KR20090035011A

KR20090035011A - 질병을 치료하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20090035011A
Application number: KR1020097003901A
Authority: KR
Inventors: 토마스 디. 리드; 로버트 피. 비치
Original assignee: 인트렉손 코포레이션
Priority date: 2006-07-26
Filing date: 2007-07-26
Publication date: 2009-04-08
Also published as: CA2658836C; RU2009103208A; ES2553332T3; JP2009544711A; AU2007332980A1; EP2043662A4; WO2008073154A3; IL196638A0; CA2658836A1; WO2008073154A2; MX2009000966A; IL196638A; US20150132265A1; RU2468820C2; DK2043662T3; HK1129596A1; HUE027142T2; EP2043662A2; US20170191027A1; NZ575075A

Abstract

본 발명은 피검자의 병든 세포를 죽이는 단계를 포함하는 피검자를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 방법은 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계 및 상기 획득된 세포군 내에서 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 이후 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 치명적 폴리펩티드의 발현이 이전에 확인된 질병 표지 유전자들 중 적어도 하나의 프로모터에 의하여 조절되는 세포 속으로 도입된다. 폴리뉴클레오티드의 도입 이후에, 세포는 질병 표지 유전자(들)을 발현하고 있는 세포를 죽이는 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리된다. 병든 세포의 죽음 이후에, 세포를 죽이는데 필요한 정도로 치명적 폴리펩티드를 발현시키지 않은 남아있는 생존한 세포는 죽은 세포로부터 분리되며, 생존한 세포는 피검자에게로 되돌려진다.

질병 표지 유전자, 치명적 폴리펩티드

Description

질병을 치료하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TRREATING DISEASE}

본 발명은 적어도 하나의 질병 표지 유전자에서 발현하는 세포에서의 치명적 폴리펩티드(lethal polypeptide)의 선택적 발현을 유발시켜 피검자의 병든 세포를 죽이는 단계를 포함하는 피검자를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

암은 미국에서만 매년 300,000 명 초과의 난치성 동통 및 사망을 초래하는 통제되지 않은 세포 성장으로부터 오는 일련의 질병을 일컫는 말이다. 종양 유전자는 일반적으로 암 세포 성장을 촉진시키는 유전자이다. 암 발생은 종양 유전자의 활성화 및 성장 억제 유전자의 동시발생적 비활성화(coincident inactivation)에 의존하는 것으로 여겨진다 (Park, M., "Oncogenes" in The Genetic Basis of Human Cancer (B. Vogelstein et al., eds.) pp. 205-228 (1998)). 종양 유전자는 세포 증식을 자극하는 세포 원종양 유전자(proto-oncogene)의 돌연변이된, 우성 형태(dominant form)인 반면에, 종양 억제 유전자는 열성이며 주로 세포 증식을 억제한다.

화학 요법제로 암 환자를 치료하는 것은 전신성 질병의 주요 치료 방법으로 여전히 남아 있으며 화학요법제 용량 강도 및 임상 반응률 사이에는 직접적인 연관 이 있다. 그러나 화학요법의 강도를 증가시키면 말초 골수 및 림프 세포성(peripheral myeloid and lymphoid ce어 화학요법을 따르는 조혈계의 회복을 용이하게 한다.llularity)의 동반 파괴와 함께 골수 조혈 전구 세포의 광범위한 파괴를 포함하는 상당한 부작용을 일으킨다. 줄기 세포 이식은 종종 고용량 화학요법과 연계하여 이용되

환자가 아닌 공여자의 줄기 세포의 이식인 동종이계(allogeneic) 줄기 세포 이식이 종종 이용된다. 그러나, 동종이계 이식 프로토콜은 주로 이식편대숙주병(GVD)으로 인한 치사율이 높은데, 이식된 세포가 환자 자신의 조직을 공격한다.

자가 줄기 세포이식은 환자의 줄기 세포가 고용량 화학요법 이전에 분리되어 이후 재주입되는 것을 특징으로 하는 프로토콜이다. 자가 이식은 GVD와 연관된 합병증을 회피하지만, 줄기 세포 생성물 내에서 종양 세포의 재주입을 발생시킬 수 있다. 종양 세포의 재주입은 재주입된 종양 세포가 질병의 재발 및 빈약한 임상 결과에 직접적인 원인이 될 수 있음을 입증하였기 때문에 중요한 것이다. 예를 들면, 림프종, 백혈병, 유방암 및 신경모세포종의 경우, 말초 혈액 줄기 세포 이식 프로토콜에서의 적어도 일부 오염 종양 세포는 환자에서 뿐만 아니라 시험관 내에서 클론원성으로(clonogenically) 성장하는 능력을 가진다.

종양 세포를 자가 줄기 세포 이식을 받는 환자에게로 재주입을 회피하기 위하여, 의료진들은 골수 세포를 그 오염 종양 세포로부터 "세정(purge)" 하도록 시도하였다. 줄기 세포군(stem cell population)을 오염시키는 종양 세포의 생체 외 세정을 위한 다양한 접근법이 개발되어 왔다. 예를 들면, 세포독성제, 독소, 광선 요법 및 생물학적 조절제 또는 세포독성제와 함께 막 항원에 대항하는 단일클론성 항체를 사용하면 종양 오염의 1 내지 3 크기 정도(order of magnitude)로 줄일 수 있다(Seiden, et al., J. Infusional Chemotherapy 6:17-22 (1996), 참고로 포함). 다른 프로토콜에서, 방사성동위원소와 접합하는 종양 세포로 향하는 항체는 종양 세포를 세정하는 시도에 이용되어 왔다. 세포독성제 및/또는 방사능의 사용은 종양 세포에 특이적이지 않을 수 있으며 전구 세포는 세포 표면 단백질의 유사한 표현형을 종종 드러내며 그러한 기법의 이용은 접목을 지연시킬 수 있다. 또한, 비록 훨씬 낮은 세정 효능에도 불구하고, 종양 세포 재주입을 줄이기 위하여 CD34⁺ 조혈 전구 세포가 선택되어 왔다. 또한, 이러한 CD34 계 선택의 방법은 종양 세포로 충분히 특이적이지 않을 수 있지만 종종 CD34 항원을 드러낼 수 있다.

따라서, 자가 이식을 표적으로하는 세포군으로부터 병든 세포를 특이적으로 제거하는 신규한 방법에 대한 업계의 요구가 존재한다.

본 발명은 피검자의 병든 세포를 죽이는 단계를 포함하는 피검자를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 방법은 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계 및 상기 획득된 세포군 내에 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 이후, 선발 표지 및 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 치명적 폴리펩티드의 발현이 이전에 확인된 질병 표지 유전자들 중 적어도 하나의 프로모터에 의하여 조절되는 세포 속으로 도입된다. 치명적 펩티드는 그 자체가 세포에 치명적이거나 세포에 치명적인 생성물을 생성하는 폴리펩티드로 정의된다. 폴리뉴클레오티드의 도입 이후에, 세포는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 획득하는 선택 조건에 노출되며 이후 세포는 질병 표지 유전자(들)을 발현하고 있는 세포를 죽이는 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리된다. 병든 세포가 파괴된 이후에, 세포를 죽이는데 필요한 정도로 치명적 폴리펩티드를 발현시키지 않은 남아있는 생존한 세포는 죽은 세포로부터 분리되며, 생존한 세포는 피검자에게로 되돌려진다.

본 발명의 일 실시예에서, 세포 속으로 도입된 폴리뉴클레오티드는 세포를 피검자에게 되돌려주기 이전에 절제된다. 다른 실시예에서, 세포를 피검자에게 되돌려지기 이전에 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 절제되지 않는다. 이로 인하여 질병의 재발시에 되돌려진 세포의 생체 내 파괴가 가능해 진다.

본 발명의 다른 실시예는 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계, 상기 세포군 내에서 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계, 상기 질병 표지 유전자의 적어도 하나의 프로모터를 분리하는 단계, 상기 프로모터를 상기 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 직접 또는 간접적으로 연결하여 치료 폴리뉴클레오티드를 발생시키는 단계 및 이를 선별 표지를 더 포함하는 벡터 속으로 위치시키는 단계를 포함하는 비정상적인 상태에 대한 치료를 필요로 하는 피검자의 치료를 개별화하는 방법에 관한 것이다. 상기 치료 폴리뉴클레오티드는 세포 속으로 도입되며, 상기 세포는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 획득하는 선택 조건에 노출되며, 이후 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리되어 질병 표지 유전자를 발현하는 세포를 죽인다. 이후 남아있는 병들지 않은 세포는 피검자에게로 되돌려진다.

도 1은 본 발명의 방법을 이용한 통상적인 처리 공정의 작업 흐름도를 도시한다. 도 1에 묘사된 방법은 게놈 내 삽입, 선택 및 죽임(killing)을 포함한다. 구조체는 게놈으로부터 선택적으로 절제될 수 있다. 또한, 상기 도면은 본 발명의 범위 내에 있는 방법의 비한정 변형을 수록한다. 임의의 게놈 내 삽입 방법(G1, G2 또는 G3)은 임의의 선택 방법(S1, S2 또는 S3) 및 세포 죽음(K1, K2, K3 또는 K4)r과 조합될 수 있다. 또한, 절제를 가능하게 하는 구성요소가 게놈 내에 존재한다면 임의의 게놈 절제(genomic excision) 방법(E1, E2 또는 E3)도 선택될 수 있다.

도 2는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 일 실시예를 도시한다. 도 2에서, PE3-1 유전자 프로그램은 게놈 내 삽입 선택자(selector)/보고자 유전자이다. PE3-2 유전자 프로그램은 예컨대, DTA와 같은 치명적 폴리펩티드의 발현을 작동시키는(driving) 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-3 유전자 프로그램은 예컨대, Cre와 같은 재결합효소의 발현을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은TetO와 같은 유도성 프로모터이다. PE3-4 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터(constitutive promoter)이다. PE3-ns 유전자 프로그램은 표적 효율을 향상시키는데 사용될 수 있는 음성 선택자/보고자 유전자이다. 화살표 기호는 예컨대, Cre와 같은 재결합효소에 의하여 인식되는 예컨대, loxP와 같은 시스-조절 서열을 나타낸다. 원(circle)은 염색질 변형 구 역(chromatin modification domain: CMD)를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다. GIS-1 및 GIS-2는 게놈 내 삽입 부위이다.

