KR20090059289A - The preservation method of peripheral blood mononuclear cells at high density condition - Google Patents

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Abstract

A preservation method of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is provided to keep the PBMC with high yield in a freezer for a long time and used the PBMC as an immune cell therapeutic agent. A method for preserving a peripheral blood mononuclear cell(PBMC) comprises: a step of isolating the PBMC; a step of keeping in a freezer; and a step of dissolving the mononuclear cell. A method for freezing comprises: a step of lowering the temperature to 40°C in the rate of 1°C/min; a step of lowering the temperature to -100°C in the rate of 10°C/min; and a step of keeping at -190 ~ -196°C in liquid nitrogen.

Description

고농도 말초혈액단핵구의 장기간 냉동 보존 방법{The preservation method of peripheral blood mononuclear cells at high density condition}The preservation method of peripheral blood mononuclear cells at high density condition

본 발명은 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)의 장기간 냉동 보존 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종래에 비해 고농도, 고회수율로 말초혈액단핵구를 장기간 동안 보존할 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a long-term cryopreservation method of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and more particularly to a method capable of preserving peripheral blood mononuclear cells for a long period of time at a high concentration and a high recovery rate as compared to the conventional.

인체 내에 존재하는 면역세포에는 암세포 또는 바이러스 감염세포와 같이 형질전환된 세포를 인식하는 세포인 수지상세포, 비(B)세포, 마크로파아지 등이 존재하며 또한 감염세포를 인식할 뿐 아니라 제거할 수 있는 자연살상(NK)세포와 T 림프구 등이 존재한다. 그리하여 이러한 면역세포들의 기능을 활용하여 상기 질병에 대한 예방 및 치료를 위한 치료제로 제조하는 방법들이 나오고 있다.Immune cells present in the human body include dendritic cells, cells that recognize transformed cells such as cancer cells or virus infected cells, non-B cells, macrophages, and the like, and can recognize and remove infected cells. Natural killer (NK) cells and T lymphocytes are present. Thus, methods for producing a therapeutic agent for the prevention and treatment of the disease by utilizing the function of these immune cells are emerging.

실제로 최근, 암 등의 질환을 치유하고자 자가 유래의 말초혈액 내 면역세포를 이용한 세포치료제 개발 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이미 품목허가를 받은 면역세포치료제도 늘어나고 있는 추세여서 앞으로 면역세포치료제의 시장이 폭발적 으로 증가할 것으로 예상된다.In fact, in recent years, active researches have been conducted on developing cell therapy products using immune cells in peripheral blood derived from self-derived blood to cure diseases such as cancer. It is expected to increase explosively.

하지만 위와 같은 세포치료제들은 모두 말초혈액 내 존재하는 면역세포(림프구, 수지상세포)를 치료제로써 이용하는 것으로 그 세포의 건강상태에 따라 치료제로 제조된 후 효과가 극적으로 차이가 날 수 있는 단점을 가지고 있다. 특히, 암질환의 경우 암 진단을 받은 후 외과적 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료를 포함한 항암화학요법 등을 받게 되는데 이러한 과정에 벌써 환자의 면역세포는 그 기능 이상을 일으키게 될 수 있어 상기 면역세포를 이용하여 면역세포치료제로 제조할시 그 효능은 장담할 수 없게 된다. 또한 면역세포의 필요에 따라 필요량을 확보하기 위하여 지속적으로 채혈할 경우 환자에게 고통을 줄 뿐만 아니라 환자에게 빈혈을 일으키게 할 수 있다.However, all of the above cell therapy products use immune cells (lymphocytes, dendritic cells) present in peripheral blood as a therapeutic agent, and have the disadvantage that the effects may vary dramatically after being manufactured as a therapeutic agent depending on the health of the cells. . In particular, cancer diseases are diagnosed with cancer and then undergoing surgery, radiation therapy, chemotherapy including hormonal therapy, etc. In this process, the immune cells of the patient may already cause abnormal function of the immune cells. When used as an immune cell therapy, its efficacy cannot be guaranteed. In addition, according to the needs of immune cells, continuous blood collection may be painful to patients as well as cause anemia in patients.

이런 문제점들을 극복하기 위하여 건강한 사람이나 암 질환이 완치된 사람 혹은 초기의 암질환 환자의 말초혈액 단핵구를 장기간 동안 동결보존하다가 이후 해당자에게 암질환이 발생 혹은 재발하였을 때 동결보존 중인 본인의 세포를 면역세포치료제로 사용하고자 해동하여 증식, 활성화시키는 방법이 연구되고 있다. 그러나 이 경우 해동 후의 활성저하 등에 대한 문제점을 극복하지 못하고 있는 실정이다. 특히 임상에 사용하기 위한 상기 세포의 양은 고농도일 것을 요하는데, 종래의 냉동보관법들은 저농도의 실험적 수준에서 그치고 있어 실제 임상에 적용하는 데에는 한계가 있다.In order to overcome these problems, the peripheral blood mononuclear cells of healthy people, people who have cured of cancer disease, or early cancer disease patients are cryopreserved for a long time, and then their cells are cryopreserved when the cancer disease develops or recurs. Methods for thawing, proliferating and activating for use as an immune cell therapy are being studied. However, this situation does not overcome the problems of deactivation after thawing. In particular, the amount of the cells for use in the clinical needs to be a high concentration, conventional cryopreservation methods are limited to low concentration experimental level, there is a limit to the practical application.

이를 해소하기 위해 본 발명에서는 말초혈액 단핵구를 실제 환자 치료를 위해 고농도로 냉동보존하는 방법을 제공하고자 한다.In order to solve this problem, the present invention is to provide a method for cryopreserving peripheral blood monocytes in high concentration for actual patient treatment.

