KR20090111121A - Composition for preventing or treating atopic dermatitis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis and a cosmetic composition for improving or alleviating symptoms of atopic dermatitis, comprising a culture of adult stem cells or a fraction thereof as an active ingredient.
아토피성 피부염은 재발되기 쉬운 만성 피부질환으로서, 유전적 소인, 환경적 원인, 면역학적 원인, 피부장벽 기능 이상 등의 내, 외부의 여러 요인이 복합적으로 관여하여 발생하는 질환으로 생각되고 있으며, 2차적으로 나타나는 증상으로 세균의 침입, 정신적 스트레스 등이 나타난다. 주요 원인으로 환경공해로 인한 알레르기 물질 증가 등이 아토피 피부염과 밀접한 관련이 있는 것으로 추정된다고 보고되고 있으나, 아직 구체적인 원인은 밝혀져 있지 않다. 현재 아토피성 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 그리고 세균감염을 예방하기 위해 항생제 연고 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 지속적으로 적용하기가 곤란하다.Atopic dermatitis is a chronic skin disease that is likely to recur, and is thought to be caused by a combination of internal and external factors such as genetic predisposition, environmental causes, immunological causes, and skin barrier dysfunction. The next symptom is bacterial invasion and mental stress. As a major cause, it is reported that the increase in allergens due to environmental pollution is closely related to atopic dermatitis, but the specific cause is not known yet. Topical steroids, immunosuppressants, antihistamines, and antibiotic ointments have been used to treat atopic dermatitis. It is not a fundamental treatment for atopic dermatitis, so it is difficult to apply them continuously.
또한, 약물 요법 이외에 아토피성 피부염의 개선이나 증상완화의 목적으로 상대적으로 부작용이 적은 화장료가 연구되고 있다. 상기 화장료에는 주로 보습제 성분이 함유되어 있으며, 예를 들어 세포막을 구성하는 인지질 성분인 세라마이드를 함유한다. 보습제 이외에 천연 식물 추출물이나 심층수로부터 분리한 천연 미네랄 등을 함유하는 기능성 화장료가 시판 중에 있다. 그러나 보습제, 천연 추출물, 혹은 미네랄 등을 함유하는 화장료에 있어서도, 아직 구체적인 임상적 활성이 명확하게 검증되어 있지는 않다.In addition to the drug therapy, relatively few side effects have been studied for the purpose of improving atopic dermatitis and alleviating symptoms. The cosmetics mainly contain a moisturizing component, and contain, for example, ceramide, a phospholipid component constituting the cell membrane. In addition to moisturizing agents, functional cosmetics containing natural plant extracts and natural minerals isolated from deep water are commercially available. However, even in cosmetics containing moisturizers, natural extracts, or minerals, the specific clinical activity has not yet been clearly verified.
한편, 최근 발표된 연구 결과들에 따르면, 줄기세포가 피부 조직의 재생을 촉진하며, 이는 줄기세포에서 분비되는 복합단백질(protein complex)에 의한 작용 (paracrine effect)이라 보고되고 있다(Pankaj K.M. J. Cardiovascular Medicine, 2008). 상기 복합 단백질의 대부분은 성장인자들로 알려져 있으며, 최근 이들 성장인자들에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 성장인자란 체내에 소량 존재하는 신호전달 물질들로 이러한 성장인자들은 나이가 증가함에 따라 그 체내 농도가 감소하게 되며, 체내 성장인자 농도의 감소는 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Waisbourd M. et al., Drungs Aging, 2007). 현재 성장인자를 외부에서 공급하여 생체의 노화를 억제하려는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 아울러 개별 성장인자들의 구체적인 효과에 대한 연구도 진행되고 있다. 근래의 연구 보고들에 의하면 피부 주변 줄기세포에서 분비되는 성장인자들이 상처 치료, 미백, 항산화 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다(Kim et al., J Dermatol Sci ., 2007; Kim et al., J Dermatol Sci ., 2008). 또한, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)가 면역억제 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 이는 MSC가 마이토젠(mitogen)이나 동종 세포로 자극된 T-세포의 증식을 억제함으로써 면역반응을 억제시키는 것으로 보고되고 있다(Djouad F. et al., Blood 2003).On the other hand, according to recently published studies, stem cells promote the regeneration of skin tissue, which is reported to be a paracrine effect (protein complex) secreted by stem cells (Pankaj KM J. Cardiovascular Medicine , 2008). Most of the complex proteins are known as growth factors, and active research on these growth factors has recently been conducted. Growth factors are signaling agents that are present in small quantities in the body, and these growth factors decrease in body concentration with age, and it has been found that the decrease in the growth factor concentration is closely related to aging (Waisbourd M). et al., Drungs Aging , 2007). Currently, various researches are being conducted to suppress the aging of living organisms by supplying growth factors from the outside, and also researches the specific effects of individual growth factors. Recent studies report that growth factors secreted from stem cells around the skin have effects on wound healing, whitening, and antioxidants (Kim et al., J Dermatol). Sci . , 2007; Kim et al., J Dermatol Sci ., 2008). In addition, mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported to exhibit immunosuppressive activity, which inhibits immune responses by inhibiting the proliferation of T-cells stimulated with mitogen or allogeneic cells. (Djouad F. et al., Blood 2003).
