KR20090066824A - Compositions for skin whitening comprising puerarin or derivates thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 퓨라린 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제의 활성을 저해하여 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 천연 화합물인 퓨라린 이소플라본류의 미백 효과를 측정하고 이들을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for skin whitening containing furin or derivatives thereof as an active ingredient, and more specifically, it is a natural compound that can inhibit melanin production by inhibiting the activity of tyrosinase, an enzyme involved in melanogenesis. It relates to a composition for skin whitening which measures the whitening effect of furarine isoflavones and contains them.
멜라닌은 피부에 존재함으로써 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능이 있다. 그러나 멜라닌의 과잉생산은 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으므로, 최근에 멜라닌 과잉생성 예방을 목적으로 하는 약제의 개발이 활발히 진행되고 있다. 피부의 색소침착은 외부에서의 자외선, 염증 등의 여러 자극에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 색소침착 경로는 결과적으로 멜라노사이트(melanocyte)와 관련 효소 인 티로시나아제(tyrosinase)의 활성증가가 주로 관여한다. 색소침착의 원인물질인 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나아제의 작용에 의해 티로신(tyrosine)으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome)등을 거쳐 생성된다(도 1 참조).Melanin has an important function of protecting the body from ultraviolet rays by being present in the skin. However, since the excessive production of melanin is known to play a significant role in the formation of blemishes, freckles, and the like, promote skin aging, and induce skin cancer, the development of drugs for the purpose of preventing melanin overproduction has been actively progressed in recent years. Pigmentation of the skin is known to be caused by various stimuli such as ultraviolet rays, inflammation from the outside. As a result, the pigmentation pathway is mainly involved in increasing the activity of melanocytes and the related enzyme tyrosinase. Melanin, a causative agent of pigmentation, is converted from tyrosine to dopa and dopaquinone by the action of tyrosinase present in pigment cells, and is produced via dopachrome and the like (Fig. 1).
현재 미백효과제로서 이용되고 있는 물질들이 있으나, 이들은 티로시나아제 억제활성이 약하거나 세포 독성 등의 부작용을 나타내기도 한다. 따라서 세포 독성이 낮은 천연 소재로부터의 미백 소재의 개발이 요구되고 있다. 특히, 하이드록시아니솔(hydroxyanisole) 및 하이드로 퀴논 등은 강력한 멜라닌 생성 저해활성은 있으나 동시에 색소세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다.Although there are some substances currently used as whitening agents, they also have side effects such as weak tyrosinase inhibitory activity or cytotoxicity. Therefore, there is a need for the development of whitening materials from natural materials with low cytotoxicity. In particular, hydroxyanisole and hydroquinone have strong melanogenesis inhibitory activity but at the same time cause side effects such as causing denaturation or lethality of pigment cells and impairing their original function.
이러한 천연 소재로 본 발명자들이 주목한 것은 갈근의 이소플라본이었다. 갈근(칡, Pueraria lobata Ohwi)은 콩과에 속하는 낙엽성 다년생 식물 덩굴이며, 갈근의 성분은 대부분이 전분이고(생체의 19~20%), 이소플라본을 상당량 함유하고 있는데, puerarin, daidzin, genistin, daidzein, genistein 등이 포함된다. 건조된 갈근에는 퓨라린(Puerarin)을 2.0% 이상을 함유하며, 식물성 호르몬인 피토에스트로겐(phytoestrogen)으로 유방암, 골다공증 치료제로 각광받고 있다. 퓨라린은 말초의 혈액순환을 촉진하고, 관상동맥을 확장하여 혈류량을 증가시키면서 혈전을 용해하여 심장의 운동능을 항진한다고 알려져 있다. 최근 연구에서 퓨라린은 항산화제로서 암을 예방하고, free radical을 없애며, 혈중 콜레스테롤을 낮추는 기능 및 심혈관계 질환의 개선에도 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 또한 퓨라린은 항혈전 및 항알레르기 활성이 보고된 바 있다. 이러한 효과를 바탕으로, 현재 갈근을 이용한 건강 보조 식품 개발이 활발히 이루어지고 있다.What the inventors noticed with this natural material was isoflavone of the root root. Pueraria lobata Ohwi is a deciduous perennial plant vine belonging to the legumes. The roots of the reed are mostly starch (19-20% of the organism) and contain a large amount of isoflavones, puerarin, daidzin and genistin. , daidzein, genistein and the like. Dried roots contain more than 2.0% of Purarin (Puerarin), a plant hormone called phytoestrogen (Phytoestrogen) has been spotlighted as a treatment for breast cancer, osteoporosis. It is known that furarin promotes peripheral blood circulation, expands coronary arteries, increases blood flow, and dissolves blood clots to promote cardiovascular activity. In recent studies, purine has been reported to be effective as an antioxidant in preventing cancer, eliminating free radicals, lowering blood cholesterol and improving cardiovascular disease. In addition, purine has been reported anti-thrombotic and anti-allergic activity. On the basis of these effects, the development of health supplements using the current root is actively made.
또한 퓨라린을 포함한 이소플라본류는 피부에 유익한 작용을 한다고 알려져 있다. 콩과(Leguminosae)에 특히 많이 함유되어 있는 이소플라본(isoflavone)계 성분인 다이드진(daidzin), 글리스틴(glycitin), 그리고 제니스틴(genistin) 등이며, 생체외(in vitro) 실험이나 동물실험에서 항산화 작용을 바탕으로 피부암 세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되어 있으며(Wei H et al. 2003, J Nutr 133), 그 구조적인 이유로 이소플라본류는 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 효소인 티로시나제의 저해작용을 한다고 알려져 있다(Chang et al. 2007, Food Chemistry 105:1430-1438).It is also known that isoflavones, including furarin, have a beneficial effect on the skin. Diflavin, glycine, and genistin, isoflavone-based components, which are found in legumes, are in vitro and animal experiments. Has been reported to inhibit the growth of skin cancer cells based on antioxidant activity (Wei H et al. 2003, J Nutr 133). For structural reasons, isoflavones inhibit tyrosinase, an enzyme that is directly involved in melanin synthesis. It is known to work (Chang et al. 2007, Food Chemistry 105: 1430-1438).
그러나 퓨라린을 추출 및 정제하여 제품화하는 경우, 퓨라린은 수용성이 낮아 물에 거의 녹지 않는 문제점이 있다. 따라서 본 발명자들은 본 발명자들의 기존 등록특허(대한민국 등록특허 10-0553578)에 기재된 수용성이 향상된 퓨라린 유도체를 이용하여, 멜라닌 합성 저해능을 측정하고 그 피부 미백효과를 확인하였다.However, in the case of extracting and purifying the furanin to commercialize, there is a problem that the furanin is low in water solubility almost insoluble in water. Therefore, the present inventors measured the melanin synthesis inhibition ability and confirmed the skin whitening effect by using the furanin derivative having improved water solubility described in the existing patents of the present inventors (Korean Patent Registration No. 10-0553578).