또한 기존의 면역세포 동결보존 방법은 동결 전 추후 면역치료의 목적에 맞게 특정 면역세포로의 활성화 배양단계를 거친 후 동결보존을 실시하고 있지만, 말초혈액단핵구의 경우에는 앞서 언급한 대로 여러 종류의 면역세포를 함유하고 있어 만일 활성화 이전에 동결보존을 안전하게 한다면 차후 말초혈액 단핵구에 포함되어 있는 특정 면역세포를 이용하여 면역세포치료를 하고자 할 때 융해하여 치료의 목적에 맞는 특정 면역세포로 성숙, 활성화시킬 수 있게 될 것이다. 이로써 동결보존 전의 고가의 싸이토카인 등이 필요로 하는 배양단계를 없애고, 추후 면역치료에 필요할 때 필요로 하는 세포의 특성에 맞게 활성화시킬 수 있어 2종, 3종 이상의 다른 종류의 면역세포로 증식, 성숙화 및 활성화시킨 다종의 면역세포치료제로 활용할 수 있게 된다.In addition, conventional cryopreservation methods for cryopreservation are performed after activating and culturing to specific immune cells for the purpose of immunotherapy before freezing, but in the case of peripheral blood monocytes, as mentioned above, If it is safe for cryopreservation before activation, it can be fused and matured and activated to specific immune cells for the purpose of treatment. It will be possible. This eliminates the cultivation step required by expensive cytokines before cryopreservation, and activates them according to the characteristics of cells needed for future immunotherapy, proliferating and maturing into two, three or more different types of immune cells. And it can be used as a multi-immune immune cell therapy.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 종래에 비해 고농도, 고회수율로 말초혈액단핵구를 장기간 동안 보존할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다. 달리 표현하면 본 발명의 목적은 종래 방법에 비하여 면역세포치료제로 사용하기 위한 충분한 수의 세포를 세포 대부분의 활성을 유지하면서 장기간 동안 냉동 보존하는 방법을 제공하는 데 있다.The present invention has been made to solve the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for preserving peripheral blood monocytes for a long time at a high concentration, high recovery rate compared with the prior art. In other words, it is an object of the present invention to provide a method of cryopreserving a sufficient number of cells for a long time while maintaining the activity of most of the cells as compared to the conventional method for use as an immunocytotherapy.

본 발명에 따르면 고농도(1mL당 세포수 108개 이상)의 말초혈액 단핵구를 실제 환자 치료를 위해 안정되게 냉동보존할 수 있다.According to the present invention, peripheral blood mononuclear cells of high concentration (more than 10 8 cells per mL) can be stably cryopreserved for actual patient treatment.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은,The present invention for achieving the above object,

말초혈액 단핵구를 분리하는 제1단계와, 상기 단핵구를 일정 기간 냉동한 후 보존하는 제2단계, 그리고 상기 냉동보존된 단핵구를 융해, 복원하는 제3단계로 이루어진 말초혈액 단핵구의 보존방법에 있어서,1. A method of preserving peripheral blood monocytes comprising a first step of separating peripheral blood monocytes, a second step of preserving the monocytes after freezing for a period of time, and a third step of melting and restoring the cryopreserved monocytes,

상기 제2단계는, 5~15중량%의 DMSO, 1~20중량%의 펜타스타치(pentastarch), 1~20중량%의 알부민(albumin), 0.1~1중량%의 글루코오즈, 0.01~0.1중량%의 EDTA 및 나머지의 무혈청배지로 조합되는 동결보존배지에 말초혈액 단핵구를 현탁하여 동결하여 보존하는 것을 특징으로 한다.The second step is 5 to 15% by weight of DMSO, 1 to 20% by weight of pentastar (pentastarch), 1 to 20% by weight of albumin (albumin), 0.1 to 1% by weight of glucose, 0.01 to 0.1 Peripheral blood monocytes are suspended and cryopreserved in a cryopreservation medium combined with the weight percent EDTA and the rest of the serum-free medium.

이때, 말초혈액 단핵구를 상기 조성의 동결보존배지에 현탁하여 동결하여 보존함에 있어서는 온도를 -40℃까지 1℃/min의 속도로 떨어뜨리고 이후 -100℃까지는 10℃/min으로 떨어뜨린 후 액체질소탱크에서 -190~196℃로 보존하는 것을 특징으로 한다.In this case, the peripheral blood mononuclear cells are suspended in a cryopreservation medium of the above composition and frozen to preserve the temperature at a rate of 1 ° C./min up to −40 ° C. and then to 10 ° C./min up to −100 ° C. and then liquid nitrogen. It is characterized in that the storage at -190 ~ 196 ℃ in the tank.

또한 위 각 경우에 있어서, 말초혈액 단핵구를 상기 조성의 동결보존배지에 현탁하여 동결하여 보존함에 있어서는 보존되는 단핵구의 농도가 1×108 내지 1×1010 세포/mL의 농도가 되도록 하는 것을 특징으로 한다.In each of the above cases, when the peripheral blood monocytes are suspended and frozen in a cryopreservation medium of the composition, the concentration of the monocytes to be preserved is 1 × 10 8 to 1 × 10 10 cells / mL. It is done.

상기와 같이 보존된 말초혈액단핵구는 이후 적절한 환경 내에서 공지의 방법에 따른 분화 배양을 통해 미성숙 수지상 세포와 성숙 수지상 세포 및 활성화 림프구(lymphocyte)로 제조될 수 있다. 그리고 이때 상기 미성숙 수지상세포는 해당 항원 포식능을 가지며 성숙 수지상세포 및 활성화 림프구는 항암, 항바이러스의 효과를 가지게 된다.Peripheral blood mononuclear cells preserved as described above may then be prepared into immature dendritic cells, mature dendritic cells and activated lymphocytes through differentiation culture according to known methods in an appropriate environment. In this case, the immature dendritic cells have the corresponding antigen phagocytosis, and mature dendritic cells and activated lymphocytes have the effects of anticancer and antiviral.

