KR20090035994A - Antibiotics containing low molecular water soluble chitosan or derivative thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항생제에 관한 것으로, 구체적으로 병원성 박테리아, 병원성 효모 곰팡이 및 균사체를 형성하는 곰팡이에 대한 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내는 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항생제에 관한 것이다.The present invention relates to an antibiotic containing a low molecular weight water-soluble chitosan or a derivative thereof as an active ingredient, and specifically, to a low molecular water-soluble chitosan or a derivative thereof which exhibits excellent antibacterial and antifungal activity against pathogenic bacteria, pathogenic yeast molds and fungi forming mycelium. It relates to an antibiotic containing as an active ingredient.
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis ) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다(Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).Bacterial infections are one of the most common and fatal causes of human disease. Unfortunately, the abuse of antibiotics has resulted in antibiotic resistance of bacteria. Indeed, the rate at which bacteria are resistant to new antibiotics is much faster than the rate at which new antibiotic analogs are developed. For example, which may pose a threat to life, Enterococcus faecalis kusu nose (Enterococcus faecalis), Mycobacterium-to M. tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) and bacterial species such as Pseudomonas her rugi Labor (Pseudomonas aeruginosa) have raised resistance to all antibiotics known so far (Stuart B. Levy, Scientific American , 46-53, 1998).
항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin)과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 페니실린의 경우에 있어서 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzymes)를 활성화함으로써 세균을 죽이지만, 또한 세균이 이 효소의 활성을 억제하여 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.Tolerance to antibiotics is a distinct phenomenon from antibiotic resistance, first discovered in Pneumococcus sp. In the 1970s and providing an important clue to the mechanism of action of penicillin (Tomasz et al., Nature , 227, 138-140, 1970). Tolerant species stop growing in the presence of the usual concentration of antibiotics but do not die as a result. Resistance is due to the absence of the activity of bacterial autolytic enzymes such as autolysin when antibiotics inhibit cell wall synthase, which in the case of penicillin activates endogenous hydrolytic enzymes. This kills the bacteria, but also inhibits the activity of the enzyme, resulting in survival during antibiotic treatment.
세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis ., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데, 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 있는 것으로 알려져 있으므로(Liu and Tomasz, J. Infect . Dis., 152, 365-372, 1985), 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.It is important for extremely clinically, this is because when it becomes impossible to kill the resistant bacteria The effectiveness of antibiotic therapy in clinical infections dropped (Handwerger and Tomasz, Rev. Infec . Dis. The bacteria having a resistance to antibiotics, 7, 368-386, 1985). In addition, resistance is regarded as a prerequisite for bacterial resistance to antibiotics, because strains survive even antibiotic treatment. These strains acquire new genetic elements that are resistant to antibiotics and continue to grow even in the presence of antibiotics. In fact, all bacteria that are resistant to antibiotics are known to be resistant to the antibiotics (Liu and Tomasz, J. Infect . Dis. , 152, 365-372, 1985), which can kill bacteria that are antibiotic resistant. The development of new antibiotics is necessary.
작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지로 구분되는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장 속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며(Tuomanen E., Revs . Infect . Dis ., 3, S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은 오토라이신 효소의 활성을 감소시키는 조절(down regulation)이 일어나는 것인데, 이러한 조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이지만 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게, 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소의 결손으로 생긴 경우인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로 이러한 자가분해 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며 오히려 임상에서 발견되는 내성은 오토라이신 효소의 활성을 외형적으로 조절하는 과정으로 이루어진다(Tuomanen et al., J. infect . Dis ., 158, 36-43, 1988).In terms of the mechanism of action, resistance is largely divided into two types, the first being a phenotypic resistance that occurs when growth rate decreases in all bacteria (Tuomanen E., Revs . Infect . Dis . , 3, S279). -S291, 1986), the second is genetic resistance by mutations in certain bacteria. In both cases, the basic phenomenon is that down regulation occurs, which reduces the activity of the autolysine enzyme, which is transient when it is externally resistant to external stimuli, but changes the pathways that regulate cellular hemolysis. It is permanent in case of genetic resistance with the resulting mutation. Clearly, the simplest case of genetic resistance is due to a deficiency of the autolysine enzyme, which has not been clinically found to be resistant to the deficiency of this autolytic enzyme for a variety of reasons, rather than clinically. Resistance consists of a process that modulates the activity of the autolysine enzyme (Tuomanen). et al ., J. infect . Dis . , 158, 36-43, 1988).
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 오토라이신 효소의 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. As described above, in order to remove bacteria showing resistance to antibiotics, the development of new antibiotics is needed, and the development of new antibiotics that act independently of the activity of the autolysine enzyme is necessary.
한편, 키토산은 게, 가재 또는 새우 껍데기에 들어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 물질을 말한다. 1811년 프랑스의 자연사학자 브라코노가 버섯에 포함 되어 있는 미지의 성분, 즉 키틴을 발견한 것이 시초이다. 그 후 1859년 화학자 루게가 키틴을 아세틸화하여 새로운 물질을 얻어냈으며, 1894년에 과학자 후페 자이라가 이를 키토산이라 명명하였다. 특성은 노폐해진 세포를 활성화하여 노화를 억제하고 면역력을 강화해주며 질병을 예방해준다. 또한 생체의 자연적인 치유 능력을 활성화하는 기능과 함께 생체 리듬을 조절해준다. 그러나 그 메커니즘은 아직 완전히 규명되지 못하였다. 이러한 키토산의 효능은 첫째, 항암작용을 들 수 있다. '키토올리고당'은 면역기구중의 암세포를 활성화시키고 암세포를 포착 공격하는 '내추럴 킬러'(N.K)세포의 작용을 강화시켜 항암효과를 높인다는 사실을 1982년 일본 도호꾸 약과대학의 시게오 교수 팀이 입증 발표하여 오늘날 '키토 올리고당'이 항암제로서 각광을 받고 있다. 둘째, 면역력 강화이다. 인체의 질병에 대한 면역계는 면역세포와 항체, 그리고 면역기능 조절물인 BRM등으로 구성되어있는데 '키토 올리고당'이 항암작용 외에 다른 질병에 대한 면역을 현저하게 발휘한다는 사실을 역시 일본의 도후꾸 약과대학과 돗도리대학 연구팀에 의하여 실험 입증 발표하였다. 셋째, 콜레스테롤의 조절이다. 동맥경화, 심장병, 뇌경색 등은 그 원인이 '콜레스테롤'에 있다는 것은 우리도 알고 있는 사실이다. '키토 올리고당'이 양전하성이라는데 착안한 일본의 규수대학 스가노교수가 식물성 섬유보다 '키토 올리고당'이 월등하게 혈중 '콜레스테롤'수치를 저하시켜 준다는 사실을 입증 발표하였다. 넷째, 혈당의 조절이다. 당뇨병의 예방과 치료에는 식물성 섬유가 유효하다는 사실도 알려졌지만 그 보다 '키토 올리고당'을 섭취하는 것이 우수한 효과가 있다는 증거를 도교대학의 농학부 영양학과 연구팀이 실험에 의하여 발표한 바 있 다. 다섯째, 장기능의 개선이다. '키토 올리고당'은 '비피더스'균이나 유산균등 장내의 유익균을 증가시키고 대장균등 유해균에는 항균력을 강하게 발휘한다는 사실을 일본 규슈대학 스가노 교수팀에 의하여 연구 발표가 있었다. 여섯째, 중금속의 흡착과 배설이다. 과다한 필요 이상의 중금속이 체내에 들어와 체외로 배출하지 못하고 질병에 시달리게 되는데 수은중독에 의한 '미나마타'병, 카드늄에 의한 '이따이 이따이'병, 우유의 비소중독 등은 활성탄을 사용하거나 화학반응을 이용하는 방법밖에 아직은 유효한 제거방법이 없는 것으로 알려져 있다. 그러나 일본의 돗도리대학 히라노 시게로 교수연구팀이 인체내에 섭취된 '키토 올리고당'이 납, 크롬, 카드뮴, 비소, 수은 등의 중금속을 이온화하여 흡착한 후 체외로 배출시킨다는 사실을 발견 학계에 발표한바 있다. 일곱째, 산성체질의 개선이다. '키토 올리고당'을 섭취함으로써 체액을 약 '알카리'성으로 환원시키고 산성체질로 개선되며 어깨 결림, 냉증이 사라지고 당뇨병에 의한 여러 가지 합병증 등에 효과가 있다고 일본의 오꾸다교수는 연구 결과를 학계에 보고 발표하였다. 