KR20090129393A - 변형된 시아노박테리아 - Google Patents

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KR20090129393A
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KR1020097010333A
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윌렘 에프. 제이. 버마스
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아리조나 보드 오브 리젠츠 퍼 앤 온 비하프 오브 아리조나 스테이트 유니버시티
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Abstract

본 발명은 발현 및/또는 코딩 영역 서열이 변화된 대상 유전자를 포함하는 변형된 광독립영양 박테리아에 관한 것이며, 여기서는 상기 박테리아에서 대상 유전자의 변화는, 대상 유전자가 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에서의 목적 생성물의 생성량과 비교하여 목적 생성물의 생성량을 증가시킨다.

Description

변형된 시아노박테리아 {MODIFIED CYANOBACTERIA}
본 발명은 일반적으로 세균학에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 대상 유전자 (genes of interest)가 과다발현되거나, 하향 조절되거나, 유입되거나, 결실되거나 변형되어 목적하는 생성물을 생산하는 변형된 광독립영양 박테리아에 관한 것이다. 목적 생성물은 바이오 연료, 바이오플라스틱, 동물 사료 첨가제, 영양보조식품, 식품 첨가제, 거름 등으로 처리될 수 있다.
오늘날 세계가 직면하고 있는 두개의 문제점으로는 세계 온난화를 초래하는 이산화탄소로의 환경 오염 및 화석 연료와 같은 천연 에너지원의 증가되는 연소를 포함한다. 화석 연료 연소의 증가가 이산화탄소 공기 오염을 증가시키는 것과 관련되는 악순한 고리가 존재한다.
예를 들어, 미국은 화석 연료의 연소로 인해 연간 17억 톤의 이산화탄소를 배출한다 (US 공개 2002/0072109 참조). 화석 연료 연소로 인한 전 세계 이산화탄소 배출량은 이보다 더 클 것이며, 이는 연간 70 내지 80억 톤으로 추정된다 (Marland et al. 2006). 이산화탄소 공기 오염의 증가는 세계 온난화를 초래하고, 이는 이상 기후, 예컨대, 홍수, 가뭄, 히트 웨이브 (heat wave), 허리케인, 토네이도 등의 빈도 및 세기를 증가시킬 수 있다. 세계 온난화의 또 다른 결과는 농작물 생산량 변화, 멸종, 및 질병 매개체 범위 증가를 포함할 수 있다.
이산화탄소 개선을 위한 방법들이 제안되고 있다. 예를 들어, U.S. 특허 2002/0072109에는 화석-연료로 구동되는 분말 생성 유닛의 배기시 탄소-함유 화합물 농도를 감소시킬 수 있는 현장 (on-site) 생물학적 격리 시스템을 기술하고 있다. 이러한 시스템은 태양 광자에 의해 점화되는 오염 챔버에 배열된 생장물 표면에 부착된 광합성 미생물 예컨대, 조류 및 시아노박테리아를 사용한다. 시아노박테리아는 화석-연료로 구동되는 분말 생성 유닛에 의해 생성되는 이산화탄소를 흡수하고 사용한다.
두번째 문제점에 있어서, 세계 에너지 요구가 계속 증가하며, 이는 비재생성 화석 연료 에너지 공급물이 더 많이 요구된다. 최근에는 대체 에너지원이 개발되었다. 예를 들어, 바이오 연료 생산에 사용하기 위한 농작물 예컨대, 옥수수, 콩, 아마인, 평지 씨, 사탕수수 및 팜 오일이 최근 성장중에 있다. 산업 예컨대, 농업, 하우징 및 산림 산업으로부터의 생분해성 부산물이 또한 바이오 에너지를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 짚, 목재, 거름, 쌀, 옥수수 껍데기, 하수물, 생분해성 폐기물 및 음식물 찌꺼지가 혐기성 분해를 통해 바이오 가스로 전환될 수 있다. 그러나, 식물 생산성은 CO2 확산 및 격리, 생육 기간 및 1년간에 걸친 태양광 에너지 수집에 대한 제한으로 인해 태양광 에너지의 바이오매스 및 바이오 연료로의 낮은 전환 수율을 갖는다. 태양광 에너지 전환의 더 높은 효율은 조류 및 시아노박테리아에 의해 달성된다.
살아있는 유기체를 사용하여 에탄올을 생성시키는 방법이 또한 기술되었다. 예를 들어, 뮬러 (Muller) 등의 U.S. 특허 4,242,455는 카보히드레이트 중합체 입자 예컨대, 전분 과립 및/또는 셀룰로오스 칩, 섬유 등의 수성 슬러리가 강한 무기 산으로 산성화되어 발효가능한 당을 생성시키는 연속 공정이 기술되어 있다. 그 후, 발효가능한 당은 두종 이상의 사카로마이세스 (Saccharomyces)에 의해 에탄올로 발효된다. 시바타 (Chibata) 등의 U.S. 특허 4,350,765는 고정화된 사카로마이세스 또는 지모모나스 (Zymomonas) 및 발효성 당을 함유하는 영양 배양 브로쓰를 사용함으로써 고농도의 에탄올을 생성하는 방법이 기술되어 있다. 아쿠리 (Arcuri) 등의 U.S. 특허 4,413,058는 연속 반응기 컬럼중에 미생물을 위치시키고, 상기 컬럼을 토해 수성 당 스트림을 통과시킴으로써 에탄올을 생성시키는데 사용되는 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) 균주를 기술하고 있다.
하트레이 (Hartley) 등의 PCT 출원 WO/88/09379에는 셀로비오스 및 펜토스를 포함하는 다양한 당을 발효시킴으로써 에탄올을 생성시키는 임의 혐기성 호열성 박테리아 균주의 사용을 기술하고 있다. 이들 박테리아 균주는 락테이트 탈수소효소의 변이를 함유한다. 그 결과, 혐기성 조건하에서 정상적으로 락테이트를 생성시키는 이들 균주는 대신에 에탄올을 생성시킨다.
U.S. 공개 2002/0042111에는 에탄올을 생성시키는데 사용될 수 있는 유전적으로 변형된 시아노박테리아가 기술되어 있다. 시아노박테리아는 지모모나스 모빌리스 플라스미드 pLOI295로부터 수득된 피루베이트 데카르복실라아제 (pdc) 및 알코올 탈수소효소 (adh)를 엔코딩하는 DNA 단편을 포함하는 작제물을 포함한다.
발명의 요약
본 발명은 대상 유전자의 서열 또는 발현 수준이 유입, 결실 및/또는 과다발현되도록 변형시켜 목적하는 생성물의 생산을 증가시키는 변형된 광독립영양 박테리아를 제공함으로써 당해분야의 결함을 극복한다. 목적 생성물은 수개의 유용한 생성물 예컨대, 바이오 연료, 바이오플라스틱, 동물 사료 첨가제, 고가의 염료 또는 항산화제, 또는 유기 비료로 가공될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는, 발현이 변화되고/거나 유전자 생성물 기능이 변화되어 박테리아에서 지방산, 지질 카로테노이드, 그 밖의 이소프레노이드, 탄수화물, 단백질, 바이오가스 또는 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생성물의 생성량을 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에서의 하나 이상의 생성물의 양과 비교하여 증가시키는 하나 이상의 대상 유전자를 포함하는 변형된 광독립영양 박테리아에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 다양한 변형이 하나 이상의 유전자에 도입되고, 여기서 다양한 변형이 집단적으로 목적하는 생성물의 생성을 증가시킨다. 변형된 광독립영양 박테리아는 이산화탄소를 흡수하고 고정시키는 유형일 수 있다. 특정 양태에서, 변형된 광독립영양 박테리아는 추가로 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 흡수량 및 고정량을 증가시키는 것으로 규정된다.
대상 유전자의 발현은 유전자가 상향조절되거나 하향조절되도록 변화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 발현은 내생 유전자의 변형, 내생 유전자의 결실 또는 내생 유전자의 조절 서열의 변형에 의해 변화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 대상 유전자의 발현은 하나 이상의 형질전환 서열을 하나 이상의 비변형된 유전자에 부가함으로써 변화될 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 "천연 광독립영양 박테리아"는 자연에서 발견되는 광독립영양 박테리아를 나타내며, 본 발명에 기술된 방식으로 변화된 유전자 기능을 갖지 않는다. 그러나, 물론, 목적 생성물의 생성을 증가시키도록 사전에 변형된 박테리아를 수득함으로써 본 발명을 수행하는 것이 가능하다. 이러한 사전 변형은 박테리아에 행해진 임의의 조작을 포함할 수 있다.
본 발명의 본 광독립영양 박테리아는, 변형에 의해, 변형되지 않은 하나 이상의 유전자의 발현이 후대에 이어지는 광독립영양 박테리아에서의 하나 이상의 생성물의 양과 비교하여 박테리아에서 하나 이상의 목적 생성물의 생성량을 증가시키는 한, 원래 변형된 박테리아이거나 임의 세대의 후손일 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 광독립영양 박테리아의 비제한적인 예로는 시아노박테리아 (cyanobacteria), 녹색 유황 박테리아 (green sulfur bacteria), 녹색 비유황 박테리아, 헬리오박테리아 (heliobacteria), 광합성 아시도박테리아 (photosynthetic acidobacteria), 홍색 유황 박테리아, 또는 홍색 비유황 박테리아를 포함한다. 특정 양태에서, 변형된 광독립영양 박테리아는 시아노박테리아이다. 시아노박테리아는 목 크로코칼레스 (Chroococcales), 노스토칼레스 (Nostocales), 오스실라토리알레스 (Oscillatoriales), 플레우로캅살레스 (Pleurocapsales), 프로클로로파이테스 (Prochlorophytes), 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales)가 있 다. 목 크로코칼레스는 아파노캅사 (Aphanocapsa), 아파노테세 (Aphanothece), 카마에시폰 (Chamaesiphon), 크로코커스 (Chroococcus), 크로코스패라 (Crocosphaera), 시아노박테리움 (Cyanobacterium), 시나오비움 (Cyanobium), 시아노테세 (Cyanothece), 다크틸로코콥시스 (Dactylococcopsis), 글로에오박터 (Gloeobacter), 글로에오캅사 (Gloeocapsa), 글로에오테세 (Gloeothece), 에유할로테세 (Euhalothece), 할로테세 (Halothece), 요하네스밥티스티아 (Johannesbaptistia), 메리스모페디아 (Merismopedia), 마이크로시스티스 (Microcystis), 라브도데르마 (Rhabdoderma), 시네코코커스 (Synechococcus), 및 시네코시스티스 (Synechocystis), 및 써모시네코코커스 (Thermosynechococcus)로 구성된 군으로부터 선택된 종을 포함할 수 있다. 목 노스토칼레스는 콜레데스미움 (Coleodesmium), 프레미엘라 (Fremyella), 마이크로샤테 (Microchaete), 렉시아 (Rexia), 스피리레스티스 (Spirirestis), 톨리포트릭스 (Tolypothrix), 아나베나 (Anabaena), 아나베놉시스 (Anabaenopsis), 아파니조메논 (Aphanizomenon), 아울로시라 (Aulosira), 시아노스피라 (Cyanospira), 실린드로스페르몹시스 (Cylindrospermopsis), 실리드로스페르뭄 (Cylindrospermum), 노둘라리아 (Nodularia), 노스톡 (Nostoc), 리첼리아 (Richelia), 칼로트릭스 (Calothrix), 글로에오트리치아 (Gloeotrichia), 및 스시토네마 (Scytonema)로 구성된 군으로부터 선택된 종을 포함할 수 있다. 목 오스실라토리알레스는 아르트로스피라 (Arthrospira), 제이틀레리네마 (Geitlerinema), 할로마이크로네마 (Halomicronema), 할로스피룰리나 (Halospirulina), 카타그나이네메 (Katagnymene), 렙토린그비아 (Leptolyngbya), 림노트릭스 (Limnothrix), 린그비아 (Lyngbya), 마이크로코레우스 (Microcoleus), 오스실라토리아 (Oscillatoria), 포르미디움 (Phormidium), 플라크토트리코이데스 (Planktothricoides), 플라크토트릭스 (Planktothrix), 플레크토네마 (Plectonema), 림노트릭스 (Limnothrix), 슈다나배나 (Pseudanabaena), 쉬조트릭스 (Schizothrix), 스피룰리나 (Spirulina), 심플로카 (Symploca), 트리코데스뮴 (Trichodesmium), 및 티코네마 (Tychonema)로 구성된 군으로부터 선택된 종을 포함할 수 있다. 목 플레우로캅살레스는 크로오코시디옵시스 (Chroococcidiopsis), 데르모카르파 (Dermocarpa), 데르모카르펠라 (Dermocarpella), 믹소사르시나 (Myxosarcina), 플레우로캅사 (Pleurocapsa), 스타니에리아 (Stanieria), 및 제노코커스 (Xenococcus)로 구성된 군으로부터 선택된 종을 포함할 수 있다. 목 프로클로로파이테스는 프로클로론 (Prochloron), 프로클로로코커스 (Prochlorococcus), 및 프로클로로트릭스 (Prochlorothrix)로 구성된 군으로부터 선택된 종을 포함할 수 있다. 목 스티고네마탈레스는 캅소시라 (Capsosira), 클로로글로에옵시스 (Chlorogloeopsis), 피세렐라 (Fischerella), 하팔로시폰 (Hapalosiphon), 마스티고클라돕시스 (Mastigocladopsis), 마스티고클라두스 (Mastigocladus), 노스토콥시스 (Nostochopsis), 스티고네마 (Stigonema), 심피오네마 (Symphyonema), 심피오네몹시스 (Symphyonemopsis), 우메자키아 (Umezakia), 및 웨스티엘롭시스 (Westiellopsis)로 구성된 군으로부터 선택된 종을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 시아노박테리아는 시네코시스티스 sp. (Synechocystis sp.) PCC 6803 또는 써모시네코코커스 엘롱가투스 균주 BP-1이다.
대상 유전자가 결실 또는 유입되거나, 이들의 발현 수준이 변화된 일부 구체예에서, 변형된 광독립영양 박테리아는 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 지질 생산량과 비교하여 하나 이상의 지질의 생성량이 증가된 것으로 추가로 규정된다. 변형된 광독립영양 박테리아는 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아의 지질 함량과 비교하여 증가된 지질 함량을 갖는 것으로 추가로 규정될 수 있다. 지질 함량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 이상으로 증가될 수 있거나, 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수까지 증가될 수 있다. 또한, 지질 함량은 당업자에게 공지된 방법에 의해 계산할 경우 유기체의 이론적 건조 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수일 수 있다. 과다발현될 수 있으며, 지질 생성 또는 지질 함량의 증가를 유도할 수 있는 대상 유전자로는 소포 유도 플래스티드 단백질 1 (vesicle-inducing protein in plastids 1) (VIPP1) 유전자 (sllO617), 유사 pspA-형 유전자 slr1188, 틸라코이드 막 형성 및 조성에 중요한 yidC 및 oxaI과 유사한 slr1471 유전자, 아세틸-CoA 카르복실라아제 유전자 (sllO728, slrO435, sll0053, 및 sllO336), 트랜스아세틸라아제 유전자, 지방산 생합성 유전자 fabD (slr2023), fabH (slr1511), fabF (sll1O69 및 slr1332), fabG (slrO886), fabZ (sll1605), 및 fabI (slr1051), 피브릴 또는 틸라코이드 막과 관련된 소수성 물질을 포함하는 단백질을 코딩하는 플라스토글로불린/피브릴린 유전자 (slr1024 및 sll1568), 데새투라아제유전자, 1-아실글리세롤-3-포스페이트 아실 트랜스퍼라아제를 엔코딩하는 sll1848, 또는 포스포리피드-글리세롤 아실트랜스퍼라아제 유전자 예컨대, slr2060을 포함할 수 있다. 막의 지질 함량은 또한, 막중의 단백질을 인지하는 프로테아제 (ftsH 유전자 sll1463, slrO228, slr1390, 및 slr1604, clpB 유전자 slrO156 및 slr1641, 및 clpP 유전자 slrO542, sllO534, 및 slr0165 포함)의 과다발현에 의해 또는 지질 생성에 사용되는 고정된 탄소량을 증가시키기 위한 대사 조작에 의해 (예를 들어, PEP 카르복실라아제 유전자인 sll0920 및 시트레이트 합성효소 유전자인 sll0401의 하향 조절에 의해 및/또는 글리코겐 생합성에 관련된 slr1176, 폴리히드록시부티레이트 형성 및 대사와 관련된 slr1829/1830, 및 시아노피신 형성 및 대사와 관련된 slr2001/2002를 포함하는 저장 화합물의 합성에 관련된 유전자의 결실에 의해) 증가될 수 있다. 또한, 유기체에 의해 생성되는 지질의 유형은 트리글리세리드 (예컨대, 효모 (LR01) 또는 아라비돕시스 (Arabidopsis) (TAG1)으로부터의 디아실글리세롤)의 형성을 허용하며, 글리코리피드, 설포리피드 및 포스포리피드의 형성을 질적으로 또는 양적으로 변화시키거나, 지방산의 포화도를 변화시키는 유전자의 도입에 의해 변화될 수 있다. 시네코시스티스 (Synechocystis)에서 지방산 데새투레이션 (desaturation)은 DesA (Slr1350), DesB (Sll1441), DesC (Sll0541), 및 DesD (Sll0262)에 의해 촉매되며, 상응하는 유전자 발현의 조절은 지방산 데새튜레이션 정도를 조정하여 세포의 온도 내성을 조절한다. 틸라코이드 막 형성의 조절 경로 또는 조절과 관련된 유전자의 상이한 발현은 또한 증가된 지질 함량 또는 증가된 바이오 연료 값을 유도할 것이다. 특정 구체예에서, 대상 유전자는 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 sllO336, sllO728, sll1568, sll1848, slr2060, sllO617, slr1471, sll1463, slrO228, slr1024, slr1390, slr1604, slrO156, slr1641, slrO542, slrO165, slrO435, sll0053, slr2023, slr1511, sll1O69, slr1332, slrO886, sll1605, slr1O51, slr1176, slr1188, slr1024, sll1568, slr1829, slr1830, slr2001, slr2002, slr1350, sll1441, sllO541, sllO262, sll0920, sll0401, 및 sllO534를 포함한다. 당업자는 이들 유전자들의 상동체가 다른 광독립영양 박테리아에서 존재함을 인지할 것이다. 이들 상동체는 또한 이들 종에서 변형되거나, 유입되거나 또는 결실될 수 있다. 또한, 세포내의 지질 유형은 트리아실글리세롤 합성을 가능하게 하는 유전자의 도입에 의해 변화될 수 있다. 트리아실글리세롤 과다생성은 채취되고 분리될 수 있는 세포중의 지질체 (lipid body)의 합성을 유도할 수 있다.
특정 이론에 결부되지 않으면서, 트리아실글리세롤은 포스파티드산 (Sll1848 생성물)의 포스페이트를 제거하여 디아실글리세롤을 생성시키고, 디아실글리세롤 아실 트랜스퍼라아제에 의해 또 다른 아실 기를 부가함으로써 형성된다. 포스파티드산으로부터 포스페이트를 제거하는데 기여하는 효소로서 가능하게는 시네코시스티스중의 sll0545에 의해 엔코딩되는 포스파티드산 포스파타아제이다. 이러한 유전자는 고(high)-트리글리세리드 균주 (예컨대, 로도코커스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus))로부터의 포스파티드산 포스파타아제와 함께 과다발현될 수 있다. 트리글 리세리드를 형성하기 위해, 효모로부터의 LRO1 또는 기타 시스템으로부터의 중요한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제가 유입될 수 있다. LR01은 진핵세포중의 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라아제 유전자와 유사하며, 급격한 성장 동안 효모에서 대부분의 트리글리세리드 합성을 매개한다. 상동체가 오일시드 식물에 존재하며, 이러한 효소에 대한 아실 도너는 포스포리피드일 수 있다. 또한, 아실 도너로서 아실-CoA를 사용하는 것으로 보이는 아라비돕시스 (Arabidopsis) (TAG1 로커스로부터의 cDNA)로부터의 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제가 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 시네코시스티스중의 트리글리세리드 형성이 최대화될 수 있다. 원핵 세포에서, 생성된 트리글리세리드는 일반적으로 단백질/포스포리피드 단일층에 의해 둘러쌓이는 작은 지질 소적인 식물 오일 시드중의 오일체와 유사하게, 세포질 봉입체로서 저장된다. 이들은 소량 (1-2%)의 포스포리피드 및 단백질을 갖는 본질적으로 순수한 트리글리세리드이며, 막에서 형성된다.
대상 유전자가 결실 또는 유입되거나, 이들의 발현 수준이 변화된 일부 구체예에서, 변형된 광독립영양 박테리아는 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 카로테노이드 또는 그 밖의 이소프레노이드 생성량과 비교하여 하나 이상의 카로테노이드 또는 그 밖의 이소프레노이드의 생성량이 증가된 것으로서 추가로 규정된다. 변형된 광독립영양 박테리아는 또한, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 카로테노이드 또는 그 빡의 이소프레노이드 함량과 비교하여 카로테노이드 또는 그 빡의 이소프레노이드 함량이 증가된 것으로 규정될 수 있다. 카로테노이드의 비제한적인 예로는 베타-카로텐, 제악산틴 (zeaxanthin), 믹스옥산토필 (myxoxanthophyll), 믹솔 (myxol), 에치네논 (echinenone), 및 이들의 생합성 중간체를 포함한다. 비제한적인 그 밖의 이소프레노이드의 예로는 이소프렌, 토코페롤 및 이들의 생합성 중산체를 포함한다. 카로테노이드 함량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 이상 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수까지 증가될 수 있다. 또한, 카로테노이드 함량은 당업자에게 공지된 방법에 의해 계산할 경우 유기체의 이론적 건조 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수일 수 있다. 유기체중의 기타 이소프레노이드의 함량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 이상 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수까지 증가될 수 있다. 또한, 천연 유기체에서는 생성될 수 없는 일부 이소프레노이드는 본원에 기술된 방법을 통해 변형된 유기체중에서 생성될 수 있다. 임의의 이소프레노이드의 함량은 당업자에게 공지된 방법에 의해 계산할 경우 유기체의 이론적 건조 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수일 수 있다. 변형될 수 있으며 카로테노이드 생성 또는 카로테노이 드 함량에서 변화된 발현을 유도할 수 있는 대상 유전자로는 카로테노이드 전구체인 C5 화합물 IPP 및 DMAPP를 발현하거나 이의 생성을 조절하는 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slrO348); 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라아제를 발현하거나 이의 생성을 조절하는 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 sll1556); crtP 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slr1254); crtQ 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slr0940); crtD 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slr1293); crtLdiox 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 sll0254); 및 crtR 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slll468)이 있다. 이소프렌 합성 가능한 시네코시스티스를 제공하기 위한, 대상 유전자는 식물 예컨대, 포플러 품종으로부터의 이소프렌 합성효소 유전자 또는 이의 상동체일 수 있으며, 이는 강한 프로모터하에 시네코시스티스로 유입된다. 당업자는 이들 유전자의 상동체가 다른 광독립영양 박테리아에 존재함을 인지할 수 있을 것이다. 이들 상동체는 또한, 이들 종에서 과다발현되거나 변형될 수 있다.
대상 유전자가 결실 또는 유입되거나, 이들의 발현 수준이 변화된 일부 구체예에서, 변형된 광독립영양 박테리아는 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 탄수화물 생성량과 비교하여 하나 이상의 탄수화물의 생성량이 증가된 것으로서 추가로 규정된다. 변형된 광독립영양 박테리아는 또한, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유 전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 탄수화물 함량과 비교하여 탄수화물 함량이 증가된 것으로 규정될 수 있다. 탄수화물 함량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 이상 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수까지 증가될 수 있다. 또한, 천연 유기체에서는 생성될 수 없는 일부 탄수화물은 본원에 기술된 방법을 통해 변형된 유기체중에서 생성될 수 있다. 유기체중에 생성된 하나 이상의 탄수화물의 함량은 당업자에게 공지된 방법에 의해 계산할 경우 유기체의 이론적 건조 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 또는 이들 지점 사이의 유도가능한 임의의 범위 또는 정수일 수 있다. 탄수화물의 비제한적인 예로는 모노사카라이드 및 모노사카라이드 포스페이트 (예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 크실룰로스-5-포스페이트, 리불로오스-5-포스페이트, 리보오스-5-포스페이트, 프룩토오스-6-포스페이트, 글루코오스-6-포스페이트, 세도헵툴로오스-7-포스페이트, 에리트로스-4-포스페이트, 세도헵툴로오스-비스포스페이트, 및 프룩토오스-비스포스페이트), 디사카라이드 (예를 들어, 수크로오스), 올리고사카라이드 (예를 들어, 프룩토-올리고사카라이드 및 만난-올리고사카라이드), 및 폴리사카라이드 (예를 들어, 글리코겐 및 이의 유도체)를 포함한다. 당업자는 글리코겐 합성효소의 유전자 및 글리코겐 분지 효소는, 탄수화물이 글리코겐으로 전환되지 않고, 폴리락트산 (PLA), 폴리-3-히드록시부티레이트 (PHB) 또는 기타 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 또는 지질 또는 기타 바이오 연료로 전환되는 방식으로 변이될 수 있다. 대안적으로, 유전자는 특정 탄소 대사에 관련된 유전자일 수 있다.
특정 양태에서, 대상 유전자는 항시성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 항시성 프로모터의 비제한적 예로는 psbDII, psbA3, 및 psbA2 프로모터를 포함한다. 대상 유전자는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 유도성 프로모터의 비제한적 예로는 nirA, isiAB, petE, nrsRS, nrsABCD, 및 ndhF3 프로모터를 포함한다. 다수의 유전자가 동일한 프로모터의 조정하에 놓이도록 유입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 광독립영양 박테리아로부터의 목적 생성물의 생성을 증가시키는 방법이 기술되어 있다. 본 방법은 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시켜 광독립영양 박테리아중의 하나 이상의 생성물 또는 하나 이상의 대상 유전자의 생성을 증가시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 변화는 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의해 생성된 생성물의 양과 비교하여 하나 이상의 생성물의 생성량을 증가시킨다. 본 방법은 추가로, 증가된 양의 목적 생성물을 생성시키는데 적합한 조건하에 광독립영양 박테리아를 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 온도 (온도에서의 시간적 및 공간적 변화 포함), 질소 수준 (질산염, 아질산염, 유기 아민, 암모니아 등에 있어서 질소의 특정 화학 구성 포함), 이산화탄소 수준, 광도, 광 노출 시간 (또는 더욱 일반적으로 광도의 시간적 조절), 광파장 (광도의 스펙트럼 조절), 광분포 (광도의 공간적 조절), 인 수준, 황 수준 (유기 황, 술페이트 등과 같은 다양한 형태의 황의 특정 수준 포함), 무기물 수준 (철, 마그네슘, 망간, 아연 등과 같은 개별 금속의 특정 수준 포함), 혼합율 (시간 또는 지점의 함유로서 혼합 조절 포함), 박테리아 밀도 (얼마나 빨리 박테리아가 채취되어 특정 정상 상태 세포 밀도 (steady state cell density)를 유도하는가), 영양분 유입 속도 및 시간적 조절 (탄소, 질소, 황, 인, 무기물 등) 및 박테리아의 성장 속도 및 조성에 중요한 그 밖의 환경의 최적화를 포함할 수 있다. 광독립영양 박테리아는 이산화탄소를 흡수하고 고정하는 유형일 수 있다. 해당 유전자의 발현 수준의 조절 및/또는 천연 유전자(들)의 결실 및/또는 이종 유전자(들)의 유입은 해당 유전자의 발현 수준이 변화되지 않고/거나 천연 유전자(들)이 결실되지 않고/거나 이종 유전자(들)이 유입되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수 및 고정 양과 비교하여 이산화탄소의 흡수 및 고정을 증가시킬 수 있다. 목적 생성물은 (비제한적으로) 지질 (또는 지질의 혼합물), 탄수화물 (또는 탄수화물의 혼합물), 일반적인 탄수화물의 당 조성, 카로테노이드 (또는 카로테노이드 예를 들어, 베타-카로텐, 제아크산틴, 마이옥소크산토필, 마익솔 (myxol), 에키네논 및 이들의 생합성 중간체의 혼합물), 또 다른 이소프레노이드 (또는 이소프레노이드의 혼합물), 단백질 (또는 단백질의 혼합물), 일반적인 단백질의 아미노산 조성, 또는 저장 단백질 시아노피신 (및 관련 화합물)일 수 있다. 단백질의 경우, 단백질의 특정 혼합물은 동물 사료의 목적, 새로운 백신 제조 또는 그밖의 유용한 단백질 생성물의 생성에 최적화되록 생성될 수 있다. 또한, 특정 단백질은 이들이 목적 생성물을 오염시키거나 이들의 수율을 저하시키는 경우 세포중에서 이들의 수준이 하향조절될 수 있다. 본 방법은 추가로 목적 생성물을 바이오 연료로 가공하는 것을 포함 할 수 있다. 바이오 연료의 비제한적인 예로는 바이오 디젤, 바이오 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 및 바이오 가스 (수소, 이소프렌, 메탄, 에탄, 프로판 및 부탄)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 목적 생성물을 바이오플라스틱으로 가공하는 것을 포함할 수 있다. 바이오플라스틱의 비제한적인 예로는 폴리락트산 (PLA), 폴리-3-히드록시부티레이트 (PHB), 또는 폴리-3-히드록시알카노에이트 (PHA)를 포함한다. 목적 생성물은 동물 사료 첨가제 또는 유기 비료로 가공될 수 있다.
