있어서, 코딩된 변이체가 도메인 A 에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 핵산.
  8. 제 6 항에 있어서, 코딩된 변이체가 도메인 B 에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 핵산.
  9. 제 6 항에 있어서, 코딩된 변이체가 도메인 C 에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 핵산.
  10. 제 1 항에 있어서, 코딩된 변이체가 치환된, 삽입된 또는 결실된 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 핵산.
  11. 제 10 항에 있어서, 코딩된 변이체가 치환된, 삽입된 또는 결실된 5 개 이상의 아미노산을 포함하는 핵산.
  12. 제 11 항에 있어서, 코딩된 변이체가 치환된, 삽입된 또는 결실된 10 개 이상의 아미노산을 포함하는 핵산.
  13. 제 12 항에 있어서, 코딩된 변이체가 11 내지 30 개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 핵산.
  14. 제 12 항에 있어서, 코딩된 변이체가 11 내지 70 개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 핵산.
  15. 제 1 항에 있어서, 코딩된 변이체가 SEQ ID NO: 4 내지 15 의 폴리펩티드 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 핵산.
  16. 제 1 항에 있어서, 코딩된 변이체가 하기 아미노산 치환, 삽입 또는 결실 중 하나 이상을 포함하는 핵산: K23N; Q26R; A33K; T49A; A52N; H68N; E82Q; K88N; H91K; R93N; D94G; D114L; T116R; D121N; A123N; D124N; R127Q; V128E; I129V; H133Y; L134T; K136E; H140Y; H142D; S148N; Y150H; D152N; H156R; T163V; E167Q; K170R; 위치 172 에서의 N 의 삽입; Q178R; A181G; S187D; N188T; N190F; K213R; R214N; E222T; F238Y; E250S; K251A; E255N; Y262F; Q264K; H293Y; T297K; R305Q; K306N; K319H; G332E; Q333E; S334A; Q340E; T341E; TKGDSQREI 에서 IPTHGV--- 로의 잔기 369-377 의 삽입 또는 결실 (여기서 실선은 결실을 나타냄); K389E; K392Q; Q393K; A398R; H400N; D416N; V419H; R437W; N444K; E447Q; H450S; E458G; E469N; 또는 H471S.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  19. 제 9 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제 17 항 또는 제 19 항에 있어서, 세포가 미생물인 숙주 세포.
  21. 제 20 항에 있어서, 미생물이 박테리아 또는 진균류인 숙주 세포.
  22. 제 21 항에 있어서, 박테리아가 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리케니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필러스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필러스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 써큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus), B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 또는 S. 뮤리너스 (S. murinus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 그람 (Gram) 양성 박테리아; 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 또는 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 인 그람 음성 박테리아인 단리된 숙주 세포.
  23. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 핵산에 의해 코딩된 변이체.
  24. 제 23 항의 변이체를 포함하는 수동 또는 자동 식기세정 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 계면활성제, 세제 강화제, 복합 작용제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제 (suds suppressor), 부식방지제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 히드로트롭, 변색 억제제 및 향수 중 하나 이상을 추가로 포함하는 수동 또는 자동 식기세정 조성물.
  26. 제 24 항의 수동 또는 자동 식기세정 조성물을 식기를 세정하는데 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함하는 식기 세정 방법.
  27. 제 23 항의 변이체를 포함하는 세제 첨가제.
  28. 제 27 항의 세제 첨가제를 포함하고, 추가로 계면활성제, 세제 강화제, 복합 작용제, 중합체, 표백 시스템, 안정화제, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 부식방지제, 오염 현탁화제, 오염 재침착방지제, 염료, 살균제, 히드로트롭, 형광 증백제 (optical brightener), 직물 컨디셔너, 및 향수 중 하나 이상을 포함하는 세탁 세제.
  29. 세탁 또는 식기세정을 위한 제 27 항의 세제 첨가제의 용도.
