KR20090055455A - Neuronal differentiation method of adult stem cells using small molecules - Google Patents

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Abstract

A method for differentiating an adult stem cell to a nerve cell using a small molecule compound is provided to treat central nervous disease such as Parkinson disease, dementia, alzheimer disease, and spinal cord injury. An adult stem cell is differentiated to a nerve cell using a small molecule compound as an inducer. The adult stem cell is derived from a bone marrow, skeletal muscle or adipose tissue. A small compound is a histon deacetylase inhibitor and comprises alkylthiobenximidazole compound, benzhydroxyamide compound, quinozaline hydrozamide compound, or acylaminomethyl hydroximide. A composition for treating the nerve disease comprises a differentiated nerve cell using the inducer. The nerve disease is Parkinson disease, dementia, Alzheimer disease, or spinal cord injury.

Description

저분자 화합물을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화방법{Neuronal differentiation method of adult stem cells using small molecules}Neuronal differentiation method of adult stem cells using small molecules}

본 발명은 저분자 화합물을 이용한 성체 줄기세포의 신경세포 분화방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for differentiating neural cells of adult stem cells using low molecular weight compounds.

의학적 발전의 눈부신 성과에도 불구하고 아직까지 현대의학이 고칠 수 없는 난치성 질환이 존재하고 있다. 중추신경계 질환이 가장 대표적으로 현대 사회에 접어들면서 산업 재해 및 교통사고에 의한 신경 손상이 증가하였으며, 선진 사회의 가장 큰 문제점인 퇴행성 신경계 질환의 증가로 인해 사회적 및 경제적 비용이 증가되고 있다. 신경계 질환 중 치료 가능성이 가장 높은 파킨슨씨병은 중뇌 흑핵(substantia nigra) 부분의 도파민 분비 세포(dopaminergic neuron)의 이상으로 온 몸의 골격근이 마비되는 증상을 보이며 현재 국내 10만 명의 환자가 있는 것으로 추정된다[Castano et al., J. Neurochem., 1998, 70:1584-1592]. 효과적인 치료방법이 부재한 가운데 1998년 신경 줄기세포를 분리하여 도파민을 분비하는 신경세포로 분화 유도에 성공하였으며, 파킨슨씨병 실험동물 모델에 이식 후 병의 호전을 보여 치료의 가능성을 보였다[McKay et al., Nat.Neurosci., 1998, 1(4):290-295]. 이는 재생이 불가능한 신경계 질환을 치료할 수 있는 가능성이 줄기세포에 있음을 보여주는 연구 성과라 할 수 있다. Despite the remarkable achievements of medical development, there are still intractable diseases that cannot be fixed by modern medicine. As central nervous system diseases enter the modern society most, nerve damage caused by industrial accidents and traffic accidents has increased, and social and economic costs have increased due to the increase of degenerative nervous system diseases, the biggest problem of advanced society. Parkinson's disease, the most treatable neurological disorder, is caused by paralysis of dopaminergic neurons in the substantia nigra area, causing paralysis of skeletal muscles of the entire body. Castano et al., J. Neurochem., 1998, 70: 1584-1592. In the absence of an effective treatment method, he successfully differentiated neural stem cells into dopamine-releasing neurons in 1998. After transplantation to Parkinson's disease experimental animal model, the disease showed improvement and showed the possibility of treatment [McKay et al. , Nat. Neurosci., 1998, 1 (4): 290-295]. This is a study showing that stem cells have the potential to treat non-renewable neurological diseases.

줄기세포란 세포 분열에 의해 무한한 자가 복재 능력과 적절한 세포 신호에 따라 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 전구세포를 말한다. 이러한 줄기세포는 본성 조절인자와 세포 외 환경인 니치(niche)에 따라 여러 세포로 분화할 수 있는 분화 유연성(differential plasticity)을 갖는다[Lee et al., Tissue engineering and regenerative medicine, 2005, 2(3):264-273]. 따라서, 분화 유연성에 영향을 주는 발생 단계에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell-이하 ESC) 및 성숙된 조직에 존재하는 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분할 수 있다. 배아 줄기세포(ESC)는 수정 후 14일 이내의 초기 배아 낭포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리(inner cell mass)로부터 추출되며 무한한 분화능력을 가지나 생명의 존엄성에 관한 윤리적 문제점과 종양을 형성할 수 있는 위험성을 갖고 있다. 성체 줄기세포(adult stem cell)는 성인이 된 후에 발생하는 유전적 및 병리학적으로 발생하는 세포 손상을 복원하기 위해 존재하며 배아 줄기세포에 비하여 제한된 분화능력을 가지나 안정적 적용이 가능하다.Stem cells are progenitor cells that have the capacity to differentiate into specific cells according to infinite self-cloning ability and appropriate cell signals by cell division. These stem cells have differential plasticity that can differentiate into multiple cells depending on the nature of the regulator and the extracellular environment niche [Lee et al., Tissue engineering and regenerative medicine, 2005, 2 (3). ): 264-273]. Therefore, embryonic stem cells (ESCs) and adult stem cells present in mature tissues may be classified according to developmental stages that affect differentiation flexibility. Embryonic stem cells (ESCs) are extracted from the inner cell mass of the early embryonic blastocyst within 14 days of fertilization and have infinite differentiation capacity but can form tumors with ethical issues about the dignity of life. It is dangerous. Adult stem cells exist to restore genetic and pathological cell damage occurring after adulthood and have a limited differentiation capacity compared to embryonic stem cells, but can be applied stably.