그러나, 아토피성 피부염이 면역반응과 관련된 알러지 뿐만 아니라, 다양한 원인에 의해 발생하므로, 특정 성장인자를 분리하여 임상에 적용할지라도 안정적인 치료 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, MSC의 면역억제 기능을 이용할 경우에도 세포를 직접 사용하여야 하므로 안정성 등의 문제로 통상의 방법에 의한 제제화가 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.However, since atopic dermatitis is caused by various causes as well as allergy related to the immune response, it is difficult to expect a stable therapeutic effect even if a specific growth factor is isolated and applied to the clinic. In addition, the cells must be used directly when using the immunosuppressive function of MSC. Therefore, it is difficult to formulate by a conventional method due to problems such as stability, and also exhibit various individual deviations depending on the source of the cell to achieve the desired therapeutic effect. It is still difficult to represent the same.
본 발명자들은 상기한 선행기술들의 문제점을 개선하면서, 안정적으로 아토피성 피부염을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과 놀랍게도, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물이 아토피성 피부염 환자에게서 나타나는 대표적 증상인 피부 보호막 소실과 이로 인한 2차 감염을 억제하고 피부 보호막을 유지한다는 것을 발견하였다.The present inventors conducted various studies to develop a method for stably preventing or treating atopic dermatitis, while improving the problems of the prior arts described above. As a result, it was surprisingly found that the culture of adult stem cells or fractions thereof inhibited the loss of skin barrier, which is a typical symptom in patients with atopic dermatitis, and thereby prevented secondary infection and maintains skin barrier.
따라서, 본 발명은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis comprising the culture of the adult stem cells or fractions thereof as an active ingredient.
또한, 본 발명은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving or alleviating symptoms of atopic dermatitis comprising the culture of the adult stem cells or fractions thereof.
본 발명의 일 태양에 따라, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.According to one aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis, comprising a culture of adult stem cells or a fraction thereof as an active ingredient.
또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 아토피성 피부염 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물이 제공된다.In addition, according to another aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition for atopic dermatitis improvement or symptom relief, comprising a culture of adult stem cells or a fraction thereof.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 성체 줄기세포의 배양물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있으며, 상기 성체 줄기세포의 배양물의 분획물이 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다. In the composition of the present invention, the adult stem cell culture is a supernatant obtained by centrifuging the culture medium of the adult stem cells; Concentrate of the supernatant; Or a lyophilized product of the supernatant, the fraction obtained by fractionating the supernatant obtained by centrifuging the culture medium of the adult stem cells to include 10-30 kDa protein; Concentrate of said fraction; Or lyophilisate of the fraction.
상기 성체 줄기세포의 배양액은 성체 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지 중에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 상기 혈청 배지는 584 mg/L의 L-글루타민, 1000 mg/L의 D-글루코스, 110 mg/L의 소디움 피루베이트, 10 %의 FBS, 및 1 %의 항생제(100 IU/ml)로 보충된 DMEM 일 수 있고, 상기 무혈청 배지는 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지에 365 mg/L의 L-글루타민, 15 mM의 HEPES, 55 mg/L의 소디움 피루베이트가 보충된 배지일 수 있다.The adult stem cell culture may be obtained by subcultured adult stem cells in serum medium, followed by culturing in serum-free medium, the serum medium is 584 mg / L L- glutamine, 1000 mg / L D- Glucose, 110 mg / L sodium pyruvate, 10% FBS, and 1% antibiotics (100 IU / ml) supplemented with DMEM, the serum-free medium containing 1 mixture of DMEM and Ham's F-12 nutrients. The medium mixed at a weight ratio of 1 may be a medium supplemented with 365 mg / L L-glutamine, 15 mM HEPES, and 55 mg / L sodium pyruvate.
