KR20100022355A - Method for monitering lactic acid bacteria during kimchi fermentation using a novel multiplex pcr - Google Patents

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KR20100022355A
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Abstract

PURPOSE: A method for detecting lactobacillus in Kimchi fermentation through multiplex PCR is provided to accurately and quickly detect grouping pattern of lactobacillus and recue time and cost. CONSTITUTION: A primer set for detecting lactobacillus in Kimchi fermentation using multiplex PCR comprises a primer pair of sequence number 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, 15 and 16, 17 and 18, or 19 and 20. A method for detecting lactobacillus in Kimchi fermentation comprises: a step of making a primer set which is specific to lactobacillus relating to Kimchi fermentation; a step of collecting a sample from Kimchi fermented 4°C~25°C in a specific time interval; a step of measuring change of strain number; a step of irritation; a step of confirming 10 kinds of lactobacillus by performing m-PCR; a step of confirming with a 16S rDNA(ribosomal DNA); and a step of detecting final m-PCR.

Description

다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인방법{Method for monitering lactic acid bacteria during kimchi fermentation using a novel multiplex PCR}Method for monitering lactic acid bacteria during kimchi fermentation using a novel multiplex PCR}

본 발명은 다중중합효소연쇄반응(m-PCR, multiplex polymerase chain reaction)을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 김치발효 관련 주요 젖산균 10종에 대해 특이적으로 확인할 수 있는 10종의 프라이머 세트를 제작하고, m-PCR의 조건을 확립한 후 각각 다른 온도(4도 및 8도, 15도, 25도)에서 발효되어지는 김치를 일정한 시간 간격으로 시료를 채취한 후, 선택배지를 사용한 균수의 변화 및 이화학적 성질의 변화를 조사하고 각각의 분리된 젖산균 96 클론에 대해서 m-PCR을 실시하는 한편 m-PCR로 확인되지 않은 클론은 16S rDNA로 확인하여 특이 젖산균 종의 변화양상을 확인하는 것으로 구성된 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for identifying lactic acid bacteria during fermentation of kimchi using multiplex polymerase chain reaction (m-PCR), and more specifically, to identify 10 major lactic acid bacteria related to kimchi fermentation. After making primer sets of species, establishing the conditions of m-PCR, sampling kimchi fermented at different temperatures (4 degrees, 8 degrees, 15 degrees, 25 degrees) at regular time intervals, and then selecting Changes in the number of bacteria and physicochemical properties using the medium and m-PCR for each isolated lactic acid bacteria 96 clones were identified by 16S rDNA. The present invention relates to a method for identifying lactic acid bacteria during fermentation of kimchi using multiple polymerase chain reaction consisting of confirming aspects.

김치는 우리나라의 전통발효식품으로서 우리의 밥상에서는 빼 놓을 수 없는 필수적인 부식이다. 현재 국내 김치 총수요는 연간 15만 톤 정도이고 이 중 상품김치 수요는 계속 증가하여 2007년에는 전체 수요의 60% 이상인 약 100만 톤으로 추정되고 있다. 김치는 재료 및 방법, 계절, 지역에 따라 200여 가지의 종류가 있는 것으로 보고되어져 있다. 한편, 1988년 서울올림픽 이후 김치는 세계적으로 널리 알려지게 되었고 2001년 코덱스(Codex Alimentarius)에 김치가 등록된 이후 세계적인 식품으로 각광받고 있으며, 수출 또한 증가하고 있는 추세이다.Kimchi is a traditional fermented food of Korea, which is an essential corrosion that cannot be excluded from our table. At present, the domestic demand for kimchi is about 150,000 tons per year. Among them, the demand for commodity kimchi continues to increase. It is reported that there are more than 200 kinds of kimchi depending on the material, method, season and region. Since the 1988 Seoul Olympics, kimchi has become widely known around the world, and since it was registered with Codex Alimentarius in 2001, it has been recognized as a global food and exports are increasing.

김치 미생물에 관한 연구는 1939년에 처음 시작된 이래 현재까지 가장 많이 연구되고 있는 분야이다. 김치는 200여 종류의 박테리아와 몇 종류의 효모가 김치의 발효에 영향을 미치지만 대부분 젖산균에 의해서 김치발효 및 품질이 결정되어진다. 일반적으로 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)는 김치 발효가 가장 활발할 때 최고량에 달하여 김치의 신선한 맛을 부여하고 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarum)은 높은 온도와 후숙기 발효과정에서 우점종으로서 김치를 산패하게 하는 원인균으로 알려져 있다. 즉, 류코노스톡 메센테로이데스와 락토바실러스 프란타륨은 좋은 맛과 과 성숙에 관련된 균으로 알려져 있다. 김치는 pH 4.2와 산도 0.6-0.8%로 발효되었을 때 향과 맛 그리고 씹는 느낌이 가장 좋으며, 김치의 일반적인 맛은 발효기간 중 여러 인자(pH 및 산도, 온도)의 영향을 받는다. Research on kimchi microorganisms has been the most studied area since its inception in 1939. Kimchi has about 200 kinds of bacteria and some kinds of yeast affecting fermentation of kimchi, but most of them are fermented and quality is determined by lactic acid bacteria. In general, Leuconostoc mesenteroides reaches the highest amount when kimchi fermentation is most active, giving the fresh taste of kimchi and Lactobacillus plantarum It is known as a causative agent of rancid kimchi as a dominant species in high temperature and ripening fermentation process. In other words, Leukonostock mesenteroides and Lactobacillus plantarium are known to be associated with good taste and overgrowth. Kimchi has the best aroma, taste and chew when fermented to pH 4.2 and acidity of 0.6-0.8%. The general taste of kimchi is affected by various factors (pH, acidity, temperature) during fermentation.

최근 김치발효 중 분자유전학적 방법을 통하여 김치발효 관여 미생물을 확인하려고 시도 중에 있다. 그 예로서 특징적으로 종 특이적 프라이머를 이용한 PCR, 단백질-SDS-PAGE, PCR-DGGE 기술, genome probing microarray, 16S rRNA 염기서열 분석 등의 방법이 사용되어지고 있다.Recently, Kimchi fermentation attempts to identify the microorganisms involved in kimchi fermentation through molecular genetic method. For example, methods using species-specific primers, PCR, protein-SDS-PAGE, PCR-DGGE techniques, genome probing microarrays, and 16S rRNA sequencing have been used.

종래 종 특이적 프라이머를 이용한 PCR 방법과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0706774호 "김치 젖산균 동정용 프라이머 및 프라이머 셋"에는 특정한 단일 또는 복수의 김치 젓산균과 종 특이적으로 반응하는 프라이머 및 그 조합을 이용하여 김치 및 절임류 등에서 많이 발견되는 젖산균의 동정에 있어서 생화학적 방법이 안고 있는 문제, 즉, 시간이 많이 소요되고 부정확한 단점을 극복하여 신속하고도 정확한 균종의 동정을 가능하게 하고 있다.Regarding the PCR method using a conventional species-specific primer, Korean Patent No. 10-0706774 "Kimchi Lactic Acid Bacteria Identification Primer and Primer Set" includes species-specific primers that react with specific single or multiple kimchi Lactobacillus and combinations thereof. By using to overcome the problem of biochemical methods in the identification of lactic acid bacteria found in many kimchi and pickles, that is, time-consuming and inaccurate disadvantages to overcome the shortcomings, it is possible to quickly and accurately identify the species.

한편 m-PCR이 1988년 처음으로 고안된 이래, 동시에 같은 증폭반응에서 두 개 혹은 그 이상의 종을 증폭할 수 있는 방법으로 한 번의 반응으로 한 개 이상의 목표서열을 동시에 증폭할 수 있어 시간과 노력을 절약할 수 있는 장점이 있다. 두 개내지 세 개의 특이 프라이머를 사용하여 김치의 젖산균을 확인 방법은 보고되어 있으나, 김치 주요 발효 젖산균인 10종의 균에 대한 특이 프라이머 제작 및 m-PCR의 방법은 전무한 상태이다.Since m-PCR was first conceived in 1988, it was possible to amplify two or more species in the same amplification reaction simultaneously, saving time and effort by simultaneously amplifying more than one target sequence in a single reaction. There is an advantage to this. Two to three specific primers have been reported to determine the lactic acid bacteria of kimchi, but there are no methods for producing specific primers and m-PCR for 10 bacteria that are major kimchi fermented lactic acid bacteria.

이러한 다중효소중합반응(mPCR)을 이용한 기술로는 대한민국 등록특허 제10-0775641호 "다중효소중합반응 방법을 이용한 기능성 식품으로부터유산균 검출방법"에 특이 프라이머를 이용하여 락토바실러스 속 2종과 비피도박테리움 속 2종의 4가지 다른 젖산균을 한 번의 반응으로 구분해 낼 수 있어서 단일 또는 이중 PCR과 비교해 볼 때, 시간과 비용을 줄일 수 있는 효과가 있으며, 상기 프라이머를 이용하여 검사체 내에 혼재되어 있는 락토바실러스 속 균종과 비피도박테리움 속 균종을 동시에 신속, 정확하게 동정할 수 있어, 건강식품 및 의약품의 원료개발 및 프로바 이오틱 제품의 표기시스템의 신뢰도를 모니터할 수 있는 방법이 개시되어 있다.As a technique using the multiple enzyme polymerization reaction (mPCR), two species of Lactobacillus genus and BP gambling using specific primers in Korean Patent No. 10-0775641 "Method for detecting lactic acid bacteria from functional food using the multiple enzyme polymerization reaction method" 4 different lactic acid bacteria of two species of terium can be separated into one reaction, which can reduce time and cost compared to single or double PCR, and are mixed in the test body using the primers. A method for rapidly and accurately identifying Lactobacillus spp. And Bifidobacterium spp. At the same time can be used to monitor the reliability of the labeling system of probiotic products and the development of ingredients for health foods and pharmaceuticals. .