광독립영양 박테리아의 적합한 성장 조건은 본 명세서에 걸쳐 기술된 것과 당업자에게 널리 공지된 것을 포함한다. 일 구체예에서, 예를 들어, 적합한 성장 조건은 박테리아에 이산화탄소 공급원을 제공하는 것을 포함한다. 이산화탄소의 공급원은 다양할 수 있다. 일 구체예에는 이러한 공급원은 연도 가스 (flue gas)로부터 수득된다. 또 다른 구체예에서, 이산화탄소의 공급원은 대기중에 존재할 수 있다. 적합한 성장 조건은 박테리아에 고정된 질소의 공급원을 제공하는 것을 포함한다. 고정된 질소의 공급원은 다양할 수 있다. 일 구체예에서, 공급원은 지하수, 암모니아, 질산나트륨 또는 질산암모늄으로부터 수득된다. 광독립영양 박테리아에 제공되는 이산화탄소의 양은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 % 또는 그 초과일 수 있으며, %는 배양물에 제공되는 가스중의 CO2의 분압을 나타낸다. 광독립영양 박테리아에 제공되는 고정된 질소의 양은 배지중의 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 mM 또는 그 초과일 수 있다. 적합한 성장 조건은 박테리아를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90℃ 또는 그 초과의 온도 또는 상기내의 임의의 범위 또는 정수의 온도에서 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 온도 범위는 10 내지 55℃이다. 적합한 성장 조건은 또한 광독립영양 박테리아를 광 (예를 들어, 태양광)으로 처리하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 광독립영양 박테리아로부터 목적 생성물을 생성시키는 방법을 포함한다. 본 방법은, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물의 기능이 변화되어, 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의해 생성된 목적 생성물의 양과 비교하여 광독립영양 박테리아의 하나 이상의 생성물 또는 하나 이상의 대상 유전자의 생성량을 증가시키는 본 발명의 방법에 의해 생성된 또는 본 발명의 변형된 광독립영양 박테리아를 수득하고; 이러한 광독립영양 박테리아를 목적 생성물을 생성하기에 적합한 조건하에 성장시키고; 목적 생성물을 분리하는 것을 포함할 수 있다. 광독립영양 박테리아는 이산화탄소를 흡수 및 고정시키는 유형일 수 있다. 대상 유전자의 발현 수준을 변화시키고/거나 천연 유전자(들)를 결실시키고/거나 이종 유전자(들)를 유입시키 는 것은 해당 유전자의 발현 수준이 변화되지 않고/거나 천연 유전자(들)가 결실되지 않고/거나 이종 유전자(들)이 유입되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 흡수량 및 고정량을 증가시킬 수 있다. 목적 생성물의 비제한적인 예로는 지질, 탄수화물, 카로테노이드, 그 밖의 이소프레노이드, 염료, 항산화제, 그 밖의 이차 대사물, 단백질, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 분리 단계의 비제한적인 예로는 본 명세서 전반에 걸쳐 기술된 것과 당업자에게 공지된 것을 포함한다. 비제한적인 예로는 유기 용매로의 추출, 초임계 조건하에 무해한 화학물질 (예를 들어, CO2 또는 물)로의 추출 또는 이상 분할을 포함한다. 본 방법은 본 명세서에 기술된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 의해 목적 생성물을 바이오 연료, 바이오플라스틱, 카로테노이드, 동물 사료 또는 발효제로 가공처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 이산화탄소를 고정하는 방법을 포함한다. 본 방법은 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물의 기능이 변화되어, 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 흡수량 및 고정량이 증가된, 이산화탄소를 흡수하고 고정시킬 수 있는 본 발명의 방법에 의해 생성된 또는 본 발명의 변형된 광독립영양 박테리아를 수득하고; 이러한 광독립영양 박테리아를 이산화탄소를 흡수하고 고정시키는데 적합한 조건하에 광독립영양 박테리아를 성장시키고; 이산화탄소 공급원을 변형된 광독립영양 박테리아에 제공하는 것을 포함하 며, 여기서 공급원으로부터의 이산화탄소의 적어도 일부는 변형된 광독립영양 박테리아에 의해 고정된다. 이산화탄소 공급원의 비제한적인 공급원은 연도 가스, 대기 CO2 또는 기타 CO2 공급원일 수 있다. 본 방법은 추가로 연도 가스중의 이산화탄소의 적어도 일부를 고정시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 방법 또는 조성과 관련하여 본 명세서에 논의된 임의 구체예가 포함될 수 있으며 그 반대의 경우도 성립된다. 또한, 본 발명의 조성은 본 발명의 방법을 달성하기 위해 이용될 수 있다.
청구범위 및/또는 명세서중의 단수 형태는 "하나"를 의미하는 것을 수 있으나, 이는 또한 "하나 또는 그 초과", "하나 이상" 및 "하나 또는 하나 보다 많은"의 의미에도 부합된다.
청구범위 및/또는 명세서중의 "하나 또는 그 초과"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과로서 규정된다.
용어 "하나 또는 그 초과의 생성물"은 단일 부류의 다수 생성물 (즉, 2개 또는 그 초과의 지질; 2개 또는 그 초과의 바이오 가스), 다중 부류의 단일 생성물 (즉, 1개의 지질, 1개의 지방산, 1개의 탄수화물 등), 또는 이의 조합일 수 있다.
예를 들어, 유전자 발현과 관련된 용어 "변화"는 (a) 발현의 상향 조절 또는 하향 조절; (b) 천연 발생 유전자 (예를 들어, 유도성 프로모터 작제물 등에 의한)의 변형; (c) 내생 유전자의 변이; 유전자이식 작제물 (예를 들어, 이식유전자) (상이한 유기체에서 천연 발생하거나 변이된)에 의한 변형; (d) 이의 조합 등을 포 함하는 임의의 유형의 변화를 포함한다.
본 출원 전반에 걸쳐 용어 "약" 및 "대략"은 장치에 있어서는, 지칭하는 값이 값을 결정하는데 사용되는 장치, 방법에 있어서 고유의 오차 변화, 또는 연구 피검체중에 존재하는 차이를 포함하는 것을 나타낸다. 하나의 비제한적인 구체예에서, 이들 용어는 10% 내, 바람직하게는, 5% 내, 더욱 바람직하게는, 1% 내, 가장 바람직하게는, 0.5% 내에 있는 것으로 규정된다.
본 청구범위에서 용어 "또는"은 단지 대체물을 명백히 나타내거나 대체물이 상호 배타적인 관계에 있는 것으로 지시되어 있지 않는 한, "및/또는"을 나타내기 위해 사용되지만, 대체물 및 "및/또는"에 대한 정의를 뒷받침한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" (및 "포함하는"의 임의의 형태 예컨대, "포함하다" 및 "포함하며"), "갖는" (및 "가지며"의 임의의 형태 예컨대, "갖는다" 및 "가지며"), 또는 "함유하는" (및 "함유하는"의 임의의 형태 예컨대, "함유하다" 및 "함유하며")는 총괄적이며 제한되는 것이 아니며, 추가적인 비언급된 엘리먼트 및 방법 단계를 배제시키는 것은 아니다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 나타내는 것으로서 단지 실례로서 제공되어 있을 뿐이며, 본 발명의 사상 및 범위내에서 다양한 변화 및 변형이 당업자에게 자명할 것임을 이해해야 한다.
하기 도면은 본 발명의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 양태를 추가로 입 증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구체예의 상세한 설명과 함께 이들 도면중 하나 이상을 참조로 하여 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1. 당 포스페이트 표준 및 시네코시스티스 추출물의 LC/MS. LC 용출 시간은 X 축이며, 당 인산염을 나타내는 당 인산염 질량은 Y 축상에 위치한다. Z 축은 MS 시그널의 밀도를 나타낸다. A. 20μM 농도에서의 당 인산염 표준. B. 특정 당 인산염의 질량을 모니터링하는, 광혼용영양적으로 성장한 시네코시스티스 야생형 배양물로부터의 세포 추출물에 대한 LC/MS. 일부 중간체가 현저한 농도로 추출물중에 존재할 수 있는 반면, 나머지는 본질적으로 검출되지 않았음을 주목하라.
도 2. MS/MS에 의한 LC/MS 피크의 입증 예. 259 m/z 피크가 제 1 MS에서 선택되었으며, 본 도면에서 나타낸 시그널은 제 2 MS 후의 97 m/z (인산염) 시그널의 세기이다.
도 3. 광혼용영양적으로 성장하는 시네코시스티스 배양물의 13C-글루코오스 라벨링시 3-포스포글리세레이트 (3PG) 동위원소이성질체의 동적 분배. 0시간에 0.5mM 13C-글루코오스를 첨가하였다. 샘플을 다양한 시점에서 회수하고, 3PG (비라벨링된 질량 (185), 질량+1, 질량+2, 질량+3)의 질량 분포를 분석하였다.
도 4. 대사 농도 대 MS 시그널의 영역의 조정. 상이한 농도의 표준물을 세포 추출물에 첨가하였다. 추출물중의 상응하는 대사물의 농도는 가로좌표와의 교차점의 절대값이다. G6P: 백색 원; 3PG: 흑색 원; PEG: 백색 삼각형.
도 5. 라벨링된 글루코오스의 첨가 후 광혼용영양적 조건하에 성장 시간의 함수로서 세포로부터의 추출물중의 헥소오스-6-포스페이트 (G6P+F6P), 포스포글리세레이트 (3PG+3PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 세도헵툴로오스-7-포스페이트 (S7P) 풀의 동위원소 분포. 0.5mM 13C 글루코오스를 0시간에 첨가하였다. 동위원소이성질체는 질량에 따라 X-축에서 분리된다 (왼쪽에서 오른쪽으로: 비라벨링된 질량, 질량+1, 질량+2, 등). 데이타는 세 실험의 평균이었다. 표준 편차 분석은 5% 초과의 상대 세기의 변화가 현저하다는 것을 보여주었다.
도 6. 라벨링된 중탄산염의 첨가 후 광혼용영양적 조건하에 성장 시간의 함수로서 세포로부터의 추출물중의 헥소오스-6-포스페이트 (G6P+F6P), 포스포글리세레이트 (3PG+2PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 세도헵툴로오스-7-포스페이트 (S7P) 풀의 동위원소 분포. 0.5mM 비라벨링된 글루코오스 및 5mM NaH13CO3를 0시간에 첨가하였다. 동위원소이성질체는 질량에 따라 X-축에서 분리된다 (왼쪽에서 오른쪽으로: 비라벨링된 질량, 질량+1, 질량+2, 등). 데이타는 세 실험의 평균이었다. 표준 편차 분석은 5% 초과의 상대 세기의 변화가 현저하다는 것을 보여주었다.
도 7. 25μM 아트라진의 존재하에 광혼용영양적 조건하에 성장 시간의 함수로서 세포로부터의 추출물중의 헥소오스-6-포스페이트 (G6P+F6P), 포스포글리세레이트 (3PG+3PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 세도헵툴로오스-7-포스페이트 (S7P) 풀의 동위원소 분포. 0.5mM 13C 글루코오스를 0시간에 첨가하였다. 동위원 소이성질체는 질량에 따라 X-축에서 분리된다 (왼쪽에서 오른쪽으로: 비라벨링된 질량, 질량+1, 질량+2, 등). 데이타는 세 실험의 평균이었다. 표준 편차 분석은 5% 초과의 상대 세기의 변화가 현저하다는 것을 보여주었다.
도 8. 야생형 비분할 도 8A 및 분할 도 8B 시네코시스티스 sp. PCC 6803 시아노박테리아 세포의 투과전자현미경 사진. 두 스테이지에서, 틸라코이드 막 쌍 (백색 화살표)의 대부분의 주변 배열이 세포질 막에 인접한 부위에서 집중된다. 카르복시좀 (흑색 화살표), PHA 과립 (별표), 지질체 (백색 화살표) 및 격막 (흑색 화살표)을 표시하였다. 도 8C-F는 틸라코이드 막 생물발생에 관련된 단백질을 코딩하는 VIPP1 유전자를 과다발현하는 시네코시스티스 sp. PCC 6803 시아노박테리아의 변이체의 전자현미경 사진이다. 도 8C는 틸라코이드 막의 양이 현저하게 증가하였으며, 납잡해진 막 (백색 별표)은 단일의 틸라코이드 시트 (백색 화살표)로 분기되는 것으로 보인다. 도 8D. 도 8C의 확대도. 도 8E는 이러한 변이체에 독특한 틸라코이드 막 (흑색 화살표)와 밀접하게 관련된 박막 구조 (흑색 별표)의 존재를 보여준다. 도 8F는 도 8E의 확대도. 스케일 막대 = 200nm.
도 9. 0.04% 나일 블루 (도 9A)로 12시간 동안 생체내 염색 후의 시네코시스티스 sp. PCC 6803 세포. 이미지는 488nm에서 여기시키고 560 내지 620nm 에서 검출한 주사형 공집점 레이저 현미경 사진 (도 9A-D) 또는 epi-형관 현미경 사진 (도 9E-F)이다. 도 9A. 표준 BG-11 배지중에서 배양된 초기 증식기에서의 야생형 세포. 도 9B. N-제한된 배지중에 배양된 정지상 야생형 세포 (1.67mM 질산염). 도 9C. NaNO3 (16.7mM)를 10mM NH4Cl로 대체한 변형된 BG-11 배지중에서 배양된 초기 대수증식기에서의 야생형 세포. 도 9D. 중간-대수증식기에서 PS II-비함유/옥시다아제 비함유 세포. 도 9E. 중간-대수증식기에서의 옥시다아제-비함유 세포. 도 9F. 중간-대수증식기에서 NDH-1-비함유 세포. PSII-비함유/옥시다아제-비함유 배양물을 제외한 모든 배양물은 광독립영양적으로 성장하였다. 막대 크기: 1μm.
도 10. 5mM 글루코오스의 존재하에 광혼용영양적으로 성장한 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 군주를 제외하고는, 광독립영양적 조건하에서 성장된 초기 대수증식기에서의 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 초미세 구조. 도 10A 야생형; 도 10B 옥시다아제-비함유 균주; 도 10C PSII-비함유/옥시다아제-비함유 균주; 및 도 10D N-고갈 후 야생형. 큰 백색 공간은 얇은 섹션의 제조 동안 세척 제거된 PHA로 인한 것이다. 막대 크기: 200nm.
도 11. 광혼용영양적 조건하에 성장한 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 균주로부터 분리되고 GC/MS에 의해 분석된 전세포 메탄올첨가분해 생성물 (도 11A). 두개의 주요 피크를 검출하였다. 피크 1 및 2의 GC/MS 핑거프린트가 각각 도 11B-C에 존재한다. 피크 1의 질량 개열 패턴은 PHB의 메탄올화된 생성물인 3-히드록시부티레이트 메틸 에스테르의 형태와 정합되며 (도 11B), 피크 2의 질량 패턴은 연장된 메탄올첨가분해 후 글루코오스 또는 글리코겐, 레불린산 메틸 에스테르의 가능한 분해 생성물의 형성을 암시한다.
도 12. ACC 착물을 코딩하는 시네코시스티스로부터의 증폭된 accA, accB, accC 및 accD 유전자를 나타내는 PCR 생성물.
도 13. 시네코시스티스 게놈의 psbA2 로커스로 삽입되기 위해 설계된 플랭킹 영역을 갖는 모든 acc 유전자를 함유하는 플라스미드 작제물. 옆의 겔은 다중 형질변화물이 목적 플라스미를 수반한다는 것을 보여준다.
도 14. 시네코시스티스의 VIPP-1 과다발현 변이체를 생성하는데 사용되는 작제물의 플라스미드 맵. VIPP-1 유전자의 이러한 복사체는 psbA3 프로모터 하에 삽입되었다.
상기 주지된 바와 같이, 이산화탄소로의 환경 오염으로 인한 문제가 발생하고 있다. 연간 70억 내지 80억 톤으로 추정되는 화석 연료 소비로 인해 이산화탄소가 전세계적으로 생성된다 (Marland et al. 2006). 또한, 통계적으로 세계의 화석 연료 공급원의 소비가 점점 증가하고 있다. 이산화탄소 오염량을 감소시키고 대체 에너지원을 사용하는 방법이 존재하지만, 이들 방법은 종종 비용이 많이 소모되고 비효율적이다.
본 출원인의 발명은 종래의 문제점들을 극복하였다. 예를 들어, 본 발명은 광독립영양 박테리아 및 이러한 박테리아를 이용하는 상응하는 방법을 기술하고 있으며, 상기 박테리아는 대상 유전자의 서열 또는 발현 수준이 변형되거/거나 결실되고/거나 이종 공급원으로부터 유입된 대상 유전자를 포함하도록 변형되었으며, 여기서 대상 유전자의 서열 또는 발현 수준의 변형, 또는 유입 또는 결실은 대상 유전자가 변화되도록 변형시키지 않은 광독립영양 박테리아에서의 목적 생성물의 양과 비교하여 목적 생성물 (예를 들어, 지질, 카로테노이드, 그 밖의 이소프레노이드 예컨대, 이소프렌 또는 토코페롤, 기타 이차 대사물, 탄수화물, 시아노피신, 또는 단백질)의 생성을 증가시킨다. 변형된 광독립영양 박테리아는 이산화탄소를 흡수하고 고정하는 유형일 수 있다. 특정 양태에서, 대상 유전자의 발현 또는 서열 변화 또는 대상 유전자의 유입은 또한 대상 유전자를 변화시키도록 변형되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 흡수량 및 고정량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 이들 양태 및 기타 양태는 추가의 상세한 설명을 위한 하기 섹션에서 설명된다.
A. 광독립영양 박테리아
광독립영양 박테리아는 에너지원으로서 광을 이용하여 음식을 합성할 수 있는 박테리아를 포함한다. 광독립영양 생물은 또한 탄소의 주요원으로서 이산화탄소를 이용할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 광독립영양 박테리아의 비제한적인 예로는 시아노박테리아, 녹색 유황 박테리아, 녹색 비유황 박테리아, 헬리오박테리아, 광합성 아시도박테리아, 홍색 유황 박테리아, 또는 홍색 비유황 박테리아를 포함한다. 특정 구체예에서, 광독립영양 박테리아는 시아노박테리아이다.
1. 시아노박테리아
일반적으로, 시아노박테리아는 전세계적으로 몇몇 서식지에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 이러한 유형의 박테리아는 바다, 민물, 맨바위 (bare rock), 및 토양에서 찾아볼 수 있다. 전형적으로, 시아노박테리아는 단세포의 섬유형 콜로니 형태를 포함한다. 일부 섬유형 콜로니는 식물성 세포 및 광합성 세포로 분화되는 능력을 나타낸다. 일부 예에서, 효소 니트로게나아제 (질소 고정에 사용됨)를 함유하는 두꺼운 벽의 이질세포는 고정된 질소가 저농도로 존재하는 경우 형성될 수 있다. 이질세포-형성 종은 질소 고정을 위해 분화되며, 질소 가스를 암모니아 (NH3), 아질산염 (NO2 -) 또는 질산염 (NO3 -)로 고정시킬 수 있으며, 이는 후속하여 단백질 및 핵산으로 전환될 수 있다. 시아노박테리아는 전형적으로 그람-네거티브인 두꺼운 세포 벽을 포함한다.
시아노박테리아 세포 구조, 구성, 기능 및 생화학에 대한 연구는 많은 연구의 주제가 되어 왔다. 1960년대 초부터 1980년대까지의 작업으로 인해 많은 시아노박테리아종의 일반적인 세포내 구성을 알 수 있었으며, 여러 세포 구조 예컨대, 광-채집 안테나, 피코빌리좀 (phycobilisome) (Gantt and Conti 1969; Edwards and Gantt 1971; Bryant et al. 1979), 폴리포스페이트 바디, 시아노피신 과립 (cyanophycin granules), 폴리히드록시알카노에이트 (PHA) 과립 (Jensen and Sicko 1971), 카르복시좀/폴리헤드랄 바디, 지질체, 틸라코이드 중심, DNA-함유 영역 (Asato and Ginoza 1973; Roberts and Koths 1976), 및 리보좀 (Ris and Singh 1961)를 확인하였다.
예를 들어, 시아노박테리아는 광합성에서 작용하는 내부 막의 고도로 조직화된 시스템을 포함한다. 시아노박테리아에서의 광합성은 일반적으로 전자 도너로서 물을 이용하며, 부산물로서 산소를 생성시킨다. 시아노박테리아는 이산화탄소를 흡수하고, 이를 환원하여 탄수화물, 지질 및 기타 탄소 함유 부산물을 형성한다. 대부분의 시아노박테리아에서, 광합성 기관은 내부막 시스템 (즉, 틸라코이드 막)에 봉입되어 있다.
천개가 넘은 다양한 시아노박테리아 종이 공지되어 있다. 예를 들어, 시아노박테리아는 하기 목 크로코칼레스 (Chroococcales), 노스토칼레스 (Nostocales), 오스실라토리알레스 (Oscillatoriales), 플레우로캅살레스 (Pleurocapsales), 프로클로로파이테스 (Prochlorophytes), 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales)가 있다. 시아노박테리아 속의 크로코칼레스 목의 비제한적인 예로는 아파노캅사 (Aphanocapsa), 아파노테세 (Aphanothece), 카마에시폰 (Chamaesiphon), 크로코커스 (Chroococcus), 크로코스패라 (Crocosphaera), 시아노박테리움 (Cyanobacterium), 시나오비움 (Cyanobium), 시아노테세 (Cyanothece), 다크틸로코콥시스 (Dactylococcopsis), 글로에오박터 (Gloeobacter), 글로에오캅사 (Gloeocapsa), 글로에오테세 (Gloeothece), 에유할로테세 (Euhalothece), 할로테세 (Halothece), 요하네스밥티스티아 (Johannesbaptistia), 메리스모페디아 (Merismopedia), 마이크로시스티스 (Microcystis), 라브도데르마 (Rhabdoderma), 시네코코커스 (Synechococcus), 및 시네코시스티스 (Synechocystis), 및 써모시네코코커스 (Thermosynechococcus)를 포함한다. 시아노박테리아 속의 노스토칼레스 목의 비제한적 예로는 콜레데스미움 (Coleodesmium), 프레미엘라 (Fremyella), 마이크로샤테 (Microchaete), 렉시아 (Rexia), 스피리레스티스 (Spirirestis), 톨리포트릭스 (Tolypothrix), 아나베나 (Anabaena), 아나베놉시스 (Anabaenopsis), 아파니조메논 (Aphanizomenon), 아울로시라 (Aulosira), 시아노스피라 (Cyanospira), 실린드로스페르몹시스 (Cylindrospermopsis), 실리드로스페르뭄 (Cylindrospermum), 노둘라리아 (Nodularia), 노스톡 (Nostoc), 리첼리아 (Richelia), 칼로트릭스 (Calothrix), 글로에오트리치아 (Gloeotrichia), 및 스시토네마 (Scytonema)를 포함한다. 시아노박테리아 속의 오스실라토리알레스 목의 비제한적 예로는 아르트로스피라 (Arthrospira), 제이틀레리네마 (Geitlerinema), 할로마이크로네마 (Halomicronema), 할로스피룰리나 (Halospirulina), 카타그나이네메 (Katagnymene), 렙토린그비아 (Leptolyngbya), 림노트릭스 (Limnothrix), 린그비아 (Lyngbya), 마이크로코레우스 (Microcoleus), 오스실라토리아 (Oscillatoria), 포르미디움 (Phormidium), 플라크토트리코이데스 (Planktothricoides), 플라크토트릭스 (Planktothrix), 플레크토네마 (Plectonema), 림노트릭스 (Limnothrix), 슈다나배나 (Pseudanabaena), 쉬조트릭스 (Schizothrix), 스피룰리나 (Spirulina), 심플로카 (Symploca), 트리코데스뮴 (Trichodesmium), 및 티코네마 (Tychonema)를 포함한다. 시아노박테리아 속의 플레우로캅살레스 목의 비제한적 예로는 크로오코시디옵시스 (Chroococcidiopsis), 데르모카르파 (Dermocarpa), 데르모카르펠라 (Dermocarpella), 믹소사르시나 (Myxosarcina), 플레우로캅사 (Pleurocapsa), 스타니에리아 (Stanieria), 및 제노코커스 (Xenococcus)를 포함한다. 시아노박테리아 속의 프로클로로파이테스 목의 비제한적 예로는 프로클로론 (Prochloron), 프로클로로코커스 (Prochlorococcus), 및 프로클로로트릭스 (Prochlorothrix)를 포함한다. 시아노박테리아 속의 스티고네마탈레스 목의 비제한적 예로는 캅소시라 (Capsosira), 클로로글로에옵시스 (Chlorogloeopsis), 피세렐라 (Fischerella), 하팔로시폰 (Hapalosiphon), 마스티고클라돕시스 (Mastigocladopsis), 마스티고클라두스 (Mastigocladus), 노스토콥시스 (Nostochopsis), 스티고네마 (Stigonema), 심피오네마 (Symphyonema), 심피오네몹시스 (Symphyonemopsis), 우메자키아 (Umezakia), 및 웨스티엘롭시스 (Westiellopsis)를 포함한다.
본 명세서에 걸쳐 확인되고 당업자에게 공지된 시아노박테리아 종은 본 발명에 유용한 것으로 고려된다. 단지 예시를 위해, 하기 섹션은 시아노박테리아의 두 특정 종의 상세한 설명을 제공한다: 시네코시스티스 sp. PCC 6803 및 써모시네코코커스 엘로가투스 sp. BP-1.
2. 시네코시스티스 sp. PCC 6803
시네코시스티스 sp. PCC 6803은 고도의 바람직한 분자 유전자적, 생리학적 및 형태학적 특징의 독특한 조합을 나타내는 단세포 유기체이다. 예를 들어, 본 종은 자연적으로 형질전환가능하며, 이중-상동 재조합에 의해 이종 DNA를 이의 게놈으로 혼입시키며, 많은 상이한 생리학적 조건 (예를 들어, 광독립/혼용/종속성)하에서도 성장하며, 비교적 작다 (~1.5㎛ 직경) (본원에 참조로 통합된 문헌 [Van de Meene et al. 2005] 참조). 이의 전체 게놈은 시퀀싱되었으며 (Kaneko et al. 1996), 다른 박테리아 그룹과의 상동성이 없는 높은 비율의 오픈 리딩 프레임이 발견되었다. 시네코시스티스 sp. PCC 6803은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 수탁 번호 ATCC 27184로부터 입수가능하다 (본원에 참조로 통합된 문헌 [Rippka et al, 1979] 참조).
3. 써모시네코코커스 엘로가투스 sp. BP-1
써모시네코코커스 엘로가투스 sp. BP-1은 더운 봄에 서식하고, 최적 성장 온도가 약 55℃인 단세포의 호열성 시아노박테리아이다 (본원에 참조로 통합된 문헌 [Nakamura et al. 2002] 참조). 본 박테리아의 전체 게놈은 시퀀싱되었다. 게놈은 2,593,857 염기쌍의 환형 크로모좀을 포함한다. 총 2,475개의 잠재적인 단백질-엔코딩 유전자, 한 세트의 rRNA 유전자, 42개 tRNA 종을 나타내는 42개 tRNA 유전자 및 소구조 RNA의 4개 유전자가 예측되었다.
B. 대상 유전자
본 발명의 바람직한 양태에서, 대상 유전자는, 대상 유전자의 서열 또는 발현 수준이 변화되거, 결실되거나 유입되는 경우, 대상 유전자와 관련하여 변형되지 않은 박테리아에서의 목적 생성물의 생산량과 비교하여, 박테리아에서 목적 생성물 (예를 들어, 지질, 그밖의 연료 예컨대, 수소 또는 알코올, 카로테노이드, 그 밖의 이소프레노이드 예컨대, 이소프렌 또는 토코페롤, 탄수화물, 시아노피신 또는 단백질)의 생성이 증가되는 유전자를 포함한다. 특정 양태에서, 대상 유전자가 이의 서열 또는 발현 수준이 변화되거나, 결실되거나 유입되는 경우, 대상 유전자와 관련하여 변형되지 않는 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 흡수량 및 고정량을 증가시킬 수 있다.