신경계 질환에 적용하기 위한 대표적 성체 줄기세포로 신경유래 줄기세포가 있다. 하지만 이 줄기세포는 뇌실하 영역(subventricular zone) 및 해마와 같이 뇌의 특정 부위에 존재하며 실제 치료에 적용하기 위해 충분한 세포를 얻을 수 없으며 분리가 어려운 문제가 제기되고 있다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow derived stem cell), 골격근 유래 줄기세포(muscle derived stem cell) 및 지방유래 줄기세포(adipose derived stem cell)는 실험관 내(in vitro)에서 스스로 복제능력(self renewing)을 보이며 적절한 분화 환경에서 골, 연골 및 지방세포로 분화가 가능한 성체 줄기세포로 분리 및 배양이 용이한 장점이 있다. 또한, 골수, 골격근 및 지방 유래 줄기세포의 신경세포로 교차 분화 능력이 보고됨에 따라 중추신경계 치료를 위한 세포원으로 가능성이 제기되고 있다[Pittenger et al., Science, 1999, 284(2):143-147; Huard et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2004,15(5):419-23]. 난치성 중추신경계를 치료하기 위한 줄기세포의 적용을 향상시키기 위한 방법으로 신경세포로의 분화를 유도하기 위하여 특정 유전자를 도입 시키는 방법이 있다[Low et al., Cell Mol. Neurobiol, 2007, 27(5):75-85; Kim et al., Eur. J. Neurosci., 2002,16(10):1829-1838]. 그러나, 생명체 단백질은 동시에 여러 기능을 수행하기 때문에 특정 유전자를 완전 제거하였을 경우 발생 가능한 부작용을 예상할 수 없다는 단점이 있다. Representative adult stem cells for application to neurological diseases are neuron stem cells. However, these stem cells are present in specific areas of the brain such as the subventricular zone and hippocampus, and sufficient cells cannot be obtained for actual treatment, and problems are difficult to isolate. Bone marrow derived stem cells, skeletal muscle derived stem cells and adipose derived stem cells are self renewing in vitro. It is easy to separate and culture into adult stem cells that can differentiate into bone, cartilage and adipocytes in an appropriate differentiation environment. In addition, the cross-differentiation ability of bone marrow, skeletal muscle and adipose-derived stem cells into neurons has been reported to raise the possibility as a cell source for the treatment of central nervous system [Pittenger et al., Science, 1999, 284 (2): 143 -147; Huard et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2004, 15 (5): 419-23]. As a method for improving the application of stem cells to treat the refractory central nervous system, there is a method of introducing a specific gene to induce differentiation into neurons [Low et al., Cell Mol. Neurobiol, 2007, 27 (5): 75-85; Kim et al., Eur. J. Neurosci., 2002, 16 (10): 1829-1838]. However, since living protein performs several functions at the same time, there is a disadvantage in that it is impossible to predict possible side effects when a specific gene is completely removed.

저분자 화합물은 생체 단백질 및 유전자와 같은 고분자에 표적성을 갖고 결합하여 다양한 생물학적 경로 및 신호를 조절하는 물질로 선택적 질환에 대한 신약 후보 가능성을 갖고 있다. 따라서, 저분자 화합물을 이용하였을 때 표적 물질에 대한 선택성을 가지고 이식한 줄기세포의 줄기세포성 혹은 분화방향을 효율적으로 조절할 수 있다[Ding et al., Curr Opin Chem Biol., 2007,11(3):252-230; Schultz et al., Nat Bitechnol, 2004, 22(7):833-840].Small molecule compounds have the potential to be drug candidates for selective diseases as substances that target and bind to polymers such as biological proteins and genes to regulate various biological pathways and signals. Therefore, when the small molecule compound is used, the stem cell characteristics or the differentiation direction of the transplanted stem cells can be efficiently controlled with selectivity to the target material. [Ding et al., Curr Opin Chem Biol., 2007, 11 (3) : 252-230; Schultz et al., Nat Bitechnol, 2004, 22 (7): 833-840.

줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위하여 가장 많이 사용되고 있는 방법은 디메틸설폭사이드(demethylsulfoxide)와 부틸히드록실아니솔(butylated hydroxyanisole-MW 180.2) 혼합물을 이용하는 것이다. 이 혼합물에 의한 신경세포 분화유도는 형태적 변화 및 신경세포 특이적 유전자 발현을 보였으나, 신경세포뿐만 아니라 교세포로 분화되는 비 특이성을 보이며 심각한 세포독성을 보여 장기간 분화 유지가 불가능하여 개선책이 필요한 실정이다[Black et al., J. Neurosci. Res., 2000, 61:364-370].The most widely used method to differentiate stem cells into neurons is to use a mixture of dimethylsulfoxide and butylated hydroxyanisole-MW 180.2. Induction of neuronal differentiation by this mixture showed morphological changes and neuronal specific gene expression, but it showed non-specificity to differentiate into glial cells as well as neurons and showed severe cytotoxicity, so it was impossible to maintain long-term differentiation. Black et al., J. Neurosci. Res., 2000, 61: 364-370.

최근 퓨린계(purines), 피리미딘계(pyrimidines) 및 퀴나졸린계(quinazolines)와 같은 수많은 저분자 화합물이 분리되어 전구세포의 자가 복재와 선택적 분화를 조절할 수 있는 강력한 도구로 연구 가능성이 제시되고 있다. 예를 들어, DNA 디메틸 화합물인 5-아자사이티딘(azacytidine)-C를 이용하여 마우스 중간엽 전구세포의 근육 세포로의 분화가 보고된 바 있다[Lassar et al., Cell, 1986,47(649-656)]. 또한, 저분자 화합물 뉴로패티아졸(neuropathiazol)을 이용한 신경전구세포의 신경세포 분화가 보고되었다[Ding et al., Angewandte Chemie., 2006, 118(4):605-607]. 또한, 신경계 질환 동물모델에 줄기세포 이식이 손상된 조직을 복원하고 내재적 신경세포의 성장을 촉진한다는 보고가 제기되었다[Shetty et al., Stem Cells., 2007, 25(8):2014-2017]. 그러나, 저분자 화합물을 이용한 성체 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화에 관한 연구 성과는 부진한 상태이다.Recently, many small-molecule compounds such as purines, pyrimidines and quinazolines have been separated, suggesting the possibility of research as a powerful tool for controlling self-reproduction and selective differentiation of progenitor cells. For example, differentiation of mouse mesenchymal progenitor cells into muscle cells using 5-azacytidine-C, a DNA dimethyl compound, has been reported [Lassar et al., Cell, 1986,47 (649). -656)]. In addition, neuronal differentiation of neural progenitor cells using the low molecular weight compound neuropathiazol has been reported [Ding et al., Angewandte Chemie., 2006, 118 (4): 605-607]. In addition, reports have been made that stem cell transplantation restores damaged tissues and promotes intrinsic neuronal growth in neurological disease animal models (Shetty et al., Stem Cells., 2007, 25 (8): 2014-2017). However, research on neuronal differentiation of adult mesenchymal stem cells using low molecular weight compounds is poor.

따라서, 저분자 화합물을 이용한 성체 중간엽 줄기세포의 신경세포 분화 유도는 난치성 중추신경재생을 위해 필요성이 증대되고 있다. Therefore, neural cell differentiation induction of adult mesenchymal stem cells using low molecular weight compounds is increasing the need for refractory central nerve regeneration.

이에, 본 발명자들은 중추신경계 재생을 위한 세포원으로 골수 유래, 골격근 유래 및 지방 유래 줄기세포를 분리 배양하고 저분자 화합물을 이용한 신경세포 분화를 분자생물학적 도구를 이용하여 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors completed the present invention by separating and culturing bone marrow-derived, skeletal muscle-derived and adipose-derived stem cells as cell sources for regeneration of the central nervous system, and confirming the differentiation of neurons using low molecular weight compounds using molecular biological tools.