김치의 발효기간 중 미생물 집단의 연구는 학문적 가치뿐만 아니라 김치 발효의 정확한 이해를 통해 김치의 산업적 생산에서 품질을 조절할 수 있는 매우 중요한 지표이다. The study of microbial populations during the fermentation of kimchi is a very important indicator to control the quality of kimchi's industrial production through accurate understanding of kimchi fermentation as well as academic value.

따라서 본 발명자들은 김치 발효중 젖산균을 확인함에 있어 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 10종의 주요 김치발효 젖산균의 특이적 프라이머를 제작, m-PCR의 조건을 확립하고 이를 통하여 김치발효 중 젖산균의 변화양상을 관찰함으로써 본 발명에 이르게 되었다.Therefore, the present inventors have made intensive studies to overcome the above-mentioned problems in identifying lactic acid bacteria during fermentation of kimchi, and produced specific primers for 10 major kimchi fermented lactic acid bacteria to establish conditions for m-PCR. This led to the present invention by observing the changes of lactic acid bacteria during kimchi fermentation.

따라서 본 발명의 목적은 김치발효 관여 미생물을 보다 정확하게 확인함에 있어 김치발효 중 젖산균을 효과적으로 검출할 수 있는 방법 및 상기 방법에 이용하기 위한 프라이머 및 프라이머 세트를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for effectively detecting lactic acid bacteria during kimchi fermentation and a primer and a primer set for use in the method in more accurately identifying the kimchi fermentation-related microorganisms.

상기와 같은 본 발명의 목적은 김치발효 관련 주요 젖산균 10종에 대해 특이적으로 검출할 수 있는 10종의 프라이머 세트를 제작하고, m-PCR의 조건을 확립한 후 각각 다른 온도(4도 및 8도, 15도, 25도)에서 발효되어지는 김치를 일정한 시간 간격으로 시료를 채취한 후, 선택배지를 사용한 균수의 변화 및 이화학적 성질의 변화를 조사하고 각각의 분리된 젖산균 96 클론에 대해서 m-PCR을 실시하는 한편 m-PCR로 확인되지 않은 클론은 16S rDNA로 확인하여 특이 젖산균 종의 변화양상을 확인함으로써 달성되었다.The purpose of the present invention as described above is to prepare a set of 10 primers that can be specifically detected for 10 major kimchi fermentation-related lactic acid bacteria, and after establishing the conditions of m-PCR, respectively, different temperatures (4 degrees and 8 degrees) , Kimchi fermented at 15 degrees, 25 degrees) is sampled at regular time intervals, and then the change in the number of bacteria and the physicochemical properties using the selective medium was investigated and m for each of the lactic acid bacteria 96 clones Clones that were not identified by m-PCR while performing -PCR were achieved by confirming changes in specific lactic acid bacteria species by confirming with 16S rDNA.

본 발명은 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 및 서열번호 19 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 1쌍의 염기서열 또는 이들 각 염기서열과 상보적인 염기서열의 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열의 쌍을 포함하는 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention is SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16 , SEQ ID NO: 17 and 18, and SEQ ID NO: 19 and 20, a polymerase comprising a pair of base sequences selected from the group consisting of any one or more base sequences selected from the group of base sequences complementary to each of these base sequences It provides a primer set for checking lactic acid bacteria during fermentation of kimchi using a chain reaction.

본 발명은 또한 김치의 발효과정 중 발효와 관련된 젖산균의 군집양상을 m-PCR을 이용하여 정확하고 신속하게 확인하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for accurately and quickly identifying the population pattern of lactic acid bacteria related to fermentation during the fermentation process of kimchi using m-PCR.

본 발명에 따른 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균의 확인 방법은 Identification method of lactic acid bacteria in kimchi fermentation using multiple polymerase chain reaction according to the present invention

김치발효 관련 주요 젖산균 10종에 대해서 확인할 수 있는 종 특이적 프라이머(primer)를 제작하는 단계;Preparing a species-specific primer (primer) that can be identified for the major lactic acid bacteria related to kimchi fermentation;

m-PCR의 조건을 확립한 후 온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 발효 중 김치를 일정한 시간간격으로 시료를 채취하는 단계; After establishing the conditions of the m-PCR sampling the kimchi during the fermentation by temperature (4 ℃ and 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃) at a predetermined time interval;

선택배지를 사용한 균수의 변화를 측정하는 단계; Measuring a change in the number of bacteria using the selection medium;

발효 중 이화학적 성질의 변화를 조사하는 단계; Investigating changes in physicochemical properties during fermentation;

각각 단계에서 분리된 젖산균 96 클론에 대해서 m-PCR을 실시하여 주요 10종의 젖산균을 확인하는 단계; Performing m-PCR on the lactic acid bacteria 96 clones isolated in each step to identify 10 major lactic acid bacteria;

m-PCR로 확인되지 않은 클론은 16S rDNA로 확인단계; 및clones not identified by m-PCR were identified by 16S rDNA; And

최종 m-PCR를 검정하는 단계Step to test final m-PCR

로 구성된다.It consists of.

본 발명의 방법에 따르면 m-PCR를 사용하여 김치발효 중 젖산균의 군집양상을 정확하고 신속하게 확인함으로써 미생물 확인에 시간과 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 김치 발효의 정확한 미생물 확인을 통한 김치의 산업에 미생물의 표준화를 제시하여 김치 품질을 조절할 수 있을 것으로 기대된다.According to the method of the present invention, by using m-PCR to accurately and quickly confirm the population pattern of lactic acid bacteria during fermentation of kimchi, not only can save time and cost in microbial identification but also the industry of kimchi through accurate microorganism identification of kimchi fermentation. It is expected to control the quality of kimchi by suggesting the standardization of microorganisms.

본 발명에 따른 김치발효 관련 주요 젖산균 10종은 여러 문헌(학술지 및 김치관련 연구보고서, 서적 등)을 참고로 하여 선택된 류코노스톡 칼노슘(Leuconostoc carnosum) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토슈스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 바이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 및 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)이다.Ten major lactic acid bacteria related to kimchi fermentation according to the present invention were selected by referring to a number of literature (academic journals and kimchi-related research reports, books, etc.) and Leuconostoc carnosum and Leuconostoc mesenteroides . , Lactobacillus brevis , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus pentosus , Lactobacillus sakei , Lactococcus lactis , Pediococcus pentosaceus , Weissella confusa and Weissella koreensis .

상기 10종 젖산균에 대해서 특이 유전자 선택하고 이로부터 특이 프라이머를 제작하였다.Specific genes were selected for the 10 lactic acid bacteria and specific primers were prepared therefrom.

본 발명에 따른 m-PCR의 조건은 공시균주를 이용하여 확립하였다. 공시균주는 한국유전자은행(KCTC) 및 한국종균협회(KCCM), 한국농업미생물자원센타(KACC)로부터 획득한 공시균주 및 김치로부터 직접 분리하여 보관하고 있던 균주를 사용하였다.The conditions of m-PCR according to the present invention were established using the test strain. The test strains were strains that were directly isolated and stored from the strains and kimchi obtained from the Korea Gene Bank (KCTC), the Korean spawn association (KCCM), the Korea Agricultural Microbial Resources Center (KACC).

상기 확립된 m-PCR를 이용하여 실제 김치발효 중 젖산균의 변화양상 관찰을 위한 김치재료는 경남 거창군에 위치한 대상 종갓집 김치를 사용하여 4도 및 8도, 15도, 25도에서 발효시키면서 일정한 간격으로 시료를 채취하였다. Kimchi material for observing the changes of lactic acid bacteria during actual kimchi fermentation using the established m-PCR is fermented at regular intervals while fermenting at 4 degrees, 8 degrees, 15 degrees and 25 degrees using the target Jonggap kimchi located in Geochang, Gyeongnam. Samples were taken.

김치 발효 중 pH의 변화는 pH 측정기(MP220, pH meter, UK)를 사용하였고 산도는 pH 8.2까지 중화하는데 소요되는 0.1N NaOH용액 소비량을 측정한 후 젖산으로 환산하여 측정하였고 아래의 계산 방식으로 환산한 후 젖산에 대한 백분율(%)로 표기하였다.The pH of Kimchi fermentation was measured using a pH meter (MP220, pH meter, UK) and the acidity was measured by converting it into lactic acid after measuring 0.1N NaOH solution consumption required to neutralize to pH 8.2. And then expressed as a percentage of lactic acid.