특정 양태에서, 대상 유전자는, 대상 유전자의 서열 또는 발현 수준이 변화되거, 결실되거나 유입되는 경우, 박테리아 세포에서 지질의 생성을 증가시킬 수 있는 유전자를 포함한다. 변화된 발현 수준, 결실 또는 유입은 박테리아 세포의 지질 함량을 증가시킬 수 있다. 이러한 유전자의 비제한적 예로는 소포 유도 플래스티드 단백질 1 (vesicle-inducing protein in plastids 1) (VIPP1) 유전자 (sllO617), 유사 pspA-형 유전자 slr1188, 틸라코이드 막 형성 및 조성에 중요한 yidC 및 oxaI과 유사한 slr1471 유전자, 아세틸-CoA 카르복실라아제 유전자 (sllO728, slrO435, sll0053, 및 sllO336), 지방산 생합성 유전자 fabD (slr2023), fabH (slr1511), fabF (sll1O69 및 slr1332), fabG (slrO886), fabZ (sll1605), 및 fabI (slr1051), 피브릴 또는 틸라코이드 막과 관련된 소수성 물질을 포함하는 단백질을 코딩하는 플라스토글로불린/피브릴린 유전자 (slr1024 및 sll1568), 1-아실글리세롤-3-포스페이트 아실 트랜스퍼라아제를 엔코딩하는 sll1848, 또는 포스포리피드-글리세롤 아실트랜스퍼라아제 유전자 예컨대, slr2060을 포함한다. 막의 지질 함량은 또한, 막중의 단백질을 인지하는 프로테아제 (ftsH 유전자 sll1463, slrO228, slr1390, 및 slr1604, clpB 유전자 slrO156 및 slr1641, 및 clpP 유전자 slrO542, sllO534, 및 slr0165 포함)의 과다발현에 의해 또는 지질 생성에 사용되는 고정된 탄소량을 증가시키기 위한 대사 조작에 의해 (예를 들어, PEP 카르복실라아제 유전자인 sll0920 및 시트레이트 합성효소 유전자인 sll0401의 하향 조절에 의해 및/또는 글리코겐 생합성에 관련된 slr1176, 폴리히드록시부티레이트 형성 및 대사와 관련된 slr1829/1830, 및 시아노피신 형성 및 대사와 관련된 slr2001/2002를 포함하는 저장 화합물의 합성에 관련된 유전자의 결실에 의해) 증가될 수 있다. 상기 내용은 시네코시스티스에 관한 것이지만, 그 밖의 시아노박테리아의 상동체가 존재하며, 이는 본 발명에 이용되는 것으로 간주된다.
또 다른 양태에서, 대상 유전자는 박테리아 세포에서 카로테노이드 또는 그 밖의 이소프레노이드의 변화된 수준을 나타내도록 변형될 수 있다. 이러한 변형은 박테리아 세포의 카로테노이드 또는 그밖의 이소프레노이드 함량을 증가시킬 수 있다. 카로테노이드의 비제한적 예로는 베타-카로텐, 제악산틴 (zeaxanthin), 믹스옥산토필 (myxoxanthophyll), 믹솔 (myxol), 에치네논 (echinenone), 및 이들의 생합성 중간체를 포함한다. 비제한적인 기타 이소프레노이드의 예로는 이소프렌, 토코페롤 및 이들의 생합성 중산체를 포함한다. 이러한 유전자의 비제한적 예로는 카로테노이드 전구체인 C5 화합물 IPP 및 DMAPP를 발현하거나 이의 생성을 조절하는 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slrO348); 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라아제를 발현하거나 이의 생성을 조절하는 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 sll1556); crtP 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slr1254); crtQ 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slr0940); crtD 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 slr1293); crtL diox 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 sll0254); 및 crtR 유전자 (예를 들어, 시네코시스티스 sp. PCC 6803로부터의 sill468)를 포함한다. 상기 내용은 시네코시스티스에 관한 것이지만, 그밖의 시아노박테리아의 상동체가 존재하며, 이는 본 발명에 이용되는 것으로 간주된다. 또한, 기타 유기체 예컨대, 식물로부터의 유전자 (예를 들어, 이소프렌 합성효소)가 본 발명에 사용되는 것으로서 간주된다.
추가의 양태에서, 대상 유전자의 서열 또는 발현을 변화시키고/거나 유전자의 결실 또는 유입에 의해 박테리아 세포에서 탄수화물의 생성 및 수준을 매우 변화시킬 수 있다. 유전자의 변화된 발현 및/또는 결실 또는 유입은 박테리아 세포의 탄수화물 함량을 변화시킬 수 있다. 이러한 유전자로는 과다발현되는 경우 박테리아 세포의 탄수화물 (예를 들어, 모노사카라이드 및 모노사카라이드 포스페이트 (예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 자일룰로스-5-포스페이트, 리불로오스-5-포스페이트, 리보오스-5-포스페이트, 프룩토오스-6-포스페이트, 글루코오스-6-포스페이트, 세도헵툴로오스-7-포스페이트, 에리트로스-4-포스페이트, 세도헵툴로오스-비스포스페이트, 및 프룩토오스-비스포스페이트), 디사카라이드 (예를 들어, 수크로오스), 올리고사카라이드 (예를 들어, 프룩토-올리고사카라이드 및 만난-올리고사카라이드), 및 폴리사카라이드 (예를 들어, 글리코겐 및 이의 유도체))의 생성 또는 탄수화물 함량을 변화시킬 수 있는 유전자를 포함한다. 이러한 유전자의 비제한적 예로는 글리코겐 합성효소를 발현하는 유전자 및 글리코겐 분지 효소를 발현하는 유전자를 포함한다. 당업자는 글리코겐 합성효소 및 글리코겐 분지 효소 유전자가, 탄수화물이 글리코겐으로 저장되지 않고, 폴리락트산 (PLA), 폴리-3-히드록시부티레이트 (PHB), 폴리히드록시알카노에이트 (PHA), 또는 지질로 전환되는 방식으로 변이 (예를 들어, 삽입 또는 결실)될 수 있음을 인지하고 있을 것이다.
본 출원에 기술된 유전자 및 엔코딩된 단백질은 당업자에게 자명한 바와 같이, 진뱅크 (GenBank) 및 시아노베이스 데이타베이스 (CyanoBase databases)에서 입수가능하며, 이는 www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez 및 http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/websites를 통해서 접근가능하다. 명세서에 걸쳐, 유기체 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 다양한 유전자 (균주: PCC 6803)가 기술되어 있다 (예를 들어, sllO617). 이러한 용어 예를 들어, "sllO617"는 각 대표 유전자에 대한 대안적 일명 또는 로커스 태그를 나타내며, 이는 상기 기술된 데이타베이스를 통해 완전 유전자 서열을 획득하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 용어 "sll0617"은 용어 "시네코시스티스 sp. PCC 6803"과 함께 상기 기술된 NCBI 웹사이트를 통해 접근가능한 진뱅크 데이타베이스에서 조회될 수 있어 유전자 정보 및 전체 유전자 서열에 대한 링크를 획득할 수 있다. 전체적으로 주석달린 오픈 리딩 프레임을 포함하는 시네코시스티스 게놈은 상기 기술된 시아노베이스 웹사이트를 통해 입수가능하다. 이러한 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
C. 대상 유전자의 발현 변화
본 발명의 구체예는 본 발명의 광독립영양 박테리아내의 특정 대상 유전자에 대한 발현 수준을 변화시키는 방법 및 조성물을 포함한다. 대상 유전자는 이들의 서열 또는 발현 수준이 변화되고/거나 결실되고/거나 이종 공급원으로부터 유입될 수 있다. 이는 상응하는 목적 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질 또는 효소)의 조절된 생성 및/또는 이러한 유전자 생성물과 관련된 경로의 조절 (예를 들어, 대상 유전자를 증가시키거나 과다발현시켜 유전자 생성물과 관련된 대사 경로의 상응하는 유전자 생성물 및/또는 성분의 양을 증가시킴)을 유도할 수 있다. 본 발명의 구체예는 하나 이상의 유전자로 유입되는 다중 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 다중 변형은 목적 생성물의 생성을 종합적으로 증가시킨다.
1. 재조합 발현 시스템
특정 구체예에서, 유전자 생성물과 관련된 대사 경로의 유전자 생성물 및/또는 성분은 재조합 발현 시스템 (예를 들어, 본 발명의 재조합 광독립영양 박테리아)을 이용하여 합성된다. 일반적으로, 이는 적합한 조절 영역의 조정하에 목적 유전자 생성물을 엔코딩하는 DNA (예를 들어, 지질, 탄수화물, 카로테노이드 또는 시아노피신의 형성 유도)를 위치시키고, 본 발명의 광독립영양 박테리아 (즉, 숙주)에서 단백질을 발현시키고, 필요에 따라, 유전자 생성물과관련된 경로의 발현된 유전자 생성물 또는 생성물들을 분리하는 것을 포함한다. 이는 유전자에 의해 엔코딩된 단백질이 증가된 양으로 발현되게 한다. 이는 숙주에서 유전자의 복사체의 수를 증가시킴으로써, 숙주에서 프로모터 영역의 결합 강도를 증가시킴으로써 또는 프로모터 대체에 의해 수행될 수 있다. 유전자 변형을 위한 기타 메카니즘은 감소된 발현, 결실, 상이한 유기체로부터의 유전자의 삽입 또는 서열 또는 조절 단백질에서의 변화를 포함한다.
전형적으로, 유전자 생성물에 대한 DNA 서열은 프로모터를 함유하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)로 클로닝되거나 서브클로닝될 것이며, 그 후, 박테리아내로 형질전환되고, 적합한 DNA 영역과 인테그레이션되어 박테리아가 유전자 생성물을 발현하게 할 것이다. 조절 서열은 또한 본 발명의 박테리아의 게놈으로 삽입될 수 있다 (예를 들어, 대상 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자에 작동적으로 결합된 이종성 조절 서열). 대안적으로, 내생 프로모터 또는 조절 메카니즘이 숙주를 천연 조절 프로세스를 자극함으로써 단백질 발현을 증가시키는 특정 조건 또는 특정 물질에 노출시킴으로써 자극될 수 있다.
시아노박테리아에 대한 유전자/발현 삽입을 위해 주로 사용되는 방법은 작제물을 이중 상동 재조합에 의해 게놈으로 인테그레이션하는 것을 포함한다 (본원에 참조로서 통합된 문헌 [Li et al. (1993); Williams (1998); Grigorieva et al. (1982)] 참조). 특정 구체예에서, 이중 상동 재조합은 시아노박테리아 게놈과 동일한 두개 영역의 서열을 갖는 작제물을 이용하여 유전자 중단 또는 결실을 유도하는데 이용될 수 있다.
a. 핵산
본 명세서에 제공된 정보를 이용하여, 본 발명의 광독립영양 박테리아에 의해 과다발현되는 핵산은 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단백질-엔코딩 핵산(들)은 클로닝되거나, 실헌관내 방법 예컨대, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 등에 의해 클로닝되거나 증폭될 수 있다. 다양한 클로닝 및 실험관내 증폭 방법이 당업자에게 널리 공지도어 있다. 당업자가 실험관내 증폭 방법을 이용하는데 충분한 기술적 예들은 문헌 [Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as U.S. Patent 4,683,202; Innis (1990); The Journal of NIH Research (1991); Kwoh et al. (1989) ; Guatelli et al, (1990); Lomell et al, (1989); Landegren et al, (1988); Van Brunt (1990); Wu and Wallace, (1989); and Barringer et al (1990)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 목적 생성물을 엔코딩하는 핵산 또한, 나랑 (Narang) (1979) 등의 포스포트리에스테르 방법; 브라운 (Brown) (1979) 등의 포스포디에스테르 방법; 뷰케이지 (Beaucage) (1981) 등의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 U.S. 특허 4,458,066의 고형 지지체 방법과 같은 방법에 의한 직접 화학 합성 또는 적합한 서열의 클로닝 및 제한에 의해 제조될 수 있다.
핵산은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)과 같은 DNA 증폭 방법을 이용하여 클로닝될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 하나의 제한 부위를 함유하는 센스 프라이머 및 또 다른 제한 부위를 함유하는 안티센스 프라이머를 이용하여 핵산 서열 또는 후속서열 (subsequence)은 PCR 증폭된다. 이는 목적 서열 또는 후속서열을 엔코딩하고, 말단 제한 부위를 갖는 핵산을 생성시킬 것이다. 그 후, 이러한 핵산은 제 2 분자를 엔코딩하는 핵산을 함유하고, 적합한 상응하는 제한 부위를 갖는 벡터로 용이하게 결찰될 수 있다. 적합한 PCR 프라이머는 서열 정보를 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 대표적인 프라이머가 제공된다. 적합한 제한 부위는 또한 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 목적 단백질 또는 단백질 후속 서열을 엔코딩하는 핵산에 첨가될 수 있다. 목적 서열 또는 후속 서열을 함유하는 플라스미드가 적합한 제한 엔도누클레아제로 절단된 후, 표준 방법에 따라 제 2 분자를 엔코딩하는 벡터로 결찰된다.
화학 합성은 일반적으로 단일 가닥 핵산을 생성시킨다. 이는 상보적 서열과의 하이브리디제이션에 의해 주형으로서 단일 가닥을 이용하여 DNA 중합효소에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학 합성이 제한적이지 않으며, 더욱 긴 서열이 짧은 서열들의 결찰에 의해 수득될 수 있음을 인지하고 있을 것이다. 대안적으로, 서열은 클로닝될 수 있으며, 적합한 제한 효소를 이용하여 절단된 적합한 후속서열일 수 있다. 그 후, 단편들이 결찰되어 목적 DNA 서열을 생성시킬 수 있다.
b. 벡터
용어 "벡터"는 본 발명의 광독립영야 박테리아에 유입시키기 위한, 핵산 서열이 삽입될 수 있는 캐리어 핵산 분자로서, 이는 게놈에 인테그레이션되고/거나 복제되고/거나 과다발현될 수 있다. 핵산 서열은 "외생성"일 수 있으며, 이는 벡터가 유입되는 박테리아에 이종이거나, 서열이 박테리아의 서열과는 상동성이나, 서열이 통상적으로 발현되지 않는 박테리아 세포 핵산내에 위치한다는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파아지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 크로모좀 (예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기법을 통해 벡터를 잘 작제할 수 있을 것이다 (예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Maniatis et al, 1989 and Ausubel et al, 1994] 참조).
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 경우에, RNA 분자는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 또 다른 경우에, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보좀의 생성시 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 박테리아 세포에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열이다. 전사 및 번역을 좌우하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 수행하며, 하기 기술된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 발현될 목적 생성물을 엔코딩하는 핵산은 각 박테리아 세포에 대한 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 이는 조정 서열 예컨대, 본 명세서에 걸쳐 기술된 조정 서열, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종료 시그날을 포함할 수 있다.
i. 조정 서열
본 발명의 재조합 광독립영양 박테리아의 설계는 트랜스펙션될 박테리아의 선택 및/또는 발현된 특정 단백질(들)과 같은 인자에 의존적일 수 있다. 적합한 조정 엘리먼트를 사용하여 본 발명의 다양한 숙주 세포에서의 폴리펩티드(들)의 변화된 수준의 발현을 유도할 수 있다. 조정 서열은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel (1990); Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif; Sambrook et al. (1989)] 참조).
예를 들어, 목적 생성물은 높은 수준의 연속 발현을 위해 항시성 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 유도성 및/또는 조직-특이적 프로모터가 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 이러한 프로모터의 비제한 예로는 항시성 프로모터 예컨대, psbDII, psbA3, 및 psbA2 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 리가드 (Lagarde) (2000) 등은 카로테노이드 생합성에 관련된 유전자를 과다발현하기 위해 시네코시스티스 sp 균주 PCC 6803에서 psbA2 프로모터를 사용하는 것에 대한 상세한 설명을 제공하고 있으며, 히 (He) (1999) 등의 문헌에는 psbA3 프로모터를 사용하는 것에 대한 상세한 설명이 기술되어 있다. 이들 참고 문헌에서의 정보는 참조로서 통하보디었다. 유도성 프로모터의 비제한적 예로는 nirA, isiAB, petE, nrsBACD, nrsAB, 및 ndhF3 프로모터를 포함한다 (문헌 [Aichi et al. (2001); Vinnemeier et al. (1998); Zhang et al (1994); Lopez-Maury et al. (2002); McGinn et al. (2003)] 참조, 이들 모두는 참조로서 통합됨).
"프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 유전자 엘리먼트를 함유할 수 있으며, 여기에 조정 단백질 및 분자 예컨대, RNA 중합효소 및 그밖의 전사 인자가 결합되어 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있다. 문구 "작동적으로 위치하는", "작동적으로 연결된", "조절하" 및 "전사 조절하에서"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 핵산 서열과 관련하여 적당한 작용 부위 및/또는 방향으로 위치함을 의미한다.
프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 출발 부위를 정위시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 추가적인 프로모터 엘리먼트는 전사 개시 빈도를 조정한다. 전형적으로, 이는 출발 부위로부터 100bp 이하의 업스트림 영역에 위치하나, 많은 프로모터가 또한, 출발 부위의 다운스트림의 작용성 엘리먼트를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 코딩 서열을 프로모터의 "조절하에" 있기 위해, 전사 해독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단이 선택된 프로모터의 "다운스트림" (즉, 3')에 위치한다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고, 엔코딩된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 엘리먼트 사이의 공간은 매우 다양할 수 있어서, 프로모터 기능은 엘리먼트들이 서로에 대해 역행되거나 이동하는 경우에도 보존된다. 프로모터에 따라, 개별 엘리먼트는 공동으로 또는 개별적으로 작용하여 전사를 활성화시키는 것임이 자명하다. 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용될 수 있거나 없으며, 이는 핵산 서열의 전사 활성화와 관련된 시스-작용 조정 서열을 나타낸다.
프로모터는 핵산 서열과 자연적으로 관련되어 있을 수 있으며, 이는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 분리함으로써 획득될 수 있다. 이러한 프로모터는 "내생성"으로서 불릴 수 있다. 유사하게는, 인핸서는 핵산 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다. 대안적으로, 천연 환경하에서 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 특정 이점들이 달성될 수 있다. 재조합 또는 이종 인핸서, 오퍼레이터 또는 기타 조정 서열은 또한 이의 자연 환경에서의 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 인핸서, 오퍼레이터 또는 기타 조정 서열을 나타낸다. 이러한 프로모터, 인핸서, 오퍼레이트 또는 그밖의 조정 서열은 다른 유전자의 프로모터, 인핸서, 오퍼레이트 또는 그밖의 조정 서열, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵세포 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 또는 그 밖의 조정 서열, 및 "자연 발생적"이지 않은 즉, 발현을 변화시키는 상이한 전사 조정 영역의 상이한 엘리먼트 및/또는 변이를 함유하는 프로모터, 인핸서, 오퍼레이트 또는 그 밖의 조정 서열을 포함할 수 있다.
천연적으로, 본 발명의 광독립영양 박테리아에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 또는 기타 조정 서열을 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서, 오퍼레이트 또는 그 밖의 조정 서열의 용도를 알고 있을 것이다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. 2001] 참조). 사용된 프로모터는 항시성, 조건-특이적, 유도성 및/또는 유입된 DNA 세그먼트의 변화된 발현을 유도하기에 적합한 조건하에 유용할 수 있으며, 이는 목적 생성물의 대규모 생성에 유리하다. 프로모터는 이종성 또는 내생성일 수 있다.
ii. 개시 시그널
코딩 서열을 효과적으로 번역하기 위해서는 특정 개시 시그널이 요구될 수 있다. 이들 시그널은 ATG 또는 GTG 개시 코돈 및 인접한 서열 예컨대, 리보좀-결합 부위를 포함한다. ATG 또는 GTG 개시 코돈 및 인접한 서열 예컨대, 리보좀-결합 부위를 포함하는 외생성 번역 조절 시그널이 필요할 수 있다. 당업자는 용이하게 이를 결정하고, 필요 시그널을 제공할 수 잇을 것이다. 개시 코돈이 유전자의 전체 코딩 영역의 번역을 보장하기 위해 목적 코딩 서열의 해독 프레임과 "인-프레임"에 위치해야 함은 널리 공지되어 있다. 외생성 번역 조절 시그널 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적합한 전사 인핸서 엘리먼트의 유입에 의해 향상될 수 있다.
iii. 다중 클로닝 부위
벡터는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있으며, 이는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역이며, 이는 벡터를 분해하는 표준 재조합 기법과 함께 이용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Carbonelli et al, 1999, Levenson et al, 1998, and Cocea, 1997] 참조). "제한 효소 분해"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 작용하는 효소로의 핵산 분자의 촉매적 절단에 관한 것이다. 이러한 많은 제한 효소는 시중에서 입수가능하다. 이러한 효소의 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 빈번하게는, 벡터는 선형이거나, 외생성 서열을 벡터로 결찰시킬 수 있는 MCS내에서 컷팅하는 제한 효소를 이용하여 단편화된다. "결찰"은 두개의 핵산 단편 사이의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 나타내며, 이는 서로에 대해 인접할 수 있거나 없다. 제한 효소 및 결찰 반응을 포함하는 기법은 재조합 기법의 당업자에게 널리 공지되어 있다.
iv. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵세포 RNA 분자는 RNA 스플라이싱 처리되어 일차 전사체로부터 인트론을 제거할 것이다. 진핵세포 서열을 함유하는 벡터는 일반적으로 단백질 발현을 위한 전사체의 cDNA (mRNA의 복사체)를 함유할 것이다 (예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Chandler et al, 1997] 참조).
v. 종료 시그널
본 발명의 벡터 또는 작제물은 하나 이상의 종료 시그널을 포함할 수 있다. "종료 시그널" 또는 "터미네이터"는 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사의 특정 종료에 관련된 DNA 서열로 이루어진다. 이와 같이, 특정 구체예에서, RNA 전사의 생성을 종료하는 종료 시그널이 고려된다. 터미네이터는 바람직한 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 것으로 고려되는 터미네이터는 본원에 기술된 또는 당업자에게 공지된 전사의 임의의 공지된 터미네이터를 포함하며, 비제한적으로 예를 들어, rho-의존적 및 rho-독립적 터미네이터와 같은 유전자의 종료 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 종료 시그널은 에컨대, 서열 절두로 인해 전사가능한 또는 번역사능한 서열이 결여일 수 있다.
vi. 복제의 오리진
본 발명의 박테리아 세포에서 벡터를 증식하기 위해서, 벡터는 복제 부위의 하나 이상의 오리진을 함유할 수 있으며 (종종 "ori"로서 불림), 이는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다.
vii. 선택 및 스크리닝 마커
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 박테리아 세포는 발현 벡터에서 마커를 함유함으로써 실험관내 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 확인가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 확인시켜 줄 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재하에 이의 선택을 가능하게 하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 이의 존재로 인해 이의 선택을 방지하는 것이다. 양성 선택 마커의 예로는 약물 내성 마커가 있다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 유입이 형질전환체의 클로닝 및 확인을 보조하며, 예를 들어, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 젠티마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 제오신 및 카나마이신에 대한 내성을 유여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 영양요구체가 결여된 유전자에 의해 기능적으로 보완되는 보완 방법이 또한 이용된다. 수행 조건에 기초하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색 형광 분석을 기초로 하는 GFP 및 YFP와 같은 스트리닝 마커를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려될 수 있다. 또한, 루시퍼라아제를 이용하는 마커가 리포터 유전자로서 이용될 수 있다. 당업자는 또한, 가능하게는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 어떻게 이용할지에 대해 알 고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 그렇게 중요하지 않다. 또한, 선택 및 스크리닝 마커의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
viii. 벡터의 비제한적 예
특정 구체예에서, 플라스미드 벡터는 본 발명의 광독립영양 박테리아 세포의 형질전환에 사용하기 위해 고려된다. 일반적으로, 자살 플라스미드 벡터가 사용되며, 여기서 대상 유전자 또는 작제물을 운반하는 목적하는 플라스미드 서열은 광독립영양 박테리아 숙주에서 복제되지 않는 것이며며, 이중-상동 재조합에 의해 숙주 게놈으로 인테그레이션된다. 플라스미드 벡터는 E.coli에서 복제된다. 벡터는 보통 E.coli에서 인지된 복제 부위를 수반하며, E.coli 및 광독립영양 박테리아 세포 둘 모두의 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 가능하게 하는 마커 서열을 수반한다.
또한, 숙주 미생물과 양립되는 리플리콘 및 조절 서열을 함유하는 파아지 벡터가 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 파아지 람다 GEMTM-11이 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있는 재조합 파아지 벡터를 제조하는데 이용될 수 있다.
추가의 유용한 플라스미드 벡터는 단백질 과다발현에 적합한 pET 벡터 및 후속 정제 및 분리 또는 절단을 위한 His 태그 및 Strep 태그를 포함하는 친화도 태그와의 번역 융합물을 포함하는 벡터를 포함한다. 그밖의 적합한 융합 단백질은 β-갈락토시다아제, 유비퀴틴 등과의 융합 단백질이 있다.
c. 핵산의 광독립영양 박테리아로의 유입
시네코시스티스 sp. PCC 6803이 자연적으로 형질전환가능하며, 유용한 DNA 흡수 및 게놈으로의 인테그레이션을 위한 처리가 필요하지 않은 경우, 본 발명의 광독립영양 박테리아의 형질전환을 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 실질적으로, 핵산 (예를 들어, DNA)이 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같이 이러한 박테리아에 유입될 수 있는 임의의 방법을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 비제한적으로, 연속 형질전환에 의한 DNA의 직접 전달 또는 표준 형질전환 방법 (Sambrook et al. 2001); 생체외 트랜스펙션 (Wilson et al, 1989, Nabel et al, 1989), 미세주입 (Harland and Weintraub, 1985; U.S. 특허 5,789,215; 본원에 참조로서 통합됨)을 포함하는 주입 (U.S. 특허 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 및 5,580,859, 본원에 참조로서 통합됨); 전기영동 (본원에 참고로서 통합된 U.S. 특허 5,384,253; Tur-Kaspa et al, 1986; Potter et al, 1984); 칼슘 인산염 침전 (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe d al, 1990); DEAE-덱스트란 사용 후 폴리에틸렌 글리콜 처리 (Gopal, 1985); 직접 음파 로딩 (Fechheimer et al, 1987); 리포좀 매개된 트랜스펙션 (Nicolau and Sene, 1982; Fraley er al, 1979; Nicolau et al, 1987; Wong et al, 1980; Kaneda et al, 1989; Kato et al, 1991) 및 수용체 매개된 트랜스펙션 (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); 미세입자투사법 (microprojectile bombardment) (PCT 출원 WO 94/09699 및 95/06128; U.S. 특허 5,610,042; 5,322,783 5,563,055, 5,550,318, 5,538,877 및 5,538,880, 이들 각각은 본원에 참조로 통합됨) 및 이러한 방법의 조합에 의한 DNA의 직접 전달을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 기법의 적용을 통해, 본 발명의 광독립영양 박테리아는 안정하게 형질전환될 수 있다.
2. 돌연변이법
돌연변이법은 유전자 발현의 조사 및 조작을 위한 강력한 도구이다. 이는 또한, 유전자의 피드백 조정 완화 및/또는 경쟁 경로의 제거 또는 하향 조절 등에 이용될 수 있다. 사용되는 경우, 돌연변이 유발은 다양한 표준의 돌연변이 유발 과정에 의해 달성될 수 있다. 변이는 유기체의 특성 또는 구조에서 변화가 발생하는 과정이다. 변이는 또한, 단일 유전자, 유전자 블록 또는 전체 크로모좀의 누클레오티드 서열의 변화를 포함한다. 단일 유전자의 변화는 DNA 서열내의 단일 누클레오티드 염기의 제거, 첨가 또는 치환을 포함하는 점 돌연변이의 결과일 수 있거나, 이들은 많은 누클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 변화의 결과일 수 있다.
변이는 특정 표적화 방법을 통한 부위 특이적일 수 있다. 변이는 또한 게놈내에서 전위성 유전자 엘리먼트 (트랜스포존)의 이동 또는 DNA 복제의 완전성 (fidelity)에서의 에러와 같은 사건의 결과로서 자연적으로 발생할 수 있다. 이들은 또한 화학 또는 물리적 돌연변이원에 노출된 후 유도될 수 있다. 이러한 변이 유도제로는 이온 방사성, 자외선 및 다양한 화학물질 예컨대, 알킬화제 및 폴리시클릭 방향족 히드로카본을 포함하며, 이들 모두는 핵산과 직접적으로 또는 간접적으로 (일반적으로, 일부 대사 생형질전환 후) 상호작용할 수 있다. 이러한 환경적 요인에 의해 유도된 DNA 병변은 침범된 DNA가 복제되거나 복구되는 경우 염기 서열의 변화를 유도하여 변이를 생성시킬 수 있다.
a. 부위-특이적 돌연변이법
구조 유도된 부위 특이적 돌연변이법은 유전자 발현의 조사 및 조작을 위한 강력한 도구이다. 이들 기법은 하나 이상의 누클레오티드 서열 변화를 선택된 DNA에 유입함으로써 서열 변이체의 제조 및 시험을 위해 제공된다.
