KR20090042105A - Ｓｉｒｔ１활성조절용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SIRT1 활성조절용 조성물을 제공한다. 또한, 이를 이용한 예방 또는 치료방법 및 용도를 제공한다. 본 발명은 SIRT1활성조절에 의하여, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병, 또는 노화관련질병의 예방, 치료 또는 진단에 이용될 수 있다.

AROS 단백질, SIRT1, p53, 노화, 당뇨, 비만

Description

ＳＩＲＴ１활성조절용 조성물{A composition for regulating SIRT1 activity}

본 발명은 SIRT1의 활성조절용 조성물에 관한 것이다. 또한, 이를 이용한 예방 또는 치료방법 및 용도에 관한 것이다.

인간의 sirtuin 1 (또는 SIRT1)은 포유류 SIRT family에 속하며, NAD⁺-의존적 class III 히스톤 탈아세틸 활성을 가진 효모의 Sir2와 가장 유사하다. 포유류 SIRT1은 유전자 발현억제와 유관한 크로마틴 재구성, DNA damage 반응, 식이제한에 동반된 수명연장 등에 관여한다(Chen et al., Science 310, 1641, 2005). 인간의 SIRT1은 효모의 Sir2처럼 히스톤 탈아세틸화를 통해 크로마틴을 재구성하고 유전자의 발현을 억제한다 (Vaquero et al., Mol. Cell 16, 93105, 2004). 또한 SIRT1은 히스톤 단백질 외에도 세포성장, 스트레스 반응, 내분비조절 등에 관련된 다양한 전사인자의 탈아세틸화를 유도한다. 또한, 최근 연구에 따르면 상기 SIRT1의 탈아세틸화 활성을 증가시켜 당뇨, 비만, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병 등에 적용하는 기술이 미국특허공개번호 US 2006/0025337 A1 또는 국제특허공개번호 WO 2005/002672 A2 등에 개시되어 있다. 이들 중 현재까지 가장 잘 알려진 SIRT1의 기질은 세포주기 및 세포 자연사 조절에 중요한 암 억제단백질 p53이다. p53은 서열특이적 전사인자로써 p21WAF1, GADD45, Bax 유전자 등의 발현을 촉진한다. DNA 손상 또는 CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 효소 (histone acetylatransferase: HAT)는 p53의 아세틸화를 유도하여 p53의 DNA 결합 활성을 증가시키며, 이에 따라 전사활성을 증가시킨다 (Gu and Roeder, Cell 90, 595606, 1997; Liu et al., Mol. Cell. Biol. 19, 12021209, 1999; Sakaguchi et al., Genes Dev. 12, 28312841, 1998). 역으로 SIRT1은 p53과 결합하고 탈아세틸화를 유도하여 p53의 전사활성을 억제하게 된다 (Langley et al., EMBO J. 21, 23832396, 2002; Luo et al., Cell 107, 137148, 2001; Vaziri et al., Cell 107, 149159, 2001). 나아가 p53의 탈아세틸화는 DNA 손상 또는 스트레스로 유발된 세포노화와 세포자연사를 억제한다. 기타 SIRT1의 기질로는 DNA 복구에 관여하는 Ku70 (Cohen et al., Science 305, 390392, 2004), 당대사 및 인슐린분비와 관련된 FOXO1 (Brunet et al., Science 303, 20112015, 2004; Motta et al., Cell 116, 551563, 2004), 신경세포증식에 관련된 NF-kB (Yeung et al., EMBO J. 23, 23692380, 2004), 에너지대사에 중요한 PGC-1α (Rodgers et al., Nature 434, 113118, 2004), 비만과 유관한 PPARγ (Picard et al., Nature 429, 771776, 2004) 등이 있다.

SIRT1의 기질은 상기와 같이 많이 알려져 있지만, SIRT1의 활성 조절 인자에 대하여는 간접적 SIRT1 활성 조절인자가 일부 보고될 뿐, 직접적 조절인자는 알려지고 있지 않다.

또한, 본 발명을 통해 발굴한 AROS(Active Regulator of SIRT1) 단백질은 NCBI 접근번호 BC037573의 단백질이며, 리보솜 S19-결합 단백질로 알려져 있을 뿐(Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 339, 41-46, 2006), 그 기능은 알려져 있지 않다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 SIRT1활성조절용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병의 예방 또는 치료용 조성물 및 그 용도를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 AROS 단백질의 항체 및 그 용도를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 AROS 단백질 검출방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 AROS 발현조절물질의 검색방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 AROS 단백질과 SIRT1 결합조절물질의 탐색방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 AROS 단백질 활성억제용 조성물 및 그 용도를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 AROS 단백질 활성을 억제하 는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, SIRT1활성 강화용 조성물을 제공한다.

본 발명은 AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하며 SIRT1활성화에 의해 효과를 나타내는, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 유전자는 DNA, cDNA, 및 mRNA 중 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 AROS 단백질을 코딩하는 DNA의 전사 및 번역에 의해 상기 AROS 단백질을 세포내 또는 세포외에서 생성하는 것이 가능하다.

상기 AROS(Active Regulator of SIRT1)단백질은 SIRT1과 결합하는 인자로 도 1에 도시된 아미노산서열을 가지며, SIRT1의 활성을 강화시키는 작용을 한다. 상기 SIRT1은 포유류 SIRT 패밀리에 속하는 인간의 sirtuin 1으로 탈아세틸 활성을 갖는다.

상기 cDNA는 NCBI 접근번호 BC037573에 개시된 서열로 구성된 것일 수 있으며, 상기 서열 중 128 내지 538 위치의 서열(도 1)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 mRNA는 NCBI 접근번호 BC037573에 개시된 서열에 상보적인 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 SIRT1활성화에 의해 효과를 나타내는, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병 치료제의 제조를 위한 AROS 단백질 또는 AROS 단 백질을 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다.

본 발명에서 상기 유전자는 DNA, cDNA, 및 mRNA 중 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 신경퇴행성질병은 알츠하이머, 근위축성축삭경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 또는 다발성경화증일 수 있다.

본 발명에서 상기 노화관련질병은 심장병, 관절염, 고혈압, 또는 알츠하이머일 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 투여하여 SIRT1활성화에 의해 효과를 나타내는, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 유전자는 DNA, cDNA, 및 mRNA 중 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 신경퇴행성질병은 알츠하이머, 근위축성축삭경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 또는 다발성경화증일 수 있다.

본 발명에서, 상기 노화관련질병은 심장병, 관절염, 고혈압, 또는 알츠하이머일 수 있다.

AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 조성물은, 생체내 또는 세포내,외에서 SIRT1의 활성을 강화한다.

본 발명의 조성물을 환자에 적용함에 있어 유효성분을 기준으로 체중 1kg당 1일 1ng 내지 1g의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명은 AROS 단백질 항체, AROS SiRNA, AROS 안티센스 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 유효성분으로 함유하는 SIRT1활성억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 AROS 단백질과 특이적으로 결합하는 다클론성항체를 제공한다.

본 발명에서, 상기 항체는 AROS 단백질의 25-33잔기를 인식할 수 있다.

상기 잔기는 프로티안(Protean, 디엔에이스타(DNA Star)) 프로그램을 이용하여, 선정한 항원성이 뛰어난 부위이다.

본 발명은 상기 항체와 AROS 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 AROS 단백질 검출방법을 제공한다.

본 발명은 상기 다클론성항체를 유효성분으로 하며 SIRT1활성억제에 의해 효과를 나타내는, 항암용 조성물을 제공한다. 상기 항암용 조성물은 SIRT1활성억제에 의해 p53의 활성이 강화되어 나타나는 항암작용에 의한 것일 수 있으며, 대장암, 또는 폐암 등에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명은 SIRT1활성억제에 의해 효과를 나타내는 암치료제의 제조를 위한, AROS 단백질과 특이적으로 결합하는 다클론성항체의 용도를 제공한다.

본 발명에서 상기 항체는 AROS 단백질의 25-33잔기를 인식하는 것일 수 있다.

본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 AROS 단백질과 특이적으로 결합하는 다클론성항체를 투여하여 SIRT1활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 예방 또는 치료방법은 SIRT1활성억제에 의해 p53의 활 성이 강화되어 나타나는 항암작용에 의한 것일 수 있으며, 대장암, 또는 폐암 등에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 상기 다클론성항체는 AROS 단백질의 25-33잔기를 인식하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 다클론성항체는 AROS 단백질의 함량을 측정함으로써, AROS 단백질의 작용활성 또는 억제에 기인하여, 예방 또는 치료될 수 있는 질병의 진단이 가능한 조성물, 진단방법 또는 용도를 제공할 수 있다.