산도(%, 젖산) = 0.009 × 0.1N NaOH의 량(ml) × F × 100/시료량(ml)Acidity (%, lactic acid) = 0.009 × 0.1 N Amount of NaOH (ml) × F × 100 / Sample amount (ml)

상기식에서 F는 0.1N NaOH 인자이다.Where F is 0.1N NaOH factor.

염도는 염도계(Atago Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였으며 환원당은 밀러(Miller, 1959)의 디니트로-살익시레이트(Dinitro-salicylate, DNS) 방법으로 측정하였다. 한편, 김치발효 중 9 종의 유기산 변화는 고속액체크로마토그래피(HPLC, Perkin-Elmer 200 series)를 이용하여 분석하였다.Salinity was measured using a salinometer (Atago Co., Tokyo, Japan) and reducing sugars were measured by Miller (1959) 's Dinitro-salicylate (DNS) method. On the other hand, nine organic acid changes during kimchi fermentation were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC, Perkin-Elmer 200 series).

김치발효 중 총 생균수의 변화는 트리픽 소이 한천배지(Tryptic Soy agar, TSA, Difco, Becton Dickinson Co., Sparks, MD, USA), 총 젖산균수는 락토바실루 스 MRS 한천배지(Lactobacilli MRS agar, MRSA, Difco), 류코노스톡은 PES 한천배지(Yeast extract 0.5 g, tripticase peptone 5.0 g, sucrose 20.0 g, MgSO47H2O 0.5 g, KH2PO4 1.0 g, phenyl ethyl alcohol 2.5 g, (NH4)SO4 2.0 g, agar 15.0 g per of liter, PESA), 페디오코쿠스는 엠 엔토로코쿠스 한천배지(m Enterococcus agar, m-ENTA, Difco)를 사용하여 측정하였다.The total viable cell counts during fermentation of Kimchi were Tryptic Soy agar, TSA, Difco, Becton Dickinson Co., Sparks, MD, USA, and the total number of lactic acid bacteria was Lactobacilli MRS agar. , MRSA, Difco), and leukonostock are PES agar medium (Yeast extract 0.5 g, tripticase peptone 5.0 g, sucrose 20.0 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, KH 2 PO 4 1.0 g, phenyl ethyl alcohol 2.5 g, ( NH 4 ) SO 4 2.0 g, agar 15.0 g per of liter (PESA), Pediococcus was measured using M Enterococcus agar (m-ENTA, Difco).

상기 락토바실루스 MRS 한천배지에서 자란 젖산균 중 임의적으로 96 클론을 선택하여 새 락토바실루스 MRS 한천배지에 옮겨 마스터 플레이트(master plate)를 만들고 이로부터 게놈 DNA를 분리하고 이를 주행으로 하여 m-PCR를 행하여 10종의 젖산균을 확인하고, 확인되지 않은 클론은 16S rDNA PCR를 수행한 후 염기서열을 결정하고 미국국립생물정보센타(NCBI) 데이타 베이스를 이용한 젖산균을 확인하였다. 각각의 젖산균 종에 대한 생균수 계산은 아래의 계산에 따라 측정하였다.Randomly selected 96 clones of the lactic acid bacteria grown on the Lactobacillus MRS agar medium were transferred to a new Lactobacillus MRS agar medium to make a master plate, and genomic DNA was separated therefrom, and m-PCR was performed by running it. Lactobacillus of the species was identified, and the unidentified clones were subjected to 16S rDNA PCR to determine the sequencing and confirmed the lactic acid bacteria using the US National Biological Information Center (NCBI) database. The viable cell count for each lactic acid bacterium was measured according to the following calculation.

특이 젖산균 생균수(log cfu/mL)Specific lactic acid bacteria viable count (log cfu / mL)

= (확인된 특이 젖산균 클론수/분리 96 클론수) × 100= (Identified specific lactic acid bacteria clone number / isolated 96 clone number) × 100

= (특이 젖산균 백분율%/100) × MRS 한천배지 상의 총 젖산균수= (Specific lactic acid bacteria percentage% / 100) × total lactic acid bacteria count on MRS agar medium

최종적으로 m-PCR로 확인된 젖산균수와 16S rDNA로 확인한 젖산균수를 조사하여 발효단계별 m-PCR의 효율을 검정하였다. 효율 검정은 아래와 같은 계산방식으로 행하여 백분율(%)로 표기하였다.Finally, the number of lactic acid bacteria identified by m-PCR and the number of lactic acid bacteria identified by 16S rDNA were examined to test the efficiency of m-PCR at each fermentation stage. The efficiency test was performed by the following calculation method and expressed as a percentage (%).

m-PCR의 효율(%)% efficiency of m-PCR

= (m-PCR에 의한 확인 젖산균 클론수/분리 96 클론수) × 100= (identification by l-PCR Lactobacillus clone count / isolated 96 clone count) × 100

본 발명의 방법은 상기와 같은 김치발효 중 젖산균의 확인 뿐만 아니라, 다른 채소 절임식품 및, 유제품, 육제품 등의 발효제품이나 발효과정 중의 젖산균 확인하는데 이용할 수도 있다.The method of the present invention can be used to identify lactic acid bacteria during fermentation of kimchi as well as other pickled foods and fermented products such as dairy products and meat products or lactic acid bacteria during fermentation.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 검출방법에 따르면 김치와 같은 채소 절임식품에 관여하는 젖산균의 군집양상을 정확하고 신속하게 확인할 수 있어 미생물 확인에 시간과 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 김치 발효의 정확한 미생물 균종 확인을 통한 김치품질 조절의 도구로 사용할 수 있다.As described above, according to the method for detecting lactic acid bacteria in kimchi fermentation using the multiple polymerase chain reaction according to the present invention, it is possible to accurately and quickly confirm the colony pattern of lactic acid bacteria involved in pickled foods such as kimchi. Not only can the cost be reduced, but it can be used as a tool to control the quality of kimchi through the accurate microbial species identification of kimchi fermentation.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 공시균주 확보Example 1 Securing Test Specimen

학술지 및 연구보고서, 서적 등을 참고로 하여 류코노스톡 칼노슘 및 류코노스톡 메센테로이데스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 프란타륨, 락토바실러 스 펜토슈스, 락토바실러스 사케이, 락토코쿠스 락티스, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 바이셀라 콘푸사, 바이셀라 코리엔시스의 주요 10종 젖산균을 본 발명의 m-PCR 반응을 위하여 선택하였다. Leuconostock calnosium and leukonostock mesenteroides, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarium, Lactobacillus Spenthus, Lactobacillus sakei, Lactococcus lactis, Pediococcus Pentosaceus, The 10 major lactic acid bacteria of Visella Confusa, Visella corriensis were selected for the m-PCR reaction of the present invention.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 15종의 젖산균들은 한국유전자은행(KCTC) 및 한국종균협회(KCCM), 한국농업미생물자원센타(KACC)로부터 수집하였고, 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) W602는 김치로부터 직접 분리한 후 동정하여 보관하고 있던 균주를 사용하였다. 모든 젖산균들은 락토바실루스 MRS 액체/한천배지에 접종하여 28℃에서 24시간동안 배양한 후 G-spinTM Genomic DNA Extraction kit(iNtRON Biotechnology, Suwon, Korea)를 사용하여 게놈 DNA 추출하고 m-PCR의 주형으로 사용하였다.As shown in Table 1 below, 15 kinds of lactic acid bacteria were collected from the Korea Gene Bank (KCTC), the Korean spawn association (KCCM), and the Korea Agricultural Microbial Resources Center (KACC), and the Weissella koreensis W602 was Kimchi. Directly isolated from the strain was used to identify and store. All lactic acid bacteria were inoculated in Lactobacillus MRS liquid / agar medium and incubated at 28 ° C for 24 hours, followed by genomic DNA extraction using G-spin TM Genomic DNA Extraction kit (iNtRON Biotechnology, Suwon, Korea) and template of m-PCR. Used as.

