KR20090051022A - Vaccine composition comprising infected tissue extract antigens for porcine respiratory disease complex - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 복합호흡기 질환의 치료 및 예방을 위한 백신에 관한 것이다. 본 발명의 따르면, 복합호흡기 질환에 걸린 돼지의 감염 조직으로부터 항원을 추출하여 백신으로 이용한다. 이와 같이 제조한 본 발명의 백신은 안정성 및 효과에 있어 기존의 백신과 비교할 수 없는 현저히 우수한 효과를 갖는다. The present invention relates to vaccines for the treatment and prophylaxis of porcine complications. According to the present invention, an antigen is extracted from an infected tissue of a pig with a combined respiratory disease and used as a vaccine. The vaccine of the present invention prepared as above has a remarkably superior effect on the stability and effectiveness compared to the existing vaccine.

감염조직백신, 이유후전신소모성증후군(PMWS), 돼지호흡기복합증후군(PRDC) Infected tissue vaccine, weaning postmenopausal syndrome (PMWS), swine respiratory complex syndrome (PRDC)

Description

복합호흡기 질환 돼지의 조직유제를 함유하는 백신 조성물 {Vaccine composition comprising infected tissue extract antigens for porcine respiratory disease complex}Vaccine composition comprising infected tissue extract antigens for porcine respiratory disease complex}

본 발명은 돼지 복합호흡기 질환의 원인체들이 감염된 조직으로부터 추출된 항원을 이용하여 제조한 백신 및 이것의 제조방법에 관한 것이다 The present invention relates to a vaccine prepared by using antigens extracted from infected tissues of the cause of the pig respiratory disease and a method for producing the same.

돼지에서의 여러 가지 전염병에 대한 백신이 개발되었으나, 복합 원인체에 의해 일어나는 질환, 원인체가 잘 확인되지 않은 질병 또는 원인체의 증식이 어려운 질병에 대해서는 백신의 제조가 불가능하다. 이러한 질환 또는 질병의 예로서, 이유후전신소모성증후군 (PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군 (PRDC)이 있다. PMWS는 돼지 써코바이러스-2(PCV-2)의 감염과 밀접한 관계가 있으나, PCV-2가 감염된 농가일지라도 PMWS에 인한 피해가 없는 예가 있으므로, PMWS는 PCV-2 및 다른 병원체 등 복합적 요인에 의한 것이라는 주장이 있다. PRDC는 돼지생식기호흡기증후군 (PRRS) 바이러스, 마이코플라즈마 및 세균들의 복합 감염에 의해 발생하며 양돈 농가에 큰 피해를 주고 있다.Vaccines against various infectious diseases in pigs have been developed, but it is not possible to manufacture vaccines for diseases caused by multiple causative agents, diseases whose cause is not well identified, or diseases in which the causative agent is difficult to proliferate. Examples of such diseases or disorders are weaning hypoallergenic syndrome (PMWS) and swine respiratory complex syndrome (PRDC). PMWS is closely related to the infection of swine circovirus-2 (PCV-2), but there is no damage caused by PMWS even in PCV-2 infected farms. Therefore, PMWS is caused by a combination of factors such as PCV-2 and other pathogens. There is a claim. PRDCs are caused by a combination of swine respiratory syndrome (PRRS) virus, mycoplasma and bacteria, and are causing severe damage to pig farms.

