KR20090100983A - Transgenic mouse expressing prion protein (prp) gene of chinese water deer(hydropotes inermis argyropus) - Google Patents

Transgenic mouse expressing prion protein (prp) gene of chinese water deer(hydropotes inermis argyropus) Download PDF

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최인수
이중복
박승용
송창선
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건국대학교 산학협력단
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Abstract

PURPOSE: A transgenic mouse expressing a prion protein gene of elk is provided to be used as an experimental animal for studying prion diseases including a chronic wasting disease generated in deer family animals. CONSTITUTION: A method for an expressing process of a prion protein gene of elk includes the following steps of: infecting deformed prion protein on a transgenic mouse expressing the prion protein gene of the elk; causing chronic wasting diseases; injecting a test object material; and screening an improvement state of the chronic wasting diseases of the deer.

Description

고라니의 프리온 단백질(ＰｒＰ) 유전자를 발현하는 형질전환 마우스 {Transgenic mouse expressing prion protein (PrP) gene of Chinese water deer(Hydropotes inermis argyropus)}Transgenic mouse expressing prion protein (PrP) gene of Chinese water deer (Hydropotes inermis argyropus)}

본 발명은 고라니의 프리온 단백질(PrP) 유전자를 발현하는 형질전환 마우스에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 서열번호 1의 고라니 프리온 단백질 유전자가 도입되어 이를 발현하는 형질전환 마우스(수탁번호: KCTC 11283BP)에 관한 것이다. The present invention relates to a transgenic mouse expressing an elk prion protein (PrP) gene, and more particularly, to a transgenic mouse having an elk prion protein gene of SEQ ID NO: 1 being introduced and expressing it (Accession Number: KCTC 11283BP). will be.

프리온 단백질(prion protein, PrP)은 사람 및 동물의 중추신경계에 존재하는 단백질로, 정상 프리온 단백질(prion protein, PrPC)이 변형된 형태의 프리온 단백질(PrPSc)로 전환된 후 변형 프리온 단백질이 뇌 및 중추신경계에 축적되면서 뇌 조직의 괴사를 유발하고 이럼으로써 해면상 뇌증을 유발하는 프리온 질병(Prion disease)의 원인 물질로 알려져 있다. 이러한 프리온 질병에 감염된 사람 및 동물에서 관찰되는 주요 임상증상은 장시간의 잠복기를 거친 후 발생하는 운동실조, 기타 뇌질환 및 사망 등이다. Prion protein (PrP) is a protein present in the central nervous system of humans and animals.The prion protein (PrP C ) is converted into a modified prion protein (PrP Sc ) and then modified prion protein. Accumulation in the brain and central nervous system is known as a causative agent of prion disease that causes necrosis of brain tissue and thereby causes cavernous encephalopathy. The main clinical symptoms observed in humans and animals infected with these prion diseases are ataxia and other brain diseases and deaths that occur after prolonged incubation.

특히, 프리온 질병 중 동물에서 발생하는 것으로는 소 해면상 뇌증(Bovine spongiform encephalitis, BSE) 및 사슴 만성 소모성 질병(Chronic wasting disease, CWD) 등이 대표적인데, 사슴 만성 소모성 질병(CWD)은 엘크, 검은꼬리사슴, 흰꼬리사슴 등과 같은 사슴과 동물에서만 발생하는 뇌 질병으로 사슴 만성 소모성 질병이 발생한 동물들에서는 소 해면상 뇌증(BSE)과 유사한 뇌 병변을 관찰할 수 있다.In particular, the prion disease is caused by animals such as bovine spongiform encephalitis (BSE) and chronic wasting disease (CWD), and deer chronic wasting disease (CWD) is elk, black tail Brain disease, which occurs only in deer and animals such as deer and white-tailed deer, can be found in animals with chronic wasting diseases, similar to bovine spongiform encephalopathy (BSE).

이러한 만성 소모성 질병의 대표적 특징은 수평감염으로, 만성 소모성 질병에 감염된 사슴과 동거하는 다른 건강한 사슴들도 일정 기간이 경과하면 만성 소모성 질병에 감염된다는 것이다. 만성 소모성 질병에 감염된 사슴에서 유래한 변형 프리온 단백질이 감염되지 않은 사슴에 침입하여 사슴 체내에 존재하던 정상 프리온 단백질이 변형되면서 만성 소모성 질병으로 발전한다. A typical characteristic of these chronic wasting diseases is horizontal infection, and other healthy deer living together with deer infected with chronic wasting diseases are also infected with chronic wasting diseases after a certain period of time. The modified prion protein derived from the deer infected with chronic wasting disease invades the uninfected deer, and the normal prion protein present in the deer body is modified and develops into a chronic wasting disease.

상기 프리온 질병의 발생 기전 연구 및 감염 실험을 수행하기 위하여 가장 좋은 방법은, 만성 소모성 질병에 감염된 사슴 또는 엘크의 뇌 유제를 목적동물인 소 및 사슴들에게 직접 접종하여 변형 프리온 단백질을 인위적으로 감염시킴으로써 질병을 유발하는 방법이다. 그러나 이러한 방법은 고비용이 요구되는 경제적인 문제 및 질병이 유발되는데 필요한 시간이 수년이 요구된다는 시간적인 문제가 있다.In order to conduct research on the mechanism of occurrence of prion diseases and experiments of infection, the best method is to directly inoculate a brain emulsion of a deer or elk infected with a chronic wasting disease by directly inoculating cows and deer as target animals to artificially infect the modified prion protein. It's a way of causing disease. However, these methods have high cost and economic problems, and the time required for the disease to take several years.

상기와 같이 사슴과 동물에서 발생하는 만성 소모성 질병 연구시 발생하는 경제적, 시간적 단점을 극복할 수 있는 방법은 목적 동물의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스를 개발하는 것이 될 수 있다. As described above, a method of overcoming the economic and temporal shortcomings occurring in the study of chronic wasting diseases occurring in deer and animals may be to develop a transgenic mouse expressing the prion protein gene of the target animal.

이에 본 발명자는 사슴과 동물에서 발생하는 만성 소모성 질병을 연구하기 위한 실험동물로써 고라니의 프리온 단백질 유전자로 형질전환된 마우스를 제작하고, 도입된 고라니의 프리온 단백질 유전자가 이 형질전환 마우스에서 정상적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors fabricated a mouse transformed with an elk prion protein gene as an experimental animal for studying chronic wasting disease occurring in deer and animals, and it was confirmed that the introduced elk prion protein gene was normally expressed in the transgenic mouse. The present invention was completed by confirming.

본 발명은 고라니(Hydropotes inermis argyropus)의 프리온 단백질(PrP) 유전자를 발현하는 형질전환 마우스를 제공한다.The present invention provides a transgenic mouse expressing the prion protein (PrP) gene of Elk ( Hypotae inermis argyropus ).

본 발명의 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스는 변형된 프리온 단백질을 감염시켜 질병을 유발하는 과정이 용이하며, 질병이 유발되는 시간이 수개월로 단축되는 등의 장점이 있다. 또한, 이 형질전환 마우스에 변형 프리온 단백질 감염 후 유발되는 질병의 증상이 목적동물인 소 및 사슴에서 발생하는 것과 매우 유사하다. The transgenic mouse expressing the prion protein gene of the elk of the present invention has an advantage such that it is easy to cause the disease by infecting the modified prion protein, and the time to induce the disease is shortened to several months. In addition, the symptoms of the disease induced after the modified prion protein infection in the transgenic mouse are very similar to those occurring in cows and deer as target animals.