<표 1>TABLE 1

본 발명에서 사용한 젖산균의 종 및 수집원, 약어Species and collectors of the lactic acid bacteria used in the present invention, abbreviations

젖산균 종Lactic acid bacteria species 수집원Collector 약어Abbreviation Leuconostoc carnosumLeuconostoc carnosum KCTC 3525KCTC 3525 LcaLca Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum KCTC 3530KCTC 3530 LmeLme Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteriodes Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteriodes KACC 10770KACC 10770 Leuconostoc mesenteroides subsp. ceremoris Leuconostoc mesenteroides subsp. ceremoris KACC 10555KACC 10555 Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides KACC 11229KACC 11229 Lactobacillus brevisLactobacillus brevis KACC 10553KACC 10553 LbrLbr Lactobacillus plantarumLactobacillus plantarum KCTC 3104KCTC 3104 LplLpl Lactobacillus plantarumLactobacillus plantarum KACC 10552KACC 10552 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KACC 10771KACC 10771 Lactobacillus pentosusLactobacillus pentosus KCCM 35472KCCM 35472 LpeLpe Lactobacillus sakeiLactobacillus sakei KCTC 3603KCTC 3603 LsaLsa Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM 40104KCCM 40104 LlaLla Pediococcus pentosaceusPediococcus pentosaceus KCTC 3507KCTC 3507 PpePpe Weissella confusaWeissella confusa KCTC 3499KCTC 3499 WcoWco Weissella koreensis Weissella koreensis W602W602 WkoWko

실시예 2 : 10종 젖산균의 특이 프라이머 제작Example 2 Preparation of Specific Primers of 10 Lactic Acid Bacteria

10종의 주요 젖산균 확인을 위한 새로운 종 특이적 프라이머 제작은 각각 NCBI 테이터 베이스로부터 검색하여 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 류코노스톡 칼노슘 확인을 위하여 DNA-depent RNA polymerase로부터 506 bp, 류코노스톡 메센테로이데스 확인을 위하여 alcohol/acetaldehyde dehydrogenase로부터 358 bp, 락토바실러스 브레비스 확인을 위하여 surface layer protein로부터 482 bp, 락토바실러스 프란타륨 확인을 위하여 cadmium/manganese transport ATPase로부터 313 bp, 락토바실러스 펜토슈스 확인을 위하여 recominase A로부터 398 bp, 락토바실러스 사케이 확인을 위하여 putative lipase/esterase로부터 269 bp, 락토코쿠스 락티스 확인을 위하여 tributyrin esterase로부터 248 bp, 페디오코쿠스 펜토사세우스 확인을 위하여 esterase/lipase로부터 330 bp, 바이셀라 콘푸사 확인을 위하여 D-alanine: D-alanine ligase로부터 208 bp 와 바이셀라 코리엔시스 확인을 위하여 maltose phosphorylase로부터 154 bp을 기초로 하여 설계하였다. 모든 primer는 Bioneer사(Daejeon, Korea)에서 합성하였다.Preparation of new species specific primers for the identification of 10 major lactic acid bacteria, respectively, from the NCBI data base, 506 bp from the DNA-depent RNA polymerase for the determination of leuconosstock calcium, as shown in Table 2 below. 358 bp from alcohol / acetaldehyde dehydrogenase for confirmation of steroids, 482 bp from surface layer protein for confirmation of Lactobacillus brevis, 313 bp from cadmium / manganese transport ATPase for confirmation of Lactobacillus plantarium, recominase for identification of Lactobacillus pentosus 398 bp from A, 269 bp from putative lipase / esterase to confirm Lactobacillus sakai, 248 bp from tributyrin esterase to identify Lactococcus lactis, 330 bp from esterase / lipase to identify Pediococcus pentosaceus , D-alanine: D-alanine ligase To the emitter 208 bp and bi-N-Sys Cellar Corey check was designed on the basis of 154 bp from the maltose phosphorylase. All primers were synthesized by Bioneer (Daejeon, Korea).

<표 2>TABLE 2

본 발명을 위하여 제작한 10종의 젖산균 프라이머 유전자 서열 및 PCR 산물의 생성 길이Production Length of 10 Lactic Acid Bacterium Primer Gene Sequences and PCR Products Produced for the Invention

프라이머primer 이름name 서열번호SEQ ID NO: 프라이머 유전자 서열Primer gene sequence (5' → 3')(5 '→ 3') 목표 젖산균 종/ 유전자Target Lactobacillus Species / Genes (Accession 번호)(Accession number) PCR 산물 PCR products (bp)(bp) LcaFLcaF 1One GAT TGT TGC TGC AGG TAT CGA GAA GGAT TGT TGC TGC AGG TAT CGA GAA G L. carnosum / DNA-depent RNA polymerase (X95811) L. carnosum / DNA-depent RNA polymerase (X95811) 506506 LcaRLcaR 22 TCC AAC GTA TCT GTG ACA GAC AAT AGCTCC AAC GTA TCT GTG ACA GAC AAT AGC LmeFLmeF 33 GAG CCG TTA TTC AAG CAC CAA TCGAG CCG TTA TTC AAG CAC CAA TC L. mesenteroides / Alcohol-acetaldehyde dehydrogenase (AY804189) L. mesenteroides / Alcohol-acetaldehyde dehydrogenase (AY804189) 358358 LmeRLmeR 44 CCT GCG CCT TGA TAG TTT AAC AAGCCT GCG CCT TGA TAG TTT AAC AAG LbrFLbrF 55 AAA GCC AGG TAC TGT TAA GGG TGCAAA GCC AGG TAC TGT TAA GGG TGC L. brevis / Surface layer protein (AY040846) L. brevis / Surface layer protein (AY040846) 482482 LbrRLbrR 66 AAC CAT CAG CCT TAG TGT CAG CGAAC CAT CAG CCT TAG TGT CAG CG LplFLplF 77 AAG GCC GTA GTC AGT CGT CTA TGGAAG GCC GTA GTC AGT CGT CTA TGG L. plantarum / Cadmium-manganese transport ATPase (AF136521) L. plantarum / Cadmium-manganese transport ATPase (AF136521) 313313 LplRLplR 88 TCA ACCA CAC GAA TAT CAG CCG GTCA ACCA CAC GAA TAT CAG CCG G LpeFLpeF 99 TCC GGT TTA CGC GGA ACA TTTTCC GGT TTA CGC GGA ACA TTT L. pentosus / Recombinase A (AJ621666) L. pentosus / Recombinase A (AJ621666) 398398 LpeRLpeR 1010 CCT TGA TTT GTT CAG CAC GAC GCCT TGA TTT GTT CAG CAC GAC G LsaFLsaF 1111 TTA AAG GCA TTA GCT GAA GGC TGTTTA AAG GCA TTA GCT GAA GGC TGT L. sakei / Putative lipase-esterase (YP_395501) L. sakei / Putative lipase-esterase (YP_395501) 274274 LsaRLsaR 1212 CGC CAT GGT GGC CAC GATCGC CAT GGT GGC CAC GAT LlaFLlaF 1313 TTG CAT GGA ATG AGC GGA AACTTG CAT GGA ATG AGC GGA AAC L. lactics / Tributyrin esterase (AF157484) L. lactics / Tributyrin esterase (AF157484) 248248 LlaRLlaR 1414 TAT CCT CCC ATT GAT AAA CCA GCGTAT CCT CCC ATT GAT AAA CCA GCG PpeFPpeF 1515 CTT TGT GCC CGG TGG ATC CTCTT TGT GCC CGG TGG ATC CT P. pentosaceus / Esterase-lipase (ZP_00323987) P. pentosaceus / Esterase-lipase (ZP_00323987) 330330 PpeRPpeR 1616 AAA GGC TGC AAT GTA GTT GAT GCT AAAA GGC TGC AAT GTA GTT GAT GCT A WcoFWcoF 1717 AAG CGT ATC TTG AAC CAA GCT GGAAG CGT ATC TTG AAC CAA GCT GG W. confusa / D-alanine: D-alanine ligase (U08910) W. confusa / D-alanine: D-alanine ligase (U08910) 208208 WcoRWcoR 1818 GCA AAG CGT CCT TAA CAC CAG CGCA AAG CGT CCT TAA CAC CAG C WkoFWkoF 1919 TCT GCC GAA GCT TGA CCG GTCT GCC GAA GCT TGA CCG G W. koreensis / Maltose phosphorylase (this study) W. koreensis / Maltose phosphorylase (this study) 154154 WkoRWkoR 2020 GCC GAA TTA AGT AGT GTA AAG TCA AAT GGCC GAA TTA AGT AGT GTA AAG TCA AAT G

실시예 3 : 공시균주에 대한 m-PCR 확인 Example 3 m-PCR Confirmation of Test Strains

m-PCR은 thermalcycler(PC802, Astec, Japan)을 이용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합물(50 μL)은 Super-therm DNA 중합효소(5.0 unit, JMR, Side Cup, Kent, UK) 1 μL, primer(20 pmol) 각각 2 μL, 2.5 mM MgCl2를 함유한 PCR 반응 완충액(buffer) 5 μL, 2.5 mM dNTP 5 μL, 주형 DNA 5 μL 그리고 증류수 30 μL를 포함한다.m-PCR was performed using a thermalcycler (PC802, Astec, Japan). The PCR reaction mixture (50 μL) was prepared by PCR reaction buffer containing 1 μL of super-therm DNA polymerase (5.0 unit, JMR, Side Cup, Kent, UK), 2 μL each of primer (20 pmol) and 2.5 mM MgCl 2 . buffer) 5 μL, 2.5 μm dNTP 5 μL, template DNA 5 μL and distilled water 30 μL.

m-PCR은 95℃에서 5분 동안 예열 단계를 거친 후 35 사이클 동안 수행하였다. 각 사이클은 94℃에서 3분간 변성, 60℃에서 1분 동안 풀림, 72℃에서 2분간 신장 단계으로 구성된다. 마지막 사이클은 72℃에서 10분간 신장 단계를 수행하였다. m-PCR was carried out for 35 cycles after a preheating step at 95 ° C. for 5 minutes. Each cycle consists of denaturation at 94 ° C. for 3 minutes, annealing at 60 ° C. for 1 minute, and extension at 72 ° C. for 2 minutes. The last cycle was followed by an elongation step at 72 ° C. for 10 minutes.

