KR20090033752A - 인돌-사이아졸린을 포함하는 신규한 베타-세크리타제저해용 화합물 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 베타 세크리타제(beta-secretase)의 활성을 저해하는 신규 화합물, 약제적으로 허용되는 그의 염 또는 이성질체, 그것의 제조방법, 및 그것을 약리학적 유효량으로 함유하는 약제 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(노인성 치매)은 나이가 들면서 점진적으로 진행되는 신경질환으로서 전체 치매환자의 약 50-70%에 이르는 질병이다. 주된 증세로는 기억력 감퇴와 인지 기능의 상실 등으로 나타나며, 통계적으로 볼 때 대부분이 약 65세를 전, 후하여 발병하며 약 9년 정도의 진행 이후에 사망하는 것으로 나타난다. 사회가 점점 발전하여 노령화 되어갈수록 알츠하이머 질환을 겪는 환자 수가 증가되고 있는 바, 향후 10년 이내에 미국 내에서만 약 600만 명의 환자가 나타나며 이는 시간이 갈수록 점점 더 증가할 것으로 추정된다.
우리 사회 또한 노인 연령층이 증가하고 있는 추세이며 특히 노인성 치매 환 자로 인해 야기되는 사회적 문제 또한 심각하게 대두되고 있다. 그러나, 현재까지 알츠하이머 질환의 근본적인 발병원인을 치료할 수 있는 치료제는 개발되어 있지 않으며, 일반적인 치료제로서 사용가능한 것으로는 아세틸콜린 에스테라제 저해제가 유일한 실정이다. 그 예로서, Pfizer의 AriceptTM, Norvatis의 ExelonTM, 및 Janssen의 ReminylTM 정도가 그 대표적인 치료제로 통용되고 있다.
이러한 아세틸콜린 에스테라제 저해제의 경우는 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인을 치료하지는 못하며, 단지 일부 환자의 경우(약 40-50%)에서 일시적인 증세 완화의 효과를 나타낼 뿐이고, 그 약효가 오래 지속되지 못하므로 엄밀한 의미에서의 치료제로서 정의하기는 어렵다. 또한 질환의 특성상 장기 복용을 요하게 되는데, 상기 의약품들의 경우, 간 독성을 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 것 또한 문제점으로 드러나고 있다.
따라서, 질환의 진행 과정을 막아 줄 수 있는 치료제의 개발이 시급한 과제가 되고 있다. 알츠하이머 질환을 일으키는 원인을 찾기 위한 한 방편으로서, 유전성 초기 발병(early on-set) 알츠하이머 질환 환자들에 대한 연구가 오랫동안 진행되어 왔는데, 그 결과로서 몇몇 유전자에서의 돌연변이가 그 주된 발병 원인으로 밝혀졌다.
상기 유전적 발병 요인들의 공통적인 생리학적 결과로서 42 개의 아미노산으로 구성된 베타 아밀로이드(이하, 때때로 'Ab 42'로 약칭함)의 생성량이 증가됨이 밝혀짐으로써, Ab 42의 생성이 알츠하이머 질환 발병의 주요 병인(causative agent)으로서 추정되게 되었다. 따라서, 상기 Ab 42의 생성량을 감소시킬 수 있는 방법이 개발될 경우, 알츠하이머 질환의 발병 기작 자체를 차단할 수 있는 가장 직접적이고도 효과적인 치료제가 될 것으로 전망되고 있다.
베타 아밀로이드 단백질들은 신경세포 내에서 만들어지는 Amyloid Precursor Protein (APP)이라는 큰 분자량의 전구체로부터 3 가지의 단백질 분해 효소(secretase)들에 의한 일련의 절단 과정을 거쳐서 만들어지게 된다. 이 과정은 신경세포의 세포질 내에 있는 Golgi(또는 Endosome)이라는 막 운반자(membrane vesicle) 내에서 이루어지는 과정이며, 상기 APP와 그 단백 분해 효소들인 세크리타제들은 그 막(membrane)에 위치해서 작용한다. 베타 아밀로이드(Ab)의 N-말단은 APP의 C-말단으로부터 99개째 아미노산에 해당되며, 이 부위가 베타 세크리타제(beta-secretase, 이하, 때때로 'BACE' (beta-site APP Cleaving Enzyme)로 약칭함)에 의해서 절단되며, 막 내에 위치하는 베타 아밀로이드(Ab)의 C-말단이 감마 세크리타제(gamma-secretase)에 의해 절단됨으로써 베타 아밀로이드(Ab) 단백질이 만들어지고, 이어서 신경세포 밖으로 분비된다. APP 전구체는, 이와는 별도의 경로를 통해 전혀 다른 위치에서 절단될 수도 있는데, 알파 세크리타제(alpha-secretase)에 의해서Ab의 중간 부위(N-말단으로부터 16 번째와 17 번째 아미노산 사이)가 절단되면 큰 분자량의 sAPPa가 만들어져서 분비되며, 더 이상의 베타 아밀로이드가 만들어지지 않게 된다.
상기 BACE와 감마 세크리타제에 의해 다양한 길이의 베타 아밀로이드(Ab) 단백질이 만들어지는데, 아미노산 40 개짜리(Ab 40)와 아미노산 42 개짜리(Ab 42)가 그 주종을 이룬다. Ab 42의 경우, Ab 40와는 달리, 좀 더 쉽게 응집되는 경향을 보이며, 환자의 뇌 속에 축적될 경우 amyloid plaque의 형성을 촉진하게 되고, 이는 그 주변 부위의 신경세포가 서서히 괴사하게 만드는 데, 이것이 알츠하이머 질환의 주된 발병 기작으로서 추정되고 있다.
Ab 40과 Ab 42는 정상적인 환경에서는 약 9:1 정도의 비율로 만들어진다. 그러나, 전체적으로 두 유형의 아밀로이드 단백질의 합성량이 증가하거나 앞서 언급한 Presenilin 1&2 유전자의 돌연변이에 의해서 Ab 42의 합성이 선택적으로 증가하게 되면, 알츠하이머 질환의 발병이 더욱 촉진되며, 그 증세 또한 심각하게 나타나는 것으로 알려져 있다. 따라서, Ab 42의 합성을 감소시키는 것이 알츠하이머 치료제 개발의 가장 중요한 부분이라고 할 수 있으며, 이를 위해서는 베타 또는 감마 세크리타제 저해제의 개발이 필요하다.
이에, 많은 다국적 제약회사들이 이 분야에 대한 연구개발에 막대한 투자를 하고 있으며, 특히 알츠하이머 질환의 근본적인 발병원인으로 추정되고 있는 42개의 아미노산으로 구성된 베타아밀로이드의 생성량을 감소시키는 베타 또는 감마 시크리테아제 저해제의 개발이 그 주종을 이루고 있다. 그러나, 세계적으로도 베타아밀로이드의 생성 기작 자체를 억제함으로써 질환의 진행 자체를 막을 수 있는 치료제의 개발 관점에서 볼 때, 아직까지 주목할만한 연구 성과를 보이고 있는 곳이 없는 실정이다.
한편, 베타와 감마 세크리타제는 둘 다 aspartic protease로 알려져 있으며 막에 부착된 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 감마 세크리타제 저해 제의 경우, 아직까지 그 유전자가 규명 되어 있지는 않다. 또한, 그 기질이 APP 전구 단백질에 한정되어 있지 않고, 분화 과정 중 cell- fate decision에 대단히 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 Notch 단백질의 절단 과정에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 감마 세크리타제 유전자 자체를 제거한 형질전환 동물이 태 내에서 사망하는 것으로 나타났을 뿐만 아니라, 최근 감마 세크리타제 저해제의 임상 실험 결과에서도 상당한 독성을 수반함으로써 그 전망이 불투명한 실정이다. 따라서, 감마 세크리타제 저해제가 알츠하이머 질환에 대한 안전한 치료제로 개발 가능한지에 대해서는 아직도 많은 부분이 입증되지 않고 있다.
반면에, BACE의 경우, 여러 제약회사가 다양한 방법을 통해 그 유전자를 규명했으며, 실제 생체 내에서 베타 세크리타제로서의 활성을 나타내는 것을 1999년도에 발표된 바 있다. 또한, 그 X-ray 결정구조가 밝혀졌으며, 이에 대한 높은 친화도의 펩티드 저해제 또한 잘 알려져 있다. 특히 유전자 결핍 형질 전환 동물이 전혀 이상이 없는 정상적인 형질을 나타냄으로써, BACE 특이 저해제가 좀 더 안전하고도 효율적인 치매 치료제로서의 개발이 가능함을 시사 해 준 바 있다. 따라서, 감마 세크리타제와 비교할 때, BACE가 좀 더 유망한 타겟이라 할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 기존의 상용 가능한 약제들은 단지 증세를 완화시키는 정도의 효과에 그칠 뿐이고, 실제 질환 자체의 진행과정에는 아무런 효과가 없음을 감안할 때, BACE 특이 저해제의 개발은 알츠하이머 질환에 대한 새로운 개념의 획기적인 신약 개발이 될 것임에는 의심의 여지가 없다. 더불어, BACE 저해제의 경우는 상대적으로 최근에 연구가 시작되었으므로, 아직까지는 펩티드 변형체 이외에 완전한 small molecule chemical compound가 발표되지 않고 있는 실정이므로, 새로운 세계적인 신약 개발의 좋은 기회가 될 것으로 사료된다.
최근 들어, BACE 저해제로서, Merck (WO2006078577, WO2006060109, Wo2006057983), Ellan (WO2004022523, WO2005095326), Schering-Plaugh (WO2006014762, WO2006014944), BMS (WO2005182105, WO2005030758), Eli-Lilly (WO2005108358, WO2006034093) 등의 회사에서 활발한 연구 결과를 발표하였다. 하지만, 상당수의 화합물들이 펩타이드성 화합물로서 경구 가능성과 대 뇌 투과도가 낮아서 실제 동물 모델에서의 효능은 약한 것으로 알려 져 있다. 최근 Eli-Lilly 에서 저 분자성 펩타이드형태의 화합물을 통해 동물실험에서 효능을 보이는 것으로 보고하고 있으나, 투여경로가 경구가 아닌, S.C. 이고, Cat.D에 대한 선택성이나 경구 가능성을 고려해 보면, 상당한 제약성이 있어 보인다.
반면, 최근 들어, Johnson & Johnson (WO2007050612, WO2007058583, WO2006024932) 및 Wyeth (WO2007072925, WO2007016012, WO2006076284) 등에서 발표한 자료를 보면, 기존의 펩타이드 형태를 벗어난, 비 펩타이드성 화합물들이 보고 되고 있고, 경구 가능성과 대뇌 투과도가 양호한 것으로 알려져 있다.
따라서, 기존의 펩타이드성 화합물을 벗어난, 비 펩타이드성 화합물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 본 연구 역시 비 펩타이드성 화합물로서 BACE 효소에 대한 활성이 우수한 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 연구화합물들은 대뇌 투과도가 경구 투여를 통해 우수한 것이다.
본 발명은 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 목적은 베타 세크리타제의 저해 효능을 갖는 신규한 화합물, 약제적으로 허용되는 그의 염 또는 이성질체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이러한 신규 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 활성 성분으로서 상기 화합물을 약리학적 유효량으로 포함하는 베타-세크리타제의 활성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 기타 목적은 이러한 신규 화합물을 활성성분으로 사용하여, 인지 기능 개선 또는 알츠하이머 병 등과 같은 신경 변성 질환을 치료 내지 예방을 위한 용도를 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체를 제공한다.