  30. 세탁 또는 식기세정을 위한 제 23 항의 변이체의 용도.
  31. 제 23 항의 변이체를, 임의로 비-분진 과립, 미립, 안정화된 액체 또는 보호된 효소의 형태로 포함하는 세제 첨가제.
  32. 제 31 항에 있어서, 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀룰라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함하는 세제 첨가제.
  33. 제 32 항에 있어서, 아밀라아제가 또다른 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 이 소아밀라아제, 또는 글루코아밀라아제인 세제 첨가제.
  34. 제 31 항의 세제 첨가제를 포함하는 세제 조성물.
  35. 제 23 항의 변이체를 포함하는 세제 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서, 셀룰라아제, 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 카르보히드라아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 키티나아제, 큐티나아제, 시클로덱스트린 글루카노트랜스페라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 할로퍼옥시다아제, 인버타아제, 락카아제, 리파아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 펙틴 가수분해 효소, 펩티도글루타미나아제, 퍼옥시다아제, 파이타아제, 폴리페놀옥시다아제, 단백질 가수분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 풀룰라나아제, 이소아밀라아제, 카라기나아제, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 추가로 포함하는 세제 조성물.
  37. 수용액 중에 제 23 항의 변이체를 포함하고, 임의로 또다른 효소를 포함하는 직물 발호 조성물.
  38. 제 37 항의 발호 조성물을 직물을 발호시키는데 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함하는 직물 발호 방법.
  39. 직물 발호를 위한 제 23 항의 변이체의 용도.
  40. 수용액 중에 제 23 항의 변이체를 포함하는 전분 가공 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서, 글루코아밀라아제, 이소아밀라아제, 풀룰라나아제, 파이타아제 또는 이의 조합을 추가로 포함하는 전분 가공 조성물.
  42. 제 40 항의 조성물을 전분을 가공하는데 충분한 시간 동안 적용하는 것을 포함하는 전분 가공 방법.
  43. 용액 또는 젤 중에 제 23 항의 변이체를 포함하고, 임의로 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 프로테아제, 펙티나아제, 항균제, 또는 이의 임의의 조합을 추가로 포함하는 균막 가수분해 조성물.
  44. 제 43 항의 조성물을 균막을 처리하는데 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함하는 균막 가수분해 방법.
  45. 용액 중에 제 23 항의 변이체를 포함하는 전분 당화 조성물.
  46. 제 45 항의 조성물을 전분을 당화시키는데 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함하는 전분 당화 방법.
  47. 용액 중에 제 23 항의 변이체를 포함하는 전분 액화 조성물.
  48. 제 47 항의 조성물을 전분을 액화시키는데 충분한 기간 동안 적용하는 것을 포함하는 전분 액화 방법.
  49. 용액 또는 젤 중에 제 23 항의 변이체를 포함하는 제빵 조성물.
  50. 제 49 항의 제빵 조성물을 적용하는 것을 포함하는 제빵 방법.
  51. 하기 단계를 포함하는, 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제와 비교하여 하나 이상의 변형된 속성을 갖는 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제 변이체의 제조 방법:
    (1) 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 구조를, 상기 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제에 비해 하나 이상의 바람직한 속성을 갖는 모델 α-아밀라아제와 비교하는 단계,
    (2) 모델 α-아밀라아제와 구조적으로 보존된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 하나 이상의 아미노산 또는 구조 영역을 확인하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2) 에서 확인된 아미노산 잔기 또는 구조 영역이 변형된 야생형 B. 리케니포르미스 (B. licheniformis) α-아밀라아제의 변이체를 구축하는 단계; 및
    (4) 변이체를 시험하여, 하나 이상의 바람직한 속성이 변이체에 부여되었는지의 여부를 확인하는 단계.
  52. 제 51 항에 있어서, 모델 α-아밀라아제가 바실러스 종 (Bacillus sp.) 번호 707 α-아밀라아제인 방법.
KR1020097024818A 2007-05-30 2008-05-28 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제의 개선된 변이체 KR20100024395A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92474607P 2007-05-30 2007-05-30
US60/924,746 2007-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100024395A true KR20100024395A (ko) 2010-03-05