동일한 PCR 조건으로 단일(single) PCR 분석을 수행하였다. PCR 산물은 전기영동법으로 분석하였다. PCR 산물 10 μL를 2.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에 주입한 후 1× TAE 완충액에서 80 볼트(volt)로 6시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 1 /mL 에티듐 브로마이드(EtBr, ethidium bromide) 용액으로 30분간 염색한 후 Gel Documentation System(Model GelDoc 1000, Bio-Red, USA)의 CCD-카메라에서 관찰하였다. PCR 산물의 분자크기는 100 bp DNA ladder(Bioneer Inc., Seoul, Korea)의 표준 마이크를 통하여 확인하였다.Single PCR analysis was performed with the same PCR conditions. PCR products were analyzed by electrophoresis. 10 μL of the PCR product was injected into a 2.5% agarose gel and electrophoresed at 80 volts in 1 × TAE buffer for 6 hours. The electrophoresed gels were stained with 1 / mL ethidium bromide (EtBr) solution for 30 minutes and observed on a CCD camera of Gel Documentation System (Model GelDoc 1000, Bio-Red, USA). The molecular size of the PCR product was confirmed through a standard microphone of a 100 bp DNA ladder (Bioneer Inc., Seoul, Korea).

공시균주의 PCR 산물들은 각각 154 bp(Wko, W. korenesis), 208 bp(Wco, W. confusa), 248 bp(Lla, L. lactics), 269 bp(L, Lac. sakei), 313 bp(Lla, L. Lac. plantarum), 330 bp(Ppe, P. pentosaceus), 358 bp(Lme, L. carnosum)로 관찰되었다. 모든 종 특이적 프라이머 쌍들은 예상했던 크기의 단일 PCR 산물을 생산했고, 설계된 프라이머들은 종 특이성을 나타내었다(도 1 참조).PCR products of the test strain were 154 bp (Wko, W. korenesis ), 208 bp (Wco, W. confusa ), 248 bp (Lla, L. lactics ), 269 bp (L, Lac. Sakei ), and 313 bp ( Lla, L. Lac. Plantarum), 330 bp (Ppe, P. pentosaceus ), 358 bp (Lme, L. carnosum ). All species specific primer pairs produced a single PCR product of the expected size and the designed primers showed species specificity (see FIG. 1).

실시예 4 : 김치발효 중 이화학적 성질의 변화Example 4 Change of Physicochemical Properties during Kimchi Fermentation

본 발명에서 사용한 김치는 경남 거창군에 위한 대상 종갓집 공장에서 포기김치 4,000 g을 얻은 후 김치는 1000 mL 용기에 옮겨 각각 4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃ 에서 발효시키면서 일정 시간간격으로 시료를 채취하여 실험을 수행하였다.Kimchi used in the present invention obtained 4,000 g of abandoned kimchi at the target Jonggapji factory for Geochang-gun, Gyeongnam, and then sampled at regular intervals while fermenting at 4 ℃ and 8 ℃, 15 ℃ and 25 ℃ respectively. The experiment was performed.

일정간격으로 채취한 김치시료를 믹서기로 갈고 여과과정을 거친 후 pH 미터기로 pH를 측정하였다. 20 mL의 여과과정을 거친 김치 쥬스는 pH 8.2 ± 0.2의 0.1N NaOH용액으로 적정하여 산도를 측정하였고 염도는 염도 측정기로, 환원당의 측정은 DNS법으로 실시하였다.Kimchi samples collected at regular intervals were ground with a blender, filtered, and the pH was measured with a pH meter. Kimchi juice, which had undergone 20 mL of filtration, was titrated with 0.1N NaOH solution at pH 8.2 ± 0.2 to measure acidity. Salinity was measured by salinity and reducing sugar was measured by DNS method.

4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃에서 숙성된 배추김치의 각각 pH와 산도는 비교되었다. pH의 감소와 산도의 증가는 온도의 증가에 따라 영향을 받았다. 각각 4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃에서 96 및 54, 30, 24일 숙성된 후 pH는 초기(0 일) 6.7에서 4.16 및 3.92, 3.79, 3.48로 감소하였다. 반면에 산도는 각각 0.24%(0 일)에서 1.14 및 1.12, 1.35, 1.54%로 증가하였다(도 2 참조). PH and acidity of Chinese cabbage kimchi aged at 4 ° C, 8 ° C, 15 ° C, and 25 ° C, respectively, were compared. The decrease in pH and the increase in acidity were affected by the increase in temperature. After aging 96 and 54, 30 and 24 days at 4 ° C. and 8 ° C., 15 ° C. and 25 ° C., respectively, the pH decreased from initial (0 days) 6.7 to 4.16 and 3.92, 3.79, 3.48. On the other hand, the acidity increased from 0.24% (day 0) to 1.14 and 1.12, 1.35, 1.54%, respectively (see FIG. 2).

배추김치 숙성동안에 환원당과 염도는 발효 0일에는 43.07 g/L와 3.3%이였고, 각각 4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃에서 발효(95 및 54, 30, 24일)시킨 후에는 14.48 및 15.25, 15.41, 15.31 g/L와 2.7 및 2.6%로 감소하였다. 특히 환원당의 수준은 배추김치 숙성기간 동안 42(4℃) 및 18(8℃), 12(15℃), 6(25℃)일에서 현저하게 감소되었다(도 3 참조).Reducing sugar and salinity during fermentation of cabbage kimchi were 43.07 g / L and 3.3% on day 0 of fermentation, and 14.48 after fermentation (95, 54, 30, 24 days) at 4 ° C, 8 ° C, 15 ° C and 25 ° C, respectively. And 15.25, 15.41, 15.31 g / L and decreased to 2.7 and 2.6%. In particular, the level of reducing sugar was significantly reduced at 42 (4 ° C) and 18 (8 ° C), 12 (15 ° C), 6 (25 ° C) days during the cabbage kimchi ripening period (see Figure 3).

실시예 5 : 김치발효 중 유기산 함량의 변화Example 5 Change of Organic Acid Content in Kimchi Fermentation

본 실시예에서는 김치의 발효 중 유기산은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 5 ml의 김치 쥬스를 모은 후 원심분리 하였다. 1 ml의 상등액을 0.45 ㎛ Minipore PVDF 필터에서 여과한 후 10 μL 주입하여 분석하였다. 사용된 HPLC 기기는 Perkin-Elmer 200 series였고 분석 칼럼은 TSKgel ODS-100V(4.6 × 250 mm, 5 ㎛, Tosoh Corp., Tokoy, Japan) 이용하였다. 이동상은 0.1% H3PO4 용액을 40도에서 분당 1 ml/min을 흘려보 보내면서 분석하였다. 다양한 유기산들은 UV 검출기 210nm에서 측정하였다. HPLC분석에서, 유기산은 대략 3.1분부터 22.8분까지 범위에서 검출 되었다. 유기산의 양은 25 및 50, 75, 100 ppm으로 만들어진 표준용액을 이용하여 검량선을 작성하여 계산하였다.In this example, the organic acid during fermentation of kimchi was analyzed using HPLC. 5 ml of kimchi juice was collected and centrifuged. 1 ml of the supernatant was filtered through a 0.45 μm Minipore PVDF filter followed by 10 μL injection. The HPLC instrument used was a Perkin-Elmer 200 series and an analytical column was used for TSKgel ODS-100V (4.6 × 250 mm, 5 μm, Tosoh Corp., Tokoy, Japan). Mobile phase was analyzed with 0.1% H 3 PO 4 solution flowing at 1 ° C./min at 40 ° C. per minute. Various organic acids were measured at 210 nm UV detector. In HPLC analysis, organic acids were detected in the range from approximately 3.1 minutes to 22.8 minutes. The amount of organic acid was calculated by preparing a calibration curve using standard solutions made of 25, 50, 75 and 100 ppm.

김치 발효 기간 동안 전체 유기산 함량은 숙성 0일에는 13.48 g/L 이였고, 각각 4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃에서 발효(95 및 54, 30, 24일)시킨 후에는 29.07, 24.07, 32.62, 38.48 g/L로 크게 증가하였다. The total organic acid content during kimchi fermentation was 13.48 g / L on day 0 of fermentation, and after fermentation (95 and 54, 30, 24 days) at 4 ° C, 8 ° C, 15 ° C and 25 ° C, respectively, 29.07, 24.07, It significantly increased to 32.62, 38.48 g / L.

김치발효 동안 젓산의 수준은 숙성 0일에는 3.74 g/L이였고, 숙성이 끝난 후에는 18.09, 10.52, 18.35, 20.5 g/L로 현저하게 증가하였다(표 3 참조).During fermentation of kimchi, the level of lactic acid was 3.74 g / L on day 0 of fermentation, and significantly increased to 18.09, 10.52, 18.35, 20.5 g / L after fermentation (see Table 3).