현재 효과적인 미백조성물을 발견하기 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 대부분의 연구는 멜라닌 합성에 관여하는 티로시나아제 효소를 직접 억제하는 물질에 집중되고 있다. 그러나 최근 티로시나아제 효소 억제 외에도 티로시나아제 발현에 관여하는 신호전달기전을 조절함으로써 미백효과를 기대할 수 있음이 제시되었다(Briganti S et al. Pigment Cell Res, 2003, 16(2): 101-10). 티로시나아제는 외부의 자극 또는 호르몬 등의 영향을 받았을 때 전사인자 MITF(microphthalmia- associated transcription factor)의 조절을 받아 생산되는 것으로 보고되어 있다(DS Kim et al. J Cell Sci. 2003, 116:1699-706). MITF가 많이 발현될 경우 티로시나제의 생산이 증가되어 결국은 멜라닌 생성을 증가시킨다. 따라서 티로시나아제 효소의 활성만을 억제하는 것뿐만 아니라, 티로시나아제 효소의 전사인자인 MITF 발현 억제를 통한 티로시나아제 생산을 저해할 수 있다면 미백 기능성을 갖는다고 할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 MITF 전사인자의 발현을 함께 측정하였다.Currently, a lot of research is being conducted to find an effective whitening composition, and most of the research has focused on substances that directly inhibit tyrosinase enzymes involved in melanin synthesis. Recently, however, it has been suggested that whitening effects can be expected by regulating signaling mechanisms involved in tyrosinase expression in addition to tyrosinase enzyme inhibition (Briganti S et al. Pigment Cell Res, 2003, 16 (2): 101-10. ). Tyrosinase has been reported to be produced under the control of the transcription factor MITF (microphthalmia-associated transcription factor) when affected by external stimuli or hormones (DS Kim et al. J Cell Sci. 2003, 116: 1699). -706). High expression of MITF increases tyrosinase production, eventually increasing melanin production. Therefore, not only the activity of tyrosinase enzymes, but also the inhibition of tyrosinase production through inhibition of MITF expression, which is a transcription factor of tyrosinase enzymes, can be said to have a whitening function. Therefore, in the present invention, the expression of the MITF transcription factor was measured together.
미백효과제로서 이미 파라메톡시페놀(p-metoxyphenol), 하이드로퀴논(hdroquinone), 코지산(kojic acid) 또는 알부틴(arbutin)등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타내기도 한다. 한편, 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 티로시나아제 저해 활성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 따라서 세포 독성이 낮고, 천연 소재에서 유래한 미백 소재의 개발이 요구되고 있다.As a whitening agent, p-metoxyphenol, hydroquinone, kojic acid or arbutin are already used, but they are weak in activity or cause denaturation or lethality of pigment cells. It can also cause side effects, such as impairing the cell's original function. On the other hand, vitamin C and derivatives thereof are used for the purpose of inhibiting melanin production, but they also have the disadvantage of low tyrosinase inhibitory activity. Therefore, the development of a whitening material derived from natural materials with low cytotoxicity is required.
또한 갈근의 항산화 및 파이토에스트로겐 활성 등이 보고된 바 있으나, 단일 물질로서 갈근의 주요 이소플라본인 퓨라린과 그 유도체의 미백 효과에 대한 연구가 부재하였으며, 분자생물학적 접근이 활발하지 않았다. 다시 말해, 종래 연구들은 이들 효과에 대한 기작 연구와 같은 생의학적 연구의 접근이 미비하여 식의약 소재 개발을 위한 한계를 가지고 있었다.In addition, antioxidants and phytoestrogens activity of reeds have been reported, but there was no study on the whitening effect of purine and its derivatives, the main isoflavone of reeds as a single substance, and the molecular biological approach was inactive. In other words, conventional studies have had limitations for the development of food and pharmaceutical materials due to the inadequate approach of biomedical research such as mechanism research on these effects.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 천연화합물인 퓨라린과 그 유도체가 세포독성이 낮으면서도 피부 미백 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made diligent research to overcome the problems of the prior arts, and as a result, it was confirmed that the natural compound furanine and its derivatives have a low skin toxicity and have a skin whitening effect, thereby completing the present invention.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 멜라닌 생합성에 관여하는 주요 효소의 활성 억제 효과와 멜라닌 합성에 관여하는 전사인자의 단백질 발현억제 효과가 있는 퓨라린 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 데 있다.Therefore, the main object of the present invention is a skin whitening composition containing as an active ingredient furanine or a derivative thereof having an inhibitory effect on the activity of a major enzyme involved in melanin biosynthesis and a protein expression inhibitory effect on a transcription factor involved in melanin synthesis. To provide.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 퓨라린(Puerarin) 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition for skin whitening containing Purin (Puerarin) or a derivative thereof as an active ingredient.
본 발명의 조성물에서, 상기 퓨라린은 갈근으로부터 추출하여 정제한 것이 바람직하다. 본 발명에 사용된 퓨라린은 갈근으로부터 메탄올을 이용하여 추출하였으며, 퓨라린의 일반적인 화학식은 다음과 같다.In the composition of the present invention, the purine is preferably extracted and purified from the roots. The purine used in the present invention was extracted from methanol using methanol, and the general formula of the purine is as follows.
[화학식 1][Formula 1]
상기 퓨라린은 갈근으로부터 다양한 추출 용매, 예컨대 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 부틸 아세테이트를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 함수 저급 알코올, 가장 바람직하게는 메탄올을 이용하여 얻어진 것이다. The purine can be extracted from a variety of extraction solvents such as water, anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, propanol, butanol, etc.), a mixed solvent of the lower alcohol with water, acetone, ethyl acetate, chloroform , 1,3-butylene glycol and butyl acetate can be obtained as an extraction solvent. More preferably, the extract of the present invention is obtained using a hydrous lower alcohol, most preferably methanol.
또한, 본 발명의 퓨라린은 상기한 추출 용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 퓨라린이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 퓨라린은 상기 추출 용매에 의해 추출된 퓨라린을 당업계의 통상적인 정제과정을 거쳐 정제한 퓨라린을 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 퓨라린에 포함된다.In addition, it will be apparent to those skilled in the art that the purine of the present invention can be obtained not only with the aforementioned extraction solvent but also with other extraction solvents. In addition, the purine of the present invention includes a purine purified from the purine extracted by the extraction solvent through a conventional purification process in the art. Obtained by various additional purification methods, such as, for example, separation using an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity). Active fractions are also included in the purines of the present invention.
본 발명의 조성물에서, 상기 “퓨라린 유도체”는 상기 화학식 1의 퓨라린을 당업계에서 통상적으로 실시되는 α-1,6-말토실기 또는 α1,6-글루코실기와 같은 치환기의 부가로 얻어지는 유도체로서, 멜라닌 생성 억제 또는 티로시나아제 활성 억제를 통하여 피부 미백 효과를 나타내는 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업계의 기술수준을 고려하여 당업자에게 명확하다. 보다 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 퓨라린 유도체인 것을 특징으로 한다.In the composition of the present invention, the “furan derivative” is a derivative obtained by the addition of a substituent such as α-1,6-maltosyl group or α1,6-glucosyl group, which is commonly practiced in the art for the purine of
상기 퓨라린 유도체 중 일례로서, 본 발명에서 예시하는 퓨라린 유도체는 다 음과 같다.As one example of the above-mentioned purine derivatives, the purine derivatives exemplified in the present invention are as follows.
