KR20090110101A - Method for Patterning of Neuronal Cells Using Magnetic Nanoparticle - Google Patents
Method for Patterning of Neuronal Cells Using Magnetic Nanoparticle Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090110101A KR20090110101A KR1020080035708A KR20080035708A KR20090110101A KR 20090110101 A KR20090110101 A KR 20090110101A KR 1020080035708 A KR1020080035708 A KR 1020080035708A KR 20080035708 A KR20080035708 A KR 20080035708A KR 20090110101 A KR20090110101 A KR 20090110101A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- magnetic
- neurons
- nerve
- magnetic nanoparticles
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/06—Magnetic means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Abstract
Description
본 발명은 자성 나노입자를 이용한 신경세포의 패터닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 외부 자기장을 가하여 자성 나노입자 함유 신경세포의 신경돌기의 신장을 유도하여 원하는 형태로 신경세포를 패터닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for patterning nerve cells using magnetic nanoparticles, and more particularly, to a method for patterning nerve cells in a desired form by inducing elongation of neurites of nerve cells containing magnetic nanoparticles by applying an external magnetic field. will be.
신경세포는 체내 다른 세포의 작동을 조절하는 세포로, 세포막에 다량 발현된 나트륨 채널에 의해 전기적인 방법으로 신호를 전달한다. 신경 세포는 몸체에서 길게 뻗어나온 신경 돌기를 그 특징으로 할 수 있는데, 신경 돌기는 세포 주변의 신호를 수집하거나, 다른 신경 세포로 신호를 전달하는 역할을 하며 다른 신경 세포에 연결되어 신호를 전달하는 축색 돌기와 주변의 신호들을 수집하는 수상 돌기로 구분된다. 축색 돌기로 연결된 신경 세포들은 감각 기관에서 수집된 신호를 중추 신경계로 전달하고, 중추 신경계에서 전달된 운동 신호를 근육 등의 운동 기관으로 전달하여 자극과 반응의 입,출력을 매개하는 중요한 역할을 한다. Neurons are cells that regulate the operation of other cells in the body and transmit signals in electrical ways by sodium channels expressed in the cell membrane. Nerve cells can be characterized by neurites that extend long from the body, which collects signals around the cell or transmits signals to other nerve cells and connects to other nerve cells to transmit signals. It is divided into axons and dendrites that collect surrounding signals. Axons connected by axons transmit signals collected from the sensory organs to the central nervous system and transmit motor signals from the central nervous system to motor organs such as muscles, which play an important role in mediating the input and output of stimuli and responses. .
따라서 사고, 질병 등으로 신경계가 손상될 경우 감각 및 운동 능력이 영구적으로 크게 제한되거나 상실된다. 또한 신경 조직의 경우 다른 장기 질환 치료에서와 같이 신경세포는 재생이 되지 않는 것으로 알려져 이러한 신경 손상의 치료는 극히 제한적인 상황이었으나, 최근 줄기세포가 신경세포로 분화할 수 있음이 보고되어 척수 손상 등의 신경 손상에 의한 질환을 근본적으로 치료할 수 있을 것이라는 기대가 커지고 있는 가운데 이를 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이와 관련하여 신경세포로 분화 가능한 신경줄기세포를 척수가 손상된 쥐에 이식하여 기능이 개선되었음이 보고된바 있다(Cummings B. J. et al ., Neurol . Res., 28(5):474, 2006).Therefore, if the nervous system is damaged due to an accident or disease, the sensory and motor skills are permanently greatly limited or lost. In the case of nerve tissue, as in the treatment of other long-term diseases, nerve cells are not regenerated, and the treatment of these nerve injuries has been extremely limited. However, recently, it has been reported that stem cells may be differentiated into nerve cells. While there is a growing expectation that it is possible to fundamentally cure diseases caused by nerve damage, research for this is being actively conducted. In this regard, it has been reported that nerve stem cells capable of differentiating into neurons were transplanted into spinal cord-injured rats to improve their function (Cummings BJ et. al ., Neurol . Res ., 28 (5): 474, 2006).
이러한 연구들로 인하여 지금까지 불치병으로 여겨졌던 척수 및 뇌 손상과 같은 질환들을 치료할 수 있는 유력한 방법으로 신경줄기세포 치료가 기대를 받고 있으나, 줄기세포 치료를 실용화하기 위해서는 종양 (tumor)의 형성, 원하는 특정 세포로의 분화, 줄기세포의 추출과 정제 및 체외배양을 통한 다량의 세포확보 등의 여러 극복 되어야 할 문제들이 산적해 있어 이를 해결하기 위한 방법들이 모색되고 있다. Although these studies are expected to be a viable method for treating diseases such as spinal cord and brain damage, which have been considered incurable until now, the neural stem cell therapy is expected to be used. There are many problems to be overcome such as differentiation into cells, extraction and purification of stem cells, and securing a large amount of cells through in vitro culture, and methods for solving them have been sought.
한편, 분화된 신경세포에서 뻗어나온 신경돌기는 주변 신경세포까지 뻗어 신경세포간 연결을 이루고, 이를 통하여 신경망을 형성한다. 목적에 맞게 조직되어 만들어진 신경 회로는 신경세포를 이용한 바이오센서, 신경전자회로로 활용되거나 약물 실험, 기초 신경 실험 등에 활용될 수 있어 활발하게 연구가 진행되고 있다. 상기와 같이 신경 회로를 조직하기 위해서는 신경돌기의 신장 방향을 유도하여 원 하는 방향으로 신경 세포가 신경 돌기로 연결되게 하는 것이 필수적이다. On the other hand, the neurites extending from the differentiated neurons to the surrounding nerve cells to form a connection between the neurons, thereby forming a neural network. Neural circuits are organized and organized according to the purpose is being actively researched because they can be used as biosensors, neuroelectronic circuits using nerve cells or drug experiments, basic neuro experiments. In order to organize the neural circuits as described above, it is essential to induce the extension direction of the neurites so that nerve cells are connected to the neurites in a desired direction.
