KR20090079128A - 유산균 발효에 의해 단백질의 항원성이 저하된 계란 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전란액 또는 난황액에 정제수와 포도당, 과당 및 프락토올리고당 등을 첨가하여 섭씨 75도 이상 100도 이하의 온도에서 열응고가 일어나지 않도록 열처리하고 혼합유산균을 접종하여 발효함으로서 계란 내에 존재하는 알레르기 유발인자로서의 계란단백질인 오보뮤코이드, 오보알부민, 포스비틴 및 리베틴 등의 항원성을 감소시킨 계란의 발명에 관한 것이다.

알레르기, 항원성, 계란, 난황, 오보뮤코이드, 오발부민, 포스비틴, 리베틴, 유산균, 발효

Description

유산균 발효에 의해 단백질의 항원성이 저하된 계란{Egg with reduced antigenicity of ovomucoid and ovalbumin by lactic acid fermentation}

인간이 생명을 유지하기 위해서는 식품을 통한 영양소의 섭취가 필수적으로 이루어져야 한다. 이러한 식품은 생체에 영양소를 공급하여 생명을 유지하게 하는 필수 조건이기도 하지만 때로는 알레르기 질환의 원인이 되기도 한다. 알레르기(allergy)라는 용어는 1906년 빈의 소아과 의사인 Clemens von Pirequest에 의해 처음으로 사용된 이래 현재까지 세계적으로 널리 쓰이는 단어이다. 식품알레르기(food allergy)라는 용어는 식품과민성(food hypersensitivity)과 같은 의미를 갖는 단어임에도 불구하고 식품에 포함된 물질에 의해 나타나는 이상반응(adverse reaction) 모두를 의미하는 말로 잘못 사용되고 있으며 식품으로 인해 일어날 수 있는 여러 형태의 반응을 정의하는데 혼란이 있다. 그래서 1984년 미국 알레르기 및 천식 학회의 식품 이상반응 협의회에서 식품이나 식품첨가물을 섭취한 뒤에 나타나는 신체의 불리한 반응을 총칭하여 이상반응으로 정의하고 이상반응 중에서 면역반응에 의해 일어나는 경우만을 식품알레르기로 정의하였다[손대열. 식품 알레르기 진단법. 식품과학과 산업. 33(2): 10-15(2000)].

식품알레르기(food allergy)란 식이 형태로 우리 몸에 들어온 음식물의 특정 물 질에 대하여 면역계가 과민하게 반응하여 여러 가지 증상을 일으키는 것을 가리키며 천식, 가려움을 동반한 발진, 발열 등의 전신 증상과 알레르기성 간장이완증후군으로 대표되는 신경증상, 설사, 복통, 구토 등의 소화기 장애 등 여러 병례를 나타낸다. 식품 알레르기를 가진 사람은 소수이지만 이들은 알레르기 원인 식품으로 심한 경우 목숨까지 위협받을 수 있으며 전 세계 1억 5천만 명(미국인 중 6~7백만 명, 개발도상국 인구의 2.5%, 한국에서는 5~38%)이 질환으로 고생하고 있다. 식품 알레르기의 원인물질은 주로 식품 중의 단백질이며 미국에서는 우유, 계란, 대두, 생선 등 일상적으로 섭취하는 8가지가 전체 알레르기 반응의 90% 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 여러 식품 중 계란을 선택한 이유는 계란이 우리나라에서 가장 알레르기를 많이 일으키는 식품 중 하나이기 때문이다. 손대열 등[한국식품과학회지. 34(5): 885-888(2002)]은 국내 주요 알레르기 원인 식품에 대한 조사에서 우리나라의 알레르기원인 식품을 파악하기 위해 약 3년간 1707명을 대상으로 9054건의 알레르기 검사를 한 결과 검사 건수 중 11.3%가 양성으로 나타났으며 난백이 336건, 우유가 266건, 난황이 95건, 대두가 76건, 알파락트알부민이 69건, 카제인이 61건, 베타락토글로부린이 58건, 메밀이 39건, 밀이 12건, 쇠고기 3건, 게 2건, 쌀, 새우, 돼지고기, 닭고기, 고등어가 각 1건으로 나타났다. 즉, 우리나라에서 제일 많은 알레르기를 유발시키는 식품은 계란이며 전체 원인 식품의 95% 이상을 차지하는 4대 알레르기 유발식품으로서는 계란, 우유, 대두, 메밀로 볼 수 있겠다.