상기 식에서,
n은 0~3이고;
W는 직접 결합이거나, 또는 N 또는 O를 선택적으로 1~2개 포함하거나 옥소 그룹을 포함하는 4~8원 환이며;
X 및 X'는 각각 독립적으로 직접 결합이거나, -NR-, -O-, -(CH2)m-C(O)-, -NR-C(O)-, -C(O)-(CH2)m- 및 -(CH2)m-C(O)NR- 로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 m은 0~2이고, R은 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;
Y 및 Z는 각각 독립적으로 N, S, 또는 O이고;
R1은 수소, -NH2, -(CH2)p-R5, -O-(CH2)p-R5, -C(O)-(CH2)p-R5, -N(H)-(CH2)p-R5, 및 -N[(CH2)p-R5][(CH2)p-R5']로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, p는 0~4이고, R5 및 R5'는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;
R2는 수소, 할로겐, 알킬, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고;
R3는 직접 결합이거나, 수소 또는 -(CH2)q-R6로 이루어진 군에서 선택되며, 여 기서, q은 0~3이고, R6은 수소, 아미노, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 알킬-아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 알킬-헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;
R4는 수소, -(CH2)r-R7, -(CH2)r-O-R7 알콕시 및 -(CH2)r-N-R7로 이루어진 군에서 선택되고, 여기서, r은 0~2이고, R7은 수소, 아미노, 히드록시, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 알킬 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;
상기에서, 알킬, 알콕시, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 치환 또는 비치환 구조일 수 있으며, 치환된 경우, 치환체는 히드록시, 할로겐, 니트릴, 아미노, C1-C4 알킬 아미노, C1-C4 디알킬아미노, C1-C4 알킬, C1-C4 알킬 알콕시, 아릴 알콕시 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상이고,
상기 헤테로아릴 및 헤테로사이클은 각각 독립적으로, N, O 및 S로 구성된 군에서 선택된 1~3개의 헤테로 원자를 포함하며, 0~3 개의 이중결합을 포함하는 4~8원 환이다.
본 발명에 따른 상기 화학식 I의 화합물은 기존에 알려져 있는 술폰아미드계 또는 펩타이드계 화합물 등의 베타 세크리타제 저해제와는 전혀 상이한 구조를 가지며, 이하의 실험예 등에서도 볼 수 있는 바와 같이, 인지 기능 개선 또는 알츠하이머병 등과 같은 신경 변성 질환의 예방 및 치료에 관계되는 인간 베타 세크리타제에 대해 우수한 저해 효과를 발휘한다.
이하에서 편의상 다르게 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물은 화학식 1의 화합물, 그의 약제적으로 허용되는 염 또는 이성질체를 모두 지칭한다.
본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 치환기에 대한 정의에서, 용어 '알킬'은 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 알킬 부위는 어떠한 알켄이나 알킨 부위를 포함하고 있지 않음을 의미하는 "포화 알킬(saturated alkyl)" 그룹일 수 있다. 알킬 부위는 적어도 하나의 알켄 또는 알킨 부위를 포함하고 있는 있음을 의미하는 "불포화 알킬(unsaturated alkyl)" 부위일 수도 있다. "알켄(alkene)" 부위는 적어도 두 개의 탄소원자가 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합으로 이루어진 그룹을 의미하며, "알킨(alkyne)" 부위는 적어도 두 개의 탄소원자가 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합으로 이루어진 그룹을 의미한다. 포화이든 불포화이든 간에 알킬 부위는 분지형, 직쇄형 또는 환형일 수 있다.
알킬 그룹은 1 내지 20 개의 탄소원자를 가질 수 있다. 알킬 그룹은 1 내지 10 개의 탄소원자들을 가지는 중간 크기의 알킬일 수도 있다. 알킬 그룹은 1 내지 6 개의 탄소원자들을 가지는 저급 알킬일 수도 있다. 예를 들어, C1-C4 알킬은 알킬쇄에 1 개에서 4 개의 탄소원자, 즉, 알킬쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어진 군에서 선택됨을 나타낸다. 또한, 단독으로 또는 알킬옥시와 같이 조합하여 사용되는 경우에 각각 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미한다.
전형적인 알킬 그룹에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
용어 '알콕시'는 1 내지 10 개의 탄소원자를 가지는 옥소 알킬을 의미한다.
용어 '시클로알킬'은 시클로헥실을 포함한 불포화 지방족 3~10원 환을 의미한다.
용어 '아릴(aryl)'은 공유 파이 전자계를 가지고 있는 적어도 하나의 링을 가지고 있고 카르보시클릭 아릴(예를 들어, 페닐)과 헤테로시클릭 아릴기(예를 들어, 피리딘)를 포함하는 아릴 그룹을 의미한다. 이 용어는 모노시클릭 또는 융합 링 폴리시클릭(즉, 탄소원자들의 인접한 쌍들을 나눠 가지는 링들) 그룹들을 포함한다. 페닐, 나프틸 등을 포함하는 4~10원, 바람직하게는 6~10원 방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭환 그룹을 의미한다.
용어 '헤테로아릴'은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3 개의 헤테로 원자를 포함하고, 벤조 또는 C3-C8 시클로알킬과 융합될 수 있는 방향족 4~8원 환, 바람직하게는 5~6원 환을 의미한다. 모노사이클릭 헤테로아릴의 예로는 티아졸, 옥사졸, 티오펜, 퓨란, 피롤, 이미다졸, 이소옥사졸, 피라졸, 트리아졸, 티아디아졸, 테트라졸, 옥사디아졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다. 비사이클릭 헤테로아릴의 예로는 인돌, 인돌린, 벤조티오펜, 벤조퓨란, 벤즈이미다졸, 벤족사졸, 벤즈이속사졸, 벤즈티아졸, 벤즈티아디아졸, 벤즈트리아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퓨린, 퓨로피리딘 및 이와 유사한 그룹을 들 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 '헤테로사이클'은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로 원자를 포함하며, 벤조 또는 C3-C8 시클로알킬과 융합될 수 있고, 포화되거나 1 또는 2 개의 이중결합을 포함하는 3~10원 환, 바람직하게는 4~8원 환, 더욱 바람직하게는 5~6원 환을 의미하고, 그 예로는 퓨란, 티오펜, 피롤, 피롤린, 피롤리딘, 옥사졸, 티아졸, 이미다졸, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 피라졸, 피라졸린, 피라졸리딘, 이소티아졸, 트리아졸, 티아디아졸, 피란, 피리딘, 피페리딘, 모폴린, 티오모폴린, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 피페라진, 트리아진, 하이드로퓨란 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
기타 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물에서, 상기 W는 바람직하게는 직접 결합이거나, 또는 N 원자를 1 또는 2개 포함하거나 옥소를 포함하는 5~6원 환이다. 하나의 바람직한 예에서, 상기 W-X'-R3는 하기 화학식 (i) 내지 (iii)의 헤테로사이클 중 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 W는 바람직하게는 피롤리딘, 피페라진, 피페리딘, 및 몰포린으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 R1은 바람직하게는, 수소, -O-(CH2)p-R5, -N(H)-(CH2)p-R5 및 -N[(CH2)p-R5][(CH2)p-R5]로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 p은 0~4이고, R5는 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기에서, 헤테로아릴 및 헤테로사이클은 각각 독립적으로 1 또는 2 개의 이중결합을 포함하는 5~6원 환일 수 있다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 R1은 수소, 아미노, 알킬아미노, 디알킬 아미노, 시클로알킬 아미노, 헤테로사이클 아미노, 아릴 아미노, 알콕시, 헤테로사이클, 시클로알킬-알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 아미노, 알킬아미노, 디알킬 아미노, 시클로알킬 아미노, 헤테로사이클 아미노 및 알릴옥시로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특히 바람직하게는, R1은 아미노, 시클로펜틸 아미노, 테트라하이드로퓨라닐 아미노, 페녹시, 디이소펜틸아미노, 및 시클로펜틸메틸옥시로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 R2는 바람직하게는 수소, 할로겐, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 및 아릴옥시 로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
하나의 바람직한 예에서, R2는 수소, Cl, F, 메틸, 메톡시 및 페녹시로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 X 및 X'는 각각 독립적이며, 바람직하게는 직접 결합이거나, 또는 -NR-, -(CH2)m-C(O)-, -NRC(O)- 및 -(CH2)m-C(O)NR-로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 X 및 X'는 각각 독립적으로 직접 결합이거나, 또는 -NH-, -C(O)-, -CH2-C(O)-, -C(O)NH- 및 -(CH2)2-C(O)NH-로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 R3는 바람직하게는 수소, 히드록시, 아미노, 알킬, 알콕시, -(CH2)q-아릴, -(CH2)q-헤테로사이클 및 -(CH2)q-헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 여기서 q은 0~3을 나타내며, 더욱 바람직하게는, 수소, 히드록시, 아미노, 알킬, 알콕시, 페닐, 벤질, 헤테로아릴 및 C1-C3 알킬-헤테로시클로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 여기서, 알킬, 페닐, 벤질, 헤테로아릴 및 헤테로사이클은 치환 또는 비치환 구조일 수 있으며, 치환된 경우 치환체는 히드록시, 할로겐, 아미노, 알킬 아미노, 디알킬 아미노 및 알킬로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 R3는 수소, 히드록시, 아미노, 디메틸아미노, 아세틸아미노, 메틸, 히드록시메틸, 아세틸, 히드록시아세틸, 페닐, 벤질, 2-플루오로페닐, 4-플루오로페닐, 피리딘-2-일, 테트라하이드로퓨란, 2-(몰포린-1-일)에틸, 및 (3-디메틸아미노)벤질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 R4는 바람직하게는 수소, 알킬, 아릴, 알콕시, 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수소일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 상기 '약제학적으로 허용되는 염'은 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산과의 염, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염이 포함된다. 이들 산 부가염들은, 상기 화학식 I의 구조를 바탕으로, 공지기술에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 수화물 또는 용매화물의 형태로 존재할 수도 있다.
상기 '이성질체(isomer)'는, 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물들은 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로, 광학 이성질 체(R 또는 S 이성질체), 라세미체, 부분 입체 이성질체 혼합물, 개개 부분 입체 이성질체 등으로 존재할 수 있으며, 이중결합을 가지는 경우, 기하 이성질체(트랜스, 시스형 이성질체)도 존재할 수 있다. 이들 모든 이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
이하에서 별도의 설명이 없는 한, 화학식 I의 화합물에는, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 및 이성질체가 포함되며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 설명의 편의를 위하여, 본 명세서에서 화학식 I의 화합물로 간단히 표현한다.
본 발명에 따른 화학식 I의 대표적인 화합물에는 R4가 수소인 하기 표 1에 나타난 바와 같은 화합물이 포함된다.
[표 1]
또 다른 바람직한 예에서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물일 수 있다.
본 발명의 따른 화학식 1의 더욱 바람직한 화합물로는 하기 화합물들을 들 수 있다.
(S)-2-[4-(히드록시에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(R)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피페라진-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-벤질-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-(4-플루오로페닐)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-(2-플루오로페닐)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-(피리딘-2-일)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린- 2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-(하이드록시아세틸)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(R)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-(테트라하이드로퓨란-4-일)아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(S)-3-(3-디메틸아미노)벤질아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피페라진-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7- 시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(S)-3-(3-디메틸아미노)벤질아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(S)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(R)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(S)-3-아세틸아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(S)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[(R)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]- 5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-메틸)티아졸-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(R)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-플루오로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-메톡시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-메틸-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
(S)-2-[4-(1-아세틸-피롤리딘-4-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-메틸-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
본 발명은 또한, 상기 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것으로서, 하기 화학식 1의 화합물은 반응식 1과 같은 방법으로 화학식 2의 화합물로부터 알킬화 반응을 통하여 합성할 수 있다.