신경줄기세포가 분화된 후 신경세포에서 나온 신경돌기(neurite)는 목적하는 부위까지 뻗어나간다. 그러나 신경돌기가 목표부위에 도달하는 데에 필요한 생물학적 메커니즘에 대하여는 현재까지 알려져 있는 것이 매우 적은 실정이다. 현재 신경돌기의 방향성을 유도하기 위해 화학적, 지형적 방법 등 여러 접근 방법이 연구되고 있다. After neural stem cells are differentiated, the neurites from nerve cells extend to the target site. However, very little is known about the biological mechanisms required for neurites to reach target sites. At present, various approaches such as chemical and topographical methods have been studied to induce the directionality of neurites.
화학적 유도 방법은 세포의 부착, 성장, 신경돌기 확장 향상에 영향을 주는ECM(extra cellular matrix) 물질을 부착 표면에 패터닝하여 이를 따라 신경세포가 부착, 성장하여 신경돌기를 원하는 대로 뻗어나갈 수 있게 하는 것이다. 이러한 패터닝에 주로 사용되는 것으로 RGD (Arginine-Glycine-Aspartate) 도메인을 가지는 ECM 단백질, laminin, polylisine 등이 있다. 또한 최근에는 이러한 물질을 photolithography, 유기 박막, 등을 이용하여 패터닝하여 신경돌기의 신장을 유도하는 방법이 연구되고 있다. 이와 관련된 국내특허로서 대한민국 등록특허 제10-0720056호 “성장인자가 함유된 나노입자가 코팅된 마이크로스피어의 제조 및 이의 신경분화로의 이용 방법”이 있다. 이는 신경재생을 위한 성장인자를 포함한 나노입자를 마이크로스피어에 정전기적으로 코팅하여 신경 재생을 위한 세포 지지체로 사용하는 것이다.Chemical induction methods pattern extra cellular matrix (ECM) substances that affect cell adhesion, growth, and neurite expansion, thereby allowing neurons to attach, grow, and stretch neurites as desired. will be. Commonly used for such patterning are ECM proteins having RGD (Arginine-Glycine-Aspartate) domains, laminin, polylisine, and the like. Recently, a method of inducing neurites extension by patterning such materials using photolithography, organic thin films, and the like has been studied. As a related domestic patent there is a Republic of Korea Patent No. 10-0720056 "Preparation of nano-spheres coated with a growth factor and a method of using them as a neural differentiation". This is to use a cell support for nerve regeneration by electrostatically coating the nanospheres nanoparticles including growth factors for nerve regeneration.
또한 세포를 원하는 방향으로 유도하는 데에 부착 표면의 곡률이 중요한 작용을 한다는 사실이 밝혀진 이후 이를 신경세포의 신경돌기 신장을 유도하는 데 응용하는 지형적(Topographical) 유도 방법도 연구되고 있다. 세포 지지체의 표면 을 식각(etch) 및 그루브(groove) 처리하여 신경돌기의 신장 방향성을 유도하는 것으로, 그루브의 깊이, 너비, 간격 등을 조절하여 신경돌기를 패터닝하여 신경 네트워크를 만들 수 있다. 신경 세포는 이러한 미세 그루브에 한 방향으로 정렬되는 성질이 있어 이를 이용한 세포 유도 기술에 대한 연구가 진행 중이다.In addition, after it has been found that the curvature of the adhesion surface plays an important role in guiding cells in a desired direction, a topographical method of applying the same to induce neural extension of neurons has been studied. The surface of the cell support is etched and grooved to induce elongation of neurites, and the neural networks can be made by patterning neurites by adjusting the depth, width, and spacing of grooves. Neurons have a property of aligning the micro grooves in one direction, and research on cell induction technology using the same is underway.
상기한 방법은 신경돌기의 성장을 효과적으로 유도할 수 있으나, 이를 위한 세포 지지체의 제작과 이용이 불가피하며, 3차원적인 유도가 어렵고 실제 치료에 응용될 경우 세포 지지체를 체내에 삽입해야 하는 불편이 따른다. The above method can effectively induce the growth of neurites, but it is inevitable to manufacture and use a cell support for this purpose, and it is difficult to induce three-dimensional induction and inconvenient to insert the cell support into the body when applied in actual treatment. .