PMWS와 PRDC는 돼지에서 호흡기계통의 질병을 일으키며, 주요 병원체로서 PRRS 바이러스, PCV-2, 오제스키바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 마이코플라즈마, 및 파스츄렐라균 등이 관련될 수 있으나, PRRS 바이러스 및 PCV-2가 가장 중요한 원인체로 볼 수 있다. 이들 두 바이러스는 호흡기질환 뿐만 아니라 유사산을 일으킬 수 있다. PRRV 또는 PCV-2에 감염된 돼지는 다른 바이러스와 달리 감염 후 높은 역가의 바이러스가 조직 내에서 오랫동안 유지되는 것이 특징이다. 정 등 (Chung et al.)은 감염된 폐, 비장 및 임파절에서 PRRS 바이러스가 log₁₀10^{7 .45} copies/ml 이상 농도, PCV-2가 log10^{5 .80} copies/ml 이상 농도로 존재함을 보고한 바 있다 (참고문헌: J. Virol metheds 124; 11 ~ 19). 농장에서 이들 질환에 걸린 돼지의 장기에는, 통상 상기 농도 보다 더 높은 역가의 바이러스들이 검출되므로, 보다 더 높은 항원량을 질환에 걸린 돼지로부터 용이하게 수득할 수 있을 것이다.PMWS and PRDC cause diseases of the respiratory system in pigs, and may be associated with PRRS virus, PCV-2, Ozeskivirus, swine influenza virus, mycoplasma, and Pasteurella as major pathogens, but PRRS virus and PCV- 2 is the most important cause. These two viruses can cause respiratory diseases as well as pseudoacids. Unlike other viruses, pigs infected with PRRV or PCV-2 are characterized by a high titer of virus in the tissues after infection. Chung et al. Reported that PRRS virus was present at log ₁₀ 10 ^{7 .45} copies / ml or higher and PCV-2 at log ^{10 .80} copies / ml or higher in infected lungs, spleen and lymph nodes. (See J. Virol metheds 124; 11-19). In the organs of these diseased pigs on the farm, viruses of higher titer than those concentrations are usually detected, so higher antigenic amounts may be readily obtained from diseased pigs.

PMWS 또는 PRDC를 예방하기 위해, 이들 질환과 관련된 원인체 각각에 대한 백신을 제조하여 이용할 수 있다. 그러나 각 농장에서 주로 감염되는 병원체들이 다르며 다양한 종류의 병원체들이 관련되고, 같은 병원체 중에서도 다양한 변이주가 존재하므로, 각 농가별 백신에 의한 방어가 실질적으로 불가능하다. 따라서 본 발명에서는 이들 질환을 심하게 앓고 있는 돼지를 희생시킨 후 병원체들이 가장 많이 함유된 조직을 채취하여 항원을 추출하고 이를 불활화하여 백신을 제조하였다. 이와 같이, 병원체에 감염된 조직으로부터 복합 항원을 수득하고 이들 항원을 이용하여 백신을 제조하는 방법은, 돼지 질환 또는 질병의 예방 및 치료에 이용된 바 없다.To prevent PMWS or PRDC, vaccines for each of the causes associated with these diseases can be prepared and used. However, since the pathogens mainly infected in each farm are different, various kinds of pathogens are involved, and there are various mutants among the same pathogens, defense by vaccines of each farmhouse is practically impossible. Therefore, in the present invention, after sacrificing pigs suffering from these diseases, tissues containing the most pathogens were extracted to extract antigens and inactivated to prepare vaccines. As such, a method of obtaining complex antigens from tissues infected with a pathogen and preparing vaccines using these antigens has not been used for the prevention and treatment of swine diseases or diseases.

본 발명의 목적은 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC) 예방 및 치료를 위한 조직유제 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for preparing a tissue emulsion vaccine for the prevention and treatment of weaning post-consumer syndrome (PMWS) and swine respiratory complex syndrome (PRDC).

또한 본 발명은 조직유제 항원을 추출하기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide a composition for extracting a tissue emulsion antigen.

또한 본 발명의 목적은 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC) 예방 및 치료를 위한 조직유제 백신 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a tissue emulsion vaccine composition for the prevention and treatment of postprandial neoplastic syndrome (PMWS) and porcine respiratory complex syndrome (PRDC).

또한 본 발명의 목적은 본 발명에 따라 제조된 조직유제 백신 조성물을 투여하여 자돈을 백신화하는 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for vaccinating piglets by administering a tissue emulsion vaccine composition prepared according to the present invention.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 구체예에서는 i) 호흡기 질환에 걸린 돼지의 감염 조직을 적출하는 단계, ⅱ) 적출 조직에 글리신 완충액 및 0.5% 트리톤X-100으로 구성된 항원추출용액을 가하여 항원을 추출하는 단계, 및 ⅲ) 포르말린으로 불활화하는 단계를 포함하는, 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC) 예방 및 치료를 위한 조직유제 백신의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, in the embodiment of the present invention, i) extracting infected tissue of a pig suffering from respiratory disease, ii) adding an antigen extraction solution consisting of glycine buffer and 0.5% Triton X-100 to the extracted tissue, It provides a method for producing a tissue emulsion vaccine for the prevention and treatment of weaning syndrome syndrome (PMWS) and pig respiratory complex syndrome (PRDC) comprising the step of extracting, and iii) inactivating with formalin.