따라서 키토산의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며 이를 이용해 세균에 대한 항생제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 지금까지 보고된 키토산으로는 고분자의 불수용성 키토산과 고분자 상태의 수용성 키토산에 대한 항생제 기능이 보고된 바 있다. On the other hand, chitosan refers to a substance obtained by deacetylating chitin contained in crab, lobster or shrimp shell. In 1811, French natural historian Bracono discovered the unknown ingredient, chitin, contained in mushrooms. Later, in 1859, the chemist Rugue acetylated chitin to obtain a new material, which in 1894 was named chitosan. The trait activates the depleted cells, inhibiting aging, strengthening immunity and preventing disease. It also regulates biorhythms with the ability to activate the body's natural healing abilities. But the mechanism is not yet fully understood. The efficacy of such chitosan is, firstly, anticancer action. In 1982, Professor Shigeo of Tohoku University of Medicine and Japan's Tohoku University of Pharmacy said that chitooligosaccharides enhance anti-cancer effects by activating cancer cells in the immune system and enhancing the effects of natural killer (NK) cells that capture and attack cancer cells. Today, 'chito oligosaccharides' are in the spotlight as anticancer drugs. Second, strengthen immunity. The immune system for human diseases consists of immune cells, antibodies, and immune function modulators, such as BRM. The fact that chito oligosaccharides exert immunity against other diseases in addition to anticancer activity is also a major factor in Tofuku University of Medicine in Japan. The experiment was announced by the Dotdori University research team. Third is the regulation of cholesterol. We know that arteriosclerosis, heart disease, and cerebral infarction are the causes of 'cholesterol'. Professor Sugano of Japan's Kyushu University, who thought that chito oligosaccharides are positively charged, proved that chito oligosaccharides significantly lower blood cholesterol levels than vegetable fiber. Fourth, blood sugar is regulated. Although vegetable fiber is known to be effective in the prevention and treatment of diabetes, experimental results have been published by the Department of Nutrition and Nutrition at the Faculty of Agriculture at the University of Taoism. Fifth, improvement of bowel function. According to the research team of Japanese Kyushu University Professor Sugano, `` Kito oligosaccharides '' increase the beneficial bacteria in the intestines such as Bifidobacteria and lactic acid bacteria, and exert strong antibacterial activity against harmful bacteria such as Escherichia coli. Sixth, the adsorption and excretion of heavy metals. Excessive heavy metals enter the body and fail to be released into the body, causing illnesses.The 'Minamata' disease caused by mercury poisoning, the 'i-day' disease caused by cadmium, and the arsenic poisoning of milk use activated carbon or chemical reactions. There is no known effective removal method yet. However, a research team from Shigero Hirano, a professor at Tottori University in Japan, found in the academic community that `` chito-oligosaccharides '' ingested in the human body ionize heavy metals such as lead, chromium, cadmium, arsenic, and mercury and then release them out of the body. have. Seventh, improvement of acid constitution. Ingesting `` kito oligosaccharides '' reduces body fluids to "alkaline" properties, improves acid constitution, eliminates stiff shoulders, coldness, and other complications caused by diabetes. Announced. Therefore, many studies have been conducted on the antimicrobial activity of chitosan, and many studies have been attempted to develop antibiotics against bacteria. The chitosan reported so far has been reported to have an antibiotic function against the water-insoluble chitosan of the polymer and the water-soluble chitosan of the polymer state.
키토산은 천연물 가운데 유일하게 아미노기(NH2)라고 하는 분자를 가진 플러스(+)이온을 가진다. (+)이온은 화학적 성질로 마이너스(-)이온과 굉장히 붙기 쉬운 성질을 가지고 있다. 흥미롭게도 세균이나 바이러스, 박테리아는 (-)이온인 카 르복실기(COOH)라고 하는 분자를 가지고 있어 키토산의 (+)이온과 만나면 바로 결합해 버리는 것이다. 세균이나 박테리아는 이렇게 무해화되어 체외로 배출되어 버린다. 키토산의 항균성은 피부병으로 고생하는 사람들에게 큰 위안이 된다. 이 성질을 이용하여 각종 요리, 빵, 과자, 찌개, 떡, 무공해 콩나물 등에 방부제 및 신선도를 유지하는 첨가제로 사용하고 있다. 또한, 키토산은 인체의 면역 기능을 강화시키는 작용을 한다. 면역기능이 제대로 작용하고 있으면 체내 침입한 병원체나 독성물질, 기타 유해물질들을 배출하는 작용도 정상적으로 가능해진다. 이러한 배출 역할을 담당하는 것이 백혈구로서, 백혈구에는 대식세포(매크로퍼지 Macrophage), T세포, B세포 (항체생산)가 있다. 일본 돗도리 대학의 히라노 교수는 쥐를 사용한 실험에서 키토산이 T세포를 활성화하는 한편 백혈구를 증식시키는 역할을 하고 있는 것을 확인하였다.Chitosan is the only natural product with a positive ion with a molecule called an amino group (NH2). Positive ions have chemical properties and are very easy to attach with negative (-) ions. Interestingly, bacteria, viruses, and bacteria have a molecule called carboxyl group (COOH), which is a negative ion. Bacteria and bacteria are so harmless that they are released out of the body. Chitosan's antibacterial properties are a great comfort for people suffering from skin diseases. By using this property, it is used as an additive to maintain preservatives and freshness in various dishes, breads, sweets, stew, rice cakes, and pollution-free sprouts. Chitosan also acts to enhance the body's immune function. If the immune function is working properly, it is also possible to release pathogens, toxic substances and other harmful substances that have invaded the body. Leukocytes play a role in this discharge, and leukocytes include macrophages (macrophage), T cells, and B cells (antibody production). Hirano, a professor at Totdori University in Japan, found that chitosan plays a role in proliferating white blood cells while activating T cells.
이러한 지금까지의 키토산은 대부분이 불수용성 상태를 이용한다든지 아니면 수용성일지라도 고분자 형태의 키토산을 산업적 혹은 의학적으로 이용하는 것이 대부분이었고, 특히 위에 언급한 불수용성 혹은 수용성일지라도 고분자 형태의 키토산의 경우에도 그 이용은 무궁무진함을 알 수 있다. 항암, 간장기능 강화, 고혈압, 당뇨병등 성인병 및 비만예방, 혈압 강화, 의료용기자재, 콘텍트 렌즈, 인공 피부, 인공혈관, 수술용 봉합사, 인공 투석막 등의 의료 의학분야에 이용될 수 있고,면역력 강화, 노화 억제, 질병예방, 생체 리듬의 조절, 세균 및 곰팡이 발생예방, 병으로부터의 회복촉진, 즘점 및 선도 유지를 위한 첨가제 등 생체기능 조절을 위한 기능성 식품에 이용될 수 있다. 또한, 무공해 랩, 비닐, 프라스틱, 사진용 필름, 의류, 연료, 지질 강화제, 룰 처리 양조 간장의 빛깔 개선, 양조식초의 혼탁 및 침전방지, 김치의 산화방지제 등 공업분야에 이용될 수 있고, 오수 처리제, 중금속 이온 회수제 등 공해처리에 이용될 수 있다. 또한, 보습제(NMF), 모발 염색제, 모발가공, 세정제 등 화장품에 이용될 수 있고, 식물항 바이러스병 방지제 식물성장 촉진제로 이용될 수 있다. 아울러, 무공해 살충제, 연작 장애 방지, 토양 개량제, 양어장의 수질개선, 사료첨가제, 동물의 성장촉진사료, 육질 개선, 환경 개선 등 농업, 어업, 축산 등 다양한 분야에서 이용될 수 있다. Most of these chitosans have been industrially or medically using chitosan in the form of polymers, even if they are insoluble or soluble in water. Especially, the use of chitosan in the form of polymers, even if insoluble or water-soluble, is You can see that it is infinite. It can be used in medical medicine fields such as anti-cancer, liver function enhancement, hypertension, diabetes, adult disease and obesity prevention, blood pressure strengthening, medical equipment, contact lens, artificial skin, artificial blood vessel, surgical suture, artificial dialysis membrane, etc. It can be used in functional foods for controlling biological functions such as aging inhibition, disease prevention, regulation of biological rhythms, prevention of bacteria and mold development, recovery from disease, additives for maintaining point and freshness. In addition, it can be used in industrial fields such as pollution-free wrap, vinyl, plastic, photographic film, clothing, fuel, lipid reinforcing agent, improving the color of ruled brewed soy sauce, preventing turbidity and precipitation of vinegar, antioxidant of kimchi, It can be used for pollution treatment such as treatment agent, heavy metal ion recovery agent. In addition, it can be used in cosmetics such as moisturizers (NMF), hair dyes, hair processing, cleaning agents, and can be used as a plant growth inhibitor for plant antiviral disease. In addition, it can be used in various fields such as agriculture, fishery, and livestock raising, including pollution-free insecticides, prevention of crop disturbances, soil improving agents, water quality improvement of fish farms, feed additives, animal growth promoting feed, meat quality improvement, and environmental improvement.
이에, 본 발명자들은 30 킬로 달톤 이하, 즉 30,000, 20,000, 10,000, 5,000, 3,000 그리고 1,000 달톤의 저분자이고 수용성인 키토산에서 병원성 박테리아, 병원성 효모 곰팡이 및 균사체를 형성하는 곰팡이에 대한 항균 및 항진균 활성을 나타내고 세포 독성이 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have shown antimicrobial and antifungal activity against fungi forming pathogenic bacteria, pathogenic yeast molds and mycelium in low molecular and water soluble chitosans of 30 kilo Daltons or less, ie 30,000, 20,000, 10,000, 5,000, 3,000 and 1,000 Daltons. The present invention was completed by confirming no cytotoxicity.
본 발명의 목적은 항균 및 항진균 활성을 나타내는 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide an antibiotic containing as an active ingredient a low molecular water-soluble chitosan or derivatives thereof that exhibit antibacterial and antifungal activity.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an antibiotic containing a low molecular weight water-soluble chitosan or a derivative thereof as an active ingredient.
또한, 본 발명은 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 항생용 건강식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food for antibiotics as an active ingredient with a low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof.
본 발명의 분자량이 1,000 ~ 30,000인 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체는 병원성 박테리아, 병원성 효모 곰팡이 및 균사체를 형성하는 곰팡이에 대한 우수한 항균 및 항진균 활성을 나타내고, 저분자 형태이므로 흡수가 유리하고 체내에서 항체 형성의 가능성이 희박하며, 수용성이므로 세포 독성이 거의 없으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.The low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof having a molecular weight of 1,000 to 30,000 of the present invention shows excellent antibacterial and antifungal activity against pathogenic bacteria, pathogenic yeast molds and fungi forming mycelium, and because of their low molecular form, their absorption is advantageous and the effect of antibody formation in the body It is very unlikely and is water soluble, so it has little cytotoxicity and can be used as a safe antibiotic for humans.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 저분자 수용성 키토산은 하기와 같은 제조방법에 의해 제조된다.The low molecular water soluble chitosan of the present invention is prepared by the following production method.
1) 초산, 과산화수소 및 황산의 혼합물을 가열하는 단계;1) heating a mixture of acetic acid, hydrogen peroxide and sulfuric acid;
2) 단계 1)의 혼합물에 잔류 석회질, 잔류 단백질, 탈아세틸화된 키토산을 가하는 단계; 2) adding residual calcareous, residual protein, deacetylated chitosan to the mixture of step 1);
3) 단계 2)의 혼합물을 가열하여 키토산을 저분자화 및 수용화하는 단계; 3) heating the mixture of step 2) to lower the molecular weight and solubilize chitosan;
4) 단계 3)의 용액을 NaOH 수용액으로 알칼리화한 후 HCl 수용액으로 중화시키는 단계; 및 4) neutralizing the solution of step 3) with aqueous NaOH solution and then neutralizing with aqueous HCl solution; And
5) 단계 4)의 중화된 용액을 투석 및 여과한 후 동결건조시키는 단계,5) lyophilization after dialysis and filtration of the neutralized solution of step 4),
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 초산은 키토산 1몰에 대하여 0.85∼6.0몰, 바람직하게는 1.5∼4.5몰, 과산화 수소는 키토산 1몰에 대하여 5.5∼19.5몰, 바람직하게는 6∼12몰 및 황산은 키토산 1몰에 대하여 0.02∼0.07몰, 바람직하게는 0.03∼0.06몰을 혼합 사용하며, 상기 혼합물은 키토산 1몰에 대하여 총 부피 80~300㎖, 바람직하게는 100~240㎖의 양으로 첨가하나 이에 한정되지 않는다. 상기 가열 온도가 30∼50℃, 바람직하게는 40~50℃일 때 키토산을 첨가하나 이에 한정되지 않는다. In the above production method, the acetic acid of step 1) is 0.85 to 6.0 mol, preferably 1.5 to 4.5 mol, per hydrogen peroxide, 5.5 to 19.5 mol, preferably 6 to 12 mol and 1 mol of chitosan Sulfuric acid is used in an amount of 0.02 to 0.07 mol, preferably 0.03 to 0.06 mol per 1 mol of chitosan, and the mixture is added in an amount of 80 to 300 ml, preferably 100 to 240 ml, based on 1 mol of chitosan. One is not limited thereto. Chitosan is added when the heating temperature is 30 to 50 ° C, preferably 40 to 50 ° C, but is not limited thereto.
상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 키토산의 저분자화 및 수용화 반응은 40∼80℃, 바람직하게는 40~65℃에서 3∼10 시간, 바람직하게는 4~8 시간 동안 수행 하나 이에 한정되지 않는다.In the above production method, the low molecular weight and solubilization reaction of chitosan in step 3) is performed at 40 to 80 ° C, preferably 40 to 65 ° C for 3 to 10 hours, preferably 4 to 8 hours, but not limited thereto. Do not.
상기 제조방법에 있어서, 단계 4)의 NaOH는 초기에는 10% NaOH 수용액을 가한 후 40% NaOH 용액을 가하여 pH를 7∼9로 조정하고, 알칼리화된 용액은 HCl 수용액을 사용하여 중화시키는 것이 바람직하다. In the above method, NaOH in step 4) is initially added to 10% aqueous NaOH solution, 40% NaOH solution is added to adjust the pH to 7-9, and the alkalized solution is preferably neutralized using HCl aqueous solution. .
상기 제조방법에 있어서, 단계 5)의 중화된 용액은 탈이온수 내에서 투석한 후 여과 및 동결건조시켜 최종적으로 저분자량의 수용성 키토산을 제조한다.In the above production method, the neutralized solution of step 5) is dialyzed in deionized water, filtered and lyophilized to finally prepare a low molecular weight aqueous chitosan.
본 발명은 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.The present invention provides an antibiotic containing a low molecular weight water-soluble chitosan or a derivative thereof as an active ingredient.
본 발명의 30킬로 달톤 이하의 저분자 수용성 키토산은 고분자에서 저분자 형태로 치환됨에 따라 흡수면에서 유리하고 체내에서 항체 형성의 가능성이 희박하며, 불수용성에서 수용성 형태로 치환됨에 따라 미생물의 세포막에 결합시 결합력을 향상시키고 세포독성이 전혀 없게 됨으로써 항생 효과를 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 저분자 수용성 키토산은 분자 크기가 1,000~30,000 사이에 있는 것은 모두 사용가능하다.The low molecular weight water-soluble chitosan of 30 kilodaltons or less of the present invention is advantageous in terms of absorption as it is substituted in the low molecular form in the polymer, and is unlikely to form antibodies in the body, and when bound to the cell membrane of microorganisms as it is substituted in water-soluble form. It is characterized by being able to enhance the antibiotic effect by improving the binding force and no cytotoxicity. The low molecular weight water-soluble chitosan of the present invention can be used for anything having a molecular size between 1,000 and 30,000.
상기 저분자 수용성 키토산의 유도체는 키토산의 구조의 2번 위치의 탄소에 유리 아미노기(-NH2) 또는 6번의 위치의 탄소에 알콜(-OH)기에 새로운 화학적 치환기를 도입시켜 키토산의 항균 및 항진균 활성의 변화가 없는 것을 특징으로 한다.The derivatives of the low molecular weight water-soluble chitosan are introduced into a free amino group (-NH2) or an alcohol (-OH) group on a carbon at position 2 of the structure of chitosan to change the antibacterial and antifungal activity of chitosan. Characterized by the absence of.
상기 키토산 유도체 제조는 "카보하드레이트 폴리머(Carbohydrate Polymers 8(1988), p1-21)"에서 알칼리 존재 하에서의 키토산의 카복시메틸화에 대한 내용을 기재하고 있으며, Int . J. Biol . Macromol. 10(1988), p124-125; J. Chem . Soc ., Chem, Comm(1980), p1153-1154; J. App . Polymer Science 31(1986), p1951-1954; Makromol . Chem. 188(1987), p1659-1664 등에서 키토산 유도체 제조에 관해 기술하고 있다. 또한, 공개특허 특2000-0045851에서는 N-카복시메틸키토산을 제조방법을, 유럽특허 EP-A 0,224,045 및 EP-A 0,277,322에서는 N-하이드록시메틸키토산, N-하이드록시프로필키토산 및 N-하이드록시프로필 에테르 키토산 등의 키토산 유도체 제조방법을 제시하고 있다. Preparation of the chitosan derivative is " carbohydrate polymer ( Carbohydrate) Polymers 8 (1988), p1-21) "describes the carboxymethylation of chitosan in the presence of alkalis, see Int . J. Biol . Macromol . 10 (1988), p124-125; J. Chem . Soc ., Chem, Comm (1980), p1153-1154; J. App . Polymer Science 31 (1986), p 1951-1954; Makromol . Chem . 188 (1987), p1659-1664, et al. Describe the preparation of chitosan derivatives. In addition, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-0045851 discloses a method for preparing N-carboxymethylchitosan, and European Patent EP-A 0,224,045 and EP-A 0,277,322 disclose N-hydroxymethylchitosan, N-hydroxypropylchitosan and N-hydroxypropyl. A method for preparing chitosan derivatives such as ether chitosan has been proposed.
상기 항생제는 병원성 박테리아, 병원성 효모 곰팡이 및 균사체를 형성하는 곰팡이에 대한 항균 및 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.The antibiotic is characterized by exhibiting antimicrobial and antifungal activity against pathogenic bacteria, pathogenic yeast fungi and fungi forming mycelium.
본 발명에서는 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 항생 효과를 확인하기 위하여 항균 및 항진균 활성을 측정하였다.In the present invention, the antimicrobial and antifungal activity was measured to confirm the antibiotic effect of the low molecular weight water-soluble chitosan and its derivatives.
상기 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 키토산의 최소 농도인 생육 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration; 이하, MIC)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스태필로코쿠스 에피더미디스(Staphlococcus epidermidis), 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 대상으로 하였으며, 그람 음성균으로써 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사(Psedomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)을 대상으로 하였다. 30킬로 달톤 이하의 저분자 형태 키토산들(30, 20, 10, 5, 3, 1킬로 달톤) 및 이의 유도체(10킬로 달톤)를 각각 첨가한 플레이트에 각 균주를 배양한 후 MIC 값을 측정한 결과, 본 발명의 저분자 수용성 키토산들 및 이의 유도체는 대부분에서 높은 항균활성을 나타내었고, 특히 10킬로 달톤의 키토산 및 이의 유도체는 실험한 모든 세균에 대하여 항균 활성을 나타내었고, 특히 이들 모든 키토산들이 살모넬라 티피뮤리움에서는 항생제 작용을 나타냄을 확인하였다(표 2 참조).The antimicrobial activity of the low molecular weight water-soluble chitosan and its derivatives was observed by measuring the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), which is the minimum concentration of chitosan in which cells are not split. As Gram-positive bacteria Bacillus subtilis (Bacillus subtilis ), Staphylococcus epidermidis epidermidis ), Staphylococcus aureus) and was intended for jeneseu L. monocytogenes (Listeria monocytogenes), gram-negative bacteria as E. coli (Escherichia coli ), Pseedomonas aeruginosa The aeruginosa) and Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium) were enrolled in this study. MIC values were measured after incubating each strain on a plate containing low molecular weight chitosans (30, 20, 10, 5, 3, 1 kilo Daltons) and derivatives (10 kilo Daltons) of 30 kilo Daltons or less, respectively. The low molecular weight water-soluble chitosans and derivatives thereof of the present invention showed high antimicrobial activity in most of them, especially 10 kilodalton chitosan and its derivatives showed antimicrobial activity against all the tested bacteria, especially all chitosans were Salmonella typhies. Murium was confirmed to exhibit antibiotic action (see Table 2).
또한, 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 항진균 활성은 병원성 효모성 진균으로는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 하였고, 사상균 곰팡이로는 아스파질러스 퓨미가튜스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스퍼럼(Fusarium oxysporum) 및 페니실리움 베르코섬(Penicillium verrucosum) 등의 균사 형성 진균들을 대상으로 하였다. 30킬로 달톤 이하의 저분자 형태 키토산들(30, 20, 10, 5, 3, 1킬로 달톤) 및 이의 유도체(10킬로 달톤)를 각각 첨가한 플레이트에 각 균주를 배양한 후 MIC 값을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di phenyl tetrazolium bromide) 분석법으로 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 저분자 수용성 키토산들 및 이의 유도체는 대부분에서 항진균 효과가 우수함을 확인하였다(표 3 참조). Further, the antifungal activity of low molecular weight water-soluble chitosan and derivatives thereof are the pathogenic yeast Candida albicans fungi sex (Candida albicans ), Trichosporon beigelii ) and Saccharomyces cerevisiae , and fungal fungi include Aspargillus fumigatus, Aspergillus parasiticus , Botrytis cinerea ( Botrytis cinerea ), Rhizoctonia solani ), Fusarium oxysporum ) and penicillium berkosum ( Penicillium) verrucosum ) and mycelial fungi. After incubating each strain on a plate containing low molecular weight chitosans (30, 20, 10, 5, 3, 1 kilo Daltons) and derivatives (10 kilo Daltons) of 30 kilo Daltons or less, the MIC value was determined by MTT (3 It was measured by-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) method. As a result, it was confirmed that the low molecular water-soluble chitosans and derivatives thereof of the present invention have excellent antifungal effects in most cases (see Table 3).
상기의 결과로부터, 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 탁월 한 항균 및 항진균 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었고, 특히 10킬로 달톤은 항균 및 항진균에 있어서 탁월한 효과가 있음을 확인하였다. From the above results, it was confirmed that the low molecular weight water-soluble chitosan and derivatives thereof of the present invention exhibited excellent antibacterial and antifungal effects, and in particular, 10 kilodalton was confirmed to have an excellent effect on antibacterial and antifungal.
본 발명에서는 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 적혈구 파괴능 및 정상 동물 세포구를 이용하여 세포독성을 조사한 결과, 불수용성 키토산의 경우 활성농도에서 세포독성이 20% 정도 나타났으나 이에 반해 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 세포독성을 거의 나타내지 않았다(표 4 및 표 5 참조).In the present invention, in order to confirm whether the low molecular water-soluble chitosan and its derivatives are cytotoxic, the cytotoxicity was examined using erythrocyte destructive ability and normal animal cellocytes, and in the case of insoluble chitosan, the cytotoxicity was about 20% at the active concentration. On the contrary, the low molecular water soluble chitosan and derivatives thereof of the present invention showed little cytotoxicity (see Tables 4 and 5).
상기의 결과로부터, 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균 및 항진균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the low molecular weight water-soluble chitosan and derivatives thereof of the present invention can be usefully used as a safe antibacterial and antifungal agent to the human body because they are not cytotoxic.
본 발명의 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체는 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤 라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.The low molecular weight water soluble chitosan or derivatives thereof of the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations. That is, the low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof of the present invention may be administered in various oral and parenteral dosage forms in actual clinical administration, and when formulated, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are commonly used. It is prepared using diluents or excipients. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules and capsules, and the like, which may be used in the pharmaceutical composition of the present invention at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose And gel latin and the like are prepared. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol and gelatin may be used. Parenteral administration may be via subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection.
또한, 본 발명의 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.In addition, the low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof of the present invention may be used in admixture with various carriers which are accepted as medicaments, such as physiological saline or organic solvents, and with glucose, sucrose or dextran to increase stability or absorption. Antioxidants such as carbohydrates, ascorbic acid or glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers can be used as medicaments.
상기 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.The effective dose of the low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof is 1 to 2 mg / kg, preferably 0.5 to 1 mg / kg, and may be administered 1 to 3 times a day.
본 발명의 항생제에서 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. In the antibiotics of the present invention, the total effective amount of the low molecular weight water soluble chitosan or derivative thereof can be administered to the patient in a single dose by bolus form or by infusion for a relatively short period of time. Multiple doses may be administered by a fractionated treatment protocol with long term administration.
상기 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 저분자 수용성 키토산의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.Since the concentration of the low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof is determined in consideration of various factors such as the route of administration and the number of treatments, as well as the age and health of the patient, the effective dosage of the patient is considered in the related art. Those skilled in the art will be able to determine the appropriate effective dosage for the particular use of the low molecular weight water soluble chitosan as a pharmaceutical composition.
또한, 본 발명은 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 유효성분으로 항생용 건강식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health food for antibiotics as an active ingredient with a low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof.
본 발명의 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.The low molecular water soluble chitosan or derivatives thereof of the present invention can be added as it is, or used with other foods or food ingredients, and can be suitably used according to conventional methods. The mixed amount of the active ingredient may be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). Generally, in the preparation of food or beverages, the composition of the present invention is added in an amount of up to 15 parts by weight, preferably up to 10 parts by weight based on the raw materials. However, in the case of long-term intake for health and hygiene or health control purposes, the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the kind of food. Examples of the food to which the substance can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like and include all of the health foods in the conventional sense.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g이다.The health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in the general beverage. The above-mentioned natural carbohydrates are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. As the sweetening agent, natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used. The proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체는 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 저분자 수용성 키토산 또는 이의 유도체는 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the low molecular water-soluble chitosan of the present invention or derivatives thereof, various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, Glycerin, alcohol, carbonation agent used for carbonated drinks, and the like. In addition, the low molecular weight water-soluble chitosan or derivatives thereof of the present invention may contain pulp for producing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by Examples, Experimental Examples and Formulation Examples.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다. However, the following Examples, Experimental Examples, and Formulation Examples specifically illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to Examples, Experimental Examples, and Formulation Examples.
<< 실시예Example 1> 1> 저분자Low molecular weight 수용성 키토산의 제조 Preparation of Water Soluble Chitosan
기계적 교반기가 부착된 1ℓ 용량의 3구 플라스크에 초산 15㎖, 과산화수소 90㎖ 및 황산 0.3㎖를 혼합첨가하고 상온에서 10∼20분간 교반한 후 온도를 상승시켜서 35℃에 도달되면 임상 의학용 키토산(게로부터 추출된 키토산으로 석회질, 단백질 잔류함량이 각각 0.1% 미만, 탈아세틸화도 92% 이상, 점도 260cps, 1% 초산 용액, 1% 키토산 용액) 20g을 가하고 30분간 교반시켰다. 30분간 교반 후 온도를 50℃로 상승시켜서 7시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 플라스크의 내용물을 1ℓ 용량의 비이커에 옮기고 빙욕 속에서 냉각시키면서 10% NaOH 수용액 30∼40㎖를 가하고 다시 40% NaOH 수용액을 사용하여 용액의 pH가 8∼9가 되도록 조정하였다. 이어서 2N 농도의 HCl 수용액을 사용하여 용액의 pH가 7이 되도록 중화시키고, 투석막(Spectra/Por Membrane, MWCO: 1000)을 이용하여 탈이온수 속에서 24시간 동안 투석시켰다. 투석이 완료된 용액을 1회 여과하고 동결건조시켜서 17.1g의 수용성 키토산을 수득하였다. 1% 초산 용액으로 1% 저분자 수용성 키토산 용액을 제조하여 점도계(Haake, RV20형)로 점도를 측정한 결과 1.00∼1.20cps의 점도를 얻 었다.15 ml of acetic acid, 90 ml of hydrogen peroxide, and 0.3 ml of sulfuric acid were mixed and mixed in a 1 liter three-necked flask equipped with a mechanical stirrer, stirred at room temperature for 10 to 20 minutes, and the temperature was raised to 35 ° C. Chitosan extracted from crab was added with calcium and calcium residual content of less than 0.1%, deacetylation degree of 92% or more, viscosity 260 cps, 1% acetic acid solution, 1% chitosan solution), and stirred for 30 minutes. After stirring for 30 minutes, the temperature was raised to 50 ° C and allowed to react for 7 hours. When the reaction was completed, the contents of the flask was transferred to a 1 L beaker, 30-40 ml of 10% NaOH aqueous solution was added while cooling in an ice bath, and the pH of the solution was adjusted to 8-9 using 40% NaOH aqueous solution. Subsequently, the solution was neutralized to a pH of 7 using 2N HCl aqueous solution, and dialyzed in deionized water for 24 hours using a dialysis membrane (Spectra / Por Membrane, MWCO: 1000). The dialysis solution was filtered once and lyophilized to yield 17.1 g of water soluble chitosan. A 1% low molecular weight aqueous chitosan solution was prepared using a 1% acetic acid solution, and the viscosity was measured using a viscometer (Haake, RV20 type) to obtain a viscosity of 1.00 to 1.20 cps.
상기 결과, 하기 표 1과 같이 분자 크기가 1000, 3000, 5000, 10000, 20000 및 30000의 저분자 수용성 키토산을 제조하였다.As a result, as shown in Table 1, low molecular weight water-soluble chitosan having a molecular size of 1000, 3000, 5000, 10000, 20000 and 30000 was prepared.
<< 실시예Example 2> 2> 저분자Low molecular weight 수용성 키토산 유도체의 제조 Preparation of Water Soluble Chitosan Derivatives
<실시예 1>의 저분자 수용성 키토산 15g을 4M 우레아 용액 1500g에 분산시킨 후, 초산 32.5g을 첨가하여 pH를 2.7로 맞춘 후 60℃에서 45분간 교반한 다음, 교반액을 25℃로 냉각한 후 에탄올 4,500㎖를 첨가하고 여과 및 건조한다. 이렇게 제조된 키토산 염 13.2g과 에탄올 13.0g을 혼합하여 10분간 교반한 후 모노클로로 아세트산 2.0g을 첨가한 후 질소 분위기 하에서 80℃, 6시간 반응시켜 저분자 수용성 N-카복시메틸키토산(분자크기 10,000)을 제조하였다. 이때 얻어진 N-카복시메틸키토산의 아미노기의 치환도는 0.55이었다(공개특허 특2000-0045851).15 g of the low molecular weight water-soluble chitosan of <Example 1> was dispersed in 1500 g of 4M urea solution, 32.5 g of acetic acid was added to adjust the pH to 2.7, stirred at 60 ° C. for 45 minutes, and the stirred solution was cooled to 25 ° C. 4,500 ml of ethanol are added, filtered and dried. 13.2 g of the chitosan salt thus prepared and 13.0 g of ethanol were mixed, stirred for 10 minutes, and then 2.0 g of monochloroacetic acid was added thereto, followed by reaction at 80 ° C. for 6 hours under a nitrogen atmosphere to produce low molecular weight water-soluble N-carboxymethylchitosan (molecular size 10,000). Was prepared. The substitution degree of the amino group of N-carboxymethyl chitosan obtained at this time was 0.55 (patent publication 2000-0045851).
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 저분자Low molecular weight 수용성 키토산 및 이의 유도체의 항균활성 측정 Determination of Antimicrobial Activity of Water Soluble Chitosan and Its Derivatives
<1-1> 항균활성 측정<1-1> Antibacterial activity measurement
상기 <실시예 1 및 2>의 방법으로 제조된 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 항균 활성을 측정하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 최소 농도인 생육 최소저해농도(MIC) 값을 측정하였다.In order to measure the antimicrobial activity of the low molecular weight water-soluble chitosan and derivatives thereof prepared by the method of <Examples 1 and 2>, the minimum growth concentration (MIC) value, which is the minimum concentration of the low molecular weight water-soluble chitosan and its derivatives, which are not split into cells Was measured.
우선, 항균 활성 측정을 위하여 그람 양성균으로 바실러스 서브틸리스(KCTC 1918), 스태필로코쿠스 에피더미디스(KCTC 1917), 스태필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621) 및 리스테리아 모노사이토제네스(KCTC 3710)를, 그람 음성균으로 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637) 및 살모넬라 티피뮤리움(KCTC 1926)을 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아 각 균주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨(Sigma)에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지(Difco)로 1×104 세포/100 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트(Nunc)에 접종하였다. 실시예 1 및 2의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체들을 각각 2.5 mg/웰(well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 6 시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기(Merck Elisa reader)를 이용하여 620 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.First, Bacillus subtilis (KCTC 1918), Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917), Staphylococcus aureus (KCTC 1621), and Listeria monocytogenes (KCTC 3710) were used as Gram-positive bacteria to measure antimicrobial activity. ), E. coli (KCTC 1682), Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1637), and Salmonella typhimurium (KCTC 1926) were distributed as a gram-negative bacterium from the Biotechnology Research Institute Gene Bank, and each strain was obtained from LB medium (1% bacto trypton, 0.5% Bactobacillus yeast extract, incubated in 1% sodium chloride (Sigma) to the mid-log phase, diluted with 1% Bactobacillus peptone medium (Difco) to a cell concentration of 1 × 10 4 cells / 100 μl. The micro titrate plate (Nunc) was inoculated The low molecular weight water-soluble chitosan and its derivatives of Examples 1 and 2 were each diluted 1/2 fold from 2.5 mg / well and added to the plate for 6 hours at 37 ° C. Cultured, Micro using a tight-rate plate reader (Merck Elisa reader) was determined the MIC values for each strain by measuring the absorbance at a wavelength of 620 ㎚ the results are shown in Table 2 below.
그 결과, 본 발명의 키토산 4로 기재되는 분자량 10,000의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 키토산 1로 기재되는 분자량 1000에 비해 균주에 따라 16배 이상 높은 항균 활성을 나타내었고, 키토산 3으로 기재되는 분자량 5,000에 비해 약 8배 이상의 높은 항균 활성을 나타냄을 확인하였다. 분자량 10,000 이상의 경우 분자량이 높을수록 낮은 항균활성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 키토산 4로 기재되는 수용성 저분자 키토산(분자량 10,000) 및 이의 유도체는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 우수한 항균 활성을 나타내었다.As a result, the low molecular weight water-soluble chitosan and its derivatives having a molecular weight of 10,000 described as chitosan 4 of the present invention showed an antimicrobial activity 16 times higher according to the strain than the molecular weight 1000 described as chitosan 1, and the molecular weight of 5,000 described as chitosan 3. Compared with about 8 times higher antimicrobial activity was confirmed. In the case of molecular weight 10,000 or more, the higher the molecular weight showed a lower antimicrobial activity. Therefore, the water-soluble low molecular chitosan (molecular weight 10,000) and its derivatives described as chitosan 4 of the present invention showed excellent antimicrobial activity in both Gram-positive and Gram-negative bacteria.
<1-2> 항균 활성의 가시화<1-2> Visualization of Antimicrobial Activity
본 발명의 저분자 수용성 키토산을 배지 상에서 가시화하기 위하여, 본 발명자들은 상기 박테리아들을 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 1% 염화나트륨)에 접종한 후 미드-로그 상(mid-log phase)까지 배양하였다. 구체적으로, 4×105 세포에 각각 저분자 수용성 키토산를 섞은 후 37℃에서 2시간 동안 배양하였고 배양액을 LB 플레이트에 도말하여 균주를 가시화시켰다.In order to visualize the low molecular weight water soluble chitosan of the present invention on the medium, the inventors inoculated the bacteria in LB medium (1% bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride), followed by a mid-log phase. Cultured up to). Specifically, 4 × 10 5 cells were mixed with low molecular weight water-soluble chitosan, and then incubated at 37 ° C. for 2 hours, and the cultures were plated on LB plates to visualize strains.
그 결과, 본 발명의 키토산 4로 기재되는 수용성 저분자 키토산(분자량 10,000)은 키토산 1로 기재되는 분자량 1000에 비해 그람 양성균 및 음성균 모두에서 강력한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the water-soluble low molecular chitosan (molecular weight 10,000) described as chitosan 4 of the present invention exhibited strong antimicrobial activity in both Gram-positive and negative bacteria compared to the molecular weight 1000 described as Chitosan 1.
<1-3> 항균 활성의 주사전자현미경 관찰<1-3> Scanning electron microscope observation of antimicrobial activity
본 발명의 저분자 수용성 키토산의 항균활성을 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 본 발명자들은 그람 양성균으로 S. 아우레어스와 그람 음성균으로 대장균을 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨)에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음, 100 mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 10 mM 농도의 인산나트륨 완충용액(Na-phosphate buffer, pH 7.4)에 108 세포/㎖ 균체 농도로 희석하였다. 상기 희석한 균주에 본 발명의 키토산들을 각각 첨가한 후 37℃에서 30분간 배양을 하였다. 5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 용해시킨 0.2 M 인산나트륨 완충용액을 상기 균주에 동일한 부피로 첨가하여 4℃에서 2시간동안 고정시켰다. 상기 시료를 이소포어 필터(Isopore filters, 0.2 ㎛ pore size, Millipore, Bedford, MA, USA)로 여과시킨 후 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충용액(Na-cacodylate buffer, pH7.4)으로 세척하였고, 필터에 1% 오스뮴 터옥사이드(osmium tertroxide)를 처리한 후 나트륨 카코딜레이트 완충용액에 녹인 5% 슈크로즈(5% sucrose)로 세척하고 에탄올로 단계적으로 탈수시켰다. 이것을 동결건조와 골드코팅을 한 후 주사전자현미경(HITACHI S-2400, Japan)에서 관찰하였다(도 1 및 도 2 참조).The antimicrobial activity of the low molecular weight water-soluble chitosan of the present invention was observed using a scanning electron microscope. We cultured Escherichia coli with S. aureas and Gram-negative bacteria in LB medium (1% bacto tryptone, 0.5% bacto yeast extract, 1% sodium chloride) to the mid-log phase. In a 10 mM sodium phosphate buffer (Na-phosphate buffer, pH 7.4) containing 100 mM sodium chloride (NaCl), the cells were diluted to a concentration of 108 cells / ml. Chitosan of the present invention was added to the diluted strains, and then cultured at 37 ° C. for 30 minutes. 0.2 M sodium phosphate buffer in which 5% glutaraldehyde was dissolved was added to the strain in the same volume and fixed at 4 ° C. for 2 hours. The sample was filtered with an isopore filter (Isopore filters, 0.2 μm pore size, Millipore, Bedford, MA, USA) and washed with 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4). After treatment with 1% osmium tertroxide, the solution was washed with 5% sucrose (5% sucrose) dissolved in sodium cacodylate buffer and dehydrated stepwise with ethanol. This was observed by scanning electron microscopy (HITACHI S-2400, Japan) after lyophilization and gold coating (see FIGS. 1 and 2).
그 결과, 본 발명의 수용성 저분자 키토산은 그람 양성균에서는 분자량 10,000에서 강력한 항균활성을 그리고 그람 음성균에서는 분자량 3,000 이상에서 분자량 1,000에서보다 세포가 더 많이 파괴되었음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the water-soluble low molecular chitosan of the present invention had strong antimicrobial activity at a molecular weight of 10,000 in Gram-positive bacteria and more cells were destroyed at a molecular weight of 3,000 or more in Gram-negative bacteria than at a molecular weight of 1,000.
<< 실시예Example 3> 항진균 활성 측정 3> Determination of antifungal activity
<3-1> 항진균 활성의 측정<3-1> Determination of antifungal activity
상기 <실시예 1 및 2>의 방법으로 제조된 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 항진균 활성을 측정하기 위하여, MTT 분석에 의한 MIC 값을 측정하였다.In order to measure the antifungal activity of the low molecular weight water-soluble chitosan and derivatives thereof prepared by the methods of <Examples 1 and 2>, MIC values were measured by MTT analysis.