따라서, 본 발명의 목적은 골수, 골격근 및 지방조직에서 분리된 줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위한 세포원으로 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a cell source for differentiating stem cells isolated from bone marrow, skeletal muscle and adipose tissue into neurons.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 저분자 화합물을 이용하여 줄기세포를 신경세포로 분화시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a method for differentiating stem cells into neurons using a low molecular weight compound.

본 발명은 저분자 화합물을 이용하여 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for differentiating adult stem cells into neurons using a low molecular weight compound.

본 발명은 상기와 같은 방법으로 분화된 신경세포를 파킨슨씨 병, 알츠하이머 병 및 척수신경 손상과 같은 난치성 중추신경계 질환에 유용성이 있는 세포 치료용 조성물로 사용할 수 있다.The present invention can be used as a composition for treating cells that are useful for refractory central nervous system diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease and spinal nerve injury.

본 발명은 저분자 화합물을 이용하여 성체 줄기세포를 분화시켰을 때 성공적으로 신경세포 분화를 유도할 수 있고 분화된 성체 줄기세포는 파킨슨씨병, 치매, 알츠하이머 병 및 척수손상과 같은 중추신경계 질환에 치료적 세포원으로 폭넓게 사용될 수 있다.The present invention can successfully induce neuronal differentiation when differentiating adult stem cells using small molecule compounds, and differentiated adult stem cells are therapeutic cells for central nervous system diseases such as Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease and spinal cord injury. It can be widely used as a circle.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.The present invention will be described in more detail as follows.

본 발명은 신경세포로의 효과적 분화가 가능하며 이를 통해 재생이 불가능한 파킨슨씨병, 치매, 알츠하이머 병 및 척수손상과 같은 중추신경계 질환을 치료하는데 유효한 저분자 화합물을 이용하여 성체 줄기세포를 신경세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention enables effective differentiation into neurons and induces adult stem cells into neurons using small molecule compounds effective for treating central nervous system diseases such as Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease and spinal cord injury that are impossible to reproduce. It is about how to.

먼저, 본 발명에서 사용된 성체 줄기세포에 관해 설명하면 다음과 같다.First, when describing the adult stem cells used in the present invention.

줄기세포는 체내에서 손상된 세포 혹은 조직의 기능을 복원 및 대체할 수 있는 특징을 가지고 있으며 적절한 분화 환경에서 다른 성질을 갖는 세포로 분화할 수 있는 전구세포를 의미한다. 이러한 줄기세포의 특성을 이용하여 재생이 불가능한 신경세포를 복원하여 난치성 중추신경계 질환을 치료할 수 있는 많은 가능성이 제시되고 있다.Stem cells refer to progenitor cells that have the characteristics of restoring and replacing the function of damaged cells or tissues in the body and can differentiate into cells having different properties in an appropriate differentiation environment. By using the characteristics of these stem cells to restore the non-renewable nerve cells have been proposed a lot of possibilities to treat the refractory central nervous system diseases.

골수, 골격근 및 지방 유래 줄기세포는 실험관 내(in vitro)에서 뛰어난 자가 재생(self renewing) 능력을 가지며 쉽게 분리할 수 있는 성체 줄기세포로 배아 줄기세포의 윤리적 문제점을 배제할 수 있는 장점을 가지며, 이들의 신경세포로의 분화 가능성은 세포 치료의 새로운 가능성을 보여준다.Bone marrow, skeletal muscle and adipose derived stem cells have excellent self renewing ability in vitro and are easily detachable adult stem cells that have the advantage of eliminating ethical problems of embryonic stem cells. Their potential for differentiation into neurons shows new possibilities for cell therapy.

이들 줄기세포의 분리, 배양 및 표면 발현 항원은 실시예 1에서 상세하게 설명하였다.Isolation, culture and surface expression of these stem cells were described in detail in Example 1.

저분자 화합물은 세포의 선택적 분화 조절을 통해 생명현상을 이해하기 위한 유용한 툴로 사용될 수 있다. 유전학적 조작은 유전자 게놈 지도가 완성된 이 래로 세포 조절기작을 연구하는데 보편적으로 사용되었던 방법으로 유전자의 점 돌연변이(point mutation) 혹은 녹아웃(knock out)을 통해 특정 유전자의 기능을 연구하는 유용한 기술이나 비가역성을 갖으며 원하는 시기에 작용시키기 어려운 단점이 있다. 그러나, 저분자 화합물은 가역적 기능조절이 가능하며 원하는 시기에 작용시킬 수 있어 유용하다.Small molecule compounds can be used as useful tools for understanding life phenomena through the regulation of selective differentiation of cells. Genetic manipulation is a method commonly used to study cellular regulatory mechanisms since the completion of gene genomic maps. It is a useful technique or irreversible study of the function of a particular gene through point mutations or knock outs of the gene. It has a disadvantage that is difficult to act at the desired time. However, low molecular weight compounds are useful because they can be reversibly modulated and function at desired times.

본 발명에서 사용되는 저분자 화합물은 예를 들면, 퓨린(purines)계 화합물, 피리미딘(pyrimidines)계 화합물, 퀴나졸린(quinazolines)계 화합물, 피라진(pyrazines)계, 피롤피리미딘(pyrrolopyrimidine)계 화합물, 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine)계 화합물, 패타라진(phthalazines)계 화합물, 피리다진(pyridazines)계 화합물 및 퀴노잘린(quinozalines)계 화합물 중에서 선택된 1종 이상이 바람직하다. The low molecular weight compounds used in the present invention may be, for example, purines compounds, pyrimidines compounds, quinazolines compounds, pyrazines compounds, pyrrolopyrimidine compounds, At least one selected from pyrazolopyrimidine-based compounds, phthalazine-based compounds, pyridazines-based compounds, and quinozalines-based compounds is preferable.

본 발명에서 사용된 저분자 화합물은 알킬티오벤즈이미다졸(Alkylthiobenximidazole)계 화합물, 벤즈하이드록사마이드(Benzhydroxyamide)계 화합물, 퀴녹살린 하이드록사마이드(Quinozaline hydrozamide)계 화합물 및 아실아미노메틸 하이드록사마이드(Acylaminomethyl hydroximide)계 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 복합체로서, 상기 화합물은 히스톤 탈아세틸 효소 억제제(이하, 'HDAC 저해제')로서 크로마틴을 아세틸화시켜 세포증식 억제인자 및 분화 유도에 필수적인 유전자의 발현을 촉진시켜 종양 유전자의 분화를 유도하고 신생혈관 형성을 억제하여 궁극적으로 세포를 사멸시키는 항암 활성을 보여 항암제 신약 합성의 중요한 표적이 된다[Sausville et al., The Oncologist., 2001,6:517-537].The low molecular weight compounds used in the present invention are alkylthiobenzimidazole-based compounds, benzhydroxyamide-based compounds, quinoxaline hydrozamide-based compounds and acylaminomethyl hydroxyamides. (Acylaminomethyl hydroximide) -based compound selected from the group consisting of one or two or more, wherein the compound is a histone deacetylase inhibitor (hereinafter referred to as 'HDAC inhibitor') to acetylate chromatin to inhibit cell proliferation factor and genes necessary for inducing differentiation It is an important target for the synthesis of anticancer drugs by promoting the expression of tumor genes, inducing differentiation of tumor genes, inhibiting angiogenesis and ultimately killing cells [Sausville et al., The Oncologist., 2001, 6: 517-537].