일 구체예에서, 본 발명은 트리톤X-100:글리신 완충액이 각각의 부피를 기준으로 1:150 ~ 1:250의 비율로 구성된 조직유제 항원을 추출하기 위한 조성물을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a composition for extracting a tissue emulsion antigen wherein Triton X-100: glycine buffer is comprised in a ratio of 1: 150 to 1: 250 based on each volume.

다른 구체예에서, 본 발명은 i) 호흡기 질환에 걸린 돼지의 감염 조직을 적 출하는 단계, ⅱ) 적출 조직에 글리신 완충액 및 트리톤X-100으로 구성된 항원추출용액을 가하여 항원을 추출하는 단계, 및 ⅲ) 포르말린으로 불활화 하는 단계에 의해 제조된, 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC) 예방 및 치료를 위한 조직유제 백신 조성물을 제공한다.In another embodiment, the present invention comprises the steps of: i) extracting infected tissue of a pig with respiratory disease, ii) extracting antigen by adding an antigen extraction solution consisting of glycine buffer and Triton X-100 to the isolated tissue, and Iii) provides a tissue emulsion vaccine composition for the prevention and treatment of weaning hypogonadism syndrome (PMWS) and swine respiratory complex syndrome (PRDC), prepared by inactivating with formalin.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 i) 호흡기 질환에 걸린 돼지의 감염 조직을 적출하는 단계, ⅱ) 적출 조직에 글리신 완충액 및 트리톤X-100으로 구성된 항원추출용액을 가하여 항원을 추출하는 단계, 및 ⅲ) 포르말린으로 불활화하는 단계에 의해 제조된 조직유제 백신 조성물을 투여하여 자돈을 백신화하는 방법으로서, 3주령 및 5주령째에 1회씩 접종하여 자돈을 백신화하는 방법을 제공한다. In another embodiment, the present invention comprises the steps of i) extracting infected tissue of a pig suffering from respiratory disease, ii) extracting antigen by adding an antigen extraction solution consisting of glycine buffer and Triton X-100 to the isolated tissue, and Vi) A method of vaccinating piglets by administering a tissue emulsion vaccine composition prepared by the step of inactivating with formalin, and provides a method of vaccinating piglets by inoculation once every 3 and 5 weeks of age.

본 발명자들은 감염된 조직세포로부터 바이러스 등 복합 항원을 보다 더 효과적으로 추출하기 위해, 항원 추출용 조성물 (Extraction buffer)를 제조하여 이용하였다. 본 발명의 항원 추출용 조성물은, 주요성분으로서 글리신 완충액 (glycine buffer), 및 0.5% 트리톤X-100(상표명)을 포함하여 세포 내 바이러스 및 세포막에 붙어있는 바이러스 외피 단백질을 모두 추출할 수 있어 감염 조직으로부터 매우 효과적으로 다양한 항원을 수득할 수 있다 (참조 문헌: Joo, Molitor, Leman 1984 AJVR45 : 2096 - 2098). 글리신 완충액은 세포벽에 미세한 구멍을 만들어 삼투압에 의해 항원을 세포 밖으로 끌어내는 역할을 함으로써 많은 양의 세포내 바이러스 예를 들어, PCV-2 추출을 가능케 하고, 트리톤X-100는 세포막에 있는 바이러스 예를 들어, PRRS 바이러스 항원 추출에 이용된다. 본 발명의 항원 추출 조성물은 트리톤X-100:글리신 완충액이 각각의 부피를 기준으로 1:150 ~ 1:250의 비율로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1:200의 부피 비를 갖는다. 표 1 및 표 2는 각각 글리신 완충액 및 항원 추출용액의 일 예를 나타낸다.The present inventors prepared and used an antigen extraction composition (Extraction buffer) to more effectively extract complex antigens such as viruses from infected tissue cells. Antigen extraction composition of the present invention, including the glycine buffer (glycine buffer), and 0.5% Triton X-100 (trade name) as the main component can extract both the viral virus and viral envelope protein attached to the cell membrane infection Various antigens can be obtained very effectively from tissues (Joo, Molitor, Leman 1984 AJVR45: 2096-2098). Glycine buffer makes micropores in the cell wall and draws antigens out of cells by osmotic pressure, allowing for the extraction of large amounts of intracellular viruses such as PCV-2. For example, it is used for PRRS virus antigen extraction. The antigen extraction composition of the present invention preferably contains Triton X-100: glycine buffer in a ratio of 1: 150 to 1: 250, and more preferably 1: 200. Table 1 and Table 2 show examples of glycine buffer and antigen extract solution, respectively.