[화학식 2][Formula 2]
상기 화학식 1은 퓨라린의 분자구조이다. 화학식 2에서, 상기 R은 α-1,6-글루코실로서, 말토제닉 아밀라아제의 당전이 반응으로 글루코오스를 퓨라린에 전이시켜 제조한 α-1,6-글루코실 퓨라린이다. 이 유도체는 퓨라린에 비해 수용성이 약 14배까지 증가되어, 이후에 산업화 시에 가공에 유리한 특성을 가진다.
본 발명에 사용된 상기 퓨라린 유도체는 본 발명자의 등록특허(10-0553578)에서와 같이 제조하였으며, 간략히 설명하면 다음과 같다.The purine derivatives used in the present invention were prepared as in the inventors patent (10-0553578), briefly described as follows.
당전이 효소에 퓨라린 및 말토트리오스를 1:1 내지 1:10 중량비율로 가하여 pH 5.5 내지 6.5의 완충액상에서 혼합 및 반응시킨다. 상기 완충액은 소듐 사이트레이트 일 수 있으며, 상기 반응은 45 내지 65 ℃에서 5시간 내지 30시간 정도 실시할 수 있다. 상기 반응 후 반응액은 여과한 후, 크로마토그래피를 이용하여 퓨라린 유도체를 분리한다.Purine and maltotriose are added to the sugar transfer enzyme in a ratio of 1: 1 to 1:10 by weight and mixed and reacted in a buffer of pH 5.5 to 6.5. The buffer may be sodium citrate, and the reaction may be performed at 45 to 65 ° C. for 5 hours to 30 hours. After the reaction, the reaction solution is filtered, and the purine derivative is separated by chromatography.
상기 당전이 효소는 통상의 말토제닉 아밀라아제 효소로, 천연형 원핵 또는 진핵생물로부터 분리 및 정제된 것일 수 있으며, 이의 유전자를 유전자 재조합기술로 인위적으로 발현시켜 제조한 것일 수 있다. 일례로 본 발명의 실시예에서는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 클로닝된 말토제닉 아밀라아제 유전자를 E. coli MC1061에 형질전환하여 발현 및 정제한 말토제닉 아밀라아제를 사용하였다.The sugar transfer enzyme is a conventional maltogenic amylase enzyme, which may be isolated and purified from natural prokaryotic or eukaryotic organisms, and may be prepared by artificially expressing a gene thereof by genetic recombination technology. In an embodiment of the present invention, for example, a maltogenic amylase obtained by transforming and expressing and transforming a maltogenic amylase gene cloned from Bacillus stearothermophilus into E. coli MC1061.
본 발명의 조성물에서, 상기 퓨라린 또는 그 유도체에 의해 티로시나아제 활성을 억제하거나 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.In the composition of the present invention, it is characterized by inhibiting tyrosinase activity or inhibiting melanin production by the purine or its derivatives.
본 발명의 조성물에서, 상기 퓨라린 또는 그 유도체에 의해 세포내 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 TRP-1(tyrosinase related protein-1)과 TRP-2(tyrosinase related protein-2)의 유전자 발현을 억제하고 멜라닌 생성에 관여하는 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 단백질 발현을 억제함으로서 피부 미백효과를 갖는 것을 특징으로 한다.In the composition of the present invention, by inhibiting the gene expression of tyrosinase related protein-1 (TRP-1) and tyrosinase related protein-2 (TRP-2), which are enzymes involved in the production of melanin in the cell by the purine or derivatives thereof It is characterized by having a skin whitening effect by inhibiting the protein expression of MITF (microphthalmia-associated transcription factor), a transcription factor involved in melanogenesis.
본 발명에서, 상기 퓨라린과 그 유도체가 유전자 및 단백질 수준에서 멜라닌 합성과 관련된 주요 효소 및 전사 인자의 발현을 억제함을 확인함으로써 멜라닌 생성을 억제하여 미백효과를 나타낼 수 있는 천연 소재임을 확인하고 식의약 소재로서 다양한 산업 분야에서 사용될 수 있음을 확인하였다.In the present invention, by confirming that the purine and its derivatives inhibit the expression of the major enzymes and transcription factors related to melanin synthesis at the gene and protein level, it is confirmed that the natural material that can exhibit a whitening effect by inhibiting melanin production It has been confirmed that it can be used in various industrial fields as a medical material.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 제형이 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클린징크림, 클린징폼, 클린징워터, 파우더, 엣센스, 팩 또는 먹는 화장품인 것이 바람직하다.In the present invention, it is preferred that the composition is a flexible cosmetic, astringent cosmetics, nourishing cosmetics, eye cream, nutrition cream, massage cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, powder, essence, pack or cosmetics to eat.
본 발명의 조성물에서, 상기 퓨라린 또는 그 유도체를 전체 조성물에 대하여 그 제형의 종류에 따라 적절하게 함유량을 조절할 수 있으나, 0.0001 내지 10 중량% 포함하는 것이 바람직하다.In the composition of the present invention, the content of the purine or its derivatives may be appropriately adjusted depending on the type of the formulation with respect to the whole composition, but preferably contains 0.0001 to 10% by weight.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 화장료 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 형태일 경우에는, 퓨라린 또는 그 유도체의 양은 전체 화장료 조성물에 대하여 0.0001-10 중량%가 바람직하며, 0.0001 중량% 미만인 경우에는 미백 효과가 너무 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 세포독성의 우려 때문에 바람직하지 못하다.The skin whitening composition of the present invention can be used in the form of a cosmetic composition. In this form, the amount of furin or derivatives thereof is preferably 0.0001-10% by weight based on the total cosmetic composition, less than 0.0001% by weight of the whitening effect is too small, if the amount exceeds 10% by weight The increase in effect with the increase is negligible and undesirable because of the concern for cytotoxicity.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 퓨라린 또는 그 유도체 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.The components included in the cosmetic composition include components conventionally used in cosmetic compositions in addition to purine or derivatives thereof as an active ingredient, and include conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and perfumes, And carriers.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, such as solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations It may be formulated as emulsion foundation, wax foundation, spray, and the like, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
본 발명의 피부 미백용 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the skin whitening composition of the present invention is a paste, cream or gel, the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or oxidation Zinc and the like can be used.
본 발명의 피부 미백용 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the skin whitening composition of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluoro Propellants such as rohydrocarbon, propane / butane or dimethyl ether.
본 발명의 피부 미백용 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the skin whitening composition of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as the carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate. , Fatty acid esters of propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or sorbitan.
본 발명의 피부 미백용 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the skin whitening composition of the present invention is a suspension, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester Suspending agents, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
본 발명의 피부 미백용 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사 르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the skin whitening composition of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent, the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, Lecosinates, fatty acid amide ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
본 발명의 퓨라린 또는 그 유도체를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물은 멜라닌 생성 억제 및 티로시나아제의 활성 저해를 통하여 피부 미백 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 미백용 화장료 조성물은 특이적으로 색소 침착 메커니즘에 작용하여 탁월한 피부 미백 효과를 달성한다.The cosmetic composition for skin whitening containing the purine or its derivatives of the present invention exhibits a skin whitening effect through the inhibition of melanin production and the inhibition of tyrosinase activity. Therefore, the cosmetic composition for whitening of the present invention specifically acts on the pigmentation mechanism to achieve an excellent skin whitening effect.
