KR20090031938A - 방향성 진화로 촉매 작용을 최적화시킨 키메라 징크 핑거 리컴비나제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 작동적으로 연결된 세린 리컴비나제를 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질에 관한 것으로, 상기 키메라 리컴비나제 단백질은 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인을 통해 특이적으로 결합된 DNA 부위에서 부위 특이적 재조합을 촉진한다. 상기 세린 리컴비나제는 몇몇 천연 발생 세린 리컴비나제 중 하나일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 키메라 리컴비나제를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포, 재조합을 수행하기 위하여 키메라 리컴비나제를 사용하는 방법, 추가적인 키메라 리컴비나제를 생성하기 위한 기질-연결된 단백질 진화법을 사용하는 방법, 유전자 치료를 위하여 키메라 리컴비나제를 사용하는 방법 및 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
전후 참조
본 출원은 2006년 7월 5일에 제출되고 발명의 명칭이 "방향성 진화로 촉매 작용을 최적화시킨 키메라 징크 핑거 리컴비나제"인 Barbas, III 등의 미국 가명세서 출원 제60/818,908호를 우선권으로 주장하며, 상기 가명세서 출원은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 신규한 DNA 결합 도메인, 바람직하지만 비제한적인 예로서 하나 이상의 징크 핑거 도메인 및 재조합을 촉진하는 촉매 활성을 가지는 하나 이상의 도메인을 도입한 키메라 리컴비나제, 방향성 진화에 의해 이들 리컴비나제의 활성을 최적화하는 방법뿐 아니라, 유전자 치료법에서의 키메라 리컴비나제 및 상기 방법의 적용 및 다른 유기체에서의 DNA 변형, 예를 들어 작물, 동물 및 산업용 유기체에 원하는 표현형을 부여하기 위한 변형에 관한 것이다.
현재, 표적화되고 부위 특이적인 내재성 인간 게놈의 재조합을 가능하게 하는 유전자 치료법에 대한 전략은 없다. 그러한 전략은 유해 유전자를 신속하게 절 제하고 유리한 유전자를 안전하게 통합할 수 있다.
Cre-loxP 재조합 시스템으로 인해 연구진들은 생체 내에서 분리 세포들의 게놈을 효과적으로 변경시킬 수 있다. 일단 상동성 재조합으로 게놈의 lox 부위가 도입되면, 이들 유전자좌에서 Cre 리컴비나제가 절단, 역위 또는 통합을 촉진할 수 있다. 이러한 대변혁의 도구는 배발생 과정에서 세포 계통을 설명하고 유전자 불활성화를 유도하면서 배아에 치명적이지 않도록 하는 것을 포함하는 신규한 용도를 계속 발견해내고 있다(16). Cre의 개발로 인해, 부위 특이적 리컴비나제(SSR)인 φC31 인테그라제 및 Flp 리컴비나제는 유전자 조작 도구를 구성한다.
그 이름에 어긋나지 않게, SSR은 천연 기질 내에 존재하는 ~28 bp 재조합 부위에 대해 고도로 특이적이다. 몇몇 돌연변이 재조합 부위가 기능성인 것으로 밝혀졌지만, 이러한 기본적인 요건이 내재성 게놈에 대한 SSR의 적용을 대체로 불가능하게 한다. 상동성 재조합의 필요조건에 의한 제약으로, SSR은 여러 가능한 용도가 제한되며, 아마도 가장 중요한 것은 유전자 치료법일 것이다. 이러한 제약이 동기가 되어 몇몇 그룹에서 방향성 단백질 진화에 의해 SSR 기질의 특이성을 변형시켰다(18, 53, 54). Calos 및 그 연구진들은 φC31이 효과적인 통합을 매개하는 내재성 인간 및 마우스 게놈 내의 "가성" attP 부위들을 특성규명하였다(65). 연접부 수포성 표피박리증(48), 듀센 근이영양증(50) 및 쥐 유전성 타이로신 혈증 I형(31)의 치료에 대한 이 효소의 적용은 내재성 부위 특이적 재조합의 치료 가능성을 제시하는 것이다.
Cre 및 φC31이 새로운 기질을 조준하는 정도는 이의 DNA 결합 상호작용의 구조적 체제에 의해 제한된다. 티로신 리컴비나제, 예컨대 Cre는 동일한 단백질 도메인으로 DNA 결합 및 촉매 작용을 매개한다. 이러한 배열은 모든 가능한 DNA-단백질 상호작용의 기하형태를 제한하며, 외인성 DNA 결합 도메인으로의 치환을 불가능하게 한다. 특히, 하나의 돌연변이 Cre-기질 상호작용의 특성규명으로 인식이 정확하지는 않은 것으로 밝혀졌다 - 변경된 염기쌍에 대한 접촉은 가교성 물 분자에 의해 매개된다(7). 잘 특성규명된 티로신 리컴비나제와는 대조적으로, φC31 인테그라제 및 다른 거대한 세린 리컴비나제의 기능은 대개 불분명하다. 3차원 단백질 구조 또는 기존의 DNA 결합 도메인의 부재 하에, Calos와 그 연구진들은 랜덤 돌연변이를 전체 단백질 서열에 적용시켜 φC31을 진화시켰다(54). 거대 세린 리컴비나제의 변형은 중요한 DNA 결합 영역의 잠재적 다양성에 의해 더욱 복잡해진다(2).