글리신 완충액 조성 예 (pH 9.0) Example glycine buffer composition (pH 9.0) 글리신Glycine 7.5 g7.5 g NaClNaCl 5.85 g5.85 g 증류수Distilled water 1,000 ml1,000 ml 2N NaOH2N NaOH 10 ml10 ml

항원 추출 용액 조성 예 Antigen Extraction Solution Composition Example 트리톤X-100Triton X-100 5 ml5 ml 멸균 글리신 완충액 (pH 9.0)Sterile Glycine Buffer (pH 9.0) 1,000 ml1,000 ml

본 발명자들은, 본 발명에 따라 제조한 백신의 완전한 불활화를 확인하기 위해, 하기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 잔류 생존 바이러스 유무를 조사하였다. 실시예 1에서는 불활화제로 이용된 포르말린의 PRRS 및 PCV-2에 대한 불활화 능력을 각각 바이러스가 감염된 세포를 이용하여 조사하였다. 이를 위해, 포르말린을 농도 0.05%이상으로 24시간 처리하고 이들 두 바이러스가 불활화되는 것을 확인하였다. 실시예 2에서는 PCV-2에 노출이 전혀 없는 생후 1일령 돼지에 시험용 불활화 백신을 접종하고 감염증식의 유무를 관찰하였다. 특히 PCV-2는 다른 바이러스와 달리 외부 환경조건 또는 화학제들에 강한 내성을 보이는 바이러스로서, 이 바이러스의 잔류 생존 유무에 대한 검사를 실시예 2에 기술하는 것과 같이, 감수성 동물 접종법(bioassay)을 수행하고 시험백신 내 생존한 PCV-2가 없음을 확인하였다. The inventors examined the presence of residual viable virus as described in Examples 1 and 2 below to confirm complete inactivation of the vaccine prepared according to the present invention. In Example 1, the inactivation capacity of formalin used as an inactivating agent for PRRS and PCV-2 was examined using cells infected with viruses, respectively. To this end, formalin was treated for 24 hours at a concentration of 0.05% or more and it was confirmed that these two viruses were inactivated. In Example 2, one day-old pig, which had no exposure to PCV-2, was inoculated with a test inactivation vaccine and observed for infection. In particular, PCV-2 is a virus that shows strong resistance to external environmental conditions or chemicals unlike other viruses. As described in Example 2, a test for the presence or absence of residual survival of this virus is performed by a susceptible animal bioassay. It was confirmed that there was no surviving PCV-2 in the test vaccine.

실시예 3에서는 PMWS에 의한 피해가 많은 2개 농장을 선택하고, 본 발명에 따른 불활화 자가 조직유제 백신을 제조하여 이유자돈에 2회 접종한 후, 백신접종을 하지 않은 그룹과 백신을 접종한 그룹에서 폐사율을 비교 실험하였다. 그 결과 백신 접종 그룹에서 폐사가 현저하게 감소함을 확인하였다. In Example 3, two farms affected by PMWS were selected, the inactivated autologous tanning emulsion vaccine according to the present invention was prepared and inoculated twice in weaning piglets, and the group not vaccinated and the group vaccinated. Mortality was compared at. As a result, it was confirmed that death in the vaccination group significantly reduced.