부위 특이적 돌연변이법은 목적하는 변이의 DNA 서열 및 충분한 수의 인접한 비변형된 누클레오티드를 엔코딩하는 특정 올리고누클레오티드 서열을 이용한다. 이러한 방식으로, 프라이머 서열이 가로지르는 결실 연합부의 양 측에서 안정한 듀플렉스를 형성하기에 충분한 크기 및 복잡성을 갖도록 제공된다. 약 17개 내지 25개 누클레오티드의 프라이머는 변형되는 서열의 연합부의 양 측에서 약 5 내지 10개 잔기를 갖는 것이 바람직하다.
이들 기법은 전형적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 형태 둘 모두에 존재하는 박테리오파아지 벡터를 이용한다. 부위 특이적 돌연변이법에 유용한 벡터는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지 벡터는 시중에서 입수가능하며, 이들의 용도는 일반적으로 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이중 가닥 플라스미드는 또한 부위 특이적 돌연변이법에 일정하게 사용되며, 이는 파아지로부터의 대상 유전자의 플라스미드로의 이동 단계를 제거시킨다.
일반적으로, 먼저 단일 가닥 벡터를 수득하거나, 이중 가닥 벡터의 두 가닥을 용융시키고, 이들은 이의 서열내에 목적하는 단백질 또는 유전자 엘리먼트를 엔코딩하는 DNA 서열을 포함하고 있다. 합성적으로 제조된 목적하는 변이된 서열을 갖는 올리고누클레오티드 프라이머는 단일 가닥 DNA 제조물과 어닐링되며, 하이브리디제이션 조건 선택시 부정합 정도를 고려해야 한다. 하이브리디제이션 생성물을 변이 함유 가닥의 합성을 완료하기 위해 DNA 중합 효소 예컨대, E.coli 중합효소 I (Klenow 단편)로 처리한다. 이렇게 해서, 헤테로듀클렉스가 형성되며, 여기서 하나의 가닥은 원래의 비변이된 서열을 엔코딩하며, 두번째 가닥은 목적하는 변이를 갖는다. 이러한 헤테로듀플렉스 벡터는 본 발명의 광독립영양 박테리아 세포를 형질전환시키는데 이용된다. 변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론이 선택될 수 있다.
주어진 단백질 잔기의 기능적 의의 및 정보에 대한 포괄적인 정보는 포화 돌연변이유발에 의해 가장 우수하게 달성될 수 있으며, 여기서 모두 19개 아미노산 치환체가 시험된다. 이러한 방법의 단점은 다중잔기 포화 돌여변이 (복합적 돌연변이유발)의 논리가 위협된다는 점이다 (Warren et al, 1996, 1996; Zeng et al, 1996; Burton and Barbas, 1994; Yelton et al, 1995; 1995; Hilton et al, 1996). 수백개 및 가능하게는 수천개의 부위 특이적 변이체가 연구되어야 한다. 그러나, 특히 목적하는 특성의 엄격한 기능 선택법이 이용가능한 경우, 개선된 기법은 더욱 간단하게 변이체를 생성하고 신속하게 스크리닝하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, "워크-쓰로우 (walk-through)" 돌연변이유발에 있어서는 U.S. 특허 5,798,208 및 5,830,650 참조.
부위 특이적 돌연변이법의 다른 방법은 U.S. 특허 5,220,007; 5,284,760; 5,354,670; 5,366,878; 5,389,514; 5,635,377; 및 5,789,166에 기술되어 있다.
b. 무작위 돌연변이법
i. 삽입 돌연변이법
삽입 돌연변이법은 공지된 DNA 단편의 삽입을 통한 유전자의 불활성화에 기초한다. 이는 일부 유형의 DNA 단편의 삽입을 포함하기 때문에, 생성된 변이체는 일반적으로 기능을 획득하기 보다는 기능을 상실한다. 그러나, 기능 획득형 돌연변이를 생성시키는 삽입의 수개의 예가 있다 (Oppenheimer et al. 1991). 삽입 돌연변이법은 박테리아 및 드로소필라 (Drosophila)에서 매우 성공적이었으며 (Cooley et al, 1988), 옥수수 (Schmidt et al, 1987); 아라비돕시스 (Arabidopsis); (Marks et al, 1991; Koncz et al, 1990); 및 안트르히눔 (Antirrhinum) (Sommer et al, 1990)과 같은 식물에서 강력한 도구가 되었다. 유전자 넉아웃은 유전자적으로 조작된 박테리아의 생성을 위해 제조될 수 있다. "넉 아웃" 유전자는 엔코딩된 유전자 생성물의 생성의 저하 또는 배제를 포함하도록 광범위하게 작제된다. 따라서, 유전자 넉아웃은 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이, 삽입 돌연변이 유발, 프레임시프트 돌연변이, 또는 유전자의 발현을 조절하는 유전자 또는 조정 유전자의 전체 또는 일부의 결실에 의해 이루어질 수 있다.
전위 유전자 엘리먼트는 세포 게놈내의 한 위치에서 다른 위치로 이동 (전위)할 수 있는 DNA 서열이다. 인지된 첫번째 전위 엘리먼트는 옥수수 (Zea mays)의 활성화제/분해 엘리먼트이다. 그 후, 이들은 원핵세포 및 진핵세포의 광범위한 유기체에서 확인되었다.
게놈에서의 전위성 엘리먼트는 표적 부위 이중복물로 불리며, 전위 동안 이중 복제되는 DNA 단서열의 동방향 반복부에 의해 플랭킹됨을 특징으로 한다. 실질적으로, 모든 전위성 엘리먼트는 이들의 유형 및 전위 메카니즘에 상관없이 이들의 삽입 부위에서 이러한 이중 복제물을 만든다. 일부 경우에는 이중 복제되는 수가 일정하며, 다른 경우에는 각각의 전위에 따라 다양할 수 있다. 대부분의 전위성 엘리먼트는 이들의 말단에 역방향 반복부를 갖는다. 이들 말단의 역방향 반복부는 소수개 내지 수백개 길이의 염기일 수 있으며, 많은 경우에, 이들은 전위에 필수적인 것으로 공지되어 있다.
원핵세포 전위성 엘리먼트는 E.coli 및 그람-네거티브 박테리아에서 대부분 연구되었으며, 또한 그람-파지티브 박테리아에도 존재한다. 이들은 일반적으로 약 2kbp 길이 미만이면 소위 삽입 서열이며, 또는 이보다 더 길면, 트랜스포존이다. 전위에 의해 복제되는 mu 및 D108과 같은 박테리아파아지는 제 3 유형의 전위성 엘리먼트로 이루어진다. 각 유형의 엘리먼트들은 이들의 자체 전위를 위해 요구되는 하나 이상의 폴리펩티드 즉, 트랜스포아제를 엔코딩한다. 트랜스포존은 종종 전위와 관련되지 않은 기능을 코딩하는 유전자 예를 들어, 항생제 내성 유전자를 추가로 포함한다.
트랜스포존은 이들 두조에 따라 두 부류로 나눠질 수 있다. 첫째로, 화합물 또는 조성 트랜스포존은 각 말단에서 일반적으로 역방향의 삽입 유전자 엘리먼트의 복사체를 갖는다. 이러한 트랜스포존은 이들의 말단 IS 엘리먼트중 하나에 의해 엔코딩되는 트랜스포아제를 필요로 한다. 두번째 부류의 트랜스포존은 약 30개 염기쌍의 말단 반복부를 가지며, IS 엘리먼트로부터의 서열은 함유하지 않는다.
전위는 일반적으로 보존적 또는 복제적일 수 있으며, 일부 경우에는 이 둘 모두일 수 있다. 복제적 전위에서, 전위 엘리먼트의 하나의 복사체는 도너 부위에 잔류되며, 또 다른 하나는 표적 부위에 삽입된다. 보존적 전위에서, 전위 엘리먼트는 한 부위로부터 절제되어 또 다른 부위로 삽입된다.
RNA 중간체를 통해 전위하는 엘리먼트는 종종 "레트로트래스포존"으로 불리며, 이들의 대부분의 특징은, 이들이 역전사효소 활성을 갖는 것으로 여겨지는 폴리펩티드를 엔코딩한다는 점이다. 두가지 유형의 레트로트랜스포존이 있다. 일부는 이들이 각 말단에서 긴 동방향 반복 서열인 긴 말단 반복부 (LTR)을 갖는다는 점에서 레트로바이러스의 인테그레이팅된 프로바이러스 DNA와 유사하다. 이러한 레트로트랜스포존과 프로바이러스 사이의 유사점은 이들의 코딩 능력의 확장이다. 이들은 레트로바이러스의 gag 및 pol 유전자와 관련된 서열을 함유하며, 이는 이들이 레트로바이러스 수명 주기와 관련된 메카니즘에 의해 전위됨을 시사한다. 두번째 유형의 레트로트랜스포존은 말단 반복부를 갖지 않는다. 이들 또한, gag- 및 pol-유사 폴리펩티드를 코딩하며, RNA 중간체의 역전사에 의해 그러나, 레트로바이러스 또는 레트로바이러스-유사 엘리먼트와는 상이한 메카니즘에 의해 전위된다. 역전사에 의한 전위는 복제 과정이며, 도너 부위로부터 엘러민트를 절제하지 않아도 된다.
전위성 엘리먼트는 자연 돌연변이의 중요한 소스이며, 유전자 및 게놈이 전개되는 방식에 영향을 끼친다. 이들은 유전자내에 삽입됨으로써 유전자를 불활성화시킬 수 있으며, 이들의 트랜스포아제의 활성을 통해 직접적으로 또는 게놈 주변에 산재된 엘리먼트의 복사체간의 재조합 결과로서 간접적으로 전체 염색체 재배열 (gross chromosomal rearrangement)를 초래할 수 있다. 절제되는 전위성 엘리먼트는 종종 부정확하게 절제되며, 첨가되거나 결실된 염기의 수가 3의 배수인 경우, 변형된 유전자 생성물을 코딩하는 대립 유전자를 생성할 수 있다.
전위성 엘리먼트 자체는 비정상적 방식으로 변화될 수 있다. 이들이 유사한 다른 DNA 서열로 유전되는 경우, 한 종의 엘리먼트의 복사체는 더욱 먼 종에서의 복사체보다 더욱 밀접한 종에서 더욱 유사한 복사체가 될 것이다. 이는 항상 그런 것은 아니며, 이는 전위성 엘리먼트가 한 종으로부터 다른 종으로 때대로 수평으로 전달됨을 시사한다.
ii. 화학 돌연변이법
화학 돌연변이법은 특정 이점 예컨대, 표현형 등급의 완전 범위의 변이체 대립유전자를 발견할 수 있는 능력을 제공하며, 용이하며, 저렴하다. 대부분의 화학적 발암원은 DNA에서의 변이를 유도한다. 벤조[a]피렌, N-아세톡시-2-아세틸 아미노플루오렌 및 아플로톡신 B1은 박테리아 및 포유동물 세포에서 GC의 TA로의 교차를 초래한다. 벤조[a]피렌은 또한 AT에서 TA로와 같은 염기 치환을 유도할 수 있다. N-니트로소 화합물은 GC에서 AT로의 변이를 유도한다. n-니트로소우레아로의 노출에 의해 유도된 티민의 O4 위치의 알킬화는 TA에서 CG로의 전이를 초래한다.
돌연변이법성과 발암성 사이의 높은 상관관계는 암스 테스트 (Ames test) (McCann et al., 1975)의 근본적인 가설이며, 이는 마이크로좀 사이토크롬 P450을 함유하는 첨가된 래트 간 균질화액과 함께 박테리아 시스템에서 변이체를 신속하게 분석하여, 필요한 경우 돌연변이원의 대사 활성화를 제공한다.
척추동물에서, ras 프로토-온코젠에서 변이를 유도하는 수개의 발암물질이 밝혀졌다. N-니트로소-N-메틸 우레아는 쥐에서 유방암종, 전립선암종 및 기타 암종을 유도하며, 대부분의 종양은 Ha-ras 온코젠의 12번 코돈중 두번째 위치가 G에서 A로 전이된 것이다. 벤조[a]피렌-유도된 피부 종양은 Ha-ras 유전자의 두번째 코돈의 A에서 T로의 변화된 것을 포함한다.
iii. 방사선 돌연변이법
생물학적 분자의 무결성은 이온화 방사선에 의해 분해된다. 입사 에너지의 흡착은 이온 및 자유 라디칼의 형성 및 일부 공유 결합의 파괴를 초래한다. 방사선 손상에 대한 민감성은 분자마다 그리고, 동일한 분자의 다양한 결정 형태 마다 매우 다양하다. 이는 전체 축적선량에 좌우되며, 또한 선량율에 의존적이다 (일단 자유 라디칼이 존재하면, 이들이 초래하는 분자 손상은 이들의 천연 확산율에 의존적이며 따라서, 실시간에 의존적이다). 샘플을 가능한 차갑게 함으로써 손상이 저하되고 제어된다.
이온화 방사선은 DNA 손상 및 세포 치사를 초래하며, 일반적으로 선량율에 비례한다. 이온화 방사선은 DNA와의 직접 상호작용에 의해 또는 자유 라디칼 종의 형성을 통해 다양한 생물학적 영향을 끼치는 것으로 간주되며, 이는 DNA 손상을 초래하다 (Hall, 1988). 이러한 영향은 유전자 변이, 유해한 형질전환 및 세포 치사를 포함한다. 이온화 방사선이 일부 원핵세포 및 하등의 진핵세포에서 특정 DNA 복구 유전자의 발현을 유도하는 것으로 입증되었으나, 포유동물 유전자 발현의 조절에 대한 이온화 방사선에 대한 효과에 대해서는 거의 알려지지 않았다 (Borek, 1985). 여러 연구에서 포유동물 세포의 방사선 처리 후 관찰된 단백질 합성 패턴의 변화를 기술하고 있다. 예를 들어, 인간 악성 흑색종 세포의 이온화 방사선 처리는 수개의 비확인된 단백질의 유도와 관련있다 (Boothman et al., 1989). 시클린 및 공동-조절된 폴리펩티드의 합성은 래트 REF52 세포에서 이온화 방사선에 의해 억제되나, 온코젠-형질전환된 REF52 세포주에서는 그렇지 않다 (Lambert and Borek, 1988). 그 밖의 연구에서는 특정 성장 인자 또는 사이토카인이 x-선 유도된 DNA 손상과 관련있을 수 있음을 입증하였다. 이와 관련하여, 혈소판 유래된 성장 인자는 방사선 처리 후 내피 세포로부터 방출된다 (Witte, et al., 1989).
"이온화 방사선"은 충분한 에너지를 갖거나 핵 상호작용을 통해 충분한 에너지를 생성할 수 있어 이온화 (전자의 획득 또는 손실)를 유도할 수 있는 입자 또는 광자를 포함하는 방사선을 포함한다. 예시적이고 바람직한 이온화 방사선은 x-방사선이다. 주어진 세포에서 필요한 이온화 방사선의 양은 일반적으로 이들 세포의 특징에 좌우된다. 전형적으로, 유효한 발현-유도 선량은 세포 손상 또는 치사를 직접적으로 초래하는 이온화 방사선 선량 보다 적다. 유효한 방사선량을 결정하는 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있다.
iv. 실험관내 스캐닝 돌연변이법
무작위 돌연변이는 또한, 에러 프론 PCR (error prone PCR) (Cadwell and Joyce, 1992)을 사용하여 유도될 수 있다. 돌연변이 유발 율은 주쇄를 희석한 다수의 튜브에서 PCR을 수행함으로써 증가될 수 있다.
한 특히 유용한 돌연변이 유발 기법은 알라닌 스캐닝 돌연변이법이며, 여기서 많은 잔기가 개별적으로 아미노산 알라닌으로 치환되어 측쇄 상호작용의 손실 효과가 측정될 수 있는 반면, 단백질 형태에서의 대규모 혼란 위험성을 최소화시킬 수 있다 (Cunningham et al., 1989).
최근에, 소량의 단백질을 이용한 리간드 결합에 대한 평형 상수를 측정하기 위한 기법이 개발되었다 (Blackburn et al, 1991; 미국 특허 5,221,605 및 5,238,808). 소량의 물질로 기능 검정을 수행하는 능력을 활용하여 항체의 포화 돌연변이 유발을 위한 매우 효과적인 실험관내 방법을 개발할 수 있다. 모두 19개 아미노산 치환이 발생할 수 있으며, 이러한 방식으로 검정될 수 있다는 높은 효율성으로 인해, 많은 대상 잔기에 대한 포화 돌연변이 유발을 수행하는 것이 가능하며, 이러한 과정은 실험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발로서 기술될 수 있다 (Burks et al., 1997).
실험관내 스캐닝 포화 돌연변이법은 (i) 리간드 결합 특이성을 조절하는 잔기의 식별, (ii) 주어진 위치에서 활성을 보유하는 아미노산 및 활성이 없어진 아미노산의 판별에 기초한 리간드 결합의 더욱 자세한 이해, (iii) 활성 부위 또는 단백질 서브도메인의 전반적인 적응성의 평가, (iv) 결합을 증가시키는 아미노산 치환의 식별을 포함하는 많은 구조-기능 정보를 수득하기 위한 신속한 방법을 제공한다.
v. 단편화 및 재조립에 의한 무작위 돌연변이법
디스플레이되는 폴리펩티드 라이브러리를 생성시키는 방법은 U.S. 특허 5,380,721에 기술되어 있다. 본 방법은 폴리누클레오티드 라이브러리 멤버를 수득하고, 폴리누클레오티드를 풀링하고 단편화시키고, 이들로부터의 단편을 재형성시키고, PCR 증폭을 수행하여, 단편을 상동적으로 재조합하여 재조합된 폴리누클레오티드의 교란된 풀을 형성하는 것을 포함한다.
D. 대사 흐름 모니터링
물질이 대사 경로를 통해 진행되는 속도인 대사 흐름은 세포 대사의 근본적인 측정 규준이다. 예를 들어, 지방산 생합성 경로 대 시트르산 사이클에 대한 대사 흐름의 측정은 특정 경로의 상대적 중요성을 결정하고, 생반응 네트워크 분석 및 대사 조작에 필수적인 주요 정량적 데이타를 제공하는 것을 돕는다 ((Fernie et al., 2005; Klapa et al, 2003; Sauer, 2004).
탄수화물 대사는 탄수화물이 지방산 생합성 경로를 포함하는 대부분의 다른 경로에 전구체 대사물을 제공하고, 주요 에너지원이기 때문에 유기체의 생리기능의 중심에 있다 (White, 2000). 시아노박테리아 예컨대, 시네코시스티스 sp. PCC 6803은 이들이 글리콜첨가분해 및 펜토오스 포스페이트 경로를 통해 글루코오스를 분해하기 위한 유전자를 가지며, 펜토오스 포스페이트 경로와 같이 많은 단계를 갖는 캘빈-벤슨-바스햄 (Calvin-Bension-Bassham) 사이클을 통한 CO2 고정을 수행하기 때문에 특히 복잡하고 주요한 대사 경로를 갖는다 (Nakamura et al., 1998).
시네코시스티스 sp. PCC 6803의 종속영양 (5mM 글루코오스와 암실에서) 및 광혼용영양 (5mM 글루코오스와 명실에서)에서 중심적인 탄수화물 대사 경로를 통한 총체적인 대사 흐름이 안정적인 최종 생성물중의 동위원소의 분포에 따라 결정되었다 (Yang et al, 2002a; Yang et al, 2002b; Yang et al, 2002c). 안정한 동위원소 라벨링된 기질이 첨가되며, 세포내 대사 풀에서 최종 동위원소 부화는 질량 분광계 (MS) 또는 핵자기공명 (NMR) 분광기에 의해 검출가능 아미노산의 라벨링 패턴으로부터 추론된다. 생성된 데이타는 세포내 흐름을 예측하는데 사용되는 많은 양의 정보를 제공한다. 이러한 분석이 동시에 많은 것을 대략적으로 짐작케하지만, 이러한 검정은 여러 단점을 갖는다: (i) 이는 정상 상태 배양에서 사용되며, 역동적인 흐름 속도는 달성되지 않는다; (ii) 이러한 분석에는 모든 분석 대상 및 경로/반응이 정확하게 공지되어 있어야 한다; (iii) 데이타 처리는 복잡하며, 모든 실험 조건하에서 유효할 수 없다는 가설이 요구된다. 이는 특히, 복잡하고 꼬인 경로가 모델링되는 경우 인공적인 값을 초래할 수 있다 (van Winden et al, 2005).
이러한 잠재적인 단점으로 인해, 중추 탄수화물 대사의 일부를 분석하기 위한 단순하고 객관적인 방법이 요망된다. 따라서, 발명자들은 개별 반응이 시간에 따라 더욱 직접적으로 모니터링될 수 있는 방법을 개발하였다. 세포내 주요 대사산물 예컨대, 당 포스페이트는 다양한 기법 예를 들어, 효소 분석, HPLC (Bhattacharya et al, 1995; Groussac et al, 2000), CE/MS (Soga et al., 2002), GC/MS (Fiehn et al, 2000; Roessner et al, 2000) 및 LC/MS (Buchholz et al, 2001; Buchholz et al, 2002; Mashego et al, 2004; van Dam et al, 2002)으로 모니터링될 수 있다. 부크홀츠 (Buchholz) (2001) 등은 LC-ESI-MS를 사용하여 대장균 K12에서 당분해 중간체의 세포내 농도를 정량하는 방법을 개발하였다. 대사 흐름 분석에 있어서, MS 검출의 가장 결정적인 이점은 이들은 13C을 추적할 수 있다는 점이며, 이로 인해 세포내 대사물의 라벨링 패턴이 결정될 수 있다. 최근에는, 반 빈덴 (van Winden) (2005) 등은 LC/MS에 의해 E.coli 배양물로부터 비라벨링된 및 13C-라벨링된 주요 대사 중간체를 직접 측정하였다.
발명자들은 시간에 따라 13C-라벨링된 대사 중간체의 부화를 직접 측정하는 LC/MS와 13C 추적 방법의 조합을 이용하였다. 본 방법은 상이한 성장 조건하에서 당 포스페이트간의 상호전환율의 심오한 분석을 가능하게 하기 때문에, 발명자들이 대사 흐름 네트워크 및 역동적인 대사 흐름에 대한 상세한 정보를 획득할 수 있게 해준다.
D. 목적 생성물의 회수
일부 예에서, 발현된 목적 생성물을 회수하는 것이 요구된다. 일단 발현되면, 목적 생성물은 황산암모늄 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동, 용매 추출, 분자체 등을 포함하는 당해분야의 표준 공정에 따라 정제될 수 있다 (R. Scopes, (1982) Protein Purification, Springer- Verlag, N. Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y.).
특정 양태에서, 목적 생성물 회수의 초기 단계는 세포를 분해하거나 파괴하는 것을 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 가능한 분해 방법이 이용될 수 있으며, 열처리, 초음파, 기계적 마모, 가압 및 급작스러운 감압, 불활성 매질의 첨가에 의해 보조되는 마모 및 마찰, 일렉트로포레이션 및 알칼리 또는 산 처리를 포함한다. 일단 분쇄되면, 세포 분해물은 지질-기재 생성물을 위한 직접적인 용매 또는 초임계 CO2 추출법으로 처리될 수 있다 (Serrano-Carreon et al. (2002); Nobre et al. (2006); Topal et al. (2006), 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨). 대안적으로, 목적 생성물은 두개 상의 분할 시스템에 의해 분리될 수 있다 (Rito-Palomares (2004); Cisneros et al. (2004); Serrano- Carreon et al. (2002), 이들 모두는 본원에 참조로서 통합됨).
E. 변형된 발현을 결정하기 위한 분석
본 발명의 광독립영양 박테리아는 본 명세서 전반에 걸쳐 기술된 방법을 이용하여 변화된 수준의 목적 생성물을 나타낼 수 있다. "변화된" 또는 "변형된"은 박테리아에서 목적 생성물의 원래의 발현과 비교하여 상이한 수준의 발현을 포함한다. 대상 유전자는 이들의 서열 또는 발현 수준이 변화될 수 있고/거나 결실되고/거나 이종 공급원으로부터 유입될 수 있다. 이는 상응하는 목적 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질 또는 효소)의 조절된 생성 및/또는 이러한 유전자 생성물에 대한 경로의 조절을 유도할 수 있다 (예를 들어, 증가된 양의 상응하는 유전자 생성물 및/또는 유전자 생성물과 관련된 대사 경로의 성분을 수득하기 위해 대상 유전자를 증가시키거나 과다 발현시킴). 이러한 변화는 방사성-라벨링, 형광 라벨링, 염색, 질량 분광계, 효소 활성 측정 및/또는 단백질 정제를 포함하는 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 간단하고 직접적인 방법으로는 SDS/PAGE 및 단백질 염색 또는 웨스턴 블롯 후 정량 분석 예컨대, 생성 겔 또는 블롯의 밀도측정 스캐닝 (densitometric scanning)을 포함하는 방법을 포함한다. 천연 박테리아에서의 수준과 비교하여 목적 생성물의 수준의 특정 증가는 과다발현을 나타내는데, 이는 박테리아 세포에 의해 생성된 그밖의 단백질과 관련하여 특정 목적 생성물의 상대적으로 풍부함을 나타내며, 예를 들어, 겔상에서 가시화된다.
F. 광독립영양 박테리아에 대한 성장/배양 조건
본 발명의 광독립영양 박테리아의 성장을 통해 목적 생성물의 대규모 생성은 배쓰 또는 연속 배양 방법 둘 모두에 의해 수행될 수 있다. 전통적인 회분식 배양 방법은 밀폐된 시스템에서 이루어지며, 여기서 배지 조성물은 배양 초기로 설정되며, 배양 과정 동안 인공적인 처리를 하지 않는다. 따라서, 배양 과정 시작시에 배지에 목적 유기체 또는 유기체들을 접종시키며, 성장 또는 대사 활성이 시스템에 아무것도 첨가하지 않은채 발생한다. 그러나, 전형적으로 "회분식" 배양은 탄소원 첨가와 관련된 회분식이며, 종종 pH 및 산소 농도와 같은 인자를 조절하기도 한다. 회분식 시스템에서, 시스템의 대사물 및 바이오매스는 배양이 종료되는 시간까지 계속적으로 변화된다. 배치 배양물내의 세포는 잠복기 (static lag phase)를 걸쳐 고성장 대수기 (high growth log phase)로 조정되며, 최종적으로는 성장 속도가 저하되거나 정지하는 정체기 (stationary phase)로 이동한다. 비처리되는 경우, 정체기에서의 세포는 결국에는 치사될 것이다. 대수 증식기에서의 세포는 종종 일부 시스템의 최종 생성물 또는 중간체의 대규모 생성을 유도한다. 정체기 또는 포스트-대수증식기 (post-exponential phase) 생성물이 다른 시스템에서 수득될 수 있다. 표준 회분식 시스템에 대해 변형된 것이 페드-배치 시스템 (Fed-Batch system)이며, 이는 배양이 진행됨에 따라 증가량의 기질을 첨가한다는 것을 제외하고는 전형적인 회분식 시스템을 포함한다. 페드-배취 시스템은 대사산물 억제작용이 세포의 대사를 억제하는 경향이 있는 경우 유용하며, 여기서 배지중에 기질은 제한된 양으로 갖는 것이 바람직하다. 배취 및 페드-배취 배양 방법은 당해분야에서 일반적이고 널리 공지된 것이며, 예로는 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., or Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992)]에서 찾아볼 수 있다.
대안적으로, 규정된 배양 배지가 연속적으로 생반응기에 첨가되고, 동일량의 컨디셔닝된 배지가 처리 동안 동시에 제거되는 개방식 시스템이다. 연속 배양은 일반적으로 일정한 높은 액체상 밀도의 세포를 유지하며, 여기서 세포는 대수 성장기에 주로 위치한다. 대안적으로, 연속 배양은 탄소 및 영양분이 연속적으로 공급되며, 유용한 생성물, 부산물 또는 폐기물이 연속적으로 세포 집단으로부터 제거되는 불명화된 세포로 실시될 수 있다. 세포 불멸화는 천연 및/또는 합성 물질로 이루어진 다양한 고형 지지체를 사용하여 수행될 수 있다.
G. 광독립영양 박테리아를 성장시키고 처리하기 위한 시스템
본 발명의 특정 양태에서, 광독립영양 박테리아는 대규모 생성 시스템에서 성장할 수 있다. 이러한 시스템은 본원에 참조로서 통합된 문헌 [U.S. Provisional Patent Application No. 60/862,366, filed on or about October 20, 2006, titled "System and Method for Growing Cells," by Willem F.J. Vermaas and Bruce E. Rittmann and PCT Application No. , entitled "System and Method for Growing Photosynthetic Cells", filed on or about October 20, 2007, by Willem FJ. Vermaas and Bruce E. Rittmann]에서 찾아볼 수 있다.
