KR20090034131A - 렉틴 유전자로 형질전환된 감자 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 겨우살이 렉틴의 유전자, 이를 함유하는 발현벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 감자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 겨우살이로부터 렉틴의 기능성 도메인을 발현하는 유전자를 분리하고 증폭하여, 재조합 식물 형질전환용 벡터로 옮긴 후 아그로박테리아를 통하여 형질전환시킨 겨우살이 렉틴을 생산하는 형질전환 감자 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

겨우살이 렉틴, 감자, 식물 발현용 벡터, 형질전환된 식물

Description

렉틴 유전자로 형질전환된 감자 및 이의 제조 방법{Transgenic potato with lectin gene and its producing method}

본 발명은 겨우살이 렉틴의 유전자, 이를 함유하는 발현벡터 및 상기 벡터를 이용하여 형질전환된 감자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 겨우살이로부터 렉틴의 기능성 도메인을 발현하는 유전자를 PCR을 통하여 증폭하고 이 유전자를 pGEM-T easy 벡터를 이용하여 대장균에서 증폭시킨 후 재조합 식물 형질전환용 벡터로 옮겨서 아그로박테리아를 통하여 형질전환시킨 겨우살이 렉틴을 생산하는 형질전환 감자 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

겨우살이 (mistletoe,Viscum album )는 참나무, 밤나무를 숙주로 하여 생장하는 상록관목 반기생 식물로서 그 숙주 식물에 따라 여러 과와 종으로 나누어지며, 세계적으로 30속 1,500여 종의 식물이 있는 것으로 알려져 있다. 겨우살이 중 유럽산 겨우살이 (Viscum album )는 백색을 띠고, 한국에 분포하고 있는 한국산 겨우살이 (Viscum album L. var. coloratum )는 황색을 띠고 있으며 동백나무 겨우살이과, 겨우살이과, 참나무 겨우살이과 등이 있고, 독일을 중심으로 한 유럽 지역에서 뿐 아니라, 우리나라에서도 오래 전부터 여러 가지 질병에 대한 민간 약재로 사 용되어 왔다. 여러 겨우살이 중 현재 약재로 사용되고 있는 것은 비스쿰 속 (Viscum genus)의 겨우살이로서, 주로 유럽 지역에서 서식하는 비스쿰 알붐 (Viscum album Loranthaceae)이다. 유럽의 겨우살이는 오래 전부터 민간요법에서 고혈압, 동맥경화증, 암 등에 대하여 효과가 있는 신비의 약재로 사용되다가 1920년경부터 항암 활성을 인정받아 종양에 대한 치료 및 항암요법시 보조제로 사용되 고 있다. 유럽지역에 서식하는 겨우살이는 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하는 면역증강 효과가 있는 것으로 보고되었고, 동물 및 인간에 대한 임상실험 결과 종양세포에 대하여 직접 또는 간접적으로 대응하는 대식세포 및 자연살해 (apoptotic killing) 세포의 활성을 증가시킴으로써 종양세포의 성장을 억제하고, 암 환자의 생존율을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고되었다 [참고문헌: Hajto, T.,Hostanska, K., Frei, K., Rordorf, C. and Gabius, H.J. Cancer Res. 50: 3322-3326 (1990)]. 이러한 효과는 겨우살이의 면역증강 작용 및 종양 세포에 대한 직접적인 세포 독성 효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 한편, 유럽산 겨우살이와 구별되는 한국산 겨우살이 (Viscum album coloratum ) 역시 민간 및 한방에서 숙주나무에 따라 기생목 (寄生木), 냉청 (冷靑), 해기생, 표기생 (票奇生), 기엽 및 비상 (比桑) 등으로 불리우면서 오래전부터 암, 동맥경화, 당뇨, 동상, 심장병, 요통, 고혈압, 유산 방지, 불임증, 치통 등 각종 질병의 약재로 사용되어 왔다. 최근의 과학조사는 겨우살이가 암세포의 세포 자살 (apoptotic killing)을 유도하고 림프구의 면역 시스템을 자극하며, 화학 치료 또는 방사선 치료 시 DNA를 보호한다고 발표하였다. 암치료 효과가 있다고 보고된 생물학적 활성도와 그 상승 작용 의 결과는 겨우살이의 렉틴에서뿐만 아니라, 비스코톡신, 다당체 (polysaccharides), 아미노산 및 플라보노이드를 포함하는 다른 구성 요소들에 대해서도 보고되었다 [참고문헌: Park, J.H., Hyun, C.K. and Shin, H.K. Cancer Lett. 126: 43-48 (1998)]. 이런 것들 사이에서도 특히 유럽산 겨우살이의 렉틴은 현대 생물 의학 연구에 있어서 주목을 받았으며, 유럽 겨우살이 조제약의 세포 독성, 면역학적 특성은 명백히 렉틴과 관계하는 것이라고 생각되었다. 렉틴 (lectin)에 대한 연구는 1888년 Stillmark가 피마자 (Ricinus communis)의 추출물이 적혈구를 응집 (hemagglutinating activity)시킨다는 사실을 발견하면서부터 시작되었으며 그 후, 여러 식물과 동물에서 비슷한 성분이 발견되면서 이들을 렉틴이라 부르게 되었다(한국 등록특허 제10-0423117호 참조).

