KR20090040391A - Treating or preventing cancers over-expressing reg4 or kiaa0101 - Google Patents

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KR20090040391A
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유스케 나카무라
히데와키 나카가와
슈이치 나카츠루
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온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
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Abstract

The invention features a method for inhibiting growth of a cancer cell by contacting the cell with a composition of an siRNA that inhibits expression of REG4 or KIAA0101. Methods of treating cancer are also within the invention. The invention also features products, including nucleic acid sequences and vectors as well as to compositions comprising them, useful in the provided methods. The invention also provides a method for inhibiting of tumor cell, for example pancreatic cancer cell, prostatic cancer cell, breast cancer cell, and bladder cancer cell, particularly pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) by inhibiting REG4 gene. The present invention also relates to methods of treating or preventing PDAC in a subject comprising the step of administering to said subject a pharmaceutically effective amount of an antibody or fragment thereof that binds to a protein encoded by REG4. The present invention also relates to methods of diagnosing chemo-radiation therapeutic resistance of a cancer. The present invention also provides therapeutic agents or methods for treating cancer using the polypeptides. The polypeptides of the present invention are composed of an amino acid sequence which comprises polypeptide which comprises QKGIGEFF/SEQ ID NO: 21. The polypeptides of the present invention can be introduced into cancer cells by modifying the polypeptides with transfection agents such as poly-arginine.

Description

ＲＥＧ４ 또는 ＫＩＡＡ０１０１을 과발현하는 암의 예방 및 치료 기술{Treating or Preventing Cancers over-expressing REG4 or KIAA0101}Prevention or treatment technology for overexpressing RA4 or GIAOA010

본 출원은 2006년 8월 18일에 출원된 미국 가특허출원 제60/838649호 및 2006년 8월 18일에 출원된 미국 가특허출원 제60/838749호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원 전문은 참조로 본 명세서에 통합되어 있다.This application claims priority to US Provisional Patent Application No. 60/838649, filed on August 18, 2006, and US Provisional Patent Application No. 60/838749, filed on August 18, 2006. Incorporated herein by reference.

본 발명은 생명 공학 분야에 관한 것, 보다 상세하게는, 암 연구 분야에 관한 것이다. The present invention relates to the field of biotechnology, and more particularly to the field of cancer research.

특히, 본 발명은 또한, 예를 들면, 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암과 같은 암의 예방및 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 REG4 및 KIAA0101의 발현을 억제할 수 있는 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 상기 핵산은 상기 유전자의 부분 서열에 상응하는 siRNA (small interfering RNA)이다.In particular, the present invention also relates to methods of preventing and treating cancers such as, for example, pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. In particular, the present invention relates to compositions comprising nucleic acids capable of inhibiting the expression of REG4 and KIAAOlOl. In some embodiments, the nucleic acid is a small interfering RNA (siRNA) corresponding to a partial sequence of the gene.

또한, 본 발명은 췌장암, 특히, 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)의 치료 또는 예방 방법에 관한 것으로서, 상기 치료 또는 예방 방법은 상기 질병에 대한 REG4에 의해 암호화된 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 PCNA과 KIAA0101의 상호작용을 억제하는 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 상기 펩티드는 보존된 PCNA-결합 모티프(PIP 상자)를 가지는 세포 투과성 지배적 음성 펩티드이다. The present invention also relates to a method for treating or preventing pancreatic cancer, in particular, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), wherein the method for treating or preventing the antibody binds to a protein encoded by REG4 for the disease. Administering a pharmaceutically effective amount of the fragment. The present invention also relates to a composition comprising a peptide that inhibits the interaction of PCNA with KIAAOlOl. In some embodiments, the peptide is a cell permeable dominant negative peptide with a conserved PCNA-binding motif (PIP box).

췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 서구에서 암 사망의 4 번째 주요 원인이며, 5년간 생존률이 오직 4% 밖에 안될 정도로, 일반 악성질병들 중 최악의 사망률을 보여주고 있다(DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.). 2006년 미국에서 약 33730 명의 새로운 사례가 췌장암으로 진단되었으며, 그들 중 32300이 그 질병으로 사망한 것으로 추정된다(Jemal A, et al. cancer statistics, 2006. CA cancer J Clin 2006 56: 106-130.). PDAC 환자들은 대부분 병이 진행된 상태에서 진단을 받기 때문에, 현재로서는 그 질병을 치료할 효과적인 치료법을 이용할 수 없다. 방사선 치료를 병행하거나 병행하지 않는, 5-FU 또는 감시타빈(gemcitabine)을 포함하는 화학치료법과 외과수술을 조합한 몇몇 접근법은 환자들의 삶의 질을 개선시킬 수 있지만(DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.), 그러한 치료는 매우 공격적이고 화학내성의 특징으로 인해 PDAC 환자들의 장기 생존에 매 우 제한적인 효과를 나타낸다 . Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer deaths in the West, with the worst mortality rate among common malignancies, with a survival rate of only 4% for five years (DiMagno EP, et. al . Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al . Gastroenterology 2005; 128: 1626-41. Approximately 33,730 new cases were diagnosed with pancreatic cancer in the United States in 2006, and 32,300 of them are estimated to have died from the disease (Jemal A, et. al . cancer statistics, 2006.CA cancer J Clin 2006 56: 106-130.). Since most PDAC patients are diagnosed with advanced disease, no effective treatment is available to treat the disease at this time. Some approaches that combine chemotherapy and surgery with or without 5-FU or gemcitabine, with or without radiation therapy, may improve the quality of life of patients (DiMagno EP, et. al . Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al . Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.), Such treatments have very limited effects on the long-term survival of PDAC patients because of their highly aggressive and chemoresistant properties.

PDAC의 매우 약한 예후는 초기단계에서의 PDAC의 검출의 어려움을 포함하는 몇몇 이유에 기인한다(DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.). "초음파 내시경(EUS, endoscopic ultrasound)" 등의 진단용 이미징 기술이나 "자기공명 담췌관 조염술(MRCP, magnetic resonance cholangiopancreaticography)"의 개선(DiMagno EP, et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.)에도 불구하고, 질병의 후기단계까지 별다른 징조가 없으므로 대부분의 환자들은 이미징 절차를 받지않는다. 전립선암의 전립선 특이 항원(PSA, prostate-specific antigen)와 같이 정확하고 쉬운 혈청학적 검사는 초기 단계에서 PDAC를 검출하는 것을 촉진시킬 수 있었고, PDAC의 대량 스크리닝에 응용될 수 있었다. PDAC 초기 단계에서의 외과적 절제술은 5년간 생존률이 50~60% 일 정도로 상대적으로 유리한 예후를 나타낸다(Wray CJ, et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.). 따라서, 생물학적 공격성 및 PDAC의 화학치료에 대한 내성을 고려할 때, 이러한 치명적 질병의 예후를 개선시키기 위한 가장 현실적인 전략 중의 하나는, 비침습적 혈청 검사에 의하여 초기 단계에 PDAC를 스크리닝하는 것이다. The very weak prognosis of PDAC is due to several reasons including the difficulty of detecting PDAC at an early stage (DiMagno EP,et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ,et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.). Diagnostic imaging techniques such as "endoscopic ultrasound (EUS)" or improvements in "magnetic resonance cholangiopancreaticography (MRCP)" (DiMagno EP,et al. Gastroenterology 1999; 117: 1464-84., Wray CJ,et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.) Most patients do not undergo imaging procedures because there is no sign until the later stages of the disease. Accurate and easy serological tests, such as prostate-specific antigen (PSA) in prostate cancer, could facilitate the detection of PDAC at an early stage and could be applied to large-scale screening of PDAC. Surgical excision in the early stages of PDAC has a relatively favorable prognosis with a 5-year survival rate of 50-60% (Wray CJ,et al. Gastroenterology 2005; 128: 1626-41.). Thus, given biological aggressiveness and resistance to chemotherapy of PDAC, one of the most realistic strategies for improving the prognosis of these fatal diseases is to screen PDAC at an early stage by non-invasive serum testing.

현재, CAl 9-9가 유일하게 상업적으로 구입할 수 있는 PDAC용 혈청학적 마커이지만, 이는 이상적인 암 마커와는 거리가 멀다. 왜냐하면 (i) 개인의 약 10~15% 가 그들의 루이스 항원 단계(Lewis antigen status)로 인하여 CAL 9-9를 분비하지 않고, (ⅱ) CAl 9-9는 췌장암에 특이적이지 않으며, 양성 조건에서도 역시 증가되며, (ⅲ) 초기 단계 환자에서도 일반적으로 정상 범위 내에 존재하기 때문이다(Sawabu N, et al. Pancreas 2004; 28: 263-7., Pleskow DK, et al. Ann Intern Med 1989; 110: 704-9.). 따라서 PDAC에 대하여 더욱 특이적이고 더욱 민감한 새로운 암 마커의 개발을 통한 스크리닝 전략의 수립이 시급하다Currently, CAl 9-9 is the only commercially available serological marker for PDAC, but this is far from an ideal cancer marker. Because (i) about 10-15% of individuals do not secrete CAL 9-9 due to their Lewis antigen status, and (ii) CAl 9-9 is not specific for pancreatic cancer, even in benign conditions It is also increased, (i) because it is generally within the normal range in early stage patients (Sawabu N, et. al . Pancreas 2004; 28: 263-7., Pleskow DK, et. al . Ann Intern Med 1989; 110: 704-9.). Therefore, it is urgent to establish a screening strategy by developing new cancer markers that are more specific and more sensitive to PDAC.

REG4는 REG 패밀리의 새로운 멤버(Hartupee JC, et al Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93.)이자, PDAC의 암 마커로서 보고되었다. REG (regenerating islet-derived)에 속하는 분자들은 소화 기관에서 조직 재생산 및 염증 반응의 역할을 하는 분비 단백질 패밀리이다(Hartupee JC, et al. Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93., Watanabe T, et al. J Biol Cheni 1990; 265: 7432-9., Uno M, et al. Adv Exp Med Biol 1992; 321 : 61-6.). 이 멤버들의 발현량은 몇몇 위암에서 상향 조절되어 있고, 암에서 영양 또는 항자가세포사(anti-apoptotic) 요소로 기능한다고 보고되었다(Unno M, et al. Adv Exp Med Biol 1992; 321 : 61-6., Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53.). cDNA 마이크로어레이 기술은 실험자가 정상과 악성 세포의 유전자 발현의 포괄적인 프로파일을 얻음으로써, 정상과 악성 세포에서의 유전자 발현을 비교할 수 있게 한다(Okabe et al., (2001) cancer Res 61:2129-37; Kitahara et al., (2001) cancer Res 61 : 3544-9; Lin et al., (2002) Oncogene 21 :4120-8; Hasegawa et al., (2002) cancer Res 62:7012-7). 이러한 접근법은 암세포의 복잡한 특성을 밝힐 수 있으며, 발암 메커니즘을 이해하는데 도움을 줄 수 있다. 암에서 조절이 완화되어 있는 유전자를 동정하는 것은 개별 암에 대한 더욱 정밀하고 정확한 진단과 새로운 치료 표적을 발굴로 이어진다(Bienz and Clevers, (200O) CeIl 103:311-20). 예를 들어, 최근 몇년간, 유전자 특이적 si-RNA을 이용한 암치료의 새로운 접근법이 임상 시험에서 시도되었다(Bumcrot D et al., Nat Chem Biol 2006 Dec, 2(12): 711-9). RNAi는 이미 기반 기술의 위치를 획득한 것처럼 보인다(Putral LN et al, Drug News Perspect 2006 JuI- Aug, 19(6): 317-24; Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 JuI, 5(7): 528-9; Dykxhoorn DM et al, gene Ther 2006 Mar, 13(6): 541-52). 그럼에도 불구하고, RNAi를 임상 용도로 사용하기 위해서는 몇가지 고려 사항이 있다. 상기 고려 사항에는 RNA의 in vivo에서의 낮은 안정성을 극복하는 것(Hall AH et al, nucleic acids Res 2004 Nov 15, 32(20): 5991-6000, Print 2004; Amarzguioui M et al, nucleic acids Res 2003 Jan 15, 31(2): 589-95), 제제로서의 독성을 줄이는 것 (Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 JuI, 5(7): 528-9), 적절한 전달 방법을 선별하는 것, 사용하는 siRNA 또는 shRNA의 정확한 서열, 및 세포 특이성이 포함된다. 부분적 상동성에 의한 비특이적 사일런싱(silencing) 또는 이중 가닥 분자로 인한 인터페론 반응의 유도와 연관된 독성 유발의 가능성은 공지의 사실이다(Judge AD et al, Nat Biotechnol 2005 Apr, 23(4): 457-62, Epub 2005 Mar 20; Jackson AL & Linsley PS, Trends Genet 2004 Nov, 20(11): 521-4). 암 특이적 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 분자는 이러한 역효과를 피하기 위해 반드시 개선되어야 한 다. REG4 is a new member of the REG family (Hartupee JC, et al Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93.) And reported as cancer markers of PDAC. Molecules belonging to the regenerating islet-derived (REG) are a family of secreted proteins that play a role in tissue reproduction and inflammatory responses in the digestive tract (Hartupee JC, et. al . Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93., Watanabe T, et al . J Biol Cheni 1990; 265: 7432-9., Uno M, et al . Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6.). The expression level of these members is upregulated in some gastric cancers and has been reported to function as a nutritional or anti-apoptotic factor in cancers (Unno M, et. al . Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6., Sekikawa A, et al . Gastroenterology 2005; 128: 642-53.). cDNA microarray technology allows experimenters to compare gene expression in normal and malignant cells by obtaining a comprehensive profile of gene expression in normal and malignant cells (Okabe et. al ., (2001) cancer Res 61: 2129-37; Kitahara et al ., (2001) cancer Res 61: 3544-9; Lin et al ., (2002) Oncogene 21: 4120-8; Hasegawa et al ., (2002) cancer Res 62: 7012-7). This approach can reveal the complex nature of cancer cells and help to understand the carcinogenic mechanisms. Identifying genes with deregulated genes in cancer leads to more precise and accurate diagnosis and discovery of new therapeutic targets for individual cancers (Bienz and Clevers, (200O) CeIl 103: 311-20). For example, in recent years, new approaches to cancer treatment with gene specific si-RNA have been tried in clinical trials (Bumcrot D et al ., Nat Chem Biol 2006 Dec, 2 (12): 711-9). RNAi seems to have already acquired the position of the underlying technology (Putral LN et al , Drug News Perspect 2006 Ju I- Aug, 19 (6): 317-24; Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 JuI, 5 (7): 528-9; Dykxhoorn DM et al , gene Ther 2006 Mar, 13 (6): 541-52). Nevertheless, there are some considerations for using RNAi for clinical use. These considerations include overcoming the low stability of RNA in vivo (Hall AH et. al , nucleic acids Res 2004 Nov 15, 32 (20): 5991-6000, Print 2004; Amarzguioui M et al , nucleic acids Res 2003 Jan 15, 31 (2): 589-95), reducing toxicity as an agent (Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 JuI, 5 (7): 528-9), and Selecting, exact sequence of siRNA or shRNA used, and cell specificity are included. The possibility of toxic induction associated with nonspecific silencing by partial homology or induction of interferon responses due to double-stranded molecules is known (Judge AD et. al , Nat Biotechnol 2005 Apr, 23 (4): 457-62, Epub 2005 Mar 20; Jackson AL & Linsley PS, Trends Genet 2004 Nov, 20 (11): 521-4). Double-stranded molecules targeting cancer specific genes must be improved to avoid this adverse effect.

본 발명인들은 앞서 암세포군을 분리하기 위해 레이저 미세해부와의 조합으로 약 27000 유전자를 포함하는 유전체 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 상세하고 정밀한 췌장암의 발현 프로파일 분석을 실시하였다(Nakamura et al., (2004) Oncogene, 23: 2385-400). 본 발명인들이 췌장암에서 트랜스-활성화되어 있는 것으로서 확인한 유전자들 중에서, 본 발명인들은 암 치료를 위한 분자 표적으로서의 KIAA0101에 초점을 두었다(WO2004/031412). PCNA (proliferating cell nuclear antigen)는 몇몇의 세포 주기 단백질과 상호작용을 통해 세포 주기 진행에 영향을 줄 뿐만 아니라, DNA 복제와 DNA 복구에 필수적이다(Prelich et al., (1987) Nature, 326: 471-5; Wyman and Botchan (1995) Curr Biol, 5: 334-7; Warbrick et al., (2000) Bioessays, 22: 997-1006). 크리스탈 구조는 PCNA가 링-모양의 동종삼합체 단백질로, DNA 중합효소(DNA polymerases)나 DNA 리가아제(DNA ligase)와 같은 DNA 복제나 대사에 관련된 단백질을 DNA의 클램핑 플랫폼(clamping platform)으로 유인하는데 필요한 기능을 한다는 것을 보여준다(Krishna et al., (1994) 세포, 79: 1233-43). PCNA는 다수의 DNA 복제/복구 효소와 상호작용하는데, 몇몇 단백질은 보존된 PCNA 결합 모티프를 가지고 있다(Jonsson et al., (1998) EMBO J, 17: 2412-25). PCNA의 과발현은 세포 증식이 활발하다는 증거이고, 임상에서, 특히 Ki67/ MIB-I와 마찬가지로 암 발달에서의 예후를 확인할 때, PCNA는 일반적인 증식 마커로 사용되고 있다(Haitel et al., (1997) Am J Clin Pathol, 107: 229-35).The present inventors previously performed detailed and precise pancreatic cancer expression profile analysis using genome cDNA microarrays containing about 27000 genes in combination with laser microdissection to separate cancer cell populations (Nakamura et al. al ., (2004) Oncogene, 23: 2385-400). Among the genes we identified as trans-activated in pancreatic cancer, we focused on KIAAOlOl as a molecular target for cancer treatment (WO2004 / 031412). Proliferating cell nuclear antigens (PCNAs) are essential for DNA replication and DNA repair as well as affect cell cycle progression through interactions with several cell cycle proteins (Prelich et al. al ., (1987) Nature, 326: 471-5; Wyman and Botchan (1995) Curr Biol, 5: 334-7; Warbrick et al ., (2000) Bioessays, 22: 997-1006). The crystal structure is a PCNA is a ring-shaped homotrimeric protein that attracts proteins involved in DNA replication or metabolism, such as DNA polymerases or DNA ligase, to the clamping platform of DNA. To perform the necessary functions (Krishna et al ., (1994) cells, 79: 1233-43). PCNA interacts with a number of DNA replication / recovery enzymes, some of which have conserved PCNA binding motifs (Jonsson et al. al ., (1998) EMBO J, 17: 2412-25). Overexpression of PCNA is evidence that cell proliferation is active, and in clinical practice, as with Ki67 / MIB-I, PCNA has been used as a general proliferation marker (Haitel et al.). al ., (1997) Am J Clin Pathol, 107: 229-35).

KIAA0101은 이전에 효모-2 하이브리드 스크리닝을 통하여 PCNA 단백질에 결합하는 pi 5PAF (PCNA-associated 인자)로서 분류되었고(Yu et al., (2001) Oncogene 20: 484-9), 그것이 PCNA와 상호작용 할 수 있도록 해주는, 보존된 PIP 상자(PIP box)를 가진다. 그러나, 그것의 기능은 불명확한 채로 남아있으며, 어떻게 KIAA0101-PCNA 상호작용이 세포 증식이나 암 진행에 관여하는지는 아직 수수께끼이다(Yu et al., (2001) Oncogene, 20: 484-9; Simpson et al., (2006) Exp cell Res. 312: 73-85).KIAA0101 was previously classified as pi 5PAF (PCNA-associated factor) that binds to PCNA protein via yeast-2 hybrid screening (Yu et al ., (2001) Oncogene 20: 484-9), have a preserved PIP box that allows it to interact with PCNA. However, its function remains unclear, and how KIAA0101-PCNA interactions are involved in cell proliferation or cancer progression is still a mystery (Yu et. al ., (2001) Oncogene, 20: 484-9; Simpson et al ., (2006) Exp cell Res. 312: 73-85).

본 발명인들은 여기에 RT-PCR 및 면역화학적 분석 뿐만 아니라 유전체-cDNA 마이크로어레이 분석(genome- wide cDNA microarray analysis)에 기반하여, REG 패밀리의 새로운 멤버인, REG4 및/또는 KIAA0101의 암세포(예를 들면, PDAC 세포)에서의 과발현을 보고하였다. 나아가, 본 발명인들은 siRNA를 이용하여 암(예를 들면, PDNA)세포주에서의 내생의 REG4 및/또는 KIAA0101 발현을 녹다운(knockdown) 시 세포의 생존 능력이 급격히 감소한 것을 발견하였다. 이와 일치하게, 재조합 REG4 및/또는 KIAA0101을 배양 배지에 첨가 시 암의 성장이 증진되었다(예를 들면, PDAC 세포주에 투여량-의존적 방법으로. REG4 및/또는 KIAA0101에 대한 단일 클론 항체는 성장 촉진 효과를 중화시켰고, 암의 성장을 유의하게 약화시켰다(예를 들면, PDAC 세포). 이러한 발견은 REG4와 KIAA0101가 PDAC를 포함하는 초기 암의 검출을 위한 유망한 암 마커라는 것을 암시하며, 또한 REG4 및/또는 KIAA0101을, 예를 들면, 항체, 억제성 폴리펩티드 또는 억제성 핵산(예를 들면, siRNA)을 사용하여 중화 시 비정상적인(예를 들면, 비정상적으로 높은) REG4 및/또는 KIAA0101의 과다 발현; 및/또는 세포내 신호 전달에 의해 야기되는 PDAC를 포함하는 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 암시한다. The inventors herein based on RT-PCR and immunochemical assays as well as genome-wide cDNA microarray analysis, cancer cells of REG4 and / or KIAA0101, which are new members of the REG family (e.g. , PDAC cells). Furthermore, the inventors found that the viability of cells rapidly decreased when knocking down endogenous REG4 and / or KIAAOlOl expression in cancer (eg PDNA) cell lines using siRNA. Correspondingly, the growth of cancer was enhanced upon addition of recombinant REG4 and / or KIAA0101 to the culture medium (eg, in a dose-dependent manner in PDAC cell lines. Monoclonal antibodies against REG4 and / or KIAA0101 promote growth. Neutralized the effect and significantly weakened the growth of cancer (eg PDAC cells) These findings suggest that REG4 and KIAAOl101 are promising cancer markers for the detection of early cancers, including PDAC, and also REG4 and / Or overexpression of REG4 and / or KIAA0101 that is abnormal (eg, abnormally high) upon neutralization with, for example, an antibody, inhibitory polypeptide, or inhibitory nucleic acid (eg, siRNA); and And / or cancer, including PDAC caused by intracellular signal transduction, can be effectively prevented or treated.

본 발명의 목적은 비정상적인(예를 들면, 비정상적으로 높은) REG4 및/또는 KIAA0101의 과다 발현; 및/또는 세포내 신호 전달에 의해 야기되는 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 사용하여, 예를 들면, 췌장암, 전립선암, 유방암 또는 방광암과 같은 암을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학적 조성물 및 방법을 제공하는데 있다. It is an object of the present invention to provide an overexpression of abnormal (eg, abnormally high) REG4 and / or KIAAOlOl; And / or compositions useful for the treatment and / or prevention of cancer caused by intracellular signal transduction. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition and method for treating and / or preventing cancer such as, for example, pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer or bladder cancer using the compound.

본 발명은 예를 들면, siRNA를 이용하여, REG4 또는 KIAA0101의 발현을 억제하여 암 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 REG4의 발현을 억제하는 siRNA를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 췌장암의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 데 있다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 비정상적인(예를 들면, 비정상적으로 높은) KIAA0101의 과발현 및/또는 세포내 신호전달에 의해 야기되는 암, 예를 들면, 췌장암, 전립선암, 유방암 또는 방광암에 대하여 KIAA0101의 발현을 억제하는 siRNA를 함유하는 조성물을 상기 암에 대한 치료 또는 예방용으로 투여하는 단계를 포함하는 상기 암에 대한 치료 또는 예방 방법을 제공하는데 있다. The present invention confirmed, for example, that siRNA can be used to inhibit the expression of REG4 or KIAAOlOl to inhibit cancer proliferation. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for treating or preventing pancreatic cancer in a subject, comprising administering to the subject a composition comprising an siRNA that inhibits the expression of REG4. More specifically, the present invention relates to the treatment of KIAA0101 against cancers caused by abnormal expression (eg, abnormally high) KIAA0101 and / or intracellular signaling, such as pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer or bladder cancer. It provides a method of treating or preventing a cancer comprising administering a composition containing siRNA that inhibits expression for the treatment or prevention of the cancer.

또한, 본 발명은 유효성분으로 REG4의 발현을 억제하는 약학적 유효량의 siRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 췌장암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 나아가, 본 발명은 유효성분으로 KIAA0101의 발현을 억제하는 약학적 유효량의 siRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 비정상적인(예를 들면, 비정상적으로 높은) KIAA0101의 과발현 및/또는 세포내 신호전달에 의해 야기되는 암, 예를 들면, 췌장암, 전립선암, 유방암 또는 방광암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pancreatic cancer containing a pharmaceutically effective amount of siRNA and a pharmaceutically acceptable carrier that inhibits the expression of REG4 as an active ingredient. Furthermore, the present invention provides overexpression and / or intracellular signaling of abnormal (eg, abnormally high) KIAA0101, comprising a pharmaceutically effective amount of siRNA and a pharmaceutically acceptable carrier that inhibits the expression of KIAA0101 as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of cancer caused by, for example, pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer or bladder cancer.

나아가, 본 발명은 췌장암의 치료 및 예방용 약학적 조성물로 제조하기위한 REG4의 발현을 억제하는 siRNA의 용도와 비정상적인(예를 들면, 비정상적으로 높은) KIAA0101의 과발현 및/또는 세포내 신호전달에 의해 야기되는 암, 예를 들면, 췌장암, 전립선암, 유방암 또는 방광암에 대한 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 제조하기위한 KIAA0101의 발현을 억제하는 siRNA의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 siRNA는 표적 서열로서 서열번호 5 또는 서열번호 32의 핵산 서열을 포함한다.Furthermore, the present invention is directed to the use of siRNAs that inhibit the expression of REG4 for the preparation and preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and prevention of pancreatic cancer, and by overexpression of KIAA0101 and / or intracellular signaling of abnormal (eg abnormally high). Provided is the use of an siRNA that inhibits the expression of KIAAOlOl for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or prophylaxis of cancer, for example pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer or bladder cancer. Preferably, the siRNA comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32 as a target sequence.

본 발명은 서열 번호 5 또는 서열 번호 32를 포함하는, 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함 표적 서열을 함유하는 리보핵산 서열을 포함하는 하는 이중 가닥 분자에 관한 것이며, 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥과 상보적인 리보핵산 서열을 가지고, 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥은 서로 혼성화하여 이중 가닥 분자를 형성하며, 상기 이중 가닥 분자는 REG4 또는 KIAA0101 유전자를 발현하는 세포내로 도입되었을 때, 상기 유전자를 억제한다. 게다가, REG4는 자가 분비 또는 측분비 성장 인자로 작용하며, Akt 신호전달경로를 매개한다는 것을 확인하였다. 나아가, 본 발명인들은 항REG4 항체가 REG4의 세포 증식 활성을 중화시켜 췌장암 세포의 성장을 약화시키는 것을 발견했다. 따라서 본 발명의 목적은 REG4의 활성을 중화하는 항REG4 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는 췌장암의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데 있다. 또한, 본 발명은 유효성분으로 약학적 유효량의, REG4를 중화시킬 수 있는 항REG4 항체 또는 이의 단편과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 췌장암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 나아가, 본 발명은 췌장암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 제조를 위한, REG4의 활성을 중화시키는 항 REG4 항체 또는 이의 단편의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 항REG4 항체는 단일 클론 항체이다. 보다 바람직하게는, 항REG4 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산에 의해 분리된 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명명된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 각 VH 및 VL 사슬의 각 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:The present invention relates to a double stranded molecule comprising a ribonucleic acid sequence comprising a target sequence comprising a sense strand and an antisense strand, comprising SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32, wherein the antisense strand is ribo complementary to the sense strand. With the nucleic acid sequence, the sense strand and the antisense strand hybridize with each other to form a double stranded molecule, which, when introduced into a cell expressing a REG4 or KIAA0101 gene, inhibits the gene. In addition, REG4 has been shown to act as a self-secreting or lateral secretory growth factor and mediate Akt signaling pathway. In addition, the inventors have discovered that anti-REG4 antibodies neutralize the cell proliferative activity of REG4, thereby weakening the growth of pancreatic cancer cells. It is therefore an object of the present invention to provide a method for the treatment or prevention of pancreatic cancer comprising the step of administering an anti-REG4 antibody or fragment thereof that neutralizes the activity of REG4. The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pancreatic cancer, comprising a pharmaceutically effective amount of an anti-REG4 antibody or fragment thereof capable of neutralizing REG4 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier. Furthermore, the present invention provides the use of an anti-REG4 antibody or fragment thereof that neutralizes the activity of REG4 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pancreatic cancer. Preferably, the antiREG4 antibody is a monoclonal antibody. More preferably, the antiREG4 antibody comprises VH and VL chains, each VH and VL chain comprising CDR amino acid sequences designated CDR1, CDR2 and CDR3 separated by framework amino acids, each VH And the amino acid sequence of each CDR of the VL chain is as follows:

VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20), VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20),

VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (서열번호 21), VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (SEQ ID NO: 21),

VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22), VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22),

VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23), VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23),

VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), 및 VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24), and

VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25).VL CDR3: QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25).

또한, 본 발명은 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산에 의해 분리된 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 명명된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 각 VH 및 VL 사슬의 각 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같은 항체를 투여하는 단계를 포함하는 췌장암의 치료 및/또는 예방용 방법을 제공한다:The invention also encompasses VH and VL chains, each VH and VL chain comprising a CDR amino acid sequence designated CDR1, CDR2 and CDR3 separated by framework amino acids, the sequence of each VH and VL chain The amino acid sequence of each CDR provides a method for the treatment and / or prophylaxis of pancreatic cancer comprising administering an antibody as follows:

VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20), VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20),

VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (S서열번호 21), VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (S SEQ ID NO: 21),

VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22), VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22),

VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23), VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23),

VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), 및 VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24), and

VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25).VL CDR3: QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25).

또한, 본 발명은 QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 억제성 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게는 상기 아미노산 서열은 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44) 또는 TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45)이다. 나아가, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료용 억제용 폴리펩티드를 이용한 약제 또는 방법을 제공한다.The present invention also provides inhibitory polypeptides comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46). Preferably the amino acid sequence is VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44) or TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45). Furthermore, the present invention provides a medicament or method using the inhibitory polypeptide for preventing and / or treating cancer.

또한, 본 발명은 QKGIGEFF (서열번호 46)를 함유하는 억제성 폴리펩티드, 예를 들면, 적어도 하나 이상의 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44), TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45)의 아미노산 서열을 가지는 단편을 가지는 억제성 폴리펩티드; 또는 상기와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 암의 치료용 및/또는 예방용 약학적 제형의 제조를 위한, 본 발명의 폴리펩티드의 용도; 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리핵산의 용도에 관한 것이다.The invention also relates to inhibitory polypeptides containing QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46), for example inhibitory polypeptides having fragments having the amino acid sequence of at least one VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44), TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45); Or to a method of treating and / or preventing cancer comprising administering a polynucleotide encoding such an amino acid sequence. Furthermore, the present invention provides the use of a polypeptide of the present invention for the preparation of a pharmaceutical formulation for treating and / or preventing cancer; Or to the use of a polynucleic acid encoding the polypeptide.

본 발명의 상기 목적과 특징은 하기의 상세한 설명을 도면과 실시예와 함께 참조 시 명확해질 것이다. 그러나 이는 발명의 요약 및 하나의 바람직한 구체예일 뿐, 본 발명이나 본 발명의 대안적 구체예를 제한하는 것은 아니다.The above objects and features of the present invention will become apparent upon reference to the following detailed description in conjunction with the drawings and examples. However, this is only a summary of the invention and one preferred embodiment, but not a limitation of the invention or alternative embodiments of the invention.

작은 간섭 RNA :Small interfering RNA:

본 발명은 REG4 및/또는 KIAA0101의 발현의 억제가, 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암을 포함하는 다양한 암 세포들의 성장을 억제하는 효과가 있다는 놀라운 발견에 일부 기초하고 있다. 특히, PDCA가 REG4 유전자를 억제함으로써 예방 또는 억제되는 것으로 밝혀졌다. 본 출원에 기술하는 발명은 상기 발견들에 일부 기초하고 있다. 본 발명은 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 제공된 방법들은, REG4 또는 KIAA0101의 발현(예를 들면, 전사 또는 번역)을 억제하는 siRNA(small interfering RNA)를 포함하는 조성물을 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 개체 내 암세포의 성장을 억제시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 REG4 또는 KIAA0101의 서열과 특이적으로 혼성화되는 siRNA (small interfering RNA)를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한편, 본 발명의 또 다른 실시형태는 생물학적 시료의 세포에서 REG4 유전자 또는 KIAA0101 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.The present invention is based in part on the surprising discovery that inhibition of expression of REG4 and / or KIAAOlOl has the effect of inhibiting the growth of various cancer cells, including pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. In particular, PDCA has been found to be prevented or inhibited by inhibiting the REG4 gene. The invention described in this application is based in part on the above findings. The present invention provides a method of inhibiting cell growth. Provided methods include contacting a cell with a composition comprising a small interfering RNA (siRNA) that inhibits expression (eg, transcription or translation) of REG4 or KIAAOlOl. The present invention also provides a method of inhibiting the growth of cancer cells in a subject. The method comprises administering a composition comprising a small interfering RNA (siRNA) that specifically hybridizes with the sequence of REG4 or KIAAOlOl. Meanwhile, another embodiment of the present invention provides a method for inhibiting expression of the REG4 gene or KIAAOlOl gene in cells of a biological sample.

상기 유전자의 발현은 REG4 유전자 또는 KIAA0101 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양으로 일정량의 이중 가닥의 리보핵산 분자를 세포 안으로 도입시킴으로써 억제될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 핵산 서열과 벡터를 포함하는 생산물 및 이들을 포함하는 예를 들면, 제공된 방법에 유용한 조성물에 관한 것이다. 상기 생산물 중에서, REG4 유전자 또는 KIAA0101 유전자를 발현하는 세포에 도입시 상기 유전자의 발현을 억제하는 특성을 가진 siRNA가 제공된다. 상기 제공된 분자들은 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는데, 상기 센스 가닥은 REG4 또는 KIAA0101 표적 서열과 일치하는 리보핵산 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥과 상보적인 리보핵산 서열을 포함한다. 상기의 센스 및 안티센스 가닥은 서로 혼성화되어 이중 가닥 분자를 형성한다. Expression of the gene can be inhibited by introducing a quantity of double stranded ribonucleic acid molecules into the cell in an amount sufficient to inhibit expression of the REG4 gene or KIAAOlOl gene. Another embodiment of the present invention relates to products comprising nucleic acid sequences and vectors and compositions useful in, for example, provided methods comprising them. Among the products, siRNA having a property of inhibiting the expression of the gene when introduced into a cell expressing the REG4 gene or KIAA0101 gene is provided. The provided molecules include a sense strand and an antisense strand, wherein the sense strand comprises a ribonucleic acid sequence consistent with a REG4 or KIAAOlOl target sequence, and the antisense strand comprises a ribonucleic acid sequence complementary to the sense strand. The sense and antisense strands above hybridize to each other to form a double stranded molecule.

본 명세서에서 사용한 “유기체”는 적어도 한 개 이상의 세포를 포함하는 모든 살아있는 존재를 지칭한다. 살아있는 유기체는 예를 들면, 한 개의 진핵 세포와 같이 단순한 것부터 인간을 포함하는 포유동물만큼 복잡한 것도 가능하다.As used herein, "organism" refers to all living beings, including at least one cell. Living organisms can be as simple as, for example, one eukaryotic cell and as complex as a mammal, including humans.

본 명세서에서 사용한 “생물학적 시료”는 전체 기관 또는 그 조직, 세포 또는 구성 부위(예를 들면, 체액, 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 침, 양수, 제대혈, 오줌, 질액 및 혈청을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 체액)의 일부를 지칭한다. 나아가 “생물학적 시료”는 균질 현탁액; 용해물; 추출물; 전체 기관 또는 그 세포 조직 또는 구성 부위의 일부로부터 분리된 세포 배양 또는 조직 배양; 또는 이의 분획이나 부분을 지칭한다. 마지막으로, “생물학적 시료”는 유기체가 번식하는, 단백질이나 핵산 분자 같은 세포 조성물을 함유하는 영양 배양액이나 겔 같은 배지를 지칭한다. 본 발명은 세포 성장을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 세포 성장은 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA의 조성물을 세포와 접촉시킴으로써 억제시킬 수 있다. 상기, 세포는 추가로 형질 전환-향상 제제와 접촉시킬 수 있다. 상기 세포는 in vitro, in vivo 또는 ex vivo로 공급될 수 있다. 상기 생물학적 시료의 대상은 포유동물, 예를 들면, 인간, 인간을 제외한 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있다. 또한, 상기 세포는 종양세포(예를 들면, 암세포), 예를 들면, 선종 세포 또는 선암종 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 췌장암 세포, 특히, 췌장 관 선암종 세포, 전립선암 세포, 유방암 세포 또는 방광암세포일 수 있다. 세포 성장을 억제하는 것은 미처리된 세포보다 상기 처리된 세포의 증식의 속도가 낮아지거나, 생존율이 감소하는 것을 의미한다. 세포 성장은 당업계에서 알려진 증식 분석을 통하여 측정된다.As used herein, “biological sample” includes whole organs or their tissues, cells, or components (eg, body fluids, blood, mucus, lymph, synovial fluid, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, umbilical cord blood, urine, vaginal fluid, and serum) But not limited thereto. Furthermore, "biological sample" includes homogeneous suspensions; Lysate; extract; Cell culture or tissue culture isolated from an entire organ or part of its cell tissue or component site; Or a fraction or part thereof. Finally, "biological sample" refers to a medium such as a nutrient culture or a gel containing a cell composition, such as a protein or nucleic acid molecule, in which an organism propagates. The present invention features a method of inhibiting cell growth. Cell growth can be inhibited by contacting the cell with a composition of siRNA of REG4 or KIAAOlOl. The cells may further be contacted with a transformation-enhancing agent. The cells can be supplied in vitro, in vivo or ex vivo. The subject of the biological sample may be a mammal, eg, a human, a primate except human, a mouse, a rat, a dog, a cat, a horse or a cow. In addition, the cells may be tumor cells (eg cancer cells), for example adenomas or adenocarcinoma cells. For example, the cells may be pancreatic cancer cells, particularly pancreatic ductal adenocarcinoma cells, prostate cancer cells, breast cancer cells or bladder cancer cells. Inhibiting cell growth means that the rate of proliferation of the treated cells is lower than the untreated cells, or the survival rate is reduced. Cell growth is measured through proliferation assays known in the art.

본 명세서에서 “폴리핵산” 및 “올리고핵산”은 달리 특별히 표시하지 않는 한 서로 번갈아 사용되며, 통상적으로 허용되는 단 문자 암호를 사용하여 지칭된다. 상기 용어는 한 개 또는 그 이상의 에스테르 결합(ester bonding)으로 연결된 핵산(뉴클레오티드)의 중합체에 적용된다. 상기 폴리핵산 또는 올리고핵산은 DNA, RNA 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. As used herein, "polynucleic acid" and "oligonucleic acid" are used interchangeably unless otherwise indicated, and are referred to using commonly accepted single letter codes. The term applies to polymers of nucleic acids (nucleotides) linked by one or more ester bonding. The polynucleic acid or oligonucleic acid may be composed of DNA, RNA or a combination thereof.

본 명세서에서 사용된 “이중 가닥 분자”는 표적 유전자를 억제하는 핵산 분자, 예를 들면, siRNA (예를 들면, dsRNA (double-stranded ribonucleic acid) 또는 shRNA (small hairpin RNA)) 및 siD/R-NA (short interfering DNA/RNA, 예를 들면, 이중-가닥의 DNA와 RNA의 키메라(dsD/R-NA) 또는 DNA와 RNA의 small hairpin 키메라(shD/R-NA))를 지칭한다. As used herein, “double stranded molecule” refers to a nucleic acid molecule that inhibits a target gene, such as siRNA (eg, double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) or small hairpin RNA (shRNA) and siD / R−). Short interfering DNA / RNA, eg, double-stranded DNA and RNA chimeras (dsD / R-NA) or DNA and RNA small hairpin chimeras (shD / R-NA).

“siRNA" 용어는 표적 mRNA의 번역을 막는 이중 가닥 RNA 분자를 의미한다. RNA가 전사되는 주형으로 DNA를 포함하는, siRNA를 세포에 도입하는 표준기술이 사용된다. 상기 siRNA는 센스의 REG4 또는 KIAA0101 핵산 서열을 포함하는 siRNA, 안티센스의 REG4 또는 KIAA0101 핵산서열을 포함하는 siRNA 또는 이 둘을 포함한다. 상기 siRNA는 두 개의 상보적인 분자를 포함하거나 한 개의 전사체에 표적 유전자의 센스 및 상보적인 안티센스의 서열을 가지도록, 예를 들면, 본 발명의 실시예와 같이 마이크로 RNA (miRNA)를 생산하는 헤어핀으로 설계될 수도 있다. 상기 siRNA는 dsRNA 또는 shRNA 모두 가능하다. The term “siRNA” refers to a double-stranded RNA molecule that prevents translation of a target mRNA. Standard techniques for introducing siRNA into cells, including DNA as a template to which RNA is transcribed, are used as the REG4 or KIAA0101 of Sense. SiRNA comprising a nucleic acid sequence, siRNA comprising a REG4 or KIAAO101 nucleic acid sequence of an antisense, or both, wherein the siRNA comprises two complementary molecules or a sense of a target gene and a complementary antisense to a transcript To have a sequence, for example, it may be designed as a hairpin to produce micro RNA (miRNA) as in the embodiment of the present invention, the siRNA can be either dsRNA or shRNA.

본 명세서에서 사용된 “dsRNA"는 한 개 가닥과 이에 상보적인 서열을 가지는 다른 가닥으로 구성된 두 개의 RNA 분자 컨스트럭트를 지칭하며, 두 분자는 상보적 서열을 가지므로 서로 결합하여 이중-가닥의 RNA 분자를 형성한다. 두 가닥의 핵산 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호화 서열에서 선택된 RNA의 "센스" 또는 “안티센스”서열 뿐만 아니라 표적 유전자의 비암호화 영역(non-coding region)에서 선택된 RNA 분자도 포함될 수 있다. As used herein, “dsRNA” refers to two RNA molecular constructs consisting of one strand and the other strand having a sequence complementary thereto, and the two molecules have complementary sequences and thus bind each other to form a double-stranded The two strands of nucleic acid sequences are not only the "sense" or "antisense" sequences of the RNA selected from the protein coding sequence of the target gene sequence, but also the RNA molecules selected from the non-coding region of the target gene. May be included.

본 명세서에서 사용된 “shRNA" 용어는 서로 상보적인 첫 번째 및 두 번째 영역, 즉 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 가지는 siRNA를 지칭한다. 상보성의 정도와 상보성 부위의 방위가 충분하면 상기 영역간의 충분한 염기쌍의 결합이 일어나고, 첫 번째 부위와 두 번째 부위는 루프 부위에 의해 연결되고, 루프 부위는 루프 부위의 핵산(또는 핵산 유사체)간의 염기쌍의 부재에 의해 이루어진다. 상기 shRNA의 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥의 사이의 단일 가닥 부위이며, 또한, “개입한 단일 가닥”로 지칭될 수 있다.As used herein, the term “shRNA” refers to an siRNA having a stem-loop structure comprising first and second regions complementary to each other, namely the sense and antisense strands. Sufficient orientation of the sites results in sufficient base pair binding between the regions, the first and second sites being linked by the loop sites, and the loop sites being made by the absence of base pairs between the nucleic acids (or nucleic acid analogs) of the loop sites. The loop region of the shRNA is a single stranded region between the sense and antisense strands, and may also be referred to as an "interleaved single strand".

본 명세서에서 사용된 "siD/R-NA" 용어는 RNA 및 DNA로 구성된 이중가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 의미하고, RNA와 DNA의 하이브리드와 키메라를 포함하며, 표적 mRNA의 번역을 막는다. 여기서, 하이브리드는 DNA로 구성된 폴리핵산과 RNA로 구성된 폴리핵산이 서로 혼성화되어 이중 가닥 분자를 형성하고 있는 분자를 지칭한다. 한편, 키메라는 이중 가닥 분자를 구성하는 한 쪽 또는 양 쪽 모두의 가닥이 RNA 및 DNA를 포함하는 것을 지칭한다. siD/R-NA를 세포 내로 도입하는 통상의 기술이 사용된다. siD/R-NA는 CX 센스 핵산 서열(또한, “센스 가닥”이라고 지칭한다), CX 안티센스 핵산 서열(또한, “안티센스 가닥”이라고 지칭한다) 또는 양쪽 방향 모두의 핵산 서열을 포함한다. 상기 siD/R-NA는 표적 유전자의 센스 및 이에 상보적인 안티센스 핵산 서열 전부를 한 개 전사체로, 예를 들면, 헤어핀(hairpin) 모양으로 설계할 수 있다. siD/R-NA는 dsD/R-NA 또는 shD/R-NA 둘 중 어느 하나일 수 있다. As used herein, the term "siD / R-NA" refers to a double-stranded polynucleotide molecule consisting of RNA and DNA, includes hybrids and chimeras of RNA and DNA, and prevents translation of the target mRNA. Here, a hybrid refers to a molecule in which a polynucleic acid composed of DNA and a polynucleic acid composed of RNA hybridize to each other to form a double stranded molecule. On the other hand, chimera refers to that one or both strands constituting a double stranded molecule include RNA and DNA. Conventional techniques for introducing siD / R-NA into cells are used. siD / R-NA includes a CX sense nucleic acid sequence (also referred to as a “sense strand”), a CX antisense nucleic acid sequence (also referred to as an “antisense strand”) or a nucleic acid sequence in both directions. The siD / R-NA can be designed as a single transcript, for example, in the shape of a hairpin, with all of the sense genes and antisense nucleic acid sequences complementary thereto. siD / R-NA may be either dsD / R-NA or shD / R-NA.

본 명세서에서 사용된 “dsD/R-NA”는 서로 상보적인 서열들을 포함하는 두 분자의 컨스트럭트를 지칭하며, 상보적 서열로 이중 가닥 폴리핵산 분자를 형성하여 서로 결합하는 구조를 지칭한다. 상기 두 가닥의 핵산 서열은 표적 유전자 서열의 단백질 암호 서열의 “센스” 또는 “안티센스”서열 뿐만 아니라 표적 유전자의 비암호화 부위에서도 선택된 뉴클레티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. dsD/R-NA를 구성하는 두 개 분자 중 하나 또는 모두는 RNA 및 DNA 모두로 이루어지거나(키메라 분자), 또한 한편으로는, 한 개 분자는 RNA로 구성되고, 다른 하나는 DNA로 구성될 수 있다(하이브리드 이중 가닥).As used herein, “dsD / R-NA” refers to a construct of two molecules comprising sequences that are complementary to each other, and refers to a structure that forms a double stranded polynucleic acid molecule with complementary sequences to bind to each other. The two stranded nucleic acid sequences may include polynucleotides having nucleotide sequences selected from the "sense" or "antisense" sequences of the protein coding sequence of the target gene sequence as well as from the non-coding region of the target gene. One or both of the two molecules that make up a dsD / R-NA may consist of both RNA and DNA (chimeric molecules), or on the other hand, one molecule may consist of RNA and the other may consist of DNA. (Hybrid double strand).

본 명세서에서 사용된 "shD/R-NA" 용어는 서로 상보적인 첫 번째 및 두 번째 영역, 즉 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는, 줄기-루프 구조를 가지는 siD/R-NA를 지칭한다. 상보성의 정도와 상보성 영역의 방위가 충분하면 부위간의 충분한 염기쌍의 결합에 의하며, 첫 번째 부위와 두 번째 부위는 루프 부위에 의해 연결되고, 루프 부위는 루프 부위의 핵산(또는 핵산 유사체)간의 염기쌍의 부재에 의해 이루어진다. 상기 shD/R-NA의 루프 부위는 센스 및 안티센스 가닥의 사이의 단일 가닥 부위이며, 또한, “개입한 단일 가닥”로 지칭될 수 있다.As used herein, the term “shD / R-NA” refers to an siD / R-NA having a stem-loop structure, including the first and second regions complementary to each other, namely sense and antisense strands. If the degree of complementarity and orientation of the complementarity region is sufficient, the binding of sufficient base pairs between the sites is achieved. The first site and the second site are linked by the loop site, and the loop site is the base pair between the nucleic acids (or nucleic acid analogs) of the loop site. Made by members. The loop region of the shD / R-NA is a single stranded region between the sense and antisense strands, and may also be referred to as an “interleaved single strand”.

본 방법은 세포의 악성 변형의 결과로서 REG4 또는 KIAA0101의 발현이 비정상적으로 상향 조절된 세포의 유전자 발현을 바꾸기 위해 사용된다. 표적 세포 내에서의 siRNA의 REG4 또는 KIAA0101 전사체와의 결합은 세포의 REG4 및 KIAA0101의 생산을 감소시키는 결과를 초래하였다. 올리고뉴클레오티드(oligonucleotid)의 길이는 적어도 10개 이상의 뉴클레오티드이며, 자연적으로 생성되는 REG4 또는 KIAA0101 전사체만큼 길 수 있다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 75개 이하, 50개 이하 또는 25개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 가장 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 19 내지 25개의 뉴클레오티드 길이이다. 포유동물 세포에서 REG4 또는 KIAA0101의 발현을 억제하는 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA 올리고뉴클레오티드의 예에는, 표적 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 각각 서열 번호 5 또는 서열번호 32인 뉴클레오티드를 포함된다. The method is used to alter the gene expression of cells in which expression of REG4 or KIAAOlOl is abnormally upregulated as a result of malignant modification of the cells. Binding of siRNA to REG4 or KIAA0101 transcripts in target cells resulted in decreased production of REG4 and KIAA0101 in cells. Oligonucleotides are at least 10 nucleotides in length and may be as long as the naturally occurring REG4 or KIAAOlO transcript. Preferably, the oligonucleotide is at most 75, at most 50 or at most 25 nucleotides in length. Most preferably, the oligonucleotide is 19 to 25 nucleotides in length. Examples of siRNA oligonucleotides of REG4 or KIAA0101 that inhibit expression of REG4 or KIAAOlOl in mammalian cells include oligonucleotides containing a target sequence, eg, nucleotides of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32, respectively.

표적세포 내 유전자 발현을 억제하는 능력을 가지는 이중 가닥 RNA를 도안하는 방법은 알려져 있다(예를 들어, 본 명세서에 통합된 미국 특허번호 6506559 참조). 예를 들면, siRNA를 고안하는 컴퓨터 프로그램은 엠비온 웹부위(Ambion website)에서 사용가능하다. 엠비온사에서 사용가능한 컴퓨터 프로그램은 하기의 방법에 따라 siRNA 합성을 위한 뉴클레오티드 서열을 선택한다.Methods of designing double stranded RNA having the ability to inhibit gene expression in target cells are known (see, eg, US Pat. No. 6506559, incorporated herein by reference). For example, a computer program for designing siRNAs is available on the Ambion website. A computer program available from Embion Corporation selects nucleotide sequences for siRNA synthesis according to the following method.

siRNAsiRNA 표적 부위의 선정 Target site selection

1. 전사체의 AUG 시작 암호를 시작으로, AA 디뉴클레오티드 서열에 대하여 아래로 스캔하였다. 잠재적인 siRNA 표적 부위로서 각 AA 및 3'에 인접한 19개 뉴클레오티드가 나타나는 것을 기록한다. 투스츨 등 (Tuschl et al.,gene Dev 13(24): 3191-7 (1999))은 5' 및 3'의 비번역 영역(untranslated regions (UTRs)) 및 시작 코돈 근처 영역(75 염기 내)에 대한 siRNA를 고안하는 것은 권고하지 않았는데, 왜냐하면 이들은 조절 단백질 결합 부위에 더 많이 존재하기 때문이다. UTR 결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체가 siRNA의 엔도뉴클레아제 복합체의 결합을 방해할 수 있다. 1. Scanning down against AA dinucleotide sequences, starting with the AUG start code of the transcript. Record the appearance of 19 nucleotides adjacent to each AA and 3 'as potential siRNA target sites. Tuszl et al. al ., gene Dev 13 (24): 3191-7 (1999)) devised siRNAs for 5 'and 3' untranslated regions (UTRs) and regions near start codons (within 75 bases). Is not recommended because they are present at more regulatory protein binding sites. UTR binding proteins and / or translation initiation complexes may interfere with the binding of the endonuclease complexes of the siRNA.

2. 잠재적 표적 부위들을 적합한 유전체 데이터베이스(인간, 마우스, 래트 등)와 비교하여 다른 암호화 서열과 상당한 상동성이 있는 표적 서열에 대한 고려를 배제한다. 상기 단계는 NCBI 서버의 블라스트(BLAST)를 이용하는 것을 제안한다: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/2. Compare potential target sites with a suitable genomic database (human, mouse, rat, etc.) to exclude consideration of target sequences that have significant homology with other coding sequences. This step suggests using BLAST of NCBI server: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

3. 합성을 위한 표적 서열의 대상을 선택한다. 평가하기위해 유전자의 길이에 따라 평가할 수 있는 몇 가지 표적 서열을 선택하는 것이 일반적이다. 3. Select the target of the target sequence for synthesis. To assess, it is common to select several target sequences that can be evaluated according to the length of the gene.

또한, 본 발명은 표적 서열의 핵산 서열을 포함하는 정제된 핵산 분자, 예를 들면, 서열 번호 5 또는 서열번호 32의 뉴클레오티드; 또는 서열번호 5 또는 서열번호 32의 뉴클레오티드의 핵산 서열과 상보적인 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용한 “분리된 핵산”은 본래 환경에서 제거된 핵산(즉, 만약 자연적으로 생성된 것이라면, 자연 환경)과 그 자연 상태에서 합성적으로 바뀐 핵산을 지칭한다. 본 발명에서 분리된 핵산은 DNA, RNA 및 이들의 유사체를 포함한다. 정제된 핵산이 RNA 또는 이의 유사사슬 경우, 핵산 서열에서 염기“t"는 “u"로 바뀌어야 한다. The invention also provides a purified nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence of a target sequence, eg, nucleotides of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32; Or a nucleic acid molecule that is complementary to the nucleic acid sequence of the nucleotide of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32. As used herein, “isolated nucleic acid” refers to nucleic acid that has been removed from its original environment (ie, if it is naturally produced, the natural environment) and nucleic acid that has been synthesized synthetically in its natural state. Nucleic acids isolated in the present invention include DNA, RNA and analogs thereof. If the purified nucleic acid is RNA or similar chains thereof, the base “t” in the nucleic acid sequence should be replaced with “u”.

본 명세서에서 사용한 용어, “상보적인”은 핵산 분자의 뉴클레오티드 단위들 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 결합을 지칭하며, “결합”은 두 개 핵산 또는 복합체; 연관된 핵산 또는 복합체; 또는 그들의 조합들 사이의 물리적 또는 화학적 상호작용을 의미한다. 폴리뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-포스포다이에스테르 결합(non-phosphodiester linkages)을 포함하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기와 같은 방법으로 서로 결합할 수 있다. 일반적으로 상보적인 핵산 서열은 적절한 조건에서 혼성화하여, 일치하지 않는 쌍을 거의 포함하지 않는 안정적인 듀플렉스(duplexes)를 형성한다. 본 발명의 목적상, 5개 또는 그 이하의 일치하지 않는 쌍들을 갖는 두 개의 서열이 상보적인 것으로 판단된다. 나아가, 본 발명의 분리된 뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 혼성화에 의하여 이중 가닥 뉴클레오티드 또는 헤어핀 루프 구조(hairpin 루프 구조)를 이룰 수 있다.As used herein, the term “complementary” refers to Watson-Crick or Hogsteen base pair binding between nucleotide units of a nucleic acid molecule, and “binding” refers to two nucleic acids or complexes; Associated nucleic acids or complexes; Or physical or chemical interactions between combinations thereof. If the polynucleotides comprise modified nucleotides and / or non-phosphodiester linkages, the polynucleotides may bind to each other in the same way. In general, complementary nucleic acid sequences hybridize under appropriate conditions to form stable duplexes containing few mismatched pairs. For the purposes of the present invention, two sequences having five or less mismatched pairs are considered to be complementary. Furthermore, the sense strand and antisense strand of the isolated nucleotides of the present invention may form a double stranded nucleotide or hairpin loop structure by hybridization.

바람직한 구체예에서, 각 듀플렉스(duplexes)는 10개 쌍 마다 1개 이하의 일치하지 않는 쌍을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서는, 듀플렉스가닥들이 완전히 상보적인 경우, 상기 듀플렉스는 일치하지 않는 쌍을 함유하지 않는다. 상기 핵산 분자는 REG4의 경우 길이가 1518 뉴클레오티드이하 또는 KIAA0101의 경우 길이가 1508 뉴클레오티드 이하이다. 예를 들면, 상기 핵산 분자는 길이가 500, 200 또는 75 뉴클레오티드 이하이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 서술하고 있는 핵산 분자를 하나 또는 그 이상을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 본 발명의 정제된 핵산은 REG4 또는 KIAA0101에 대한 siRNA 또는 상기 siRNA를 암호화하는 DNA로 유용하다. 핵산이 siRNA 또는 이를 암호화하는 DNA로 사용되었을 때, 바람직하게는 센스 가닥은 약 19개의 뉴클레오티드보다 더 길고, 더욱 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드보다 더 길다. In a preferred embodiment, each duplexes comprise no more than one mismatched pair every 10 pairs. In a more preferred embodiment, when the duplex strands are completely complementary, the duplexes do not contain mismatched pairs. The nucleic acid molecule is less than 1518 nucleotides in length for REG4 or less than 1508 nucleotides in length for KIAAOlOl. For example, the nucleic acid molecule is less than 500, 200 or 75 nucleotides in length. The present invention also includes a vector comprising one or more nucleic acid molecules described herein and a cell comprising the vector. Purified nucleic acids of the invention are useful as siRNAs for REG4 or KIAAOlOl or DNAs encoding such siRNAs. When a nucleic acid is used as the siRNA or DNA encoding it, the sense strand is preferably longer than about 19 nucleotides, more preferably longer than 21 nucleotides.