백신 vaccine 제조예Production Example

PMWS 또는 PRDC는 주로 6 ~ 12주령 자돈에서 발병하므로, 수의사의 협조로 심한 폐병변과 임파절의 종대 및 출혈 돼지로부터, 폐, 비장 및 임파절을 채취하여 개체별 장기를 지퍼 백 (Zipper bag)에 따로 보관했다. 이때 소량의 폐장은 바이러스 함유량을 조사하기 위해 분리 채취하고 나머지 장기는 -20℃에서 보관했다. 다음 개체별 바이러스 함량시험을 수행한 후 장기를 실온에 방치하여 해동시켰다. 후속하여 무게(1kg)를 측정한 후 소독된 블랜더(blender)를 이용하여 잘게 갈아 유제액을 제조했다. 다음 조직 유제액에 항원 추출 완충액 또는 PBS를 가했다 (1 kg 조직 유제액에 1,000 ml 비율). 추출 완충액을 가한 조직 유제액을 4℃에서 자석교반장치로 15시간 정도 교반하고, PBS를 넣은 조직 유제액은 2회 동결 융해시켰다. 다음 융해된 유제액을 약 1분간 블랜딩한 후 3,000 ~ 5,000 rpm으로 20 ~ 30분간 원심분리하고 상층액만 수거했다. 이들 상층액을 가는 동망을 이용하여 여과한 후, 4,000 ml가 될 때까지 PBS를 가했다. 이때 5 ml 항원액을 채취하여 -20℃에 보관하고 바이러스 함량을 조사했다. 유제액을 희석하고 PCR법으로 희석된 조직 유제액 속의 바이러스 예를 들어, PCV-2 또는 PRRS의 역가를 측정하여 바이러스 함량을 확인했다. 포르말린(Formalin) (37%) 8 ml를 4,000 ml 항원액에 넣고, 상온에서 24 ~ 48시간 교반시킨 후 상층액 5 ml를 채취하여 세균검사를 하고 잔류세균이 없음을 확인한 후 1,000 ml 수산화알루미늄겔을 넣고 2-3시간 교반 후 4℃에 보관했다. 이때 100 ~ 500 ml 소독된 병에 소분하여 백신으로 사용할 수 있다.Since PMWS or PRDC usually occur in piglets 6 to 12 weeks of age, the lungs, spleen and lymph nodes are collected from severe lung lesions and lymph nodes and hemorrhagic pigs with the help of a veterinarian. Kept. At this time, a small amount of lung was separated to examine the virus content and the remaining organs were stored at -20 ° C. After performing the individual virus content test, the organs were thawed by leaving the organs at room temperature. Subsequently, the weight (1 kg) was measured and finely chopped using a sterilized blender to prepare an emulsion. Antigen extraction buffer or PBS was then added to the tissue emulsion (1,000 ml ratio to 1 kg tissue emulsion). The tissue emulsion solution to which the extraction buffer was added was stirred for 15 hours at 4 ° C. with a magnetic stirrer, and the tissue emulsion solution containing PBS was freeze-thawed twice. The melted emulsion was then blended for about 1 minute and then centrifuged at 3,000 to 5,000 rpm for 20 to 30 minutes and only the supernatant was collected. These supernatants were filtered using a thin network and then PBS was added until it became 4,000 ml. At this time, 5 ml of the antigen solution was collected and stored at -20 ° C and the virus content was examined. The virus content was determined by diluting the emulsion and measuring the titer of the virus, eg, PCV-2 or PRRS, in the diluted tissue emulsion by PCR. 8 ml of formalin (37%) was added to 4,000 ml of antigen solution, stirred at room temperature for 24 to 48 hours, 5 ml of supernatant was collected for bacterial examination, and confirmed to be free of residual bacteria. After stirring for 2-3 hours and stored at 4 ℃. At this time, divided into 100 ~ 500 ml sterilized bottle can be used as a vaccine.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 조직유제 백신 조성물은 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC)의 예방 및 치료에 매우 우수한 효과가 있다. 따라서, 양돈 농가에 막대한 손실을 가져오는 질환인 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC)의 예방 및 치료용 백신으로서 유용하게 이용될 수 있다.As described above, the tissue emulsion vaccine composition according to the present invention has a very excellent effect in the prevention and treatment of weaning postnatal neoplastic syndrome (PMWS) and swine respiratory complex syndrome (PRDC). Therefore, it can be usefully used as a vaccine for the prophylaxis and treatment of postprandial neoplastic syndrome (PMWS) and swine respiratory complex syndrome (PRDC), which are diseases that cause enormous losses in pig farms.