따라서 본 발명의 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스는 사슴과 동물에서 발생하는 만성소모성 질병을 포함하는 프리온 질병을 연구하 기 위한 실험동물로써 중요한 도구로써 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the transgenic mouse expressing the prion protein gene of the elk of the present invention can be usefully used as an important animal as an experimental animal for studying prion diseases, including chronic wasting diseases occurring in deer and animals.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 수정란 단계에서 고라니의 프리온 단백질(PrP) 유전자가 도입되어, 체세포와 생식세포에 고라니의 프리온 단백질 유전자를 포함하고, 이로부터 고라니의 프리온 단백질 유전자가 발현되는 형질전환 마우스를 제공한다. The present invention provides a transgenic mouse in which the prion protein (PrP) gene of the elk is introduced at the fertilized egg stage, and the prion protein gene of the elk is included in somatic cells and germ cells, from which the prion protein gene of the elk is expressed.

상기 형질전환 마우스는 서열번호 1의 고라니 프리온 단백질(PrP) 유전자가 도입되어 이를 발현하고 수정란이 수탁번호 KCTC 11283BP로 기탁된 것을 특징으로 한다. The transgenic mouse is characterized in that the Elk prion protein (PrP) gene of SEQ ID NO: 1 was introduced and expressed, and the fertilized egg was deposited with accession number KCTC 11283BP.

또한, 본 발명은 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스에 변형 프리온 단백질을 감염시켜 만성 소모성 질병을 유발한 다음, 시험대상물질을 투여하고 사슴 만성 소모성 질병의 증상 개선 정도를 관찰하여 스크리닝함을 특징으로 하는 사슴과 동물에서 발생하는 만성 소모성 질병 치료제 또는 개선제 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention infects a transgenic mouse expressing the prion protein gene of the elk to induce a chronic wasting disease, and then screening by administering a test substance and observing the degree of symptom improvement of deer chronic wasting disease It provides a method for screening a therapeutic agent or amelioration agent for chronic wasting diseases occurring in deer and animals.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.

[실시예] 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스 제작EXAMPLES Preparation of Transgenic Mouse Expressing an Elk Prion Protein Gene

1) 고라니 프리온 단백질 (PrP) 유전자의 형질전환용 벡터 내로의 클로닝1) Cloning of Elk Prion Protein (PrP) Gene into Transformation Vector

가. 고라니 프리온 단백질 (PrP) 유전자 준비end. Elk Prion Protein (PrP) Gene Preparation

본 발명에서 사용된 고라니의 프리온 단백질 유전자 (771-bp, 도 1)로는 등록특허 10-0756284의 것을 사용하였다 (서열번호 1, 서열번호 2는 서열번호 1의 유전자가 발현될 때의 아미노산 서열임). Prion protein gene (771-bp, Fig. 1) of the elk used in the present invention was used in the registered patent 10-0756284 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence when the gene of SEQ ID NO: 1 is expressed) ).

고라니의 프리온 단백질 유전자를 함유하고 있는 TA 클로닝 벡터 DNA를 EcoRI 제한효소를 이용하여 절단하였다. 이때 사용된 조건은 다음과 같다. 즉 30㎕의 플라스미드 DNA, 5㎕의 반응 완충액, 1㎕의 EcoRI 제한효소, 14㎕의 증류수를 넣은 튜브를 37℃에서 2시간 반응시킨 후 전기영동을 수행하여 절단된 795 bp의 고라니 프리온 단백질 유전자를 포함하고 있는 DNA 밴드를 확인하였다 (도 2). 그 다음 절단된 DNA 밴드를 DNA 정제키트(Qiagen사)를 이용하여 정제하였다.TA cloning vector DNA containing the elk prion protein gene was digested using EcoRI restriction enzyme. The conditions used at this time are as follows. That is, the 795 bp Elk prion protein gene was cut by electrophoresis after 30 hours of plasmid DNA, 5 μl of reaction buffer, 1 μl of EcoRI restriction enzyme, and 14 μl of distilled water at 37 ° C. for 2 hours. The DNA band containing the was confirmed (FIG. 2). Then, the cleaved DNA band was purified using a DNA purification kit (Qiagen).

나. 형질전환용 벡터 준비I. Transformation vector preparation

또한, 고라니의 프리온 유전자를 발현시키기 위하여 사용된 형질전환용 벡터는 치킨 베타-액틴 프로모터(chicken beta-actin promoter)를 보유한 pCAGGS (Dr. Tokuhisa 제공, Chiba University, Japan)(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene 108, 193-200 (1991) Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector)가 사용되었으며 벡터의 구조는 도 3과 같다. In addition, the transformation vector used to express the elk prion gene was pCAGGS (chicken beta-actin promoter) (Dr. Tokuhisa, Chiba University, Japan) (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene 108, 193-200 (1991) Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector) was used as shown in FIG.

다. 형질전환용 벡터 내로 고라니 프리온 단백질 (PrP) 유전자 클로닝All. Cloning Elk Prion Protein (PrP) Genes into Transformation Vectors

고라니의 프리온 유전자는 다음과 같은 방법에 의하여 pCAGGS 벡터 내로 삽입되어 발현되었다. The prion gene of the elk was inserted into the pCAGGS vector and expressed by the following method.

즉, 상기 EcoRI 제한 효소에 의해 절단된 고라니 프리온 단백질 유전자 DNA(795 bp)를 pCAGGS 벡터에 라이게이션(ligation) 시키기 위해 pCAGGS 벡터를 EcoRI으로 절단하였다. 이때 사용된 조건은 다음과 같다. 즉 30㎕의 pCAGGS 벡터, 5㎕의 반응 완충액, 1㎕의 EcoRI, 14㎕의 증류수를 포함한 튜브를 37℃에서 두 시간 처리하였다. 그 다음 셀프 라이게이션을 방지하기 위하여 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)로 처리하였다. 이때의 조건은 다음과 같다. 즉 50㎕의 EcoRI으로 절단된 pCAGGS 벡터, 2㎕의 CIP , 5㎕의 반응 완충액, 43㎕의 증류수를 포함한 튜브를 37℃에서 한 시간 반 동안 반응을 시켰다. 이후 반응물을 아가로즈 젤에서 전기영동한 후, 젤 상의 플라스미드 DNA 밴드를 분리하여 DNA 정제키트(Qiagen사)를 이용하여 추출하였다.That is, the pCAGGS vector was digested with EcoRI in order to ligation of the elk prion protein gene DNA (795 bp) digested with the EcoRI restriction enzyme to the pCAGGS vector. The conditions used at this time are as follows. That is, a tube containing 30 μl of pCAGGS vector, 5 μl of reaction buffer, 1 μl of EcoRI, and 14 μl of distilled water was treated at 37 ° C. for two hours. It was then treated with Cal Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) to prevent self-ligation. The conditions at this time are as follows. That is, a tube containing a pCAGGS vector digested with 50 μl of EcoRI, 2 μl of CIP, 5 μl of reaction buffer, and 43 μl of distilled water was reacted at 37 ° C. for an hour and a half. After the reaction was electrophoresed in agarose gel, the plasmid DNA band on the gel was separated and extracted using a DNA purification kit (Qiagen).