표1) 각 국가별 알레르기 유발 관리대상 식품의 종류(각 재료 명 표기 의무화)

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국가명 : 알레르기 유발 관리대상 식품

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대한민국: 난류(가금류), 우유, 메밀, 땅콩, 대두, 밀, 고등어, 게, 돼지고기, 복숭아, 토마토

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일 본: 계란,우유,밀,메밀,땅콩(의무표시 5종).대두,고등어,게,돼지고기,복숭아,바나나,전복,오징어,연어,연어알,새우,오렌지,키위,쇠고기,호두,닭고기,송이버섯,참마,사과,젤라틴(권장표시 20종)

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미 국: 우유, 난류, 생선, 갑각류, 견과류, 땅콩, 대두, 밀

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CODEX : 곡류(글루텐), 갑각류, 난류, 어류, 땅콩, 대두, 유제품, 견과류, 설파이트(sulfite)

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EU : 곡류(글루텐),갑각류,난류,생선,대두,유제품,너트,샐러리,겨자,참깨,설파이트(sulfite)

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계란알레르기는 소아에게 가장 발현빈도가 높아 대표적인 식품알레르기의 하나이다. 우유알레르기와는 달리 성인에게서도 발견되는 특징이 있다. 계란 알레르겐에 관한 생화학적인 해석이 진보하고 있는데 주요 알레르겐은 계란 전체 중량의 60% 이상을 차지하는 난백에 존재하고 난황단백질은 알레르기와 관련이 매우 낮다. 난백은 20종 이상의 단백질이 알려져 있다. 그 중 대표적인 것은 ovalbumin, ovomucoid, lysozyme이다. Ovalbumin(OA; 알레르겐명, Gal d 2)은 전체 난백단백질의 54%를 차지하고 있어 주요 알레르겐으로 생각된다. 그러나 계란 알레르기 환자의 혈중에 난백단백질에 특이적인 IgE 항체를 가지지만 ovomucoid(OM; 알레르겐명 Gal d 1)에 특이적인 IgE 항체를 가지지 않은 경우에는 난백을 섭취해도 알레르기를 일으키지 않는 경우가 있는 점 등을 미루어 ovomucoid가 가장 중요한 알레르겐으로 생각된다. Ovomucoid는 총 난백단백질의 11%가량 차지한다. 분자내 S-S결합을 3개씩 가지는 3개의 subunit로 구성되어 있으며 고차구조는 열이나 화학처리에 의하여 쉽게 파괴되지 않는다. 또한 protease inhibitor의 활성을 갖고 있어 소화효소에 내성이 매우 강하기 때문에 ovomucoid가 ovalbumin 보다 높은 알레르기 유발성을 나타낸다고 생각된다. 장관면역계가 미숙하여 소화효소의 분비능이 약한 영유아에 계란 알레르기가 많고 나이가 들면서 소화관의 성숙으로 치유됨을 고려하면 소화내성이 높은 ovomucoid가 실제로 주요 알레르겐이라는 주장이 설득력이 있다.

남승연과 이상일[식품과학과 산업. 33(4): 16-21(2000)]은 식품알레르기의 치료와 예방에 관한 보고에서 식품 알레르기의 1차 예방법으로 모유수유를 하는 여성에게 알레르기성 식품의 제한 식이를 시행할 때 영아기 동안 알레르기 피부병변과 식 품감작이 감소됨이 증명되어 모유 수유를 시행하되 수유하는 동안 여성은 땅콩, 견과류, 어패류의 섭취를 삼가고 경우에 따라 우유, 계란도 자제하라고 제시하였다. 이렇듯이 계란은 완전식품이라고 불리는 고영양식품임에도 불구하고 알레르기의 문제로 인하여 유아 뿐 아니라 수유부에게 까지 자제해야 하는 식품군이 되고 있다.

따라서 본 발명에서는 당의 첨가, 열처리, 유산발효 등의 공정을 거쳐 생산된 계란이 알레르기를 일으키는 항원 즉, 항 오보뮤코이드 및 항 오보뮤신의 항체를 이용한 ciELISA test를 실시한 결과 항원성이 현저히 약화된 계란을 생산할 수 있었다.

이는 기존의 문헌에서 나타난 난백의 항원성은 열처리, 효소처리, 알카리처리 등 화학처리에 의해 오보뮤코이드와 오보뮤신의 항원성이 동시에 현저히 약화된 예가 없는 것과 비교해 볼 때 계란의 알레르기를 염려하지 않고 계란을 성인 뿐 아니라 유아 등 어린이에게도 제공할 수 있는 장점을 가지고 있다.

본 발명에 제공된 기술은 난백단백질을 가열 처리하여 유산균 발효를 성공적으로 유도하기 위하여 난백을 기존의 열응고 조건 이상으로 가열하더라도 응고시키지 않도록 하는 난백의 열감수성 저하 기술과 더불어 적절한 유산발효 기술이 적용되었다