본 발명에서 상기 저분자 화합물은 1 nM ~ 100 μM을 사용하는 것이 바람직하며, 만일 1 nM 미만에서는 분화 효과가 미비하며, 100 μM을 초과하면 화합물 결정이 형성되며, 또한 세포 독성을 보이므로 5 ~ 30 μM 농도로 적용하는 것이 바람직하다.In the present invention, the low molecular weight compound is preferably used 1 nM ~ 100 μM, if less than 1 nM differentiation effect is insufficient, if it exceeds 100 μM compound crystals are formed, and also shows cytotoxicity 5 ~ 30 It is preferable to apply at a concentration of μM.

본 발명에서 사용된 저분자 화합물은 다음 표 1에 나타낸 알킬티오벤즈이미다졸(Alkylthiobenzimidazole)계 화합물, 벤즈하이드록사마이드(Benzhydroxyamide)계 화합물, 퀴녹살린 하이드록사마이드(Quinoxaline hydroxamide)계 화합물, 아실아미노메틸 하이드록사마이드(Acylaminomethyl hydroxyamide)계 화합물이다.The low molecular weight compounds used in the present invention include alkylthiobenzimidazole-based compounds, benzhydroxyamide-based compounds, quinoxaline hydroxamide-based compounds, and acylamino compounds shown in Table 1 below. Methyl hydroxyamide (Acylaminomethyl hydroxyamide) compound.

Figure 112008024056133-PAT00001
Figure 112008024056133-PAT00001

본 발명에 따르면 상기 저분자 화합물을 이용하여 분화를 유도한 결과, 형태학적 분석, 세포면역화학 염색 및 RT-PCR을 통해 신경세포로 분화함을 확인할 수 있었다. 이때, 분화된 줄기세포를 신경세포 마커로 선별하여 순수한 신경세포를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 신경세포의 사멸에 의한 난치성 중추신경계 질환에 유용한 치료방법이 될 수 있다.According to the present invention, as a result of inducing differentiation using the low molecular weight compound, it was confirmed that differentiation into neurons was carried out through morphological analysis, cytoimmunochemical staining and RT-PCR. At this time, the differentiated stem cells can be selected with neuronal markers to obtain pure neurons. Therefore, the present invention can be a useful therapeutic method for intractable central nervous system diseases caused by the death of neurons.

따라서, 본 발명에 따른 신경세포 분화방법으로 얻어진 분화된 신경세포를 함유하는 신경질환 치료용 조성물을 포함할 수 있다.Therefore, it may include a composition for treating neurological diseases containing differentiated neurons obtained by the neuronal cell differentiation method according to the present invention.

상기 신경질환은 파킨슨씨병, 치매, 알츠하이머 병, 척수손상과 같은 중추신경계 질환을 의미한다.The neurological disease refers to diseases of the central nervous system such as Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease, and spinal cord injury.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 다음 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 특히, 선 출원된 제2007-0128788호에 줄기세포 분리 및 배양에 대한 상세한 설명을 모두 포함한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples. In particular, the previously filed 2007-0128788 includes all the details of stem cell isolation and culture.

실시예 1 : 성체 줄기세포의 분리 및 배양 Example 1 Isolation and Culture of Adult Stem Cells

본 실시예는 신경세포 분화 세포원으로 골수, 골격근 및 지방유래 줄기세포의 분리 및 배양에 관한 것이다. This example relates to the isolation and culture of bone marrow, skeletal muscle and adipose derived stem cells as neuronal differentiation cell sources.

(단계 1) 줄기세포 분리(Step 1) Stem Cell Isolation

첫 번째 세포원으로 골수 유래 줄기세포의 분리이다. The first cell source is the isolation of bone marrow-derived stem cells.

골수 유래 줄기세포를 분리하기 위하여 60 ~ 80 g Fischer 쥐의 대퇴골과 하퇴골을 분리하여 1 ㎖ 주사기를 이용하여 인산완충용액(phosphate buffered saline-Gibco Life Technology, Germany)을 관류하여 골내강의 세포를 획득하여 원심분리를 통하여 분리하였다. 10% 우태혈청과 1% 항생제가 들어있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium-Gibco Life Technology, Germany) 배양액을 이용하여 배양하였다. To separate bone marrow-derived stem cells, 60-80 g Fischer rat femurs and lower femurs were isolated and perfused with phosphate buffered saline (Gibco Life Technology, Germany) using a 1 ml syringe to obtain intraosseous cells. By centrifugation. Culture was performed using Dulbecco's Modified Eagle Medium-Gibco Life Technology, Germany (DMEM) containing 10% fetal calf serum and 1% antibiotic.

두 번째 세포원으로 골격근 유래 줄기세포의 분리이다. The second cell source is the isolation of skeletal muscle-derived stem cells.

골격근 유래 줄기세포를 분리하기 위해 60 ~ 80 g Fischer 쥐의 대퇴부에서 골격근을 분리하여 콜라겐 분해 효소를 이용하여 세포를 분리하였다. 분리한 세포는 5% 우태혈청, 5% 말혈청 및 2% 항생제를 첨가한 DMEM 배양액에 부유시킨 후 콜라겐을 코팅한 세포배양 플라스크에 분주하였다. 1시간이 지난 후 세포배양 플라스크로부터 상층액을 모아 원심 분리하여 배양액으로 세척을 한 후 새로운 세포배양 플라스크에 분주하였다. 이 1시간 이내에 대부분의 섬유아세포가 플라스크 바닥에 부착하게 되고 세포배양 플라스크에 섬유아세포가 30 ~ 40% 정도 차게 되면 다시 상층액을 모아 원심분리를 하고 배양액으로 세척하여 새로운 플라스크에 분주하였다. 그 후 2시간이 지난 후와 1, 2, 및 3일이 되는 날 같은 과정을 반복하여 골격근 유래 줄기세포를 분리하였다. In order to separate the stem cells derived from the skeletal muscle, skeletal muscle was isolated from the thigh of 60-80 g Fischer rats, and the cells were separated using collagenase. The isolated cells were suspended in DMEM culture medium containing 5% fetal calf serum, 5% horse serum and 2% antibiotics, and then dispensed into collagen-coated cell culture flasks. After 1 hour, the supernatant was collected from the cell culture flask, centrifuged, washed with the culture solution, and then dispensed into a new cell culture flask. Within 1 hour, most of the fibroblasts adhered to the bottom of the flask, and when the fibroblasts became 30-40% of the cell culture flask, the supernatant was collected, centrifuged, washed with culture, and dispensed into a new flask. After 2 hours and 1, 2, and 3 days the same process was repeated to isolate the skeletal muscle derived stem cells.