따라서, 내재성 개놈의 표적화되고 부위 특이적인 재조합을 촉진하는 더욱 일반화된 방법, 특히 유전자 치료법과, 그러한 표적화되고 부위 특이적인 재조합을 촉진할 수 있는 효소가 필요하다. 이는 특히 유전자 치료법에 유용하지만, 산업용 유기체 및 농업용 식물 및 동물의 변형에서의 용도 및 유전자 클로닝을 비롯하여 분자 생물학에 있어 여러 다른 용도를 가진다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 일 측면은, 키메라 리컴비나제 단백질이 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 DNA 부위에서 부위 특이적 재조합을 촉진하고, 세린 리컴비나제가 키메라 단백질 환경에서 효과적으로 재조합을 촉진하도록 선택 또는 진화되도록 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 작동적으로 연결된 세린 리컴비나제를 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질이다. 통상적으로, 세린 리컴비나제 도메인은 일반적인 가닥 교환 기전을 촉진하는 촉매적 세린 친핵체를 가지는 리컴비나제 도메인이다. 특히 바람직한 키메라 리컴비나제 단백질은, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 융합된 Tn3, Hin, 또는 Gin로부터 유래한 도메인을 가지는 Tn3GAGGAG, HinGAGGAG, 및 GinGAGGAG를 포함한다. 다른 키메라 리컴비나제 단백질은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 그러한 키메라 리컴비나제 단백질은, 키메라 리컴비나제 단백질이 Tn3Ch15G이고 Tn3으로부터 유도된 돌연변이된 세린 리컴비나제를 가지는 키메라 리컴비나제 단백질; 키메라 리컴비나제 단백질이 GinL7C7H1이고 Gin으로부터 유도된 돌연변이된 세린 리컴비나제를 가지는 키메라 리컴비나제 단백질; 키메라 리컴비나제 단백질이 GinL7C7P2이고 Gin으로부터 유래한 돌연변이된 세린 리컴비나제를 가지는 키메라 리컴비나제 단백질; Hin 및 Gin의 상응하는 상동성 잔기의 돌연변이와 함께, 하기 (1) 내지 (4)의 돌연변이 중 하나 이상이 세린 리컴비나제에 도입된 키메라 리컴비나제 단백질: (1) Tn3 세린 리컴비나제 촉매 도메인 내의 G70S, D102Y, 또는 E124Q; (2) Hin 세린 리컴비나제 촉매 도메인 내의 H107Y; (3) Gin 세린 리컴비나제 촉매 도메인 내의 M70V, T96A, 또는 H106Y; 또는 (4) Tn3 세린 리컴비나제 촉매 도메인 내의 I12V, D13G, K65R, M73V, I80M, V108A, K53E, 및 K151M; 세린 리컴비나제가 D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V, Y109H, M114V, 및 K148M의 돌연변이 전부를 포함하는 Gin 도메인인 키메라 리컴비나제; 또는 세린 리컴비나제가 D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V, 및 M114V의 돌연변이 전부를 포함하는 Gin 도메인인 키메라 리컴비나제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기한 바와 같은 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열이다. 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기한 바와 같은 DNA 서열을 포함하는 벡터이다. 이 벡터는 발현 벡터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기한 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(1) 스페이서에 의해 분리되어 있고, 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제 단백질에 결합하는 2 이상의 부위를 가지는 DNA 서열을 제공하는 단계; 및
(2) DNA 서열의 양 가닥이 키메라 리컴비나제에 특이적으로 결합하는 2개의 부위 사이에서 분해되는 부위 특이적 재조합 사건을 하나 이상의 키메라 리컴비나제가 촉진하는 조건 하에 상기 DNA 서열을 키메라 리컴비나제와 반응시켜 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계
를 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은,
(1) 각각, 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 결합하는 부위 를 가지는 제1 서열 및 제2 서열의 2개의 DNA 서열을 제공하는 단계; 및
(2) 상기 제1 서열 및 제2 서열의 양 가닥이 분해되는 부위 특이적 재조합 사건을 키메라 리컴비나제가 촉진하는 조건 하에 상기 제1 서열 및 제2 서열을 하나 이상의 키메라 리컴비나제와 반응시켜 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계
를 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(1) 제1 서열 및 제2 서열의 2개의 서열을 제공하는 단계로서, 상기 제1 서열 및 제2 서열 중 하나는 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 결합하는 부위를 가지며, 상기 제1 서열 및 제2 서열 중 나머지 하나는 하나 이상의 천연 발생 세린 리컴비나제에 결합하는 부위를 가지는 것인 단계; 및
(2) 상기 제1 서열 및 제2 서열의 양 가닥이 분해되는 부위 특이적 재조합 사건을 키메라 리컴비나제 및 천연 발생 세린 리컴비나제가 촉진하는 조건 하에 상기 제1 서열 및 제2 서열을 하나 이상의 키메라 리컴비나제 및 천연 발생 세린 리컴비나제와 반응시켜 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계
를 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(1) 각각의 부위가
(a) 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 최적의 결합 부위와 비교 하여 실질적으로 낮은 친화도에서 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 결합하는 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 대한 돌연변이된 결합 부위; 및
(b) 스페이서에 의해 분리되어 있고, 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 특이적으로 결합하며, 최적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 결합 부위
를 포함하는 재조합에 대한 2개의 부위를 가지는 DNA 서열을 제공하는 단계; 및
(2) DNA 서열의 양 가닥이 키메라 리컴비나제에 특이적으로 결합하는 2개의 부위 사이에서 분해되는 부위 특이적 재조합 사건을 하나 이상의 키메라 리컴비나제가 촉진하는 조건 하에 상기 DNA 서열을 하나 이상의 키메라 리컴비나제와 반응시켜 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계로서, 부위 특이적 재조합 사건은 통합이며, 재조합에 대해 기능성이 아닌 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 돌연변이된 결합 부위의 동종이량체가 형성되어 통합의 결과가 안정하게 되는 것인 단계