본 발명에 따른 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 조성물은 피부 보호막 소실과 이로 인한 2차 감염을 억제하고 피부 보호막을 유지시킴으로써, 아토피성 피부염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써, 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 거부 반응을 최소화할 수 있다.A composition comprising a culture of an adult stem cell or a fraction thereof according to the present invention can be used to prevent or treat atopic dermatitis by inhibiting skin barrier loss and resulting secondary infection and maintaining the skin barrier. In particular, the composition of the present invention contains an active protein complex secreted by stem cells rather than stem cells, thereby minimizing immunological rejection that may occur when using stem cells.
본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis, comprising a culture of adult stem cells or a fraction thereof as an active ingredient. The present invention also provides a cosmetic composition for improving or alleviating symptoms of atopic dermatitis, including a culture of adult stem cells or a fraction thereof.
상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.The adult stem cells refer to undifferentiated cells having multipotency derived from adult cells of mammals including humans, preferably humans. For example, bone marrow, blood, brain, skin, fat (ie, adipose tissue) Or adipocytes), umbilical cord blood, umbilical cord Bart's jelly, and the like. In the present specification, the "adult stem cells" include mesenchymal stem cells derived from adult cells.
상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기 되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다. As the adult stem cells, it is possible to obtain adipose tissue that is discarded during a liposuction process that is commonly performed, and thus, fat-derived stem cells that do not require invasive procedures can be preferably used. Adipose-derived stem cells are known from known methods (e.g., WO2000 / 53795 and WO2005 / 042730) from adipose tissue or adipocytes of mammals including humans, preferably humans. It can be obtained through processes such as liposuction and sedimentation, enzymatic treatment of collagenase and the like, and removal of floating cells such as red blood cells by centrifugation. The adipose tissue includes brown or white tissue derived from subcutaneous, retinal, visceral, breast gonad or other adipose tissue sites and can be readily obtained from conventional liposuction.
성체 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있다. 즉, 골수, 혈액, 제대혈, 지방 등으로부터 유래된 줄기세포는 각각의 줄기세포에 적합한 통상의 줄기세포 배양용 배지, 예를 들어 혈청 배지 중에서 계대 배양될 수 있다. 더욱 바람직하게는 성체 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 최종적으로 무혈청 배지 중에서 계대 배양함으로써, 얻어지는 배양물 혹은 분획물 중의 단백질 함량을 높일 수 있다. Adult stem cells can be cultured in a conventional manner using a stem cell culture medium. That is, stem cells derived from bone marrow, blood, umbilical cord blood, fat, and the like can be passaged in a conventional stem cell culture medium suitable for each stem cell, for example, serum medium. More preferably, adult stem cells are passaged in serum medium and finally passaged in serum-free medium to increase the protein content in the resulting culture or fraction.
상기 혈청 배지는 지방 유래 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로서, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 7 ∼ 10 중량%의 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 첨가된 동결건조된 DMEM에 혈청을 함유시켜 얻어진 배지일 수 있다. 상기 혈청으로는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용할 수 있으며, 그 함량은 혈청 배지 총 중량에 대하여 약 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이 코플라스마 억제제를 포함할 수 있다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있으며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신(tylosin), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈청 배지는 584 mg/L의 L-글루타민, 1000 mg/L의 D-글루코스, 110 mg/L의 소디움 피루베이트, 10 %의 FBS, 및 1 %의 항생제(100 IU/ml)로 보충된 DMEM 일 수 있다. 혈청 배지 중에서의 배양은 90∼95 %의 습도 및 35∼39 ℃의 조건으로 5∼10 % CO2 배양기에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라, 최종농도가 0.17∼0.22 중량%가 되도록 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가할 수 있으며, 트립신-EDTA를 처리함으로써 성장을 촉진시킬 수 있다. 누적집단 배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85% 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80% 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 수행할 수 있다.The serum medium is a medium suitable for maintaining and storing the same cell type as the adipose-derived stem cells, and is lyophilized with DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) or 7-10% by weight of dimethyl sulfoxide (DMSO). It may be a medium obtained by containing serum in DMEM. Fetal bovine serum (FBS) may be used as the serum, and the content thereof may be about 10% by weight based on the total weight of the serum medium. If desired, antibiotics, antifungal agents and mycoplasma inhibitors that cause contamination may be included. As antibiotics, antibiotics commonly used in cell culture, such as penicillin-streptomycin, can be used, and antifungal agents include amphotericin B, mycoplasma inhibitors tylosin, gentamicin, ciprofloxacin, azithromycin, and the like. Can be used. Further, if necessary, oxidative nutrients such as glutamine and energy metabolites such as sodium pyruvate can be further added. Preferably, the serum medium comprises 584 mg / L L-glutamine, 1000 mg / L D-glucose, 110 mg / L sodium pyruvate, 10% FBS, and 1% antibiotic (100 IU / ml DMEM supplemented with). Cultivation in serum medium can be performed in a 5-10% CO 2 incubator at 90-95% humidity and 35-39 [deg.] C. and, if necessary, sodium bicarbonate so as to have a final concentration of 0.17-0.22% by weight. Carbon modulators, such as these, can be added, and growth can be promoted by treating trypsin-EDTA. Cumulative population doubling time is maintained until 75-85% confluence of the cells in culture in the flask, and preferably, subculture may be performed by collecting the cells at the 80% confluence time.