한편, 자성 나노입자란 강자성을 띠는 입자로서 일반적으로 크기는 약 10nm이다. 그 종류로는 Fe2O3, Fe3O4와 같은 산화철, Fe3O4에서 Fe 하나가 다른 자성관련 원자로 바뀐 형태인 CoFe2O4, MnFe2O4와 같은 Ferrite, 자성원자들로 인해 나타나는 산화문제, 전도성 및 안정성을 높이기 위해 귀금속과 합금시킨 FePt, CoPt 등이 있다. 이러한 자성입자는 분말형태보다는 액체에 분산시킨 형태로 여러 분야에 응용하게 된다. 그 이유는 그 용액(ferrofluid: 액체자석)을 만들었을 때, 평소에는 여느 액체들처럼 가만히 있다가 자석을 갖다대는 등의 자기장이 가해지면, 그 자기장이 있는 부분만 자기력선을 따라서 뾰족하게 솟아오르게 되는 현상을 보이기 때문이다. 따라서, 산업적인 응용을 고려할 때, 일반적으로는 전기를 이용한 장치가 대부분이기 때문에 이와 같이 자기장을 이용하면 비용면에서 아주 저렴하고, 자기장의 세기와 방향을 변화시킴으로써 자유자재로 조절할 수도 있는 장점을 가진다. Magnetic nanoparticles, on the other hand, are ferromagnetic particles and are generally about 10 nm in size. The sorters due to Ferrite, the magnetic atoms such as Fe 2 O 3, Fe 3 O 4 and the like of iron oxide, Fe 3 O 4 in the form Fe one change other magnetic related reactor CoFe 2 O 4, MnFe 2 O 4 There are oxidation problems, FePt and CoPt alloyed with precious metals to improve conductivity and stability. Such magnetic particles are applied to various fields in the form of dispersion in liquid rather than powder form. The reason for this is that when a ferrofluid (liquid magnet) is made, if a magnetic field is normally applied like other liquids and then with a magnet, only the part with the magnetic field rises sharply along the magnetic field line. It is because of the phenomenon. Therefore, in consideration of industrial applications, since most electric devices are generally used, the use of a magnetic field in this way is very inexpensive in terms of cost, and can be freely adjusted by changing the strength and direction of the magnetic field. .
자성 나노입자의 제조 방법으로는 이온들이 만나 함께 침전하는 공침법(co-precipitation method)이 대표적이다. Fe3O4를 예로 들면, Fe2 + 및 Fe3 + 수용성 염을 1:2의 몰비율로 물에 녹인 뒤 염기를 가하여 제조된다. 다른 방법으로, 작은 물 입자들이 계면활성제(surfactant)에 의해 유기용매 상에 떠 있는 미셀(micelle)을 만든 뒤, 미셀 내부의 물 층에 반응물(reactant)을 녹여 반응시켜 미셀 내부에서 ㅅ산화철(iron oxide)의 침전을 유발시켜 산화철 나노입자(iron oxide nanoparticle)을 합성하는 마이크로에멀젼(microemulsion) 방법이 있다. 이 방법은 상기 공침법에 비하여 고른 크기의 나노입자(nanoparticle)을 합성할 수 있다. 아울러, 자성 나노입자의 또 다른 합성 방법으로, Fe-oleic acid 복합체를 합성한 뒤 열을 가하여 계면활성제(surfactant)를 용해(lysis)하여 균일한 크기의 철 나노입자를 만든 후 이를 산화시켜 균일한 크기와 모양을 지닌 산화철(iron oxide) 나노입자를 만드는 방법이 있다. 그 외에도 많은 합성 방법들이 연구되고 있다 (T. Hyeon, The Royal Society of Chemistry, 927-934, 2003; Ajay Kumer Gupta et al ., Biomaterials, 26:3995, 2005) Co-precipitation method is a typical method for manufacturing magnetic nanoparticles in which ions meet and precipitate together. Fe 3 O 4, for example, Fe 2 +, and the Fe 3 + salt water-soluble 1: is prepared by adding the rear base is dissolved in water in a molar ratio of 2. Alternatively, small water particles form a micelle suspended in an organic solvent by a surfactant, and then reacted by dissolving the reactant in the water layer inside the micelle. There is a microemulsion method for synthesizing iron oxide nanoparticles by causing precipitation of oxides. This method can synthesize evenly sized nanoparticles (nanoparticle) compared to the co-precipitation method. In addition, as another method of synthesizing magnetic nanoparticles, Fe-oleic acid composites are synthesized and then heated to dissolve a surfactant to form iron nanoparticles of uniform size, which is then oxidized to uniform There is a way to make iron oxide nanoparticles of size and shape. In addition, many synthetic methods have been studied (T. Hyeon, The Royal Society of Chemistry , 927-934, 2003; Ajay Kumer Gupta et al ., Biomaterials , 26: 3995, 2005)
한편, 화학적으로 자성 나노입자를 합성하는 방법 외에 자성 나노입자를 체내에 형성하는 박테리아를 배양하여 자성 나노입자를 수득할 수 있다. 마그네틱 박테리아는 강이나 호수 등의 바닥에 주로 서식하며, 지구 자기장 방향으로 이동하는 주자성을 지닌다. 이는 마그네틱 박테리아가 체내에 긴 사슬 형태로 배열된 마그네타이트(magnetite, Fe3O4)로 이루어진 자성 나노입자들을 합성하는 것에 기인한다. 상기한 마그네틱 박테리아의 유영 특성은 대한민국 등록특허 제10-0337495호 "마그네틱 박테리아를 이용한 수계의 독성 측정방법"에 기재되어 있으며, 상기 특허에서는 수계 오염정도를 마그네틱 박테리아의 유영 속도와 그 분포의 측정에 이용된 바 있다 (S. Seong et al ., Biotechnology and Bioengineering, 76:11, 2001). 또한 대한민국 등록특허 제 10-0792185호 “자성 나노입자를 이용한 세포의 이동과 고정 방법”에서 박테리아로부터 수득한 자성 나노입자를 세포 내에 함입시켜 응용하는데 사용될 수 있음을 보인 바 있다. 그러나, 이상의 기술은 현탁 상태의 세포를 원하는 부분에 이동, 고정시키는 데에 집중하고 있으며, 이미 고정된 신경세포의 신경 돌기 신장을 유도하는 기술의 개발은 미흡하였다. Meanwhile, in addition to chemically synthesizing the magnetic nanoparticles, the magnetic nanoparticles may be obtained by culturing bacteria that form the magnetic nanoparticles in the body. Magnetic bacteria inhabit the bottom of rivers and lakes, and have a magnetism that moves in the direction of the earth's magnetic field. This is due to the synthesis of magnetic nanoparticles composed of magnetite (Fe 3 O 4 ) arranged in a long chain form in the magnetic bacteria. The swimming characteristics of the magnetic bacteria are described in Korean Patent No. 10-0337495 "Method for Measuring Toxicity of Water System Using Magnetic Bacteria". The patent describes the degree of water pollution in measuring the swimming speed and distribution of magnetic bacteria. Have been used (S. Seong et. al ., Biotechnology and Bioengineering , 76:11, 2001). In addition, the Republic of Korea Patent Registration No. 10-0792185 "Method for migration and fixation of cells using magnetic nanoparticles" has been shown that the magnetic nanoparticles obtained from bacteria can be used for application by incorporating into the cells. However, the above technique focuses on the movement and fixation of suspended cells in a desired part, and the development of a technique for inducing neurites extension of already fixed neurons is insufficient.