이후 EcoRI에 의해 절단된 pCAGGS 벡터 1㎕, EcoRI에 의해 절단된 고라니 프리온 단백질 유전자 DNA 4㎕, T4 라이게이즈(ligase) 1㎕, 반응 완충액 1㎕, 증류수 3㎕를 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 라이게이션 시켰다. 라이게이션 된 반응물을 M15 컴피턴트 세포(competent cell) 내로 다음과 같은 방법에 의해 형질전환(transformation) 시켰다. 즉 M15 컴피턴트 세포 100㎕에 라이게이션 반응물 3㎕를 분주 후 얼음에서 20분간 반응시켰다. 이후 42℃에서 90초간 열 충격 처리를 하고 psi 액체배지(broth)를 500㎕ 첨가한 후에 한 시간 동안 37℃에서 진탕배양 후 암피실린 (100㎍/㎖)이 포함된 LB 아가 플레이트에 50, 100, 200㎕씩 도말하였 다. LB 아가 플레이트는 이후 37℃ 세균배양기에서 16시간 배양시킨 후 콜로니를 선택하여 암피실린 (100㎍/㎖)이 포함된 LB 액체 배지에서 배양 시킨 후 플라스미드 DNA (Qiagen사)를 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 EcoRI 제한효소로 절단하여 795-bp의 DNA를 확인하였다 (도 4). 또한 고라니의 프리온 유전자가 pCAGGS 벡터에 정방향으로 삽입되었음을 확인하기 위해 KpnI과 HindIII 제한효소를 이용하여 절단하여 1033-bp의 DNA를 확인하였다 (도 5).Then, 1 μl of pCAGGS vector cleaved by EcoRI, 4 μl of Elk prion protein gene DNA cleaved by EcoRI, 1 μl of T4 ligase, 1 μl of reaction buffer, and 3 μl of distilled water were added for 18 hours at 4 ° C. While ligation. The ligated reaction was transformed into M15 competent cells by the following method. That is, 3 μl of the ligation reaction was dispensed into 100 μl of M15 competent cells, followed by 20 minutes of reaction on ice. After heat shock treatment at 42 ° C. for 90 seconds, 500 μl of psi broth was added, followed by shaking culture at 37 ° C. for 1 hour, followed by 50, 100, 100 LB agar plate containing ampicillin (100 μg / ml). 200 μl each was plated. The LB agar plates were then incubated in a 37 ° C. bacterial incubator for 16 hours, followed by colony selection, incubation in LB liquid medium containing ampicillin (100 μg / ml), and plasmid DNA (Qiagen) was extracted. The extracted plasmid DNA was digested with EcoRI restriction enzyme to confirm 795-bp DNA (FIG. 4). In addition, in order to confirm that the prion gene of the elk was inserted into the pCAGGS vector in the forward direction, 1033-bp DNA was confirmed by cleavage using KpnI and HindIII restriction enzymes (FIG. 5).

이와 같이, 고라니 프리온 단백질 유전자를 형질전환용 pCAGGS 벡터 내에 성공적으로 클로닝하여 고라니 프리온 단백질 유전자를 발현하는 플라스미드를 확보하였다.As such, the Elk prion protein gene was successfully cloned into a transforming pCAGGS vector to obtain a plasmid expressing the Elk prion protein gene.

2) 포유동물 세포 내에서의 프리온 단백질 유전자 발현여부 확인 2) Confirmation of Prion Protein Gene Expression in Mammalian Cells

고라니 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스를 제작하기 전에 pCAGGS벡터에 클로닝된 고라니 프리온 단백질 유전자가 포유동물 세포 내에서 발현되는지를 증명하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. Before fabricating transgenic mice expressing the elk prion protein gene, the following experiment was performed to verify whether the elk prion protein gene cloned into the pCAGGS vector was expressed in mammalian cells.

즉 6-웰 플레이트에 2×105 개의 3T3 세포를 분주한 후 70~80%의 단일층(monolayer)이 될 때까지 세포를 배양하였다. 형질감염(Transfection)에 필요한 PBS, 혈청 및 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지는 실험 30분 전에 37℃ 수욕조(water bath)에서 온도를 맞추어 놓았다. 이 후 클린 벤치 내에서 멸균된 에펜도르프 튜브에 상기 1)-다의 고라니의 프리온 단백질 유전자를 보유한 pCAGGS DNA(10㎍/㎖)를 넣은 후 무혈청 배지(serum free medium) 100㎕, 리포펙타민(Lipofectamin) 20㎕ 가하고 이를 혼합한 DNA와 혼합한 후 45분간 상온에서 반응을 시켰다. DNA와 리포펙타민을 반응시키는 동안 3T3 세포가 배양되어 있는 6-웰 플레이트를 PBS로 2번 세척하였으며 이후 무혈청 배지를 웰 당 0.8㎖ 씩 첨가하였다. 이후 리포펙타민과 DNA를 섞은 샘플을 각각의 웰에 100㎕씩 분주하고 고루 섞이도록 가볍게 흔들어 주었다. 6-웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 5시간 배양한 후 혈청 및 항생제가 포함되어 있는 DMEM 배지로 교체하여 60시간 정도 배양시켰다. That is, after dispensing 2 × 10 5 3T3 cells in a 6-well plate, the cells were cultured until 70-80% of the monolayer was obtained. DMEM medium without PBS, serum and antibiotics required for transfection was set at 37 ° C. water bath 30 minutes before the experiment. Subsequently, pCAGGS DNA (10 µg / ml) containing the prion protein gene of the above 1) -C is added to a sterilized Eppendorf tube in a clean bench, and then 100 µl of serum free medium and lipofectamine (Lipofectamin) 20 μl was added and mixed with the mixed DNA, followed by reaction at room temperature for 45 minutes. During the reaction of lipofectamine with DNA, 6-well plates containing 3T3 cells were washed twice with PBS, and then serum-free medium was added 0.8 ml per well. Then, 100 μl of the sample mixed with lipofectamine and DNA was dispensed into each well and gently shaken to mix well. Six-well plates were incubated for 5 hours in a CO 2 incubator and then replaced with DMEM medium containing serum and antibiotics for 60 hours.

이후 고라니의 프리온 단백질 유전자 DNA가 형질감염된 3T3 세포 내에서 발현되었는지를 RT-PCR(Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction) 방법을 이용하여 다음과 같이 확인하였다. 즉 DNA를 형질감염시킨 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 300㎕의 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 각각의 웰에 분주하여 37℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. 이후 트립신-EDTA로 처리되어 플레이트 바닥에서 탈락된 세포를 일정량의 배지와 섞어 15㎖ 튜브에 분주 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리된 세포로부터 RNA 추출 키트 (QIAGEN사)를 사용하여 회사에서 제시한 프로토콜에 준하여 RNA를 추출하였다. Thereafter, the prion protein gene DNA of the elk was confirmed in the transfected 3T3 cells using RT-PCR (Reverse-transcription Polymerase Chain Reaction) method as follows. That is, cells transfected with DNA were washed twice with PBS, and then 300 μl of trypsin-EDTA was dispensed into each well and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. After treatment with trypsin-EDTA, the cells dropped from the bottom of the plate was mixed with a predetermined amount of medium and dispensed into a 15 ml tube and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. RNA was extracted from the centrifuged cells using a RNA extraction kit (QIAGEN) according to the protocol proposed by the company.

그 다음, 추출한 mRNA를 이용하여 다음과 같이 cDNA를 제작하였다. Then, using the extracted mRNA was prepared cDNA as follows.

즉 mRNA 10㎕에 역방향 프라이머 (5'-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3', 서열번호 3) 1㎕를 첨가한 후 70℃에서 10분간 열처리를 하였다. 열처리 후 즉시 얼 음에 튜브를 옮겨서 5분간 정치시켰다. 이후 다음과 같이 조성된 마스터 믹스(Master mix)를 준비하였고 (5× 완충액 4㎕, 0.1M DTT 1㎕, 10mM dNTP 1㎕, RNasin 1㎕, RTase 1㎕), 이 마스터 믹스를 튜브에 넣고 37℃에서 50분 이상 반응시켰다. 이 후 튜브를 70℃에서 15분 동안 반응시킨 후 얼음에서 냉각시켰다. That is, 1 μl of a reverse primer (5′-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3 ′, SEQ ID NO: 3) was added to 10 μl mRNA, followed by heat treatment at 70 ° C. for 10 minutes. Immediately after the heat treatment, the tube was transferred to ice and allowed to stand for 5 minutes. Thereafter, a master mix prepared as follows was prepared (4 μl of 5 × buffer, 1 μl of 0.1M DTT, 1 μl of 10mM dNTP, 1 μl of RNasin, 1 μl of RTase), and the master mix was put into a tube 37 It reacted at 50 degreeC or more. The tube was then reacted at 70 ° C. for 15 minutes and then cooled in ice.