무혈청 배지 중에서 계대 배양은 상기 혈청 배지에서의 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 세척하고 트립신-EDTA로 처리한 후, 세포부유액을 원심분리하여 획득한 펠렛을 인산화 완충 용액으로 2∼3회 세척한 후, 수행할 수 있다.Subsequent culture in serum-free medium, after removing the culture medium in the serum medium, washed with phosphorylated buffer solution, treated with trypsin-EDTA, pellet obtained by centrifugation of cell suspension was washed 2-3 times with phosphorylated buffer solution. After that, it can be done.
상기 무혈청 배지는 산화영양원, 에너지 대사물질, 탄소조절원이 보충된 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 DMEM과 Ham's F-12 영양소 혼합액(SIGMA, Cancer Research Vol 47, Issue 1 275-280)을 1 : 1의 중량비로 혼합 한 배지에 365 mg/L의 L-글루타민, 15 mM HEPES, 55 mg/L의 소디움 피루베이트가 보충된 배지일 수 있다. 상기와 같이, DMEM과 Ham's F-12 영양소 혼합액을 조합하여 사용하는 경우, 줄기세포의 성장과 항상성을 효과적으로 유지시킬 수 있으며, 얻어지는 배양물 또는 분획물 중의 활성 단백질 함량을 더욱 높일 수 있다. 특히, 혈청 배지에 포함된 동물혈청으로부터 야기되는 다양한 변수들을 최소화할 수 있다.The serum-free medium is preferably a medium supplemented with oxidants, energy metabolites, and carbon modulators, more preferably DMEM and Ham's F-12 nutrient mixture (SIGMA, Cancer Research Vol 47, Issue 1 275-). 280) may be a medium supplemented with 365 mg / L of L-glutamine, 15 mM HEPES, and 55 mg / L of sodium pyruvate. As described above, when using a combination of DMEM and Ham's F-12 nutrient mixture, it is possible to effectively maintain the growth and homeostasis of stem cells, it is possible to further increase the active protein content in the culture or fraction obtained. In particular, various variables resulting from animal serum contained in serum medium can be minimized.
상기 Ham's F-12 영양소 혼합액의 각 구성성분들의 성분 및 함량은 다음 표 1과 같다.The components and contents of the components of the Ham's F-12 nutrient mixture are shown in Table 1 below.
본 발명의 약학 조성물은 상기한 바와 같이 성체 줄기세포의 배양액으로부터 얻어진 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함한다. 상기 성체 줄기세포의 배양물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 성체 줄기세포의 배양물의 분획물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention comprises a culture of the adult stem cells obtained from the culture of the adult stem cells or fractions thereof as described above. The culture of the adult stem cells is a supernatant obtained by centrifuging the culture of the adult stem cells; Concentrate of the supernatant; Or lyophilisate of the supernatant. In addition, the fraction of the culture of the adult stem cells is a fraction obtained by fractionating the supernatant obtained by centrifuging the culture medium of adult stem cells to contain 10 to 30 kDa protein; Concentrate of said fraction; Or lyophilisate of the fraction.