여기서, 화장료 조성물은 미백 효과를 달성하기 위한 목적으로서 먹는 화장품의 형태로도 제조될 수 있는데, “먹는 화장품”이란 그 형태의 분류상 식품에 해당하지만, 최근 미백효과를 나타내는 기능적인 측면에서 먹는 화장품은 화장품의 한 형태로서 인정되고 있다. 따라서 실제 먹는 화장품의 제조에는 본 발명의 퓨라린 또는 그 유도체와 함께 비타민류, 항산화제 등이 첨가제로서 사용될 수 있다. 이러한 먹는 화장품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액, 환 등의 식품 제형과 동일하게 제조할 수 있다. Here, the cosmetic composition may also be prepared in the form of cosmetics for the purpose of achieving a whitening effect, "eating cosmetics" corresponds to the food in the form of the classification, but cosmetics to eat in terms of functional whitening effect recently Is recognized as a form of cosmetics. Therefore, vitamins, antioxidants, and the like may be used as additives in the production of cosmetics to be eaten with the furin or the derivatives of the present invention. Such eating cosmetics can be prepared in the same manner as food formulations such as tablets, granules, powders, capsules, liquid solutions, pills and the like according to known production methods.
또한, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 상기 화장료 조성물의 형태 뿐만 아니라 경구 또는 비경구 투여와 같은 일반적인 의약품, 의약외품 및 기능성 식품의 형태로 사용될 수 있다.In addition, the composition for skin whitening of the present invention can be used in the form of general pharmaceuticals, quasi-drugs and functional foods such as oral or parenteral administration as well as the form of the cosmetic composition.
상기 피부 미백용 조성물의 경구 투여용 제형은, 예컨대 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다. Formulations for oral administration of the composition for skin whitening are, for example, tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, prepared powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs Formulated). Binders such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin for formulation into tablets and capsules; Excipients such as dicalcium phosphate; Disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax. Capsules contain liquid carriers, such as fatty oils, in addition to the substances mentioned above.
또한, 상기 피부 미백용 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용제, 주사제 등의 제형을 의미한다.In addition, the composition for skin whitening can be administered parenterally, parenteral administration means a formulation such as an external preparation for the skin, injections.
상기 화합물의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎/㎏/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.Effective dosages of the compounds may vary depending on the age, physical condition, weight, etc. of the patient, but are generally administered within the range of 1-100 mg / kg / day. In addition, within the effective daily dosage range, it is injected once a day or divided several times a day.
상기 기능성 식품으로서, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액, 환 등의 식품 제형으로 제조할 수 있는데, 본 발명에 따라 퓨라린 또는 그 유도체의 함량은 제형에 따라 식품 조성물 총 중량을 기준으로 0.1 내지 100중량%로 조절할 수 있다. 조성물 제조의 일례로서, 본 발명에 따른 퓨라린 또는 그 유도체를 주성분으로, 부형제로 일반적으로 사용되는 대두유, 밀납(황납), 레시틴 등을 혼합한 후 젤라틴 기제의 피막에 그 혼합물을 주입함으로써 통상의 연질 캅셀을 제조할 수 있다. 또한, 상기의 여러 제형을 조성물을 제조하기 위하여 각 성분들은 동일한 효능을 가지는 유도체로 대체하여 사용될 수 있다. 일례로 아스콜빈산은 L-아스콜빈산나트륨, L-아스콜빈산스테아레이트, 아스콜빈산칼륨, 아스콜빈산칼슘, 아스콜빈산팔미테이트 등으로 대체하여 사용될 수 있다.As the functional food, the composition for skin whitening of the present invention can be prepared in food formulations such as tablets, granules, powders, capsules, liquid solutions, pills, etc. according to known production methods, The content of the derivative may be adjusted to 0.1 to 100% by weight based on the total weight of the food composition depending on the formulation. As an example of preparation of the composition, a mixture of soybean oil, beeswax, lecithin, and the like commonly used as excipients is used as a main component of a purine or a derivative thereof according to the present invention, followed by injecting the mixture into a gelatin-based coating. Soft capsules can be prepared. In addition, in order to prepare the composition of the above various formulations, each component may be used in place of a derivative having the same efficacy. For example, ascorbic acid may be used in place of sodium L-ascorbate, L-ascorbate stearate, potassium ascorbate, calcium ascorbate, palmitate ascorbate, and the like.
또한, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 의약품으로 섭취할 수도 있고, 원료로서 식품에 배합할 수도 있다.In addition, the composition for skin whitening of the present invention may be ingested as a medicine or may be blended into food as a raw material.
본 발명에서, “유효성분으로서 함유한다”라는 것은, 그 미백 효과 등을 발휘할 정도로 함유한다는 것이지만, 그 함량은 특별히 제한되지 않고 섭취의 빈도, 섭취량, 사용의 목적에 따라 적절히 조정하면 된다. 예를 들어, 직접 경구 섭취하는 경우에는 비교적 저농도가 좋고, 음식물의 원료 등에 사용하는 경우는 고농도가 바람직하다.In the present invention, the term "contained as an active ingredient" means to contain the whitening effect or the like, but the content thereof is not particularly limited and may be appropriately adjusted according to the frequency of ingestion, the intake amount and the purpose of use. For example, relatively low concentration is good when taken directly orally, and high concentration is preferable when used for raw materials of food.
상기와 같이, 본 발명의 경구 미백제를 원료로서 음식물에 배합하여, 피부의 미백 효과를 가지는 음식물을 얻을 수 있다. 식품으로서의 미백 효과는 예를 들어, 퓨라린 또는 그 유도체를 함유하는 사료를 동물에게 섭취시켜서, 피부의 색소 침착의 개선도를 지표로서 평가할 수 있다.As mentioned above, the oral whitening agent of this invention can be mix | blended with foodstuffs as a raw material, and the foodstuff which has the skin whitening effect can be obtained. The whitening effect as a food can be evaluated as an index for improving the pigmentation of the skin, for example, by ingesting a feed containing furan or a derivative thereof into the animal.
구체적으로는, 갈색 흑색마우스의 등의 반을 제모하고, 상기 제모한 부분에 UV 램프를 조사하여 2주간 사육한 후, 이들의 흑색마우스를 자외선 유도에 의한 멜라닌 색소 침착의 정도에 차이가 생기기 않도록 무리를 나누어, 비타민 C가 저함유된 사료에 퓨라린 또는 그 유도체를 첨가한 시험 먹이를 각각의 무리에 섭취시켜서, 다시 4주간 후의 피부의 색소 침착의 정도에 대하여 컨트롤군 및 포지티브 컨트롤군과 비교 평가할 수 있다. 이러한 평가로부터, 본 발명에 있어서의 퓨라린 또 는 그 유도체는 경구 섭취하여, 확실하게 피부로의 색소 침착을 조기에 개선하고, 눈에 띄지 않게 할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.Specifically, half of the black black mouse's back is epilated, the hair is irradiated with UV lamps for 2 weeks, and then these black mice are subjected to ultraviolet ray induction so that there is no difference in the degree of melanin pigmentation. Each group was fed with a test food containing furarine or a derivative thereof in a feed containing low vitamin C in each group, and compared with the control group and the positive control group for the degree of pigmentation of the skin after 4 weeks. Can be evaluated From these evaluations, it can be confirmed that the purine or its derivatives in the present invention can be orally ingested to reliably improve pigmentation to the skin early and inconspicuous.