위에서 생성된 cDNA를 이용하여 고라니의 프리온 단백질 유전자를 확인하기 위한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 반응을 다음과 같이 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction for identifying the prion protein gene of the elk using the cDNA generated above was performed as follows. The primers used are as follows.

정방향 프라이머 : 5'-ATG GTG AAA AGC CAC ATA GGC-3' (서열번호 4)Forward primer: 5'-ATG GTG AAA AGC CAC ATA GGC-3 '(SEQ ID NO: 4)

역방향 프라이머 : 5'-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3' (서열번호 3)Reverse primer: 5'-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3 '(SEQ ID NO: 3)

PCR 반응은 30 사이클로 수행되었으며 반응의 조건은 다음과 같다. The PCR reaction was carried out in 30 cycles and the conditions of the reaction were as follows.

즉 94℃에서 5분간 초기 디네츄레이션 반응 후, 94℃에서 45초 동안 디네츄레이션, 50℃, 51.9℃, 54℃, 56.4℃ 및 58.8℃의 각각의 온도에서 60초간 어닐링, 72℃에서 90초간 익스텐션 후, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 익스텐션 반응을 유도하였다.That is, after the initial centrifugation reaction at 94 ° C. for 5 minutes, annealing for 60 seconds at each temperature of 50 ° C., 51.9 ° C., 54 ° C., 56.4 ° C., and 58.8 ° C. for 45 seconds at 94 ° C., and 90 ° at 72 ° C. After the extension for a second, the extension reaction was finally induced at 72 ° C. for 5 minutes.

PCR 반응물을 전기영동한 후 771-bp인 고라니의 프리온 유전자가 증폭된 것을 확인하였다 (도 6). After electrophoresis of the PCR reaction, it was confirmed that the prion gene of the elk of 771-bp was amplified (FIG. 6).

이와 같은 결과는 pCAGGS벡터 내에 클로닝된 고라니의 프리온 단백질 유전자가 포유동물 세포 내에서 발현된다는 것을 증명하는 것이며 이로써 또한 형질전환 마우스의 제작에 사용될 수 있음을 확인하였다.These results demonstrate that the prion protein genes of the elk cloned in the pCAGGS vector are expressed in mammalian cells, thereby confirming that they can also be used for the production of transgenic mice.

3) 형질전환 마우스 제작3) Transgenic Mouse

형질전환 마우스를 제작하기 위해, 먼저 고라니 PrP 유전자를 보유하고 있는 발현 벡터인 pCAGGS를 Sal Ⅰ 및 Hind Ⅲ 제한효소를 이용하여 절단하여 선형화(linerization) 시킨 후 전기영동을 실시하여 분리하였고, 분리된 DNA 절편을 순수 정제하여 DNA를 정량하고 미세주입 완충액 (microinjection buffer, 10 mM Tris, pH 7.4, 0.3 mM EDTA)에 DNA 농도가 1-4 ng/㎕ 되도록 용해시켰다. In order to prepare a transgenic mouse, first, pCAGGS, an expression vector containing an Elk PrP gene, was cleaved and linearized by Sal I and Hind III restriction enzymes, followed by electrophoresis, and isolated DNA. Sections were purified purely to quantify DNA and dissolved in microinjection buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 0.3 mM EDTA) to a DNA concentration of 1-4 ng / μl.

또한, 마우스에서 과배란을 유도하여 수정란(zygote)을 확보하기 위하여, 4주령된 암컷 C57BL/6N 마우스에 PMSG와 hCG 호르몬 주사를 48 시간 간격으로 주사하고 수컷 마우스와 교미를 유도한 후 다음날 난관으로부터 수정란을 채란하였다. In addition, in order to secure zygote by inducing overovulation in mice, 4 weeks old female C57BL / 6N mice were injected with PMSG and hCG hormone injections at 48-hour intervals and induce mating with male mice. Was filled.

상기 채란된 수정란에 DNA 용액을 미세주입(microinjection)하였고, DNA가 주입된 수정란 중 생존한 것을 선별하여 대리모의 난관에 이식하여 이식 후 19일째 마우스를 분만시켰다. 분만 2주 후에 마우스의 꼬리를 잘라 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 771-bp의 고라니 프리온 단백질 유전자의 삽입 여부를 PCR을 이용하여 확인하였다. PCR에 사용된 프라이머는 다음과 같다. The DNA solution was microinjected into the fertilized eggs, and the surviving eggs injected with DNA were selected and transplanted into the fallopian tube of the surrogate mother to deliver mice 19 days after transplantation. Two weeks after delivery, the tail of the mouse was cut to extract genomic DNA, and the insertion of 771-bp Elk prion protein gene was confirmed by PCR. Primers used for PCR are as follows.

정방향 프라이머 : 5'-ATG GTG AAA AGC CAC ATA GGC-3' (서열번호 4)Forward primer: 5'-ATG GTG AAA AGC CAC ATA GGC-3 '(SEQ ID NO: 4)

역방향 프라이머 : 5'-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3' (서열번호 3)Reverse primer: 5'-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3 '(SEQ ID NO: 3)

PCR 조건은 다음과 같다; 초기 디네츄레이션을 94℃에서 5분간 한 후, 디네츄레이션 94℃에서 1분, 어닐링 55℃에서 1분, 익스텐션 72℃에서 1분으로 총 35 사이클을 행하고, 최종 익스텐션 72℃에서 10분을 행하였다.PCR conditions were as follows; After 5 minutes of initial filtration at 94 ° C., a total of 35 cycles were performed for 1 minute at 94 ° C., 1 min at 55 ° C., and 1 min at 72 ° C., and 10 min at 72 ° C. at final extension 72 ° C. It was done.

그 결과를 도 7에 나타내었다. The results are shown in FIG.

도 7은 고라니의 PrP 유전자를 게놈 DNA 내에 포함하는 형질전환 마우스인지 여부를 PCR로 확인한 도로, P/C는 양성 플라스미드 DNA 대조군이고, 19, 20, 23, 32, 49 및 73번 마우스가 고라니의 PrP 유전자 PCR 결과에서 양성을 나타내었다.Figure 7 is a PCR confirmed whether the mouse is a transgenic mouse containing the PrP gene of the elk in genomic DNA, P / C is a positive plasmid DNA control, 19, 20, 23, 32, 49 and 73 mice of the elk PrP gene PCR showed positive results.

결과적으로, 총 103마리의 마우스 중 5마리의 마우스가 고라니의 PrP 유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었으며 그 중에서 암컷은 1마리 그리고 수컷은 4마리로 확인되었다. 즉 형질전환 마우스로 제작된 마우스들은 마우스 프리온 유전자(mouse-PrP gene)를 보유한 상태에서 고라니 프리온 유전자(water deer-PrP gene)를 함께 발현하는 이형접합(heterozygous) 마우스로 확인되었다.As a result, 5 out of a total of 103 mice were found to carry the Elk's PrP gene, of which 1 was female and 4 were male. In other words, mice made with a transgenic mouse were identified as heterozygous mice expressing a water deer-PrP gene together with a mouse-PrP gene.