96-웰 플레이트에 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(TIMM 1768), 트리코스포론 베이겔라이(KCTC 7707) 및 사카로마이세스 세르비지애(KCTC 7296)의 각종 진균을 포함한 PDB 배지(20% 포테이토 인퓨전 프럼, 2% 박토 덱스트로즈, Difco) 100 ㎕씩을 분주한 다음, 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체들을 각각 50 μM/웰(well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가하여 다시 16시간 이상 배양하였다. 이어서, 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액(3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; [Amersham life science, 5mg/ml MTT in phosphate-buffered saline(PBS), pH 7.4]) 10 ㎕를 모든 웰에 첨가하여 다시 5 내지 6시간 배양하였다. 그 후, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔(formazan)을 0.04 N HCl-이소프로판올(isopropanol) 용액 100 ㎕로 잘 용해시킨 후 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 발색되는 정도로 MIC 값을 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었고, 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.PDB medium (20% potato infusion) containing various fungi of the pathogenic fungi Candida albicans (TIMM 1768), Tricosporon Beiglai (KCTC 7707) and Saccharomyces cerbizia (KCTC 7296) in 96-well plates 100 μl of frum, 2% bactodextrose, and Difco) were dispensed, and then the low molecular weight water-soluble chitosan and its derivatives of the present invention were diluted 1 / 2-fold from 50 μM / well, respectively, and added to the plate for another 16 hours. The above culture was carried out. Subsequently, MTT solution (3- [4,5-dimethyl-2-thiazolyl] -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide at 5 mg / ml concentration; Amersham life science, 5 mg / ml MTT in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4]) was added to all wells and incubated again for 5 to 6 hours. Subsequently, formazan produced by mitochondrial enzymes in living cells was well dissolved with 100 μl of 0.04 N HCl-isopropanol solution, and then absorbance was measured at 570 nm using an ELISA reader. The MIC value was measured to the extent of color development, and the results are shown in Table 3 below, and observed using an optical microscope.
그 결과, 키토산 4로 기재되는 수용성 저분자 키토산(분자량 10,000) 및 이의 유도체는 C. 알비칸스, S. 세르비지애 및 T. 베이겔라이의 경우에는 분자량 1000에 비해 항진균 활성을 경우에 따라 40배 정도 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 이들 모든 수용성 저분자 키토산들이 강한 항진균 활성을 나타내었다. 분자량 20,000 또는 30,000의 경우 10,000 보다 낮은 항진균 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 효모 타입의 진균에 대해 강한 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다. As a result, the water-soluble low molecular chitosan (molecular weight 10,000) and its derivatives described as chitosan 4 are C. Albicans, S. Serbia and T. Beiglai showed antifungal activity about 40 times higher than the molecular weight of 1000 in some cases. All these water-soluble low molecular chitosans showed strong antifungal activity. Molecular weight 20,000 or 30,000 showed antifungal activity lower than 10,000. Therefore, it was confirmed that the low molecular water-soluble chitosan and derivatives thereof of the present invention exhibit strong antifungal activity against yeast type fungi.
또한, 균사체를 형성하는 곰팡이에 대한 항진균 활성을 위의 실험 방법대로 수행하였다. 균사를 형성하는 병원성 진균인 A. 퓨미가튜스(ATCC 6145), A. 파라시티커스(ATCC 6598), B. 시네레아(KACC 40573), F 솔라니(KCTC 6326), F 옥시스퍼럼(ATCC 16909) 및 P 베르코섬(KCTC 6265)를 이용하였으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. In addition, the antifungal activity against the fungus forming mycelium was performed according to the above experimental method. Pathogenic fungi that form mycelium: A. fumigatus (ATCC 6145), A. paracitus (ATCC 6598), B. cinerea (KACC 40573), F Solani (KCTC 6326), F oxiferum (ATCC) 16909) and P Berkosum (KCTC 6265) were used and the results are shown in Table 4 below.
그 결과, 키토산 4로 기재되는 저분자 수용성 키토산(분자량 10,000) 및 이의 유도체는 A. 퓨미가튜스, A. 파라시티커스, B. 시네레아, F. 솔라니, F. 옥시스퍼럼 및 P. 베르코섬의 경우에는 분자량 1000에 비해 항진균 활성을 경우에 따라 16배 정도 높은 활성을 나타내었으며, 이들 모든 수용성 저분자 키토산들이 강한 항진균 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 균사체를 형성하는 동물 및 식물의 병원성 진균들에 대해 강한 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다. 또한 이 결과를 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.As a result, the low molecular water soluble chitosan (molecular weight 10,000) and derivatives thereof described as chitosan 4 are A. fumigactus, A. paracitus, B. cinerea, F. solani, F. oxsperum and P. berg In the case of cosum, the antifungal activity was 16 times higher than the molecular weight of 1000. All these water-soluble low molecular chitosans showed strong antifungal activity. Therefore, it was confirmed that the low molecular water soluble chitosan of the present invention and its derivatives exhibit strong antifungal activity against pathogenic fungi of animals and plants forming mycelium. This result was also observed using an optical microscope.
<3-2> 항진균 활성의 주사전자현미경 관찰<3-2> Scanning electron microscope observation of antifungal activity
본 발명의 저분자 수용성 키토산의 항진균 활성을 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 먼저, 효모성 진균으로 C. 알비칸스를 균사를 형성하는 진균으로는 F. 옥시스포럼을 각각 배양한 다음, 100 mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 10 mM 농도의 인산나트륨 완충용액(Na-phosphate buffer, pH 7.4)에 108 세포/㎖ 균체 농도로 희석하였다. 상기 희석한 균주에 본 발명의 키토산들을 각각 첨가한 후 28℃에서 30분간 배양을 하였다. 5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 용해시킨 0.2 M 인산나트륨 완충용액을 상기 균주에 동일한 부피로 첨가하여 4℃에서 2시간동안 고정시켰다. 상기 시료를 이소포어 필터(Isopore filters, 0.2 ㎛ pore size, Millipore, Bedford, MA, USA)로 여과시킨 후 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충용액(Na-cacodylate buffer, pH7.4)으로 세척하였고, 필터에 1% 오스뮴 터옥사이드(osmium tertroxide)를 처리한 후 나트륨 카코딜레이트 완충용액에 녹인 5% 슈크로즈(5% sucrose)로 세척하고 에탄올로 단계적으로 탈수시켰다. 이것을 동결건조와 골드코팅을 한 후 주사전자현미경(HITACHI S-2400, Japan)에서 관찰하였다(도 3 및 도 4 참조).The antifungal activity of the low molecular weight water soluble chitosan of the present invention was observed using a scanning electron microscope. First, the fungus forming mycelia of C. albicans as a yeast fungus was incubated with F. oxime forum, respectively, and then 10 mM sodium phosphate buffer solution containing 100 mM sodium chloride (NaCl) (Na-phosphate). buffer, pH 7.4) was diluted to a concentration of 108 cells / ml cells. Chitosan of the present invention was added to the diluted strains, and then cultured at 28 ° C. for 30 minutes. 0.2 M sodium phosphate buffer in which 5% glutaraldehyde was dissolved was added to the strain in the same volume and fixed at 4 ° C. for 2 hours. The sample was filtered with an isopore filter (Isopore filters, 0.2 μm pore size, Millipore, Bedford, MA, USA) and washed with 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4). After treatment with 1% osmium tertroxide, the solution was washed with 5% sucrose (5% sucrose) dissolved in sodium cacodylate buffer and dehydrated stepwise with ethanol. This was observed by scanning electron microscopy (HITACHI S-2400, Japan) after freeze drying and gold coating (see FIGS. 3 and 4).
그 결과, 본 발명의 저분자 수용성 키토산(분자량 10,000)에서 세포가 파괴 되거나 균사형성을 저해시킴을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the cells were destroyed or inhibited mycelial formation in the low molecular weight water-soluble chitosan (molecular weight 10,000) of the present invention.
<< 실시예Example 4> 세포 독성 측정 4> Cytotoxicity Measurement
본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체의 세포독성을 확인하기 위하여, 이들의 적혈구 파괴능을 조사하였다.In order to confirm the cytotoxicity of the low molecular water soluble chitosan and derivatives thereof of the present invention, their red blood cell destruction ability was investigated.