실시예Example 1 One

PRRS 바이러스가 감염된 Marc-145 세포(ATCC CRL-12219) 및 PCV-2가 감염된 PK-15 세포(ATCC CCL33)를 24-웰 마이크로플레이트에 준비한 후 배양액을 제거하고, 각 웰에 다양한 농도의 포르말린 (0.4 ml/well)을 가한 후 1시간 또는 24시간 실온에 두었다. 다음 포르말린을 흡입 제거하고 바닥에 붙어있는 세포를 PBS로 3회씩 세척하였다. 후속하여 0.2 ml/well의 PBS를 가하여 마이크로플레이트 바닥에 붙어있는 세포를 긁어내고, 3회 동결 융해 후 상기 2가지 세포로부터 생존 바이러스를 조사하였다. 그 결과는 표 3과 같다.Marc-145 cells infected with PRRS virus (ATCC CRL-12219) and PK-15 cells infected with PCV-2 (ATCC CCL33) were prepared in 24-well microplates, cultures were removed, and each concentration of formalin ( 0.4 ml / well) was added and then left at room temperature for 1 hour or 24 hours. The formalin was then aspirated off and the cells adhered to the bottom were washed three times with PBS. Subsequently, 0.2 ml / well of PBS was added to scrape off the cells attached to the bottom of the microplate, and viable virus was examined from the two cells after three freeze thaws. The results are shown in Table 3.

생존 바이러스 조사 결과Survival virus findings 포르말린 농도 (%)  Formalin concentration (%) 감염세포 monolayer 접촉시간Infected cell monolayer contact time PRRS 바이러스PRRS virus PCV-2PCV-2 1h1h 24h24h 1h1h 24h24h 00 ++ ++ ++ ++ 0.050.05 ++ -- ++ -- 0.10.1 ++ -- ++ -- 0.20.2 -- -- ++ -- 0.40.4 -- -- ++ -- 0.80.8 -- -- -- --

실시예Example 2 2

포르말린으로 불활화된 항원의 안전성 조사와 비불활화 잔류 PCV-2를 조사하였다. 이를 위해, 초유를 먹지 않은 생후 1일령 돼지에 접종용량 5X (5 ml)를 표 4와 같이 복강 내에 접종하고, 인공포유로 7일간 사육한 후 PCV-2 검출유무를 조사하였다. 포르말린 불활화 전 항원을 접종한 돼지(B1-4)는 접종 후 7일내 PCV-2가 검출되었으나, 포르말린 불활화된 항원을 접종한 돼지(A1-4)에서는 잔류 바이러스가 검출되지 않았다. 돼지(A1-A4)는 접종 후 7일에 약한 PCR반응을 보였으나, 바이러스 분리법 및 조직면역 효소반응(IHC)법에서는 음성반응을 나타내었으며, 이로부터 포르말린에 의한 PCV-2의 불활화를 확인하였다. 약한 PCR 양성 반응은 접종된 항원 재료 (5 ml) 중의 잔류 PCV-2 DNA일 것으로 추측된다.Formalin-inactivated antigen safety and non-inactivated residual PCV-2 were investigated. To this end, inoculated dose 5X (5 ml) was inoculated in the abdominal cavity as shown in Table 4 to pigs not fed colostrum as shown in Table 4, and examined for the detection of PCV-2 after 7 days of breeding. PCV-2 was detected within 7 days after the inoculation of pigs (B1-4) inoculated with the antigen before formalin inactivation, but no residual virus was detected in the pigs (A1-4) inoculated with the formalin inactivation antigen. Pigs (A1-A4) showed a weak PCR reaction 7 days after inoculation, but showed negative reactions in virus isolation and tissue immunoassay (IHC) methods, confirming inactivation of PCV-2 by formalin. It was. The weak PCR positive response is assumed to be residual PCV-2 DNA in the inoculated antigen material (5 ml).