상기 제1단계는 말초혈액 단핵구를 분리하는 단계로서 종래의 공지된 방법을 사용한다. 채혈방법으로서는 질환 또는 건강한 상태 때의 자신의 말초혈액을 팔의 정맥에서 채혈을 하여 단핵구를 얻는 것이 바람직하지만 단핵구를 함유하는 것이라면 어느 것도 재료로 할 수 있다. 채혈량으로서는 0.001ml 내지 500ml 정도의 말초혈액이 좋다. 채혈한 말초혈액에는 응고가 일어나지 않도록 헤파린, EDTA 또는 구 연산을 첨가할 수 있다. 채취한 말초혈액에서 단핵구를 분리하고 단핵구의 생존율을 측정하고, 유세포 분석기를 통해 단핵구의 표현형을 검사한 후 단핵구의 동결을 실시한다. The first step is to separate peripheral blood monocytes using a conventionally known method. As a blood collection method, it is preferable to obtain mononuclear cells by bleeding one's own peripheral blood in a disease or healthy state from the vein of the arm, but any material containing monocytes can be used. The amount of blood drawn is about 0.001 ml to about 500 ml of peripheral blood. Peripheral blood can be added with heparin, EDTA or citric acid to prevent coagulation. Monocytes are isolated from the collected peripheral blood and the viability of the monocytes is measured. After the monocyte phenotype is examined by flow cytometry, the monocytes are frozen.

제2단계는 제1단계에서 분리한 말초혈액 단핵구를 일정 기간 냉동보존하는 동결 단계를 말한다. 보존하는 단핵구는 그 세포의 농도에 따라서 세포 보존액에 현탁하는 밀도를 적당히 선택할 수 있는데 1×108개/ml~1×1010개/ml 밀도에서 보존액 안에 현탁하고 동결 보존한다. 종래 방법에 따를 경우 1×108개/ml 이상의 고농도로 냉동보존하면 해동 후 세포의 생존율과 회수율이 급격히 떨어지는 단점을 가지고 있으나, 본 발명에 따를 경우 위와 같은 밀도에서 최적의 상태로 세포를 보존하는 게 가능해진다. 동결보존액의 양은 0.1ml~1000ml의 범위로 사용할 수 있다. 제조된 동결 보존액은 제조 후 사용 시까지 냉장고(4°C) 혹은 냉동고(-20°C 혹은 -70°C)에 보존할 수 있다. 동결 세포가 보존될 동결 튜브는 시판 중인 세포 동결 튜브를 사용하는 것이 바람직하나 동결 백을 사용할 수도 있으며, 그 크기는 적당하게 선택할 수 있다. 동결하는 세포의 수는, 각 동결 튜브당 1×108~1×1010개가 적당하며 동결하는 튜브의 수는 채혈량에 따라 달라지며 1~1000개의 단위 수까지 보존 가능하고, 사용 시에 이것을 해동, 융해하고 복원한다. 한편, 동결의 경우에서는 자동동결시스템(controlled rate freezing system)을 사용해본 결과 세포의 안정성과 증식효율 면에서 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 상기 자동동결시스템은 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 상기 자동동결시스템에서 질소탱크로 옮길 때는 cane이나 동결튜브상자를 포함하여 질소탱크에 들어갈 수 있는 어느 물건을 사용해도 무방하다. The second step refers to a freezing step of cryopreserving the peripheral blood monocytes isolated in the first step for a certain period of time. Monocytes to be preserved can be appropriately selected from the density of the cells suspended in the cell stock according to the concentration of the cells. The cells are suspended in the stock at a density of 1 × 10 8 / ml to 1 × 10 10 / ml and cryopreserved. According to the conventional method, if the cryopreservation at a high concentration of 1 × 10 8 / ml or more has a disadvantage that the survival rate and recovery rate of the cells rapidly after thawing, but in accordance with the present invention to preserve the cells in the optimal state at the density as described above It becomes possible. The amount of cryopreservation liquid can be used in the range of 0.1ml ~ 1000ml. The prepared cryopreservation liquid can be stored in a refrigerator (4 ° C) or a freezer (-20 ° C or -70 ° C) until manufacture and use. The freezing tube in which the frozen cells will be preserved is preferably a commercially available cell freezing tube, but a freezing bag may be used, and the size thereof may be appropriately selected. The number of cells to freeze is 1 × 10 8 ~ 1 × 10 10 for each freezing tube is appropriate, the number of freezing tubes depends on the volume of blood collected and can be stored up to 1 to 1000 units, which is Thaw, thaw and restore. In the case of freezing, a controlled rate freezing system was used to obtain good results in terms of cell stability and proliferation efficiency. The automatic freezing system may be commercially available. When moving from the automatic freezing system to the nitrogen tank, any item that can enter the nitrogen tank, including a cane or a freezing tube box, may be used.

본 발명의 상기 제3단계는 상기 냉동보존 단계의 말초혈액 단핵구를 융해, 복원하는 공지의 단계를 말하는데 냉동보존된 상기의 단핵구를 37℃에서 융해 후 배양 배지에 현탁한 후 융해하여 생존율과 회수율을 측정하고, 분리 배양을 통한 단핵구 및 림프구의 활성도를 측정하여 면역세포치료제로서 사용할 수 있음을 확인하였다. 37℃에서의 융해을 위해 heat block이나 항온조(water bath)를 사용할 수 있다. 상기의 배지는 일반적으로 사용되는 세포배양용 무혈청동물배지를 사용하였다.The third step of the present invention refers to a known step of melting and restoring the peripheral blood monocytes of the cryopreservation step. The cryopreserved monocytes are fused at 37 ° C. and then suspended in a culture medium to be fused to survive and recover. It was determined that the activity of monocytes and lymphocytes through isolation culture was measured and used as an immune cell therapy agent. A heat block or water bath may be used for melting at 37 ° C. The medium used was a serum-free animal medium for cell culture generally used.

한편 위에서 말초혈액 단핵구를 현탁한 동결보존배지의 온도를 -40℃까지 1℃/min의 속도로 떨어뜨리고 이후 -100℃까지는 10℃/min으로 떨어뜨리는 것은 기존에 나와 있는 자동동결시스템(controlled rate freezing system)을 통해 용이하게 시행할 수 있으며 본 발명의 실시에서는 IceCube Series 15x 자동동결시스템을 사용하였다. 그리고 위와 같은 속도와 방법으로 온도를 조절하는 것은 세포의 생존율과 회수율을 높이기 위한 것으로서, 발명자들의 실험에 의해 밝혀진 사항이다.On the other hand, the temperature of the cryopreservation medium in which peripheral blood monocytes are suspended above is lowered to -40 ° C. at a rate of 1 ° C./min, and then to -100 ° C. at 10 ° C./min. Freezing system) can be easily implemented in the practice of the present invention was used IceCube Series 15x automatic freezing system. And controlling the temperature by the above speed and method is to increase the survival rate and recovery rate of the cells, which is revealed by the inventors' experiment.