세 번째 세포원으로 지방 유래 줄기세포의 배양이다. The third cell source is the culture of adipose derived stem cells.

지방 유래 줄기세포를 분리하기 위하여 60 ~ 80 g의 Fischer 쥐의 복부 지방을 분리하여 콜라겐 분해 효소 처리를 거친 후 세포를 분리하였다. 10% 우태혈청과 1% 항생제가 들어있는 DMEM 배양액를 이용하여 세포를 배양하였다.In order to separate adipose-derived stem cells, abdominal fat of 60-80 g of Fischer rats was isolated and subjected to collagenase treatment. Cells were cultured using DMEM medium containing 10% fetal calf serum and 1% antibiotic.

(단계 2) 줄기세포 배양(Step 2) Stem Cell Culture

상기 단계 1에서 분리된 줄기세포를 103 ~ 104 세포/cm2의 농도로 배양 플라스크에 파종한 후 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양한 세포는 3 일에 한 번씩 배양액을 교체해 주었으며 배양 플라스크의 70% 이상 성장하면 0.05% 트립신을 5분간 처리하여 단일 세포로 만든 후 계대 배양하였다[도 1]. Stem cells isolated in step 1 were seeded in a culture flask at a concentration of 10 3 to 10 4 cells / cm 2 and then cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. The cultured cells were replaced with a culture solution once every 3 days, and when more than 70% of the culture flask was grown, 0.05% trypsin was treated for 5 minutes to make single cells and then passaged (FIG. 1).

(단계 3) 줄기세포 표면 항원 확인(Step 3) Stem Cell Surface Antigen Identification

상기 단계 1에서 분리된 줄기세포를 0.05% 트립신을 처리하여 단일 세포로 만든 다음 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 각 세포에 조혈모세포(Hematopoietic stem cell) 마커인 CD45(Chemicon, Temecula, CA)와 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell) 마커인 CD44(Chemicon, Temecula, CA)에 대한 항체 처리하고 4 ℃에서 30분간 처리하였다. 인산완충용액으로 3번 세척하고 인산완충용액 30 ㎕를 넣어 완충시킨 후 FACS(BD Biosciences, San Jose, CA) 분석기로 줄기세포 표면에서 발현되는 항원을 확인한다.Stem cells isolated in step 1 were treated with 0.05% trypsin to form single cells, and then washed twice with phosphate buffer solution. Each cell was treated with antibodies against CD45 (Chemicon, Temecula, CA), a hematopoietic stem cell marker, and CD44 (Chemicon, Temecula, CA), a mesenchymal stem cell marker, and 30 minutes at 4 ° C. Treated. After washing three times with phosphate buffer solution and buffering with 30 μl of phosphate buffer solution, the antigen expressed on the surface of stem cells is confirmed by FACS (BD Biosciences, San Jose, CA) analyzer.

그 결과, 98% 이상의 CD44 발현과 1% 미만의 CD45 발현을 보였으며 순수한 중간엽 줄기세포의 분리를 확인하였다[도 2].As a result, 98% or more CD44 expression and less than 1% CD45 expression were observed and the isolation of pure mesenchymal stem cells [FIG. 2].

실시예 2 : 화합물을 이용한 줄기세포의 신경세포 분화Example 2 Neuronal Differentiation of Stem Cells Using Compounds

본 실시예는 상기 실시예 1에서 분리한 성체 줄기세포의 신경세포 분화 유도에 관한 것이다.This example relates to the induction of neuronal differentiation of adult stem cells isolated in Example 1.

다섯 번 계대 배양한 골수 유래 줄기세포를 웰 플레이트에 분주, 하루 후 20% 우태혈청, 10 ng/㎖ b-FGF를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium )을 하루 동안 처리하여 세포의 증식이 충분히 이루어질 수 있게 하였다. 신경세포 분화 유도를 위하여, 상기 표 1에 기술한 저분자 화합물인 Hee-1039, Hee-2013, Hee-2073, Hee-3025, Hee-4029, Hee-4016 및 Hee-4135를 각각 함유한 분화 유도 배지를 처리하였다. 상기 화합물은 디메틸설폭사이드(demethylsulfoxide,Sigma, USA)에 녹여 사용하였으며 디메틸설폭사이드의 농도는 전체 배양액의 2% 미만으로 하였고 화합물의 1 μM에서 100 μM의 농도를 가지도록 희석하여 사용하였다. 음성 대조군으로는 10% 우태혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM을 사용하였으며 양성 대조군으로는 신경분화 유도 물질로 잘 알려져 있는 레티놀산을 2 μM로 DMEM에 희석하여 사용하였다. 골격근 유래 줄기세포 및 지방 유래 줄기세포 또한 골수 유래 줄기세포와 동일한 방법으로 신경세포 분화를 유도하였다.Five passages of bone marrow-derived stem cells were dispensed into well plates, and after one day, DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) containing 20% fetal calf serum and 10 ng / ml b-FGF was treated for one day. Made it possible. To induce neuronal differentiation, differentiation induction medium containing Hee-1039, Hee-2013, Hee-2073, Hee-3025, Hee-4029, Hee-4016 and Hee-4135, respectively, described in Table 1 above Was treated. The compound was used by dissolving in dimethylsulfoxide (demethylsulfoxide, Sigma, USA) and the concentration of dimethyl sulfoxide was less than 2% of the total culture solution and diluted to have a concentration of 1 μM to 100 μM of the compound. As a negative control, DMEM containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin was used. As a positive control, 2 μM of retinol acid, a well-known neuron differentiation inducing substance, was diluted in DMEM. Skeletal muscle-derived stem cells and adipose-derived stem cells also induced neuronal differentiation in the same way as bone marrow-derived stem cells.

그 결과, 신경세포와 유사한 세포질의 응축과 길게 뻗는 신경돌기의 형성을 확인하였다[도 3 및 도 4].As a result, the condensation of the cytoplasm and the formation of elongated neurites similar to the neurons were confirmed (FIGS. 3 and 4).

실시예 3 : 화합물의 줄기세포에 미치는 독성평가Example 3 Toxicity Assessment of Stem Cells of Compounds

본 실시예는 상기 실시예 2의 성체 줄기세포의 신경세포 분화유도 과정에서 저분자 화합물의 줄기세포에 미치는 독성을 평가하기 위한 것이다.This example is for evaluating the toxicity of the stem cells of the small molecule compound in the process of inducing differentiation of adult stem cells of Example 2.