겨우살이에 존재하는 렉틴은 세 가지 아이소폼 (isoform)이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이 중 겨우살이 렉틴 (mistletoe lectin Ⅰ; MLⅠ)이 가장 많이 존재한다. MLⅠ은 분자량이 62 kDa으로 리보솜 불활성 단백질(RIP) 타입 Ⅱ에 해당하며 두 개의 폴리펩타이드가 이황화 결합으로 연결되어 있다. MLⅠ의 A-쇄 (A)는 28S 진핵 rRNA에 대한 N-글리코시다아제 활성을 가져서 세포독성을 나타내며, B-쇄(B)는 렉틴으로서 탄수화물 결합 성질을 나타낸다. 겨우살이로부터 렉틴을 분리하는 과정과 이의 이용에 대한 연구는 비교적 상당히 진척되어 있으나 [참고문헌: Stauder H, Kreuser ED. 2002, Mistletoe extracts standardised in terms of mistletoe lectins (ML I) in oncology: current state of clinical research, onkologie, 25(4):374-380], 시료 확보의 어려움으로 인해 대량 생산 및 이용에는 어려움이 있다.

유럽산 겨우살이 렉틴(European mistletoe lectin; EML)의 경우 그 유전자가 분리되었는데, 분리된 클론의 전체 유전자의 크기는 1,923개 염기로 되어있고, 열린 해독틀 (ORF) 는 1,695개 염기(564개 아미노산)였다. 상기 유전자는 99개 염기(33개 아미노산)의 리더 펩타이드 서열을 포함하며, 762개 염기 (254개 아미노산)의 A-쇄와 789개 염기(263개 아미노산)의 B-쇄가 48개 염기(16개 아미노산)의 링커로 연결되어 있는 유전자 구조를 가지는 것으로 알려져 있다 [참고문헌: Eck J, Langer M, Mockel B, Baur A, Rothe M, Zinke H, Lentzen H., 1999, Cloning of the mistletoe lectin gene and characterization of the recombinant A-chain, Eur J Biochem., 264(3):775-784]. 재조합 유전자를 이용한 미생물에서의 대량 생산 및 특성 연구 [참고문헌: Eck J, Langer M, Mockel B, Witthohn K, Zinke H, Lentzen H., 1999, Characterization of recombinant and plant-derived mistletoe lectin and their B-chains, Eur J Biochem., 265(2):788-797], 점돌연변이를 이용한 활성 구조 분석 [참고문헌: Langer M, Mockel B, Eck J, Zinke H, Lentzen H., 1999, Site-specific mutagenesis of mistletoe lectin: the role of RIP activity in apoptosis, Biochem Biophys Res Commun., 264(3):944-948], 재조합 EML의 항암 효과 [참고문헌: Elsasser-Beile U, Ruhnau T, Freudenberg N, Wetterauer U, Mengs U., 2001, Antitumoral effect of recombinant mistletoe lectin on chemically induced urinary bladder carcinogenesis in a rat model, Cancer, 91(5):998-1004], 결정화 구조 연구 [참고문헌: Niwa H, Tonevitsky AG, Agapov II, Saward S, Pfuller U, Palmer RA., 2003, Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexed with galactose, Eur J Biochem ., 270(13):2739-2749]가 현재 진행 중에 있다.

최근 유럽산 겨우살이와 한국산 겨우살이(Viscum album subsp. coloratum , Korean mistletoe)의 효능을 비교 측정한 결과, 한국산 겨우살이가 활성 물질을 더 많이 포함하고, 그 활성 또한 더 크다는 보고가 있었다. 겨우살이(Viscum album L.)는 현재 유럽에서 대체의학의 재료로서 오래전부터 사용되고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항암 및 면역증진 효과가 있는 것으로 보고된 겨우살이로부터 렉틴의 대량 생산에 필요한 유전자를 분리하고 이를 아그로박테리움을 이용하여 감자에 형질전환시켜서 재조합 렉틴을 대량 생산 능력을 가진 감자를 얻는 것이다.

본 발명은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가지는 한국산 겨우살이의 렉틴 단백질 및 서열번호: 2의 핵산 서열을 가지는 한국산 겨우살이의 렉틴 단백질의 유전자를 제공한다.

본 발명은 렉틴 유전자를 PCR을 이용하여 증폭하기 위기 위하여 순방향 PCR 프라이머(서열번호: 3) 및 역방향 PCR 프라이머(서열번호: 4)를 제공한다. 바람직하게는 PCR 프라이머는 유럽산 겨우살이 렉틴 유전자를 주형으로 하고, 보다 바람직하게는 한국산 렉틴 유전자를 주형으로 한다.

본 발명에 있어서, 유전자 증폭용 재조합 벡터는 감자를 포함하는 진핵 쌍엽식물체에서 유전자를 발현시키기 이전에 대장균과 같은 원핵세포에서 목적 유전자를 증폭시키기 위한 벡터를 의미한다.

본 발명은 한국산 겨우살이의 렉틴 단백질의 아미노산 서열(서열번호: 1)을 코딩하는 유전자 또는 한국산 겨우살이의 렉틴 단백질의 유전자(서열번호: 2)를 포함하는 유전자 증폭용 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자 증폭 용 재조합 벡터는 pGEM-T 벡터이다. 보다 바람직하게는 상기 벡터는 원핵세포, 특히 대장균에서 최대 복제수를 가지고 있는 벡터이다.

본 발명에 있어서, "식물 발현용 재조합 벡터"는 감자를 포함하는 진핵 쌍엽식물체에서 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 의미한다.

본 발명은 상기 유전자 증폭용 벡터에서 겨우살이 렉틴 단백질을 코딩하는 유전자를 이동시킨 진핵세포, 특히 식물세포에서 발현될 수 있는 식물 발현용 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 발현용 재조합 벡터는 pCAMBIA 3000이다.

본 발명은 유전자 증폭용 재조합 벡터 또는 식물 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 원핵 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는 상기 유전자 증폭용 재조합 벡터를 포함하는 세포는 대장균이다. 또한 바람직하게는 상기 식물 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 원핵 숙주 세포가 아그로박테리움 속이다. 보다 바람직하게는 상기 식물 발현용 재조합 벡터를 도입시킨 숙주는 아그로박테리움 투메파시엔스이다. 또한, 가장 바람직하게는 상기 식물 발현용 재조합 벡터를 도입시킨 숙주는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404이다. 바람직하게는 상기 형질전환된 원핵 숙주 세포는 한국산 겨우살이의 렉틴 단백질의 아미노산(서열번호: 1), 한국산 겨우살이의 렉틴 단백질의 유전자(서열번호: 2), 및 유럽산 겨우살이의 렉틴 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호: 5)를 포함한다.

본 발명에 있어서 "형질전환된 식물성 세포"라는 것은 형질전환된 식물 또는 임의의 기타의 유기체로부터 유래할 수 있는 유전자를 이의 게놈에서 통합시키거나 통합없이 안정적으로 발현하여 신규 형질이 발생하거나 본래 형질이 증폭된 식물 또는 식물성 세포를 의미한다. 본 발명은 형질전환된 식물성 세포로부터 형질전환된 식물을 재생시키는 것으로 이루어진다. 이러한 재생은 식물의 성질에 따라 적절한 임의의 방법에 의하여 얻는다. 또한, 본 발명은 이러한 형질전환된 식물로부터의 부분 및, 이러한 식물의 자손을 포함한다. 이러한 "식물의 부분"이라는 것은 지상의 또는 땅속에 존재하는 이들 식물의 임의의 기관을 의미한다. 지상의 기관이라는 것은 줄기, 잎 그리고, 암술 및 수술의 생식 기관을 포함하는 꽃 등이 있다. 지하 기관이라는 것은 주로 뿌리이지만, 이는 구근이 될 수 있다. 용어 "자손"이라는 것은 주로 이들 사이에서의 식물의 생식으로부터 발생한 배를 포함하는 종자를 의미한다. 광의로는, 용어 "자손"이라는 것은 1 이상의 부모가 본 발명에 의하여 형질전환된 식물인 교배로부터 생성된 각각의 새로운 세대로 형성된 모든 종자에도 적용된다. 또한, 자손은 전술한 형질전환된 식물의 식물 증식에 의하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 상기 식물성 세포는 캘러스 및 감자를 포함한다.

본 발명은 식물 발현용 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포에 의하여 형질전환된 식물성 세포를 제공한다. 바람직하게는 식물 발현용 재조합 벡터는 겨우살이의 렉틴 단백질의 아미노산 서열(서열번호: 1)을 코딩하는 유전자 또는 겨우살이 렉틴 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호: 2 또는 5)를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 발현용 재조합 벡터는 pCAMBIA 3000이다.

또한, 본 발명은 상기 식물성 세포의 추출 분말을 주 성분으로 하는 항암용 식품 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 식물성 세포는 감자이다. 보다 바람 직하게는 상기 식품 조성물은 형태가 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료 또는 죽이다.

본 발명에 의하여 형질전환된 식물 또는 상기 식물의 일부는 사람 또는 동물에게 공급하기 위한 식품 조성물에 직접 사용될 수 있거나 또는 혼입될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 "식물의 일부"라는 것은 지상의 또는 땅속에 존재하는 이들 식물의 임의의 기관을 의미한다. 지상의 기관이라는 것은 종자뿐 아니라, 줄기, 잎 그리고, 암술 및 수술의 생식 기관을 포함하는 꽃 등이 있다. 땅속 기관이라는 것은 주로 뿌리이지만, 이는 구근이 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 의하면, 종자는 식품을 위한 형질전환된 식물의 일부가 된다.

본 발명은 상기 식물성 세포로 부터 분리한 렉틴을 유효성분으로 하는 항염증 또는 항암용 약제 조성물로서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 형질전환 감자에서 분리한 상기 렉틴 단백질의 암세포에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여 인간 위장 세포주 중 하나인 AGS 세포주를 이용하여 암세포에 대한 세포 독성을 확인하였다(도 9).

또한, 본 발명은 본 발명에 의한 형질전환된 식물의 종자를 포함하며, 전술한 종자는 형질전환되지 않은 식물의 종자에 비하여 렉틴이 풍부하다.

본 발명은 한국산 겨우살이로부터 렉틴 합성에 필요한 유전자의 분리하여, 유용 작물 형질전환용 벡터제조한 후, 유전자 전환을 통한 재조합 한국산 겨우살이 렉틴을 생산하는 형질전환 작물를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 작물은 감자이다.

본 발명의 한 구체예에서, 겨우살이의 렉틴으로 형질전환된 감자를 생산하는 방법으로서,

1)강원도 고령지농업연구소에서 채취한 한국산 겨우살이의 전체 RNA와 게놈DNA를 추출하고 정제하는 단계;

2)정제한 상기 한국산 겨우살이의 전체 RNA와 게놈 DNA 를 유럽산 겨우살이 렉틴 유전자를 참고로 디자인한 프라이머를 반응시켜 RT-PCR 및 PCR 증폭을 실시하는 단계;

3)상기 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터에 삽입하여 구축한 재조합 벡터를 대장균에 도입시켜 제조한 양성의 균주로부터 재추출한 렉틴 유전자의 DNA 서열을 분석하고 기존의 보고된 한국산 겨우살이와의 상동성을 비교하여 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자를 획득하는 단계;

4)한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자의 작물로의 형질전환을 위하여 재조합 식물 형질전환용 벡터를 제작하는 단계;

5)상기 제작한 재조합 식물 형질전환용 벡터를 아그로박테리아에 삽입 후, 감자에 형질전환하고, 조직배양하여 형질전환 감자를 생산하는 단계;

6)생산된 형질전환 감자를 제초제 저항성 유전자와 PCR 기술과 웨서턴 블롯 기술을 이용하여 선발하고 검정하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 겨우살이의 렉틴 유전자를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 감자는 항암 효과를 가진 식품 조성물로 제공될 수 있고,형질전환된 식물을 이용한 신기능성물질의 대량생산의 방법과 농업적 이용을 위한 공정개발에 이용할 수 있을 것이다.

클로닝을 통한 형질 전환 식물체 개발을 통해서 대량으로 생산한 겨우살이 렉틴을 항염증제 또는 항암제 등의 신약 개발에 이용할 수 있으며, 구조 및 작용기작의 연구로 새로운 항균, 항염증, 항암 생물신소재를 만들 수 있다. 또한 유효성분이 확인 선발되면 독성에 관한 전임상 실험 및 임상시험을 통하여 유효성과 안전성이 입증된 후 의약품으로 개발될 것이다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1 : 한국산 겨우살이 렉틴의 유전자 분리

제 1 단계, 한국산 겨우살이의 전체 RNA 및 게놈 DNA 획득

시료는 고령지농업연구소에서 채취한 한국산 겨우살이의 잎과 줄기를 이용하였다. RNA 추출 방법은 요약하면 다음과 같다. 겨우살이 식물조직 0.5g을 액체질소에 급속 냉동시켜 파쇄한 뒤, 이지블루 (easy-BLUE^TM) 용액 1_ml (입수처: iNtRoN, Korea)을 처리하고 RNA의 순도 및 농도를 높이기 위해, 여기에 클로로포 름:이소아밀알콜(24:1) 및 이소프로필 알콜 침전을 수행하여 RNA를 얻고, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 옵티컬덴서티(Optical Density)를 측정하여 계산하였고, 순도는 0.8 % 아가로오스 겔(agarose gel)에 로딩하여 밴드의 양상을 분석하여 확인함으로써 농도와 순도를 측정했다. 이지블루 (easy-BLUE^TM)를 첨가하여 식물 조직을 막자와 막자 발을 이용하여 미세하게 파쇄한 후, 상온에서 10분간 반응 시킨 뒤, 클로로포름을 200㎕ 처리하고 원심분리하여 상층액을 e-tube에 옮긴 다음, DNase 처리 후 이소프로판올(isopropanol) 250㎕ 첨가하여 잘 섞어준 뒤, 상온에서 10분간 반응 시키고 나서, 원심분리 후 상층액은 제거하고 남은 RNA 펠렛에 30㎕의 DEPC 가 처리된 멸균수를 첨가하여 녹임으로써 [마머 (Marmur)의 방법], 게놈 DNA를 분리하였다.

제 2 단계, 상기 한국산 겨우살이 cDNA의 PCR 증폭 및 렉틴 유전자의 획득

유럽산 겨우살이 렉틴 유전자의 염기 서열 및 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 염기 서열을 바탕으로 하여 특이적 프라이머 (서열번호: 3 및 서열번호: 4)를 고안하고, 한국산 겨우살이로부터 추출한 전체 RNA를 시료로 하여 하기 설명한 RT-PCR을 수행하였으며, PCR 수행시의 실험적 오차를 줄이기 위해 반복적, 독립적으로 실험을 10회 수행하였다.

RT 조건 (reverstransciption)

: 37℃에서 1시간 반응 후, 70℃에서 15분 반응 시켜 역전사를 완료시키고, 이렇게 완료 된 cDNA를 가지고 PCR을 수행하였다.

PCR 조건 (Polymerse Chain Reaction)

: pre-denaturaion : 94℃, 5분

denaturaion : 94℃, 30초

annealing : 58℃, 30초

extension : 72℃, 1분

final extension : 72℃, 5분

cycle 수 : denaturation부터 extension 까지 30회 반복

그리고 나서, PCR 산물은 pGEM-T 이지 클로닝 벡터 시스템(Promega Co., USA)을 이용하여 제조사가 제공한 매뉴얼에 따라 클로닝 하였다. 클로닝한 유전자는 α-보상 시험을 통하여 재조합 유전자를 가지는 대장균 균주를 선발하였다.

α-보상 시험을 위해, kmla 유전자를 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector) (입수처: Promega) 1㎕에 16℃에서 1시간 반응으로 라이게이션 시킨 뒤, 이를 대장균(E. coli DH5α)에 형질전환 시켰다. 이렇게 형질전환된 세포를 플레이트에 도말(spreading)하기 전에 10mM IPTG (입수처: Duchefa) 34㎕와 20㎎/㎖ X-gal (입수처: Duchefa) 20㎕의 혼합물을 먼저 도말한 뒤, 세포를 플레이트에 도말했다. 그리고 대장균이 37℃에서 오버나잇 (overnight) 반응시켰다.