4) 수정란동결을 위한 형질전환 마우스 선발4) Selection of transformed mouse for freezing fertilized eggs

가. F49, F73 형질전환 마우스와 야생형 마우스와의 교배end. Crossbreeding of F49, F73 Transgenic Mice with Wild-type Mice

상기 고라니의 프리온 단백질 유전자 발현하는 형질전환마우스 (F49-♂, F73-♂)와 야생형 암컷 마우스(6주령 C57BL/6N 마우스)를 교배시켜 19일 후에 각각의 마우스에서 F1을 확보하였다. The elk prion protein gene-expressing transgenic mice (F49-♂, F73-♂) and wild-type female mice (6 weeks old C57BL / 6N mice) were crossed to obtain F1 in each mouse after 19 days.

나. 마우스 게놈상 고라니의 프리온 단백질 유전자 보유 확인I. Identification of Prion Protein Gene Retention of Elk Elk in the Mouse Genome

확보된 마우스들이 고라니의 프리온 단백질 유전자를 보유하고 있는지를 확인하기 위하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 PCR 방법을 이용하여 고라니의 프리온 단백질 유전자를 검출하였다. In order to confirm whether the mice possessed the elk prion protein gene, genomic DNA was extracted, and then the elk prion protein gene was detected by PCR.

마우스의 게놈 DNA 추출은 QIAGEN 키트를 사용하였고, DNA 추출과정은 회사 에서 제시한 방법 및 시약을 사용하여 다음과 같이 실시하였다. 즉 0.2㎝ 정도 잘라낸 마우스 꼬리를 1.5㎖ 튜브에 담고 ATL 완충액 180㎕와 프로테이나제 K(proteinase K) (50㎍/㎖)로 처리한 후, 55℃에서 1시간 30분 동안 라이시스시켰다. 스핀 컬럼을 장착 후 200㎕의 에탄올을 위의 샘플과 섞어 분주 후 1분간 원심분리하고 AW1과 AW2 완충액을 각각 500㎕씩 분주하여 세척 후 AE 완충액 100㎕로 용출시켰다.Genomic DNA extraction from mice was performed using the QIAGEN kit, and DNA extraction was performed using the methods and reagents suggested by the company as follows. That is, a mouse tail cut about 0.2 cm was placed in a 1.5 ml tube, treated with 180 μl of ATL buffer and proteinase K (50 μg / ml), and then lysed at 55 ° C. for 1 hour and 30 minutes. After mounting the spin column, 200 μl of ethanol was mixed with the above sample, centrifuged for 1 minute after dispensing, and 500 μl of AW1 and AW2 buffers were dispensed, washed, and eluted with 100 μl of AE buffer.

상기 추출한 DNA를 이용하여 PCR을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 즉 고라니 프리온 단백질 유전자 뒤에 연결되어있는 래빗 베타-글로빈 폴리 A(Rabbit beta-globin poly A)는 형질전환 마우스에서만 가지고 있는 유전자이므로 고라니 프리온 단백질 유전자의 3' 말단 부분과 래빗 베타-글로빈 유전자의 앞부분을 프라이머로 디자인하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 다음과 같으며, 561-bp의 PCR 산물을 생산할 경우 고라니 프리온 단백질 유전자가 게놈 DNA에 삽입된 것으로 판단하였다. PCR was performed using the extracted DNA under the following conditions. In other words, since the beta-globin poly A, which is linked to the elk prion protein gene, is unique to the transgenic mouse, the 3 'end portion of the elk prion protein gene and the front part of the rabbit beta-globin gene A PCR was performed by designing with primers. The primers used were as follows, and when the 561-bp PCR product was produced, it was determined that the elk prion protein gene was inserted into genomic DNA.

정방향 프라이머 : 5'-CCC AAC CAA GTG TAC TAC AGG C-3' (서열번호 5)Forward primer: 5'-CCC AAC CAA GTG TAC TAC AGG C-3 '(SEQ ID NO: 5)

역방향 프라이머 : 5'-ATG CTC AAG GGG CTT CAT GAT G-3' (서열번호 6)Reverse primer: 5'-ATG CTC AAG GGG CTT CAT GAT G-3 '(SEQ ID NO: 6)

PCR 반응은 20 pmol의 프라이머를 각각 1㎕씩, 10 X Taq DNA polymerase 완충액 5㎕, 0.2mM dNTP 1㎕ 및 2.5 units Taq DNA polymerase(Promega, USA) 0.5㎕를 섞은 후 증류수로 전체 용량을 50㎕로 맞춰 준 후 수행하였다. The PCR reaction was performed by mixing 1 μl of 20 pmol primer, 5 μl of 10 × Taq DNA polymerase buffer, 1 μl of 0.2 mM dNTP and 0.5 μl of 2.5 units Taq DNA polymerase (Promega, USA), and then 50 μl of the total volume with distilled water. It was performed after adjusting to.

PCR 반응은 30 사이클로 수행되었으며 이때 사용된 조건은 다음과 같았다. 즉 94℃에서 5분간 초기 디네츄레이션, 94℃에서 45초간 디네츄레이션, 58℃에서 45초간 어닐링, 72℃에서 60초간 익스텐션 후 72℃에서 5분간 최종 익스텐션. PCR reactions were carried out in 30 cycles and the conditions used were as follows. In other words, initial centrifugation at 94 ° C for 5 minutes, 45 ° C at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 58 ° C for 45 seconds, extension at 72 ° C for 60 seconds, and final extension at 72 ° C for 5 minutes.

도 8은 상기와 같이 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 형질전환 마우스를 PCR로 확인한 결과도로서, (A)는 BOD가 070709인 F49-F1 6마리 마우스 중에서 한 마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이고, (B) BOD가 070724인 F73-F1 6마리 마우스 중에서 한 마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이고, (C)는 BOD가 070802인 F49-F1 5마리 마우스 중에서 한 마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이고, (D)는 BOD가 070818인 F73-F1 6마리 중에서 5마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이다.8 is a result of PCR confirming the transgenic mouse containing the PrP gene of the elk as described above, (A) is one of the six F49-F1 mice with BOD 070709 Tg mouse containing the elk PrP gene (B) one out of six F73-F1 mice with BOD 070724 was identified as a Tg mouse containing the Elk PrP gene, and (C) one out of five F49-F1 mice with BOD 070802 It was confirmed that the Tg mouse containing the Elk PrP gene, (D) was confirmed that 5 out of 6 F73-F1 BOD is 070818 Tg mouse containing the Elk PrP gene.

결과적으로, 고라니의 프리온 단백질(PrP) 유전자가 게놈 DNA에 삽입된 형질전환 마우스는 총 8 마리로 확인되었다.As a result, a total of 8 transgenic mice with the Elk prion protein (PrP) gene inserted into genomic DNA were identified.