혈중 바이러스 검출 결과Blood virus detection result 돼지번호  Pig number 접종 항원 및 투여량 Inoculation Antigens and Dosages 혈중 바이러스 검출Blood virus detection 0일째Day 0 7일째7th day PCRPCR 바이러스 분리법Virus isolation 폐 IHCLung IHC PCRPCR A1A1 포르말린 불활화 후 5ml 복강 내 투여  5ml intraperitoneal administration after formalin inactivation -- -- -- ++ A2A2 -- -- -- ++ A3A3 -- -- -- ++ A4A4 -- -- -- ++ B1B1 포르말린 불활화 전 5ml 복강 내 투여  5ml intraperitoneal administration before formalin inactivation -- 2일령에 기아로 인한 폐사Death due to starvation at 2 days of age B2B2 -- ++ ++ ++++++ B3B3 -- ++ ++ ++++++ B4B4 -- ++ ++ ++++++ N1N1 PBS 5ml 복강 내 투여PBS 5ml Intraperitoneal Administration -- -- -- --

IHC = immunohistochemistry(조직면역효소반응법)IHC = immunohistochemistry

실시예Example 3 3

조직유제 항원을 이용한 백신의 안전성 및 효능시험을 위해, PMWS에 의한 피해가 많은 2개 농장 (A 농장 및 B 농장)을 선정하고, PMWS에 걸린 10 ~ 12주령 돼지로부터 감염조직(폐, 비장 및 임파절)을 채취하였다. 이들 감염조직을 이용하여 시험용 백신을 제조예에 따라 제조하고, 3주령 및 5주령의 시험농장 이유자돈에 2회 접종 (1 ml, 근육)한 후, PMWS에 의한 폐사가 일어나는 10 ~ 16주령 사이의 폐사율을 비교하였다. 그 결과를 표 5 및 표 6에 나타냈다.For safety and efficacy testing of vaccines using tissue tanning antigens, two farms (A farm and B farm) with high damage by PMWS were selected and infected tissues (lung, spleen and Lymph nodes) were harvested. Test vaccines were prepared using these infected tissues according to the preparation examples, and were inoculated twice (1 ml, muscle) in 3 and 5 week old test farm weaning pigs, and between 10 and 16 weeks of age when death by PMWS occurred. Mortality was compared. The results are shown in Tables 5 and 6.

A 농장의 폐사율Mortality of Farm A 육성/비육 GroupNurturing / Finishing Group 백신사용여부Use of vaccine 전입두수Transfer head 폐사두수(10 ~ 16주령)Number of dead heads (10 to 16 weeks of age) 폐사율Mortality 1One 없음none 480480 4040 8.3%8.3% 22 없음none 503503 6262 12.3%12.3% 33 없음none 460460 3434 7.4%7.4% 44 2회 접종2 inoculations 532532 1010 1.9%1.9% 55 2회 접종2 inoculations 545545 66 1.1%1.1% 66 2회 접종2 inoculations 530530 2121 3.9%3.9%

상기 표 5에 제시된 바와 같이, A 농장에서 본 발명의 조직유제 백신을 총 1,607두에 2회 접종한 결과, 접종 반응에 의한 폐사는 없었다. 이로부터 본 발명에 따른 백신의 높은 안전성을 확인하였다. 또한 백신 미처리군 총 1,443두에서는 134두가 폐사하여 평균 9.3% 폐사율을 보였으나, 백신을 처리한 군에서는 총 1,607두 중 37두만이 폐사하여 평균 2.3% 폐사율을 보였다. 따라서, 본 발명의 백신은 돼지 폐사율을 4배까지 감소시킬 수 있다. As shown in Table 5, when the tissue emulsion vaccine of the present invention was inoculated twice in a total of 1,607 heads in farm A, there was no death due to the inoculation reaction. This confirmed the high safety of the vaccine according to the invention. In vaccinated group, 134 cases died and 9.3% mortality occurred in 1,443 untreated vaccines. However, only 37 of 1,607 vaccinated groups died and average 2.3% mortality. Thus, the vaccine of the present invention can reduce pig mortality by four times.