본 발명과 관련된 기존 연구결과 및 특허를 제품별 및 연구의 종류별로 요약하면 다음과 같다. 본 발명의 소재로 사용된 계란에 관한 연구로는 난백단백질의 항원성 저하 연구로서 류주현 등[한국식품과학회지. 32: 720-725(2000)]은 효소, trifluoromethanesulfonic acid, 열 및 NaOH 처리에 의한 계란 난백의 항원성 변화 연구에서 효소를 이용한 가수분해처리로서 난백의 항원성에 영향을 주지 못했으며 trifluoromethanesulfonic acid는 난백의 항원성을 제거시켰고 열처리는 섭씨 121도의 고온 처리시 항원성을 제거시켰다. 그러나 섭씨 100도 이상의 고온처리는 가열취를 생성하는 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 류주현 등[한국식품과학회지. 36: 147-151(2004)]은 NaOH, 열 및 효소 처리에 의한 계란 난백 중 ovomucoid(OM)와 ovalbumin(OA)의 항원성 변화에 관한 연구에서 효소처리는 OM의 항원성을 감소시키지 못한 반면 OA의 항원성은 감소시켰다고 하였다. 열처리는 섭씨 100도 이하에서 항원성을 감소시키지 못했으며 NaOH는 1% 이상의 농도에서 OM의 항원성을 제거했으나 OA는 오히려 증가하였다고 보고한 바 있다. 하기와라요시히데 등[대한민국 특허등록번호 10-0500004. 특허권자: 니혼 야쿠힌 가이하츠 가부시키가이샤]은 초란 분말의 제조방법에 관한 특허에서 난각이 포함된 전란을 산수용액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 초란을 제조할 경우 소화성이 향상되고 알레르기 발생이 적은 초란을 생산할 수 있다고 하였다.

우유는 계란 다음으로 한국인에게 알레르기를 많이 유발시키는 식품이다. 우유 및 유제품에 관한 기존의 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 하월규 등[한국식품과학회지. 26: 74-80(1994)]은 효소가수분해에 의한 유청단백질의 항원성 저하에 관한 연구를 진행한 결과 토끼 항유청단백질 항혈청에 의한 ciELISA로 검토한 유청단백질 가수분해물의 monovalent 항원성은 chymotrypsin 등의 효소처리에 의해서 저하되었으며 가수분해가 많이 일어날수록 그 항원성이 낮아지는 것으로 나타났다고 보고하였으며 또한, 각 처리구내에서는 열 및 pepsin의 전처리 후 효소 분해한 유청단백질 가수분해물의 항원성이 가장 낮았으며 pacreatin 가수분해물의 경우 항원성이 거의 상실된 것으로 나타났다고 하였다. 또한, 하월규 등[한국식품과학회지.26(4): 436-441(1994)]은 토끼 항알파락트알부민 항혈청에 대한 유청단백질 가수분해물의 항원성에 관한 연구에서 유청단백질의 항원성은 효소로 가수분해하면 쉽게 파괴되며 특히 단백분해효소를 적용하기 전에 열이나 pepsin처리에 의해서 더 효과적으로 항원성을 감소시킬 수 있다고 보고하였다. 그리고 하월규 등[한국식품과학회지. 26(5): 532-538(1994)]은 토끼 항베타락토글로부린 항혈청에 대한 유청단백질 가수분해물의 항원성에 관한 연구에서 미생물 유래의 단백질 분해 효소를 사용하여 유청단백질을 가수분해할 경우 우유알레르기의 주요 원인인 베타락토글로부린의 항원성이 제거됨으로 조제분유용 유청단백 가수분해물을 제조할 수 있다고 보고하였다. 한편, Moneret-Vautrin, A 등(1982) 및 Maruyama, N 등(1999)은 우유 알레르기를 저감화하기 위하여 소화효소를 이용하여 베타락토글로부린(BLG)을 가수분해 시킬 경우 알레르기원성이 감소되며 단백질 가수분해 효소를 사용하여 제조한 저알레르기원성 분유가 판매되고 있다고 보고하였다[한국식품영양학회지. 19(3): 296-300(2006)]. 우유가공품에 관한 연구로서 이형규 등[대한민국 특허등록번호 10-0685285. 특허권자: 한국생명공학연구원, 주)더멋진바이오텍]의 항알러지, 항염증 및 항천식 활성을 갖는 캐피어 분말 또는 그 추출물을 함유하는 조성물에 관한 특허에는 항염증 및 항천식 활성을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스, 락토바실러스 케피리 등 2종의 유산균과 클루베라마이세스 속 효모로 구성되는 캐피어그 레인 및 탈지분유를 이용하여 얻은 캐피어 물추출물을 유효성분으로 하는 약학조성물이 특허 등록된 바 있으며 이를 포함하는 화장품이 특허의 범위에 포함되어 있다.