다. 형질전환 마우스에서의 고라니 프리온 단백질 유전자 발현 확인All. Confirmation of Elk Prion Protein Gene Expression in Transgenic Mice

앞서 실시한 PCR을 통해 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 각 F-1 세대에서 mRNA 발현 정도를 알아보기 위하여 8 마리의 형질전환 마우스의 혈액에서 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 QIAGEN사 키트를 사용하였으며 실험방법 및 시약은 회사에서 제시한 것을 사용하였다. 즉, 각각의 마우스 눈에서 약 100㎕의 혈액을 채혈한 후 EL 완충액을 500㎕를 첨가한 다음, 약 10분 정도 얼음에서 반응시킨 후 400 × g 에서 10분간 원심분리를 하였다. 원심분리 후 상층액에 존재하는 적혈구는 제거하고 펠렛으로 존재하는 백혈구는 EL 완충액 500㎕로 용해시킨 후 다시 400 × g 에서 10분간 원심분리를 실행하였다. 이 후 상층액을 제거하고 RLT 완충액을 350㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후 스핀 컬럼-콜렉션 튜브에 샘플을 분주하고 2분 동안 최대 14,000 rpm으로 원심분리를 실행하였다. 이때 사용된 스핀 컬럼은 미리 DNase 스탁 (1500 Kunitz units인 DNase I을 550㎕ RNase free water에 녹인 것) 10㎕를 70㎕ RDD 완충액과 섞은 후 컬럼에 분주하여 15분간 정치시킨 후 RW1 350㎕로 세척한 것을 사용하였다. 샘플 컬럼은 600㎕의 70% 에탄올로 세척한 후, 700㎕ RW1와 500㎕ RPE 완충액으로 다시 세척하였다. 세척이 끝난 각 샘플은 30㎕의 RNase-free water로 용출하였다.RNA was extracted from the blood of 8 transgenic mice in order to determine the mRNA expression level in each F-1 generation expressing the prion protein gene of the elk by the PCR. RNA extraction was performed using QIAGEN's kit, and experimental methods and reagents were used by the company. That is, about 100 μl of blood was collected from each mouse eye, 500 μl of EL buffer solution was added, and then reacted on ice for about 10 minutes, followed by centrifugation at 400 × g for 10 minutes. After centrifugation, the red blood cells present in the supernatant were removed, and the white blood cells present as pellets were dissolved in 500 µl of EL buffer, followed by centrifugation at 400 x g for 10 minutes. Thereafter, the supernatant was removed, the mixture was mixed well by adding 350 µl of RLT buffer, and the sample was dispensed into a spin column-collection tube and centrifuged at a maximum of 14,000 rpm for 2 minutes. The spin column used was prepared by mixing 10 μl of DNase stock (1500 Kunitz units of DNase I in 550 μl RNase free water) with 70 μl RDD buffer, aliquoting the column, and allowing to stand for 15 minutes before washing with 350 μl of RW1. One was used. The sample column was washed with 600 μl 70% ethanol and then again with 700 μl RW1 and 500 μl RPE buffer. After washing, each sample was eluted with 30 μl of RNase-free water.

추출된 RNA는 QIAGEN 사에서 제공하는 역전사 키트(Reverse Transcription kit)를 사용하여 cDNA로 합성을 수행하였다. 먼저 10× RT 완충액 2㎕, dNTP 믹스 (5mM) 2㎕, Oligo-dT 프라이머 (10 uM) 2㎕, RNase 저해제 (10 units/㎕) 1㎕, 역전사효소(sensiscript reverse transcriptase) 1㎕, 주형 RNA 10㎕를 섞어주고 증류수로 최종 용량을 20㎕로 맞춘 후 37℃에서 60분간 반응시키고 RT-PCR 과정을 실시하였다. 합성된 cDNA를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 앞서 사용한 프라이머(서열번호 4, 서열번호 5의 프라이머)와 동일하며 PCR 조건도 앞서 4-나)의 조건과 동일한 조건으로 수행하였다.The extracted RNA was synthesized by cDNA using a reverse transcription kit provided by QIAGEN. First 2 μl of 10 × RT buffer, 2 μl of dNTP mix (5 mM), 2 μl of Oligo-dT primer (10 uM), 1 μl of RNase inhibitor (10 units / μl), 1 μl of sensiscript reverse transcriptase, template RNA 10 μl was mixed, the final volume was adjusted to 20 μl with distilled water, and then reacted at 37 ° C. for 60 minutes, followed by RT-PCR. RT-PCR was performed using the synthesized cDNA. At this time, the primer used was the same as the primer (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 primer) used previously, and the PCR conditions were performed under the same conditions as the conditions of 4-B).

그 결과를 도 9에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 9는 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 각 형질전환 마우스의 F-1에서 mRNA 발현 정도를 알아보기 위하여 RT-PCR로 확인한 결과도로서, 8마리 Tg 마우스 중 4마리가 고라니의 프리온 단백질 유전자를 mRNA로 발현하는 것을 확인한 것이다. M 은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1은 BOD가 070709인 F49-F1, 레인 2는 BOD가 070724인 F73-F1, 레인 3은 BOD가 070802인 F49-F1, 레인 4, 5, 6, 7, 8은 BOD가 070818인 F73-F1에서 RT-PCR한 결과이다.9 is a result of RT-PCR to determine the mRNA expression level of F-1 of each transgenic mouse including the PrP gene of the elk, 4 of 8 Tg mice mRNA of the elk prion protein gene It is confirmed that the expression. M is a 100-bp standard DNA marker, lane 1 is F49-F1 with BOD 070709, lane 2 is F73-F1 with BOD 070724, lane 3 is F49-F1 with BOD 070802, lanes 4, 5, 6, 7, 8 is the result of RT-PCR on F73-F1 with BOD 070818.

결과적으로, 고라니의 프리온 단백질(PrP) 유전자가 게놈 DNA에 삽입된 형질전환 마우스 총 8 마리 중 4 마리가 고라니의 프리온 단백질 유전자를 mRNA로 발현하는 것을 확인하였다 (도 9).As a result, it was confirmed that 4 out of 8 transgenic mice in which the elk prion protein (PrP) gene was inserted into genomic DNA express the elk prion protein gene as mRNA (FIG. 9).

라. 형질전환 마우스 스크리닝 및 수정란 기탁la. Transgenic Mouse Screening and Fertilized Egg Deposits

마우스 성별을 확인해본 결과 BOD가 070818 (F73-F1)인 4번 마우스 (F73-F1-4) 만이 수컷으로 확인되었다. 따라서 4번 수컷 마우스를 이용하여 SPF 형질전환 마우스를 다량 생산하기 위해 정자를 채취하여 암컷의 난자와 인공수정을 시켰다. 인공수정된 수정란을 야생형 암컷 대리모 마우스에 이식하였다. 야생형의 암컷 마우스는 19일의 임신기간이 지나 총 12마리의 마우스를 생산하였으며 생후 14일이 지난 12마리의 마우스에서 고라니 프리온 단백질 유전자의 삽입을 확인하기 위해 꼬리를 일부분 절단하여 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA 추출은 앞서 기술한 QIAGEN사의 게놈 DNA 추출방법과 동일하며, 추출된 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행하여 고라니의 프리온 단백질 유전자를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머는 상기 4-나)의 서열번호 4 및 5의 프라이머쌍과 동일하며 PCR 조건도 앞서 4-나)의 조건과 동일한 조건으로 수행하였다. As a result of confirming the gender of the mouse, only mouse 4 (F73-F1-4) having a BOD of 070818 (F73-F1) was identified as male. Therefore, in order to produce a large amount of SPF transgenic mice using 4 male mice, sperm were collected and fertilized with female eggs. Inseminated fertilized eggs were implanted into wild type female surrogate mice. Wild-type female mice produced a total of 12 mice after 19 days of gestation, and the tails were partially cut to extract DNA from the 12 mice after 14 days of age to confirm the insertion of the elk prion protein gene. Genomic DNA extraction was the same as QIAGEN's genomic DNA extraction method described above, PCR was performed using the extracted genomic DNA to identify the prion protein gene of the elk. The primers used were the same as the primer pairs of SEQ ID Nos. 4 and 5 in 4-na) and PCR conditions were also performed under the same conditions as in 4-na).

PCR 결과 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, 12의 마우스들이 고라니 프리온 단백질 유 전자를 보유하고 있음이 확인되었다 (도 10).PCR confirmed that the mice 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, 12 have an elk prion protein gene (Fig. 10).