<표 3>TABLE 3

온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 김치발효 기간 동안의 유기산 함량의 변화 양상Changes of Organic Acid Content during Kimchi Fermentation by Temperature (4 ℃, 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃)

Figure 112008059041359-PAT00001
Figure 112008059041359-PAT00001

실시예 6: 김치 발효기간 동안 미생물상의 변화Example 6: Change of Microbial Phase during Kimchi Fermentation

본 실시예에서는 온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃김치발효 중 총 생균수의 변화는 트리픽 소이 한천배지(TSA), 총 젖산균수는 락토바실루스 MRS 한천배지(MRSA), 류코노스톡은 PES 한천배지(PESA), 페디오코쿠스는 엔토로코쿠스 한천배지(m-ENTA)를 사용하여 측정하였다. In the present embodiment, the total viable cell number during fermentation at 4 ° C and 8 ° C, 15 ° C, and 25 ° C fermentation is Tripic Soy Agar Medium (TSA), and the total number of Lactic Acid Bacteria is Lactobacillus MRS agar medium (MRSA), Conosstock was measured using PES agar medium (PESA) and Pediococcus using Entorococcus agar medium (m-ENTA).

4℃에서 발효된 경우, 총 생균수 총량 및 총 젖산균수, 페디오코쿠스 균수는 42일 까지는 점차적으로 증가하였고(각각 12.39, 12.32, 8.83 log cfu/mL) 그 이후 96일까지 감소하였다. 한편, 류코노스톡 균수는 발효 36일째(8.2 log cfu/mL) 최대치에 도달하였고 그 이 후 96일까지 감소하였다. When fermented at 4 ° C., the total viable cell count, total lactic acid bacteria count and pediococcus bacterial count gradually increased up to 42 days (12.39, 12.32, 8.83 log cfu / mL, respectively) and then decreased until 96 days. On the other hand, the number of leukonostock bacteria reached the maximum at 36 days of fermentation (8.2 log cfu / mL) and then decreased to 96 days.

8℃의 경우, 총 생균수 총량 및 총 젖산균수 그리고 류코노스톡 균수는 36일째(12.32, 12.28, 9.40 log cfu/mL)까지 빠르게 증가하였고, 그 이후 54일(10.70, 10.48, 6.67 log cfu/mL)까지 감소하였다. 또한, 페디오코쿠스 균수는 발효 24일째의 최고 7.81 log cfu/mL 까지 증가한 후 감소하였다. At 8 ° C., the total viable cell count, total lactic acid bacteria count, and leukonostock bacterial count increased rapidly on day 36 (12.32, 12.28, 9.40 log cfu / mL) and thereafter 54 days (10.70, 10.48, 6.67 log cfu /). mL). Pediococcus bacteria It increased and decreased up to 7.81 log cfu / mL at 24 days of fermentation.

15℃의 김치발효에서는 총 생균수 및 총 젖산균수의 수준은 각각 초기(발효 0일)에서 6.15, 5.23 log cfu/mL에서 21일째 13.7 및 13.44 log cfu/mL로 현저하게 증가하였고, 그 이후 발효 중에 급격히 감소하였다. 류코노스톡과 페디오코쿠스 균수는 발효 15일째 최고 9.46 및 8.91 log cfu/mL 만큼 증가하였고 그 후 30일까지(7.95, 6.63 log cfu/mL) 동안 감소하였다. In kimchi fermentation at 15 ° C, the levels of total viable cell count and total lactic acid bacteria increased significantly from 6.15 and 5.23 log cfu / mL at the beginning (day 0) to 13.7 and 13.44 log cfu / mL at 21 days, then fermentation thereafter. Sharply decreased. The bacterial counts of leukonostock and pediococcus increased by 9.46 and 8.91 log cfu / mL up to 15 days of fermentation and then decreased for up to 30 days (7.95, 6.63 log cfu / mL).

최종 25℃에서 발효한 김치에서 총 생균수 및 총 젖산균수는 현저하게 증가하여 발효 15일째 최고 13.5 및 13.4 log cfu/mL까지 증가하였으며, 그 후 점차적 으로 감소하였다. 류코노스톡과 페디오코쿠스 균수는 각각 12일 및 15일째 발효에서 최고 9.65 및 9.72 log cfu/mL까지 증가하였다(도 4 참조).In kimchi fermented at 25 ° C, the total viable cell count and total lactic acid bacteria count increased markedly up to 13.5 and 13.4 log cfu / mL at 15 days of fermentation, and then gradually decreased. Leukonostock and pediococcus bacterial counts increased up to 9.65 and 9.72 log cfu / mL in fermentation at 12 and 15 days, respectively (see Figure 4).

실시예 7 : 김치발효 중 젖산균 종의 변화Example 7 Changes in Lactic Acid Bacteria Species During Kimchi Fermentation

본 실시예에서 특이 젓산균 종의 변화를 김치발효 동안 m-PCR과 16S rDNA를 이용하여 관찰하였다. In this example, changes of specific Lactobacillus spp. Were observed using m-PCR and 16S rDNA during kimchi fermentation.

각 시료는 96개 콜로니씩 분석하였다. 우선 상기 실험 예1에 기술된 m-PCR를 행하여 10종의 젖산균을 확인하고, 확인되지 않은 클론은 16S rDNA PCR를 수행한 후 염기서열을 결정하고 미국국립생물정보센타(NCBI) 데이타 베이스를 이용한 젖산균을 확인하였다. 16S rDNA 유전자 단편 증폭을 위해 사용된 PCR 프라이머는 5-CGGAGAGTTTPATCCTPG-3(순방향), 5-TACGGCTACCT TPTTAGCGAC-3(역방향). 16S rDNA 유전자는 추출된 DNA, Super-Term DNA 중합효소(JMR, Side Cup, Kent, UK), 1.5mM MgCl2, 2mM dNTP 그리고 primer를 포함해 최종부피 50μL로 PCR 수행에 의해 증폭되었다. Each sample was analyzed by 96 colonies. First, 10 kinds of lactic acid bacteria were identified by performing m-PCR described in Experimental Example 1, and the unidentified clones were subjected to 16S rDNA PCR to determine the sequencing and using the US National Biological Information Center (NCBI) database. Lactic acid bacteria were identified. PCR primers used for 16S rDNA gene fragment amplification were 5-CGGAGAGTTTPATCCTPG-3 (forward), 5-TACGGCTACCT TPTTAGCGAC-3 (reverse). The 16S rDNA gene was amplified by PCR with a final volume of 50 μL, including extracted DNA, Super-Term DNA Polymerase (JMR, Side Cup, Kent, UK), 1.5 mM MgCl 2 , 2 mM dNTP and primer.

PCR 조건은 30cycle(94℃에서 3분간 변성, 60℃에서 1분 동안 풀림, 72℃에서 2분간 신장)로 수행되고 72℃에서 10분간 최종 신장 단계를 거쳐 끝났다. 약 1,500 bp PCR 산물은 전기영동을 거친 후 gel extraction kit(iNtRON Biotechnology, Suwon, Korea)을 사용하여 분리하였다. PCR 산물은 직접 pGEM-T Easy vector(Promega, WI, USA)에 클로닝한 후 재조합된 클론들을 무작위로 선발하 였다. DNA 염기서열 결정은 PRISM Ready Reaction Dye terminator와 primer cycle sequencing kit(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CN, USA)를 사용한 사슬종결법(dideoxy-chain termination method)로 수행하였다. 시료들은 automated DNA sequencer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 통해 분석되었고, 16S rDNA 상동 염기서열 검색은 NCBI 생물정보학사이트의 블라스트 엔(Blast N)을 사용하였다.PCR conditions were carried out in 30 cycles (denatured at 94 ° C. for 3 minutes, annealed at 60 ° C. for 1 minute, elongated at 72 ° C. for 2 minutes) and finished through a final elongation step at 72 ° C. for 10 minutes. About 1,500 bp PCR product was subjected to electrophoresis and separated using a gel extraction kit (iNtRON Biotechnology, Suwon, Korea). PCR products were cloned directly into the pGEM-T Easy vector (Promega, WI, USA) and randomly selected recombinant clones. DNA sequencing was performed by a chain-end termination method using a PRISM Ready Reaction Dye terminator and a primer cycle sequencing kit (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CN, USA). Samples were analyzed using an automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), and 16S rDNA homology sequences were searched using Blast N from NCBI Bioinformatics site.

분리 젖산균들은 류코노스톡 종 5개(류코노스톡 칼노슘, 류코노스톡 시트레륨, 류코노스톡 가시콤이타튬, 류코노스톡 게리듐, L류코노스톡 메센테로이데스), 락토바실러스 종 5개(락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 프란타륨, 락토바실러스 펜토슈스, 락토바실러스 사케이, 락토바실러스 쿨바투스), 락토코쿠스 종 1개(라토코쿠스 락티스), 페디오코쿠스 종 1개(페디오코쿠스 펜토사세우스), 바이셀라 종 2개(바이셀라 콘푸사, 바이셀라 코리엔시스)이 관찰되었다. Isolated lactic acid bacteria 5 species (kind Pocono knife Stock nosyum, flow sheets Stock Pocono reryum, Ryu Kawano Stock visible comb lithium altruistic, kind Kono Stock Geridium, L Leukonostock Mesenteroides, 5 Lactobacillus Species (Lactobacillus brevis, Lactobacillus frantrium, Lactobacillus Pentochesus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus coolbatus), Lactococcus 1 species (Latococcus lactis), Pediococcus 1 species (Pediococcus pentosaceus), bisella Two species (Vicella confusa, Vicella corriensis) were observed.