이에, 본 발명자들은 신경돌기의 성장을 효과적으로 유도하여 신경세포를 패터닝할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 자성 나노입자가 도입된 신경세포를 외부 자기장을 이용하여 신경 돌기 신장 방향을 효율적으로 유도할 수 있다는 사실을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to provide a new method for patterning nerve cells by effectively inducing the growth of neurites, and as a result, the neural cells into which the magnetic nanoparticles have been introduced are efficiently moved by using the external magnetic field. After confirming that it can be derived, the present invention has been completed.
본 발명의 목적은 자성 나노입자 함유 신경세포를 이용하여 신경세포의 신경돌기 신장을 유도하여 신경세포의 패터닝 방법을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a method for patterning neurons by inducing neurites extension of neurons using magnetic nanoparticle-containing neurons.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자성 나노입자 함유 신경세포에 외부 자기장을 가하여 신경세포의 신경돌기의 신장을 유도하는 것을 특징으로 하는 신경세포의 패터닝 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for patterning nerve cells, which induces elongation of neurites of neurons by applying an external magnetic field to magnetic nanoparticle-containing neurons.
본 발명은 자성 나노입자를 이용하는 것을 특징으로 하는 신경세포의 패터닝 방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 패터닝 방법은 기존의 방법들에 비해 특정한 화학물질과 세포 지지체를 이용할 필요가 없으며, 실제 치료에 이용 시 세포 지지체를 조직 내에 넣을 필요가 없어 비침입적인 치료가 가능하고, 세포 종류나 조직 특성에 상관없이 여러 종류에 세포에 적용될 수 있다. 또한, 자성 나노입자가 세포 또는 조직에 미치는 독성은 미미하므로, 주변 조직이나 세포에 악영향을 미칠 우려가 적어, 신경세포에 적용하는 데 효과적이므로, 본 발명에 따른 패터닝 방법은 신경세포를 이용한 바이오센서, 신경전자회로, 신경임플란트, 신약개발을 위한 약물실험 및 기초 신경 실험 등에 유용하다.The present invention has the effect of providing a method for patterning neurons, characterized in that using magnetic nanoparticles. The patterning method according to the present invention does not require the use of specific chemicals and cell scaffolds compared to the existing methods, and does not need to put the cell scaffold into the tissues when used in actual treatment, thereby enabling non-invasive treatment. It can be applied to cells in various kinds regardless of tissue characteristics. In addition, since the toxicity of the magnetic nanoparticles to the cells or tissues is insignificant, there is little possibility of adversely affecting the surrounding tissues or cells and is effective for applying to neurons, so the patterning method according to the present invention is a biosensor using nerve cells. It is useful for neuroelectronic circuits, nerve implants, drug experiments for basic drug development, and basic nerve experiments.
본 발명은 자성 나노입자 함유 신경세포에 외부 자기장을 가하여 신경세포의 신경돌기의 신장을 유도하는 것을 특징으로 하는 신경세포의 패터닝 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for patterning nerve cells, which induces elongation of neurites of neurons by applying an external magnetic field to magnetic nanoparticle-containing neurons.
본원에서 신경세포의 "패터닝 방법"이란 신경세포를 원하는 형태로 만들도록 신경세포의 신경돌기가 뻗어나가는 방향을 유도하는 것을 의미한다. As used herein, the "patterning method" of a neuron means to induce the direction in which the neurites of the neuron extend to make the neuron into the desired shape.
본원에서 "자성 나노입자 함유 신경세포"란, 자성나노입자를 세포 내 함유하거나 또는 자성 나노입자가 세포 표면에 부착된 신경세포를 의미한다.As used herein, the term "magnetic nanoparticle-containing neurons" refers to neurons that contain magnetic nanoparticles intracellularly or to which magnetic nanoparticles are attached to the cell surface.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자 함유 신경세포는 자성 나노입자를 함유한 배양배지에 목적 신경세포를 배양한 다음, 회수하여 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the magnetic nanoparticle-containing neurons may be prepared by culturing the target neurons in a culture medium containing the magnetic nanoparticles, and then collecting them.
