KR20090092039A - 역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 감초로부터유용성분을 분리하는 추출방법 - Google Patents
역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 감초로부터유용성분을 분리하는 추출방법Info
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Abstract
본 발명은 감초에 메탄올 또는 메탄올 수용액을 가하고 실온에서 20-120분 동안 침지하여 추출하는 단계 및 아세토니트릴 및 1%(v/v) 아세트산으로 구성된 이동상을 이용한 역상 액체 크로마토그래피에 의해 감초로부터 리퀴리틴, 글리시리진산 및 글라브리딘을 분리하는 단계로 이루어지는 감초로부터 유용성분을 분리하는 추출방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 감초로부터 유용성분인 리퀴리틴, 글리시리진산 및 글라브리딘을 동시에 각각 분리할 수 있는 추출방법에 관한 것이다.
감초는 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 뿌리로서, 4000년 이상 사용되어 왔다. 감초는 거담제로 사용되던 차이니즈 허브로서, 기침을 멈추고, 열을 내리고, 위를 편안하게 하며, 긴급한 상황을 완화시켜 주며, 다른 다양한 허브의 효과를 증진시킨다.
리퀴리틴(liquiritin; LQ)은 감초에서 가장 주요한 플라보노이드 중 하나로서, 항바이러스 및 항산화 특성을 지닌다. 글리시리진산(glycyrrhizic acid; GA)은 감초 중에서 가장 연구가 많이 된 성분으로서, 단맛을 나타내며, 설탕보다 50배 더 뛰어난 단맛을 제공하여 식품산업에서 단맛 첨가제로서 폭넓게 사용되고 있다.
GA는 항염증, 항궤양, 항간독성 및 항바이러스 활성을 나타내며, 많은 나라에서 알러지성 피부염 및 만성 바이러스 간염을 치료하기 위한 중요한 치료제로서 GA를 사용하고 있다.
글라브리딘(glabridin)은 감초 중에 함유된 또다른 활성성분으로서, 항균활성; 세포독성활성; 인간유방암 세포에 대한 에스트로겐 활성 및 항증식활성; 저밀도 리포단백질 산화, 멜라닌 세포 생성, 염증에 대한 효과; 산화적 스트레스로부터 미토콘드리아 기능 보호 등 다양한 약리활성을 나타낸다.
역상 분취용(reversed-phase preparative) 고성능액상 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography; HPLC)는 감초로부터 LQ, GA 및 글라브리딘을 정제하는 데에 응용되어 왔다.
분취용 크로마토크래피는 정제공정이며, 혼합물로부터 순수 물질을 동정하는 것을 목적으로 한다.
LQ, GA 및 글라브리딘 각각의 분리에 대하여 몇몇 보고가 되어 있다. 그러나, 이러한 3가지 성분을 분취용 컬럼을 이용하여 동시에 추출 및 분리하는 방법에 대한 보고는 아직 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 RP-HPLC를 이용하여 감초로부터 LQ, GA 및 글라브리딘을 동시에 추출하고, 분취용 컬럼을 이용하여 세가지 성분을 분리하는 방법을 개발하고자 하였다.
종래기술과 비교하여, 본 발명에 따른 추출방법은 간단하고, 빠르며, 감초로부터 3가지 성분을 동시에 분리할 수 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감초에 메탄올 또는 메탄올 수용액을 가하고 실온에서 20-120분 동안 침지하여 추출하는 단계; 및 아세토니트릴 및 1%(v/v) 아세트산으로 구성된 이동상을 이용한 역상 액체 크로마토그래피에 의해 감초로부터 리퀴리틴, 글리시리진산 및 글라브리딘을 분리하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 추출방법을 제공한다.
이때, 상기 메탄올 또는 메탄올 수용액은 감초 1 중량부에 대하여 15 내지 70 중량부로 첨가되는 것이 바람직하다. 만약 메탄올 또는 메탄올 수용액이 상기 범위를 벗어나 과량으로 사용되면 추출효율에 비해 추출용매가 낭비되어 비경제적이며, 소량으로 사용되면 감초의 유용성분이 잘 추출되지 않는 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 침지는 시간이 경과할수록 추출효율이 높지만, 침지시간이 120분을 경과하면 추출효율에 포화가 생기므로, 침지시간은 120분인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 역상 액체 크로마토그래피는 12μm 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 컬럼 입경이 12μm이 아닌 40/63μm 컬럼을 사용하게 되면 3가지 유용성분이 뚜렷하게 분리되지 않는 문제가 야기될 수 있다.
또한, 역상 액체 크로마토그래피에 사용되는 시료의 최대 주입 용량은 50μL인 것이 바람직하다. 만약 50μL를 넘는 과량을 주입하면 LQ의 추출 및 분리에 방해를 받는 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 이동상은 아세토니트릴 및 1%(v/v) 아세트산을 20:80 내지 60:40의 부피비율로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 추출방법에 따르면, 감초로부터 리퀴리틴 0.29mg/g, 글리시리진산 1.43mg/g 및 글라브리딘 0.07mg/g을 추출할 수 있고, 회수율이 각각 80.79%, 89.70% 및 72.51%로 나타났다.
본 발명의 추출방법에 의해, 감초로부터 고농도로 리퀴리틴, 글리시리진산 및 글라브리딘을 각각 추출 및 분리할 수 있기 때문에 감초로부터 유용성분을 간단하고 신속하게 동시에 분리할 수 있다.
도 1은 침지시간에 따른 LQ, GA 및 글라브리딘의 추출농도를 나타낸 것이고,
도 2는 초음파처리 시간에 따른 LQ, GA 및 글라브리딘의 추출농도를 나타낸 것이고,
도 3은 메탄올 용량에 따른 LQ, GA 및 글라브리딘의 추출농도를 나타낸 것이고,
도 4는 5μm의 컬럼을 이용한 감초 추출물의 주입 용량에 따른 크로마토그래프를 나타낸 것이고(붉은선: 10μL, 검은선: 75μL),
도 5는 40/63μm의 컬럼을 이용한 감초 추출물의 주입 용량에 따른 크로마토그래프를 나타낸 것이고(검은선: 10μL, 붉은선: 100μL, 초록선: 200μL),
도 6은 12μm의 컬럼을 이용한 감초 추출물의 주입 용량에 따른 크로마토그래프를 나타낸 것이다(검은선: 10μL, 붉은선: 100μL, 초록선: 200μL).
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 설명일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 전준비 절차
1) 재료 및 시약 준비
감초는 재래시장에서 구매하였고, 리퀴리틴은 NICPBP(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products)로부터 구매하였고, 글리시리진산(제1암모늄염 수화물)은 Sigma사로부터 구매하였으며, 글라브리딘은 Wako Pure Chemical Industries로부터 구매하였다.
메탄올, 아세토니트릴, 클로로포름(HPLC 등급), 아세트산 및 n-헥산(Extra pure reagent)은 Duksan Pure Chemical사로부터 구매하였다. 물은 압축 펌프(Division of Millipore, Waters, USA)를 이용하여 2차 증류수를 필터(FH-0.45μm, Advantec MFS)하였다.
2) HPLC 분석
본 발명에서 사용된 HPLC 시스템은 M930 용매전달 펌프(Yuong Lin Co.), UV 검출기(M 720 Absorbance Detector, Young-In Scientific Co.), 및 통합 데이터 시스템(Autochrowin. Ver. 1.42, Young Lin Co.)을 포함하며, 25μL 및 200μL 시료 루프를 지닌 2개의 Reodyne injection valve를 사용하였다.
유속은 0.5mL/min, UV 파장은 252nm로 고정하였다. 모든 용매는 휴대 시린지 필터 유니트(0.2μm)에 의해 필터되어 사용되었다.
3) 시료 준비
감초 뿌리를 오븐에 말리고, 자른 후, 분쇄하여 분말을 만들어 추출 실험에 사용하였다.
LQ, GA 및 글라브리딘의 표준물질은 메탄올에 용해시켜 최종농도 0.33mg/mL로 제조하였다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다.
4) LQ, GA 및 글라브리딘의 결정
LQ, GA 및 글라브리딘의 농도를 아세토니트릴/1%(v:v) 아세트산으로 이루어진 이동상을 지닌 컬럼(C18, 5μm, 150X4.6mm, RStech사)을 이용하여 분석하였다. 이때, 이동상의 구배용매 조성은 아세토니트릴과 1%(v:v) 아세트산을 20:80에서 60:40으로 하여 0 내지 10분간 추출하였다.
분석물의 피크면적값을 분석물의 관련 농도에 대해 플로팅하고, 최소자승법을 이용하여 calibration curve를 그렸다. LQ, GA의 표준물 용액에 대해 0.2, 0.4, 0.5, 0.8 및 1.0 mg/mL의 농도를 사용하였고, 글라브리딘 표준물 용액에 대해 0.01, 0.04, 0.08, 0.1 및 0.2 mg/mL의 농도를 사용하였고, 각 농도별로 3회 주입하였다.
3개 화합물의 calibration curve는 양호한 선형성(r2>0.998)을 나타내며, LQ, GA 및 글라브리딘의 각 회귀식은 Y=11531x-23.942(x는 0.01 내지 0.1 mg/mL), Y=9721.7x+97.429(x는 0.1 내지 1.0 mg/mL) 및 Y=10730x-31.147(x는 0.01 내지 0.1 mg/mL)이다.