우선, 인간 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰부터 1/2의 농도로 표 1의 키토산 1부터 6까지로 기재된 저분자 수용성 키토산들 및 유도체, 및 불수용성 키토산(분자량 10,000)을 각각 연속적으로 희석하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈량을, 414 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 비교 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100(sigma, USA) 을 인간 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였다. 상기 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하고, 하기 수학식 1에 따라 본원 발명의 수용성 저분자 키토산들의 적혈구 파괴능을 계산하였다.First, dilute human erythrocytes with phosphate buffer (PBS, pH 7.0) to a concentration of 8%, and the low molecular weight water soluble chitosans described in chitosan 1 to 6 in Table 1 at concentrations of 12.5 μM / well to 1/2 And the derivative and the water-insoluble chitosan (molecular weight 10,000) were continuously diluted and reacted at 37 DEG C for 1 hour. Then, the amount of hemoglobin contained in the supernatant by centrifugation at 1,000 g was investigated by measuring the absorbance at 414 nm wavelength. In order to investigate the degree of cell destruction, 1% Triton X-100 (sigma, USA) was added to human erythrocytes and the absorbance of the supernatant was measured. The cell destruction capacity of the 1% Triton X-100 was 100%, and the red blood cell destruction ability of the water-soluble low molecular chitosan of the present invention was calculated according to Equation 1 below.
상기 식에서, 흡광도 A는 414 ㎚ 파장에서 저분자 수용성 키토산 용액의 흡 광도, 흡광도 B는 414 ㎚ 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 ㎚ 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.In the above formula, absorbance A is the absorbance of the low molecular weight water-soluble chitosan solution at 414 nm wavelength, absorbance B is the absorbance of PBS at 414 nm wavelength and absorbance C is the absorbance of 1% Triton X-100 at 414 nm wavelength.
상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기 표 5에 나타내었다.The results of erythrocyte destructive ability according to the above formula are shown in Table 5 below.
그 결과, 불수용성 키토산의 경우 활성농도에서 세포독성이 20% 정도 나타나는 반면 본 발명의 저분자 수용성 키토산 및 이의 유도체는 세포독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있다(표 5).As a result, the insoluble chitosan showed about 20% of the cytotoxicity at the active concentration, while the low molecular weight water-soluble chitosan and derivatives thereof of the present invention showed little cytotoxicity (Table 5).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.Examples of preparations for the compositions of the present invention are illustrated below.
<< 제제예Formulation example 1> : 약학적 제제의 제조 1>: Preparation of pharmaceutical preparation
1. 산제의 제조1. Preparation of powder
저분자 수용성 키토산 2 g2 g of low molecular weight water-soluble chitosan
유당 1 g1 g lactose
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.The above ingredients were mixed and filled in airtight cloth to prepare a powder.
2. 정제의 제조2. Preparation of Tablets
저분자 수용성 키토산 100 ㎎Low molecular water soluble chitosan 100 mg
옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg
유 당 100 ㎎Lactose 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.After mixing the above components, tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
3. 캡슐제의 제조3. Preparation of Capsule
저분자 수용성 키토산 100 ㎎Low molecular water soluble chitosan 100 mg
옥수수전분 100 ㎎Corn starch 100 mg
유 당 100 ㎎Lactose 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 ㎎2 mg magnesium stearate
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.After mixing the above components, the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
4. 환의 제조4. Manufacture of rings
저분자 수용성 키토산 1 g1 g of low molecular water soluble chitosan
유당 1.5 gLactose 1.5 g
글리세린 1 g1 g of glycerin
자일리톨 0.5 gXylitol 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.After mixing the above components, it was prepared to be 4 g per ring in a conventional manner.
5. 과립의 제조5. Preparation of Granules
저분자 수용성 키토산 150 ㎎Low Molecular Water Soluble Chitosan 150mg
대두 추출물 50 ㎎Soybean Extract 50mg
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎Starch 600 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.After mixing the above components, 100 mg of 30% ethanol was added and dried at 60 ° C. to form granules, which were then filled into fabrics.
<< 제제예Formulation example 2> : 식품의 제조 2>: Manufacture of food
본 발명의 저분자 수용성 키토산을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.Foods containing the low molecular weight water soluble chitosan of the present invention were prepared as follows.
1. 조리용 양념의 제조1. Preparation of Cooking Seasonings
본 발명의 저분자 수용성 키토산 20~95 중량부로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.20 to 95 parts by weight of the low molecular weight water-soluble chitosan of the present invention was prepared for cooking spices for health promotion.
2. 밀가루 식품의 제조2. Manufacturing of Flour Foods
본 발명의 저분자 수용성 키토산 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.0.5 to 5.0 parts by weight of the low molecular weight water-soluble chitosan of the present invention was added to flour, and bread, cake, cookies, crackers and noodles were prepared using this mixture to prepare foods for health promotion.
3. 유제품(dairy products)의 제조3. Manufacture of dairy products
본 발명의 저분자 수용성 키토산 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.5-10 parts by weight of the low molecular weight water-soluble chitosan of the present invention was added to milk, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared using the milk.
4. 선식의 제조4. Manufacture of wire
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.Brown rice, barley, glutinous rice, and yulmu were alphad by a known method, and then dried and roasted to prepare a powder having a particle size of 60 mesh.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.Black beans, black sesame seeds, and perilla were also steamed and dried by a known method, and then ground to a powder having a particle size of 60 mesh.
본 발명의 저분자 수용성 키토산을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.The low molecular weight water-soluble chitosan of the present invention was concentrated under reduced pressure in a vacuum concentrator, and the dried product obtained by drying with a spray and a hot air dryer was pulverized with a particle size of 60 mesh to obtain a dry powder.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 옻나무의 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.It was prepared by combining the dry powder of the grains, seeds and lacquer extract prepared above in the following ratio.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),Cereals (30 parts by weight brown rice, 15 parts by weight brittle, 20 parts by weight of barley),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),Seeds (7 parts by weight perilla, 8 parts by weight black beans, 7 parts by weight black sesame seeds),
저분자 수용성 키토산의 건조분말(3 중량부),Dry powder of low molecular water-soluble chitosan (3 parts by weight),
영지(0.5 중량부),Ganoderma lucidum (0.5 parts by weight),
지황(0.5 중량부)Foxglove (0.5 part by weight)
<< 제제예Formulation example 3> : 음료의 제조 3>: Manufacture of beverage
1. 건강음료의 제조1. Manufacture of health drinks
저분자 수용성 키토산 1000 ㎎ Low Molecular Water Soluble Chitosan 1000mg
구연산 1000 ㎎ Citric acid 1000 mg
올리고당 100 g 100 g oligosaccharides
매실농축액 2 g Plum concentrate 2 g
타우린 1 g 1 g of taurine
정제수를 가하여 전체 900 ㎖ Add 900 ml of purified water
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. After mixing the above components according to the conventional healthy beverage manufacturing method, and stirred and heated at 85 ℃ for about 1 hour, the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilization and then refrigerated and stored Used to prepare the healthy beverage composition of the invention.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and intended use.
도 1은 저분자 수용성 키토산이 병원성 그람 양성균에 대한 항균 활성이 있음을 전자현미경을 통해 관찰한 그림이고, 1 is an illustration of electron microscopic observation that low molecular water-soluble chitosan has antimicrobial activity against pathogenic Gram-positive bacteria.
도 2는 저분자 수용성 키토산이 병원성 그람 음성균에 대한 항균 활성이 있음을 전자현미경을 통해 관찰한 그림이고, Figure 2 is a picture observed through an electron microscope that the low molecular water-soluble chitosan has an antimicrobial activity against pathogenic Gram-negative bacteria,
도 3은 저분자 수용성 키토산이 병원성 진균에 대한 항진균 활성이 있음을 전자현미경을 통해 관찰한 그림이고,Figure 3 is a picture observed by electron microscope that the low molecular water-soluble chitosan has antifungal activity against pathogenic fungi,
도 4는 저분자 수용성 키토산이 균사를 형성하는 병원성 진균에 대한 항진균 활성이 있음을 전자현미경을 통해 관찰한 그림이다.FIG. 4 is an electron microscope showing that low molecular water-soluble chitosan has antifungal activity against pathogenic fungi that form mycelia.
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| KR102200874B1 (en) * | 2019-12-03 | 2021-01-12 | 한국세라믹기술원 | Composition for improving skin condition comprising chitosan as a effective ingredient and method for preparing the same |
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