를 포함하는 DNA 분자 내에서 안정한 통합을 실시하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(1) 본 발명에 따른 하나 이상의 제1 키메라 리컴비나제와 반응성인 제1의 재조합 부위를 가지는 제1 DNA 서열을 제공하는 단계;
(2) 본 발명에 따른 하나 이상의 제2 키메라 리컴비나제와 반응성인 제2의 재조합 부위를 가지는 제2 DNA 서열을 제공하는 단계로서, 상기 제1 부위 및 제2 부위는 기능적으로 오르소고날인 단계; 및
(3) 상기 제1 DNA 서열을 하나 이상의 제1 키메라 리컴비나제와 반응시키고 상기 제2 DNA 서열을 하나 이상의 제2 키메라 리컴비나제와 반응시켜 재조합을 실시하는 단계
를 포함하는 DNA 분자 내에서 재조합을 실시하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(1) (a) 제1 촉매 도메인과 제1 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제를 발현하고 제1 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1 플라스미드; 및
(b) 제2 촉매 도메인과 제2 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제를 발현하고 제2 항생제 내성 유전자를 발현하는 제2 플라스미드의 2개의 플라스미드를 형성하는 단계로서, 상기 제1 촉매 도메인 및 제2 촉매 도메인이 서로 상이하고, 상기 제1 징크 핑거 도메인 및 제2 징크 핑거 도메인이 서로 상이하며, 제1 및 제2 항생제 내성 유전자는 2종의 다른 항생제에 대한 내성을 부여하는 것인 단계;
(2) 2개의 키메라 리컴비나제에 의한 플라스미드내 절단이 일어나지 않도록 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제 및 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제 중 하나에 각각 결합하는 비반복 동종이량체 부위를 가지는 상기 제1 유전자의 코딩 영역 및 제2 유전자의 코딩 영역을 측접시켜 2개의 카세트를 회합하는 단계;
(3) 각 플라스미드 내에 하나의 카세트를 삽입하여 카세트를 포함하는 2개의 플라스미드를 형성하는 단계; 및
(4) 카세트를 포함하는 제1 플라스미드 및 카세트를 포함하는 제2 플라스미드로 박테리아 숙주를 동시 형질감염시켜 재조합을 수행하는 단계
를 포함하는 카세트 교환 촉진 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은
(1) (a) 제1 촉매 도메인과 제1 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제를 발현하고 제1 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1 플라스미드로서, 상기 제1 키메라 리컴비나제가 제1 유전자의 내재성 측접 서열에 결합하도록 돌연변이 또는 선택되는 제1 플라스미드; 및
(b) 제2 촉매 도메인과 제2 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제를 발현하고 제2 항생제 내성 유전자를 발현하는 제2 플라스미드로서, 상기 제2 키메라 리컴비나제가 제2 유전자의 내재성 측접 서열에 결합하도록 돌연변이 또는 선택되는 제2 플라스미드
의 2개의 플라스미드를 형성하는 단계로서, 상기 제1 촉매 도메인 및 제2 촉매 도메인이 서로 상이하고, 상기 제1 징크 핑거 도메인 및 제2 징크 핑거 도메인이 서로 상이하며, 제1 및 제2 항생제 내성 유전자는 2종의 다른 항생제에 대한 내성을 부여하는 것인 단계;
(2) 2개의 키메라 리컴비나제에 의한 플라스미드내 절단이 일어나지 않도록 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제 및 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제 중 하나에 각각 결합하는 비반복 동종이량체 부위를 포함하는 2개의 내재성 측접 영역 각각에 의해, 제1 내재성 측접 영역에 측접한 제1 유전자를 포함하는 제1 카세트와 제2 내재성 측접 영역에 측접한 제2 유전자를 포함하는 제2 카세트의 2개의 카세트를 회합하는 단계;
(3) 각 플라스미드 내에 하나의 카세트를 삽입하여 카세트를 포함하는 2개의 플라스미드를 형성하는 단계; 및
(4) 카세트를 포함하는 제1 플라스미드 및 카세트를 포함하는 제2 플라스미드로 박테리아 숙주를 동시 형질감염시켜 재조합을 수행하는 단계
를 포함하는 카세트 교환 촉진 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는
(1) 무작위화된 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 사용하여 2개의 상용성 플라스미드에 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 단일 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 생성된 단일 하프 사이트 라이브러리로 적절한 숙주를 공동 형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;
(3) 선별을 위한 2종의 항생제를 사용하여 상기 형질전환체를 공동 유지하는 단계;
(4) 상기 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;
(5) 상기 적절한 숙주를 저농도로 재형질전환시키는 단계;
(6) 상기 재형질전환된 숙주를 상기 2종의 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장시키는 단계; 및
(7) 상기 2종의 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장하는 콜로니를 PCR로 단일방향 통합에 대해 스크리닝하여, cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위를 동정하는 단계
를 포함하는, cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위를 동정하는 방법이다.
유사하게, 본 발명의 또 다른 양태는
(1) 무작위화된 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 사용하여 2개의 상용성 플라스미드에 스페이서 서열을 포함하는 단일 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 생성된 단일 하프 사이트 라이브러리로 적절한 숙주를 공동 형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;
(3) 선별을 위한 2종의 항생제를 사용하여 상기 형질전환체를 공동 유지하는 단계;
(4) 상기 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;
(5) 상기 적절한 숙주를 저농도로 재형질전환시키는 단계;
(6) 상기 재형질전환된 숙주를 상기 2종의 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장시키는 단계; 및
(7) 상기 2종의 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장하는 콜로니를 PCR로 단일방향 통합에 대해 스크리닝하여, cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 단계
를 포함하는, cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 방법이다.