본 발명의 이중가닥 분자는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비-포스포다이에스테르 연결(non-phosphodiester linkages)을 포함할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 화학적 변형은 안정성, 이용성 및/또는 이중 가닥 분자의 세포 흡수를 증가시킬 수 있다. 당업자는 본 분자로 적용할 수 있는 화학적 변형의 다른 형태를 알 수 있다(WO03/070744; WO2005/045037). 일 구체예에서, 변형은 분해에 대한 저해를 증가시키거나 흡수를 증가시키는데 사용할 수 있다. 이러한 변형의 보기로서, 포스포로티오산 결합(phosphorothioate linkages), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드( 2'-O- methyl robonucleotids (특히, 이중 가닥 분자의 센스 가닥)), T-데옥시-플루오로 리보뉴클레오티드(T-deoxy-fluoro robonucleotid), 2'-데옥시 리보뉴클레오티드(2'-deoxy robonucleotids), “보편적 염기(universal base)”뉴클레오티드, 5'-C-메틸 뉴클레오티드(5'-C- methyl 뉴클레오티드s) 및 인벌티드 데옥시어베이직(inverted deoxyabasic) 잔기의 혼성을 포함한다(US20060122137).Double-stranded molecules of the invention may comprise one or more modified nucleotides and / or non-phosphodiester linkages. Chemical modifications well known in the art can increase the stability, availability and / or cellular uptake of double stranded molecules. One skilled in the art can know other forms of chemical modifications which can be applied with the present molecules (WO03 / 070744; WO2005 / 045037). In one embodiment, the modification can be used to increase inhibition to degradation or to increase absorption. Examples of such modifications include phosphorothioate linkages, 2'-0-methyl ribonucleotides (in particular, the sense strand of double stranded molecules), T-deoxy-fluoro T-deoxy-fluoro robonucleotids, 2'-deoxy robonucleotids, “universal base” nucleotides, 5'-C-methyl nucleotides (5'-C- methyl nucleotides) and inverted deoxyabasic residues (US20060122137).

또 다른 구체예에서, 변형은 이중 가닥 분자의 안정성을 증가시키기 위해서 또는 표적 효율성을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 변형은 이중 가닥 분자의 두 상보적 가닥간의 화학적 교차 결합(chemical cross linking), 이중 가닥 분자의 한 개 가닥의 3‘ 또는 5'의 화학적 변형, 다당류의 변형, 핵염기의 변형 및/또는 뼈대의 변형; 2-플루오로 변형된 리보뉴클레오티드(2-fluoro modified robonucleotids) 및 2‘데옥시 리보뉴클레오티드(2'-deoxy robonucleotids)를 포함한다(WO2004/029212). 또 다른 구체예에서, 변형은 표적 mRNA 및/또는 상보적 이중 가닥 분자의 상보적 뉴클레오티드와의 친화도를 증가시키거나 감소시키는데 사용될 수 있다(WO2005/044976). 예를 들면, 변형되지 않은 피리미딘(pyrimidine) 뉴클레오티드는 2-티오(2-thio), 5-알키닐(5-alkynyl), 5-메틸(5-methyl), 또는 5-프로피닐 피리미딘(5-propynyl pyrimidine)으로 대신할 수 있다. 더불어, 변형되지 않은 퓨린(purine)은 7-데자(7-deza), 7-알킬(7-alkyl) 또는 7-알케닐(7-alkenyl) 퓨린으로 대체될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이중 가닥 분자가 3' 오버행(3' overhang)을 갖는 이중 가닥 분자일 때, 3'-말단의 오버행된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyrobonucleotids)로 대체될 수 있다(Elbashir SM et al,gene Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200). 추가 상세사항을 위해, US 20060234970 같은 공개 자료를 이용할 수 있다. 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 능력을 유지하는 한, 임의의 공지된 다른 화학적 변형이 본 발명의 이중 가닥 분자에 도입될 수 있다.In another embodiment, the modification can be used to increase the stability of the double stranded molecule or to increase the target efficiency. Modifications include chemical cross linking between two complementary strands of a double stranded molecule, chemical modification of 3 'or 5' of one strand of a double stranded molecule, modification of polysaccharides, modification of nucleobases, and / or skeletons. transform; 2-fluoro modified robonucleotids and 2'-deoxy robonucleotids (WO2004 / 029212). In another embodiment, modifications can be used to increase or decrease the affinity of the target mRNA and / or complementary double stranded molecules with complementary nucleotides (WO2005 / 044976). For example, unmodified pyrimidine nucleotides may be 2-thio, 5-alkynyl, 5-methyl, or 5-propynyl pyrimidine ( 5-propynyl pyrimidine). In addition, the unmodified purine may be replaced with 7-deza, 7-alkyl or 7-alkenyl purine. In another embodiment, when the double-stranded molecule is a double-stranded molecule with a 3 'overhang, the 3'-terminal overhanged nucleotide may be replaced with deoxyrobonucleotids (Elbashir SM). et al , gene Dev 2001 Jan 15, 15 (2): 188-200). For further details, publicly available materials such as US 20060234970 are available. The present invention is not limited to these examples, and any other known chemical modification may be introduced into the double stranded molecule of the present invention, as long as the molecule maintains the ability to inhibit expression of the target gene.

나아가, 본 발명의 이중 가닥 분자는 예를 들면, dsD/R-NA 또는 shD/R-NA같은 DNA 및 RNA 모두를 포함할 수 있다. 특히, DNA 가닥과 RNA 가닥의 혼성화 폴리뉴클레오티드 또는 DNA-RNA 키메라 폴리뉴클레오티드가 안정성의 향상을 보였다. DNA 및 RNA의 혼합, 즉, DNA 가닥(폴리뉴클레오티드) 및 RNA 가닥(폴리뉴클레오티드)로 구성되는 하이브리드 형태의 이중 가닥 분자; 단일 가닥(폴리뉴클레오티드) 하나 또는 양쪽 모두에서, DNA 및 RNA 모두로 구성되는 키메라 형태의 이중 가닥 분자; 또는 그러한 유사체를 이중 가닥 분자의 안정성을 증가시키기 위해 형성할 수 있다. DNA 가닥과 RNA 가닥의 하이브리드는, 센스 가닥은 DNA이고 안티센스 가닥은 RNA인 하이브리드이거나, 또는 표적 유전자를 발현하는 세포로 도입되었을 때, 상기 유전자의 발현을 억제하는 능력을 가지는 한 이의 반대로 혼성화 될 수 있다. 바람직하게는, 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 DNA이고, 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 또한, 키메라 형태의 이중 가닥 분자는 센스 및 안티센스 가닥 모두가 DNA 및 RNA로 구성되거나, 그것이 표적 유전자를 발현하는 세포로 도입되어, 상기 유전자의 발현을 억제하는 능력을 가지는 한, 센스 및 안티센스 가닥 중 어느하나가 DNA 및 RNA로 구성될 수 있다. Furthermore, the double-stranded molecule of the invention may comprise both DNA and RNA, such as, for example, dsD / R-NA or shD / R-NA. In particular, hybridized polynucleotides or DNA-RNA chimeric polynucleotides of the DNA strand and the RNA strand have shown an improvement in stability. A hybrid form of double stranded molecule consisting of a mixture of DNA and RNA, ie a DNA strand (polynucleotide) and an RNA strand (polynucleotide); Single-stranded (polynucleotide) double-stranded molecules in chimeric form consisting of both DNA and RNA, in one or both; Or such analogs may be formed to increase the stability of the double-stranded molecule. Hybrids of DNA strands and RNA strands can be hybrids where the sense strand is DNA and the antisense strand is RNA, or vice versa, as long as they have the ability to inhibit expression of the gene when introduced into cells expressing the target gene. have. Preferably, the sense strand polynucleotide is DNA and the antisense strand polynucleotide is RNA. In addition, the chimeric form of the double-stranded molecule is one of the sense and antisense strands, as long as both the sense and antisense strands are composed of DNA and RNA, or they are introduced into cells expressing a target gene and thus have the ability to inhibit expression of the gene. Either can be composed of DNA and RNA.

이중 가닥 분자의 안정성을 높이기 위하여, 바람직하게는 상기 분자는 가능한 한 많은 DNA를 포함하며, 이에 반하여 표적 유전자 발현의 억제를 증가시키기 위하여, 상기 분자는 발현의 충분한 억제를 유도하는 범위 내에서 RNA 분자일 것이 요구된다. 키메라 형태의 이중 가닥 분자의 바람직한 예로써, 이중 가닥 분자의 상류 부분 영역(예를 들면, 표적 서열의 옆 부분; 또는 센스 또는 안티센스 가닥에 존재하는 이와 상보적인 서열)은 RNA이다. 바람직하게는, 상기 상류 부분 부위는 센스 가닥의 5' 쪽(5'-말단) 및 안티센스 가닥의 3' 쪽(3'-말단)이다. 즉, 바람직한 구체예에서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 옆 부분; 또는 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 3 '-말단 모두의 옆 부분은 RNA로 이루어져 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 또는 하이브리드 형태의 이중 가닥 분자는 하기의 조합을 포함한다. In order to increase the stability of the double-stranded molecule, preferably the molecule contains as much DNA as possible, whereas in order to increase the inhibition of target gene expression, the molecule is an RNA molecule within a range that induces sufficient inhibition of expression. Is required to be. As a preferred example of a chimeric form of the double stranded molecule, the upstream partial region of the double stranded molecule (eg, the side of the target sequence; or a complementary sequence present in the sense or antisense strand) is RNA. Preferably, the upstream portion is the 5 'end (5'-end) of the sense strand and the 3' end (3'-end) of the antisense strand. That is, in a preferred embodiment, the 3′-terminal side of the antisense strand; Or the flank of both the 5'-end of the sense strand and the 3'-end of the antisense strand consists of RNA. For example, the chimeric or hybrid form double stranded molecules of the present invention include the following combinations.

센스 가닥: 5'-[DNA]-3'Sense strand: 5 '-[DNA] -3'

3'-(RNA)-[DNA]-5' : 안티센스 가닥,               3 '-(RNA)-[DNA] -5': antisense strand,

센스 가닥: 5'-(RNA)-[DNA]-3'Sense strand: 5 '-(RNA)-[DNA] -3'

3'-(RNA)-[DNA]-5' : 안티센스 가닥, 및               3 '-(RNA)-[DNA] -5': antisense strand, and

센스 가닥: 5'-(RNA)-[DNA]-3' Sense strand: 5 '-(RNA)-[DNA] -3'

3'-(RNA)-5' : 안티센스 가닥.                 3 '-(RNA) -5': antisense strand.

바람직하게는, 상기 상류 일부 영역은 이중 가닥 분자의 센스 또는 안티센스 가닥 내에 표적 서열 말단 9 내지 13 뉴클레오티드를 포함하는 영역이다. 게다가, 상기와 같은 키메라 형태의 이중 가닥 분자의 바람직한 예에는, 상류의 절반(센스 가닥의 5' 쪽 부위 및 안티센스 가닥의 3' 쪽 부위)은 RNA이고 나머지 절반은 DNA인 폴리 뉴클레오티드에서 적어도 19 내지 21 뉴클레오티드 길이의 가닥이 포함된다. 이러한 키메라 타입의 이중 가닥 분자는, 안티센스 가닥 전체가 RNA인 경우보다 표적 유전자의 발현을 억제하는 효과가 더욱 높다(US 20050004064).Preferably, the upstream partial region is a region comprising 9 to 13 nucleotides of the target sequence terminal within the sense or antisense strand of the double stranded molecule. Furthermore, in a preferred example of such a chimeric double stranded molecule, at least 19 to up to half of the polynucleotides upstream (5 'side of the sense strand and 3' side of the antisense strand) are RNA and the other half is DNA. Strands of 21 nucleotides are included. Such chimeric type double-stranded molecules have a higher effect of inhibiting expression of target genes than when the entire antisense strand is RNA (US 20050004064).

본 발명에서, 상기 이중 가닥 분자는 shRNA(short hairpin RNA) 및 shD/R-NA(DNA 및 RNA로 구성되는 short hairpin)같은 헤어핀을 형성할 수 있다. shRNA 또는 shD/R-NA는 RNA 간섭을 통해서 유전자 발현을 억제시키는데 사용될 수 있는 견고한 헤어핀 턴(hairpin turn)을 형성하는 RNA 서열 또는 RNA와 DNA의 혼합이다. 상기 shRNA 또는 shD/R-NA는 상기 서열에서 루프 서열에 의해 분리되는 단일 가닥에 센스 표적 서열 및 안티센스 표적 서열을 포함한다. 일반적으로, 상기 세포 기관에 의해 dsRNA 또는 dsD/R-NA로 쪼개진 후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하고, 이들 복합체는 dsRNA 또는 dsD/R-NA의 표적서열과 일치하는 mRNA에 결합하여 잘라낸다. In the present invention, the double-stranded molecule may form hairpins such as shRNA (short hairpin RNA) and shD / R-NA (short hairpin composed of DNA and RNA). shRNA or shD / R-NA is an RNA sequence or a mixture of RNA and DNA that forms a robust hairpin turn that can be used to inhibit gene expression through RNA interference. The shRNA or shD / R-NA comprises a sense target sequence and an antisense target sequence in a single strand separated by a loop sequence in the sequence. In general, the cells are cleaved into dsRNA or dsD / R-NA and then bound to an RNA-induced silencing complex (RISC), and these complexes bind to mRNAs corresponding to target sequences of dsRNA or dsD / R-NA. Cut it off.

본 발명은 REG4를 암호화하는 유전자가 비암성 췌장조직에 비해 PDACa(pancreatic ductal adenocarcinoma)에서 과발현된다는 것과 KIAA0101을 암호화하는 유전자가 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암에서 비암성 각 조직에 비해 과발현 된다는 발견에 기초한 것이다. REG4의 cDNA는 길이가 1518개의 뉴클레오티드이다. 한편, KIAA0101의 cDNA는 길이가 1508 뉴클레오티드이다. REG4(Genbank accession No: AY 126670)의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 서열 번호 1 및 2에 각각 나타내었으며, KIAA0101(Genbank accession No: NM_014736)의 핵산 및 폴리펩티드 서열은 서열번호 39 및 40에 각각 나타내었다. 본 발명은 서열번호 5를 포함하는 siRNA의 형질도입이 PDAC 세포주의 성장억제를 초래함을 확인하였다. 나아가, 서열 번호 32를 포함하는 siRNA는 췌장암 세포주의 성장억제를 초래하였다. According to the present invention, the gene encoding REG4 is overexpressed in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDACA) compared to noncancerous pancreatic tissue, and the gene encoding KIAA0101 is overexpressed in pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. It is based. The cDNA of REG4 is 1518 nucleotides in length. On the other hand, the cDNA of KIAAOlOl is 1508 nucleotides in length. The nucleic acid and polypeptide sequences of REG4 (Genbank accession No: AY 126670) are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the nucleic acid and polypeptide sequences of KIAAOl101 (Genbank accession No: NM_014736) are shown in SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively. The present invention confirmed that transduction of siRNA comprising SEQ ID NO: 5 results in growth inhibition of the PDAC cell line. Furthermore, siRNA comprising SEQ ID NO: 32 resulted in growth inhibition of pancreatic cancer cell line.

세포 증식 억제 방법Cell proliferation inhibition method

본 발명은 세포 증식의 억제, 즉, REG4 또는 KIAA0101 발현의 억제를 통한 암세포의 성장 억제에 관한 것이다. REG4 또는 KIAA0101의 발현은, 예를 들면, REG4 유전자 또는 KIAA0101 유전자를 특이적으로 표적하는 siRNA (small interfering RNA)를 통해서 억제되었다. 예를 들면, REG4 표적은 서열 번호 5의 뉴클레오티드를 포함하고, KIAA0101 표적은 서열번호 32의 뉴클레오티드를 유사하게 포함한다.The present invention relates to inhibition of growth of cancer cells through inhibition of cell proliferation, ie, inhibition of REG4 or KIAAOlOl expression. Expression of REG4 or KIAA0101 was inhibited, for example, via siRNA (small interfering RNA) specifically targeting the REG4 gene or KIAA0101 gene. For example, the REG4 target comprises the nucleotides of SEQ ID NO: 5 and the KIAAOlOl target similarly comprises the nucleotides of SEQ ID NO: 32.

억제성 폴리뉴클레오티드(polynucleotids) 및 폴리펩티드(polypeptids)에 대한 문맥에서의 용어, “특이적인 억제”는 REG4 및/또는 KIAA0101의 발현 또는 생물학적 기능을 억제하는 제제 또는 리간드(ligands)로서의 능력을 지칭한다. 특이적인 억제는 일반적으로 기저치(backgraound)보다 2배, 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 100배 이상 REG4 및/또는 KIAA0101 발현(예를 들면, 전사 및 번역) 또는 측정된 생물학적 기능(예를 들면, 세포 성장 또는 증식, 세포자멸사(apoptosis)의 억제, REG4의 세포내 신호전달, 예를 들면, REG4를 통한 EGF 수용체/ Akt/AP-1 신호전달경로의 활성화; KIAA0101을 통한 PCNA 또는 다른 세포내 단백질과의 결합)을 억제한다. 발현량 및/또는 생물학적 기능은 문맥에서 처리 및 미처리한 세포; 또는 처리 전 후의 세포군을 비교하여 측정할 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, REG4 및/또는 KIAA0101의 발현 또는 생물학적 기능은 완전히 억제되었다. 일반적으로, 특이적 억제는 적당한 통계적 시험에 의한 REG4/LIAA0101의 발현 또는 생물학적 기능의 통계적 의미의 감소이다(예를 들면, p≤0.05). The term "specific inhibition" in the context of inhibitory polynucleotids and polypeptides refers to the ability as an agent or ligand to inhibit the expression or biological function of REG4 and / or KIAAOlOl. Specific inhibition is generally 2 times, preferably at least 10 times, most preferably at least 100 times the REG4 and / or KIAAOlOl expression (eg, transcription and translation) or measured biological function (eg For example, cell growth or proliferation, inhibition of apoptosis, intracellular signaling of REG4, eg, activation of EGF receptor / Akt / AP-1 signaling pathways through REG4; PCNA or other via KIAA0101 Binding to intracellular proteins). The amount of expression and / or biological function can be determined in the context of cells treated and untreated; Alternatively, the cell groups before and after the treatment can be compared and measured. In certain embodiments of the invention, the expression or biological function of REG4 and / or KIAAOlOl is completely inhibited. In general, specific inhibition is a reduction in the expression of REG4 / LIAA0101 or the statistical significance of the biological function by appropriate statistical tests (eg p ≦ 0.05).

비포유류 세포에서, 이중 가닥 RNA (dsRNA)은 유전자 발현에 대하여, 강력하고 특이적인 사일런싱(silencing)을 행사하는 것을 보여주었고(Sharp PA.gene Dev. 1999 Jan 15;13(2): 139-41.), 이는 RNA 간섭(RNAi)이라고 지칭된다. dsRNA는 RNase Ⅲ 모티브를 포함하는 효소에 의해서 siRNA (small interfering RNA)로 불리는 20 내지 23 뉴클리오티드의 dsRNA로 만들어진다. 상기 siRNA는 다성분 뉴클리아제 복합체(multicomponent 뉴클레아제 complex)에 의하여 상보적 mRNA를 특이적으로 표적한다(Hammond SM, et al. Nature. 2000 Mar 16; 404 (6775): 293- 6; Hannon GJ. Nature. 2002 JuI 11; 418 (6894): 244-51.). 포유류 세포에서는, 19개의 상보적 뉴클레오티드; 및 티미딘(thymidine) 또는 유리딘(uridine)의 3'말단 비상보적 이합체(dimmers)로 구성된 20 내지 21단위체의 dsRNA로 구성된 siRNA는 유전자 발현의 광범위한 변화없이 특이적인 유전자 녹다운(knock-down) 효과를 보여주었다(Elbashir SM, et al. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.).In non-mammalian cells, double stranded RNA (dsRNA) has been shown to exert strong and specific silencing for gene expression (Sharp PA.gene Dev. 1999 Jan 15; 13 (2): 139- 41.), which is called RNA interference (RNAi). dsRNA is made into 20-23 nucleotide dsRNA called small interfering RNA (siRNA) by an enzyme containing an RNase III motif. The siRNA specifically targets complementary mRNA by a multicomponent nuclease complex (Hammond SM, et. al . Nature. 2000 Mar 16; 404 (6775): 293-6; Hannon GJ. Nature. 2002 JuI 11; 418 (6894): 244-51.). In mammalian cells, 19 complementary nucleotides; And siRNA consisting of 20 to 21 units of dsRNA consisting of 3 'terminal non-complementary dimers of thymidine or uridine have specific gene knock-down effects without extensive changes in gene expression. (Elbashir SM, et al . Nature. 2001 May 24; 411 (6836): 494-8.).

세포의 성장은 REG4 또는 KIAA0101dml siRNA를 함유하는 조성물과 세포의 접촉에 의해서 억제된다. 상기 세포에 추가로 형질 전환 제제를 처리하였다. 적합한 형질 전환 제제는 당업계에 알려져 있다. 세포 성장의 억제는 상기 조성물에 노출되지 않은 세포와 비교하여 낮은 속도의 세포 증식 또는 생존력의 감소를 의미한다. 세포 성장은 당업계에서 알려진 MTT 세포 증식 분석방법을 통하여 측정하였다.Growth of the cells is inhibited by contact of the cells with a composition containing REG4 or KIAAOl 10 dml siRNA. The cells were further treated with transfection agents. Suitable transformation agents are known in the art. Inhibition of cell growth means a low rate of cell proliferation or a reduction in viability compared to cells not exposed to the composition. Cell growth was measured through MTT cell proliferation assays known in the art.

상기 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA는 직접적인 단일 표적은 각각 REG4 유전자 서열 또는 KIAA0101 유전자 서열이다. 택일적으로, 상기 siRNA는 REG4 또는 KIAA0101 유전자 서열의 복합적인 표적을 유도한다. 예를 들면, 각각, REG4 또는 KIAA0101의 두 개, 세 개, 네 개, 또는 다섯 개; 또는 그 이상의 표적 서열을 가리키는 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA를 포함하는 조성물이다. 상기 REG4 또는 KIAA0101 표적 서열은 REG4 유전자 또는 KIAA0101 유전자(예를 들면, siRNA와 길이가 같고, 상보적인, REG4 또는 KIAA0101 유전자 내에 존재하는 폴린뉴클레오티드)의 일부와 동일한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 표적 서열은 인간 REG4 또는 KIAA0101 유전자의 5‘UTR (5' untranslated (UT) 영역), ORF (open reading frame) 또는 3' UTR (3' untranslated 영역)을 포함할 수 있다. 택일적으로, 상기 siRNA는 REG4 또는 KIAA0101 유전자 발현의 상류 또는 하류의 조절자와 상보적인 핵산 서열이다. 상기 상류 및 하류 조절자의 예시에는 REG4 또는 KIAA0101 유전자 프로모터; REG4 또는 KIAA0101 폴리펩티드와 상호작용하는 인산화효소 또는 탈인산화효소; REG4 또는 KIAA0101 프로모터; 또는 인핸서를 포함한다.The siRNA of REG4 or KIAAOlOl is a direct single target, respectively, the REG4 gene sequence or KIAAOlOl gene sequence. Alternatively, the siRNA induces a complex target of the REG4 or KIAA0101 gene sequence. For example, two, three, four, or five of REG4 or KIAAOlOl, respectively; Or a siRNA of REG4 or KIAAOlO pointing to a further target sequence. The REG4 or KIAA0101 target sequence refers to a nucleotide sequence identical to a portion of a REG4 gene or a KIAA0101 gene (eg, a polyline nucleotide that is the same length as the siRNA and is complementary, present in the REG4 or KIAA0101 gene). The target sequence may comprise 5'UTR (5 'untranslated (UT) region), ORF (open reading frame) or 3' UTR (3 'untranslated region) of human REG4 or KIAA0101 gene. Alternatively, the siRNA is a nucleic acid sequence that is complementary to a regulator upstream or downstream of REG4 or KIAAOlOl gene expression. Examples of such upstream and downstream regulators include the REG4 or KIAA0101 gene promoter; Kinase or dephosphatase that interacts with REG4 or KIAAOlOl polypeptides; REG4 or KIAA0101 promoter; Or enhancers.

표적 mRNA에 혼성화하는 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA는, 정상의 단일 가닥 mRNA 전사체와 결합함으로써, REG4 또는 KIAA0101 유전자에 의해서 암호화되는 REG4 또는 KIAA0101 폴리펩티드 산물의 생산을 감소 또는 억제하고, 그 결과 번역을 방해하고, 따라서, 상기 단백질의 발현을 억제한다. 따라서, 본 발명의 siRNA 분자는 엄격한 조건 하에서 REG4 또는 KIAA0101 유전자의 mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화되는 능력으로 정의될 수 있다. SiRNAs of REG4 or KIAA0101 that hybridize to target mRNAs, by binding to normal single-stranded mRNA transcripts, reduce or inhibit the production of REG4 or KIAA0101 polypeptide products encoded by the REG4 or KIAA0101 genes, thereby disrupting translation and Thus, inhibiting expression of the protein. Thus, siRNA molecules of the invention can be defined as the ability to specifically hybridize to mRNA or cDNA of the REG4 or KIAA0101 gene under stringent conditions.

본 발명의 목적에 따른 용어 "혼성화" 또는 "특이적인 혼성화" 는 두 개 핵산 분자가 "엄격한 혼성화 조건"에서 혼성화되는 능력을 지칭하여 사용되었다. 용어 "엄격한 혼성화 조건"은 일반적으로 핵산의 복합 혼합물에서 핵산 분자가 그의 표적 서열에 혼성화 되고, 다른 서열에는 탐지되지 않는 조건이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 다른 환경에서는 달라질 것이다. 긴 서열은 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 포괄적 안내는 “혼성화 원칙 및 핵산 분석 방법의 전략에 대한 개관”(Tijssen, techniques in Biochemistry and Molecular Biology hybridization with Nucleic probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993))에서 확인된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 일정한 pH의 이온세기에서 특이적 서열에 대한 융점(Tm) 보다 낮은 약 5-100 ℃에서 선택된다. 상기 융점(일정한 pH의 이온세기, 및 핵산 농도)은 표적에 상보적인 탐침의 50%가 표적 서열과 혼성화되어 평형(과량의 표적 서열이 존재할 때, Tm에서 50%의 탐침이 평형 상태이다)을 이루는 온도이다. 또한, 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정화 제제를 첨가하여 도달할 수 있다. 선택적인 또는 특이적인 혼성화를 위하여, 적어도 양성 신호가 바탕값의 두 배이고, 바람직하게는 바탕값 혼성화의 10배이다. 모범적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 5O℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS로 세척하면서 50% 포름아마이드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 반응; 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 반응.The term “hybridization” or “specific hybridization” according to the purpose of the present invention has been used to refer to the ability of two nucleic acid molecules to hybridize under “strict hybridization conditions”. The term “strict hybridization conditions” is generally a condition in which a nucleic acid molecule hybridizes to its target sequence in a complex mixture of nucleic acids and is not detected in other sequences. Stringent conditions are sequence-dependent and will vary in other circumstances. Long sequences hybridize specifically at high temperatures. A comprehensive guide to hybridization of nucleic acids can be found in the "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (Tijssen, techniques in Biochemistry and Molecular Biology hybridization with Nucleic probes) ( 1993). In general, stringent conditions are selected at about 5-100 ° C. below the melting point (Tm) for specific sequences at constant pH ionic strength. The melting point (the ionic strength at a constant pH, and the nucleic acid concentration) is such that 50% of the probes complementary to the target hybridize with the target sequence to equilibrate (when an excess target sequence is present, 50% of the probe is in equilibrium). Temperature. Stringent conditions can also be achieved by the addition of destabilizing agents such as formamide. For selective or specific hybridization, at least the positive signal is twice the background, preferably 10 times the background hybridization. Exemplary stringent hybridization conditions may be as follows: 50% formamide, 5 × SSC, and 1% SDS at 42 ° C., washing with 0.2 × SSC and 0.1% SDS at 42 ° C .; Or at 5 × SSC, 1% SDS, 65 ° C.

본 발명의 siRNA는 적어도 길이가 500, 200, 100, 50, 또는 25개의 뉴클레오티드 이상이다. 바람직하게는 상기 siRNA는 길이가 약 19 내지 25개 뉴클레오티드이다. REG4 siRNA의 생산을 위한 예시적인 핵산서열은 표적서열로서 서열번호 5의 뉴클레오티드를 포함한다. 유사하게, KIAA0101 siRNA 의 생산을 위한 핵산 서열은 표적서열로서 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 나아가, siRNA의 억제 활성을 증가시키기 위하여, 뉴클레오티드 "u"를 표적서열의 안티센스가닥의 3‘ 말단에 첨가할 수 있다. 첨가되는 "u"의 개수는 적어도 2개 이상, 일반적으로는 약 2 내지 10개, 바람직하게는 약 2 내지 5개일 수 있다. 상기 첨가된 "u"는 siRNA의 안티센스 가닥의 3' 말단에서 단일가닥을 형성한다. The siRNA of the invention is at least 500, 200, 100, 50, or 25 nucleotides in length. Preferably the siRNA is about 19-25 nucleotides in length. Exemplary nucleic acid sequences for the production of REG4 siRNA include the nucleotide of SEQ ID NO: 5 as the target sequence. Similarly, the nucleic acid sequence for the production of KIAAOlOl siRNA comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 as the target sequence. Furthermore, in order to increase the inhibitory activity of siRNA, nucleotide "u" may be added to the 3 'end of the antisense strand of the target sequence. The number of "u" added may be at least two, generally about 2 to 10, preferably about 2 to 5. The added "u" forms a single strand at the 3 'end of the antisense strand of the siRNA.

상기 세포는 REG4 또는 KIAA0101을 발현하거나 과발현하는 세포이다. 상기 세포는 췌장 관 세포 같은 내피세포이다. 택일적으로, 상기 세포는 암종, 선암종, 아세포종, 백혈병, 골수종 같은 종양 세포이다. 상기 세포는 췌장암 세포, 특히 췌장 관 선암종 세포, 전립선암 세포, 유방암 세포, 및 방광암 세포이다.The cell is a cell that expresses or overexpresses REG4 or KIAAOlOl. The cells are endothelial cells such as pancreatic duct cells. Alternatively, the cells are tumor cells such as carcinoma, adenocarcinoma, blastoma, leukemia, myeloma. The cells are pancreatic cancer cells, especially pancreatic ductal adenocarcinoma cells, prostate cancer cells, breast cancer cells, and bladder cancer cells.

상기 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA는 mRNA 전사체와 결합할 수 있는 형태로 세포 내로 직접 도입된다. 택일적으로, REG4 또는 KIAA0101의 siRNA를 암호화하는 DNA가 벡터 내에 있을 수 있다. The siRNA of REG4 or KIAAOl101 is introduced directly into the cell in a form capable of binding to the mRNA transcript. Alternatively, DNA encoding the siRNA of REG4 or KIAAOlOl may be in the vector.

벡터는 양 쪽 가닥의 발현((DNA 분자가 전사됨으로써)이 가능하도록 REG4 또는 KIAA0101 서열 옆에 조절 서열이 작동가능하게 연결된 발현 벡터로 REG4 또는 KIAA0101의 표적서열을 클로닝 함으로써 제조할 수 있다(Lee, N.S., et al. Nature Biotechnology 20 : 500-5.). REG4 또는 KIAA0101 mRNA의 안티센스인 RNA 분자는 첫 번째 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 3‘ 프로모터 서열)에 의해서 전사되고, REG4 또는 KIAA0101 mRNA에 대한 센스 가닥인 RNA 분자는 두 번째 프로모터(예를 들면, 상기 클로닝된 DNA의 5‘ 프로모터 서열)에 의해 전사된다. 상기 센스 및 안티센스 가닥은 in vivo에서 혼성화되어 REG4 또는 KIAA0101 유전자의 사일런싱(silencing)을 위한 siRNA 컨스트럭트를 생성한다.Vectors can be prepared by cloning the target sequence of REG4 or KIAA0101 with an expression vector operably linked to a REG4 or KIAA0101 sequence to enable expression of both strands (by DNA molecules being transcribed) (Lee, NS, et al. Nature Biotechnology 20: 500-5.) RNA molecules that are antisense of REG4 or KIAAOlO mRNA are transcribed by the first promoter (e.g., the 3 'promoter sequence of the cloned DNA), and REG4 or The RNA molecule, which is the sense strand for KIAA0101 mRNA, is transcribed by a second promoter (eg, the 5 'promoter sequence of the cloned DNA) The sense and antisense strands hybridize in vivo to yield a silon of the REG4 or KIAA0101 gene. SiRNA constructs are generated for silencing.

택일적으로, siRNA 컨스트럭트의 센스 및 안티센스 가닥을 생성하는 데 두 개의 컨스트럭트가 사용될 수 있다. 클로닝된 REG4 또는 KIAA0101는 2차 구조, 예를 들면 헤어핀을 갖는 컨스트럭트를 암호화 할 수 있으며, 여기에서 단일 전사체는 표적 유전자에 대한 센스 및 상동적 안티센스를 갖는다. Alternatively, two constructs can be used to generate the sense and antisense strands of the siRNA construct. The cloned REG4 or KIAAOlOl can encode a construct with a secondary structure, such as a hairpin, where a single transcript has sense and homologous antisense for the target gene.

임의의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 루프 서열은 헤어핀 루프 구조를 형성하기 위하여 센스 및 안티센스 서열의 사이에 위치할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 일반식으로 5'-[A]-[B]-[A']-3'를 가지는 siRNA를 제공하는데, 상기 식에서 [A]는 REG4 또는 KIAA0101의 mRNA 또는 cDNA와 특이적으로 혼성화하는 서열과 상응하는 리보뉴클레오티드 서열이다. 바람직한 구체예에서, [A]는 서열번호 5 또는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 리보뉴클레오티드 서열이고, [B]는 3 내지 23 개의 뉴클레오티드로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열이며, [A']는 [A]와 상보적인 서열로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열이다. A loop sequence consisting of any nucleotide sequence can be located between the sense and antisense sequences to form a hairpin loop structure. Accordingly, the present invention also provides siRNA having 5 '-[A]-[B]-[A']-3 'in the general formula, wherein [A] is specific for mRNA or cDNA of REG4 or KIAAOlOl. Ribonucleotide sequence corresponding to the sequence that hybridizes. In a preferred embodiment, [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32, [B] is a ribonucleotide sequence consisting of 3 to 23 nucleotides, and [A '] is [ Ribonucleotide sequence consisting of a sequence complementary to A].

[A] 영역은 [A']와 혼성화되며, 그리고 나서, [B]영역으로 구성된 루프가 형성된다. 상기 루프 서열은 바람직하게는 3 내지 23개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 루프서열은, 예를 들면, 하기의 서열로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html). 나아가, 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 루프 서열 역시 활성형 siRNA로 제공한다(Jacque, J.M., et al (2002) Nature 418 : 435-438.).Region [A] is hybridized with [A '], and then a loop consisting of region [B] is formed. The loop sequence may preferably be 3 to 23 nucleotides in length. The loop sequence may be selected, for example, from the group consisting of the following sequences (www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html). Furthermore, loop sequences consisting of 23 nucleotides are also provided as active siRNAs (Jacque, JM, et al (2002) Nature 418: 435-438.).

CCCCCACC 또는 CCACACC: Jacque, J.M., et al. (2002) Nature, Vol. 418: 435-8. CCCCCACC or CCACACC: Jacque, JM, et al . (2002) Nature, Vol. 418: 435-8.

UUCG: Lee, N.S., et al. (2002) Nature Biotechnology 20 : 500-5. Fruscoloni, P., et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44.UUCG: Lee, NS, et al . (2002) Nature Biotechnology 20: 500-5. Fruscoloni, P., et al . (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (4): 1639-44.

UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M., et al. Nature Reviews Molecular cell Biology 4: 457-67.UUCAAGAGA: Dykxhoorn, DM, et al . Nature Reviews Molecular cell Biology 4: 457-67.

예를 들어, 본 발명의 헤어핀 루프 구조를 가지는 바람직한 siRNA를 하기에 나타내었다. 하기의 구조에서, 상기 루프 서열은 CCC, UUCG, CCACC, CCACACC, 및 UUCAAGAGA로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 루프 서열은 UUCAAGAGA (DNA로는 "ttcaagaga")이다.For example, the preferred siRNA having the hairpin loop structure of the present invention is shown below. In the structure below, the loop sequence may be selected from the group consisting of CCC, UUCG, CCACC, CCACACC, and UUCAAGAGA. Preferred loop sequence is UUCAAGAGA ("ttcaagaga" for DNA).

5 '-GACAGAAGGAAGAAACTCA-[B]-TGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3' (서열번호 5의 표적서열로서) 5 '-GACAGAAGGAAGAAACTCA- [B] -TGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3' (as target sequence of SEQ ID NO: 5)

REG4 또는 KIAA0101 서열의 옆에 존재하는 조절 서열은 동일하거나 다를 수 있고, 그들의 발현을 독립적으로, 일시적으로 또는 위치적 방법으로 조절할 수 있다. The regulatory sequences present beside the REG4 or KIAAOlOl sequences can be the same or different and can control their expression independently, temporarily or in a positional manner.

siRNA는 REG4 또는 KIAA0101 유전자 주형을 예를 들면, 작은 핵 RNA (small nuclear RNA (snRNA)) U6 또는 인간 Hl RNA 프로모터를 포함하는 벡터 내로 클로닝 함으로써, 세포내에서 전사된다. 상기 벡터를 세포 내로 도입하기 위하여, 형질도입-촉진제를 사용할 수 있다. 퓨젠(FuGENE (Roche Diagnostices)), 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000 (Invitrogen)), 올리고펙타민(Oligofectamine (Invitrogen)), 및 뉴클레오펙터(Nucleofector (Wako pure Chemical))가 형질도입-증진제로서 유용하다. siRNAs are transcribed intracellularly by cloning the REG4 or KIAAOlOl gene template into a vector comprising, for example, a small nuclear RNA (snRNA) U6 or human Hl RNA promoter. To introduce the vector into cells, transduction-promoters can be used. FuGENE (Roche Diagnostices), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen), and Nucleofector (Wako pure Chemical) are useful as transduction-enhancers. Do.

올리고뉴클레오티드 및 REG4 또는 KIAA0101 mRNA의 다양한 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드에 대하여, 표준 방법에 따라 종양세포(예를 들면, 췌장암 세포주 또는 췌장 관 선암종(PDAC) 세포주같은 췌장세포를 사용하여)내 REG4 또는 KIAA0101생산을 감소시키는 능력을 in vitro에서 시험하였다. 후보 조성물이 없는 상태에서 배양한 세포와 비교하여 볼때, siRNA 조성물 후보와 접촉한 세포내 REG4 또는 KIAA0101 유전자산물의 감소가 REG4 또는 KIAA0101에 특이정인 항체 또는 기타 검출 전략을 사용하여 검출되었다. in vitro 세포-기반(cell-based) 또는 세포-프리(cell-free) 분석에서 REG4 또는 KIAA0101의 생산을 감소시키는 서열로 세포 성장에서의 그들의 억제 효과를 시험하였다. in vitro 세포-기반 분석에서 세포성장을 억제한 서열도 REG4 또는 KIAA0101 생산이 감소하는지를 확인 하고자, in vivo 랫트 또는 마우스로 시험하였고, 악성 종양을 가진 동물에서 종양 세포 성장이 감소되었다. For oligonucleotides and oligonucleotides that are complementary to various portions of REG4 or KIAAOlOl mRNA, REG4 or KIAAOlOl in tumor cells (e.g., using pancreatic cells such as pancreatic cancer cell lines or pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell lines) according to standard methods. The ability to reduce production was tested in vitro. Compared to cells cultured in the absence of the candidate composition, a decrease in intracellular REG4 or KIAA0101 gene product in contact with the siRNA composition candidate was detected using an antibody or other detection strategy specific for REG4 or KIAA0101. Their inhibitory effects on cell growth were tested with sequences that reduce the production of REG4 or KIAAOlOl in in vitro cell-based or cell-free assays. In vitro cell-based assays were also tested in rats or mice in vivo to determine whether the sequences that inhibited cell growth also reduced REG4 or KIAAOlOl production, and tumor cell growth was reduced in animals with malignant tumors.

악성 종양 치료 방법How to treat malignant tumors

REG4 또는 KIAA0101를 과발현하는 특징의 종양을 가진 환자는 REG4 또는 KIAA0101 각각에 대한 siRNA를 투여함으로써 치료할 수 있다. siRNA 치료법은 예를 들면, 췌장암, 특히 췌장 관 선암종(PDAC), 전립선암 세포, 유방암 세포, 및 방광암 세포와 같은 것을 겪고 있거나 발전할 위험을 가진 환자에게서 REG4 또는 KIAA0101의 발현을 막기위해 사용되는 방법이다. 환자들은 개개의 종양 타입의 표준 방법에 따라 분리된다. 췌장암, PDAC, 전립선암 세포, 유방암세포, 및 방광암 세포는 예를 들면, CT, MRI, ERSP, MPCR, 컴퓨터 X-선 단층촬영 또는 초음파를 이용함으로써 진단할 수 있다. Patients with tumors characterized by overexpressing REG4 or KIAAOlOl can be treated by administering siRNA for REG4 or KIAAOlOl, respectively. siRNA therapy is a method used to prevent the expression of REG4 or KIAA0101 in patients suffering from or at risk of developing, for example, pancreatic cancer, particularly pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), prostate cancer cells, breast cancer cells, and bladder cancer cells. to be. Patients are isolated according to standard methods of individual tumor types. Pancreatic cancer, PDAC, prostate cancer cells, breast cancer cells, and bladder cancer cells can be diagnosed using, for example, CT, MRI, ERSP, MPCR, computed X-ray tomography or ultrasound.

만약 치료가 개체 내의 REG4 또는 KIAA0101의 발현의 감소, 크기, 분포 정도 또는 종양의 전이 가능성의 감소와 같은 임상적 이점을 나타낸다면 치료는 효과적이다. 치료가 예방에 응용되는 경우, “효과적인”의 의미는 치료를 늦추는 것; 종양의 형성을 방어 또는 예방하는 것; 또는 종양의 임상적 증상을 완화하는 것이다. 효능 여부는 특정 종양 형태를 진단 또는 치료에 관해 공지된 방법에 따라 결정하였다. siRNA 치료법은 표준적인 본 발명의 siRNA를 암호화하는 벡터 및/또는 합성한 siRNA 분자를 전달하는 것과 같은 유전자 전달 시스템에 따라 siRNA를 환자에게 투여함으로써 실시된다. 일반적으로, 합성한 siRNA 분자는 in vivo 조건에서의 뉴클레아제 분해를 막아 화학적으로 안정화되어있다. 화학적으로 안정한 RNA 분자를 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 상기 분자는 변형된 뼈대 및 리보뉴클라제 활성을 방해하는 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 변형도 역시 가능한데, 예를 들면, 콜레스테롤-결합 siRNA는 개선된 약학적 특성을 나타내었다(Song et al Nature Med. 9:347-351 (2003)).Treatment is effective if the treatment exhibits clinical benefits such as a decrease in the expression, size, distribution of tumors or the likelihood of metastasis of the tumor in the subject. When treatment is applied for prevention, “effective” means slowing down treatment; Defending or preventing the formation of tumors; Or to relieve the clinical symptoms of the tumor. Efficacy was determined according to known methods for diagnosing or treating specific tumor types. siRNA therapy is performed by administering siRNA to a patient in accordance with a gene delivery system such as delivering a vector encoding a standard siRNA of the present invention and / or a synthesized siRNA molecule. In general, the synthesized siRNA molecules are chemically stabilized by preventing nuclease degradation in in vivo conditions. Methods for preparing chemically stable RNA molecules are well known in the art. Generally, such molecules include nucleotides that interfere with modified skeletal and ribonuclease activity. Other modifications are also possible, for example cholesterol-binding siRNAs have shown improved pharmaceutical properties (Song et. al Nature Med. 9: 347-351 (2003).

적합한 유전자 전달 시스템은 리포좀, 수용체-매개 전달 시스템, 또는 그 중에서도, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 치료용 핵산 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체에서 제형화된다. 또한, 상기 치료용 조성물은 위에서 기술한 바와 같은 유전자 전달 시스템을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들면, 생리 식염수같이 실험 동물에게 투여하기 적합한, 생물학적으로 거부반응을 일으키지 않는 매개물이다. 조성물의 치료적 유효량은 처리 동물에서 REG4 또는 KIAA0101 유전자 산물의 생산 감소, 세포 성장 감소, 예를 들면 증식 또는 종양 성장 감소와 같은 의학적으로 바람직한 결과를 만들어 낼 수 있는 양이다. Suitable gene delivery systems can include liposomes, receptor-mediated delivery systems, or, inter alia, viral vectors such as herpes virus, retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses. The therapeutic nucleic acid composition is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. In addition, the therapeutic composition may comprise a gene delivery system as described above. Pharmaceutically acceptable carriers are those that do not cause biological rejection, eg, suitable for administration to experimental animals, such as physiological saline. A therapeutically effective amount of the composition is an amount that can produce a medically desirable result such as reduced production of REG4 or KIAAOlOl gene product, reduced cell growth, eg, reduced proliferation or tumor growth in treated animals.

정맥주사, 피하주사, 근육주사 및 복막내 전달 경로와 같은 비경구의 투여법을 REG4 또는 KIAA0101의 siRNA의 전달에 사용할 수 있다. 췌장, 전립선, 유방 및 방광암의 치료를 위하여, 상기 조직 또는 암 부위의 조직으로 직접 주입하는 것이 유용하다. Parenteral administration such as intravenous, subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal delivery routes can be used for the delivery of siRNAs of REG4 or KIAAOlOl. For the treatment of pancreatic, prostate, breast and bladder cancer, it is useful to inject directly into the tissue or tissue of the cancerous site.

환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체적, 나이, 투여되는 개별 핵산, 성별, 투여하는 시간 및 방법, 일반적 건강상태 및 최근에 투여된 다른 약물을 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 핵산의 정맥주사를 위한 투여량은 대략 106 내지 1022개 사본의 핵산 분자이다.Dosage to a patient depends on many factors including the size, volume, age of the patient, individual nucleic acid administered, sex, time and method of administration, general health and other drugs recently administered. The dosage for intravenous injection of nucleic acid is approximately 10 6 to 10 22 copies of the nucleic acid molecule.

상기 폴리뉴클레오티드는 근육 또는 피부와 같은 조직의 세포 간 영역으로의 주입; 순환계 또는 체강으로의 도입; 또는 흡입제 또는 흡입법과 같은 표준 방법에 따라 투여할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 주입되거나 그렇지 않은 경우, 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들면, 수용성 또는 부분 tndydtd 액체 담체와 함께 동물에 전달된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 리포좀(예를 들면, 양전하 또는 음전하 리포좀)과 연관될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 같은, 표적세포에서의 발현에 필요한 유전적 정보를 포함한다.The polynucleotide is injected into an intercellular region of a tissue such as muscle or skin; Introduction into the circulatory system or body cavity; Or in accordance with standard methods such as inhalation or inhalation. The polynucleotides are injected or otherwise delivered to the animal with a pharmaceutically acceptable carrier, such as a water soluble or partially tndydtd liquid carrier. The polynucleotide may be associated with liposomes (eg, positively or negatively charged liposomes). The polynucleotide contains genetic information necessary for expression in a target cell, such as a promoter.

항term REG4REG4 항체 및 항원 결합 단백질; Antibodies and antigen binding proteins;

항체Antibodies

본 발명은 REG4에 대한 단일클론항체가 REG4의 성장 촉진 효과를 중화시키고 PDAC 세포 성장을 현저히 약화시킨다는 것을 보여주었다. 상기 결과는 REG4 발현 세포와 연관된 질병, 예를 들면, 췌장암 치료가 REG4에 결합하는 항체를 사용하여 수행될 수 있음을 나타낸다.The present invention showed that monoclonal antibodies against REG4 neutralize the growth promoting effect of REG4 and significantly weaken PDAC cell growth. The results indicate that diseases associated with REG4 expressing cells, such as pancreatic cancer treatment, can be performed using antibodies that bind to REG4.

본 발명은 췌장암을 포함하는 REG4의 비정상적 과발현에 의해 일어나는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 유효 성분으로 REG4를 암호화하는 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편; 또는 항원 결합 단백질의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 발명은 또한, 항REG4 항체 또는 항원 결합 단백질의 췌장암의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 생산하기 위한 용도에 대한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 항REG4 항체 또는 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer caused by abnormal overexpression of REG4 including pancreatic cancer, the composition comprising an antibody or fragment thereof that binds to a protein encoding REG4 as an active ingredient; Or a pharmaceutically effective amount of an antigen binding protein and a pharmaceutically acceptable carrier. The invention also relates to the use of an antiREG4 antibody or antigen binding protein for producing a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of pancreatic cancer. The pharmaceutical composition of the present invention comprises an antiREG4 antibody or antigen binding protein and a pharmaceutically acceptable carrier.

"분리된" 또는 "정제된" 폴리펩티드는 실질적으로 탄수화물, 지질, 그 단백질이 유래한 세포 또는 조직 근원으로부터 오염된 다른 단백질이 없는 것; 또는 화학적으로 합성시 실질적으로 화학적 전구물질 또는 기타 화학 물질이 없는 것이다. 용어 “실질적으로 세포 내 물질이 없는 것”은 분리되거나 재조합에 의해 생산된 세포의 세포 내 성분으로부터 분리된 폴리펩티드 제조물을 포함한다.An "isolated" or "purified" polypeptide is substantially free of carbohydrates, lipids, and other proteins contaminated from the cell or tissue source from which the protein is derived; Or when chemically synthesized, is substantially free of chemical precursors or other chemicals. The term “substantially free of intracellular material” includes preparations of polypeptides isolated from intracellular components of cells that have been isolated or recombinantly produced.

따라서, 실질적으로 세포 내 물질이 없는 폴리펩티드는 이종 단백질(또한, 본 명세서에서 "오염된 단백질"로 지칭되는)을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량으로) 이하로 포함하는 폴리펩티드의 제조물을 포함한다. 상기 폴리펩티드가 재조합에 의해 생산되는 경우, 또한, 바람직하게는 실질적으로 세포 배양액이 없어야하며, 이는 단백질 제조물 부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 이하의 세포 배양액을 포함하는 폴리펩티드의 제조물을 포함한다. 상기 폴리펩티드가 화학적으로 합성하여 생산된 것일 경우, 바람직하게는 실질적으로 화학적 전구체 또는 화학 제품이 없어야 하며, 이는 단백질 제조물 부피의 약 30%, 20%, 10%, 5% (건조 중량으로)이하의 단백질 합성과 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질을 포함하는 폴리펩티드의 제조물을 포함한다.Thus, a polypeptide that is substantially free of intracellular material contains up to about 30%, 20%, 10%, or 5% (by dry weight) of heterologous protein (also referred to herein as "contaminated protein"). It includes the preparation of the polypeptide. If said polypeptide is produced recombinantly, it should also preferably be substantially free of cell culture, which comprises a preparation of a polypeptide comprising up to about 20%, 10%, or 5% of the cell culture of the protein product volume. do. If the polypeptide is produced by chemical synthesis, it should preferably be substantially free of chemical precursors or chemical products, which is less than about 30%, 20%, 10%, 5% (by dry weight) of the protein preparation volume. Preparations of polypeptides comprising chemical precursors or other chemicals involved in protein synthesis.

특정 단백질 표본이 분리된 또는 정제된 폴리펩티드를 포함하는 것이, 예를 들면, 상기 단백질 제조물의 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis )및 젤의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색으로 확인했을 때 단일 밴드로 나오는 것으로부터 확인할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 분리되거나 정제된다. “분리된” 또는 “정제된” 핵산분자는 핵산 분자의 본래의 출처에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. cDNA 분자와 같은 “분리된” 또는 “정제된” 핵산분자는 재조합 기술에 의해 생산되었을 경우 실질적으로 다른 세포 내 물질 또는 세포 배양액이 없는 것; 또는 화학적으로 합성된 경우 실질적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학 제품이 없는 것일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편를 암호화하는 핵산분자를 분리 또는 정제할 수 있다.Specific protein samples include isolated or purified polypeptides, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of the protein preparation and Coomassie Brilliant Blue of the gel. When confirmed by staining, it can be confirmed from coming out as a single band. In a preferred embodiment, the antibody or fragment thereof of the invention is isolated or purified. A “isolated” or “purified” nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules present at the original source of the nucleic acid molecule. “Isolated” or “purified” nucleic acid molecules, such as cDNA molecules, are substantially free of other intracellular material or cell culture when produced by recombinant technology; Or when chemically synthesized, may be substantially free of chemical precursors or other chemical products. In a preferred embodiment, nucleic acid molecules encoding the antibodies of the invention or fragments thereof can be isolated or purified.

"항체" 및 "면역글로불린"은 동일한 구조적 특징을 가지는 당단백질이다. 항체가 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는데 반해, 면역글로불린은 항원 특이성이 결정되지 않은 항체 및 항체 유사 분자 모두를 포함한다. 후자의 폴리펩티드는 예를 들면, 림프계에서는 낮은 수준으로 생산되거나, 골수종에서는 수준으로 생산된다. "Antibodies" and "immunoglobulins" are glycoproteins having the same structural characteristics. Whereas antibodies exhibit binding specificity for specific antigens, immunoglobulins include both antibodies and antibody like molecules for which antigen specificity has not been determined. The latter polypeptide is produced at low levels, for example in the lymphatic system, or at levels in myeloma.

"천연 항체 및 면역글로불린"은 두 개의 동일한 경(L)쇄 및 두 개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 일반적으로 약 150000 달톤(daltons)의, 이종사합체(heterotetramer) 당단백질이다. 각 경쇄는 중쇄와 하나의 공유 이황화 결합을 통해 연결되어 있으며, 상기의 이황화 결합수는 다른 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 간에 달라진다. 또한, 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 위치하는 사슬 내 이황화 결합을 가진다. 각 중쇄는 한쪽 말단의 가변 도메인(variable domain (VH))에 이어서 고정 영역(constant domain (CH))을 가진다. 각 경쇄는 한 쪽 말단에 가변 도메인(VL)을 가지고 반대쪽 말단에 고정 영역(CL)을 가진다; 상기 경쇄의 고정 영역은 첫번째 중쇄의 고정 영역과 같이 배열되며, 상기 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 같이 배열된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 사이의 경계면을 형성한다고 알려져있다(Chothia et al, (1985) J MoI Biol.;186:651-63; Novotny and Haber, (1985) Proc Natl Acad Sci USA.;82:4592-6). 용어 "가변" 은 가변 부위의 특정 부분의 항체 중 서열이 광범위하게 달라 특정 항체를 특정 항원에 결합하거나 특이성에 사용된느 것을 의미한다. 한편, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 고르게 분포되어 있지는 않다. 그것은 각 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역(complementarity-determining 영역 (CDRs)) 또는 초가변 도메인(hyper가변 도메인)이라고 불리는 세 개 구획에 집중되어 있다. 가변 도메인 중 보다 높게 보존된 부분은 프레임워크(framework (FR))이라고 불린다. 천연의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 넓은 범위에서 β-쉬트(sheet) 배열, 연속된 세 개의 CDR, CDR을 연결하는 루프 및 β-쉬트(sheet) 구조 부분을 형성하는 루프, 각 네 개의 프레임워크 영역을 포함한다. 각 사슬의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하게 함께 존재하며, 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다(Kabat et al, (1991) sequenses of proteins of imunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.). 고정 영역은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체-의존성 세포 독성에서 항체의 참여와 같은 기능의 다양한 효과를 내는 기능을 나타낸다.“Natural antibodies and immunoglobulins” are heterotetramer glycoproteins, generally of about 150000 daltons, composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to the heavy chain via one covalent disulfide bond, wherein the number of disulfide bonds varies between the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. In addition, each heavy and light chain has regularly disulfide bonds in the chain. Each heavy chain has one end of a variable domain (VH) followed by a constant domain (CH). Each light chain has a variable domain (VL) at one end and a fixed region (CL) at the other end; The fixed region of the light chain is arranged like the fixed region of the first heavy chain, and the variable domain of the light chain is arranged like the variable domain of the heavy chain. It is known that certain amino acid residues form the interface between the variable domains of the light and heavy chains (Chothia et al , (1985) J Mo I Biol.; 186: 651-63; Novotny and Haber, (1985) Proc Natl Acad Sci USA .; 82: 4592-6). The term "variable" means that the sequence of the antibodies of a particular portion of the variable region varies widely so that the specific antibody is used for binding to specific antigens or for specificity. On the other hand, variability is not evenly distributed throughout the variable domains of antibodies. It is concentrated in three compartments called complementarity-determining regions (CDRs) or hypervariable domains (hypervariable domains) in both variable domains of each light and heavy chain. The higher conserved portions of variable domains are called frameworks (FRs). The variable domains of the natural heavy and light chains have a broad range of β-sheet arrangements, three contiguous CDRs, loops connecting CDRs, and loops forming β-sheet structural parts, each four frameworks. It includes an area. CDRs of each chain are present together closely by framework regions, and together with other chain CDRs contribute to the formation of the antigen binding site of the antibody (Kabat et al , (1991) sequenses of proteins of imunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.). The immobilized region is not directly involved in binding the antibody to the antigen, but exhibits a function that produces various effects of function, such as the involvement of the antibody in antibody-dependent cytotoxicity.

항체의 파파인 소화는 각자 단일 항원-결합 부위를 가지는, "Fab" 단편이라고 불리는 두개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 두개의 항원-결합 부위를 가지는 F(ab')2 단편을 산출한다. "Fv"는 완전한 항원-인지 및 결합 부위를 가진 최소의 체 단편이다. 이 영역은 단단한 비공유 결합으로 연결된, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 가변 도메인의 이량체로 구성되어 있다. 이러한 배열에서, 각 가변 도메인의 세 개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL이량체 표면상의 항원 결합부위를 결정한다. 종합하면, 상기 여섯개의 CDR이 항체의 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 하나의 단일 가변 도메인(또는 오직 항원에 특이적인 세 개의 CDR을 포함하는 절반의 Fv)도 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화성이긴 하지만, 항원을 인지하여 결합할 수 있는 능력을 지닌다. Papain digestion of the antibody produces two identical antigen-binding fragments called "Fab" fragments and the remaining "Fc" fragments, each with a single antigen-binding site. Pepsin treatment yields an F (ab ') 2 fragment having two antigen-binding sites. "Fv" is the minimum sieve fragment with a complete antigen-recognition and binding site. This region consists of dimers of the variable domains of one heavy chain and one light chain, linked by tight non-covalent bonds. In this arrangement, the three CDRs of each variable domain interact to determine the antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Taken together, these six CDRs confer the antigen-binding specificity of the antibody. However, even one single variable domain (or half of the Fv containing only three CDRs specific for the antigen), although having a lower affinity than the entire binding site, has the ability to recognize and bind the antigen.

상기 Fab 단편 역시 경쇄의 고정 영역 및 중쇄의 첫 번째 고정 영역(CH-I)을 함유한다. Fab' 단편은 항체의 경첩 영역의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH-I영역의 C-말단에 몇개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 다르다. 자유 티올기(free thiol group)를 지니는 고정 영역의 시스테인 잔기를 가지는 Fab'-SH는 본 명세서에서 Fab'로 명명되었다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 시스테인 경첩을 가지는 Fab' 단편 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 연결도 알려져 있다. The Fab fragment also contains the anchor region of the light chain and the first anchor region (CH-I) of the heavy chain. Fab 'fragments differ from Fab fragments by the addition of several residues at the C-terminus of the heavy chain CH-I region, including one or more cysteines of the hinge region of the antibody. Fab'-SH having a cysteine residue in a fixed region with a free thiol group was named Fab 'herein. F (ab ') 2 antibody fragments originally were produced as pairs of Fab' fragments with cysteine hinges between them. Other chemical linkages of antibody fragments are also known.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 고정 영역의 아미노산 서열에 기반하여, K (kappa) 및 λ (lambda)로 불리는 두개의 뚜렷하게 구분되는 형태로 구분될 수 있다. The “light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species can be divided into two distinctly distinct forms called K (kappa) and λ (lambda), based on the amino acid sequences of their fixed regions.