본 발명의 다클론성 항체 제제는 일반적으로 정맥내 투여의 경우 유효성분을 기준으로 성인에 대하여 체중 1㎏당 1일 0.001 내지 1000㎎으로 투여할 수 있다.

본 발명은 AROS 단백질의 항체와 AROS 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 AROS 발현조절물질의 검색방법을 제공한다.

본 발명은 AROS 단백질과 SIRT1을 결합시키는 단계를 포함하는 AROS 단백질과 SIRT1 결합 조절물질의 탐색방법을 제공한다.

상기 탐색방법은 이스트 투-하이브리드법, GST 풀다운분석법, 또는 이뮤노프리시피테이션(Immunoprecipitation)분석법에 의한 것일 수 있다.

본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 유효성분으로 함유하는, AROS 단백질 활성억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 유효성분으로 하며 SIRT1 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 AROS 단백질 활성억제제의 제조를 위한 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스의 용도를 제공한다.

본 발명은 SIRT1 활성억제에 의해 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료제의 제조를 위한 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스의 용도를 제공한다.

본 발명은 포유동물에게 유효량의 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 투여하여, AROS 단백질 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 투여하여 SIRT1 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 듀플렉스는 서열번호 1의 센스 5'-UCUCGUCCUGGUCAGAAACUUCAGG-3' 와 서열번호 2의 안티센스 5'-CCUGAAGUUUCUGACCACGAGA-3'가 결합하여 형성된 siRNA로, 세포내 AROS 단백질 발현을 억제할 수 있다. 상기 siRNA는 세포내 AROS 단백질발현을 억제하기 위한 것으로, 암억제인자인 p53활성 등을 증가시켜 암치료에 활용할 수 있다.

본 발명의 siRNA는 그 자체로 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤 형질도입(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감 염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다.

본 발명의 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는, 즉 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함한다. 이러한 변형체는 상기한 siRNA 서열과 70% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘(Altschul, J. Mol. Biol. 219-555-565, 1991, Heniloff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992)을 이용하여 폴리뉴클레오타이드의 서열을 표적 폴리뉴클레오타이드의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.

상기 암은 폐암, 대장암 등 암억제인자인 p53활성 등을 증가시켜 치료할 수 있는 모든 암을 포함하는 것이다.

상기 siRNA는 추가로 암 예방 또는 치료를 위해 암 환자의 암 세포의 증식을 저해시키는 추가의 물질을 포함하여 사용할 수 있으며, siRNA의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다.

본 발명의 siRNA의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여방법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들 에 의해 용이하게 결정될 수 있으나, 약 0.01ug 내지 약 100ug/kg/day의 범위일 수 있다.

본 발명은 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 유효성분으로 함유하는, AROS 단백질 활성억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 유효성분으로 하며 AROS 단백질 발현억제에 의해 효과를 나타내는, 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 AROS 단백질 활성억제제의 제조를 위한 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주의 용도를 제공한다.

본 발명은 암 예방 또는 치료제의 제조를 위한 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주의 용도를 제공한다.

본 발명은 포유동물에게 유효량의 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 투여하여, AROS 단백질 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 투여하여 AROS 단백질 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여방법, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있으나, 약 0.01ug 내지 약 100ug/kg/day의 범위일 수 있다.

본 발명에 의한 AROS 단백질, SiRNA, 다클론성 항체 또는 AROS 안티센스 DNA 를 유효성분으로 하는 조성물은 주사 등의 비경구 경로로 투여가능하며, 필요에 따라 액체 또는 동결 건조된 형태로 제형화해도 좋다. 또한, 임의로 제약학상 허용되는 담체, 예컨대 안정화제, 방부제, 등장화제 등을 함유시킬 수도 있다. 제약학상 허용되는 담체로는 동결 건조된 제제일경우, 만니톨, 락토오스, 사카로오스, 인간 알부민 등을 예로 들 수 있다. 액상 제제의 경우에는 생리 식염수, 주사용수, 인산염 완충액 등을 예로 들수 있다. 그러나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별, 건강의 일반적인 상태, 질병의 정도 및 투여되는 조성물의 성분에 따라 다양하다.

상기 AROS단백질을 코딩하는 유전자, AROS 안티센스 DNA, 또는 SiRNA를 포함하는 조성물은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함할 뿐만 아니라, 직접적으로 주입하거나 올리고뉴클레오타이드-리포솜을 포함할 수 있다. 단백질을 암호화하는 DNA를 바이러스 벡터에 삽입시키는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 재조합 DNA를 포함하는 바이러스 입자 또는 상기 바이러스 입자를 이용하여 트랜스덕션된 세포주를 제조한 뒤, 이를 유전자 치료에 사용되는 기재와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA를 포함하는 세포주도 동일한 방식으로 제조할 수 있다.

유전자 치료용 기재는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기재라도 사용 가능하다. 예를 들어, 기재는 증류수, 염화나트륨 염 용액, 염화나트륨 및 무기 물염의 혼합물 또는 그와 유사한 혼합물, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 아르기닌 같은 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염용액 및 글루코스 용액의 혼합 및 이와 유사한 용액 등을 포함한다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름 같은 식물성 기름, 또는 레시친, 비이온성 표면활성제 같은 계면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결건조형 등으로 제조하여 사용하기 바로 전에 용해하여 쓸 수도 있다. 본 발명의 조성물은 고체상인 경우 유전자 치료 바로 전에 필요하면 미리 멸균한 기재에 용해하여 사용하거나, 액상인 경우 별도의 처리 없이 그대로 사용할 수 있다. 또한, 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.

상기에서 벡터를 포함하는 세포주로는 환자의 MHC(major histocompatibility complex)항원이 동일하거나 유사하여 이식시 조직 거부 반응이 일어나지 않는 모든 세포가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 환자 자신의 활막 세포를 분리하여 유전자 전달에 사용함으로써 조직 이식 거부 반응을 완전히 배제할 수 있어 바람직하다.

본 발명에 의해 SIRT1활성의 조절이 가능하여, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병, 또는 노화관련질병의 예방 또는 치료가 가능하고, 이를 이용한 예방 또는 치료방법 및 용도를 제공할 수 있다. 또한, AROS 및 SIRT1과 관련된 물질의 탐색이 가능하다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 제조예 1] 각종 세포에서 AROS 단백질 발현용 플라스미드 제조

1) 대장균

PCR을 통해 확보한 AROS cDNA(HeLa cDNA 라이브러리를 템플리트로 하여 PCR로 증폭한 AROS cDNA(NCBI 접근번호 BC037573))를 대장균 발현용 벡터 [His-tag 단백질용 pET15b (Invitrogen, Carlsbad, CA), GST-tag 단백질용 pGEXT-4T (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)]에 전통적인 클로닝법으로 도입하고, 필요에 따라 IPTG로 대장균내 발현을 유도한 후 각각 니켈-친화성, 글루타치온-친화성 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 His-tag, GST-tag된 AROS 단백질을 순수 정제하였다.

2) 효모

PCR을 통해 확보한 서열번호 3의 AROS cDNA를 효모 발현용 벡터 [LexA DBD-tag용 pBTM116 및 VP16 AD-tag용 pASV3 (Kim et al., J. Biol. Chem. 277, 3202032028, 2002), Gal4 AD-tag용 pGAD10 (BD Biosciences)]에 전통적인 클로닝법으로 도입하였다.

3) 동물세포

PCR을 통해 확보한 서열번호 3의 AROS cDNA를 동물세포 발현용 벡터 [Flag-tag용 pcDNA3 (Invitrogen), GFP-tag용 pEGFP 및 HcRed-tag용 pHcRed (BD Biosciences)]에 전통적인 클로닝법으로 도입하였다.

[ 제조예 2] 세포주 제조

본 발명에 사용한 세포주 H1299와 HCT116는 RPMI1640배지에서 배양되었고, 다른 세포들은 DMEM 배지(5% 열불활성FBS와 항생-항진균성; Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 배양되었다. 상기 배양은 37℃, 5% 이산화탄소대기중에서 행해졌다.