본 발명에 있어서, 상기 자성 나노입자는 화학적 방법에 의하여 수득되거나 자성 박테리아를 파쇄하여 수득한 것임을 특징으로 할 수 있다. 상기 자성 박테리아는 마그네토스피릴륨 속 AMB-1 (Magnetospirillum sp. AMB-1)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. In the present invention, the magnetic nanoparticles may be obtained by chemical methods or by crushing magnetic bacteria. The magnetic bacteria may be characterized in that the magnetospirillum sp. AMB-1 ( Magnetospirillum sp. AMB-1), but is not limited thereto.
또한, 상기 자성 나노입자는 다음 중 어느 하나의 방법에 의하여 제조될 수 있다:In addition, the magnetic nanoparticles may be prepared by any one of the following methods:
(a) 금속이온들을 함께 침전하여 제조하는 공침법(co-precipitation);(a) co-precipitation prepared by precipitation of metal ions together;
(b) 미셀 내부에 금속 산화물을 침전시켜 제조하는 마이크로에멀젼 방법; 및(b) a microemulsion method prepared by precipitating a metal oxide inside the micelle; And
(c) 금속-올레산 복합물을 합성한 다음 가열하고 산화시켜 제조하는 방법.(c) A method of synthesizing a metal-oleic acid complex followed by heating and oxidizing.
본 발명에 있어서, 상기 목적 신경세포는 세포치료제용 신경세포, 세포치료제용 신경줄기세포 및 세포치료제용 신경줄기세포로부터 분화된 세포로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 상기 세포치료제용 신경세포라면 어떤 종류의 세포든지 가능하고, 상기 세포치료용 신경줄기세포로부터 분화된 세포는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 올리고덴트로사이트(oligodentrocyte) 등인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the target nerve cells may be selected from the group consisting of cells differentiated from neuronal cells for cell therapy, neuronal stem cells for cell therapy and neuronal stem cells for cell therapy, but if the neuronal cells for cell therapy Any kind of cells are possible, and the cells differentiated from the neural stem cells for cell therapy may be characterized in that the neurons (neuron), astrocytes (astrocyte) and oligodentrocyte (oligodentrocyte), etc., but is not limited thereto. no.
본원에서, 세포치료제(Cell Therapy Products)란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 혹은 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 행위를 통해 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 신개념 의약품을 말한다. As used herein, cell therapy products refer to the proliferation or selection of viable autologous, allogenic, or xenogenic cells in vitro to restore the function of cells and tissues, or by other methods of biological It is a new concept medicine that is used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention by changing its characteristics.
본 발명의 실시예에서는 염화철(FeCl3)에 Na-Oleate를 가하여 만들어진 Fe-oleate를 높은 온도의 용액 하에서 열분해하여 얻은 산화철 자성 나노입자에 인지질을 싼 뒤 형광물질인 FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate)을 붙여 만든 자성 나노입자를 PC12 세포 내에 도입하였으나, 이에 제한되지 않고, 공침법이나 마이크로에멀전 방법 등 다른 제조 방법이나 다른 작용기로 표면을 처리한 자성 나노입자 또한 적용 가능하다. 또한 마그네틱 박테리아를 배양배지에서 배양한 다음, 파쇄하여 자성 나노입자를 분리 및 정제하여 수득된 지질 이중막으로 덮여 있는 자성 나노입자 또한 적용 가능하다.In an embodiment of the present invention, Fe-oleate made by adding Na-Oleate to iron chloride (FeCl 3 ) is pyrolyzed in iron oxide magnetic nanoparticles obtained by pyrolysis under a high temperature solution, and then fluorescent substance FITC (Fluorescein-5-isothiocyanate) Magnetic nanoparticles prepared by the addition of the nanoparticles were introduced into the PC12 cells. However, the present invention is not limited thereto, and magnetic nanoparticles treated with other functional methods such as coprecipitation method or microemulsion method or other functional groups are also applicable. In addition, magnetic nanoparticles covered with a lipid bilayer obtained by culturing the magnetic bacteria in a culture medium and then crushing the magnetic nanoparticles are also applicable.
상기 방법을 통해 수득한 자성 나노입자를 세포 배양 배지에 첨가하여, 세포 내로 도입하였다. PC12 세포 (pheochromocytoma cells)는 rat phochromocytoma(크롬 친화성 세포종) cell line으로 ATCC catalog number는 CRL-1721(http://www.atcc.org)이다. 또한, 쥐에서 유래된 세포로, 신경성장영양인자(Nerve Growth Factor, NGF) 등에 의해 신경 세포처럼 분화하는 신경세포와 유사한 세포(neuron-like cell)로 분화하는 특성이 있어, in vitro 신경세포 분화모델로 널리 쓰이는 세포주이다. 하기 실시예에서는 PC12 세포를 이용하였으나, 이에 제한되지 않고, 줄기 세포를 포함한 다른 여러 세포에도 용이하게 적용가능하다. 상기 자성 나노입자가 도입된 세포를 외부 자기장을 이용하여 원하는 방향으로 이동시키고 고정하였다.Magnetic nanoparticles obtained through the above method were added to the cell culture medium and introduced into the cells. PC12 cells (pheochromocytoma cells) are rat phochromocytoma cell lines and the ATCC catalog number is CRL-1721 ( http://www.atcc.org ). In addition, cells derived from rats have the property of differentiating into neuron-like cells that differentiate like neurons by neuronal growth factor (NGF) and the like. Cell line widely used as a model. In the following examples, PC12 cells were used, but the present invention is not limited thereto and can be easily applied to various other cells including stem cells. The cells into which the magnetic nanoparticles were introduced were moved and fixed in a desired direction using an external magnetic field.