기타의 식품군에서 알레르기를 일으키는 예를 광범위하게 조사하였고 그 결과는 다음과 같이 나타났다. 이주운 등[한국식품과학회지. 32(4): 822-827(2000)]은 감마선 조사에 의한 갈색 새우에 있어서 주요 알러젠의 알러지성 및 항원성의 변화 연구에서 환자의 IgE는 감마선 조사된 새우 단백질 추출액과 열안정성 단백질 용액 모두에서 감마선 조사선량이 증가함에 따라 감소하여 감마선조사가 새우 알러지 억제에 적용할 수 있는 가능성이 제시되었다. 또한, 박주연 등[한국식품과학회지. 36(1): 152-157(2004)]은 효소분해에 의한 밀가루의 항원성 저감화 연구에서 우리 밀(금강 밀)의 글루텐 분획에 bovine pancreas protease를 일정시간 처리함으로서 우리 밀의 항원성 저하 가능성이 확인되었다고 보고하였다. 특허 분야에서 남용석 등[대한민국 특허등록번호 10-0720867. 특허권자: (주)코젠바이오텍]은 알레르기 유발식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 유발식품 검출방법에 관한 특허에서 알레르기를 유발하는 식품인 고등어 또는 이의 가공식품 내 함유된 알레르기 유발식품을 신속, 간편하게 검출할 수 있는 알레르기 유발 식품 검출용 프라이머 및 이를 이용한 알레르기 유발식품 검출방법을 제시하였다. 이연희와 백경수[대한민국 특허등록번호 10-0507417. 특허권자: (주)피엘바이오]의 알레르기 질환 예방 및 치료기능을 가진 유산균과 이를 함유한 항알레르기 제품에 과한 특허에는 알레르기 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균으로서 락토바실러스 플랜타룸 PL9011이 등록된 바 있으며 이를 포함하는 화장품 및 식품 등도 특허의 범위에 포함되어 있다. 그리고 이연희와 백경수[대한민국 특허등록번호 10-0532362. 특허권자: (주)피엘바이오]의 알레르기 질환 예방 및 치료기능을 가진 비피도박테리움 인판티스의 특허에는 알레르기 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균으로서 비피도박테리움 인판티스 PL9506이 등록된 바 있으며 이를 포함하는 화장품이 특허의 범위에 포함되어 있다. 한편, 이키모토켄고[대한민국 특허공개번호 10-2007-0108291. 특허권자: 산토리 가부시키가이샤]는 알레르기 증상의 예방 또는 개선작용을 갖는 음식물 및 당해 음식물의 제조방법에 관한 특허출원에서 디옥사비사이클로옥탄 유도체를 유효성분으로 함유하는 알레르기 증상의 예방 또는 개선제를 포함하고 있다. 그리고 제르몽쟈끄에두아르[대한민국 특허공개번호 특2003-0034178. 특허권자: 소시에떼 데 프로듀이 네슬레]는 알레르기 반응을 발달시키는 개인의 경향을 감소시킬 수 있는 젖산박테리아에 관해 특허출원 한 바 있으며 면역허용원 펩티드를 포함하는 단백질을 발달시키는 젖산 박테리아 종의 발생 및 알레르기 반응을 일으키는 개인의 경향을 감소시키는 용도로서 새로운 종의 젖산박테리아 및 그 활성분획을 포함하는 물질을 특허 출원의 범위에 두고 있다. 알레르기 위험을 감소시키는 개선된 모유 수유를 위한 방법에 관해 연구하여 출원한 비조르크스텐 등[대한민국 특허공개번호 10-2007-0018907. 특허권자: 바이오가이아 에이비]은 수유 유아에서 알레르기의 발병위험을 감소시키고 수유모체에서 유선염의 발병위험을 감소시키기 위하여 선별된 균주의 세포를 함유하는 산물에 대해 특허 출원한 바 있다.

계란을 삶거나 날것으로 섭취할 경우 유아 및 성인에게 자주 발생하는 알레르기는 대표적인 식품 알레르기로 계란의 소비 및 이용에 큰 저해 요인이므로 이를 해결하고자 하는 것이 본 발명의 목적이다. 그러나 많은 연구자 들이 시도한 결과 최종 식품의 품질을 손상시키지 않거나 향상시킨다는 전제하에서 이루어진 괄목한 성과는 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 발명에서는 계란의 부가가치를 향상시키면서 알레르기를 일으키는 대표적인 계란단백질의 항원성을 저감화 혹은 제거시키는 것이 본 과제의 목적이다.

일반적으로 발효유제품은 알레르기를 일으키는 단백질의 항원성이 약화 혹은 제거되어 있는 것으로 알려져 있다. 강근옥[한국식품영양학회지. 19(3): 296-300(2006)]은 면역분석법을 이용한 발효유제품의 알레르기원성 평가 연구에서 시유, 분유, 발효유에 존재하는 우유알레르겐인 베타락토글로부린(BLG)를 측정하기 위해 면역 blotting 및 간접결합면역분석법(ciELISA)을 사용하고 Immunoblotting 결과 발효유에서는 우유알레르기 환자의 IgE와의 반응이 나타나지 않았고 분유와 시유에서는 나타났다고 하였으며 다클론항체 및 우유알레르기 환자의 IgE로 BLG 함량을 측정한 결과 시유가 가장 높았고 발효유가 가장 낮았다고 보고 하였다. 그러나 발효유에서도 잔존하는 항원성을 제거하기 위한 노력이 이루어지지 않는 것은 아니다. 박순옥 등[대한민국특허 공개번호 10-2007-0071535. 출원인: 매일유업(주)]은 항원성이 저감화된 발효유 및 그의 제조방법에 관한 특허에서 우유단백질에 대해 일정량의 단백분해효소를 첨가하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 항원성이 저감화되면서 쓴 맛이 없는 발효유의 제조방법을 개발한 바 있다.