그들의 중쇄의 고정 영역의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 다른 종류로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 다섯개의 주된 종류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있으며, 그들의 몇몇은 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, 및 IgA2의 이소타이프(isotypes)로 나아가 나뉘어 질 수 있다. 중쇄의 고정 영역은 면역글로불린의 종류에 따라, 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 다른 종류의 서브유닛 구조 및 삼차원 구성은 널리 알려져 있다. Depending on the amino acid sequence of the fixed region of their heavy chains, immunoglobulins can be classified into different classes. There are five main types of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, some of which are further divided into isotypes of, for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, and IgA2. Can be. The fixed region of the heavy chain is called α, δ, ε, γ, and μ, respectively, depending on the type of immunoglobulin. Other kinds of subunit structures and three-dimensional configurations of immunoglobulins are well known.

본 명세서에서 사용한 용어 "단일 클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단, 예를 들면, 상기 집단의 개별 항체들을 적은 양으로 존재하는 자연적인 돌연변이를 제외하면 동일한 항체 집단으로부터 얻은 항체를 지칭한다. 상기 단일 클론 항체는 매우 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대하여 유도된다. 나아가, 다른 결정자(에피토프)에 대하여 유도되는 다른 항체를 포함하는 전통적(다클론성) 항체 제조물과는 반대로, 각각의 단일 클론 항체는 항원의 단일 결정자에 대해서 유도된다. 그들의 특이성 외에는, 상기 단일 클론 항체는 다른 면역글로불린에 오염되지 않고, 하이브리도마 배양에 의하여 생성될 수 있다는 이점이 있다. 따라서, 변경된 "단일 클론"은 항체의 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 가리키며, 임의의 특정 방법으로 항체를 생산하는데 필요한 것으로서 해석되지는 않는다. 예를 들면, 본 발명과 일치하게 사용된 상기 단일 클론 항체는 코러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)이 처음 기술한 하이브리도마 방법(Kohler and Milstein, (1975) Nature.;256:495-7) 또는 재조합 DNA 방법(Cabilly et al. , (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81:3273-7)에 의하여 만들어질 수 있다.As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from the same antibody population except for a natural mutation in which a small amount of substantially homogeneous antibody populations exist, eg, individual antibodies of the population. The monoclonal antibodies are very specific and are directed against a single antigenic site. Furthermore, in contrast to traditional (polyclonal) antibody preparations that include other antibodies directed against other determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant of the antigen. Besides their specificity, the monoclonal antibody has the advantage that it can be produced by hybridoma culture without being contaminated with other immunoglobulins. Thus, an altered “single clone” refers to the properties of an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population of antibodies and is not to be construed as necessary to produce the antibody in any particular manner. For example, the monoclonal antibodies used in accordance with the present invention may be used in the hybridoma method described by Kohler and Milstein (Kohler and Milstein, (1975) Nature.; 256: 495-7). ) Or recombinant DNA methods (Cabilly et al . (1984) Proc Natl Acad Sci USA .; 81: 3273-7).

본 명세서의 단일 클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특정 종 유래 또는 특정 항체 강(class) 또는 아강(subclass)에 속하는 항체 내 서열과 동일하거나 상동성을 갖는 반면, 나머지 쇄 부분은, 원하는 생물학적 활성을 가지는 한, 항체 단편 뿐만 아니라 또 다른 종 또는 다른 항체 강(class) 도는 아강(subclass)으로부터 유래한 항체 내 서열과 동일하거나 상동성을 갖는 "키메라" 항체 또는 면역글로불린을 포함한다(Cabilly et al, supra; Morrison et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA.;81 : 6851 -5). 가장 보편적으로, 키메라(키메라) 항체 또는 면역글로불린은 인간 및 쥐 항체 단편, 일반적으로 인간의 고정 영역 및 마우스 가변 도메인을 포함한다. Monoclonal antibodies herein have the same or homologous sequences as those in antibodies of which the heavy and / or light chains are from a particular species or belong to a particular antibody class or subclass, while the rest of the chain portions are of the desired biological As long as it has activity, it includes not only antibody fragments but also "chimeric" antibodies or immunoglobulins that have the same or homologous sequences in antibodies derived from another species or other antibody class or subclass (Cabilly et al. al , supra; Morrison et al ., (1984) Proc Natl Acad Sci USA .; 81: 6851-5). Most commonly, chimeric (chimeric) antibodies or immunoglobulins comprise human and murine antibody fragments, generally human fixed regions and mouse variable domains.

비인간(예를 들면, 쥐) 항체의 "인간화(humanized)" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소한의 서열을 포함하는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편이다. 또한, 이러한 단편은 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 다른 항원-결합 부분서열을 포함한다. 대부분, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수령 항체)에서 상기 수령체(recipient)의 CDR의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 수용력을 가지는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (수여 항체)의 CDR에서 유래한 잔기로 교체된 것이다.A “humanized” form of a non-human (eg, murine) antibody is a specific chimeric immunoglobulin, an immunoglobulin chain or fragment thereof that contains a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. Such fragments also include Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2, or other antigen-binding subsequences of the antibody. Mostly, humanized antibodies are derived from CDRs of non-human species (donating antibodies), such as mice, rats or rabbits, in which the residues of the CDRs of the recipient in human immunoglobulins (recipient antibodies) have the desired specificity, affinity and capacity. Replaced with one residue.

일부의 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 교체될 수 있다. 본 발명에 있어서, 인간화 항체 내 몇 개, 두 개 또는 프레임워크의 두 개 또는 바람직하게는 한 개의 프레임워크가 비인간 잔기로 교체될 수 있다. 나아가, 인간화 항체는 수령 항체 뿐만 아니라 들여온 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 나아가 개선되고 최적화된 항체 성능을 만들어낼 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 것에 상응되고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 인간 면역글로불린의 보존 서열의 프레임워크 영역인 적어도 하나 이상의, 일반적으로 두 개의 가변영역을 실질적으로 포함할 것이다.In some cases, Fv framework residues of human immunoglobulins may be replaced with corresponding nonhuman residues. In the present invention, several, preferably two, or preferably one, frameworks of humanized antibodies can be replaced with non-human residues. Furthermore, humanized antibodies may comprise residues not found in the recipient antibody as well as in imported CDR or framework sequences. Such modifications may further result in improved and optimized antibody performance. In general, the humanized antibody comprises at least one, generally two, all or substantially all CDR regions corresponding to those of a non-human immunoglobulin, and all or substantially all framework regions are framework regions of the conserved sequence of human immunoglobulins. It will substantially comprise three variable regions.

또한, 상기 인간화 항체는 최적으로 적어도 면역글로불린, 일반적으로 인간 면역글로불린의 고정 영역(Fc)의 일부를 포함할 것이다. 더욱 상세한 설명은 존스 등의 1986년 논문(Jones et al, (1986) Nature.;321:522-5; Riechmann et al, (1988) Nature.;332:323-7; Presta, (1992) Curr Opin Struct Biol. 2:593-6)을 참조할 수 있다.In addition, the humanized antibody will optimally comprise at least a portion of the immobilized region (Fc) of an immunoglobulin, generally a human immunoglobulin. For a more detailed description, see Jones et al. al , (1986) Nature .; 321: 522-5; Riechmann et al , (1988) Nature .; 332: 323-7; Presta, (1992) Curr Opin Struct Biol. 2: 593-6).

"단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 단일 폴리펩티드 사슬로 존재하는 영역인 VH 및 VL 영역을 포함한다. 바람직하게는, 상기 Fv 폴리펩티드는 나아가 항원 결합을 위한 원하는 형태의 sFv를 가능하게 하는, VH 및 VL 영역 사이의 폴리펩티드 링커를 포함한다. 자연적으로 결합되어있지만, 화학적으로 분리된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항체 V 영역으로부터 항원-결합 부위와 실질적으로 유사한 3차 구조로 접히는 sFv 분자로 변환시키기 위한 화학적 구조를 식별하기위하여 많은 방법들이 기술되었다(U.S. Pat. Nos. 5,091,513, 5,132,405, and 4,946,778; Pluckthun in The Pharmacology of monoclonal antibody, vol. 113, Rosenberg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))."Single-chain Fv" or "sFv" antibody fragments comprise the VH and VL regions, which are regions present as a single polypeptide chain of an antibody. Preferably, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL regions, which allows for the desired form of sFv for antigen binding. Many methods have been described to identify chemical structures for converting naturally-linked, but chemically isolated light and heavy chain polypeptides from the antibody V region to sFv molecules that fold into tertiary structures that are substantially similar to antigen-binding sites. US Pat.Nos. 5,091,513, 5,132,405, and 4,946,778; Pluckthun in The Pharmacology of monoclonal antibody, vol. 113, Rosenberg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)).

항원 결합 단백질Antigen binding protein

또한, 본 발명은 REG4 또는 KIAA0101에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 또는 비항체 결합 단백질(예를 들면, 리간드)를 포함한다. 비항체 리간드는 하기에서 기술하는 바와 같이, 어드넥틴(adnectins), 아비머스(avimers), 단일 사슬 폴리펩티드 결합 분자, 및 항체-유사 결합 펩티도미메틱스(peptidomimetics)를 포함하는 비 면역글로불린 단백질 골격을 사용한 모조 항체를 포함한다. The invention also encompasses antigen binding proteins or non-antibody binding proteins (eg ligands) that specifically bind to REG4 or KIAAOlOl. Non-antibody ligands comprise non-immunoglobulin protein backbones, including adnectins, avimers, single chain polypeptide binding molecules, and antibody-like binding peptidomimetics, as described below. Included counterfeit antibodies used.

항체와 유사한 방법으로 표적에 타겟팅하여 결합하는 기타 화합물이 종래 개발된 바 있다. 이러한 “모조 항체”중 일부는 항체의 가변 도메인에 대한 대안적 단백질 프레임워크(frameworks)로서 비면역글로불린 단백질 뼈대를 사용한다.Other compounds that target and bind to targets in a manner similar to antibodies have been previously developed. Some of these “mock antibodies” use non-immunoglobulin protein skeletons as an alternative protein framework for the variable domains of antibodies.

예를 들면, 라드너 등은 응집되어 있지만 분자적으로 분리된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 유사한 결합 특이성을 갖는 단일 폴리펩티드 사슬 결합 분자에 대하여 기술하고 있다(Ladner et al. U.S. Patent No. 5,260,203). 상기 단일-사슬 결합 분자는 펩티드 링커로 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 항원 결합 부위를 함유하고 있어, 상기 두 개 펩티드 항체의 구조와 유사한 구조로 접힐 것이다. 상기 단일-사슬 결합 분자는 더 작은 크기, 더 큰 안정성 및 나아가 쉽게 변형되는 것을 포함하여, 전통적인 항체를 뛰어넘는 몇몇의 이점을 나타낸다.For example, Radner et al. Describe single polypeptide chain binding molecules that have similar binding specificities to aggregated but molecularly separated light and heavy chain variable domains (Ladner et. al . US Patent No. 5,260,203). The single-chain binding molecule contains the antigen binding sites of the heavy and light chain variable domains of the antibody linked by a peptide linker and will fold into a structure similar to that of the two peptide antibodies. Such single-chain binding molecules exhibit several advantages over traditional antibodies, including smaller size, greater stability and even easier modification.

쿠 등은 사이토크롬 b562 (cytochrome b562)에 기반한 대안의 항체를 개시하고 있다(Ku et al , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995)). 쿠 등은 사이토크롬 b562의 두 개의 루프를 무작위화시켜 라이브러리를 만들고, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)에 결합하는 것을 선별하였다. 상기 개별 돌연변이들은 항BSA 항체와 유사하게 선택적으로 BSA에 결합하는 것으로 밝혀졌다. Ku et al disclose an alternative antibody based on cytochrome b562 (Ku et al , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (14): 6552-6556 (1995)). Ku et al randomized two loops of cytochrome b562 to make a library and selected for binding to bovine serum albumin. These individual mutations have been found to bind selectively to BSA similarly to anti-BSA antibodies.

리포브세크 등은 피브로넥틴(fibronectin) 또는 피브로넥틴 유사(fibronectin-like) 단백질 지지체 및 적어도 하나 이상의 가변 루프의 특징을 가지는 모조 항체를 개시하고 있다(Lipovsek et al. U.S. Patent Nos. 6,818,418 and 7,115,396). 어드넥틴으로 알려진, 이러한 피브로넥틴 기반 모조 항체는 높은 친화성 및 임의의 표적 리간드에 대한 특이성을 포함하는 자연의 또는 조작된 항체와 많은 공통의 특징을 나타내었다. 새로운 또는 개선된 결합단백질로 발전시키기 위한 임의의 기술이 이러한 모조항체에 사용될 수 있다. Lipobsek et al . Disclose counterfeit antibodies characterized by fibronectin or fibronectin-like protein supports and at least one variable loop (Lipovsek et. al . US Patent Nos. 6,818,418 and 7,115,396). Known as Adnectins, these fibronectin-based mock antibodies exhibited many common features with natural or engineered antibodies, including high affinity and specificity for any target ligand. Any technique for developing new or improved binding proteins can be used for such mimicking antibodies.

이러한 피브로넥틴-기반 모조항체의 구조는 IgG 중쇄의 가변영역의 구조와 유사하다. 그러므로, 이러한 모조품은 천연의 것과 유사한 항원 결합 특성 및 천연의 것과 같은 항체의 친화성을 나타낸다. 나아가, 이러한 피브로넥틴-기반 모조 항체는 항체 및 항체 단편의 몇몇 이점을 나타낸다. 예를 들면, 이러한 모조 항체는 자연적 접힘 안정성을 위해 이황화 결합에 의지하지 않으므로, 정상적으로 항체를 파괴하는 조건에서도 안정하다. 게다가, 이러한 피브로넥틴 기반 모조 항체의 구조는 IgG 중쇄의 구조과 유사하기 때문에, in vivo에서의 항체의 친화도 숙성의 과정과 유사한 루프 무작위화 및 뒤섞기 과정은 in vitro로 도입될 수 있다. The structure of these fibronectin-based mimic antibodies is similar to that of the variable region of the IgG heavy chain. Therefore, such replicas exhibit antigen binding properties similar to those of natural and affinity of antibodies as natural. Furthermore, such fibronectin-based mimicking antibodies exhibit some advantages of antibodies and antibody fragments. For example, such simulated antibodies do not rely on disulfide bonds for natural folding stability and are therefore stable even under conditions that normally destroy the antibody. In addition, since the structure of such fibronectin-based mock antibodies is similar to that of IgG heavy chains, loop randomization and shuffling processes similar to those of affinity maturation of antibodies in vivo can be introduced in vitro.

베스테 등(Beste et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5): 1898-1903 (1999))은 리포칼린(lipocalin) 구조에 기반한 모조항체(Anticalin)를 개시하고 있다. 리포칼린은 단백질의 말단에 네 개의 초가변(supervariable) 루프를 가진 β-배럴(barrel)로 구성되어 있다. 베스테(1999)는 상기 루프를 무작위 돌연변이화 시키고, 예를들면, 플루오레세인(fluorescein)과의 결합을 위하여 선별하였다. 세 개의 변종이 플루오레세인과 특이적인 결합을 나타내었으며, 한 개 변종은 항플루오레세인 항체와 유사한 결합을 나타내었다. 추가 분석으로 모든 무작위화된 부분이 가변적인 것으로 나타났으며, 이는 안티칼린(Anticalins)이 항체의 대안으로서 사용되기에 적합함을 가리킨다. Beste et al. al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (5): 1898-1903 (1999) discloses an antibody that is based on a lipocalin structure. Lipocalins consist of β-barrels with four supervariable loops at the ends of the protein. Beste (1999) randomly mutated the loop and, for example, selected for binding to fluorescein. Three variants showed specific binding with fluorescein, and one variant showed similar binding with antifluorescein antibody. Further analysis showed that all randomized portions were variable, indicating that Anticalins are suitable for use as an alternative to antibodies.

안티칼린(Anticalins)은 작은, 단일 사슬 펩티드이며, 일반적으로 160 내지 180 잔기 사이로서, 생산 단가를 낮추고 보관시의 안정성을 높이며, 면역성 반응을 감소시키는 것을 포함하는 항체를 능가하는 몇 가지 이점을 제공한다. Anticalins are small, single-chain peptides, typically between 160 and 180 residues, which provide several advantages over antibodies, including lower production costs, increased storage stability, and reduced immune responses. do.

해밀톤 등은 결합 부위로서 사용된 다가변성(multivariable)가 부착된 펩티드 루프, 칼릭사렌(calixarene)의 단단한 비펩티드성 유기 지지체를 사용한 합성 모조 항체를 개시하고 있다(Hamilton et al. (U.S. Patent No. 5,770,380). 상기 펩티드 루프는 칼릭사렌과 기하학적로 동일 면으로 돌출되어 있다. 이러한 기하학적 일치로, 모든 루프가 리간드에 대한 결합을 위해 그리고 결합 친화도를 높이기 위해 사용된다. 그러나, 다른 모조 항체와 비교하여 볼 때, 상기 칼렉사렌-기반 모조 항체는 펩티드만으로 구성된 것이 아니므로, 프로테아제 효소들의 공격에 덜 취약하다. 상기 지지체는 순수 펩티드, DNA 또는 RNA로 구성된 것이 아니며, 이는 상기 모조 항체가 극한 환경 조건에서 비교적 안정하며, 긴 수명을 가지는 것을 의미한다. 나아가, 칼릭사렌-기반 모조 항체는 비교적 작기 때문에, 면역성 반응을 가능석이 적다.Hamilton et al. Disclose synthetic synthetic antibodies using a multivariable attached peptide loop used as a binding site, a rigid nonpeptidic organic support of calixarene (Hamilton et. al . (US Patent No. 5,770,380). The peptide loops protrude geometrically in the same plane as calixarene. With this geometric agreement, all loops are used for binding to the ligand and for increasing binding affinity. However, compared to other counterfeit antibodies, the callexaren-based counterfeit antibodies are not only composed of peptides and are therefore less susceptible to attack of protease enzymes. The support is not composed of pure peptides, DNA or RNA, which means that the simulated antibody is relatively stable under extreme environmental conditions and has a long lifespan. Furthermore, since the calyxaren-based imitation antibody is relatively small, there are few possible immune responses.

머럴리 등은 항체를, 그들이 "항체 유사 결합 펩티도미메틱스" (ABiP)라고 이름붙인, 항체의 대안으로도 사용될 수 있는 작은 펩티도미메틱스(peptidomimetics)로 줄이기 위한 방법론을 논의하였다(Murali et al. Cell MoI. Biol. 49(2): 209-216 (2003)).Murley et al . Discussed a methodology for reducing antibodies to small peptidomimetics, which they may use as alternatives to antibodies, termed “antibody-like binding peptidomimetics” (ABiP) (Murali et. al . Cell MoI. Biol. 49 (2): 209-216 (2003).

실버맨 등은 "아비머스(avimers)"라고 불리는 다도메인(multiple domain)을 포함하는 단일-사슬 폴리펩티드인 융합 단백질을 개시하고 있다. in vitro 엑손 뒤섞기(exon shuffling) 및 파지 디스플레이(phage display)에 의해 인간의 세포외 수용체 도메인으로부터 발전된 아비머스는 다양한 표적 분자에 대한 친화성 및 특이성 면에서 다소 항체와 비슷한 결합 단백질의 한 종류이다. 다도메인(multiple domain) 단백질은 단일-에피토프 결합 단백질과 배교하여 볼 때 개선된 특이성과 친화성(어떤 경우에서는 서브나노몰라(sub-nanomolar))를 나타낼 수 있는 다독립적(multi independent) 결합 도메인을 포함할 수 있다. 아비머스의 제조 방법 및 용도에 과한 추가적 세부사항은 예를 들면, 미국 특허출원 공개번호 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 및 20050221384에 개시되어 있다.Silverman et al. Disclose a fusion protein, which is a single-chain polypeptide comprising multiple domains called "avimers." Avimus, developed from human extracellular receptor domains by exon shuffling and phage display, is a type of binding protein that is somewhat similar to antibodies in terms of affinity and specificity for various target molecules. Multiple domain proteins have multiple independent binding domains that can exhibit improved specificity and affinity (in some cases, sub-nanomolar) when crosslinked with single-epitope binding proteins. It may include. Further details regarding the preparation and use of Avimus are disclosed, for example, in US Patent Application Publication Nos. 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 and 20050221384.

비면역 글로불린 단백질 프레임워크 외에도, 항체 특성들을 RNA 분자 및 인위적인 올리고머(예를 들면, 프로테아제 억제제, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 퓨린 유도체(purine derivatives) 및 베타 턴 미믹( beta-turn mimics))를 포함하는 화합물에서 모방된 적이 있는데, 이들 모두는 본 발명의 용도에 적합하다.In addition to the non-immunoglobulin protein framework, antibody properties include RNA molecules and artificial oligomers (eg, protease inhibitors, benzodiazepines, purine derivatives, and beta-turn mimics). It has been imitated at, all of which are suitable for use in the present invention.

중화 활성Neutralization activity

병원균의 감염성 및 독소 활성을 빼앗는 기능을 가지는 항체 및 비항체 결합 단백질이 존재한다. 항체-매개성 중화는 항원성 가변 도메인이 항원에 결함함으로써 달성될 수 있거나, 또는, 보체의 매개를 요구할 수도 있다. 예를 들면, 어떤 경우에서, 항 바이러스 항체는 바이러스의 감염성을 빼앗기 위하여 보체의 매개를 요구한다. Fc 영역은 보체의 참여에 필수적이다. 따라서, 이와 같은 항체는 바이러스 및 세포를 중화시키는데 Fc를 요하는 효과 또는 기능을 포함한다. 본 발명은 항REG4 항체 및 비항체 결합 단백질이 REG4에 특이적으로 결합하고 나서 이들이 세포증식, 특히, 암세포에서의 비정상적으로 높은 REG4 발현 또는 세포내 신호전달에 의해 매개되는 증식을 촉진하는 REG4의 활성을 중화시킨다는 연구에 근거를 두고 있다.There are antibodies and non-antibody binding proteins that have the function of depriving pathogens of infectious and toxin activity. Antibody-mediated neutralization may be achieved by the antigenic variable domains deficient in the antigen, or may require the mediation of complement. For example, in some cases, antiviral antibodies require mediation of complement to deprive the virus of infectivity. The Fc region is essential for the participation of complement. Thus, such antibodies include effects or functions that require Fc to neutralize viruses and cells. The present invention relates to the activity of REG4 in which anti-REG4 antibodies and non-antibody binding proteins specifically bind to REG4 and then promote proliferation mediated by cell proliferation, in particular by abnormally high REG4 expression or intracellular signaling in cancer cells. Is based on research that neutralizes

항체 또는 비항체 결합 단백질 관련 용어 “특이적으로 결합하다”, "결합이 특이적이다", "부착된" 또는 "부착하는"은 세포 또는 조직에서 발현되는 REG4에 대한 결합을 위한 다른 제제 또는 리간드와 결합 또는 경쟁하는, 표적 에피토프(예를 들면, REG4)를 갖는 제제 또는 리간드 전체 또는 일부와의 선택적 연관성을 지칭한다.The terms “specifically bind”, “binding is specific”, “attached” or “adhering” to an antibody or non-antibody binding protein refer to other agents or ligands for binding to REG4 expressed in cells or tissues. Refers to a selective association with all or part of an agent or ligand with a target epitope (eg, REG4), which binds or competes with.

당연히, 항체 및 비표적 에피토프 간에 비특이적 상호작용이 어느 정도 일어날 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특이적 결합은 표적 에피토프의 특이적 인지를 통해 매개됨으로서 구별될 수 있다. 일반적으로, 특이적 결합은 결합된 항체와 표적 에피토프가 없는 실체(entity)(예를 들면, 분석 웰 또는 세포) 사이보다 전달된 분자와 표적 에피토프를 포함하는 실체(예를 들면, 분석 웰 또는 세포) 사이의 회합이 더 강하게 한다. 특이적 결합은 일반적으로, 표적 에피토프가 없는 세포 또는 조직과 비교하여, 표적 에피토프(예를 들면, REG4)를 갖는 세포 또는 조직 대비 결합된 제제 또는 리간드의 양(시간당 단위)이 적어도 기저치보다 2배 이상 증가하며, 바람직하게는 약 10배 이상 증가하며, 가장 바람직하게는 100 배 이상 증가한다. 두 실체간의 특이적 결합은, 일반적으로, 적어도 106 M- 1이상의 친화성을 의미한다. 친화성은 108 M-1 이상, 또는 그 이상이 바람직하다. 특이적 결합은 단백질 제제 및 리간드 뿐만 아니라 핵산에 대해서도 결정될 수 있다. 핵산 제제에 대한 특이적 결합은 노던 블롯, 젤 쉬프트 어세이(gel shift assays) 및 인 시투 혼성화(in situ hybridization)를 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 분석법을 이용하여 결정될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 제제 및 리간드에 대한 특이적 결합은 젤 전기영동, 웨스턴 블롯, ELISA, 유체 세포측정법 및 면역조직화학법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 분석법을 사용하여 결정될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. Naturally, some degree of nonspecific interaction may occur between the antibody and the non-target epitope. Nevertheless, specific binding can be distinguished by mediating through specific recognition of the target epitope. In general, specific binding is achieved by an entity (eg, an assay well or cell) that contains a delivered epitope and a molecule that is delivered between the bound antibody and an entity that lacks the target epitope (eg, an assay well or cell). ) Make the meeting between the two stronger. Specific binding generally refers to an amount (in units of time) of bound agent or ligand relative to a cell or tissue having a target epitope (e.g., REG4), at least twice the baseline, compared to a cell or tissue lacking a target epitope. More than, preferably about 10 times or more, most preferably 100 times or more. Specific binding between two entities are, in general, at least 10 6 M - it means an affinity of 1 or more. The affinity is preferably 10 8 M −1 or more, or more. Specific binding can be determined for nucleic acids as well as protein preparations and ligands. Specific binding to nucleic acid agents can be determined using any assay known in the art, including but not limited to Northern blots, gel shift assays, and in situ hybridization. It doesn't happen. Specific binding to protein agents and ligands can be determined using any assay known in the art, including, but not limited to, gel electrophoresis, western blots, ELISA, fluid cytometry, and immunohistochemistry. .

본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는, REG4를 발현하는 세포의 세포 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다:The invention also relates to a method of inhibiting cell growth of a cell expressing REG4, comprising the following steps:

1) REG4를 발현하는 세포를 항REG4 항체 또는 항REG4 비항체 결합 단백질과 접촉시키는 단계, 및1) contacting a cell expressing REG4 with an antiREG4 antibody or an antiREG4 non-antibody binding protein, and

2) REG4의 세포 증식 활성을 중화시키는 단계.2) neutralizing the cell proliferative activity of REG4.

본 발명의 방법 또는 약학적 조성물에 있어서, 임의의 REG4를 발현하는 세포가 억제될 수 있다. 예를 들면, 췌장암 세포가 본 발명의 REG4를 발현하는 세포로서 적당하다. 그러한 것으로써, 췌장암종 또는 세포가 적당하다.In the methods or pharmaceutical compositions of the invention, cells expressing any REG4 can be inhibited. For example, pancreatic cancer cells are suitable as cells expressing the REG4 of the present invention. As such, pancreatic carcinoma or cells are suitable.

세포 및 항체 (또는 비항체 결합 단백질)는 in vitro 또는 in vivo로 접촉될 수 있다. REG4 발현 세포로서 생체 내의 암세포를 표적으로 하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 사실 암 치료 방법 또는 예방 방법이다. 특히, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암을 위한 치료 방법을 제공한다.Cells and antibodies (or non-antibody binding proteins) can be contacted in vitro or in vivo. When targeting cancer cells in vivo as REG4 expressing cells, the method according to the invention is in fact a method of treating or preventing cancer. In particular, the present invention provides a method of treatment for cancer comprising the following steps.

1) REG4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 비항체 결합 단백질을 암환자에게 투여하는 단계, 및1) administering an antibody or non-antibody binding protein that specifically binds REG4 to cancer patients, and

2) REG4의 세포 증식 활성을 중화시키는, REG4에 결합된 항체 또는 비항체 결합 단백질의 기능을 사용하여 암세포 성장을 억제하는 단계.2) inhibiting cancer cell growth using the function of an antibody or non-antibody binding protein bound to REG4, which neutralizes the cell proliferative activity of REG4.

본 발명에서, 항REG4 항체 또는 비 항체 결합 단백질의 중화 기능은 REG4 발현 세포의 세포 증식을 촉진하는 REG4의 활성을 억제하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명은 REG4의 자가분비 또는 측분비 성장인자로서의 기능 및 Akt 신호전달 경로를 매개하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 항REG4 항체 또는 비항체 결합 단백질은 REG4의 자가분비/측분비 경로를 중지시키고, Akt 인산화 후의 과정을 막는다. 본 발명은 또한, 중화 기능을 사용하여 REG4를 발현하는 세포, 특히 췌장암 세포의 세포 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 본 발명은 나아가, REG4가 췌장암에서 높은 가능성을 가지고 많이 발현되어 있음을 확인하였다. 게다가, 정상조직에서의 REG4 발현량은 낮았다. 이러한 정보를 함께 놓고, 항REG4 항체를 투여하는 췌장암 치료 방법은 낮은 부작용의 위험과 함께 효과적일 수 있다.In the present invention, the neutralizing function of an anti-REG4 antibody or non-antibody binding protein refers to inhibiting the activity of REG4 to promote cell proliferation of REG4 expressing cells. For example, the present invention has been shown to mediate the function of REG4 as a self-secreting or lateral secretory growth factor and the Akt signaling pathway. Thus, in a preferred embodiment of the invention, the anti-REG4 antibody or non-antibody binding protein disrupts the self-secreting / lateral secretion pathway of REG4 and prevents the process after Akt phosphorylation. The present invention has also been found to effectively inhibit cell proliferation of cells expressing REG4, particularly pancreatic cancer cells, by using a neutralizing function. The present invention further confirmed that REG4 is highly expressed and highly expressed in pancreatic cancer. In addition, the amount of REG4 expression in normal tissues was low. Putting this information together, methods of treating pancreatic cancer with anti-REG4 antibodies can be effective with a low risk of side effects.

그러나, 본 발명의 항체 및 비항체 결합 단백질은 그들이 원하는 중화 기능을 포함하는 것에 한정되지 않는다. Fc 일부의 변종, 유사체 또는 유도체가 예를 들면, 다양한 잔기 또는 서열에 따라 만들어져, 구성될 수 있다.However, the antibodies and non-antibody binding proteins of the present invention are not limited to those containing the desired neutralizing function. Variants, analogs or derivatives of some of the Fc may be constructed and constructed, for example, according to various residues or sequences.

변종(또는 유사체) 폴리펩티드는 Fc 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 추가한 삽입 변종을 포함한다. 삽입은 단백질의 한쪽 또는 양쪽 끝에 위치하거나, Fc 아미노산 서열의 내부 영역에 위치할 수 있다. 한쪽 또는 양쪽의 끝에 추가적 잔기를 가진 삽입 변종은 예를 들면, 융합 단백질 및 아미노산 표지 또는 표시된 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 Fc 분자는 특히, 상기 분자가 E. coil와 같은 박테리아 세포에서 재조합적으로 발현되는 경우, N-말단의 메티오닌(Met)을 선택적으로 포함할 수 있다.Variant (or analog) polypeptides include insertion variants that add one or more amino acid residues to an Fc amino acid sequence. Insertion may be located at one or both ends of the protein or in an internal region of the Fc amino acid sequence. Insertion variants having additional residues at one or both ends may include, for example, fusion proteins and amino acid labels or labeled proteins. For example, the Fc molecule may optionally comprise an N-terminal methionine (Met), particularly when the molecule is recombinantly expressed in bacterial cells such as E. coil .

Fc 삭제 변종에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 Fc 폴리펩티드에서 제거된다. 삭제는 Fc 폴리펩티드의 한쪽 또는 양쪽 끝, 또는 Fc 아미노산 서열 내에서 하나 또는 그 이상을 삭제할 때 효과적일 수 있다. 그러므로, 삭제 변종은 Fc 폴리펩티드 서열의 모든 단편을 포함한다.In an Fc deletion variant, one or more amino acid residues are removed from the Fc polypeptide. Deletion can be effective when deleting one or more of one or both ends of an Fc polypeptide, or within an Fc amino acid sequence. Thus, deletion variants include all fragments of the Fc polypeptide sequence.

Fc 치환 변종에서, Fc 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 다른 잔기로 제거되고 교체될 수 있다. 한 측면에서, 상기 치환은 자연적으로 보존되어 있으나, 본 발명은 비보존된 치환도 포용한다. 바람직하게는, 근원의 Fc 영역은 인간 Fc 영역, 예를 들면, 인간 IgG1 (A 및 비A 알로타이프(allotypes)s)의 인간 Fc 영역 또는 인간 IgG3 Fc 영역의 원래의 서열이다. 하나의 구체예에서, 상기 증가된 ADCC의 변종은 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역의 원래의 서열 및 비정상적인 항원 결합 영역보다 실질적으로 더욱 효과적으로 ADCC를 매개한다. 바람직하게는, 상기 변종은 Fc 영역의 298, 333 및 334 부위에 두 개 또는 세 개의 잔기의 치환으로 구성되거나, 포함한다.In an Fc substitution variant, one or more amino acid residues of the Fc polypeptide may be removed and replaced with other residues. In one aspect, the substitutions are preserved naturally, but the invention embraces unconserved substitutions. Preferably, the source Fc region is the original sequence of a human Fc region, eg, a human Fc region or human IgG3 Fc region of human IgG1 (A and non-A allotypes). In one embodiment, said increased variant of ADCC mediates ADCC substantially more effectively than the original sequence of an IgGl or IgG3 Fc region and an abnormal antigen binding region. Preferably, said variant comprises or comprises substitutions of two or three residues at the 298, 333 and 334 sites of the Fc region.

면역글로불린 중쇄의 잔기의 숫자는 특별히 본 명세서에 참조로서 통합되는 카바트 등(Kabat et al., (supra))의 EU 인덱스에 따른다. 가장 바람직하게는, 298, 333 및 334 위치의 잔기가 치환될 수 있다(예를 들면, 알라닌 잔기로). 나아가, ADCC 활성을 가진 Fc 영역 변종을 생성하기 위해서, ADCC를 매개하는데 중요한 FcR로 생각되는 FcγRⅲ에 대한 증가된 결합 친화성을 가지는 Fc 영역 변종을 일반적으로 설계한다. 예를 들면, 이와 같은 변종을 생성하기 위한 하나로써, 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430 아미노산 부위의 어느 하나 또는 그 이상의 근원의 Fc 영역에 아미노산 변형을 도입할 수 있을 것이다. FcγRⅲ에 대한 증가된 결합 친화성을 가진 변종은, 이에 더하여 FcγRⅱ에 대한 결합 친화성, 특히, FcγRⅱB 수용체를 억제하기 위한 친화성이 감소될 수 있다.The number of residues in an immunoglobulin heavy chain is specifically described by Kabat et al., Incorporated herein by reference. al ., (supra)). Most preferably, residues at positions 298, 333, and 334 can be substituted (eg, with alanine residues). Furthermore, in order to generate Fc region variants with ADCC activity, Fc region variants with increased binding affinity for FcγRVIII, which are considered to be important FcRs for mediating ADCC, are generally designed. For example, as one for generating such a variant, an amino acid modification in the Fc region of any one or more origins of 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 or 430 amino acid sites. Could be introduced. Variants with increased binding affinity for FcγR ′ may further reduce binding affinity for FcγRii, particularly for inhibiting FcγRiiB receptors.

어떤 경우에서, 어떤 변종 아미노산의 삽입, 삭제 및/또는 치환 (예를 들면, 1-50 아미노산으로, 바람직하게는, 1-25 아미노산으로, 더욱 바람직하게는, 1-10 아미노산으로)을 고려할 수 있으며, 이는 본 발명의 범주에 들어간다. 보존된 아미노산의 치환이 일반적으로 바람직할 것이다. 나아가, 변경은 펩티도미메틱스 또는 D-아미노산과 같은 변경된 아미노산의 형태일 수 있다..In some cases, insertion, deletion and / or substitution of certain variant amino acids (eg, with 1-50 amino acids, preferably with 1-25 amino acids, more preferably with 1-10 amino acids) can be considered. Which falls within the scope of the present invention. Substitution of conserved amino acids will generally be preferred. Furthermore, the alteration may be in the form of altered amino acids such as peptidomimetics or D-amino acids.

그러므로, 이러한 종류에 따른 인간-유래 항체는 본 발명에서 바람직하다. 인간 항체는 인간으로부터 얻은 항체 생성 세포 또는 인간 항체 유전자를 이식한 키메라 실험 동물을 사용하여 얻을 수 있다(Ishida I, et al., (2002) Cloning and Stem cells., 4: 91-102.).Therefore, human-derived antibodies of this kind are preferred in the present invention. Human antibodies can be obtained using antibody-producing cells obtained from humans or chimeric experimental animals implanted with human antibody genes (Ishida I, et. al ., (2002) Cloning and Stem cells., 4: 91-102.).

나아가, 항체 Fc 영역은 임의의 가변 도메인과 연결될 수 있다. 특이적으로, 인간 고정 영역에 결합되는 다른 동물 종의 가변영역을 포함하는 키메라 항체가 공지이다. 택일적으로, 인간-인간 키메라 항체는 또한 임의의 고정 영역에 대한 인간 유래 가변영역에 대해서 요구될 수 있다. 추가로, 인간 항체 가변 도메인을 구성하는 CDR을 이종 기원의 항체의 CDR로 교체하는 CDR 접합 기술 역시 공지이다("imunoglobuline gene", Academic Press (London), pp260-274, 1989; Roguska MA, et al, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91 : 969-73.).Furthermore, the antibody Fc region can be linked to any variable domain. Specifically, chimeric antibodies comprising variable regions of other animal species that bind to human anchoring regions are known. Alternatively, human-human chimeric antibodies may also be required for human derived variable regions for any fixed region. In addition, CDR conjugation techniques for replacing CDRs constituting human antibody variable domains with CDRs of antibodies of heterologous origin are also known ("imunoglobuline gene", Academic Press (London), pp260-274, 1989; Roguska MA, et. al , (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 969-73.).

CDR을 교체함으로써, 항체 결합 특이성이 교체된다. 그것은, 인간 REG4는 인간 REF4 결합 항체의 CDR로 바뀐 인간화 항체에 의해서 인지될 것이다. 상기 바뀐 항체는 또한 인간화 항체로 불릴 수 있다. 그래서 항체는 그들의 가변 도메인의 본래의 기원에 상관없이, 본 발명의 항체로써 사용될 수 있는 중요한 효과 또는 기능의 Fc 영역을 포함하거나 갖추게 된다. 예를 들면, 그들의 가변 도메인이 다른 강 또는 다른 종의 면역글로불린으로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하더라도, 본 발명에서는 항체가 인간 IgG Fc를 포함한다면 바람직하다. 택일적으로, Fc 영역이 없는 항체 단편도 원하는 중화 기능을 가진다면 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 다른 항원-결합 부분서열을 항체로서 역시 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 중화 효과를 증가시키는 제제를 항체 또는 이의 단편에 연결시킬 수 있다. 본 발명의 항체의 VH 및 VL 영역은 각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3로 명명된 3개의 CDR을 포함하고, 이들은 프레임워크(framework) 아미노산에 의해 분리된다. CDR의 아미노산 서열은, REG4에 특이적으로 결합할 수 있는 항체라면 특별히 제한되지 않는다. CDR 아미노산 서열의 바람직한 예시는 하기를 포함한다:By replacing the CDRs, the antibody binding specificities are replaced. That is, human REG4 will be recognized by humanized antibodies which have been replaced with CDRs of human REF4 binding antibodies. The altered antibody may also be called a humanized antibody. Thus, antibodies contain or have an Fc region of important effect or function that can be used as an antibody of the present invention, regardless of their original origin. For example, even if their variable domains include amino acid sequences derived from other rivers or other species of immunoglobulins, it is preferred in the present invention that the antibodies comprise human IgG Fc. Alternatively, antibody fragments lacking an Fc region may be used as long as they have the desired neutralizing function. For example, in the present invention, Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2, or other antigen-binding subsequences of the antibody can also be used as the antibody. In some embodiments, agents that increase the neutralizing effect can be linked to an antibody or fragment thereof. The VH and VL regions of the antibodies of the invention comprise three CDRs, named CDR1, CDR2, and CDR3, respectively, which are separated by framework amino acids. The amino acid sequence of the CDR is not particularly limited as long as it is an antibody that can specifically bind REG4. Preferred examples of CDR amino acid sequences include:

VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20), VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20),

VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (서열번호 21),VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (SEQ ID NO: 21),

VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22), VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22),

VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23), VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23),

VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24),

VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25).VL CDR3: QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25).

더욱 바람직한 구체예에서, VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, VH는 서열번호 18의 전체 길이에서 적어도 약 90%, 95%, 98%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열번호 19의 전체 길이에서 적어도 약 90%, 95%, 98%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 서열 동일성은 예를 들면, BLAST 또는 ALIGN같은 당업계에서 잘 알려진, 사용가능한 소프트웨어의 디폴트 세팅을 이용하여 측정될 수 있다. 본 발명에서, 상기 항체는 단일 클론 항체 또는 다클론성 항체 일 수 있다. 인간에게 투여될 때조차, 인간 다클론성 항체는 전술한 인간 항체 유전자로 형질전환한 동물을 사용하여 비롯될 수 있다. 택일적으로, 인간화 항체, 인간-비인간 키메라 항체, 및 인간-인간 키메라 항체와 같은 유전자 재조합 기술을 사용하여 구축된 면역글로불린을 사용할 수 있다. 나아가, 인간 항체 생산 세포를 클로닝함으로써 인간 단일 클론 항체를 얻기 위한 방법은 공지이다.In a more preferred embodiment, the VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH comprises an amino acid sequence having at least about 90%, 95%, 98% sequence identity at full length of SEQ ID NO: 18, and the VL is at least about 90%, 95 at full length of SEQ ID NO: 19 %, Amino acid sequence having 98% sequence identity. Sequence identity can be measured using default settings of available software, such as, for example, BLAST or ALIGN, which are well known in the art. In the present invention, the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Even when administered to humans, human polyclonal antibodies can be derived using an animal transformed with the human antibody gene described above. Alternatively, immunoglobulins constructed using genetic recombination techniques such as humanized antibodies, human-non-human chimeric antibodies, and human-human chimeric antibodies can be used. Furthermore, methods for obtaining human monoclonal antibodies by cloning human antibody producing cells are known.

REG4, 또는 이의 부분 펩티드를 포함하는 단편은 상기 항체를 포함하는 면역원으로써 사용될 수 있다. 본 발명에서, REG4는 임의의 종으로부터 유래된 것이라도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인간, 마우스 또는 래트와 같은 포유동물에서 유래한 것, 더욱 바라직하게는 인간으로부터 유래한 것을 사용할 수 있다. 인간 REG4 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 공지이다. REG4의 cDNA 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 기술하였고, 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 기술하였다(GenBank Accession No. AY126670). 당업계의 기술에서 상기 제공된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 분리하고, 요구에 따라 상기 서열의 단편을 준비하여, 표적 아미노산 서열을 포함하는 단백질 A를 얻는 것은 일상적으로 할 수 있는 것이다.Fragments comprising REG4, or partial peptides thereof, can be used as an immunogen comprising the antibody. In the present invention, REG4 can be used even if it is derived from any species, preferably one derived from a mammal such as human, mouse or rat, more preferably one derived from human. Human REG4 nucleotide sequences and amino acid sequences are known. The cDNA nucleotide sequence of REG4 is set forth in SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 2 (GenBank Accession No. AY126670). It is routine in the art to isolate a gene comprising the provided nucleotide sequence, to prepare a fragment of the sequence as required, and to obtain Protein A comprising the target amino acid sequence.

예를 들면, REG4 단백질을 암호화하는 유전자 또는 그의 단편은 공지의 숙주 세포로의 형질 도입에 사용되는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 원하는 단백질, 또는 그의 단편은 임의 및 표준 방법을 사용하여 숙주 세포의 안 또는 밖으로부터 수집될 수 있으모, 항원으로써 또한 사용될 수 있다. 추가로, 단백질, 그들의 파쇄물, 및 화학적으로 합성된 단백질을 항원으로써 사용될 수 있다. 나아가, REG4 단백질을 발현하는 세포 또는 이의 단편은 그들 자신을 면역원으로써 사용할 수 있다.For example, a gene encoding a REG4 protein or fragment thereof can be inserted into an expression vector used for transduction into a known host cell. Desired proteins, or fragments thereof, can be collected from within or outside the host cell using any and standard methods, and can also be used as antigens. In addition, proteins, their lysates, and chemically synthesized proteins can be used as antigens. Furthermore, cells expressing the REG4 protein or fragments thereof can use themselves as immunogens.

펩티드 단편을 REG4의 면역원으로써 사용할 때, 세포 외 영역으로 예상되는 영역을 포함하는 아미노산 서열을 선택하는 것이 특히 중요하다. 신호전달 펩티드의 존재는 REG4의 N-말단의 1 내지 25개 부위로부터 예상될 수 있다. 그래서, 예를 들면, N-말단 신호전달 펩티드(25 아미노산 잔기)를 제외한 영역은 본 발명의 항체를 얻기 위한 면역원으로써 바람직하다. 말하자면, REG4의 세포외 영역에 결합하는 항체는 본 발명의 항체로서 바람직하다.When using peptide fragments as immunogens of REG4, it is particularly important to select amino acid sequences that include regions expected to be extracellular regions. The presence of signaling peptides can be expected from 1 to 25 sites at the N-terminus of REG4. Thus, for example, a region except for the N-terminal signaling peptide (25 amino acid residues) is preferable as an immunogen for obtaining the antibody of the present invention. In other words, antibodies that bind to the extracellular domain of REG4 are preferred as antibodies of the invention.

그러므로, 본 발명에서 바람직한 항체는 효과 또는 기능에 중요한 Fc 및 REG4의 세포외 영역에 결합할 수 있는 가변영역을 갖춘 항체이다. 인간으로의 투여를 목적으로 할 때, IgG Fc를 갖춘것이 바람직하다. Therefore, preferred antibodies in the present invention are antibodies with variable regions capable of binding to the extracellular regions of Fc and REG4 which are important for effect or function. For the purpose of administration to humans, it is preferred to have IgG Fc.

임의의 포유동물이라도 이러한 항원으로 면역화 될 수 있다. 그러나, 세포 융합에 사용될 근원 세포와의 양립가능성을 고려하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 설치류, 토끼류 또는 협비류 원숭이가 사용된다.Any mammal can be immunized with such an antigen. However, it is desirable to consider compatibility with the source cell to be used for cell fusion. In general, rodents, rabbits or conifer monkeys are used.

설치류는, 예를 들면, 마우스, 래트 및 햄스터를 포함한다. 토끼류는, 예를 들면, 토끼를 포함한다. 영장류는, 예를 들면, 마카카 파시키다리스(Macaca fascicidaris), 마카카 물라타(Macaca mulatta), 망토개코원숭이 및 침팬지와 같은 협비류 원숭이를 포함한다.Rodents include, for example, mice, rats and hamsters. Rabbits include, for example, rabbits. Primates include, for example, coniferous monkeys such as Macaca fascicidaris, Macaca mulatta, cloak baboons and chimpanzees.

항원으로 실험동물을 면역화하는 방법은 당업계에서 공지이다. 복강내 또는 정맥내로의 항원 주입이 포유동물을 면역화하기 위한 표준 방법이다. 특별히, 항원은 PBS, 생리 식염수 등의 적당한 양에 희석 및 부유시킬 수 있다. 원하는 바로써, 항원 부유물은 후룬즈 완전 아주번트와 같은 표준 아주번트의 적당한 양과 섞어서, 유상화 시킨 뒤에 포유동물로 투여할 수 있다. 그 다음으로, 적당한 양의 후룬즈 비완전 아주번트와 섞은 항원을 복합적 투여양으로 21일 동안 4일마다 투여시킬 수 있다. 면역화를 위해서는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 상기에서 약술한 바와 같이 면역화를 실시한 이후에, 표준 방법을 원하는 항체 수준으로 증가되었는지 혈청을 실험하기 위하여 사용할 수 있다.Methods for immunizing laboratory animals with antigens are known in the art. Intraperitoneal or intravenous antigen injection is the standard method for immunizing mammals. In particular, the antigen can be diluted and suspended in an appropriate amount of PBS, physiological saline or the like. As desired, the antigenic suspension can be mixed with an appropriate amount of standard adjuvant such as Furunz complete adjuvant, emulsified and then administered to the mammal. The antigen mixed with the appropriate amount of Furunz incomplete adjuvant can then be administered in multiple doses every 4 days for 21 days. Suitable carriers can be used for immunization. After immunization as outlined above, standard methods can be used to test serum for increased antibody levels to desired levels.

REG4 단백질에 대한 다클론성 항체는 원하는 항체를 증가시키기 위해 실험한 면역화 시킨 포유동물의 혈청으로부터 준비할 수 있다. 상기 동물로부터 혈액을 수집함으로써 수행되거나, 그들의 혈액으로부터 혈청을 분리하는 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 다클론성 항체는 다클론성 항체 및 혈청으로부터 분리될 수 있는 다클론성항체를 포함하는 분획을 포함하는 혈청을 포함한다. IgG 및 IgM은, 예를 들면, REG4 단백질과 연결된 친화성 컬럼을 사용하여 REG4 단백질을 인지하는 분획으로부터, 단백질 A 또는 G 단백질을 사용하여 상기 분획을 나아가 정제하여 준비할 수 있다. 본 발명에서, 항혈청을 다클론성 항체로서 사용할 수 있다. 택일적으로, 정제된 IgG, IgM, 또는 이와 같은 것을 사용할 수 있다.Polyclonal antibodies against the REG4 protein can be prepared from the sera of immunized mammals tested to increase the desired antibody. This can be done by collecting blood from the animal, or using any method that separates serum from their blood. Polyclonal antibodies include serum comprising fractions comprising polyclonal antibodies and polyclonal antibodies that can be isolated from serum. IgG and IgM can be prepared by further purifying the fraction using protein A or G protein, for example, from a fraction that recognizes REG4 protein using an affinity column linked to the REG4 protein. In the present invention, antisera may be used as polyclonal antibodies. Alternatively, purified IgG, IgM, or the like can be used.

단일 클론 항체를 준비하기 위하여, 항원으로 면역화된 포유동물로부터 면역세포를 수집하고, 혈청에서의 원하는 항체 수준(상기와 같이)이 증가되었는지 조사한 다음, 세포 융함에 사용하였다. 세포 융함에 사용하기 위한 면역세포는 바람직하게는 비장으로부터 온것이다. 상기의 면역원을 가지는 다른 바람직한 세포 융합에 적합한 근원 세포는 예를 들면, 포유동물 골수종 세포, 더욱 바람직하게는, 약학적 제제에 의하여 융합세포의 선별을 위해 요구되는 특징을 가지는 골수종 세포를 포함한다.To prepare monoclonal antibodies, immune cells were collected from mammals immunized with antigen, examined for increased desired antibody levels in serum (as above) and used for cell fusion. Immune cells for use in cell fusion are preferably from the spleen. Source cells suitable for other preferred cell fusions having the above immunogens include, for example, myeloma cells, mammalian myeloma cells, more preferably, myeloma cells having the characteristics required for selection of the fusion cells by pharmaceutical agents.

상기의 면역세포 및 골수종 세포는 공지의 방법, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법을 사용하여 융합될 수 있다(Galfre, G. and Milstein, C, (1981) Methods. Enzymol. : 73, 3-46.). 세포 융합에 의해 생산된 하이브리도마는 HAT 배지(하이포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin), 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지)와 같은 표준 선별 배지에서 배양함으로써 선별될 수 있다. HAT 배지에서의 세포 배양은 보통 수 일에서 수 주 동안 원하는 하이브리도마를 제외한 모든 세포(비융합 세포)를 죽이는데 충분한 기간 동안 계속된다. 그리고 나서, 표준적인 한계 희석을 수행하여, 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 탐색하고 클로닝한다.Said immune cells and myeloma cells can be fused using known methods such as Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, (1981) Methods. Enzymol .: 73, 3- 46.). Hybridomas produced by cell fusion can be selected by culturing in standard selection media, such as HAT medium (medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). Cell culture in HAT medium usually lasts for days to weeks for a period sufficient to kill all cells (non-fused cells) except the desired hybridomas. Standard limiting dilution is then performed to search for and clone hybridoma cells that produce the desired antibody.

비인간 실험동물은 상기 기술한 방법에 따라 하이브리도마를 분비하기 위해 항원으로 면역화 시킬 수 있다. 추가로, EB 바이러스 또는 그러한 종류로 감염된 세포에서 유래한 인간 림프구는 단백질, 세포 발현 단백질 또는 이들의 부유물을 사용하여 in vitro에서 면역화 시킬 수 있다. 그리고 나서, 상기 면역화된 림프구는 무한히 분열하는 능력의 인간 유래 골수종 세포(U266 등)와 융합되어, 단백질에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 수득한다(일본 공개 특허번호(심사청구 안됐음) (JP-A) 소 63-17688).Non-human experimental animals can be immunized with antigens to secrete hybridomas according to the methods described above. In addition, human lymphocytes derived from EB virus or cells infected with that kind can be immunized in vitro using proteins, cell expressing proteins or their suspensions. The immunized lymphocytes are then fused with human-derived myeloma cells (U266, etc.) with the ability to divide indefinitely, yielding hybridomas that produce the desired human antibody capable of binding to proteins (Japanese Laid-open Patent No. (examination) Not charged) (JP-A) SO 63-17688).

상기 수득한 하이브리도마는 그 다음으로 마우스의 복강으로 이식한 후, 복수를 추출하였다. 상기 수득한 단일 클론 항체는 예를 들면, 황산 암모늄 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 또는 본 발명의 단백질과 연관된 친화성 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 단백질을 정제 및 탐지하는데 뿐만 아니라, 본 발명의 활성제 및 억제제의 후보로서도 사용될 수 있다. 또한, 이러한 항체는 본 발명의 단백질과 관계된 질병을 위한 항체 치료에 응용될 수 있다. 수득한 항체를 인간의 몸에 투여하는 경우(항체 치료), 인간 항체 또는 인간화 항체가 낮은 면역성을 가지는 것이 바람직하다.The obtained hybridoma was then transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and the ascites was extracted. The monoclonal antibodies obtained can be purified using, for example, ammonium sulfate precipitation, Protein A or Protein G columns, DEAE ion exchange chromatography, or affinity columns associated with the proteins of the invention. The antibodies of the invention can be used not only for purifying and detecting the proteins of the invention, but also as candidates for the active agents and inhibitors of the invention. In addition, such antibodies can be applied to antibody therapy for diseases associated with the proteins of the invention. When the obtained antibody is administered to the human body (antibody treatment), it is preferable that the human antibody or humanized antibody has low immunity.

예를 들면, 인간 항체유전자 레파토리를 포함하는 형질 전환 동물은 단백질, 단백질-발현 세포, 또는 이들의 부유물로부터 선택된 항원으로 면역화 시킬 수 있다. 그리고 나서, 항체-생산 세포는 상기 동물로부터 회수되고, 하이브리도마를 얻기 위한 골수종 세포와 융합되며, 이러한 하이브리도마로부터 항단백질 인간 항체가 준비될 수 있다. (국제 공개 특허번호 92-03918, 94-02602, 94- 25585, 96-33735, 및 96-34096).For example, transgenic animals comprising a human antibody gene repertoire can be immunized with an antigen selected from proteins, protein-expressing cells, or their suspensions. Antibody-producing cells are then recovered from the animal, fused with myeloma cells to obtain hybridomas, and antiprotein human antibodies can be prepared from these hybridomas. (International Publication Nos. 92-03918, 94-02602, 94-25585, 96-33735, and 96-34096).

택일적으로, 면역화 된 림프구와 같은 항체를 생산하는 면역세포는 암유전자를 사용하여 불멸화 시켜서, 단일 클론 항체를 준비하는데 사용한다Alternatively, immune cells producing antibodies, such as immunized lymphocytes, are immortalized using oncogenes and used to prepare monoclonal antibodies.

본 발명에 따른 단일 클론 항체는 유전자 공학 방법을 이용하여 분비되는 방법을 포함한다(Borrebaeck, C.A.K.and Larrick, J. W., (1990) Therapeutic monoclonal antibody, MacMillan Publishers, UK). 예를 들면, 재조합 항체는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역세포로부터 유래한 항체를 암호화하는 DNA; 이러한 DNA를 적절한 벡터로 삽입; 및 상기 벡터를 숙주 세포로 형질 도입하는 클로닝에 의하여 준비될 수 있다. 상기와 같이 준비된 재조합 항체는 본 발명에서 사용될 수 있다.Monoclonal antibodies according to the invention include methods secreted using genetic engineering methods (Borrebaeck, C.A.K.and Larrick, J. W., (1990) Therapeutic monoclonal antibody, MacMillan Publishers, UK). For example, recombinant antibodies include DNA encoding antibodies derived from immune cells such as hybridomas or immunized lymphocytes that produce the antibody; Inserting such DNA into an appropriate vector; And cloning to transduce the vector into a host cell. Recombinant antibodies prepared as described above can be used in the present invention.

상기 항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols (PEGs))과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형된 항체를 사용할 수 있다. 이러한 방법으로 변형된 항체 역시 본 발명에서 사용될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 변형된 항체를 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형 방법은 당업계에서 전통적인 것이다. 상기 항체는 또한, 다른 단백질에 의해서 변형될 수 있다. 단백질 분자에 의해 변형된 항체는 유전자 공학을 사용하여 생산될 수 있다. 그것은, 표적 단백질을 변형 단백질을 암호화하는 유전자를 항체 유전자와 융합시킴으로써 발현시킬 수 있다.The antibody may use an antibody modified by binding to various molecules such as polyethylene glycols (PEGs). Antibodies modified in this manner can also be used in the present invention. Modified antibodies can include chemically modified antibodies. Modifications of this kind are traditional in the art. The antibody may also be modified by other proteins. Antibodies modified by protein molecules can be produced using genetic engineering. It can express a target protein by fusing a gene encoding a modified protein with an antibody gene.