본 발명에 따른 자기적(Magnetic) 유도 방법은 자성나노입자를 세포 내 또는 세포 표면에 도입한 후, 외부 자기장에 의해 세포를 정렬시키고 자기장의 방향을 조정하여 신경돌기가 뻗어나가는 방향을 유도하는 방법으로, 종래의 화학적, 지형적 방법에서 문제가 되는 부분들을 상당부분 해결할 수 있으며, 3차원적인 유도가 가능하고 세포 지지체가 필요 없어 실제 세포치료 응용에 유리한 특징을 지닌다.Magnetic induction method according to the present invention is a method of inducing the direction in which the neurites extend by introducing the magnetic nanoparticles into the cell or the cell surface, align the cells by the external magnetic field and adjust the direction of the magnetic field As a result, it is possible to solve a large part of the problem in the conventional chemical and topographic methods, it is possible to three-dimensional induction and does not need a cell support has the characteristics that are advantageous for the actual cell therapy applications.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
실시예Example 1: 자성 나노입자 함유 1: Contains magnetic nanoparticles PC12PC12 세포 제조 Cell manufacturing
염화철(FeCl3)에 Na-Oleate를 가하여 만들어진 Fe-oleate를 높은 온도의 용액 하에서 열분해하여 얻은 산화철 자성 나노입자에 인지질을 싼 뒤 형광물질인 FITC(Fluorescein-5-isothiocyanate)을 붙여 만든 산화철 자성 나노입자를 세포 배양 배지에 첨가하여 PC12 세포(ATCC Catalog No. CRL-1721)에 상기 자성 입자를 도입하였다. Fe-oleate made by adding Na-Oleate to iron chloride (FeCl 3 ) was wrapped in phospholipids by fermenting iron oxide magnetic nanoparticles obtained by pyrolysis under high temperature solution, and then iron oxide magnetic nanoparticles made by attaching fluorescent material, Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC). Particles were added to the cell culture medium to introduce the magnetic particles into PC12 cells (ATCC Catalog No. CRL-1721).
PC12 세포는 DMEM 배지에 15% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)를 첨가한 배지로 배양하였으며, 자성 나노입자를 상기 배지에 20㎍/ml의 농도가 되도록 첨가한 자성 나노입자 배지를 준비하였다. PC12 cells were cultured in a medium to which 15% Fetal Bovine Serum (FBS) was added to DMEM medium, and magnetic nanoparticle medium in which magnetic nanoparticles were added to the medium at a concentration of 20 µg / ml was prepared. .
24-웰 플레이트(웰 당 바닥 면적 1.9cm2)에 5.0 × 104/cm2의 농도로 웰 당 1ml씩 접종한 뒤 약 24시간 동안 배양함으로써, 자성 입자가 세포 속으로 도입되도록 하였다. 실험군의 경우 앞서 만든 자성 나노입자 배지를, 대조군의 경우 DMEM(FBS 15%) 배지를 사용하였다. Magnetic particles were introduced into the cells by inoculating 1 ml per well at a concentration of 5.0 × 10 4 / cm 2 in a 24-well plate (bottom area 1.9 cm 2 per well) and incubating for about 24 hours. In the experimental group, the magnetic nanoparticle medium prepared above was used, and in the control group, DMEM (FBS 15%) medium was used.
도 1은 자성 나노입자가 도입된 PC12 세포의 광학 사진과 형광 사진이다. 형광 사진에서 확인할 수 있듯이, FITC가 결합된 자성 나노입자가 세포 내에 효과적으로 도입되어 광학 사진상의 같은 위치에서 형광을 내는 것을 관찰할 수 있다.1 is an optical photograph and a fluorescence photograph of PC12 cells into which magnetic nanoparticles are introduced. As can be seen from the fluorescence picture, it can be observed that the magnetic nanoparticles to which FITC is bound are effectively introduced into the cell to fluoresce at the same position on the optical picture.
실시예Example 2: 본 발명에 따른 자성 나노입자가 도입된 세포의 생존율 2: survival rate of cells into which the magnetic nanoparticles according to the present invention are introduced
실시예 1의 자성 나노입자가 도입된 세포와 자성 나노입자가 도입되지 않은 대조군에 대하여, 세포의 생존율을 측정하였다. The viability of the cells was measured for the cells into which the magnetic nanoparticles of Example 1 were introduced and the control to which the magnetic nanoparticles were not introduced.
실시예 1과 같이, 24-웰 플레이트에 접종된 PC12 세포에 5, 10, 20㎍/ml의 세 가지 농도로 상기 산화철 자성 나노입자를 처리한 후, 72시간 후에 각 세포의 생존율을 자성 나노입자가 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하였다. 세포 생존율은 부착되어 있는 세포를 트립신-EDTA 처리하여 떼어낸 다음, 현탁하여 0.1ml 취한 뒤 현탁한 세포를 0.4% 트라이판 블루 용액으로 염색하여 헤모사이토미터에서 전체 세포수와 죽은 세포수를 세는 방법으로 측정하였다. As in Example 1, PC12 cells inoculated into 24-well plates were treated with the iron oxide magnetic nanoparticles at three concentrations of 5, 10, and 20 µg / ml, and after 72 hours, the viability of each cell was measured. Was compared to untreated control cells. Cell viability is determined by removing trypsin-EDTA from attached cells, suspending 0.1 ml of the cells, and counting the total and dead cells on a hemocytometer by staining the suspended cells with 0.4% trypan blue solution. Measured by.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 72시간 후의 생존율은 각각 100%, 98%, 97%으로 자성입자가 세포에 미치는 독성은 거의 없음이 관찰되었다.As a result, as shown in Figure 2, the survival rate after 72 hours was 100%, 98%, 97%, respectively, it was observed that the magnetic particles have little toxicity on the cells.