H. 목적 생성물 처리
특정 양태에서, 목적 생성물 (예를 들어, 지질, 카로테노이드, 탄수화물 또는 시아노피신)은 (i) 하나 이상의 대상 유전자의 발현 수준이 변화되어, 하나 이상의 대상 유전자의 변화된 발현이 하나 이상의 대상 유전자의 발현 수준이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의해 생성된 하나 이상의 목적 생성물의 양과 비교하여 하나 이상의 목적 생성물의 생성량을 증가시키는 변형된 광독립영양 박테리아를 수득하고; (ii) 이러한 광독립영양 박테리아를 목적 생성물을 생성하기에 적합한 조건하에서 성장시키고, (iii) 목적 생성물을 분리함으로써 수득될 수 있다. 분리된 생성물은 추가로 수개의 상이한 생성물로 처리될 수 있다. 비제한적 예로는 바이오 연료, 바이오 플라스틱, 동물 사료 첨가제 및 유기 비료를 포함한다.
바이오 연료와 관련하여, 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질 및 탄수화물은 추가로 바이오디젤 및 바이오 가스로 처리될 수 있다. 바이오디젤은 석유 기재 디젤 연료와 유사한 방식으로 사용될 수 있는 액체 연료원이다. 바이오 디젤 생성은 글리세롤을 단쇄 알코올 예컨대, 메탄올 또는 에탄올로 에스테르화교환 반응으로서 공지된 단계로 대체함으로써 합성될 수 있다. 에스테르교환 공정은 전형적으로 실온에서 메탄올 (50% 과량)과 NaOH (100% 광량)을 혼합하고, 액체/오일을 강하게 혼합한 후, 글리세롤을 정치(定置) 시키는 것을 포함한다 (약 15%의 바이오디젤 혼합물). 상청액에 바이오디젤이며, 메틸화된 지방산 및 메탄올의 혼합물을 함유하며, NaOH 촉매는 글리세롤 분획에 용해된채 유지된다. 공업적으로, 에스테르는 물 세척, 진공 건조 및 여과로 이루어진 세척 또는 정제 과정으로 전달될 수 있다. 에스테르교환 반응은 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올 또는 부탄올을 이용하여 진행될 수 있다. 촉매는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨일 수 있다. 메탄올/오일 몰비가 반응 효율에 크게 영향을 끼치며, 메틸 에스테르 장치의 최적의 크기에 중요하게 관련되어 있음이 공지되어 있다. 대안적 방법은 초음계 유체 메탄올 방법 또는 초음파 반응기의 사용, 및 당업자에게 공지된 그 밖의 방법을 포함한다 (본원에 참조로서 통합된 문헌 [Aresta (2005); Saka et al. (2006)] 참조).
바이오가스는 당업자에게 공지된 방법에 의해 본 발명의 방법으로부터 수득된 탄수화물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법 및 프로토콜의 비제한적 예는 문헌 [Gong et al. (1999)]에 설명되어 있다. 한 예로서, 글루코오스 산화는 환원 등가물을 형성시키는데 사용되며, 이는 히드로게나아제에 의해 시아노박테리아에서 수소로의 양성자 환원에 사용될 수 있다 (본원에 참조로 통합된 문헌 [Nandi et al. (1998)] 참조). 또 다른 비제한 예로는 광바이오수소 생성을 포함한다 (본원에 참조로 통합된 문헌 [Prince et al. (2005)] 참조).
바이오플라스틱은 당업자에게 공지된 방법에 의해 본 발명의 방법으로 수득된 탄수화물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 탄수화물중의 PHA 수준 (PHB)은 환원 조건으로 이동시 수배로 증가되며, 글루코오스 첨가시 추가로 증가될 수 있다. 바이오플라스틱의 비제한적 예는 문헌 [Taroncher et al. (2000)]에 기술되어 있다. 추가적으로, 시아노박테리아가 폴리락트산을 천연적으로 제조하지 않지만, 이들은 E.coli에 대해 개발된 원리에 따른 적당한 효소로 폴리락트산을 생성하도록 변형될 수 있다 (본원에 참조로 통합된 문헌 [Zhou et al. (2005)] 참조).
대안적으로, 또는 목적 생성물을 처리하는 것에 추가하여, 본 발명의 변형된 광독립영양 박테리아는 박테리아에 공급된 탄수화물을 고정시키는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 이산화탄소 공급원으로부터 이산화탄소를 감소시키거나 제거하는데 유리할 수 있다 (예를 들어, 연도 가스중의 이산화탄소의 양 감소). 이를 수행하는데 사용될 수 있는 비제한적 시스템은 본원에 참조로 통합된 문헌 [U.S. Provisional Patent Application No. 60/862,366, filed on or about October 20, 2006, titled "System and Method for Growing Cells," by Willem FJ. Vermaas and Bruce E. Rittmann and PCT Application No. , entitled "System and Method for Growing Photosynthetic Cells", filed on or about October 20, 2007, by Willem FJ. Vermaas and Bruce E. Rittmann]에 기술되어 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 비제한적 양태를 나타내기 위해 포함된 것이다. 하기 실시예에 기재된 기법은 본 발명의 실시에 잘 적용되는 본 발명자들에 의해 개발된 기법을 나타낸다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 그러나, 당업자는 본 기재의 관점에서, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 기재된 특정 구체예에 많은 변화를 적용하여 여전히 동일하거나 유사한 결과를 획득할 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
지질 함량을 증가시키기 위한 변형된 시네코시스티스 sp. PCC 6803 시아노박테리아
시아노박테리아 시네코시스티스 sp. PCC 6803을 변형시켜 VIPP1 유전자 sll0617을 과다발현시켰다. vipp1 유전자 (sll0617)의 높은 발현 수준을 달성하기 위해 이를 시네코시스티스 psbA3 유전자 (sll1867)의 항시성 천연 프로모터하에 클로닝시켰다. vipp1 유전자를 pA3lhcgA3 플라스미드의 스텍티노마이신 유사체중의 천연 psbA3 유전자의 업스크림 (287bp) 및 다운스트림 (394bp) 영역 사이에 클로닝 시켰다 (He et al. 1999); 생성된 플라스미드는 Highvipp1으로 칭하고, 도 14에 개략적으로 나타내었다. vipp1 (sllO617) 유전자에 대한 서열은 시아노베이스로부터 수득되었으며, 두개의 프라이머를 작제하여 vipp1 유전자 개시 코돈으로부터 15bp 업스트림 내지 vipp1 유전자 정지 코돈으로부터 18bp 다운스트림인 804bp의 vipp1 유전자에 상응하는 시네코시스티스 게놈 837-bp 단편을 증폭시켰다. 프라이머의 서열은 5'- GAG GAT AAG TAA GtC ATG aGA TTA TTT GAC 및 5'- CTG GCT GAG TTA Atg CAt TTA CAG ATT ATT TAA CC이다. 소문자는 제 1 프라이머 및 제 2 프라이머에서 각각 BspHI 및 NsiI의 독특한 제한 부위의 유입을 위한 누클레오티드 염기 변화를 나타낸다. 증폭된 vipp1 단편 및 pA3lhegA3으로부터의 스펙티노마이신 내성 카세트를 각각 (BspHI, NsiI) 및 (NcoI, PstI)로 분해시켰다. 결찰 후, E.coli 형질전환을 일렉트로포레이션에 의해 수행하고, 형질전환 후, 세포를 실온에서 플레이팅시켰다; 인렉트로포레이션 이후의 모든 단계에서 (37℃ 보다는) 실온에서 인큐베이션할 경우, 플라스미드 시퀀싱에 의해 확인되는 바와 같이 전장 vipp1 유전자를 갖는 E.coli 형질전환체가 성공적이었다.
시네코시스티스 sp. PCC6803의 형질전환
시네코시스티스를 문헌 [Vermaas et al. 1987]에 따라 Highvipp1 플라스미드 (도 14)로 형질전환시켰다. 키메라 vipp1 유전자를 수반하는 시네코시스티스 형질전환체를 스펙티노마이신 내성을 통해 선택하고, 형질전환체의 후속의 리스트레이크 (restreak)시 스펙티노마이신 농도 증가를 이용하여 단일 콜로니의 완전한 분리를 달성하였다. 시네코시스티스 게놈의 목적 부위에서 전장 길이 vipp1의 게놈 인 테그레이션을 입증하기 위해, 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 psbA3 유전자의 말단 업스트림 서열에서 T1T2 터미네이터 서열이 시작되는 부위 사이의 단편을 증폭하였다. 업스트림 psbA3 유전자의 말단 서열은 5'-GAC AAA TAC ATA AGG AAT TAT AAC c이며, T1T2 터미네이터 서열의 시작부에 맵핑된 프라이머의 서열은 5'-GCC AAA ACA GCC AAG CTT GGC이다. 제 1 프라이머를 사용하여 전방향 DNA 시퀀싱을 수행하고, 후자의 프라이머는 증폭된 키메라 vipp1 유전자의 역 DNA 시퀀싱에 사용하였다.
하기 설명되고 표 1 및 도 8에 도시된 바와 같이, 이러한 유전자의 과다발현은 시네코시스티스 sp. PCC 6803 시아노박테리아중의 지질 함량을 약 50 건조 중량%로 증가시켰다. sll0617 유전자를 psbA3 프로모터하에 위치시켰다. 시네코시스티스 세포를 30℃에서 50 마이크로몰 광자 m-2s-1로 성장시켰다. 표준 방법을 통해 지질 추출을 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Tasaka et al. 1996] 참조).
표 1 배가 시간 (h) 및 지질 건조 중량%, 신선한 물, 스트레스 받지 않는 조건. 균주는 다르게 언급되어 있지 않는 한 야생형이다.
유기체 배가 시간 (h) 지질 (DW %) 결정 방법 설명 참조
시아노박테리아
"아니시스티스 니둘란스 (Anacystis nidulans)" (시네코코커스) 14 7 지방산으로부터1) [1]
시네코시스티스 sp. PCC 6803 12 20 중량측정2) [2]
시네코시스티스 sp. PCC 6803, Sll0617 과다발현인자 13 47 중량측정2) [2]
녹조
안키스트로데스무스 sp. (Ankistrodesmus sp.) 24 25 중량측정2) +0.1M NaCl [3]
보트리오코커스 브라우니 (Botryococcus braunii) 72 45 중량측정2) [3]
난노클로리스 sp. (Nannochloris sp.) 20 21 중량측정2) +0.1M NaCl [3]
1) 공정 동안 손실로 인해 과소평가된 것으로 보임
2) 공동 분리 불순물로 인해 과다평가된 것으로 보임
[1] Sato et al., BBA 572 (1979) 19-28
[2] Vermaas lab, unpublished
[3] Ben-Amotz et al., J. Phycol. 21 (1985) 72-81
실시예 2
시네코시스티스 sp. PCC 6803의 중추 탄수화물 대사 경로를 통한 대사 흐름의 역동적 분석 및 accABCD 과다발현에 의한 지방산 생합성의 증가
1. 재료 및 방법
화학물질 . 기준 물질로서 사용된 화학 물질 (글루코오스-6-포스페이트 (G6P), 프룩토오스-6-포스페이트 (F6P), 프룩토오스-1,6-비스포스페이트 (FBP), 글리세르알데히드-3-포스페이트 (GAP), 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP), 3-포스포글리세레이트 (3PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP), 6-포스포글루코네이트 (6PG), 리보오스-5 -포스페이트 (R5P), 리불로오스-5-포스페이트 (Ru5P), 리불로오스-1,5-비스포스페이트 (RuBP), 및 에리트로오스-4-포스페이트 (E4P))를 시그마 (Sigma) (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 균일하게, 13C-라벨링된 D-글루코오스 (U-13C6-D-글루코오스)를 캠브리지 이소토프 라보라토리스, 인크. (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) (Andover, MA)로부터 구입하였다. 밀리-Q 등급 물 (Milli-Q- grade water) (Millipore, Van Nuys, CA)을 모든 용액에 사용하였다.
성장 조건 및 13 C-글루코오스 라벨링 . 시네코시스티스 sp. 균주 PCC 6803 야생형 및 포스포프룩토키나아제 및/또는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 결핍 변이체를 5mM TES [N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산]-NaOH (pH 8.0)으로 완충된 BG-11에서 30분 동안 공기중에서 배양시켰다. 광혼용영양적 및 광종속영양적 성장을 위해, 성장 배지에 5mM 글루코오스를 보충하였다. 광종속영양적 성장을 위해, PS II를 통해 전자 이송을 차단하는 25μM의 헤르비시드 아트라진을 배지에 첨가하였다. 배양물을 50μmol 광자 m-2s-1 광도의 백색 광으로 조사시키고, 120rpm의 교반 속도로 교반하였다. 배양물의 성장을 쉬마드주 (Shimadzu) UV-160 분광광도계로 730nm에서 광밀도를 측정하여 모니터링하였다.
13C 라벨링을 위해, 성장기 후반의 세포 (OD730=1.0)를 1mM 글루코오스가 보충된 BF-11 배지로 40배 희석하였다. 세포 밀도가 OD730=0.5에 도달하는 경우, 0.5mM 13C 글루코오스 또는 5mM 13C NaHCO3 (라벨링된 중탄산염을 0.5mM 비라벨링된 글루코오스와 함께 첨가함)를 배양물에 첨가하고, 일반적인 성장 조건하에서 계속해서 인큐베이션하였다. 0시간에 라벨링된 글루코오스 또는 중탄산염을 첨가한 후로부터 상이한 시점에 샘플을 취하였다.
샘플 제조. 100ml의 분취물을 라벨 첨가 후 특정 시점에서 라벨링된 시네코시스티스 sp. PCC 6803 (OD730=0.5)로부터 제거하고, 배양 분취물을 유리 마이크로 섬유 필터 (FG/B, Whatman)를 통한 여과에 의해 신속하에 채집하고, 35ml의 물로 세척하여 잔여 배지를 제거하였다. 세포를 갖는 필터를 바로 20ml의 냉 (-40℃) 메탄올에 넣고, 이러한 조건하에서 30분 동안 인큐베이션하여 반응을 켄칭시켰다. 그 후, 메탄올/필터/세포 혼합물을 대사물 추출을 위해 70℃에서 6분 동안 인큐베이션하였다. 필터를 버린 후, 메탄올을 4℃에서 N2하에 증발시켰다. 최종적으로, 남아있는 분말을 0.25ml 물에 용해시켰다. 1시간 동안 옵티마 TLX 120 (Optima TLX 120) 초원심분리기 (Beckman)에서의 초원심분리 후, 투명한 상청액을 새로운 튜브에 이동시키고, -70℃에서 저장하였다.
HPLC 분리 . HPLC를 다공성 흑연성 탄소 하이퍼캅 칼럼 (Hypercarb column) (100x2.1 mm, 5 mm, Thermo-Electronic, Bellefonte, PA)을 사용하여 수행하였다. 추가적으로, 하이퍼캅 가드 칼럼 (10x2.1 mm)을 사용하여 주요 칼럼을 보호하였다. 0.125 ml min-1의 유속의 이진 구배 (binary gradient)를 벡맨 HPLC 시스템을 이용하여 적용하였다. 주입 부피는 50㎕이다. 용매 A는 12mM 수성 암모늄 아세테이트이며, 용매 B는 물이다. 분리를 위해 적용된 구배는 처음 20분내에 용매 B에서 60%에서 100%로 증가시켰다. 이러한 수준을 5분 동안 유지하고, 그 후 다음 2분 동안 다시 60% B로 저하시켰다. 이러한 수준을 10분 동안 유지시켜 칼럼을 재균등화시켰다.
포스트칼럼 T-스플릿터 (T-splitter)를 사용하여 메탄올을 펌핑하여 0.125ml min-1의 유속으로 HPLC 용출물과 합류시키고, 그 후, 혼합물을 ESI 계면을 통해 질 량 분광계로 유입시켰다.
질량 분광계 . ABI 365 삼중-사중극장 질량 분광기 (Applied Biosystems/MDS Sciex)를 사용하여 MS 분석을 수행하였다. 질소를 시스 가스 (sheath gas) 및 충돌 가스 (collision gas)로서 사용하였다. 데이타 획득 및 분석은 아날리스트 소프트웨어 (Analyst software) (Applied Biosystems/MDS Sciex)를 사용하여 수행하였다.
MS 실험을 위한 최적의 파라미터를 10㎕ min-1 속도로 주사 펌프로 상이한 기준 물질을 직접 주입함으로써 전체 스캔 모드에서 결정하였다. 기준 물질 G6P (메탄올중의 5μM G6P:12mM 암모늄 아세테이트 (50:50, v/v))로의 조정 (tuning)으로부터의 조정 파라미터 (tune parameter)를 MS 및 MS/MS 검출에 이용하였다. 하기 ESI 파라미터를 이용하였다: 가열된 모세관의 온도: 300℃; 전자스프레이 모세관 전압: 4.2kV; 커튼 가스: 8psi; 포커스 전압: 100V. 모든 다른 파라미터를 자동 조정에 의해 결정하였다.
Q1 멀티플 이온 모드 (Q1 Multiple Ion mode)를 사용하여 중간체의 농도 및 이들의 동위원소 이성질체의 농도를 정량하였다. MS/MS 모드를 사용하여 화학물질을 식별하거나 이의 동일한 화학물질을 확인하였다.
대사산물의 식별 및 정량화 . 샘플중의 대사산물을 이들의 보유시간, m/z, 특이적 단편화 패턴에 따라 그리고, 필요에 따라, 추출물에 10-50 μM 농도의 대사 기준 물질을 첨가함으로써 확인하였다. 13C-라벨링 실험으로 대사산물의 존재를 추 가로 확인하였다. 대사산물의 정량화는 표준 첨가 방법을 적용함으로써 [M-H]- 이온을 통해 달성하였다 (Skoog and Leary, 1992). 공지된 농도의 단지 하나의 분석물을 함유하는 기준 용액을 분리하였다. 세포 추출물에 증가된 양의 이러한 기준 용액을 첨가함으로써, 농도에 대한 피크 영역의 선형 회귀 플롯을 달성하였다.
13 C 분포 분석 . 광혼용영양적 및 광종속영양적 배양으로부터 수집된 13C-라벨링된 샘플을 13C 라벨 첨가 후 0, 0.33, 1.5, 5, 20 및 60 분에 수집하였다. 세포 추출물을 HPLC로 분리하고, MIM 모드로 MS에 의해 측정하였으며, 동시에 다양한 중간체의 상이한 질량 동위소 이성질체를 측정하였다. 상이한 질량 동위원소 이성질체의 함량 및 분포를 이들의 피크 영역으로부터 계산하였다.
2. 결과
LC/MS에 의한 대사 중간체의 분리 및 확인. HPLC에 의한 대사 중간체의 분리는 MS 검출의 민감도를 향상시킬 뿐만 아니라 중간체의 확인 및 정량에 필수적이다. 하이퍼캅 HPLC 칼럼이 당 포스페이트 및 광범위한 보유시간을 갖는 관련된 화합물의 분리에 적합하다 (도 1A). MS에 의한 질량 분리와 조합하여, 탄수화물 대사 중간체의 모든 이용가능한 관련 기준 물질을 확실히 분리하고, 20μM 용액을 용이하게 검출하였다. 일부 기준 물질 예컨대, S7P 및 SBP는 시중에서 입수할 수 없으나, 이들 화합물은 이들 질량에 기초하여 세포 추출물중에 확인되었다 (도 1B).
도 1A에 도시된 바와 같이, 상이한 기준 물질의 보유 시간은 5 내지 25분이었다. 일부 기준 물질 예컨대, R5P (질량 299, 첫번째 피크) 및 G6P (질량 259, 첫번째 피크)이 LC에서 소로 중복되지만, 이들은 이들의 질량 차로 인해 MS에 의해 구별되었다. 거꾸로, 질량 169 (GAP, 피크 1 (가장 짧은 용출 시간); DHAP, 피크 2 (더 긴 용출 시간), 229 (R5P, 피크 1; Ru5P, 피크 2) 및 259 (G6P, 피크 1; F6P, 피크 2)는 LC에 의해 분리하였으나 MS에 의해서는 분리하지 않았다. LC 및/또는 MS에 의한 화합물 사이의 명백한 분리는 이들 중추 대사 중간체의 정량화를 가능하게 하였다.
이제 기준 물질이 이러한 방법에 의해 μM 농도에서 검출가능한 것으로 입증되었음으로, 시네코시스티스 추출물을 분석하였다. MS 민감도를 최대화시키기 위해서는, 미립자는 샘플로부터 가능한 범위까지 제거되어 이온 억제가 최소화되어야 한다. 이러한 이유로, 샘플을 LC/MS 분석 전에 60분 동안 초원심분리기에서 80,000rpm (280,000g)에서 스피닝시켰다. 예상한 바와 같이, 천연 세포 추출물에 13C이 풍부한 반면, 질량 187 또는 188의 3PC 분자 (두개 또는 세개의 라벨링된 탄소를 수반)는 부화도는 매우 낮았다. 18C-글루코오스의 존재하에 20초 동안 성장시킨 후, 라벨링된 3PG가 나타나기 시작하였으며, 1.5분에는 명백한 188 (3개의 라벨링된 탄소) 3PG 피크가 가시화되었다. 그 후, 두개의 13C 원자를 갖는 3PG 분자가 증가되기 시작하였으며, 이는 주요 라벨링된 동위원소 이성질체가 되었다. 라벨링된 글루코오스의 첨가 후 1시간에, 3PG의 동위원소 이성질체 분포 패턴이 현저한 양의 모든 동위원소 이성질체를 포함하였으며, 명백하게 정상 상태에 도달하였다; 피크는 더 긴 인큐베이션 시간에서 크기 및 비율에 있어서 현저하게 변화되지 않았 다 (미도시됨).
이론적으로, 시그널의 LC/MS 피크 영역은 특정 화합물 농도에서 선형이어야 한다. 시네코시스티스 세포 추출물중의 중추 대사 중간체의 검출 범위에서의 선형을 입증하기 위해, 공지된 농도의 기준 물질을 세포 추출물에 첨가한 후, G6P, 3PG 및 PEP MS 시그널의 피크 영역을 측정하였다. 원래 추출물중의 G6P, 3PG 및 PEP의 농도를 이들 곡선으로부터 획득하였으며 (도 4), 가로좌표의 음의 값에 상응한다. S7P 농도는 이 기준 물질이 입수불가능하기 때문에 이러한 방식으로 계산할 수 없지만, 이의 피크 영역은 로딩된 세포 추출물의 부피와 관련하여 선형이었다.
G6P 및 F6P의 비 및 라벨링 패턴, 및 3PG 및 2PG의 비 및 라벨링 패턴은 여기서 시험된 모든 실험 조건하에서 유사하였으며, 이는 이들 이성질체간의 매우 높은 교환율을 시사한다. 데이타 수집 및 처리를 간략화하기 위해, G6P 및 F6P를 G6P+F6P의 공통의 풀로 혼합하고, 3PG 및 2PG를 혼합하여 3PG+2PG의 공통의 풀을 생성시켰다.
시네코시스티스에서 13 C-라벨링 패턴의 역동적 변화 . 본 발명자들은 본 시아노박테리아에서 중추 대사 흐름을 이해하기 위해, 세포의 성장 모드 (광혼용영양적 대 광종속영양적)의 함수로서 및 13C 첨가 후 시간의 함수로서 시네코시스티스 추출물중의 G6P+F6P, 3PG+2PG, PEP 및 S7P의 동위원소 이성질체의 분포에서의 변화를 비교하였다. 세포가 동일한 성장 모드 (광혼용영양적 또는 광종속영양적)에서 성장하여 측정된 중간체중의 동위원소 이성질체 분포가 완전하게 재생가능하지만, 세포로부터 추출되는 이들 화합물의 전체 농도는 실험마다 현저하게 변하였다 (표 2). 추출물중의 측정된 농도는 하기 파라미터 및 가설을 이용하여 세포내 농도로서 다시 환산하였다: (1) 쉬마드주 UV-160 분광광도계를 사용하여 모니터링한 경우, 지수 성장 동안 시네코시스티스의 배양물은 리터당 0D730 당 1011 세포를 갖는다; (2) 세포의 평균 직경은 2㎛이다; (3) 대사산물 추출 효율은 100%이다; 냉 세포/메탄올 혼합물 대 MS에 사용된 최종 추출물에 첨가되는 이용가능한 기준 물질의 정량은 추출 공정이 현저한 정량적 손실을 초래하지 않음을 보여주었다 (데이타 미도시). 무엇이 세포중의 대사산물의 농도를 변화시키는지는 현재 분명하지 않다; 완전히 조정되지 않으며 산정되지 않는 파라미터는 화합물이 냉 메탄올중에 세포로부터 추출되는 효율이다.
표 2. 광혼용영양적 및 광종속영양적 성장 조건하의 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 세포내 대사 중간체 농도
Figure 112009030264884-PCT00001
a 데이타는 세개의 독립된 실험의 평균을 나타낸다. 100% 추출 효율 및 1㎛의 구형 세포의 평균 반지름의 가정하에 세포내 농도를 계산하였다.
b 더욱 순수한 기준 물질이 입수할 수 없기 때문에, S7P 및 SBP의 절대 농도 보다는 상대 농도가 제공되었다.
c UD: 검출불가능
임의의 경우에, 광혼용영양적 대 광종속영양적 성장 모드하의 G6P+F6P, 3PG+-2PG, PEP 및 R5P는 서로 두개의 인자내에 포함되는 반면, 캘빈-벤슨-바스햄 사이클에 특이적인 두 화합물인 RuBP 및 SBP는 광종속영양적 조건하에서 검출불가능하였으나, 광혼용영양적 조건하에서는 존재하였다. S7P 수준은 광종속 성장 조 건하에서 약 두배 증가하였다.
13 C-글루코오스로의 광혼용영양적 성장 배양물의 라벨링. 도 5에서, 광혼용영양적 성장 배지로부터 추출물중의 동위원소 이성질체 분포는 13C-글루코오스의 첨가 후 시간의 함수로서 그래프로 나타내었다. 도 5가 유래되는 실제 데이타는 표 3에 기록되어 있다. 광혼용영양적으로 성장한 배양물에서, 라벨링된 G6P+F6P는 13C-글루코오스의 첨가 후 20초에 전체 G6P+F6P의 약 40%를 이루며, 이는 시네코시스티스중의 글루코오스의 매우 신속한 흡수 및 전환을 의미한다. 일반적으로, 이 시점에서 전체 라벨링된 G6P+F6P는 가장 풍분하 동위원소 이성질체 (265m/z)를 나타내었다. 그러나, 비라벨링된 질량 보다 1, 2, 3 또는 4 초과의 질량을 갖는 G6P+F6P 풀에서의 분자의 신속한 출현은 주목할 만하다 (라벨링 20s 후 전체 풀의 각각 약 6%). 질량 +2, +3 및 +4 피크의 신속한 출현은 용이하게 가역적인 트랜스알돌라아제 및 트랜스케톨라아제 반응을 통해 탄소 원자의 매우 신속한 재분포를 나타낸다. 하나의 13C 원자를 갖는 G6P+F6P의 신속한 형성은 반응 10 및 11을 통한 부분적으로 라벨링된 G6P+F6P (예를 들어, 1,2-13C2 또는 3,4,5,6-13C4 G6P+F6P)의 데카르복실화 및 이어서, 반응 12 및 16을 통한 G6P+F6P의 재형성으로부터 또는 반응 3 및 4를 통한 부분적으로 라벨링된 G6P+F6P (예를 들어, 3,4,5,6-13C4 G6P+F6P)의 분할 및 이어서, 비라벨링된 디히드록시아세톤 3-포스페이트 또는 글리세르알데 히드 3-포스페이트 분자와의 재조합으로부터 생성될 수 있다. 라벨링 20분 후, 비라벨링된 G6P+F6P에 상응하는 피크는 전체 약 15%로 감소하였으며, 이는 세포중에 단량체로 전환되는 비라벨링된 당 중합체의 주요 완충제 또는 저장소가 존재하지 않는 반면, 첨가된 글루코오스는 이용가능함을 나타낸다.
표 3. 광혼용영양적으로 성장한 시네코시스티스 sp. PCC 6803에서 13C-글루코오스 라벨링시 헥소오스-6-포스페이트 (G6P+F6P), 포스포글리세레이트 (3PG+2PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP), 및 세도헵툴로오스-7-포스페이트 (S7P)의 역동적인 동위원소 이성질체 분포a
Figure 112009030264884-PCT00002
a 데이타는 3개의 독립적인 실험의 평균이다.
b ID, 동위원소 이성질체 분포: 화합물의 전체 양에 대한 동위원소 이성질체의 백분율. SD, 표준 편차
3PG+2PG 및 PEP는 이들의 13C 분포 패턴에서 유사하였으나, 이들 화합물의 라벨링은 G6P 및 F6P 보다 훨씬 느렸다. 20s 후, 3PG+2PG 및 PEP는 거의 라벨링되 지 않았으며 (도 5), 이들 C3 중간체이 하나 이상의 라벨링된 탄소를 수반하기 까지 약 5분이 소요되었다. 1.5분에, 3PG+2PG 및 PEP에 대한 주요 라벨링된 피크가 하나였으며, 여기서 모든 3개의 탄소가 라벨링되었으며, 이는 전체 라벨링된 G6P+F6P로부터 기원된다. 5분 및 이를 넘어서서, 3PG+2PG 및 PEP의 주요 라벨링된 피크는 두개의 라벨링된 탄소를 함유하였다. 3PG+2PG 및 PEP의 라벨링 패턴은 후속 시점에서 매우 많이 변화되지 않았으며, 13C-라벨리된 동위원소 이성질체 분포는 라벨 첨가 후 약 20분에 정상 상태에 도달하였다. 분자당 두개의 13C를 갖는 3PG+2PG의 우세성은, 광혼용영양적 조건하에서, 3PG의 현저한 부분이 두개의 3PG 당 하나의 비라벨링된 CO2를 혼입시키는 캘빈-벤슨-바스햄 사이클을 통해 합성됨을 암시하며, 반면 라벨링된 3PG는 트랜스알돌라아제 및 트랜스케톨라아제 반응에서 스크램블링된 동위원소로부터 기원된다.