α-보상 시험 (complementation test)의 원리는 다음과 같다: Lac 오페론 (operon) 의 LacZ 유전자를 가진 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector)의 MCS (multiple cloning site)는 LacZ 유전자 내에 존재한다. 따라서 클로닝하여 벡터내로 삽입 될 유전자가 벡터로 삽입되게 되면 LacZ 유전자는 깨지게 되고, 반대로 벡터내로 삽입 될 유전자가 벡터로 삽입이 되지 않으면 LacZ 유전자는 깨지지 않고 기능을 하게 된다. LacZ 유전자는 락토오스 (lactose) 혹은 락토오스 유사체인 IPTG 존재하에 β-갈락토시다아제 (galactosidase)의 α-fragment를 합성하여 결국 β-갈락토시다아제가 활성을 가지게 해준다. α-보상 시험 시 IPTG 와 X-gal 을 넣어주게 되는데 α-fragment가 합성되어 즉 보상되어 β-갈락토시다아제가 활성을 띄게되면 X-gal 은 분해되어 브롬과 다른 화합물질로 나눠지게 되는데 이때 브롬은 푸른 색을 나타낸다. 즉 다시 말하면 목표 유전자가 벡터의 MCS 내로 삽입이 되어서 LacZ 유전자가 깨지게 되면 α-fragment가 합성되지 않아서 결국 β-갈락토시다아제가 활성을 띄지 못하게 되어 X-gal 이 분해되지 않아 흰색 콜로니가 나타나게 되고, 반대로 목표 유전자가 벡터 내로 삽입이 안 된 경우는 위의 과정과 반대로 되어서 X-gal 이 브롬으로 분해되게 되어 푸른색 콜로니가 나타나게 된다. 이를 블루/화이트 셀렉션 (blue/white selection) 이라고도 한다.

선발된 균주로부터 pH 변화를 이용한 알칼라인 플라스미드 미니 프렙 (alkine plasmid mini prep.) 방법을 이용하여 플라스미드를 분리하였다(LaboPass^TM 사의 키트(kit)-(LaboPass^TM mini plasmid DNA purification kit-250prep)를 사용하고 제조사가 권고하는 방법에 따라 수행하였다). 우선 세포막을 제거한 뒤, NaOH를 이용하여 pH를 높여 염색체 DNA(chromosomal DNA) 와 플라스미드 DNA (plasmid DNA)를 모두 변성시켰다. 그 후 아세테이트 (acetate) 를 이용하여 pH를 낮추게 되면 원형으로 된 플라스미드 DNA 는 재활성(renaturation)을 가지지만 크기가 크고 선형의 크로모조멀 DNA 는 재활성을 가지지 못하게 되는데 이를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 확인은 0.8 % 아가로오스 겔에서 전기영동하여 확인하였다. 이때 대조군으로 크기를 이미 알고 있는 플라스미드 DNA 를 함께 로딩하여 비교 분석하였다.

제 3 단계, 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자 DNA 서열 판독 및 기존에 밝혀진 한국산 겨우살이 렉틴 유전자와의 상동성 비교

클로닝한 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 염기서열을 ABI 377 유전자 분석기(ABI, USA)를 이용하여 결정하고, NCBI (National center for biological information)의 GenBank 및 BLAST, SWISS 플롯, 다중 서열 정렬 프로그램 등을 이용하여 유전자의 구조 및 다른 렉틴 유전자와의 상동성 등을 비교 분석하였다. 주요 도메인 및 주요 활성 부위에 대한 구조 분석을 수행하였다.

그 결과를 토대로 주요 도메인 및 주요 활성 부위에 대한 구조 분석을 수행하였다. 클로닝 된 각각의 유전자는 MLⅡ와 비교하여 약 92 %의 상동성을 나타내었다. 한국산 겨우살이 렉틴의 A-쇄 (747 bp)은 유럽산 겨우살이 렉틴의 A-쇄 (762 bp)와 비교하여 약 15 bp정도 작은 크기를 보였다. 한국산 겨우살이에서 클로닝한 A-쇄와 유럽산 겨우살이의 A-쇄의 아미노산 서열을 비교해보면 유럽산 겨우살이에서 관찰된 세포독성에 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기가 한국산 겨우살이에서도 관찰되었으며 (도 3 참조), 관찰된 아미노산 잔기는 다음과 같다.

76 번째 아미노산 잔기 - Y (Tyrosine)

115 번째 아미노산 잔기 - Y (Tyrosine)

165 번째 아미노산 잔기 - E (Glutamate)

168 번째 아미노산 잔기 - R (Arginine)

199 번째 아미노산 잔기 - W (Tryptophan)

203 번째 아미노산 잔기 - S (Serine)

실시예 2 : 한국산 겨우살이 렉틴의 재조합 식물 발현벡터 제작

상기 실시예 1에서 클로닝한 한국산 겨우살이 렉틴 유전자를 유용 식물체로 도입할 수 있는 벡터를 제작하였다. 감자에서 식용으로 사용되는 괴경 부위 뿐 만 아니라 식물체의 모든 부위에서 과발현을 유도하고자, CaMV 35S 프로모터를 이용한 겨우살이 렉틴 재조합 발현벡터를 제작하였다. 선발을 위해 항생제 선별마커로 카나마이신 (kanamycin) 저항성 유전자(nptⅡ) 및 제초제 저항성 유전자(bar)를 이용하였다. 우선, 식물 발현용 벡터인 pBI121 (입수처: Clontech) 로부터 GUS 유전자를 제한효소 BamHⅠ과 SacⅠ처리로 제거한 뒤 한국산 겨우살이 렉틴 유전자 (서열번호: 2)를 삽입하고 그 후, CaMV35S 프로모터부터 NOS 터미네이터 까지를 제한효소 SmaⅠ과 EcoRⅠ처리 후 이를 제초제 저항성 유전자 (bar, bar 유전자는 Streptomyces hygroscopicus로부터 클로닝되었음)를 가지는 식물 발현용 벡터인 pCAMBIA 3000 (입수처: CAMBIA, Australia)으로 옮겼다 (도 4).