[반응식 1]
상기 반응식에서 A는 할로겐 또는 트리메탄술폰닐을 나타내고, Y, R1, R2, R3 및 R4는 앞서 정의된 바와 같다.
화학식 2와 같은 인돌-티아졸린 화합물은 화학식 4의 인돌산과 화학식 5의 티아졸 유도체를 고리화시켜 합성할 수 있다
[반응식 2]
즉, 화학식 4와 같은 인돌산과 화학식 5와 같은 아민 화합물을 아미드화 반응으로 연결하고 산 조건하에서 가열하면, 화학식 6과 같은 티아졸린 화합물을 얻을 수 있다. 그런 다음, 에스테르 그룹을 환원시켜 알코올로 변환한 후, 트리페닐 포스핀, 이미다졸 등을 이용하여 요오드화 반응을 수행하면, 화학식 2'과 같은 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 4와 같은 인돌산은, 피셔 인돌 합성법을 통해서, 하기 반응식 3과 같은 방법으로 합성할 수 있다.
[반응식 3]
화학식 7과 같은 아닐린을 NaNO2로 니트로소화 시킨 후 Pd/C로 환원시키면 화학식 8과 같은 이드라진 화합물을 얻을 수 있고, 다시 케토에스테르와 반응하여 화학식 9와 같은 이민 화합물을 얻을 수 있다. 화학식 10과 같은 인돌 화합물은 화학식 9와 같은 이민 화합물로부터 산 조건하에 피셔 인돌 합성법을 이용하여 합성할 수 있으며, 합성된 인돌의 NO2 그룹을 아민으로 바꾸고 환원성 아미노화 반응과 가수 분해를 행하면, 화학식 4'과 같은 인돌산 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 7과 같은 니트로 아닐린 화합물은 상업적으로 구입 가능하거나 하기 반응식 4와 같은 방법으로 합성할 수 있다.
[반응식 4]
화학식 5와 같은 아민 화합물은 반응식 5와 같은 방법으로 합성할 수 있다. [반응식 5]
상업적으로 구입 가능한 화학식 13과 같은 화합물을 이소프로판올로 에스테르화 시키고, NaBH4로 환원 반응을 수행하면, 화학식 15와 같은 알코올을 합성할 수 있다. 이 알코올을 다시 메탄 술폰닐 그룹으로 바꾸고, 벤질 티아졸을 연결하고 BOC 그룹을 탈 보호화 하면, 화학식 5와 같은 아민 화합물을 합성할 수 있다.
상기 반응은 바람직하게는 반응에 악영향을 끼치지 않는 통상적인 용매 중에 서 수행될 수 있으며, 특히 바람직하게는, DMF, 디메틸아세트아미드, 테트라하이드로 퓨란, 메틸린 클로라이드, 디클로로에탄, 메탄올, 및 물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용할 수 있으나, 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
또한, 커플링 반응에 사용될 수 있는 커플링제로는 공지의 커플링제를 사용할 수 있는 바, 예를 들어, 디시클로헥실카보디이미드(DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드(EDC), 1,1'-디카보닐디이미다졸(CDI) 등의 카보이미드류를 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 또는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAT)과 혼합된 상태로 사용하거나, 비스-(2-옥소-3-옥사졸리디닐)-포스핀산 클로라이드(BOP-Cl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), N-[디메틸아미노-1H-1,2,3-트리아졸[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄(HATU) 등을 들 수 있으나, 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
일반적인 혼합물의 분리는 칼럼 크로마토그래피를 사용하고, 최종 화합물의 경우 재결정이나 노말 또는 리버스 상태의 HPLC(Waters, Delta Pack, 300x50 mmI.D., C18 5㎛, 100A)를 통해 분리할 수 있다. 재결정이나 HPLC를 통해 정제하는 경우, 트리플루오로아세트산염의 형태로 화합물을 얻을 수 있으며, 염산염을 얻고자 하는 경우에는 이온교환 수지를 이용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 반응이 완결된 후에 생성물은 통상적인 후처리 방법, 예를 들어, 크로마토그래피, 재결정화 등의 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명은 또한, 활성 성분으로서 약리학적 유효량의 상기 화학식 I의 화합 물, 약제적으로 허용되는 그의 염 또는 이성질체 및 약제적으로 허용되는 담체를 포함하는 베타 세크리타제 저해용 약제 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 조성물에는 경우에 따라 희석제, 또는 부형제가 추가적으로 포함될 수 있다.
상기 화학식 I의 화합물은 베타 세크리타제에 대한 저해 효과가 우수하므로, 이를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 베타 세크리타제 저해제의 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 인지 기능 개선 또는 신경 변성 질환을 치료 내지 예방에 우수한 효과를 나타내고, 특히 알츠하이머병의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타내지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 '약제 조성물(pharmaceutical composition)'은 본 발명의 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다. 약제 조성물은 생물체내로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 약제 조성물은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.
용어 '약리학적 유효량(therapeutically effective amount)'은 투여되는 화합물의 양이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키는 효과; (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키거나 어느 정도 느리게 하는 효과; 및/또는 (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바 람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 양을 의미한다.
용어 '담체(carrier)'는 세포 또는 조직내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 '희석제(diluent)'는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
용어 '약리학적으로 허용되는(physiologically acceptable)'은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제로 정의된다.
여기에 사용된 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제 조성물로서 투여될 수 있다. 본 응용에서의 화합물의 제형 및 투여에 관한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990에서 확인할 수 있다.
a)
투여 경로
본 발명의 화합물은 목적하는 바에 따라 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 주사, 경구 및 비강 투여가 바람직하나, 피부, 복강, 후강 및 직장을 통하여 투여할 수도 있다.
b)
조성물/제형
본 발명의 약제 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 약제 조성물은, 약제학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
주사용 제제는, 예를 들어 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 적합한 분산제, 습윤제, 또는 현탁제를 사용하여 제조할 수 있다. 이를 위해 사용될 수 있는 용매에는 물, 링거액 및 등장성 NaCl 용액이 있으며, 멸균 고정오일도 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용한다. 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있으며, 또한 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용할 수 있다.
경구 투여용 고체투여 형태로는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 있으며, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바 람직하다. 고체투여 형태는 본 발명에 따른 화학식 I의 활성화합물을 수크로오즈, 락토오즈, 전분 등과 같은 하나 이상의 불활성 희석제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 붕해제, 결합제 등과 같은 담체와 혼합시켜 제조할 수 있다.
c)
유효량
본 발명에서 사용에 적합한 약제 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위내에 있다.
본 발명의 화합물을 임상적인 목적으로 투여시에 단일용량 또는 분리용량으로 숙주에게 투여될 총 일일용량은 체중 1 ㎏ 당 10 내지 100 ㎎의 범위가 바람직하나, 개개 환자에 대한 특이적인 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 건강상태, 식이, 약제의 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명은 하기 제조예 및 실시예들에 의해 더욱 구체적으로 설명되지만, 본 발명의 범주가 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다. 상기 반응식, 하기 제조예 및 실시예에서 화합물의 명칭에 사용되는 약어와 용어의 설명은 다음과 같다.
하기 제조예는 본 발명에 따른 실시예 화합물의 합성에 필요한 중간체 제조를 보다 구체적으로 설명한다.
제조예
1: (S)-3-아미노-4-(4-
메톡시벤질설파닐
)
부타노익산
이소프로필 에스테르
단계 A: (S)-N-
BOC
-
ASP
(O-i-
Pr
)-
OMe
(S)-N-BOC-ASP-OMe(14.6 g, 100 mmol)를 DMF(250 mL)에 녹이고 EDC(22.4 g, 130 mmol)와 DMAP(1.2 g, 10 mmol)를 첨가한 다음 이소프로필 알코올(6 g, 100 mmol)을 첨가하고 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 감압하에 DMF를 제거하고, NaHCO3 수용액으로 희석시킨 후, EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기물을 물과 1N HCl, NaCl 수용액으로 씻어 주고, MgSO4로 건조시킨 후 잔유물 EtOAc와 n-Hex을 이용하여 재결정하여 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc/n-Hex = 1/10)로 정제하여 표제 화합물(18.1 g, 89 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 203 (M+1)
단계 B: 이소프로필 (S)-4-(히드록시)-3-N-
BOC
-아미노-
부틸레이트
단계 A에서 수득한 (S)-N(BOC)-ASP(O-i-Pr)-OMe(15 g, 73.8 mmol)를 THF(200 mL) 에 넣고, NaBH4(4.1 g, 110.7 mmol)를 0℃에서 천천히 첨가하였다. 첨가가 끝나면 반응 용액을 상온으로 올리고 12 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반응 용액의 온도를 0℃로 낮추고, 물을 천천히 적가한 다음, EtOAc로 유기물을 추출하여 무수 MgSO4로 건조한 후 감압하에 용매를 제거 하고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액 EtOAc: n-Hex = 1: 5)로 정제하여 표제 화합물 (9.2 g, 78%)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 161(M+1)
단계 C: 이소프로필 (S)-4-(
메탄술폰닐옥시
)-3-N-
BOC
-아미노-
부틸레이트
단계 B에서 수득한 이소프로필 (S)-4-(히드록시)-3-NBOC-아미노-부틸레이 트(9.0 g, 55.9 mmol)를 DCM(150 mL)에 녹이고 Et3N(15.6 mL, 118 mmol)을 첨가하고, 반응 용액의 온도를 0℃로 낮춘 다음, 메탄술포닐클로라이드(8.24 g, 72.6 mmol)를 천천히 첨가하여 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 물로 희석하고, EtOAc와 DCM으로 유기물을 추출하고 무수 MgSO4로 건조한 후 감압하에 용매를 제거한 다음, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc: n-Hex = 1: 4)로 정제하여 표제 화합물(12.3 g, 92 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 239(M+1)
단계 D: 이소프로필 (S)- 4-(4-
메톡시벤질티오
)-3-
NBOC
아미노-
부틸레이트
4-메톡시벤질머캅탄(6.3 g, 41.8 mmol)을 DMF(150 mL)에 녹이고, NaH(60%, 20 g, 50. 2 mmol)를 0℃에서 첨가한 다음, 단계 C에서 수득한 이소프로필 (S)-4-(메탄술폰닐옥시)-3-N-BOC-아미노-부틸레이트(12 g, 41.8 mmol)를 DMF(5 mL)에 녹인 용액을 10분 동안 적가하고, 반응용액을 상온으로 올린 후 4 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 물을 천천히 넣고 EtOAc로 유기물을 추출하고, 포화 NaCl 수용액으로 씻어 주었다. 남은 유기 용액을 MgSO4로 건조시킨 후 감압하에 용매를 제거하고 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc: n-Hex = 1: 2)로 정제하여 표제 화합물(8.1 g, 65 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 297(M+1)
단계 E: 이소프로필 (S)-4-(4-
메톡시벤질티오
)-
3아미노
-
부틸레이트
단계 D에서 수득한 이소프로필 (S)-4-(4-메톡시벤질티오)-3-NBOC아미노-부틸레이트(8 g, 26.9 mmol)를 DCM(30 mL)에 녹이고 TFA(30 mL)를 첨가한 후 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 감압하에 용매를 제거하고 추가의 정제없이 다음 반응에 사용하였다.
Mass[M+H] =197 (M+1)
제조예
2: (R)-3-아미노-4-(4-
메톡시벤질설파닐
)
부타노익산
이소프로필 에스테르
상업적으로 구입 가능한 (R)-N-BOC-ASP-OMe를 이용하여 제조예 1과 같은 방법으로 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
Mass[M+H] =197 (M+1)
제조예 3: (R)-4-아미노-5-(4-메톡시벤질설파닐)펜타노익산 에틸 에스테르
단계 A: (S)-N-
BOC
-
Glu
(O-
Et
)-
OMe
상업적으로 구입 가능한 (S)-N-BOC-Glu-OMe과 에탄올을 이용하여 제조예 1의 단계 A와 같은 방법으로 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
Mass[M+H] =189 (M+1)
단계 B: (R)-4-아미노-5-(4-
메톡시벤질설파닐
)
펜타노익산
에틸 에스테르
단계 A에서 수득한 (S)-N-BOC-Glu(O-Et)-OMe를 이용하여 제조예 1의 단계 B~E와 같은 방법으로 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
Mass[M+H] =197 (M+1)
제조예
4: (S)-2-아미노-3-(4-
메톡시벤질설파닐
)
펜타노익산
에틸 에스테르
상업적으로 구입 가능한 N-BOC-세린 메틸 에스테르를 이용하여 제조예 1의 단계 C~E와 같은 방법으로 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
Mass[M+H] =169 (M+1)
제조예 5: 2-페녹시-아닐린
단계 A: 2-
페녹시
니트로벤젠
상업적으로 구입 가능한 2-플루오로니트로벤젠(14 g, 10 mmol)을 DMF(30 mL)에 녹이고 K2CO3(6.9 g, 50 mmol)를 첨가한 다음, 페놀을 넣고 100℃에서 12 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 감압하에 DMF를 제거하고, 포화 NH4Cl 수용액으로 희석시킨 다음, EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기 용액을 물과 NaCl 수용액으로 씻어준 다음, MgSO4로 건조 하고 감압하에 용매를 제거하였다. 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 디에틸에테르: n-Hex = 1: 10)로 정제하여 표제 화합물(17.2 g, 80 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 216(M+1)
단계 B: 2-
페녹시
-아닐린
단계 A에서 수득한 2-페녹시 니트로벤젠(15 g, 69 mmol)를 메탄올 (50 mL)에 넣고 Pd/C(1.5 g)을 첨가 한 다음, 수소 반응기(수소, 45 psi)를 이용하여 4 시간 동안 반응시킨 후, 셀라이트 필터를 하고 감압하에 용매를 제거하여, 표제 화합물(12.1 g, 95 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 185(M+1)
제조예 6: 4-페녹시-2-니트로아닐린
단계 A: N-아세틸-4-
페녹시
-아닐린
4-페녹시 아닐린(50 g, 270 mmol)을 DCM(150 mL)에 녹이고 Et3N(30 g, 540 mmol)을 첨가한 다음, 아세틱 언하이드라이드(30 g, 300 mmol)를 0℃에서 적가한 후 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결 되면 1N HCl을 첨가하고, EtOAc로 유기물을 추출한 다음, 추출한 유기물을 NaHCO3로 씻어 주었다. 남은 유기 용액을 MgSO4로 건조시킨 후 감압하에 용매를 제거하고, 추가의 정제없이 다음 반응에 사용하였다(54.8 g, 89 %).
Mass[M+H] = 228(M+1)
단계 B: 4-
페녹시
-2-니트로 아닐린
단계 A에서 수득한 N-아세틸-4-페녹시-아닐린(54.8 g, 240 mmol)를 DCM(200 mL)에 녹이고 0℃에서 발연 질산(20.2 mL)을 적가하여, 0℃~상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 포화 NaHCO3 수용액으로 희석하고, EtOAc로 유기물을 추출한 후, 포화 NaCl 수용액으로 씻어 주었다. 여액을 MgSO4로 건조한 후 감압하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 테트라하이드로 퓨란(500 mL)과 메탄올(500 mL)에 녹이고, 6N NaOH(116 mL)를 적가 하여, 상온에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 6N HCl 용액으로 중화시키고(pH = 7), EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기용액을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고 MgSO4로 건조시킨 후 추가의 정제없이 다음 반응에 사용하였다.
Mass[M+H] = 230(M+1)
제조예 7: 메틸 7-니트로-5-페녹시-3-인돌카르복실레이트
단계 A: (4-페녹시-2-니트로-페닐)하이드라진
제조예 6에서 수득한 4-페녹시-2-니트로아닐린(50 g, 217mmol)를 염산 (30 g)에 녹인 후, 0℃에서 물에 녹인 소듐 나이트레이트(33 g, 622 mmol)를 천천히 적가하여, 반응물을 0 ~ 30℃에서 30 분 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 반응물의 온도를 0℃로 낮추고 12N 염산에 녹인 틴(II)클로라이드를 천천히 적가한 후 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 중에 생성된 노란색 고체 반응물을 여과하고 소량의 6N 염산으로 세척한 후 건조하여 표제 화합물(54.8 g, 89 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 246(M+1)
단계 B: 2-[(4-
페녹시
-2-니트로-
페닐
)
하이드라조노
]
프로피오닉에틸
에스테르
단계 A에서 수득한 (4-페녹시-2-니트로-페닐)하이드라진(20 g, 81.6 mmol)을 메탄올 (150 mL)에 녹이고, 에틸 2-메틸아세토아세테이트(7.25 g, 75.9 mmol)과 소듐 아세트(6.4 g, 96.9 mmol)를 첨가한 다음 상온에서 0℃에서 8 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 물을 넣고 결정화되는 고체를 모은 다음, 다시 물로 씻어 주고 남은 고체를 건조하여 표제 화합물(19.7 g, 84 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 330 (M+1)
단계 C:
메틸
7-니트로-5-
페녹시
-3-
인돌카르복실레이트
단계 B에서 수득한 2-[(4-페녹시-2-니트로-페닐)하이드라조노]프로피오닉에틸 에스테르(18.7 g, 56.8 mmol)를 폴리인산(60 mL)과 섞고 60℃에서 7 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 물을 넣고 결정화되는 고체를 모은 다음, 다시 물로 씻어 주고, 남은 고체를 건조하여 표제 화합물(10.4 g, 58 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 313(M+1)
제조예 8: [(S)-2-(5-페녹시-7-니트로-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-아세트산 이소프로필 에스테르
단계 A: 7-니트로-5-
페녹시
-1-H-2-
인돌카르복실산
제조예 6에서 수득한 메틸 7-니트로-5-페녹시-3-인돌카르복실레이트 (10.4 g, 33.3 mmol)를 테트라히이드로 퓨란(250 mL)과 물(50 mL) 용액에 녹이고, LiOH(13.36 g)를 첨가한 후 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 감압하에 메탄올을 제거하고, 1N HCl로 희석시킨 후(pH = 2~3), EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기 용매을 감압하에 제거하고, 건조하여 표제 화합물(9.78 g, 98%)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 299(M+1)
단계 B: (S)-3-[(5-페녹시-7-니트로-1-H-인돌-2-일)]카보닐아미노-4-(4-메톡시-벤질설파닐)-
부티릭산
이소프로필 에스테르
단계 A에서 수득한 7-니트로-5-페녹시-1-H-2-인돌카르복실산(12 g, 40 mmol)을 DMF(100 mL)에 녹이고 Et3N(8.4 mL, 60 mmol), EDC(12.3 g, 64.3 mmol), 및 HOBt(9.23 g, 68.3 mmol)를 첨가한 다음, 제조예 1에서 수득한 (S)-3-아미노-4-(4-메톡시벤질설파닐)부타노익산 이소프로필 에스테르(16.0 g, 48.2 mmol)를 넣고 상온에서 7 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 감압하에 용매를 제거하고, 1N 염산으로 희석한 후 EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기물을 포화 NaCl 수용액과 물로 씻어준 다음, MgSO4로 건조하고 감압하에 용매를 제거한 후 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc/n-Hex = 1/8 -> 1/2)로 정제하여 표제 화합물(17.5 g, 75 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 577(M+1)
단계 C: [(S)-2-(5-페녹시-7-니트로-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-아세트산 이소프로필 에스테르
단계 B에서 수득한 (S)-3-[(5-페녹시-7-니트로-1-H-인돌-2-일)]카보닐아미노-4-(4-메톡시-벤질설파닐)-부티릭산 이소프로필 에스테르(17.4 g, 30.3 mmol)를 디클로로메탄(150 mL)에 녹이고 PCl5(12.6 g, 60.6 mmol)를 첨가한 후 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. NaHCO3 수용액으로 반응을 종결시키고, NH4OH로 희석시킨 후 EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기물을 MgSO4로 건조시키고, 감압하에 용매를 제거하여 표제 화합물(17.3 g)을 수득하였다.
단계 D: [(S)-2-(5-페녹시-7-아미노-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-아세트산 이소프로필 에스테르
단계 C에서 수득한 [(S)-2-(5-페녹시-7-니트로-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-아세트산 이소프로필 에스테르(17.3 g, 30.3 mmol)를 테트라하이드로퓨란(130 mL), 메탄올(130 mL), 및 물(130 mL)의 혼합 용액에 녹이고, NH4Cl(14.6 g, 27.3 mmol)를 첨가 한 다음, 반응의 물의 온도를 60℃로 올린 후 Fe(15.2 g, 273 mmol)를 넣고 30 분 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 셀라이트로 여과하여 고형질을 제거하고 남은 용액에서 일정 용매를 감압하에 제거한 다음, EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기물을 MgSO4로 건조시키고, 감압하에 용매를 제거하여 표제 화합물(5.0 g, 40 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 410(M+1)
제조예
9 ~ 21
제조예 1 ~ 4에서 수득한 머켑탄 유도체와 제조예 5에서 수득한 아닐닌 및 상업적으로 구입 가능한 니트로아닐린 화합물을 이용하여 제조예 7 과 8에서와 같은 방법으로 수행하여 하기 표 2와 같은 제조예들을 합성 하였다.
[표 2]
제조예 21: [2-(5-클로로-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산 에틸 에스테르
단계 A: [2-(5-
클로로
-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산
아마이드
제조예 14를 합성하는 중간에 수득한 5-클로로-7-니트로-1-H-인돌-2-카르복실산(2.0 g, 8.3 mmol) 디클로로메탄(50 mL)에 넣고 SOCl2(2.97 g, 25.1 mmol)와 DMF(10 방울)를 첨가한 다음 40℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 반응이 종결되면, 디클로로메탄를 감압하에 제거하였다. 잔류물에 테트라하이드로퓨란(50 mL)을 첨가하고 NH4OH(10 mL)를 첨가한 다음, 상온에서 1 시간 동안 교반한 후 얼음물을 넣어 결정화 된 고체 화합물을 수득하였다. 수득한 물질을 건조하여 표제 화합 물(1.85 g, 93 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 240(M+1)
단계 B: [2-(5- 클로로 -7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]아세트산 티오 아마이 드
단계 A에서 수득한 [2-(5-클로로-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산 아마이드(1.84 g, 7.7 mmol)를 테트라하이드로퓨란(70 mL)에 녹이고, 로웬슨 시약(2,4-비스-(4-메톡시-페닐)-1,2,3,4-디티아디포스페탄-2,4-디설파이드, 4.68 g, 11.58 mmol)을 첨가한 다음 40℃에서 가열하였다. 반응이 종결되면, 온도를 상온으로 내리고, 디에틸에스테르를 첨가하여 고형질 물질을 수득하고, 이 고형질 물질을 테트라하이드로퓨란과 n-Hex을 이용하여 재결정하여 표제 화합물(1.33 g, 67%)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 256(M+1)
단계 C: [2-(5-
클로로
-7-니트로-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산 에틸 에스테르
단계 B에서 수득한 [2-(5-클로로-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]아세트산 티오 아마이드(1.33 g, 5.2 mmol)를 에탄올(30 mL)에 녹이고, 에틸 4-클로로아세토아세테이트(942 mg, 5.7 mmol)를 첨가한 후 70℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 감압하에 에탄올을 제거하고, 잔유물을 DMF(30 mL)에 녹인 후 80℃에서 1 시 간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 감압하에 DMF를 제거 하고 잔유물을 디클로로메탄/n-Hex을 이용하여 재결정하여 표제 화합물(1.32 g, 69 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 366(M+1)
단계 D: [2-(5-
클로로
-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산 에틸 에스테르
단계 C에서 수득한 [2-(5-클로로-7-니트로-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산 에틸 에스테르를 이용하여 제조예 8의 단계 D와 같이 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
Mass[M+H] = 336(M+1)
제조예
22: [2-(5-
클로로
-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-카르복시산 에틸 에스테르
제조예 21의 단계 B에서 수득한 [2-(5-클로로-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]아세트산 티오 아마이드와 에틸브로모파루베이트를 이용하여 제조예 21의 단계 C 및 D와 같이 수행하여 표제 화합물을 수득하였다
Mass[M+H] = 322(M+1)
실시예 1: (S)-2-[4-(히드록시에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
단계 A: [2-(5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-카르복시산 에틸 에스테르
제조예 8에서 수득한 [(S)-2-(5-페녹시-7-니트로-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-아세트산 이소프로필 에스테르(5.0 g, 12.2 mmol)와 시클로펜타논(2.05 g, 24 mmol)을 디클로로에탄(50 mL)에 넣고 NaBH(OAc)3(5.3 g, 25 mmol)를 첨가한 후 상온에서 19 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 포화 NaHCO3 수용액으로 희석하고, 디클로로메탄과 EtOAc로 유기물을 추출하였다. 추출한 유기물을 물과 NaCl 수용액으로 씻어 주고, MgSO4로 건조 한 후, 감압하에 용매를 제거한 다음, 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc/n-Hex = 1/5)로 정제하여 표제 화합물(3.77 g, 64 %)을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 10.1 (s, 1H), 7.31-7.26 (m, 2H), 7.04-6.98 (m, 3H), 6.83 (s, 1H), 6.64 (d, 1H, J=2.0Hz), 6.30 (d, 1H, J=2.0Hz), 5.08-4.96 (m, 2H), 3.80 (brs, 1H), 3.68-3.62 (m, 1H), 3.25-3.21 (m, 1H), 2.87-2.82 (m, 1H), 2.67-2.61 (m, 1H), 2.01-1.96 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 5H), 1.50-1.45 (m, 2H), 1.22-1.21 (m, 6H)
Mass[M+H] = 478(M+1)
단계 B: (S)-2-[4-(
히드록시에틸
)-4,5-
디하이드로
-
티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-
시클
로펜틸아미노-1-H-인돌
단계 A에서 수득한 [2-(5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌-2-일)-4,5-디하이드로-티아졸-4-일]-카르복시산 에틸 에스테르(3.77 g, 18.7 mmol)를 테트라하이드로퓨란(100 mL)에 녹이고, 리튬보로하이드라이드(2.0 M, 9.5 mL)를 첨가한 후 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 물을 천천히 넣고, EtOAc로 유기물을 추출한 다음, MgSO4로 건조하고 감압하에 용매를 제거하였다. 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc/n-Hex = 1/3 -> 1/1) 로 정제하여 표제 화합물(2.56 g, 32 %)을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 10.8 (s, 1H), 7.33-7.23 (m, 2H), 7.03-6.99 (m, 3H), 6.85 (s, 1H), 6.60 (d, 1H, J=2.0Hz), 6.25 (d, 1H, J=2.0Hz), 4.86 (brs, 1H), 4.69-4.61 (m, 1H), 4.04-3.93 (m, 2H), 3.84-3.78 (m, 1H), 3.59-3.55 (m, 1H), 3.13-3.08 (m, 1H), 2.08-1.96 (m, 4H), 1.69-1.55 (m, 7H)
Mass[M+H] = 422(M+1)
실시예 2: (S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
단계 A: (S)-2-[4-(
아이오도에틸
)-4,5-
디하이드로
-
티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-
시클
로펜틸아미노-1-H-인돌
실시예 1에서 수득한 (S)-2-[4-(히드록시에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2- 일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(2.56 g, 6.88 mmol)를 테트라하이드로퓨란(30 mL)에 넣고 트리페닐포스핀(2.3 g, 9.12 mmol), 아이오다이드(2.31 g, 9.12 mmol), 및 이미다졸(1.24 g, 18.24 mmol)을 넣고 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 물과 포화 암모늄클로라이드를 넣어 희석시키고, 유기물을 EtOAc로 추출한 다음 MgSO4로 건조하고 감압하에 용매를 제거 하였다. 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 EtOAc/n-Hex = 1/10 -> 1/5) 로 정제하여 표제 화합물(1.25 g, 34 %)을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 10.8 (s, 1H), 7.30-7.25 (m, 2H), 7.03-6.99 (m, 3H), 6.90 (s, 1H), 6.64 (d, 1H, J=1.8Hz), 6.28 (d, 1H, J=1.8Hz), 4.89-4.85 (m, 1H), 3.87 (brs, 1H), 3.80-3.75 (m, 1H), 3.62-3.58 (m, 1H), 3.30-3.14 (m, 3H), 2.35-2.29 (m, 1H), 2.20-2.13 (m, 1H), 2.02-1.95 (m, 2H), 1.68-1.53 (m, 4H), 1.49-1.42 (m, 1H), 1.38-1.32 (m, 1H)
Mass[M+H] = 532(M+1)
단계 B: (S)-2-[4-(
피롤리딘
-1-일-에틸)-4,5-
디하이드로티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-시
클로펜틸아미
노-1-H-인돌
단계 A에서 수득한 (S)-2-[4-(아이오도에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(540 mg, 1.02 mmol)를 DMF(5 mL)에 녹이고, Et3N(0.21 mL, 1.52 mmol)을 첨가한 다음, 피롤리딘(0.13 mL, 1.52 mmol)을 첨가하여 상온에서 30 분 동안 교반하였다. 물과 포화 암모늄클로라이드를 넣어 희석시키고, 유기물을 EtOAc로 추출한 다음 1N HCl과 소금물로 씻어 준 다음, MgSO4로 건조하고 감압하에 용매를 제거하였다. 잔유물을 칼럼 크로마토그래피(용리액 MeOH/DCM = 1/20)로 정제하여 표제 화합물(0.47 g, 97%)을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 7.31-7.27 (m, 2H), 7.03-7.00 (m, 1H), 6.96-6.94 (m, 2H), 6.50 (d, 1H, J=2.0Hz), 6.17 (d, 1H, J=2.0Hz), 4.73-4.66 (m, 1H), 3.86 (brs, 1H), 3.74-3.58 (m, 2H), 3.46-3.37 (m, 4H), 3.23-3.19 (m, 1H), 2.24-2.10 (m, 6H), 2.10-1.80 (m, 2H), 1.70-1.65 (m, 5H)
Mass[M+H] = 475(M+1)
실시예 3: (S)-2-[4-(3-S-아미노-피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
단계 A: (S)-2-[4-(3-S-
BOC
-아미노-
피롤리딘
-1-일-에틸)-4,5-
디하이드로
-
티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-
시클로펜틸아미노
-1-H-인돌
실시예 1에서 수득한 (S)-2-[4-(히드록시에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌과 3S-BOC-아미노-피롤리딘을 이용하여 실시예 1의 단계 B와 같이 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
Mass[M+H] = 590 (M+1)
단계 B: (S)-2-[4-(3-S-아미노 -
피롤리딘
-1-일-에틸)-4,5-
디하이드로
-
티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-
시클로펜틸아미노
-1-H-인돌
단계 A에서 수득한 (S)-2-[4-(3-S-BOC-아미노 -피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드-로티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(59 mg, 1 mmol)를 DCM (2 mL)에 녹이고, HCl(4 M 다이오산, 2 mL)를 첨가한 다음 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면, 감압하에 용매를 제거하고 디에틸에테르로 재결정하여 표제 화합물 (47 mg, 90 %)을 수득하였다.
Mass[M+H] = 490(M+1)
실시예
4 ~ 49
제조예 8 ~ 20에서 합성한 인돌 유도체로부터 실시예 1 ~ 3과 같은 방법으로 수행하여 하기 실시예들을 합성하였다.
[표 3]
실시예 50: (S)-2-[(S)-3-(3-디메틸아미노)벤질아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
실시예 35에서 수득한 (S)-2-[3-S-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌과 디메틸아미노벤즈알데히드를 이용하여 실시예 1의 단계 A와 같이 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 7.13-7.17(t, 1H), 6.89(s, 1H), 6.74(s, 1H), 6.61-6.62(d, 2H), 6.59(s, 1H), 6.34(s, 1H), 4.62-4.65(m, 1H), 3.85-3.91(m, 1H), 3.64-3.69(dd, 2H), 3.49-3.53(dd, 2H), 3.30-3.40 (m, 2H), 3.10-3.13(m, 1H), 3.02-3.05(t, 1H), 2.92 (s, 6H), 2.40-2.42(m, 1H), 1.99-2.10(m, 5H), 1.96-1.98 (m, 1H), 1.71-1.76(m, 4H), 1.57-1.60 (m, 3H), 1.24-1.29(m, 1H).
Mass[M+H] = 566(M+1)
실시예
51: (S)-2-[4-(
테트라하이드로퓨란
-2-
카보닐
-피페라진-1-일-에틸)-4,5-
디하
이드로-
티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-
시클로펜틸아미노
-1-H-인돌
실시예 45에서 합성한 (S)-2-[(4-피페라진-1-일)에틸-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌과 테트라하이드로-카르복실산을 이용하여 제조예 8의 단계 B와 같이 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 10.67-10.58 (m, 1H), 7.30-7.27 (m, 2H), 7.04-6.98 (m, 3H), 6.85 (d, 1H, J=1.2Hz), 6.62 (d, 1H, J=2.0Hz), 6.27 (brs, 1H), 4.84-4.78 (m, 1H), 4.58-4.54 (m, 1H), 3.96-3.91 (m, 1H), 3.87-3.71 (m, 3H), 3.59-3.42 (m, 3H), 3.19-3.14 (m, 1H), 2.47-2.37 (m, 2H), 2.33-2.16 (m, 4H), 2.07-1.87 (m, 6H), 1.83-1.75 (m, 4H), 1.68-1.56 (m, 1H), 1.49-1.40 (m, 2H)
Mass[M+H] = 548(M+1)
실시예
52 ~ 54
실시예 9 및 45에서 수득한 화합물을 이용하여 실시예 51에서와 동일한 방법으로 수행하여 하기 화학식 IV로 표시되는 실시예 52 ~ 54의 화합물들을 합성하였다.