PCR을 통해 센스, 안티센스 방향으로 확보한 AROS cDNA를 동물세포 발현용 벡터인 pcDNA3(G418-저항성)에 도입하였다. 이렇게 제조된 플라스미드 DNA를 대장암 세포주 HCT116에 도입하고 G-418 (Amersham Pharmacia Biotech)을 24시간 동안 1mg/ml 처리한 후, 3-5일 후, G-418을 함유하는 배지에서 배양하여 2주 후에 G-418에 저항성을 갖는 콜로니를 확보하고, AROS 단백질의 발현 증감 여부를 웨스턴 블럿으로 확인하였다.

[ 실시예 1] AROS 폴리클로날 항체의 제조

합성한 AROS peptide 항원(아미노산 25-33)((주)펩트론, 대한민국)을 글루타알데히드 콘주게이션법으로 KLH와 콘주게이션하고 생리식염수에 0.2mg/ml로 녹였다. 녹인 액 5ml를 SPF 백색토끼에 피하주사하여 토끼를 면역화하였다. 2주 걸러 3회 면역화한 후 ELIZA방법으로 항체값을 확인하고, 귀 동맥으로부터 대량채혈을 실 시하였다. 채혈된 혈액으로부터 항혈청을 얻었다. CNBr로 활성화된 Sepharose 4V(GE Healthcare)에 AROS 단백질 항원을 고정화하여 친화성 컬럼을 제조하고 생리식염수로 평형화한 후 5ml의 항혈청을 통과시켰다. 이후 생리식염수(+ 1M NaCl)로 8번 세척하고, 100mM glycine(pH 2.5)으로 용출시키고, 1M Tris-Cl(pH 8.0)이 미리 들어있는 튜브에 용출분획을 회수하여 정제된 항체를 얻었다.

[ 실시예2 ] AROS 폴리클로날 항체에 의한 AROS 단백질 검출효과 확인

AROS 단백질과, 실시예 1에서 제조된 폴리클로날 항체 (1:100 희석) 및 Texas Red-conjugated anti-rabbit IgG (1:200 희석; Amersham Pharmacia Biotech)에 반응 시킨 후 웨스턴 블랏 및 형광현미경 (AX70; Olympus Optical Co, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 결과를 도 1 C(웨스턴 블랏)과 도 1 D(형광현미경)에 나타내었으며, 본 발명의 항체에 의해 AROS 단백질이 용이하게 검출됨을 확인하였다.

[ 실시예 3] AROS 발현 억제용 siRNA 제조

서열번호 1 및 서열번호 2의 듀플렉스로 이루어진 siRNA, 즉 센스 5'-UCUCGUCCUGGUCAGAAACUUCAGG-3'와 안티센스 5'-CCUGAAGUUUCUGACCACGAGA-3를 Invitrogen사(미국)에 의뢰하여 duplex형태로 제공받았다. 최종 100mM의 농도로 물에 녹인 후 Lipofectamine 2000(Invitrogen)으로 50, 100nM을 동물세포(HCT116)에 도입하고, AROS의 발현억제는 웨스턴 블랏으로 확인하였다.(도 3D)

[ 실시예 4] siRNA 에 의한 AROS 발현억제 효과 확인

제조예 2에 나와 있듯이 PCR을 통해 확보한 서열번호 2의 AROS cDNA를 동물세포 발현용 벡터 pcDNA3 (Invitrogen)에 정방향(서열번호 3의 AROS cDNA) 또는 역 방향(서열번호 5의 AROS cDNA)을 삽입하여 각각 AROS 센스 및 안티센스 발현 벡터를 제조하였다. 제조한 AROS 센스 및 안티센스 발현 벡터를 동물세포(H1299 세포)에 도입한 후 AROS 단백질의 발현 및 발현억제 여부를 웨스턴 블랏으로 확인하였다 (각각 도 2D, 4C). 한편 제조예 2를 통해 제조한 AROS 센스 발현용 HCT116 세포주 (S, 1개; S#1) 및 안티센스 발현용 HCT116 세포주(AS, 2개; AS#1, AS#2)에서 추출한 단백질로 웨스턴 블랏으로 확인한 결과 AROS-S#1에서는 AROS 단백질이 증가, AROS-AS#1 및 AROS-AS#2에서는 AROS 단백질 발현이 억제됨이 확인되었다 (도 6A, 좌측).

[ 실시예 5] AROS 단백질이 SIRT1 발현 조절에 미치는 효과 확인

1) AROS 단백질의 분리

AROS 단백질은 동물세포에서 다음 방법으로 분리하였다.

LexA DBD를 연결한 SIRT1을 미끼로 하고 Gal4 AD에 연결한 HeLa 세포의 cDNA library (BD Biosciences, Palo Alto, CA)를 이용하여 Yeast two-hybrid 탐색방법으로 SIRT1의 활성을 직접 조절하는 세포 내 인자를 탐색하였다. 실험방법은 LexA를 연결한 SIRT1을 미끼로 사용한 것을 제외하고는 공지의 방법(Kim et al., J. Biol. Chem. 277, 32020-32028, 2002)에 따랐다. 그 결과 SIRT1과 결합하는 인자로 AROS (Active Regulator of SIRT1: GenBank number BC037573)를 분리해 냈다.

도 1 A는 본 발명에 따른 인간 AROS 단백질의 전장 아미노산서열과 그를 코드화하는 cDNA의 핵산서열을 나타낸 것으로, 도 1 A에 도시한 바와 같이 인간 AROS단백질을 코드하는 전장 cDNA(서열번호 3)는 135개 아미노산을 코드하여, AROS단백 질(서열번호 4)을 만드는 것을 알 수 있다.

2) AROS mRNA의 발현확인

KPL (Gaithersburg, MD)사의 키트를 이용하여 biotin-labeled DNA 탐침 (AROS and control β-actin)을 제작하고 human Multiple Tissue Northern (MTN) Blot Membrane (#7780-1; BD Biosciences)을 구매하여 Detector AP Chemiluminescent Blotting Kit (#54-30-02 KPL)로 노던 블랏으로 분석하고, 그 결과는 도 1 B에 나타내었다.

도 1 B는 인간조직에서 AROS mRNA 발현정도를 노던 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. β-엑틴은 내부 대조군으로 이용한 것이다.

도 1 B에 도시한 바와 같이 AROS mRNA는 상대적으로 심장, 간, 소장, 폐 등에서 높게 나타났다.

3) AROS 단백질에 의한 SIRT1의 발현 조절 효과 확인

AROS 단백질과 SIRT1과의 상관성을 분석하기 위하여 각종 암세포주에서 분리한 단백질로 ECL 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 실시예 1에서 제조한 AROS 항체와 SIRT1 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 웨스턴블랏 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 1 C에 도시하였다.

도 1 C에 도시한 바와 같이 AROS의 발현과 SIRT1 발현은 유사한 패턴으로 발현됨이 확인되었다.

4) 세포 내 AROS 단백질의 분포 확인

세포내 AROS 단백질을 폴리클로날 항체(1:100 희석) 및 Texas Red- conjugated anti-rabbit IgG (1:200 dilution; Amersham Pharmacia Biotech)과 반응시킨 후, 형광현미경 (AX70; Olympus Optical Co, Tokyo, Japan)으로 분석하고, 결과를 도 1 D에 나타내었다. 도 1 D의 왼쪽은 세포 내 AROS를 나타내고, 오른쪽은 과발현된 AROS를 나타낸다. 또한, 핵을 나타내기 위해 훼스트 염색(Hoechst staining)을 이용하였다. 도 1 D에 나타낸 바와 같이 AROS 단백질은 세포핵에 존재하고, GFP-AROS를 과발현시켰을 때는 세포핵 내 특정 영역 (핵인 또는 heterochromatin)에 존재함을 확인하였다.

상기 결과로부터 AROS 단백질과 SIRT1은 동일하게 세포핵 내에 분포하며, 세포에서 발현하는 패턴도 동일함을 알 수 있다.

[ 실시예 6] AROS 와 SIRT1 사이의 결합 확인

1) AROS 단백질과 SIRT1의 특이적 결합확인

LexA DBD-SIRT family와 Gal4 AD-AROS를 이용하,여 기존에 알려진 Yeast two-hybrid 분석방법(Kim et al., J. Biol. Chem. 277, 3202032028, 2002)으로, AROS 단백질과 SIRT family1의 상호반응을 확인하고 그 결과를 도 2 A에 나타내었다.