도 3은 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 다른 실시예를 도시한다. 도 3에서, PE3-1 유전자 프로그램은 게놈 내 삽입 선택자/보고자 유전자이다. PE3-2 및 PE3-3 유전자 프로그램은 각각 레오(Rheo) 전사 인자의 2 개의 절반 중 하나의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-4 유전자 프로그램은 예컨대, DTA와 같은 치명적 폴리펩티드의 발현을 작동시키는 레오 프로모터이다. 상기 레오 프로모터는 리간드의 존재하에 함께 결합하는 2 개의 소단위체로 구성된 레오 전사 인자의 존재를 필요로 한다. 상기 레오 전사 인자의 소단위체들 각각은 상기 PE3-2 및 PE3-3 유전자 프로그램에서 각각 발현된다. PE3-5 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터이다. PE3-6 유전자 프로그램은 예컨대, Cre와 같은 재결합효소의 발현을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은 유도성 프로모터이다. PE3-ns 유전자 프로그램은 표적 효율을 향상시키는데 사용될 수 있는 음성 선택자/보고자 유전자이다. 화살표 기호는 예컨대, Cre와 같은 재결합 효소에 의하여 인식되는 예컨대, loxP와 같은 시스-조절 서열을 나타낸다. 원은 염색질 변형 구역(CMD)를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다. GIS-1 및 GIS-2는 게놈 내 삽입 부위이다.

도 4는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 다른 실시예를 도시한다. 도 4에서, PE3-1 유전자 프로그램은 게놈 내 삽입 선택자/보고자 유전자이다. PE3-2 유전자 프로그램은 예컨대, DTA와 같은 치명적 폴리펩티드의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-3 유전자 프로그램은 치명적 폴리펩티드의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. 상기 프로모터 및 치명적 폴리펩티드는 PE3-2 유전자 프로그램의 프로모터 및 치명적 폴리펩티드와 동일하거나 상이할 수 있다. PE3-4 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터이다. PE3-5 유전자 프로그램은 예컨대, Cre와 같은 재결합효소의 발현을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은 유도성 프로모터의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터이다. PE3-ns 유전자 프로그램은 표적 효율을 향상시키는데 사용될 수 있는 음성 선택자/보고자 유전자이다. 화살표 기호는 예컨대, Cre와 같은 재결합 효소에 의하여 인식되는 예컨대, loxP와 같은 시스-조절 서열을 나타낸다. 원은 염색질 변형 구역(CMD)를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다. GIS-1 및 GIS-2는 게놈 내 삽입 부위이다.

도 5는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 일 실시예를 도시한다. 도 5에서, PE3-1 유전자 프로그램은 게놈 내 삽입 선택자/보고자 유전자이다. PE3-2 유전자 프로그램은 예컨대, DTA와 같은 치명적 폴리펩티드의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-3 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터이다. PE3-4 유전자 프로그램은 예컨대, Cre와 같은 재결합효소의 발현을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은 유도성 프로모터이다. PE3-5 유전자 프로그램은 전구 세포의 탈분화를 촉진시키는 인자의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터이다. PE3-ns 유전자 프로그램은 표적 효율을 향상시키는데 사용될 수 있는 음성 선택자/보고자 유전자이다. 화살표 기호는 예컨 대, Cre와 같은 재결합 효소에 의하여 인식되는 예컨대, loxP와 같은 시스-조절 서열을 나타낸다. 원은 염색질 변형 구역(CMD)를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다. GIS-1 및 GIS-2는 게놈 내 삽입 부위이다.

도 6은 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 일 실시예를 도시한다. 도 6에서, PE3-1 유전자 프로그램은 항시발현 프로모터의 통제하에 있는 네오 선택자 유전자(neo selector gene)이다. PE3-2 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-3 유전자 프로그램은 예컨대, DTA와 같은 치명적 폴리펩티드의 발현을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은 유도성 프로모터이다. 원은 염색질 변형 구역(CMD)의 존재를 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 일 실시예를 도시한다. 도 7에서, PE3-1 유전자 프로그램은 전구 세포-특이적 프로모터에 의하여 작동되는 예컨대, 네오와 같은 게놈 내 삽입 선택자이다. PE3-2 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-3 유전자 프로그램은 예컨대, DTA와 같은 살생 유전자(killer gene)의 발현을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은 유도성 프로모터이다. PE3-4 유전자 프로그램은 예컨대, RheoCept

와 같은 제2 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터이다. PE3-5 유전자 프로그램은 구조체를 삭제시키기 위하여 Cre와 같은 재결합효소의 발현을 작동시키는 예컨대, RheoSwitch

와 같은 유도성 프로모터이다. 화살표 기호는 예컨대, loxP와 같은 재결합 효소에 의하여 인식되는 시스-조절 서열을 나타낸 다. 원은 염색질 변형 구역(CMD)의 존재를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다.

도 8은 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드의 일 실시예를 도시한다. 도 8에서, PE3-1 유전자 프로그램은 줄기 세포 프로모터에 의하여 작동되는 게놈 삽입 내 선택자 유전자이다. PE3-2 유전자 프로그램은 예컨대, rTTA와 같은 유도자 cDNA의 발현을 작동시키는 질병 표지 유전자 프로모터이다. PE3-3 유전자 프로그램은 예컨대, 티미딘 키나아제와 같은 살생 유전자의 치명적 전환으로 효소계 기질을 작동시키는 예컨대, TetO와 같은 유도성 프로모터이다. PE3-ns 유전자 프로그램은 예컨대, 표적 효율을 향상시키기 위한 시토신 탈아미노효소(CDA) 또는 디프테리아(DTA)의 발현을 작동시키는 항시발현 프로모터와 같은 음성 선택자 유전자이다. 원은 염색질 변형 구역(CMD)의 존재를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 영역을 나타낸다. GIS-1 및 GIS-2는 게놈 내 삽입 부위이다.

본 발명은 피검자의 병든 세포를 죽이는 단계를 포함하는 피검자를 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 방법은 피검자의 세포군을 획득하는 단계 및 상기 획득된 세포의 군 내에서 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 이후 상기 세포에 도입되는데, 상기 세포에서 상기 치명적 폴리펩티드의 발현이 이전에 확인된 상기 질병 표지 유전자 중 적어도 하나의 프로모터에 의하여 조절된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 도입 이후에, 상기 세포는 상기 질병 표지 유 전자(들)을 발현하는 세포를 죽이도록 상기 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리된다. 상기 병든 세포의 파괴 이후에, 세포를 죽이는데 필요한 정도로 상기 치명적 폴리펩티드를 발현시키지 않았던 남아있는 생존 세포는 죽은 세포로부터 분리되며, 상기 생존 세포는 상기 피검자에게 되돌려 진다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포에 도입된 폴리뉴클레오티드는 상기 세포를 피검자에게 되돌려 주기 이전에 절제된다. 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 세포를 피검자에게 되돌려 주기 이전에 상기 세포로부터 절제되지 않는다. 이로 인하여 질병의 재발시에 생체 내에서 재도입된 세포의 파괴를 가능하게 한다.

본 명세서에 사용된 "병든 세포"는 그 대사, 조직학, 성장률, 유사분열율 또는 표현형에 있어서 비정상적인 세포 또는 세포들을 의미하는데 사용된다. 본 명세서에 사용된 세포와 관련된 "표현형"이라는 용어는 특정 조직 또는 기관으로부터 나온 세포가 통상적으로 발현하는 단백질 집합물을 의미하는데 사용된다. 예를 들면, 개별 분리된 세포의 표현형은 세포 펴면 항원인 분화군(cluster of differentiation: CD 인자)과 같은 세포 표면 표지의 존재 또는 부재에 근거하여 평가되거나 분류될 수 있다. 세포의 표현형이 일반적으로 세포가 발현하거나 함유하는 단백질 집합물로 여겨지지만, 세포를 주어진 군(population) 또는 아군(subpopulation)으로 적당히 분류하거나 그 표현형을 평가하는데 단일 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 것만 필요할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "표현형"이라는 용어는 적어도 하나의 단백질 또는 그 부분의 존재 또는 부재에 기반 하여 세포가 속하는 특정한 군 또는 아군을 함축하는데 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 실시예는 말초혈 및 골수에서 주로 발견되는 CD34⁺ 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 예를 계속하여, 분리된 세포의 주어진 군 또는 아군의 표현형은 단순히 CD34 양성(CD34⁺) 또는 CD34 음성(CD34^-)으로 지정될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법은 또한 세포를 세포의 주어진 군 또는 아군으로 분류하는데 하나 이상의 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 고찰한다. 세포 표현형을 분류하는데 사용될 수 있는 CD 단백질의 예는 CD3, CD38, CD59, CD49, CD54, CD61(비트로넥틴 수용체), CD71, CD73(SH3), CD90(Thy-1), CD105(SH2), CD117, CD133, CD144 및 CD166을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 또한, 다른 단백질은 주어진 세포 또는 세포군의 표현형을 결정하는데 사용될 수 있다. 세포의 표현형을 분류하는데 사용될 수 있는 다른 단백질의 예는 OCT4, cdx2 및 Sox2와 같은 전사 인자, 태반 ABC 운반체(ABC-p)와 같은 운반체 단백질 및 케라틴 황산염-연관 항원, TRA-1-60, TRA-1-81, Thy-1 및 예컨대, SSEA-1, SSEA-2, SSEA-3 및 SSEA-4와 같은 발육단계 특이 배아 항원(stage-specific embryonic antigens: SSEAs)과 같은 다른 세포 표면 항원을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 세포의 표현형을 분류하는데 사용될 수 있는 단백질의 또 다른 예는 클래스 I 및 클래스 II MHC 단백질과 같은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질뿐만 아니라 섬유아세포 성장 인자(FGF), 변형 성장 인자-알파(TGFα), 변형 성장 인자-베타(TGFβ), 액티빈 IIa 및 골 형성 단백질(BMP)에 대한 수용체와 같은 성장 인자 수용체를 포함한다. 세포 표현형을 확인 하는데 사용될 수 있는 표지의 또 다른 예는 CK(시토케라틴) 9, CK19, pdx-1, 네스틴, Pax-6, Nkx2.2, 신경세사(neurofilament), 타우(Tau), 신경-특이 에놀라제(NSE), 신경세사 단백질(NF), 미세관 관련 단백질 2(MAP2), MAP2 키나아제, 아교 섬유 산성 단백질(GFAP) 및 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제(phosphodiesterase)이다. 또한, 전체 단백질이 아닌 단백질의 일부 또는 구역의 존재를 검출하여 세포의 표현형을 평가하거나 분류가 가능하다. 예를 들면, 일부 단백질은 그 존재 또는 부재가 예컨대, SH2⁺ 또는 SH2^-와 같은 세포의 표현형을 적당히 평가하거나 분류하는데 충분할 수 있는 SH1, SH2, SH3, SH4 등과 같은 src-상동성 영역(src-homology domain: SH)을 함유할 수 있다. 상술한 바와 같이, 세포의 표현형은 또한 특정 단백질의 부재에 의하여 평가되거나 분류될 수 있다.

세포 표현형을 확인하는 방법은 예를 들면, 항-CD34 항체와 같이 항원-특이적 항체를 사용한 표준 면역조직학 기법을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 세포의 표현형을 평가하거나 분류하는 다른 방법은 웨스턴 블로팅(Western blotting) 및 노던 블로팅(Northern Blotting)과 같은 표준 블로팅 기법 및 역전사효소-PCR(RT-PCR)과 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예컨대, RT-PCR과 같은 mRNA를 측정하거나 검출하는 검사와 같은 간접적인 방법이 사용되어 세포의 표현형을 평가하거나 분류하는데 사용될 수 있음은 진실로 명백하다. 세포의 표현형을 평가하거나 분류하는 또 다른 방법은 마이크로어레이 기법 및 유동 세포 계측법을 포함한다. 그 표현형에 기반하여 세포를 정 렬하는데 유용한 유동 세포 계측법의 예는 여기에 참고로 포함된 Practical Flow Cytometry, 3^rd Edition, Wiley-Liss, Inc. (1995)에 개시되어 있다.