또한, 유사하게, 본 발명의 또 다른 양태는
(1) 2개의 상이한 DNA 결합 도메인 인식 서열, 선별 표적 서열 및 트랜스활성인자 서열을 포함하는 재조합 부위를 포함하는 표적 기질을 생성하는 단계;
(2) 상기 트랜스활성인자 서열에 완벽하게 상보성인 본 발명에 따른 고정된 키메라 리컴비나제 존재하에 상이한 DNA 결합 도메인을 갖는 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제의 라이브러리와 함께 상기 표적 기질을 항온처리하여 단일 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;
(3) 단계 (2)에서 생성된 단일 하프 사이트 라이브러리로 적절한 숙주를 공동 형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;
(4) 선별을 위한 2종의 항생제를 사용하여 상기 형질전환체를 공동 유지하는 단계;
(5) 상기 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;
(6) 상기 적절한 숙주를 저농도로 재형질전환시키는 단계;
(7) 상기 재형질전환된 숙주를 상기 2종의 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장시키는 단계; 및
(8) 상기 2종의 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장하는 콜로니를 PCR로 단일방향 통합에 대해 스크리닝하여, cis-불활성화 DNA 결합 도메인을 동정하는 단계
를 포함하는, cis-불활성화 DNA 결합 도메인을 동정하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는
(1) 리컴비나제 돌연변이의 라이브러리를 생성하여 돌연변이된 리컴비나제 도메인을 생성하는 단계;
(2) 돌연변이되지 않은 DNA 결합 도메인에 상기 돌연변이된 리컴비나제 도메인을 융합시켜 돌연변이된 융합 단백질의 라이브러리를 생성하는 단계;
(3) 상기 돌연변이된 융합 단백질의 라이브러리를, 기능적 선별을 위해, 리컴비나제 기질을 포함하는 플라스미드로 클로닝하는 단계; 및
(4) 리컴비나제의 활성에 의해 변경된 플라스미드를 선별함으로써 돌연변이된 활성 융합 단백질을 선별하는 단계
를 포함하는, 기존의 키메라 리컴비나제로부터 새로운 키메라 리컴비나제를 생성하기 위해 기질-연결된 단백질 진화법(substrate-linked protein evolution)을 이용하는 방법이다.
본 발명은 또한 유전자 치료법을 포함한다. 이러한 방법의 일 실시형태는
(1) 본 발명에 따른 부위 특이적 리컴비나제를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을, 게놈에 유해 유전자를 갖는 개체에 투여하는 단계로서, 상기 부위 특이적 리컴비나제는 발현될 경우 상기 게놈으로부터 상기 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 것인 단계; 및
(2) 상기 부위 특이적 리컴비나제를 발현시켜, 상기 게놈으로부터 상기 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 단계
를 포함하는, 재조합적 절단으로 상기 유해 유전자를 제거하는 유전자 치료법이다.
상기 방법의 또 다른 실시형태는
(1) 본 발명에 따른 부위 특이적 리컴비나제를 코딩하는 핵산을, 게놈에 유해 유전자를 갖는 개체에 투여하는 단계로서, 상기 부위 특이적 리컴비나제는 발현될 경우 상기 게놈으로부터 상기 유해 유전자를 제거하는 것인 단계;
(2) 상기 부위 특이적 리컴비나제를 발현시켜, 상기 게놈으로부터 상기 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 단계;
(3) 상기 유해 유전자에 대한 기능성 교체 유전자를 포함하는 핵산을 상기 개체에 투여하는 단계; 및
(4) 상기 부위 특이적 리컴비나제에 의해 촉진되는 재조합적 통합에 의해 상기 기능적 교체 유전자를 상기 게놈으로 삽입하는 단계
를 포함하는, 유해 유전자가 재조합적 절단으로 제거되고 그 후 재조합적 통합에 의해 교체되는 유전자 치료법이다.
본 발명의 또 다른 양태는, (1) 개선된 기능을 갖는 유전자를 포함하는 DNA 절편; 및 (2) 상기 개선된 기능을 갖는 유전자를 포함하는 DNA 절편이 유해 유전자의 게놈 좌위로 통합되도록 작용하는 본 발명에 따른 1종 이상의 키메라 리컴비나제를, 게놈에 유해 유전자를 갖는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 유해 유전자의 구조 또는 기능을 파괴하고, 선택된 게놈 좌위로 개선된 기능을 갖는 유전자를 전달하기 위해 치료적 통합이 행해지는 유전자 치료법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 약학 조성물이다. 본 발명에 따른 약학 조성물 중 하나는
(1) 치료적 유효량의, 전술한 것과 같은 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제 단백질; 및
(2) 약학적으로 허용 가능한 담체
를 포함한다.
본 발명에 따른 또 다른 약학 조성물은
(1) 치료적 유효량의, 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(2) 약학적으로 허용 가능한 담체
를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 의해 촉진되는 재조합 작용에 의해 생성된 트랜스제닉 유기체이다.
이 기법은 농작물, 동물, 미생물 및 다세포 유기체(예컨대 곤충)의 유전자 변형에 널리 이용될 것이다. 농작물과 동물의 유전자 변형은 질병에 대한 내성, 성장 프로필의 개선, 영양적 요건의 완화 또는 기타 목적을 비롯한 다양한 목적을 위해 이용될 수 있다.
이하에 개시하는 발명은 명세서, 첨부된 청구의 범위 및 첨부 도면을 참조하면 더욱 잘 이해될 것이다.
도면에서 도 1은 기질 20T-GFP-20T에 대하여 징크 핑거-리컴비나제 융합 단백질 Tn3GAGGAG에 의해 매개되는 재조합 사건의 개략도이다. (A) 4종의 효소 단량체가 도시되어 있다; 삼각형은 징크 핑거 도메인, 팔각형은 리컴비나제 촉매 도메인을 나타낸다. 윗쪽의 시냅스는 동종 사량체이긴 하지만, 명확성을 위해 4 가지의 상이한 색을 이용하였다. 상기 징크 핑거 도메인은 어느 한 가닥에서 그 동족체 서열(cognate sequence), 즉 GAGGAG(서열 번호 1)(밑줄침)에 결합한다. 역위된 결합 부위에 측접한 2개의 동일한 '스페이서' 영역은 진한 이탤릭체로 특별히 표시하였다. 절단 부위(별표로 표시함)에 있는 중심 염기쌍 AT는 분해 또는 역위가 일어나게 하는데; 반대 방향으로 부위를 갖는 시냅시스(synapsis)(도시됨)는 역위를 가능하게 하고, 동일 방향으로 부위를 갖는 시냅시스(도시되지 않음)는 분해를 가능하게 한다. 실선은 개재된 플라스미드 DNA를 나타내고; 점선은 인접한 염기쌍 간의 연결을 나타낸다. (B) 해당 플라스미드의 도해; 박스는 재조합 부위를 나타내고, 빗금은 각각의 리컴비나제 단량체의 위치를 나타낸다.