Family

ID=39864805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097024818A KR20100024395A (ko) 2007-05-30 2008-05-28 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제의 개선된 변이체

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20110033882A1 (ko)
EP (1) EP2155870A2 (ko)
JP (1) JP2010528606A (ko)
KR (1) KR20100024395A (ko)
CN (1) CN101815783A (ko)
BR (1) BRPI0812786A2 (ko)
CA (1) CA2689629A1 (ko)
MX (1) MX2009012682A (ko)
RU (1) RU2009149405A (ko)
WO (1) WO2008153805A2 (ko)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008143889A1 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Research Foundation Of State University Of New York Induction of a physiological dispersion response in bacterial cells in a biofilm
WO2011017093A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Danisco Us Inc. Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof
EP2521775A1 (en) 2010-01-04 2012-11-14 Novozymes A/S Alpha-amylases
GB201011513D0 (en) * 2010-07-08 2010-08-25 Danisco Method
WO2012048758A1 (fr) 2010-10-15 2012-04-19 S.A. Realco Produit et procede d'elimination des biofilms
US20140206026A1 (en) * 2011-06-30 2014-07-24 Novozymes A/S Method for Screening Alpha-Amylases
RU2014121491A (ru) * 2011-10-28 2015-12-10 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Варианты вариантной альфа-амилазы, образующей мальтогексаозу
AU2011383639B2 (en) * 2011-12-21 2014-10-02 Colgate-Palmolive Company Oral care compositions
EP4026902A1 (en) * 2012-06-08 2022-07-13 Danisco US Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
BR112015003071A2 (pt) * 2012-08-16 2019-09-24 Danisco Us Inc método de uso de alfa-amilase a partir de aspergillus clavatus e de isoamilase para sacarificação.
EP3336183B1 (en) 2013-03-11 2021-05-12 Danisco US Inc. Alpha-amylase conbinatorial variants
CN114634921A (zh) * 2013-06-06 2022-06-17 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
CN103509739B (zh) * 2013-08-06 2015-08-05 安徽工程大学 一种生产多酶系的地衣芽孢杆菌及其制备方法和应用
MX2016006489A (es) * 2013-11-20 2016-08-03 Danisco Us Inc Alfa-amilasas variantes que tienen susceptibilidad reducida a la escision por proteasas y metodos de uso.
WO2015157656A1 (en) * 2014-04-10 2015-10-15 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN106164237B (zh) * 2014-04-11 2021-01-05 诺维信公司 洗涤剂组合物
US10131863B2 (en) 2014-04-11 2018-11-20 Novozymes A/S Detergent composition
CA2945977C (en) 2014-04-24 2019-12-31 Bnnt, Llc Continuous boron nitride nanotube fibers
WO2016070179A1 (en) 2014-11-01 2016-05-06 Bnnt, Llc Target holders, multiple-incidence angle, and multizone heating for bnnt synthesis
MX2017014125A (es) 2015-05-08 2018-03-01 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican las mismas.
EP3964575A3 (en) 2015-05-08 2022-09-28 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
KR102505224B1 (ko) 2015-05-13 2023-03-02 비엔엔티 엘엘씨 질화 붕소 나노튜브 중성자 검출장치
WO2016186721A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Bnnt, Llc Boron nitride nanotube synthesis via direct induction
FI3419991T3 (fi) 2016-03-04 2023-01-31 Modifioidut ribosomaaliset promoottorit proteiinien tuottamiseksi mikro-organismeissa
CN107345223B (zh) * 2016-09-12 2019-05-03 南京百斯杰生物工程有限公司 α淀粉酶变体及其应用
CN110023474A (zh) * 2016-09-29 2019-07-16 诺维信公司 酶用于洗涤的用途、洗涤方法和器皿洗涤组合物
WO2018102348A1 (en) * 2016-11-29 2018-06-07 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN110520520B (zh) 2017-02-24 2024-03-22 丹尼斯科美国公司 用于增加地衣芽孢杆菌中蛋白质产生的组合物和方法
EP3601551A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having rnase activity
WO2019089898A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Danisco Us Inc Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes
CN108396019B (zh) * 2018-03-01 2021-08-03 江南大学 一种降低普鲁兰酶对环糊精敏感性的方法
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
US20220073845A1 (en) 2018-10-02 2022-03-10 Novozymes A/S Endonuclease 1 ribonucleases for cleaning
CN114945665A (zh) 2020-01-15 2022-08-26 丹尼斯科美国公司 用于增强地衣芽孢杆菌中蛋白产生的组合物和方法
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2024033135A2 (en) * 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033133A2 (en) * 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Enzyme compositions comprising an amylase

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0772684B1 (en) * 1994-06-17 2005-08-10 Genencor International, Inc. Amylolytic enzymes derived from the b. licheniformis alpha-amylase, having improved characteristics
CA2197203A1 (en) * 1994-08-11 1996-02-22 Genencor International, Inc. An improved cleaning composition
JP4658433B2 (ja) * 1999-12-23 2011-03-23 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 改良された機能特性を有するタンパク質を得る方法
EP2302048B1 (en) * 2000-03-08 2014-07-09 Novozymes A/S Variants with altered properties

Also Published As

Publication number Publication date
RU2009149405A (ru) 2011-07-10
JP2010528606A (ja) 2010-08-26
US20110033882A1 (en) 2011-02-10
EP2155870A2 (en) 2010-02-24
CN101815783A (zh) 2010-08-25
MX2009012682A (es) 2009-12-14
WO2008153805A3 (en) 2009-05-14
BRPI0812786A2 (pt) 2014-10-14
WO2008153805A2 (en) 2008-12-18
CA2689629A1 (en) 2008-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9334466B2 (en) Alpha-amylase variants
KR20100024395A (ko) 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라아제의 개선된 변이체
CA2704644C (en) Variants of bacillus licheniformis alpha-amylase with increased thermostability and/or decreased calcium dependence
US9040278B2 (en) Production of glucose from starch using alpha-amylases from Bacillus subtilis
EP2428572A2 (en) Alkaliphilic Bacillus species alpha-amylase variants, compositions comprising alpha-amylase variants, and methods of use
EP2132316B1 (en) Enhanced amylase production by n-terminal addition to mature amylase protein

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid