KR20090086817A

KR20090086817A - 손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20090086817A
Application number: KR1020080012293A
Authority: KR
Inventors: 진창배; 김형자; 이용섭; 정서윤
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2008-02-11
Filing date: 2008-02-11
Publication date: 2009-08-14
Also published as: KR100963643B1

Abstract

본 발명은 손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten) 열매의 종자를 알콜로 추출하여 얻은 알콜 추출물과 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1 ~ 8)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

손바닥선인장, 열매, 종자, 간독성 질환

Description

손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물{LIVER TOXICITY DISORDER COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT FROM THE SEED OF OPUNTIA FICUS-INDICA VAR. SABOTEN AND COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

본 발명은 손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 인간의 신체 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치하면서 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하게 되므로 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기 보다 많아 그 만큼 손상될 확률도 매우 높다. 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상이 있을 경우에는 충분히 정상으로 회복되지만, 손상이 지속될 경우에는 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 간 기능도 저하되는 등 정상 간으로의 회복이 어려운 상태가 된다. 또한, 우리의 몸은 산업화에 따른 공해물질, 유독물질에 항상 노출되어 있어 우리의 간은 끊임없이 해독작용에 시달리 고 있는데 간독성을 유발하는 물질 외에도 정신적 스트레스, 과음, 흡연 등은 간 손상을 가중시켜 인체가 방어 해독 작용을 하지 못해 면역 체계에 이상을 가져와 다른 질병의 원인이 되기도 한다. 간질환은 병이 생기는 원인에 따라 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물독성 간질환, 지방간, 자가 면역성 간질환, 대사성 간질환 및 기타 간질환으로 구분된다. 간 질환은 초기에 자각증상이 없어 상당히 진행되어서야 발견되기 때문에, 우리나라뿐만 아니라 세계적으로도 사망원인의 수위를 차지하고 있으나, 효과적인 치료제 및 진단방법이 없는 실정이다. 이러한 간 질환의 심각성에도 불구하고 아직까지 간 질환의 효과적인 치료방법이 없는 실정이므로 간 조직의 구조 및 기능을 유지하면서 간 손상을 치료 및 예방할 수 있는 약물 개발이 절실히 필요한 상황이다.

현재까지 천연식물에서 추출되어 실제 임상에서 응용되고 있는 간기능 보호제로서는 실리범 마리아넘(Silybum marianum)이라는 식물에서 추출된 실리빈(silybin), 실리디아민(silydiamine), 실리크리스틴(silycristine) 등의 이성체로 구성된 실리마린(silymarin) 제제가 있다. 이와 같이, 천연물로부터 간질환 치료제를 개발하려는 수많은 노력에도 불구하고 실제로 치료제로 현재 사용 중이거나 임상시험 중인 예는 소수에 불과하다. 이에, 본 발명자들은 간보호 효과를 가지는 물질을 탐색하여 식품 및 의약품에 활용하기 위한 목적으로 손바닥선인장 열매의 종자를 이용한 간 보호 활성을 조사하였다. 본 발명자들에 의하여 손바닥선인장의 줄기가 항산화 활성을 가지고 있는 것은 공지되었으며, 손바닥선인장 줄기로부터 분리된 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides)들이 효과적 으로 항산화 활성을 나타낸다고 보고된 바 있다[Saleem M. et. al., 2006, Phytochemistry 67:1390; Lee E.H. et. al., 2003, Arch. Pharm. Res. 26:1018; Dok-Go H. et. al., 2003, Brain Res. 965:130]. 그러나, 아직까지 손바닥선인장의 종자에 대한 간보호 활성에 관한 보고는 알려진 바가 없다.

예로부터 민간에서 화상, 부종, 소화불량, 종기 및 기관지 천식 등에 사용되어 온 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten Makino)은 아메리카 남부가 원산지인 선인장과(Cactaceae)에 속하는 다년초이다[이영노, 1998, 한국식물도감 교학사 p150]. 현재 제주도에서 특용작물로 다량 경작되고 있으며, 건강보조식품과 비누와 같은 미용제품으로 개발되어 시판되고 있다. 손바닥선인장의 열매 및 줄기의 에탄올 추출물은 진통 및 소염작용에 의한 위점막 보호효과, 혈당강하작용, 면역증강작용 등의 효능이 있는 것으로 알려졌다. 최근에 본 발명자에 의하여 손바닥선인장 줄기의 알콜 추출물이 항산화작용 및 뇌신경보호 효과가 있음을 발견하고, 특허 출원하여 등록받은 바 있다[한국 특허 등록 제523562호]. 또한, 손바닥선인장의 라디칼 소거활성, 멜라닌 생합성에 관여하는 티로시나제 억제활성, 항알레르기 활성[이남호 등, 2000, 생약학회지 31:412] 및 열매의 70% 메탄올 추출물의 신경손상을 억제효과[위명복 등, 2000, 약학회지 44:613] 등이 보고된 바 있다.

그러나, 손바닥선인장 열매 종자의 알콜 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들의 간 보호 활성에 관한 보고는 전혀 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 다양한 식물을 대상으로 간 보호 물질을 연구하던 중, 손바닥선인장 열매에서 간 보호 효과를 나타내는 물질을 확인하게 되었다. 손바닥선인장 열매 종자의 알콜 추출물 및 이 추출물에 함유되어 있는 성분을 수종 분리 동정하여 얻은 화합물들(화학식 1 ~ 8)은 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포를 t-BHP로 독성을 유도한 후 세포독성 보호효과를 검색한 결과 간 보호 작용에 탁월한 효과가 있음을 발견하고 간염, 지방간, 간경화 및 간장독성과 같은 간질환에 유용한 소재임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1 ~ 8)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1 ~ 8)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명은 손바닥선인장 열매 종자의 알콜 추출물, 알콜 추출물로부터 분리 정제한 화합물들이 t-BHP과 같은 독성물질에 의하여 간독성이 유발되었을 때 간세포 보호효과가 우수하여 회복능력이 우수하므로 간질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 기대할 수 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 손바닥선인장 열매의 종자를 알콜로 추출하여 얻은 간 보호 효과를 갖는 추출물과 이로부터 분리된 화합물들(화학식 1 ~ 8)을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화학식 1 ~ 8의 화합물들은 다음의 추출 및 분리 방법에 의하여 수득할 수 있다.

손바닥선인장 열매로부터 과육을 제거하여 깨끗하게 씻어 건조한 종자를 분쇄기를 이용하여 잘게 부수고, 이의 약 1 ~ 5배의 헥산(n-Hexane)으로 탈지한 후, 탄소수 1 내지 6개의 저급 알콜 또는 5 ~ 30%의 상기 알콜 용매에 가하여 1 ~ 2 리터/kg로 만들어 추출장치에 넣고 1 ~ 24시간 동안 60 ~ 100 ℃로 초음파 추출 또는 환류 추출한다. 이 알콜 용매를 여과지로 걸러서 얻은 용액을 농축기로 농축 및 건조하여 저급 알콜 추출물을 얻고, 이 알콜 분획물을 물에 가한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH)을 순차적으로 사용하여 분배하여 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 나머지 남는 물 분획물을 제조한다. 상기에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 세파덱스를 이용하여 조분획을 얻은 후, 실리카겔, 역상 실리카겔 및 세파덱스를 이용하여 상기 화학식 1 ~ 8의 화합물들을 얻을 수 있다.

상기 에틸아세테이트 분획물에서 활성이 가장 강하게 나타났으므로 이 분획 에서 간 보호 효능을 나타내는 성분을 분리하여 그 구조를 동정하고자 하였다. 손바닥선인장 열매 종자의 에틸아세테이트 분획물을 세파덱스, 역상 칼럼크로마토그래피(RP-18) 등을 사용하여 화합물들의 분리를 시도한 결과, 아메리카놀 A(화학식 1), 이소아메리카놀 A(화학식 2), 이소아메리카닌 A(화학식 3), 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화학식 4), 아메리카닌 D(화학식 5), 3,3′-비스드메틸 피노레시놀(화학식 6), 프린세핀(화학식 7), 이소프린세핀(화학식 8)의 8종 화합물들을 분리할 수 있었다.

특히, 이들 화합물들은 최초로 본 발명자들에 의하여 손바닥선인장으로부터 분리되었다.

상기와 같은 공정을 통하여 얻은 알콜 추출물과 이로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물 및 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제한 화합물들이 사람의 간암 세포주인 HepG2 세포를 t-BHP로 독성을 유도한 후 세포독성 보호효과를 검색한 결과, 에틸아세테이트 분획에서의 간 보호 효과가 우수하게 나타남을 알았으며(표 1), 순수 화합물들에서도 간 보호 작용에 탁월한 효과가 나타났다(표 2). 분리된 화합물 중 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화학식 4)가 간세포의 손상을 효과적으로 억제하였으며, 이의 효과는 대조약물로 사용한 실리빈이나 콰르세틴보다 우수한 세포독성 보호효과를 나타내었다. 아메리카놀 A(화학식 1), 이소아메리카놀 A(화학식 2), 이소아메리카닌 A(화학식 3), 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화학식 4), 아메리카닌 D(화학식 5), 3,3′-비스드메틸 피노레시놀(화학식 6), 프린세핀(화학식 7), 이소프린세핀(화학식 8)이 손바닥선인장 열매의 종자로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물이 간암 세포주인 HepG2 세포를 t-BHP로 독성을 유도한 간세포의 손상을 억제하는데 중요한 작용을 하는 유효활성성분들임을 밝혔다. 그러므로 본 발명은 아메리카놀 A(화학식 1), 이소아메리카놀 A(화학식 2), 이소아메리카닌 A(화학식 3), 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화학식 4), 아메리카닌 D(화학식 5), 3,3′-비스드메틸 피노레시놀(화학식 6), 프린세핀(화학식 7), 이소프린세핀(화학식 8), 이들의 혼합물 및 이들이 다량 존재하는 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten) 열매 종자의 알콜 추출물 또는 에틸아세테이트 분획물이 간 보호 작용이 우수하여 간독성 질환의 예방 및 치료에 유효하다는 사실을 제공하는 것이다. 즉, 상기 추출물과 이로부터 분리된 화합물들이 HepG2 세포에서의 세 폭독성의 보호효과로 인하여 간독성 질환, 구체적으로는 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암, 간성혼수 등에 대한 예방 및 치료 효과가 있는 것이다.

본 발명의 약학 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분을 담체와 함께 혼합하거나, 담체로 희석하거나, 캅셀, 새세이 또는 기타 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭서제, 현탁제, 에멀젼, 액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제 등의 경구 투여용 제형으로 제제화할 수 있다. 또한, 주사용 제형으로서 용액 또는 현탁액 등의 형태로 제제화할 수 있고, 경피 투여용 제형으로서 연고제, 크림제, 겔제 또는 로숀제 등의 형태로 제제화할 수도 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 알콜 추출물 또는 에틸아세테이트 분획물을 임상적인 목적으로 투여 시에 단일용량 또는 분리용량으로 성인에게 투여될 총 일일용량은 약 200 ㎎ 내 지 20 g, 바람직하게는 500 ㎎ 내지 10 g의 범위가 충분할 것이나, 일부 질환에 따라 더 높거나 더 낮은 일일 투여량이 요구될 수 있다. 또한, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령, 성, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물을 임상적으로 투여하여 목적하는 간독성 질환 치료효과를 얻고자 하는 경우에, 손바닥선인장의 알콜 추출물, 이로부터 분리된 화합물들을 공지의 간독성질환 치료제 중에서 선택된 1종 이상의 성분과 혼합하여 동시에 투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하겠지만, 본 발명의 기술적 범위가 다음 실시예로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 손바닥선인장 열매 추출물의 제조, 유효성분의 분리 및 정제

제주도산 손바닥선인장 열매(백년초)로부터 과육을 발라내어 제거하고 물로 씻은 후 잘 건조시킨 종자 9.44 kg을 분쇄하여 씨의 지방성분을 제거하고자 n-헥산(12.5 ℓ)으로 탈지하였다. 탈지한 종자 분말을 건조시킨 다음 환류장치를 이용하여 MeOH(2.5 ℓ)로 80 ℃에서 4시간 동안 환류 추출하였다. 이를 실온으로 냉각한 후 여과지로 여과한 용액은 감압 농축기를 이용하여 건조시켜 메탄올 추출물 224.6 g을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 증류수(1.0 ℓ)에 현탁시키고 이 어서 디클로로메탄(CH₂Cl₂, 0.5 ℓ× 3), 에틸아세테이트(EtOAc, 0.5 ℓ× 3), 부탄올(BuOH, 0.5 ℓ× 3)을 순차적으로 사용하여 분배하여 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 나머지 남는 물(H₂O) 분획물을 제조하였다.

제조예 2: 손바닥선인장 열매 종자의 에틸아세테이트 분획물로부터 간세포 보호성분의 분리

손바닥선인장 열매 종자의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물 24.7 g을 메탄올을 전개용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하여 14개의 소분획으로 나누었다. 소분획 E9(1.42 g)을 실리카겔을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂:MeOH(11:1)의 혼합용매로부터 메탄올의 양을 증가시켜 CH₂Cl₂:MeOH(5: 1)을 사용하여 14개의 소분획을 얻을 수 있었다. 소분획 E9d(34.0 ㎎)는 분취용 역상 실리카겔 TLC를 이용하여 40% CH₃CN을 전개용매로 하여 분리를 실시한 결과, 24.7 ㎎의 이소아메리카닌 A(화학식 3)를 얻었다. 소분획 E9f(153.7 ㎎)는 역상 실리카겔을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 사용한 용매는 40% 아세토니트릴(CH₃CN)의 전개용매를 사용하여 한 결과 95.2 ㎎의 3,3′-비스드메틸 피노레시놀(화학식 6)을 얻었다.

소분획 E10(963.0 ㎎)을 실리카겔을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. CH₂Cl₂:MeOH(12:1)의 혼합용매를 전개용매로 사용하여 얻은 소분획 E10i(227.1 ㎎)를 분취용 HPLC(LiChrosorb RP-18 250-10, 7 ㎛)를 이용하여 분리를 실시하였다. 35% MeOH부터 점진적으로 메탄올의 양을 증가시켜 50% MeOH를 사용하여 유속 3.4 ㎖/min으로 흘려준 결과 43.6 ㎎의 프린세핀(화학식 7)과 65.7 ㎎의 이소프린세핀(화학식 8)을 각각 얻을 수 있었다. 소분획 E7(1.75 g)은 역상 실리카겔을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매는 25% CH₃CN을 사용하여 18개의 소분획으로 나누었다. 소분획 E7h(176.5 ㎎)는 실리카겔을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매로는 CH₂Cl₂:MeOH(11:1)을 사용하여 73.3 ㎎의 3,3′-비스드메틸 피노레시놀(화학식 6)을 추가로 얻었다.

소분획 E7i(133.7 ㎎)는 실리카겔(전개용매-CH₂Cl₂:MeOH/13:1)과 역상 실리카겔(전개용매- 55% MeOH)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 4.9 ㎎의 아메리카닌 D(화학식 5)를 순수하게 얻었다.

소분획 E7l(447.5 ㎎)을 실리카겔(CH₂Cl₂:MeOH/13:1)과 분취용 HPLC(LiChrosorb RP-18 250-10, 7 ㎛)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 전개용매는 30~70% CH₃CN의 구배 시스템(gradient system)을 사용하였고 유속 3.1 ㎖/min의 속도로 용매를 전개시켜 11.7 ㎎의 아메리카놀 A(화학식 1), 21.2 ㎎의 이소아메리카놀 A(화학식 2), 17.5 ㎎의 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화학식 4)을 각각 얻을 수 있었으며, 44.5 ㎎의 이소아메리카닌 A(화학식 3)를 추가로 얻을 수 있었다.

제조예 3: 손바닥선인장 열매 종자의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 성분들의 구조 결정

상기 제조예 2에서 얻은 각 성분들에 대한 물리적 특성 및 ¹H-NMR (400 MHz)과 ¹³C-NMR (100 MHz) 스펙트럼을 측정하였다.

각 피크의 화학이동 값(chemical shift)을 측정용매인 메탄올의 화학이동 값 (3.3 ppm, 49.8 ppm)에 대한 상대값으로 나타내었으며, 그 결과는 다음 표 1 내지 표 3에 나타내었다.

화합물 1( 아메리카놀 A): 무색의 화합물, Mp 129 ℃, [α]²² _D+1.50°(c 0.54, MeOH)

ES-MS(positive-ion mode):m/z = 353[M+Na]⁺

[화학식 1]

화합물 2( 이소아메리카놀 A): 무색의 화합물, Mp 103-105 ℃, [α]²² _D+1.44°(c 0.98, MeOH), ES-MS(positive-ion mode):m/z = 353[M+Na]⁺

[화학식 2]

화합물 3( 이소아메리카닌 A): 무색의 화합물, Mp 140 ℃, [α]²² _D+0.19°(c 2.13, MeOH), ES-MS(positive-ion mode):m/z = 351[M+Na]⁺

[화학식 3]

화합물 4(9′- O - 메틸이소아메리카놀 A): 무색의 화합물, [α]²² _D+2.57°(c 0.70, MeOH), ES-MS(positive-ion mode):m/z = 367[M+Na]⁺

[화학식 4]

화합물 5( 아메리카닌 D): 무색의 화합물, Mp 162 ℃(dec.), [α]²² _D+2.76°(c 0.15, MeOH), ES-MS(positive-ion mode):m/z = 351[M+Na]⁺

[화학식 5]

화합물 6(3,3′- 비스드메틸 피노레시놀 ): 연노란색의 화합물, [α]²² _D+0°(c 0.44, MeOH), ES-MS(positive-ion mode):m/z = 353[M+Na]⁺

[화학식 6]

화합물 7( 프린세핀 ): 무색의 화합물, Mp 117 ℃, [α]²² _D-1.61°(c 1.74, MeOH)

ES-MS(positive-ion mode):m/z = 517[M+Na]⁺

[화학식 7]

화합물 8( 이소프린세핀 ): 무색의 화합물, Mp 136-137 ℃, [α]²² _D+0.46°(c 2.62, MeOH) ES-MS(positive-ion mode):m/z = 517[M+Na]⁺

[화학식 8]

분석 결과, 본 발명에서 손바닥선인장 열매 종자의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 구조는 공지의 아메리카놀 A(1), 이소아메리카놀 A(2), 이소아메리카닌 A(3), 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(4)[Waibel R. et. al., 2003, Phytochemistry 62:805], 아메리카닌 D(5)[Woo, W. S. et. al., 1980, Tetrahedron Lett. 21:4258], 3,3′-비스드메틸 피노레시놀(6), 프린세핀(7), 이소프린세핀(8)[Waibel R. et. al., 2003, Phytochemistry 62:805]의 알려진 문헌과 잘 일치함을 확인할 수 있었다.

실시예 1: t -BHP에 의한 간세포 손상 회복 효과

손바닥선인장 열매의 종자로부터 추출한 알콜 추출물 및 에틸아세테이트로부터 순수하게 분리 정제한 화합물들은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 10 ㎎/㎖ 저장용액(stock solution)을 만들었으며, 이를 배지로 희석시켜 알맞은 농도로 사용하였다. 사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 2×10⁴ cell/well로 분주하여 24시간동안 배양하여 안정화하였다. 배양된 세포에 손바닥선인장 알콜 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들을 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양하고, 200 μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 독성을 유발하였다. 이와 같이 처리된 세포를 세포독성 및 세포 생존 정도를 알아보기 위하여 MTT 분석법[Hansen M.B. et. al., 1989, J. Immunol . Methods 119:119]을 사용하였다.

MTT가 첨가된 세포를 4시간 동안 배양한 후 시약을 제거하고 각 웰에 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. t-BHP 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 독성 처리군 및 시료 처리군의 세포생존율을 대조군에 대한 백분율로 나타내었으며 3회 반복 실험한 결과를 다음 표 4와 표 5에 각각 나타내었다.

(계속)

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하였을 때 대조군에 비하여 47.84%로 세포생존율이 낮아지는 것을 알 수 있었으며, 이 세포독성은 손바닥선인장 열매의 종자로부터 추출한 용매 추출물들에 의하여 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물에서는 대조약물로 사용한 실리빈 보다도 훨씬 우수하게 나타나고, 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴과 유사한 보호 효능을 나타내고 있다.

이는 손바닥선인장 열매의 종자로부터 추출한 용매 추출물들이 독성에 의한 간세포 손상 보호 효과가 우수함을 알 수 있었다.