택일적으로, 이러한 항체는 키메라 항체로서 비인간 항체 유래의 가변 도메인 및 인간 항체 유래의 고정 영역으로 구성되는 것; 또는 인간화 항체로서 비인간 항체 유래의 CDR, 인간 항체 유래의 프레임워크 영역, 및 고정 영역으로 구성되는 것으로부터 얻을 수 있다. 상기 항체는 알려진 방법을 사용하여 생산될 수 있다.Alternatively, such antibodies are chimeric antibodies consisting of a variable domain from a non-human antibody and a fixed region from a human antibody; Alternatively, the humanized antibody can be obtained from a CDR derived from a non-human antibody, a framework region derived from a human antibody, and a fixed region. The antibody can be produced using known methods.

분자 생물학의 표준 기술을 키메라 및 CDR-융합된 산물을 암호화하는 DNA 서열을 준비하는데 사용될 수 있다. 흥미있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자가 예를 들면, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 도메인을 합성하기 위하여 DNA 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용함으로써 준비된다(Larrick et al., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", vol. 2: page 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of monoclonal antibody" in monoclonal antibody: Production, Engineering and Clinical Application; Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press, 1995), and Ward et al., "Genetic Manipulation and expression of antibody" in monoclonal antibody: Principles and Applications; Birch et al. (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995)).Standard techniques of molecular biology can be used to prepare DNA sequences encoding chimeric and CDR-fused products. Genes encoding the CDRs of the antibody of interest are prepared by using DNA polymerase chain reaction (PCR), for example, to synthesize variable domains from RNA of antibody-producing cells (Larrick et al. al ., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", vol. 2: page 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of monoclonal antibody" in monoclonal antibody: Production, Engineering and Clinical Application; Ritter et al . (eds.), page 166 (Cambridge University Press, 1995), and Ward et al ., “Genetic Manipulation and expression of antibody” in monoclonal antibody: Principles and Applications; Birch et al . (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995).

키메라 및 CDR-융합된 산물을 암호화하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 전부 또는 부분만 합성될 수 있다. 단염기-돌연변이 방법 및 DNA 중합 효소 연쇄 반응 기술을 적당하게 쓸 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드를 존스 등이 서술한 바에 따라 직접 합성할 수 있다(Jones et al., (1986), Nature.;321:522-5 may be used). 또한, 이미 존재하는 가변 도메인에, 예를 들면, 베로이엔 등(Verhoeyen et al, (1988) Science. ;239: 1534-6) 또는 리치맨 등(Riechmann et al., {supra))이 기술한 바대로, 올리고뉴클레오티드 디렉티드 돌연변이화(directed mutagenesis)를 사용할 수도 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 공백은 T4 DNA 중합효소를 사용한 효소적 채움을, 예를 들면, 퀸 등이 설명한 바대로 사용할 수 있다(Queen et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86: 10029-33; PCT Publication WO 90/07861)DNA sequences encoding chimeric and CDR-fused products can be synthesized in whole or in part using oligonucleotide synthesis techniques. Monobase-mutation methods and DNA polymerase chain reaction techniques can be suitably used. For example, oligonucleotides can be synthesized directly as described by Jones et al . (Jones et. al ., (1986), Nature .; 321: 522-5 may be used). In addition, in the variable domains already present, for example, Verhoeyen et al. al , (1988) Science. ; 239: 1534-6) or Richman et al. al ., (supra)) may also use oligonucleotide directed mutagenesis. In addition, the oligonucleotide gap can be enzymatically filled using T4 DNA polymerase, for example, as described by Quinn et al . (Queen et. al ., (1989) Proc Natl Acad Sci USA; 86: 10029-33; PCT Publication WO 90/07861)

어떠한 적당한 숙주 세포/벡터 시스템은 CDR-융합된 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA의 발현에 사용될 수 있다. 원핵세포, 예를 들면, E. coli, 및 다른 미생물 시스템이 그중에서도 FAb 및 (Fab')2 단편과 같은 항체 단편, 그리고 특히, Fv 단편 및 단일-사슬 항체 단편, 예를 들면, 단일-사슬 Fvs의 발현을 위해서 사용될 수 있다. 진핵세포c, 예를 들면, 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템은 특히 완전한 항체 분자를 포함하는 큰 CDR-융합된 항체 산물의 생산을 위해 사용될 수 있다. 적당한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포 및 골수종 또는 하이브리도마 세포주를 포함한다. Any suitable host cell / vector system can be used for the expression of DNA encoding CDR-fused heavy and light chains. Prokaryotic cells, such as E. coli , and other microbial systems, among others, antibody fragments such as FAb and (Fab ') 2 fragments, and in particular Fv fragments and single-chain antibody fragments, such as single-chain Fvs It can be used for the expression of. Eukaryotic cells, e.g., mammalian, host cell expression systems, can be used for the production of large CDR-fused antibody products, particularly including complete antibody molecules. Suitable mammalian host cells include CHO cells and myeloma or hybridoma cell lines.

상기를 포함하는 항체는 균일하게 정제될 수 있다. 예를 들면, 항체는 단백질을 정제하거나 분리하는 일반적인 방법을 이용하여 정제되거나 분리될 수 있다. 예를 들면, 항체는 친화성 크로마토그래피, 여과법, 한외여과기, 염침전, 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, 등전점 포커싱 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 컬럼 크로마토그래피의 조합에서 적당히 선택한 것을 사용하여 분리하거나 단리할 수 있다(antibody : A Laboratory Manual, Harlow and David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).Antibodies comprising the above can be purified uniformly. For example, antibodies can be purified or isolated using conventional methods to purify or isolate proteins. For example, the antibody may be one selected from a combination of column chromatography, including but not limited to affinity chromatography, filtration, ultrafiltration, salt precipitation, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, and the like. Can be isolated or isolated (antibody: A Laboratory Manual, Harlow and David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

단백질 A 컬럼 및 G 단백질 컬럼을 친화성 컬럼으로서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 하이퍼 D (Hyper D), 포로스(POROS), 및 세파로즈(Sepharose) FF (Pharmacia)를 포함하는 단백질 A 컬럼을 사용한다. Protein A columns and G protein columns can be used as affinity columns. Preferably, a Protein A column is used, including Hyper D, POROS, and Sepharose FF (Pharmacia).

바람직한 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피를 포함하는)는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤 여과, 역상 크로마토그래피 및 흡착 크로마토그래피를 포함한다("strategy for protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual" Daniel R. Marshak et al, (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press.). 상기 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC와 같은 액체 크로마토그래피의 절차에 따라서 수행될 수 있다. Preferred chromatography (including affinity chromatography) includes ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography and adsorption chromatography ("strategy for protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual" Daniel R. Marshak et al , (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press.). The chromatography can be performed according to the procedure of liquid chromatography, such as HPLC or FPLC.

예를 들면, 본 발명의 항체의 항원-결합 활성은 흡광도 측정, 효소 연결 면역흡광 분석 (ELISA), 효소 면역분석 (EIA), 방사선면역분석 (RIA) 및/또는 면역형광 방법을 사용함으로써 측정될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체를 기판에 고정시키고, 본 발명의 단백질 A를 기판에 첨가하고 나서, 항체를 생산하는 세포의 배양 상청 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체를 포함하는 시료를 첨가하였다. 상기 1차 항체를 인지할 수 있는, 알칼리성 탈인산화 효소와 같은 효소로 표지된 이차 항체를 첨가한 후 배양한다. 세척 후에, p-니트로페닐 포스포산(p-nitrophenyl phosphate)과 같은 효소 기질을 기판에 첨가하고, 흡광도를 측정하여, 시료의 항원-결합 활성을 평가하였다. 항체의 단백질 단편(C-말단 또는 N-말단 단편 및 그러한 것)을 단백질과 같은 방법으로 사용할 수 있다. 상기 항체의 결합 활성은 비아코아(BIAcore (Pharmacia))를 사용하여 평가하였다. .For example, the antigen-binding activity of the antibodies of the invention can be measured by using absorbance measurements, enzyme linked immunoabsorbance assays (ELISA), enzyme immunoassays (EIA), radioimmunoassay (RIA) and / or immunofluorescence methods. Can be. In ELISA, the antibody of the present invention was immobilized on a substrate, and Protein A of the present invention was added to the substrate, followed by the addition of a sample containing the desired antibody, such as culture supernatant or purified antibody of the cells producing the antibody. The secondary antibody labeled with an enzyme such as alkaline dephosphorase, which can recognize the primary antibody, is added and then cultured. After washing, an enzyme substrate such as p-nitrophenyl phosphate was added to the substrate and the absorbance was measured to assess the antigen-binding activity of the sample. Protein fragments of antibodies (C-terminal or N-terminal fragments and the like) can be used in the same way as proteins. The binding activity of the antibody was evaluated using BIAcore (Pharmacia). .

나아가, REG4 활성을 억제하는 하나 또는 그 이상의 항REG4 항체를 본 발명의 방법 및 조성물을 위해서 사용하였다. 본 발명에서, 바람직한 항REG4 항체는 췌장암의 세포 증식을 촉진하는 REG4의 활성을 중화한다. 항REG4 항체의 중화 기능은 in vitro 또는 in vivo에서 평가할 수 있다. 예를 들면, 항REG4 항체의 중화 기능은 REG4를 발현하는 세포의 증식에서 항체의 효과를 나타내는가를 통해서 추측할 수 있다. 특히, 당업계에서 알려진 임의의 방법을 이용하여 측정함으로써, 항체가 세포증식을 탐지 가능할 정도로 감소시켰을 때, 상기 중화 기능을 알 수 있을 것이다. 택일적으로, 또한, 이러한 기능은 Alct 신호전달 경로의 억제로써 확인할 수 있다(Sekikawa A, et al Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.).Furthermore, one or more antiREG4 antibodies that inhibit REG4 activity were used for the methods and compositions of the present invention. In the present invention, preferred anti-REG4 antibodies neutralize the activity of REG4 to promote cell proliferation of pancreatic cancer. The neutralizing function of anti-REG4 antibodies can be assessed in vitro or in vivo. For example, the neutralizing function of the anti-REG4 antibody can be inferred from the effect of the antibody on the proliferation of cells expressing REG4. In particular, by measuring using any method known in the art, the neutralizing function will be known when the antibody reduces the cell proliferation to a detectable level. Alternatively, this function can also be confirmed by inhibition of the Alct signaling pathway (Sekikawa A, et. al Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al . Gastroenterology 2006; 130: 137-49.

본 발명에서, 항REG4 항체 및 비항체 결합 단백질은 인간 또는 다른 동물에게 약학적 제제로서 투여될 수 있다. 본 발명에서, 상기 항체를 투여할 수 있는 인간을 제외한 다른 동물은 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 닭, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비 및 침팬지를 포함한다. 상기 항체 및 비항체 결합 단백질은 개체로 직접 투여될 수 있으며, 추가로, 알려진 약학적 공식화 방법을 이용하여 투여 형식을 공식화 할 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라서, 살균한 용액, 물의 현탁액 또는 다른 임의의 약학적으로 허용 가능한 용액과 같은 주입 가능한 형태를 비경구적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 이러한 조성물의 종류는 일반적으로 약학적 제제로서 사용할 때 필수적인, 허용 가능한 단위의 투여량으로 허용 가능한 담체 또는 용매, 특히 살균한 물, 생리학적인 염류, 식물성 기름, 유화제, 부유제, 계면 활성제, 안정제, 향신료, 첨가제, 방부제, 응결제 및 그 밖에 유사한 것과 혼합할 수 있다.In the present invention, the antiREG4 antibody and the non-antibody binding protein can be administered to a human or other animal as a pharmaceutical agent. In the present invention, other animals except humans to which the antibody can be administered include mice, rats, guinea pigs, rabbits, chickens, cats, dogs, sheep, pigs, cows, monkeys, baboons and chimpanzees. The antibody and non-antibody binding protein can be administered directly to the subject, and further, the dosage form can be formulated using known pharmaceutical formulation methods. For example, injectable forms may be administered parenterally, such as sterile solution, suspension of water or any other pharmaceutically acceptable solution, if desired. For example, the type of such composition is generally acceptable when used as a pharmaceutical formulation, in acceptable dosages of acceptable carriers or solvents, in particular sterile water, physiological salts, vegetable oils, emulsifiers, flocculants, interfacial It can be mixed with active agents, stabilizers, spices, additives, preservatives, coagulants and the like.

생리 식염수, 글루코즈 및 에주번트를 포함하는 다른 등장액(D-소비톨(D-sorbitol), D-만노즈(D-mannose), D-만니톨(D-mannitol), 및 염화 나트륨과 같은)주사용 수용액으로서 사용할 수 있다. 그들은 또한, 알콜; 특히 에탄올 및 폴리알콜(예를 들면, 프로필렌 글리콜(propylene glycols) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)); 및 비이온성 계면 활성제(예를 들면, 폴리소르브산(Polysorbate 80™) 또는 HCO-50)와 같은 적당한 가용화제와 함께 사용할 수 있다.Injecting other isotonic solutions (such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride), including physiological saline, glucose, and adjuvant It can be used as an aqueous solution. They are also alcohol; In particular ethanol and polyalcohols (eg propylene glycols and polyethylene glycol); And suitable solubilizers such as nonionic surfactants (e.g., Polysorbate 80 ™ or HCO-50).

참깨 기름 또는 콩기름는 유기 용매로 사용될 수 있으며, 벤질 벤조산(benzyl benzoate) 또는 벤질 알콜(benzyl alcohols)는 상기 유기 용매와 함께 가용화제로서 사용될 수 있다. 완충액(인산염 버퍼, 아세트산 나트륨 버퍼 등), 마취약(프로카인 하이드로클로라이드(procaine hydrochloride) 같은), 안정제(벤질 알콜(benzyl alcohol), 페놀(phenols) 등), 및 항산화제를 성분배합으로 사용할 수 있다. 상기 준비된 주입물은 적당한 앰풀(ampules)로 포장할 수 있다. Sesame oil or soybean oil may be used as the organic solvent, benzyl benzoate or benzyl alcohols may be used as the solubilizer with the organic solvent. Buffers (phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), anesthetics (such as procaine hydrochloride), stabilizers (benzyl alcohol, phenols, etc.), and antioxidants can be used in the formulation. . The prepared infusion can be packaged in suitable ampules.

본 발명에서, 상기 항REG4 항체 및 비항체 결합 단백질은 예를 들면, 동맥주사, 정맥주사, 피하 주사, 비강흡입, 세기관지 흡입, 국부 주사 또는 근육주사로 환자에게 투여할 수 있다. 점적 또는 주입에 의한 정맥주사(정맥의) 투여는 췌장암 환자들에 대한 항체의 개체 투여의 일반적 방법의 예시이다. 추가로, 암세포에 대한 영양분을 공급하는 혈관 근처에 삽입되는 동맥 카테터(intraarterial catheter) 방법은 항체제제와 같은 항암제를 국부 주입하기 때문에 영양학적 초점에 따른 국부 조절 치료뿐만 아니라 췌장암의 일차 초점에서도 효과적이다. In the present invention, the anti-REG4 antibody and the non-antibody binding protein may be administered to the patient by, for example, arterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, nasal inhalation, bronchioles, local injection or intramuscular injection. Intravenous (intravenous) administration by drop or infusion is an example of a general method of subject administration of an antibody to pancreatic cancer patients. In addition, the intraarterial catheter method, which is inserted near blood vessels that supply nutrients to cancer cells, is effective in the primary focus of pancreatic cancer as well as in localized control therapy according to the nutritional focus because local injection of anticancer drugs such as antibody preparations. .

투여량 및 투여 방법은 환자의 체중 및 연령에 따라 변화됨에도 불구하고, 이러한 투여 방법은 당업계에서 일상적으로 선택되는 하나의 기술이 될 수 있다. 추가로, 항체를 암호화하는 DNA는 유전자 치료를 위하여 벡터 내로 삽입될 수 있으며, 상기 벡터는 치료를 위해 투여될 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 환자의 체중, 연령 및 조건에 따라 바뀌지만, 당업자는 이러한 것을 적당히 선택할 수 있다. 일반적으로 처음에는 낮은 투여량을 투여한 다음, 일정량씩 증가시켜 원하지 않는 부작용이 없는 효력적인 효과를 달성할 수 있다. Although dosages and methods of administration vary with the weight and age of the patient, such methods of administration may be one technique routinely selected in the art. In addition, DNA encoding the antibody can be inserted into a vector for gene therapy, and the vector can be administered for treatment. Dosage and method of administration vary depending on the weight, age and conditions of the patient, but one of ordinary skill in the art can make appropriate selections. Generally, low doses are initially administered and then increased in increments to achieve an effect without unwanted side effects.

항REG4 항체 및 비항체 결합 단백질은 REG4에 대한 기능을 중화시키는 것으로 확인할 수 있는 양으로 생체내로 투여될 수 있다. 예를 들면, 증상에 따라 다른 일정한량이기는 하지만, 항REG4 항체 투여량은 하루에 0.1 ㎎ 내지 250 ㎎/㎏이다. 일반적으로, 상기 투여량은 어른(60 ㎏ 체중)의 경우, 5 ㎎ 내지 17.5 g/일, 바람직하게는 5 ㎎ 내지 10 g/일, 그리고 더욱 바람직하게는 100 ㎎ 내지 3 g/일이다. 상기 투여 일정은 2 내지 10일 간격이상으로 한번 내지 10번이이고, 예를 들면, 과정은 3 내지 6번 투여 후에 관찰된다.Anti-REG4 antibodies and non-antibody binding proteins may be administered in vivo in amounts that can be found to neutralize the function for REG4. For example, the dose of anti-REG4 antibody is between 0.1 mg and 250 mg / kg per day, although at certain constants depending on the condition. In general, the dosage is 5 mg to 17.5 g / day, preferably 5 mg to 10 g / day, and more preferably 100 mg to 3 g / day for an adult (60 kg body weight). The dosing schedule is once to 10 times over a 2 to 10 day interval, for example, the process is observed after 3 to 6 doses.

택일적으로, 항체, 비항체 결합 단백질 또는 이들의 기능적 유도체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산은 PDAC를 포함하는 췌장암과 같은 REG4를 발현하는 세포와 연관된 질병의 치료 또는 예방을 위한 유전자 치료 방법으로 투여될 수 있다. 유전자 치료는 발현된 또는 발현 가능한 핵산을 개체로 투여함으로써 수행되는 치료를 지칭한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 핵산은 그들이 암호화하고, 예방 또는 치료 효과를 매개하는 항체 또는 항체 단편을 생산한다. 당업계에서 사용가능한 임의의 유전자 치료 방법도 본 발명에 따라서 사용가능하다. 바람직한 방법을 하기에 기술하였다. Alternatively, nucleic acids comprising sequences encoding antibodies, non-antibody binding proteins or functional derivatives thereof may be administered in a gene therapy method for the treatment or prevention of diseases associated with cells expressing REG4, such as pancreatic cancer, including PDAC. Can be. Gene therapy refers to the treatment performed by administering an expressed or expressible nucleic acid to an individual. In an embodiment of the invention, the nucleic acids produce antibodies or antibody fragments that they encode and mediate a prophylactic or therapeutic effect. Any gene therapy method available in the art may also be used in accordance with the present invention. Preferred methods are described below.

유전자 치료의 방법에 대한 일반적인 재검토를 위하여, 하기를 참조한다: Goldspiel et al., (1993) Clin. Pharm.;12:488-505; Wu and Wu, (1991) Biotherapy.;3 : 87-95; Tolstoshev, (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol. ;32: 573-96; Mulligan, (1993) Science.;260:926-32; Morgan and Anderson, (1993) Ann Rev Biochem.;62:191-217; Trends Biotechnol.;l 1(5): 155-215. Methods commonly known in the art of recombinant DNA technology which can be used are described in Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, gene Transfer and expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). 바람직한 관점에서, 본 발명의 조성물은 항체 또는 비항체 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 적합한 숙주에서 항체 또는 이의 단편; 키메라 단백질 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 발한하는 발현 벡터의 일부일 수 있다. 특히, 이러한 핵산은 프로모터, 바람직하게는 항체를 암호화하는 영역과 실행가능하도록 연결된 이종기원의 프로모터일 수 있으며, 상기 프로모터는 유도 가능 또는 구성 가능; 및 선택적으로, 조직-특이적일 수 있다. 다른 상세한 구체예에서, 핵산 분자는 항체를 암호화 하는 서열 및 유전체의 원하는 부위에서 상동성 재조합을 촉진시키는 영역의 옆에 존재하여, 항체를 암호화하는 핵산의 염색체 내 발현을 제공하는 다른 임의의 원하는 서열로 사용되었다(Roller and Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:8932-5; Zijlstra et al, (1989) Nature. ;342:435-8). 특이적인 구체예에서, 발현된 항체 분자는 단일 사슬 항체; 택일적으로, 항체의 중쇄 및 경쇄; 또는 이들의 단편 양 쪽 모두를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 서열 이다.For a general review of methods of gene therapy, see Goldspiel et. al ., (1993) Clin. Pharm .; 12: 488-505; Wu and Wu, (1991) Biotherapy .; 3: 87-95; Tolstoshev, (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol. 32: 573-96; Mulligan, (1993) Science .; 260: 926-32; Morgan and Anderson, (1993) Ann Rev Biochem .; 62: 191-217; Trends Biotechnol .; l 1 (5): 155-215. Methods commonly known in the art of recombinant DNA technology which can be used are described in Ausubel et al . (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, gene Transfer and expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). In a preferred aspect, a composition of the present invention comprises a nucleic acid encoding an antibody or non-antibody binding protein, said nucleic acid comprising: the antibody or fragment thereof in a suitable host; Chimeric protein or a heavy or light chain thereof may be part of an expression vector. In particular, such nucleic acid may be a heterologous promoter viablely linked with a promoter, preferably a region encoding an antibody, which promoter is inducible or configurable; And optionally, tissue-specific. In another detailed embodiment, the nucleic acid molecule is next to the sequence encoding the antibody and the region that promotes homologous recombination at the desired site of the genome, thereby providing any other desired sequence that provides in-chromosomal expression of the nucleic acid encoding the antibody. (Roller and Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA .; 86: 8932-5; Zijlstra et. al , (1989) Nature. 342: 435-8). In specific embodiments, the expressed antibody molecule is a single chain antibody; Alternatively, the heavy and light chains of the antibody; Or a nucleic acid sequence comprising a sequence encoding both fragments thereof.

개체내로의 핵산의 전달은 직접, 개체가 상기 핵산 또는 핵산을 탑재한 벡터에 직접적으로 노출되는 경우에는 직접, 세포가 in vitro에서 상기 핵산으로 먼저 형질 도입되고 나서, 개체로 이식되는 경우에는 간접으로 이루어 질 수 있다. 이러한 두 가지 접근법은 각각 in vivo 또는 ex vivo 유전자 치료로 알려져 있다.The delivery of nucleic acid into an individual is either direct when the individual is directly exposed to the nucleic acid or the vector carrying the nucleic acid, or indirectly when the cell is first transduced into the nucleic acid in vitro and then transplanted into the individual. Can be done. These two approaches are known as in vivo or ex vivo gene therapy, respectively.

특이적인 구체예에서, 상기 핵산 서열은 in vivo에서 그것이 암호화하는 산물을 생산하기 위해 발현되는 곳으로 직접적으로 투여된다. 이는 당업계에서 알려진 어떠한 다수의 방법, 예를 들면, 그들을 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성한 다음, 벡터가 세포 내에 존재하도록 예를 들면, 결손의 또는 약화된 레트로 바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염(미국특허번호 4980286); DNA 자체를 직접 주입; 미세입자 충격(유전자 총; Biolistic, Dupont); 지질 또는 세포 표면 수용체로 코팅, 형질 도입 제제, 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐로 캡슐화; 핵 내로 들어간다고 알려진 펩티드와 연결시켜 도입; 수용체 매개 엔도시토시스(endocytosis)할 수 있는 리간드와 연결시켜 도입(예를 들면, Wu and Wu, (1987) J Biol Chem.;262:4429-32)(발현하는 수용체에 따라 표적 세포 유형 특이적으로 사용할 수 있다)하는 방법 등을 통해서 도입하여 성취될 수 있다.In a specific embodiment, the nucleic acid sequence is administered directly to where it is expressed in vivo to produce the product it encodes. This can be accomplished by any number of methods known in the art, for example, by constructing them as part of a suitable nucleic acid expression vector and then using, for example, a defective or attenuated retrovirus or other viral vector so that the vector is present in the cell ( US Patent No. 4980286); Direct injection of DNA itself; Microparticle bombardment (gene gun; Biolistic, Dupont); Coating with lipid or cell surface receptors, encapsulating with transduction agents, liposomes, microparticles or microcapsules; Introduction by linking with a peptide known to enter the nucleus; Introduction by linking with ligands capable of receptor mediated endocytosis (e.g., Wu and Wu, (1987) J Biol Chem .; 262: 4429-32) (target cell type specific depending on the expressing receptor) It can be achieved by introducing through a method) (or the like).

다른 구체예에서, 핵산-리간드 복합체는 엔도좀을 파괴시켜, 핵산이 리소좀성 분해되는 것을 피할 수 있도록 도와주는 퓨소제닉(fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하는 리간드로 이루어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 핵산은 특이적 수용체를 표적함으로써, in vivo에서 세포 특이적 흡수 및 발현을 위하여 표적할 수 있다(예를 들면, PCT 공보 WO 92/06180, WO 92/22635, WO92/20316, WO93/14188 또는 WO 93/20221). In another embodiment, the nucleic acid-ligand complex may consist of a ligand comprising a fusogenic viral peptide that destroys the endosome, thereby helping to avoid lysosomal degradation of the nucleic acid. In another embodiment, the nucleic acid can be targeted for cell specific uptake and expression in vivo by targeting specific receptors (eg, PCT publications WO 92/06180, WO 92/22635, WO92 / 20316, WO93 / 14188 or WO 93/20221).

택일적으로, 상기 핵산은 세포내로 도입되고, 발현을 위하여 숙주 세포 DNA내로 상동성 재조합에 의해 합병될 수 있다(Koller and Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA.;86:8932-5; Zijlstra et al, (1989) Nature.;342:435-8).Alternatively, the nucleic acid can be introduced into cells and merged by homologous recombination into host cell DNA for expression (Koller and Smithies, (1989) Proc Natl Acad Sci USA .; 86: 8932-5; Zijlstra et al , (1989) Nature .; 342: 435-8).

특이적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터를 사용하였다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다(Miller et al, (1993) Methods Enzymol.;217:581-99). 상기 레트로바이러스 벡터는 이러한 바이러스 유전체를 확실히 패키징(packaging)하고, 숙주 세포의 DNA로 삽입하기위해 필요한 조성물을 함유한다. 상기 항체 또는 비항체 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 개체 내로의 유전자 전달을 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 벡터로 클로닝되어 유전자 치료에 사용될 수 있다. 레트로 바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 설명은 보어슨 등이 (1994) Biotherapy.;6:291-302에서 화학치료에 대하여 더욱 내성있는 줄기 세포를 만들기 위해 mdr 1 유전자를 조혈모세포로 전달 시 레트로바이러스의 사용에 대하여 기술한 것에서 찾을 수 있다. 유전자 치료에서 레트로바이러스 베거의 사용에 대한 다른 참조는 하기에서 나타내었다: Clowes et al, (1994) J Clin Invest. ;93: 644-51; Keim et al, (1994) Blood.;83:1467-73; Salmons and Gunzberg, (1993) Hum gene Ther.;4: 129-41; Grossman and Wilson, (1993) Curr Opin Genet Dev.;3:l 10-4.In specific embodiments, viral vectors containing nucleic acid sequences encoding antibodies of the invention or fragments thereof are used. For example, retroviral vectors can be used (Miller et. al , (1993) Methods Enzymol .; 217: 581-99). The retroviral vector contains the necessary composition to reliably package this viral genome and insert it into the DNA of the host cell. Nucleic acid sequences encoding such antibody or non-antibody binding proteins can be cloned into one or more vectors to facilitate gene transfer into an individual and used for gene therapy. A more detailed description of retroviral vectors is described in Bohrson et al. (1994) Biotherapy .; 6: 291-302 using retroviruses to deliver mdr 1 genes to hematopoietic stem cells to make stem cells more resistant to chemotherapy. It can be found in the description for. Other references for the use of retroviral vega in gene therapy are shown below: Clowes et al , (1994) J Clin Invest. 93: 644-51; Keim et al , (1994) Blood .; 83: 1467-73; Salmons and Gunzberg, (1993) Hum gene Ther .; 4: 129-41; Grossman and Wilson, (1993) Curr Opin Genet Dev .; 3: l 10-4.

아데노바이러스는 유전자 치료에서 사용가능한 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 특히 호흡 상피를 통한 유전자 전달을 위해서 매력적인 매체이다. 아데노바이러스는 자연적으로 호흡 상피를 통하여 감염되어 가벼운 질병을 일으킨다. 아데노바이러스-기반 전달 시스템의 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 분열하지 않는 세포에도 감염할 가능성이 있다는 이점을 가지고 있다(Kozarsky and Wilson, in (1993) Curr Opin Genet Dev.;3:499-503, present a review of adenovirus-based gene therapy. Bout et al, in (1994) Hum gene Ther.;5:3-10, demonstrates the use of adenovirus vectors to transfer gene to the respiratory epithelia of rhesus monkeys. Other instances of the use of adenoviruses in gene therapy can be found in Rosenfeld et al, (1991) Science. ;252:431-4; Rosenfeld et αl., (1992) cell. ;68: 143-55; Mastrangeli et αl., (1993) J Clin Invest. ;91 :225-34; PCT 공보 WO94/12649; Wang et al, (1995) gene Ther.;2:775-83). 바람직한 구체예에서, 아데노바이러스 벡터를 사용하였다.Adenoviruses are other viral vectors that can be used in gene therapy. Adenoviruses are an attractive medium, especially for gene delivery through the respiratory epithelium. Adenoviruses naturally infect the respiratory epithelium and cause mild disease. Other targets of adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells, and muscle. Adenoviruses have the advantage of infecting even non-dividing cells (Kozarsky and Wilson, in (1993) Curr Opin Genet Dev .; 3: 499-503, present a review of adenovirus-based gene therapy.Bout et al , in (1994) Hum gene Ther .; 5: 3-10, demonstrates the use of adenovirus vectors to transfer gene to the respiratory epithelia of rhesus monkeys. Other instances of the use of adenoviruses in gene therapy can be found in Rosenfeld et al , (1991) Science. 252: 431-4; Rosenfeld et al ., (1992) cell. 68: 143-55; Mastrangeli et a l ., (1993) J Clin Invest. 91: 225-34; PCT publication WO94 / 12649; Wang et al , (1995) gene Ther .; 2: 775-83). In a preferred embodiment, adenovirus vectors were used.

아데노-연관 바이러스(AAV) 역시 유전자 치료에 사용될 수 있다(Walsh et al, (1993) Proc Soc Exp Biol Med.;204:289-300; 미국 특허번호 5436146).Adeno-associated viruses (AAV) can also be used for gene therapy (Walsh et. al , (1993) Proc Soc Exp Biol Med .; 204: 289-300; US Patent No. 5436146).

유전자 치료의 다른 접근법은 전기 천공법, 리포펙션(lipofection), 인산 칼슘 매개 형질 도입 또는 바이러스 감염과 같은 방법을 통해서 조직 배양에서 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 전달 방법은 세포에 대한 선별 마커를 전달하는 것을 포함한다. 상기 세포는 전달된 유전자를 받아들이고 발현하는 세포들을 분리하여 선별되어 자리잡게 된다. 그리고 나서, 이들 세포는 개체내로 옮겨진다.Other approaches of gene therapy include delivering genes into cells in tissue culture through methods such as electroporation, lipofection, calcium phosphate mediated transduction or viral infection. In general, the method of delivery involves delivering a selection marker for the cell. The cells are isolated and selected to segregate cells that receive and express the delivered gene. Then, these cells are transferred into the individual.

본 명세서의 구체예에서, 상기 핵산은 결과적인 재조합 세포를 생체 내로 투여하기 전에 세포 내로 도입될 수 있다. 그러한 도입은 형질 도입, 전기 천공법, 미세 주입법, 상기 핵산서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리아파지 벡터를 이용한 감염, 세포 융합, 유전체 매개 유전자 전달, 미세 세포 매개 유전자 전달, 스페로플라스트(spheroplast) 융합 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 당업계에서 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 따른, 수령 세포가 파괴되지 않는 발생학적 및 생리학적 요구에 응하는, 외래 유전자를 세포 내로 도입하기위한 다양한 기술들이 당업계에서 공지이며(Loeffler and Behr, (1993) Methods Enzymol.;217:599-618; Cotton et al, 1993, Methods Enzymol.;217:618-44; Cline MJ. Pharmacol Ther. 1985;29(l):69-92.), 이들을 사용할 수 있다. 상기 기술은 핵산이 세포에 의해 발현되고, 바람직하게는 그 세포 자손에 대해서도 유전되고 발현되기 위해서, 세포 내로의 핵산의 안정된 전달을 위해 제공된다.In embodiments herein, the nucleic acid may be introduced into the cell prior to administration of the resulting recombinant cell in vivo. Such introduction may include transduction, electroporation, microinjection, infection with the viral or bacterial phage vector containing the nucleic acid sequence, cell fusion, genome mediated gene transfer, micro cell mediated gene transfer, spherooplast fusion, etc. It can be carried out using any method known in the art, including but not limited to. According to the present invention, various techniques for introducing foreign genes into cells in response to developmental and physiological requirements in which recipient cells are not destroyed are known in the art (Loeffler and Behr, (1993) Methods Enzymol .; 217 : 599-618; Cotton et al , 1993, Methods Enzymol .; 217: 618-44; Cline MJ. Pharmacol Ther. 1985; 29 (l): 69-92.), These may be used. The technique is provided for stable delivery of nucleic acid into a cell so that the nucleic acid is expressed by the cell, and preferably also inherited and expressed for that cell progeny.

결과적인 재조합 세포는 당업계에서 알려진 다양한 방법에 의해 개체내로 전달될 수 있다. 재조합 혈액 세포(예를 들면, 조혈모세포 또는 전구 세포)는 바람직하게는 정맥 내로 투여된다. 세포의 양은 원하는 효과, 환자의 상태 등에 의존한 용도를 위해 구상되며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.The resulting recombinant cell can be delivered into an individual by various methods known in the art. Recombinant blood cells (eg, hematopoietic stem or progenitor cells) are preferably administered intravenously. The amount of cells is envisioned for use depending on the desired effect, the condition of the patient and the like and can be determined by one skilled in the art.

세포는 핵산으로, 임의의 바라는 바의, 상피 세포, 내피 세포, 케라티노부위(keratinocytes), 섬유 세포, 근육 세포, 조혈 세포; T 림프구, B 림프구, 단핵 세포, 대식 세포, 중성구, 호산구, 다핵 세포, 과립구; 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히, 예를 들면, 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간 등에서 얻을 수 있는 조혈모세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 사용가능한 세포 유형을 포함하는 유전자 치료의 목적을 달성하기 위하여 도입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 개체내로의 자가 유전자 치료를 위하여 사용되었다.Cells are nucleic acids, as desired, epithelial cells, endothelial cells, keratinocytes, fiber cells, muscle cells, hematopoietic cells; T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, multinuclear cells, granulocytes; To achieve the purpose of gene therapy comprising a variety of stem or progenitor cells, in particular, usable cell types, including but not limited to hematopoietic stem cells obtainable from, eg, bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, fetal liver, etc. Can be introduced. In a preferred embodiment, the cells were used for autologous gene therapy into the subject.

한 구체예에서, 재조합 세포는 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산서열을 세포 내로 도입하여, 그들이 상기 세포 도는 그들의 자손으로부터 발현되고, 상기 재조합 세포를 치료 효과를 위해 in vivo으로 투여하는 유전자 치료에 사용되었다. 특이인 구체예에서, 줄기 또는 전구 세포가 사용되었다. 시험관 조건으로 분리되고 유지될 수 있는 임의의 줄기 및/또는 전구세포라면 본 발명의 구체예에 따라 가능성 있게 사용될 수 있다(예를 들면, PCT 공보 WO 94/08598; Stemple and Anderson, (1992) cell.;71:973-85; Rheinwald. (1980) Methods cell Biol.;21 A:229-54; Pittelkow and Scott, (1986) Mayo Clin Proc.;61:771-7).In one embodiment, the recombinant cells incorporate a nucleic acid sequence encoding an antibody or fragment thereof into the cells, where they are expressed from the cell or their progeny and used for gene therapy in which the recombinant cells are administered in vivo for therapeutic effect. It became. In specific embodiments, stem or progenitor cells were used. Any stem and / or progenitor cell that can be isolated and maintained in vitro conditions can possibly be used according to embodiments of the invention (eg PCT Publication WO 94/08598; Stemple and Anderson, (1992) cell 71: 973-85; Rheinwald. (1980) Methods cell Biol .; 21 A: 229-54; Pittelkow and Scott, (1986) Mayo Clin Proc .; 61: 771-7).

특이적인 구체예에서, 상기 핵산이 암호화하는 영역에서 실시가능 하도록 연결된, 유도 가능한 프로모터와 상기 핵산의 발현이 전사의 인두서(inducer)의 존재 또는 부재를 조절함으로써 조절되는 것을 포함하는 유전자 치료의 목적을 위해서 도입될 수 있다. 게다가, 본 발명은 REG4를 중화시키는 기능을 포함하는 항체를 유도하기위한 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 유효 성분으로서 REG4; 면역학적 활성형의 REG4 단편; 또는 이와 같은 것을 발현할 수 있는 DNA 또는 세포를 포함한다. 택일적으로, 본 발명은 REG4에 대한 중화 기능을 포함하는 항체를 유도시키기 위한 면역원성 조성물의 제조에서의 REG4; 면역학적 활성형의 REG4 단편; 또는 이와 같은 것을 발현할 수 있는 DNA 또는 세포의 용도에 관한 것이다.In a specific embodiment, the purpose of gene therapy comprising controlling the presence or absence of an inducible promoter and an inducer of transcription that is operably linked in a region encoding the nucleic acid, by controlling the presence or absence of an inducer of transcription. Can be introduced for In addition, the present invention provides immunogenic compositions for inducing antibodies comprising a function of neutralizing REG4, wherein the composition comprises REG4 as an active ingredient; REG4 fragment of immunologically active form; Or DNA or cells capable of expressing the same. Alternatively, the invention provides REG4 in the preparation of an immunogenic composition for inducing an antibody comprising a neutralizing function against REG4; REG4 fragment of immunologically active form; Or it relates to the use of DNA or cells capable of expressing the same.

본 발명에서, 자가분비/측분비를 통해 세포 증식을 촉진하는 REG4 활성의 중화는 항REG4 항체를 투여함으로써 달성될 수 있다. 그래서, REG4 항체가 in vivo에서 유도될 수 있다면, 항체 투여에 따른 치료 효과의 평형에 도달할 수 있을 것이다. 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 투여할 때, 표적 항체가 in vivo에서 유도될 수 있다. 상기 본 발명의 면역원성 조성물은 REG4를 발현하는 세포에 대한 백신 치료로서 특히 유용하다. 이로써, 상기 본 발명의 면역원성 조성물은 예를 들면, 췌장암 치료를 위한 백신 조성물로 효과적이다.In the present invention, neutralization of REG4 activity that promotes cell proliferation via autosecretion / lateral secretion can be achieved by administering an antiREG4 antibody. Thus, if REG4 antibodies can be induced in vivo, equilibrium of therapeutic effects following antibody administration can be reached. When administering an immunogenic composition comprising an antigen, the target antibody can be induced in vivo. The immunogenic composition of the present invention is particularly useful as a vaccine treatment for cells expressing REG4. As such, the immunogenic compositions of the present invention are effective, for example, as vaccine compositions for the treatment of pancreatic cancer.

본 발명의 면역원성 조성물은 유효 성분으로서, REG4 또는 면역학적 활성형의 REG4 단편을 포함할 수 있다. 상기 면역학적 활성형의 REG4 단편은 REG4를 인지하여 항REG4 항체를 유도시킬 수 있고, 중화 기능을 포함하는 것을 지칭한다. 하기에서, REG4 및 면역학적 활성형의 REG4 단편을 면역원성 단백질로서 기술하였다. 주어진 단편이 표적 항체를 유도시키는지는 실험동물을 면역화 시킨 다음, 유도된 항체의 활성을 확인하는 것으로 결정될 수 있다. 항체 유도 및 그의 활성의 확인은, 예를 들면, 실시예에서 기술한 방법을 사용하여 도출될 수 있다. The immunogenic composition of the present invention may comprise, as an active ingredient, REG4 or an REG4 fragment of an immunologically active form. The REG4 fragment of the immunologically active form is capable of recognizing REG4 to induce antiREG4 antibodies, and refers to the inclusion of neutralizing function. In the following, REG4 and immunologically active REG4 fragments are described as immunogenic proteins. Whether a given fragment induces a target antibody can be determined by immunizing the experimental animal and then confirming the activity of the induced antibody. Antibody induction and confirmation of its activity can be derived, for example, using the methods described in the Examples.

상기 본 발명의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체뿐만 아니라 유효성분으로 면역원성 단백질을 포함한다. 만약 필요하다면, 상기 조성물은 또한 에주반트와 함께 결합될 수 있다. 사멸시킨 결핵 박테리아, 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), 사포닌(saponin) 등이 에주반트로서 사용될 수 있다. The immunogenic composition of the present invention includes an immunogenic protein as an active ingredient as well as a pharmaceutically acceptable carrier. If necessary, the composition may also be combined with an adjuvant. Killed tuberculosis bacteria, diphtheria toxoid, saponin and the like can be used as the adjuvant.

택일적으로, 면역원성 단백질을 암호화하는 DNA 또는 이러한 DNA를 발현 가능한 상태로 보유하는 세포를 면역원성 조성물로서 사용할 수 있다. 면역원으로서 표적 항원을 발현하는 DNA, DNA 백신이라고 불리는 것을 사용하기위한 방법은 공지이다. DNA 백신은 REG4 또는 그의 단편을 암호화하는 DNA를 적당한 발현 벡터로 삽입함으로써 얻을 수 있다. Alternatively, DNAs encoding immunogenic proteins or cells bearing such DNAs in an expressible state can be used as immunogenic compositions. As immunogens, methods for using a DNA, which expresses a target antigen, called a DNA vaccine are known. DNA vaccines can be obtained by inserting DNA encoding REG4 or fragments thereof into a suitable expression vector.

레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 또는 이러한 것들을 벡터로서 사용할 수 있다. 게다가, 면역원성 단백질을 암호화하는 DNA와 같은 DNA는 프로모터 하류와 DNA 자체로서 세포 내로 직접적으로 도입되어 발현될 수 있도록 기능적으로 연결되어 있다. DNA 자체는 리포좀 또는 바이러스 외피 벡터로 캡슐화된 후 세포내로 도입될 수 있다. Retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, or the like can be used as the vector. In addition, DNA, such as DNA encoding immunogenic proteins, is functionally linked to be introduced and expressed directly into cells downstream of the promoter and as the DNA itself. The DNA itself can be encapsulated in liposomes or viral envelope vectors and then introduced into the cell.

위에서 특별히 언급한 바와 같이, 본 발명은 REG4에 대한 중화 기능을 포함하는 항체를 유도하기위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 REG4; 면역학적 활성형의 REG4 단편; 또는 이와 같은 것을 발현시킬 수 있는 DNA 또는 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 췌장암과 같은 REG4를 발현하는 세포의 세포 성장을 억제하는 중화 기능을 포함하는 항체를 유도한다. 그 결과로써, 췌장암 등을 위한 치료 효과를 가질 수 있다.As specifically mentioned above, the present invention provides a method for inducing an antibody comprising a neutralizing function for REG4, the method comprising: REG4; REG4 fragment of immunologically active form; Or administering DNA or cells capable of expressing the same. The method according to the invention induces antibodies comprising a neutralizing function which inhibits cell growth of cells expressing REG4 such as pancreatic cancer. As a result, it may have a therapeutic effect for pancreatic cancer and the like.

KIAA010을 차단하는 지배적 장애 단백질:Dominant disorder proteins that block KIAA010:

본 발명은 QKGIGEFF(서열번호 46)을 포함하는 억제성 폴리펩티드에 관한 것이다. 어떤 바람직한 구체예에서, 상기 억제성 폴리펩티드는 QKGIGEFF(서열번호 46); 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동일한 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성된 펩티드의 생물학적 기능을 가지지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 40으로 기재되는 아미노산 서열은 국제공개특허 제WO2004/31412호에 기재되어 있다. 암세포 증식은 상기 아미노산 서열의 발현을 억제함으로써 조절될 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 아미노산 서열에서 특이적으로 돌연변이된 서열을 포함하는 단편이 상기 암세포 증식을 억제하는 것은 본 발명자들에 의해 새롭게 밝혀졌다.The present invention relates to inhibitory polypeptides comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46). In certain preferred embodiments, the inhibitory polypeptide is QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46); A polypeptide functionally identical to the polypeptide; Or a polynucleotide encoding the polypeptide, wherein the polypeptide does not have a biological function of the peptide consisting of SEQ ID NO: 40. The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 is described in WO2004 / 31412. It is known that cancer cell proliferation can be regulated by inhibiting the expression of the amino acid sequence. However, it has been newly discovered by the inventors that fragments containing sequences specifically mutated in the amino acid sequence inhibit the cancer cell proliferation.

본 발명의 상기 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 암세포 증식을 억제할 수 있는 길이이면, 어떠한 길이도 될 수 있다. 특히, 상기 아미노산 서열의 길이는 8 내지 70 잔기, 예를 들면, 8 내지 50, 바람직하게는 8 내지 30, 더욱 특이적으로는 8 내지 20, 더욱더 바람직하게는 8 내지 16 잔기 범위일 수 있다. 예를 들면, 상기 아미노산 서열 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44는 상기 기술된 선택된 아미노산 서열로 바람직하다. 따라서 상기 아미노산 서열 TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45를포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드는 본 발명에서 상기 폴리펩티드의 바람직한 예이다. 또한, 아미노산 서열 QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 폴리펩티드는 "PIP 결합 모티프(PIP 박스)"로 여겨질 수 있다.The polypeptide comprising the selected amino acid sequence of the present invention may be any length as long as it can inhibit cancer cell proliferation. In particular, the length of the amino acid sequence may range from 8 to 70 residues, for example 8 to 50, preferably 8 to 30, more specifically 8 to 20, even more preferably 8 to 16 residues. For example, the amino acid sequence VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44 is preferred with the selected amino acid sequence described above. Thus, the polypeptide comprising or consisting of the amino acid sequence TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45) is a preferred example of the polypeptide in the present invention. In addition, a polypeptide of the invention characterized by the amino acid sequence QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46) may be considered a "PIP binding motif (PIP box)".

본 발명의 폴리펩티드는 두 개 이상의 "선택된 아미노산 서열"을 포함할 수 있다. 상기 두 개 이상의 "선택된 아미노산 서열"은 상기 아미노산 서열과 같거나 상이할 수 있다. 추가로, 상기 "선택된 아미노산 서열"은 직접적으로 연결될 수 있다. 또한, 이것들은 중간에 어떠한 개입한 서열(intervening sequences)과 함께 배열될 수 있다.Polypeptides of the invention may comprise two or more "selected amino acid sequences". The two or more “selected amino acid sequences” may be the same as or different from the amino acid sequence. In addition, the “selected amino acid sequences” may be directly linked. They can also be arranged with any intervening sequences in between.

추가로, 본 발명은 본 명세서에서 특별히 기재한 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 상동체(즉, 서열의 동일성을 공유)에 관한 것이다. 본 발명에서, QKGIGEFF (서열번호 46 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드 상동체는 하나 또는 여러 개의 아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어떠한 돌연변이를 포함하는 것이고, 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 폴리펩티드와 기능적으로 동일한 것이다. 상기 문구 "상기 QKGIGEFF (서열번호 46 폴리펩티드와 기능적으로 동일한"은 PCNA와 KIAA0101의 결합을 차단하는 기능을 갖는 것을 나타낸다. 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 서열은 바람직하게는 QKGIGEFF (서열번호 46 폴리펩티드와 기능적으로 동일한 폴리펩티드를 구성하는 상기 아미노산 서열에 보존된다. 따라서 본 발명에서 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 펩티드에 기능적으로 동일한 폴리펩티드는 바람직하게는 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 서열을 제외한 위치에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 본 발명에서 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 펩티드에 기능적으로 동일한 폴리펩티드의 아미노산 서열은 QKGIGEFF (서열번호 46 서열을 보존하고, "선택된 아미노산 서열"에 60% 이상, 보통 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 또는 95% 이상 및 추가로 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성을 갖는다. 아미노산 서열 상동성은 당업자에게 잘 알려진 알고리듬, 예를 들면, BLAST 또는 ALIGN의 기본 셋팅을 이용함으로써 결정될 수 있다.In addition, the present invention provides a polypeptide homolog for the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 polypeptide, Sharing identity of sequences). In the present invention, a polypeptide homologue for a QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 polypeptide) includes any mutation selected from the group consisting of addition, deletion, substitution, and insertion of one or several amino acid residues, and the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 polypeptide) The phrase "QQGIGEFF (functionally identical to SEQ ID NO: 46 polypeptide") denotes having the function of blocking the binding of PCNA and KIAA0101. The QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 sequence is preferably QKGIGEFF (SEQ ID NO: The polypeptide is functionally conserved in the amino acid sequence constituting the same polypeptide as 46. Thus, in the present invention, a polypeptide functionally identical to the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 peptide) is preferably an amino acid mutation at a position other than the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 sequence). Has The amino acid sequence of the polypeptide functionally identical to the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 peptide) in the invention preserves the sequence of QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 and is at least 60%, usually at least 70%, preferably at least 80%, of the "selected amino acid sequence", More preferably at least 90%, or at least 95% and further more preferably at least 98% .Amino acid sequence homology is achieved by using an algorithm well known to those skilled in the art, for example, BLAST or ALIGN. Can be determined.

또한, 돌연변이될 아미노산의 수는 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 펩티드의 활성이 유지되는 한 제한되지 않는다. 일반적으로 대략 50개 이상의 아미노산, 바람직하게는 대략 30개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게는 대략 10개 이상의 아미노산 및 더욱더 바람직하게는 대략 3개 이상의 아미노산이 돌연변이될 수 있다. 유사하게, 돌연변이될 위치는 상기 돌연변이에 의해 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 펩티드의 활성이 파괴되지 않는 한 제한되지 않는다.In addition, the number of amino acids to be mutated is not limited as long as the activity of the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 peptide is maintained. Generally, at least about 50 amino acids, preferably at least about 30 amino acids, more preferably at least about 10 or more Amino acids and even more preferably about 3 or more amino acids may be mutated.Similarly, the position to be mutated is not limited unless the mutation disrupts the activity of the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 peptide).

바람직한 구체예에서, 상기 QKGIGEFF (서열번호 46 펩티드의 상기 활성은 KIAA0101 발현세포, 즉, 췌장암세포, 전립선암세포, 유방암세포 및 방광암세포에서 세포자멸사 유도 효과를 포함한다. 세포자멸사는 세포 스스로 유발한 세포 죽음을 의미하고, 프로그래밍된 세포 죽음으로 불린다. 세포자멸사 중의 세포에서는 핵 염색체의 응축, 핵의 단편화 또는 세포질의 응축이 관찰된다. 세포자멸사를 검출하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들면, 세포자멸사는 TUNEL 염색법(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling; Gavrieli et al.,(1992) J. Cell Biol. 119: 493-501, Mori et al.,(1994) Anat. & Embryol. 190: 21-28)에 의해 검증될 수 있다. 또한, DNA 래더 검사법, 아넥신 V 염색법, 카스파아제 검사법, 전자현미경 또는 핵 또는 세포막에서 형태적 변화의 관찰 등의 방법도 세포자멸사를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 키트들도 세포자멸사에 의해 유도된 세포에서의 상기 행동양식들을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포자멸사의 검출 키트는 하기 공급업자들로부터상업적으로 구입가능할 것이다:In a preferred embodiment, said activity of said QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 peptide) comprises an apoptosis-inducing effect in KIAAOlOl expression cells, ie, pancreatic cancer cells, prostate cancer cells, breast cancer cells and bladder cancer cells. It refers to death and is called programmed cell death In cells during apoptosis, condensation of the nuclear chromosome, fragmentation of the nucleus, or condensation of the cytoplasm is observed, and methods for detecting apoptosis are well known. TUNEL staining (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling; Gavrieli et al., (1992) J. Cell Biol. 119: 493-501, Mori et al., (1994) Anat. & Embryol. 190: 21- 28) In addition, methods such as DNA ladder assay, Annexin V staining, caspase assay, electron microscopy or observation of morphological changes in the nucleus or cell membrane can also be used. Commercially available kits can also be used to detect the behaviors in cells induced by apoptosis, for example, the detection kits for apoptosis are Will be commercially available from:

랩캠사(LabChem Inc.),LabChem Inc.,

프로메가(Promega), Promega,

BD 바이오사이언스 파민젠(BD Biosciences Pharmingen), BD Biosciences Pharmingen,

캘바이오켐(Calbiochem), Calbiochem,

다카라 바이오사(클론테크사)[Takara Bio Company(CLONTECH Inc.)], Takara Bio Company (CLONTECH Inc.),

케미콘 인터네셔날 사(CHEMICON International, Inc), CHEMICON International, Inc.,

메디칼 & 바이올로지칼 래보러터리 사(Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.) 등.Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.

본 발명의 폴리펩티드는 선택된 아미노산 서열에 근거하여, 화학적으로 합성될 수 있다. 일반적인 펩티드 화학에서 사용되는 방법은 폴리펩티드의 합성 방법을 위해 사용될 수 있다. 특히, 상기 방법들은 하기 문헌 및 일본 특허 출원에서 기술된 것들을 포함한다:Polypeptides of the invention can be chemically synthesized based on selected amino acid sequences. The methods used in general peptide chemistry can be used for methods of synthesizing polypeptides. In particular, the methods include those described in the following documents and Japanese patent applications:

Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976;

Peputido gousei (Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1975; Peputido gousei (Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1975;

Peputido gousei no kiso to jikken (Fundamental 및 Experimental Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1985; Peputido gousei no kiso to jikken (Fundamental and Experimental Peptide Synthesis), Maruzen (Inc.), 1985;

Iyakuhin no kaihatsu (Development of Pharmaceuticals), Sequel, Vol. 14: Peputido gousei (Peptide Synthesis), Hirokawa Shoten, 1991; Iyakuhin no kaihatsu (Development of Pharmaceuticals), Sequel, Vol. 14: Peputido gousei (Peptide Synthesis), Hirokawa Shoten, 1991;

International Patent Publication WO99/67288. International Patent Publication WO99 / 67288.

또한 본 발명의 폴리펩티드는 이미 알려진 유전공학기술에 의해서도 합성될 수 있다. 유전공학 기술의 예를 하기와 같다. 특히, 목적 펩티드를 암호화하는 DNA는 적절한 숙수 세포에 도입됨으로써 형질전환된 세포로 제조된다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 형질전환된 세포에서 생산된 폴리펩티드를 회수함으로써 수득될 수 있다. 또한, 목적 폴리펩티드는 단백질 합성에 필요한 성분들이 세포외(in vitro)에서 재구성된, 세포외 번역계(translation system)에 의해서도 합성될 수 있다.Polypeptides of the invention can also be synthesized by known genetic engineering techniques. Examples of genetic engineering techniques are as follows. In particular, the DNA encoding the peptide of interest is made into transformed cells by introduction into appropriate pluripotent cells. Polypeptides of the invention can be obtained by recovering a polypeptide produced in the transformed cell. In addition, the polypeptide of interest can also be synthesized by an extracellular translation system in which the components necessary for protein synthesis are reconstituted in vitro .

유전공학기술이 사용될 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 융합된 단백질의 형태로 발현될 수 있다. 목적 융합단백질을 발현하기 위한 벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 상이한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 동일한 리딩 프레임(reading frame)으로 연결한 후, 이를 발현 벡터에 도입함으로써 수득 될 수 있다. 상기 융합단백질은 상기 벡터를 적절한 숙주에 형질전환함으로써 발현될 수 있다. 융합단백질 형성에 사용되는 상이한 펩티드는 하기 펩티드들을 포함한다:When genetic engineering techniques are used, the polypeptides of the invention can be expressed in the form of proteins fused with peptides having different amino acid sequences. A vector for expressing a fusion protein of interest can be obtained by linking a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention with a polynucleotide encoding a different peptide in the same reading frame and then introducing the same into an expression vector. The fusion protein can be expressed by transforming the vector into a suitable host. Different peptides used to form fusion proteins include the following peptides:

FLAG(Hopp et al.,(1988) BioTechnology 6, 1204-10),FLAG (Hopp et al., (1988) BioTechnology 6, 1204-10),

6개의 His(histidine: 히스티딘) 잔기를 포함하는 6xHis, 10xHis,6xHis, 10xHis, containing six His (histidine) residues,

인플루엔자 헤마글루티닌(Influenza hemagglutinin: HA),Influenza hemagglutinin (HA),

인간 c-myc 단편, Human c-myc fragment,

VSV-GP 단편, VSV-GP fragment,

p18 HIV 단편,p18 HIV fragment,

T7-태그, T7 Tag,

HSV-태그, HSV-Tag,

E-태그, E-Tag,

SV40T 항원 단편, SV40T antigen fragment,

lck 태그, lck tag,

α-튜불린 단편, α-tubulin fragment,

B-태그, B-Tag,

단백질 C 단편, Protein c fragment,

GST(glutathione-S-transferase: 글루타치온-S-전이효소), Glutathione-S-transferase (GST),

HA(인플루엔자 헤마글루티닌), HA (influenza hemagglutinin),

면역단백질 불변 지역, Immunoprotein constant region,

β-갈락토시다아제, 및β-galactosidase, and

MBP(maltose-binding protein: 말토오스 결합 단백질).Maltose-binding protein (MBP).

본 발명의 폴리펩티드는 상기 융합단백질을 적절한 프로테아제로 처리한 후, 목적 폴리펩티드를 회수함으로써 수득 될 수 있다. 상기 폴리펩티드를 정제하기 위해서는, 상기 융합단백질에 결합하는 친화도 크로마토그래피를 이용하여 상기 융합단백질이 포획된 후, 프로테아제로 처리될 수 있다. 상기 프로테아제의 처리에 의해, 목적 폴리펩티드는 친화도 크로마토그래피로부터 분리되고, 상기 고순도의 목적 폴리펩티드가 회수된다.The polypeptide of the present invention can be obtained by treating the fusion protein with an appropriate protease and then recovering the desired polypeptide. In order to purify the polypeptide, the fusion protein may be captured using affinity chromatography that binds to the fusion protein and then treated with a protease. By treatment of the protease, the target polypeptide is separated from the affinity chromatography and the high purity target polypeptide is recovered.