또한 위에서 단핵구의 농도는 동결보존배지를 첨가하는 양으로 조절할 수 있다.In addition, the concentration of monocytes in the stomach can be adjusted by the amount of cryopreservation medium added.

또한 동결보존배지에 첨가되는 무혈청배지는 어떤 것이라도 본 발명에 적용될 수 있으며 예로써 DMEM, RPMI-1640, medium 199, IMDM, AIM-V 등의 무혈청배지 를 사용할 수 있다.In addition, any serum-free medium added to cryopreservation medium may be applied to the present invention, and for example, serum-free mediums such as DMEM, RPMI-1640, medium 199, IMDM, and AIM-V may be used.

본 발명에 따르면, 면역세포치료제로 사용하기 위해 정상인, 암질환 완치 판정자, 초기 암환자 등에서 분리된 말초혈액 단핵구를 고농도로 적절한 동결보존배지에 현탁 후 안정하게 온도를 떨어뜨린 후 최종 액체질소 탱크 내에서 장기간 냉동보관함으로써 고농도, 고회수율로 말초혈액단핵구를 장기간 동안 보존할 수 있게 되므로, 이후 본인에게 암 질환이 발병하거나 재발하였을 때 냉동 보관하고 있던 상기의 세포를 융해 후 안정하게 증식, 활성화시켜 면역세포치료제로 제조하여 해당 암 질환의 면역치료에 이용할 수 있게 된다.According to the present invention, peripheral blood mononuclear cells isolated from normal people, cancer disease cure determinants, early cancer patients, and the like are suspended in a high concentration of appropriate cryopreservation medium for stable use after treatment. Long-term cryopreservation results in long-term preservation of peripheral blood mononuclear cells at high concentrations and high yields. Afterwards, when the cancer disease develops or recurs, the cells stored in the frozen state can be stably proliferated and activated after thawing. Prepared as a cell therapy, it can be used for immunotherapy of the cancer disease.

이하 본 발명을 실험예와 함께 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described with experimental examples.

이하의 실시예에서는 본 발명에 따른 면역세포치료제로 사용하기 위한 말초혈액 단핵구의 장기보관 처리방법을 상세히 설명하였다. 이들 실시예는 단지 본 발명의 실험예를 설명한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.In the following Examples, the long-term storage method of peripheral blood monocytes for use as an immune cell therapy according to the present invention has been described in detail. These examples are only illustrative of the experimental examples of the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예Example 1. 채혈 및 단핵구 분리 1. Blood Collection and Monocyte Isolation

사람의 정맥으로부터 말초혈액을 10ml~500ml을 채혈하고 무균상태에서 혈액 을 뽑아내었다. 이때, 채혈 용기로는 헤파린 또는 EDTA와 같은 항응고제가 포함된 채혈 튜브(tube) 또는 백(bag)을 이용하였다. 일차로 백혈구 세포층을 분리한 후 50ml 튜브에 넣고 동량의 인산염 완충용액(PBS)을 첨가하여 희석하였다. 희석한 혈액을 Histopaque-1077 용액 위에 1:2∼1:4의 비율이 되도록 서서히 올려주고 400 ×g, 상온 조건하에서 30분간 원심분리한 후 단핵구를 분리하였다. 그런 다음 적당량의 인산염 완충용액으로 3회 원심세척하였다. 마지막 원심세척 후, 상층액을 제거하고 인산염 완충용액으로 단핵구 침전물을 잘 부유시켜 trypan blue 용액을 이용하여 단핵구수를 측정한 결과, 총 세포개수는 1×108개 이상이었다.Peripheral blood was drawn from 10ml to 500ml from human veins and blood was drawn under aseptic conditions. In this case, a blood collection tube or bag containing an anticoagulant such as heparin or EDTA was used as a blood collection container. First, the leukocyte cell layer was separated and placed in a 50 ml tube and diluted by the addition of the same amount of phosphate buffer (PBS). The diluted blood was slowly raised to a ratio of 1: 2 to 1: 4 on Histopaque-1077 solution, and centrifuged at 400 × g for 30 minutes under room temperature, and monocytes were separated. Then centrifuged three times with an appropriate amount of phosphate buffer. After the last centrifugation, the supernatant was removed, the monocyte precipitate was suspended with phosphate buffer, and the number of monocytes was measured using trypan blue solution. The total cell count was more than 1 × 10 8 .

실시예Example 2. 말초혈액 단핵구의 냉동보존 2. Cryopreservation of Peripheral Blood Monocytes

상기 1단계에서 얻은 말초혈액 단핵구 혼합액을 원심분리한 후 각각의 상기 인산염 완충용액을 제거하고 말초혈액 단핵구 침전물을 얻었다. 상기 단핵구를 세포보존액[5~15중량% DMSO, 1~20중량% pentastarch, 1~20중량% albumin, 0.1~1중량% 글루코오즈, 0.01~0.1% EDTA, 나머지 무혈청배지인 medium 199를 조합하여 함유하는 동결보존배지]과 잘 혼합한 후 배양 조건별로 1.8ml의 세포 보존용 튜브에 각각 1.0ml씩 분주하였다. 그런 다음 전술한 자동동결시스템을 이용하여 동결 튜브의 온도를 -40℃까지 1℃/min으로 떨어뜨리고 -100℃까지 10℃/min으로 떨어뜨린 후 질소탱크에 옮겨서 보관하였다.After centrifuging the peripheral blood monocyte mixture obtained in step 1, each of the phosphate buffers was removed to obtain a peripheral blood mononuclear precipitate. The monocytes were combined with cell preservation solution [5-15% by weight DMSO, 1-20% by weight pentastarch, 1-20% by weight albumin, 0.1-1% by weight glucose, 0.01-0.1% EDTA, the remaining serum-free medium medium 199. And cryopreservation medium containing] and 1.0ml each was dispensed into 1.8ml cell preservation tubes for each culture condition. Then, the temperature of the freezing tube was dropped to 1 ° C./min to −40 ° C. and 10 ° C./min to −100 ° C. using the above-mentioned auto-freezing system, and then stored in a nitrogen tank.