본 발명의 기능성 식품은 상기 퓨라린 또는 그 유도체를 함유하기 때문에, 이들이 가지는 여러 가지 효과를 가지지만, 특히 피부의 미백 효과를 가지는 것을 특징으로 한다. 음식물이기 때문에 용이하게 계속적인 섭취가 가능하며, 적합한 효과를 기대할 수 있다.Since the functional food of the present invention contains the above-mentioned furanine or its derivatives, it has various effects which they have, but in particular, it has a skin whitening effect. Because it is a food, it can be easily consumed continuously and a suitable effect can be expected.
또한, 본 발명의 기능성 식품은 기능의 향상, 특히 미백 효과의 상승적인 향상, 미백 효과의 보조, 흡수성의 향상 등을 목적으로 하여, 다른 생리적 활성 성분 등을 배합할 수 있다. 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 상승적인 효과를 기대할 수 있는 다른 경구 미백 성분, 간접적으로 미백 효과로의 기여가 있는 항산화 성분, 체내에서의 흡수성을 향상시켜 효과의 효율을 올리기 위한 유성 성분, 영양 강화를 위한 각종 비타민류, 미네랄류, 아미노산류 등을 들 수 있다.In addition, the functional food of the present invention may be blended with other physiologically active ingredients for the purpose of improving the function, in particular, synergistically improving the whitening effect, assisting in the whitening effect, and improving the absorbency. There is no particular limitation, but for example, other oral whitening ingredients that can be expected to have a synergistic effect, antioxidants that indirectly contribute to the whitening effect, oily ingredients to improve the efficiency of the body by improving the absorption efficiency, nutritional enhancement Various vitamins, minerals, amino acids and the like can be mentioned.
본 발명의 피부 미백용 조성물을 섭취함으로써 그 미백 효과를 발현하는 것으로, 거뭇한 피부나 기미, 주근깨, 다크서클을 개선 혹은 방지하여, 투명감 있는 아름다운 피부로 유지하는데 크게 기여할 수 있다.By ingesting the skin whitening composition of the present invention, the whitening effect is expressed, and it is possible to greatly improve or prevent dark skin, blemishes, freckles, and dark circles, thereby greatly maintaining the beautiful skin with transparency.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1: 퓨라린 또는 그 유도체의 제조Example 1: Preparation of Purine or Derivatives thereof
본 발명에 사용된 퓨라린은 갈근으로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 메탄올 추출법을 이용하여 추출하였고, 그 유도체는 본 발명자의 등록특허(10-0553578)에서와 같이 제조하였으며, 간략히 설명하면 다음과 같다.The purine used in the present invention was extracted using the methanol extraction method commonly used in the art from the root, the derivatives thereof were prepared as in the inventors' patent (10-0553578), briefly described as follows. .
퓨라린 유도체의 제조에 사용되는 말토트리오스는 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 말토제닉 아밀라아제는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)로부터 클로닝한 말토제닉 아밀라아제 유전자를 Escherichia coli MC1061에 형질전환하여 이로부터 말토제닉 아밀라아제를 발현시킨 다음 컬럼크로마토 그래피로 정제하여 준비하였다(Cha et al., 1998, Eur. J. Biochem. 253, 251-262).Maltotriose used for the preparation of the purine derivatives was purchased from Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA, and maltogenic amylase was cloned from Bacillus stearothermophilus. The maltogenic amylase gene was transformed into Escherichia coli MC1061 to express maltogenic amylase therefrom and purified by column chromatography (Cha et al., 1998, Eur. J. Biochem. 253, 251-262).
말토제닉 아밀라아제 1 U/mg G3, 0.25 % 퓨라린, 1 % 말토트리오스를 소듐 사이트레이트 완충용액(pH 6, 시그마)에 혼합한 후 55 ℃에서 20시간 반응시켰다. 반응 후 5분간 반응액을 끓인 후 왓트만 여지를 이용하여 여과하고, 여과액은 C18컬럼(Sep-Pak Plus C18, 30 mm X 25 mm, 브이덱(VyDAC)) 상에서 분리한 후 고성능 순환(recycling) 액체 크로마토그래피를 이용하여 젤투과컬럼(JAIGEL-W251, 40mm x 500mm, 자이(JAI))을 통과시켜 반응생성물을 분리 정제하였다.Maltogenic amylase 1 U / mg G3, 0.25% furarine and 1% maltotriose were mixed in sodium citrate buffer (pH 6, Sigma) and reacted at 55 ° C. for 20 hours. After the reaction, the reaction solution was boiled for 5 minutes and filtered using Whatman filter paper, and the filtrate was separated on a C18 column (Sep-Pak Plus C18, 30 mm X 25 mm, VyDAC), and then recycled. The reaction product was separated and purified through a gel permeation column (JAIGEL-W251, 40 mm x 500 mm, JAI) using liquid chromatography.
실시예 2: 시험관내 미백 활성 시험Example 2: In Vitro Whitening Activity Test
버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase)를 이용한 티로시나아제 억제 활성 을 갖는 미백 활성을 가질 가능성을 선별하기 위해 검사 방법이 간단하면서 시간이 적게 걸리는 방법을 선택하여 수행하였다. 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase)와 L-DOPA는 반응하여 도파퀴논(dopaquinone)을 형성한다. 버섯 티로시나아제 25 μl(400 unit/ml)와 0.1M 염산완충액에 녹인 시료 75 μl와 증류수에 녹인 0.1% L-DOPA 수용액 50 μl를 넣어 37℃에서 20분간 반응시킨 후 도파퀴논의 최대 흡수파장인 475nm에서 측정하였다. 티로시나아제의 작용에 의해 L-DOPA가 도파퀴논으로 합성되는데 티로시나아제의 활성이 억제되면, 도파퀴논의 합성량이 상대적으로 적어지는 원리를 이용하여 간단하게 사용할 수 있는 1차 검색 방법이다. To select the possibility of having a whitening activity with tyrosinase inhibitory activity using mushroom tyrosinase, a simple and time-consuming method was selected. Mushroom tyrosinase and L-DOPA react to form dopaquinone. 25 μl of mushroom tyrosinase (400 unit / ml), 75 μl of sample dissolved in 0.1 M hydrochloric acid buffer solution, and 50 μl of 0.1% L-DOPA aqueous solution dissolved in distilled water were reacted at 37 ° C. for 20 minutes, and then the maximum absorption wavelength of dopaquinone. Phosphorus was measured at 475 nm. L-DOPA is synthesized into dopaquinone by the action of tyrosinase. When tyrosinase activity is inhibited, it is a simple first-order search method using the principle that the synthesis amount of dopaquinone is relatively small.