실시예Example 3: 본 발명에 따른 자성 나노입자를 이용한 신경세포의 신경돌기 신장 유도 3: induction of neurites in neural cells using magnetic nanoparticles according to the present invention
실시예 1의 자성 나노입자가 도입된 PC12세포의 신경돌기 신장을 다음과 같이 유도하였다. Neurites elongation of PC12 cells into which the magnetic nanoparticles of Example 1 were introduced were induced as follows.
자성 나노입자가 도입된 PC12 세포를 세포 배양 디쉬에 접종한 뒤, 세포가 디쉬 바닥에 부착된 후 세포 배양 배지에 신경 성장 인자(Neuronal Growth Factor, NGF)를 10ng/ml의 농도로 첨가하여 PC12세포의 신경돌기 성장을 유도하였다. 외부 자기장은 디쉬 옆면에 정방향의 네오디뮴 영구자석을 붙여 세포에 가해졌다. 현미경(TE300; Nikon사 제조)을 이용하여 자성 나노입자가 도입된 PC12 세포의 신경돌기 신장 방향을 관찰하였으며, 현미경에 연결된 카메라를 이용하여 이미지를 촬영하였다.PC12 cells into which the magnetic nanoparticles were introduced were inoculated into the cell culture dish, and after the cells had adhered to the bottom of the dish, neuronal growth factor (NGF) was added to the cell culture medium at a concentration of 10 ng / ml. Neurite outgrowth was induced. The external magnetic field was applied to the cells with a forward neodymium permanent magnet on the side of the dish. The direction of neurites extension of PC12 cells into which magnetic nanoparticles were introduced was determined using a microscope (TE300; manufactured by Nikon), and images were taken using a camera connected to the microscope.
그 결과, 도 3의 A에 나타난 바와 같이, 자성 나노입자가 도입된 PC12 세포에서 외부 자기장에 의하여 일정한 방향으로 신경 돌기가 신장되었음을 확인할 수 있었다 (좌측 사진). 이에 반하여, 도 3의 A의 우측 사진은 자성 나노입자가 처리되지 않은 대조군으로 신경 돌기가 방사형으로 신장되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 자성 나노입자가 도입된 세포는 외부 자기장에 의하여 신경돌기의 신장 방향이 유도될 수 있음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 3A, it was confirmed that the neurites elongated in a predetermined direction by an external magnetic field in the PC12 cells into which the magnetic nanoparticles were introduced (left photograph). On the contrary, in the right picture of A of FIG. 3, it was confirmed that the neurites elongated radially as a control group in which the magnetic nanoparticles were not treated. That is, it was confirmed that the cells in which the magnetic nanoparticles were introduced may be induced to extend the neurites by an external magnetic field.
또한, 도 3의 B에 나타난 바와 같이, 자기장에 의하여 세로 방향으로 신장된 신경 돌기를 확인할 수 있었다 (우측 광학사진, 좌측 형광사진) 형광 사진에서 보이는 녹색 빛은 PC12 세포에 처리한 산화철 자성 나노입자의 표면에 처리되어 있는 FITC에 의한 것으로, 이를 통해 자성 나노입자가 도입된 세포에서 효과적으로 신경 돌기 신장 방향이 유도되었음을 알 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 3B, the neurites elongated in the longitudinal direction by the magnetic field could be confirmed (right optical photograph, left fluorescence photograph). The green light seen in the fluorescence photograph was the iron oxide magnetic nanoparticles treated with PC12 cells. FITC is treated on the surface of the, it can be seen that effectively induced the direction of neural processes in the cells introduced magnetic nanoparticles.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those skilled in the art, such a specific description is only a preferred embodiment, which is not limited by the scope of the present invention Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
도 1은 자성 나노입자가 도입된 PC12 세포의 사진이다.1 is a photograph of PC12 cells into which magnetic nanoparticles are introduced.
도 2는 자성 나노입자가 도입된 PC12 세포의 생존율을 나타낸 도면이다.2 is a diagram showing the survival rate of PC12 cells in which magnetic nanoparticles are introduced.