실시예Example 3. 냉동보존  3. Cryopreservation 말초혈액단핵구의Peripheral Blood Monocytes 융해, 검사 Fusion inspection

보관 70일 후, 상기 실시예 2에서 냉동보존해둔 튜브를 1개 꺼내 37℃ 항온조 (water bath)에서 약 1~4분간 해동하고 냉동보존 단핵구의 융해, 복원을 시행하였다. 원심분리용 튜브 안에 배지 8~11mL과 융해한 냉동보존 단핵구를 포함한 세포보존액 약 1ml을 넣어 현탁시켰다. 세포보존액을 제거하기 위하여 배양배지를 이용하여 3회 원심세척하고 상기의 배양배지 40mL로 현탁하였다. 상기 세포 현탁액 20μL를 trypan blue 용액 20uL와 혼합한 후 혈구 계산판에 옮긴 후 현미경 (올림푸스)하에서 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하였다. 생존율을 측정한 결과, 일반적인 수동의 방법 (세포를 상기의 동결보존배지로 현탁한 후 isopropanol 박스에 담아 -70℃에서 하룻밤을 지내 후 최종 액체질소 탱크에 보존)으로 냉동보존한 세포의 융해 후 생존율은 68%였으며, 회수율은 44%였다. 반면 본 발명에 의해 냉동보존된 세포의 융해 후 생존율은 93%였으며, 회수율은 100%이였다(도 1).After 70 days of storage, one cryopreserved tube was removed in Example 2, thawed in a 37 ° C. water bath for about 1 to 4 minutes, and the cryopreserved monocytes were fused and restored. In a centrifuge tube, about 1 ml of the cell stock solution containing 8-11 mL of the medium and fused cryopreserved monocytes was suspended. In order to remove the cell stock solution, the cells were centrifuged three times using a culture medium and suspended in 40 mL of the culture medium. 20 μL of the cell suspension was mixed with 20 μL of trypan blue solution and transferred to a hemocytometer, and the number of living and dead cells was measured under a microscope (Olympus). Survival rate was measured and the survival rate after thawing of the cryopreserved cells by the usual manual method (suspension of the cells in the cryopreservation medium and then put in an isopropanol box overnight at -70 ℃ and stored in the final liquid nitrogen tank) Was 68% and the recovery was 44%. On the contrary, the survival rate of the cryopreserved cells was 93% and the recovery rate was 100% (FIG. 1).

실시예Example 4. 냉동보존  4. Cryopreservation 말초혈액단핵구Peripheral Blood Monocytes 배양 culture

실시예 4는 상기 3단계에서 융해, 복원된 단핵구를 배양하여 면역세포치료제로 사용할 수 있도록 하는 분화 배양 방법을 설명하는데 융해, 복원된 단핵구를 단구(monocyte)와 림프구(lymphocyte)로 나누어 배양하여 성숙 수지상세포와 활성화 림프구로 제조하기 위한 배양을 실시하였다. 일반적인 수동의 방법으로 냉동보존한 말초혈액단해구의 경우는 생존율과 회수율이 낮아 활성 검사를 실시하지 못했다. 본 발명에 의해 냉동보존한 말초혈액단핵구의 융해 후 배양 전 상기의 말초혈액 단 핵구의 표면항원들 중 단구와 림프구에서 발현되는 대표적인 표면 항원을 유세포 분석기로 조사해 본 결과 냉동보존하지 않은 말초혈액단핵구 내 단구 및 림프구의 표면항원의 성상과 별 차이 없이 일정한 발현 분포도를 나타내었다(도 2).Example 4 describes a differentiation and culturing method for culturing the fused and restored monocytes in the step 3 to be used as an immune cell therapeutic agent. The fused and restored monocytes are divided into monocytes and lymphocytes and cultured to mature. Cultures for production of dendritic cells and activated lymphocytes were performed. Peripheral erythrocytes cryopreserved by the conventional manual method had low survival rate and low recovery rate. According to the present invention, the surface antigens expressed in monocytes and lymphocytes among the surface antigens of the peripheral blood mononuclear cells before fusion after cryopreservation of the frozen blood mononuclear cells were examined by flow cytometry. A constant expression distribution was shown without difference between the surface antigens of monocytes and lymphocytes (FIG. 2).

상기의 융해된 말초혈액 단핵구를 제 3단계에서 언급한 세포 배양용 배지에 현탁하여 바닥면적 75cm2인 배양용 플라스크에 넣고 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하였다. 배양 2시간 후, 플라스크 용기 내의 부유한 림프구 세포와 배양액을 수거하여 새로운 T75 cm2 플라스크 용기로 옮기고 500U/ml rhIL-2와 50ng/ml 항 CD3 항체를 첨가하였다. 또한, 원래의 플라스크 바닥에 부착되어 있는 단구 (monocyte) 세포를 미성숙 수지상 세포로 분화 배양하기 위하여 제 3단계에서 언급한 세포 배양용 배지에 1000U/ml rhGM-CSF, 1000U/ml rhIL-4를 첨가하여 만든 현탁액을 플라스크에 넣고 새로운 플라스크와 함께 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하였다.The fused peripheral blood monocytes were suspended in the cell culture medium mentioned in the third step and placed in a culture flask having a bottom area of 75 cm 2 and incubated in the presence of 37 ° C. and 5% CO 2 . After 2 hours of incubation, the floating lymphocyte cells and cultures in the flask vessel were harvested and transferred to a new T75 cm 2 flask vessel and 500 U / ml rhIL-2 and 50 ng / ml anti CD3 antibody were added. In addition, 1000 U / ml rhGM-CSF and 1000 U / ml rhIL-4 were added to the cell culture medium mentioned in step 3 to differentiate and culture the monocyte cells attached to the bottom of the original flask into immature dendritic cells. The resulting suspension was placed in a flask and incubated with new flask at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .

실시예Example 5. 미성숙  5. Immature 수지상세포Dendritic cells 배양 culture

상기 바닥에 부착된 단구세포의 배양을 통해 미성숙 수지상세포로 분화 배양을 실시하였다. 배양 3일째 1000U/ml rhGM-CSF, 1000U/ml rhIL-4를 추가로 첨가한 후 배양 6일째 유세포 분석기를 이용하여 세포성상을 관찰하였다. 동결하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리 후 6일 동안 분화 배양된 미성숙 수지상세포의 성상(도 3a)과 상기의 방법으로 융해된 말초혈액 단핵구에서 분리 후 6일 동안 분화 배양된 미성숙 수지상세포의 성상(도 3b)에 별 차이가 없이 모두 덴드라이트가 발달되어 있는 것을 관찰하였다.Differentiation and culture of immature dendritic cells was carried out through the culture of monocytes attached to the bottom. On the third day of culture, additional 1000 U / ml rhGM-CSF and 1000 U / ml rhIL-4 were added, and then, on the 6th day of culture, the cytoplasm was observed using a flow cytometer. Characteristics of Immature Dendritic Cells Differentiated and Cultured for 6 Days after Separation from Unfrozen Peripheral Blood Monocytes (Fig. 3a) and Immature Dendritic Cells Differentiated and Cultured for 6 Days after Separation from Peripheral Blood Monocytes Fused by the Method (Fig. It was observed that dendrites were developed without any difference in 3b).

동결하지 않은 말초혈액단핵구에서 단구세포를 분리하여 6일 동안 미성숙 수지상세포로 분화배양한 후 유세포 분석기를 통해 세포의 표면항원을 분석한 결과와(도 4a) 상기방법으로 융해된 말초혈액단핵구에서 분리한 단구세포를 6일 동안 미성숙 수지상세포로 분화 배양 후 유세포 분석기로 세포의 표면항원을 분석한 결과(도 4b)를 비교했을 때 그 표현형의 차이가 동결 전후 별 차이가 없었다. 또한 덱스트란을 이용하여 미성숙 수지상세포의 항원 포식능을 확인한 결과 동결 전후 모두 세포의 항원 포식능이 있음이 확인되었다(도 5a, 5b).After the monocytes were isolated from unfrozen peripheral blood monocytes and differentiated into immature dendritic cells for 6 days, the surface antigens of the cells were analyzed by flow cytometry (FIG. 4a) and isolated from the peripheral blood mononuclear cells fused by the above method. After differentiating and culturing one monocyte into immature dendritic cells for 6 days, the surface antigens of the cells were analyzed by flow cytometry (Fig. 4b). In addition, as a result of confirming the antigen phagocytosis of immature dendritic cells using dextran, it was confirmed that the antigen phagocytosis of the cells before and after freezing (Fig. 5a, 5b).

실시예Example 6. 성숙  6. Maturity 수지상세포의Dendritic 배양 culture

상기 실시예에서와 같이 6일 동안 배양된 미성숙 수지상세포를 무혈청배지에 1×106cells/ml이 되도록 현탁한 후 종양항원 단백질 50ug/ml을 첨가하여 배양하였다. 배양 4시간 후 성숙유도인자인 10ng/ml의 TNF-a, 10ng/ml의 IL-1b, 1000u/ml의 IL-6, 1ug/ml의 PGE2를 첨가하여 37℃, 5% CO2 존재하에서 48시간 동안 배양 하였다. 동결하지 않은 말초혈액에서 유래한 성숙 수지상세포의 표면항원 분석 결과(도 6a)와 상기의 융해한 말초혈액에서 유래한 성숙 수지상세포의 표면항원 분석 결과(도 6b)를 분석한 결과를 비교했을 때 동결하지 않은 세포와 동결 후의 세포 표현형 모두에서 CD80, CD83, CD86 등 성숙인자 발현이 증가한 것을 확인 하였다. 또한 동종의 T세포와 성숙한 수지상세포와의 혼합배양 후, 수지상세포에 의해 자극을 받은 T 세포의 증식능을 관찰한 결과, 동결 전 후 모두 성숙한 수지상세포에 의해 T세포 증식한 것을 확인하였다(도 7a, b). 또한 성숙한 수지상세포에 의해 자극을 받은 T 세포의 인터페론 감마 분비능을 확인해본 결과, 동결여부에 관계없이 성숙한 수지상세포에 의해 T세포의 인터페론 감마 분비능이 증가하는 것을 확인하였다(도 8a, b). Immature dendritic cells cultured for 6 days as in the above embodiment was suspended in a serum-free medium to 1 × 10 6 cells / ml, and then cultured by adding 50 ug / ml of tumor antigen protein. After 4 hours of incubation, 10 ng / ml of TNF-a, 10 ng / ml of IL-1b, 1000 u / ml of IL-6, and 1 ug / ml of PGE 2 were added at 37 ° C. and 5% CO 2 . Incubated for 48 hours. When comparing the results of analyzing the surface antigen analysis of mature dendritic cells derived from unfrozen peripheral blood (Fig. 6a) and the results of analyzing the surface antigen analysis of mature dendritic cells derived from the fused peripheral blood (Fig. 6b). It was confirmed that the expression of mature factors such as CD80, CD83, CD86 was increased in both unfrozen cells and cell phenotypes after freezing. In addition, after the mixed culture of the homogenous T cells and mature dendritic cells, the proliferative capacity of the T cells stimulated by the dendritic cells was observed. , b). In addition, as a result of confirming the interferon gamma secretion capacity of the T cells stimulated by mature dendritic cells, it was confirmed that the interferon gamma secretion capacity of the T cells by the mature dendritic cells regardless of whether frozen cells (Fig. 8a, b).