초기 발효일(0 일)의 경우, 젓산균 군집은 류코노스톡 칼노슘은 0.33 log cfu/mL, 류코노스톡 시트레륨은 0.71 log cfu/mL, 류코노스톡 메센테로이데스은 0.38 log cfu/mL, 락토바실러스 프란타륨은 0.16 log cfu/mL, 락토바실러스 사케이는 1.58 log cfu/mL, 락토코쿠스 락티스는 1.26 log cfu/mL, 페디오코쿠스 펜토사세우스는 0.16 log cfu/mL, 바이셀라 콘푸사는 0.65 log cfu/mL로 분포하였다.For the initial fermentation date (Day 0), the Lactobacillus population was 0.33 log cfu / mL for leuconosstock calnosium, 0.71 log cfu / mL for leuconosstock citrium, 0.38 log cfu / mL for leuconosstock mesenteroide, Lactobacillus plantarium is 0.16 log cfu / mL, Lactobacillus sakei is 1.58 log cfu / mL, Lactococcus lactis is 1.26 log cfu / mL, Pediococcus pentosaceus is 0.16 log cfu / mL, It was distributed at 0.65 log cfu / mL.

김치 4℃ 발효의 경우, 류코노스톡 칼노슘 및 류코노스톡 시트레륨, 락토코쿠스 락티스, 바이셀라 콘푸사는 42일째까지 감소한 후 그 후 관찰되지 않았고 류코노스톡 메센테로이데스는 숙성 36일째(2.82 log cfu/mL)까지는 증가했으나 그 이 후 감소하여 0.70 log cfu/mL 있었다. 락토바실러스 사케이는 빠르게 증가하여 발효 72일째에 최대 6.66 log cfu/mL까지 도달하였다. 바이셀라 코리엔시스는 숙성 36일째(0.52 log cfu/mL) 처음 나타난 후 발효기간 동안 점점 증가했다. In the case of kimchi 4 ℃ fermentation acids Kono Stock knife nosyum and current Pocono Stock Sheet reryum, Lactobacillus nose Syracuse lactis, by Selah konpu living then was not observed after reduced to 42 days Ryu Kawano Stock mesen teroyi des aged 36 days ( 2.82 log cfu / mL), but thereafter decreased to 0.70 log cfu / mL. Lactobacillus sakei increased rapidly to reach up to 6.66 log cfu / mL at 72 days of fermentation. Vicella corriensis gradually increased during the fermentation period after first appearing on day 36 of aging (0.52 log cfu / mL).

8℃에서 발효되는 동안 류코노스톡 칼노슘 및 류코노스톡 시트레륨, 락토코쿠스 락티스, 바이셀라 콘푸사는 발효 12일(0.08 log cfu/mL), 15일(0.28 log cfu/mL), 15일(0.28 log cfu/mL), 18일(0.09 log cfu/mL)까지 감소했고, 그 후 발효 기간 동안 관찰되지 않았다. 류코노스톡 메센테로이데스는 숙성 12일째(3.36 log cfu/mL)까지 크게 증가하였고, 그 후 숙성 54일(0.87 log cfu/mL)까지 점점 감소하였다. 락토바실러스 프란타륨은 발효 42일까지 최대 1.08 log cfu/mL로 천천히 증가한 후 김치 발효 기간 동안 일정하게 유지가 되었다(발효 종점 1.09 log cfu/mL). 락토바실러스 사케이는 숙성 73일째까지 빠르게 증가하여 최대 7.92 log cfu/mL 있었다. 바이셀라 코리엔시스는 숙성 12일(0.08 log cfu/mL)에 처음 나타났고, 그 후 발효 기간 동안 54일(2.7 log cfu/mL)까지 현저하게 증가하였다.During the fermentation at 8 ℃ flow Pocono Stock knife nosyum and flow Pocono stock sheet reryum, Lactobacillus nose kusu lactis, by Cellar konpu live fermentation 12 days (0.08 log cfu / mL), 15 il (0.28 log cfu / mL), 15 It decreased to day (0.28 log cfu / mL), day 18 (0.09 log cfu / mL), and then was not observed during the fermentation period. Leukonostock mesenteroides increased significantly until day 12 of aging (3.36 log cfu / mL) and then gradually decreased to day 54 (0.87 log cfu / mL). Lactobacillus plantarium slowly increased to a maximum of 1.08 log cfu / mL until 42 days of fermentation and then remained constant during the fermentation of kimchi (fermentation endpoint 1.09 log cfu / mL). Lactobacillus sakei increased rapidly up to day 73 of aging, up to 7.92 log cfu / mL. Vicellar corriensis first appeared on day 12 of maturation (0.08 log cfu / mL), and then increased significantly to 54 days (2.7 log cfu / mL) during the fermentation period.

15℃ 발효의 경우, 류코노스톡 칼노슘 및 류코노스톡 시트레륨, 락토코쿠스 락티스, 바이셀라 콘푸사의 수준은 발효 9일(0.24 log cfu/mL), 18일(0.28 log cfu/mL), 18일(0.42 log cfu/mL), 9일(0.2 log cfu/mL)까지 감소하였고, 그 후에는 관찰되지 않았다. 류코노스톡 메센테로이데스는 발효 9일(2.86%)까지 증가하였고, 그 후 감소하여 발효 종점기(30일)에는 관찰되지 않았다. 락토바실러스 프란타륨은 발효 24일째 5.83 log cfu/mL로 최대치에 도달하였다. 락토바실러스 사케이는 숙성 12일에는 최대 2.30 log cfu/mL로 증가하였고 그 이후 서서히 감소하였다. 류코노 스톡 가시콤이타튬은 발효 9일째 처음 나타났으며, 발효 21일에 최대 1.4 log cfu/mL까지 증가하였다. 바이셀라 코리엔시스는 역시 발효 9일째 처음 나타났으며, 그 후 숙성기간동안 30일(3.4 log cfu/mL)까지 현저하게 증가하였다. For 15 ℃ fermentation, flow Pocono Stock knife nosyum and flow Pocono stock sheet reryum, Lactobacillus nose kusu lactis, by Cellar konpu's level of fermentation 9 days (0.24 log cfu / mL), 18 il (0.28 log cfu / mL) , Decreased to 18 days (0.42 log cfu / mL), 9 days (0.2 log cfu / mL), not observed thereafter. Leukonostock mesenteroides increased up to 9 days of fermentation (2.86%) and then decreased and was not observed during fermentation endpoint (30 days). Lactobacillus plantarium reached its maximum at 5.83 log cfu / mL on day 24 of fermentation. Lactobacillus sakei increased to 2.30 log cfu / mL up to 12 days of aging and then slowly decreased. Leukono stock thornycomitatium first appeared on day 9 of fermentation and increased up to 1.4 log cfu / mL on day 21 of fermentation. Bisella corriensis also appeared first on the 9th day of fermentation, after which it increased significantly up to 30 days (3.4 log cfu / mL) during the ripening period.

25℃ 김치발효의 경우, 류코노스톡 칼노슘 및 락토코쿠스 락티스, 바이셀라 콘푸사의 수준은 숙성 3일째 각각 0.22 및 0.45, 0.22 log cfu/mL 있었고, 류코노스톡 시트레륨은 발효 6일째 0.25 log cfu/mL로 감소하였다. 류코노스톡 가시콤이타튬은 발효 3일째 처음 나타나 12일째 최대 1.36 log cfu/mL로 증가하였으며, 그 후 숙성 21일(0.72 log cfu/mL)까지 감소하였다. 류코노스톡 메센테로이데스는 발효 1일째 최대치 2.57 log cfu/mL을 나타낸 후 서서히 감소하였다. 락토바실러스 프란타륨은 발효 15일(8.16 log cfu/mL)까지 빠르게 증가하였고, 그 후에는 점점 감소하였다. 락토바실러스 사케이는 발효 1일에는 최대 2.36 log cfu/mL로 증가하였고, 그 후 서서히 감소하였다. 바이셀라 코리엔시스는 발효 3일째 처음 나타났으며, 그 후 숙성기간동안 21일(3.08 log cfu/mL)까지 빠르게 증가하였다(표 4 참조).For 25 ℃ kimchi fermentation, flow Pocono Stock knife nosyum and Lactobacillus nose kusu lactis, by Cellar konpu's level is aged for 3 days, respectively 0.22 and 0.45, 0.22 log cfu / mL were, flow Pocono stock sheet reryum the fermentation day 6 0.25 decreased to log cfu / mL. Leukonostock bariumcomitatium first appeared on day 3 of fermentation, increased to a maximum of 1.36 log cfu / mL on day 12, and then decreased to 21 days (0.72 log cfu / mL) of aging. Leukonostock mesenteroides gradually decreased after peaking at 2.57 log cfu / mL on day 1 of fermentation. Lactobacillus plantarium increased rapidly up to 15 days of fermentation (8.16 log cfu / mL) and then gradually decreased. Lactobacillus sakei increased to 2.36 log cfu / mL up to 1 day of fermentation and then slowly decreased. Vicella corriensis first appeared on the third day of fermentation, and then rapidly increased to 21 days (3.08 log cfu / mL) during the ripening period (see Table 4).