본 발명의 폴리펩티드는 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에서, 용어 "변형된"는 예를 들면, 다른 물질과 결합된 것을 나타낸다. 따라서 본 발명에서, 본 발명의 폴리펩티드는 추가로 세포막 투과성 물질과 같은 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 다른 물질은 펩티드, 지질, 다당류 및 다양한 자연발생 또는 합성 중합체와 같은 유기 화합물을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 KIAA0101와 PCNA의 결합을 억제하는 목적 활성을 가질 수만 있다면, 어떠한 변형도 가질 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 억제성 폴리펩티드는 PCNA에 결합하기 위해 KIAA0101과 직접적으로 경쟁할 수 있다. 또한 변형은 본 발명의 폴리펩티드에 추가의 기능을 수여할 수도 있다. 상기 추가의 기능의 예로는 표적성, 전달성 및 안정성을 포함한다.Polypeptides of the invention include modified polypeptides. In the present invention, the term "modified" refers to, for example, combined with other materials. Thus, in the present invention, the polypeptide of the present invention may further include other materials such as cell membrane permeable materials. Such other materials include organic compounds such as peptides, lipids, polysaccharides and various naturally occurring or synthetic polymers. The polypeptide of the present invention may have any modification as long as it can have the desired activity of inhibiting the binding of KIAAOlOl to PCNA. In some embodiments, the inhibitory polypeptide may compete directly with KIAAOlOl to bind PCNA. Modifications may also confer additional functionality to the polypeptides of the invention. Examples of such additional functions include targetability, deliverability and stability.

본 발명에서 변형의 바람직한 예로는 예를 들면, 세포막 투과성 물질의 도입을 포함한다. 보통, 상기 세포내 구조물은 세포막에 의해 외부와 차단된다. 따라서, 세포로 외부 물질을 효과적으로 도입하는 것은 어렵다. 세포막 투과성 물질로 상기 폴리펩티드를 변형함으로써 본 발명의 폴리펩티드에 세포막 투과성이 수여될 수 있다. 그 결과, 본 발명의 폴리펩티드를 세포와 접촉시킴으로써, 상기 폴리펩티드는 세포로 전달되어 그곳에서 활성을 나타낼 수 있다.Preferred examples of modifications in the present invention include, for example, the introduction of cell membrane permeable substances. Usually, the intracellular structure is blocked from outside by the cell membrane. Therefore, it is difficult to effectively introduce foreign substances into cells. By modifying the polypeptide with a cell membrane permeable substance, cell membrane permeability can be conferred to the polypeptide of the present invention. As a result, by contacting a polypeptide of the invention with a cell, the polypeptide can be delivered to the cell and exhibit activity there.

상기 "세포막 투과성 물질"은 세포질로 유입되기 위해 포유동물 세포막으로 침투될 수 있는 물질을 나타낸다. 예를 들면, 임의의 리포솜은 세포 내로 함유 성분을 방출하기 위해 상기 세포막과 융합된다. 반면에, 임의의 종류의 폴리펩티드는 세포 안쪽으로 유입되기 위해 포유동물 세포의 세포질 막으로 침투된다. 그러한 세포-유입 활성을 갖는 폴리펩티드의 경우, 본 발명에서 세포질 막 등은 물질로서 바람직하다. 특히, 본 발명은 하기 일반식을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.The "cell membrane permeable substance" refers to a substance that can penetrate into a mammalian cell membrane to enter the cytoplasm. For example, any liposome is fused with the cell membrane to release the containing component into the cell. On the other hand, any kind of polypeptide penetrates into the cytoplasmic membrane of mammalian cells for entry into the cell. In the case of a polypeptide having such cell-inducing activity, the cytoplasmic membrane and the like in the present invention are preferred as the substance. In particular, the present invention includes polypeptides having the following general formula.

[R]-[D]; [R]-[D];

여기서, here,

[R]은 세포막 투과성 물질을 대표한다; [D]는 QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 단편 서열을 대표한다. 상기 기술된 일반식에서, [R] 및 [D]는 직접적으로 연결되거나 링커를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 다중 작용기를 가지는 펩티드 등은 링커로서 사용될 수 있다. 특이적으로는, -GGG- 를 포함하는 아미노산 서열이 링커로 사용될 수 있다. 또한, 세포막 투과성 물질 및 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드는 미립자의 표면에 결합될 수 있다. [R]은 [D]의 어느 위치에도 연결될 수 있다. 특이적으로, [R]은 [D]의 N 말단 또는 C 말단에 연결될 수 있거나, [D]를 치환하는 아미노산의 곁사슬에 연결될 수 있다. 추가로, 하나 이상의 [R] 분자가 하나의 [D] 분자에 연결될 수 있다. 상기 [R] 분자는 상기 [D] 분자 상의여러 위치에 도입될 수 있다. 또한, [D]는 여러 개가 함께 연결된 [R]으로 변형될 수 있다.[R] represents a cell membrane permeable material; [D] represents a fragment sequence comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46. In the general formulas described above, [R] and [D] can be linked directly or indirectly through a linker. Peptides with multiple functional groups Etc. Specifically, an amino acid sequence comprising -GGG- can be used as the linker, and a polypeptide comprising a cell membrane permeable material and the selected sequence can be bound to the surface of the microparticles. [R] may be linked to any position of [D] Specifically, [R] may be linked to the N or C terminus of [D], or may be linked to the side chain of an amino acid substituting [D] In addition, one or more [R] molecules may be linked to one [D] molecule, and the [R] molecules may be introduced at various positions on the [D] molecule. Can be transformed into [R] linked together .

예를 들면, 세포막 투과성을 가지는, 다양한 자연발생 또는 인공적으로 합성된 폴리펩티드들이 보고되고 있다(Joliot A. & Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004; 6: 189-96). 상기 알려진, 모든 세포막 투과성 물질들은 본 발명에서 폴리펩티드를 변형하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서, 예를 들면, 하기 군으로부터 선택된 임의의 물질도 상기 세포-투과성 물질로 사용될 수 있다:For example, various naturally occurring or artificially synthesized polypeptides with cell membrane permeability have been reported (Joliot A. & Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004; 6: 189-96). All cell membrane permeable materials, known above, can be used to modify polypeptides in the present invention. In the present invention, for example, any material selected from the following group may be used as the cell-permeable material:

폴리-알지닌; Matsushita et al.,(2003) J. Neurosci.; 21, 6000-7.Poly-arginine; Matsushita et al., (2003) J. Neurosci .; 21, 6000-7.

[Tat / RKKRRQRRR](서열번호 47) Frankel et al.,(1988) Cell 55,1189-93.[Tat / RKKRRQRRR] (SEQ ID NO: 47) Frankel et al., (1988) Cell 55, 1189-93.

Green & Loewenstein(1988) Cell 55, 1179-88.Green & Loewenstein (1988) Cell 55, 1179-88.

[Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK](서열번호 48)[Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK] (SEQ ID NO 48)

Derossi et al.,(1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50.Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50.

[Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](서열번호 49)[Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK] (SEQ ID NO 49)

Park et al.,(2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50.Park et al., (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50.

[Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](서열번호 50)[Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL] (SEQ ID NO: 50)

Pooga et al.,(1998) FASEB J. 12, 67-77.Pooga et al., (1998) FASEB J. 12, 67-77.

[MAP(model amphipathic peptide) / KLALKLALKALKAALKLA](서열번호 51)[Model amphipathic peptide (MAP) / KLALKLALKALKAALKLA] (SEQ ID NO: 51)

Oehlke et al.,(1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39.Oehlke et al., (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39.

[K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP](서열번호 52)[K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP] (SEQ ID NO: 52)

Lin et al.,(1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-8.Lin et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14255-8.

[Ku70 / VPMLK](서열번호 53)[Ku70 / VPMLK] (SEQ ID NO 53)

Sawada et al.,(2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.

[Ku70 / PMLKE](서열번호 61)[Ku70 / PMLKE] (SEQ ID NO: 61)

Sawada et al.,(2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.Sawada et al., (2003) Nature Cell Biol. 5, 352-7.

[Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](서열번호 54)[Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP] (SEQ ID NO: 54)

Lundberg et al.,(2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90. Lundberg et al., (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90.

[pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK](서열번호 55)[pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK] (SEQ ID NO 55)

Elmquist et al.,(2001) Exp. Cell Res. 269, 237-44.Elmquist et al., (2001) Exp. Cell Res. 269, 237-44.

[Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](서열번호 56)[Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV] (SEQ ID NO: 56)

Morris et al.,(2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6.Morris et al., (2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6.

[SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR](서열번호 57)[SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR] (SEQ ID NO 57)

Rousselle et al.,(2000) Mol. Pharmacol. 57, 679-86.Rousselle et al., (2000) Mol. Pharmacol. 57, 679-86.

[Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY](서열번호 58)[Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY] (SEQ ID NO 58)

Gao et al.,(2002) Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65.Gao et al., (2002) Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65.

[HN-1 / TSPLNIHNGQKL](서열번호 59)[HN-1 / TSPLNIHNGQKL] (SEQ ID NO: 59)

Hong & Clayman(2000) Cancer Res. 60, 6551-6.Hong & Clayman (2000) Cancer Res. 60, 6551-6.

본 발명에서, 세포막 투과성 물질의 예로 상기 기술된, 상기 폴리-아르기닌은 많은 수의 아르기닌 잔기로 구성되어 있다. 특이적으로, 예를 들면, 연속적인 5-20개의 아르기닌 잔기로 구성되어 있다. 바람직한 아르기닌 잔기의 개수는 11개이다(서열번호 60).In the present invention, the poly-arginine described above as an example of cell membrane permeable material is composed of a large number of arginine residues. Specifically, it consists of 5-20 arginine residues, for example. Preferred number of arginine residues is 11 (SEQ ID NO: 60).

QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 약학적 조성물QKGIGEFF (Pharmaceutical composition comprising SEQ ID NO: 46

본 발명의 폴리펩티드는 암세포의 증식을 억제한다. 따라서 본 발명은 QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함하는 암 치료 및/또는 예방용 약제를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 암 치료 및/또는 예방용 약학적 조성물의 제조에 본 발명의 폴리펩티드를 이용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 암의 종류는 암세포에서 KIAA0101의 발현이 증가하는 한 제한되지는 않는다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 췌장암, 폐암, 전립선암, 유방암, 방광암, 신장암 또는 고환종양의 치료에 유용하다. 이들 중, 췌장암은 본 발명의 치료 또는 예방을 위한 표적으로 특히 바람직하다.Polypeptides of the invention inhibit the proliferation of cancer cells. Accordingly, the present invention provides a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cancer comprising QKGIGEFF (polypeptide comprising SEQ ID NO: 46 or a polynucleotide encoding the same) as an active ingredient. In addition, the present invention relates to the use of the polypeptide of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of cancer. The kind of cancer that can be prevented is not limited as long as the expression of KIAAOl101 is increased in cancer cells, for example, the polypeptide of the present invention is used for the treatment of pancreatic cancer, lung cancer, prostate cancer, breast cancer, bladder cancer, kidney cancer or testicular tumor. Of these, pancreatic cancer is particularly preferred as a target for the treatment or prevention of the present invention.

또한, 본 발명의 상기 억제성 폴리펩티드는 암세포의 세포자멸사를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함하는 세포의 세포자멸사 유도제를 제공한다. 본 발명의 상기 세포자멸사 유도제는 암과 같은 세포 증식성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 암의 종류는 암세포에서 KIAA0101의 발현이 증가하는 한 제한되지는 않는다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 췌장암, 폐암, 전립선암, 유방암, 방광암, 신장암 또는 고환종양의 치료에 유용하다. 이들 중, 췌장암은 본 발명의 치료 또는 예방을 위한 표적으로 특히 바람직하다. 또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 세포자멸사를 유도하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포자멸사 유도용 약학적 조성물의 제조에 본 발명의 폴리펩티드를 이용하는 용도에 관한 것이다.In addition, the inhibitory polypeptide of the present invention can be used to induce apoptosis of cancer cells. Accordingly, the present invention provides an apoptosis inducer of cells comprising as an active ingredient a polypeptide comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46 or a polynucleotide encoding it). The apoptosis inducer of the present invention is a cell proliferative disorder such as cancer. The kind of cancer that can be treated or prevented by the present invention is not limited as long as the expression of KIAAOl101 in cancer cells is increased, for example, the polypeptide of the present invention is for pancreatic cancer, lung cancer, prostate cancer. It is useful for the treatment of breast cancer, bladder cancer, kidney cancer or testicular tumor, among which pancreatic cancer is particularly preferred as a target for the treatment or prevention of the present invention. In addition, the present invention relates to a method for inducing apoptosis. A use of the polypeptide of the invention in the preparation of

본 발명의 상기 억제성 폴리펩티드는 췌장암과 같은 KIAA0101-발현세포에서 세포자멸사를 유도한다. 동시에, KIAA0101의 발현은 대부분의 정상기관에서는 관찰되지 않는다. 일부 정상 기관에서 상기 KIAA0101의 발현 수준은 암 조직과 비교하여 상대적으로 낮다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 암세포에서 특이적으로 세포자멸사를 유도할 것이다.The inhibitory polypeptide of the present invention induces apoptosis in KIAA0101-expressing cells such as pancreatic cancer. At the same time, expression of KIAAOlOl is not observed in most normal organs. In some normal organs the expression level of KIAAOlOl is relatively low compared to cancer tissue. Thus, the polypeptides of the invention will induce apoptosis specifically in cancer cells.

본 발명의 폴리펩티드가 The polypeptide of the present invention

인간과 마우스, 래트, 기니아 피그, 래빗, 고양이, 개, 양, 돼지, 가축, 원숭이, 비비(baboon) 또는 침팬지의 암을 치료하거나 세포자멸사를 유도하기 위한 약제로서 본 발명의 폴리펩티드를 투여할 때, 분리된 화합물을 직접적으로 투여되거나 통상적인 약제 제조 방법을 이용하여 적절한 투여형(dosage form)으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 필요한 경우, 상기 약제는 당의정(sugar-coated tablet), 캡슐, 캡슐, 엘릭시르 및 마이크로캡슐 등으로 경구로 투여되거나, 살균 용액, 또는 물 또는 다른 약학적으로 허용가능한 액체와의 현탁액, 등의 주사 형태로 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물들은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 매개물, 특히 살균수, 생리적 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 착향료, 첨가제, 부형제, 보존제 및 결합제 등과 함께 일반적으로 허용되는 약제 제조를 위해 요구되는 단위 투약 형태로 혼합될 수 있다. 상기 제형에 포함되는 활성 성분의 양은 허용되는 지시된 범위 내에서 적절한 투약량이 된다.When administering a polypeptide of the invention as a medicament for treating cancer or inducing apoptosis in humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, livestock, monkeys, baboons or chimpanzees The isolated compounds may be administered directly or formulated into suitable dosage forms using conventional pharmaceutical preparation methods. For example, if necessary, the medicament may be administered orally in a sugar-coated tablet, capsule, capsule, elixir, microcapsules, or the like, or as a sterile solution or suspension with water or other pharmaceutically acceptable liquid, It can be administered parenterally in the form of an injection, for example. For example, the compounds are generally acceptable with pharmaceutically acceptable carriers or mediators, in particular with sterile water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, additives, excipients, preservatives and binders, and the like. It can be mixed in the unit dosage form required for the manufacture of a medicament. The amount of active ingredient included in the formulation is an appropriate dosage within the indicated and acceptable ranges.

정제 및 캡슐 내로 혼합될 수 있는 첨가물의 예로는 젤라틴(gelatin), 옥수수 전분(corn starch), 트래거캔스 검(tragacanth gum) 및 아라비아 검(arabic gum) 등의 결합제; 크리스탈린 셀룰로즈(crystalline cellulose) 등의 매개물; 옥수수 전분, 젤라틴 및 알긴산(alginic acid) 등의 팽윤제; 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 등의 윤활제; 수크로즈(sucrose), 락토오즈(lactose) 또는 사카린(saccharin) 등의 감미료; 페퍼민트(peppermint), 윈터그린 오일(wintergreen oil) 및 체리(cherry) 등의 착향료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단위-투약 형태가 캡슐일 때, 오일과 같은 액체 담체가 상기 성분에 추가로 포함될 수 있다. 주사용 살균 조성물은 주사용으로 적합한 증류수와 같은 매개물을 이용하여 일반적인 약제 실행을 따라서 제형될 수 있다.Examples of additives that can be mixed into tablets and capsules include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, and arabic gum; Media such as crystalline cellulose; Swelling agents such as corn starch, gelatin and alginic acid; Lubricants such as magnesium stearate; Sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin; Flavoring agents such as peppermint, wintergreen oil and cherry. When the unit-dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oil may additionally be included in the component. Sterile compositions for injection may be formulated according to conventional pharmaceutical practice using a medium such as distilled water suitable for injection.

생리적 식염수, 당, 및 디-솔비톨(D-sorbitol), 디-만노오즈(D-mannnose), 디-만니톨(D-mannitol) 및 염화나트륨(sodium chloride) 등의 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는 등장액은 주사용 수용액으로 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면, 알코올, 특히 에탄올 및 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의 폴리알코올(polyalcohol); 및 폴리솔베이트(Polysorbate) 80(TM) 및 HCO-50 등의 비-이온 계면활성제; 등의 적절한 가용화제와 함께 사용될 수 있다.Physiological saline, sugars, and isotonic solutions, including adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannnose, D-mannitol, and sodium chloride. Silver may be used as the aqueous solution for injection. These include, for example, alcohols, in particular ethanol and polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; And non-ionic surfactants such as Polysorbate 80 (TM) and HCO-50; It may be used together with a suitable solubilizer.

참기름 또는 대두유는 유성액(oleaginous liquid)으로 사용될 수 있고, 또한 가용화제로서 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate) 또는 벤질 알코올(benzyl alcohol)과 함께 사용될 수 있다. 또한, 인산 완충용액(phosphate buffer) 및 아세트산 나트륨 완충용액(sodium acetate buffer) 등의 완충용액; 염산 프로카인(procaine hydrochloride) 등의 진통제; 벤질 알코올(benzyl alcohol) 및 페놀(phenol) 등의 안정제; 및 항-산화제(anti-oxidant)와 함께 제형될 수 있다. 이렇게 제조된 주사제는 적합한 앰풀(ampoule) 내로 채워질 수 있다.Sesame oil or soybean oil may be used as an oleaginous liquid and may also be used with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer. In addition, buffer solutions such as phosphate buffer and sodium acetate buffer; Analgesics such as procaine hydrochloride; Stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; And anti-oxidants. The injection so prepared can be filled into a suitable ampoule.

본 발명의 약학적 조성물은 예를 들면, 동맥(intraarterial) 주사, 정맥(intravenous) 주사 또는 경피(percutaneous) 주사, 또는 유사하게는 비강 내(intranasal) 투여, 경기관지(transbronchial) 투여, 근육 내(intramuscular) 투여 또는 경구(oral) 투여 등의 당업자에게 잘 알려진 방법들로 환자들에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 환자의 체중 및 나이, 및 투여 방법에 따라 투여량 및 투여 방법은 달라질 수 있으나, 당업자는 적절한 투여 방법을 일반적으로 선택할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 유전자 치료를 위해 벡터 내로 삽입될 수 있고, 치료를 위해 상기 벡터를 투여할 수 있다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중, 나이 및 증상에 따라 다르나 당업자는 이를 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하고 이의 활성을 조절하는 화합물의 투여량은 증상에 따라 약간씩 달라질 수는 있지만, 상기 투약량은 정상적인 성인(체중 60 ㎏)에게 경구로 투약할 때, 일반적으로 일당 대략 0.1 ㎎ 내지 대략 100 ㎎이고, 바람직하게는 일당 대략 1.0 ㎎ 내지 대략 50 ㎎이고, 더욱 바람직하게는 일당 약 1.0 ㎎ 내지 약 20 ㎎이다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be used, for example, by intraarterial injection, intravenous injection or percutaneous injection, or similarly intranasal administration, transbronchial administration, intramuscular ( It can be used for administration to patients by methods well known to those skilled in the art, such as intramuscular administration or oral administration. The dosage and method of administration may vary depending on the weight and age of the patient and the method of administration, but one of ordinary skill in the art will generally select an appropriate method of administration. DNA encoding a polypeptide of the invention can be inserted into a vector for gene therapy and the vector can be administered for treatment. Dosage and method of administration will vary depending on the weight, age and symptoms of the patient, but one of ordinary skill in the art can select one as appropriate. For example, the dosage of a compound that binds to and modulates the activity of a polypeptide of the invention may vary slightly depending on the condition, but the dosage is generally given orally to normal adults (60 kg body weight). From about 0.1 mg to about 100 mg per day, preferably from about 1.0 mg to about 50 mg per day, more preferably from about 1.0 mg to about 20 mg per day.

상기 화합물을 정상적인 성인(체중 60 ㎏)에게 주사의 형태로 비경구로 투여할 때, 환자, 표적 기관, 증상 및 투여방법들에 따라 일부 차이가 있음에도, 일당 대략 0.01 ㎎ 내지 약 30 ㎎이고, 바람직하게는 일당 대략 0.1 ㎎ 내지 대략 20 ㎎이고, 더욱 바람직하게는 일당 대략 0.1 ㎎ 내지 대략 10 ㎎으로 정맥 내 주사하는 것이 바람직하다. 유사하게 다른 동물의 경우에 있어서도, 적절한 투여량은 체중 60 ㎏에 대한 투여량의 변환에 의해 일반적으로 계산될 수 있다.When the compound is parenterally administered to a normal adult (60 kg body weight) in the form of an injection, it is preferably about 0.01 mg to about 30 mg per day, although there are some differences depending on the patient, the target organ, the symptoms, and the administration methods. Is about 0.1 mg to about 20 mg per day, more preferably intravenously at about 0.1 mg to about 10 mg per day. Similarly for other animals, the appropriate dosage can generally be calculated by the conversion of the dose to 60 kg of body weight.

약학적 조성물:Pharmaceutical Compositions:

따라서, 본 발명은 암 예방 및 치료에 유용한 약제 및 방법을 포함한다. 상기 약제 및 방법은 REG4 또는 KIAA0101의 발현을 억제하는 siRNA, REG4의 활성을 중화시키는 항체, QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동일한 폴리펩티드; 또는 본 발명의 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나의, 세포 증식성 질환의 약화 또는 정지시킬 수 있는 정도의 유효량을 포함한다. 더욱 특이적으로는, 본 발명의 문맥에 있어서, 약학적으로 유효한 량은 치료될 개체의 증상의 발전을 차단하거나 경감시키기에 효과적인 양을 의미한다.Accordingly, the present invention includes agents and methods useful for the prevention and treatment of cancer. The agents and methods include siRNA that inhibits the expression of REG4 or KIAAOlOl, an antibody that neutralizes the activity of REG4, a QKGIGEFF (polypeptide comprising SEQ ID NO: 46; a polypeptide functionally identical to the polypeptide; or encoding the polypeptide of the invention At least one of the polynucleotides comprises an effective amount to attenuate or arrest the cell proliferative disease More specifically, in the context of the present invention, a pharmaceutically effective amount is determined by the condition of the subject to be treated. A quantity effective to block or mitigate power generation.

본 발명의 방법으로 치료될 개체는 예를 들면, 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암을 포함하는 암에 걸린 개체는 모두 포함한다. 상기 개체들에는 예를 들면, 인간, 개, 고양이, 말, 소 또는 염소 등의 척추동물; 또는 다른 모든 동물, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 가축 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 마커 단백질의 향상된 발현은 하나 또는 두 개의 마커 단백질에 대한 평균 세포내 마커 단백질 농도, 즉, 상기 마커 단백질의 적어도 0%, 바람직하게는 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 세포내 정상 평균 농도 이상인 것을 나타낸다.Individuals to be treated by the methods of the invention include all individuals with cancer, including, for example, pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. Such individuals include, for example, vertebrates such as humans, dogs, cats, horses, cows or goats; Or all other animals, especially commercially important animals or livestock. For the purposes of the present invention, enhanced expression of a marker protein is characterized by an average intracellular marker protein concentration for one or two marker proteins, ie at least 0%, preferably 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% or higher than normal mean concentration in cells.

본 발명의 문맥에 있어서, 적합한 약학적 조성물 제형들은 경구, 직장, 코, 국부[구강(buccal) 및 설하선(sub-lingual)을 포함], 질(vaginal) 또는 비경구(근육 내, 피하, 및 정맥 내를 포함) 투여, 또는 흡입(inhalation) 또는 통기(insufflation)에 의한 투여에 적합한 제형을 포함한다. 정맥 내 투여가 바람직하다. 상기 제형들은 개별 투약량 단위로 선택적으로 포장된다.In the context of the present invention, suitable pharmaceutical composition formulations are oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sub-lingual), vaginal or parenteral (intramuscular, subcutaneous, and Formulations suitable for administration by intravenous) or by inhalation or insufflation. Intravenous administration is preferred. The formulations are optionally packaged in individual dosage units.

경구 투여를 위해 적합한 약학적 제형들은 사전에 각각에 대해 결정된 활성 성분의 양을 포함하는 캡슐, 교갑(cachet) 또는 정제를 포함한다. 또한, 적합한 제형들은 분말, 과립, 용액, 현탁액 및 에멀젼(emulsion)을 포함한다. 상기 활성 성분은 선택적으로 덩어리 연약(bolus electuary) 또는 연고(paste)로 투여될 수 있다. 경구 투여용 정제 및 캡슐은 락토오즈, 수크로즈, 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는 당과 같은 충진제, 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스(hydroxypropylmethyl-cellulose), 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 및/또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone: PVP) 등과 같은 셀룰로오스 제형, 결합제, 윤활제, 및/또는 습윤제 등과 같은 일반적인 부형제를 포함할 수 있다. 원한다면, 교차 연결된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨(sodium alginate)과 같은 이들의 염 등과 같은 분해제(disintegrating agent)가 추가될 수 있다.Pharmaceutical formulations suitable for oral administration include capsules, cachets or tablets which contain an amount of active ingredient previously determined for each. Suitable formulations also include powders, granules, solutions, suspensions and emulsions. The active ingredient may optionally be administered in a bolus electuary or ointment. Tablets and capsules for oral administration include fillers such as sugars, including lactose, sucrose, mannitol or sorbitol, corn starch, wheat starch, rice starch, potato starch, gelatin, tragacanth gum, methyl cellulose, hydroxypropylmethyl Cellulose formulations such as hydroxypropylmethyl-cellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone (PVP), and the like, and common excipients such as binders, lubricants, and / or wetting agents. Can be. If desired, disintegrating agents such as cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, or salts thereof such as alginic acid or sodium alginate can be added.

정제는 선택적으로 하나 이상의 제형 성분으로 압축(compression) 또는 몰딩(molding)에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제들은 선택적으로 바인더(binder), 윤활제(lubricant), 불활성 희석제(inert diluent), 윤활 및 표면 활성제 및/또는 분산제(dispersing agent)로 혼합된 분말 또는 과립 등의 자유 유동성(free-flowing) 형태로 활성 성분들을 적절한 기계에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제들은 분말화된 화합물을 비활성 희석액으로 적신 혼합물을 적절한 기계로 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 상기 정제들은 당업계에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다. 경구용 액제(Oral fluid preparation)는 예를 들면, 수성(aqueous) 또는 유성(oily) 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽(syrup) 또는 엘릭시르(elixir)의 형태가 될 수 있거나, 사용하기 전에 물 또는 다른 적합한 담체와 함께 구성하기 위해 건조물(dry product)로서 제시될 수 있다. 상기 액제는 현탁제, 에멀젼화제, 비수성 담체(식용유를 포함할 수 있음), pH 유지제 및/또는 보존제 등의 일반적인 첨가제들을 포함할 수 있다. 상기 정제들은 활성 성분의 서방형 또는 방출조절을 제공하기 위해 선택적으로 제형화될 수 있다. 정제의 포장은 한 달에 한번 한 알의 정제를 섭취하도록 한다.Tablets may be made by compression or molding, optionally with one or more formulation ingredients. Compressed tablets are optionally free-flowing, such as powders or granules mixed with binders, lubricants, inert diluents, lubricating and surfactants and / or dispersing agents. It can be prepared by compressing the active ingredients in a suitable machine in the form. Molded tablets can be made by molding in a suitable machine a mixture moistened with a powdered compound with an inert diluent. The tablets may be coated by methods well known in the art. Oral fluid preparations may be, for example, in the form of aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or elixirs, or may be water or other prior to use. It may be presented as a dry product for constitution with a suitable carrier. The solution may include common additives such as suspending agents, emulsifiers, non-aqueous carriers (which may include cooking oil), pH maintainers and / or preservatives. The tablets may be optionally formulated to provide sustained release or controlled release of the active ingredient. Packaging tablets requires one tablet per month.

비경구 투여에 적합한 제형으로는 수성 및 비수성 살균 주사액을 포함하고, 현탁제 및/또는 농유제를 포함하는 수성 및 비수성 살균 현탁액뿐만 아니라, 선택적으로 항산화제, 완충용액, 세균발육저해제(bacteriosta) 및 예정된 수령자의 혈액과 등장의 제형이 되게 하는 용질을 포함한다. 상기 제형들은 예를 들면, 봉인된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial) 등의 단위 투약량 또는 다중-투약량 용기들로 제시될 수 있고, 사용 바로 전에 염(saline) 또는 주사액(water-for-injection) 등의 살균 액체 담체를 첨가할 필요가 있는, 동결-건조된(감압하에 동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 또한, 상기 제형들은 연속적인 주입으로 제시될 수 있다. 즉석 주입용액 및 현탁액들은 상기 기재된 종류의 살균된 분말, 과립 및 정제들로부터 제조될 수 있다. Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions, optionally as well as aqueous and non-aqueous sterile suspensions containing suspending and / or agrochemicals, as well as antioxidants, buffers, bacteriostases. ) And a solute that results in a formulation of isotonic blood and intended recipient. The formulations may be presented in unit dose or multi-dose containers, such as, for example, sealed ampoules and vials, and may be used as saline or water-for-injection just prior to use. It may be stored in a freeze-dried (lyophilized state under reduced pressure), where it is necessary to add a sterile liquid carrier. The formulations may also be presented in continuous infusion. Instant infusion solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules and tablets of the kind described above.

직장 투여를 위해 적합한 제형은 코코아 버터(cocoa butter) 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol) 등의 표준 담체를 가지는 좌제(suppository)를 포함한다. 예를 들면, 구강 또는 설하 등의 입으로의 국부적 투여에 적절한 제형은, 활성 성분에 당 및 아카시아, 또는 트래거캔스(tragacanth), 및 선향(pastille) 등의 향신료(flavored base)를 포함하고, 활성 성분에 젤라틴 및 글리세린, 또는 당 및 아카시아 등의 염을 포함하는 로젠지(lozenge)를 포함한다. 비강 내 투여의 경우, 본 발명의 화합물들은 액체 스프레이, 분산성 분말(dispersible powder) 또는 드롭(drop) 형태로 사용될 수 있다. 드롭(Drop)은 하나 이상의 분산제, 가용제 및/또는 현탁제를 포함하는 수성 또는 비수성 염으로 제형될 수 있다.Suitable formulations for rectal administration include suppositories with standard carriers such as cocoa butter or polyethylene glycol. For example, formulations suitable for topical administration to the mouth, such as oral or sublingual, include flavored bases such as sugar and acacia, or tragacanth, and pastille in the active ingredient, Active ingredients include lozenges comprising salts such as gelatin and glycerin, or sugars and acacia. For intranasal administration, the compounds of the present invention can be used in the form of liquid sprays, dispersible powders or drops. Drops may be formulated with an aqueous or non-aqueous salt comprising one or more dispersants, solubilizers and / or suspending agents.

설하 투여의 경우, 화합물은 취입기(insufflator), 네뷸라이저(nebulizer), 압입된 팩(pressurized pack) 또는 다른 편리한 전달 수단의 에어로졸 스프레이(aerosol spray)로부터 편리하게 전달될 수 있다. 압입된 팩은 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오르메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소(carbon dioxide) 또는 다른 적합한 가스 등의 적절한 추진제(propellant)를 포함할 수 있다. 압입된 에어로졸의 경우, 투약량 단위는 측정된 양을 운반하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.For sublingual administration, the compound may be conveniently delivered from an aerosol spray by an insufflator, nebulizer, pressurized pack or other convenient delivery means. Indented packs may contain suitable propellants such as dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. have. In the case of indented aerosols, dosage units can be determined by providing a valve that delivers a measured amount.

또한, 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation) 투여의 경우, 화합물은 예를 들면, 상기 화합물과 락토오즈 또는 전분 등의 적합한 분말기제가 혼합된 분말과 같은 건조한 분말 조성물의 형태일 수 있다. 상기 분말 조성물은 예를 들면, 캡슐, 카트리지(cartridge), 젤라틴 또는 발포 팩(blister pack)과 같은 단위 투약량 형태로 제시될 수 있고, 상기 분말은 흡입기 또는 취입기를 이용하여 투여될 수 있다.In addition, for inhalation or insufflation administration, the compound may be in the form of a dry powder composition such as, for example, a powder in which the compound is mixed with a suitable powder base such as lactose or starch. The powder composition may be presented in unit dosage form such as, for example, a capsule, cartridge, gelatin or blister pack, and the powder may be administered using an inhaler or blower.

다른 제형으로는 매몰식(implantable) 장치 및 치료제를 방출하는 접착형 패치(adhesive patche)를 포함한다.Other formulations include implantable devices and adhesive patches that release the therapeutic agent.

활성 성분이 서방형으로 방출되는 것이 요구될 땐, 이에 적당한 상기 기재된 제형들이 적용될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 항균제, 면역보조제 및/또는 보존제 등의 다른 활성 성분을 포함할 수 있다.When it is desired for the active ingredient to be released in sustained release, the formulations described above suitable for this can be applied. In addition, the pharmaceutical composition may include other active ingredients such as antibacterial agents, adjuvant and / or preservatives.

상기 특별히 언급된 성분들을 첨가하는 것은, 본 발명의 제형에 당업계에서 보편적인 제형 유형과 관련된 다른 약제를 포함할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위한 적합한 제형은 착향료를 포함할 수 있다.It is to be understood that the addition of the components specifically mentioned above may include other agents related to formulation types common in the art in the formulations of the present invention. For example, suitable formulations for oral administration may include flavoring agents.

임의의 첨가제가 더 바람직할지는, 투여 경로, 투여될 검사 화합물의 농도, 또는 상기 치료법이 단백질, 상기 검사 화합물을 암호화하는 핵산, 또는 상기 활성 성분으로 검사 화합물을 분비할 수 있는 세포 등을 포함하는 약제들을 이용하는지 여부에 따라 다른 것은 당업자에게 자명한 것이다.Optional additives may be more preferred, such as the route of administration, the concentration of the test compound to be administered, or a medicament comprising a protein, a nucleic acid encoding the test compound, or a cell capable of secreting the test compound with the active ingredient. Other things will be apparent to those skilled in the art depending on whether they are used.

본 발명의 약학적 조성물은 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있고, 예를 들면, 일반적인 혼합, 용해, 정제화, 당의정 제형, 가루화, 유화, 캡슐화, 봉입 또는 동결건조 공정 등에 의해 제조될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 다를 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared by well known methods and can be prepared, for example, by general mixing, dissolving, tableting, dragee formulations, powdering, emulsifying, encapsulating, encapsulating or lyophilizing processes, and the like. . Proper formulation may vary depending upon the route of administration chosen.

투여 및 투여 일정Dosing and Dosing Schedule

당업자는 특히 본 명세서에서 상세히 기술한 내용에 비추어, 본 발명의 약제에 적합한 유효 투여량을 적절하게 선택할 수 있다. 검사 화합물의 치료적 유효 투여량은 처음에 세포 배양 검사 및/또는 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들면, 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC50(세포의 50%가 원하는 효과를 나타내는 투여량)을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해, 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 또한 검사 화합물의 세포독성 및 치료 효능은 예를 들면, LD50(개체군의 50%가 치사하는 투여량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료효과를 나타내는 투여량)을 결정하기 위해, 세포 배양에서의 표준 약학적 절차 또는 실험적 동물에 의해 결정될 수 있다. 세포독성 및 치료 효능 사이의 투여량 비는 치료 지표(즉, LD50 및 ED50의 비)이다. 높은 치료 지표를 나타내는 화합물이 바람직하다. 상기 세포배양 검사 및 동물 연구로부터 수득한 정보는 인간에게 이용하기 위한 투여량 결정에 사용될 수 있다. 상기 화합물의 투여량은 세포독성이 매우 적거나 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위에서 결정될 수 있다. 상기 투여량은 적용된 제형 및 사용될 투여 경로에 따라 상기 범위에서 결정될 수 있다. 상기 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태에 따라 개별적인 치료자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, Fingl 외(1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1 을 참고하시오. 투여량 및 투여간격은 상기 활성 검사 화합물의 원하는 효과를 유지하기에 충분한 혈장 내 함유량을 제공하도록 개인에 따라 조절될 수 있다.One of ordinary skill in the art can appropriately select an effective dosage suitable for the medicaments of the present invention, particularly in light of the details set forth herein. A therapeutically effective dose of a test compound can be initially determined from cell culture tests and / or animal models. For example, it can be formulated in an animal model to achieve a range of circulating concentrations comprising an IC 50 (a dose at which 50% of the cells exhibit the desired effect) as determined in cell culture. In addition, the cytotoxicity and therapeutic efficacy of the test compound can be determined, for example, by cell culture to determine LD 50 (the dose at which 50% of the subjects are lethal) and ED 50 (the dose at which 50% of the subjects are therapeutic). Can be determined by standard pharmaceutical procedures in or by experimental animals. The dose ratio between toxic and therapeutic effect is treatment cell index (that is, LD 50 And Ratio of ED 50 ). Preference is given to compounds which exhibit a high therapeutic index. The information obtained from these cell culture assays and animal studies can be used to determine dosage for use in humans. The dosage of the compound can be determined in a range of circulating concentrations that include ED 50 with very little or no cytotoxicity. The dosage may be determined in this range depending upon the dosage form applied and the route of administration to be used. The exact formulation, route of administration and dosage can be determined by the individual therapist depending on the condition of the patient. For example, Fingl et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. See 1 p1. Dosages and intervals may be adjusted by the individual to provide sufficient plasma content to maintain the desired effect of the active test compound.

특히, 상술한 각각의 상황에 따라, 상기 조성물, 예를 들면, 폴리펩티드 및 유기 화합물들은 일당 대략 0.1 내지 대략 250 ㎎/㎏ 범위의 투여량이 경구 또는 주사로 투여될 수 있다. 성인의 경우, 상기 투여량은 일반적으로 일당 대략 5 ㎎ 내지 대략 17.5, 바람직하게는 일당 대략 5 ㎎ 내지 대략 10 g 및 가장 바람직하게는 일당 대략 100 mg 내지 대략 3 g이다. 분리된 단위들로 제공되는 정제 또는 다른 단위 투약량 형태들은 특정 투여량 또는 예를 들면, 대략 5 ㎎ 내지 대략 500 ㎎, 보통 대략 100 ㎎ 내지 대략 500 ㎎ 등을 포함하는 동일한 단위로 다수의 투여량에 효과적인 양을 편리하게 포함할 수 있다.In particular, depending on each of the situations described above, the compositions, eg, polypeptides and organic compounds, may be administered orally or by injection in a range of from about 0.1 to about 250 mg / kg per day. For adults, the dosage is generally from about 5 mg to about 17.5 per day, preferably from about 5 mg to about 10 g per day and most preferably from about 100 mg to about 3 g per day. Tablets or other unit dosage forms provided in discrete units may be formulated in multiple dosage forms at the same unit, including a specific dosage or, for example, about 5 mg to about 500 mg, usually about 100 mg to about 500 mg, and the like. Effective amounts may be conveniently included.

상기 투여량은 개체의 나이 및 성별, 치료될 정확한 질환 및 심각도 등을 포함하는 많은 인자에 의해 결정될 수 있다. 또한, 상기 투여 경로도 질병의 상태에 따라 달라질 수 있다. 어떠한 경우에도, 적절한 최적의 투약량은 상기 기재된 인자를 고려하여 당업자에 의해 일반적으로 계산될 수 있다.The dosage can be determined by a number of factors including the age and sex of the individual, the exact disease and severity to be treated and the like. In addition, the route of administration may also vary depending on the condition of the disease. In any case, appropriate optimal dosages can generally be calculated by one skilled in the art, taking into account the factors described above.

일반적으로, 하나 이상의 REG4 또는 KIAA0101 억제제의 효과적이거나 유효한 량은 최초에는 REG4 및/또는 KIAA0101 억제제의 낮은 투여량 또는 적은 량을 투여한 후에 이후 단계적으로 복용량 및 투여량을 증가시키면서 결정할 수 있고, 및/또는 비정상의 REG4 및/또는 KIAA0101 과발현 또는 세포내 신호전달에 의한, 암을 억제 또는 예방하기 위한 원하는 효과가 독성의 부작용이 최소화되거나 없이, 치료될 개체에서 관찰될 때까지 필요한 만큼 2차로 REG4 및/또는 KIAA0101 억제제를 투여함으로써 결정할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 대해, 적절한 투여량 및 투여 일정을 결정하는 데에 이용될 수 있는 방법은 예를 들면, Goodman 및 Gilman의 The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, et al., Eds., McGraw-Hill(2006) 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia(USIP), Lippincott Williams & Wilkins(2005)에 기술되어 있고, 이들은 본 명세서에 참조로서 포함된다.In general, an effective or effective amount of one or more REG4 or KIAAOlO inhibitors may be determined initially with low or small doses of the REG4 and / or KIAAOlO inhibitors, followed by incremental doses and dosages, and / or Or REG4 and / or secondary as needed until abnormal effects of REG4 and / or KIAA0101 overexpression or intracellular signaling have the desired effect for inhibiting or preventing cancer observed in the subject to be treated, with or without minimal side effects of toxicity. Or by administering a KIAAOl101 inhibitor. For administration of the pharmaceutical compositions of the present invention, methods that can be used to determine appropriate dosages and dosing schedules are described, for example, in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, et. al ., Eds., McGraw-Hill (2006) and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins (2005). It is incorporated by reference into the specification.

유전자 치료Gene therapy

REG4 또는 KIAA0101의 발현을 억제하는 상기 siRNA, REG4의 활성을 중화시키는 항체, KIAA0101/PCNA 결합 사이의 상호작용을 억제하는 것으로 분류된 세포 투과성 우성 장애 펩티드는 암환자에게 유전자 치료법을 이용하여 전달될 수 있다. 또한, 상기 중화 항체 또는 본 발명의 QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 폴리펩티드는 REG4의 활성 또는 KIAA0101/PCNA 결합을 직접적으로 변형하도록 사용될 수 있다. 어떤 측면에서, 유전자 치료 실시는 본 발명의 적절히 분류된 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 핵산 서열은 표적 세포에서 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 핵산은 상기 표적 세포의 게놈에 안정적으로 삽입될 수 있도록 구성될 수 있다(예를 들면, 상동체 재조합 카세트 벡터에 대해 설명한 Thomas 및 Capecchi,(1987) Cell 51:503을 참조).Cell-permeable dominant disorder peptides classified as inhibiting the interaction between the siRNA that inhibits the expression of REG4 or KIAA0101, the antibody that neutralizes the activity of REG4, KIAA0101 / PCNA binding can be delivered to cancer patients using gene therapy have. In addition, the neutralizing antibody or polypeptide comprising the QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46) of the present invention can be used to directly modify the activity of REG4 or KIAAOlOl / PCNA binding. In some aspects, gene therapy practice is appropriately classified A nucleic acid sequence encoding a peptide, in a preferred embodiment, the nucleic acid sequence comprises a regulatory element necessary for expression of the peptide in a target cell, wherein the nucleic acid is configured to be stably inserted into the genome of the target cell. (See, eg, Thomas and Capecchi, (1987) Cell 51: 503, described for homologous recombinant cassette vectors).

환자로의 상기 핵산의 전달은, 직접적인 방법, 예를 들면 환자를 상기 핵산 또는 핵산을 운반하는 벡터에 직접적으로 노출함으로써 또는 간적접인 방법, 예를 들면 세포를 일차적으로 상기 핵산으로 시험관에서 형질전환시킨 후, 상기 환자에게 이식함으로써 수행될 수 있다. 상기 두 가지 접근법은 각각 세포내(in vivo) 또는 세포외(ex vivo) 유전자 치료법으로 알려져 있다.The delivery of the nucleic acid to the patient can be carried out directly, for example by directly exposing the patient to the nucleic acid or the vector carrying the nucleic acid, or indirectly, for example, transforming a cell in vitro with the nucleic acid primarily. And then implanted into the patient. Each of these two approaches is intracellular ( in in vivo or extracellular ( ex vivo ) is known as gene therapy.

유전자 치료 방법에 대한 일반적인 리뷰를 위해서는 Goldspiel 외, (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu 및 Wu, (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev,(1993) Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol. 33:573-96; Mulligan, (1993) Science 260:926-32; 및 Morgan 및 Anderson, (1993) Ann . Rev . Biochem . 62:191-217;(1993) Trends Biotechnol. 11(5):155-215를 참조하시오. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당업계에 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel 외, (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; 및 Kriegler, (1990), Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY에 기술되어 있다.For a general review of gene therapy methods, see Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, (1993) Ann . Rev. Pharmacol . Toxicol . 33: 573-96; Mulligan, (1993) Science 260: 926-32; And Morgan and Anderson, (1993) Ann . Rev. Biochem . 62: 191-217; (1993) Trends Biotechnol. See 11 (5): 155-215. Methods generally known in the art of recombinant DNA techniques that can be used are described in Ausubel et al., ( Eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; And Kriegler, (1990), Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

암의 화학-방사선 치료 내성 진단Diagnosis of Chemo-radiotherapy Tolerance in Cancer

용어 "진단"은 예측 및 유사 분석을 포함하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 방법은 치료 개입, 질환 단계와 같은 진단 기준 및 질환의 모니터링 및 암의 감시 등을 포함하는 치료 방법을 고려하는 임상적 의사 결정에 사용되는 것으로 여겨진다. The term "diagnosis" is intended to include prediction and similar analysis. The methods of the present invention are believed to be used in clinical decision-making, taking into account treatment interventions, diagnostic criteria such as disease stages and methods of treatment, including monitoring of diseases, monitoring of cancer, and the like.

암의 화학-방사선 치료 내성 진단 방법Methods of Diagnosing Chemo-radiation Resistance in Cancer

상기 REG4의 발현은 수술 시료에서 췌장암의 화학-방사선 치료 내성에 걸린 환자에서 특히 향상되는 것으로 발견되었다. 따라서 본 발명에서 분류된 REG4 유전자 및 이의 전사 및 번역 산물은 암의 화학-방사선 치료 내성의 마커로서 및 세포 시료에서 상기 REG4 유전자의 발현을 측정함으로써 진단 효용이 발견되었고, 상기 암의 화학-방사선 치료 내성이 진단될 수 있다. 특히, 본 발명은 개체에서 REG4의 발현량을 결정함으로써 상기 암의 화학-방사선 치료 내성의 하기 진단 방법을 제공한다:The expression of REG4 was found to be particularly enhanced in patients with chemo-radiotherapy resistance of pancreatic cancer in surgical samples. Thus, the REG4 gene and its transcription and translation products classified in the present invention have been found to have diagnostic utility as markers of chemo-radiotherapy resistance in cancer and by measuring expression of the REG4 gene in cell samples, and chemo-radiotherapy of the cancer. Resistance can be diagnosed. In particular, the present invention provides the following diagnostic methods of chemo-radiotherapy resistance of said cancer by determining the expression level of REG4 in a subject:

[1] 환자-유래의 생물학적 시료에서 REG4 유전자의 발현량을 검출하는 단계; 및 검출된 발현량이 정상 대조군의 발현량에 비해 증가시, 개체가 화학-방사선 치료 내성의 암에 걸렸거나 화학-방사선 치료 내성의 위험 상태에 있다고 판단하는 단계를 포함하는 개체 내 암의 화학-방사선 치료 내성의 진단 방법.[1] detecting the expression level of REG4 gene in a patient-derived biological sample; And when the detected expression amount is increased compared to the expression level of the normal control group, determining that the individual has a cancer of chemo-radiotherapy resistance or is at risk for chemo-radiotherapy resistance. Method of diagnosis of treatment tolerance.

[2] [1]의 방법에 있어서, 상기 발현량은 상기 정상 대조군보다 적어도 10% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.[2] The method of [1], wherein the expression level is at least 10% or more than the normal control.

[3] [1]의 방법에 있어서,[3] The method of [1],

(a) 유전자의 mRNA를 검출하는 단계;(a) detecting the mRNA of the gene;

(b) 상기 유전자를 암호화하는 단백질을 검출하는 단계; 및,(b) detecting the protein encoding the gene; And,

(c) 상기 유전자를 암호화하는 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 단계;(c) detecting the biological activity of the protein encoding the gene;

를 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법에 의해 상기 발현량이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.The expression amount is determined by any one method selected from the group comprising.

[4] [3]의 방법에 있어서, 상기 발현량은 상기 유전자의 유전자 전사체에 혼성화된 탐침을 검출함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.[4] The method of [3], wherein the expression level is determined by detecting a probe hybridized to a gene transcript of the gene.

[5] [3]의 방법에 있어서, 상기 혼성화 단계는 DNA 어레이에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.[5] The method of [3], wherein the hybridization step is performed on a DNA array.

[6] [3]의 방법에 있어서, 상기 발현량은 상기 유전자의 발현량으로써 REG4 유전자에 의해 암호화된 단백질에 대한 항체의 결합을 검출함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.[6] The method of [3], wherein the expression level is determined by detecting the binding of the antibody to the protein encoded by the REG4 gene as the expression level of the gene.

[7] [1]의 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 생체검사(biopsy), 객담(sputum) 또는 혈액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.[7] The method of [1], wherein the biological sample comprises biopsy, sputum or blood.

[8] [1]의 방법에 있어서, 상기 개체에서 유래한 생물학적 시료는 상피세포(epithelial cell)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.[8] The method of [1], wherein the biological sample derived from the subject comprises epithelial cells.

[9] [1]의 방법에 있어서, 상기 개체에서 유래한 생물학적 시료는 암세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.[9] The method of [1], wherein the biological sample derived from the individual comprises cancer cells.

[10] [1]의 방법에 있어서, 상기 개체에서 유래한 생물학적 시료는 암성 상피세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.[10] The method of [1], wherein the biological sample derived from the individual comprises cancerous epithelial cells.

[11] [1]의 방법에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.[11] The method of [1], wherein the cancer is pancreatic cancer.

본 발명의 방법에 의해 진단될 개체는 포유동물이 바람직하다. 대표적인 포유동물로는 예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 개, 고양이, 말 또는 소 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The subject to be diagnosed by the method of the invention is preferably a mammal. Representative mammals can be, for example, but not limited to, humans, non-human primates, mice, rabbits, dogs, cats, horses, or cattle.

진단을 수행하기 위해서는 진단받을 개체로부터 생물학적 시료를 수집하는 것이 바람직하다. 결정을 위한 생물학적 시료로는 REG4의 목적 전사 또는 번역 산물을 포함하는 한 어떠한 생물학적 재료도 사용될 수 있다. 상기 생물학적 시료는 신체 조직 및 혈액, 객담 및 오줌과 같은 체액을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 상피세포, 더욱 바람직하게는 암성 상피세포 또는 암성이 의심되는 조직에서 유래한 상피세포를 포함하는 세포군을 포함한다. 추가로, 필요한 경우 상기 세포는 수득한 신체 조직 및 체액으로부터 정제될 수 있고, 이후 생물학적 시료로 사용될 수 있다.In order to perform a diagnosis, it is desirable to collect a biological sample from the individual to be diagnosed. Any biological material can be used as a biological sample for determination, as long as it contains the desired transcription or translation product of REG4. Such biological samples include, but are not limited to, body tissues and body fluids such as blood, sputum and urine. Preferably the biological sample comprises a cell group comprising epithelial cells, more preferably cancerous epithelial cells or epithelial cells derived from a suspected cancerous tissue. In addition, the cells can be purified from the body tissues and body fluids obtained, if necessary, and then used as biological samples.

본 발명에 따라서, REG4의 발현량은 개체에서 유래한 생물학적 시료로부터 결정된다. 상기 발현량은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전사(핵산) 산물의 양으로 결정될 수 있다. 예를 들면, REG4의 mRNA는 혼성화 방법(예를 들면, 노던 혼성화)에 의해 탐침을 사용하여 정량될 수 있다. 상기 검출은 칩 또는 어레이 상에서 수행될 것이다. 어레이의 용도는 REG4를 포함하는 다수의 유전자(예를 들면, 다양한 암에 특이적인 유전자)의 발현량을 검출하기에 적합하다. 당업자들은 상기 REG4의 서열 정보(서열번호 1 GenBank 접근번호 AY126670)를 이용하여 탐침 등을 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 REG4의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 필요한 경우, 상기 탐침은 적절한 표지, 예를 들면 염료, 형광 및 동위원소로 표지될 수 있고, 상기 유전자의 발현량은 상기 결합된 표지의 감도로써 검출될 수 있다.According to the present invention, the expression level of REG4 is determined from a biological sample derived from the individual. The expression amount can be determined by the amount of the transcription (nucleic acid) product using methods known in the art. For example, mRNA of REG4 can be quantified using probes by hybridization methods (eg, northern hybridization). The detection will be performed on a chip or array. The use of the array is suitable for detecting the expression level of a number of genes including REG4 (eg, genes specific for various cancers). Those skilled in the art can prepare a probe or the like using the sequence information of the REG4 (SEQ ID NO: 1 GenBank Accession No. AY126670). For example, the cDNA of REG4 can be used as a probe. If necessary, the probe can be labeled with a suitable label such as dye, fluorescence and isotope and the expression level of the gene can be detected with the sensitivity of the bound label.

추가로, 상기 REG4의 전사 산물은 증폭반응 기반 검출 방법(예를 들면, RT-PCR)에 의해 프라이머를 사용하여 정량화될 수 있다. 또한 상기 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보에 기반하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 실시예에서 사용된 상기 프라이머(서열번호 3 및 4)는 RT-PCR 또는 노던 블랏팅에 의한 검출에 이용될 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 특이적으로, 본 발명의 방법에서 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한, 적당히 엄격한 또는 낮은 엄격한 조건에서 REG4의 mRNA에 혼성화 된다. 본 명세서에서 사용된 문구 “엄격한(혼성화) 조건"은 작은 간섭 RNA( Small interfering RNA ) 부분에서 기재되었다.In addition, the transcription product of REG4 can be quantified using primers by amplification-based detection methods (eg RT-PCR). The primer can also be prepared based on available sequence information of the gene. For example, the primers (SEQ ID NOs: 3 and 4) used in the examples can be used for detection by RT-PCR or Northern blotting, but the present invention is not limited thereto. Specifically, the probes or primers used in the methods of the invention hybridize to mRNA of REG4 under stringent, moderately stringent or low stringent conditions. As used herein, the phrase “stringent (hybridization) conditions” refers to small interfering RNA ( Small interfering RNA ) section.

또한, 상기 번역 산물은 본 발명의 진단을 위해 검출될 수 있다. 예를 들면, 상기 REG4 단백질의 정량이 결정될 수 있다. 상기 단백질의 정량을 번역 산물로서 결정하는 방법은 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 면역검사 방법을 포함한다. 상기 항체는 단클론 또는 다클론일 수 있다. 추가로, 상기 항체의 단편 또는 변형된 항체(예를 들면, 키메라 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv 등)는 상기 REG4 단백질에 대한 결합력이 남아 있다면, 모두 검출에 사용될 수 있다. 단백질 검출을 위한 상기 항체 종류들을 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있는 어떠한 방법들도 상기 항체 및 이의 등가물을 제조하기 위해 본 발명에서 채택될 수 있다.In addition, the translation product can be detected for the diagnosis of the present invention. For example, the quantification of the REG4 protein can be determined. The method of determining the quantification of the protein as a translation product includes an immunoassay method using an antibody that specifically recognizes the protein. The antibody may be monoclonal or polyclonal. In addition, fragments or modified antibodies of the antibodies (eg, chimeric antibodies, scFv, Fab, F (ab ') 2, Fv, etc.) can all be used for detection provided that binding to the REG4 protein remains. . Methods for preparing the antibody types for protein detection can be employed in the present invention to prepare the antibodies and their equivalents, any method well known to those skilled in the art.

REG4 유전자의 발현량의 그의 번역 산물에 기반하여 검출하는 다른 방법으로는 REG4 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역화학적 분석을 통해 관찰된 염색 감도를 관찰하는 방법이 있다. 즉, 강한 염색의 관찰 결과는 상기 단백질의 발현량이 증가한 것과 동시에 상기 REG4 유전자의 고발현을 지시한다. 추가로, 상기 번역 산물은 이의 생물학적 활성에 기반하여 검출될 수 있다.Another method of detecting the expression level of the REG4 gene based on its translation product is to observe the staining sensitivity observed through immunochemical analysis using an antibody against the REG4 protein. That is, the observation of strong staining indicates that the expression level of the protein is increased and at the same time, the high expression of the REG4 gene is indicated. In addition, the translation product can be detected based on its biological activity.

REG4 유전자의 발현량이 대조군보다 증가한 경우, 예를 들면, 10%, 25%, 또는 50%; 또는 1.1 배 이상, 1.5 배 이상, 2.0 배 이상, 5.0 배 이상, 10.0 배 이상 또는 그 이상으로 증가한 경우, 생물학적 시료에서 REG4 유전자의 발현이 증가한 것으로 판단된다.When the expression level of the REG4 gene is increased than the control, for example, 10%, 25%, or 50%; Or increased by at least 1.1 times, at least 1.5 times, at least 2.0 times, at least 5.0 times, at least 10.0 times, or more, the expression of the REG4 gene in the biological sample.

대조군 발현량은 질병 상태(암성 또는 비암성)가 알려진 개체들로부터 미리 수집 및 저장된 시료를 이용함으로써 검사 생물학적 시료와 함께 동시에 결정될 수 있다. 또한, 질병 상태를 알고 있는 개체의 시료에서, 상기 REG4 유전자의 미리 결정된 발현량을 분석함으로써 수득한 결과를 기반으로, 상기 대조군 발현량은 통계적으로 결정될 수 있다. 추가로, 상기 대조군 발현량은 미리 검사된 세포의 발현 양상의 데이타베이스일 수 있다. 게다가, 본 발명의 측면에 따라서, 생물학적 시료에서 REG4 유전자의 발현량은 다수의 참조 시료로부터 결정된 다수의 대조군 발현량과 비교될 수 있다. 대조군 발현량은 환자로부터 유래한 생물학적 시료와 동일한 조직 유형으로부터 유래한 참조 시료로부터 결정되는 것이 바람직하다. 게다가 질병 상태를 알고 있는 개체군에서의 상기 REG4 유전자의 발현량의 표준 수치를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표준 수치는 당업계에 알려진 방법으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 평균 ± 2 S.D. 또는 평균 ± 3 S.D.의 범위에서 표준 수치로 사용될 수 있다.Control expression levels can be determined simultaneously with test biological samples by using samples previously collected and stored from individuals with known disease states (cancerous or noncancerous). In addition, based on the results obtained by analyzing a predetermined expression amount of the REG4 gene in a sample of an individual with a known disease state, the control expression amount may be statistically determined. In addition, the control expression level may be a database of the expression pattern of the previously examined cells. In addition, according to aspects of the present invention, the expression level of the REG4 gene in a biological sample can be compared with a plurality of control expression levels determined from multiple reference samples. The control expression level is preferably determined from a reference sample derived from the same tissue type as the biological sample derived from the patient. In addition, it is preferable to use standard values of the expression level of the REG4 gene in a population with a known disease state. Such standard values can be obtained by methods known in the art. For example, mean ± 2 S.D. Or as a standard value in the range of ± 3 S.D. on average.