실시예Example 7. 활성화림프구 배양 7. Culture of activated lymphocytes

상기 실시예 4에서 분리한 림프구를 1000U/ml IFN-γ와 사람혈청이 포함된 세포배양 배지에서 1일 배양 후 500U/ml rhIL-2와 50 ng/ml 항 CD3 항체를 첨가하였다. 배양기간 2-3일 간격으로 인터루킨 2가 포함된 배지를 첨가했으며 활성화 림프구의 과밀도 현상을 막기 위하여 플라스크 용기의 크기 및 개수를 늘리면서 37℃, 5% CO2 존재 하에서 21일 동안 배양함으로써 활성화 림프구 5.0×108-5.0×1010개를 얻었다. 도 9는 유세포 분석기를 이용하여 배양 21일째의 활성화 림프구의 표면항원을 조사한 결과인데 동결 전후의 세포 표면항원의 비율에 별 차이 없었으며 상기의 융해한 말초혈액단핵구 유래 림프구의 경우 활성화림프구의 대표적인 표면항원인 CD3, CD16(살해세포(killer cell) 표지자), CD56[살해세포(killer cell)표지자], NKG2D(살해세포 (killer cell) 표지자)의 발현이 동결하지 않고 배양한 림프구와 별 차이 없이 발현한 것을 확인 하였다. 특히 림프구 중 배양 21일째에 항 암치료제로 사용할 수 있는 살해세포의 표지자인 CD3음성 CD56양성 림프구, CD56양성 NKG2D양성 림프구 및 CD56양성 CD16양성 림프구가 동결 전후 관계없이 각각 54-64%, 68-71% 및 55-61%로 나타났으며, 따라서 항암치료제로 사용할 시 우수한 항암효과를 나타낼 것으로 판단할 수 있다. 이러한 결과로 유추해 볼 때, 대용량의 말초혈액단핵구의 장기간 냉동보존상태가 활성화림프구의 활성도에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.Lymphocytes isolated in Example 4 were cultured in a cell culture medium containing 1000 U / ml IFN-γ and human serum for 1 day, and then 500 U / ml rhIL-2 and 50 ng / ml anti CD3 antibody were added. The medium containing interleukin 2 was added at intervals of 2-3 days and the activated lymphocytes were incubated for 21 days in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. while increasing the size and number of flask vessels to prevent excessive density of activated lymphocytes. 5.0 * 10 <8> -5.0 * 10 <10> pieces were obtained. Figure 9 shows the surface antigens of activated lymphocytes on day 21 of the culture using a flow cytometer. There was no difference in the ratio of cell surface antigens before and after freezing. In the case of the fused peripheral blood mononuclear cell-derived lymphocytes, representative surface of activated lymphocytes was shown. The expression of the antigens CD3, CD16 (killer cell marker), CD56 (killer cell marker), and NKG2D (killer cell marker) are not significantly different from those of cultured lymphocytes. Confirmed that one. In particular, CD3 negative CD56 positive lymphocytes, CD56 positive NKG2D positive lymphocytes, and CD56 positive CD16 positive lymphocytes, which are markers of killer cells that can be used as anticancer drugs at 21 days of culture, were 54-64% and 68-71, respectively. % And 55-61%, which can be judged to show excellent anticancer effect when used as an anticancer drug. Inferred from these results, it was determined that the long-term cryopreservation of large peripheral blood monocytes did not significantly affect the activity of activated lymphocytes.

위에서 본 바와 같이, 사람의 말초혈액단핵구를 본 발명에 따라 동결튜브당 고농도로 안정하게 장기간 냉동보관 후 융해했을 때, 종전의 냉동보존법에 비하여 탁월한 세포생존율 및 회수율을 보였다. 그리고 상기 냉동보존방법을 통해서 얻은 수지상세포 및 림프구의 면역세포치료제로서의 기능성을 측정했을 때, 신선한 대조군과 동등한 수치를 보였다. 이를 근거로, 본 발명은 말초혈액단핵구를 동결튜브당 고농도로 안정하게 장기간 냉동보관 후 본인이 암 질환이 발병 혹은 재발하였을 때 면역세포치료제로 효율적으로 제조하여 해당 암 질환의 면역치료에 이용할 수 있는 방법이 효과적으로 시행될 수 있다.As seen above, when human peripheral blood mononuclear cells were thawed stably after prolonged cryopreservation at a high concentration per cryotube according to the present invention, cell viability and recovery were excellent compared to conventional cryopreservation methods. And when the functionality of the dendritic cells and lymphocytes obtained through the cryopreservation method as an immune cell therapy, the same value as the fresh control. On the basis of this, the present invention, after a long-term cryopreservation of the peripheral blood mononuclear cells at a high concentration per freeze tube stably, when the cancer disease develops or relapses, the drug can be efficiently prepared as an immune cell therapy and used for immunotherapy of the cancer disease. The method can be implemented effectively.

도 1은 일반적인 수동 동결방법과 본 발명에 따라 냉동 보존한 말초혈액단핵구의 융해 후 생존율과 회수율을 나타낸 것이고,Figure 1 shows the survival and recovery rate after melting of the peripheral blood monocytes cryopreserved according to the general manual freezing method and the present invention,

도 2a는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구와 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구의 단구세포 표면항원 발현양상을 유세포형광분석기로 분석한 결과이고,Figure 2a is a result of analyzing the surface antigen expression patterns of peripheral blood mononuclear cells fused after cryopreservation and peripheral blood mononuclear cells unfrozen as a control according to the present invention by flow cytometry,

도 2b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구와 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구의 림프구 표면항원 발현양상을 유세포형광분석기로 분석한 결과이고,Figure 2b is a result of analyzing the surface expression of lymphocytes of the peripheral blood mononuclear cells fused after cryopreservation and peripheral blood mononuclear cells unfrozen as a control according to the present invention by flow cytometry,

도 3a는 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포의 현미경 사진을 나타낸 것이고,Figure 3a shows a micrograph of immature dendritic cells obtained through culture by separating from the frozen blood mononuclear cells as a control,

도 3b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포의 현미경 사진을 나타낸 것이고,Figure 3b is a micrograph of immature dendritic cells obtained through culturing separated from frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention,

도 4a는 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포의 표면항원 발현양상을 유세포형광분석기로 분석한 결과이고,Figure 4a is a result of analyzing the surface antigen expression pattern of immature dendritic cells obtained by culturing isolated from unfrozen peripheral blood monocytes as a control by flow cytometry,