예를 들면, 병든 세포는 동일한 원천 또는 조직으로부터 취한 다른 세포와 비교하여 비정상적인 표현형을 가질 수 있다. 예를 들면, 조혈 줄기 세포는 주로 CD34 및 CD59를 발현하지만, 흉선세포, T 보조 세포, 대식세포, 랑게르한스 세포, 수지상세포 또는 과립구에 의하여 주로 발현되는 CD4를 발현하지 않는다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, CD34, CD59 및 CD4를 발현하는 임의의 조혈 줄기 세포는 비정상적인 표현형을 가지는 것으로 여겨진다, 즉, 세포가 병든 것이다. 일 실시예에서, 세포는 조혈 줄기 세포를 포함하는데, 상기 조혈 세포의 적어도 일 부분은 병든 세포이다.

줄기 세포의 다른 예는 간 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 줄기 세포는 다능성(pluripotent)이거나 다능성이지 않을 수 있다. "다능성 세포"는 중복성(multipotent), 소기능성(oligopotent) 및 단능성(unipotent) 세포로 분화하거나 이를 발생시킬 수 있는 세포 및 그 자손(progeny)을 포함한다. "중복성 세포"는 중복성 세포로부터 유래한 성숙한 또는 부분적으로 성숙한 세포 유형이 특정 조직, 기관 또는 기관계의 세포로 한정되는 것을 제외하고는 중복성, 소기능성 및 단능성 전구 세포 및/또는 하나 이상의 성숙한 또는 부분적으로 성숙한 세포 유형으로 분화하거나 이를 발생시킬 수 있는 세포 및 그 자손을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "부분적으로 성숙한 세포"는 동일한 기관 또는 조직으로부터 성숙한 세포의 형태학적 또는 단백질 발현과 같은 적어도 하나의 표현형의 특징을 보이는 세포이다. 예를 들면, 중복성 조혈 전구 세포 및/또는 그 자손은 골수 전구 세포 및 림프 전구 세포와 같은 하나 이상의 소기능성 세포 유형으로 발현하거나 이를 발생시키는 능력을 소유하고 있으며, 또한 혈액에서 주로 발견되는 다른 성숙한 세포 구성요소를 발생시킨다. "소기능성 세포"는 성숙한 또는 부분적으로 성숙한 세포로 분화하는 그 능력이 다능성 세포보다 더 제한되는 세포 및 그 자손을 포함한다. 그러나, 소기능성 세포는 소기능성 및 단능성 세포 및/또는 주어진 조직, 기관 또는 기관계의 하나 이상의 성숙한 또는 부분적으로 성숙한 세포 유형으로 분화하는 능력을 여전히 가질 수 있다. 다능성 세포의 일 예는 성숙한 또는 부분적으로 성숙한 적혈구, 혈소판, 호염기구(basophils), 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils) 및 단핵구(monocyte)를 종국적으로 발생시킬 수 있는 골수 전구 세포이다. "단능성 세포"는 다른 단능성 세포 및/또는 성숙한 또는 부분적으로 성숙한 세포 유형의 일 유형으로 분화하거나 발생시키는 능력을 가지는 세포 및 그 자손을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "전구 세포"라는 용어는 적어도 부분적으로 성숙한 세포로 분화할 수 있지만, 배양 중의 무한한 자기-재생에 대한 능력이 부족한 세포 및 그 자손을 의미하는데 사용된다. 본 명세서에 사용된 전구 세포는 다능성, 중복성, 소기능성 또는 심지어 단능성일 수 있다.

본 발명의 방법은 치료를 필요로 하는 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "피검자"라는 용어는 "환자"라는 용어와 호환하 여 사용되며, 특히, 포유류 및 더 특정하게는 인간이 아닌 또는 인간 영장류인 동물을 의미하는데 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포를 언급하는데 사용되는 경우 "획득하는"이라는 용어는 피검자로부터 세포를 제거하는 임의의 공정을 의미하려는 의도이다. 상기 세포는 피검자로부터 획득되는 경우 분리되거나 정제될 필요가 없다. 피검자의 임의의 체액(예컨대, 혈액, 혈청, 소변, 타액, 뇌척수액) 또는 피검자의 조직 표본(예컨대, 생검, 골수 흡입액)으로부터 획득될 수 있다. 소기의 세포가 일단 획득되면 이후 분리될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "분리된" 또는 "분리하는"이라는 용어 또는 그 변형은 세포 또는 세포군을 언급하여 사용되는 경우에 세포 또는 세포군이 대부분의 주변 분자 및/또는 상기 세포 또는 세포들이 생체계(예컨대, 골수)와 연관되어 있는 경우에 상기 세포 또는 세포들을 둘러싸며 존재하는 물질들로부터 분리되는 것을 의미한다. 물, 염 및 완충액과 같은 물질의 농도는 세포가 "분리"되었는지의 여부를 결정하는 경우에 고려되지 않는다. 따라서, "분리된"이라는 용어는 특정한 표현형의 정제된 세포군을 의미하거나 시사하는 의도는 아니며, 조직파편, 비생존 가능(non-viable) 세포 또는 다른 표현형의 세포가 전혀 결핍된 세포군을 의미하려는 의도도 아니다. 세포를 분리하는 방법은 본 명세서에 기술된 본 발명의 범위를 한정하지 않아야 한다. 예를 들면, 상기 세포는 유동 계측법 또는 세포의 표현형을 이용하는 다른 방법과 같은 공지된 방법을 이용하여 분리될 수 있다. 세포를 분리하는 다른 방법은 상기 세포가 치료 폴리뉴클레오티드를 상기 세포로 도입하기 전 후에 분리될 수 있도록 치료 구조체가 함유할 수 있는 양성 또는 음성 선택자를 사용하는 단계를 포함한다. 따라서, 일 실시예에서, 상기 구조체는 초기에 획득된 다른 세포로부터 소기의 세포를 "분리하는"데 사용될 수 있는 양성 선택자를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "정제된"이라는 용어는 세포 또는 세포군을 언급하여 사용되는 경우에, 상기 세포 또는 세포들이 생체계와 연관되어 있었을 경우 상기 세포 또는 세포들을 주로 둘러싸는 실질적으로 모든 물질로부터 분리되었다는 것을 의미한다. 따라서, "정제된"은 정제되고 있는 분리된 세포들에 근접한 세포 및/또는 물질로 환산된 상태에서의 변화에 근거한 상대적인 용어이다. 따라서, 분리된 조혈 세포는 적어도 일부 세포 조직파편, 비생존 가능 세포, 다른 표현형의 세포 또는 단백질 및/또는 탄수화물과 같은 세포 또는 분자가 분리 이후에 세척 또는 다른 공정에 의하여 제거된다 하더라도 정제된 것으로 간주된다. "정제된"이라는 용어는 제거될 예정인 물질 모두가 정제되고 있는 세포로부터 제거되는 것을 의미하는 것으로 사용되지 않는다. 따라서, 오염물질의 일부는 상기 정제된 세포와 함께 존재할 수 있다.

일 실시예에서, 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성은 세포가 획득된 이후에 측정된다. 다른 실시예에서, 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성은 세포가 획득되기 이전에 측정된다. 따라서, 하나 이상의 질병 표지 유전자의 활성은 피검자에서의 질병 또는 비정상적인 상태가 일련의 질병 표지 유전자들의 활성이 수립되어 있는 질병 또는 비정상적인 상태의 통상적인 징후 또는 표지를 드러내 보인다면 추정되거나 추론될 수 있다. 본 명세서에 사용된 질병 표지 유전자는 그 발현 수준이 질병 또는 비정상적인 상태를 평가, 진단 또는 그 진단의 보조에 사용될 수 있는 유전자를 의미하려는 의도이다. 질병 표지 유전자는 정상적인 세포에서 발현되지만 병든 세포에서 증가한 수준으로 발현되는 병든 세포 및 유전자에서만 발현되는 유전자를 포함한다. 질병 표지 유전자의 가장 흔히 공지된 예는 종양 유전자이지만, 본 발명의 방법은 종양 유전자에 한정되지 않는다. 종양 유전자 클래스의 예는 성장 인자, 성장 인자 수용체, 단백질 키나아제, 프로그램된 세포 사멸 조절자 및 전사 인자를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 종양 유전자의 특이적인 예는 sis, erb B, erb B-2, ras, abl, myc 및 bcl-2 및 TERT를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 다른 질병 표지 유전자의 예는 종양 관련 항원 유전자 및 병든 세포에서 과다발현된 다른 유전자(예컨대, MAGE-1, 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen), 티로시나아제, 전립선 특이 항원, 전립선 특이 막 항원, p53, MUC-1, MUC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-1, gp100, GM2, Tn, sTn 및 톰슨-프리덴라이히 항원(TF))를 포함한다.

질병 표지 유전자가 일단 측정되면, 이러한 질병 표지 유전자의 프로모터는 치료 폴리뉴클레오티드로 옮겨진다. 본 명세서에 사용된 치료 폴리뉴클레오티드라는 용어는 병든 세포를 죽일 목적으로 세포군으로 도입되는 폴리뉴클레오티드를 의미하는데 사용된다. 일 실시예에서, 프로모터는 프로모터가 세포에 치명적인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일 부분에 작동가능하게 연결되도록 폴리뉴클레오티드 속으로 삽입된다. 따라서, 상기 방법은 병든 세포가 궁극적으로 그 자신이 죽도록 상기 병든 세포의 비정상적인 활성을 이용한다. 본 명세서에 사용된 " 작동가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 발현 조절 서열(프로모터 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이와 같은) 및 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결로서, 상기 발현 조절 조절 서열이 상기 제2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 지시하는 것을 특징으로 하는 기능적 연결을 의미한다. 다른 실시예에서, 상기 프로모터는 치명적 폴리펩티드의 발현에 간접적으로 연결된다. 예를 들면, 질병 표지 프로모터는 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 활성화시키는 전사 인자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

"프로모터"라는 용어는 업계에서와 같은 의미로 본 명세서에 사용된다. 즉, 프로모터라는 용어는 RNA 중합효소의 결합으로 유전자 서열 전사를 개시하도록 하는 DNA의 영역을 지칭한다. 상기 프로모터 영역을 포함하는 많은 질병 표지 유전자의 서열은 업계에 공지되어 있으며 예컨대, GenBank와 같은 공중 데이터베이스에서 이용가능하다. 따라서, 병든 표지 유전자가 획득되거나 분리된 세포에서 일단 확인되면, 상기 프로모터 서열은 용이하게 확인되고 획득될 수 있다. 본 발명의 다른 태양은 그 프로모터가 분리되어 치료 폴리뉴클레오티드로 옮겨지는 질병 표지 유전자를 확인하는 단계에 관한 것이다. 따라서, 질병 표지 유전자의 정체성(identity)은 상기 프로모터가 분리되고 이후 세팅 또는 환경에서 사용될 수 있다면, 본 발명의 특이적인 실시예에 중요하지 않을 수 있다. 따라서, 당해 발명은 아직 확인되지 않은 질병 표지 유전자로부터 프로모터의 사용을 포함한다. 새로운 질병 표지 유전자가 일단 확인된다면, 프로모터 기능에 필요한 유전자 서열을 결정하는 것은 일상적인 기술 또는 실험의 문제일 수 있다. 진실로, 일부 상용 프로토콜은 중요한 유 전자의 프로모터 영역의 결정을 보조하기 위하여 존재한다. 예를 들면, Ding 등은 최근에 인간 Sprouty4 유전자의 5'-주변 서열(flanking sequence)을 점진적으로 삭제하여 신규한 Sprouty4 유전자의 프로모터 서열을 개시하였다(참고로 포함된 Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 287: L52-L59 (2004)). 요약하면, 전사 개시 부위가 일단 결정되면, PCR 단편은 단일방향으로 상기 5'-주변 단편의 클론 세그먼트에 흔히 사용하는 PCR 프라이머를 사용하여 발생되었다. 상기 발생된 세그먼트는 루시페라제 보고자 벡터로 클론되었으며 루시페라제 활성은 측정되어 인간 Sprouty4 유전자의 프로모터 영역을 결정하였다.

질병 표지 유전자 프로모터를 획득하고 확인하는 프로토콜의 다른 예는 하기의 단계를 포함한다: (1) 유사/동일 조직 유형의 암 세포/조직 표본 및 비암 세포/조직 표본을 획득하는 단계; (2) 상기 표본으로부터 총 RNA 또는 mRNA를 분리하는 단계; (3) 암 표본 및 비암 표본의 미분 마이크로어레이 분석(differential microarray analysis)을 실시하는 단계; (5) 상기 암-특이 전사체와 연관된 게놈 서열을 확인하는 단계; (6) 상기 암-특이 전사체의 예측된 전사 개시 부위의 DNA 서열 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)을 획득하거나 합성하는 단계; (7) 단계 6으로부터 다른 길이의 DNA를 사용하여 프로모터 보고자 벡터를 설계하고 생성하는 단계; 및 (8) 비관련 세포/조직에서뿐만 아니라 암 및 비암 세포/조직에서의 프로모터 보고자 벡터를 시험하는 단계.

치료 폴리뉴클레오티드에 삽입되는 프로모터의 원천(source)은 천연이거나 또는 합성되는 것일 수 있으며, 프로모터의 원천은 본원에 개시된 범위로 제한되서 는 안된다. 다른 말로는, 프로모터는 얻어지거나 분리된 세포들로부터 직접 클로닝될 수도 있고, 또는 프로모터는 다른 원천으로부터 미리 클로닝될 수도 있고, 또는 프로모터는 합성되어진 것을 수도 있다.

일 실시예에서, 프로모터는 발현되는 경우 폴리펩티드 그 자체가 치명적이거나 폴리펩티드가 치명적인 화합물을 생성하는 이유로 인하여 폴리펩티드를 발현하는 세포에 치명적인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포에 치명적인 폴리펩티드는 또한 괴사, 세포자살 및 세포독성을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 임의의 방식으로 세포 사멸을 유도하는 폴리펩티드를 포함한다. 세포에 치명적일 수 있는 폴리펩티드의 예는 p53, Rb 및 BRCA-1 등이지만, 여기에 한정되지 않는 세포자살 유도 종양 억제 유전자, 디프테리아 독소(DTA), 이질균 신경독, 보툴리누스 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, CSE-V2 및 나열하기에 몇 안 되는 전갈 단백질 독소의 다른 변이체와 같은 독소, 시토신 탈아미노효소 및 티미딘 키나아제와 같은 자살 유전자 및 예컨대, 종양 괴사 인자, 인터페론-알파와 같은 세포독성 유전자를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 본 발명은 단백질이 발현되는 세포에 상기 단백질이 치명적일 수 있다면 치명적 단백질의 정체성에 제한되지는 않는다.

다른 실시예에서, 질병 표지 유전자 프로모터는 치명적 폴리펩티드의 발현에 간접적으로 연결되어 있다. 일 실시예에서, 질병 표지 유전자 프로모터는 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되어 있으며 치명적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전사 인자에 의하여 활성화되는 프로모터에 작 동가능하게 연결되어 있다. 상기 전사 인자는 예컨대, 그 각각의 리간드에 의하여 활성화되는 스테로이드 수용체 상과(superfamily)(예컨대, 당질코르티코이드, 에스트로겐, 프로제스틴, 레티노이드, 엑디손 및 그 유사체 및 모방체) 또는 테트라사이클린에 의하여 활성화되는 rTTA의 구성요소와 같은 리간드의 존재하에서만 전사를 활성화시키는 리간드-의존성 전사 인자일 수 있다. 상기 전사 인자는 자연발생적 폴리펩티드 또는 둘 이상의 다른 전사 인자로부터 나온 구역을 포함하는 키메라 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 리간드 결합 영역, 전사활성 영역 및 DNA 결합 영역은 각각 2 또는 3 개의 다른 전사 인자로부터 획득될 수 있다. 일 실시예에서, 전사 인자는 존재하는 리간드의 수준에 의하여 엄격히 조절되는 인자이다. 다른 실시예에서, 전사 인자의 영역은 두 개의 폴리펩티드가 함께 이량체화되는 경우(그리고 리간드가 존재하는 경우)에만 전사의 활성화가 일어날 수 있도록 각각의 폴리펩티드 상에서 발현될 수 있다. 그러한 시스템의 일 예는 그 각각이 그대로 참고로 포함되어 있는 미국 특허 번호 제 7,091,038호, 미국 공개 특허 출원 번호 제 2002/0110861호, 2002/0119521호, 2004/0033600호, 2004/0096942호, 2005/0266457호 및 2006/0100416호 및 국제 공개 출원 번호 WO 01/70816호, WO 02/066612호, WO 02/066613호, WO 02/066614호, WO 02/066615호, WO 02/29075호 및 WO 2005/108617호에 기술된 키메라 엑디손 수용체 시스템이다. 비스테로이드성 엑디손 작용제-조절 시스템의 일 예는 RheoSwitch

포유류 유도성 발현 시스템(Mammalian Inducible Expression System) (New England Biolabs, Ipswich, 마이애미 주)이다.

치료 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하기 위하여, 선택된 프로모터 및 치명 적 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 사용될 수 있다. 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드 벡터, 단일-가닥 또는 이중-가닥 파지 벡터 또는 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 DNA 및 RNA를 세포로 도입하는 공지된 기법에 의하여 세포로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 가능이거나 복제 결함(defective)일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 숙주 세포를 보충할 경우에만 발생한다. 본 명세서에 사용된 "숙주 세포" 또는 "숙주"는 하나 이상의 치료 폴리뉴클레오티드를 함유하고 있는 본 발명의 세포를 의미하는데 사용된다.

따라서, 최소한 상기 벡터는 질병 표지 유전자로부터 유래한 프로모터 및 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여야 한다. 상기 벡터의 다른 구성요소는 선발 표지(selectable marker), 염식질 변형 구역, 또한 상기 벡터 상에 존재할 수 있는 다른 폴리펩티드의 발현을 작동시키는 다른 프로모터, 게놈 내 삽입 부위, 재조합 부위 및 분자 삽입 피봇(molecular insertion pivots)을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 벡터는 구조체가 원하는 치료 방법의 특이적인 목표에 맞춰질 수 있도록 임의의 숫자의 이러한 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 세포로 도입된 벡터는 그 유전자가 발현되는 경우에 본 발명의 치료 구조체가 숙주 세포의 게놈 속으로 삽입될 수 있음을 시사하는 "선발 표지 유전자"를 더 포함할 수 있다. 이런 방식으로, 선택자 유전자는 게놈 내 삽입에 대한 양성 표지일 수 있다. 선발 표지 유전자의 존재는 본 발명의 방법 에 중요하지 않은 반면에, 그 존재로 인하여 실무자로 하여금 벡터가 세포의 게놈 속으로 삽입되어 있는 살아있는 세포군을 선택할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 특정한 실시예는 벡터가 성공적으로 삽입되어 있는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "선택하다"라는 용어 또는 그 변형은 세포와 연계하여 사용되는 경우에 특이적인 유전적 구성 또는 표현형을 갖는 세포를 선택하는 표준적인 공지된 방법을 의미하려는 의도이다. 통상적인 방법은 G418, 네오마이신 및 앰피실린과 같은 항생제의 존재하에 세포를 배양하는 단계를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 선발 표지 유전자의 다른 예는 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase), 하이그로마이신 또는 마이코페놀산에 내성을 부여하는 유전자를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 다른 선택 방법은 티미딘 키나아제, 하이포잔틴-구아닌-인산리보전이효소(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 및 아데닌 인산리보전이효소를 선택 물질(selection agent)로서 사용을 가능하게 하는 선발 표지 유전자를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 항생제 내성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하는 세포는 이후 배양 중의 항생제에 내성이 있을 것이다. 마찬가지로, 항생제 내성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하지 않는 세포는 배양 중의 항생제에 내성이 있지 않을 것이다.

본 명세서에 사용된 "염색질 변형 구역"(CMD)은 DNA 절연체와 같지만, 여기에 한정되지 않는 염색질 구조를 유지하고/하거나 변형시키는 것과 연관된 다양한 단백질과 상호 작용하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에 참고로 포함 된 Ciavatta, D., et al, Proc. Nat 'I Acad. Sci. U.S.A., 103(26):9958-9963 (2006) 참조. CMD의 예는 닭 베타-글로불리 절연체(chicken β-globulin insulator) 및 닭 과민성 부위 4(cHS4)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 예를 들면, 하나 이상의 유전자 프로그램 사이에서 다른 CMD 서열을 사용하면 다양한 미생물 또는 시험관 내 재조합 기법과 병행하여 미분 CMD DNA 서열을 "미니 상동성 팔(mini homology arms)"로서의 사용을 용이하게 하여 기존 다인자 및 단일인자(multigenic and monogenic) 셔틀 벡터 사이의 유전자 프로그램을 "교환(swap)"할 수 있게 한다. 염색질 변형 구역의 다른 예는 업계에 공지되어 있거나 용이하게 확인될 수 있다.

본 발명과 함께 사용되는 특정 벡터는 단백질 또는 그 부분을 코딩하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 그러한 벡터는 발현되는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 숙주에서의 발현에 유효한 시스-작용 조절 영역(cis-acting control regions). 적당한 트랜스-작용 인자는 숙주에 의하여 공급되거나, 상보 벡터(complementing vector)에 의하여 공급되거나 숙주 속으로 도입 시에 벡터 그 자체에 의하여 공급된다.

단백질을 발현하는데 대단히 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 벡터는 염색체 벡터, 에피솜 벡터 및 예컨대, 세균 플라스미드로부터 유래한 벡터, 박테리오파아지로부터 유래한 벡터, 효모 에피솜으로부터 유래한 벡터, 효모 염색체 구성요소로부터 유래한 벡터, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 바큐로바이러스, SV40와 같은 파포바바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러 스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래한 벡터 및 코스미드(cosmid) 및 파지미드(phagemid)와 같은 플라스미드 및 박테리오파지 유전 구성요소로부터 유래한 벡터와 같이 그 조합으로부터 유래한 벡터와 같은 바이러스-유래 벡터를 포함한다. 상기 모두가 본 발명의 본 태양에 따라 발현을 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 내에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 유지하고, 증식시키거나 발현시키는데 적당한 임의의 벡터는 이런 맥락에서 발현을 위하여 사용될 수 있다.

발현 벡터에 있어서 DNA 서열은 예를 들면, mRNA 전사를 지시하는 프로모터를 포함하는 적절한 발현 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결되어 있다. 다른 프로모터의 대표적인 것은 항시발현 프로모터 및 조직 특이 또는 유도성(inducible) 프로모터를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 항시발현 진핵 프로모터(constitutive eucaryotic promoters)의 예는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(Hamer et al., J. MoI. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); 헤르페스 바이러스의 프로모터(McKnight, Cell 31:355-365 (1982)); SV40 조기 프로모터(early promoter)(Benoist, et al., Nature (London) 290:304-310 (1981)); 및 우두 바이러스 프로모터를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 나열된 참고문헌 모두가 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 단백질의 발현을 작동시키는데 사용될 수 있는 프로모터의 다른 예는 조직 특이 프로모터 및 알부민 프로모터(간세포), 프로인슐린(proinsulin) 프로모터(췌장 베타 세포) 등과 같은 특이적인 단백질에 대한 다른 내생성 프로모터를 포함하지만, 여기에 ㅎ한정되지 않는다. 일반적으로, 발현 구조체는 전사, 개시 및 종결을 위한 부위 및 전사 영역에서 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 포함한다. 상기 구조체에 의하여 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 처음에 번역 개시 AUG 및 번역되는 폴리펩티드의 말미에 적절히 위치된 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)를 포함할 수 있다.

또한, 상기 구조체는 발현을 발생시킬 뿐만 아니라 조절하는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 그러한 영역은 다른 것들 중에서 억제자 결합 부위 및 인핸서(enhnacer)와 같이 전사를 조절하여 작동한다.

적절한 프로모터뿐만 아니라 적절한 뉴클레오티드 서열 및 다른 적절한 조절 서열을 포함하는 벡터는 소기의 폴리펩티드의 발현에 적당한 다양한 공지된 기법을 이용하여 본 발명의 세포 속으로 도입될 수 있다.

진핵 벡터(eucaryotic vector)의 예는 Stratagene 사로부터 구입가능한 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl 및 pSG; Amersham Pharmacia Biotech 사로부터 구입가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL; 및 Clontech 사로부터 구입가능한 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, pCMV-EGFP를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 많은 다른 벡터가 공지되어 있으며 상용 구입가능하다.

유전자 프로그램의 구성요소의 신속한 삽입 및 제거를 위한 분자 삽입 피봇을 포함하는 특히 유용한 벡터는 미국 공개 특허 출원 번호 제 2004/0185556호, 미국 특허 출원 번호 제 11/233,246호 및 국제 공개 출원 번호 WO 2005/040336 호 및 WO 2005/116231에 기술되어 있으며, 이 모두가 참고로 포함되어 있다. 그러한 벡터의 예는 Ultra Vector™ 생산 시스템(Intrexon Corp., Blacksburg, 버지니아 주)이 다. 본 명세서에 사용된 프로모터(P), 발현 서열(E) 및 3' 조절 서열(3)을 포함하는 유전자 구성요소의 조합으로서, 도면에 제시되어 있는 "PE3"는 유전자 프로그램이다. 상기 유전자 프로그램 내의 구성요소는 유전자 프로그램의 구성요소의 각각을 측면에서 접하는(flank) 분자 피봇 사이에서 용이하게 교환될 수 있다. 본 명세서에 사용된 분자 피봇은 선형으로 배열된 적어도 2 개의 비가변적인(non-variable) 희귀(rare)하거나 드문(uncommon) 제한 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 일 실시예에서, 상기 분자 피봇은 직선으로 배열된 적어도 3 개의 비가변적인 희귀하거나 드문 제한 부위를 포함한다. 통상적으로 임의의 분자 피봇은 동일한 유전자 프로그램 내의 임의의 다른 분자 피봇의 희귀하거나 드문 제한 부위를 포함하지 않을 것이다. 주어진 제한 효소가 작용하는 6 개의 뉴클레오티드를 초과하는 동족 서열(cognate sequences)은 "희귀한" 제한 부위로 지칭된다. 그러나, 통계적으로 예측되는 것보다 더 드물게 발생하는 6 염기쌍(bp)의 제한 부위가 있으며, 이러한 부위 및 이를 절단하는 엔도뉴클레아제는 "드문" 제한 부위로 지칭된다. 희귀하거나 드문 제한 효소의 예는 AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I 및 Sse8781 I를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.

또한, 벡터는 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease, HE) 효소라 불리는 제2 클래스의 제한 효소에 대한 제한 부위도 포함할 수 있다. HE 효소는 큰 비대칭 제한 부위(12 내지 40 염기쌍)를 가지며, 그 제한 부위는 성질상 드물게 발생하는 것이다. 예를 들면, I-Scel로 공지된 HE는 무작위 서열의 매 7x10¹⁰ 개의 염기쌍에서 1회만 발생하는 것으로 예측되는 18 개 염기쌍 제한 부위(5'TAGGGATAACAGGGTAAT3' (서열번호: 1))를 가진다. 이러한 발생률은 포유류 게놈의 크기의 20 배인 게놈에서 한 개 부위에만 해당하는 것이다. HE 부위의 희귀한 성질로 인하여, HE 부위가 클로닝 벡터 플라스미드 내의 적절한 위치에 포함된다면 유전 공학으로 유전자 프로그램의 통합성을 해치지 않으면서 유전자 프로그램을 절단할 수 있는 가능성을 대단히 증가시킨다.

숙주 세포 내의 발현을 위한 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 공지된 절차이며, 숙주 내의 그 발현뿐만 아니라 숙주 속으로의 벡터 구성 및 도입에 필요한 기법은 업계의 일상적인 기술이다.

숙주 속으로 구조체의 도입은 일시적인 트랜스펙션(transfection), 안정적인 트랜스펙션일 수 있거나 벡터의 유전자좌-특이 삽입일 수 있다. 숙주 세포 속으로 벡터의 일시적이고 안정적인 트랜스펙션은 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션(DEAE-dextran mediated transfection), 양이온 지질-매개 트랜스펙션, 전기천공법, 형질도입, 감염 또는 다른 방법에 의하여 발생될 수 있다. 그러한 방법은 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y와 같은 많은 표준 실험 지침서에 기술 되어 있다. 이러한 안정적인 트랜스펙션 방법으로 인하여 세포 게놈 속으로 벡터의 무작위 삽입이 발생한다. 또한, 벡터의 복제수 및 배향은 일반적으로 무작위적이다.

본 발명의 일 실시예에서, 벡터는 게놈 내의 생체-중성적(bio-neutral) 부위 속으로 삽입된다. 생체 중성적 부위는 구조체의 삽입으로 세포의 정상적인 기능을 간섭한다고 하더라도 거의 간섭하지 않는 게놈 내의 부위이다. 생체-중성적 부위가 이용가능한 생물정보학(bioinformatics)을 이용하여 분석될 수 있다. 예컨대, ROSA-동등 유전자좌(ROSA-equivalent locus)와 같은 많은 생체-중성적 부위는 업계에 알려져 있다. 다른 생체-중성적 부위는 업계에 일상적인 기법을 이용하여 확인될 수 있다. 게놈 내 삽입 부위(들)의 특징화는 업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 벡터를 세포 속으로 도입하는 경우에 구조체의 위치, 복제수 및/또는 배향을 조절하기 위하여, 유전자좌-특이 삽입 방법이 이용될 수 있다. 유전자좌-특이 삽입 방법은 업계에 공지되어 있으며 상동 재조합(homologous recombination) 및 재조합효소-매개 게놈 삽입(recombinase-mediated genome insertion)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 물론, 유전자좌-특이 삽입 방법이 본 발명의 방법에 이용된다면, 벡터는 상동 재조합과 같지만, 여기에 한정되지 않는 이러한 유전자좌-특이 삽입에 보조하는 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 하나, 둘, 셋, 넷 이상의 게놈 내 삽입 부위(genomic integration sites: GISs)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "게놈 내 삽입 부위"는 그 뉴클레오티드 서열이 게놈에 벡터의 삽입을 가능하게 하는, 세포 내의 게놈의 부분들과 동일하거나 거의 동일한 벡터의 서열의 일부로서 정의된다. 특히, 벡터는 적어도 질병 표지 유전자 프로모터 및 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 측면에서 접하는 2 개의 게놈 내 삽입 부위를 포함할 수 있다. 물론, GISs는 다른 구성요소 또는 심지어 벡터 상에 존재하는 모든 구성요소를 측면에서 접할 수 있다.

다른 실시예에서, 유전자좌-특이 삽입은 재조합효소-부위 특이 유전자 삽입에 의하여 수행될 수 있다. 요약하면, PhiC31 삽입효소(integrase)와 같지만, 여기에 한정되지 않는 박테리아 재조합효소는 인간 게놈 내의 "가성(pseudo)" 재조합 부위상에 작용할 수 있다. 재조합효소-부위 특이적 유전자 삽입은 본 명세서에 참고로 포함된 Thyagarajan, B. et al, Mol. Cell Biol. 21(12):3926-34 (2001)에 기술되어 있다. 재조합효소-부위 특이적 유전자 삽입을 위하여 사용될 수 있는 재조합효소 및 그 각각의 부위의 다른 예는 R4 및 TP901-1과 같은 세린 재조합효소를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 실시예는 세포를 유전자형 분석(genotyping)을 실시하는 단계를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 유전자형 분석이라는 용어는 업계에 사용되는 바와 같이 본 명세서에 사용된다. 구체적으로, 본 발명의 방법의 특정 실시예는 병든 세포의 죽음을 유도하는 단계 전 또는 단계 후에 세포의 유전자형 분석을 제공한다. 또한, 상기 방법은 품질 보증 목적으로 세포의 유전자형 분석을 1회 이상 실시하는 단계를 고려한다. 유전자형 분석은 세포 게놈의 전부 또는 일부에 대한 유전자 서열 정보를 제공하는 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 유전자형 분석은 DNA 분리 및 이후 시퀀싱(sequencing)에 의하여 수행될 수 있거 나, PCR 방법 또는 제한 분석(restriction analysis) 또는 그것의 임의의 조합을 통하여 수행될 수 있다.

피검자 세포의 유전자형 분석이 수행되어 피검자의 게놈 프로파일(genomic profile)을 결정할 수 있다. 이러한 정보가 이용되면 피검자에게 되돌려지는 병들지 않은 세포의 이후 발생에서 질병의 재발에 피검자를 더 민감하게 할 수 있는 돌연변이적 사건에 피검자가 소인이 있는지의 여부를 결정할 수 있다. 돌연변이적 사건에의 소인(predisposition)은 일반적으로 DNA 합성을 엔코딩하는 유전자 및 교정 유전자(repair gene)에서 또는 피검자의 돌연변이적 사건에 관련된 다른 유전자에서의 변경(alteration) 또는 돌연변이의 검출로 확인될 수 있다. 특이적 유형의 질병에의 소인은 질병과 연관된 유전자에서의 변경 또는 돌연변이의 검출로 확인될 수 있다. 피검자 유전자형에 대한 지식을 이용하면 각각의 피검자에 대한 적절한 치료 폴리뉴클레오티드를 설계할 수 있다. 예를 들면, 피검자가 특정 질병에 소인이 있다면, 특정 질병 특이 프로모터 또는 치명적 폴리펩티드는 가장 적당할 수 있다. 만약 피검자가 질병의 재발에 대한 소인이 있다면, 병든 세포가 이후 필요하다면 생체 내에서 정화(purge)될 수 있도록 치료 폴리뉴클레오티드를 절제하지 않는 것이 바람직할 것이다. 다른 예에서, 피검자의 유전형이 사용되어 게놈에서의 특정 삽입 부위가 다소간 적당한지의 여부를 결정할 수 있다. 피검자의 게놈 프로파일에 기반한 개별화된 치료 폴리뉴클레오티드의 설계는 도 1에 도시된 바와 같이 폴리뉴클레오티드의 각각의 매개변수에 대한 선택에 기반한 것일 수 있다. 상술한 바와 같이 부품(parts)이 용이하게 상호교환될 수 있는 벡터 시스템은 피검자의 유전자 형에 기반한 피검자-특이 치료 폴리뉴클레오티드를 조립하는데 이상적으로 적합하다.

또한, 본 발명의 방법의 특정 실시예는 치료 폴리뉴클레오티드의 절제를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 세포의 질병 상태에 관계없이 모든 세포 또는 대부분의 세포 속으로 치료 폴리뉴클레오티드의 도입을 일어나게 할 것이다. 따라서, 병들지 않은 세포로부터 치료 폴리뉴클레오티드(들)을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 그 자신이 절제되는 것을 보조하기 위하여, 구조체는 재조합효소 부위와 같은 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 재조합효소 부위의 일 예는 공지된 cre-lox에서의 loxP 부위 또는 Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 레솔바제(resolvase), ΦC31, TndX, XerC 및 XerD 재조합효소와 연관된 재조합효소 부위를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 적절한 재조합효소가 재조합효소 부위상에 작용한다면 다른 재조합효소 부위가 사용될 수 있다. 또한, 구조체는 하나 이상의 재조합효소를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다. 재조합효소의 발현은 절제가 소정의 시간에 유도될 수 있도록 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 치료 폴리뉴클레오티드는 병든 세포가 죽은 이후에 그리고 생존한 세포가 피검자에게 되돌려지기 전에 생존한 세포로부터 절제될 수 있다. 다른 실시예에서, 생존한 세포는 치료 폴리뉴클레오티드를 절제하지 않으면서 피검자에게 되돌려질 수 있다. 본 실시예에서, 치명적 폴리펩티드의 발현은 세포가 피검자에게 되돌려진 이후의 임의의 시간에 생체 내에서 유도될 수 있다. 피검자에서의 질병의 재발이 있다면 본 실시예가 이용될 수 있다. 재발은 피검자에 게 되돌려진 병들지 않은 세포의 이후 발생에서 질병의 재발로 이어지는 돌연변이적 사건에로 피검자의 소인을 포함하는 임의의 이유로 인하여 일어날 수 있다. 또한, 재발은 피검자에게 세포를 되돌려주기 이전에 모든 병든 세포의 불완전한 세척(purging)으로 인하여 일어날 수 있다. 생체 내에서 병든 세포를 죽인 (예컨대, 치명적 폴리펩티드를 유도성 프로모터의 조절하에 두고 상기 유도 물질을 피검자에게 제공하여) 능력은 피검자로 하여금 다른 생체 외 이식 주기 및 상기 주기와 연관된 위험(예컨대 이식 전에 골수 제거를 위해 요구되는 방사선조사/화학요법)을 회피하도록 한다. 또한 이러한 실시예는 임상의로 하여금 치명적 폴리펩티드의 생체 내 발병(onset), 수준 및 지속을 조절하도록 한다.

다른 실시예에서, 치료 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 다약제 내성 유전자 mdrl과 같은 화학-내성 유전자를 포함할 수 있다. 상기-화학 내성 유전자는 항시발현(예컨대, CMV) 또는 유도성(예컨대, RheoSwitch®) 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 본 실시예에서, 피검자에게서 질병의 재발이 있다면, 임상의는 되돌려진 세포가 화학치료제로부터 보호되면서 병든 세포를 죽이기 위하여 더 강한 용량의 화학치료제를 적용할 수 있다. 화학-내성 유전자를 유도성 프로모터 하에 둠으로써, 화학-내성 유전자의 불필요한 발현이 회피될 수 있지만, 이는 질병 재발의 경우에 여전히 이용가능할 것이다. 만약 되돌려진 세포가 병이 든다면, 이는 상술한 바와 같이 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하여 여전히 죽여질 수 있을 것이다.

또 다른 실시예는 세포를 피검자에게 재도입하기 이전에 생존한 세포군을 분석하고/하거나 팽창하는 단계를 고찰한다. 예를 들어, 세포를 피검자에게 되돌려주 기 이전에 본 명세서에 기술되거나 언급된 임의의 방법 또는 프로토콜을 이용하여 유전자형화 시키고/시키거나 표현형화 시킬 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법과 연계하여 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 본 발명의 이 태양에 따른 키트는 하나 이상의 핵산 분자, 제한 효소 및 그러한 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 세포를 배양하는데 적당한 세포 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 용기, 본 발명의 세포 배양에의 사용에 적당한 항생제를 포함하는 하나 이상의 용기, 완충액을 포함하는 하나 이상의 용기, 트랜스펙션 시약을 포함하는 하나 이상의 용기 및/또는 효소 반응을 위한 기질을 포함하는 하나 이상의 용기를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 본 발명과 함께 사용될 수 있는 광범위한 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 공급될 수 있는 핵산 분자의 예는 프로모터, 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열, 인핸서, 억제자, 선발 표지(selection marker), 전사 신호, 번역 신호, 프라이머 혼성화 부위(예컨대, 시퀀싱 또는 PCR을 위한), 재조합 부위, 제한 부위 및 폴리링커(polylinker), 억제자 tRNA의 존재하에 번역 종결을 억제하는 부위, 억제자 tRNA 코딩 서열, 구역 및/또는 영역을 엔코딩하는 서열, 복제 기점, 텔로미어, 동원체 등을 함유하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 상술한 전사 조절 서열에 더하여 이러한 특징들 중 하나 이상의 임의의 특징을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 적당한 재조합 단백질은 Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 레솔바제, ΦC31, TndX, XerC 및 XerD를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 다른 적당한 재조합 부위 및 단백질은 캘리포니아 주 Carlsbad 소재 Invitrogen Corp.로부터 구입할 수 있는 GATEWAY™ Cloning Technology와 연관된 재조합 부위 및 단백질이며, 그 전체 개시물이 본 명세서에 포함된 GATEWAY™ Cloning Technology의 제품 소개서(product literature)에 기술되어 있다.

사용에 있어서, 본 발명의 키트에 제공된 하나 이상의 질병 표지 유전자 프로모터(P)를 포함하는 핵산 분자는 치명적 폴리펩티드(E) 및 3' 조절 서열(3)에 대한 발현 폴리뉴클레오티드와 조합되어 PE3 유전자 프로그램을 작성할 수 있다. 하나 이상의 3' 조절 서열을 포함하는 핵산 분자는 예를 들면, 3' 조절 서열의 5' 및 3' 말단 상의 분자 피봇과 함께 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 프라이머와 함께 제공될 수 있다. 예를 들면, 이러한 프라이머는 특이적 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자를 복원(anneal)하도록 일반적으로 설계될 것이다. 예를 들면, 이러한 프라이머는 PCR에 사용되도록 설계되어 특정 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 또한, 시퀀싱 프라이머는 키트와 함께 공급될 수 있다.

하나 이상의(예컨대, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여덟, 열, 열다섯 개) 완충액이 본 발명의 키트와 함께 공급될 수 있다. 이러한 완충액은 작업 농도(working concentration)로 공급될 수 있거나 농축 형태로 공급되어 이후 작업 농도로 희석 될 수 있다. 이러한 완충액은 종종 완충액 그 자체 또는 완충액 내의 분자의 활성 향상 또는 안정화를 위하여 염, 금속 이온, 보조 인자, 금속 이온 킬레이트제 등을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 완충액은 건조한 형태 또는 수용액 형태로 공급될 수 있다. 완충액이 건조한 형태로 공급되는 경우, 이는 일반적으로 사용 전에 물에 용해시킬 것이다.

본 발명의 키트는 상술되거나 본 명세서의 어딘가에 기술된 구성요소들의 거의 모든 조합을 포함할 수 있다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 키트와 함께 공급되는 구성요소는 키트에 대한 의도된 용도에 따라 다양해질 것이다. 따라서, 키트는 본 출원에서 기술된 다양한 기능을 수행하도록 설계될 수 있으며 그러한 키트의 구성요소는 그에 따라 다양해 질 것이다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시사항에 관한 것이다. 그러한 지시사항은 본 발명의 방법을 수행하는데 적당한 조건을 알려줄 수 있다. 본 발명의 지시사항은 예를 들면, 서면 지시사항(예컨대, 종이 상에 타이핑된)과 같은 유형의 형태일 수 있거나, 예를 들면, 컴퓨터 디스크를 통하거나 인터넷 상에서 접근할 수 있는 무형의 형태일 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시사항의 전체 텍스트 또는 상기 키트를 사용하기 위해 키트와 함께 포함된 지시사항의 전체 텍스트는 제공될 필요가 없음을 알 것이다. 예를 들면, 본 발명의 키트가 그러한 전장 지시사항을 포함하지 않는 상황의 일 예는 제공된 지시사항이 키트의 사용자에게 상기 키트가 사용될 수 있는 방법의 실행을 위한 지시사항을 어디에서 획득할 수 있는지 알려주는 상황에 서 그러하다. 따라서, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지시사항은 인터넷 웹 페이지, 별도로 판매되거나 배포된 매뉴얼 또는 다른 제품 소개서 등으로부터 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 키트 사용자로 하여금 키트와 함께 직접 포장되고/되거나 배포되지 않은 지시사항을 구할 수 있는 하나 이상의 위치를 알려주는 키트를 포함할 수 있다. 그러한 지시사항은 전자 또는 인쇄된 형태를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 임의의 형태일 수 있다.

하기 예는 본 발명의 방법을 예시하는 것이지만, 제한하는 것은 아니다. 의료 치료 및 유전자 발현 시스템에서 주로 만나게 되고 당업자에게 명백한 다양한 조건 및 변수의 다른 적당한 변형 및 개작은 본 발명의 취지 및 범위 내에 있다.

예

예 1

CD34⁺ 세포는 골수성 백혈병 환자의 혈액으로부터 획득하여 분리된다. 분리된 세포는 항시발현, 편재성(ubiquitous) 거대세포바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에 있는 네오마이신(네오) 선택 유전자 및 TERT 프로모터의 조절하에 있는 유도성 트랜스-활성제(trans-activator) rTTA를 포함하는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 구조체로 생체 외적으로 처리된다. 디프테리아(DTA) 독소 코딩 서열은 TetO 유도성 프로모터의 조절하에 있다. 이후 세포 형질전환은 치료 구조체의 게놈 속으로 무작위 삽입(random integration)을 촉진하는 조건하에서 수행된다. 안정적인 형질전환체는 G418의 첨가에 의하여 선택된다. 이후 생존한 군체는 테트라사이클린 또는 독시사이클린으로 처리되어 TERT 프로모터가 rTTA 단백질 생성물의 발현을 작동시키는 것을 특징으로 하는 세포 내에서의 DTA 치명적 유전자 생성물의 발현을 활성화시킨다. 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 및 rTTA의 발현은 TERT 프로모터가 활성인 것을 특징으로 하는 병든 세포의 죽음으로 이어지게 한다.

도 6에 도시된 벡터는 본 예의 방법에 유용할 수 있는 벡터 설계의 일 예이다. 게놈 내 삽입 부위(들)의 특징화는 업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 일 실시예에서, 구조체가 생체-중성적 부위 속으로 삽입되어 있는 세포는 구조체를 포함하는 세포 상에 선택적 압력을 제공하는 조건 하에서 성장하고 팽창된다.

이러한 팽창된 군체는 표현형화 되어 질병 표지 유전자의 존부를 시사한다. 또한, 표현형은 평가되어 CD34⁺ 생물표지를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 공지된 전구 생물표지(progenitor biomarker)에 의하여 평가된 전구 세포의 가소성(plasticity)을 유지하는 세포의 능력을 측정할 수 있다. 이 최종 표현형 분석을 통과한 세포군은 이후 공여 환자에게로 이식될 것이다. 이식 전에, 환자는 자신의 혈액 세포/골수를 화학적 또는 방사능적 방법을 통하여 제거되도록 할 수 있다.

예 2

말초 혈액 세포는 혈액 세포기원 암 환자의 혈액으로부터 획득하여 분리된다. 분리된 세포는 알데히드 탈수소효소 프로모터의 조절하에 있는 네오마이신(네오) 선택 유전자 및 TERT 프로모터의 조절하에 있는 유도성 트랜스-활성제 rTTA를 포함하는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 구조체로 생체 외적으로 처리된다. 디 프테리아(DTA) 독소 코딩 서열은 TetO 유도성 프로모터의 조절하에 있으며, CMV 하항시발현 프로모터는 RheoCept® 트랜스-활성제의 발현을 조절한다. 차례로, RheoSwitch® 유도성 프로모터는 Cre 재조합효소의 발현을 조절한다. LoxP 부위는 구조체의 5' 및 3' 말단에서 구조체의 유전자 프로그램의 각각을 측면에서 접한다. 세포 형질전환은 게놈 속으로 이형 DNA의 무작위 삽입을 촉진하는 조건하에서 수행된다. 알데히드 탈수소효소 프로모터는 구조체를 포함하는 전구 세포 내에서 높은 수준으로 발현되기 때문에, G418은 세포 배양액에 첨가되어 전구 세포 표현형을 보이는 안정한 형질전환체를 선택한다. 이후 생존한 군체는 테트라사이클린 또는 독시사이클린으로 처리되어 TERT 프로모터가 rTTA 단백질 생성물의 발현을 작동시키는 것을 특징으로 하는 세포 내에서 DTA 치명적 유전 생성물의 발현을 활성화시킨다.

도 7에 도시된 벡터는 본 예의 방법에 유용할 수 있는 벡터 설계의 일 예이다. 게놈 내 삽입 부위(들)의 특징화는 업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 일 실시예에서, 구조체가 생체-중성적 부위 속으로 삽입되어 있는 세포는 구조체를 포함하는 세포 상에 선택적 압력을 제공하는 조건 하에서 성장하고 팽창된다.

이러한 팽창된 군체는 표현형화 되어 질병 표지 유전자의 존부를 시사한다. 또한, 표현형은 평가되어 CD34⁺ 및 알데히드 탈수소효소를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 공지된 전구 생물표지에 의하여 평가된 전구 세포의 가소성을 유지하는 세포의 능력을 측정할 수 있다. 이 최종 표현형 분석을 통과한 세포군은 이후 공여 환자에게로 이식될 것이다. 이식 전에, 환자는 자신의 혈액 세포/골수를 화학적 또는 방사능적 방법을 통하여 제거되도록 할 수 있다. 벡터의 절제는 세포를 엑디손 수용체 작용제(receptor agonist)에 노출시켜 Cre 재조합효소의 발현을 유도하여 임의의 시간에 유도될 수 있다.

예 3

수술 후 암 환자의 암 전이를 방지하고 예컨대, 유방암 세포와 같은 암 세포의 순환을 줄이기 위하여, 말초 혈액 세포는 유방암을 가지고 있거나 가졌던 환자로부터 획득하여 분리된다. 이러한 분리된 세포는 편재성, 항시적으로 발현된 포스포 글리세린산염(phospho-glycerate) 키나아제(PGK) 프로모터의 조절하에 있는 시토딘 탈아미노효소(CDA) 유전자 및 생체-중성적 ROSA-동등 유전자좌에 상동인 DNA의 일부를 포함하는 치료 구조체로 생체 외적으로 처리된다. 상기 구조체에서, 네오 선택 유전자는 알데히드 탈수소효소 프로모터의 조절하에 있으며, 유도성 트랜스-활성제 rTTA는 TERT 프로모터의 조절하에 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제(TK) 코딩 서열은 TetO 유도성 프로모터 및 제1 DNA 영역의 3'에 있는 생체-중성적 ROSA-동등 유전자좌에 상동인 DNA의 다른 영역의 조절하에 있다. 또한, 디프테리아(DTA) 독소 유전자는 항시적으로 발현되는 CMV 프로모터의 조절하에 있다. 세포 형질전환은 상동 재조합을 통하여 유전자좌-특이적 삽입을 촉진하는 조건하에서 수행된다. 알데히드 탈수소효소 프로모터는 전구 세포 내에서 높은 수준으로 발현되기 때문에, 전구 세포 표현형을 보이는 안정한 형질전환체는 G418의 첨가에 의하여 선택된다.

도 8에 도시된 벡터는 본 예의 방법에 유용할 수 있는 벡터 설계의 일 예이다. 구체적으로, 구조체는 생체-중성적 ROSA-동등 유전자좌에서 게놈 속으로 삽입된다. 구조체의 DTA 선택자의 상실은 상동 재조합이 성공적이었다는 것을 시사한다. 5-플루오로시토신으로 처리하면 CDA 선택자 유전자의 상실에 대한 음성 선택자로서 작용한다. 게놈 내 삽입 부위의 특징화는 업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다.

생체-중성적 ROSA-동등 유전자좌에서 게놈 속으로 삽입하는 상동 재조합 영역의 내부에 구조체의 부분이 있는 것을 특징으로 하는 군체가 선택되어 팽창된다. 이러한 팽창된 세포는 이후 간시클로비르(gancyclovir)에 더하여 테트라사이클린 또는 독시사이클린으로 처리된다. 테트라사이클린 또는 독시사이클린으로 처리하면 선택된 질병 표지 유전자를 발현하는 세포에서 TetO 프로모터의 활성화로 이어지고, 차례로 TK 유전자 생성물의 발현을 활성화할 것이다. 간시클로비르 처리는 높은 발현 수준에 있는 티미딘 키나아제를 발현시키는 세포를 선택적으로 죽인다.

이러한 팽창된 군체는 표현형화 되어 질병 표지 유전자의 존부를 시사한다. 또한, 표현형은 평가되어 CD34⁺ 및 알데히드 탈수소효소를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 공지된 전구 생물표지에 의하여 평가된 전구 세포의 가소성을 유지하는 세포의 능력을 측정할 수 있다. 이 최종 표현형 분석을 통과한 세포군은 이후 공여 환자에게로 이식될 것이다. 이식 전에, 환자는 자신의 혈액 세포/골수를 화학적 또는 방사능적 방법을 통하여 제거되도록 할 수 있다.

예 4

말초 혈액 세포는 혈액 세포기원 암 환자의 혈액으로부터 획득하여 분리된다. 분리된 세포는 알데히드 탈수소효소 프로모터의 조절하에 있는 네오마이신(네오) 선택 유전자 및 TERT 프로모터의 조절하에 있는 디프테리아(DTA) 독소 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 구조체로 생체 외적으로 처리된다. 세포 형질전환은 게놈 속으로 이형 DNA의 무작위 삽입을 촉진하는 조건하에서 수행된다. 알데히드 탈수소효소 프로모터는 구조체를 포함하는 전구 세포 내에서 높은 수준으로 발현되기 때문에, G418은 세포 배양액에 첨가되어 전구 세포 표현형을 보이는 안정한 형질전환체를 선택한다.

게놈 내 삽입 부위(들)의 특징화는 업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 일 실시예에서, 구조체가 생체-중성적 부위 속으로 삽입되어 있는 세포는 구조체를 포함하는 세포 상에 선택적 압력을 제공하는 조건 하에서 성장하고 팽창된다.

이러한 팽창된 군체는 표현형화 되어 질병 표지 유전자의 존부를 시사한다. 또한, 표현형은 평가되어 CD34⁺ 및 알데히드 탈수소효소를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 공지된 전구 생물표지에 의하여 평가된 전구 세포의 가소성을 유지하는 세포의 능력을 측정할 수 있다. 이 최종 표현형 분석을 통과한 세포군은 이후 치료 유전자의 절제 없이 공여 환자에게로 이식될 것이다. 이식 전에, 환자는 자신의 혈액 세포/골수를 화학적 또는 방사능적 방법을 통하여 제거되도록 할 수 있다.

환자의 혈액 세포 암의 재발시에, TERT 프로모터로부터 DTA의 발현은 이식된 세포에서 활성화될 것이며, 이러한 세포는 죽을 것이다.