[표 4]
실시예
55: (S)-2-[(S)-3-
아세틸아미노
-
피롤리딘
-1-일-에틸]-4,5-
디하이드로
-
티아졸린
-2-일]-5-
페녹시
-7-
시클로펜틸아미노
-1-H-인돌
실시예 26에서 수득한 (S)-2-[(S)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌과 아세트산을 이용하여 제조예 51과 같은 방법으로 수행하여 표제의 화합물을 수득하였다.
H1 NMR (CDCl3) δ 8.31(br, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.77(s, 1H), 6.36(s, 1H), 4.80-4.85(m, 1H), 4.64-4.68(m, 1H), 3.89-3.91(m, 1H), 3.71-3.79(m, 1H), 3.54-3.60(m, 1H), 2.96-3.11(m, 1H), 2.71-2.85(m, 1H), 2.37-2.41(m, 1H), 2.12-2.21(m, 1H), 1.99-2.05(m, 4H), 1.99(s, 3H), 1.55-1.79(m, 6H).
실시예
56: (S)-2-[4-(
피롤리딘
-1-일-에틸)티아졸-2-일]-5-
클로로
-7-
시클로펜틸아
미노-1-H-인돌
제조예 21에서 수득한 [2-(5-클로로-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-아세트산 에틸 에스테르를 이용하여 실시예 1 및 2와 같이 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.77 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 6.84 (d, 1H), 6.43 (d, 1H), 6.48 (d, 1H), 5.30 (br s, 1H), 4.02-3.96 (m, 1H), 3.62-3.40 (br s, 4H), 3.57 (t, 2H), 3.24 (t, 2H), 2.22-2.15 (m, 4H), 2.15-2.05 (m, 2H), 1.92-1.80 (m, 4H), 1.70-1.61(m, 2H)
Mass[M+H] = 415 (M+1)
실시예
57: (S)-2-[4-(
피롤리딘
-1-일)
메틸
-티아졸-2-일]-5-
클로로
-7-
시클로펜틸아
미노-1-H-인돌
제조예 22에서 수득한 [2-(5-클로로-7-아미노-1-H-인돌-2-일)티아졸-4-일]-카르복시산 에틸 에스테르를 이용하여 제조예 1 및 2와 같은 방법으로 수행하여 표제 화합물을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.91 (S, 1H), 7.14(s, 1H), 7.06(s, 1H), 6.96(s, 1H), 6.84(s, 1H), 3.74-3.80(m, 1H), 3.70(s, 2H), 2.63(s, 4H), 1.91-1.96(m, 2H), 1.54-1.61(m, 4H), 1.26-1.36(m, 2H)
Mass[M+H] = 403 (M+1)
실험예 1: 재조합 베타 세크리타제2 효소 활성도 측정
단계 A: 재조합 베타 세크리타제2 발현 벡터의 제조
기존의 public data base인 Genebank에 공지된 사람 BACE2 유전자 염기서열(accession #: BC014453)을 기초로 만든 cDNA(ATCC, Cat #: 6896840)를 구매하였다. 상기 BACE 전체 유전자 중에서 세포 막 투과 부분(trnsmembrane domain)과 세포 질 부분(cytoplasmic domain)을 제외한 아미노산 서열 1-466에 해당하는 부분, 즉, ectodomain만을 다시 클로닝한 다음, 그 3' 말단에 사람 면역 글로불린 G (hIgG)의 아미노산 230 개(아미노산 서열 1-466)에 해당하는 Fc 부분 염기서열을 붙였다. 상기 BACE (ectodomain)-IgG Fc (이하 BACE-Fc)를 포유동물 발현 벡터인 pCDNA3 (Invitrogen)의 BamHI과 XhoI 사이에 접합(ligation)시켜 넣음으로써 BACE2-Fc 단백질 발현 벡터 pCDNA3 BACE2 Fc를 제조하였다.
단계 B: BACE2-Fc 융합 단백질 발현 포유동물 세포주 제조
CHO(Chinese hamster ovary) DHFR-세포(ATCC Accession# CRL9096)를 10%의 소 태아 혈청(fetal bovine serum) (FBS) (GIBCO-BRL)을 함유한 a-MEM (a-minimum essential medium) (GIBCO-BRL) 배양액으로 배양한 다음 100 mm culture plate로 옮기고 세포가 배양 용기 바닥을 덮을 정도로 자란 뒤에 Lipofectamine Plus (Life Technologies)를 사용하여 상기 BACE2-Fc 단백질 발현 벡터 pCDNA3 BACE2-Fc로 형질전환 시켰다. 형질 전환된 세포들은 1 mg/ml의 Geneticin (G418 sulfate) (GIBCO-BRL)을 함유한 10%의 투석된 소 태아 혈청(dialyzed fetal bovine serum) (dFBS) (JRH) 배양액으로 매 4일 마다 교체해 주면서 선택배양 하였고, 그 중 100 여개의 클론을 24-well culture plate에서 분리 배양하였다. 분리된 클론들 중 세포 성장 속도가 양호한 20여 개의 클론들을 동일한 세포 수(2 X 105 cells/ml/24-well)로 맞추어서 24-well culture plate에서 다시 3일 동안 배양하였다. 배양액으로 분비된 BACE2-Fc 단백질의 양을 염소 유래 항사람 IgG (Goat anti-human IgG (Pierce))를 사용하는 ELISA 방법으로 정량하여 가장 빠른 성장속도와 BACE2-Fc 발현 양(1 리터 배양 시 약 3 mg)을 나타내는 클론 #66을 선별하였다.
단계 C: BACE2-Fc 융합 단백질 생산 및 정제
CHO DHFR- BACE2-Fc #66 세포주를 10%의 dFBS를 함유한 a-MEM 배양액 250 ml이 있는 roller bottle에 2 X 105 cells/ml이 되게 넣고 Roll-In 세포 배양기(Bellco)에서 40 rpm의 속도로 회전시키면서 37℃의 온도 하에서 4 일 동안 배양하였다. 세포가 배양용기를 완전히 덮을 정도로 자라면, 250 ml의 무혈청 배지 (SFII; GIBCO-BRL)로 1 회 세척해 준 다음 다시 500 ml의 인슐린(0.5 ug/ml) (SIGMA)을 함유한 무혈청 배지를 넣고 3 일 동안 배양했다. 배양액을 수거한 다음 다시 500 ml의 무혈청 배지를 넣고 3 일 동안 배양하는 과정을 2 회 반복한 다음, 수거된 모든 세포 배양액(conditioned media)을 7000 rpm에서 20 분 동안 원심분리(Beckman, JA 10 rotor)한 다음 세정액만을 분리했다. 상기 세정액을 0.45 um 필터로 통과 시킨 후 20 mM sodium phosphata buffer (pH 7.0)로 평형화 시킨 Protein A sepharose 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia)에 통과시킨 뒤 다시 20 mM sodium phosphata buffer(pH 7.0)로 세척 함으로써 흡착되지 않은 모든 단백질을 제거하였다. 100 mM sodium acetate 완충액(pH 3.5)을 가하여 흡착된 단백질을 떨어뜨려 냄으로써 순도 95% 이상의 BACE2-Fc 단백질(M.W 75 KDa.)을 얻을 수 있었다.
단계 D: 형광 표지 특이 기질을 사용한 베타 세크리타제2 활성도 검정
베타 세크리타제2의 효소 활성도와 합성 화합물들의 저해 효능을 측정하기 위하여, 상기 정제된 BACE2-Fc 융합단백질과 형광 표지 베타 세크리타제2 특이 기질을 사용한 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 효소 활성도 측정법을 확립하였다. 이를 간략히 서술하면 다음과 같다.
세포 내 베타 세크리타제2 특이 기질로 알려져 있는 Amyloid precursor protien (APP)의 전체 아미노산 서열 중 베타 세크리타제 절제 부분을 포함하는 10 개 아미노산 부위에 해당하는 펩티드 특이 기질을 형광 발색체 (Fluorophore)인 EDANS와 Quenching group인 DABCYL을 부착시킨 형태로 합성하였다. 이 형광 표지 기질을 BACE2-Fc와 같이 반응 시키면, BACE2 작용 부위가 절단되면서 quenching group이 떨어져나가고, EDANS는 350 nm의 excitation light에 의해 510 nm 파장의 형광을 나타내게 되는데, 그 양을 측정함으로써 반응 진행정도를 민감하고도 간편하게 측정할 수 있다.
각 합성 화합물들은 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시켜서 20℃에서 보관하였다. 활성도를 측정하기 위해서는 먼저 10 mM DMSO용액을 96 well plate 가장 오른쪽 열에 넣은 뒤 동일한 양의 DMSO로 2 배 희석하는 단계를 9 단계까지 순차적으로 실행하였다. 15 ul의 반응 완충액(50 mM sodiumacetate, pH 4.5, 0.05% CHAPS)과 10 ul의 50% DMSO에 용해되어 있는 600 uM 형광 표지 BACE 기질을 넣어둔 96-well assay plate에 상기 희석 화합물 용액 10 ul를 첨가함으로써 최종 DMSO 농도는 10%가 되게 하고, 저해제 처리 농도는 500 uM 부터 9 단계의 2배 희석이 되게 하였다. 65 ul의 상기 정제된 BACE2-Fc 융합단백질 용액을 최종농도 0.4 ug/ml이 되게 가한 뒤 상온에서 1 시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 결과물의 생성량은 fluorescent plate reader (SpectraMax Gemini XS, Molecular Device)를 사용하여 350 nM excitation과 510 nm emission 파장에서 나타나는 형광으로써 측정하였다. 이 측정값을 합성화합물이 첨가되지 않은 대조군에서의 측정값과 비교함으로써 상기 베타 세크리타제 활성도의 50%를 저해하는 합성 화합물의 농도, 즉, IC50와 Ki를 결정하였다.
실험예 2: 재조합 카셉신디 효소 활성도 측정
카셉신디의 효소 활성도와 합성 화합물들의 저해 효능을 측정하기 위하여, 카셉신디(Calbiochem, #219401)와 형광 표지 카셉신디 특이 기질(Bachem #M-2455)을 사용한 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 효소 활성도 측정법을 확립하였다. 이를 간략히 서술하면 다음과 같다.
카셉신디 특이 기질로 알려진 것은 10개 아미노산 부위에 해당하는 펩티드 특이 기질을 형광 발색체 (Fluorophore)인 Mca와 Quenching group인 Dnp을 부착시킨 형태이다. 이 형광 표지 기질을 카셉신디와 같이 반응 시키면 카셉신디 작용 부위가 절단되면서 quenching group이 떨어져 나가고 Mca는 328 nm의 excitation light에 의해 393 nm 파장의 형광을 나타내게 되는데 그 양을 측정함으로써 반응 진행 정도를 민감하고도 간편하게 측정할 수 있다.
각 합성 화합물들은 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시켜서 20℃에서 보관하였다. 활성도를 측정하기 위해서는 먼저 10 mM DMSO용액을 96 well plate 가장 오른쪽 열에 넣은 뒤 동일한 양의 DMSO로 2 배 희석하는 단계를 9 단계까지 순차적으로 실행하였다. 50 ul의 반응 완충액 (50mM sodiumacetate, pH 4.0)과 10 ul의 25% DMSO에 용해되어있는 7 uM 형광 표지 카셉신 기질을 넣어 둔 96-well assay plate에 상기 희석 화합물 용액 10 ul를 첨가함으로써 최종 DMSO 농도는 5%가 되게 하고 저해제 처리 농도는 250 uM부터 9 단계의 2배 희석이 되게 하였다. 30 ul의 상기 정제된 카셉신디 융합단백질 용액을 최종농도 0.75 ng/ml이 되게 가한 뒤 37℃에서 1 시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 결과물의 생성량은 fluorescent plate reader (SpectraMax Gemini XS, Molecular Device)를 사용하여 328 nM excitation 과 393 nm emission 파장에서 나타나는 형광으로써 측정하였다. 이 측정값을 합성 화합물이 첨가되지 않은 대조군에서의 측정값과 비교함으로써, 상기 카셉신디 활성도의 50%를 저해하는 합성 화합물의 농도, 즉, IC50와 Ki를 결정하였다.