상호반응은 β-gal 분석법으로 측정하였고, 폴딩활성(folding activity)은 Gal4 AD 엠프티 콘트롤(empty control)의 상대적인 값을 나타낸다. 데이타는 3회 실험의 평균±표준편차를 나타낸다.

도 2 A에 도시한 바와 같이 AROS 단백질은 SIRT family 중 SIRT1에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

2) 결합부분 확인

PCR을 통해 SIRT1의 각종 결실을 LexA DBD 벡터 (pBTM116)에 제조하고 공지 방법(Kim et al., J Biol Chem., 277, 32020-32028, 2002)으로 이스트 투-하이브리드(Yeast two-hybrid) 분석을 하였다.

도 2 B는 AROS 단백질과 상호작용하는 SIRT1 도메인의 지도를 나타낸 것이다. 폴딩활성은 Gal4 AD 엠프티 콘트롤(empty control)과 LexA DBD-SIRT1의 합과 비교한 상대적인 β-gal값을 나타낸다. 데이타는 3회 실험의 평균±표준편차를 나타낸다.

도 2 B에 나타난 바와 같이, AROS 단백질은 SIRT family에서 SIRT1에만 존재하는 아미노산 114-217 부분과 결합하는 것으로 확인되었다.

3) 시험관 내(in vitro)에서 AROS 단백질과 SIRT1 사이의 결합 확인

대장균에서 글루타치온-세파로스 비즈(glutathione-Sepharose beads; Amersham Pharmacia Biotech)로 분리한 GST-SIRT1 (아미노산 114-217)과 티엔티 레티큘로싸이트시스템(TNT reticulocyte system; Promega, Madison, WI)으로 시험관내(in vitro)에서 합성한 AROS 단백질을 이용해 GST pull-down과 AROS 항체로 웨스턴 블랏을 수행하였다.

도 2 C는 그 결과를 나타낸 것으로, 시험관 내에서도 AROS 단백질이 SIRT1에 직접 결합됨이 확인되었다.

4) 세포 내에서 AROS 단백질과 SIRT1 사이의 결합 확인

세포내에서 AROS 백질과 SIRT1 사이의 결합은 이하의 2가지 조건의 면역침전 법(immunoprecipitation; IP)으로 확인하였다.

4-1) Flag 항체로 면역침전 후, SIRT1 항체로 확인

먼저 폐암 세포주 H1299에 Flag-AROS 발현벡터를 도입한 후 세포추출물을 얻고 Flag 항체(mouse monoclonal; Sigma, St. Louis, MO)로 면역침전시키고 SIRT1 항체 (rabbit polyclonal; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 웨스턴블롯팅을 수행하였고, 또한 반대 방향으로 실험을 수행하였다.

그 결과를 도 2 D에 도시하였으며, AROS 단백질과 SIRT1의 결합을 확인하였다.

4-2) AROS 항체로 면역침전 후, SIRT1 항체로 확인

세포내 존재하는 AROS단백질과 SIRT1사이의 결합은 AROS 항체로 IP, SIRT1 항체로 웨스턴블롯을 수행하여 확인하였고, 그 결과를 도 2 E에 나타내었다.

도 2 E에 나타난 바와 같이 AROS단백질과 SIRT1 사이의 결합은 DNA 손상 조건 (20 μM Etoposide + 0.5 μM TSA를 6시간 처리)에 영향이 없음이 확인되었다.

5) 형광현미경분석

AROS 단백질과 SIRT1 사이의 세포내 결합을 재차 확인하기 위하여 각각의 1차 항체(AROS의 경우 자체 제작된 폴리클론항체, SIRT1의 경우 Santa Cruz Biotechnology에서 구입한 단클론항체)와 AROS의 경우 Texas Red가 붙은 이차 항체 (Amersham Pharmacia Biotech), SIRT1의 경우 FITC 가 붙은 이차 항체 (Santa Cruz Biotechnology)로 세포내 SIRT1과 AROS 단백질을 형광현미경(AX70; Olympus Optical Co, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 이를 위해 생리식염수로 세척된 H1299 세포는 4% paraformaldehyde로 고정, 0.5% Triton X-100으로 구멍을 뚫어 각각의 항체로 반응시켰다.

도 2F에 그 결과를 나타냈으며, AROS단백질과 SIRT1 모두 핵질에 존재함을 확인하였다.

[ 실시예 7] AROS 단백질에 의한 p53 의 탈아세틸화 ( deacetylation ) 촉진 효과 확인

본 발명의 AROS 단백질이 SIRT1의 대표적 활성인 p53 단백질의 탈아세틸화(deacetylation)에 미치는 영향을 분석하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

1) 시험관 내(in vitro)시험

대장균에서 GST-AROS, SIRT1을 분리하고 형광이 붙은 아세틸 p53 peptide (아미노산 379-382)를 구매 ( Biomol, Plymouth Meeting, and PA ) 하고 Flour de Lys-SIRT1 Assay Kit (Biomol)를 사용하여 공지의 방법에 따라 실험하였다 (Langley et al., EMBO J. 21, 23832396, 2002).

실험 결과를 도 3 A에 도시하였다. 그 결과 SIRT1 혼자서도 p53의 탈아세틸화를 유도하였으나 GST만 들어갔을 때에 비해 추가로 GST-AROS를 넣으면 p53의 탈아세틸화가 의미있게 증가하는 것이 관찰되었다.

2) 생체 내(in vivo) 시험

2-1) CBP에 의해 유도된 p53 아세틸화 억제 효과 확인

CBP에 의한 p53의 아세틸화는 공지의 방법에 따라 수행되었다 (Gu and Roeder, Cell 90, 595606, 1997).

SIRT1, AROS, 또는 SIRT1 및 AROS를 조합하여, H1229세포에 p53, HA표지 CBP발현벡터를 도입(cotransfection)하였다. 세포용해물은 HA, Ac-p53(K-382), 및 p53에 대한 항체로 웨스턴블럿을 하여 분석하였다.

그 결과를 도 3B에 나타내었다.

도 3B에 나타난 바와 같이 p53만을 인식하는 항체 (Santa Cruz Biotechnology)를 이용한 웨스턴블랏으로 SIRT1 또는 AROS를 H1299 세포에 과발현시켰을 때 HAT (histone acetyltransferase) 활성을 가진 CBP에 의해 유도된 p53의 아세틸화가 감소되나, 전체 p53 단백질의 양에는 변함이 없음을 확인하였다.

2-2) 에토포사이드와 트리코스타틴에 의해 유도된 p53 아세틸화 억제효과 확인

에토포사이드와 트리코스타틴에 의한 p53의 아세틸화는 공지의 방법에 따라 수행되었다 (Luo et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101, 2259-2264, 2004).

HCT116세포에 SIRT1, AROS, 또는 SIRT1 및 AROS 발현벡터를 도입하였고, 20μM 에토포사이드(etoposide)와 0.5μM TSA로 처리하였다. 세포용해물은 Flag, Ac-p53 및 p53에 대한 항체를 사용한 웨스턴블랏으로 분석하였다.

그 결과를 도 3 C에 나타내었다.

도 3 C에 나타낸 바와 같이 DNA damage를 유도하는 etoposide와 p53의 아세틸화를 증가시키는 HDAC (histone deacetylase) 억제제 TSA (tricostatin A)를 처리시 HCT116 세포에 있는 p53의 아세틸화가 증가, SIRT1 또는 AROS를 과발현시키면 감소, 나아가 SIRT1과 AROS를 동시에 발현시키면 더욱 감소하는 것으로 나타났다.

이와 같은 결과는 SIRT1와 AROS 단백질의 작용에 의해 p53의 아세틸화를 억제하는 것을 나타내는 것이다.

3) RNA 저해 실험

실시예 3에 나와 있는 실험법에 따라 AROS siRNA를 이용하여 실험을 수행하였다.

HCT116 세포에 AROS siRNA (50, 100 nM: Invitrogen)를 하루동안 처리하였고, p53의 아세틸화를 위해 etoposide/TSA 처리(각각 20μM, 0.5μM로 6시간 처리)하였다. AROS의 발현과 p53의 아세틸 정도는 웨스턴블랏으로 확인하였고, 이 때 로딩컨트롤(loading control)로 β-엑틴의 발현을 β-틴 항체로 웨스턴블랏을 하여 분석하였다.

도 3 D는 RNA 저해 실험의 결과를 나타낸 것이다.