티로시나아제 억제률(%)= 
A : 시료 + 티로시나아제 + L-DOPAA: Sample + Tyrosinase + L-DOPA
B : 시료 + 인산염완충액(phosphate buffer) + L-DOPAB: sample + phosphate buffer + L-DOPA
C : D.W + 티로시나아제 + L-DOPAC: D.W + tyrosinase + L-DOPA
D : D.W + 인산염완충액 + L-DOPAD: D.W + Phosphate Buffer + L-DOPA
멜라닌(melanin) 합성의 key enzyme인 티로시나아제(tyrosinase)의 효소 활성을 얼마나 억제하는지, 시험관 내에서 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase)를 이용해서 시험 물질을 첨가하여 생성된 DOPA (dihydroxyphenylalanine)와 dopachrome 생성량을 측정하였고, 퓨라린과 그 유도체의 효소활성 억제능을 확인하 였다. 티로시나아제 억제률은 상기 식에 의해 구하였다. 양성 대조군인 PTU(phenylthiourea)와 알부틴 첨가 시와 마찬가지로 퓨라린과 그 유도체를 첨가하였을 때, 버섯 티로시나아제의 활성이 농도에 비례하여 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 퓨라린 유도체는 퓨라린이 녹지 않는 범위에서도 버섯 티로시나아제 활성을 억제하였다(도 2).DOPA (dihydroxyphenylalanine) and dopachrome produced by adding test substance using mushroom tyrosinase in vitro, how much inhibition of the enzyme activity of tyrosinase, a key enzyme of melanin synthesis The amount of production was measured and the enzyme activity inhibitory activity of the purine and its derivatives was confirmed. The tyrosinase inhibition rate was calculated by the above formula. As with the positive control group PTU (phenylthiourea) and arbutin, when the addition of the purine and its derivatives, it was confirmed that the activity of mushroom tyrosinase in proportion to the concentration. In addition, the furanine derivatives inhibited mushroom tyrosinase activity even in the range in which the furin was insoluble (FIG. 2).
실시예 3: B16/F1 세포에 대한 독성 시험Example 3: Toxicity Tests on B16 / F1 Cells
티로시나아제 억제 물질의 세포 독성을 알아보기 위해 마우스의 멜라닌 생성세포(melanoma, 흑색종)인 B16/F1 세포주을 한국세포주은행에서 구입(KCLB No. 80007)하여, 본 발명의 퓨라린 및 그 유도체에 대한 MTT test를 실시하였다. 약물들의 세포독성 효과는 3,4,5-dimethyl-thiazole-3, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay로 조사하는데, 이 방법은 살아있는 세포는 테트라졸륨염(tetrazolium salt)을 분해할 수 있어 MTT의 세포내 축적을 막는데 근거한다.To investigate the cytotoxicity of tyrosinase inhibitors, B16 / F1 cell line, which is melanoma (melanoma, melanoma) of mouse, was purchased from Korea Cell Line Bank (KCLB No. 80007), to furanine and its derivatives of the present invention. MTT test was performed. The cytotoxic effects of the drugs were examined by 3,4,5-dimethyl-thiazole-3 and 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assays, in which live cells can degrade tetrazolium salts and thus MTT To prevent intracellular accumulation.
멜라노사이트 세포 용액을 희석하여 24-웰 플레이트에 180 μl씩 가하고 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양 후, 퓨라린과 그 유도체를 다양한 농도(1000, 500, 200, 100, 40, 20, 10, 0 μg/ml)로 처리하여 72시간을 배양한 후 0.5 mg/ml MTT 용액을 4시간 처리하여 제거한 뒤, DMSO(dimethyl sulfoxide) 1ml에 용해 시의 OC570 값을 측정하여 상대적인 세포 사멸율을 구하였다.After diluting the melanocyte cell solution and adding 180 μl to a 24-well plate and incubating for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 , the purine and its derivatives were prepared at various concentrations (1000, 500, 200, 100, 40, 20, 10, 0 μg / ml) incubated for 72 hours, 0.5 mg / ml MTT solution for 4 hours, and then removed. After dissolving in 1 ml of DMSO (dimethyl sulfoxide), OC 570 was measured. The killing rate was calculated.
상기 본 발명의 퓨라린과 그 유도체을 처리하여 세포 생존률 시험인 MTT 분 석 결과, 퓨라린(도 3a)과 그 유도체(도 3b)는 200 μg/ml 이하의 농도 구간에서 뚜렷한 세포독성이 없었다(도 3a와 3b).As a result of MTT analysis of cell viability test by treating the purine and its derivatives of the present invention, the purine (FIG. 3a) and its derivatives (FIG. 3b) had no apparent cytotoxicity in the concentration range of 200 μg / ml or less (FIG. 3a and 3b).
실시예 4: B16/F1의 세포내 멜라닌 합성량 측정Example 4 Measurement of Intracellular Melanin Synthesis of B16 / F1
6-웰 플레이트에 1× 105 cells/well이 되도록 세포를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하고, 각 웰에 농도가 100 μg/ml이 되도록 DMSO에 녹인 퓨라린과 그 유도체를 첨가하였다. 72시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 20 mmol/L Tris-0.1% Triton X-100 (pH 7.5) 150 μl를 첨가하여 용해시킨 후, 4℃에서 30분간 파쇄하였다. 12000 g에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 1 N NaOH를 150 μl를 첨가한 다음 70℃ 수조에서 1시간 동안 끓여 세포내 멜라닌이 유리되어 나오도록 하였다. 상온에서 식힌 후 마이크로플레이트 ELISA 판독기에서 멜라닌의 최대흡수 파장인 405nm 흡광도를 측정하여, 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다.Add cells to 1 × 10 5 cells / well in a 6-well plate, incubate for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 , and purine in dissolved DMSO so that the concentration is 100 μg / ml in each well. And its derivatives were added. After incubation for 72 hours, the medium was removed, washed twice with PBS, and dissolved by adding 150 μl of 20 mmol / L Tris-0.1% Triton X-100 (pH 7.5), followed by crushing at 4 ° C. for 30 minutes. The supernatant was removed by centrifugation at 12000 g for 5 minutes, 150 μl of 1 N NaOH was added, and then boiled for 1 hour in a 70 ° C. water bath to release intracellular melanin. After cooling at room temperature, the absorbance of 405 nm, the maximum absorption wavelength of melanin, was measured in a microplate ELISA reader, and the amount of melanin in the experimental group was calculated as a percentage of the amount of melanin in the control group.
즉, B16 세포에 72시간 동안 퓨라린과 그 유도체, 그리고 양성대조군인 PTU를 처리하여 멜라닌의 생성량과 세포내 티로시나아제의 활성을 측정하였다. 퓨라린과 그 유도체를 처리한 군이 대조군에 비해 멜라닌 합성량이 유의적으로 저하되었다(도 4).That is, B16 cells were treated with furin, its derivatives, and PTU, a positive control group, for 72 hours to measure the production of melanin and the activity of intracellular tyrosinase. The group treated with furarin and its derivatives significantly decreased the amount of melanin synthesis compared to the control group (FIG. 4).