광혼용영양적 조건하에서, S7P 풀을 신속하고 부분적으로 라벨링시켰으며, 이는 3PG+2PG 또는 PEP 보다는 G6P+F6P 라벨링 패턴과 더욱 유사하다. 13C-글루코오스로의 20초 라벨링 후, 비라벨링된 S7P에 상응하는 피크는 50% 미만으로 저하되었으며, 따라서, S7P 분자의 반 이상은 이 시점에서 하나 이상의 13C 탄소를 함유하였다. 20s 시점에서 라벨링된 S7P 분자 대 비라벨링된 S7P 분자의 비는 심지어 G6P+F6P 보다 더 높았다. 이는 매우 높은 속도의 트랜스케톨라아제/트랜스아돌라아제 반응을 시사하는데, 그 이유는 이들 반응은 F6P로부터 라벨을 직접적으로 또 는 간접적으로 S7P 및 그 밖의 화합물에 전달하기 때문이다. 이들 라벨링된 S7P 동위원소 이성질체중, 라벨링 시작 후 20s에 가장 풍부한 이성질체는 두개의 13C 탄소를 함유하였다. 이러한 분자는 완전히 라벨링된 F6P와 비라벨링된 GAP와의 반응을 통해 형성되어 두개의 라벨링된 탄소를 갖는 크실룰로오스-5-포스페이트 (X5P)를 형성시키고, 이어서 X5P와 비라벨링된 R5P와의 반응에 의해 두개의 12C를 갖는 S7P 및 GAP를 생성시킬 수 있다. 완전히 라벨링된 F6P 및 비라벨링된 E4P의 S7P 및 PGA로의 직접적인 전환은 라벨링 시작 직후 잠깐 덜 부화된 세개의 13C를 갖는 S7P를 생성시킬 것이며, 이는 트랜스케톨라아제 반응을 통한 분자 교환이 본 발명자들의 실험 조건하에서는 트랜스알돌라아제를 통한 반응 보다 더욱 신속함을 나타낸다. 더 긴 라벨링 시간 후, 모든 S7P 동위원소 이성질체가 상당한 양으로 존재하며 (전체의 6-20%), 이는 S7P중의 라벨의 본질적으로 완전한 스크램블링을 나타낸다. 임의의 경우에, 당 포스페이트중의 분자 교환은 포스포글리세레이트로의 전환 보다 훨씬 빠른 것으로 여겨지며, 이는 글리세르알데히드-3-포스페이트와 포스포글리세레이트 사이의 단계가 비교적 느림을 시사한다.
NaH 13 CO 3 로의 광혼용영양적으로 성장한 배양물의 라벨링. 도 6은 광혼용영양적으로 성장한 배양물을 5mM NaH13CO3로 라벨링시킨 결과를 나타낸다; 0.5mM 비라벨링된 글루코오스가 배양물에 첨가되었다. 이들 데이타는 표 4에 정량적으로 나타 내었다. 광합성 CO2 고정이 3PG의 형성을 유도하기 때문에, 중탄산염으로부터 기원된 13C이 3PG+2PG 및 PEP 풀에 대부분 신속하게 혼입된다는 점은 그리 놀랍지 않다: 라벨링 시작 20s 후에 하나의 라벨링된 13C를 갖는 분명히 측정가능한 양의 3PG+2PG 및 PEP가 입증된 반면, 이 시점에서 매우 적게 라벨링된 G6P+F6P가 검출되었다 (도 6). 5분 후, 3PG+2PG 및 PEP 풀중의 분자의 반 이상이 하나 이상의 13C을 함유하였다. 하나 이상의 13C을 갖는 3PG+2PG의 형성은 3PG의 일부가 캘빈-벤슨-바스햄 사이클의 반응에 다시 사용되기 때문에 예측되었다. 더 긴 시간의 라벨링 후에, 3PG+2PG 및 PEP의 라벨링 패턴은 크게 변화되지 않았으며, 이는 13C 라벨링 패턴이 정상 상태에 근접하게 위치함을 보여주며, 혼입된 라벨의 양은 캘빈-벤슨-바스햄 사이클을 통해 고정된 탄소의 양 대 (비라벨링된) 글루코오스로부터 기원된 탄소의 양을 대략적으로 추정할 수 있게 한다.
표 4. 광혼용영양적으로 성장한 시네코시스티스 sp. PCC 6803에서 13C-NaHCO3 라벨링시 헥소오스-6-포스페이트 (G6P+F6P), 포스포글리세레이트 (3PG+2PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP), 및 세도헵툴로오스-7-포스페이트 (S7P)의 역동적인 동위원소 이성질체 분포a
Figure 112009030264884-PCT00003
a 데이타는 3개의 독립적인 실험의 평균이다.
b ID, 동위원소 이성질체 분포: 화합물의 전체 양에 대한 동위원소 이성질체의 백분율. SD, 표준 편차
단일 13C (질량 259)를 갖는 G6P+F6P는 라벨링 시작 후 1.5분에 나타나기 시 작한 반면, 이중 라벨링된 G6P+F6P는 라벨링 시작 후 5분에 현저한 양으로 나타났다. 13C-라벨링된 S7P는 3PG+2PG 및 PEP 보다 더욱 느렸으나, G6P+F6P 보다는 신속하였다. 이는 S7P가 캘빈-벤슨-바스햄 사이클 (CO2 고정에 비례)에서 3PG 보다 더 뒤에 오며, CO2 고정으로부터 탄소를 수용하는 대부분의 F6P+G6P가 역 글리콜첨가분해를 통한 글루코오스 신생합성을 통하기 보다는 S7P 및 그 밖의 캘빈-벤슨-바스햄 사이클 중간체을 통해 형성된다는 것은 같은 맥락이다.
라벨링된 중탄산염의 첨가후 1시간에도, 라벨링된 S7P 분자중에서, 가장 풍분한 동위원소 이성질체는 단지 단일 13C를 가지며, 이는 더 무거운 동위원소 이성질체가 질량이 증가함에 따라 신속하게 이탈됨을 나타낸다. 이는 주로 비라벨링된 글루코오스의 존재 및 높은 속도의 트랜스케톨라아제- 및 트랜스알돌라아제-촉매된 교환의 결과이며, 이는 글루코오스 대사 및 CO2 고정이 광혼용영양적 성장 조건하에서 탄소 대사에 현저하게 기여한다는 해석을 지지한다.
13 C-글루코오스로의 광종속영양적으로 성장한 배양물의 라벨링. 시네스코시스티스가 광종속영양적 조건하에서 (즉, 글루코오스와 같은 고정돤 탄소 공급원과 함께 PS II 억제제 아트라진의 존재하에) 성장하는 경우, 네트 CO2 고정은 무시할 정도이며, NaH13CO3 첨가 2시간 후에도 3PG+2PG 풀은 비라벨링된채 유지되었다 (데이타 미도시됨). 실제로, 도 7에 도시된 바와 같이, 광종속영양적 성장 조건은 13C-글루코오스로 모든 중간체를 신속하게 라벨링시키기 위한 본 연구에서 입증된 세가지 조건중 가장 효과적이었다. 라벨링 20초 후, G6P+F6P 풀의 반 이상은 이미 라벨링되었으며, -광혼용영양적 조건하에서의 상황과는 반대로- 완전히 라벨링된 당 포스페이트가 가장 우세하였다. 광종속영양적 배양에서의 G6P+F6P의 풀 크기는 광혼용영양적으로 성장한 세포에서의 풀 크기와 유사하므로 (표 2), 광종속영양적 조건하에서, 글루코오스는 광혼용영양적 조건하에서 보다 더욱 신속하게 사용되었다. 여기서 모니터링된 모든 시점에서, 완전하게 라벨링된 G6P+F6P가 가장 풍부하였으며, 이는 -광혼용영양적 조건하에서와 반대로- 중추 대사에서 그 밖의 화합물의 당 포스페이트로의 대사 또는 CO2 고정이 거의 발생하지 않음을 나타낸다.
그밖의 성장 조건으로 관찰한 경우, 3PG+2PG 및 PEP는 유사한 라벨링된 패턴을 갖는다. 가장 풍부한 동위원소 이성질체는 완전하게 라벨링된 화합물인 반면, 두개의 라벨링된 C를 갖는 동위원소 이성질체는 또한 특히 1.5-20분 라벨링 시간프레임에서 완전하게 라벨링된 것에 비해 풍부하였다. 3PG+2PG 및 PEP의 라벨링은 G6P+F6P 또는 S7P의 라벨링보다 더욱 느리게 발생하였으며, 이는 트랜스알돌라아제 및 트랜스케톨라아제 반응을 통한 상호교환이 신속하며, 포스포글리세레이트와의 상호교환은 훨씬 느리다는 광혼용영양적 조건하에 이루어진 관찰에 대한 해석을 추가로 보강시켜 준다. 완전하게 라벨링된 3PG, 2PG 또는 PEP는 글리콜첨가분해 또는 펜토오스 포스페이트 경로에 의해 형성될 수 있으나, 단지 두개의 13C 라벨을 수반하는 이들 분자의 형성은 글리콜첨가분해 및 펜토오스 포스페이트 경로 효소가 모두 요구된다. 펜토오스 포스페이트 경로 반응으로부터 유래된 2-5개의 13C-라벨링된 탄소를 갖는 부분적으로 라벨링된 F6P는 글리콜첨가분해를 통해 두개의 13C 라벨링된 탄소를 수반하는 3PG 및 2PG를 생성시킬 수 있다.
광종속영양적 조건하에 13C-글루코오스로의 라벨링 20s 후, 라벨링된 S7P 분자의 합계, 특히, 혼입된 2, 4 또는 7개의 13C 원자를 갖는 분자는 비라벨링된 분자를 초과한다. 하나의 13C가 혼입된 S7P 분자는 실질적으로 존재하지 않는다. 라벨링 시간이 증가함에 따라, 6개의 13C 원자를 갖는 분자의 풀이 증가하는 반면, 더 적은 수의 13C 원자를 갖는 분자의 풀은 시간에 따라 감소하며, 이는 비라벨링된 중간체의 풀의 고갈을 반영한다. 라벨링 60분 후, 대부분의 S7P는 완전하게 라벨링되었으며, 일부는 하나의 비라벨링된 C를 갖는다.
도 5-7에 도시된 결과는 동위원소 이성질체 분포 패턴이 첨가된 동위원소의 특성 및 성장 모드에 의존적임을 보여준다. 동위원소 이성질체 분포 패턴은 각 조건하에서 매우 재현가능하며, 이는 시네코시스티스에서, 중추 당 포스페이트 경로를 통한 대사 흐름이 특정 성장 조건에 따라 매유 규정되어 있음을 나타낸다. 따라서, 중간체의 측정된 농도의 다양성 (표 2)은 동일한 성장 조건하에서 성장한 상이한 시네코시스티스 배양물의 대사 능력에 있어서의 다양성이라기 보다는 추출 효율의 다양성을 반영하는 것으로 보인다.
라벨링 수준. 시간에 따른 중추 대사산물에 혼입된 라벨의 양을 더욱 직접적으로 측정하기 위해, 13C 대 전체 탄소의 양을 시간에 따라 상이한 성장 조건하에서 G6P+F6P, 3PG+2PG, PEP 및 S7P에서 계산하였다. 결과는 표 5에 요약되어 있으며, 이는 세개의 탄소-중간체이 일차 CO2 고정 산물 (3PG)에 보다 가깝기 때문에, G6P+F6P 및 S7P가 라벨로서 13C-글루코오스를 사용하여 광혼용영양적 및 광종속영양적 조건하에서 3PG+2PG 및 PEP 보다 더욱 신속하게 라벨링되는 반면, 중탄산염으로 라벨링할 경우, G6P+S7P에서 보다 3PG+2PG 및 PEP에서 라벨이 더욱 신속하게 나타난다는 상기에서 이루어진 관찰을 더욱 정성적으로 확인시켜 준다. 유사한 라벨링 비는 아마도 신속한 대사 상호연결을 암시한다. 그러나, 라벨링된 글루코오스 대 중탄산염중의 탄소 수를 수정한다 하더라도, 3PG+2PG 및 PEP중의 라벨의 양은 글루코오스로 라벨링한 경우보다 중탄산염으로 라벨링한 경우 더욱 느리게 나타난다. 이는 글루코오스와 중탄산염/CO2 사이의 흡수율 차이, 캘빈-벤슨-바스햄 사이클 대 글루코오스 대사의 동역학 차이, 및/또는 실험이 시작되는 시점에서 비라벨링된 탄소 풀 크기의 차이로 인한 것일 수 있다.
라벨링 시간에 따른 라벨링 비를 도표화할 경우, 라벨링 시작 후 무한 시점에서 각 화합물의 라벨링 비 (즉, 최종 정상 상태에서의 라벨링 비)는 회귀 분석에 의해 외삽될 수 있다 (표 5). 13C-글루코오스가 공급된 광종속영양 배양물에서, 당 포스페이트 및 3-당 포스페이트중의 탄소의 90%가 라벨링되며, 이는 이들 조건하에 서 CO2 고정의 억제와 일맥 상통하는 사항이다: 중추 탄소 대사 경로의 실질적으로 모든 탄소는 글루코오스로부터 유래된다. 그러나, 배양물이 광혼용영양적으로 성장되는 경우, 3PG+2PG 풀에서 전체 탄소량의 반이 라벨링된 글루코오스 또는 중탄산염이 제공되는지의 여부에 상관없이 13C-라벨링되었다 (표 5). 이는 세포가 광혼용영양적 조건하에서 성장하는 경우, 3PG+2PG 및 PEP에서의 탄소의 약 반이 중탄산염으로부터 유래되며, 나머지 반은 글루코오스로부터 유래됨을 나타낸다. 그러나, 광혼용영양적 조건하에서, G6P+F6P 및 S7P는 중탄산염 보다 글루코오스에 의해 더욱 라벨링된다; 이는 아마도 이들 당 포스페이트가 글루코오스로부터 제거된 소수개의 대사 단계에서 존재하는 반면, 3PG는 캘빈-벤슨-바스햄 사이클에 의한 CO2 고정화의 산물이기 때문이다. 임의의 경우에, 표 5에서 각 화합물에 대한 13C-글루코오스 및 13C-중산탄염 라벨링된 분획의 총계는 정상-상태 라벨링에서 90%인 것으로 추정되며, 이는 글루코오스 대사 및 CO2 고정 경로가 광혼용영양적 조건하에서 완전히 보완됨을 나타낸다.
표 5. 13C-글루코오스 (G) 또는 13C-중탄산염 (B)으로 라벨링시 광혼용영양적 (PM) 및 광종속영양적 (PH) 성장 조건하에서 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 역동적 라벨링 비a
Figure 112009030264884-PCT00004
a 라벨링 비는 화합물 (모든 이의 동위원소 이성질체 포함)의 모든 탄소에서 13C 라벨의 총 양의 백분율로서 규정된다. 데이타는 세개의 독립적인 실험의 평균이다.
b 컬럼 라벨링된 최종값은 정상 상태에서의 라벨링 비를 나타내며, "무한" 시점에서 본 표의 데이타로부터 라벨링 비로의 외삽된 것이다.
이는 라벨링된 탄소 공급원의 첨가 후 시간에 따라 13C-라벨링된 대사 중간체의 역동적 분포를 모니터링하는, 시네코시스티스에서 중추 대사 흐름의 분석에 대한 신규한 접근법을 제공한다. 시네코시스티스에서, 중간체의 라벨링 패턴은 20s-1.5분에서 현저하게 변화되었기 때문에, 중추 대사 경로를 통한 흐름은 중간체의 풀 크기에 비해 신속하였다.
13C 글루코오스가 배양물에 첨가되는 경우, 이는 세포에 의해 용이하게 흡수되고 포스포릴화된다. G6P+F6P 풀로부터, 분자는 펜토오스 경로 또는 글리콜첨가분해에 사용될 수 있거나, 트랜스알돌라아제 및 트랜스케톨라아제 반응을 통해 다른 당 포스페이스로 전환될 수 있다. 균일하게 라벨링된 13C-글루코오스로 광혼용영양적 또는 광종속영양적 배양물을 라벨링한 경우 (도 5 및 7), 예측하지 못했던 특징 중 하나는 부분 라벨링된 G6P+F6P 분자의 신속한 형성이며, 이는 라벨의 신속한 스크램블링 및 이로 인한, 다양한 수의 탄소 원자를 갖는 분자의 부분적으로 라벨링된 풀과 G6P+F6P 플 사이의 상호전환을 나타낸다. G6P+F6P 풀에서의 라벨의 스크램블링은 S7P의 스크램블링과 유사하며, 이는 직접적인 또는 간접적인 그러나, 현저하게 급속한 당 포스페이트의 이러한 두 유형 사이의 상호작용을 시사한다. 이러한 방식의 급속한 스크램블링은 다양할 수 잇으며, 각각의 동위원소 이성질체는 반응의 조합을 통해 형성된다. 라벨링 패턴의 더욱 상세한 분석은 상이한 성장 조건하에서의 일반적 대사 흐름을 드러낼 수 있다. 특히, F6P와 관련된 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제 반응은 동위원소 이성질체의 신속한 스크램블링에 주요 역할을 수행한다. 트랜스알돌라아제 반응 비 (F6P+E4P 대 S7P+GAP 및 그 반대)는 트랜스케톨라아제 반응 비 만큼 높은 것으로 보이지 않는데, 그 이유는 광혼 용영양적 조건하에서 13C-글루코오스의 첨가후 20s에 3 또는 7개의 라벨링된 탄소를 갖는 S7P가 우세하게 존재하지 않기 때문이다 (도 5). 게다가, 라벨링 20s 후 5개의 13C를 갖는 S7P 동위원소 이성질체가 낮으나, 두개의 13C를 갖는 것은 높다는 점은 Ru5P로부터 R5P로의 흐름이 상대적으로 낮으며; 반대로, Ru5P와 X5P 간의 흐름이 더욱 신속하여 캘빈 캘빈-벤슨-바스햄 사이클 및 펜토오스 포스페이트 경로의 자유로움 흐름을 보장한다.
G6P+F6P의 광종속영양적 라벨링 패턴에서, 라벨링 후 모든 시점에서 가장 풍부한 동위원소 이성질체는 질량+6이며, 이는 이들 성장 조건하에서의 신속한 글루코오스 흐름과 일관된다. 광혼용영양적 조건에서와 같이, G6P+F6P의 질량+2 및 질량+4의 신속한 라벨링은 반응 16이 발생하며 가역적임을 나타낸다. 광혼용영양적 조건하에서의 성장과 비교하여, 5개의 라벨링된 C를 갖는 G6P+F6P 동위원소 이성질체는 20s 후에 풍부하며, 하나의 라벨링된 C를 갖는 것은 그렇지 않았다. 이러한 차이는 아미도 E4P가 광종속영양적 조건하에서 용이하게 라벨링되기 때문인 것으로 여겨지며, 이는 더 작은 E4P 풀 또는 글루코오스로부터 기원된 탄소와의 더욱 신속한 교환을 암시할 수 있다. 3개의 라벨링된 탄소를 갖는 G6P+F6P 동위원소 이성질체는 대부분 비라벨링된 GAP로의 트랜스알돌라아제 반응 (반응 15) 후 라벨링된 S7P로부터 기원되었다.
S7P 풀. 두개 이상의 13C을 수반하는 완전하게 라벨링된 R5P 및 X5P로부터 기원된 완전하게 라벨링된 S7P 동위원소 이성질체는 라벨링된 3PG+2PG에서의 발생 훨씬 전에 광종속영양적 조건하에서 성장한 세포에서의 라벨링 개시 후 20s에 현저한 양으로 이미 존재하며, 이는 S7P의 다운스트림에서의 속도 제한 단계를 나타낸다. 아마도 비라벨링된 R5P와 라벨링된 X5P의 반응 (반응 14)에 의해 형성된 두개의 라벨링된 탄소를 갖는 S7P 동위원소 이성질체는 단지 일시적이며, 라벨링 개시 후 1.5분에 실질적으로 나타났으며 (도 7), 이는 당 포스페이트 풀이 신속하게 라벨링됨을 나타낸다. 시간에 따른 그 밖의 부분적으로 라벨링된 S7P 동위원소 이성질체 풀 (예를 들어, 4 또는 5개의 13C를 갖는 동위원소 이성질체)의 소멸은 이를 추가적으로 입증한다.
3PG+2PG 및 PEP 풀. 13C-글루코오스를 갖는, 3PG+2PG 피크에서의 라벨의 양은 세포가 광혼용영양적 조건 또는 광종속영양적 조건하에서 성장하는지의 여부에 상관없이 1.5분 시점까지는 매우 적게 유지된다 (표 5). 시네코시스티스에서, GAP 풀은 작으며 (도 1B), 3PG+2PG 및 PEP 풀에서 라벨 도달의 지연은 GAP로부터 3PG로의 흐름이 당 포스페이트중의 흐름과 관련하여 느리다는 것을 시사한다.
시네코시스티스에서, 두개의 GAP 탈수소효소가 존재하며, 하나 (GAP-1)는 전방향 반응 (GAP에서 디포스포글리세레이트로)을 다른 하나 (GAP-2)는 후방향 반응 (디포스포글리세레이트에서 GAP로)을 명백히 촉매한다 (Koksharova et al., 1998). GAP-1을 코딩하는 유전자의 발현은 약하며(Figge et al., 2000), 따라서, 이러한 단계는 당 포스페이트 풀로부터의 탄소의 손실을 최소화하도록 속도 제한될 수 있다. 실제로 GAP-1이 속도 제한되는 경우, 펜토오스 포스페이트 경로 및 글리콜첨 가분해 둘 모두가 이러한 단계를 이용하기 때문에, 이들 경로중 어느 것이 시아노박테리아에서 당 대사에 가장 중요한가라는 질문 (Yang et al., 2002a)은 중요하지 않게 될 수 있다. 당 포스페이트 대사 네트워크의 조절에서 GAP 탈수소효소의 중요성은 또한 기타 광합성 시스템에서 보고되었다 (Ihlenfeldt and Gibson, 1975; Tamoi et al., 2005; Wedel and Soil, 1998).
광혼용영양적 조건하에서, 탄소 고정 (GAP-1이 관련되지 않음)을 통한 3PG의 형성은 주요 경로인 것으로 여겨진다. 이는 RuBisCO 활성 이 자체가 시아노박테리아에서 광합성 흐름의 주요 지체 요인이 아니라는 개념과 일치한다 (Marcus et al., 2005). 도 6 및 표 5에 도시된 바와 같이, 광혼용영양적 조건하에서 라벨링된 중산탄염으로의 3PG+2PG 및 PEP 풀의 라벨링이 당 포스페이트 풀 보다 훨씬 많으며, 이는 3PG로부터 PEP로의 흐름이 매우 신속하며, 글루코오스신생합성으로부터의 G6P+F6P 풀의 흐름이 글루코오스로부터의 흐름과 비교하여 우세하지 않음을 나타낸다. 높은 라벨링 비는 또한, 캘빈-벤슨-바스햄 사이클이 고정된 CO2를 재순환시키는데 잇어서 배우 신속함을 시사한다. CO2는 3PG+PEP 풀에 대한 탄소 공급원의 약 반을 제공하기 때문에 (표 5), 캘빈-벤슨-바스햄 사이클에 의한 생성된 3PG의 2/3는 F6P를 포함하는 당 포스페이트로 다시 돌아가야 한다. 광혼용영양적 조건하에서, GAP-2에 대한 mRNA 및 단백질 발현 수준은 시네코시스티스에서의 광혼용영양적 조건하에서 보다 약 2배 증가되었다 (Yang et al, 2002b). 반응 16 (GAP+S7P 내지 F6P+E4P)은 또한, 소모된 S7P가 새로 공급됨과 동시에 글루코오스신생합성 및 글루코오스 사용으로부터의 유입 이외에 G6P+F6P의 재생과 관련있다. 이는 RuBP 재생 동안, 주요 탄소 흐름이 3PG로부터 GAP, X5P, Ru5P 및 RuBP으로 흐르며, 이들 중간체 풀이 탄수화물 대사 네트워크의 특성으로 인한 화학 반응 배리어에 의해 다른 중간체 예컨대, G6P+F6P, E4P 및 S7P로부터 비교적 분리되어 있음이 흥미로웠다.
글리콜첨가분해 및 펜토오스 포스페이트 경로. 수개의 논문에 의해 광혼용영양적 조건하에서, 대부분의 G6P가 펜토오스 포스페이트 경로를 통해 이용되며 (6-포스포글루코네이트의 탈카르복실화를 포함), 글리콜첨가분해를 통해서는 거의 대사되지 않음을 시사하고 있다 (예를 들어, 문헌 [Pelroy et al, 1972; Yang et al, 2002a]). 실제로, S7P는 광혼용적 조건하에서 매우 신속하게 라벨링되며 (FIG. 7), 이는 모든 당 포스페이트 풀 (E4P, X5P, 등을 포함)이 신속하게 라벨링되며, 이는 활성 펜토오스 포스페이트 사이클과 일관된다. 완전한 S7P 라벨링은 광혼용영양적 조건하에서 관찰되지 않으며 (FIG. 5), 이는 현저한 비라벨링된 당 포스페이트 풀 및 아마도 G6P의 포스포글루코네이트로의 더 적은 전환을 나타낸다. 그러나, 시네코시스티스에서, 노웰 및 플락스톤 (Knowles and Plaxton) (Knowles and Plaxton, 2003)은 광혼용영양적 성장 대 광종속영양적 성장에서 변화되지 않은채 유지되는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PDH) (및 또한, 포스포프룩토키나아제)의 활성은 대부분의 글리콜첨가분해 및 펜토오스 포스페이트 경로 반응이 주로 기질 수준에서 조절됨을 시사한다고 보고하고 있다. 그러나, G6P/F6P 분포 (데이타 미도시됨) 뿐만 아니라 G6P+F6P 풀 (표 1)은 두 성장 조건하에서 크게 변 화되지 않았다. 또한, 글루코오스의 존재하에 암실에서, G6PDH 활성은 10배 넘게 증가된 것으로 보고되었으며 (Kurian et al, 2006), G6PDH는 세포 비함유 추출물중의 RuBP 및 NADPH에 의해 크게 억제되는 것으로 보고되었다 (Pelroy et al, 1972; Pelroy et al, 1976). 따라서, 적어도 광종속영양적 조건하에서 펜토오스 포스페이트 경로를 통한 흐름이 중요하는 것이 자명하며, 이는 상기 관찰과도 일관된다.
광혼용영양적 조건하에서, 13C 글루코오스에 의한 하나의 탄소 라벨링된 G6P+F6P의 피크는 상기 조건하에서, 3PG+2PG 풀이 신속하게 라벨링되지 않기 대문에 이러한 흐름이 매우 적을 수 있음에도 불구하고 여전히 작용적이다. 그러나, 일부 연구 (Shasri and Morgan, 2005; Yang et al., 2002a)에서, 이러한 흐름이 무시되었다. 성장 조건, 주로 광도 및 유기 탄소 공급원에서의 차이에도 불구하고, 이들의 불일치는 이들 데이타의 해석에 의해 초래된 것으로 여겨졌다. 펜토오스 포스페이트 경로 및 캘빈-벤슨-바스햄 사이클이 주료 역 공정이지만, 혼용영양적 조건하에서 캘빈-벤슨-바스햄 사이클의 우세성은 G6PDH가 여전히 작용성을 띠는 것을 불가능하게 하였다. 종래의 것 (Yang et al., 2002a)과 비교되는 본 발명자들의 흐름 맵의 또 다른 주요 차이는 본 발명자들의 구성된 대사 네트워크에서, DHAP, GAP 및 3PG+2PG 풀은 중추 대사 네트뤄크에서 이들의 역할 및 13C 라벨링 측정에서의 구별되는 성향으로 인해 각각 고찰된다. C13 중탄산염에 의한 3PG+2PG의 라벨링 패턴에 기초하여, 광혼용영양적 조건하에서, 재순화된 3PG로부터의 G6P+F6P의 재생이 요구되었다.