<실시예 2> 추출방법
1) 최적 추출용매의 선정
감초로부터 LQ, GA 및 글라브리딘을 추출하기 위해 물, 메탄올, n-헥산 및 클로로포름과 같은 다양한 추출용매를 이용하였다. 50mL의 각 용매를 이용하여 실온에서 60분간 침지하여 1.0g의 감초를 추출하였다.
그 결과, 표 1과 같이 극성용매에서 추출효율이 좋았고, 특히 물에 메탄올 농도를 증가시킨 혼합용매에서 메탄올 농도의 증가에 따라 추출효율도 증가하였다. 이후, 실험에서는 추출용매로 메탄올을 사용하였다.
| 추출용매 | LQ(mg/g) | GA(mg/g) | 글라브리딘(mg/g) |
| 클로로포름 | * | * | * |
| n-헥산 | * | * | 0.006 |
| 물 | 0.15 | 2.08 | 0.001 |
| 메탄올:물 (25:75) | 0.20 | 1.93 | 0.008 |
| 메탄올:물 (50:50) | 0.23 | 1.76 | 0.023 |
| 메탄올:물 (75:25) | 0.25 | 1.59 | 0.066 |
| 메탄올 | 0.29 | 1.43 | 0.070 |
*: 검출안됨
2) 다양한 추출법에 의한 메탄올 추출
1.0g 감초 분말인 5개의 시료를 50mL 메탄올과 혼합하여 실온에서 20, 30, 60, 120 및 240분 동안 침지시켰다.
또다른 방법으로, 상기 메탄올과 혼합된 5개의 시료를 각각 2, 5, 10, 20 및 30분간 초음파로 처리하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 침지법에서 20분 내지 120분으로 침지시간을 증가함에 따라 LQ, GA 및 글라브리딘의 추출양도 증가하였지만, 120분이 경과하면 뚜렷한 증가가 나타나지 않았다. 따라서, 최적 침지시간이 120분인 것을 확인하였다.
또한, 침지없는 초음파법은 도 2에 나타난 바와 같이 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 LQ, GA 및 글라브리딘의 추출양도 증가하였다.
한편, 상기 두가지 방법을 비교하면 초음파법이 침지법에 비해 낮은 추출양을 나타내면서 더 많은 에너지를 필요로 하므로, 본 발명에서는 침지법을 사용하였다.
3) 다양한 용량의 메탄올을 이용한 추출
1.0g 감초 분말인 5개의 시료에 20, 50, 70, 100mL의 메탄올을 가하여 초음파 없이 실온에서 처리하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 추출용매의 용량이 증가함에 따라 LQ, GA 및 글라브리딘의 추출양도 증가하지만, 70mL 이상의 메탄올에서는 거의 동일한 추출양을 나타내었다. 따라서, 추출용매의 용량을 70mL로 사용하였다.
4) 추출방법의 타당성 검토
3가지 성분이 한번의 추출에 의해 완전히 추출되는지를 확인하기 위하여, 3단계로 추출하였다. 즉, 제1단계로 1g 감초 분말을 70mL 메탄올과 120분 동안 혼합한 후, 용매로부터 분말을 분리하고 오븐에서 건조하였다.
다음 제2단계 또다시 제3단계로서, 70mL 메탄올로 한번더 상기 과정을 반복하였다.
메탄올 70mL를 이용하여 1.0g 감초 분말을 3단계로 추출하면, 표 2와 같이 제2단계에서 LQ 및 GA의 추출양이 매우 낮고, 제3단계에서는 감초로부터 어떠한 것도 추출되지 않았다. 따라서, 70mL 메탄올로 일회 120분 동안 추출하였다.
| 메탄올 추출 | LQ(mg/g) | GA(mg/g) | 글라브리딘(mg/g) |
| 제1단계 (70 mL)제2단계 (70 mL)제3단계 (70 mL) | 0.290.0010.0 | 1.430.030.0 | 0.070.00.0 |
정확도 시험의 RSD, 표준물 용액에 대한 검출한계(LOD) 및 회수율을 표 3에 나타내었다. 이러한 값들은 실제 시료 분석을 위하여 받아들일 수 있는 정확도를 나타내었다.
RSD(relative standard deviation)로서 측정되는 재현성 분석은 LQ, GA 및 글라브리딘 표준용액을 하루에 5회 주입하여 수행하였다. 또, 이러한 실험을 5일동안 반복하였다. 표준용액의 농도는 0.33mg/mL이며, 주입 용량을 10μL로 고정하였다.