본 발명의 문맥에 있어서, 암성으로 알고 있는 생물학적 시료에서 결정된 대조군 발현량은 "정상 대조군 발현량"으로 지칭된다. 반면에, 상기 대조군 발현량이 화학-방사선 치료 내성 생물학적 시료로부터 결정되면, "화학-방사선 치료 내성 대조군 발현량"으로 지칭된다.In the context of the present invention, the control expression level determined in a biological sample known to be cancerous is referred to as "normal control expression level". On the other hand, if the control expression level is determined from a chemo-radiotherapy resistant biological sample, it is referred to as "chemo-radiotherapy resistance control expression".

REG4 유전자의 발현량이 정상 대조군 발현량에 비해 증가했거나 화학-방사선 치료 내성 대조군 발현량과 유사한 경우, 상기 개체가 화학-방사선 치료 내성 암에 걸렸거나 화학-방사선 치료 내성의 위험 상태에 있다고 진단될 수 있다.If the expression level of the REG4 gene is increased compared to the normal control expression level or is similar to the chemo-radiotherapy resistant control expression, the individual may be diagnosed as having chemo-radiotherapy resistant cancer or at risk for chemo-radiotherapy resistance. .

검사 생물학적 시료의 발현량 및 상기 대조군 발현량 사이의 차이는 대조군 핵산, 예를 들면, 세포의 암성 또는 비암성 상황에 따라 발현량에 차이가 없는 것으로 알려진, 하우스키핑 유전자(housekeeping genes)의 발현량으로 표준화될 수 있다. 대표적인 대조군 유전자에는 β-액틴, 글리세르알데히드 3 인산 탈수소효소 및 리보솜 단백질 P1등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The difference between the expression level of the test biological sample and the control expression level is that of the housekeeping genes, which are known to have no difference in the expression level depending on the control nucleic acid, for example, the cancerous or noncancerous condition of the cell. Can be standardized. Representative control genes include, but are not limited to, β-actin, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase, and ribosomal protein P1.

본 발명의 관점은 하기 실시예에서 상세히 기재하고 있고, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.Aspects of the invention are described in detail in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

다르게 정의하지 않는다. 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 검사를 위해 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 하기에 기술된다.It is not defined differently. All technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used for the practice or testing of the present invention, suitable methods and materials are described below.

본 발명은 추가로 하기 실시예를 기술할 것이고, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.The invention will further describe the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

실시예Example 1:  One:

1. 일반적인 방법1. The common way

임상 재료Clinical material

통지해 준 동의에 대한 적합한 규칙에 따라, 수술전 및 수술후(절제수술 3 또는 4주 후) 혈청 시료를 체장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC)에 대한 절제술을 수행한 7명의 환자들로부터 수득하였다. 전통적인 파라핀이 끼워진 PDAC의 조직 절편도 통지해 준 동의에 대한 적합한 규칙에 따라, 외과 견본에서 수득하였다. 31개의 PDAC 조직 및 2개의 내분비종양(endocrine-tumor) 조직이 두 번씩 점착된 조직 마이크로어레이는 ISU ABXIS(Seoul, Korea)로부터 수득하였다.In accordance with the appropriate rules of informed consent, preoperative and postoperative (3 or 4 weeks after resection) serum samples were obtained from 7 patients who underwent resection for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). . Traditional paraffin-embedded tissue sections of PDAC were also obtained from surgical specimens according to the appropriate rules for consent to inform tissue sections. Tissue microarrays that were adhered twice to 31 PDAC tissues and two endocrine-tumor tissues were obtained from ISU ABXIS (Seoul, Korea).

세포주Cell line

PDAC 세포주인, PK-45P 및 SUIT-2는 토호쿠 대학의 생물의학 연구를 위한 세포 자원 센터(Cell Resource Center for Biomedical Research; Sendai, Japan) 및 규슈 대학병원(Kyushu Medical Center: Fukuoka, Japan)에서 각각 제공받았다. MIAPaCa-2는 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD)에서 구매하였다. 상기 세포주는 PK-45P 및 SUIT-2의 경우 RPMI 1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), MIAPaCa-2의 경우 10% 우태아혈청(Cansera International, Ontario, Canada) 및 1% 항생제/항균제 용액(Sigma-Aldrich)이 첨가된, 듀벨코의 변형된 이클스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; Sigma-Aldrich)에서 배양하였다. 세포들은 5% CO2를 포함하는 습한 공기의 37℃에서 유지되었다. FreeStyleTM 293 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA)는 FreeStyleTM 293 발현 배지(Invitrogen)에 현탁하여, 삼각플라스크(Corning, NY)에서 오비탈 쉐이커 플랫폼에서 125 rpm으로 교반 하면서 배양하였다. 세포들은 5% CO2를 포함하는 습한 공기의 대기에서 37℃에서 유지되었다. 췌장암 세포주 MIA-PaCa2 및 Panc-1 및 정상 설치류 세포주 NIH3T3은 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD)에서 구매하여, 듀벨코의 변형된 이클스 배지 또는 RPMI1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 배양하였다. 췌장암세포주 PK-59, KLM-1, PK-45P 및 PK-1은 토호쿠 대학의 생물의학 연구를 위한 세포 자원 센터(Japan)에서 제공받아서, RPMI1640(Sigma-Aldrich)에서 유지하였다; 모든 배지에는 10% 우태아혈청(Cansera International, Ontario, Canada) 및 1% 항생제/항균제 용액(Sigma-Aldrich)이 첨가되었다. 세포들은 5% CO2를 포함하는 습한 공기의 37℃에서 유지되었다.The PDAC cell lines, PK-45P and SUIT-2, were used at the Cell Resource Center for Biomedical Research (Sendai, Japan) and Kyushu Medical Center (Fukuoka, Japan), respectively. Provided. MIAPaCa-2 was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. The cell lines were RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for PK-45P and SUIT-2, 10% fetal bovine serum (Cansera International, Ontario, Canada) and 1% antibiotic / antibacterial for MIAPaCa-2. Cultures were incubated in Dulbecco's modified Eagle's medium (Sigma-Aldrich) to which a solution (Sigma-Aldrich) was added. Cells were maintained at 37 ° C. in humid air containing 5% CO 2 . FreeStyle ™ 293 cells (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Were suspended in FreeStyle ™ 293 expression medium (Invitrogen) and incubated with stirring at 125 rpm on an orbital shaker platform in a conical flask (Corning, NY). Cells were maintained at 37 ° C. in a humid air atmosphere containing 5% CO 2 . Pancreatic cancer cell lines MIA-PaCa2 and Panc-1 and normal rodent cell lines NIH3T3 were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, and Dubelco's modified Ecles medium or RPMI1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Incubated). Pancreatic cancer cell lines PK-59, KLM-1, PK-45P and PK-1 were provided by the Cell Resource Center for Biomedical Research at Tohoku University (Japan) and maintained at RPMI1640 (Sigma-Aldrich); 10% Fetal Bovine Serum (Cansera International, Ontario, Canada) and 1% Antibiotic / Antibiotic Solution (Sigma-Aldrich) were added to all media. Cells were maintained at 37 ° C. in humid air containing 5% CO 2 .

2. 2. REG4REG4 에 대한 반-정량 Semi-quantitative for RTRT -- PCRPCR 분석 analysis

PDAC 세포, 췌장암세포 및 정상 췌관 상피세포의 정제는 이미 기술되어 있다(Nakamura T, et al. Oncogene 2004; 23: 2385-400.); Purification of PDAC cells, pancreatic cancer cells and normal pancreatic duct epithelial cells has already been described (Nakamura T, et. al . Oncogene 2004; 23: 2385-400.);

분리된 세포 개체군 및 정상 인간 심장, 폐, 간, 심장 뇌, 췌장(BD Biosciences, Palo Alto, CA) 및 정상 췌관세포의 RNA는 T7-기반 세포외 전사에 의해 2 라운드로 증폭된 후(Epicentre Technologies, Madison, WI), 이어서 단일 가닥 cDNA로 합성되었다. 인간 췌장암세포주의 전체 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 제조업자의 권고에 따라 추출하였다. 추출된 RNA를 DNase I(Roche, Mannheim, Germany)으로 처리한 후, 올리고(dT) 프라이머를 수퍼스 크립트 II 역전사 효소(Invitrogen)와 함께 이용하여 단일 가닥 cDNA로 역전사 하였다. 본 발명자들은 정량 대조군으로 α-튜불린(TUBA)을 모니터하면서 연속 PCR 증폭을 위한 각각의 단일-가닥 cDNA에 대해 적절히 희석하여 제조했다. 프라이머 서열은 하기와 같다:RNA from isolated cell populations and normal human heart, lung, liver, heart brain, pancreas (BD Biosciences, Palo Alto, Calif.) And normal pancreatic duct cells were amplified in round 2 by T7-based extracellular transcription (Epicentre Technologies , Madison, Wis.), Followed by single stranded cDNA. Total RNA of the human pancreatic cancer cell line was extracted using Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) According to the manufacturer's recommendations. The extracted RNA was treated with DNase I (Roche, Mannheim, Germany), and then oligo (dT) primers were reverse transcribed into single-stranded cDNA using SuperCrypt II reverse transcriptase (Invitrogen). We prepared by appropriate dilution for each single-stranded cDNA for continuous PCR amplification while monitoring α-tubulin (TUBA) as a quantitative control. Primer sequences are as follows:

TUBA에 대해 About TUBA

5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3'(서열번호 9) 및 5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 9) and

5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3'(서열번호 10);5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3 '(SEQ ID NO: 10);

REG4에 대해 About REG4

5'-CCAATTGCTATGGTTACTTCAGG-3'(서열번호 3) 및 5'-CCAATTGCTATGGTTACTTCAGG-3 '(SEQ ID NO: 3) and

5'-GAAAAACAAGCAGGAGTTGAGTG-3'(서열번호 4).5'-GAAAAACAAGCAGGAGTTGAGTG-3 '(SEQ ID NO: 4).

KIAA0101(NM_014736, 서열번호 39로 기재되는 뉴클레오티드 서열로 암호화되는 상기 서열번호 40으로 기재되는 아미노산 서열)에 대해For KIAA0101 (NM_014736, amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 40 encoded by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39)

5'-AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3'(서열번호 26) 및 5'-AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3 '(SEQ ID NO: 26) and

5'-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3'(서열번호 27),5'-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3 '(SEQ ID NO: 27),

β2 MG에 대해 About β2 MG

5'-CACCCCCACTGAAAAAGAGA-3'(서열번호 28) 및 5'-CACCCCCACTGAAAAAGAGA-3 '(SEQ ID NO: 28) and

5'-TACCTGTGGAGCAAGGTGC-3'(서열번호 29).5'-TACCTGTGGAGCAAGGTGC-3 '(SEQ ID NO: 29).

모든 반응은 초기 변성 94℃, 2 분; 94℃, 30 초, 58℃, 30 초, 및 72℃, 1 분으로 23 사이클(TUBA의 경우) 또는 28 사이클(REG4의 경우)의 조건 또는 All reactions were initially denatured at 94 ° C., 2 minutes; 23 cycles (for TUBA ) or 28 cycles (for REG4 ) at 94 ° C, 30 seconds, 58 ° C, 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute, or

초기 변성 95℃, 5 분; 95℃, 30 초, 55℃, 30 초, 및 72℃, 30 초로 23 사 이클(β2 MG의 경우) 또는 28 사이클(KIAA0101의 경우)의 조건으로 , GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems, Foster, CA)에서 수행되었다.Initial denaturation 95 ° C., 5 min; GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems, Foster,) at conditions of 23 cycles (for β2 MG ) or 28 cycles (for KIAA0101) at 95 ° C, 30 seconds, 55 ° C, 30 seconds, and 72 ° C, 30 seconds. CA).

3. 3. REG4REG4 에 대한 항체Antibody against

히스틴이 태깅된 전장 인간 REG4의 발현 벡터를 293T 세포에 형질감염한 후, 재조합 REG4(REG4-His)를 TALON 정제 키트(Clontech, San Diego, CA)를 사용하여 배양액으로부터 정제하였다. 프로인트 완전아주반트(Freund's complete adjuvant)와 상기 항원 용액을 유화시킴으로써 상기 REG4-His 단백질을 주사용으로 제조하였다. 토끼(Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan)로부터 상기 REG4-His 단백질에 대한 다클론 항-REG4 항체(pAb)를 제조하였고, 상기 면역된 형철은 표준 방법에 따라 친화성 컬럼에서 정제되었다. 또한, 마우스 단클론 항체(mAb)는 REG4-His를 프로인트 완전아주반트와 함께 BALB/C 마우스에 접종하여 제조하였다. 이의 림프구를 골수종세포 P3U1와 융합하여 단클론의 융합세포를 생성하였고, 표준 기술로 검증하였다.Expression vectors of full-length human REG4 tagged with histin were transfected into 293T cells, and then recombinant REG4 (REG4-His) was purified from the culture using the TALON purification kit (Clontech, San Diego, Calif.). The REG4-His protein was prepared for injection by emulsifying Freund's complete adjuvant and the antigen solution. Polyclonal anti-REG4 antibodies (pAbs) against the REG4-His protein were prepared from rabbits (Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan), and the immunized iron was purified on an affinity column according to standard methods. In addition, mouse monoclonal antibody (mAb) was prepared by inoculating BALB / C mice with REG4-His with Freund's complete adjuvant. Its lymphocytes were fused with myeloma cells P3U1 to generate monoclonal fusion cells and verified by standard techniques.

4. 4. KIAA0101KIAA0101 에 대한 항체 및 재조합 단백질.Antibodies and Recombinant Proteins.

전장 KIAA0101(111 아미노산, NP_055551)(서열번호 15)을 암호화하는 cDNA 단편을 KOD-Plus 중합효소(TOYOBO)를 이용하여 생성한 후, pET21 벡터(Novagen)에 클로닝하였다. COOH 말단에 폴리히스티딘 태그가 융합된 상기 재조합 KIAA0101 단백질을 대장균, BL21 codon plus(Stratagene)에서 발현시킨 후, 공급자의 프로토콜 에 따라 정상 조건에서 Ni-NTA 레진(QIAGEN)으로 정제하였다. MonoS HR 5/5(Amersham)이 장착된 HPLC AKTA 검사기계(Amersham)를 이용하여 추가의 정제과정이 수행되었다. 상기 단백질은 토끼에서 면역화되었고, 상기 면역 혈청은 기본 방법론에 따라서, 재조합 KIAA0101 단백질이 연결된 Affi-Gel 10 활성화된 친화성 기질(Bio-Rad)로 충진된 친화도 컬럼에서 정제되었다. 상기 친화도 정제된 항-KIAA0101 다클론 항체는 KIAA0101 단백질의 검출용으로 이용되었다.CDNA fragments encoding full-length KIAAOlOl (111 amino acids, NP_055551) (SEQ ID NO: 15) were generated using KOD-Plus polymerase (TOYOBO) and cloned into pET21 vector (Novagen). The recombinant KIAA0101 protein fused with a polyhistidine tag at the COOH end was expressed in E. coli, BL21 codon plus (Stratagene), and then purified by Ni-NTA resin (QIAGEN) under normal conditions according to the supplier's protocol. Further purification was performed using an HPLC AKTA tester (Amersham) equipped with MonoS HR 5/5 (Amersham). The protein was immunized in rabbits and the immune serum was purified on an affinity column filled with Affi-Gel 10 activated affinity substrate (Bio-Rad) to which the recombinant KIAAO101 protein was linked, according to the basic methodology. The affinity purified anti-KIAA0101 polyclonal antibody was used for the detection of KIAA0101 protein.

5. 5. REG4REG4 에 대한 면역조직화학 염색.Immunohistochemical staining for.

상기 절편은 pH 6.0의 구연산염 완충용액에서 108℃에서 15분 동안 탈파라핀화(deparaffinized) 및 멸균하였다. 내재성 퍼옥시다아제 활성은 메탄올에 희석된 0.33% 과산화수소에서 30분동안 인큐베이션 함으로써 켄칭되었다. 우태아혈청과 함께 인큐베이션 함으로써 차단한 후에, 상기 절편을 실온에서 1시간 동안 항-REG4 pAb(1:1000)와 인큐베이션 하였다. PBS로 세척한 후, 퍼옥시다아제가 표지된 항-마우스 면역글로불린(Envision kit, Dako Cytomation, Carpinteria, CA)을 이용하여 면역검출하였다. 마지막에, 상기 반응물을 3,3'-디아미노벤지딘(Dako)으로 전개하였고, 상기 세포를 헤마톡실린으로 대조염색하였다.The sections were deparaffinized and sterilized for 15 minutes at 108 ° C. in citrate buffer, pH 6.0. Intrinsic peroxidase activity was quenched by incubation for 30 minutes in 0.33% hydrogen peroxide diluted in methanol. After blocking by incubation with fetal calf serum, the sections were incubated with anti-REG4 pAb (1: 1000) for 1 hour at room temperature. After washing with PBS, peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin (Envision kit, Dako Cytomation, Carpinteria, Calif.) Was used for immunodetection. Finally, the reaction was developed with 3,3'-diaminobenzidine (Dako) and the cells counterstained with hematoxylin.

전유전체 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해, 본 발명자들은 PDAC 세포에서 과발현된 수십 개의 유전자를 분류하였다(Hartupee JC, et al. Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93.). 이들 중, 본 발명자들은 RT-PCR에 의해 검사된 미세절편화된 PDAC 세포 개체군 9개 중 7개에서 과발현된 REG4에 집중하였다(도 1A). PDAC 세포에서 그것의 mRNA 발현량은 정상 췌장 및 심장, 폐, 신장 및 뇌를 포함하는 중추기관보다 PDAC 세포에서 현저하게 높았다.Through genome cDNA microarray analysis, we have sorted out dozens of genes overexpressed in PDAC cells (Hartupee JC, et. al . Biochim Biophys Acta 2001; 1518: 287-93.). Among these, we focused on REG4 overexpressed in 7 of 9 microfragmented PDAC cell populations examined by RT-PCR (FIG. 1A). Its mRNA expression in PDAC cells was markedly higher in PDAC cells than in normal pancreas and central organs including heart, lung, kidney and brain.

PDAC 조직의 다른 계열에서 REG4에 대한 다클론 항체를 사용하여 수행한 면역조직화학적분석 결과, 배상세포 유사 액포(도 1B) 또는 암세포의 세포표면(도 1C)에서는 REG4에 강한 신호를 나타내었지만, 정상 췌장의 포상세포에서는 REG4에 약한 신호를 나타내었고(도 1D), 심장, 폐, 신장 및 뇌에서는 염색결과가 나타나지 않았다(데이타는 보여주지 않음). 추가로 다른 계열의 31개의 PDAC 조직으로 점착된 조직-마이크로어레이에서는 31개의 PDAC 중 14개에서 고 농도로 REG4 발현하였고, 전체 64개의 PDAC 중 35개(55%)는 항-REG4 항체에 대해 양성 염색을 나타내었다. 분화가 잘된 PDAC(G1)는 분화가 덜된(G2, G3 및 G4) PDAC에 비해 더욱 빈번하게 REG4에 대한 양성 염색을 나타내었다(두 번 검사에 의해 p=0.0001).Immunohistochemical analysis using polyclonal antibodies against REG4 in other lines of PDAC tissue showed strong signals to REG4 on goblet cell-like vacuoles (FIG. 1B) or on the cell surface of cancer cells (FIG. 1C), but normal. Acinar cells of the pancreas showed a weak signal in REG4 (FIG. 1D), but no staining results in the heart, lung, kidney and brain (data not shown). In addition, tissue-microarrays adhered to 31 PDAC tissues of different lines expressed high levels of REG4 in 14 of 31 PDACs, and 35 (55%) of 64 PDACs positive for anti-REG4 antibodies. Staining was shown. Well-differentiated PDAC (G1) showed positive staining for REG4 more frequently than less-differentiated (G2, G3 and G4) PDAC ( p = 0.0001 by two tests).

6. 안정적으로 6. stably REG4REG4 를 발현하는 세포의 제조. Preparation of the cell expressing.

REG4 발현 벡터를 제조하기 위해, REG4 cDNA의 전체 암호화 서열을 제한 효소 위치를 갖는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하였다;To prepare REG4 expression vectors, the entire coding sequence of the REG4 cDNA was amplified by PCR using primer pairs with restriction enzyme positions;

5'-CGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGC-3'(서열번호 63) 및 5'-CGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGC-3 '(SEQ ID NO: 63) and

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGGTCGGTACTTGCACAGG-3'(서열번호 64) 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGGTCGGTACTTGCACAGG-3 '(SEQ ID NO: 64)

포함된 EcoRI 및 NotI 제한 위치는 첫번째 및 두번째 밑줄로 각각 표시하였다. 상기 산물은 HA 태깅된 단백질을 발현하는 pCAGGSnHC의 EcoRI 및 NotI 위치에 삽입되었다. 상기 플라스미드는 FuGENE6(Roche)를 제조자의 권고 절차에 따라 이 용하여 REG4-음성 PDAC 세포주인, PK-45P 세포에 형질감염하였다. 상기 세포 개체군은 0.5 ㎎/㎖ 제네티신(제네티신: Invitrogen)으로 선별된 후, 클로날 PK-45P 세포를 제한된 희석으로 서브클로닝하였다. HA 태깅된 REG4 발현량을 평가하기 위해, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% 디옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 0.1% 프로테아제 억제제 칵테일 III(Calbiochem, San Diego, CA)을 포함하는 용해 완충용액으로 수집하였다. 시료를 원심분리 한 후, 펠렛을 제거하였다. 상등액에 존재하는 단백질의 함량을 브래드포드 방법으로 측량하였다. 10 g 씩 분배하여 15% SDS-PAGE에 주입하였고, 항-HA 항체(3F10)(Roche)를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 검출하였다. 각 단백질의 함량은 항-β-액틴 항체(Sigma-Aldrich)를 이용하여 표준화하였다. REG4가 발현된 세 개의 클론들(C1-6, C2-6, C10)이 구성적으로 제조되었다. pCAGGSnHC-HA 공벡터로 형질감염된 대조군 PK-45P 세포도 제조되었다(M1, M3, M6).The included EcoRI and NotI restriction sites are indicated by the first and second underline, respectively. The product was inserted at the EcoRI and NotI positions of pCAGGSnHC expressing HA tagged proteins. The plasmid was transfected to PK-45P cells, REG4-negative PDAC cell lines using FuGENE6 (Roche) according to the manufacturer's recommended procedure. The cell population was selected with 0.5 mg / ml Geneticin (Genetisin: Invitrogen) and then subcloned clonal PK-45P cells at limited dilution. To assess HA tagged REG4 expression, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.25% deoxycholic acid, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 0.1% protease inhibitor cocktail III (Calbiochem, San Diego, CA), and collected in lysis buffer. After centrifuging the sample, the pellet was removed. The amount of protein present in the supernatant was measured by the Bradford method. 10 g aliquots were injected into 15% SDS-PAGE and detected by Western blotting using anti-HA antibody (3F10) (Roche). The content of each protein was normalized using anti-β-actin antibody (Sigma-Aldrich). Three clones (C1-6, C2-6, C10) expressing REG4 were constructed constitutively. Control PK-45P cells transfected with the pCAGGSnHC-HA empty vector were also prepared (M1, M3, M6).

7. γ-선 및 7. γ-rays and 젬시타빈Gemcitabine 내성 검사.  Immunity test.

REG4를 발현하는 클론들(C1-6, C2-6, C10) 또는 대조군 클론들(M1, M3, M6) 각각의 3,000개의 세포를 96-웰 배양 접시에 각각 접종한 후, 10% FBS를 포함하는 배지에서 배양하였다. 48시간 동안 전배양한 후에, 60Co source를 이용하여 1, 5, 10, 또는 30 Gy로 세포에 γ-선을 조사하거나 0.1-100,000 nM의 젬시타빈으로 48시간 동안 처리하였다. 48시간 후에 생존한 세포를 세포 계수 키트-8(DOJINDO)을 이용하여 측정하였다. 억제 수치 백분율을 계산하기 위해, 흡광도-(각 처리군)/흡광 도-(비처리 대조군)의 상대적 비율을 계산하였다. FACS 분석을 위해, 48,000 세포/웰로 6웰 플레이트에 접종하여 48시간 동안 전배양한 후, 세포를 60Co source를 이용하여 0, 1, 또는 5 Gy로 세포에 γ-선을 조사하거나 10 ㎚ 또는 50 nM의 젬시타빈으로 48시간 동안 처리하였다. 48시간 후에 세포를 수집한 후, PBS로 세척하였고, 차가운 70% 에탄올로 세척한 후, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI; 10 ㎍/㎖) 및 리보핵산가수분해효소 A(100 ㎍/㎖)로 염색하였고, FACSCalibur™Flow Cytometry System(BD) 분석을 이용하여 세포 주기 분석을 수행하였다. 이수체 세포의 백분율은 세포주기 분석 프로그램(BD CELLQuest™)을 이용하여 계산하였다.3,000 cells of each of the clones expressing REG4 (C1-6, C2-6, C10) or control clones (M1, M3, M6) were inoculated in 96-well culture dishes, respectively, followed by 10% FBS. Cultured in the medium. After 48 hours preculture, cells were irradiated with γ-rays at 1, 5, 10, or 30 Gy using a 60Co source or treated with 0.1-100,000 nM gemcitabine for 48 hours. Cells that survived after 48 hours were measured using Cell Counting Kit-8 (DOJINDO). To calculate the percentage of inhibition values, the relative ratio of absorbance- (each treatment group) / absorbance- (untreated control group) was calculated. For FACS analysis, inoculate 6 well plates at 48,000 cells / well and preincubate for 48 hours, then irradiate the cells with γ-rays at 0, 1, or 5 Gy using a 60Co source or 10 nm or 50 Treatment with nM gemcitabine for 48 hours. After 48 hours, cells were collected, washed with PBS, washed with cold 70% ethanol, and then propidium iodide (PI; 10 μg / ml) and ribonuclease A (100 μg / ml). ) And cell cycle analysis was performed using the FACSCalibur ™ Flow Cytometry System (BD) assay. The percentage of dimer cells was calculated using a cell cycle analysis program (BD CELLQuest ™).

8. 8. KIAA0101KIAA0101 에 대한 면역조직화학 염색. Immunohistochemical staining for.

적합한 통지해 준 동의에 대한 규칙에 따라 절제된 외과 견본에서 전통적인 췌장암 조직 절편을 수득하였다. 정상 췌장으로부터의 절편은 Biochain(Hayward, CA)으로부터 구입하였다. 상기 절편은 Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH(Dako, Carpinteria, CA)에서 108℃에서 15분 동안 탈파라핀화(deparaffinized) 및 멸균하였다. 내재성 퍼옥시다아제 및 단백을 차단한 후에, 상기 절편을 실온에서 30분 동안 항-KIAA0101 항체(1:200)와 인큐베이션 하였다. PBS로 세척한 후, 퍼옥시다아제가 표지된 항-토끼 면역글로불린(Envision kit, Dako Cytomation, Carpinteria, CA)을 이용하여 면역검출하였다. 마지막에, 상기 반응물을 3,3'-디아미노벤지딘(Dako)으로 전개하였다. 헤마톡실린을 이용하여 대 조염색하였다.Traditional pancreatic cancer tissue sections were obtained from surgical specimens excised according to the rules for informed consent. Sections from normal pancreas were purchased from Biochain (Hayward, CA). The sections were deparaffinized and sterilized for 15 minutes at 108 ° C. in Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH (Dako, Carpinteria, Calif.). After blocking endogenous peroxidase and protein, the sections were incubated with anti-KIAA0101 antibody (1: 200) for 30 minutes at room temperature. After washing with PBS, peroxidase-labeled anti-rabbit immunoglobulin (Envision kit, Dako Cytomation, Carpinteria, Calif.) Was used for immunodetection. Finally, the reaction was developed with 3,3'-diaminobenzidine (Dako). Hematoxylin was used to counterstain.

9. 노던 9. Northern 블랏팅Blotting 분석.  analysis.

본 발명자들은 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 여러 췌장암세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 노던 블랏팅 분석을 수행하였다. DNase I(Nippon Gene, Osaka, Japan)으로 처리한 후, 제조자의 프로토콜에 따라 Micro-FastTrack(Invitrogen)를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 췌장암세포주의 mRNA 및 정상 성인의 심장, 폐, 간, 신장, 뇌 및 췌장에서 분리된 mRNA(BD Biosciences, Palo Alto, CA) 각각의 1 ㎍의 분배물을 1% 변성 아가로오스 겔에서 분리한 후, 나일론 막으로 전달하였다. KIAA0101에 특이적인 702-bp 탐침을 하기 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 제조하였다: 정방향 5'- AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3'(서열번호 1) 및 역방향 5'-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3'(서열번호 2). 무작위로 제작된 α32P-dCTP-표지 탐침을 이용한 혼성화를 Megaprime DNA 표지 시스템(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 설명서에 따라 수행하였다. 전혼성화, 혼성화 및 세척은 공급자의 권고에 따라 수행하였다. 상기 블랏팅은 10일 동안 -80℃에서 증감도 조사(intensifying screens)로 자가-방사선 투여되었다.We performed Northern blotting analysis by extracting total RNA from several pancreatic cancer cell lines using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). After treatment with DNase I (Nippon Gene, Osaka, Japan), mRNA was purified using Micro-FastTrack (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. A 1 μg aliquot of mRNA from pancreatic cancer cell lines and mRNA isolated from heart, lung, liver, kidney, brain and pancreas of normal adults (BD Biosciences, Palo Alto, CA) was isolated from a 1% denatured agarose gel. Then transferred to a nylon membrane. A 702-bp probe specific for KIAA0101 was prepared by PCR using the following primer sets: forward 5'-AGCTTTGTTGAACAGGCATTT-3 '(SEQ ID NO: 1) and reverse 5'-GGCAGCAGTACAACAATCTAAGC-3' (SEQ ID NO: 2). Hybridization with a randomized α32P-dCTP-labeled probe was performed according to the instructions using a Megaprime DNA labeling system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Prehybridization, hybridization and washing were performed according to the supplier's recommendations. The blotting was self-radiated with intensifying screens at −80 ° C. for 10 days.

10. 10. KIAA0101KIAA0101 녹다운을 위한 작은 간섭  Small interference for knockdown RNARNA (( siRNAsiRNA )-발현 구조물 및 형질감염.) -Expressing constructs and transfections.

췌장암 세포에서 내재성 KIAA0101의 발현을 녹다운하기 위해, 본 발명자들은 기존에 기술된 대로 표적 유전자에 대한 짧은 헤어핀 RNA를 발현하는 psiU6BX3.0 벡터를 사용하였다(Taniuchi et al.,(2005) Cancer Res, 65: 105-12). KIAA0101에 대한 siRNA를 위한 합성 올리고뉴클레오티드의 표적 서열은 하기와 같다: #759si; 5'-GCCATATTGTCACTCCTTCTA-3'(서열번호 7) 및 EGFPsi; 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(서열번호 8)(음성 대조군). KIAA0101을 고발현하는 췌장암세포주 KLM-1 및 MIA-PaCa2를 10 cm 플레이트에 접종한 후, 제조자의 지시에 따라 FuGENE6(Roche)를 이용하여 KIAA0101에 대한 siRNA를 발현하도록 설계된 플라스미드 8 ㎍으로 형질감염하였다.To knock down expression of endogenous KIAAOlOl in pancreatic cancer cells, we used a psiU6BX3.0 vector that expresses short hairpin RNA for target genes as previously described (Taniuchi et al., (2005) Cancer Res, 65: 105-12). Target sequences of synthetic oligonucleotides for siRNA for KIAAOlOl are as follows: # 759si; 5'-GCCATATTGTCACTCCTTCTA-3 '(SEQ ID NO: 7) and EGFPsi; 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 8) (negative control). Pancreatic cancer cell lines KLM-1 and MIA-PaCa2 expressing KIAA0101 were inoculated into 10 cm plates and then transfected with 8 μg of plasmid designed to express siRNA against KIAA0101 using FuGENE6 (Roche) according to the manufacturer's instructions. .

5 ㎎/㎖(KLM-1의 경우) 또는 0.8 ㎎/㎖(MIA-PaCa2의 경우)의 제네티신(Sigma-Aldrich)을 이용하여 5일 동안 세포를 선별한 후, KIAA0101 발현에 대한 녹다운 효과를 분석하기 위해 수집했다. 콜로니 형성 검사를 위해, siRNA를 발현하는 형질전환체를 14일 동안 제네티신을 포함하는 배지에서 배양하였다. 상기 생존 세포들은 4% 파라포름알데히드로 고정한 후, 콜로니 형성 평가를 위해 형질감염된 세포를 Giemsa 용액으로 염색하였다. 세포 생존도는 세포 계수 키트-8(DOJINDO, Kumamoto, Japan)를 이용하여 정량되었다. 14일 동안 상기 제네티신을 포함하는 배지에서 배양한 후, 상기 용액을 최종 농도 10%로 첨가하였다. Knockdown effect on KIAA0101 expression after cell selection for 5 days using genicine (Sigma-Aldrich) at 5 mg / ml (for KLM-1) or 0.8 mg / ml (for MIA-PaCa2) Collected to analyze it. For colony formation testing, transformants expressing siRNA were incubated for 14 days in media containing geneticin. The viable cells were fixed with 4% paraformaldehyde and then transfected cells were stained with Giemsa solution for colony formation evaluation. Cell viability was quantified using Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan). After incubation for 14 days in a medium containing geneticin, the solution was added at a final concentration of 10%.

100% 메탄올로 고정된 후 Giemsa 용액으로 염색되었다. 또 다른 실험에서, 생존 세포들은 세포 계수 키트(DOJINDO, kumamoto, Japan)로 측정되었다. 이어서 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 450 ㎚에서 흡광도를 Microplate Reader 550(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 측정하였다.It was fixed with 100% methanol and then stained with Giemsa solution. In another experiment, viable cells were measured with a cell count kit (DOJINDO, kumamoto, Japan). After incubation for 3 hours at 37 ℃, absorbance at 450 nm was measured using a Microplate Reader 550 (Bio-Rad, Hercules, CA).

11. 11. 내재성Immanence KIAA0101KIAA0101 -발현세포의 제조 및 Preparation of expression cells and 세포외Extracellular 및  And 세포외에서Extracellularly 이들의 성장. Their growth.

KIAA0101 cDNA는 Kozak 서열 및 NotI 링커를 포함하는 정방향 프라이머 및 NotI 링커를 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 증폭에 의해 제조되었다. 상기 PCR 산물은 HA 태깅된 단백질 발현을 위한 포유동물 발현벡터인 pCAGGS/HA의 NotI 영역에 삽입되었다. 상기 pCAGGS-KIAA0101-HA 또는 빈 pCAGGS/HA 공벡터는 KIAA0101의 발현량이 거의 적은 PK-45P 및 마우스 KIAA0101 상동체(NP_080791)의 발현을 거의 검출할 수 없는 NIH3T3 세포에 제조자의 프로토콜에 따라 FuGENE6(Roche)을 이용하여 형질감염되었다.KIAA0101 cDNA was prepared by PCR amplification using a forward primer comprising a Kozak sequence and a NotI linker and a reverse primer comprising a NotI linker. The PCR product was inserted into the NotI region of pCAGGS / HA, a mammalian expression vector for HA tagged protein expression. The pCAGGS-KIAA0101-HA or the empty pCAGGS / HA empty vector was used in FuGENE6 (Roche) according to the manufacturer's protocol in NIH3T3 cells that are hardly able to detect the expression of PK-45P and mouse KIAA0101 homologs (NP_080791) with little expression of KIAA0101. Transfection).

이후, 상기 제네티신-저항성 클론을 PK-45P의 경우 0.5 ㎎/㎖ 및 NIH3T3의 경우 0.9 ㎎/㎖의 제네티신을 포함하는 배양 배지에서 선별하였다. 각 클론에서 상기 내재성 KIAA0101 발현은 항-FLAG 태그 항체(Sigma-Aldrich) 및 항-β-액틴 항체(Sigma-Aldrich)를 이용한 웨스턴 블랏팅 분석에 의해 확인되었다. 성장도 검사를 위해서는, KIAA0101 발현 클론(PK45P-KIAA0101) 또는 대조군 클론(PK45P-Mock) 각각의 7,500개의 세포를 24-웰 배양 접시의 각 웰에 접종한 후, 10% FBS를 포함하는 배지에서 배양하였다. 세포 생존도는 MTT 검사로 정량하였다. 상기 실험은 적어도 세번씩 반복되었다. 세포내 형질전환의 경우, 하나의 안정적인 클론 NIH3T3-KIAA0101 및 하나의 NIH3T3-Mock의 5 x 106 세포를 8주된 누드 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리에 각각 접종하였고, 4주 후 종양을 수집하였다. 각각의 종양의 무게 를 잰 후, 항-KIAA0101 항체를 이용하여 면역염색하였다.The genetisine-resistant clones were then selected in culture medium containing 0.5 mg / ml for PK-45P and 0.9 mg / ml for NIH3T3. The endogenous KIAAOlOl expression in each clone was confirmed by Western blotting analysis using anti-FLAG tagged antibody (Sigma-Aldrich) and anti-β-actin antibody (Sigma-Aldrich). For growth testing, 7,500 cells of each of the KIAA0101 expressing clone (PK45P-KIAA0101) or the control clone (PK45P-Mock) were seeded in each well of a 24-well culture dish and then cultured in medium containing 10% FBS. It was. Cell viability was quantified by MTT assay. The experiment was repeated at least three times. For intracellular transformation, 5 x 10 6 cells of one stable clone NIH3T3-KIAA0101 and one NIH3T3-Mock were inoculated into the right and left flanks of 8 week old nude mice, respectively, and tumors were collected after 4 weeks. Each tumor was weighed and immunostained using anti-KIAA0101 antibody.

12. 12. KIAA0101KIAA0101 -관련 복합체 분석을 위한 For analysis of relevant complexes 면역침강Immunoprecipitation 및 질량분석. And mass spectrometry.

KIAA0101 단백질과 관련된 단백질을 분리하기 위해, 본 발명자들은 항-KIAA0101 항체를 이용하여 면역침강 실험을 수행하였다. KIAA0101을 과발현하는 췌장암세포주 KLM-1 및 PK59를 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 프로테아제억제제 칵테일 세트 III[Calbiochem, San Diego, CA])에서 용해하였다. 전체 단백질의 동량을 40℃에서 1시간 동안 2 ㎍의 항-KIAA0101 다클론 항체 또는 토끼 IgG(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA)와 인큐베이션하였다. 면역복합체는 단백질 G 세파로오즈(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)와 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 분해 완충용액으로 세척하였다.To isolate proteins associated with KIAA0101 protein, we performed immunoprecipitation experiments with anti-KIAA0101 antibodies. Pancreatic cancer cell lines KLM-1 and PK59 overexpressing KIAA0101 were dissolved in lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, protease inhibitor cocktail set III [Calbiochem, San Diego, CA]). Dissolved. Equal amounts of total protein were incubated with 2 μg of anti-KIAA0101 polyclonal antibody or rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) for 1 hour at 40 ° C. The immunocomplex was incubated with Protein G Sepharose (Zymed Laboratories, South San Francisco, Calif.) For 1 hour and then washed with digestion buffer.

공동 침강된 단백질들은 5-20% 기울기 SDS-PAGE에서 분리하였고, 은염색 키트(Wako, Osaka, Japan)로 염색하였다. 대조군 IgG로 침강된 것들로부터 항-KIAA0101 다클론 항체로 침강된 단백질의 밴드를 절단하여 트립신으로 겔상에서 분해하였고, AXIMA-CFR MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu Corporation, Tsukuba, Japan)를 이용하여 펩티드-질량 핑거프린트로 분석하였다. 펩티드 질량은 10-ppm 질량 정확도로 조사되었고, 단백질 데이타 베이스 검색은 IntelliMarque(Shimadzu) 데이타베이스 맞춤 프로그램을 이용하여 수행되었다. 상기 전략에 의해 확인된 상기 단백질 결합은 항-KIAA0101, 항-PCNA 항체(Santa-Cruz), 항-POLD1 항체(Santa-Cruz) 및 항-FEN1 항체(Santa-Cruz)를 이용한 면역침강에 의해 검증되었다.Co-precipitated proteins were isolated on 5-20% gradient SDS-PAGE and stained with silver stain kit (Wako, Osaka, Japan). Bands of proteins precipitated with anti-KIAA0101 polyclonal antibodies from those precipitated with control IgG were cleaved on trypsin gel and digested on gel with AXIMA-CFR MALDI-TOF mass spectrometer (Shimadzu Corporation, Tsukuba, Japan). Analysis was by mass fingerprint. Peptide mass was investigated with 10-ppm mass accuracy and protein database searches were performed using the IntelliMarque (Shimadzu) database customization program. The protein binding confirmed by this strategy was verified by immunoprecipitation using anti-KIAA0101, anti-PCNA antibody (Santa-Cruz), anti-POLD1 antibody (Santa-Cruz) and anti-FEN1 antibody (Santa-Cruz) It became.

13. 세포투과성 펩티드 처리 및 13. Cell Permeable Peptide Treatment and KIAA0101KIAA0101 -- PCNAPCNA 상호작용.  Interaction.

우점 장애 양식으로 KIAA0101 및 PCNA의 상호작용을 억제하기 위해, 본 발명자들은 아르기닌(R)이 반복된 세포투과성 펩티드(Noguchi et al.,(2004) Nat Med., 10: 305-9)와 연결된 KIAA0101의 PIP 박스 모티프 펩티드를 설계하였다. PIP20은 RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW{qKGiGEff}RLSPK(서열번호 9)(PIP 박스 모티프는 괄호 안에 나타내었고, 상기 보존된 잔기는 흔하지 않다)이었다. PIP20mut는 상기 PIP 박스 모티프의 보존된 잔기를 알라닌으로 대치했다: RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW{aKGaGEaa}RLSPK(서열번호 10). 또한 스크램블 펩티드는 음성 대조군으로 설계되었다; RRRRRRRRRRRGGG-IFKQWPRGETKPRVLSPKGF(서열번호 11). 추가로, 또한 본 발명자들 PIP 박스 모티프를 포함하는 더 짧은 펩티드를 설계하였다: PIP16, RRRRRRRRRRRGGG-TPKW{qKGiGEff}RLSP(서열번호 12), PIP16mut; RRRRRRRRRRRGGG-TPKW{aKGaGEaa}RLSP(서열번호 13). 상기 펩티드들은 Sigma-Aldrich에 의뢰하여 합성하였고, HPLC를 이용하여 95% 이상의 등급으로 정제하였다. KIAA0101을 발현하는 암세포주 KLM-1 및 마우스 KIAA0101 상동체를 발현하지 않는 정상 마우스 세포주 NIH3T3는 일련의 농도(5 μM, 10 μM 및 20 μM)의 상기 세포 투과성 펩티드로 각각 처리하였다. 1일 및 3일째에, 상기 세포는 각각의 펩티드에 노출되었고, 5일째에 생존세포주를 MTT 검사에 의해 상기 기술대로 평가하였다.In order to inhibit the interaction of KIAA0101 and PCNA in a predominant disorder modality, the inventors have found that arginine (R) is linked to repeated cell permeable peptides (Noguchi et al., (2004) Nat Med., 10: 305-9). PIP box motif peptide was designed. PIP20 was RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW {qKGiGEff} RLSPK (SEQ ID NO: 9) (PIP box motifs are shown in parentheses and the conserved residues are not common). PIP20mut replaced the conserved residues of the PIP box motif with alanine: RRRRRRRRRRRGGG-VRPTPKW {aKGaGEaa} RLSPK (SEQ ID NO: 10). Scrambled peptides were also designed as negative controls; RRRRRRRRRRRGGG-IFKQWPRGETKPRVLSPKGF (SEQ ID NO: 11). In addition, we also designed shorter peptides comprising the PIP box motif: PIP16, RRRRRRRRRRRGGG-TPKW {qKGiGEff} RLSP (SEQ ID NO: 12), PIP16mut; RRRRRRRRRRRGGG-TPKW {aKGaGEaa} RLSP (SEQ ID NO: 13). The peptides were synthesized by Sigma-Aldrich and purified to a grade of 95% or higher using HPLC. Cancer cell lines KLM-1 expressing KIAA0101 and normal mouse cell line NIH3T3 not expressing the mouse KIAA0101 homologues were treated with a series of concentrations (5 μM, 10 μM and 20 μM) of the cell permeable peptide, respectively. On days 1 and 3, the cells were exposed to their respective peptides, and on day 5 the viable cell lines were assessed as described above by MTT assay.

실시예Example 2 2

1. One. siRNAsiRNA -발현 벡터 및 -Expression vector and 콜로니Colony 형성 검사/ Formation inspection / MTTMTT 검사. inspection.

PDAC 세포에서 내재성 REG4의 발현을 녹다운 시키기 위해, 본 발명자들은 기존에 기술된 대로 표적 유전자에 대한 짧은 헤어핀 RNA를 발현하는 psiU6BX3.0 벡터를 사용하였다(Shimokawa T, et al. Cancer Res 2003; 63: 611-620). REG4에 대한 siRNA를 위한 합성 올리고뉴클레오티드의 표적 서열은 하기와 같다: REG4-si2; 5'-GACAGAAGGAAGAAACTCA-3'(서열번호 5) 및 EGFPsi; 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(서열번호 6)(음성 대조군). PDACs 세포주, SUIT-2(REG4-양성) 및 MIAPaCa-2(REG4-음성)를 6-웰 플레이트에 접종한 후, 제조자의 지시에 따라 FuGENE6(Roche)를 이용하여 siRNA를 발현하도록 설계된 플라스미드 10 ㎍으로 형질감염하였다. siRNA를 발현하는 플라스미드는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 클로닝에 의해 제조되었다. 상기 쌍을 이룬 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다;Intrinsic REG4 in PDAC Cells To knock down expression, we used a psiU6BX3.0 vector that expresses short hairpin RNA for the target gene as previously described (Shimokawa T, et. al . Cancer Res 2003; 63: 611-620). Target sequences of synthetic oligonucleotides for siRNA against REG4 are as follows: REG4-si2; 5'-GACAGAAGGAAGAAACTCA-3 '(SEQ ID NO: 5) and EGFPsi; 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 6) (negative control). 10 μg of plasmid designed to express siRNA using FuGENE6 (Roche) following inoculation of the PDACs cell lines, SUIT-2 (REG4-positive) and MIAPaCa-2 (REG4-negative) into 6-well plates. Transfection. Plasmids expressing siRNA were prepared by cloning of double stranded oligonucleotides. The sequence of the paired oligonucleotides is as follows;

si2에 대해about si2

5'-CACCGACAGAAGGAAGAAACTCATTCAAGAGATGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3'(서열번호 11) 및 5'-CACCGACAGAAGGAAGAAACTCATTCAAGAGATGAGTTTCTTCCTTCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 11) and

5'-AAAACTGTCTTCCTTCTTTGAGTAAGTTCTCTACTCAAAGAAGGAAGACAG-3'(서열번호 12);5'-AAAACTGTCTTCCTTCTTTGAGTAAGTTCTCTACTCAAAGAAGGAAGACAG-3 '(SEQ ID NO: 12);

0.9 ㎎/㎖(SUIT-2의 경우) 또는 0.8 ㎎/㎖(MIA-PaCa2의 경우)의 제네티신(Sigma-Aldrich)을 이용하여 7일 동안 세포를 선별한 후, REG4 발현에 대한 녹다운 효과를 분석하기 위해 수집했다. 콜로니 형성 검사를 위해, siRNA를 발현하는 형질전환체를 7일 동안 제네티신을 포함하는 배지에서 배양하였다. 상기 생존 세포들은 메탄올로 고정한 후, 콜로니 형성 평가를 위해 형질감염된 세포를 0.1% 크 리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 세포 생존도는 세포 계수 키트-8(DOJINDO, Kumamoto, Japan)를 이용한 MTT 검사에서 정량되었다. 7일 동안 상기 제네티신을 포함하는 배지에서 배양한 후, 상기 용액을 최종 농도 10%로 첨가하였다. 이어서, 37℃에서 1.5 시간 동안 배양한 후, 490 ㎚ 및 630 ㎚(배경)에서 Microplate Reader 550(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.Cells were screened for 7 days using either 0.9 mg / ml (for SUIT-2) or 0.8 mg / ml (for MIA-PaCa2) of Geneticin (Sigma-Aldrich), followed by REG4 Collected to analyze knockdown effect on expression. For colony formation testing, transformants expressing siRNA were incubated in media containing geneticin for 7 days. The viable cells were fixed with methanol and then transfected cells were stained with 0.1% crystal violet solution for colony formation evaluation. Cell viability was quantified by MTT assay using Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan). After incubation in the medium containing geneticin for 7 days, the solution was added at a final concentration of 10%. Subsequently, after incubation at 37 ° C. for 1.5 hours, absorbance was measured using a Microplate Reader 550 (Bio-Rad, Hercules, CA) at 490 nm and 630 nm (background).

PDAC 세포 배양시 REG4 과발현의 역할을 검사하기 위해, 본 발명자들은 특이적으로 REG4에 특이적인 siRNA를 발현하도록 설계된 발현 벡터를 여러 개 구성한 후, 내재적으로 REG4를 고발현하는 PDAC 세포주 SUIT-2에 형질감염시켰다. 본 발명자들이 SUIT-2 세포에서 검사한 세 개의 플라스미드 중, REG4-si2는 내재성 REG4 전사체에 대해 현저한 녹다운 효과를 나타내었고(도 2A), 상기 형질감염에 의해 MTT 검사로 측정된 세포 생존도(도 2B) 뿐만 아니라 콜로니 개수(도 2C)가 감소한 것으로 나타났으나, 다른 플라스미드의 형질감염(siEGFP의 음성 대조군)에서는 REG4 발현 및 SUIT-2의 세포 성장에 대해 녹다운 효과를 나타내지 않았다. 반면에, REG4-si2의 "오프-타켓팅" 효과의 가능성을 배제하고, REG4-si2는 REG4를 발현하지 않는 MIAPaCa-2의 세포 생존도에는 영향을 주지 않았다(데이타는 기재하지 않았음). 상기 siRNA-발현 벡터(REG4-si2)의 성장 억제 효과는 상기 유전자의 침묵효과와 관련되어 있고, 상기 데이타는 췌장암세포 생존 및/또는 성장에서 REG4의 주요한 역할을 나타낸다.To examine the role of REG4 overexpression in PDAC cell culture, the present inventors construct several expression vectors specifically designed to express REG4 specific siRNA, and then inherently transduce the PDAC cell line SUIT-2, which expresses REG4. Infected. Of the three plasmids we examined in SUIT-2 cells, REG4-si2 showed a significant knockdown effect on endogenous REG4 transcripts (FIG. 2A), and cell viability measured by MTT assay by the transfection (FIG. 2B) as well as the number of colonies (FIG. 2C) were shown to be reduced, but transfection of other plasmids (negative control of siEGFP) did not show a knockdown effect on REG4 expression and cell growth of SUIT-2. On the other hand, excluding the possibility of the "off-targeting" effect of REG4-si2, REG4-si2 did not affect the cell viability of MIAPaCa-2 that does not express REG4 (data not shown). The growth inhibitory effect of the siRNA-expressing vector (REG4-si2) is associated with the silencing effect of the gene and the data indicate a major role of REG4 in pancreatic cancer cell survival and / or growth.

실시예Example 3 3

1. 생활성형 재조합 인간 1. Lifelike recombinant human REG4REG4 의 제조. Manufacturing.

생활성형 REG4를 제조하기 위해, 각각 괄호 안에 EcoRI 및 NotI 제한효소인식부위를 가지는 하기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 방법으로 REG4 cDNA의 전장 암호화 서열을 증폭하였다;To prepare biocompatible REG4, the full length coding sequence of REG4 cDNA was amplified by PCR using the following primer pairs, each with Eco RI and Not I restriction enzyme recognition sites in parentheses;

5'-CG{GAATTC}ATGGCTTCCAGAAGCATGC-3'(정방향)(서열번호 7) 및 5'-CG {GAATTC} ATGGCTTCCAGAAGCATGC-3 '(forward) (SEQ ID NO: 7) and

5'- ATAAGAAT{GCGGCCGC}TGGTCGGTACTTGCACAGG-3'(역방향)(서열번호 8). 상기 산물은 HA 태깅된 단백질 발현을 위한 pCAGGS의 EcoRI 및 NotI 위치에 삽입시켰다. FreeStyleTM 293 세포를 30 ㎖ 배지에 1.5×105 세포/㎖의 농도로 접종하였다. REG4-HA/pCAGGS 벡터를 FuGene 6를 이용하여 설명서에 따라 세포에 형질감염하였다. 배양액을 48시간 후에 수집한 후, HA 아가로스(Sigma-Aldrich)를 이용하여 재조합 인간 REG4(rhREG4)를 정제하였다.5'-ATAAGAAT {GCGGCCGC} TGGTCGGTACTTGCACAGG-3 '(reverse) (SEQ ID NO: 8). The product was inserted at the Eco RI and Not I positions of pCAGGS for HA tagged protein expression. FreeStyle ™ 293 cells were seeded in 30 ml medium at a concentration of 1.5 × 10 5 cells / ml. REG4-HA / pCAGGS vectors were transfected into cells using FuGene 6 according to the instructions. After 48 hours of incubation, the recombinant human REG4 (rhREG4) was purified using HA agarose (Sigma-Aldrich).

2. 2. 면역침강Immunoprecipitation ..

10-㎝ 접시에서 배양한 SUIT-2 세포를 수확한 후, 추가로 무혈청 배지에서 2일동안 배양하였다. 10,000x g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후, 상기 상등액을 단백질 G Sepharose(Zymed Laboratories, San Francisco, CA)로 1시간 동안 4℃에서 처리하였다. 이후 항-REG4 mAb로 미리 처리된 상등액을 단백질 G Sepharose 혼합물에 첨가하였다. 4℃에서 부드럽게 교반하면서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 2회 세척하였다. 결합된 단백질을 용리한 후, 15% SDS-PAGE에서 분리하였다. 전 기영동 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Amersham)으로 이동시킨 후, 항-REG4 pAb로 표지하였다. 단백질 밴드를 화학발광 검출시스템(ECL, Amersham)으로 시각화하였다.SUIT-2 cells cultured in 10-cm dishes were harvested and then further cultured in serum-free medium for 2 days. After centrifugation at 10,000 × g and 15 ° C. for 15 minutes, the supernatant was treated with protein G Sepharose (Zymed Laboratories, San Francisco, Calif.) At 4 ° C. for 1 hour. The supernatant pretreated with anti-REG4 mAb was then added to the Protein G Sepharose mixture. Incubate for 4 hours with gentle stirring at 4 ° C. and then wash twice. Bound proteins were eluted and then separated on 15% SDS-PAGE. After electrophoretic separation, proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Amersham) and then labeled with anti-REG4 pAb. Protein bands were visualized with a chemiluminescent detection system (ECL, Amersham).

3. Akt 인산화. 3. Akt phosphorylation .

Akt의 인산화를 정량하기 위해 PK-45P 세포를 0, 0.1, 1 또는 10 nM rhREG4로 6시간 동안 처리하였고, 동시에 100 μg/㎖항-REG4 mAb를 처리하거나 처리하지 않았다. 처리 후, 상기 세포를 차가운 PBS로 세척하였고, 50 mM HEPES, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 2.5mM EGTA, 10mM NaF, 1mM Na3VO4, 0.5% Triton X-100, 0.5 mM 1,4-디티오쓰레이톨, 0.1% 프로테아제 억제제 칵테일 III(Calbiochem, San Diego, CA)를 포함하는 용해 완충용액에 수집하였다. 시료를 원심분리한 후, 펠렛을 제거하였다. 상기 상등액에 존재하는 단백질의 함량을 브래드포드 방법으로 측량하였다. 20 ㎍ 씩 분배하여 10% SDS-PAGE에 주입하였고, 항-pSer473 Akt 항체(Abcam, Cambridge, MA)를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 검출하였다. 전체 Akt 단백질의 발현량은 항-Akt 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)를 이용하여 측정하였다.To quantify phosphorylation of Akt, PK-45P cells were treated with 0, 0.1, 1 or 10 nM rhREG4 for 6 hours, with or without 100 μg / ml anti-REG4 mAb. After treatment, the cells were washed with cold PBS, 50 mM HEPES, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 2.5 mM EGTA, 10 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 , 0.5% Triton X-100, 0.5 mM 1 Collected in lysis buffer containing, 4-dithiothritol, 0.1% protease inhibitor Cocktail III (Calbiochem, San Diego, Calif.). After centrifuging the sample, the pellets were removed. The content of protein present in the supernatant was measured by the Bradford method. 20 μg aliquots were injected into 10% SDS-PAGE and detected by western blotting using anti-pSer473 Akt antibody (Abcam, Cambridge, Mass.). Expression of total Akt protein was measured using an anti-Akt antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA).

췌장암세포 성장에 대한 분비된 REG4의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 포유동물 시스템(FreeStyleTM 293-F)을 이용하여 생활성 rhREG4 단백질을 제조하였고(도 3A), REG4의 발현량이 적은 PK-45P 세포로 처리함으로써 여러 농도의 rhREG4(0-10 nM)를 이용하여 세포 성장 검사를 수행하였다. 도 4B는 배양액에서 REG4 단백질 존재하에 농도 의존적으로 확실히 세포 증식이 촉진된 것을 나타내며, 이는 세포외 및 자동분비(autocrine)/부분비(paracrine) 방식으로 세포 증식을 촉진하는 분비된 REG4 기능을 지시한다. REG 패밀리의 하류 표적 중 하나는 Akt 신호전달 경로인 것으로 보고되었다.(Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.). 본 발명의 rhREG4가 PDAC 세포에서 Akt 신호전달 경로를 활성화할 수 있는지 평가하기 위해, PK-45P 세포를 일련의 농도의 rhREG4 존재하에서 배양하였고, 인산화된 Akt를 473 세린이 인산화된 Akt에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅 분석 방법으로 검출하였다. 상기 rhREG4 처리에 의해 Akt의 인산화가 확실히 증가하였으나(도 3C), 전체 Akt의 발현량은 rhREG4 처리에 의해 변화하지 않았다. 상기 결과는 REG4가 PDAC 세포에서 Akt 신호전달 경로를 통해 세포 증식을 촉진하는 것을 나타낸다.To assess the effect of secreted REG4 on pancreatic cancer cell growth, we prepared a viable rhREG4 protein using a mammalian system (FreeStyle ™ 293-F) (FIG. 3A), and PK- with low expression levels of REG4. Cell growth assays were performed using various concentrations of rhREG4 (0-10 nM) by treatment with 45P cells. FIG. 4B shows that cell growth was certainly promoted in a concentration dependent manner in the presence of REG4 protein in culture, indicating the secreted REG4 function of promoting cell proliferation in an extracellular and autocrine / paracrine manner. . One of the downstream targets of the REG family has been reported to be the Akt signaling pathway (Sekikawa A, et. al . Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al . Gastroenterology 2006; 130: 137-49. In order to evaluate whether rhREG4 of the present invention can activate Akt signaling pathway in PDAC cells, PK-45P cells were cultured in the presence of a series of concentrations of rhREG4, and phosphorylated Akt was specific for Akt phosphorylated with 473 serine. Was detected by Western blotting analysis method. Phosphorylation of Akt was obviously increased by the rhREG4 treatment (FIG. 3C), but the expression level of total Akt was not changed by the rhREG4 treatment. The results indicate that REG4 promotes cell proliferation via Akt signaling pathway in PDAC cells.