실시예 5: B16/F1의 세포내 티로시나아제 활성 억제 측정Example 5: Measurement of Inhibition of Intracellular Tyrosinase Activity of B16 / F1
세포내로 흡수된 미백활성물질이 세포내 티로시나아제의 활성을 억제하는지를 다음과 같이 측정하였다. 6-웰 플레이트에 1× 105 cells/well이 되도록 세포를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하고, 각 웰에 농도가 100 μg/ml이 되도록 DMSO에 녹인 퓨라린과 그 유도체를 첨가하였다. 72시간 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 20 mmol/L Tris-0.1% Triton X-100 (pH 7.5) 150 μl를 첨가하여 용해시킨 후, 4℃에서 4시간 동안 파쇄하였다. 12000g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 티로시나아제 조추출물로 사용하였다. 70 μl 상층액 + 140 μl 0.1% L-DOPA를 첨가하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간 반응시킨 뒤 마이크로플레이트 흡광 판독기로 475nm에서 흡광도를 측정하였다.Whether the whitening active material absorbed into the cell inhibits the activity of the intracellular tyrosinase was measured as follows. Add cells to 1 × 10 5 cells / well in a 6-well plate, incubate for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 , and purine in dissolved DMSO so that the concentration is 100 μg / ml in each well. And its derivatives were added. After incubation for 72 hours, the medium was removed, washed twice with PBS, dissolved by adding 150 μl of 20 mmol / L Tris-0.1% Triton X-100 (pH 7.5), and then disrupted at 4 ° C. for 4 hours. The supernatant was used as a tyrosinase crude extract by centrifugation at 12000g for 5 minutes. 70 μl supernatant + 140 μl 0.1% L-DOPA was added and reacted in a 37 ° C. incubator for 2 hours and then absorbance was measured at 475 nm with a microplate absorbance reader.
즉, 세포로부터 단백질을 추출하여 L-DOPA를 기질로 한 티로시나아제의 활성을 측정한 결과, 실시예 4에서의 멜라닌 합성량과 같이, 퓨라린과 그 유도체를 처리하였을 때, 효소 활성이 유의적으로 감소하였다(도 5).That is, when protein was extracted from cells and the activity of L-DOPA-based tyrosinase was measured, the enzyme activity was significant when the treatment of furaline and its derivatives was carried out as in the melanin synthesis amount in Example 4. Decreases (FIG. 5).
실시예 6: B16/F1의 세포내 멜라닌 합성 관여 효소들의 유전자 발현 측정Example 6: Measurement of gene expression of enzymes involved in intracellular melanin synthesis of B16 / F1
세포내에서 멜라닌 합성에 관여하는 효소들인 티로시나아제와 TRP-1, TRP-2의 유전자 발현 변화를 살피기 위하여 역전사 반응(RT-PCR)법을 실시하였으며, 다음과 같이 측정하였다. 6 웰 플레이트에 4× 105cells/well이 되도록 세포를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하고, 각 웰에 농도가 각각 40 μg/ml와 200 μg/ml이 되도록 DMSO에 녹인 퓨라린을 첨가하였다. 24시간 배양한 후 배지를 제거하고, TRIzol시약(Invitrogen사)을 첨가하여 조제한 total RNA로부터 Invitrogen사 제조의 SuperscriptⅡ를 사용하여 RT-PCR을 실시하고, cDNA를 합성하였다.In order to examine the gene expression changes of the enzymes involved in melanin synthesis, tyrosinase, TRP-1, and TRP-2, reverse transcription reaction (RT-PCR) was performed as follows. Add cells to 4 × 10 5 cells / well in a 6-well plate and incubate for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 , so that the concentrations in each well are 40 μg / ml and 200 μg / ml, respectively. Purine dissolved in DMSO was added. After incubation for 24 hours, the medium was removed, RT-PCR was performed from Total RNA prepared by adding TRIzol reagent (Invitrogen) using Superscript II manufactured by Invitrogen, and cDNA was synthesized.
상기 cDNA를 주형으로 한 PCR의 반응액 조성은 상기 합성한 cDNA, 10 pmol 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머, 10XPCR Buffer, 2.5mM dNTP Mix를 Taq-DNA-polymerase(Corebiosystem사, 한국)를 혼합하였다. 반응은 열변성 94℃ 30초, 프라이머 anealing 56℃ 30초, 신장반응 72℃ 2분의 행정을 25사이클 반복하였다. 얻어진 PCR산물은 1% Agarose 겔에서 TAE(Tris-Acetate-EDTA)완충액 중에서 통상의 방법에 따라 전기영동하고, 증폭밴드는 GelPro 분석 소프트웨어를 이용해 정량화하였다. 여기서, PCR 반응에 사용된 프라이머 세트는 다음과 같다.The reaction solution composition of the PCR using the cDNA template was mixed with the synthesized cDNA, 10 pmol forward primer and reverse primer, 10XPCR Buffer, 2.5mM dNTP Mix Taq-DNA-polymerase (Corebiosystem, Korea). The reaction was repeated 25 cycles of heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, primer anealing at 56 ° C for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 2 minutes. The obtained PCR product was electrophoresed in a TAE (Tris-Acetate-EDTA) buffer in a 1% Agarose gel according to a conventional method, and the amplification band was quantified using GelPro analysis software. Here, the primer set used for the PCR reaction is as follows.
Tyrosinase: upstream 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3' Tyrosinase: upstream 5'-GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT-3 '
downstream 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3', downstream 5'-TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC-3 ',
TRP-1: upstream 5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3' TRP-1: upstream 5'-GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC-3 '
downstream 5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3', downstream 5'-AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT-3 ',
TRP-2: upstream 5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3' TRP-2: upstream 5'-GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC-3 '
downstream 5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC-3', downstream 5'-CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC-3 ',
beta-actin: upstream 5'-TGC TGT CCC TGT ATG CCTCT-3' beta-actin: upstream 5'-TGC TGT CCC TGT ATG CCTCT-3 '
downstream 5'-AGG TCT TTA CGG ATG TCA ACG-3'. downstream 5'-AGG TCT TTA CGG ATG TCA ACG-3 '.
그 결과, 200 μg/ml의 퓨라린 농도에서 이들 효소의 유전자 전사 수준의 감소 경향을 확인할 수 있었다. 퓨라린이 유전자 수준에서 또한 멜라닌 합성 억제에 낮게나마 관여하고 있음을 알 수 있다(도 6).As a result, the tendency of the gene transcription level of these enzymes to be confirmed at the concentration of 200 μg / ml of furin. It can be seen that furanin is also involved at the gene level and also at low melanin synthesis inhibition (FIG. 6).
실시예 7: B16/F1의 세포내 멜라닌 합성 관여 효소들의 단백질 합성량 측정Example 7: Determination of the amount of protein synthesis of enzymes involved in the intracellular melanin synthesis of B16 / F1
세포내 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 티로시나아제와 TRP-1, TRP-2 및 티로시나제 효소의 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 단백질 해독 수준에서의 발현량을 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 실시하여 조사하였다.Western blotting of expression levels at the level of protein translation of tyrosinase, an enzyme involved in intracellular melanin synthesis, and microphthalmia-associated transcription factor (MITF), a transcription factor of TRP-1, TRP-2 and tyrosinase enzymes ) To investigate.