MTT 분석법은 미토콘드리아의 탈수소효소작용에 의하여 노란색 수용성 MTT 테트라졸리움(tetrazolium)을 자주색을 띄는 비수용성의 MTT 포마전(formazan)으로 환원시키는 원리를 이용한 방법으로 포마전의 농도는 살아있고 대사적으로 왕성한 세포의 농도를 반영하였다. MTT 분석을 위하여 골수 및 골격근 유래 줄기세포를 24 웰 플레이트에 3 × 104 cells/well의 농도로 분주하고 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 상기 실시예 2에서의 신경세포 분화 유도 과정에 따라 배양액을 처리하고 1일 및 4일이 되는 각 시간에 맞추어 기존의 배양액을 제거하고 새로운 배양액 1 ㎖을 첨가하였다. MTT assay is based on the principle of reducing the yellow water-soluble MTT tetrazolium to purple water-insoluble MTT formazan by the dehydrogenase action of mitochondria. The concentration of was reflected. For MTT analysis, bone marrow and skeletal muscle-derived stem cells were dispensed in 24 well plates at a concentration of 3 × 10 4 cells / well and incubated for one day in an incubator. The culture solution was treated according to the neural cell differentiation induction process in Example 2, and the existing culture solution was removed at each time of 1 day and 4 days, and 1 mL of a new culture solution was added.

우선, 2 μM, 10 μM 및 100 μM의 농도 구배로 세포 독성을 평가하였으며[도 5], 세포에 처리하기에 최적 농도가 10 μM이므로 모든 실험에 개별적으로 10 μM씩 처리하였다. 그 후 5 mg/㎖의 농도를 갖는 MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 100 ㎕씩 넣고 4시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 보라색의 결정이 생성되면 배양액과 MTT 용액을 제거하고 디메틸설폭사이드(demethylsulfoxide) 용액 1 ㎖을 넣어 결정이 완전히 녹을 때까지 30분 교반하였다. 96 웰 플레이트에 샘플을 100 ㎕씩 분주하고 ELISA 플레이트 리더기(E-max, Molecular Device, USA)를 이용하여 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다[도 6]. First, cytotoxicity was evaluated at concentration gradients of 2 μM, 10 μM and 100 μM [FIG. 5], and the optimal concentration for processing to cells was 10 μM, so all experiments were individually treated with 10 μM. Thereafter, 100 μl of MTT (3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) solution having a concentration of 5 mg / ml was added thereto and incubated in a 37 ° C. incubator for 4 hours. When the purple crystals were produced, the culture solution and the MTT solution were removed, and 1 ml of dimethylsulfoxide solution was added and stirred for 30 minutes until the crystals were completely dissolved. 100 μl of the sample was dispensed into a 96 well plate and the absorbance was measured at a wavelength of 590 nm using an ELISA plate reader (E-max, Molecular Device, USA) [FIG. 6].

실시예 4 : 세포면역화학염색을 이용한 신경세포 분화 확인Example 4 Confirmation of Neuronal Differentiation Using Cell Immunochemical Staining

본 실시예는 상기 실시예 2의 상기 화합물을 이용해 분화된 성체 줄기세포에서 발현되는 신경세포 마커인 Tuj1과 NSE 및 신경교세포 중 별아교세포의 마커인 GFAP 및 희소돌기아교세포의 마커인 CNPase의 발현을 확인하기 위한 것이다. In this embodiment, Tuj1, a neuronal marker expressed in adult stem cells differentiated using the compound of Example 2, and expression of CNPase, a marker of GFAP and oligodendrocytes, which are markers of astrocytic cells among NSE and glial cells, were expressed. It is to confirm.

세포면역화학 염색법은 항체를 이용하여 세포에서 발현되는 단백질을 확인하는 방법이다. Cytoimmunochemical staining is a method for identifying proteins expressed in cells using antibodies.

먼저, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, Sigma, USA)를 20분간 처리하여 고정하고, 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 3% 과산화수소를 10분간 처리하여 세포 내부 과산화수소 분해효소(peroxidase)를 억제하고 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 1% BSA(Bovine serum albumin)로 30분간 처리하고 1:100 (Tuj1-Chemicon, Temecula, CA)및 1:20 (NSE-Serotec, Oxford, UK)으로 희석된 일차항체를 1시간 30분간 처리하고 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 바이오틴(biotin)이 접합된 이차항체를 20분간 처리하고 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 30분간 스트렙아비딘(streptavidine)을 처리한 다음 인산완충용액으로 2번 세척 후 DAB으로 발색을 확인하고 헤마토실린(hematoxylin)을 이용해 대조 염색을 실시하였다. 또한, 형광 염색을 위하여, 분화된 세포를 4% 파라포름알데하이드로(paraformaldehyde, Sigma, USA) 고정하여 인산완충용액으로 2회 세척하고 1% BSA(Bovine serum albumin)로 30분간 처리하고 1:100 (Tuj1-Chemicon, Temecula, CA)및 1:20 (NSE-Serotec, Oxford, UK), 1:300 (GFAP-Sigma Chemicals, UK) 및 1:100 (CNPase-Sigma Chemicals, UK)으로 희석된 일차항체를 16시간 4 ℃에서 처리하였다. 인산완충용액으로 2회 세척 하고 1:1000으로 희석된 이차항체를(rat anti-mouse Alexa Fluor® 594, Invitrogen) 3시간 처리하고 DAPI로 대조염색을 실시하였다.First, 4% paraformaldehyde (paraformaldehyde, Sigma, USA) was treated for 20 minutes and fixed, and washed twice with phosphate buffer solution. 10% treatment with 3% hydrogen peroxide inhibited intracellular hydrogen peroxidase and was washed twice with phosphate buffer solution. Treatment with 1% BSA (Bovine serum albumin) for 30 minutes and treatment with primary antibody diluted 1: 100 (Tuj1-Chemicon, Temecula, CA) and 1:20 (NSE-Serotec, Oxford, UK) for 1 hour 30 minutes Washed twice with phosphate buffer solution. Biotin conjugated secondary antibody was treated for 20 minutes and washed twice with phosphate buffer solution. After treatment with streptavidin for 30 minutes, washing twice with phosphate buffer solution, color development was confirmed with DAB, and control staining was performed using hematoxylin. In addition, for fluorescent staining, the differentiated cells were fixed with 4% paraformaldehyde (paraformaldehyde, Sigma, USA), washed twice with phosphate buffer solution, treated with 1% BSA (Bovine serum albumin) for 30 minutes, and then 1: 100. (Tuj1-Chemicon, Temecula, CA) and 1:20 (NSE-Serotec, Oxford, UK), 1: 300 (GFAP-Sigma Chemicals, UK) and 1: 100 (CNPase-Sigma Chemicals, UK) Antibodies were treated at 4 ° C. for 16 hours. Washed twice with PBS and 1: 1000 secondary antibody treatment the (rat anti-mouse Alexa Fluor ® 594, Invitrogen) diluted in 3 hours and was subjected to contrast staining with DAPI.