상기 원심분리는 줄기세포, 거대 분자, 배지 성분들을 침강시켜 제거할 수 있는 조건, 예를 들어, 300 ∼ 600 g로 5 ∼ 10 분 동안, 바람직하게는 약 300 g로 약 5 분 동안 수행될 수 있다. 필요에 따라, 약 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포와 미지의 거대분자들을 제거할 수도 있다. 또한, 상기 농축물은 상기 배양액 또는 분획을 감압농축 등의 통상의 방법으로 원하는 단백질 농도가 얻어질 때까지 농축함으로써 얻을 수 있다. 또한 상기 분획은 특정 포어 사이즈를 갖는 통상의 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킨 후, 막을 통과한 분획물을 다시 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킴으로써 수행될 수 있다.The centrifugation may be performed under conditions that can be removed by sedimentation of stem cells, macromolecules, and media components, for example, 300 to 600 g for 5 to 10 minutes, preferably about 300 g for about 5 minutes. have. If necessary, the remaining stem cells and unknown macromolecules may be removed by filtration with a syringe filter of about 0.22 μm. In addition, the concentrate may be obtained by concentrating the culture solution or fraction until a desired protein concentration is obtained by a conventional method such as vacuum concentration. In addition, the fraction may be carried out using a conventional membrane having a specific pore size, for example, the supernatant obtained by centrifugation of the culture solution is passed through a membrane having a pore size of 30 kDa, and then the fraction passed through the membrane. This can be done by passing through a membrane having a pore size of 10 kDa.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 외용액제, 에멀젼, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention comprises the culture of the adult stem cells or fractions thereof as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier, liquids, suspensions, emulsions, lotions, ointments according to conventional methods It may be formulated into parenteral formulations, such as lyophilizers. Preferably, it may be formulated into a transdermal dosage form such as an external solution, an emulsion, an ointment. The pharmaceutically acceptable carrier includes an aqueous diluent or a solvent such as phosphate buffered saline, purified water or sterile water, and a non-aqueous diluent or solvent such as propylene glycol, polyethylene glycol, and olive oil. It includes. In addition, wetting agents, fragrances, preservatives, and the like may be included as necessary.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물은 1일 10 내지 1000 ng/kg으로, 바람직하게는 50 내지 500 ng/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 100 ng/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 아토피성 피부염 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The dosage of the adult stem cell culture or fraction thereof contained in the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Can be. For example, the culture of adult stem cells or fractions thereof is administered at a dose of 10 to 1000 ng / kg, preferably at a dose of 50 to 500 ng / kg, more preferably at a dose of about 100 ng / kg. The administration may be administered once or several times a day. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents for atopic dermatitis, and when administered in combination, may be administered sequentially or simultaneously with other therapeutic agents. When administered alone or in combination, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered in an amount that can achieve the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
상기한 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물은 아토피성 피부염 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있으며, 그 함량은 아토피성 피부염 개선 또는 증상완화 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ∼ 20.0 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 2 중량%의 함량으로 함유될 수 있다. 상기 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우 원하는 효과를 기대하기 곤란하고, 20.0 중량% 보다 클 경우에는 피부에 자극을 유발할 가능성이 있고, 제형의 안정화에도 영향을 미칠 수 있다.The culture of the adult stem cells or fractions thereof may be contained as an active ingredient of the cosmetic composition for atopic dermatitis improvement or symptom relief, the amount of which is effective to achieve atopic dermatitis improvement or symptomatic effect, eg For example, the composition may be contained in an amount of 0.0001 to 20.0% by weight based on the total weight of the composition, and preferably, in an amount of about 2% by weight. If the content is less than 0.0001% by weight it is difficult to expect the desired effect, if greater than 20.0% by weight may cause irritation to the skin, it may also affect the stabilization of the formulation.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.Ingredients included in the cosmetic composition of the present invention as an active ingredient may include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the culture of the adult stem cells or fractions thereof, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, Conventional adjuvants such as pigments and flavorings, and carriers.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 유연 화장수 (스킨), 영양 화장수 (밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, in solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, sprays, and the like. It may be, but is not limited to such. More preferably, it may be prepared in the form of a flexible lotion (skin), nourishing lotion (milk lotion), nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder. .