그 결과 RNA 저해 μ실험을 위해 AROS siRNA (50, 100 nM: Invitrogen)를 처리한 경우, 대조 siRNA에 비해 세포내 AROS 단백질 양이 감소하였고 이에 따라 etoposide/TSA 처리(각각 20μM, 0.5μM로 6시간 처리)로 유도된 p53의 아세틸화가 더욱 증가된 결과를 알 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 AROS siRNA에 의해 AROS 단백질의 발현이 억제되고, 그 결과 p53의 아세틸화는 증가되는 것을 알 수 있다.

상기의 결과를 통해 AROS 단백질은 세포내 SIRT1을 도와 p53의 탈아세틸화를 강화하는 인자임을 알 수 있다.

[ 실시예 8] AROS 단백질의 p53 전사활성 억제 효과 확인

AROS 단백질이 p53의 전사활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

1) SIRT1 야생형과 디아세틸라제 결함형에 대한 AROS 단백질 영향

AROS 단백질에 의해 유도된 p53의 탈아세틸화가 p53의 전사활성에 미치는 영향을 트랜스펙션(transfection) 실험법으로 분석하였다.

p53이 없는 H1299세포(한국세포주은행, 서울대학교 의과대학)에 p53에 의해 발현이 유도되는 Bax 유전자의 프로모터(promoter)를 루시퍼라제(luciferase) 리포터 유전자에 결합시킨 Bax-Luciferase를 도입하고, Flag-AROS, Flag-SIRT1 야생형(WT), 또는 Flag-SIRT1 HY 변이형(디아세틸라아제 결함형)의 양을 증가(0.1, 0.3, 0.5μg)시키며 도입하였으며, p53발현벡터를 상호 조합하여 도입하였다.

조합은 도 4 A의 X축에 나타낸 바와 같다. +는 함유된 것을 의미하며, -는 함유되지 않은 것을 의미한다. 직각삼각형형태는 주입양이 증가하는 것을 의미하며, 직사각형 형태는 주입양이 일정한 것을 의미한다.

루시퍼라아제 활성은 관찰된 β-gal 활성으로 정상화한 후 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 결정하였다. Y축의 폴드-루시퍼라아제 활성은 p53벡터의 존재와 부재시 얻어진 상대적 비를 나타낸 것이다. 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 분산은 p값을 계산하여 나타냈다.

도 4 A에 결과를 나타내었다.

도 4 A에 나타난 바와 같이 p53에 의해 증가된 루시퍼라제 활성은 AROS 및 SIRT1에 의해 감소된다. 한편 탈아세틸 활성이 없는 SIRT1 HY 변이형(mutant)은 p53의 활성에 영향이 없었고, AROS에 대한 반응도 없었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 AROS 단백질이 SIRT1와 함께 p53의 탈아세틸화를 유발하고 나아가 p53의 전사활성을 억제하는 것이 확인된다.

2) SIRT1과 AROS단백질에 의한 p53 전사활성 억제효과 확인

H1299세포에 p53, SIRT1, AROS 발현 벡터를 조합하여 도입하였다. 세포는 12시간 동안 니코틴아미드(NAM)의 농도를 증가(1, 5, 10 mM)시키며 처리하였다. 그 후 세포용해물을 루시퍼라아제 분석법으로 분석하였다. 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 분산은 p값을 계산하여 나타냈다.

조합은 도 4 B의 X축에 나타낸 바와 같다. +는 함유된 것을 의미하며, -는 함유되지 않은 것을 의미한다. 직각삼각형형태는 주입양이 증가하는 것을 의미하며, 직사각형 형태는 주입양이 일정한 것을 의미한다.

루시퍼라아제 활성은 관찰된 β-gal 활성으로 정상화한 후 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 결정하였다. Y축의 폴드-루시퍼라아제 활성은 p53벡터의 존재와 부재시 얻어진 상대적 비를 나타낸 것이다. 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 분산은 p값을 계산하여 나타냈다.

도 4 B에 그 결과를 나타냈다.

도 4 B에 나타낸 바와 같이 SIRT1의 활성 억제물질로 잘 알려진 Nicotinamide (NAM)를 1, 5, 10 mM로 12시간 처리 시 AROS 또는 SIRT1에 의한 p53의 전사활성 억제를 방해하는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는 AROS에 의한 p53의 전사활성 억제에는 SIRT1이 필요함을 의미한다.

3) AROS 안티센스 도입에 따른 세포내 p53 전사활성에 대한 영향

제조예 2와 실시예 4에 나와 있는 실험법에 따라 AROS 안티센스를 이용하여 실험을 수행하였다.

H1299세포에 p53과 AROS안티센스 발현 벡터를 도입하여 세포용출물을 루시퍼라아제 시험법으로 측정하였다. 아세틸화 p53, AROS, 및 p53의 수치를 웨스턴블랏으로 측정하였다. 루시퍼라아제 활성은 관찰된 β-gal 활성으로 정상화한 후 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 결정하였다. Y축의 폴드-루시퍼라아제 활성은 p53벡터의 존재와 부재시 얻어진 상대적 비를 나타낸 것이다. 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다.

그 결과를 도 4 C에 나타내었다.

도 4 C에 나타낸 바와 같이, H1299 세포에 AROS 안티센스(antisense)를 도입하여 세포내 AROS 양을 줄이면 p53의 발현에는 영향 없이 p53의 전사활성과 아세틸화가 증가되는 것을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 AROS에 의한 p53의 전사활성 억제에는 SIRT1이 필요함을 의미한다.

4) AROS 과발현에 따른 p21WAF1의 발현에 대한 영향

제조예 1-3에 나와 있는 실험법에 따라 AROS 과발현 벡터 (AROS-pcDNA3)를 제조하여 실험을 수행하였다.

한편 AROS를 과발현시켰을 때 etoposide/TSA (각각 20 μM, 0.5 μM로 6시간) 처리로 유도된 p21WAF1 (p53의 또 다른 타겟유전자)의 발현의 억제정도를 알아보기 위해 실험하였으며, 이때 아세틸 p53, p21WAF1, AROS와 p53의 양은 웨스턴블 랏으로 확인하였다.

그 결과를 도 4 D에 나타내었다. AROS를 과발현시켰을 때 etoposide/TSA (각각 20 μM, 0.5 μM로 6시간) 처리로 유도된 p53의 또 다른 타겟유전자인 p21WAF1 의 발현도 억제되는 것을 알 수 있다.

이와 같은 결과로 미루어 AROS는 SIRT1과 함께 p53의 탈아세틸화를 유발하고 나아가 p53의 전사활성을 억제하는 것으로 보인다.

[ 실시예 9] AROS 와 SIRT1 에 의한 p53 활성억제 효과 확인

본 발명의 AROS에 의한 p53 단백질의 활성억제가 SIRT1과의 작용에 의함을 증명하기 위하여 이하의 방법으로 실험하였다.

1) GST pull-down 분석

GST-p53 단백질과 시험관 내(in vitro)에서 합성한 Flag-SIRT1 또는 Flag-AROS을 사용하여 GST pull-down 분석을 하였다. 결합단백질은 anti-Flag 항체를 사용한 SDS-PAGE와 이에 대한 웨스턴블랏으로 나타내었다.

그 결과를 도 5 A에 나타내었으며, 도 5 A에 나타난 바와 같이 AROS 대신 SIRT1이 p53과 직접 결합함이 확인되었다.

이는 AROS 단백질은 SIRT1과 직접 결합하여 p53 활성을 억제함을 의미한다.

2) 생체 내 면역 분석방법 (In vivo Immunoprecipitation(면역침전 분석법))

HCT116 세포주에 Flag-AROS 발현벡터를 도입 후 생체 내 면역분석방법으로, SIRT1, AROS 및 p53의 상호관계를 확인하였다. HCT116세포에 SIRT1 siRNA처리를 한 경우와 하지 않은 경우로 나누어 Flag-AROS벡터를 도입하였다. 세포용출물은 프 리이뮨(preimmune)혈청이나 p53항체으로 면역침전시킨 후, 항-Flag 항체로 웨스턴블랏을 행하였다. SIRT1, p53, 및 Flag-AROS의 발현값은 웨스턴블랏으로 나타내었다.

그 결과를 도 5 B에 나타내었다.

도 5B에 나타낸 바와 같이, p53 항체로 면역침전시킨 후 Flag 항체로 웨스턴블랏 분석을 수행하여 p53과 AROS 사이의 상당한 결합을 확인하였고, 같은 조건에서 추가로 SIRT1 siRNA(Invitrogen)를 처리하여 SIRT1의 발현을 억제 (WB로 확인)했을 때 이들 사이의 결합이 소실되었다. 이는 p53과 SIRT1이 결합함을 의미한다.