실시예 3 : 재조합 한국산 겨우살이 렉틴을 생산하는 작물개발

제 1 단계, 재조합 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 작물 형질전환

농촌진흥연구소에서 분양받은 야생종 감자(수미)를 이용하였다. 감자의 전형성능을 이용하여, 계대배양을 통해 개체 수를 증가시켰다.

선행 연구를 통해 제작된 재조합 식물 형질전환용 벡터 (벡터명: pCAMBIA 3300/kmla, 입수처: CAMBIA, Australia)를 아그로박테리움 투메파시안스 LBA4404 (입수처: ATCC no.: 15955) 에 형질전환한 후, 이 재조합 플라스미드 DNA: pCAMBIA 3300/kmla를 추출하여 제한효소 (BamHⅠ, SacⅠ)를 이용해서 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 아그로박테리움 내 존재 여부를 전기영동을 통하여 확인하였다. 플라스미드 DNA를 제한효소(BamHⅠ, SacⅠ)를 처리한 결과 pCAMBIA 3300 벡터(9.6 kb)와 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자(0.7 kb)가 확인되어 앞선 연구를 통해 제작된 형질전환용 벡터가 아그로박테리움에 형질전환 되었음을 알 수 있었다 (도 2 참조).

상기 재조합 플라스미드 DNA가 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 감자에 형질전환시켰다. 이 과정을 요약하면 다음과 같다. 계대배양 후 4주가 된 개체 (감자)의 마디사이를 잘라 세포탁심 (cefotaxime)이 빠진 캘러스 유도 배지(배지 조성은 하기 참조)에 두어 하루 동안 명배양했다. 그 후, 선행 연구를 통해 제작된 재조합 식물 형질전환용 벡터가 들어있는 아그로박테리움을 마디사이로 형질전환 시켰다. 4일 뒤, 캘러스 유도 배지에 옮겨서 계속 명배양하며 캘러스 생성을 유도한 후, 3주 뒤에 캘러스를 잘라서 shooting 유도 배지 (배지 조성은 하기 참조)로 옮겨서 계속 명배양하며 줄기 발생을 유도했다. 약 2주 뒤 캘러스를 rooting 유도 배지 (배지 조성은 하기 참조)로 옮긴 후 뿌리 발생을 유도한 후, 개체의 성장 정도에 따라 2??3주 뒤에 순화과정을 거쳐 필드로 꺼내었다.

캘러스 유도 배지 조성: 1ℓ 기준

PCIM (Potato Callus Inducing Medium)

- 30g sucrose + Murasige Skoog(MS) 0.5g + 1㎎/ℓ NAA(Naphthalene acetic acid) 4㎎/ℓ + BA(benzyladenine) + 250㎎/ℓ Cefotaxime + 나머지 증류수

shooting 유도 배지 조성: 1ℓ 기준

- 30g sucrose + Murasige Skoog(MS) 0.5g + 5㎎/ℓ BA(benzyladenine) + 0.3㎎/ℓ GA₃(gibberellic acid) + 250㎎/ℓ Cefotaxime + 나머지 증류수

rooting 유도 배지 조성: 1ℓ 기준

- 30g sucrose + Murasige Skoog(MS) 0.5g + 250㎎/ℓ Cefotaxime + 나머지 증류수

제 2 단계, 형질전환 감자의 선발 및 검정

형질전환 감자를 DNA 수준에서의 검정을 위한 PCR 방법과 해당 유전자의 형질전환 식물내에서의 발현 유무의 확인을 통해서 선발하고 검정했다.

야생종의 게놈 DNA와 형질전환체의 게놈 DNA를 각각 분리해냈다. 전기영동을 통해서 분리된 각각의 게놈 DNA 밴드의 선명도를 파악하였다. 형질전환체의 DNA 수준에서의 검정을 위하여 PCR을 수행하였다.

PCR 조건은 다음과 같다:

pre-denaturaion : 94℃, 5분

denaturaion : 94℃, 30초

annealing : 58℃, 30초

extension : 72℃, 1분

final extension : 72℃, 5분

cycle 수 : denaturation부터 extension 까지 30회 반복

프라이머 정보

chain A-F

5'-GGA TCC ATG TAC GAG AGG CTA AGA CTC A-3' (서열번호: 6)

chain A-R

5'-GAG CTC TCA GTC CTC GCA TAC AAA CAA C-3' (서열번호: 7)

야생종 감자와 형질전환체 감자의 게놈 DNA를 각각 추출하여 전기영동을 수행한 후 가장 선명하게 보인 밴드의 샘플을 이용하였다. 그 결과 야생종에서는 밴드가 보이지 않았지만, 형질전환체 감자에서는 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자(0.7 kb)의 밴드를 확인할 수 있었다.

카나마이신을 이용한 1 차 선발과 PCR 분석을 통해 2 차 선발과정을 통과하여 유전자의 존재가 확인된 형질전환감자로부터 미정제 추출물과 마우스(입수처: (주)초원상사)로부터 추출된 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 통해 최종적으로 감자에 전달된 kmla 가 단백질을 발현하였다는 사실을 검증하였다.

형질전환감자로부터 미정제 추출물을 추출하는 방법

: 식물 조직 0.5g 을 액체 질소를 이용하여 미세하게 파쇄한 후, 1㎖ 의 식물 단백질 추출 버퍼(1xTBS(Tris-buffered saline), 5mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF(pretease inhibitor), 0.1% Triton X-100) 를 1㎖ 첨가한 뒤 막자와 막자 사 발로 다시 한번 더 조직을 파쇄한 다음. 원심분리한 후 상층액을 보관하였으며 이 상층액을 미정제 추출물로 사용하였다.

마우스로부터 항체를 추출하는 방법

: 항원 (KMLA 재조합 단백질)과 함께 항원과 동일 부피의 애쥬번트 (Complete Freud Adjuvant, Incomplete Freud Adjuvant: 면역증강제, 입수처: SIGMA)을 마우스에 주사하고 3일 뒤 혈액을 취하고 다시 7일 뒤에 항원을 주사하고 3일 뒤 에 혈액을 취하고 하는 것을 4회 반복했다. 취한 혈액은 2시간 상온에 두었다가 원심분리 후 상층액인 혈청만 보관하여 웨서턴 블롯에 항체로 사용하였다.

마지막으로 형질전환 감자로부터 단백질을 분리하여 암세포에 처리해 본 결과 농도 의존적으로 암세포에 대한 독성을 나타낸 것을 인간 위장 세포주 중 AGS 를 이용한 MTT 분석을 통해서 확인할 수 있었다.

MTT 분석을 위해, 한국산 겨우살이 렉틴 중 A-chain 유전자를 형질전환 시킨 형질전환 감자로부터 단백질을 분리해내고 이를 사람 위암 세포주 (human stomach cancer cell line)인 AGS 을 이용한 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphinyltetrazolium bromide) 어세이 (assay) 분석을 이용하여 암세포의 생존율을 비교하였다. 대조군으로는 단백질 분리시 사용한 식물 단백질 추출 완충액 (plant protein extraction buffer)를 사용하였다. 세포 독성은 MTT assay 를 사용하여 분석하였다 [참고문헌: Mosmann, T.,1983, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferatin and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65, 55-63]. 96-웰 세포 배양 플레이트에 5 x 10⁴의 세포를 도말 (plating)하고 37 ℃에서 24 시간 동안 CO₂ 인큐베이텨 (incubator)에서 배양했다. 96-웰 플레이트에 50 ㎕ MTT 용액 (stock concentration : 0.5 ㎎/㎖)를 첨가하여 4 시간동안 37 ℃에서 반응을 시켰다. 각 웰에 100 ㎕ DMSO (dimethyl sulfoxide)와 20 ㎕ Sorenson`s solution (0.1 M glycine, 0.1 M NaCl, pH 10.2)를 첨가하여 포르마잔 크리스탈 (formazan crystal)을 용해시켰다. 세포 내에서 MTT가 포르마잔 (formazan)으로 환원 (reduction)된 양을 540 nm의 흡광도를 이용하여 측정했다. 생존율은 물질을 처리하지 않은 세포의 흡광도 값의 백분율로 계산을 하며 세포 독성은 대조군과 생존 퍼센트 (per cent survival)의 차이로 나타내진다.

도 1은 형질전환 감자를 생산하기 위한 본 발명의 방법의 개요도이다.

도 2는 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자의 pGEM-T 이지 벡터에서 클로닝한 결과를 아가로오스 겔에서 분석한 결과이다.

도 3은 클로닝한 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자의 염기서열을 이미 알려진 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 염기서열과 상동성을 비교 분석한 결과이다.

도 4는 한국산 겨우살이 렉틴 기능성 도메인 유전자의 식물로의 형질전환을 위한 재조합 식물 발현용 벡터의 제작을 나타낸다. 식물 발현용 벡터인 pBI121 로부터 GUS 유전자를 제한효소 BamHⅠ과 SacⅠ처리로 제거한 뒤 한국산 겨우살이 렉틴 유전자를 삽입했다. 그 후, CaMV35S 프로모터부터 NOS 터미네이터 까지를 제한효소 SmaⅠ과 EcoRⅠ처리 후 이를 제초제 저항성 유전자를 가지는 식물 발현용 벡터인 pCAMBIA 3300 으로 옮겼다.

도 5는 식물 발현용 벡터 pCAMBIA 3300으로 한국산 겨우살이 렉틴 유전자의 삽입 여부를 아가로오스 겔에서 분석한 결과이다.

도 6은 아그로박테리아를 이용한 감자 형질전환 후 조직배양으로 형질전환 감자를 배양하는 단계를 나타낸다.

도 7은 PCR을 이용하여 형질전환 감자에서 해당 유전자의 존재 유무를 아가로오스 겔에서 분석한 결과이다.

도 8은 웨스턴 블롯을 이용하여 형질전환 감자에서 해당 유전자의 단백질로 의 안정적인 발현여부를 확인하였다.