B 농장의 폐사율Mortality of Farm B 육성/비육 GroupNurturing / Finishing Group 백신사용여부Use of vaccine 전입두수Transfer head 폐사두수(육성, 비육돈)Number of dead sows (cultivation, finishing pigs) 폐사율Mortality 1One 없음none 5,2265,226 949949 18.2%18.2% 22 없음none 9,2529,252 1,6811,681 18.2%18.2% 33 없음none 8,5368,536 1,6571,657 19.4%19.4% 44 2회 접종2 inoculations 9,8189,818 831831 8.5%8.5% 55 2회 접종2 inoculations 10,73810,738 227227 2.1%2.1%

상기 표 6에 제시된 바와 같이, B 농장에서 본 발명의 조직유제 백신을 총 43,570두에 2회 접종 한 결과, 접종 반응에 의한 폐사는 없었다. 이로부터 본 발명의 백신의 높은 안전성을 확인하였다. 또한 백신 미처리군 총 23,014두에서 4,287두가 폐사하여 평균 18.6% 폐사율을 보였으나, 백신 처리군 총 20,556두에서 1,058두가 폐사하여 평균 5.2% 폐사율을 나타냈다. 따라서 본 발명의 백신은 폐사율을 약 4배까지 줄일 수 있음을 확인하였다. 6주령 및 9주령 자돈에 2회 백신접종 한 4번 그룹은 8.5%의 폐사율을 보였고, 3주령 및 5주령 자돈에 2회 백신접종 한 5번 그룹은 2.1%의 훨씬 낮은 폐사율을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 조직유제 백신의 자돈 접종시기는 각각 3주령 및 5주령에 각각 접종하는 것이 최적임을 알 수 있다. As shown in Table 6, when the tissue tanning vaccine of the present invention was inoculated twice to 43,570 heads in a farm B, there was no death due to the inoculation reaction. This confirmed the high safety of the vaccine of the present invention. In addition, 4,287 deaths in 23,014 cases of unvaccinated group showed 18.6% mortality, but 1,058 deaths in 20,556 cases of vaccine treated group resulted in an average 5.2% mortality. Therefore, the vaccine of the present invention was confirmed to reduce mortality by about four times. Group 4 vaccinated twice in 6- and 9-week-old pigs showed a mortality rate of 8.5%, and group 5 vaccinated twice in 3-week and 5-week-old piglets showed a much lower mortality rate of 2.1%. Therefore, it can be seen that the pig inoculation timing of the tissue emulsion vaccine of the present invention is optimally inoculated at 3 and 5 weeks of age, respectively.

Claims (2)

트리톤X-100:글리신 완충액이 각각의 부피를 기준으로 1:150 ~ 1:250의 비율로 구성된, 호흡기 질환에 걸린 돼지의 적출 조직으로부터 조직유제 항원을 추출하기 위한 조성물. A composition for extracting a tissue emulsion antigen from an isolated tissue of a pig with respiratory disease, wherein Triton X-100: glycine buffer is comprised in a ratio of 1: 150 to 1: 250 based on each volume. 적출한 호흡기 질환에 걸린 돼지의 감염 조직으로부터 제1항의 조성물을 이용하여 추출한 조직유제 항원을 포함하는, 이유후전신소모성증후군(PMWS) 및 돼지호흡기복합증후군(PRDC) 예방 및 치료를 위한 조직유제 백신 조성물.Tissue emulsion vaccine for the prevention and treatment of postprandial neoplastic syndrome (PMWS) and pig respiratory complex syndrome (PRDC) comprising a tissue emulsion antigen extracted using the composition of claim 1 from infected tissues of swine infected respiratory disease. Composition.