본원에 제시된 결과는 시간에 걸쳐 안정한 동위원소 라벨링의 직접적인 검출이 화합물간의 대사 연결 및 비를 결정하는 직접적인 방법을 제공함을 나타낸다. 현재 이러한 작업은 첫 단계에 있으며, 화합물의 모델링 및 더욱 민감한 검출이 더욱 상세한 분석을 도울 것이다. 추가적인 라벨링 적용으로, 더욱 민감한 대사 검출 및 돌연변이 검출과의 조합, 심지어 생체내에서 더욱 상세한 대사 흐름 분석이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 완전하게 이해되지 않은 대사 네트워크를 갖는 미생물을 사용하더라도, 이들의 대사 흐름의 직접적이고 신속한 측정을 위한 특이적인 고정된-탄소 화합물을 용이하게 흡수하는 미생물에 용이하게 적용될 수 있다.
표 6. 광종속영양적으로 성장한 시네코시스티스 sp. PCC 6803에서 13C-글루코오스 라벨링시 헥소오스-6-포스페이트 (G6P+F6P), 포스포글리세레이트 (3PG+2PG), 포스포에놀피루베이트 (PEP), 및 세도헵툴로오스-7-포스페이트 (S7P)의 역동적인 동위원소 이성질체 분포a
Figure 112009030264884-PCT00005
a 데이타는 3개의 독립적인 실험의 평균이다.
b ID, 동위원소 이성질체 분포: 화합물의 전체 양에 대한 동위원소 이성질체의 백분율. SD, 표준 편차
accABCD 과다발현과 관련하여
증가된 지질 생합성에 대한 대사 조작의 첫 단계는 아세틸-CoA 카르복실라아 제 효소 AccABCD의 성분을 과다발현시키는 것이다. 시네코시스티스 sp. PCC 6803으로부터의 accA, accB, accC, 및 accD 유전자의 코딩 영역은 PCR-증폭되며 (FIG. 12), 시네코시스티스 게놈에서 이들 유전자의 예정된 발현을 위한 플라스미드는 도 13에 나타내었다.
실시예 3
PHB (바이오플라스틱) 함량을 증가시키기 위한 변형된 시아노박테리아
1. 재료 및 방법
박테리아 균주 및 배양 조건: 시네코시스티스 sp. PCC 6803중의 PHB 합성의 생리학적 역할을 이해하기 위해, 현저하게 상이한 PHB 함량을 유도하는 변형된 대사 경로의 일련의 변이체를 다양한 배양 조건하에서 비교하였다. 세개의 말단 옥시다아제가 결여된 변이체 (시토크롬 aa3-형 시토크롬 c 옥시다아제 (CtaI), 유력한 시토크롬 bo-형 퀴놀 옥시다아제 (CtaII) 및 시토크롬 bd-형의 퀴놀 옥시다아제 (Cyd))가 기술되었다 (Howitt et ah, 1998). 광합성 산소 전개 및 호흡성 산소 소모 둘 모두가 결여된 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체가 포스포시스템 II의 CP47 단백질을 엔코딩하는 psbB의 추가적인 결실에 의해 후에 성립되었다 (Howitt et ah, 2001). 닥터 마이클 구레비츠 (Dr. Michael Gurevitz) (Tel-Aviv University, Israel)로부터의 시아노루브럼 (CyanoRuburm)은 유기 시아노박테리아 RuBisCO 유전자가 혐기성 광합성을 수행하는 유기체인 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum)으로부터의 상응하는 유전자로 대체된 변이체이다 (Amichay et al., 1992). R. 루브럼 RuBisCO가 카르복실화 활성에 비해 비교적 높은 산화 활성을 갖기 때문에, 변이체는 증가된 CO2 농도하에서만 성장할 수 있다. 닥터, 테루오 오가와 (formerly at the University of Nagoya, Japan)로부터의 타입 I NADPH-선호 탈수소효소 (NDH-1)이 결여된 ndhB- 균주에는 또한, 손상된 Ci 이송으로 인한 성장을 위해 CO2가 풍부한 공기가 유구된다 (Ogawa, 1991). NADH-산화 타입 II 탈수소효소 (NDH-2)가 결여된 균주는 시네코시스티스 sp. PCC 6803에서 밝혀진 3개의 상응하는 유전자 (ndbA, ndbB, 및 ndbC)의 결실에 의해 작제되었다 (Howitt et al, 1999).
시네코시스티스 sp. PCC 6803 야생형, 말단 옥시다아제-비함유, PS II-비함유/옥시다아제-비함유 및 NHD-2-비함유 변이체를 BG-11에서 성장시키고, 30℃에서 공기로 버블링시켰다; 시아노루브럼 및 NDH-1-비함유 균주를 2% CO2가 풍부한 공기로 버블링시켰다. 10 mM TES-NaOH (pH 8.0)를 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 배양물에 첨가하는 것을 제외하고는, BG-11 배지를 5mM TES [N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노에탄설폰산]-NaOH (pH 8.0)로 완충시켰다. PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체는 광독립적으로 성장하는 능력을 손실하였기 때문에, 여기에는 모든 조건하에서 배지에 5mM 글루코오스를 제공하였다. 기술한 바와 같이, BG-11로부터 NaNO3를 제거하고, 10mM NH4C1 ("N-환원된")로 대체하였다. 질소- 또는 인-고갈된 배양물은 정상 BG-11 배지에 성장시킨 펠렛팅된 세포를 세척하고 NaNO3 또는 K2HPO4가 각각 생략된 BG-11 배지로 옮김으로써 수득하였다. 질소- 또는 인-제 한된 조건하에서, 배지중의 각각의 공급원을 원래 농도의 10%로 저하시켰다. 나타난 바와 같이, 글루타메이트 합성효소 (또한, 글루타메이스 합성효소-글루타민 (아미드)2-옥소글루타레이트 아미노트랜스퍼라아제 (GOGAT)로 공지됨)의 특정 억제제인 6-디아조-5-옥소-L-노르류신 (DON)을 0.5mM의 최종 농도로 BG-11 배지에 첨가하였다.
플레이트상에서 성장시키기 위해, 1.5% (w/v) 아가 및 0.3% (w/v) 나트륨 트리설페이트를 첨가하고, BG-II에 항생제를 보충하였으며, 특정 균주는 유전자 불활성화로 유입된 항생제 내성 마커의 존재로 인해 이러한 항생제에 대해 내성이 있다. 농도는 다음과 같다: 20 μg의 제오신 ml-1, 25 μg의 카나마이신 ml-1, 25 μg의 에리트로마이신 ml-1, 25 μg의 스펙티노마이신 ml-1 및/또는 14 μg의 클로르암페니콜 ml-1.
다르게 언급되어 있지 않는 한, 균주를 50μmol 광자 m-2s-1의 광도에서 광독립적으로 성장시켰다. 쉬마드주 UV-160 분광광도계로 730nm에서 배양물의 최적 밀도를 측정함으로써 모니터링하였다. 중간-대수증식기상 배양물을 OD730 ~0.5에서 획득하였다; 정지상 배양물을 성장 7일 후에 채집하였다.
광학 및 전자 현미경 : 광학 현미경에 의해 PHB 과립을 관찰하기 위해, 옥사진 염료 나일 블루 A (Nile blue A)의 필터 멸균된 1% 수용액 50㎕를 2ml의 시네코시스티스 배양물 분취물에 첨가하고, 세포를 관찰전에 표준 조건하에서 12h 동안 성장시켰다. 그 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛팅시키고, BG-11 배지로 2회 세척하였다. 세포를 1% (w/v) BG-11 아가의 얇은 층으로 현미경 슬라이드상에 고정시키고, 커버 슬립으로 바로 덮었다. 슬라이드를 제이스 형광현미경 (Zeiss epifluorescence microscope) (Axioskop) 또는 레이카 TCS SP2 멀티포톤 공초점 레이저 주사 현미경 (Leica TCS SP2 multi-photon confocal laser scanning microscope) 하에 시험하였으며, 이는 488nm에서 여기되고, 560nm 내지 620nm에서 형광 방출이 검출된다. 염색 후 미분간섭대비 (DIC) 모드 또는 형광 모드에서의 세포 형태를 모니터링하였다 (여기 필터: BP 450-490. 빔 필터: FT 510. 배리어 필터: BP 515-565). 투과전자현미경을 본질적으로 종래 기술된 바와 같이 수행하였다 (Mohamed et al., 2005). 세포를 발저 고압 냉동기 (Balzers high-pressure freezer)를 사용하여 크리오고정(cryofixed)시켰다. 냉동-치환은 8시간 동안 아세톤중의 1% OsO4로의 추가 고정으로 아세톤중의 1% 글루타르알데히드 및 2% 탄닌산을 사용하여 -85℃에서 48-72시간에 걸쳐 수행하였다. 세포를 스푸르 수지 (Spurrs resin)에 함침시키고, 70nm 두께의 단편으로 절단하였다; 그 후, 이들 단편을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 후속 염색하였다. 세포를 필립스 CM12 스캐닝-투과 전자 현미경을 사용하여 80kV에서 관찰하였다.
PHA 분석 및 정량화: 상이한 균주의 세포네 PHA 함량을 가스 크로마토그래피 - 질량 분광계 (GC/MS)에 의해 분석하였다. OD730 = 0.5 (대수증식기를 대표함) 또는 OD730 > 1.0 (정지기를 대표함; 7일 동안 배양됨)에서의 세포 배양물 (200- 400ml)를 원심분리 (10 min, 3,200 x g, 4℃) 또는 1μm 포어 크기 막을 통한 여과에 의해 수집하고, 세포를 물로 2회 세척하였다. 생성된 펠렛을 액체 질소중에 냉동시키고, -80℃에서 저장하고, 24시간 이상 동안 동결건조시켰다. 그 후, 세포를 105℃에서 4h 동안 건조시켰다. 건조 세포 (10-30 mg)를 분쇄 사이에 얼음위에서 30s 동안 인큐베이션하면서, 1.5ml 클로로포름 중의 미니-비드비터 (Mini-BeadBeaterTM) (Biospec Products, Bartlesville, OK) (3 x 60s)로 분쇄하였다. 1ml 분취물을 취하고, 메탄올첨가분해를 위해 1ml의 산성화된 메탄올 (20% HCl v/v)과 혼합하였다. 샘플 및 PHB 표준 (0.1-10 mg/ml)를 테플론 라이닝된 캡이 구비된 15ml 피렉스 테스트 튜브 (Pyrex test tube)중에서 95℃에서 2.5h 동안 가열하였다. 후속하여, 샘플을 5분 동안 얼음상에서의 인큐베이션에 의해 냉동시켰다. 0.5ml의 더욱 농축된 클로로포름 상을 0.5ml H2O를 함유하는 또 다른 10ml 피렉스 튜브에 옮김으로써 추가의 정제를 달성하였다. 3분 동안 심하게 교반하고 원심분리 (1,500 x g, 3 min)한 후, PHB 메틸 에스테르를 함유하는 2μl의 클로로포름상을 분석을 위해 GC 칼럼에 주입하였다.
GC/MS 분석을 DB-5 MS 칼럼 (30m x 0.25㎛의 내부 직경, 0.25㎛ 필름 두께)이 구비된 쉬마드주 17-A 가스 크로마토그래피 및 데이타 프로세서에 연결된 (GCMSsolutions software; Shimadzu, Japan) 쉬마드주 QP5000 질량 분광계에서 수행하였다. 200℃에서, 캐리어 가스로서 헬륨을 사용하여 선형 점도는 20 내지 30 cm/s이었다. 주입 포트의 온도는 210℃이며, 계면 온도는 250℃로 설정하였다. 하기 GC 오븐 온도 프로필을 이용하였다: 60℃에서 1분 후, 8 ℃/분으로 160℃까지 증가시키고, 5분 동안 160℃에서 등온 가열시키고, 200℃에서 4분 동안 후속-진행시켰다. 평형 시간은 60℃에서 2분이었다. 더 높은 질량화 정밀도를 위한 전체 이온 스캠 모드에서의 각 검출 후, 단일 이온 모니터링 (The Single Ion Monitoring) (SIM) 모드를 사용하였다.
니코틴아미드 누클레오티드 분석 : 두개의 독립적인 방법을 각 균주중의 니코틴아미드 누클레오티드 수준을 분석하는데 적합하게 하였다. 먼저, 환원된 수준의 NAD 및 NADP를 문헌 [Zhnag et al., 2000]에서의 방법으로부터 변형된 효소 반응 방법에 의해 분광광도에 의해 측정하였다. 약 400-500ml의 액체 배양물을 4℃에서의 원심분리에 의해 채집하였다. 펠렛을 H2O로 2회 세척하고, 0.1M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.01 M EDTA, 및 0.05% (v/v) 트리톤 X-100을 함유하는 1ml 추출 완충제중에 재현탁시켰다. 유리 비드 부피의 약 반 (70-100 μm 직경)을 첨가하고, 세포를 미니-비드비터 (Mini-BeadBeaterTM) (4 x 30 s, 교반 사이에 얼음위에서 1분 인큐베이션함)를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄 후, 모든 단계를 암실에서 수행하여 피리딘 누클레오티드의 광분해를 방지하였다. 혼합물을 에펜도르프 미세원심분리기 (Eppendorf microcentrifuge)에서 3분 동안 14,000 rpm에서 스피닝하고, 상청액을 새로운 튜브에 옮겼다. 상청액을 이 부피의 반의 클로로포름으로 2회 추출하여 액체 및 대부분의 단백질을 제거하였다. 하기와 같은 4개의 상이한 조건하에서 340nm에서의 흡광도를 해석하였다. 20㎕ 추출물을 원래 추출 완충제에 최종 1ml가 되도록 첨가하여 총 (NADPH + NADH) 수준을 결정하였다 (A1). 또 다른 20㎕의 추출물을 0.1M 트리스-HCl (pH 8.0), 0.01 M MgCl2, 0.05% (v/v) 트리톤 X-100, 5 mM 글루코오스-6-포스페이트, 및 5.0 IU NADP-특이적 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 (G6PD; Sigma Chemical Co., G-4134)를 함유하는 1ml의 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션함으로써, 샘플중의 모든 NADP+를 NADPH로 전환시켰다 (A2). 제 3 분취량의 20㎕의 추출물을 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 7.6), 0.05% (v/v) 트리톤 X-100, 5 mM 글루타티온 (GSSG) 및 5.0 IU 글루타티온 환원효소 (GR; Sigma)를 함유하는 반응 혼합물중에서 25℃에서 5분 동안 인큐베이션하여, 모든 NADPH를 NADP+로 전환시켰다 (A3). 0.1 M 트리스-HCl, pH 8.0, 1% (w/v) 소태 혈청 알부민, 7% 에탄올, 5.0 IU NAD-특이적 알코올 탈수소효소의 1ml 혼합물중의 20㎕ 추출물을 25℃에서 5분 동안 반응시켜 (A4) NAD+를 NADH로 전환시킨 후 네번째 해독을 수행하였다. 모든 반응 혼합물을 추출물을 첨가하기 5분 전에 상응하는 온도에서 사전인큐베이션하였다. A1-A3는 샘플중의 NADPH의 총 양을 나타낸다; A2-A1은 NADP+의 총 양을 나타낸다; A3는 NDAH의 총 양을 나타낸다; A4-A1은 NAD+의 총 양을 나타낸다. NAD(P)H의 몰 흡광곁수는 6.3 x 103 cm-1이다 (Bergmeyer, 1975).
유도체화 후 NADP-NADPH 및 NAD-NADH를 추출하고 검출하기 위한 클라이드만 (Klaidman) (1995) 등의 방법으로부터 변형된 형광-기재 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 방법이 이미 기술되어 있다 (Cooley et al., 2001). 먼저, 1리터의 세포 (OD73O = 0.5)을 펠렛팅시키고, 0.06 mM KOH, 0.2 mM KCN, 및 1 mM 바토펜안트롤린디설폰산을 함유하는 1ml 혼합물중에 재현탁시켰다. 이 용액에서, NAD 및 NADP의 산화된 형태를 CN으로 유도하고, 환원된 형태의 효율과 거의 동일한 효율로 형광 (330nm에서 여기시 460nm에서 방출)에 의한 가시성의 산화된 형태를 제조하였다 (Klaidman et ah, 1995). 유리 비드를 1.5ml의 전체 부피에 첨가하고, 세포를 하기 기술된 바와 같이 분쇄하였다. 샘플을 에펜도르프 5415 미세원신분리기에서 5분 동안 14,000 rpm에서 스피닝시키고, 상청액을 0.5부피의 클로로포름으로 추출하여 지질 제거를 확실히 하였다. 샘플을 로딩 전에 0.45-μm-포어-크기 원심분리기 스핀 필터를 통해 스피닝하였다. 산화된 형태 및 환원된 형태의 NAD 및 NADP의 농도 및 비를 애질런트 1100 형광 검출기 및 수펠코 수펠코실 (Supelco Supelcosil) 5㎛ C18 칼럼 (누클레오티드의 효과적인 분리를 위해 고안된 4.6- x 250-nm 분석 칼럼)이 구비된 HP1100 LC를 사용하는 형광 검출하면서 HPLC에 의해 모니터링하였다.
2. 결과
PHA 과립의 가시적 확인 : 위상차 광학 현미경 (phase constrast light microscopy)으로의 PHA 과립의 직접적인 관찰이 박테리아에서 PHA에 대한 가시적 스크리닝 방법으로서 보통 이용된다 (McCool et ah, 1999). 그러나, 이러한 방법은 시아노피신 및 폴리포스페이트와 같은 봉입체 및 틸라코이드 막의 존재로 인해 시아노박테리아에는 적용할 수 없다. PHA 과립의 가시성을 향상시키기 위해, 세포 를 친지성 옥사진 염료 나일 블루 A로 염색하였다. 염료의 옥사존 형태인 나일 핑크는 수용액중의 나일 블루 A의 자연적 산화에 의해 형성된다. 전형적으로, 나일 블루 염색은 세포를 치사시키는 세포의 슬라이드로의 열 고정화 및 비교적 고농도의 염료로의 염색을 포함한다 (Ostle et ah, 1982). 그러나, 시아노박테리아에서, 이러한 처리는 염료의 존재로 인해 높은 배경 형광을 초래한다. 대신, 생 시아노박테리아 세포를 수용액중의 0.04% (w/v; 최종 농도) 나일 블루 A를 초기 지수상의 2ml 배양 분취물중에 첨가하여 염색시키고, 샘플링 전에 추가로 12시간 동안 배양물을 성장시켰다. 대조군 실험에 의해 염료의 0.25% (w/v) 이하는 세포 성장 속도 또는 최대 세포 밀도에 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다 (데이타 미도시). 현미경 슬라이드상에 아가-함침된 세포는 나일 블루/나일 레드 형광 수율에서의 많은 감소 없이 3 내지 4시간 이상 동안 이들 조건하에서 생존할 수 있다.
여기시, PHA 과립은 시네코시스티스 세포의 적색 자동-형광 배경에서 밝은 오렌지색 스팟으로서 가시화되었다 (도 9). 정상적인 BG-11 배지중의 영양분-균형 조건하에서, 소수개의 PHB 과립이 정지기 말기까지 시아노루브럼 또는 NDH-2-비함유 균주 (미도시됨)의 세포 또는 야생형 세포 (도 9A)로 검출되었다. 그러나, BG-11 배지중의 지수 성장기 동안에도 다중 과립이 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 (도 9D), 옥시다아제-비함유 (도 9E) 및 NDH-1-비함유 변이체 (도 9F)의 세포로 관찰되었다. 질소 공급원이 원래 농도의 10%로 저하된 질소-제한된 배지로 이동시킬 경우, 야생형은 거의 즉시 PHA를 축적하기 시작하였으며, 세포당 평균 약 4개의 과립이 정지기에 위치하는 것으로 관찰될 수 있다 (도 9B). 감소된 질소 공급원 예 컨대, 염화 암모늄이 질산염을 대체하여 성장 배지에 공급된 경우, 광독립영양적으로 성장한 야생형은 지수 성장기 동안에 PHA를 축적하였다 (도 9C). 질산염을 암모늄으로 대체시킨 후, 배양물은 정상 속도로 성장하였으며, 이의 정상적인 형태를 유지하였다.
상기 단락에 나타난 결과는 환원된 고정된-질소 공급원이 가능하게는, 질산염 환원에 사용된 NADH/NADPH에 대한 감소된 요구로 인해 PHA 축적을 유도함을 시사한다. 그러나, 대안적으로는, 이 자체의 낮은 질소 이용도가 PHA 축적을 유도하는 것으로 해석될 수 있다: 16.7mM 질산염은 10mM 암모늄에 의해 대체되는데, 더 높은 암모늄 농도는 독성을 띤다. 이러한 가용도 (possibility)를 시험하기 위해, 0.5mM (최종 농도)의 글루타메이트 합성효소의 특정 억제제인 DON을 BG-11 배지중의 지수적으로 성장한 야생형 배양물에 첨가하였다. 질소 흡수가 배양물의 색이 청색-녹색으로부터 황색-갈색으로 신속하게 변화되는 것을 차단하며, 이는 피코빌린 단백질의 분해를 반영한다. 그러나, DON의 존재 및 부재하에 야생형중에 발견된 PHA 과립의 수는 세포 당 하나 또는 그 미만으로 매우 유사하였다 (데이타 미도시). 따라서, 질소 축적 자체의 결여는 PHA 축적을 유도하지 않는다.
전자 현미경: 나일 블루 A-염색된 형광 과립이 실제로 PHA 과립과 유사한 봉입체에 상응함을 입증하기 위해, 전자 현미경을 대수증식기 야생형 시네코시스티스 sp. PCC 6803에서 수행하였으며, 이는 표준 BG-11에서 성장하였으며, 매우 소수의 형광 과립을 나타내었으며, N-제한 후 야생형 및 두개의 다른 균주 (옥시다아제-비함유 및 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체)상에서도 매우 수소의 형광 과 립을 나타내었다 (도 10). 후자의 3개의 경우에서, 증가된 수준의 나일 블루 염색 과립이 관찰되었다. 실제로, 투과 전자 현미경 (70nm)에 대한 슬라이스 두께가 세포 (600-800nm)에 걸쳐 z 축에 따라 형광 초점 장 (focal field)의 돌출부 미만임을 고려하여, 세포내의 개방 공간의 수에 매우 상응한다. PHA 과립은 일반적으로 전자 형미경에서 전자-투명 봉입체로서 가시화되며 (Ballard et al., 1987), 아마도 PHA가 샘플 제조 동안 세척 제거되기 때문이다. 다수의 절편의 조사는 정상 조건하에서 성장한 야생형에서, 절편화된 세포의 단지 약 20%가 이러한 과립을 함유하며, 각 절편화된 세포에서 수는 3 이하이다 (표 7). 그러나, PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체에서, 대부분의 절편화된 세포는 하나 이상의 과립을 함유하였으며, 과립 크기는 정상 조건하에서 성장한 야생형에서의 크기 (약 75nm 직경)와 비교하여 훨씬 컸다 (평균 145nm 직경). 절편 두께를 초과하는 직경을 갖는 과립에 있어서, 과립 직경은 과립이 샘플 제조 동안 어떻게 절단되는지에 따라 과소평가될 수 있다. 질소-제한된 야생형 세포에서, 틸라코이드 구조는 덜 구조화되며 (도 10D), 세포당 과립의 평균 수는 그 10배의 범위까지 증가되었다. 도 10C 및 D에 도시된 바와 같이, 시네코시스티스에서, 과립은 일반적으로 틸라코이드 또는 세포질 막과 관련된 것으로 밝혀지지 않았으며, 이는 PHB 과립이 틸라코이드 막과 매우 밀접하거나 이에 의해 둘러쌓여지는 것으로 공지되어 있는 시네코코커스 MA19에서의 상황 또는 때때로 과립이 세포질 막과 밀접하게 관련된 것으로 밝혀진 글리코겐 생합성에서 시노코시스티스 변이체 결함에서와는 상반되는 것이다.
표 7. 시네코시스티스 균주의 전자 현미경 얇은 (70nm) 절편에서 발견된 PHA 과립의 평균 수 및 직경
균주 성장 조건 과립 수a 직경 (nm)b
야생형 BG-11 0.4 75±26
야생형 N-제한 3.8 85±21
옥시다아제-비함유 BG-11 2.3 100±34
옥시다아제-비함유 N-제한 3.1 95±28
PS II-비함유/옥시다아제 비함유 BG-11+글루코오스 1.5 145±54
시아노루브럼 BG-11 1.7 105±44
NDH-1-비함유 BG-11 1.4 85±32
a 조사는 50개 이상의 세포를 통한 절편에서 수행되었다; 과립이 수는 절편화된 세포 당 과립의 평균 수를 나타낸다.
b 과립의 직경은 각 균주에서 계수된 모든 과립에 대한 평균화되었다.
PHA는 이의 조성이 변화될 수 있으며, GC/MS는 이들 봉입체의 화학적 특성을 결정하는데 사용되었다. 이를 위해, 세포를 특정 배양 단계에서 채집하고, 냉동 건조에 의해 건조한 후, 105℃에서 베이킹하여 잔여 수분 함유물을 제거하였다. 세포를 파괴한 후, 이를 클로로포름중에서 2.5시간 동안 메탄올첨가분해 처리하였다. 주요 메탄올첨가분해 생성물중 하나의 질량 패턴 (도 11A에서 피크 1)은 3-히드록시부티레이트의 메틸 에스테르와 단독으로 정합되는 반면 (도 11B), 히드록시발러레이트 또는 기타 에스테르가 수득되었다는 증거는 없다. 관찰된 제 2의 주요 피크는 레불린산의 메틸 에스테르로서 확인되었으며 (도 11C), 이는 건조된 세포에서 글루코오스 또는 글리코겐의 존재하에 유입된 인공물로서 후에 입증되었다 (데이타 미도시). 이들 데이타는 시네코시스티스 sp. PCC 6803이 생성할 수 있는 유일한 PHA가 PHB 동종폴리에스테르임을 나타낸다.
PHB 함량 : 상기에서 입증된 바와 같이, PHB의 축적은 균주의 표현형에 의해 서 관찰될 뿐만 아니라, 세포 성장의 단계 또는 조건과도 관련이 있다. 상이한 조건 및 상이한 균주에서의 PHB 축적량은 표 8에 기록되어 있다. PHB 함량은 표준 물질로서 Sigma로부터 구입된 PHB를 사용하여, 건조된 세포로부터 PHB의 추출 및 메탄올첨가분해 후 GC/MS에 의해 결정하였다. PHB 함량 (건조 중량%)은 형광 및 전자 현미경 가시화에 의해 예측되는 것보다 일관되게 낮았다 (도 9 및 10). 이는 불완전한 PHB 추출 및/또는 메탄올분해에 의해 초래될 수 있다. 따라서, 도 8에 기록된 PHB 함량은 PHB 정량에 대한 하한값을 제시한다. 그러나, 추출 효율은 모든 세포 및 조건에 있어서 유사한 것으로 예측되었으며, 따라서, PHB 함량은 균주 및 조건사이에서 정량적으로 비교될 수 있다. 균형잡힌 영양분을 갖는 배지중의 정상 성장 조건하에서, 야생형 및 NDH-2-비함유 및 시아노루브럼 균주는 PHB를 거의 합성하지 않으며, PHB 함량은 0.3% 미만이다. 그러나, 옥시다아제-비함유 변이체 및 NDH-1-비함유 변이체는 이들 조건하에서 PHB 보다 10배 까지의 규모로 더 많은 PHB를 축적하였으며, PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체는 옥시다아제-비함유 및 NDH-1-비함유 균주 보다 PHB의 양을 두배로 축적하였다.
표 8. 다양한 성장 조건하에서의 시네코시스티스 sp. PCC 6803 및 이의 변이체의 PHB 축적. 배양물을 PHB 함량을 분석하기 전에 기술된 조건하에서 7일 동안 성장시켰다. 도시된 결과는 3개의 독립된 실험의 평균이다.
Figure 112009030264884-PCT00006
a 다르게 언급되어 있지 않는 한, 배양물은 5mM TES-NaOH (pH 8.0)가 보충된 BG-11 배지에서 50μmol 광자 m-2s-1에서 광독립영양적으로 성장시켰다.
b BG-11중의 질산염을 1.67mM로 저하시켰다 (원래 농도의 10%).
c BG-11중의 질산염을 10mM NH4Cl로 대체하였다.
d BG-11에 10mM 아세트산나트륨을 보충하였다.
e BG-11에 10mM TES-NaOH (pH 8.0) 및 5mM 글루코오스를 보충하였다.
f 2% CO2 풍부 공기로 버블링시켰다.
ND: 검출되지 않음
질소-제한된 조건하에서, 모든 균주가 높은 수준의 PHB를 축적하였다: 양은 정상 조건하에서의 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 균주에서의 양에 거의 필적한 다. 세포에 암모니아 형태의 감소된 질소 공급원을 제공한 경우에도 유사한 결과가 획득되었다.