항-REG4 mAb의 치료적 잠재성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 PDAC 세포를 항-REG4 mAb로 처리한 후, 세포 증식 검사를 수행하였다. 우선, 본 발명자들은 세포 배양액을 이용하여 면역 침강에 의한 여러 항-REG4 mAb의 결합 친화도를 확인하였다. 도 4A는 단일 항-REG4 mAb(34-1)가 SUIT-2 배양액 내 내재성 REG4 단백질과 고친화도로 결합하는 것을 나타낸다. PK-45P를 이용한 중화 검사결과, 상기 항-REG4 mAb 클론 34-1은 rhREG4 처리에 의해 성장 촉진 효과를 완벽하게 상쇄하였지만 대조군 항체는 어떠한 중화 활성도 나타내지 않았고(도 4B), 고농도로 내재성 REG4f를 발현하는 SUIT-2 세포를 이용한 증식검사 결과, 항-REG4 mAb 처리에 의해 SUIT-2 세포에서 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하였고(도 4C), 항-REG4 mAb는 REG4를 발현하지 않는 MIAPaCa-2의 세포 성장에는 전혀 영향을 주지 않았다.To assess the therapeutic potential of the anti-REG4 mAb, we treated the PDAC cells with the anti-REG4 mAb and then performed a cell proliferation test. First, the inventors confirmed the binding affinity of various anti-REG4 mAbs by immunoprecipitation using cell culture. 4A shows that a single anti-REG4 mAb (34-1) binds with high affinity to endogenous REG4 protein in SUIT-2 culture. Neutralization test using PK-45P showed that the anti-REG4 mAb clone 34-1 completely offset the growth promoting effect by rhREG4 treatment, but the control antibody did not show any neutralizing activity (FIG. 4B) and the high concentration of endogenous REG4f Proliferation assay using expressing SUIT-2 cells showed that cell proliferation was inhibited in a concentration-dependent manner in SUIT-2 cells by anti-REG4 mAb treatment (FIG. 4C), and anti-REG4 mAb did not express REG4 MIAPaCa-2 Had no effect on cell growth.

추가로, 또한 본 발명자들 rhREG4 및 항-REG4 mAb를 이용하여 PK45P 세포를 처리함으로써 Akt 인산화에 대한 영향을 평가하였고, 항-REG4 mAb 처리에 의해 rhREG4 처리에 의해 유도된 PDAC 세포에서의 Akt 인산화가 억제되었고(도 4D), 이는 항-REG4 mAb는 PDAC 세포에서 분비된 REG4의 중화 및 이의 자동분비/부분비 경로의 차단에 의해 Akt 신호전달 경로를 억제하는 것을 지시한다. 이를 통합하여, 상기 결과로부터 항-REG4 항체가 REG4에 의해 촉진된 세포 증식에 대해 중화 활성을 갖는 것이 제안된다.In addition, we also evaluated the effects on Akt phosphorylation by treating PK45P cells with rhREG4 and anti-REG4 mAbs, and Akt phosphorylation in PDAC cells induced by rhREG4 treatment by anti-REG4 mAb treatment (FIG. 4D), which indicates that the anti-REG4 mAb inhibits the Akt signaling pathway by neutralizing REG4 secreted from PDAC cells and blocking its autosecretory / partial pathway. Integrating this, it is suggested from the above results that the anti-REG4 antibody has neutralizing activity against cell proliferation promoted by REG4.

항-REG4 mAb 치료적 잠재성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 PDAC 세포를 접종된 마우스에 항-REG4 mAb로 처리한 후, 종양 성장 검사를 수행하였다. REG4를 발현하는 PDAC 세포주 SUIT2 5x106 세포를 8-주 누드 마우스의 옆구리에 접종한 후, 일주일에 두 번긴 직경(L) 및 짧은 직경(S)씩 종양의 긴 직경(L) 및 짧은 직경(S)을 측정하였다. 종양 부피는 L x L x S x 0.52 식으로 계산하였다. 종양 부피가 100-200 ㎜3에 다다랐을 때, 항-REG4 마우스 mAb 34-1(300 ㎍/마우스 복강주사) 처리를 시작하였다. 항체는 1주일에 세 번 복강주사로 처리하였고, 또한 대조군으로 비특이적 마우스 IgG(Acris)를 동일하게 처리하였다. 도 5A에 나타난 바와 같이, 34-1 mAb 처리에 의해 종양 성장(P=0.0598)을 억제하였고, 30일째에 상기 종양을 회수하여 무게를 측정하였다. 종양 무게는 34-1 mAb 처리에 의해 현저하게 억제되었다(도 5B, P=0.0489).To assess the anti-REG4 mAb therapeutic potential, we treated tumors with PDAC cells after inoculation with anti-REG4 mAbs. PDAC cell line expressing REG4 SUIT2 5x10 6 cells were inoculated into the flanks of 8-week nude mice, followed by a long diameter (L) and a short diameter (S) of twice the week for long diameter (L) and short diameter (S). ) Was measured. Tumor volume was calculated by the formula L × L × S × 0.52. When tumor volume reached 100-200 mm 3 , anti-REG4 mouse mAb 34-1 (300 μg / mouse intraperitoneal) treatment was started. Antibodies were treated with intraperitoneal injection three times a week and also treated with the same non-specific mouse IgG (Acris) as a control. As shown in FIG. 5A, tumor growth ( P = 0.0598) was inhibited by 34-1 mAb treatment, and at 30 days the tumor was recovered and weighed. Tumor weight was significantly suppressed by 34-1 mAb treatment (FIG. 5B, P = 0.0489).

실시예Example 4 4

1. One. 세포외Extracellular 화학-방사선 치료 내성  Chemo-radiotherapy resistance PDACPDAC 에서 in REG4REG4 발현. Expression.

화학-방사선 치료법에 대한 PDAC의 내성에 REG4 발현이 어떻게 영향을 줄 수 있는지를 연구하기 위해, 본 발명자들은 REG4-음성 PDAC 세포로부터 구조적으로 REG4가 발현되는 클론 세 개를 제조하였고, 상기 클론을 γ-방사선 또는 젬시타빈으로 세포외로 처리하였다. C1-6, C2-6 및 C10 클론에서 내재성 REG4의 발현을 웨스턴 블랏팅 분석으로 확인하였고, 대조군 클론에서는 발현하지 않았다(도 6A). 비조사와 비교하여, γ-방사선은 REG4-발현세포 및 대조군 세포의 세포 생존도를 억제하였다. 그러나 도 6B에 나타난 바와 같이, REG4-발현세포는 γ-방사선에 덜 민감하였고, 30-Gy로 γ-방사선을 조사한 후, REG4-발현세포(C1-6, C10, C2-6)의 생존도는 비조사군과 비교하여 60%로 억제되었고, 반면에 대조군의 세포 생존도는 40% 이하로 억제되었다(P<0.001). γ-방사선 조사 후, FACS 분석 결과는 1-Gly의 γ-방사선에 의해 대조군 세포의 서브-G1 개체군(사멸세포)의 28.7%를 유도한 것으로 나타내었고, 반면 REG4-발현세포에서는 10.73%만을 유도한 것으로 나타났다(도 6C). 추가로, 5-Gly의 γ-방사선에 의해 대조군 세포의 서브-G1 개체군(사멸세포)의 46.47 %를 유도한 것으로 나타내었고, 반면 REG4-발현세포에서는 24.68%만을 유도한 것으로 나타났다(도 6C). 상기 결과는 PK-45P 세포에서 REG4가 발현함으로써 γ-방사선에 대한 내성에 강하게 영향을 줄 수 있는 것을 나타낸다.In order to study how REG4 expression can influence the resistance of PDAC to chemo-radiation therapy, we prepared three clones that structurally express REG4 from REG4-negative PDAC cells, Treatment extracellularly with radiation or gemcitabine. Expression of endogenous REG4 in C1-6, C2-6 and C10 clones was confirmed by Western blotting analysis, but not in control clones (FIG. 6A). In comparison to non-irradiation, γ-radiation inhibited cell viability of REG4-expressing cells and control cells. However, as shown in FIG. 6B, REG4-expressing cells were less sensitive to γ-radiation, and after irradiation of γ-radiation with 30-Gy, survival of REG4-expressing cells (C1-6, C10, C2-6) Was suppressed to 60% compared to the non-irradiated group, while the cell viability of the control group was suppressed to 40% or less (P <0.001). After γ-radiation, FACS analysis indicated that 1-Gly γ-radiation induced 28.7% of the sub-G1 population (apoptotic cells) of control cells, whereas only 10.73% induced REG4-expressing cells. One figure (Fig. 6C). In addition, 5-Gly γ-radiation induced 46.47% of the sub-G1 population (apoptotic cells) of control cells, whereas only 24.68% were induced in REG4-expressing cells (FIG. 6C). . The results indicate that expression of REG4 in PK-45P cells can strongly affect resistance to γ-radiation.

다음으로 REG4-양성 또는 음성 세포를 일련의 농도의 젬시타빈으로 처리한 후, 그 들의 생존도를 평가하였다. 도 7A에 나타난 바와 같이, REG4-발현세포(C1-6, C10, C2-6)는 대조군 세포에 비해 젬시타빈에 덜 민감하였다. 대조군 세포의 IC50은 대략 30 nM인 것에 비해, REG4-발현세포에 대한 젬시타빈의 IC50은 C1-6 및 C10에서 대략 100 nM, C2-6에서 대략 50 nM이었고, 이것은 C1-6 및 C10보다 REG4의 발현이 적은 것으로 나타났다(도 6A). 그러나 상기 차이는 그리 우성이지 않다. 추가로 FACS 분석 결과, 50 nM 젬시타빈 처리 후에, REG4-발현세포에서 사멸세포가 더 적은 경향을 나타내었으나, 이는 통계적으로 유의하지 않았다(도 7B). 고농도의 젬시타빈 처리는 사멸세포에 대해 유의한 차이를 나타내지 않았다. 상기 결과는 PK-45P 세포에서 REG4 발현이 젬시타빈에 대한 내성에 영향을 줄 수 있는 것을 나타냈으나, 상기 영향은 그리 강하지 않았다. 그러나 PDAC 세포에서 REG4의 발현은 젬시타빈-기반 화학치료법보다는 방사선에 대한 내성에 영향을 주는 듯하다.Next, REG4-positive or negative cells were treated with a series of concentrations of gemcitabine and their viability was evaluated. As shown in FIG. 7A, REG4-expressing cells (C1-6, C10, C2-6) were less sensitive to gemcitabine than control cells. The IC 50 of gemcitabine for REG4-expressing cells was approximately 100 nM in C1-6 and C10 and approximately 50 nM in C2-6, compared to the IC 50 of the control cell was approximately 30 nM, which is REG4 than C1-6 and C10. Was found to be less (FIG. 6A). However, the difference is not so dominant. In addition, FACS analysis showed less apoptosis in REG4-expressing cells after 50 nM gemcitabine treatment, but this was not statistically significant (FIG. 7B). High concentrations of gemcitabine did not show significant difference for dead cells. The results showed that REG4 expression in PK-45P cells could affect resistance to gemcitabine, but the effect was not so strong. However, expression of REG4 in PDAC cells appears to affect radiation resistance rather than gemcitabine-based chemotherapy.

2. 2. 수술전Preoperative 선행화학-방사선 치료 내성 환자의  Prior Chemo-radiation Treatment of Patients Resistant REG4REG4 발현. Expression.

췌장암에 대한 REG4 발현 및 치료적 내성의 관련도를 평가하기 위해, 수술전 선행화학-방사선 치료(네오-CRT) 후에 췌장선암을 수술로 절제한 환자의 수술 견본을 대상으로 분석하였다. 견본을 3D 공초점 방사선 치료법(전체 50 Gy), 및 동시에 젬시타빈(3주 동안 1 g/m2/주)으로 치료한 후, 8주간 후속치료(follow-up treatment)를 수행하였다. 19개의 수술 견본을 항-REG4 항체로 면역염색한 후, REG4 발현 및 네오-CRT에 대한 병리학적 반응을 평가하였다. 19개의 네오-CRT 수술 견본 중, 9개의 시료는 네오-CRT에 대한 조직학적 반응을 나타냈지만, 10개에서는 나타나지 않았다. REG4 반응에 관련하여, 상기 반응한 9개의 시료 중 오직 2 개만 종양 세포에서 REG4 발현을 나타내었으나(도 8A 및 B), 반면에 10개의 반응하지 않은 시료 중 7개는 REG4 발현을 나타내었다(도 8C 및 D). 상기 REG4 발현은 네오-CRT에 대한 반응과 유의하게 관련되었고(카이제곱 테스트, P=0.0028), 이는 REG4 발현에 의해 화학치료법 및 방사선 치료법과 같은 세포독성 치료 하에서 암세포가 생존하도록 하는 것을 나타낸다.To assess the relevance of REG4 expression and therapeutic resistance to pancreatic cancer, surgical specimens of patients who underwent surgical resection of pancreatic adenocarcinoma after preoperative chemo-radiotherapy (neo-CRT) were analyzed. Samples were treated with 3D confocal radiation therapy (50 Gy total) and simultaneously with gemcitabine (1 g / m 2 / week for 3 weeks) followed by 8 weeks of follow-up treatment. Nineteen surgical specimens were immunostained with anti-REG4 antibody and then assessed for REG4 expression and pathological response to neo-CRT. Of the 19 neo-CRT surgical specimens, 9 samples showed histological response to neo-CRT but not 10. In relation to the REG4 response, only two of the nine samples reacted showed REG4 expression in tumor cells (FIGS. 8A and B), whereas seven of ten unreacted samples exhibited REG4 expression (FIG. 8C and D). The REG4 expression was significantly associated with the response to neo-CRT (chi-square test, P = 0.0028), indicating that cancer cells survive under cytotoxic treatments such as chemotherapy and radiotherapy by REG4 expression.

실시예Example 5 5

췌장암세포에서 In pancreatic cancer cells KIAA0101KIAA0101 의 과발현.Overexpression.

전유전체 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해, 본 발명자들은 췌장종양 세포에서 과발현된 수십 개의 유전자를 분류하였다(Nakamura T., Oncogene, 23: 2385-400, 2004.). 이들 중, 본 발명자들은 본 발명에서 KIAA0101에 집중하였다. 본 발명자들의 상기 마이크로어레이 결과는 본 발명자들이 검사한 췌장암세포의 모든 유익한 대상(14개의 유익한 대상 중 14개는 10배 이상의 발현 신호를 나타냄)에서 KIAA0101의 과발현을 나타내었고, 이의 과발현은 9개의 검사된 미세절편화된 췌장암세포 개체군 중 9개에서 RT-PCR에 의해 확인되었다(도 9A). KIAA0101 cDNA 단편을 탐침으로 사용한 노던블랏팅 분석 결과, 본 발명자들이 검사한 모든 암세포주에 서 높게 발현하는 대략 1.2 kb의 전사체를 분리하였다; 폐, 심장, 간 및 신장을 포함하는 중추기관에서는 발현이 관찰되지 않았다장(도 9B). 또한, KIAA0101에 대한 다클론 항체를 이용하는 면역조직화학적 분석결과, 추가의 5명의 환자의 모든 췌장암 조직 절편에서 췌장암 세포의 핵에서 강한 신호가 나타났다(도 9C). 정상 췌장점막 및 포상세포(도 9C) 및 폐, 심장, 간 및 신장을 포함하는 정상 중추기관에서는 염색이 관찰되지 않았다.Through pregenotypic cDNA microarray analysis, we classified dozens of genes overexpressed in pancreatic tumor cells (Nakamura T., Oncogene, 23: 2385-400, 2004.). Among these, the present inventors focused on KIAA0101 in this invention. The microarray results of the present inventors showed the overexpression of KIAAOl101 in all the beneficial subjects (14 of 14 beneficial subjects showed 10 times or more expression signals) of the pancreatic cancer cells examined by the present inventors, and the overexpression thereof was detected in 9 tests. 9 of the microfractionated pancreatic cancer cell populations identified by RT-PCR (FIG. 9A). Northern blotting analysis using the KIAA0101 cDNA fragment as a probe resulted in the isolation of approximately 1.2 kb of transcript that was highly expressed in all cancer cell lines examined by the inventors; No expression was observed in the central organs including lung, heart, liver and kidney (FIG. 9B). In addition, immunohistochemical analysis using polyclonal antibodies against KIAAOlOl showed strong signals in the nuclei of pancreatic cancer cells in all pancreatic cancer tissue sections of an additional 5 patients (FIG. 9C). No staining was observed in normal pancreatic mucosa and acinar cells (FIG. 9C) and normal central organs including lung, heart, liver and kidney.

실시예Example 6 6

췌장암세포 성장에 대한 About pancreatic cancer cell growth siRNAsiRNA 에 의한 On by KIAA0101KIAA0101 녹다운 효과. Knockdown effect.

암세포에서 KIAA0101 과발현의 생물학적 유의성 및 암 치료를 위한 분자 표적으로서의 가능성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 KIAA0101 mRNA 서열에 특이적인 siRNA-발현 벡터를 여러 개 제조하였고, 내재적으로 KIAA0101 mRNA를 고발현하는 KLM-1 및 MIA-PaCa2에 형질감염하였다. 본 발명자들이 #759si 구조물을 사용하였을 때의 녹다운 효과를 RT-PCR로 확인하였다(도 10A). KLM-1을 이용한 콜로니 형성 검사(도 10B) 및 MTT 검사(도 10C) 결과, 녹다운 효과가 없는 EGFPsi와 비교하여서 #759si로 형질감염된 세포의 개수가 더욱 감소하는 것으로 나타났다. MIA-PaCa2 세포주에서도 유사한 효과가 나타났다. 상기 발견들은 KIAA0101이 암세포 증식에 중요한 역할을 수행하는 것과, KIAA0101 기능의 억제가 암치료를 위한 신규의 분자 표적으로의 가능성을 나타낸다.In order to investigate the biological significance of KIAA0101 overexpression in cancer cells and the potential as a molecular target for cancer treatment, we have prepared several siRNA-expression vectors specific for KIAA0101 mRNA sequence and implicitly express KLMA0101 mRNA. 1 and MIA-PaCa2. The knockdown effect when the inventors used the # 759si structure was confirmed by RT-PCR (FIG. 10A). Colony formation test using KLM-1 (FIG. 10B) and MTT test (FIG. 10C) showed that the number of cells transfected with # 759si was further reduced compared to EGFPsi without knockdown effect. Similar effects were seen in the MIA-PaCa2 cell line. The findings indicate that KIAA0101 plays an important role in cancer cell proliferation and that inhibition of KIAA0101 function is a potential new molecular target for cancer therapy.

실시예Example 7 7

내재성Immanence KIAA0101KIAA0101 의 과발현은 암세포 성장을 촉진하여Overexpression promotes cancer cell growth NIH3T3NIH3T3 을 전환한다.Switch.

KIAA0101의 잠재적 발암성을 추가로 탐색하기 위해, 본 발명자들은 구조적으로 내재성 KIAA0101을 발현하는, PK45P-유래 세포주인 PK45P-KIAA0101의 여러 개의 클론을 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 공벡터(PK45P-Mock)로 형질감염된 대조군 PK-45P 세포를 제조하였고, 이들의 성장률을 비교하였다. 웨스턴 블랏팅 분석 결과(도 11A), 6개의 클론에서 내재성 KIAA0101 발현이 확인되었다. MTT 검사에 의해 측정된 상기 성장곡선을 통해, PK45P-KIAA0101의 6개의 클론(실선)이 4개의 PK45P-Mock 클론(점선, 도 11B)보다 유의하게 더욱 빠르게 성장하는 것으로 나타났고, 이는 KIAA0101 발현에 의해 암세포의 증식이 강화되는 것을 나타낸다.In order to further explore the potential carcinogenicity of KIAA0101, we have produced several clones of PK45P-derived cell line PK45P-KIAA0101 that structurally express the endogenous KIAA0101. In addition, we prepared control PK-45P cells transfected with an empty vector (PK45P-Mock) and compared their growth rate. Western blotting analysis (FIG. 11A) confirmed endogenous KIAA0101 expression in six clones. The growth curve measured by the MTT test showed that six clones (solid line) of PK45P-KIAA0101 grew significantly faster than four PK45P-Mock clones (dotted line, FIG. 11B), which resulted in KIAA0101 expression. This shows that the proliferation of cancer cells is enhanced.

본 발명자들이 검사한 세포주 중, 오직 정상 마우스 NIH3T3 세포주만 KIAA0101 상동체의 발현을 나타내지 않았고, 본 발명자들은 NIH3T3에서 KIAA0101을 발현시켰고, KIAA0101 과발현에 의해 NIH3T3을 세포내에서 전환하는 지를 조사하였다. 도 11C에 나타난 바와 같이, NIH3T3-KIAA0101의 세 개의 클론은 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 종양을 형성하였으나, 반면에 NIH3T3-Mock는 왼쪽 옆구리에 종양을 형성하지 않았고, 상기 종양의 면역조직화학적 염색을 통해 종양 세포의 핵에서 KIAA0101의 양성 염색을 확인하였다(도 11D). 상기 결과는 KIAA0101이 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 능력을 갖는 것을 지시한다.Of the cell lines we examined, only normal mouse NIH3T3 cell lines did not show expression of KIAA0101 homologues, and we expressed KIAA0101 in NIH3T3 and investigated whether NIH3T3 is intracellularly converted by KIAA0101 overexpression. As shown in FIG. 11C, three clones of NIH3T3-KIAA0101 formed tumors in the right flank of nude mice, whereas NIH3T3-Mock did not form tumors in the left flank, and through immunohistochemical staining of the tumor Positive staining of KIAA0101 was confirmed in the nuclei of tumor cells (FIG. 11D). The results indicate that KIAAOlOl has the ability to convert normal cells into tumor cells.

실시예Example 8 8

KIAA0101KIAA0101 단백질의 복합체로서  As a complex of proteins PCNAPCNA , , POLD1POLD1 , , FEN1FEN1 의 분리.Separation.

추가로 KIAA0101의 생물학적 기능을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 KIAA0101 단백질과의 복합체를 확인하기 위해 KIAA0101에 대한 다클론 항체를 이용하여 면역침강을 수행하였다. SDS-PAGE 겔에서 분리된 은염색된 면역침강된 분획에서, 대조군 시료와 비교하여 암세포 세포분해물 중에서 여러 개의 단백질이 KIAA0101 단백질과 함께 면역침강된 것으로 나타났다(도 12A). 겔 트립신 분해 후, 각각의 단백질을 MALDI-TOF 시스템으로 분석하였다; 그 결과 PCNA, POLD1(polymerase p125 subunit) 및 FEN1(flap endonuclease-1)으로 확인되었다. 상기 상호작용은 면역침강 실험에 의해 도 12B에서 확인되었다. 상기 단백질들 모두는 DNA 복제/수선과 관련되어 있었고, POLD1 및 FEN1도 KIAA0101 뿐만 아니라 PCNA에도 결합하는 것으로 나타났고(Jonsson et al.,(1998) EMBO J. Apr 15;17(8):2412-25, Zhang et al.,(1999) J Biol Chem. Sep 17;274(38):26647-53; Bruning & Shamoo(2004) Structure. Dec;12(12):2209-19.), KIAA0101이 PCNA와의 상호작용을 통해 DNA 복제에 포함될 수 있는 것을 제안한다.To further investigate the biological function of KIAA0101, we performed immunoprecipitation using polyclonal antibodies against KIAA0101 to identify complexes with KIAA0101 protein. In the silver stained immunoprecipitated fractions isolated on the SDS-PAGE gel, several proteins in the cancer cell cytolyte were immunoprecipitated with the KIAAOlO protein compared to the control sample (FIG. 12A). After gel trypsin digestion, each protein was analyzed by MALDI-TOF system; As a result, it was identified as PCNA, POLD1 (polymerase p125 subunit) and FEN1 (flap endonuclease-1). This interaction was confirmed in FIG. 12B by immunoprecipitation experiments. All of these proteins were involved in DNA replication / repair, and POLD1 and FEN1 were found to bind to PCNA as well as KIAA0101 (Jonsson et al. al ., (1998) EMBO J. Apr 15; 17 (8): 2412-25, Zhang et. al ., (1999) J Biol Chem. Sep 17; 274 (38): 26647-53; Bruning & Shamoo (2004) Structure. Dec; 12 (12): 2209-19.), Suggests that KIAAOlOl can be included in DNA replication via interaction with PCNA.

실시예Example 9 9

세포투과성 우성 장애 펩티드에 의한 Caused by cell permeable dominant disorder peptides KIAA0101KIAA0101 및  And PCNAPCNA 사이의 상호작용의 억제. Suppression of interaction between them.

KIAA0101의 보존된 PIP 박스 모티프를 통한 KIAA0101 및 PCNA 사이의 상호작용을 억제하기 위하여, 본 발명자들은 상기 PIP 박스를 포함하는 우성 장애 펩티드를 설계하였고, 이것을 세포 투과성을 촉진하기 위한 아르기닌(R)-반복과 결합하였 다(도 13A). 세포관 연구에서, 본 발명자들은 PCNA 및 KIAA0101 사이의 상호작용의 억제를 면역침강에 의해 증명하였다. PIP20의 존재하에서, PCNA는 KIAA0101과 면역침강하지 않았으나, 반면에 보존된 잔기가 알라닌(도 13A) 및 스크램블 펩티드로 치환된 PIP20mut는 상기 상호작용에 영향을 주지 않았다(도 13B). 이후, 상기 펩티드로 암세포 및 정상 섬유아세포 NIH3T3 세포를 처리함으로써, 상기 펩티드의 암세포 성장을 억제하는 지를 평가하였다. 마우스 KIAA0101(NP_080791)은 인간의 그것과 높은 상동성을 갖고, 인간 KIAA0101에서 우성 장애 펩티드에 대한 표적 영역은 마우스 KIAA0101과 100% 동일하였다. 도 13C는 PIP20mut 및 스크램블 펩티드와는 달리 PIP20에 의해 농도 의존적으로 암세포의 성장이 억제되는 것을 증명한다. 반면에, PIP20은 인간 KIAA0101의 상동체를 발현하지 않는 마우스 정상 세포주 NIH3T3 세포의 성장에 영향을 주지 않았다. 상기 결과는 PIP20이 KIAA0101을 표적화함으로써 세포 성장을 특이적으로 억제하는 것을 지시한다.In order to inhibit the interaction between KIAA0101 and PCNA through the conserved PIP box motif of KIAA0101, we designed a dominant hindered peptide comprising the PIP box and arginine (R) -repeats to promote cell permeability. Combined with (FIG. 13A). In cell tube studies, we demonstrated the inhibition of the interaction between PCNA and KIAAOlOl by immunoprecipitation. In the presence of PIP20, PCNA did not immunoprecipitate with KIAAOlOl, whereas PIP20mut with conserved residues substituted with alanine (Figure 13A) and scrambled peptide did not affect this interaction (Figure 13B). Then, by treating cancer cells and normal fibroblast NIH3T3 cells with the peptide, it was evaluated whether to inhibit the cancer cell growth of the peptide. Mouse KIAA0101 (NP_080791) had high homology with that of humans, and the target region for dominant disorder peptides in human KIAA0101 was 100% identical to mouse KIAA0101. Figure 13C demonstrates that, unlike PIP20mut and scrambled peptides, growth of cancer cells is inhibited by PIP20 in a concentration dependent manner. In contrast, PIP20 did not affect the growth of mouse normal cell line NIH3T3 cells that did not express homologs of human KIAAOlOl. The results indicate that PIP20 specifically inhibits cell growth by targeting KIAAOlOl.

다음으로, 본 발명자들은 PIP 박스 모티프가 유지되도록 N- 및 C-측면 영역의 일부 잔기를 결실시킴으로써, 짧은 PIP 펩티드를 설계하였고(도 13A에 나타난 PIP16 및 PIP16mut), 이들로 암세포주 및 NIH3T3 세포를 처리하였다. PIP16 처리에 의해 암세포의 성장은 강하게 억제하였으나, PIP16은 NIH3T3 성장에도 영향을 주었고, 이의 성장-억제성 효과는 PIP20 뿐만 아니라 PIP 박스 모티프의 보존된 잔기를 알라닌으로 치환함으로써 없어졌다(도 13D). 상기 발견은 PIP16이 KIAA0101에 특이적으로 영향을 주는 것이 아니라, PCNA 및 다른 DNA 복제 단백질의 상호작용에 영향을 주는 것을 제안한다.Next, we designed short PIP peptides (PIP16 and PIP16mut shown in Figure 13A) by deleting some residues in the N- and C-lateral regions so that the PIP box motif is maintained, thereby resulting in cancer cell lines and NIH3T3 cells. Treated. PIP16 treatment strongly inhibited the growth of cancer cells, but PIP16 also affected NIH3T3 growth, and its growth-inhibitory effect was lost by substituting alanine for the conserved residues of the PIP box motif as well as PIP20 (FIG. 13D). The findings suggest that PIP16 does not specifically affect KIAAOlOl but rather affects the interaction of PCNA and other DNA replication proteins.

논의Argument

본 발명은 PDAC 치료를 위한 분자 표적으로서의 가능성을 증명한다. 췌장 발암 또는 진행에서 분비된 REG4의 역할 또는 기능을 조사하기 위해, 본 발명자들은 PDAC 세포주에서 내재성 REG4의 발현을 siRNA로 녹다운 시켰고, 암세포를 재조합 REG4에 노출시켰다. 상기 실험을 통해 얻은 결과는 REG4가 자동분비/부분비 성장 인자로서 기능을 하며, 미지의 수용체를 통해 Akt 신호전달 경로를 조정하는 것을 나타낸다. 그러나 어떻게 REG4가 Akt 신호전달 경로를 조정하는 지는 알려지지 않았고, REG4 수용체의 분리와 함께 추가로 연구되어야 할 주제이다(Kobayashi S, et al. J Biol Chem 2000; 275: 10723-6.).The present invention demonstrates its potential as a molecular target for PDAC treatment. To investigate the role or function of REG4 secreted in pancreatic carcinogenesis or progression, we knocked down expression of endogenous REG4 with siRNA in PDAC cell lines and exposed cancer cells to recombinant REG4. The results obtained through this experiment indicate that REG4 functions as an autosecretory / partial growth factor and modulates the Akt signaling pathway through an unknown receptor. However, how REG4 modulates the Akt signaling pathway is unknown and is a subject that should be further studied with the isolation of REG4 receptors (Kobayashi S, et al . J Biol Chem 2000; 275: 10723-6.).

최근 연구결과는 REG4 및 다른 패밀리 구성원인, REG1이 대장암 또는 위암에 대해 Akt 경로를 통해 항-세포사멸 인자로서의 기능을 하는 것으로 보고하였고(Sekikawa A, et al. Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.), 본 발명은 분비된 REG4의 처리에 의해 활성화된 경로 및 Akt 신호전달 경로가 암 성장 또는 항-세포사멸과 관련된 REG 패밀리 신호전달의 하류 경로일 수 있다는 것을 증명하였다. REG 패밀리는 조직 손상 또는 재생 과정에서 발현되고, 조직 재생에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 예측된다(Unno M, et al. Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6., Zhang YW, et al. World J Gastroenterol 2003; 9: 2635-41.). REG4 및 다른 REG 구성원에 의한 Akt 신호전달 경로 활성화를 고려하면, 암의 화학치료법 또는 방사선 치료법에 대한 민 감도와 관련될 수 있고, 생체내 또는 생체외에서 REG4 발현 및 화학-방사선 치료법의 효과 사이의 관련성을 연구하는 것이 흥미로울 수 있다.Recent studies have reported that REG4 and other family members, REG1, function as anti-apoptotic factors through the Akt pathway for colorectal or gastric cancer (Sekikawa A, et. al . Gastroenterology 2005; 128: 642-53., Bishnupuri KS, et al . Gastroenterology 2006; 130: 137-49.), The present invention demonstrated that the pathway activated by the treatment of secreted REG4 and the Akt signaling pathway may be downstream of REG family signaling associated with cancer growth or anti-cell death. The REG family is expressed during tissue damage or regeneration and is predicted to play an important role in tissue regeneration (Unno M, et. al . Adv Exp Med Biol 1992; 321: 61-6., Zhang YW, et al . World J Gastroenterol 2003; 9: 2635-41.). Considering the activation of Akt signaling pathways by REG4 and other REG members, it may be related to sensitivity to chemotherapy or radiation therapy of cancer and relate the relationship between REG4 expression and the effect of chemo-radiotherapy in vivo or ex vivo. May be interesting to study.

본 발명의 REG4에 특이적인 단클론 항체가 세포외에서 배양액으로 분비된 REG4를 중화하였고, 상기 중화 항체를 처리함으로써 REG4 자동분비/부분비 경로 및 이어서 Akt 인산화를 차단하여 PDAC 세포 성장을 억제하는 것에 주목할 필요가 있다. 상기 발견은 REG4를 표적화하는 중화 항체 치료법의 가능성을 제시한다. VEGF에 대한 인간화 단클론 항체인 베바시주맙(Bevacizumab)은 전이성 결장암의 일선의 치료에 정맥내 5-플루러유러실(5-fluorouracil)을 포함하는 섭생과 조합하여 일반적으로 입증되고 있다. 게다가 HGF(Burgess T, et al. Cancer Res. 2006; 66: 1721-9.) 및 IL-6(Trikha M, et al. Clin Cancer Res 2003; 9: 465365.)와 같은 순환성 리간드에 대한 항체인 항-신생혈관형성 인자 항체는 항암 치료제로 검토되었고, REG4를 표적화하는 중화항체 치료법도 PDAC 및 다른 REG4를 발현하는 암에 대한 신규의 치료 전략으로 제공될 수 있다.It should be noted that monoclonal antibodies specific for REG4 of the present invention neutralized REG4 secreted into the culture extracellularly and inhibiting PDAC cell growth by blocking the REG4 auto secretion / partial pathway and then Akt phosphorylation by treating the neutralizing antibody. There is. The findings suggest the possibility of neutralizing antibody therapy targeting REG4. Bevacizumab, a humanized monoclonal antibody against VEGF, is generally demonstrated in combination with a regimen that includes intravenous 5-fluorouracil in the first line of treatment of metastatic colon cancer. In addition, HGF (Burgess T, et al . Cancer Res. 2006; 66: 1721-9.) And IL-6 (Trikha M, et. al . Clin Cancer Res 2003; 9: 465365.), anti-angiogenic factor antibodies that are antibodies to circulating ligands have been reviewed as anticancer agents, and neutralizing antibody therapies targeting REG4 are also novel therapeutic strategies for cancers expressing PDAC and other REG4. It may be provided as.

결론적으로, 본 발명자들은 PDAC에 대한 혈청 진단 마커 및 PDAC 치료를 위한 분자 표적으로써 REG4의 잠재적 가능성을 나타내었고, REG4를 표적화하는 신규 전략을 그 외의 탐색 방법 또는 항암 치료 전략과 조합함으로써, PDAC의 진단은 현재의 참담한 진단보다 더욱 용이하게 될 수 있다.In conclusion, we have shown the potential of REG4 as a serum diagnostic marker for PDAC and a molecular target for PDAC treatment, and by combining a novel strategy of targeting REG4 with other screening or anticancer treatment strategies, the diagnosis of PDAC Can be made easier than the current terrible diagnosis.

또한, 본 발명자들은 췌장암세포에서 과발현되는 유전자 중 하나인 KIAA0101을 분리하였다. RNA 수준에서 인간 암에 대한, 본 발명자들의 마이크로어레이 분석 정보 및 일부 보고들(Peiwen et al.,(2001) Oncogene, 20: 484-9; Mizutani et al.,(2005) Cancer, 103: 1785-90)에 따르면, 여러 다른 암세포에서도 KIAA0101이 과발현되었고, 이는 고 증식성 세포에서 일반적으로 관찰되었다. 항-KIAA0101 항체를 이용한 면역화학조직 분석 결과, KIAA0101은 암세포에서 고발현되었고, 증식성 세포가 존재하는 정상 장 점막(intestinal mucosa)의 장샘(crypt) 및 림프절의 배심(germinal center)에서 일부 수준으로 고발현되었다. 그리고 KIAA0101 발현은 세포 주기 의존적이었고, 이의 발현은 DNA 복제가 가장 활성화된 S 기에서 가장 높았고(데이타는 기재하지 않았음), 이는 KIAA0101 발현이 세포 증식에 관련된 것을 강하게 나타내었다. 실질적으로 siRNA에 의한 KIAA0101의 녹다운은 본 발명에서 암세포의 세포 증식을 억제하였고, 이전의 보고에서 효모 2 잡종(two-hybrid) 시스템을 이용하여 KIA0101를 PCNA-결합 단백질로서 분리하였다(Yu et al.,(2001)Oncogene, 20: 484-9).In addition, the present inventors isolated KIAA0101, one of genes overexpressed in pancreatic cancer cells. Microarray analysis information and some reports of our inventors on human cancer at the RNA level (Peiwen et al ., (2001) Oncogene, 20: 484-9; Mizutani et al ., (2005) Cancer, 103: 1785-90), KIAAOl101 was overexpressed in several other cancer cells, which is generally observed in high proliferative cells. Immunohistochemical analysis using anti-KIAA0101 antibody revealed that KIAA0101 was highly expressed in cancer cells and at some level in the crypt of the intestinal mucosa and in the germinal center of lymph nodes where proliferative cells were present. High expression. And KIAAOlOl expression was cell cycle dependent and its expression was highest in S phase where DNA replication was most active (data not shown), indicating strongly that KIAAOlOl expression is involved in cell proliferation. Substantially knockdown of KIAA0101 by siRNA inhibited cell proliferation of cancer cells in the present invention, and KIA0101 was isolated as a PCNA-binding protein using a yeast two-hybrid system in a previous report (Yu et al. al ., (2001) Oncogene, 20: 484-9).

PCNA는 DNA 복제 및 DNA 수선 과정에서 필수적인 보조 단백질이고, DNA 주형을 따라서 움직이는 클램프 플랫폼으로 작용하며, 수많은 합성 또는 대사효소와 상호작용한다(Wyman 및 Botchan,(1995) Curr Biol., 5: 334-7; Warbrick,(2000) Bioessays, 22: 997-1006; Krishna et al.,(1994) Cell, 79: 1233-43). 또한 본 발명자들은 본 명세서에서 KIAA0101이 보존된 PIP 박스 모티프를 통해 PCNA에 직접적으로 결합하며, KIAA0101이 PCNA와 결합하거나 p21과 같은 다른 PCNA 결합 파트너(Waga et al.,(1994) Nature 369: 574-8; Chen et al.,(1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et al.,(2005) PNAS, 102: 1871-6)들과 경쟁하여 PCNA 기능을 도울 수 있는 것을 나타내었다. 본 발명에서, 본 발명자들은 상기 PIP 박스 모티 프에 집중하였으며, PCNA 및 KIAA0101의 상호작용을 특이적으로 억제하기 위하여 세포 투과성 알지닌-반복체와 결합한 우성 장애 펩티드를 설계하였다. PIP20은 농도 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였으나, PIP20mut은 억제하지 않았고, PIP20은 KIAA0101을 발현하지 않는 NIH3T3의 성장에 영향을 주지 않았으며, 이는 이의 특이성응ㄹ 나타낸다.PCNA is an essential accessory protein for DNA replication and DNA repair, acts as a clamping platform along the DNA template, and interacts with numerous synthetic or metabolic enzymes (Wyman and Botchan, (1995) Curr Biol., 5: 334-). 7; Warbrick, (2000) Bioessays, 22: 997-1006; Krishna et al ., (1994) Cell, 79: 1233-43). We also bind directly to PCNA through a PIP box motif in which KIAA0101 is conserved herein, and KIAA0101 binds to PCNA or other PCNA binding partners such as p21 (Waga et al. al ., (1994) Nature 369: 574-8; Chen et al ., (1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et al ., (2005) PNAS, 102: 1871-6), have shown that it can help PCNA function. In the present invention, we focused on the PIP box motif and designed a dominant hindered peptide bound to cell permeable arginine-repeat to specifically inhibit the interaction of PCNA and KIAAOlOl. PIP20 inhibited the growth of cancer cells in a concentration dependent manner, but did not inhibit the PIP20mut, PIP20 did not affect the growth of NIH3T3 that does not express KIAA0101, indicating its specificity.

흥미롭게도, 본 발명자들은 PIP 박스를 유지하도록 PIP20의 측면 영역에서 일부 잔기를 제거함으로써, 더 짧아진 PIP16 및 PIP16 펩티드를 설계하였고, 이들은 PIP20보다 더욱 강하게 암세포 성장을 억제하였으나, KIAA0101-PCNA 상호작용에 대한 특이성이 소실된 것 같다. PCNA는 PIP 박스 모티프를 통해 수많은 단백질과 상호작용하며(Wyman 및 Botchan,(1995) Curr Biol., 5: 334-7; Warbrick,(2000) Bioessays, 22: 195-1006; Krishna et al.,(1994) Cell, 79: 1233-43; Chen et al.,(1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et al.(2005) PNAS, 102: 1871-6), PIP16이 PCNA 및 세포 증식에서 중요한 역할을 수행하며 편재하여 발현되는 다른 많은 단백질 사이의 상호작용을 억제할 가능성이 있다. PIP20의 측면 잔기는 KIAA0101 및 PCNA의 특이적 억제에 중요한 것으로 사료된다. 유사한 방식으로 p21 PIP 박스로부터 유래된, 역시 PCNA와 상호작용할 수 있는 상기 펩티드는 암세포를 추적 및 사멸하여, PCNA-의존적 DNA 복제를 억제함으로써, 암 치료를 위한 전략으로의 가능성이 있다(Chen et al.,(1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et al.(2005) PNAS, 102: 1871-6).Interestingly, we designed shorter PIP16 and PIP16 peptides by removing some residues in the flank region of PIP20 to maintain the PIP box, which inhibited cancer cell growth more strongly than PIP20, but not in KIAA0101-PCNA interactions. Specificity seems to have been lost. PCNA interacts with numerous proteins through PIP box motifs (Wyman and Botchan, (1995) Curr Biol., 5: 334-7; Warbrick, (2000) Bioessays, 22: 195-1006; Krishna et al ., (1994) Cell, 79: 1233-43; Chen et al ., (1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et . al (2005) PNAS, 102 : 1871-6), PIP16 are likely to inhibit the interaction between a number of other proteins that play an important role in cell growth and PCNA, and the ubiquitous expression. The flanking residues of PIP20 are believed to be important for the specific inhibition of KIAAOlOl and PCNA. Peptides derived from the p21 PIP box, which can also interact with PCNA in a similar manner, have the potential to be a strategy for cancer treatment by tracking and killing cancer cells to inhibit PCNA-dependent DNA replication (Chen et al. al ., (1996) Nucl Acid Res 24: 1727-33; Kontopidis et al . (2005) PNAS, 102: 1871-6).

세포내 단백질-단백질 상호작용은 많은 신호전달 경로에서 주요 대조 지점을 구성하나, 그러나 종종 비싸고, 얕으며, 소수성인 단백질 경계면을 반영하는 소분자 화학에 종종 어려운 표적을 증명하였다성(Walensky et al.,(2004) Science, 305: 1446-70). 비록 펩티드가 단백질-단백질 상호작용을 안정화 또는 파괴하는 흥미로운 후보물질이더라도, 생체내 시약으로서의 효능은 2차 구조의 소실, 단백질 파괴에 대한 감수성 및 접촉 세포로의 투과의 어려움 등에 의해 현저하게 떨어질 수 있다. 그러나 최근의 펩티드 변형에 대한 보고들은 ‘의약품이 될만한 표적(druggable target)'(Walensky et al.,(2004) Science, 305: 1446-70)으로서의 가능성, 추가로 표적화 단백질-단백질 상호작용의 구조적 분석(Kontopidis et al.,(2005) PNAS, 102: 1871-6) 또는 DDS 개선은 더 큰 약제 개발에 대한 매력 및 잠재적 가능성을 갖는 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 펩티드를 제공할 수 있다.Intracellular protein-protein interactions constitute a key control point in many signaling pathways, but have often proved a difficult target for small molecule chemistry that reflects expensive, shallow, hydrophobic protein interfaces (Walensky). et al ., (2004) Science, 305: 1446-70. Although peptides are interesting candidates for stabilizing or disrupting protein-protein interactions, their efficacy as in vivo reagents can be markedly degraded by loss of secondary structure, susceptibility to protein destruction, and difficulty in penetration into contact cells. . However, recent reports of peptide modifications have been `` druggable targets '' (Walensky). et al ., (2004) Science, 305: 1446-70), further structural analysis of targeting protein-protein interactions (Kontopidis et al ., (2005) PNAS, 102: 1871-6) or DDS improvement Peptides that inhibit protein-protein interactions with attractiveness and potential for large drug development can be provided.

도 1은 PDAC 세포에서의 REG4 mRNA와 단백질의 발현량을 나타낸 것이다. (A) 정량적 대조군으로서 현미 해부한 PDAC 세포에서의 REG4 및 TUBA를, 정상 췌장에서 현미 해부한 정상 췌장 관 상피세포(normal pancreatic ductal epithelial cells, NPD); 및 심장, 폐, 간, 신장 및 뇌를 포함하는 정상 중요 기관에서의 REG4를 TUBA와 RT-PCR 분석으로 비교한 결과이다. (B, C, D) 항REG4 항체를 이용한 면역화학적 연구에 있어서, PDAC 세포에서 강한 염색이 관찰되었다. REG4의 분비를 암시하는 REG4의 양성 염색은 세포질 미립자로서 관찰되었고(B), 세포막에서 관찰되었다(C). 정상 췌장 조직에서는 포상세포(acinar cells)가 아주 희미하게 염색되었으나, 정상 관 상피세포(normal ductal epithelium cells), 췌도 세포(islet cells)에서는 염색이 되지 않았다(D).Figure 1 shows the expression level of REG4 mRNA and protein in PDAC cells. (A) Normal pancreatic ductal epithelial cells (NPD) in which REG4 and TUBA in brown rice dissected PDAC cells were microscopically dissected in normal pancreas as a quantitative control; And REG4 in normal critical organs, including heart, lung, liver, kidney and brain, by TUBA and RT-PCR analysis. In immunochemical studies with (B, C, D) anti-REG4 antibodies, strong staining was observed in PDAC cells. Positive staining of REG4 suggesting secretion of REG4 was observed as cytoplasmic particulates (B) and on the cell membrane (C). Acinar cells were stained very faintly in normal pancreatic tissue, but not in normal ductal epithelium cells and islet cells (D).

도 2는 췌장암 세포 성장의 약화를 초래하는 siRNA에 의한 REG4의 발현의 녹다운(knockdown) 결과를 나타낸 것이다. REG4 발현의 녹다운 효과를 REG4에 대한 siRNA (REG4-si2)를 발현하는 벡터와 음성 대조군 벡터(siEGFP)로 형질 전환된 세포를 이용하여 반 정량적 RT-PCR로 평가하였다(A). β-2-㎎는 RNA의 정량을 위하여 사용하였다. EGFPsi는 REG4 전사체 양에 아무런 효과도 보이지 않았지만, REG4-si2는 강력한 녹다운 효과를 나타내었다(B, C). REG4-si2벡터를 SUIT-2에 형질도입 시킨 결과, REG4에 대해 어떠한 녹다운 효과도 나타내지 않은 EGFPsi 벡터로 형질 도입된 세포와 비교하여 볼 때, MTT 분석에 의해 측정된 살아있는 세포의 수가 급격하게 감소하는 것으로 나타났고(B) 콜로니 형성수도 감소하였다(C). 컬럼은 제네티신(Geneticin)으로 일주일 간 배양시킨 후 세 번 실험한 평균 흡광도를 나타낸 것이고; 바는 표준편차이다. *p < 0.01 (스튜던트 t검정) MTT 분석(B). 2 shows knockdown results of expression of REG4 by siRNA leading to attenuation of pancreatic cancer cell growth. The knockdown effect of REG4 expression was assessed by semi-quantitative RT-PCR using a vector expressing siRNA (REG4-si2) and negative control vector (siEGFP) for REG4. β-2-mg was used for quantification of RNA. EGFPsi showed no effect on the amount of REG4 transcript, but REG4-si2 showed a strong knockdown effect (B, C). Transduction of the REG4-si2 vector into SUIT-2 resulted in a dramatic decrease in the number of viable cells measured by the MTT assay as compared to cells transfected with EGFPsi vectors that did not show any knockdown effect on REG4. (B) the number of colony formations also decreased (C). The column shows the average absorbance of three experiments after incubation with Geneticin for one week; Bars are standard deviations. * p <0.01 (Student's t-test) MTT assay (B).

도 3은 PDAC 세포에서 rhREG4의 성장 촉진 효과를 나타낸 것이다. (A)생활성을 가진 rhREG4는 포유동물세포(FreeStyle™ 293)에서 생성되었다. 상기 rhREG4는 SDS-PAGE로 정제 및 분석하고 나서 쿠마시 염색(왼쪽) 및 REG4 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(오른쪽). PK-45P 세포를 0, 0.1, 1 및 10 nM rhREG4와 함께 배양하였고, 1%의 FBS를 공급하였다(B). rhREG4의 처리 시 투여량 의존적으로 PK-45P세포의 증식이 촉진되었다. 데이터 점은, 세 번 실험하여 0일째와 비교한 흡광도의 비율을 평균으로 나타내었다; 바는 표준편차, *p < 0.01 (스튜던트 t검정). PK-45P 세포에 0, 0.1, 1 및 10 nM 로 rhREG4를 처리하였을 때, 투여량 의존적으로 Akt (Ser473)의 인산화가 증가하였다(C). 인산화된 Akt는 인산화된 Akt (Ser473)에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해서 검출하였으며, 상기 블롯을 Akt에 대한 항체를 사용하여 재탐지하여 Akt의 총량을 평가하였다. Figure 3 shows the growth promoting effect of rhREG4 in PDAC cells. (A) Bioactive rhREG4 was produced in mammalian cells (FreeStyle ™ 293). The rhREG4 was purified and analyzed by SDS-PAGE followed by Western blot using Coomassie staining (left) and REG4 specific antibodies (right). PK-45P cells were incubated with 0, 0.1, 1 and 10 nM rhREG4 and fed 1% FBS (B). Dose-dependent treatment of rhREG4 promoted proliferation of PK-45P cells. The data points represent the average of the absorbance ratios compared to day 0 on three experiments; Bars are standard deviation, * p <0.01 (Student's t-test). When rhREG4 was treated with PK-45P cells at 0, 0.1, 1 and 10 nM, dose-dependent phosphorylation of Akt (Ser473) increased (C). Phosphorylated Akt was detected by Western blot using antibodies specific for phosphorylated Akt (Ser473), and the blot was redetected using an antibody against Akt to assess the total amount of Akt.

도 4는 항 REG4 단일 클론 항체의 중화와 성장 억제 효과를 나타낸 것이다. 항 REG4 항체의 결합 친화도는 SUIT-2의 배양 배지를 이용한 면역 침각에 의해 평가한 후 항REG4 pAb를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하였다(A). 항 REG4 mAb 및 pAb는 높은 친화도로 SUIT-2 배양 세포로부터 REG4를 면역 침강시켰다. 항 REG4 항체의 처리가 rhRNA의 성장 촉진 효과를 상쇄하는 것을 나타낸 것이다(B). PK-45P는 항REG4 mAb가 존재 또는 부재 시 모두 10 nM rhRNA에 의해서 자극되었다. (-) 배지에서 성장한 세포와 비교한 흡광도의 비율을 세 번 실험을 평균하여 기둥으로 나타내었다; 바는 표준편차. *p < 0.01 (스튜던트 t검정). 다양한 농도의 항REG4 항체의 SUIT-1(REG4 양성) 및 MIAPaCa-2 (REG4-음성) 세포의 성장에 대한 영향을 나타낸 것이다(C). 각 세포주를 다양한 농도의 항REG4 mAb 존재 하에서 배양하였다. 항REG4 mAb의 처리는 REG4를 발현하지 않는 MIAPaCa-2 세포에서는 아무런 효과를 보이지 않았지만, SUIT-2 세포에서는 투여량 의존적으로 성장을 억제하였다. 데이터 에서 점은(-) 배지에서 성장한 세포 대비 흡광도의 비율을 세 번 실험하여 평균한 것이고; 바는 표준편차이다. *p < 0.01 (스튜던트 t검정). 항REG4 mAb의 처리는 rhRNA에 의해 자극된 Akt의 인산화를 상쇄시켰다(D). PK-45P 세포는 항REG4 mAb가 존재 또는 부재하는 조건에서 10 nM rhRNA를 처리하였다. Akt의 인산화는 인산화된 Akt (Ser473)에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통하여 평가되었으며, 상기 블롯을 Akt에 대한 항체를 사용하여 재탐지하여 Akt의 총량을 평가하였다. 1, 무자극; 2, 1O nM rhREG4; 3, 1O nM rhREG4 + 항REG4 mAb.Figure 4 shows the neutralization and growth inhibitory effect of the anti-REG4 monoclonal antibody. The binding affinity of the anti REG4 antibody was assessed by immunoprecipitation with the culture medium of SUIT-2 followed by Western blot using anti REG4 pAb (A). Anti-REG4 mAb and pAb immunoprecipitated REG4 from SUIT-2 cultured cells with high affinity. Treatment with anti-REG4 antibodies counteracts the growth promoting effect of rhRNAs (B). PK-45P was stimulated by 10 nM rhRNA both in the presence or absence of anti-REG4 mAb. The ratio of absorbance compared to cells grown in (-) medium is shown as columns with the average of three experiments; Bars are standard deviation. * p <0.01 (student's t-test). The effect of varying concentrations of antiREG4 antibody on the growth of SUIT-1 (REG4 positive) and MIAPaCa-2 (REG4-negative) cells is shown (C). Each cell line was incubated in the presence of varying concentrations of anti-REG4 mAb. Treatment with anti-REG4 mAb showed no effect on MIAPaCa-2 cells that did not express REG4, but dose-dependently inhibited growth in SUIT-2 cells. The point in the data is the average of three experiments of the ratio of absorbance to cells grown in (-) medium; Bars are standard deviations. * p <0.01 (student's t-test). Treatment of anti-REG4 mAb offset the phosphorylation of Akt stimulated by rhRNA (D). PK-45P cells were treated with 10 nM rhRNAs in the presence or absence of anti-REG4 mAb. Phosphorylation of Akt was assessed by Western blot using antibodies specific for phosphorylated Akt (Ser473), and the blot was redetected using an antibody against Akt to assess the total amount of Akt. 1, no stimulation; 2, 10 nM rhREG4; 3, 10 nM rhREG4 + anti-REG4 mAb.

도 5는 항REG4 항체의 처리가 in vivo에서 췌장암 세포의 성장을 억제하는 것을 나타낸 것이다. 누드마우스로 주입한 종양 용적은 일주일에 두 번씩(300 ㎍/mouse i.p.) 항REG4 항체(34-1 mAb; n=8)를 처리하는 동안 또는 대조군 항체(정상 마우스 IgG; n=9)를 처리하는 동안 평가하였다(A). 34-1 mAb의 처리(두꺼운 선과 짙은 원 표시)는 대조군 IgG와 비교하여 종양 용적의 상당한 감소를 유도하였다(P=0.0598). 항REG4 항체(34-1 mAb) 또는 대조군 항체를 처음 처리한 30일 뒤에 종양의 무게를 측정하였다(B). 34-1 mAb의 처리(검은 상자에 표시)는 대조군 항체와 비교하여 종양 무게의 상당한 감소를 유도하였다(P=O.0489). 5 shows that treatment of anti-REG4 antibodies inhibits the growth of pancreatic cancer cells in vivo. Tumor volume injected with nude mice was treated twice a week (300 μg / mouse ip) during treatment with anti-REG4 antibody (34-1 mAb; n = 8) or with control antibody (normal mouse IgG; n = 9). (A). Treatment of 34-1 mAb (thick lines and dark circles) resulted in a significant decrease in tumor volume compared to control IgG (P = 0.0598). Tumors were weighed 30 days after first treatment with anti-REG4 antibody (34-1 mAb) or control antibody (B). Treatment of 34-1 mAb (indicated in black boxes) led to a significant reduction in tumor weight compared to the control antibody (P = 0.0489).

도 6은 REG4의 과발현이 췌장암의 γ-선 내성에 기여함을 나타낸 것이다. ρCAGGSnHC-REG4-HA를 REG4를 발현하지 않는 췌장암 세포주인 PK-45P에 형질 도입하였다. 제네티신(Geneticin) 내성 세포를 선별한 다음, 세포주에서 재조합 REG4의 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 48시간 선 배양 후에, REG4 발현 클론(C 1-6, C2-6 및 ClO) 또는 대조군 클론(Ml, M3 및 M6)을 60Co 소스를 이용하여 1, 5, 10 또는 30 Gy로 γ선을 조사시켜주었다(B). 48시간 후, 살아있는 세포를 세포수 계수로 측정하여, 각 조사별 흡광도/비조사 시 흡광도의 상대적 비율로 평가하였다. 0, 1 또는 5 Gy의 γ선 조사 후에, 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 서브-G1 분획을 탐지하여 세포자멸사(apoptosis)를 평가하였다(C).6 shows that overexpression of REG4 contributes to γ-ray resistance of pancreatic cancer. ρCAGGSnHC-REG4-HA was transduced into PK-45P, a pancreatic cancer cell line that does not express REG4. Geneticin resistant cells were selected and expression of recombinant REG4 in the cell line was confirmed by Western blot analysis. After 48 hours of incubation, REG4 expressing clones (C 1-6, C2-6 and ClO) or control clones (Ml, M3 and M6) were irradiated with gamma rays at 1, 5, 10 or 30 Gy using a 60Co source. (B). After 48 hours, the living cells were measured by counting cell counts and evaluated by the relative ratio of absorbance at each irradiation / non-irradiation. After γ-ray irradiation of 0, 1 or 5 Gy, apoptosis was assessed by detecting the sub-G1 fraction using a flow cytometer (C).

도 7은 REG4의 과발현이 췌장암의 젬시타빈(gemcitabine) 내성에 기여함을 나타낸 것이다. 선 배양 48시간 후, REG4 발현 클론(C 1-6, C2-6, ClO)과 대조군 클론(Ml, M3, M6)에 0.1 내지 100000 nM의 젬시타빈을 48시간 동안 처리하였다(A). 배양 후, 살아있는 세포를 세포수 계수로 측정하여, 각 조사별 흡광도/비조사 시 흡광도의 상대적 비율로 평가하였다. 10 nM 또는 50 nM 젬시타빈(gemcitabine)을 48시간 동안 처리한 다음, 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 서브-G1 분획을 탐지하여 세포자멸사(apoptosis)를 평가하였다(B).Figure 7 shows that overexpression of REG4 contributes to gemcitabine resistance of pancreatic cancer. After 48 hours of pre-culture, REG4 expressing clones (C 1-6, C2-6, ClO) and control clones (Ml, M3, M6) were treated with 0.1-100000 nM gemcitabine for 48 hours (A). After incubation, the living cells were measured by counting cells and evaluated by the relative ratio of absorbance at each irradiation / non-irradiation. After treatment with 10 nM or 50 nM gemcitabine for 48 hours, apoptosis was evaluated by detecting the sub-G1 fraction using a flow cytometer (B).