실험예 3: 세포 내 SEAP(Secreted alkaline phosphatase 분비되는 알칼리 인산화 효소)활성도 측정
단계 A:
SEAP
-
APPsw
-
KK
를 발현하는 영구세포주 확립
CRE(cAMP response elements) 조절하에 SEAP와 swedish 돌연변이형 아밀로이드전구체(CRE-SEAP-APP695sweKK)를 발현시키는 유전자를 포유동물 발현 벡터인 pcDNA3.1(+)Neo (Invitrogen)에 클로닝 했다. Neuro-2a 세포(ATCC Accession# CCL-131)를 10%의 FBS를 함유한 DMEM (Dulbecco's minimum essential medium) (GIBCO-BRL) 배양액으로 배양한 다음 6-well culture plate로 옮기고 세포가 배양 용기 바닥을 덮을 정도로 자란 뒤에 Lipofectamine 2000(Life Technologies)을 사용하여 상기 CRE-SEAP-APP695sweKK 발현 벡터로 형질전환시켰다. 각 클론들을 각각 분리한 다음 다시 6-well culture plate에서 분리 배양하였다. 선택된 클론들 중 세포 성장 속도가 양호한 100개의 클론들을 24-well culture plate에서 새로 3 일 동안 배양한 다음, DMSO/10uM Forskolin media로 6 시간 동안 배양한 후, 각 웰에서 50 ㎕를 따내어 50 ul Attophos(Promega)와 반응시켰다. 30 분간 상온에서 fluorescent plate reader (SpectraMax Gemini XS, Molecular Device)로 450 nM excitation과 580 nm emission 파장에서 나타나는 형광을 측정하였다. 선택된 클 론들 중 forskolin/DMSO에서 SEAP활성 비율이 크고 forskolin에 의해 가장 많이 SEAP활성이 나오는 4 개의 클론들을 선별하였다. 선별된 클론들을 동일한 세포 수(2 X 104 cells/96-well)로 맞추어서 새로 1일 동안 배양한 다음, DMSO/Forskolin10uM로 처리하여 6 시간 후에 분비된 SEAP 활성을 측정하여 가장 좋은 클론 #159를 선별하였다.
단계 B: SEAP 활성분석법
상기 CRE-SEAP-APP695sweKK를 발현시키는 N2A SEAP-APPsw-KK #159를 96-well 배양용기에 각 well 당 2 X 104 개/80 ul의 세포를 깔았다. Forskolin 10mM과 DMSO를 준비하여 배양액으로 100 배 희석시킨 후 10 ul씩 96-well에 첨가하였다.
각 합성 화합물들은 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시켜서 20℃에서 보관하였다. 활성도를 측정하기 위해서는 먼저 10 mM DMSO 용액을 96 well plate 가장 오른쪽 열에 넣은 뒤 동일한 양의 DMSO로 3 배 희석하는 단계를 7 단계까지 순차적으로 실행하였다. 순차적으로 희석한 화합물 10 ul를 90 ul의 배양액으로 10배 희석시킨다. 최종 DMSO 농도는 1.1%가 되게 하고 저해제 처리 농도는 100 uM부터 7 단계의 2배 희석이 되게 하였다. 모두 처리한 후 6% CO2의 존재 하에서 37℃ 배양기에서 5 시간 동안 배양하였다. 배양액으로 분비된 SEAP 양을 측정하기 위해 먼저 65℃ 온도로 30 분간 열에 의한 비활성 반응을 하여, 다른 alkaline phosphatase의 활성을 없앤다. 열에 의해 비활성화된 배양액 50 ul와 Attophos(Promega) 50 ul를 30 분간 상온에서 반응시키며, fluorescent plate reader (SpectraMax Gemini XS, Molecular Device)로 450 nM excitation과 580 nm emission 파장에서 나타나는 형광을 측정하였다. 이 측정값을 합성화합물이 첨가되지 않은 대조 군에서의 측정값과 비교함으로써, 상기 SEAP 활성도의 50%를 저해하는 합성 화합물의 농도, 즉, IC50를 결정하였다
실험예 4: 유전형질전환 생쥐에서 나온 신경세포에서 아밀로이드 베타 측정
단계 A:
유전형질전환
생쥐(
APP
/
PS1dE9
)Primary 신경세포 배양
유전형질 전환된(APP/PS1dE9) 수컷 생쥐와 암컷 생쥐를 교배하여 태어난 생쥐를 가지고 실험하였다. 태어난지 3~4 일 정도가 된 쥐의 뇌를 꺼내어 4℃에서 해마조직과 뇌막을 제거한 후 잘게 쪼개어 DNA효소(Sigma, D5025)와 단백질분해효소(Sigma, P5147)를 처리하여 37℃ 배양기에서 20~25분간 놓아둔다. 세포들로 분리가 된 후에 Poly-L-Lysine으로 덮혀진 24well plate에 배양액 (27.6 ml Neurobasal + 1.5 ml FBS + 600 ul B27 + 300 ul of 200mM of L-Glutamine)를 이용하여 각 well당 4 X 105 cell의 세포를 깐다. 37℃ incubator에서 7 일간 배양 한 후 실험하였다.
단계 B: Ab40 활성측정
각 합성 화합물들은 10 mM의 농도로 DMSO에 용해시켜서 20℃에서 보관하였 다. 활성도를 측정하기 위해서는 먼저 10 mM DMSO 용액을 96 well plate 가장 오른쪽 열에 넣은 뒤 동일한 양의 DMSO로 3 배 희석하는 단계를 6 단계까지 순차적으로 실행하였다. 순차적으로 희석한 화합물을 배양액(neurobasal 29.1 ml + B27 600 ul + 200mM의 L-Glutamine 300 ul + 100mM의 L-Glutamate 7.5 ul)으로 250 배 희석하여 상기 배양된 primary 신경세포에 350 ul를 넣어주고 8 시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상기 배양액으로 분비된 베타 아밀로이드 펩티드 발현량은 베타 아밀로이드 펩티드에 특이적인 2 개의 항체를 사용한 sandwich ELISA 방법(Biosource, #KHB3482)을 통하여 측정했는데 간략히 기술하면 다음과 같다.
50 ul의 각 농도로 희석된 수용성 베타-아밀로이드 또는 세포 배양액을 50 ul의 확인 항체와 섞으면서 항체가 표면에 코팅된 plate에 첨가하고 상온에서 3 시간(또는 4℃에서 하루 이상) 반응시켰다. 1 배 세척액(Biosource, #KHB3482) 으로 5 회 세척해 준 다음, 항체희석용액(Biosource, #KHB3482)으로 100 배 희석한 HRP (horse radish peroxidase) 부착 항체 100 ul를 첨가한 뒤 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 그런 다음 HRP항체를 제거하고 1 배 세척액으로 5 회 세척해 준 다음 크로모젠 용액(Biosource, #KHB3482) 100 ul를 가하고 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 그리고, 정지용액(Biosource, #KHB3482) 100 ul를 가하고 상온에서 30 분 동안 반응시킨 후, microplate reader (SpectraMax 340, Molecular Device)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 측정값을 합성 화합물이 첨가되지 않고 0.4%의 DMSO만을 처리한 대조군에서의 측정값과 비교함으로써 세포 내 베타 세 크리타제 활성도의 50%를 저해하는 합성 화합물의 농도, 즉, IC50를 결정하였다.
실험예 5: 세포 내 베타 세크리타제 활성도 측정
아밀로이드 전구체(APP)로부터 베타 아밀로이드 펩티드를 만드는 세포 주를 이용하여 합성 화합물들의 세포 내 베타 세크리타제 활성의 저해도를 측정할 수 있다.
단계 A: 아밀로이드 전구체를 생산하는 영구 세포 주 확립
TRE(Tet-response element) 조절하에 돌연변이형 아밀로이드 전구체 유전자(APP751NFEV)를 TRE(Tet-response element) 조절 하에 luciferase 유전자를 발현시키는 포유동물 발현 벡터인 PBI-L vector(CloneTech)에 클로닝 했다. Neuro-2a 세포(ATCC Accession# CCL-131)를 10%의 FBS를 함유한 DMEM (Dulbecco's minimum essential medium) (GIBCO-BRL) 배양액으로 배양한 다음 6-well culture plate로 옮기고 세포가 배양 용기 바닥을 덮을 정도로 자란 뒤에 Lipofectamine 2000 (Life Technologies)을 사용하여 상기 pBI-L APP751 NFEV 발현 벡터로 형질전환시켰다. 각 클론들을 각각 분리한 다음 다시 6-well culture plate에서 분리 배양하였다.
선택된 클론들 중 세포 성장 속도가 양호한 100 개의 클론 들을 96-well culture plate에서 새로 1 일 동안 배양한 다음, 1 ug/ml Doxicycline을 함유한 배양액으로 교환해 준 다음 24 시간 동안 배양한 후, 각 웰에 50 ㎕의 Bright-Glo 루시퍼라제 시약(Promega)을 처리한 다음 15 분간 상온에 방치한 뒤 발광측정 기(Luminometer, Victor)를 사용하여 각 웰의 발광 정도(Luminescence)를 측정하였다. 선택된 클론들 중 Luciferase 발현양이 가장 많은 4 개의 클론들을, 동일한 세포 수(3 X 105 cells/ml/24-well)로 맞추어서 24-well culture plate에서 새로 1일 동안 배양한 다음, 1 ug/ml Doxicycline을 함유한 OPTI-MEM (GIBCO-BRL) 배양액으로 교환해 준 다음 24 시간 동안 배양하면서 배양액으로 분비된 베타 아밀로이드 펩티드의 양을 베타 아밀로이드 펩티드에 선택적인 항체를 사용한 ELISA 방법으로 정량하였다. 그 결과로서, 가장 빠른 성장속도와 가장 많은 베타 아밀로이드 펩티드 발현 양을 나타내는 클론 #79를 선별하였다.
단계 B: 수용성 베타-아밀로이드 전구체(
sAPP
)
ELISA
분석법
상기 돌연변이형 아밀로이드 전구체를 영구 발현시키는 세포주인 Neuro-2a APP751 NFEV # 79 세포를 24-well 배양용기에 각 well 당 3 X 105 개의 세포를 넣고 6% CO2의 존재 하에서 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포가 배양용기를 완전히 덮을 정도로 자라면, 300 ul의 1 ug/ml Doxicycline과 각 단계별 농도로 희석시킨 베타 세크리타제 저해제 (실시예 화합물)를 함유한 Opti-MEM (GIBCO-BRL)으로 교환해준 뒤 다시 24 시간 동안 배양했다. 상기 배양액으로 분비된 수용성 베타-아밀로이드 전구체 발현 양은 Human sAPP assay kit (IBL)를 사용하여 제조사의 실험계획안에 따라 측정하였으며, 간략히 기술하면 다음과 같다.