도 2는 RecZF 단백질 구조 및 20T 재조합 부위 사이의 RecZF 플라스미드 분해를 도시한다. (A) DNA 결합된 γδ 레솔바제(resolvase)(66)와 Zif268(24)의 정렬에 의해 추정한 RecZF 구조. (B) 20T 재조합 부위, ResA 및 ResB 사이의 RecZF 플라스미드 분해의 다이아그램; 기질과 생성물 PCR 밴드의 상대 강도는 이 반응의 정도를 나타낸다. 성공적인 분해 후에는 PCR 생성물 크기에 변화가 있다.
도 3은 자유 시냅시스에 의한 RecZF 부위 특이적 재조합을 도시한다. (A) 3 가지의 재조합 분석의 도해; 생성물 존재하에, 화살표로 표시된 프라이머는 특유의 PCR 밴드를 생성한다. (B) Tn3GAGGAG에 의한 부위 특이적 재조합: 분해(1039 bp, 1), 역위(1263 bp, 2) 및 통합(370 bp, 3). 3B를 제외하고 'B'는 모두 기질이 없는 PCR 대조군을 나타내며; 3B는 비특이적 통합에 대한 대조군이다.
도 4는 준최적 징크 핑거 결합 부위와 기질의 Tn3GAGGAG 재조합을 도시한다. (A) 단일방향 분해(1) 및 통합(2)에 대한 RE/LE 전략법의 도해. (B) 각각의 기질에 존재하는 재조합 부위; 진한 글씨는 징크 핑거-기질 불일치를 나타낸다. (C) 이종 부위에 대한 Tn3GAGGAG의 분해 PCR 분석(레인 1∼4), 및 약한 부위 동종 이량체에 대한 Tn3GAGGAG의 통합 분석(레인 5∼8); 각각의 이종 부위의 분해 생성물은 최적의 재조합 부위를 갖는 또 다른 플라스미드와 함께 항온처리하였다.
도 5는 카세트 교환 방법을 도시한다. (A) 카세트 교환 방법의 도해. 통합은 2개의 직교 부위 중 어느 하나에서 일어날 수 있으며(단, 한 부위에서의 분해 바로 다음에 다른 부위에서의 분해가 일어나야 함); 2개의 가능한 기전 중 하나만을 도시하였다. 여기서 p1 및 p2는 상이한 플라스미드 골격이며, '프라임(')'은 관심있는 카세트의 존재를 나타낸다. (B) GinL7C7H1(1) 및 GinL7C7P2(2)에 의한 선택적 역위. 윗열의 숫자는 기질의 DNA 결합 부위에 해당하고, 아랫열은 발현된 RecZF에 해당한다. (C) GinL7C7H1(1) 및 GinL7C7P2(2)에 의한 선택적 분해.
도 6은 촉매 도메인 스페이서 서열 바이어스를 조사하기 위한 PCR법을 도시한다. 꺾인 화살표는 프라이머 결합 부위를 나타낸다. 스페이서 서열 20T'은 도 1에 도시된 역위의 대칭 생성물이다.
도 7은 포유동물 세포에서의 RecZF 매개 분해를 예시하기 위한 시스템을 도시한다.
도 8은 내재성 유전자 CCR5 내에서의 RecZF 매개 절단를 평가하기 위한 방법을 도시한다. (A) CCR5의 4개의 엑손을 코딩하는 게놈 영역. (B) 4번째 엑손의 번역 영역 내에 존재하는 잠재적 RecZF 부위 중 일부의 지도. 'd32' 직사각형은 천연 ΔCCR5 변이체를 보유하는 개체에서 유실된 게놈 영역을 차지한다. ΔCCR5 돌연변이는, 이 HIV 보조 수용체를 무력화함으로써, 이 대립 유전자의 동형접합체 보유자에게 X5 HIV 감염으로부터의 전신 면역을 부여한다(38). 높히 그려진 백색 원은 20 bp 스페이서 부위이고, 낮게 그려진 회색 원은 22 bp 부위이다. 검게 그려진 2개의 원은 이. 콜라이에서의 특성 분석을 위해 선택된 후보를 나타낸다. (C) 선택된 부위에 대한 RecZF 분해의 평가; 4개의 선별된 하프 사이트 각각은 상이한 RecZF 단량체의 회합 및 공동 발현을 요할 것이다.
도 9는 무작위화된 DNA 결합 부위를 이용하여 Tn3GAGGAG에 대한 trans-활성화된("약한") 재조합 부위를 찾아내기 위한 방법을 도시한다. 이. 콜라이에서 기질과 함께 항온처리하게 되면, 이중 항생제 배지에서 단일방향 통합을 촉진하는 부위가 선별될 것이다.
도 10은 징크 핑거 도메인의 라이브러리부터 회합된 RecZFs를 이용하여 특정 6 bp DNA 결합 서열에 대한 대한 trans-활성화된("약한") RecZFs 재조합 부위를 찾 아내기 위한 방법을 도시한다.
도 11은 순차적 재조합에 의해 직교 부위에서 일어나는 안정한 통합 반응에 대한 2 가지 기전을 도시한다. (A) 2개의 상용성 플라스미드 간의 GFPuv(A) 카세트와 mCD2(B) 카세트의 교환; 이 반응의 생성물은 선별 배지에서 단리되고 2개의 PCR 프라이머의 독특한 조합에 의해 동정된다. (B) 단일방향 플라스미드 융합; 2개의 작은 카세트 분해 생성물(점선)은 복제 기점을 보유하고 있지 않기 때문에 유실될 것이다. 명확성을 위해 플라스미드를 도시하였으나 유전자는 염색체(들) 또는 선형 DNA에 의해 코딩될 수 있다.