그러나 계란의 경우는 유산발효 그 자체가 용이하지 않다. 그 이유는 첫째, 유산균을 접종하여 발효를 시키기 위하여 사전에 살균을 해야 하는데 살모넬라 및 일반 세균을 사멸시키기 위하여 섭씨 65도 이상의 온도로 가열할 경우 난백단백질의 12%를 차지하는 오보트란스페린이 가장 먼저 섭씨 61도 이상에서는 응고하여 겔을 만듦으로서 이는 접종된 유산균이 증식하기에 부적합한 조건을 제공하게 된다. 즉 일반적으로 발효유를 만들기 위해 적용되는 섭씨 75도 이상의 온도로 가열할 경우 계란은 오보트란스페린 뿐 아니라 계란을 구성하는 다른 단백질들도 가열 변성이 일어나 단단히 응고하여 접종된 유산균 스타터가 제 기능을 발휘하지 못하여 발효된 계란을 만들지 못한다. 둘째, 섭씨 65도 혹은 75도의 온도로 가열하여 응고가 일어나지 않는다 하더라도 열변성 온도가 섭씨 85도인 아비딘은 열변성되지 않아 미생물 생육에 필수영양소인 비오틴과 결합하여 유산균의 생육을 억제함으로서 유산발효가 원활치 않게 된다. 난백의 11%를 차지하는 오보뮤코이드 단백질의 열변성 온도는 섭씨 79도 이므로 그 이하의 온도에 의해서는 오보뮤코이드가 갖는 단백분해효소 저해제로서의 기능을 불활성화 시킬 수 없으므로 유산균이 증식해서 분비하는 단백분해효소에 의한 알레르기물질인 난백단백질의 가수분해효과를 충분히 기대할 수 없다. 그 뿐만 아니라 섭씨 65도 이상의 열변성온도를 갖는 난백단백질은 난백에 다량 존재한다. 즉, 열변성온도 섭씨 75도인 라이소자임은 미생물의 세포벽을 용혈시키는 기능이 있어 유산균 스타터의 증식을 억제하며, 난백단백질의 가장 많 은 부분인 54%를 차지하는 오발부민의 열변성온도도 섭씨 84도이다[Stadelman W.J. Egg Science and Technology. Food Products Press. p.120, 1995]. 특히 오발부민은 대표적인 난백 알러젠으로 알려져 있기도 하다.

따라서 계란을 유산 발효시키기 위해서는 이상에서 언급된 두 가지 문제를 해결해야하는 과제가 선행되어야 하며 이를 충족시키는 조건하에서 결과적으로 목적하는 바 오보뮤코이드와 오발부민의 항원성을 제거 또는 저감화 시킬 수 있는 방법의 모색이 요구된다.

계란의 단백질 즉 난백단백질은 알을 보호하기 위한 목적으로 항균성 물질을 다량 함유하고 있다. 즉 외부의 침입에 의하여 난황을 보호하여 하나의 생명인 병아리를 무사히 탄생시키기 위한 자연의 섭리인 것이다. 따라서 난백단백질에는 세포벽을 용해하여 미생물을 사멸시키는 대표적인 항균물질인 라이소자임을 비롯하여 철이온을 강력히 결합함으로서 유산균을 비롯한 미생물이 증식할 때 철 성분을 영양소로 이용하지 못하게 하여 간접적으로 미생물의 생육을 저해하는 효과를 가지고 있는 난백단백질의 12%를 차지하는 오보트란스페린이 그 주인공이다. 아비딘도 많은 량이 존재하지는 않으나 필수 영양소인 비오틴과 결합하는 성질이 있어 오보트란스페린과 함께 미생물이 영양소 결핍을 일으키게 작용한다. 그러나 이러한 난백에 존재하는 항균성 단백질 들은 가열에 의해서 변성되고 열변성 됨으로서 불활성화 된다. 따라서 계란을 난백단백질의 열변성 온도 이상에서 가열할 수 있으면 더 이상 난백단백질의 항균특성을 염려하지 않고 유산균을 접종하여 난백 뿐 아니라 계란 전체 를 유산발효 할 수 있는 것이다.

다행히 난백 단백질은 물을 첨가하여 희석하거나 당 등의 부원료를 첨가할 경우 섭씨 65도 이상의 열처리에도 열응고가 일어나지 않는 현상이 밝혀져 있다. 즉, 난백의 단백질 농도가 일정수준이상 낮아지고 특정 당류가 일정량 첨가되면 비전해질인 당은 단백질 분자간의 소수결합에 의한 분자간의 회합을 방해하여 열에 의한 응고 억제로 난백의 열안정성을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다(유익종. 1988. 난백단백질의 열감수성과 안정성에 관한 연구. 서울대학교박사학위논문집). 본 발명에서는 난백의 대표적인 알레르기 유발 단백질인 오보뮤코이드의 열변성온도인 섭씨 79도 이상의 온도에서 계란을 가열처리한 후 유산발효를 시켜 계란의 항원성을 확인하였으며 또 다른 난백의 대표적인 알레르기 유발 단백질인 오발부민의 열변성온도인 섭씨 84도 이상의 온도에서 계란을 가열처리한 후 유산발효를 시켜 계란의 항원성을 확인하여 항원성이 현격히 저하되거나 제거된 계란을 얻었다.