<표 4>TABLE 4

온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 김치발효 기간 동안의 젖산균의 변화 양상을 나타낸 결과Results of Lactic Acid Bacteria Change During Kimchi Fermentation by Temperature (4 ℃, 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃)

Figure 112008059041359-PAT00002
Figure 112008059041359-PAT00002

Figure 112008059041359-PAT00003
Figure 112008059041359-PAT00003

실시예 8: m-PCR 효율의 검정Example 8: Assay of m-PCR Efficiency

본 실시예에서는 최종적으로 m-PCR로 확인된 젖산균수와 16S rDNA로 확인한 젖산균수를 조사하여 발효단계별 m-PCR의 효율을 검정하였다.In this example, the lactic acid bacteria identified by m-PCR and lactic acid bacteria identified by 16S rDNA were finally examined to test the efficiency of m-PCR at each fermentation stage.

모든 온도에서 발효가 진행됨에 따라 m-PCR의 효율은 증가하였다. 4도의 경우 미숙기 86.5%에서 적숙기 89.4%, 산패기에는 100% 효율을 나타내었으며, 8도의 경우 적숙기에는 94.8%, 산패기에는 99.0% 이며, 15도의 경우 적숙기에는 90.6%, 산패기에는 91.7% 이며, 25도의 경우에는 적숙기 91.7%, 산패기 93.7%의 효율을 나타냈었다(도 5 참조).As fermentation proceeded at all temperatures, the efficiency of m-PCR increased. In case of 4 degrees, the immature stage was 86.5%, the maturity stage was 89.4%, and in the postpartum stage, the efficiency was 94.8% in the maturity stage and 99.0% in the antenatal stage. Was 91.7%, and in the case of 25 degrees, the maturity was 91.7%, and the rancidity was 93.7% (see FIG. 5).

도 1은 본 발명에서 제작한 10종의 김치발효 관여 젖산균의 다중중합효소연쇄반응 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of electrophoresis after multiple polymerase chain reaction of lactic acid bacteria involved in the kimchi fermentation of 10 species produced in the present invention.

도 2는 온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 김치발효 기간 동안의 pH와 산도의 변화 양상을 나타낸 결과이다. 도 2A는 4℃에서 발효, 도 2B는 8℃에서 발효, 도 2C는 15℃에서 발효, 도 2D는 25℃에서 발효를 나타낸 결과이다.Figure 2 shows the results of changes in pH and acidity during the kimchi fermentation period by temperature (4 ℃ and 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃). 2A shows the fermentation at 4 ° C., FIG. 2B shows the fermentation at 8 ° C., FIG. 2C shows the fermentation at 15 ° C., and FIG. 2D shows the fermentation at 25 ° C. FIG.

도 3은 온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 김치발효 기간 동안의 환원당과 염도의 변화 양상을 나타낸 결과이다. 도 3A는 4℃에서 발효, 도 3B는 8℃에서 발효, 도 3C는 15℃에서 발효, 도 3D는 25℃에서 발효를 나타낸 결과이다.Figure 3 is a result showing the change of reducing sugar and salinity during the kimchi fermentation period by temperature (4 ℃ and 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃). 3A shows the fermentation at 4 ° C., FIG. 3B shows the fermentation at 8 ° C., FIG. 3C shows the fermentation at 15 ° C., and FIG. 3D shows the fermentation at 25 ° C. FIG.

도 4는 온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 김치발효 기간 동안에 선택배지를 사용하여 총균수(TSA) 및 총 젖산균수(MRSA), 류코노스톡 균수(PESA), 페디오코쿠스 균수(m-ENTA)의 변화 양상을 나타낸 결과이다. 도 4A는 4℃에서 발효, 도 4B는 8℃에서 발효, 도 4C는 15℃에서 발효, 도 4D는 25℃에서 발효를 나타낸 결과이다.Figure 4 shows the total number of bacteria (TSA) and total lactic acid bacteria (MRSA), leukonostock bacteria (PESA), pedioco by using the selective medium during the Kimchi fermentation period by temperature (4 ℃ and 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃) This is the result showing the change pattern of m-ENTA. 4A shows the fermentation at 4 ° C., FIG. 4B shows the fermentation at 8 ° C., FIG. 4C shows the fermentation at 15 ° C., and FIG. 4D shows the fermentation at 25 ° C. FIG.

도 5는 온도별(4℃ 및 8℃, 15℃, 25℃) 김치발효 단계에 따른 본 발명의 다중중합효소연쇄반응의 효율을 나타낸 결과이다.Figure 5 is a result showing the efficiency of the multi-polymerase chain reaction of the present invention according to the kimchi fermentation step by temperature (4 ℃ and 8 ℃, 15 ℃, 25 ℃).

Claims (4)

서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 및 서열번호 19 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 1쌍의 염기서열 또는 이들 각 염기서열과 상보적인 염기서열의 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열의 쌍을 포함하는 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인용 프라이머 세트.SEQ ID NO: 1 and 2, SEQ ID NO: 3 and 4, SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: 7 and 8, SEQ ID NO: 9 and 10, SEQ ID NO: 11 and 12, SEQ ID NO: 13 and 14, SEQ ID NO: 15 and 16, SEQ ID NO: 17 and 18, and a multiple polymerase chain reaction comprising a pair of nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19 and 20 or any one or more nucleotide sequences selected from the group of nucleotide sequences complementary to each of these nucleotide sequences A primer set for checking lactic acid bacteria during fermentation of kimchi. 김치발효 관련 젖산균에 대해서 확인할 수 있는 상기 제1항의 종 특이적 프라이머 세트을 제작하는 단계;Preparing a species-specific primer set of claim 1 which can be identified for kimchi fermentation-related lactic acid bacteria; m-PCR의 조건을 확립한 후 4℃ 내지 25℃의 온도별 발효 중 김치를 일정한 시간간격으로 시료를 채취하는 단계; After establishing the conditions of m-PCR sampling the kimchi during the fermentation by temperature of 4 ℃ to 25 ℃ at a predetermined time interval; 선택배지를 사용한 균수의 변화를 측정하는 단계; Measuring a change in the number of bacteria using the selection medium; 발효 중 이화학적 성질의 변화를 조사하는 단계; Investigating changes in physicochemical properties during fermentation; 각각 단계에서 분리된 젖산균 96 클론에 대해서 m-PCR을 실시하여 주요 10종의 젖산균을 확인하는 단계; Performing m-PCR on the lactic acid bacteria 96 clones isolated in each step to identify 10 major lactic acid bacteria; m-PCR로 확인되지 않은 클론은 16S rDNA로 확인단계; 및clones not identified by m-PCR were identified by 16S rDNA; And 최종 m-PCR를 검정하는 단계Step to test final m-PCR 로 이루어진 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인 방법.Lactic acid bacteria identification method during fermentation of kimchi using a multiplex polymerase chain reaction. 제2항에 있어서, 상기 김치발효 관련 젖산균이 류코노스톡 칼노슘(Leuconostoc carnosum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 프란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토슈스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 바이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 및 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)인 것을 특징으로 하는 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인 방법.According to claim 2, The lactic acid bacteria related to kimchi fermentation is Leuconostoc carnosum , Leuconostoc mesenteroides , Lactobacillus brevis , Lactobacillus plantarum , Lactobacillus plantarum Lactobacillus pentosus , Lactobacillus sakei , Lactococcus lactis , Pediococcus pentosaceus , A method for identifying lactic acid bacteria during fermentation of kimchi using multiple polymerase chain reaction, characterized in that it is Weissella confusa and Weissella koreensis . 제2항에 있어서, 상기 프라이머 세트을 이용한 m-PCR 조건에서, PCR 반응 혼합물(50 μL)은 Super-therm DNA 중합효소(5.0 unit, JMR, Side Cup, Kent, UK) 1 μL, primer(20 pmol) 각각 2 μL, 2.5 mM MgCl2를 함유한 PCR 반응 완충액(buffer) 5 μL, 2.5 mM dNTP 5 μL, 주형 DNA 5μL 그리고 증류수 30 μL를 포함하며, 반응조건은 95℃에서 5분 동안 예열 단계를 거친 후 35 사이클 동안 수행되고, 각 사이 클은 94℃에서 3분간 변성, 60℃에서 1분 동안 풀림, 72℃에서 2분간 신장 단계로 구성되며, 마지막 사이클은 72℃에서 10분간 신장 단계를 수행되는 것을 특징으로 하는 다중중합효소연쇄반응을 이용한 김치발효 중 젖산균 확인 방법.According to claim 2, under m-PCR conditions using the primer set, PCR reaction mixture (50 μL) is 1 μL of super-therm DNA polymerase (5.0 unit, JMR, Side Cup, Kent, UK), primer (20 pmol ) 2 μL, 5 μL of PCR reaction buffer containing 2.5 mM MgCl 2 , 5 μL of 2.5 mM dNTP, 5 μL of template DNA and 30 μL of distilled water, respectively, and the reaction conditions were performed at 95 ° C. for 5 minutes. After roughing, 35 cycles were performed, each cycle consisted of denaturation at 94 ° C. for 3 minutes, annealing at 60 ° C. for 1 minute, and extension at 72 ° C. for 2 minutes, and the last cycle at 72 ° C. for 10 minutes. Lactic acid bacteria confirmation method during fermentation of kimchi using multiple polymerase chain reaction, characterized in that.
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