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components. Can be.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다. When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of, 3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, and microcrystals are used as carrier components. Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다 When the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing, the carrier component is aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide. Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기한 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물 이외에 다른 종래의 아토피성 피부염 개선을 위한 성분들을 더 함유할 수도 있으며, 이들 기존의 성분들의 종류 및 함량은 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있다.In addition, the cosmetic composition of the present invention may further contain components for improving conventional atopic dermatitis in addition to the culture of the adult stem cells or fractions thereof, the type and content of these conventional components can be easily You can choose to use it.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. 지방 줄기세포의 수득 1. Obtaining Adipose Stem Cells
피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 지방조직의 세포외기질을 약 37 ℃, 약 5% CO2 배양기에서 45분간 0.075% 콜라게나아제로 처리한 다음, 얻어진 지방조직을 약 1200g에서 5분간 원심 분리하여 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 얻어진 분획을 PBS로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 다른 조직을 제거한 후 Histopaque-1077로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵 세포를 분리하였다.The patient received the subcutaneous fat removal procedure, and the adipose tissue was removed from the patient by liposuction method. The extracellular matrix of adipose tissue was treated with 0.075% collagenase for about 45 minutes in an incubator at about 37 ° C. and about 5% CO 2 , and then the resulting adipose tissue was centrifuged at about 1200 g for 5 minutes to obtain a stromal vascular fraction. The obtained fractions were washed with PBS, other tissues were removed through a 70 μm nylon cell filter, and cell debris and mononuclear cells including red blood cells were separated by Histopaque-1077.
분리된 단핵세포를 10% 소 태아 혈청((fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하여 약 37 ℃, 약 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리하였다.The separated mononuclear cells with 10% fetal bovine serum ((fetal bovine serum, FBS) , 1% penicillin / streptomycin supplemented DMEM with (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) by using a medium of about 37 ℃, about 5% CO 2 incubator After incubation for 24 hours, adipocytes were isolated by removing non-adherent cells.
실시예Example 2. 줄기세포의 배양 2. Culture of Stem Cells
실시예 1에서 얻어진 지방 줄기세포 1.25 × 105 cells를 1000 mg/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트 10 % FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90 %의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO2 배양기에서 30일 동안 계대 배양하였다.1.25 × 10 5 cells of the adipose stem cells obtained in Example 1 were treated with 1000 mg / L D glucose, 584 mg / L L-glutamine, 110 mg / L sodium pyruvate 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin. It was added to supplemented DMEM medium and passaged for 30 days in a 5% CO 2 incubator under about 90% humidity and about 37 ° C. temperature conditions.
파이펫을 사용하여 계대 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 3 회 세척한 후, 365 mg/L의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:1 (중량비) 혼합 배지 중에서 1.2 × 106 cell/dish의 농도로 접종하여 저산소(Hypoxia) 조건으로 72 시간 동안 배양하였다.The cultures were removed from the passaged culture using a pipette, washed three times with phosphorylation buffer solution, and then supplemented with 365 mg / L L-glutamine, 15 mM HEPES, 55 mg / L sodium pyruvate. Inoculated at a concentration of 1.2 × 10 6 cells / dish in a 1: 1 (weight ratio) mixed medium of DMEM and Ham's F-12 nutrient mixtures, and incubated for 72 hours under hypoxia conditions.
실시예Example 3. 줄기세포의 배양물 농축액 및 분획의 제조 3. Preparation of culture concentrate and fraction of stem cells
실시예 2에서 최종적으로 얻어진 배양액 500 ml을 300 g로 5 분간 원심분리하여 펠렛으로 가라앉는 줄기세포를 제거하였다. 얻어진 상층액을 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자를 제거하였다. 얻어진 액을 반으로 나누어 감압 농축하여 5 ml의 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액은 동결건조하여 -70 ℃에서 보관하였다.500 ml of the culture solution finally obtained in Example 2 was centrifuged at 300 g for 5 minutes to remove stem cells that settle into pellets. The obtained supernatant was filtered through a 0.22 μm syringe filter to remove residual stem cells and unknown macromolecules. The obtained solution was divided in half and concentrated under reduced pressure to obtain a concentrated solution of 5 ml. The resulting concentrate was lyophilized and stored at -70 ° C.
잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자가 제거된 나머지 액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜고, 멤브레인을 통과하지 못한 여과물에 인산 완충 식염수로 3회 세척하여 30 kDa 이상의 거대 분자 분획과 30 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 30 kDa 이하의 용액과 세척한 인산 완충 식염수를 포함한 용액을 다시 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과 시켜 10 kDa에서 30 kDa의 농축된 분획과 10 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 10 kDa에서 30 kDa의 농축된 분획을 -70℃에서 보관하였다The remaining solution from the remaining stem cells and unknown macromolecules was passed through a membrane having a pore size of 30 kDa, and the filtrate that did not pass through the membrane was washed three times with phosphate buffered saline to obtain a macromolecular fraction of 30 kDa or more. After separation into fractions of 30 kDa or less, a solution containing 30 kDa or less and washed phosphate buffered saline is passed again through a membrane having a pore size of 10 kDa to a concentrated fraction of 10 kDa and 30 kDa or less And then concentrated fractions from 10 kDa to 30 kDa were stored at -70 ° C.
시험예Test Example 1. 아토피성 피부염에 대한 억제 활성 평가 1. Evaluation of inhibitory activity against atopic dermatitis
20% 트리암시놀론 아세토나아드(triamcinolone acetonide, TCA)를 마우스(n=3) 등의 왼쪽과 오른쪽 각각 1cm 직경으로 도포하여 표피가 손상된 화학적 아토피성 피부염을 유발시킨 후, 왼쪽에는 인산화 완충 식염수 1 ml를 거즈를 이용하여 아토피성 피부염 부위에 도포하고, 오른쪽에는 실시예 3에서 얻어진 10-30 kDa 분획 1 ml를 동일한 방법으로 도포하였다. 20% triamcinolone acetonide (TCA) was applied to the left and right sides of the mouse (n = 3) at 1 cm diameter to induce chemical atopic dermatitis with damage to the epidermis and 1 ml of phosphorylated buffered saline on the left side. The gauze was applied to the site of atopic dermatitis, and on the right side, 1 ml of the 10-30 kDa fraction obtained in Example 3 was applied in the same manner.
마우스에 TCA를 처리한 직후에 표피가 손상된 화학적 아토피 피부염을 유발 시킨 결과는 도 1과 같으며, 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 지방 유래 줄기세포 분획물(10 ∼ 30 kDa)을 투여한 후 2일 후 측정한 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 왼쪽은 인산화 완충 식염수를 투여한 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸다. 도 3 및 도 4는 각각 대조군 및 분획물 처리군의 조직학적 슬라이드 사진이다.Immediately after treatment with TCA in the mouse, the epidermal damage was induced by chemical atopic dermatitis as shown in FIG. 1, and 2 days after administration of adipose-derived stem cell fraction (10-30 kDa) to the atopic dermatitis-inducing mouse The measurement result is shown in FIG. In Figure 2, the left side is a control group administered with phosphorylated buffered saline, and the right side shows a treatment group in which the fraction is administered. 3 and 4 are histological slide photographs of the control and fraction treatment groups, respectively.
상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 2일 후 육안으로도 상처의 크기가 뚜렷하게 작아진 것을 확인할 수 있었으며, 조직학적 검사에서 표피가 뚜렷하게 생성되었고 피하지방과 진피층 사이에 염증 세포들이 유의성 있게 줄어든 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 줄기세포의 분획물이 아토피성 피부염으로 생긴 상처치료와 면역학적 염증 반응을 억제하여 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 유용함을 나타낸다.As can be seen from the above results, it was confirmed that the size of the wound was clearly reduced even with the naked eye after 2 days, and the epidermis was clearly generated by histological examination and the inflammatory cells were significantly reduced between the subcutaneous fat and the dermis layer. Can be. This indicates that the fraction of stem cells according to the present invention is useful for the prevention and treatment of atopic dermatitis by inhibiting wound treatment and immunological inflammatory response caused by atopic dermatitis.
도 1은 TCA를 이용하여 아토피성 피부염을 유발한 마우스의 사진이다.1 is a photograph of a mouse inducing atopic dermatitis using TCA.
도 2는 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 지방 유래 줄기세포 분획물(10 ∼ 30 kDa)을 투여한 후 측정한 사진이다. 왼쪽은 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸다.Figure 2 is a photograph taken after administration of adipose derived stem cell fractions (10-30 kDa) to the atopic dermatitis induced mice. The left side is the control and the right side represents the treatment group to which the fraction was administered.
도 3은 대조군의 조직학적 슬라이드 사진이다.3 is a histological slide photograph of the control group.
도 4는 지방 유래 줄기세포 분획물(10 ∼ 30 kDa)을 투여한 처리군의 조직학적 슬라이드 사진이다.4 is a histological slide photograph of the treatment group to which the adipose derived stem cell fractions (10-30 kDa) were administered.
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