도 12에서는 RecZF 디자인 및 기능 분석시험을 도시한다. (a) 감마 델타 리솔베이즈로 이합체화된 트리닥틸 RecZF 키메라의 모델. (b) 분해 및 역위 분석시험, 및 지향 진화에 사용된 기질과 RecZF 발현 플라즈미드의 조합. (c-e) Tn3Ch15G에 의한 20T 재조합 부위 사이에서, 부위 특이 분해(c), 역위(d), 및 통합(e)의 PCR 분석시험에 대한 도해. (f) Tn2Ch15G에 의한 20T 재조합 부위 사이에서 재조합에 대한 PCR 분석시험. 레인 1은 250, 500, 750, 1000, 4500 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 및 10,000 bp (프로메가 1 kb 래더)에서 분자량 표지를 포함한다. 분해 분석시험 결과가 레인 2와 7에 제시된다(Res(B), PCR 음성 제어). 성공적인 분해는 생성물 밴드의 강도를 증가시킨다[기질 밴드(1.8 kb)에 대해 (1.0 kb)]. 역위 분석시험(Inv) 결과가 레인 3과 8에 제시된다(Inv(B), PCR 음성 제어). 성공적인 통합은 생성물 밴드(0.4 kb)를 생성한다. G20T 재조합 부위가 함유되거 나(Int(+), 레인 4), 결실된(Int(-), 레인 5), 통합 반응을 제2의 플라즈미드 존재하에 수행하였다. 레인 6은 100, 200, 300, 400, 500, 600 700, 800, 900, 1000, 1200, 및 1500 bp(로체 100 bp 래더)에서 분쟈량 표지를 포함한다. 모든 분석시험에서, 플라즈미드를 전기천공에 의해 이. 콜라이(E. coli,)로 도입하고 배양을 37℃에서 밤새 유지하였다. PCR을 30 ng 플라즈미드 DNA에 의해 수행하고, 1% 아가로즈 겔 상에서 분석하였다. PCR 음성 제어 반응을 주형 없이 수행하였다(레인 7, 8 및 9). (g) 20T 스페이서 유도체(표 1)를 함유한, 카세트에 대해, 동일한 방식으로 수행된, 분해 분석시험: G18T-G-G18T(레인 1, 18-18), G18-T-G20T(레인 2, 18-20) G20T-G-G20-T(레인 3, 20-20), G22T-G-G20T(레인 4, 22-20), G22T-G-G22T(레인 5, 22-22), G20TC-G-G20T(레인 7, TC), G20TC4-G-G20T(레인 8, C4), G20TC5-G-G20T(레인 9, C5), G20TC6-G-G20T(레인 10, C6), G20TC4-G-G20T(레인 11, C7), G20G-G-G20T(레인 12, g). 레인 6은 프로메가 1 kb 래더를 함유한다. 주형 없이 수행된 음성 제어 PCR 반응은 f, 레인 7에 제시한다.
도 13에서는 RecZF G20G-G-G20T 리솔베이즈의 지향 진화를 도시한다. (a) 생성물 특이 선택 프라이머가 있는 기질-연결된 지향 진화(SLiPE). 레인 1은 프로메가 1 kb 래더를 포함한다. 선택 분석시험 결과를 레인 2-4에 제시한다. 성공적인 분해는 생성물 밴드(0.8 kb)를 생성한다. 레인 2) 이. 콜라이 중에서 37℃에 밤새 pB-GinL7C7G-G20G-G-G20T의 배양 후 분리된 생성물 혼합물(RecZF (+)); 레인 3) RecZF 기질 플라즈마드 pBSS-G20G-G-G20T(RecZF(-)); 레인 4) 주형 없이 수행된 PCR 음성 제어(RecZF(B)). (b) 출발 클론(sc; Tn3Ch15G, GinG, HinG) 및 나이브 라이브러리(1; Tn3L1G, GinL1G, HinL1G)로부터 상호 선택의 순환(2-8)을 통해 고활성 클론(*;Tn3L8C18G, GinL7C7G, HinL6C4G)으로 기능 개선. 레인 1은 프로메가 1 kb 래더를 포함한다. 주형 없이 수행된 음성 제어 PCR 반응은 f, 레인 7에 제시한다. 분해 분석시험을 이전에 설명한 방식으로 수행하였다. (c,d) 고활성 클론의 50% 이상 선택된 돌연변이체가 일차 서열 배열 내에 도시되어 있고(c), DNA 결합 감마 델타 리솔베이즈 이합체의 결정 구조상에 매핑되어 있다(d). 청색, 신규 Tn3 촉매 도메인 돌연변이; 녹색, 신규 Gin 촉매 도메인 돌연변이; 오렌지색, 신규 Hin, 촉매 도메인 돌연변이; 분홍색, 원 클론에 존재한 과도 활동 돌연변이; 적색, 촉매 세린, S10.
도 14에서는 GinL7C7 촉매 도메인의 특성을 도시한다. (a) 기질 H120G-G-H120T(H1) 및 P220G-G-P220T(P2) 상에서, GinL7C7H1(H1) 및 GinL7C7P2(P2)에 대해, 이전에 설명한 방식으로 수행된, 분해 및 역위 분석시험. 분해 분석시험 결과를 레인 1-t에 제시한다. 성공적인 분해는 생성물 밴드의 강도를 증가시킨다[기질 밴드(1.9 kb)에 대해 (1.1 kb)]. 레인 6은 프로메가 1 kb 래더를 포함한다. 역위 분석시험 결과를 레인 7-11에 제시한다. 성공적인 역위는 생성물 밴드(1.4 kb)를 생성한다. 분해(레인 1) 및 역위(레인 11) 분석 시험 모두에 대해 주형 없이 PCR 음성 제어 반응(-,-)을 수행하였다. (b-c) RecZF 기질 라이브러리를 이용한 스페이서 서열 바이어스의 분석. 5 bp 영역이 무작위화된 기질의 4개 풀과 GinL7C7G를 반응시킨, 이전에 설명된 방식으로 수행한, 역위 분석시험(b). 역위 관련 PCR 생성물을 겔 정제하고 서열화하였다. 기능성 스페이서에 대한 각 집합체의 서열화 크로마토그램(c, 좌측). 완전 스페이서 영역(20T 및 20G)은 5 bp 무작위화 영역이 단일 뉴클레오티드에서 중첩하는 2개의 기질 라이브러리로부터 크로마토그램의 합성에 의해 표시된다(위치 6, 표 1).