예 5

말초 혈액 세포는 혈액 세포기원 암 환자의 혈액으로부터 획득하여 분리된다. 분리된 세포는 알데히드 탈수소효소 프로모터의 조절하에 있는 네오마이신(네오) 선택 유전자 및 TERT 프로모터의 조절하에 있는 유도성 트랜스-활성제 RheoCept® 트랜스-활성제를 포함하는 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 구조체로 생체 외적으로 처리된다. 차례로, RheoSwitch® 유도성 프로모터는 DTA의 발현을 조절한다. 세포 형질전환은 게놈 속으로 이형 DNA의 무작위 삽입을 촉진하는 조건하에서 수행된다. 알데히드 탈수소효소 프로모터는 구조체를 포함하는 전구 세포 내에서 높은 수준으로 발현되기 때문에, G418은 세포 배양액에 첨가되어 전구 세포 표현형을 보이는 안정한 형질전환체를 선택한다. 생존한 군체는 이후 RheoCept® 작용제로 처리되어 TERT 프로모터가 RheoCept® 단백질 생성물의 발현을 작동시키는 것을 특징으로 하는 세포 내에서 DTA 치명적 유전자 생성물의 발현을 활성화시킨다.

이러한 팽창된 군체는 표현형화 되어 질병 표지 유전자의 존부를 시사한다. 또한, 표현형은 평가되어 CD34⁺ 및 알데히드 탈수소효소를 포함하지만, 여기에 한정 되지 않는 공지된 전구 생물표지에 의하여 평가된 전구 세포의 가소성을 유지하는 세포의 능력을 측정할 수 있다. 이 최종 표현형 분석을 통과한 세포군은 이후 치료 유전자의 절제 없이 공여 환자에게로 이식될 것이다. 이식 전에, 환자는 자신의 혈액 세포/골수를 화학적 또는 방사능적 방법을 통하여 제거되도록 할 수 있다.

환자의 혈액 세포 암의 재발시에, RheoCept® 작용제는 환자에게 투여되어, TERT 프로모터가 RheoCept® 단백질 생성물의 발현을 작동시키는 것을 특징으로 이식된 세포 또는 그 자손 내에서 DTA 유전자 생성물의 발현을 유도하게 된다.

이제 본 발명을 충분히 기술하였으므로, 본 발명 또는 그 임의의 실시예의 범위에 영향을 주지 않으면서 조건, 제형 및 다른 변수의 넓고 동등한 범위 내에서 동일 사항이 수행될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 명세서에 그대로 전부 포함되어 있다.

Claims

피검자의 병든 세포를 파괴하여 질병을 치료하는 방법에 있어서,

(a) 상기 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계;

(b) 상기 세포군 내에 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계;

(c) 선발 표지(selectable markder) 및 상기 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 속으로 도입하여, 상기 치명적인 폴리펩티드의 발현이 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 프로모터에 의하여 직접 또는 간접적으로 조절되는 단계;

(d) 상기 세포를 상기 폴리펩티드를 포함하는 세포를 획득하는 선택 조건으로 노출시키는 단계;

(e) 상기 세포를 상기 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리하여, 상기 치명적 폴리펩티드의 상기 발현으로 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자를 발현하는 상기 세포를 죽이는 단계;

(f) 상기 죽은 세포를 남아있는 생존한, 병들지 않은 세포로부터 분리하여, 상기 생존 세포가 상기 병들지 않은 세포를 죽이는데 충분한 정도로 상기 치명적 폴리펩티드를 발현하지 않는 단계; 및

(g) 상기 피검자에게 상기 생존한 병들지 않은 세포를 되돌려 주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 프로모터는 상기 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

단계 (a) 이후에 상기 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포, 간 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및 신경 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계는 상기 세포 속으로 상기 폴리뉴클레오티드의 일시적인 트랜스펙션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계는 상기 세포 속으로 상기 폴리뉴클레오티드의 안정한 트랜스펙션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 유전자 프로그램을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 질병 표지 유전자의 프로모터는 제1 및 제2 분자 삽입 피봇(pivot) 사이에서 결찰(ligate)되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서,

상기 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제2 및 제3 분자 삽입 피봇 사이에서 결찰되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,

상기 분자 삽입 피봇은 인접 배열(contiguous arrangement)에서, AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I 및 Sse878 I 제한 효소와 상관하는 제한 부위로 구성된 군으로부터 선택된 3 개 또는 4 개의 희귀(rare)하거나 드문(uncommon) 제한 부위로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8에 있어서,

폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 염색질 변형 구역(chromatin modification domain)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자좌-특이 삽입(locus-specific insertion)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13에 있어서,

상기 유전자좌-특이 삽입은 상동 재조합 및 재조합효소 매개 게놈 내 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 게놈 내 삽입 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 14에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 게놈 내 삽입 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

뉴클레오티드가 게놈 내의 생체-중성적 부위(bio-neutral site) 속으로 삽입되었는지의 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 피검자에게 상기 세포를 되돌려 주기 전에 상기 세포의 게놈으로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 절제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 18에 있어서,

상기 절제 단계는 부위-특이적 재조합효소 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 19에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 재조합효소 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 피검자에게 되돌려지기 전에 상기 남아있는 생존한 병들지 않은 세포로부터 절제되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 세포가 상기 피검자에게로 되돌려진 이후에 상기 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 22에 있어서,

상기 추가 단계는 상기 피검자 내에서 상기 질병의 재발 이후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
질병에 대한 치료를 필요로 하는 피검자의 치료를 개별화하는 방법에 있어서,

(a) 상기 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계;

(b) 상기 세포군 내에서 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계;

(c) 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 적어도 하나의 프로모터를 분리하는 단계;

(d) 상기 프로모터를 상기 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴 클레오티드에 직접 또는 간접적으로 연결하는 단계;

(e) 상기 연결된 폴리뉴클레오티드를 선별 표지를 포함하는 벡터 속으로 위치시키는 단계;

(f) 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 속으로 도입하는 단계;

(g) 상기 세포를 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 획득하는 선택 조건에 노출시키는 단계;

(h) 상기 세포를 상기 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리하여, 상기 치명적 폴리펩티드의 상기 발현으로 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자를 발현하는 상기 세포를 죽이는 단계;

(i) 상기 죽은 세포를 남아있는 생존한 병들지 않은 세포로부터 분리하여, 상기 생존한 세포가 상기 병들지 않은 세포를 죽이는데 충분한 정도로 상기 치명적 폴리펩티드를 발현하지 않는 단계; 및

(j) 상기 생존한 병들지 않은 세포를 상기 피검자에게 되돌려주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서,

상기 프로모터는 상기 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서,

단계 (a) 이후에 상기 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포, 간 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및 신경 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 27에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 24에 있어서,

폴리뉴클레오티드가 게놈 내의 생체-중성적 부위 속으로 삽입되었는지의 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 25에 있어서,

상기 프로모터는 제1 분자 삽입 피봇 및 상기 프로모터의 3' 말단에 위치된 제2 분자 삽입 피봇 사이에서 상기 프로모터를 결찰하여 상기 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 30에 있어서,

상기 분자 삽입 피봇은 인접 배열에서, AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I 및 Sse878 I 제한 효소와 상관하는 제한 부위로 구성된 군으로부터 선택된 3 개 또는 4 개의 희귀하거나 드문 제한 부위로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
피검자의 병든 세포를 파괴하여 질병을 치료하는 방법에 있어서,

(a) 상기 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계;

(b) 상기 세포군 내에 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계;

(c) 상기 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 상기 세포 속으로 도입하여, 상기 치명적인 폴리펩티드의 발현이 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 프로모터에 의하여 조절되며, 상기 프로모터는 상기 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 단계;

(d) 상기 세포를 상기 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리하여, 상기 치명적 폴리펩티드의 상기 발현으로 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자를 발현하는 상기 세포를 죽이는 단계;

(f) 상기 죽은 세포를 남아있는 생존한, 병들지 않은 세포로부터 분리하여, 상기 생존 세포가 상기 병들지 않은 세포를 죽이는데 충분한 정도로 상기 치명적 폴리펩티드를 발현하지 않는 단계; 및

(g) 상기 피검자에게 상기 생존한 병들지 않은 세포를 되돌려 주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 32에 있어서,

상기 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 32에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포, 간 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및 신경 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 34에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 34에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계는 상기 세포 속으로 상기 폴리뉴클레오티드의 일시적인 트랜스펙션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 34에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계는 상기 세포 속으로 상기 폴리뉴클레오티드의 안정한 트랜스펙션을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 34에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 유전자 프로그램을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 38에 있어서,

상기 질병 표지 유전자의 프로모터는 제1 및 제2 분자 삽입 피봇 사이에서 결찰되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 39에 있어서,

상기 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 제2 분자 사빙 피봇 및 제3 분자 삽입 피봇 사이에서 결찰되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 40에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 선발 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 41에 있어서,

폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 염색질 변형 구역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 42에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자좌-특이 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 43에 있어서,

상기 유전자좌-특이 삽입은 상동 재조합 및 재조합효소 매개 게놈 내 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 44에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 게놈 내 삽입 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 45에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 게놈 내 삽입 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 46에 있어서,

상기 피검자에게 상기 세포를 되돌려 주기 전에 상기 세포의 게놈으로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 절제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 47에 있어서,

상기 절제는 부위-특이적 재조합효소 활성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 48에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 2 개의 재조합효소 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
비정상적인 상태로부터 치료를 필요로 하는 피검자의 치료를 개별화하는 방법에 있어서,

(a) 상기 피검자로부터 세포군을 획득하는 단계;

(b) 상기 세포군 내에서 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 활성을 측정하는 단계;

(c) 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자의 적어도 하나의 프로모터를 분리하는 단계;

(d) 상기 프로모터를 상기 세포에 치명적인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결하여 치료 폴리뉴클레오티드를 발생시키는 단계;

(e) 상기 치료 폴리뉴클레오티드를 상기 세포 속으로 도입하는 단계;

(f) 상기 세포를 상기 치명적 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건으로 처리하여, 상기 치명적 폴리펩티드의 상기 발현으로 상기 적어도 하나의 질병 표지 유전자를 발현하는 상기 세포를 죽이는 단계;

(g) 상기 죽은 세포를 남아있는 생존한 병들지 않은 세포로부터 분리하여, 상기 생존한 세포가 상기 병들지 않은 세포를 죽이는데 충분한 정도로 상기 치명적 폴리펩티드를 발현하지 않는 단계; 및

(j) 상기 생존한 병들지 않은 세포를 상기 피검자에게 되돌려주는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 50에 있어서,

상기 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 51에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포, 간 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 및 신경 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 52에 있어서,

상기 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 53에 있어서,

상기 치명적 폴리펩티드를 엔코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드에 상기 프로모터를 작동가능하게 연결하는 단계는 제1 분자 삽입 피봇 및 상기 프로모터의 3' 말단에 위치된 제2 분자 삽입 피봇 사이에서 상기 프로모터를 결찰하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 54에 있어서,

상기 분자 삽입 피봇은 인접 배열에서, AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I 및 Sse878 I 제한 효소와 상관하는 제한 부위로 구성된 군으로부터 선택된 3 개 또는 4 개의 희귀하거나 드문 제한 부위로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.