도 8은 네오-CRT (neo-CRT)를 처리한 췌장 선암종 제조물에서의 REG4 면역염색을 나타낸 것이다. 췌장 선암종 제조물의 네오-아주번트 화학방사선 치료(neo-adjuvant chemo-radiation therapy (neo-CRT))를 한 경우 REG4의 발현이 낮거나 발현하지 않는 효과를 보였다(A), (B). 췌장 선암종 제조물의 네오-아주번트 화학방사선 치료(neo-adjuvant chemo-radiation therapy (neo-CRT))를 하지 않은 경우, REG4가 강하게 발현되었다(C), (D). Figure 8 shows REG4 immunostaining in pancreatic adenocarcinoma preparations treated with neo-CRT (neo-CRT). Neo-adjuvant chemo-radiation therapy (neo-CRT) of pancreatic adenocarcinoma products showed low or no expression of REG4 (A), (B). In the absence of neo-adjuvant chemo-radiation therapy (neo-CRT) of pancreatic adenocarcinoma preparations, REG4 was strongly expressed (C), (D).

도 9는 췌장암 세포에서 KIAA0101을 과발현시킨 결과를 나타낸 것이다. 반 정량적 RT-PCR 결과, 현미 해부한 정상 췌장관세포 및 정상 췌장 조직과 비교하여 볼 때, 현미 해부한 췌장암세포에서 KIAA0101의 발현이 상향 조절된 것으로 확인되었다(A). 정량적 대조군으로서 TUBA의 발현을 함께 보았다. 노던 블롯 분석 결과 췌장암 세포주(레인 1 내지 6)에서 KIAA0101의 강한 발현이 나타났으나, 심장, 폐, 간, 신장 및 뇌를 포함하는 생체 기관(레인 7 내지 11)에서는 발현되지 않았다(B). 항KIAA0101 항체를 이용한 면역화학적 연구를 나타낸 것이다. 췌장암 세포의 핵에서 강한 염색이 관찰되었으나(화살표, 400배), 반면, 정상 췌장 조직의 포상세포(acinar cells) 및 정상 관 표피세포는 염색이 되지 않았다(C). Figure 9 shows the results of overexpressing KIAA0101 in pancreatic cancer cells. Semi-quantitative RT-PCR revealed that KIAA0101 expression was upregulated in brown dissected pancreatic cancer cells as compared to normal pancreatic duct cells and normal pancreatic tissue. The expression of TUBA was also seen as a quantitative control. Northern blot analysis revealed strong expression of KIAAOl101 in pancreatic cancer cell lines (lanes 1-6), but not in biological organs (lanes 7-11) including heart, lung, liver, kidney and brain (B). Immunological studies using anti-KIAA0101 antibodies are shown. Strong staining was observed in the nucleus of pancreatic cancer cells (arrow, 400-fold), whereas acinar cells and normal vascular epidermal cells of normal pancreatic tissue were not stained (C).

도 10은 siRNA에 의한 KIAA0101의 녹다운(knockdown)이 췌장암 세포의 성장에 미치는 효과를 나타낸 결과이다. KIAA0101의 전사체에 특이적인 두 가지 siRNA 발현 벡터(#759si) 및 음성 대조군으로서 EGFP siRNA 발현 벡터(EGFPsi)를 KLM-I 세포에 형질 전환하였다(A). KIAA0101 전사체에 대한 녹다운 효과를 정량적 대조군인 β2MG의 발현과 함께 RT-PCR로 평가하였다. #759si로 형질 전환한 경우 강한 녹다운 효과를 보여주었으나, EGFPsi의 경우 KIAA0101 전사체의 수준에 아무런 효과를 보이지 않았다. #759si 벡터를 형질 전환한 경우 콜로니 형성의 숫자로 측정한 살아있는 세포의 수에서 급격히 감소하는 결과를 보여주었지만, 이와 비교하여 siRNA 발현벡터로 형질 전환한 세포에서는 KIAA0101에서 아무런 녹다운 효과도 보이지 않았다(B). #759si 벡터로 형질 전환한 경우 MTT 분석을 통하여 측정한 살아있는 세포의 수에서 급격히 감소하는 결과를 보여주었다(C). MTT 분석에서 Y축의 ABS는 마이크로플레이트 리더기(microplate leader)로 측정한 630 nm에서의 흡광도 및 참고로 490 nm에서의 흡광도 의미한다.10 is a result showing the effect of knockdown of KIAAOl101 by siRNA on the growth of pancreatic cancer cells. Two siRNA expression vectors (# 759si) specific for the transcript of KIAAOlO and EGFP siRNA expression vectors (EGFPsi) as negative controls were transformed into KLM-I cells (A). The knockdown effect on the KIAAOlOl transcript was assessed by RT-PCR with the expression of β2MG, a quantitative control. Transformation with # 759si showed a strong knockdown effect, but EGFPsi had no effect on the level of KIAA0101 transcript. The transfection of the # 759si vector showed a sharp decrease in the number of living cells as measured by the number of colony formations, whereas the cells transformed with siRNA expression vectors showed no knockdown effect in KIAA0101 ( B). Transformation with # 759si vector showed a sharp decrease in the number of live cells measured by MTT analysis (C). In the MTT analysis, the ABS on the Y axis means absorbance at 630 nm and absorbance at 490 nm as measured by a microplate leader.

도 11은 외인성(exogenous) KIAA0101의 과발현이 암세포의 성장을 촉진시킨다는 것과 NIH3T3를 형질 전환 시킨다는 결과이다. 외인성 KIAA0101을 구조적으로 발현하는 여섯 개의 PK-45P 유래 세포(클론 1 내지 6) 및 공 벡터(mock 벡터)(Mock 1 내지 4)로 형질 전환된 세포. KIAA0101의 외인성 도입에 의한 발현은 항HA 표지 항체로 확인하였다. 로딩(loading) 대조군으로 ACTB를 사용하였다. MTT 분석을 통한 성장 측정은 여섯 개의 KIAA0101 클론(1-6, solid lines)이 두 개 대조군 클론(1-4, dash lines)보다 유의적으로 보다 빠르게 성장한다는 것을 증명해준다(B). X축과 Y축은 접종 후 날짜에 따라 대조군으로서 1일 째의 흡광도 수치와 비교한 지름의 흡광도를 측정한 성장률을 나타낸 것이다. 각 평균은 표준 오차를 나타내는 오차막대와 함께 나타내었다. 이 실험은 모두 세 번 반복하였다. 내재하는 마우스 상동의 KIAA0101을 발현하지 않는 NIH3T3로부터 세 개의 KIAA0101 과발현 클론과 세 개의 모크(mock) 클론을 확립하였다(C). 세 개의 KIAA0101 과발현 NIH3T3 클론과 세 개의 모크(mock) NIH3T3 클론을 8주 령의 누드마우스의 오른쪽과 왼쪽 옆구리에 각각 접종하였다. 4주 후, 오직 KIAA0101 과발현 NIH3T3 클론만이 누드마우스 의 오른쪽 옆구리에 종양을 형성하였다. 각 종양은 항KIAA0101 항체로 면역 염색하여 내재성의 KIAA0101의 발현을 보여주었다(D).11 shows that overexpression of exogenous KIAA0101 promotes cancer cell growth and transforms NIH3T3. Cells transformed with six PK-45P derived cells (clones 1 to 6) and mock vectors (Mock 1 to 4) that structurally express exogenous KIAAOlOl. Expression by exogenous introduction of KIAA0101 was confirmed with anti-HA labeled antibody. ACTB was used as the loading control. Growth measurements through MTT analysis demonstrate that six KIAA0101 clones (1-6, solid lines) grow significantly faster than the two control clones (1-4, dash lines) (B). X-axis and Y-axis represent the growth rate measured the absorbance of the diameter compared to the absorbance value on the day 1 as a control according to the date after inoculation. Each mean is shown with an error bar representing standard error. This experiment was repeated three times in all. Three KIAA0101 overexpressing clones and three mock clones were established from NIH3T3 that did not express KIAA0101 of intrinsic mouse homology (C). Three KIAA0101 overexpressing NIH3T3 clones and three mock NIH3T3 clones were inoculated into the right and left flanks of 8-week-old nude mice, respectively. Four weeks later, only KIAA0101 overexpressing NIH3T3 clones formed tumors in the right flank of nude mice. Each tumor was immunostained with anti-KIAA0101 antibody to show endogenous KIAA0101 expression (D).

도 12는 KIAA0101 단백질이 몇몇의 DNA 복제 단백질과 연관되어 있음을 보여주는 것이다. 은염색(silver staining)한 결과, 대조군에서의 결과와 SDS-PAGE 젤로 분리한 면역 침강 분획을 비교하여 볼 때, 암세포 용해물에서는 KIAA0101과 함께 몇몇의 단백질이 면역 침강됨을 보여주었다(A). 각각의 다른 밴드는 젤 내 트립신 소화(in-gel trypsin digestion)시킨 후, 말디-토프 시스템(MALDI-TOF system)으로 분석하였다; 이들은 PCNA, POLDl (polymerase δ ρl25 subunit) 및 FENl (flap endonuclease-1)로 확인되었다. 이러한 상호작용은 면역 침강 실험을 통하여 확인하였다(B). 이들 모든 단백질은 DNA 복제와 관련이 있으며, POLDI와 FENI는 KIAA0101뿐만 아니라 PCNA와도 결합한다.12 shows that KIAAOlOl protein is associated with several DNA replication proteins. As a result of silver staining, a comparison of the result from the control group with the immunoprecipitated fraction separated by SDS-PAGE gel showed that some proteins were immunoprecipitated with KIAA0101 in cancer cell lysates (A). Each other band was in-gel trypsin digestion and analyzed by the MALDI-TOF system; They were identified as PCNA, POLDl (polymerase δ ρ2525 subunit) and FENl (flap endonuclease-1). This interaction was confirmed through immunoprecipitation experiments (B). All these proteins are involved in DNA replication, and POLDI and FENI bind to PCNA as well as KIAA0101.

도 13은 세포 투과성 지배적 네거티브 펩티드(세포- 투과성 dominant-negative 펩티드s)로 KIAA0101과 PCNA간의 상호작용을 억제한 것이다. PIP 박스(PIP 박스, {q}KG{i}GE{ff} (서열번호 21)를 포함하는 두 가지 지배적 네거티브 펩티드(PIP20, PIP16)) 및 알라닌(alanine)으로 변환된, 보존된 PIP 박스 잔기를 갖는 돌연변이 펩티드(PIP20mt, PIPlmt, {a}KG{a}GE{aa} (서열번호 37)를 고안하고, 세포 투과성을 촉진시키기 위해 이들을 아르기닌 반복(arginine (R)-repeat) 부위와 결합시켰다(A). in vitro 연구에서, 면역 침강으로 PIP20의 처리에 의한 KIAA0101과 PCNA의 결합의 억제를 확인하였으나, PIP20mt 및 스크램블(scramble) 펩티드는 KIAA0101과 PCNA의 결합에 아무런 효과도 나타내지 않았다(B). PIP20의 처리는 투여량 의존적인 KIAA0101의 발현으로 세포 성장을 억제시켰으나, PIP20mt 및 스크램블(scramble) 펩티드에서는 그렇지 않았다(C). 반면, PIP20은 상동성 인간 KIAA0101을 발현하지 않는 정상 마우스 세포주인 NIH3T3 세포의 성장에는 아무런 영향을 미치지 않았다. 짧은 PIP 펩티드(PIP16 and PIPlmt)는 PIP 상자 모티프를 유지한 채 N-말단과 C-말단의 4개 잔기를 제거하여 고안하였고, PIP16의 처리는 암세포의 성장을 강하게 억제시켰으나, 또한 NIH3T3의 성장에도 영향을 주었다. FIG. 13 shows the inhibition of the interaction between KIAAOlOl and PCNA with cell permeable dominant negative peptides (cell-permeable dominant-negative peptides). Conserved PIP box residues converted to PIP boxes (PIP box, two dominant negative peptides including {q} KG {i} GE {ff} (SEQ ID NO: 21) (PIP20, PIP16)) and alanine Mutant peptides (PIP20mt, PIPlmt, {a} KG {a} GE {aa} (SEQ ID NO: 37)) were designed and combined with an arginine (R) -repeat site to promote cell permeability. In vitro studies confirmed the inhibition of binding of KIAA0101 to PCNA by treatment with PIP20 by immunoprecipitation, but PIP20mt and scramble peptides had no effect on binding of KIAA0101 to PCNA (B). Treatment with PIP20 inhibited cell growth with expression of dose dependent KIAA0101 but not with PIP20mt and scramble peptides (C), whereas PIP20 was a normal mouse cell line that did not express homologous human KIAA0101 NIH3T3. No zero to cell growth Short PIP peptides (PIP16 and PIPlmt) were designed by removing four residues at the N-terminus and C-terminus while maintaining the PIP box motif, and treatment of PIP16 strongly inhibited the growth of cancer cells. It also affected the growth of NIH3T3.

본 발명자들은 REG4 유전자 또는 KIAA0101 유전자를 특이적으로 표적화하는 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 세포 성장이 억제되는 것을 나타내었다. 따라서 상기 신규 siRNA는 항암제 개발을 위한 유용한 표적이다. 예를 들면, REG4의 발현을 차단하거나 이의 활성을 막는 약제는 항암제, 특히 췌장 관 선암종(PDAC)과 같은 췌장암의 치료를 위한 항암제로써 치료적 유용을 발견할 수 있다. 유사하게는, KIAA0101의 발현을 차단하거나 이의 활성을 막는 약제는 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암 치료용 항암제로써 치료적 유용을 발견할 수 있다.We have shown that cell growth is inhibited by small interfering RNAs (siRNAs) that specifically target the REG4 gene or KIAA0101 gene. Thus, the novel siRNAs are useful targets for anticancer drug development. For example, agents that block the expression of REG4 or block its activity may find therapeutic utility as anticancer agents, particularly as anticancer agents for the treatment of pancreatic cancer, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Similarly, agents that block the expression of KIAA0101 or block its activity may find therapeutic utility as anticancer agents for the treatment of pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer.

또한 본 발명자들은 REG4에 대한 단클론 항체가 그것의 성장 증식 효과를 중화시키고, PDAC 세포의 성장을 유의하게 감소시키는 것을 발견하였다. 따라서 REG4-발현세포와 관련된 질환, 예를 들면, 췌장암의 치료는 REG4에 결합하는 항체를 이용하여 편리하게 수행되었다.We have also found that monoclonal antibodies against REG4 neutralize its growth proliferative effect and significantly reduce the growth of PDAC cells. Thus, the treatment of diseases associated with REG4-expressing cells, such as pancreatic cancer, was conveniently performed using antibodies that bind to REG4.

또한 본 발명자들은 KIAA0101이 PCNA와 상호작용하고, 상기 상호작용의 억제를 통해 암세포의 세포 증식의 억제를 유도할 수 있는 것을 나타내었다. 따라서, PCNA와 상호작용하는 KIAA0101의 결합을 억제하고, 이의 활성을 막는 약제는 항암제로써 치료적 유용을 발견할 수 있다.In addition, the present inventors have shown that KIAAOlOl can interact with PCNA and induce inhibition of cell proliferation of cancer cells through inhibition of the interaction. Thus, agents that inhibit the binding of KIAAOlOl that interact with PCNA and block its activity may find therapeutic utility as anticancer agents.

따라서 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 유용한 신규의 폴리펩티드 및 이외의 화합물을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 QKGIGEFF (서열번호 46을 포함하는 아미노산 서열로 구성되었다. 본 발명의 폴리펩티드는 암세포의 증식을 억제하거나 세포자멸사를 유도하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 다양한 암에 대해 세포 증식 억제 효과를 나타내는 것을 기대된다. 특히 , 본 발명의 폴리펩티드는 췌장암의 세포 증식을 억제하는 효과를 갖는 것으로 확인되었다.The present invention therefore provides novel polypeptides and other compounds useful for the treatment or prevention of cancer. Polypeptides of the invention consist of an amino acid sequence comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46. Polypeptides of the invention may be administered to inhibit the proliferation of cancer cells or induce apoptosis. In particular, the polypeptide of the present invention was confirmed to have an effect of inhibiting cell proliferation of pancreatic cancer.

췌장암은 여전히 효과적인 처리 방법이 제공되는 것이 필요한 중요한 암이다. 따라서 본 발명은 또한 췌장암의 치료 또는 예방에 유용한 방법을 제공하는 것에 대해서 중요하다.Pancreatic cancer is an important cancer that still needs to be provided with effective treatment methods. The present invention is therefore also important for providing methods useful for the treatment or prevention of pancreatic cancer.

본 발명은 상세하고 이의 특정 실시예를 기재하고 있는 반면에, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않은 점에서 발생하는 다양한 변화 및 변형들을 용이하게 인지할 것이다.While the present invention has been described in detail and specific embodiments thereof, those skilled in the art will readily recognize various changes and modifications that occur without departing from the spirit and scope of the invention.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE INC. THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> Treating or Preventing Cancers over-expressing REG4 or KIAA0101 <130> 9fpi-02-03 <150> US 60/838,649 <151> 2006-08-18 <160> 64 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1518 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ataagacttt tatggatgga ttgtttttct caaataatat tatcgcttag tgactaaagt 60 aaagattatt aattcctgag gcaagaagat ataaaagctc cagaaacgtt gactgggacc 120 actggagaca ctgaagaagg caggggccct tagagtcttg gttgccaaac agaatgccca 180 tatccgtctt acctgtgagg aagcttgcct tgggcgccct ctgctggccc tcctgaagct 240 aacaggggcg agtgctcggt ggtttacaaa ttgcctccat gcagactatg aaactgttca 300 gcctgctata gttagatctc tggcactggc ccaggaggtc ttgcagattt gcagatcaag 360 gagaacccag gagtttcaaa gaagcgctag taaggtctct gagatccttg cactagctac 420 atcctcaggg taggaggaag atggcttcca gaagcatgcg gctgctccta ttgctgagct 480 gcctggccaa aacaggagtc ctgggtgata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat 540 ggttttacca caagtccaat tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg 600 ccgagctcga gtgtcagtct tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa 660 aggaagccag caccatagca gagtacataa gtggctatca gagaagccag ccgatatgga 720 ttggcctgca cgacccacag aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc 780 tgtacagatc ctggtctggc aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct 840 ccaataacaa ctttttaact tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt 900 gcaagtaccg accatagagc aagaatcaag attctgctaa ctcctgcaca gccccgtcct 960 cttcctttct gctagcctgg ctaaatctgc tcattatttc agaggggaaa cctagcaaac 1020 taagagtgat aagggcccta ctacactggc ttttttaggc ttagagacag aaactttagc 1080 attggcccag tagtggcttc tagctctaaa tgtttgcccc gccatccctt tccacagtat 1140 ccttcttccc tcctcccctg tctctggctg tctcgagcag tctagaagag tgcatctcca 1200 gcctatgaaa cagctgggtc tttggccata agaagtaaag atttgaagac agaaggaaga 1260 aactcaggag taagcttcta gcccccttca gcttctacac ccttctgccc tctctccatt 1320 gcctgcaccc caccccagcc actcaactcc tgcttgtttt tcctttggcc atgggaaggt 1380 ttaccagtag aatccttgct aggttgatgt gggccataca ttcctttaat aaaccattgt 1440 gtacataaga ggttgctgtg ttccagttca gtaatggtga atgtggaaaa gtgaaataag 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primer sequence for RT-PCR <400> 10 cttgggtctg taacaaagca ttc 23 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 11 caccgacaga aggaagaaac tcattcaaga gatgagtttc ttccttctgt c 51 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 12 aaaactgtct tccttctttg agtaagttct ctactcaaag aaggaagaca g 51 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 13 gacagaagga agaaactcat tcaagagatg agtttcttcc ttctgtc 47 <210> 14 <211> 1475 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 aaacataagg tcactgttct cactacagtt actgagcaca cagacctcac catgggatgg 60 agctctatca tcctcttctt ggtagcaaca gcctcaggtg tccactccca ggtccaactg 120 cagcaacctg ggtctgagct ggtgaggcct ggagcttcag tgaagctgtc ctgcaaggct 180 tctggctaca cattcaccag ctactggatg cactgggtga agcagaggcc tggacaaggc 240 cttgagtgga ttggaaatat ttatcctggt agtggtagta ctaactacga 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accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1200 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1260 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1320 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1380 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaatgagga 1440 tccccgggta ccgagccgaa ttcactgcag cgtaa 1475 <210> 15 <211> 461 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ser Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Leu Trp Leu Arg Val Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser 130 135 140 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val 145 150 155 160 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro 210 215 220 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly 225 230 235 240 Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile 245 250 255 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys 260 265 270 Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln 275 280 285 Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu 305 310 315 320 Pro Ile Met His Gln Asp 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atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct gctcgcttca 300 gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg 360 ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc tcggggacaa 420 agttggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagtg 480 agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc taccccaaag 540 acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc ctgaacagtt 600 ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc acgttgacca 660 aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag acatcaactt 720 cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttagtt aaattaagcg gaatccatat 780 gactagtaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 820 <210> 17 <211> 235 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Ile Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly 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anti-REG4 <400> 25 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe 1 5 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 26 agctttgttg aacaggcatt t 21 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 27 ggcagcagta caacaatcta agc 23 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 28 cacccccact gaaaaagaga 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 29 tacctgtgga gcaaggtgc 19 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 30 aaggattatg aggaggttgg tgt 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 31 cttgggtctg taacaaagca ttc 23 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<400> 36 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ile Phe 1 5 10 15 Lys Gln Trp Pro Arg Gly Glu Thr Lys Pro Arg Val Leu Ser Pro Lys 20 25 30 Gly Phe <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesised dominant negative peptide <400> 37 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Thr Pro 1 5 10 15 Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro 20 25 30 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesised dominant negative peptide <400> 38 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Thr Pro 1 5 10 15 Lys Trp Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala Arg Leu Ser Pro 20 25 30 <210> 39 <211> 1508 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gagagacctt ggagcgcgcg ggaaagagac caatataaac tgtggcggga tagttttcgg 60 gtccttgtcc agtgaaacac cctcggctgg gaagtcagtt cgttctctcc tctcctctct 120 tcttgtttga acatggtgcg gactaaagca gacagtgttc caggcactta cagaaaagtg 180 gtggctgctc gagcccccag aaaggtgctt 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peptide <400> 45 Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro 1 5 10 15 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIP motif <400> 46 Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesised Tat sequence <400> 47 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesised Penetratin sequence <400> 48 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesised Buforin II sequence <400> 49 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 50 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesised Transportan sequence <400> 50 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala 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THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> Treating or Preventing Cancers over-expressing REG4 or KIAA0101 <130> 9fpi-02-03 <150> US 60 / 838,649 <151> 2006-08-18 <160> 64 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1518 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ataagacttt tatggatgga ttgtttttct caaataatat tatcgcttag tgactaaagt 60 aaagattatt aattcctgag gcaagaagat ataaaagctc cagaaacgtt gactgggacc 120 actggagaca ctgaagaagg caggggccct tagagtcttg gttgccaaac agaatgccca 180 tatccgtctt acctgtgagg aagcttgcct tgggcgccct ctgctggccc tcctgaagct 240 aacaggggcg agtgctcggt ggtttacaaa ttgcctccat gcagactatg aaactgttca 300 gcctgctata gttagatctc tggcactggc ccaggaggtc ttgcagattt gcagatcaag 360 gagaacccag gagtttcaaa gaagcgctag taaggtctct gagatccttg cactagctac 420 atcctcaggg taggaggaag atggcttcca gaagcatgcg gctgctccta ttgctgagct 480 gcctggccaa aacaggagtc ctgggtgata tcatcatgag acccagctgt gctcctggat 540 ggttttacca caagtccaat tgctatggtt acttcaggaa gctgaggaac tggtctgatg 600 ccgagctcga gtgtcagtct tacggaaacg gagcccacct ggcatctatc ctgagtttaa 660 aggaagccag caccatagca gagtacataa gtggctatca gagaagccag ccgatatgga 720 ttggcctgca cgacccacag aagaggcagc agtggcagtg gattgatggg gccatgtatc 780 tgtacagatc ctggtctggc aagtccatgg gtgggaacaa gcactgtgct gagatgagct 840 ccaataacaa ctttttaact tggagcagca acgaatgcaa caagcgccaa cacttcctgt 900 gcaagtaccg accatagagc aagaatcaag attctgctaa ctcctgcaca gccccgtcct 960 cttcctttct gctagcctgg ctaaatctgc tcattatttc agaggggaaa cctagcaaac 1020 taagagtgat aagggcccta ctacactggc ttttttaggc ttagagacag aaactttagc 1080 attggcccag tagtggcttc tagctctaaa tgtttgcccc gccatccctt tccacagtat 1140 ccttcttccc tcctcccctg tctctggctg tctcgagcag tctagaagag tgcatctcca 1200 gcctatgaaa cagctgggtc tttggccata agaagtaaag atttgaagac agaaggaaga 1260 aactcaggag taagcttcta gcccccttca gcttctacac ccttctgccc tctctccatt 1320 gcctgcaccc caccccagcc actcaactcc tgcttgtttt tcctttggcc atgggaaggt 1380 ttaccagtag aatccttgct aggttgatgt gggccataca ttcctttaat aaaccattgt 1440 gtacataaga ggttgctgtg ttccagttca gtaatggtga atgtggaaaa gtgaaataag 1500 accaagaaat acacccag 1518 <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu Ala   1 5 10 15 Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys Ala Pro              20 25 30 Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Leu          35 40 45 Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser Tyr Gly Asn Gly      50 55 60 Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu Ala Ser Thr Ile Ala  65 70 75 80 Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln Pro Ile Trp Ile Gly Leu                  85 90 95 His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met             100 105 110 Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His         115 120 125 Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn     130 135 140 Glu Cys Asn Lys Arg Gln His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro 145 150 155 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 3 ccaattgcta tggttacttc agg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 4 gaaaaacaag caggagttga gtg 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A target sequence for siRNA <400> 5 gacagaagga agaaactca 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400> 6 gaagcagcac gacttcttc 19 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 7 cggaattcat ggcttccaga agcatgc 27 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 8 ataagaatgc ggccgctggt cggtacttgc acagg 35 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 9 aaggattatg aggaggttgg tgt 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 10 cttgggtctg taacaaagca ttc 23 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 11 caccgacaga aggaagaaac tcattcaaga gatgagtttc ttccttctgt c 51 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 12 aaaactgtct tccttctttg agtaagttct ctactcaaag aaggaagaca g 51 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 13 gacagaagga agaaactcat tcaagagatg agtttcttcc ttctgtc 47 <210> 14 <211> 1475 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 aaacataagg tcactgttct cactacagtt actgagcaca cagacctcac catgggatgg 60 agctctatca tcctcttctt ggtagcaaca gcctcaggtg tccactccca ggtccaactg 120 cagcaacctg ggtctgagct ggtgaggcct ggagcttcag tgaagctgtc ctgcaaggct 180 tctggctaca cattcaccag ctactggatg cactgggtga agcagaggcc tggacaaggc 240 cttgagtgga ttggaaatat ttatcctggt agtggtagta ctaactacga tgagaagttc 300 aagagcaagg ccacactgac tgtagacaca tcctccagca cagcctacat gcagctcagc 360 agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat tactgtacaa gagggggtct atggttacgg 420 gttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagccaaaac gacaccccca 480 tctgtctatc cactggcccc tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga 540 tgcctggtca agggctattt ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg 600 tccagcggtg tgcacacctt cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc 660 tcagtgactg tcccctccag cacctggccc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac 720 ccggccagca gcaccaaggt ggacaagaaa attgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct 780 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat 840 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat 900 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg 960 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg 1020 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac 1140 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata 1200 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag 1260 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag 1320 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat 1380 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaatgagga 1440 tccccgggta ccgagccgaa ttcactgcag cgtaa 1475 <210> 15 <211> 461 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ser Gly   1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg              20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe          35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu      50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp  65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser 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<213> Mus musculus <400> 16 agaactaatg agaatagcag taattagcta gggaccaaaa tacaaagaca aaatggattt 60 tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcctca gtcataatat ccagaggaaa 120 ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga 180 cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct 240 cccccaaaag atggatttat gacacatcca aactggcttc tggagtccct gctcgcttca 300 gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg 360 ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccatt cacgttcggc tcggggacaa 420 agttggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca ccatccagtg 480 agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc taccccaaag 540 acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc ctgaacagtt 600 ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc acgttgacca 660 aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag acatcaactt 720 cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttagtt aaattaagcg gaatccatat 780 gactagtaga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 820 <210> 17 <211> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of VH CDR3 of anti-REG4 <400> 22 Gly Gly Leu Trp Leu Arg Val Asp Tyr   1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of VL CDR1 of anti-REG4 <400> 23 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His   1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of VL CDR2 of anti-REG4 <400> 24 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser   1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An amino acid sequence of VL CDR3 of anti-REG4 <400> 25 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe   1 5 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 26 agctttgttg aacaggcatt t 21 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 27 ggcagcagta caacaatcta agc 23 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<400> 34 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Val Arg   1 5 10 15 Pro Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser              20 25 30 Pro lys         <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 35 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Val Arg   1 5 10 15 Pro Thr Pro Lys Trp Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala Arg Leu Ser              20 25 30 Pro lys         <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 36 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Ile Phe   1 5 10 15 Lys Gln Trp Pro Arg Gly Glu Thr Lys Pro Arg Val Leu Ser Pro Lys              20 25 30 Gly phe         <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 37 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Thr Pro   1 5 10 15 Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro              20 25 30 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 38 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Thr Pro   1 5 10 15 Lys Trp Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala Arg Leu Ser Pro              20 25 30 <210> 39 <211> 1508 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 gagagacctt ggagcgcgcg ggaaagagac caatataaac tgtggcggga tagttttcgg 60 gtccttgtcc agtgaaacac cctcggctgg gaagtcagtt cgttctctcc tctcctctct 120 tcttgtttga acatggtgcg gactaaagca gacagtgttc caggcactta cagaaaagtg 180 gtggctgctc gagcccccag aaaggtgctt ggttcttcca cctctgccac taattcgaca 240 tcagtttcat cgaggaaagc tgaaaataaa tatgcaggag ggaaccccgt ttgcgtgcgc 300 ccaactccca agtggcaaaa aggaattgga gaattcttta ggttgtcccc taaagattct 360 gaaaaagaga atcagattcc tgaagaggca ggaagcagtg gcttaggaaa agcaaagaga 420 aaagcatgtc ctttgcaacc tgatcacaca aatgatgaaa aagaatagaa ctttctcatt 480 catctttgaa taacgtctcc ttgtttaccc tggtattcta gaatgtaaat ttacataaat 540 gtgtttgttc caattagctt tgttgaacag gcatttaatt aaaaaattta ggtttaaatt 600 tagatgttca aaagtagttg tgaaatttga gaatttgtaa gactaattat ggtaacttag 660 cttagtattc aatataatgc attgtttggt ttcttttacc aaattaagtg tctagttctt 720 gctaaaatca agtcattgca ttgtgttcta attacaagta tgttgtattt gagatttgct 780 tagattgttg tactgctgcc atttttattg gtgtttgatt attggaatgg tgccatattg 840 tcactccttc tacttgcttt aaaaagcaga gttagatttt tgcacattaa aaaattcagt 900 attaattaaa cattacttat tctaccctct tttttggcaa ggaggacaaa tacgcaatgt 960 tggaaaacct tggatggata tcttctcttt aaaaaaatgt aaagataatt tggtcttgag 1020 ggtttaaacg gttgataatg cctctacaac aacaagaaaa aagataaaat actaggatag 1080 aatcatggtg ggcacagtgg cttctcagga ggctgaggag ggaggtttgc ttgagtccag 1140 gagttggaga ccagcccagg caacatagcg taaaccctat ctctaaaaca atttttagcc 1200 aggtgcggtg gctcacgcct gtaatcccag cactctggga ggccgaggcg ggtggatcat 1260 gaggtcagga gatcgagacc atcctgccta acaaggtgaa accccgtctc tactaaaaat 1320 acaaaaaatt agccgggcgc ggtggcgggc gcctgtagtc ccagctactc gggaggctga 1380 ggcaggagaa tggcgtgaac ccgggaagtg gagcttgcag tgagccgaga ttgcgccact 1440 gcagtcggca gtccggcttg ggcgacagag cgagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaa 1508 <210> 40 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Val Arg Thr Lys Ala Asp Ser Val Pro Gly Thr Tyr Arg Lys Val   1 5 10 15 Val Ala Ala Arg Ala Pro Arg Lys Val Leu Gly Ser Ser Thr Ser Ala              20 25 30 Thr Asn Ser Thr Ser Val Ser Ser Arg Lys Ala Glu Asn Lys Tyr Ala          35 40 45 Gly Gly Asn Pro Val Cys Val Arg Pro Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly      50 55 60 Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro Lys Asp Ser Glu Lys Glu Asn  65 70 75 80 Gln Ile Pro Glu Glu Ala Gly Ser Ser Gly Leu Gly Lys Ala Lys Arg                  85 90 95 Lys Ala Cys Pro Leu Gln Pro Asp His Thr Asn Asp Glu Lys Glu             100 105 110 <210> 41 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 41 caccgccata ttgtcactcc ttctattcaa gagatagaag gagtgacaat atggc 55 <210> 42 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 42 aaaagccata ttgtcactcc ttctattcaa gagatagaag gagtgacaat atggc 55 <210> 43 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 43 gccatattgt cactccttct attcaagaga tagaaggagt gacaatatgg c 51 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 44 Val Arg Pro Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg   1 5 10 15 Leu Ser Pro Lys              20 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 45 Thr Pro Lys Trp Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe Arg Leu Ser Pro   1 5 10 15 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIP motif <400> 46 Gln Lys Gly Ile Gly Glu Phe Phe   1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Tat sequence <400> 47 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg   1 5 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Penetratin sequence <400> 48 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys   1 5 10 15 <210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Buforin II sequence <400> 49 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His   1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys              20 <210> 50 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Transportan sequence <400> 50 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu   1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu              20 25 <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized MAP (model amphipathic peptide)          sequenc <400> 51 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys   1 5 10 15 Leu Ala         <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized K-FGF sequence <400> 52 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro   1 5 10 15 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Ku70 sequence <400> 53 Val Pro Met Leu Lys   1 5 <210> 54 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Prion sequence <400> 54 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp   1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro              20 25 <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized pVEC sequence <400> 55 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His   1 5 10 15 Ser lys         <210> 56 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Pep-1 sequence <400> 56 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys   1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val              20 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized SynB1 sequence <400> 57 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr   1 5 10 15 Gly arg         <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Pep-7 sequence <400> 58 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr   1 5 10 15 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized HN-1 sequence <400> 59 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu   1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized poly-arginine sequence <400> 60 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg   1 5 10 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized Ku70 sequence <400> 61 Pro Met Leu Lys Glu   1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized dominant negative peptide <400> 62 Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ala   1 5 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for synthesis <400> 63 cggaattcat ggcttccaga agcatgc 27 <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer sequence for synthesis <400> 64 ataagaatgc ggccgctggt cggtacttgc acagg 35  

Claims (76)

REG4 또는 KIAA0101의 발현을 억제하는 적어도 하나 이상의 작은 간섭 RNA (small interfering RNA (siRNA))를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내 췌장암의 치료 또는 예방방법.A method of treating or preventing pancreatic cancer in a subject, comprising administering to the subject a composition comprising at least one small interfering RNA (siRNA) that inhibits expression of REG4 or KIAAOlOl. 제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 REG4 또는 KIAA0101의 서열에 특이적으로 혼성화하는 센스 핵산 서열 및 안티센스 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the siRNA comprises a sense nucleic acid sequence and an antisense nucleic acid sequence that specifically hybridize to a sequence of REG4 or KIAAOlOl. 제 1항에 있어서, 상기 치료되는 암은 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the cancer to be treated is selected from the group consisting of pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. 제 3항에 있어서, 상기 췌장암은 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC))인 것을 특징으로 하는 방법.4. The method of claim 3, wherein the pancreatic cancer is pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). 제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 REG4의 발현을 억제하고, 상기 치료되는 암이 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC))인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the siRNA inhibits expression of REG4 and the cancer to be treated is pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). 제 1항에 있어서, 상기 작은 간섭 RNA (siRNA)는 KIAA0101의 발현을 억제하고, 상기 치료되는 암은 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the small interfering RNA (siRNA) inhibits expression of KIAAOlOl and the cancer to be treated is selected from the group consisting of pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. 제 2항에 있어서, 상기 siRNA은 표적 서열로서 서열번호 5 또는 서열번호 32에 상응되는 리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the siRNA comprises a ribonucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32 as a target sequence. 제 7항에 있어서, 상기 siRNA는 일반식으로 5'-[A]-[B]-[A']-3'를 갖고,The method according to claim 7, wherein the siRNA has 5 '-[A]-[B]-[A']-3 'in general formula, 상기 식에서, [A]는 서열번호 5 또는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열에 상응되는 리보뉴클레오티드 서열이고,Wherein [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 리보뉴클레오티드 루프 서열이며     [B] is a ribonucleotide loop sequence consisting of 3 to 23 nucleotides [A']는 [A]에 상보적인 서열로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열인 것을 특징 으로 하는 방법,[A '] is a ribonucleotide sequence comprising a sequence complementary to [A], 표적 서열로 상응하는 서열번호 5 또는 서열번호 32의 리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스가닥; 및 상기 센스 가닥에 상보적인 리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 혼성화되어 상기 이중 가닥 분자를 형성하고, 상기 이중 가닥 분자는 REG4 또는 KIAA0101 유전자를 발현하는 세포내로 도입되어 상기 유전자의 발현을 억제하는 이중 가닥 분자.A sense strand comprising a ribonucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32 corresponding to a target sequence; And an antisense strand comprising a ribonucleotide sequence complementary to the sense strand, wherein the sense strand and the antisense strand hybridize with each other to form the double-stranded molecule, wherein the double-stranded molecule expresses a REG4 or KIAA0101 gene. A double stranded molecule introduced into to inhibit expression of the gene. 제 9항에 있어서, 상기 표적 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열에서 적어도 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.10. The double stranded molecule of claim 9, wherein the target sequence comprises at least 10 contiguous nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 39. 제 10항에 있어서, 상기 표적 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 39의 뉴클레오티드 서열에 약 19 내지 25개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자.The double stranded molecule of claim 10, wherein the target sequence comprises about 19 to 25 contiguous nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 39. 제 11항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 단일 가닥의 리보뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 리보뉴클레오티드 전사체 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자. 12. The double stranded molecule of claim 11, wherein the double stranded molecule is a single ribonucleotide transcript comprising a sense strand and an antisense strand joined by a single stranded ribonucleotide sequence. 10항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자가 약 100개 이하의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자. The double stranded molecule of claim 10, wherein the double stranded molecule is an oligonucleotide of about 100 nucleotides or less in length. 제 13항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 75개 이하의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자. The double stranded molecule of claim 13, wherein the double stranded molecule is an oligonucleotide of up to 75 nucleotides in length. 제 14항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자가 50개 이하의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자. 15. The double stranded molecule of claim 14, wherein said double stranded molecule is an oligonucleotide of up to 50 nucleotides in length. 제 15항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 25개 이하의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 분자. 16. The double stranded molecule of claim 15, wherein said double stranded molecule is an oligonucleotide of up to 25 nucleotides in length. 제 16항에 있어서, 상기 이중 가닥 분자는 약 19 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드17. The double stranded polynucleotide of claim 16, wherein said double stranded molecule is an oligonucleotide of about 19 to 25 nucleotides in length. 제 10항의 이중 가닥 분자를 암호화하는 벡터.A vector encoding the double stranded molecule of claim 10. 제 18항에 있어서, 상기 벡터는 이차 구조를 가지는 전사체를 암호화하며, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.19. The vector of claim 18, wherein the vector encodes a transcript having a secondary structure and comprises a sense strand and an antisense strand. 제 19항에 있어서, 상기 전사체는 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 연결하는 단일 가닥 리보뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.The vector of claim 19, wherein the transcript further comprises a single stranded ribonucleotide sequence connecting the sense strand and the antisense strand. 제 18항에 있어서, 서열번호 5 또는 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 센스 가닥 핵산 및 상기 센스 가닥의 상보적인 서열로 구성되는 안티센스 핵산의 조 합을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.The vector of claim 18, wherein the vector comprises a polynucleotide comprising a combination of a sense strand nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32 and an antisense nucleic acid consisting of the complementary sequence of the sense strand. 제 21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 일반식으로 5'-[A]-[B]-[A']-3'를 가지며, 상기 식에서,The method of claim 21, wherein the polynucleotide has a general formula 5 '-[A]-[B]-[A']-3 ', wherein [A]는 서열번호 5 또는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열이고,[A] is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열이며, [B] is a nucleotide sequence consisting of 3 to 23 nucleotides, [A']는 [A]에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 벡터. [A '] is a vector characterized by a nucleotide sequence complementary to [A]. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 REG4의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA (siRNA)의 약학적으로 유효한 양을 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물. A pharmaceutical composition for treating or preventing pancreatic cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a pharmaceutically effective amount of a small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of REG4 as an active ingredient. 제 23항에 있어서, 상기 siRNA는 표적서열로 서열번호 5 또는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 23, wherein the siRNA comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 32 as a target sequence. 제 24항에 있어서, 상기 siRNA는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 가지고, 상기 식에서The method of claim 24, wherein the siRNA has the general formula 5 ′-[A]-[B]-[A ′]-3 ′, wherein [A]는 상기 [A]는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열에 상응되는 리보뉴클레오티드 서열이며,[A] is the [A] is a ribonucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열이고,[B] is a ribonucleotide sequence consisting of 3 to 23 nucleotides, [A']는 [A]에 대하여 상보적인 리보뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물. [A '] is a pharmaceutical composition, wherein the ribonucleotide sequence is complementary to [A]. 유효성분으로 KIAA0101의 발현을 억제하는 약학적 유효량의 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물. Pharmaceutical for the treatment or prophylaxis of cancers selected from the group consisting of pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer comprising a pharmaceutically effective amount of small interfering RNA (siRNA) and a pharmaceutically acceptable carrier which inhibit the expression of KIAA0101 as an active ingredient Composition. 제 26항에 있어서, 상기 siRNA는 표적서열로 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 26, wherein the siRNA comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 as a target sequence. 제 27항에 있어서, 상기 siRNA는 일반식 5'-[A]-[B]-[A']-3'을 가지고, 상기 식에서,The method of claim 27, wherein the siRNA has the general formula 5 '-[A]-[B]-[A']-3 ', wherein [A]는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 리보뉴클레오티드 서열이며,[A] is a ribonucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32, [B]는 3 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성되는 리보뉴클레오티드 서열이고,[B] is a ribonucleotide sequence consisting of 3 to 23 nucleotides, [A']는 [A]에 대하여 상보적인 리보뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.[A '] is a pharmaceutical composition, wherein the ribonucleotide sequence is complementary to [A]. REG4의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA (siRNA)의 췌장암의 치료 및 예방용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도.Use of a small interfering RNA (siRNA) that inhibits the expression of REG4 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of pancreatic cancer. 제 29항에 있어서, 상기 siRNA는 표적서열로 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도. The use of claim 29, wherein the siRNA comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 as a target sequence. REG4의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 작은 간섭 RNA (siRNA)의 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암으로부터 선택되는 암의 치료 및 예방용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도Use of small interfering RNA (siRNA) for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and prevention of cancers selected from pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer characterized by inhibiting the expression of REG4 제 31항에 있어서, 상기 siRNA는 표적서열로서 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.The use according to claim 31, wherein the siRNA comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32 as a target sequence. REG4 활성을 중화시키는 항REG4 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 췌장암 치료 또는 예방방법.A method of treating or preventing pancreatic cancer in a subject, comprising administering to the subject an anti-REG4 antibody or fragment thereof that neutralizes REG4 activity. 제 33항에 있어서, 상기 중화되는 REG4 활성은 자가분비(autocrine)/측분비(paracrine) 방식으로 췌장암의 세포 증식을 촉진하는 활성인 것을 특징으로 하는 방법.34. The method of claim 33, wherein said neutralized REG4 activity is an activity that promotes cell proliferation of pancreatic cancer in an autocrine / paracrine manner. 제 33항에 있어서, 상기 췌장암은 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC))인 것을 특징으로 하는 방법.34. The method of claim 33, wherein the pancreatic cancer is pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). 제 33항에 있어서, 상기 항REG4 항체는 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 33, wherein the anti-REG4 antibody is a monoclonal antibody. 제 33항에 있어서, 상기 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 명명된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 각 VH 및 VL사슬 내의 각 CDR의 아미노산 서열은The antibody of claim 33, wherein the antibody comprises a VH and VL chain, each VH and VL chain comprising a CDR amino acid sequence designated CDR1, CDR2 and CDR3 separated by a framework amino acid sequence, each of The amino acid sequence of each CDR in the VH and VL chains is VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20),VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20), VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (서열번호 21),VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (SEQ ID NO: 21), VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22),VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22), VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23),VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23), VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), 및VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24), and VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25)인 것을 특징으로 하는 방법.VL CDR3: QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25). 제 36항에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 VL이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.37. The method of claim 36, wherein the human VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the human VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. 유효성분으로 REG4 활성을 중화하는 약학적 유효량의 항REG4 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 췌장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물. A pharmaceutical composition for treating or preventing pancreatic cancer comprising a pharmaceutically effective amount of an anti-REG4 antibody or fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier, which neutralizes REG4 activity as an active ingredient. 제 39항에 있어서, 상기 췌장암은 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC))인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.40. The pharmaceutical composition of claim 39, wherein the pancreatic cancer is pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). 제 39항에 있어서, 상기 항REG4 항체는 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.40. The pharmaceutical composition of claim 39, wherein the anti-REG4 antibody is a monoclonal antibody. 제 39항에 있어서, 상기 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 명명된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 각 VH 및 VL 사슬 내의 각 CDR의 아미노산 서열은The antibody of claim 39, wherein the antibody comprises a VH and VL chain, each VH and VL chain comprising a CDR amino acid sequence designated CDR1, CDR2, and CDR3 separated by a framework amino acid sequence, The amino acid sequence of each CDR in the VH and VL chains is VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20),VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20), VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (서열번호 21),VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (SEQ ID NO: 21), VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22),VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22), VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23),VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23), VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), 및VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24), and VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.VL CDR3: QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25). 제 42항에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 VL은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.43. The pharmaceutical composition of claim 42, wherein the human VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the human VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. 항체가 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 명명된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 각 VH 및 VL 사슬 내의 각 CDR의 아미노산 서열은The antibody comprises a VH and VL chain, each VH and VL chain comprising a CDR amino acid sequence named CDR1, CDR2 and CDR3 separated by a framework amino acid sequence, each CDR within each VH and VL chain The amino acid sequence of VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20),VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20), VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (서열번호 21),VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (SEQ ID NO: 21), VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22),VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22), VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23),VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23), VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), 및VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24), and VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25)인 항체.VL CDR3: an antibody which is QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25). 제 44항에 있어서, 상기 인간 VH는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하 고, 인간 VL은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.45. The antibody of claim 44, wherein the human VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 and the human VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. 제 44항의 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.An isolated polynucleotide encoding the antibody of claim 44. 제 44항의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.A vector comprising a polynucleotide encoding the antibody of claim 44. 제 44항의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포.An isolated host cell comprising a vector comprising a polynucleotide encoding the antibody of claim 44. 제 48항의 숙주세포를 배양하여 폴리뉴클레오티드는 발현되고, 숙주 세포 배양액으로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체 생산 방법.49. A method for producing an antibody comprising culturing the host cell of claim 48, wherein the polynucleotide is expressed and recovering the antibody from the host cell culture. 제 44항의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 췌장암 치료 또는 예방용 약학적 조성물.45. A pharmaceutical composition for treating or preventing pancreatic cancer comprising a polynucleotide encoding the antibody of claim 44 or a vector comprising the same. REG4를 암호화하는 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 췌장암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물의 제조를 위한 용도.Use for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of pancreatic cancer of an antibody or fragment thereof that binds a protein encoding REG4. 제 51항에 있어서, 상기 항체는 VH 및 VL 사슬을 포함하고, 각 VH 및 VL 사슬은 프레임워크(framework) 아미노산 서열에 의해 분리되는 CDR1, CDR2 및 CDR3로 명명된 CDR 아미노산 서열을 포함하며, 각 VH 및 VL 사슬 내의 각 CDR의 아미노산 서열은The antibody of claim 51, wherein the antibody comprises a VH and VL chain, each VH and VL chain comprising a CDR amino acid sequence designated CDR1, CDR2, and CDR3 separated by a framework amino acid sequence, The amino acid sequence of each CDR in the VH and VL chains is VH CDR1 : SYWMH (서열번호 20),VH CDR1: SYWMH (SEQ ID NO: 20), VH CDR2 : NIYPGSGSTNYD (서열번호 21),VH CDR2: NIYPGSGSTNYD (SEQ ID NO: 21), VH CDR3 : GGLWLRVDY (서열번호 22),VH CDR3: GGLWLRVDY (SEQ ID NO: 22), VL CDR1 : SASSSVSYMH (서열번호 23),VL CDR1: SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 23), VL CDR2 : DTSKLAS (서열번호 24), 및VL CDR2: DTSKLAS (SEQ ID NO: 24), and VL CDR3 : QQWSSNPF (서열번호 25)인 것을 특징으로 하는 용도.VL CDR3: Use characterized in that QQWSSNPF (SEQ ID NO: 25). QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 펩티드 의 생물학적 기능이 결여된, 암 치료 및/또는 예방용 제제.Polypeptides comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46); A polypeptide functionally equivalent to the polypeptide; Or a polynucleotide encoding the polypeptides as an active ingredient, wherein the polypeptide lacks the biological function of the peptide consisting of SEQ ID NO: 40. 제 53항에 있어서, 상기 생물학적 기능은 세포 증식 활성인 것을 특징으로 하는 제제.54. The formulation of claim 53, wherein said biological function is cell proliferation activity. 제 53항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 8 내지 30개의 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 제제.54. The formulation of claim 53, wherein said polypeptide consists of 8 to 30 residues. 제 53항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44) 또는 TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.55. The formulation of claim 53, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence of VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44) or TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45). 제 53항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44) 또는 TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45)로 구성되는 것을 특징으로 하는 제제.54. The formulation of claim 53, wherein the polypeptide consists of VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44) or TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45). 제 53항에 있어서, 상기 유효 성분은 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드는 세포막 투과성 물질로 변형된 것을 특징으로 하는 제제.54. The formulation of claim 53, wherein said active ingredient is a polypeptide and said polypeptide is modified with a cell membrane permeable substance. 제 58항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 일반식 [R]-[D]를 가지고, 상기 식에서59. The polypeptide of claim 58, wherein the polypeptide has the general formula [R]-[D], wherein [R]은 세포막 투과성 물질을 나타내고,[R] represents a cell membrane permeable substance, [D]는 QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 단편서열의 아미노산 또는 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 나타내며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 펩티드의 생물학적 기능이 결여된 것을 특징으로 하는 제제.[D] represents an amino acid of a fragment sequence comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46) or a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide, wherein the polypeptide lacks the biological function of the peptide consisting of SEQ ID NO: 40. 제 58항에 있어서, 상기 세포막 투과성 물질은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나인 제제:59. The formulation of claim 58, wherein the cell membrane permeable material is any one selected from the group: 폴리-아르기닌(poly-arginine);Poly-arginine; 태트(Tat) / RKKRRQRRR (서열번호 47);Tat / RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 47); 페네트라틴(Penetratin) / RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 48);Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 48); 부포린ⅱ(Buforin ⅱ) / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (서열번호 49);Buforin ii / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 49); 트랜스포탄(Transportan) / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 50);Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 50); 맵(MAP) (model amphipathic 펩티드) / KLALKLALKALKAALKLA (서열번호 51);MAP (model amphipathic peptide) / KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 51); K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP (서열번호 52);K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 52); Ku70 / VPMLK (서열번호 53 또는 PMLKE (서열번호 61);Ku70 / VPMLK (SEQ ID NO: 53 or PMLKE (SEQ ID NO: 61)); 프리온(Prion) / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (서열번호 54);Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (SEQ ID NO: 54); pVEC / LLⅱLRRRIRKQAHAHSK (서열번호 55);pVEC / LLiiLRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 55); Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열번호 56);Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 56); SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR (서열번호 57);SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO: 57); Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY (서열번호 58); 및 Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO: 58); And HN-1 / TSPLNIHNGQKL (서열번호 59). HN-1 / TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO: 59). 제 60항에 있어서, 상기 폴리-아르기닌은 Arg 11 (서열번호 60)인 것을 특징으로 하는 제제61. The formulation of claim 60, wherein said poly-arginine is Arg 11 (SEQ ID NO: 60). 제 53항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 전립선암, 유방암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제제.55. The agent of claim 53, wherein the cancer is any one selected from the group consisting of pancreatic cancer, prostate cancer, breast cancer and bladder cancer. QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 폴리펩티드; 상기 펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포 함하는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 펩티드의 생물학적 기능이 결여된 것을 특징으로 하는 암 치료 및/또는 예방방법.Polypeptides comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46); Polypeptides functionally equivalent to the peptide; Or administering a polypeptide comprising a polynucleotide encoding said polypeptides, said polypeptide lacking the biological function of a peptide consisting of SEQ ID NO: 40. QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드; 또는 상기 폴리펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 암 치료 및/또는 예방용 조성물의 제조에 사용하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 폴리펩티드의 생물학적 기능이 결여된 것을 특징으로 하는 용도.Polypeptides comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46); A polypeptide functionally equivalent to the polypeptide; Or a polynucleotide encoding the polypeptides for use in the manufacture of a composition for treating and / or preventing cancer, wherein the polypeptide lacks the biological function of the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 40. QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 펩티드의 생물학적 기능이 결여된 폴리펩티드.Polypeptides comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46); A polypeptide functionally equivalent to the polypeptide; And a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the polypeptide lacks the biological function of the peptide consisting of SEQ ID NO: 40. QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 펩티드의 생물학적 기능이 결여된 폴리펩티드.A polypeptide comprising the polypeptide comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46) or a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide, wherein the polypeptide lacks the biological function of the peptide consisting of SEQ ID NO: 40. 17. 제 66항에 있어서, 상기 생물학적 기능이 세포 증식 활성인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.67. The polypeptide of claim 66, wherein said biological function is cell proliferation activity. 제 66항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 8 내지 30개의 잔기를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.67. The polypeptide of claim 66, wherein the polypeptide has 8 to 30 residues. 제 66항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44) 또는 TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45)를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.67. The polypeptide of claim 66, wherein the polypeptide comprises VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44) or TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45). 제 66항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (서열번호 44) 또는 TPKWQKGIGEFFRLSP (서열번호 45)의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.67. The polypeptide of claim 66, wherein the polypeptide consists of the amino acid sequence of VRPTPKWQKGIGEFFRLSPK (SEQ ID NO: 44) or TPKWQKGIGEFFRLSP (SEQ ID NO: 45). 제 66항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 세포막 투과성 물질로 변형된 것을 특 징으로 하는 폴리펩티드. 67. The polypeptide of claim 66 wherein the polypeptide is modified with cell membrane permeable material. 제 71항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 일반식 [R]-[D]를 가지고, 상기 식에서The polypeptide of claim 71, wherein the polypeptide has the general formula [R]-[D], wherein [R]은 세포막 투과성 물질을 나타내고,[R] represents a cell membrane permeable substance, [D]는 QKGIGEFF (서열번호 46)을 포함하는 단편 서열의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 상기 단편 서열을 포함하며, 상기 폴리펩티드는 서열번호 40으로 구성되는 펩티드의 생물학적 기능이 결여된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.[D] comprises the amino acid sequence of a fragment sequence comprising QKGIGEFF (SEQ ID NO: 46) or the fragment sequence functionally equivalent to the polypeptide, wherein the polypeptide lacks the biological function of a peptide consisting of SEQ ID NO: 40 Polypeptide. 제 72항에 있어서, 상기 세포막 투과성 물질은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:The polypeptide of claim 72, wherein the cell membrane permeable material is any one selected from the group consisting of: 폴리-아르기닌(poly-arginine);Poly-arginine; Tat / RKKRRQRRR (서열번호 47);Tat / RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 47); 페네트라틴(Penetratin) / RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 48);Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 48); 부포린 ⅱ(Buforin ⅱ) / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (서열번호 49);Buforin ii / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK (SEQ ID NO: 49); 트랜스포탄(Transportan) / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 50);Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 50); MAP (model amphipathic 펩티드) / KLALKLALKALKAALKLA (서열번호 51);MAP (model amphipathic peptide) / KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 51); K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP (서열번호 52);K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 52); Ku70 / VPMLK (서열번호 53);Ku70 / VPMLK (SEQ ID NO: 53); Ku70 / PMLKE (서열번호 61);Ku70 / PMLKE (SEQ ID NO: 61); 프리온(Prion) / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (서열번호 54);Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP (SEQ ID NO: 54); pVEC / LLⅱLRRRIRKQAHAHSK (서열번호 55);pVEC / LLiiLRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 55); Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열번호 56);Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 56); SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR (서열번호 57);SynB1 / RGGRLSYSRRRFSTSTGR (SEQ ID NO: 57); Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY (서열번호 58); 및 Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY (SEQ ID NO: 58); And HN-1 / TSPLNIHNGQKL (서열번호 59). HN-1 / TSPLNIHNGQKL (SEQ ID NO: 59). 제 73항에 있어서, 상기 폴리-아르기닌은 Arg 11 (RRRRRRRRRRR (서열번호 60)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.The polypeptide of claim 73, wherein the poly-arginine is Arg 11 (RRRRRRRRRRR (SEQ ID NO: 60)). (a)환자-유래의 생물학적 시료에서 REG4 유전자의 발현량을 검출하는 단계;(a) detecting the expression level of the REG4 gene in the patient-derived biological sample; (b)검출된 발현량과 대조군의 발현량을 비교하는 단계; 및(b) comparing the detected expression level with that of the control group; And (c)검출된 발현량이 정상 대조군의 발현량에 비해 증가시, 개체가 화학-방사선 치료 내성이 있는 암을 겪고 있거나, 화학-방사선 치료 내성의 위험 상태에 있다고 판단하는 단계를 포함하는 개체 내 암의 화학-방사선 치료 내성의 진단 방법(c) when the detected expression level is increased relative to the expression level of the normal control, cancer in the subject comprising determining that the individual is suffering from chemo-radiotherapy resistant cancer or at risk for chemo-radiotherapy resistance Method of chemo-radiation therapy tolerance 제 75항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 방법.76. The method of claim 75, wherein the cancer is pancreatic cancer.
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