도 15는 인간 게놈의 표적화 부위 특이 분해를 나타낸다. (a) GinL7C7H1 분해를 위한 리포터 카세트의 단일 카피를 Flp-In 시스템에 의해 Flp-InTM 293 인간 배아 신장 세포로 도입하였다. (b,c,d) 상기 리포터 세포주를 공 pBabe-퓨로마이신 벡터(RecZF (-)), GinL7C7P2, 및 GinL7C7H1로서 형질도입하고, 퓨로마이신 선택에 의해 보강하였다(2 ㎍/mL). 9일간 형질도입한 후, 각 시료의 형광을 FACS에 의해 측정하였다(b). 형광이 감소된 세포의 백분율에 대해 3개의 독자적인 실험 간에 평균을 내였다(c). FACS 시료를 게놈 DNA 정제를 위해 용해시켰다. 단리된 DNA(100-400 ng)는 게놈 분해 분석시험을 위한 PCR 주형의 역할을 하였고((a)에서 도시한 프라이머를 사용), 1% 아가로즈 겔 상에서 결과를 분석하였다(d). 레인 1은 프로메가 1kb 래더를 포함한다. 분해 분석시험 결과를 레인 2-6 및 8에 제시한다(Res(B), PCR 음성 제어). 성공적인 분해는 기질 밴드(1.6 kb pb)에 대해 생성물 밴드(0.2 kb)의 강도를 증가시킨다. 레인 6은 로체 100 bp 래더를 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술용어와 과학용어는 본 발명이 속하는 기술의 당업자가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된, "핵산", "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드", 또는 유사 용어는 단일 가닥형 또는 이중 가닥형, 및 코딩형 또는 비코딩형(예를 들어, "안티센스")를 비롯하여, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 뜻한다. 상기 용어는 공지된 천연 뉴클레오티드 유사체를 함유한 핵산을 포함한다. 상기 용어는 또한 개질되거나 치환된 염기가 상보 뉴클레오티드의 와슨-크릭 결합을 방해하지 않거나 특이하게 결합하는 단백질, 이를테면 징크 핑거 단백질에 의해 뉴클레오티드 서열의 결합을 방해하지 않는 한 개질되거나 치환된 염기를 포함하는 핵산을 포함한다. 상기 용어는 또한 합성 골격이 있는 핵산 유사 구조체를 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 DNA 골격 유사체는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N=-카르바메이트, 모르폴리노 카르바메이트, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다[참조, Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)]. PNA는 비이온성 골격, 이를테면 N-(2-아미노에틸)글리신 단위를 함유한다. 포스포로티오에이트 결합은 예를 들어 미국특허 제6,031,092호; 제6,001,982호; 제5,684,148호에 기재되어 있다[참조, WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197]. 상기 용어에 의해 포함된 다른 합성 골격은 메틸포스포네이트 결합 또는 교호 메틸포스포네이트 및 포스포디에스테르 결합(참조예, 미국특허 제5,962,674호; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698), 및 벤질포스포네이트 결합(참조예, 미국특허 제5,532,226호; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156)을 포함한다. "핵산", "뉴클레오티드 서열" 등의 용어는 보체가 제외되지 않는 한 와슨-크릭 염기 짝짓기 규칙에 따라 정의된 서열의 보체를 추가로 포함한다. 핵산에 포함된 염기는 임의의 공지된 DNA와 RNA 염기 유사체를 포함하며, 이들은 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리딘일시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜텐일아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실, β-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜텐일아데닌, 우라실-5-옥시 아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시 아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시 아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시 아세트산, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. DNA는 cDNA, 시험관 내 중합화 DNA, 플라즈미드 DNA, 플라즈미드 DNA의 부분, 바이러스 유래 유전자 물질, 선형 DNA, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 재조합 DNA, 염색체 DNA, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA, 또는 이들 군의 유도체의 형태로 존재할 수 있다. RNA는 올리고뉴클레오티드 RNA, tRNA(트랜스퍼 RNA), snRNA(소형 핵 RNA), rRNA(리보좀 RNA), mRNA(메신저 RNA), 시험관 내 중합화 RNA, 재조합 RNA, 키메라 서열, 안티센스 RNA, siRNA(소형 간섭 RNA), 리보자임, 또는 이들 군의 유도체의 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된, "징크 핑거"(zinc finger), "징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인" 또는 유사 용어는 천연 및 인공 생성 징크 핑거 모두를 뜻한다. 이러한 징크 핑거는 다양한 골격(framework) 구조를 가질 수 있으며, 이 구조는 이를테면 C2H2, C4, H4, H3C, C3X, H3X, C2X2, 및 H2X2(여기서, X는 아연 결찰(ligating) 아미노산임)이나, 이에 한정되지 않는다. 이들 골격 구조에서, 징크 핑거 구조의 상세한 설명에서 통상적인 바와 같이, "C"는 시스테인 잔기를 나타내며 "H"는 히스티딘 잔기를 나타낸다. 