3) SIRT1 미발현 세포주를 이용한 확인

SIRT1이 거의 발현되지 않은 HeLa 세포주(한국세포주은행에서 구입: 도 1C 참고)를 사용하여 Bax-Luciferase 리포터 분석을 수행하였다. HeLa 세포에 p53 또는/및 SIRT1벡터로 Flag-AROS의 양을 증가(0.1, 0.3, 및 0.5 μg)시키며 형질도입하였다.

도 5 C에 그 결과를 나타내었으며, 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 분산은 p값을 계산하여 나타냈다.

그 결과 외부에서 SIRT1을 도입했을 때만 AROS의 증가 (0.1, 0.3, and 0.5 μg)에 의한 p53의 전사활성 억제가 관찰되었다. 이와 같은 결과로부터 SIRT1만이 p53의 전사활성 억제에 직접 관여함을 알 수 있다.

4) SIRT1 미발현 세포주를 이용한 확인

공지한 방법 (Luo et al., Cell 107, 137-148, 2001)에 따라 SIRT1 siRNA를 이용하여 실험을 수행하였다. SIRT1 siRNA는 센스 5'-ACUUUGCUGUAACCCUGUA (dTdT)-3'와 안티센스 5'-UACAGGGUUACAGCAAAGU (dTdT)-3'를 Invitrogen에서 duplex 형태로 구매하여 사용하였다.

SIRT1이 과발현되는 H1299 세포주(한국세포주은행에서 구입: 도 1 C 참고)에 SIRT1 siRNA (100 nM)를 처리하여 SIRT1의 발현을 억제 (WB로 확인)했을 때 AROS에 의한 p53의 전사활성 억제 현상 소실여부를 확인하였다. HCT116세포에 Flag-AROS벡터를 도입하고, 100nM의 SIRT1 siRNA 또는 컨트롤 siRNA로 처리하였다. 폴드-루시퍼라아제 활성은 Bax-루시퍼라아제의 존재와 부재시 얻어진 상대적 비를 나타낸 것이다. SIRT1과 AROS값은 웨스턴블랏으로 나타낸 것이다. 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다. 분산은 p값을 계산하여 나타내었다.

그 결과를 도 5 D에 나타내었다.

도 5 D에서 보는 바와 같이 SIRT1이 과발현되는 H1299 세포주 (도 1D)에 SIRT1 siRNA (100 nM)를 처리하여 SIRT1의 발현을 억제(웨스턴블랏으로 확인)했을 때, AROS에 의한 p53의 전사활성 억제 현상이 소실되었고, 이는 SIRT1만이 p53의 전사활성 억제에 직접 관여함을 의미한다.

5) SIRT1발현억제 및 AROS과발현이 p53의 아세틸화에 미치는 영향분석

제조예 1의 3)과 실시예 4에 나와 있는 실험법에 따라 과발현용 AROS 센스벡터를 이용하고, SIRT1 발현억제를 위해서는 실시예 9-4에 나와 있는 실험법에 따라 siRNA를 사용하여 실험을 수행하였다.

HCT116 세포주에서 etoposide/TSA (각각 20 μM, 0.5 μM로 6시간) 처리로 유도된 p53의 아세틸화에 SIRT1의 발현억제 및 AROS의 과발현이 미치는 영향을 분석하였다. HCT116세포에 Flag-AROS, SIRT1 siRNA, 또는 컨트롤 siRNA("C"로 나타냄)을 도입하였다. 1일 후, 세포를 etoposide/TSA (각각 20 μM, 0.5 μM로 6시간) 처리하거나 처리하지 않았다. 단백질값은 Flag(AROS), Ac-p53, SIRT1 및 β-액틴에 대한 항체를 이용하여 웨스턴블랏으로 구하였다.

그 결과를 도 5 E에 나타내었다. 도 5 E에 나타낸 바와 같이 p53의 아세틸화는 SIRT1의 발현억제로 증가, AROS 단백질의 과발현으로 감소, 두 조건이 같이 있을 때는 AROS 단백질의 효과가 상당히 상실되는 것을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터 SIRT1가 p53의 전사활성 억제에 큰 영향을 미침을 알 수 있다.

6) 스플리토마이신 처리에 의한 AROS 단백질의 p53 탈아세틸화 억제 확인

공지한 방법 (Bedalov et al., Proc Natl Acad Sci USA. 98, 15113-15118, 2001)에 따라 SIRT1의 억제물질인 splitomicin을 이용하여 실험을 수행하였다.

SIRT1의 억제물질인 splitomicin을 처리시 AROS에 의한 p53의 탈아세틸화가 억제됨을 확인하고자, 실험하였다. H1299세포에 p53, CBP, 및 AROS벡터를 조합하여 도입하고, splitomicin (240μM, 9시간; Calbiochem, La Jolla, CA)을 처리하였다. 세포용출물은 항체를 이용하여 웨스턴블랏으로 분석하였다.

그 결과를 도 5F에 나타내었다.

도 5 F에 나타나는 바와 같이 잘 알려진 SIRT1의 억제물질인 splitomicin을 처리한 경우, AROS에 의한 p53의 탈아세틸화가 억제됨을 확인하였다.

이와 같은 결과로 AROS에 의한 p53의 불활성화 (탈아세틸 및 전사활성억제) 에는 SIRT1과 SIRT1의 탈아세틸 효소활성이 필요함을 알 수 있다.

[ 실시예 10] p53 의 세포성장 조절활성에 미치는 AROS 단백질의 효과 확인

본 발명에 따른 AROS 단백질이 p53의 세포성장 조절활성에 미치는 영향을 이하의 방법으로 분석하였다.

상기한 대로 AROS는 SIRT1과의 결합을 통해 SIRT1의 효소활성을 증가시킴으로써 p53의 탈아세틸화를 유도하고 나아가 p53의 전사활성을 억제함을 입증하였다. 한편 p53은 암억제 전사인자로 작용하여 암세포의 증식억제 및 세포자연사에 관여한다는 것이 잘 알려져 있으므로 상기한 결과에 기초하여 AROS가 암세포의 성장에 미치는 영향을 분석하였다.

1) AROS 단백질에 의한 세포증식 효과 확인

제조예 2와 실시예 4에 나와 있는 실험법에 따라 AROS를 과발현 (sense: 1개, S#1) 또는 AROS의 세포내 발현을 억제시킨(antisense; 2개, AS#1과 AS#2) 세포주를 제조하여 실험에 사용하였다.

HCT116 세포를 이용하여 AROS를 과발현 (sense) 또는 AROS의 세포내 발현을 억제시킨(antisense) 세포주를 제조(제조예 2의 세포주)하여 AROS의 발현을 웨스턴블랏으로 확인하고 세포증식을 MTT 분석법으로 확인하였다. 안정적으로 Flag-empty, Flag-AROS 센스(S), 또는 AROS 안티센스(AS)를 안정적으로 발현하는 HCT116세포를 1μM 에토포사이드와 0.5μM TSA로 도 6A(우측)그래프에 표시된 시간별로 처리하였다. AROS 단백질발현은 항-AROS 항체로 웨스턴블랏으로 분석하였다.(왼쪽) 세포 생존능력(viability)은 MTT분석법으로 확인하였다.(오른쪽) 데이타는 3회실험 의 평균±표준편차를 나타낸다.

그 결과를 도 6 A에 도시하였다.

도 6 A(좌측)에 도시된 바와 같이 AROS의 세포내 발현을 본 발명의 siRNA에 의해 유효하게 억제시킬 수 있으며, 도 6A(우측)에 도시한 바와 같이 HCT116 세포는 증식이 억제되며, AROS를 과발현하는 세포는 etoposide/TSA 처리에 의한 증식억제에 저항하고, AROS의 세포내 발현을 억제시킨 세포주는 etoposide/TSA 처리에 보다 민감하게 반응하였다. 즉, 본 발명에 따른 AROS 단백질의 세포내 발현을 억제할 경우 세포 생존능력은 감소하며, AROS 단백질에 의해 생존능력은 증가함을 알 수 있다.

2) p21WAF1의 발현에 대한 AROS 단백질의 효과확인

제조예 2와 실시예 4에 나와 있는 실험법에 따라 AROS를 과발현 (센스) 또는 AROS의 세포내 발현을 억제시킨(안티센스) 세포주를 제조하여 실험에 사용하였다.