마우스의 성별을 확인한 결과 1, 2, 3, 8, 9 번 마우스들이 수컷 마우스로 확인되어 이들을 과배란을 유도시킨 야생형의 암컷마우스와 교배를 한 후 8세포기의 수정란 323개를 획득하여 2008년 2월 20일자로 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC)에 수탁번호 KCTC 11283BP로 기탁되었다.As a result of confirming the sex of the mice, mice 1, 2, 3, 8, and 9 were identified as male mice, and they were mated with wild-type female mice that induced over-ovulation. It was deposited with the accession number KCTC 11283BP to the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank (KCTC) on February 20.

도 1은 고라니의 말초혈액 단핵구세포에서 분리한 게놈 DNA를 가지고 PCR을 수행하여 수득한 고라니의 PrP 유전자를 전기영동으로 확인한 도로, M은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1이 고라니의 PrP 유전자(771-bp)이다.1 is a diagram showing the electrophoresis of a PrP gene of an elk obtained by PCR with genomic DNA isolated from peripheral blood mononuclear cells of an elk, M is a 100-bp standard DNA marker, and lane 1 is an Elk PrP gene. (771-bp).

도 2는 TA 클로닝 벡터 내에 들어있는 고라니 PrP 유전자를 제한효소 EcoRI으로 잘라 고라니 PrP 유전자를 포함하는 DNA 절편을 전기영동으로 확인한 도로, M은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1이 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 DNA 절편(795-bp)이다.Figure 2 is a diagram showing the electrophoresis of the DNA fragment containing the Elk PrP gene cut by the restriction enzyme EcoRI in the Elk PrP gene contained in the TA cloning vector, M is a 100-bp standard DNA marker, Lane 1 is the PrP gene of Elk DNA fragment containing the (795-bp).

도 3은 고라니의 프리온 유전자를 발현하기 위해 본 발명에서 사용한 pCAGGS 발현 벡터 구조를 나타낸 도이다. Figure 3 is a diagram showing the structure of pCAGGS expression vector used in the present invention to express the prion gene of elk.

도 4는 pCAGGS 발현 벡터 내에 클로닝 된 고라니 PrP 유전자를 제한효소 EcoRI으로 잘라 고라니 PrP 유전자를 포함하는 DNA 절편을 전기영동으로 확인한 도로, M은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1이 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 DNA 절편(795-bp)이다.4 is a diagram showing the electrophoresis of a DNA fragment containing an Elk PrP gene cloned in a pCAGGS expression vector with a restriction enzyme EcoRI, where M is a 100-bp standard DNA marker, and Lane 1 is an Elk PrP gene. DNA fragment containing the (795-bp).

도 5는 고라니 PrP 유전자가 클로닝된 pCAGGS 발현 벡터를 제한효소 KpnI 및 HindIII로 잘라 고라니 PrP 유전자가 정방향으로 삽입되었는지 전기영동하여 확인한 도로, M은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1이 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 DNA 절편(1033-bp)이다.Figure 5 is a pCAGGS expression vector cloned with the Elk PrP gene was cut with restriction enzymes KpnI and HindIII and confirmed by electrophoresis that the Elk PrP gene was inserted in the forward direction, M is a 100-bp standard DNA marker, lane 1 is the PrP of Elk DNA fragment (1033-bp) containing the gene.

도 6은 포유동물 세포에서의 고라니 PrP 유전자 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 도로, 고라니 PrP 유전자를 포함한 pCAGGS 발현 벡터로 형질도입한 3T3 세포로 부터 mRNA를 추출하여 RT-PCR을 수행한 결과이다. M은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1은 어닐링온도 58.8℃, 레인 2는 56.4℃, 레인 3은 어닐링 온도 54℃에서 RT-PCR 하여 수득한 결과이고, 레인 3에서 771-bp의 PrP 유전자 절편이 확인된다.FIG. 6 shows the results of RT-PCR by extracting mRNA from 3T3 cells transduced with pCAGGS expression vector including the Elk PrP gene. M is a 100-bp standard DNA marker, lane 1 was obtained by RT-PCR at annealing temperature of 58.8 ° C, lane 2 at 56.4 ° C, lane 3 at annealing temperature of 54 ° C, and 771-bp PrP gene in lane 3 The intercept is identified.

도 7은 고라니의 PrP 유전자를 게놈 DNA 내에 포함하는 형질전환 마우스인지 여부를 PCR로 확인한 도로, P/C는 양성 플라스미드 DNA 대조군이고, 19, 20, 23, 32, 49 및 73번 마우스가 고라니의 PrP 유전자 PCR 결과에서 양성을 나타냄이 확인된다.Figure 7 is a PCR confirmed whether the mouse is a transgenic mouse containing the PrP gene of the elk in genomic DNA, P / C is a positive plasmid DNA control, 19, 20, 23, 32, 49 and 73 mice of the elk PrP gene PCR result confirmed that it is positive.

도 8은 상기와 같이 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 형질전환 마우스(Tg 마우스)를 PCR로 확인한 결과도로서, (A)는 BOD가 070709인 F49-F1 6마리 마우스 중에서 한 마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이고, (B) BOD가 070724인 F73-F1 6마리 마우스 중에서 한 마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이고, (C)는 BOD가 070802인 F49-F1 5마리 마우스 중에서 한 마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이고, (D)는 BOD가 070818인 F73-F1 6마리 중에서 5마리가 고라니 PrP 유전자를 포함하는 Tg 마우스임을 확인한 것이다.FIG. 8 is a result of PCR confirming the transgenic mouse (Tg mouse) including the PrP gene of the elk as described above. (A) shows one of the six F49-F1 mice having a BOD of 070709. It was confirmed that the Tg mouse containing, (B) one of the six F73-F1 mice BOD is 070724 confirmed that the Tg mouse containing the Elk PrP gene, (C) is five F49-F1 BOD is 070802 One of the mice was confirmed to be a Tg mouse containing the Elk PrP gene, (D) was confirmed that five of the six F73-F1 BOD is 070818 Tg mouse containing the Elk PrP gene.

도 9는 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 각 형질전환 마우스의 F-1에서 mRNA 발현 정도를 알아보기 위하여 RT-PCR로 확인한 결과도로서, 8마리 Tg 마우스 중 4마리가 고라니의 프리온 단백질 유전자를 mRNA로 발현하는 것을 확인한 것이다. M은 100-bp 표준 DNA 마커이고, 레인 1은 BOD가 070709인 F49-F1, 레인 2는 BOD가 070724인 F73-F1, 레인 3은 BOD가 070802인 F49-F1, 레인 4, 5, 6, 7, 8은 BOD가 070818인 F73-F1에서 RT-PCR한 결과이다.Figure 9 containing the PrP gene of the elk As a result of confirming by RT-PCR to determine the mRNA expression level in F-1 of each transgenic mouse, it was confirmed that four of the eight Tg mice express the prion protein gene of the elk as mRNA. M is a 100-bp standard DNA marker, lane 1 is F49-F1 with BOD 070709, lane 2 is F73-F1 with BOD 070724, lane 3 is F49-F1 with BOD 070802, lanes 4, 5, 6, 7, 8 is the result of RT-PCR on F73-F1 with BOD 070818.