도 4b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포의 표면항원 발현양상을 유세포형광분석기로 분석한 결과이고, Figure 4b is the result of analyzing the surface antigen expression pattern of immature dendritic cells obtained through culturing separated from frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention,

도 5a는 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포의 항원 포식능 여부를 분석한 결과이고,Figure 5a is a result of analyzing the antigen phagocytosis of immature dendritic cells obtained through culture by separating from the peripheral blood monocytes not frozen as a control,

도 5b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포의 항원 포식능 여부를 분석한 결과이고,Figure 5b is the result of analyzing the antigen phagocytosis of immature dendritic cells obtained through culturing separated from frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention,

도 6a는 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포를 성숙 배양시켜 얻은 성숙 수지상세포의 표면항원 발현양상을 유세포형광분석기로 분석한 결과이고, 6A is a result of analyzing the surface antigen expression pattern of mature dendritic cells obtained by maturation of immature dendritic cells obtained by culturing isolated from peripheral blood mononuclear cells which were not frozen as a control group,

도 6b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포를 성숙 배양시켜 얻은 성숙 수지상세포의 표면항원 발현양상을 유세포형광분석기로 분석한 결과이고, 6b is a result of analyzing the surface antigen expression pattern of mature dendritic cells obtained by maturing and culturing immature dendritic cells obtained by culturing isolated from frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention,

도 7a는 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포를 성숙 배양 시켜 얻은 성숙 수지상세포에 의한 티세포 (T cell)의 증식 유도여부를 분석한 결과이고,Figure 7a is a result of analyzing the proliferation induction of T cells by the mature dendritic cells obtained by maturing the immature dendritic cells obtained by culturing separated from the peripheral blood monocytes not frozen as a control,

도 7b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포를 성숙 배양시켜 얻은 성숙 수지상세포에 의한 티세포 (T cell)의 증식 유도여부를 분석한 결과이고,Figure 7b is a result of analyzing the proliferation induction of T cells by the mature dendritic cells obtained by maturing the immature dendritic cells obtained by culturing isolated from the frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention ,

도 8은 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구와 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 배양을 통해 얻어진 미성숙 수지상세포를 성숙 배양시켜 얻은 성숙 수지상세포에 의한 티세포 (T cell)의 인터페론감마의 분비능을 분석한 결과이고,FIG. 8 shows T cells caused by mature dendritic cells obtained by maturing and culturing immature dendritic cells obtained by culturing isolated from frozen frozen peripheral blood mononuclear cells and frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention. Result of analyzing the secretion ability of interferon gamma

도9a는 대조군으로서 냉동하지 않은 말초혈액단핵구에서 분리하여 21일간 배 양을 통해 얻어진 림프구의 표면항원을 분석한 결과이고, Figure 9a is a result of analyzing the surface antigen of lymphocytes obtained by 21 days culture by separating from the peripheral blood mononuclear cells not frozen as a control,

도9b는 본 발명에 따라 냉동 보존 후 융해한 말초혈액단핵구에서 분리하여 21일간 배양을 통해 얻어진 림프구의 표면항원을 분석한 결과이다.Figure 9b is the result of analyzing the surface antigen of the lymphocytes obtained through 21 days of culturing isolated from frozen peripheral blood mononuclear cells after cryopreservation according to the present invention.

Claims (3)

말초혈액단핵구를 분리하는 제1단계와, 상기 단핵구를 일정 기간 냉동한 후 보존하는 제2단계, 그리고 상기 냉동보존된 단핵구를 융해, 복원하는 제3단계로 이루어진 말초혈액단핵구의 보존방법에 있어서,1. A method of preserving peripheral blood monocytes, comprising: a first step of separating peripheral blood monocytes, a second step of preserving the monocytes after freezing for a period of time, and a third step of melting and restoring the cryopreserved monocytes, 상기 제2단계는, 5~15중량%의 DMSO, 1~20중량%의 펜타스타치(pentastarch), 1~20중량%의 알부민(albumin), 0.1~1중량%의 글루코오즈, 0.01~0.1중량%의 EDTA 및 나머지의 무혈청배지로 조합되는 동결보존배지에 말초혈액단핵구를 현탁하여 동결하여 보존하는 것을 특징으로 하는,The second step is 5 to 15% by weight of DMSO, 1 to 20% by weight of pentastar (pentastarch), 1 to 20% by weight of albumin (albumin), 0.1 to 1% by weight of glucose, 0.01 to 0.1 Characterized in that the peripheral blood mononuclear cells are suspended and frozen in cryopreservation medium combined with the weight percent EDTA and the remaining serum-free medium. 고농도 말초혈액단핵구의 장기간 냉동 보존 방법.Long term cryopreservation of high concentration peripheral blood monocytes. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 말초혈액단핵구를 상기 조성의 동결보존배지에 현탁하여 동결하여 보존함에 있어서는 온도를 -40℃까지 1℃/min의 속도로 떨어뜨리고 이후 -100℃까지는 10℃/min으로 떨어뜨린 후 액체질소탱크에서 -190~196℃로 보존하는 것을 특징으로 하는,In suspension and freezing the peripheral blood mononuclear cells in the cryopreservation medium of the composition, the temperature was dropped at a rate of 1 ° C./min to -40 ° C. and then dropped to 10 ° C./min to -100 ° C. in a liquid nitrogen tank. I save it at -190-196 degrees Celsius, 고농도 말초혈액단핵구의 장기간 냉동 보존 방법.Long term cryopreservation of high concentration peripheral blood monocytes. 제1항 또는 제2항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 말초혈액단핵구를 상기 조성의 동결보존배지에 현탁하여 동결함에 있어서는 보존되는 단핵구의 농도가 1×108 내지 1×1010 세포/mL의 농도가 되도록 하는 것을 특징으로 하는,When the peripheral blood monocytes are suspended and frozen in a cryopreservation medium of the above composition, the concentration of the monocytes to be preserved is 1 × 10 8 to 1 × 10 10 cells / mL, characterized in that 고농도 말초혈액단핵구의 장기간 냉동 보존 방법.Long term cryopreservation of high concentration peripheral blood monocytes.
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