도 3은 자성 나노입자가 도입된 PC12 세포가 외부 자기장 방향으로 신경돌기가 신장되었음을 보여주는 사진이다.3 is a photograph showing that neurites elongated in the direction of an external magnetic field of PC12 cells into which magnetic nanoparticles are introduced.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080035708A KR20090110101A (en) | 2008-04-17 | 2008-04-17 | Method for Patterning of Neuronal Cells Using Magnetic Nanoparticle |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080035708A KR20090110101A (en) | 2008-04-17 | 2008-04-17 | Method for Patterning of Neuronal Cells Using Magnetic Nanoparticle |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090110101A true KR20090110101A (en) | 2009-10-21 |
Family
ID=41537970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080035708A KR20090110101A (en) | 2008-04-17 | 2008-04-17 | Method for Patterning of Neuronal Cells Using Magnetic Nanoparticle |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20090110101A (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102011007740A1 (en) | 2010-04-26 | 2012-01-19 | Electronics And Telecommunications Research Institute | Diagnosing Alzheimer's disease using phototransistor, involves placing phototransistor in place, fixing cells on surface of channel layer, and sensing difference of photocurrents induced by cells |
| US9023607B2 (en) | 2010-04-26 | 2015-05-05 | Intellectual Discovery Co., Ltd. | Method for early diagnosis of alzheimer'S disease using phototransistor |
| US9541561B2 (en) | 2012-06-14 | 2017-01-10 | Electronics And Telecommunications Research Institute | Method for diagnosing Alzheimer's disease using biomaterial |
| WO2018008779A1 (en) * | 2016-07-07 | 2018-01-11 | 서강대학교 산학협력단 | Method for controlling growth direction of neuron dendrite |
| KR101953472B1 (en) * | 2017-08-22 | 2019-03-04 | 서강대학교산학협력단 | Cell culture chip for modulating direction of neuronal dendrite comprising complex nanostructure and method for manufacturing thereof |
| KR20190140538A (en) | 2018-05-31 | 2019-12-20 | 서강대학교산학협력단 | Basal Ganglia Mimetic Chip for Screening Therapeutic Agents for Diseases of the Brain and Nervous System Diseases |
-
2008
- 2008-04-17 KR KR1020080035708A patent/KR20090110101A/en not_active Application Discontinuation
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102011007740A1 (en) | 2010-04-26 | 2012-01-19 | Electronics And Telecommunications Research Institute | Diagnosing Alzheimer's disease using phototransistor, involves placing phototransistor in place, fixing cells on surface of channel layer, and sensing difference of photocurrents induced by cells |
| US9023607B2 (en) | 2010-04-26 | 2015-05-05 | Intellectual Discovery Co., Ltd. | Method for early diagnosis of alzheimer'S disease using phototransistor |
| US9541561B2 (en) | 2012-06-14 | 2017-01-10 | Electronics And Telecommunications Research Institute | Method for diagnosing Alzheimer's disease using biomaterial |
| WO2018008779A1 (en) * | 2016-07-07 | 2018-01-11 | 서강대학교 산학협력단 | Method for controlling growth direction of neuron dendrite |
| KR101953472B1 (en) * | 2017-08-22 | 2019-03-04 | 서강대학교산학협력단 | Cell culture chip for modulating direction of neuronal dendrite comprising complex nanostructure and method for manufacturing thereof |
| KR20190140538A (en) | 2018-05-31 | 2019-12-20 | 서강대학교산학협력단 | Basal Ganglia Mimetic Chip for Screening Therapeutic Agents for Diseases of the Brain and Nervous System Diseases |
| US11959909B2 (en) | 2018-05-31 | 2024-04-16 | Sogang University Research Foundation | Basal ganglia-on-chip for screening therapeutic agents for brain and nervous system diseases |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Polydopamine and its derivative materials: synthesis and promising applications in energy, environmental, and biomedical fields | |
| Kim et al. | Cytotoxicity of ferrite particles by MTT and agar diffusion methods for hyperthermic application | |
| Lu et al. | Biogenic and biomimetic magnetic nanosized assemblies | |
| KR20090110101A (en) | Method for Patterning of Neuronal Cells Using Magnetic Nanoparticle | |
| Liu et al. | Control the neural stem cell fate with biohybrid piezoelectrical magnetite micromotors | |
| JP2007518710A (en) | Method | |
| DE102005030986B4 (en) | Use of rotating magnetic nanoparticles | |
| BRPI0919036B1 (en) | magnetic orientation method | |
| WO2012105796A2 (en) | Rotating nanowire and method for inducing cell necrosis using same | |
| Munshi et al. | Transient magnetothermal neuronal silencing using the chloride channel anoctamin 1 (TMEM16A) | |
| US11959909B2 (en) | Basal ganglia-on-chip for screening therapeutic agents for brain and nervous system diseases | |
| Li et al. | A review of magnetic ordered materials in biomedical field: Constructions, applications and prospects | |
| Stone et al. | Highly stable multi-anchored magnetic nanoparticles for optical imaging within biofilms | |
| Apu et al. | Biomedical applications of multifunctional magnetoelectric nanoparticles | |
| KR100792185B1 (en) | Method for Fixing or Mobilizing Cells Using Magnetic Nanoparticle | |
| Ivanković et al. | Cytotoxicity of nanosize V2O5 particles to selected fibroblast and tumor cells | |
| Jiang et al. | Nanomaterial-based cell sheet technology for regenerative medicine and tissue engineering | |
| Chansoria et al. | Untethered: Using remote magnetic fields for regenerative medicine | |
| Yang et al. | Rapid construction and enhanced vascularization of microtissue using a magnetic control method | |
| WO2010061474A1 (en) | Connecting magnetic element, connecting magnetic element manufacturing method, connecting magnetic element injecting device, connecting magnetic element injection control system, magnetic field control device, and connecting magnetic element injection control method | |
| CN104258401A (en) | Magnetic nano-chains and preparation method thereof | |
| Naumenko et al. | Magnetically functionalized cells: fabrication, characterization, and biomedical applications | |
| Thakare et al. | Functionalization of biogenic and biomimetic magnetic nanosystems for biomedical applications | |
| DE102005028899B4 (en) | Skin equivalent and method for producing the same | |
| WO2002064122A1 (en) | Bioactive and biocompatible conjugates with magnetic properties and a method for producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20100831 Effective date: 20110513 |