그 결과, 분화된 줄기세포에서 신경세포 마커인 Tuj1 및 NSE의 발현을 확인하였다. 이는 양성 대조군인 레티놀산과 동일한 결과로서 화합물을 이용한 신경세포분화를 확인할 수 있었다[도 7]. 또한, 신경세포 분화를 형광 현미경으로 확인할 수 있었다[도 8].As a result, the expression of the neuronal markers Tuj1 and NSE in the differentiated stem cells was confirmed. This could confirm neuronal differentiation using the compound as a result of the positive control retinol acid [Fig. 7]. In addition, neuronal differentiation could be confirmed by fluorescence microscopy [FIG. 8].

실시예 5 : RT-PCR을 이용한 신경세포 분화 확인Example 5 Confirmation of Neuronal Differentiation Using RT-PCR

본 실시예는 상기 실시예 2의 상기 화합물을 이용해 분화된 성체 줄기세포의 신경세포 유전자의 발현을 확인한 것이다. This example confirms the expression of neuronal genes of adult stem cells differentiated using the compound of Example 2.

RT-PCR(Reverse transcriptase polymerase chain reaction)은 세포가 발현하는 RNA를 역전사 과정을 통해 cDNA로 변환시킨 후 PCR 과정을 통해 유전자를 선택적 증폭시키는 방법으로 분화된 성체 줄기세포의 신경세포 특이적 유전자의 발현을 확인할 수 있다. RT-PCR을 수행하기 위하여 세포에서 발현되는 RNA를 키트(Qiagen, Germany)를 이용하여 순수하게 분리하였으며, 모든 실험과정은 제조사의 메뉴얼을 따라 수행하였다. 분리된 RNA를 정량하였으며(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE), A260/A280 값이 1.6 ~ 1.9의 RNA를 사용하였다. 분리된 RNA를 주형으로 역전사 과정을 통해 cDNA를 만들고 β-actin, NSE 및 NF 프라이머로 PCR을 수행하여 유전자 발현을 분석하였다. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) converts RNA expressed in cells into cDNA through reverse transcription and then selectively amplifies the gene through PCR to express neuronal-specific genes in adult stem cells. can confirm. In order to perform RT-PCR, RNA expressed in the cells was isolated purely using a kit (Qiagen, Germany), and all experiments were performed according to the manufacturer's manual. The isolated RNA was quantified (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE), and the A260 / A280 value of 1.6 ~ 1.9 RNA was used. CDNA was prepared by reverse transcription using the isolated RNA as a template and PCR was performed with β-actin, NSE and NF primers to analyze gene expression.

그 결과, 저분자 화합물을 처리한 골수 유래[도 9] 및 골격근 유래 줄기세포[도 10]가 신경세포로 분화 유도되었음을 확인하였다. As a result, it was confirmed that bone marrow-derived [FIG. 9] and skeletal muscle-derived stem cells [FIG. 10] treated with the low molecular weight compound induced differentiation into neurons.

도 1은 5주령 Fischer 쥐의 골수, 골격근 조직 및 지방조직을 분리하여 실험관 내(in vitro)에서 세포를 분리하여 5번 계대를 거친 줄기세포를 역상 현미경에서 촬영한 사진으로, 골수 유래 줄기세포(A), 골격근 유래 줄기세포(B) 및 지방유래 줄기세포(C)를 배양한 사진이다.FIG. 1 is a photograph of stem cells undergoing passages 5 times using an inverted microscope to isolate bone marrow, skeletal muscle tissue and adipose tissue of Fischer rats at 5 weeks of age and in vitro . A), skeletal muscle-derived stem cells (B) and adipose derived stem cells (C) is a photograph of the culture.

도 2는 유세포 분류기를 이용하여 분리된 성체 줄기세포의 표면에서 발현되는 항원을 확인한 사진으로, 골수 유래 줄기세포 표면에서 발현되는 항원(A), 골격근 유래 줄기세포 표면에서 발현되는 항원(B)이며, 지방 유래 줄기세포 표면에서 발현되는 항원(C)이다.Figure 2 is a photograph confirming the antigen expressed on the surface of the adult stem cells separated using a flow cytometry, the antigen expressed on the surface of bone marrow-derived stem cells (A), the antigen expressed on the surface of the stem cell derived stem cells (B) , An antigen (C) expressed on the surface of adipose derived stem cells.

도 3은 골수, 골격근 및 지방 유래 줄기세포에 10 μM의 화합물(Hee-1039 및 Hee-2013) 및 2 μM 레티놀산(retinoic acid)을 처리하여 분화시킨 후 역상 현미경으로 촬영한 사진으로, (A)는 골수 유래 줄기세포를 분화시킨 사진이며[A1: Hee-1039, A2: Hee-2013, A3: 양성 대조군 레티놀산], (B)는 골격근 유래 줄기세포를 분화시킨 사진이고[B1: Hee-1039, B2: Hee-2013, B3: 양성 대조군 레티놀산], (C)는 지방 유래 줄기세포를 분화시킨 사진이다[C1: Hee-1039, C2: Hee-2013, C3: 양성 대조군 레티놀산].FIG. 3 is a photograph taken with a reversed-phase microscope after differentiation of bone marrow, skeletal muscle and adipose derived stem cells treated with 10 μM of compounds (Hee-1039 and Hee-2013) and 2 μM retinoic acid. ) Are differentiation of bone marrow-derived stem cells [A1: Hee-1039, A2: Hee-2013, A3: positive control retinoic acid], (B) are differentiation of skeletal muscle-derived stem cells [B1: Hee- 1039, B2: Hee-2013, B3: positive control retinolic acid], (C) are photos of differentiation of adipose derived stem cells [C1: Hee-1039, C2: Hee-2013, C3: positive control retinolic acid].

도 4는 지방 유래 줄기세포에 10 μM의 저분자 화합물을 처리하여 분화시킨 사진이다[A: Hee-1039, B: Hee-2013, C: Hee-2073, D: Hee-3025, E: Hee-4016, F: Hee-4029, G: Hee-4135, H: KR63240, I: KR63244].4 is a photograph of differentiation of adipose derived stem cells by treatment with 10 μM of low molecular weight compounds [A: Hee-1039, B: Hee-2013, C: Hee-2073, D: Hee-3025, E: Hee-4016 , F: Hee-4029, G: Hee-4135, H: KR63240, I: KR63244].