이러한 결과는 향후 계란을 알레르기 유발식품이라고 여겨 섭취를 꺼리는 많은 유야 및 일반 소비자에게 알레르기를 염려하지 않고 계란을 섭취할 수 있는 기회를 제공한다는 면에서 그 가치가 인정되길 기대한다.

계란에 일정량의 당과 물을 첨가하고 특정한 온도 조건하에서 열처리 한 후 복합유산균 스타터를 접종하여 적절한 조건하에서 유산발효를 시킨 결과 계란단백질의 항원성이 저하된 계란을 생산할 수 있었으며 그 주요 실험 결과를 기술하면 다음과 같다.

실험재료

본 발명에 사용된 계란은 풀무원의 “아침 후라이로 좋은 달걀™"을 사용하였다. 포도당 및 과당, 프락토올리고당은 (주)삼양제넥스로부터 구입하여 사용하였으며 유산균 스타터는 국내 S업체를 통해 수입하여 사용하였다. 표준품 ovomucoid, ovalbumin, phosvitin, livetin은 sigma사 제품(St. Luis, USA)을 사용하였으며 난백분해용 효소 등 기타의 시약은 류주현 등[한국식품과학회지. 32: 720-725(2000)]의 기준에 준하여 사용하였다.

계란의 열처리 및 유산 발효

계란에서 전란액을 얻어 균질화하고 70mesh의 체로 걸러 알끈을 제거한 후 이에 정제수와 포도당, 과당, 프락토올리고당을 일정량 첨가한 후 섭씨 75도, 80도 및 85도에서 각 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하의 조건에서 냉각하여 보관하면서 시험에 공시하였다.

OA , OM , phosvitin , livetin 에 대한 특이 항체의 생산

항원으로서 OA 또는 OM, phosvitin, livetin을 phosphate buffered saline(PBS: 0.01M phosohate buffer with 0.138M NaCl, 0.0027M KCl)에 1mg/ml로 준비한 후 Freund's complete adjuvant와 1:1로 혼합하여 만든 유탁액을 매회 1ml 씩 토끼에 피하 주사하는 방법으로 2주 간격으로 총 5회 면역을 실시하였다. 단 2차부터 adjuvant로서 Freund's incomplete adjuvant를 사용하였다. 면역 1주일 후 채혈하고 높은 항체가의 항혈청을 모아 다음 실험에 특이 항체로 사용하였다.

간접경합 ELISA

ciELISA를 이용하여 조사하였다. Microplate에 coating한 항원은 표준단백질 OM 또는 OA, phosvitin, livetin을 사용하였으며 농도는 2μg/ml로 coating buffer(tris hydroxymethyl aminomethane 0.05M, pH 9.0)로 희석하여 microplate well당 100μL를 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 이것을 washing buffer(phosphate buffered saline with Tween 20, PBST; 0.01M phosphate buffer with 0.138M NaCl, 0.0027M KCl, 0.05% Tween 20)로 3번 세척한 다음 well에 계란처리물과 특이항체를 1:1로 혼합한 용액을 100μL 넣고서 경합반응을 유도하였다. 이때 특이 항체는 앞에서 제조한 항OM, 항OA, 항phosvitin, 항livetin 항혈청을 5,000배 가량 희석하여 각각 사용하였다. 실온에서 1시간 반응 후 washing buffer로 3번 세척한 후 여기에 goat anti-rabbit IgG-HRP conjugate 100μL를 첨가하고 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 앞의 방법으로 3번 세척한 다음 여기에 기질 용액(0.01% TMB in phosphate-citrate buffer pH 5.0, 0.001% H2O2 ) 100μL를 첨가하여 30분 반응 후 2M H2SO4 를 50μL를 가하여 반응을 정지시키고 microplate reader(Emax, Molecular Devices)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

항원성 조사방법

계란처리물의 항원성변화를 검토하기 위하여 상기 ciELISA의 결과로부터 처리 전 계란의 IC50(the half maximal inhibitory concentration) 값과 처리 후 계란의 IC50 값을 각각 구한 다음, 전자를 후자로 나누어서 얻은 상대적인 수치로서 항원성의 변화를 조사하였다.

실험결과

실험 1: 계란을 할란하여 균질화하고 알끈이 제거된 전란액 500g에 정제수 853g과 포도당 30g, 과당 90g, 프락토올리고당 27g을 첨가한 후 섭씨 75도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum) 30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하의 조건에서 냉각하여 보관하면서 OM 및 OA의 항원성 변화를 생란과 대비하여 ciELISA를 이용하여 조사하였다. 항OM의 항체를 이용한 ciELISA의 경우 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 4μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50은 3-4μg/ml로서 항원성의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 또한 항OA의 항체를 이용한 ciELISA의 경우에는 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 80μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50도 80-90μg/ml로 나타나 항OM의 항체와 유사한 결과로서 항원성의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 이는 섭씨 75도의 열처리 조건이 오보뮤코이드와 오발부민의 열변성온도인 섭씨 79도와 84도보다 낮은 온도이므로 유산발효가 적절히 이루 어지지 못하였거나 유산은 생성하였더라도 유산균이 생산한 단백질분해효소가 알러젠인 오보뮤코이드와 오발부민을 적절히 분해하지 못하였기 때문인 것으로 사료되었다.