HCT116 세포를 이용하여 AROS를 과발현 (sense) 또는 AROS의 세포내 발현을 억제시킨 (antisense) 세포주를 제조(제조예 2에 의함.)하여 p53의 타겟유전자이면서 세포증식억제에 중요한 p21WAF1의 발현을 AROS를 과발현하는 세포, 및 AROS의 세포내 발현을 억제시킨 세포에서는 증가함을 웨스팅블랏으로 확인하였다. HCT116안정세포는 상기 1)과 같이 처리되었다. 2일의 처리 후 세포용출물을 웨스턴블랏으로 확인하였다.

그 결과를 도 6 B에 나타내었다.

p53의 타겟유전자이면서 세포증식억제에 중요한 p21WAF1의 발현은 도 6B에 도시한 바와 같이 AROS를 과발현하는 세포에서 상당히 감소, AROS의 세포내 발현을 억제시킨 세포에서는 증가함을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 AROS 단백질은 p53의 전사활성을 억제함을 알 수 있다.

3) 세포주기 프로그레션에 대한 AROS 단백질의 영향 확인

공지한 방법(Kim et al., J Biol Chem, 277, 32020-32028, 2002)에 따라 FACS 분석법을 수행하였다.

세포주기를 분석하기 위해 FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA)를 사용하여 실험한 결과를 나타낸 것이다. 세포는 상기 2)와 동일하게 처리되었다.

그 결과를 도 6C에 나타내었다.

도 6C에 나타난 바와 같이 etoposide/TSA 처리시 G0/G1 상태의 세포가 증가, AROS를 과발현하는 세포의 경우 감소, AROS의 세포내 발현을 억제시킨 세포에서는 G0/G1 상태의 세포가 더욱 증가하였다. 즉, AROS의 세포내 발현에 의해 p53에 의한 세포증식억제효과가 감소됨을 알 수 있다.

4) AROS 단백질이 세포자연사에 미치는 영향 확인

공지한 방법(Kim et al., J Biol Chem, 277, 32020-32028, 2002)에 따라 DAPI 염색법을 수행하였다.

세포는 상기 2)와 동일하게 처리하고, AROS가 세포자연사에 미치는 영향을 분석하기 위해 DAPI 염색법과 정량적 세포자연사 분석법(DNA 분절을 정량화)을 이용하였다.

그 결과를 도 6D에 나타내었다.

etoposide/TSA 처리 후 DAPI 염색을 통해 세포자연사의 특징인 세포핵 내 크로마틴의 응축 및 분절을 도 6D에 나타낸 바와 같이 확인하였다. 그 결과 AROS를 과발현하는 세포에서는 세포자연사의 특징인 세포핵 내 크로마틴의 응축 및 분절과 같은 현상이 감소하였으며, AROS의 세포내 발현을 억제시킨 세포자연사의 특징이 더욱 증가하였다. 이와 같은 결과로 부터 AROS 단백질의 세포내 발현에 의해 세포자연사가 감소함을 알 수 있다.

5) DNA분절의 정량화

공지한 방법(Holdenrieder et al., Clin Chem Lab Med. 39, 596-605, 2001)에 따라 DNA분절의 정량화 실험을 수행하였다.

세포자연사의 지표인 DNA 분절을 정량화하기 위하여 ELISA 분석 (Roche Diagnostics)을 하였다. 세포는 컨트롤 또는 SIRT1 siRNA(100nM)로 하룻밤 처리되고 1μM 에토포사이드와 0.5μM TSA로 2일간 처리하였다. 데이타는 3회실험의 평균±표준편차를 나타낸다.

그 결과를 도 6 E에 나타내었다.

그 결과 도 6 E에 나타난 바와 같이 상기 4)의 결과와 유사한 정량적 패턴을 나타내었고, 이와 같은 패턴은 siRNA로 세포내 SIRT1의 발현을 억제한 경우 대부분 소실되어 AROS에 의한 세포자연사 억제에 SIRT1의 필요성을 입증하였다.

결론적으로, 본 발명에서는 도 6F에 모식적으로 나타낸 바와 같이 AROS 단백질은 SIRT1와의 결합을 통해 SIRT1의 활성을 증가시킴으로써 p53의 불활성화를 유 도하고, 나아가 세포내 p53의 대표적 활성인 세포증식억제 및 세포자연사 유도를 억제함을 알 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 AROS 단백질은 p53의 활성을 억제함으로써, p53의 활성증가에 따른 세포노화와 같은 노화의 치료 및 예방을 위한 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, AROS 단백질을 코딩하는 유전자(DNA, cDNA, mRNA 등)도 상기 AROS 단백질을 전사 또는/및 번역에 의해 생산할 수 있으므로, 세포노화와 같은 노화의 치료 및 예방을 위한 유전자치료제로 사용될 수 있다.

이외에도 예방 또는 치료를 위해 SIRT1 활성강화가 필요한 질병 들인 당뇨병, 신경질병, 비만증, 후천성면역결핍증, 암 등에 사용될 수 있다.

도 1 A는 인간 AROS 단백질의 아미노산서열과 그를 코딩하는 cDNA 서열을 나타낸 것이다.

도 1 B는 인간의 조직 별 AROS mRNA 발현정도를 비교한 도이다.

도 1 C는 각종 암세포주에서 AROS 단백질과 SIRT1의 상관성을 비교한 도이다.

도 1 D는 AROS 단백질의 세포 내 존재를 확인한 도이다.

도 2 A는 AROS 단백질과 SIRT1의 특이적 결합을 나타낸 도이다.

도 2 B는 AROS 단백질과 결합하는 SIRT1 도메인의 지도를 나타낸 도이다.

도 2 C는 AROS 단백질과, 대장균으로부터 분리한 GST-SIRT1의 결합을 시험관 내에서 확인한 도이다.

도 2 D는 폐암 세포주에Flag-AROS 발현벡터를 도입한 후 SIRT1 와의 결합을 확인한 도이다.

도 2 E는 DNA 손상 조건 하에서 AROS 단백질과 SIRT1의 결합을 확인한 도이다.

도 2 F는 대부분의 AROS와 SIRT1가 핵질 내에 공존함을 확인한 면역형광현미경 분석도이다.

도 3 A는 AROS 단백질이 SIRT1에 의한 p53 탈아세틸화에 미치는 영향을 시험관 내에서 분석한 도이다.

도 3 B는 AROS 단백질이 CBP에 의해 유도된 p53의 탈아세틸화에 미치는 영향 을 시험관 내에서 분석한 도이다.

도 3 C는AROS 단백질이 SIRT1과 함께 DNA 손상으로 유발된 내인성 p53의 탈아세틸화를 감소시킴을 확인한 도이다.

도 3 D는 AROS siRNA에 의한 DNA 손상으로 유발된 p53의 아세틸화를 측정한 도이다.

도 4 A는 AROS 단백질이 SIRT1와 함께 p53 에 의해 유도되는 전사활성을 억제함을 확인한 도이다.

도 4 B는 니코틴아미드에 의해 AROS 및 SIRT1에 의해 유도된 p53의 불활성화 저해를 나타낸 도이다.

도 4 C는 AROS 안티센스 도입에 의한 p53 전사활성 증가를 확인한 도이다.

도 4 D는 AROS 에 의하여, DNA 손상으로 유도된 p21WAF1의 발현 억제 효과를 확인한 도이다.

도 5 A는 p53에 결합하는 단백질을 GST pull-down 분석으로 확인한 도이다.

도 5 B는 siRNA tSIRT1이 AROS 단백질과 p53의 상호작용에 관여하는 지를 생체 내에서 siRNA를 이용하여 관찰한 도이다.

도 5 C는 AROS 단백질이 p53의 전사활성에 미치는 영향을 확인한 도이다.

도 5 D는 SIRT1 siRNA가, AROS에 의해 유도된 p53의 전사활성에 미치는 영향을 확인한 도이다.

도 5 E는 SIRT1의 발현억제 및 AROS 의 과발현이, DNA 손상으로 유도된 p53의 아세틸화에 미치는 영향을 분석한 도이다.

도 5 F는 SIRT1의 억제제인 splitomicin 처리시, AROS에 의한 p53의 탈아세틸화가 억제됨을 확인한 도이다.

도 6 A는 AROS가 세포증식에 미치는 영향을 확인한 도이다.