도 9는 형질전환 감자에서 분리한 단백질이 본래의 기능인 암세포에 대한 독성 여부를 확인하기 위하여 인간 위장 세포주 중 하나인 AGS 세포주를 이용하여 암세포에 대한 세포 독성을 확인하였다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Transgenic potato with lectin gene and its producing method <130> IPM-34339 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 249 <212> PRT <213> Lectin protein of Viscum album coloratum <400> 1 Tyr Glu Arg Leu Arg Leu Arg Val Thr His Gln Thr Thr Gly Asp Gln 1 5 10 15 Tyr Phe Lys Phe Ile Thr Leu Leu Arg Asp His Val Ser Ser Gly Ser 20 25 30 Leu Ser Asn Gln Ile Pro Leu Leu Arg Gln Ser Thr Val Pro Val Ser 35 40 45 Asp Ser Gln Arg Phe Val Leu Val Glu Leu Thr Asn Gln Gly Gly Asp 50 55 60 Ser Ile Thr Ala Ala Ile Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Tyr 65 70 75 80 Gln Ala Gly Asn Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Arg Gly Ala 85 90 95 Glu Thr Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Thr Arg Ser Ser Leu Pro Phe Asn 100 105 110 Gly Ser Tyr Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Ala Gly His Arg Asp Gln Ile 115 120 125 Pro Leu Gly Ile Asp Gln Leu Ile Gln Ser Val Ser Ala Leu Arg Phe 130 135 140 Pro Gly Ser Asn Thr Arg Ala Gln Ala Arg Ser Phe Ile Ile Leu Ile 145 150 155 160 Gln Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Asn Pro Ile Leu Trp Arg Ala 165 170 175 Arg Gln Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Phe Leu Pro Asp Thr Tyr Ile 180 185 190 Leu Gln Leu Glu Thr Ser Trp Gly Gln Gln Ser Thr Gln Val Gln His 195 200 205 Ser Thr Asp Gly Val Phe Asn Asn Pro Ile Arg Leu Thr Ile Ser Thr 210 215 220 Gly Val Phe Val Thr Leu Ser Asn Val Arg Asp Val Ile Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Ile Met Leu Phe Val Cys Glu Asp 245 <210> 2 <211> 747 <212> DNA <213> lectin gene of Viscum album coloratum <400> 2 tacgagaggc taagactcag agttacgcat caaaccacgg gcgaccaata tttcaagttc 60 atcacgcttc tccgagatca tgtctcaagc ggaagcttgt ccaatcaaat accactcttg 120 cgtcagtcta ctgtccccgt ctcggattcg cagagatttg tgttggtgga actcaccaat 180 caggggggag actcgatcac ggcggccatc gacgttacca atctgtacgt ggtggcttac 240 caagcaggca accaatccta ctttttgcgc gacgcacctc gcggcgcgga aacgtatctc 300 ttcaccggca ccacccgatc ctctctccca ttcaacggaa gctaccctga tctggagcga 360 tacgccggac atagggacca gatccctctc ggtatagacc aactcattca atccgtctcg 420 gcccttcgtt ttccgggcag caacactcgt gcccaagctc gttcctttat tatcctcatt 480 cagatgatct ccgaggccgc cagattcaat cccatcttat ggagggctcg ccaatacatt 540 agcagtgggg ggtcatttct gccagacacg tacattctcc agctggagac gagttggggg 600 caacaatcca cgcaagtcca gcactcgacg gatggcgttt ttaataaccc aattcggttg 660 actatatcca ctggtgtctt cgtgacgttg agcaatgttc gcgacgtgat cgccagctta 720 gcgatcatgt tgtttgtatg cgaggac 747 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LecA-F <400> 3 atgaatgcgg ttatggactc aaga 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LecA-R <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> g or c <220> <221> misc_feature <222> (4) <223> t or c <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> t or c <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> t or c <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> a or c <400> 4 stcyyygcat acaaacamca tgat 24 <210> 5 <211> 762 <212> DNA <213> lectin gene of Viscum album Loranthaceae <400> 5 tacgagaggc taagactcag agttacgcat caaaccacgg gcgacgaata tttccggttc 60 atcacgcttc tccgagatta tgtctcaagc ggaagctttt ccaatgagat accactcttg 120 cgtcagtcta cgatccccgt ctcggatgcg caaagatttg tcttggtgga gctcaccaat 180 caggggggag actcgatcac ggccgccatc gacgttacca atctgtacgt ggtggcttac 240 caagcaggcg accaatccta ctttttgcgc gacgcacctg acggcgcgga aaggcatctc 300 ttcaccggca ccaccagatc ctctctccca ttcaccggaa gctacacaga tctggagcga 360 tacgccggtc atagggacca gatccctctg ggtatagagg aactcattca atcggtctcg 420 gcgcttcgtt atccaggcgg cagcacccgg gcccaagctc gttctattat agtcctcatt 480 cagatgatct ccgaggcggc cagattcaat cccatctttt ggagggttcg ccaagacatt 540 aacagtgggg agtcatttct tccagacatg tacatgctgg agctggagac gagttggggc 600 caacaatcca cgcaagtcca gcagtctacg tatggcgttt ttaataaccc atttcggttg 660 gctatatcca ccggtaactt cgtgacgttg agcaacgttc gcgacgtgat cgccagctta 720 gcgatcatgt tgtttgtatg ccgggaccgg ccatcttcct cc 762 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chain A-F <400> 6 ggatccatgt acgagaggct aagactca 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chain A-R <400> 7 gagctctcag tcctcgcata caaacaac 28

Claims (3)

1. 한국산 겨우살이 렉틴 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 유전자가 작동적으로 삽입되어 도 4의 구조를 갖는 재조합 식물발현벡터.
2. 제 1항의 재조합 식물발현벡터로 형질전환된 감자.
3. 제 1항의 재조합 식물발현벡터로부터 발현된 한국산 겨우살이 렉틴 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암 조성물.

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