6-웰 플레이트에 1× 105 cells/well이 되도록 세포를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하고, 각 웰에 농도가 100 μg/ml이 되도록 DMSO에 녹인 퓨라린을 첨가하였다. 72시간 배양한 후 배지를 제거하고 4℃ PBS로 2회 세척한 후, 리파 세포용해 완충액(RIPA buffer, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 균질화 처리하여 세포의 총 단백질 추출액을 얻어냈다. 이를 사용하여 단백질 함량을 표준용액으로서 BSA(Bolvin Serum Albumin)를 사용하는 브라드포드 방법(Bio-rad 단백질 검정)에 의해 결정하였다. 단백질 추출물을 7.5% SDS 겔에서 분리하고, 니트로셀룰로스 막(Schleicher & Schuell BioScience)으로 이동시킨 후, 쥐의 티로시나아제, TRP- 1, TRP-2, 및 Mitf에 대한 1차 항체(Anti-tyrosinase(C-19), anti-TRP1(G-17), anti-TRP2(D-18), anti-Mitf(N-15), and anti-a-tubulin(B-7)) antibodies, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 완충액 내 1:500으로 희석하여 4℃에서 밤새 항온처리한 후, 광범위하게 세척하여 퍼옥시다아제 보족 2차 항체(goat peroxidase-conjugated second antibody)와 반응시켰다. 세척과정을 거친 막은 ECL 키트(Amersham-Pharmacia사)를 사용하여 발색시켜 사진 찍고, 밴드는 GelPro 분석 소프트웨어를 이용해 정량화하였다.Add cells to 1 × 10 5 cells / well in a 6-well plate, incubate for 24 hours at 37 ° C and 5% CO 2 , and purine in dissolved DMSO so that the concentration is 100 μg / ml in each well. Was added. After incubation for 72 hours, the medium was removed and washed twice with 4 ° C. PBS, followed by lipa lysis buffer (RIPA buffer, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS). , 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) was homogenized to obtain a total protein extract of the cells. Using this, the protein content was determined by the Bradford method (Bio-rad protein assay) using BSA (Bolvin Serum Albumin) as a standard solution. Protein extracts were separated on 7.5% SDS gels and transferred to nitrocellulose membranes (Schleicher & Schuell BioScience), followed by primary antibodies against tyrosinase, TRP-1, TRP-2, and Mitf in mice (Anti-tyrosinase). (C-19), anti-TRP1 (G-17), anti-TRP2 (D-18), anti-Mitf (N-15), and anti-a-tubulin (B-7)) antibodies, Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA) was diluted 1: 500 in buffer, incubated overnight at 4 ° C, and then washed extensively to react with a goat peroxidase-conjugated second antibody. The washed membrane was developed by color using ECL kit (Amersham-Pharmacia) and the band was quantified using GelPro analysis software.
그 결과, TRP-1과 TRP-2의 단백질 합성량은 퓨라린을 처리하였을 때, 유의한 경향성 없이 단백질 합성량에 변화가 없었으나, 티로시나아제와 Mitf는 퓨라린을 처리하였을 때, 단백질 발현이 대조군에 비해 감소함을 확인하였다(도 7). 이로써, 퓨라린이 티로시나아제와 그 전사인자의 단백질 합성을 저해함으로써 미백 기능성을 보이는 것을 확인하였다.As a result, the protein synthesis amount of TRP-1 and TRP-2 did not change the protein synthesis amount without significant tendency when treated with furarin, whereas tyrosinase and Mitf expressed protein when treated with furarin. It was confirmed that the decrease compared to the control (Fig. 7). As a result, it was confirmed that furin showed whitening function by inhibiting protein synthesis of tyrosinase and its transcription factors.
이하, 제형예에서, 본 발명의 퓨라린 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물의 제형으로 유연화장수, 로션, 크림 및 팩을 예시하고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, in the formulation example, the soft cosmetics, lotions, creams and packs are exemplified as the formulation of the composition containing the purine or derivatives of the present invention as an active ingredient, but are not limited thereto.
제형예 1: 유연화장수(스킨)Formulation Example 1: Softening Longevity (Skin)
제형예 2: 에먼젼(로션)Formulation Example 2: Emulsion (Lotion)
제형예 3: 크림Formulation Example 3: Cream
제형예 4: 팩Formulation Example 4: Pack
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 갈근의 주요 이소플라본인 퓨라린과 수용성이 개선된 그 유도체를 이용하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소들의 활성을 억제하고 멜라닌 합성을 저해함으로써, 퓨라린 및 그 유도체의 피부 미백효과를 확인하였다. 따라서 본 발명의 퓨라린 또는 그 유도체를 이용하여 피부 미백효과가 뛰어나면서도 세포독성이 낮은 약학적 또는 식품 조성물을 제조할 수 있으며, 나아가 천연 식의약 소재 및 건강 기능성 식품 개발 원료로도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.As described above, according to the present invention, by inhibiting the activity of the enzymes involved in the production of melanin and inhibiting the melanin synthesis by using the main isoflavone of the root is the purine and the derivative of improved water solubility, Skin whitening effect was confirmed. Therefore, it is possible to prepare a pharmaceutical or food composition having excellent skin whitening effect and low cytotoxicity by using the purine or its derivatives of the present invention, and furthermore, it can be used as a raw material for developing natural food and health functional foods. It is expected to be.
도 1은 멜라닌 생합성 경로를 도시한 그림이고,1 is a diagram showing a melanin biosynthetic pathway,
도 2는 PTU, 알부틴(arbutin)과 퓨라린 이소플라본과 그 유도체를 첨가하였을 때, 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase)의 효소활성 저해 정도를 측정한 것이고,Figure 2 is a measure of the inhibition of the enzyme activity of mushroom tyrosinase (mushroom tyrosinase) when PTU, arbutin and furan isoflavones and derivatives thereof are added,
도 3a은 퓨라린을, 도 3b는 퓨라린 유도체를 각각 첨가하였을 때 murine B16 melanocyte의 생존률을 MTT 법을 실시하여 나타낸 것이고,Figure 3a shows the survival rate of the murine B16 melanocyte when the addition of furin, Figure 3b furanin derivatives by MTT method,
도 4는 퓨라린과 그 유도체, 그리고 양성대조군이 B16 melanocyte의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이며,4 is a graph showing the effect of furin and its derivatives, and positive control group on melanin synthesis of B16 melanocyte,
도 5는 B16 melanocyte를 퓨라린 및 양성대조군으로 처리하였을 때, 멜라닌 합성에 직접적으로 관여하는 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해함을 측정한 결과이며,5 is a result of measuring the inhibition of tyrosinase activity directly involved in melanin synthesis when B16 melanocytes were treated with furin and a positive control group,
도 6은 퓨라린이 멜라닌 합성에 관여하는 주요 효소들의 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,6 is a graph showing the effect of furin on the gene expression of major enzymes involved in melanin synthesis,
도 7은 퓨라린이 멜라닌 합성에 관여하는 주요 효소들 및 전사인자의 단백질 합성에 미치는 영향력을 나타낸 사진과 그래프이다.FIG. 7 is a photograph and a graph showing the effect of furin on the protein synthesis of major enzymes and transcription factors involved in melanin synthesis.
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