도 6 B는 AROS가 p21WAF1의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.

도 6 C는 AROS 발현이 세포주기에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

도 6 D는 AROS 단백질이 세포자연사에 미치는 영향을 분석한 도이다.

도 6 E는 세포자연사의 지표인 DNA 분절을 정량 분석한 도이다.

도 6 F는 AROS가 SIRT1과의 결합을 통하여 p53 활성에 미치는 영향을 모식적으로 나타낸 도이다.

<110> CHEBIGEN INC. <120> A composition for regulating SIRT1 activity <130> P07-052-KBG <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA for AROS <400> 1 ucucguccug gucagaaacu ucagg 25 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA for AROS <400> 2 ccugaaguuu cugaccacga ga 22 <210> 3 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense cDNA <400> 3 atgtccgccg ccctgctgcg gcggggcctg gagctgctgg cggcgtccga ggccccccgg 60 gaccctccag gtcaggccaa gccgagaggg gctccggtga aacggccccg gaagacgaag 120 gcaattcagg cccagaaact gcggaactcg gccaagggaa aggtgcccaa gtcggcactg 180 gacgagtacc ggaagcgaga gtgtcgagac cacctcagag taaacctgaa gtttctgacc 240 aggacgagaa gcaccgtggc tgagtctgtg agccagcaga ttttgcgcca gaaccggggc 300 cgcaaggcct gtgaccggcc tgtggccaag accaagaaga agaaggctga gggcaccgtg 360 ttcaccgagg aagacttcca gaagttccag caggaatact tcggcagcta g 411 <210> 4 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ala Ala Ser 1 5 10 15 Glu Ala Pro Arg Asp Pro Pro Gly Gln Ala Lys Pro Arg Gly Ala Pro 20 25 30 Val Lys Arg Pro Arg Lys Thr Lys Ala Ile Gln Ala Gln Lys Leu Arg 35 40 45 Asn Ser Ala Lys Gly Lys Val Pro Lys Ser Ala Leu Asp Glu Tyr Arg 50 55 60 Lys Arg Glu Cys Arg Asp His Leu Arg Val Asn Leu Lys Phe Leu Thr 65 70 75 80 Arg Thr Arg Ser Thr Val Ala Glu Ser Val Ser Gln Gln Ile Leu Arg 85 90 95 Gln Asn Arg Gly Arg Lys Ala Cys Asp Arg Pro Val Ala Lys Thr Lys 100 105 110 Lys Lys Lys Ala Glu Gly Thr Val Phe Thr Glu Glu Asp Phe Gln Lys 115 120 125 Phe Gln Glu Tyr Phe Gly Ser 130 135 <210> 5 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense cDNA <400> 5 gatcgacggc ttcataagga cgaccttgaa gaccttcaga aggagccact tgtgccacgg 60 gagtcggaag aagaagaacc agaaccggtg tccggccagt gtccggaacg ccggggccaa 120 gaccgcgttt tagacgaccg agtgtctgag tcggtgccac gaagagcagg accagtcttt 180 gaagtccaaa tgagactcca ccagagctgt gagagcgaag gccatgagca ggtcacggct 240 gaacccgtgg aaagggaacc ggctcaaggc gtcaaagacc cggacttaac ggaagcagaa 300 ggccccggca aagtggcctc ggggagagcc gaaccggact ggacctccca gggccccccg 360 gagcctgcgg cggtcgtcga ggtccggggc ggcgtcgtcc cgccgcctgt a 411

Claims (37)

1. AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 SIRT1 활성강화용 조성물.
2. AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하며 SIRT1활성화에 의해 효과를 나타내는, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병의 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 DNA, cDNA, 및 mRNA 중 선택된 어느 하나 이상인 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 신경퇴행성질병은 알츠하이머, 근위축성축삭경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 또는 다발성경화증인 조성물.
5. 제 2항에 있어서, 상기 노화관련 질병은 심장병, 관절염, 고혈압, 또는 알츠하이머인 조성물.
6. SIRT1활성화에 의해 효과를 나타내는, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병 치료제의 제조를 위한 AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유 전자의 용도.
7. 제 6항에 있어서, 상기 유전자는 DNA, cDNA, 및 mRNA 중 선택된 어느 하나 이상인 용도.
8. 제 6항에 있어서, 상기 신경퇴행성질병은 알츠하이머, 근위축성축삭경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 또는 다발성경화증인 용도.
9. 제 6항에 있어서, 상기 노화관련 질병은 심장병, 관절염, 고혈압, 또는 알츠하이머인 용도.
10. 포유동물에게 치료상 유효량의 AROS 단백질 또는 AROS 단백질을 코딩하는 유전자를 투여하여 SIRT1활성화에 의해 효과를 나타내는, 당뇨, 비만, 암, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병의 예방 또는 치료 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 유전자는 DNA, cDNA, 및 mRNA 중 선택된 어느 하나 이상인 방법.
12. 제 10항에 있어서, 상기 신경퇴행성질병은 알츠하이머, 근위축성축삭경화증, 파킨슨병, 헌팅톤병, 또는 다발성경화증인 방법.
13. 제 10항에 있어서, 상기 노화관련질병은 심장병, 관절염, 고혈압, 또는 알츠하이머인 방법.
14. AROS 단백질 항체, AROS SiRNA, AROS 안티센스 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 유효성분으로 함유하는 SIRT1활성억제용 조성물.
15. AROS 단백질과 특이적으로 결합하는 다클론성항체.
16. 제 15항에 있어서, 상기 항체는 AROS 단백질의 25-33잔기를 인식하는 다클론성항체.
17. 제 15항 또는 제 16항에서 선택된 어느 한 항의 항체와 AROS 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 AROS 단백질 검출방법.
18. 제 15항 또는 제 16항에서 선택된 어느 한 항의 다클론성항체를 유효성분으로 하며 SIRT1활성억제에 의해 효과를 나타내는, 항암용 조성물.
19. SIRT1활성억제에 의해 효과를 나타내는 암치료제의 제조를 위한, AROS단백질과 특이적으로 결합하는 다클론성항체의 용도.
20. 제 19항에 있어서, 상기 항체는 AROS단백질의 25-33잔기를 인식하는 다클론성항체의 용도.
21. 포유동물에게 치료상 유효량의 AROS단백질과 특이적으로 결합하는 다클론성항체를 투여하여 SIRT1활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암의 예방 또는 치료방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 다클론성항체는 AROS단백질의 25-33잔기를 인식하는 것인 방법.
23. 제 15항 또는 제 16항에서 선택된 어느 한 항의 항체와 AROS 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 AROS 발현조절물질의 검색방법.
24. AROS 단백질과 SIRT1을 결합시키는 단계를 포함하는 AROS 단백질과 SIRT1 결합력 조절물질의 탐색방법.
25. 제 24항에 있어서, 상기 탐색방법은 이스트 투-하이브리드법, GST 풀다운분석법, 또는 이뮤노프리시피테이션(Immunoprecipitation)분석법에 의한 것인 AROS 단백질과 SIRT1 결합력 조절물질의 탐색방법.
26. 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 유효성분으로 함유하는, AROS 단백질 활성억제용 조성물.
27. 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 유효성분으로 하며 SIRT1 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
28. AROS 단백질 활성억제제의 제조를 위한 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스의 용도.
29. SIRT1 활성억제에 의해 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료제의 제조를 위한 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스의 용도.
30. 포유동물에게 유효량의 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 투여하여, AROS 단백질 활성을 억제하는 방법.
31. 포유동물에게 치료상 유효량의 서열번호 1과 서열번호 2에 의해 형성된 듀플렉스를 투여하여 SIRT1 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암의 예방 또는 치료방법.
32. 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 유효성분으로 함유하는, AROS 단백질 활성억제용 조성물.
33. 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 유효성분으로 하며 AROS 단백질 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암 예방 또는 치료용 조성물.
34. AROS 단백질 활성억제제의 제조를 위한 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주의 용도.
35. 암 예방 또는 치료제의 제조를 위한 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주의 용도.
36. 포유동물에게 유효량의 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 투여하여, AROS 단백질 활성을 억제하는 방법.
37. 포유동물에게 치료상 유효량의 서열번호 5의 AROS 안티센스 DNA 또는 상기 DNA를 포함하는 세포주를 투여하여 AROS 단백질 활성억제에 의해 효과를 나타내는, 암의 예방 또는 치료방법.

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