환원된 NADP 및 NAD(P)H의 조건하에서 축적되는 것으로 보이는 PHB는 아세토아세틸~CoA 환원에 사용되기 때문에, PHB는 NADP를 생성시키기 위한 발효 생성물일 수 있으며, 따라서, PHB 수준은 미세-호기성 조건하에서 성장시 여러 균주에서 측정되었다. 이들 균주에서의 PHB는 정상 조건하에서 성장된 대조군에서와 유사하였으며 (데이타 미도시), 따라서, PHB는 시네코시스티스에서의 발효 생성물인 것으로 보이지 않는다.
PHB 경로의 개시 근처의 대사 수준이 PHB 합성에 영향을 끼치는지의 여부를 결정하기 위해, 10mM Na-아세테이트를 배양물에 첨가하였다. 표 8에 도시된 바와 같이, 야생형 세포는 4.7% 만큼 많은 PHB를 축적하였으며, 이는 세포중의 아세테이트 (또는 유래된 대사물)의 수준이 PHB 수준에 현저하게 영향을 끼침을 시사한다.
고려해야 할 한가지 추가적 사항은 배양물의 성장 속도인데, 세포당 PHB 함량이 대수증식기 말기에서 유사한 경우, 회분식 배양에서, 더 높은 성장 속도가 더 느리게 성장하는 균주보다 많은 PHA를 생성시킬 것이기 대문이다. 다양한 조건하의 상이한 균주의 성장을 표 9에서 비교하였다. 대조군 조건하에서, 옥시다아제-비함유 균주를 제외한 모든 변이체는 야생형 보다 더 느리게 성장하였다. 질소-제한된 조건에서, 모든 균주는 16-21 시간의 배가 시간으로 성장하였다. 아세테이트 또는 암모늄의 존재하에, 균주는 표준 BG-11에서와 실질적으로 동일한 속도로 성장하였다. 따라서, 다양한 조건하에서 다양한 변이체중의 PHB 축적의 큰 차이는 단 순히 성장 속도의 차이에 의해 설명될 수 없다.
표 9. 다양한 성장 조건하에서 성장한 시네코시스티스 sp. PCC 6803의 야생형 및 이의 변이체의 배가 시간. 제시된 데이타는 3개 이상의 독립된 측정치의 평균이다.
Figure 112009030264884-PCT00007
a 다르게 언급되어 있지 않는 한, 배양물은 5mM TES-NaOH (pH 8.0)가 보충된 BG-11 배지에서 50μmol 광자 m-2s-1에서 광독립영양적으로 성장시켰다.
b BG-11중의 질산염을 1.67mM로 저하시켰다 (원래 농도의 10%).
c BG-11중의 질산염을 10mM NH4Cl로 대체하였다.
d BG-11에 10mM 아세트산나트륨을 보충하였다.
e BG-11에 10mM TES-NaOH (pH 8.0) 및 5mM 글루코오스를 보충하였다.
f 2% CO2 풍부 공기로 버블링시켰다. ND: 검출되지 않음
레독스 보조인자 (Redox cofactor) 수준 : 이와 같은 결과는 첨가된 아세테이트의 존재를 포함하는 특정 조건하에서 PHB 축적이 발생함을 나타내는 것으로 여겨진다. PHB 합성에 중요한 다른 가능한 인자는 세포내의 NADPH 수준인데, NADPH는 PHB 합성에 사용되며, 높은 NADP 환원 수준은 TCA 사이클에서 이소시트레이트 탈수소효소를 억제하는 것으로 보이며 (Cooley et al., 2000), 따라서, 높은 아세테이트 수준을 유도할 수 있기 때문이다. PHB 축적과 세포의 레독스 상태의 상관관계를 결정하기 위해, 환원된/산화된 니코틴아미드 누클레오티드의 수준을 측정하고, 세포질의 레독스 상태의 지시체로서 비교하였다. NADPH/NADP 및 NADH/NAD 수준을 두개의 독립적인 방법을 이용하여 즉, 특정 처리 후 340nm에서의 분광광도계 검출 및 형광 검출로의 HPLC에 의해 결정하였다. 분광광도계 방법은 신속하나, 완전히 특이적이지 않을 수 있는 반면, HPLC 방법은 느리나 (따라서, 인공적 상호작용을 위한 더 많은 시간을 허용함) 더욱 특이적일 수 있다. 두개의 생성된 데이타 세트는 필적하며, 20% 미만의 차가 있다 (데이타 미도시); 따라서, 단지 HPLC 데이타만 본원에 나타내었다 (표 10). 이들 측정을 위해, 모든 배양물을 중간-대수증식기에서 채집하고, 추가 실험 30분 이내에 추출하였다.
표 10. 질소-제한된 조건 및 감소된 질소 (NH4Cl) 조건하에서 BG-11에서 성 장하는 대수증식기의 다양한 균주중의 환원된 보조인자/총 보조인자의 비 및 정지기 피리딘 누클레오티드 수준 (농도 μM/OD730)
Figure 112009030264884-PCT00008
a 다르게 언급되어 있지 않는 한, 배양물은 5mM TES-NaOH (pH 8.0)가 보충된 BG-11 배지에서 50μmol 광자 m-2s-1에서 광독립영양적으로 성장시켰다.
b BG-11중의 질산염을 1.67mM로 저하시켰다 (원래 농도의 10%).
c BG-11중의 질산염을 10mM NH4Cl로 대체하였다.
d BG-11에 10mM 아세트산나트륨을 보충하였다.
e BG-11에 10mM TES-NaOH (pH 8.0) 및 5mM 글루코오스를 보충하였다.
f 2% CO2 풍부 공기로 버블링시켰다.
ND: 검출되지 않음
다양한 시네코시스티스 sp. PCC 6803 균주중의 NAD(H) 및 NADP(H)의 총 양은 약 10배 이하로 다양하였다. 그러나, 각 균주에 있어서, NAD(H) 및 NADP(H) 양은 상이한 배지에서 성장할 경우 3 내지 4배 이하로 상이하였다 (표 10). 모든 균주중의 NAD(H) 수준은 상대적으로 낮으며, 데이타의 표준 편차는 상대적으로 큰 반면, NADP 풀 크기는 더 크며, 상이한 균주에서 10배 이하로 다양하였다 (표 10). 종래의 관찰 (Cooley et ah, 2001)과 일관되게, NAD 및 NADP 환원 상태는 균주에 매우 의존적이었다. NAD는 NAD-2-비함유 균주에서 완전하게 저하되었으며, 35% 내지 70%의 NAD가 나머지 균주에서 감소되었다. NDH-1-비함유 변이체는 실질적으로 완전히 저하된 NADP(H) 풀을 갖는 반면, 옥시다아제-비함유 변이체에서는 NADP가 40-70% 저하되었다. 반대로, NADP 풀은 야생형, 시아노루브럼 및 NDH-2-비함유 변이체에서 다소 산화되었다. 따라서, 후자의 파라미터 (NADP 환원 상태)는 PHB 축적 수준과 상호관련된 것으로 보인다.
NADP 환원상태와 PHB 축적량 사이의 가능한 상호관련을 입증하기 위해, NADP 및 NAD 수준 및 환원 상태를 고정된-질소 제한 및 감소된 질소 공급원 (암모니아)의 존재에 따라, 야생형 및 옥시다아제-비함유 및 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체에서 결정하였다. 질산염 수준을 제한하거나 암모니아의 존재하에서 BG-11 배지중에 배양시킨 경우, NADH/NAD(총) 비는 암모니아 존재시 또는 제한된 양의 질산염하에서 크기 변화되지 않았으나, 이들 조건하에서 시험된 세개의 균주에서는, 야생형에서의 NADPH/NADP(총) 비는 옥시다아제-비함유 및 PS II-비함유/옥시다아제-비함유 변이체중에서는 높은 환원 수준에 필적하는 수준으로 5 내지 6배로 증가하였다.
표 4에 기록된 결과와 표 2에 기록된 PHB 함량 데이타와 비교할 경우, 모든 경우에서 높은 NADPH/NADP (총) 비가 시네코시스티스 sp. PCC 6803에서의 높은 PHB 함량과 상호관련되어 있음이 분명하다. NADH/NAD(총) 비 및 PHB 축적에 관한 이러한 상호관계는 분명하지 않다.
참고문헌
하기 참고문헌은 예시적 과정 또는 기타 상세한 보충을 본원에 제공하는 범위로 본원에 특정하게 통합되었다.
U.S. 특허 4,413,058
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U.S. 공개 2002/0042111
U.S. 공개 2002/0072109
Figure 112009030264884-PCT00009
Figure 112009030264884-PCT00010
Figure 112009030264884-PCT00011
Figure 112009030264884-PCT00012
Figure 112009030264884-PCT00013
Figure 112009030264884-PCT00014
SEQUENCE LISTING <110> VERMAAS, WILLEM F. J. <120> MODIFIED CYANOBACTERIA <130> AZTE:003WO <140> PCT/US2007/082000 <141> 2007-10-19 <150> 60/853,285 <151> 2006-10-20 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 1 gaggataagt aagtcatgag attatttgac 30 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 2 ctggctgagt taatgcattt acagattatt taacc 35 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 3 gacaaataca taaggaatta taacc 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Primer <400> 4 gccaaaacag ccaagcttgg c 21

Claims (97)

  1. 하나 이상의 대상 유전자 (genes of interest)를 포함하는 변형된 광독립영양 박테리아로서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되고/거나 이의 유전자 생성물 기능이 변화되어, 광독립영양 박테리아에서의 지방산, 지질, 카로테노이드 (carotenoid), 그 밖의 이소프레노이드 (isoprenoid), 탄수화물, 단백질, 바이오 가스 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생성물의 생성량을 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에서의 하나 이상의 생성물의 양과 비교하여 증가시키는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  2. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되어, 비변형된 박테리아에서의 대상 유전자의 발현과 비교하여 상향 조절되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되어, 비변형된 박테리아에서의 대상 유전자의 발현과 비교하여 하향 조절되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  4. 제 1항 내지 제 3항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 비변형된 박테리아의 내생 유전자의 발현 변화를 통해 변화된, 변형된 광독 립영양 박테리아.
  5. 제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 내생 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물의 기능이 유전자의 결실, 유전자의 변이, 또는 유전자의 조절 서열의 변형에 의해 변화된, 변형된 광독립영양 박테리아.
  6. 제 1항 내지 제 5항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 변이에 의해 변화된 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 갖는 하나 이상의 유전자를 포함하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  7. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 이의 유전자 생성물의 기능이 비변형된 박테리아로의 이식유전자 서열의 첨가에 의해 변화된, 변형된 광독립영양 박테리아.
  8. 제 1항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 하나 이상의 이식유전자를 포함하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  9. 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 발현이 변화되고/거나 유전자 생성물 기능이 변화된 두개 이상의 유전자를 포함하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  10. 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 이산화탄소를 흡수하고 고정하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  11. 제 10항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 증가된 흡수량 및 고정량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  12. 제 1항 내지 제 11항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 지질 생성량과 비교하여 증가된 하나 이상의 지질 생성량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  13. 제 1항 내지 제 12항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아의 지질 함량과 비교하여 증가된 지질 함량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  14. 제 1항 내지 제 13항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 소포 유도 플래스티드 단백질 1 (vesicle-inducing protein in plastids 1) (VIPP1) 유전자, pspA 유전자, yidC/oxaI 상동체, 플라스토글로불린 유전자, 아세틸-CoA 카르복실라아제 유전자, 트랜스아세틸라아제 유전자, 데새투라아제 (desaturase) 유전자, PEP 카르복실라아제 유전자, 시트레이트 합성효소 유전자, 지방산 생합성 유전자, 프로테아제 유전자, 글리코겐, 폴리히드록시부티레이트 또는 시아노피신 (cyanophycin) 생합성 또는 분해에 관련된 유전자, 포스파티드산 포스파타아제 유전자, 및 아실트랜스퍼라아제 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  15. 제 1항 내지 제 14항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 sllO336, sllO728, sll1568, sll1848, slr2060, sllO617, slr1471, sll1463, slrO228, slr1024, slr1390, slr1604, slrO156, slr1641, slrO542, slrO165, slrO435, sll0053, slr2023, slr1511, sll1O69, slr1332, slrO886, sll1605, slr1O51, slr1176, slr1188, slr1024, sll1568, slr1829, slr1830, slr2001, slr2002, slr1350, sll1441, sllO541, sllO262, sll0920, sll0401, sllO534, sllO545, slrO348, sll1556, slr1254, slr0940, slr1293, sllO254 및 sll1468 유전자, 및 이들의 상동체로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  16. 제 1항 내지 제 15항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 카로테노이드 생성량과 비교하여 증가된 하나 이상의 카로테노이드의 생성량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  17. 제 1항 내지 제 16항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 카로테노이드 함량과 비교하여 증가된 카로테노이드 함량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 카로테노이드가 베타-카로텐, 제악산틴 (zeaxanthin), 믹스옥산토필 (myxoxanthophyll), 믹솔 (myxol), 에치네논 (echinenone), 및 이들의 생합성 중간체로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  19. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 slrO348, sll1556, slr1254, slrO94O, slr1293, sllO254, 및 sll1468 유전자, 및 이들의 상동체로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  20. 제 1항 내지 제 19항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이 소프레노이드 생성량과 비교하여 증가된 하나 이상의 그 밖의 이소프레노이드의 생성량을 갖는 것으로 추가로 규정된, 변형된 광독립영양 박테리아.
  21. 제 1항 내지 제 20항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아의 이소프레테노이드 함량과 비교하여 증가된 이소프레노이드 함량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 하나 이상의 그 밖의 이소프레노이드가 이소프렌, 토코페롤 및 이들의 생합성 중간체로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  23. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 식물로부터의 이소프렌 합성효소 유전자, 토코페롤 생합성 유전자, 및 이들의 상동체로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  24. 제 1항 내지 제 23항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 탄수화물 생성량과 비교하여 증가된 하나 이상의 탄수화물의 생성량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  25. 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아의 탄수화물 함량과 비교하여 증가된 탄수화물 함량을 갖는 것으로 추가로 규정되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  26. 제 25항에 있어서, 탄수화물이 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 탄수화물이 글루코오스, 갈락토오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 모노사카라이드인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  28. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 탄수화물이 모노사카라이드 포스페이트 크실룰로오스-5-포스페이트, 리불로오스-5-포스페이트, 리보오스-5-포스페이트, 프룩토오스-6-포스페이트, 글루코오스-6-포스페이트, 세도헵툴로오스-7-포스페이트, 에리트로오스-4-포스페이트, 세도헵툴로오스-비스포스페이트, 및 프룩토오스-비스포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  29. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 탄수화물이 수크로오스인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  30. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 탄수화물이 프룩토-올리고사카라이드 및 만난-올리고사카라이드로 구성된 군으로부터 선택된 올리고사카라이드인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  31. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 탄수화물이 글리코겐 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 폴리사카라이드인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  32. 제 25항 내지 제 31항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 글리코겐 합성효소 또는 글리코겐 분지 효소 (glycogen branching enzyme)를 엔코딩하는 유전자, 또는 중추 탄소 대사 (central carbon metabolism)에 관련된 유전자를 포함하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  33. 제 1항 내지 제 32항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 항시성 프로모터 (constitutive promoter)에 작동적으로 연결된 하나 이상의 유전자를 포함하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  34. 제 33항에 있어서, 항시성 프로모터가 psbDII, psbA3 및 psbA2로 구성된 군 으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  35. 제 1항 내지 제 34항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자가 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 유전자를 포함하는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  36. 제 35항에 있어서, 유도성 프로모터가 nirA, isiAB, petE, nrsRS, nrsBACD, 및 ndhF3로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  37. 제 1항에 있어서, 변형된 광독립영양 박테리아가 시아노박테리아, 녹색 유황 박테리아 (green sulfur bacterium), 녹색 비유황 박테리아, 헬리오박테리아 (heliobacterium), 아시도박테리아 (acidobactrium), 홍색 유황 박테리아 (purple sulfur bactrium), 또는 홍색 비유황 박테리아인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  38. 제 37항에 있어서, 변형된 광독립영양 박테리아가 시아노박테리아인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  39. 제 38항에 있어서, 시아노박테리아가 시네코시스티스 (Synechocystis)인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  40. 제 39항에 있어서, 시아노박테리아가 시네코시스티스 sp. PCC 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  41. 제 38항에 있어서, 시아노박테리아가 써모시네코코커스 (Thermosynechococcus)인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  42. 제 41항에 있어서, 시아노박테리아가 써모시네코코커스 엘롱가투스 sp. BP-1 (Thermosynechococcus elongatus sp. BP-1)인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  43. 제 38항에 있어서, 시아노박테리아가 목 크로코칼레스 (Chroococcales), 노스토칼레스 (Nostocales), 오스실라토리알레스 (Oscillatoriales), 플레우로캅살레스 (Pleurocapsales), 프로클로로파이테스 (Prochlorophytes), 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales)인, 변형된 광독립영양 박테리아.
  44. 제 43항에 있어서, 목은 크로코칼레스이며, 종은 아파노캅사 (Aphanocapsa), 아파노테세 (Aphanothece), 카마에시폰 (Chamaesiphon), 크로코커스 (Chroococcus), 크로코스패라 (Crocosphaera), 시아노박테리움 (Cyanobacterium), 시나오비움 (Cyanobium), 시아노테세 (Cyanothece), 다크틸로코콥시스 (Dactylococcopsis), 글로에오박터 (Gloeobacter), 글로에오캅사 (Gloeocapsa), 글로에오테세 (Gloeothece), 에유할로테세 (Euhalothece), 할로테세 (Halothece), 요 하네스밥티스티아 (Johannesbaptistia), 메리스모페디아 (Merismopedia), 마이크로시스티스 (Microcystis), 라브도데르마 (Rhabdoderma), 시네코코커스 (Synechococcus), 및 시네코시스티스 (Synechocystis), 및 써모시네코코커스 (Thermosynechococcus)로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  45. 제 43항에 있어서, 목은 노스토칼레스이며, 종은 콜레데스미움 (Coleodesmium), 프레미엘라 (Fremyella), 마이크로샤테 (Microchaete), 렉시아 (Rexia), 스피리레스티스 (Spirirestis), 톨리포트릭스 (Tolypothrix), 아나베나 (Anabaena), 아나베놉시스 (Anabaenopsis), 아파니조메논 (Aphanizomenon), 아울로시라 (Aulosira), 시아노스피라 (Cyanospira), 실린드로스페르몹시스 (Cylindrospermopsis), 실리드로스페르뭄 (Cylindrospermum), 노둘라리아 (Nodularia), 노스톡 (Nostoc), 리첼리아 (Richelia), 칼로트릭스 (Calothrix), 글로에오트리치아 (Gloeotrichia), 및 스시토네마 (Scytonema)로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  46. 제 43항에 있어서, 목은 오스실라토리알레스이며, 종은 아르트로스피라 (Arthrospira), 제이틀레리네마 (Geitlerinema), 할로마이크로네마 (Halomicronema), 할로스피룰리나 (Halospirulina), 카타그나이네메 (Katagnymene), 렙토린그비아 (Leptolyngbya), 림노트릭스 (Limnothrix), 린그비아 (Lyngbya), 마이크로코레우스 (Microcoleus), 오스실라토리아 (Oscillatoria), 포르미디움 (Phormidium), 플라크토트리코이데스 (Planktothricoides), 플라크토트릭스 (Planktothrix), 플레크토네마 (Plectonema), 림노트릭스 (Limnothrix), 슈다나배나 (Pseudanabaena), 쉬조트릭스 (Schizothrix), 스피룰리나 (Spirulina), 심플로카 (Symploca), 트리코데스뮴 (Trichodesmium), 및 티코네마 (Tychonema)로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  47. 제 43항에 있어서, 목은 플레우로캅살레스이며, 종은 크로오코시디옵시스 (Chroococcidiopsis), 데르모카르파 (Dermocarpa), 데르모카르펠라 (Dermocarpella), 믹소사르시나 (Myxosarcina), 플레우로캅사 (Pleurocapsa), 스타니에리아 (Stanieria), 및 제노코커스 (Xenococcus)로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  48. 제 43항에 있어서, 목은 프로클로로파이테스이며, 종은 프로클로론 (Prochloron), 프로클로로코커스 (Prochlorococcus), 및 프로클로로트릭스 (Prochlorothrix)로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  49. 제 43항에 있어서, 목은 스티고네마탈레스이며, 종은 캅소시라 (Capsosira), 클로로글로에옵시스 (Chlorogloeopsis), 피세렐라 (Fischerella), 하팔로시폰 (Hapalosiphon), 마스티고클라돕시스 (Mastigocladopsis), 마스티고클라두스 (Mastigocladus), 노스토콥시스 (Nostochopsis), 스티고네마 (Stigonema), 심피오네마 (Symphyonema), 심피오네몹시스 (Symphyonemopsis), 우메자키아 (Umezakia), 및 웨스티엘롭시스 (Westiellopsis)로 구성된 군으로부터 선택되는, 변형된 광독립영양 박테리아.
  50. 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 이의 유전자 생성물 기능을 변화시켜 광독립영양 박테리아에서 하나 이상의 대상 유전자 또는 하나 이상의 생성물의 생성을 증가시키는 것을 포함하며, 상기 변화가 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의해 생성된 생성물의 양과 비교하여 증가된 하나 이상의 생성물의 생성량을 유도하는, 광독립영양 박테리아로부터 목적 생성물의 생성을 증가시키는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 증가된 양의 목적 생성물을 생성시키기에 적합한 조건하에서 광독립영양 박테리아를 성장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  52. 제 50항 또는 제 51항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시키는 것이 두개 이상의 유전자의 발현 또는 기능을 변화시키는 것을 포함하는 방법.
  53. 제 50항 내지 제 52항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시키는 것이 하향 조절에 의해 하나 이상의 유전자의 발현을 변화시키는 것을 포함하는 방법.
  54. 제 50항 내지 제 53항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시키는 것이 하나 이상의 이식유전자의 발현을 변화시키는 것을 포함하는 방법.
  55. 제 50항 내지 제 54항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시키는 것이 변이에 의해 하나 이상의 유전자의 발현을 변화시키는 것을 포함하는 방법.
  56. 제 50항 내지 제 55항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시키는 것이 상향 조절에 의해 하나 이상의 유전자의 발현을 변화시키는 것을 포함하는 방법.
  57. 제 50항 내지 제 56항중의 어느 한 항에 있어서, 광독립영양 박테리아가 이산화탄소를 흡수하고 고정하는 방법.
  58. 제 50항 내지 제 57항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자의 발현 및/또는 유전자 생성물 기능을 변화시키는 것이 하나 이상의 대상 유전자의 발현이 변화되지 않은 광독립영양 박테리아에 의한 이산화탄소의 흡수량 및 고정량과 비교하여 이산화탄소의 흡수량 및 고정량을 증가시키는 방법.
  59. 제 50항 내지 제 58항중의 어느 한 항에 있어서, 목적 생성물이 하나 이상의 지질를 포함하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 하나 이상의 지질를 바이오-연료로 가공처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 바이오-연료가 바이오디젤인 방법.
  62. 제 50항 내지 제 58항중의 어느 한 항에 있어서, 목적 생성물이 하나 이상의 탄수화물을 포함하는 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물을 바이오-연료로 가공처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 바이오-연료가 알코올 또는 가스인 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 바이오-연료가 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구 성된 군으로부터 선택된 알코올인 방법.
  66. 제 64항에 있어서, 바이오 연료가 수소, 이소프렌, 메탄, 에탄, 프로판 및 부탄으로 구성된 군으로부터 선택된 가스인 방법.
  67. 제 62항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물을 바이오플라스틱으로 가공처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 바이오플라스틱이 폴리락트산, 폴리-3-히드록시부티레이트 또는 폴리-3-히드록시알카노에이트를 포함하는 방법.
  69. 제 50항 내지 제 58항중의 어느 한 항에 있어서, 목적 생성물이 하나 이상의 카로테노이드를 포함하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 카로테노이드가 베타-카로텐, 제악산틴, 믹스옥산토필, 믹솔, 에치네논, 및 이들의 생합성 중간체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  71. 제 50항 내지 제 58항중의 어느 한 항에 있어서, 목적 생성물이 하나 이상의 시아노피신 또는 관련 화합물 또는 유도체를 포함하는 방법.
  72. 제 50항 내지 제 71항중의 어느 한 항에 있어서, 광독립영양 박테리아에 의해 생성된 과량의 부산물을 바이오-플라스틱, 바이오 연료, 동물 사료 첨가제, 또는 유기 발효제중 하나 이상으로 가공처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  73. 제 50항 내지 제 72항중의 어느 한 항에 있어서, 적합한 성장 조건이 광독립영양 박테리아에 이산화탄소의 공급원을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 이산화탄소 공급원이 연도 가스 (flue gas)로부터 공급되는 방법.
  75. 제 73항 또는 제 74항에 있어서, 광독립영양 박테리아에 제공된 이산화탄소의 양이 연도 가스의 총 부피의 0.03-5.0%인 방법.
  76. 제 50항 내지 제 75항중의 어느 한 항에 있어서, 적합한 성장 조건이 광독립영양 박테리아에 질소 공급원을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  77. 제 76항에 있어서, 고정된 질소 공급원이 지하수, 암모니아 또는 질산염으로부터 공급되는 방법.
  78. 제 76항 또는 제 77항에 있어서, 광독립영양 박테리아에 제공되는 질소의 양 이 0.03-5.0mM인 방법.
  79. 제 50항 내지 제 78항중의 어느 한 항에 있어서, 적합한 성장 조건이 광독립영양 박테리아를 10 내지 55℃의 온도 범위에서 성장시키는 것을 포함하는 방법.
  80. 제 50항 내지 제 79항중의 어느 한 항에 있어서, 적합한 성장 조건이 광독립영양 박테리아를 태양광으로 처리하는 것을 포함하는 방법.
  81. 제 50항 내지 제 80항중의 어느 한 항에 있어서, 광독립영양 박테리아가 시아노박테리아, 녹색 유황 박테리아, 녹색 비유황 박테리아, 헬리오박테리아, 광합성 아시도박테리아, 홍색 유황 박테리아, 또는 홍색 비유황 박테리아인 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 광독립영양 박테리아가 시아노박테리아인 방법.
  83. 제 82항에 있어서, 시아노박테리아가 시네코시스티스인 방법.
  84. 제 83항에 있어서, 시아노박테리아가 시네코시스티스 sp. PCC 6803인 방법.
  85. 제 82항에 있어서, 시아노박테리아가 써모시네코코커스인 방법.
  86. 제 85항에 있어서, 시아노박테리아가 써모시네코코커스 엘롱가투스 sp. BP-1인 방법.
  87. 제 50항 내지 제 86항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자중 하나 이상이 항시성 프로모터에 작동적으로 연결되는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 항시성 프로모터가 psbDII, psbA3, 및 psbA2로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  89. 제 50항 내지 제 88항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 대상 유전자중 하나 이상이 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 방법.
  90. 제 89항에 있어서, 유도성 프로모터가 nirA, isiAB, petE, nrsRS, nrsBACD, 및 ndhF3로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  91. 광독립영양 박테리아로부터 하나 이상의 목적 생성물을 생성시키는 방법으로서,
    (i) 제 1항 내지 제 49항중의 어느 한 항에 따른 변형된 광독립영양 박테리아 및/또는 제 50항 내지 제 90항중의 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 변형된 광독립영양 박테리아를 얻고;
    (ii) 목적 생성물을 생성시키기에 적합한 조건하에 광독립영양 박테리아를 성장시키는 것을 포함하는 방법.
  92. 제 91항에 있어서, 목적 생성물을 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  93. 제 91항 또는 제 92항에 있어서, 하나 이상의 목적 생성물이 지질, 탄수화물, 카로테노이드, 그 밖의 이소프레노이드, 단백질 또는 이의 혼합물인 방법.
  94. 제 91항 내지 제 93항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 목적 생성물을 유기 용매, 초임계 무해 용매 예컨대, 물 또는 CO2로의 추출에 의해 또는 이상 분별 (two-phase partitioning)에 의해 분리하는 방법.
  95. 제 91항 내지 제 94항중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 목적 생성물을 바이오-연료, 바이오-플라스틱, 카로테노이드, 동물 사료 또는 비료중 하나 이상으로 가공처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  96. 이산화탄소를 고정하는 방법으로서,
    (i) 제 1항 내지 제 49항중의 어느 한 항에 따른 변형된 광독립영양 박테리아 및/또는 제 50항 내지 제 90항중의 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 변형된 광 독립영양 박테리아를 얻고;
    (ii) 이산화탄소를 흡수하고 고정하는데 적합한 조건하에 광독립영양 박테리아를 성장시키고;
    (iii) 변형된 광독립영양 박테리아에 이산화탄소 공급원을 제공하는 것을 포함하며, 공급원으로부터의 이산화탄소의 일부 또는 전부가 변형된 광독립영양 박테리아에 의해 고정되는 방법.
  97. 제 96항에 있어서, 이산화탄소 공급원이 연도 가스이며, 연도 가스중의 이산화탄소의 일부 또는 전부가 변형된 광독립영양 박테리아에 의해 고정되는 방법.
KR1020097010333A 2006-10-20 2007-10-19 변형된 시아노박테리아 KR20090129393A (ko)

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