(계속)

상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하여 낮아진 세포생존율이 손바닥선인장 열매 종자의 에틸아세테이트 분획물에서 분리 정제한 화합물 1 ~ 8에 의하여 농도 의존적으로 증가됨을 알 수 있었다. 특히, 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화합물 4)는 대조약물로 사용한 실리빈 보다도 보호효과가 훨씬 탁월하게 나타나고, 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 보호효과보다도 우수한 효능을 나타내고 있다. 따라서, 손바닥선인장 열매의 종자의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물의 우수한 간 보호 효과는 이들 화합물들에서 기인한 것임을 알 수 있었으며, 이들 화합물들은 독성에 의한 간세포 보호제로 유용함을 알 수 있었다.

실시예 2: t-BHP에 의한 간세포 괴사 억제 효과

세포독성에 의하여 세포가 괴사(necrosis)되면 젖산 탈수소효소(LDH: lactate dehydrogenase)가 유리되는데 이를 세포괴사의 지표로 삼아 그 활성을 측정하였다.

사람 간세포인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 2×10⁴ cell/well로 분주하여 24시간동안 배양하여 안정화하였다. 배양된 세포에 손바닥선인장 열매의 종자로부터 추출한 알콜 추출물 및 순수 분리된 화합물들을 농도별로 처리하여 2시간 동안 배양하고, 200 μM의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 독성을 유발하였다. 배양이 끝난 세포의 상층액으로부터 유출된 LDH의 양을 키트(Roche)를 이용하여 측정하였다[Chen Q. et. al., 1997, J. Biol . Chem ., 272:14532]. 결과는 3회 반복 실험하여 다음 표 6과 표 7에 각각 나타내었다.

(계속)

상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하였을 때 세포손상에 따른 LDH의 유출양이 대조군의 11.20%에 비하여 56.07%로 증가됨을 알 수 있었다. 그러나, 손바닥선인장 열매의 종자로부터 추출한 용매 추출물들을 처리했을 때는 세포괴사가 억제되어 LHD의 유출양이 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물에서는 대조약물로 사용한 실리빈 보다도 세포괴사 억제 효과가 훨씬 우수하게 나타나고, 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 억제 효과와 유사한 효능을 나타내고 있다.

이는 손바닥선인장 열매의 종자로부터 추출한 용매 추출물들이 독성에 의한 간세포 괴사 억제 효과가 우수함을 알 수 있었다.

(계속)

상기 표 7에서 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 200 μM t-BHP를 처리하여 증가된 LDH의 유출양이 손바닥선인장 열매 종자의 에틸아세테이트 분획물에서 분리 정제한 화합물 1 ~ 8에 의하여 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다. 특히, 9′-O-메틸이소아메리카놀 A(화합물 4)는 대조약물로 사용한 실리빈 보다도 세포괴사 억제 효과가 훨씬 탁월하게 나타나고, 항산화물질로 잘 알려진 콰르세틴의 괴사억제 효과 보다도 우수한 효능을 나타내고 있다. 따라서, 손바닥선인장 열매의 종자의 알콜 추출물로부터 분획한 에틸아세테이트 분획물의 우수한 세포괴사 억제 효과는 이들 화합물들에서 기인한 것임을 알 수 있었으며, 이들 화합물들은 독성에 의한 간세포 괴사를 억제하는데 유용함을 알 수 있었다.

Claims

손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten) 열매의 종자 알콜 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 손바닥선인장 열매 종자의 알콜 추출물은

1) 손바닥선인장 열매 종자의 분말을 1 ㎏당 알콜 용매 0.1 내지 10 ℓ를 첨가하고 60 ~ 100 ℃에서 2 ~ 6시간동안 환류하여 추출하고,

2) 상기 추출물을 여과 및 감압 증발시켜 얻은 추출물이거나;

상기 2)의 추출물로부터 에틸아세테이트(EtOAc) 1 내지 5 ℓ로 추출하여 얻어진 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 1)의 알콜 용매는 탄소수가 1 ~ 4개인 저급 알콜 및 50% 이상의 알콜 수용액으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
다음 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성 분으로 함유하는 간독성 질환의 예방 및 치료용 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
제 4 항에 있어서, 상기 화합물은 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten) 열매의 종자 알콜 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 간독성 질환은 약물성 간 손상, 바이 러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수인 것을 특징으로 하는 조성물.