도 10은 BOD가 070818인 F73-F1 마우스와 교배하여 나온 12마리의 마우스에서 고라니의 프리온 단백질 유전자를 보유한 형질전환마우스를 PCR로 확인한 결과도로서, 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, 12번 마우스가 고라니의 프리온 단백질 유전자를 보유한 형질전환 마우스임을 확인한 도이다. 10 is a result of PCR confirming the transgenic mice carrying the prion protein gene of the elk in 12 mice crossing the F73-F1 mouse having a BOD of 070818, 1, 2, 3, 6, 8, 9, Figures 11 and 12 confirmed that the mouse is a transgenic mouse carrying the prion protein gene.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Transgenic mouse expressing prion protein (PrP) gene of Chinese water deer(Hydropotes inermis argyropus) <130> P08-E068 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 771 <212> DNA <213> Hydropotes inermis argyropus <220> <221> CDS <222> (1)..(768) <223> prion protein (PrP) gene of Chinese water deer(Hydropotes inermis argyropus) <400> 1 atg gtg aaa agc cac ata ggc agc tgg atc cta gtt ctc ttt gtg gcc 48 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala 1 5 10 15 atg tgg agt gac gtg ggc ctc tgc aag aaa cga cca aaa cct gga gga 96 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 gga tgg aac act ggg ggg agc cga tac ccg gga cag gga agt cct gga 144 Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly 35 40 45 ggc aac cgc tat cca cct cag gga ggg ggt ggc tgg ggt cag ccc cat 192 Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His 50 55 60 gga ggt ggc tgg ggt cag ccc cat gga ggt ggc tgg gga cag ccc cat 240 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His 65 70 75 80 ggt ggt ggc tgg ggt cag ccc cat ggt ggt gga ggc tgg ggt caa ggt 288 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly 85 90 95 ggt acc cac aat cag tgg aac aag ccc agt aaa cca aaa acc aac atg 336 Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met 100 105 110 aag cat gtg gca gga gct gct gca gct gga gca gta gta ggg ggc ctc 384 Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu 115 120 125 ggt ggc tac atg ctg gga agt gcc atg agc agg cct ctt ata cat ttt 432 Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe 130 135 140 ggc aat gac tat gag gac cgt tac tat cgt gaa aac atg tac cgt tac 480 Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr 145 150 155 160 ccc aac caa gtg tac tac agg cca gtg gat cag tat aat aac cag aac 528 Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn 165 170 175 acc ttt gtg cat gac tgt gtc aac atc aca gcc aag caa cac aca gtc 576 Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ala Lys Gln His Thr Val 180 185 190 acc acc acc acc aag ggg gag aac ttc acc gaa act gac atc aag atg 624 Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met 195 200 205 atg gag cga gtt gtg gag caa atg tgc atc acc cag tac cag aga gaa 672 Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu 210 215 220 tcc cag gct tat tac caa aga ggg gca agt gtg atc ctc ttc tcc tcc 720 Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser 225 230 235 240 cct cct gtg atc ctc ctc atc tct ttc ctc att ttt ctc ata gta gga 768 Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255 ta g 771 <210> 2 <211> 256 <212> PRT <213> Hydropotes inermis argyropus <400> 2 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala 1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly 35 40 45 Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His 50 55 60 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His 65 70 75 80 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly 85 90 95 Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met 100 105 110 Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe 130 135 140 Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr 145 150 155 160 Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn 165 170 175 Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ala Lys Gln His Thr Val 180 185 190 Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met 195 200 205 Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu 210 215 220 Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser 225 230 235 240 Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 3 ctatcctact atgagaaaaa tg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 4 atggtgaaaa gccacatagg c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 5 cccaaccaag tgtactacag gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 6 atgctcaagg ggcttcatga tg 22 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Transgenic mouse expressing prion protein (PrP) gene of Chinese          water deer (Hydropotes inermis argyropus) <130> P08-E068 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 771 <212> DNA <213> Hydropotes inermis argyropus <220> <221> CDS <222> (1) .. (768) <223> prion protein (PrP) gene of Chinese water deer (Hydropotes inermis          argyropus) <400> 1 atg gtg aaa agc cac ata ggc agc tgg atc cta gtt ctc ttt gtg gcc 48 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala   1 5 10 15 atg tgg agt gac gtg ggc ctc tgc aag aaa cga cca aaa cct gga gga 96 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly              20 25 30 gga tgg aac act ggg ggg agc cga tac ccg gga cag gga agt cct gga 144 Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly          35 40 45 ggc aac cgc tat cca cct cag gga ggg ggt ggc tgg ggt cag ccc cat 192 Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His      50 55 60 gga ggt ggc tgg ggt cag ccc cat gga ggt ggc tgg gga cag ccc cat 240 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His  65 70 75 80 ggt ggt ggc tgg ggt cag ccc cat ggt ggt gga ggc tgg ggt caa ggt 288 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly                  85 90 95 ggt acc cac aat cag tgg aac aag ccc agt aaa cca aaa acc aac atg 336 Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met             100 105 110 aag cat gtg gca gga gct gct gca gct gga gca gta gta ggg ggc ctc 384 Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu         115 120 125 ggt ggc tac atg ctg gga agt gcc atg agc agg cct ctt ata cat ttt 432 Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe     130 135 140 ggc aat gac tat gag gac cgt tac tat cgt gaa aac atg tac cgt tac 480 Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr 145 150 155 160 ccc aac caa gtg tac tac agg cca gtg gat cag tat aat aac cag aac 528 Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn                 165 170 175 acc ttt gtg cat gac tgt gtc aac atc aca gcc aag caa cac aca gtc 576 Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ala Lys Gln His Thr Val             180 185 190 acc acc acc acc aag ggg gag aac ttc acc gaa act gac atc aag atg 624 Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met         195 200 205 atg gag cga gtt gtg gag caa atg tgc atc acc cag tac cag aga gaa 672 Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu     210 215 220 tcc cag gct tat tac caa aga ggg gca agt gtg atc ctc ttc tcc tcc 720 Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser 225 230 235 240 cct cct gtg atc ctc ctc atc tct ttc ctc att ttt ctc ata gta gga 768 Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly                 245 250 255         ta g 771 <210> 2 <211> 256 <212> PRT <213> Hydropotes inermis argyropus <400> 2 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala   1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly              20 25 30 Gly Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly          35 40 45 Gly Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His      50 55 60 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His  65 70 75 80 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly                  85 90 95 Gly Thr His Asn Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met             100 105 110 Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu         115 120 125 Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe     130 135 140 Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr 145 150 155 160 Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Asn Asn Gln Asn                 165 170 175 Thr Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ala Lys Gln His Thr Val             180 185 190 Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met         195 200 205 Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu     210 215 220 Ser Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser 225 230 235 240 Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly                 245 250 255 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 3 ctatcctact atgagaaaaa tg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 4 atggtgaaaa gccacatagg c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 5 cccaaccaag tgtactacag gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for prion protein (PrP) gene of Chinese water deer <400> 6 atgctcaagg ggcttcatga tg 22  

Claims (3)

서열번호 1의 고라니(Hydropotes inermis argyropus)의 프리온 단백질(PrP) 유전자를 발현하는 형질전환 마우스.A transgenic mouse expressing the prion protein (PrP) gene of the Elk ( Hypotica inermis argyropus ) of SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 마우스의 수정란이 수탁번호 KCTC 11283BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스.The transgenic mouse of claim 1, wherein the fertilized egg of the transgenic mouse has been deposited with accession number KCTC 11283BP. 제 1항의 고라니의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스에 변형 프리온 단백질 감염시켜 만성 소모성 질병을 유발한 다음, 시험대상물질을 투여하고 사슴 만성 소모성 질병의 증상 개선 정도를 관찰하여 스크리닝함을 특징으로 하는 사슴과 동물에서 발생하는 만성 소모성 질병 치료제 또는 개선제 스크리닝 방법.The transgenic mouse expressing the prion protein gene of the elk according to claim 1 modified chronic prion protein infection to cause chronic wasting disease, and then administered the test substance and screened by observing the improvement of symptoms of chronic wasting disease of deer Screening method for treating or ameliorating chronic wasting diseases occurring in deer and animals.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101491813B1 (en) * 2012-12-21 2015-02-16 대한민국 Expression vector comprising gene coding prion protein from Capra aegagrus hircus and transfected cell by the same

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101491813B1 (en) * 2012-12-21 2015-02-16 대한민국 Expression vector comprising gene coding prion protein from Capra aegagrus hircus and transfected cell by the same

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