실험 2: 계란을 할란하여 균질화하고 알끈이 제거된 전란액 500g에 정제수 853g과 포도당 30g, 과당 90g, 프락토올리고당 27g을 첨가한 후 섭씨 80도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하의 조건에서 냉각하여 보관하면서 OM 및 OA의 항원성 변화를 생란과 대비하여 ciELISA를 이용하여 조사하였다. 항OM의 항체를 이용한 ciELISA의 경우 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 5μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50은 10,000,000μg/ml로서 항원성이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 80도에서의 열처리와 유산발효에 의해 OM의 항원성이 1/2,000,000 로 감소되었음이 확인되었다. 한편 항OA의 항체를 이용한 ciELISA의 경우에는 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 50μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50도 50-60μg/ml로 나타나 항OM 항체의 결과와는 대조적으로 항원성의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 이는 섭씨 80도의 열처리 조건이 열변성온도가 섭씨 79도인 오보뮤코이드를 불활성화 시켰고 유산발효에 의해 생성된 단백질분해효소가 오보뮤코이드를 변성시킨 것으로 추정된다. 그러나 오발부민의 열변성 온도인 섭씨 84도보다 낮은 온도이므로 오발 부민의 항원성은 저하시키지 못한 것으로 판단되었다.

실험 3: 계란을 할란하여 균질화하고 알끈이 제거된 전란액 500g에 정제수 853g과 포도당 30g, 과당 90g, 프락토올리고당 27g을 첨가한 후 섭씨 85도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하의 조건에서 냉각하여 보관하면서 OM 및 OA의 항원성 변화를 생란과 대비하여 ciELISA를 이용하여 조사하였다. 항OM의 항체를 이용한 ciELISA의 경우 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 9μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50은 10,000,000μg/ml로서 항원성이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 85도에서의 열처리와 유산발효에 의해 OM의 항원성이 1/1,111,111 로 감소되었음이 확인되었다. 또한 항OA의 항체를 이용한 ciELISA의 경우에도 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 60μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50은 50,000,000μg/ml로 나타나 항OM의 항체와 유사한 결과로서 항원성이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 85도에서의 열처리와 유산발효에 의해 OA의 항원성이 1/833,333 로 감소되었음이 확인되었다. 이는 섭씨 85도의 열처리 조건이 오보뮤코이드와 오발부민의 열변성 온도인 섭씨 79도와 84도보다 높은 온도이므로 열변성에 의해 오보뮤코이드의 트립신 저해작용이 이루어지지 못했고 오발부민 역시 열변성 되어 성공적으로 유산발효가 진행되어 알러젠인 오보뮤코이드와 오발부민을 적절히 분해하였기 때문인 것으로 사료되었다.

실험 4: 계란을 할란하여 난황만 분리하여 균질화하고 알끈이 제거된 난황액 170g에 정제수 732g과 포도당 20g, 과당 60g, 프락토올리고당 18g을 첨가한 후 섭씨 75도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 즉시 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하의 조건에서 냉각하여 보관하면서 포스비틴(phosvitin) 및 리베틴(livetin)의 항원성 변화를 생란과 대비하여 ciELISA를 이용하여 조사하였다. 항phosvitin의 항체를 이용한 ciELISA의 경우 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 100μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50은 1,000,000μg/ml로서 항원성이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 75도에서의 열처리와 유산발효에 의해 phosvitin의 항원성이 1/10,000로 감소되었음이 확인되었다. 또한 항livetin의 항체를 이용한 ciELISA의 경우에도 유산발효를 하지 않은 생란의 IC50은 80μg/ml 이었고 유산발효를 한 계란의 IC50은 5,000,000μg/ml로 나타나 항phosvitin의 항체와 유사한 결과로서 항원성이 감소하였음을 알 수 있었다. 즉, 85도에서의 열처리와 유산발효에 의해 livetin의 항원성이 1/62,500 로 감소되었음이 확인되었다. 이는 섭씨 75도의 열처리 조건이 phosvitin과 livetin을 적절하게 열변성시켰으며 아울러 난황단백질의 경우는 난백과는 달리 열응고 및 미생물 생육억제작용이 없어서 성공적으로 유산발효가 진행되어 phosvitin 및 livetin의 항원 성이 감소된 것으로 판단된다.