100 ul의 각 농도로 희석된 수용성 베타-아밀로이드 전구체 또는 세포 배양 액을 항체가 표면에 코팅된 plate에 첨가하고 상온에서 4 시간(또는 4℃에서 하루 이상)반응시켰다. 세척액(0.05% Tween20가 첨가된 PBS)으로 7 회 세척해 준 다음, 항체 희석용액(1% BSA, 0.05% Tween20가 첨가된 PBS)으로 30 배 희석한 HRP(horse radish peroxidase) 부착 항체 100 ul를 첨가한 뒤 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 세척액으로 9 회 세척해 준 다음 TMB 용액 100 ul를 가하고 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 1N 황산(H2SO4) 용액 100 ul를 가하고 상온에서 30 분 동안 반응시킨 후, microplate reader (SpectraMax 340, Molecular Device)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 측정값을 합성 화합물이 첨가되지 않고 1%의 DMSO만을 처리한 대조군에서의 측정값과 비교함으로써 세포 내 베타 세크리타제 활성도의 50%를 저해하는 합성 화합물의 농도, 즉, IC50를 결정하였다.
실험예 6: 베타 아밀로이드 단백질 분석 시험
베타 아밀로이드 단백질(beta-amyloid)은 두 개의 항체를 사용하는 효소결합 면역항체 분석법(ELISA)을 통하여 정량을 실시하였다(Human beta amyloid 1-40 colorimetric immunoassay kit, Biosource, California, USA). 효소결합 면역항체 분석법에 사용되는 두개의 항체는 베타 세크리타제에 의해 잘려진 베타 아밀로이드 단백질의 N-말단을 특이적으로 인지하는 항체와 C-말단에 결합하는 항체로 구성된다. 두개의 항체와 베타 아밀로이드 단백질을 상온에서 3 시간 (또는 4℃에서 하루 이상) 동안 반응시킨 후, 세척액으로 4 회 세척하고 HRP(horseradish peroixdase) 부착 항 토끼 IgG 항체(anti-rabbit IgG's peroxidase antibody)에 30 분 반응시켰다. 세척액으로 4 회 세척해 준 다음 HRP의 기질인 tetramethylbenzidine을 가하고 상온에서 30 분 동안 반응시킨 뒤 microplate reader (SpectraMax 340, Molecular Device)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이 측정값을 대조군에서의 측정값과 비교함으로써 베타 아밀로이드 단백질의 감소 정도를 결정하였다.
sAPPbeta (secreted amyloid precursor protein beta) 단백질의 경우도 베타 아밀로이드 단백질을 정량하기 위해 사용된 효소결합 면역항체 분석법과 동일한 방법으로 진행된다.
실험예 7: 동물 시험 (
in vivo
assay)
베타 세크리타제의 활성이 억제되는 것을 확인하기 위하여 베타 세크리타제의 산물인 베타 아밀로이드 단백질의 생성 저해 정도를 동물에서 시험하였다. 시험에 사용된 동물은 베타 아밀로이드 단백질 전구체의 Swedish 돌연변이 유전자(chimeric mouse/human amyloid precursor protein 695swe)와 프레세닐린 1의 돌연변이 유전자(presenilin 1-dE9)가 함께 들어있는 형질전환 마우스(Jankosky JL et al., Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, 2001)이다. 베타 세크리타제 억제제는 복강 투여법 또는 피하 투여법을 통하여 아밀로이드 단백질의 감소 효과는 보이지만 독성은 없을 것으로 예상되는 농도로 투여 된다. 약물의 투여 후 정해진 시간에 동물을 마취시키고 혈액과 뇌조직을 분리하였다. 혈액은 심장 채혈을 통하여 헤파린이 코팅된 튜브에 모으고 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리(Eppendorf) 한 다음 혈장만을 분리하였고 적출한 뇌조직(대뇌 피질과 해마)과 함께 분석하기 전까지 80℃에서 보관하였다. 분석을 위하여 혈장은 5 배 희석하고 위에 언급된 효소결합 면역항체 분석법을 통하여 혈장에서의 아밀로이드 단백질의 억제 효과를 확인하였다. 적출된 뇌조직은 4배 볼륨의 PBS를 넣은 후 초음파분쇄기에서 뇌조직을 분쇄시키고 8.2 M guanidine /82 mM Tris HCl (pH 8.0)을 사용하여 최종적으로 5M Guanidine 농도로 상온에서 4 시간 반응시킨 후 베타 아밀로이드 단백질을 추출하였고 BSAT-DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline with 5% BSA and 0.03% Tween-20) 용액을 사용하여 베타 아밀로이드 단백질을 1:500 희석한 후 분석하였다.
실험예 8: Dosing and formulation
약물은 10% HPCD (hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin)에 녹인 후 일반적으로 15 mg/kg에서 100mg/kg 사이의 농도로 단 회 또는 하루에 3 번에서 5 번 반복 투여하였다.
본 발명의 화합물은, Ki 의 범위가 약 0.1 uM에서 500 uM, 바람직하게는 약 0.1 uM 내지 100 uM, 더욱 바람직하게는 약 0.1 uM 내지 10 uM 이며, 대표적 실시예의 Ki 는 하기 표 5와 같다.
[표 5]
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은 인간 베타 세크리타제에 대해 우수한 저해 효과를 발휘한다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 인지 기능 개선 또는 알츠하이머병 등과 같은 신경 변성 질환의 예방 및 치료를 위한 약제로서 사용될 수 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
Claims (18)
- 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체:상기 식에서,n은 0~3이고;W는 직접 결합이거나, 또는 N 또는 O를 선택적으로 1~2개 포함하거나 옥소 그룹을 포함하는 4~8원 환이며;X 및 X'는 각각 독립적으로 직접 결합이거나, -NR-, -O-, -(CH2)m-C(O)-, -NRC(O)-, -C(O)-(CH2)m- 및 -(CH2)m-C(O)NR- 로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 m은 0~2이고, R은 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;Y 및 Z는 각각 독립적으로 N, S, 또는 O이고;R1은 수소, -NH2, -(CH2)p-R5, -O-(CH2)p-R5, -C(O)-(CH2)p-R5, 및 -N[(CH2)p-R5][(CH2)p-R5']로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, p는 0~4이고, R5 및 R5'는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;R2는 수소, 할로겐, 알킬, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고;R3는 직접 결합이거나, 수소 또는 -(CH2)q-R6로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, q은 0~3이고, R6은 수소, 아미노, 히드록시, 알킬, 알콕시, 아릴, 알킬-아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 알킬-헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;R4는 수소, -(CH2)r-R7, -(CH2)r-O-R7 알콕시 및 -(CH2)r-N-R7로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서, r은 0~2이고, R7은 수소, 아미노, 히드록시, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 알킬 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되며;상기에서, 알킬, 알콕시, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴은 치환 또는 비치환 구조일 수 있으며, 치환된 경우, 치환체는 히드록시, 할로겐, 니트릴, 아미노, C1-C4 알킬 아미노, C1-C4 디알킬아미노, C1-C4 알킬, C1-C4 알킬 알콕시, 아릴 알콕시 및 옥소로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상이고,상기 헤테로아릴 및 헤테로사이클은 각각 독립적으로, N, O 및 S로 구성된 군에서 선택된 1~3개의 헤테로 원자를 포함하며, 0~3 개의 이중결합을 포함하는 4~8원 환이다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 W는 직접 결합이거나, 또는 N 원자를 1 또는 2개 포함하거나 옥소를 포함하는 5 또는 6원 환인 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 1 항에 있어서, R1은 수소, -O-(CH2)p-R5, -N(H)-(CH2)p-R5 및 -N[(CH2)p- R5][(CH2)p-R5]로 이루어진 군에서 선택되며, 여기서 p은 0~4이고, R5는 수소, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로사이클 및 헤테로아릴로 이루어지는 군에서 선택되며, 상기 헤테로아릴 및 헤테로사이클은 1 또는 2 개의 이중결합을 포함하는 5~6원 환인 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 4 항에 있어서, R1은 수소, 아미노, 알킬아미노, 디알킬 아미노, 시클로알킬 아미노, 헤테로사이클 아미노, 아릴 아미노, 헤테로사이클, 알콕시 시클로알킬-알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 4 항에 있어서, R1은 아미노, 시클로펜틸 아미노, 테트라하이드로퓨라닐 아미노, 페녹시, 디이소펜틸 아미노 및 시클로펜틸메틸옥시로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 R2는 수소, 할로겐, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합 물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 7 항에 있어서, 상기 R2는 수소, Cl, F, 메틸, 메톡시 및 페녹시로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 X 및 X'는 각각 독립적으로 직접 결합이거나, 또는 -NR-, -(CH2)m-C(O)-, -NRC(O)- 및 -(CH2)m-C(O)NR-로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 9 항에 있어서, 상기 X 및 X'는 각각 독립적으로 직접 결합이거나, -NH-, -C(O)-, -CH2-C(O)-, -C(O)NH- 및 -(CH2)2-C(O)NH-로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 R3는 수소, 히드록시, 아미노, 알킬, 알콕시, 페닐, 벤질, 헤테로아릴, 및 C1-C3 알킬-헤테로사이클로 이루어진 군에서 선택되고, 여기 서, 알킬, 페닐, 벤질, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클은 치환 또는 비치환 구조일 수 있으며, 치환된 경우 치환체는 히드록시, 할로겐, 아미노, 알킬 아미노, 디알킬 아미노 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 11 항에 있어서, 상기 R3는 수소, 히드록시, 아미노, 디메틸아미노, 아세틸아미노, 메틸, 히드록시메틸, 아세틸, 히드록시아세틸, 페닐, 벤질, 2-플루오로페닐, 4-플루오로페닐, 피리딘-2-일, 테트라하이드로퓨란, 2-(몰포린-1-일)에틸, 및 (3-디메틸아미노)벤질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 1 항에서, 상기 R4는 수소, 알킬, 아릴, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 13 항에 있어서, 상기 R4는 수소인 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 표의 화합물들로부터 선 택되는 것을 특징으로 하는, 화학식 I로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염 또는 이성질체:(S)-2-[4-(히드록시에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(R)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피페라진-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-벤질-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-(4-플루오로페닐)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-(2-플루오로페닐)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-(피리딘-2-일)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-(하이드록시아세틸)-피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(R)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-(테트라하이드로퓨란-4-일)아미노-1-H-인돌(S)-2-[(S)-3-(3-디메틸아미노)벤질아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피페라진-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[(S)-3-(3-디메틸아미노)벤질아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[(S)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[(R)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-아세틸피페라진-4-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-디시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[(S)-3-아세틸아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[(S)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[(R)-3-아미노-피롤리딘-1-일-에틸]-4,5-디하이드로-티아졸린-2-일]-5-페녹시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-메틸)티아졸-2-일]-5-클로로-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(R)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-플루오로 -7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-메톡시-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(피롤리딘-1-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-메틸-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌(S)-2-[4-(1-아세틸-피롤리딘-4-일-에틸)-4,5-디하이드로티아졸린-2-일]-5-메틸-7-시클로펜틸아미노-1-H-인돌
- 활성 성분으로서 약리학적 유효량의 제 1 항에 따른 화학식 I의 화합물, 약제학적으로 허용되는 그의 염 또는 이성질체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 베타 세크리타제 저해용 약제 조성물.
- 제 16 항에 있어서, 상기 약제 조성물은 인지 기능 개선 또는 신경 변성 질환을 치료 내지 예방하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
- 제 17 항에 있어서, 상기 조성물은 알츠하이머병을 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
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WO2010076884A1 (ja) * | 2008-12-29 | 2010-07-08 | 武田薬品工業株式会社 | 新規縮合環化合物およびその用途 |
-
2007
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