도 5는 골수 유래 줄기세포에 10 μM 및 100 μM의 화합물(Hee-1039)을 처리 하여 세포내 독성을 평가한 결과로, (A)는 세포 모폴로지를 현미경으로 관찰한 사진으로 10 μM (A1), 100 μM (A2)의 농도로 화합물을 처리한 것이며, (B)는 MTT 분석을 실시한 결과이다.5 is a result of evaluating intracellular toxicity by treating 10 μM and 100 μM compounds (Hee-1039) to bone marrow-derived stem cells, (A) is a microscopic observation of the cell morphology 10 μM (A1) , The compound was treated at a concentration of 100 μM (A2), and (B) is the result of MTT analysis.

도 6은 골수 및 골격근 유래 줄기세포에 10 μM의 화합물(Hee-1039 및 Hee-2013) 및 2 μM의 레티놀산을 처리하고 세포 독성을 측정한 그래프로 골수 유래 줄기세포(A), 골격근 유래 줄기세포(B)의 결과이다.6 is a graph showing treatment of bone marrow and skeletal muscle-derived stem cells with 10 μM of compounds (Hee-1039 and Hee-2013) and 2 μM of retinoic acid and measurement of cytotoxicity. It is the result of the cell (B).

도 7은 골수 유래 줄기세포에 10 μM의 화합물(Hee-1039 및 Hee-2013) 및 2 μM의 레티놀산을 처리하여 분화시킨 후 신경세포 마커를 세포면역화학 염색으로 확인한 사진으로, (A)는 골수 유래 줄기세포를 NSE(neuron specific enolase)로 염색한 사진이고[A1: Hee-1039, A2: Hee-2013, A3: 레티놀산], (B)는 골수 유래 줄기세포를 Tuj1(beta Ⅲ tubulin)으로 염색한 사진이다[B1: Hee-1039, B2: Hee-2013, B3: 레티놀산].7 is a photograph of bone marrow-derived stem cells treated with 10 μM of compounds (Hee-1039 and Hee-2013) and 2 μM of retinoic acid to differentiate them, and then confirming neuronal markers by cell-immunochemical staining, (A) Bone marrow-derived stem cells were stained with NSE (neuron specific enolase) [A1: Hee-1039, A2: Hee-2013, A3: Retinol acid], and (B) the bone marrow-derived stem cells were Tuj1 (beta III tubulin) Photo stained with B1: Hee-1039, B2: Hee-2013, B3: Retinol acid.

도 8은 골격근 유래 줄기세포에 10 μM의 화합물을 처리하여 분화시킨 후 신경세포 마커를 세포면역화학 염색으로 확인한 사진으로[A: Hee-2073, B: Hee-3025, C: Hee-4016, D: Hee-4029, E: Hee-4135], 1은 신경세포 마커 NSE로 염색한 사진이고, 2는 Tuj1으로 염색한 사진이고, 3은 신경교세포 중 별아교세포의 마커 GFAP로 염색한 사진이고, 4는 신경교세포 중 희소돌기아교세포의 마커 CNPase로 염색한 사진이다.FIG. 8 is a photograph showing differentiation of 10 μM of compound into skeletal muscle-derived stem cells after treatment by neuroimmunochemical staining [A: Hee-2073, B: Hee-3025, C: Hee-4016, D : Hee-4029, E: Hee-4135], 1 is a picture stained with the neuronal marker NSE, 2 is a photo stained with Tuj1, 3 is a photo stained with the glial marker GFAP of glial cells, 4 Are photographs stained with the marker CNPase of oligodendrocytes among glial cells.

도 9는 10 μM의 화합물(Hee-1039 및 Hee-2013) 및 2 μM의 레티놀산을 처리하여 분화시킨 골수 유래 줄기세포의 RNA를 분리하여 신경세포 마커를 RT-PCR로 확 인한 결과로 골수 유래 줄기세포의 NSE 발현을 확인한 결과이다.Figure 9 shows the separation of RNA from bone marrow-derived stem cells differentiated by treatment with 10 μM compounds (Hee-1039 and Hee-2013) and 2 μM retinol acid to confirm the neuronal markers by RT-PCR as a result of bone marrow This is a result of confirming the NSE expression of stem cells.

도 10은 10 μM의 화합물(Hee-1039 및 Hee-2013) 및 2 μM의 레티놀산을 처리하여 분화시킨 골격근 유래 줄기세포의 RNA를 분리하여 신경세포 마커를 RT-PCR로 확인한 결과로 골격근 유래 줄기세포의 NF(neurofilament) 발현을 확인한 결과이다.Figure 10 is a skeletal muscle-derived stem as a result of confirming the neuronal marker by RT-PCR RNA isolated from skeletal muscle-derived stem cells differentiated by treatment with 10 μM compound (Hee-1039 and Hee-2013) and 2 μM retinol acid This is the result of confirming NF (neurofilament) expression of the cell.

Claims (7)

성체 줄기세포를 신경세포 유도물질을 이용하여 신경세포로 분화하는 방법에 있어서, 상기 신경세포 유도물질은 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는 신경세포의 분화방법. A method of differentiating adult stem cells into neurons using neuronal inducers, wherein the neuronal inducers are low molecular weight compounds. 제 1 항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 골수, 골격근 또는 지방 유래인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the adult stem cells are derived from bone marrow, skeletal muscle or fat. 제 1 항에 있어서, 상기 저분자 화합물은 히스톤 탈아세틸효소 억제제 계통의 저분자 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the low molecular weight compound is a low molecular weight compound of the histone deacetylase inhibitor family. 제 3 항에 있어서, 상기 히스톤 탈아세틸효소 억제제 계통의 저분자 화합물은 알킬티오벤즈이미다졸(Alkylthiobenximidazole)계 화합물, 벤즈하이드록사마이드(Benzhydroxyamide)계 화합물, 퀴녹살린 하이드록사마이드(Quinozaline hydrozamide)계 화합물 및 아실아미노메틸 하이드록사마이드(Acylaminomethyl hydroximide)계 화합물 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 복합체인 것을 특징으 로 하는 방법.The method of claim 3, wherein the low molecular weight compound of the histone deacetylase inhibitor system is an alkylthiobenzimidazole-based compound, a benzhydroxyamide-based compound, quinoxaline hydrozamide-based quinozaline hydrozamide A compound and acylaminomethyl hydroximide-based compound characterized in that one or two or more complexes selected from. 제 1항에 있어서, 상기 저분자 화합물은 1 nM ~ 100 μM인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the low molecular weight compound is 1 nM to 100 μM. 청구항 1 내지 5 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 분화된 신경세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 신경 질환 치료용 조성물.A composition for treating neurological diseases, comprising neurons differentiated by the method of any one of claims 1 to 5. 제 6 항에 있어서. 상기 신경 질환은 파킨스씨병, 치매, 알츠하이머병 또는 척수 손상에 의한 중추신경계 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.The method of claim 6. The neurological disease is a composition characterized in that the central nervous system diseases caused by Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease or spinal cord injury.
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