이상의 실험에서 사용된 주요 수단으로서는 계란단백질의 열변성을 억제할 수 있는 적절한 량의 당과 물의 첨가 후 특정한 온도에서의 열처리를 한 후 복합유산균을 접종하여 유산발효에 의해 알레르기 유발성 계란단백질의 항원성을 저하시키고자 하였으며 항 오보뮤코이드 및 항 오보뮤신의 항체를 이용한 ciELISA test를 실시한 결과 항원성이 현저히 약화된 계란을 생산할 수 있었다. 따라서 계란단백질의 항원성을 저하시키기 위하여는 섭씨 85도 이상의 온도조건 하에서 열처리를 한 후 유산발효를 적절히 거칠 경우 가능하다는 결론을 내릴 수 있다고 판단된다.

이러한 결과는 기존의 연구에서 나타난 난백의 항원성은 열처리, 효소처리, 알카리처리 등 화학처리에 의해 오보뮤코이드와 오보뮤신의 항원성이 동시에 현저히 약화된 예가 없는 것과 비교해 볼 때 비교적 간단한 처리를 통해서 계란의 알레르기를 배제할 뿐 아니라 유산균 발효에 의해 유산균을 다량 섭취할 수 있는 계기를 동시에 제공함으로서 계란의 부가가치를 향상시키고 계란을 성인 뿐 아니라 알레르기가 염려되는 유아 및 어린이에게도 제공할 수 있는 장점을 가지고 있다.

[실시예 1] 계란(규격: 특란) 10개를 할란하여 거품이 심하게 나지 않도록 균질화하고 70mesh 체에 걸러 알끈이 제거된 전란액 500g을 얻는다. 이에 정제수 853g과 포도당 30g, 과당 90g, 프락토올리고당 27g을 첨가한 후 섭씨 85도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 즉시 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도의 항온기에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하가 되도록 냉각함으로서 계란단백질의 항원성이 현저히 저하된 계란을 얻는다. 참고적으로 이렇게 생산된 계란은 ciELISA test를 실시한 결과 생란에 비해 오보뮤코이드(OM)의 항원성이 1/1,000,000 이하로 감소되며 오발부민(OA) 항원성이 1/800,000 이하로 감소된 계란이다.

[실시예 2] 계란(규격: 특란) 10개를 할란하여 거품이 심하게 나지 않도록 균질화하고 70mesh 체에 걸러 알끈이 제거된 전란액 500g을 얻는다. 이에 정제수 853g과 포도당 30g, 과당 90g, 프락토올리고당 27g을 첨가한 후 섭씨 90도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 즉시 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도의 항온기에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하가 되도록 냉각함으로서 계란단백질의 항원성이 현저히 저하된 계란을 얻는다. 참고적으로 이렇게 생산된 계란은 생란에 비해 오보뮤코이드(OM)의 항원성이 1/2,000,000 이하로 감소되며 오발부민(OA) 항원성이 1/1,000,000 이하로 감소된 계란이다.

[실시예 3] 계란(규격:특란) 10개를 할란하여 거품이 심하게 나지 않도록 균질화하고 70mesh 체에 걸러 알끈이 제거된 전란액 500g을 얻는다. 이에 정제수 853g과 포도당 30g, 과당 90g, 프락토올리고당 27g을 첨가한 후 섭씨 95도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 즉시 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도의 항온기에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하가 되도록 냉각함으로서 계란단백질의 항원성이 현저히 저하된 계란을 얻는다. 참고적으로 이렇게 생산된 계란은 생란에 비해 오보뮤코이드(OM)의 항원성이 1/2,500,000 이하로 감소되며 오발부민(OA) 항원성이 1/1,000,000 이하로 감소된 계란이다.

[실시예 4] 계란(규격:특란) 10개를 할란하여 난황만 분리하여 균질화하고 70mesh 체에 걸러 알끈이 제거된 난황액 170g을 얻는다. 이에 정제수 732g과 포도당 20g, 과당 60g, 프락토올리고당 18g을 첨가한 후 섭씨 75도에서 15분간 열처리한 후 섭씨 40도로 즉시 냉각하여 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 35%, 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum)30%, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 35% 비율의 혼합유산균스타터를 총중량 대비 0.01% 접종하여 섭씨 40도의 항온기에서 6시간 동안 배양하여 유산발효를 마치고 즉시 섭씨 4도 이하가 되도록 냉각함으로서 계란단백질의 항원성이 현저히 저하된 계란을 얻는다. 참고적으로 이렇게 생산된 계란은 생란에 비해 포스비틴(phosvitin)의 항원성이 1/10,000로 감소되며 리베틴(livetin)의 항원성이 1/62,500로 감소된 계란이다.

Claims (2)

1. 전란액에 대해 정제수와 포도당, 과당 및 프락토올리고당 등을 첨가하여 균질한 후 섭씨 85도 이상 100도 미만의 온도에서 열응고가 일어나지 않도록 열처리하고 유산균을 접종하여 발효함으로서 얻어진 오보뮤코이드 및 오발부민의 항원성이 저하된 계란
2. 난황액에 대해 정제수와 포도당, 과당 및 프락토올리고당 등을 첨가하여 균질한 후 섭씨 75도 이상 100도 미만의 온도에서 열응고가 일어나지 않도록 열처리하고 유산균을 접종하여 발효함으로서 얻어진 포스비틴 및 리베틴의 항원성이 저하된 난황