3가지의 표준물 농도 즉, LQ(0.15, 0.20, 0.30 mg/mL), GA(0.5, 0.6, 0.8 mg/mL) 및 글라브리딘(0.05, 0.06, 0.07 mg/mL) 각각을 실제 시료 3mL에 첨가하여 6mL로 채웠다.
상기 측정된 농도는 회수율 측정을 위하여 이론상 농도와 비교하였다. LQ, GA 및 글라브리딘 표준 용액은 희석하고 신호/노이즈 비율이 3으로 얻어지는 검출한계(LOD)가 나타나도록 주입하였다.
| 성분 | RSD(%) | 회수율 | LOD(ng/mL) | |||
| Intra-day | Inter-day | Added(mg/mL) | Recovery(%) | RSD(%) | ||
| LQ | 0.34 | 0.37 | 0.150.200.30 | 81.3379.9981.04 | 0.38 | 365 |
| GA | 0.54 | 0.59 | 0.50.60.8 | 88.7390.0590.32 | 0.66 | 464 |
| 글라브리딘 | 0.83 | 0.90 | 0.050.060.07 | 74.4569.8973.17 | 0.77 | 229 |
본 발명의 추출방법에 의해, 감초로부터 리퀴리틴 0.29mg/g, 글리시리진산 1.43mg/g 및 글라브리딘 0.07mg/g을 추출하고, 회수율이 각각 80.79%, 89.70% 및 72.51%로 나타남으로써 감초의 유용성분을 각각 추출 및 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 간단하고, 빠르며, 감초로부터 3가지 성분을 동시에 분리할 수 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.
<실시예 3> 다른 입경 컬럼에 의한 추출물 분리
분석컬럼에 대한 최대 주입 용량을 결정하기 위하여, 10, 25, 50, 75 및 100μL 주입 용량을 각각 사용하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 주입 용량을 50μL보다 과량으로 주입한 경우 GA 및 글라브리딘은 잘 분리되지만, LQ는 분리할 수 없었다. 따라서, 분석 컬럼의 최대 주입 용량은 50μL이었다.
분취용 컬럼(250X4.6mm)에서 ODS(12μm, 40/63μm, YMC Co.)의 입경을 사용하였다. 10, 20, 50, 100 및 200μL의 감초 추출물을 각 컬럼에 주입하였다.
도 5 및 도 6은 각각 40/63, 12μm의 입경에서의 크로마토그래프 분석을 나타낸 것으로, 10μL 주입 용량의 결과를 비교하면 GA는 두개의 분취용 컬럼 모두에서 잘 분리되지만, LQ 및 글라브리딘의 피크는 40/63μm 컬럼에서 방해를 받았다.
주입 용량이 100μL로 증가되면 표 4에 나타난 바와 같이, GA는 순수하게 분리되지 않으며 다른 두가지 성분은 40/63μm 컬럼에서 거의 검출되지 않았다.
고체 패킹 표면을 가진 시료의 더 작은 접촉면적, 더 넓은 열확산성, 더 긴 유출통로로 인하여 입경이 커질수록 컬럼효율 및 분해능은 떨어진다. 이러한 결과로부터 12μm의 입경을 지닌 분취용 컬럼을 사용해야 한다.
| 주입 용량(μL) | 피크너비 | |||||
| 40/63 μm | 12 μm | |||||
| LQ | GA | 글라브리딘 | LQ | GA | 글라브리딘 | |
| 10 | 1.38 | 1.54 | 1.02 | 0.87 | 0.78 | 0.50 |
| 30 | 1.78 | 1.61 | 1.12 | 1.23 | 0.88 | 0.63 |
| 50 | 1.84 | 1.66 | 1.52 | 1.38 | 1.14 | 0.77 |
| 100 | * | 1.68 | * | 1.78 | 1.61 | * |
| 150 | * | 1.70 | * | 1.96 | 1.79 | * |
| 200 | * | 1.82 | * | * | 1.84 | * |
*: 검출안됨
Claims (3)
- 감초에 메탄올 또는 메탄올 수용액을 가하고 실온에서 20-120분 동안 침지하여 추출하는 단계; 및아세토니트릴 및 1%(v/v) 아세트산으로 구성된 이동상을 이용한 역상 액체 크로마토그래피에 의해 감초로부터 리퀴리틴, 글리시리진산 및 글라브리딘을 분리하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 추출방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 메탄올 또는 메탄올 수용액은 감초 1 중량부에 대하여 15 내지 70 중량부로 첨가되는 것을 특징으로 하는 추출방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 역상 액체 크로마토그래피는 12μm 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 추출방법.
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