골격 C2H2를 가진 징크 핑거는 예를 들어 미국특허 제7,101,972호(Barbas), 미국특허 제7,067,617호(Barbas et al.), 미국특허 제6,790,941호(Barbas et al.), 미국특허 제6,610,512호(Barbas), 미국특허 제6,242,568호(Barbas et al.), 미국특허 제6,140,466호(Barbas et al.), 미국특허 제6.140,081호(Barbas), 미국특허출원 공개 제20060223757호(Barbas), 미국특허출원 공개 제20060211846호(Barbas et al.), 미국특허출원 공개 제20060078880호(Barbas et al.), 미국특허출원 공개 제20050148075호(Barbas), 미국특허출원 공개 제20050084885호(Barbas et al.), 미국특허출원 공개 제20040224385호(Barbas et al.), 미국특허출원 공개 제20030059767호(Barbas et al.), 미국특허출원 공개 제20020165356호(Barbas et al.)에 기재된 징크 핑거를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 본 명세서에서 이들 문헌은 참고문헌으로 인용하고 있다. 다른 징크 핑거는 미국특허 제7,067,317호(Rebar et al.); 미국특허 제7,030,215호(Liu et al.); 미국특허 제7,026,462호(Rebar et al.); 미국특허 제7,013,219호(Case et al.); 미국특허 제6,979,539호(Cox III et al.); 미국특허 제6,933,113호(Case et al.); 미국특허 제6,824,978호(Cox III et al.); 미국특허 제6,794,136호(Eisenberg et al.); 미국특허 제6,785,613호(Eisenberg et al.); 미국특허 제6,777,185호(Case et al.); 미국특허 제6,706,470호(Choo et al.); 미국특허 제6,607,882호(Cox III et al.); 미국특허 제6,599,692호(Case et al.); 미국특허 제6,534,261호(Cox III et al.); 미국특허 제6,503,717호(Case et al.); 미국특허 제6,453,242호(Eisenberg et al.); 미국특허출원 공개 제2006/0246588호(Rebar et al.); 미국특허출원 공개 제2006/0246567호(Rebar et al.); 미국특허출원 공개 제2006/0166263호(Case et al.); 미국특허출원 공개 제2006/0078878호(Cox III et al.); 미국특허출원 공개 제2005/0257062호(Rebar et al.); 미국특허출원 공개 제2005/0215502호(Cox III et al.); 미국특허출원 공개 제2005/0130304호(Cox III et al.); 미국특허출원 공개 제2004/0203064호(Case et al.); 미국특허출원 공개 제2003/0166141호(Case et al.); 미국특허출원 공개 제2003/0134318호(Case et al.); 미국특허출원 공개 제2003/0105593호(Eisenberg et al.); 미국특허출원 공개 제2003/0087817호(Cox III et al.); 미국특허출원 공개 제2003/0021776호(Rebar et al.); 및 미국특허출원 공개 제2002/0081614호(Case et al.)에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 모두 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다. 예를 들어, 이들 특허 및 특허공보에 기재된 대안 하나는 소위 "D-가능 부위(D-able site)"와 이러한 부위에 결합할 수 있는 징크 핑거 모듈 또는 징크 핑거 DNA 결합 도메인의 사용과 관련되어 있다. "D-가능" 부위는 적절히 설계된 징크 핑거 모듈 또는 징크 핑거 DNA 결합 도메인이 3개의 표적 가닥이 아니라 4개의 염기에 결합하게 하는 표적 부위의 영역이다. 이러한 징크 핑거 모듈 또는 징크 핑거 DNA 결합 도메인은 이중 가닥 DNA 표적 절편의 한 가닥(표적 가닥) 상의 3개 염기의 트리플릿과 다른 상보 가닥 상의 4번째 염기에 결합한다. 단일 징크 핑거가 4개의 염기 표적 절편에 결합하는 것은 표적 가닥의 서열상에 그리고 징크 핑거의 아미노산 서열상에 모두 제약이 되게 한다. 표적 가닥 내의 표적 부위는 "D-가능" 부위 모티프 5' NNGK 3'을 포함해야 하며, 여기서 N과 K는 종래의 IUPAC-IUB 모호 코드이다. 이러한 부위에 결합하기 위한 징크 핑거는 -1 위치에 아르기닌 잔기를 포함하고 +2 위치에 아스파르트산(또는 더 바람직한 것은 아니지만 글루탐산)을 포함해야 한다. -1 위치에서 아르기닌 잔기는 D-가능 부위 중 G 잔기와 상호작용한다. 징크 핑거의 +2 위치에서 아스파르트산(또는 글루탐산)은 D-가능 부위 중 K 염기에 상보적인 반대쪽 가닥 염기와 상호작용한다. 명칭 D-가능 부위를 부여하는 것은 아스파르트산(기호 D)과 반대쪽 가닥 염기(4번째 염기) 사이의 상호작용이다. D-가능 부위 식에서 명백하듯이, 5' NNGG 3' 및 5' NNGT 3'인 D-가능 부위의 2개 아형이 존재한다. 전자의 부위에 대해, 징크 핑거의 +2 위치에서 아스파르트산 또는 글루탐산은 D-가능 부위의 반대쪽 가닥 중 C와 상호작용한다. 후자의 부위에서, 징크 핑거의 +2 위치에서 아스파르트산 또는 글루탐산은 D-가능 부위의 반대쪽 가닥 중 A와 상호작용한다. 일반적으로, NNGG가 NNGT에 비해 바람직하다. 3개의 핑거가 있는 ZFP의 디자인에서, 단백질 중 하나 이상의 핑거, 및 임의로, 2 또는 3개의 모든 핑거가 D-가능 부위를 결합하는 잠재성을 갖는 표적 부위가 선택되어야 한다. 이것은 세트 (x,a), (y,b) 및 (z,c)의 각각이 (N,N) 또는 (G,K)이며; (x,a), (y,b) 및 (z,c) 중 하나 이상이 (G,K)이고, N과 K는 IUPAC-IUB 모호 코드인, 식 5'-NNx aNy bNzc-3'인 더 큰 표적 유전자 내에서 표적 부위를 선택함으로써 달성될 수 있다. 환언하면, 상기 3개 세트 (x,a), (y,b) 및 (z,c) 중 하나 이상이 세트 (G,K)이다(세트의 첫 번째 위치가 G이고 두 번째 위치가 G 또는 T라는 것을 의미함). (G,K)가 아닌, 3개 세트(어느 것이든)는 (N,N)이다(세트의 첫 번째 위치는 임의의 뉴클레오티드에 의해 점유될 수 있으며 세트의 두 번째 위치는 임의의 뉴클레오티드에 의해 점유될 수 있다는 것을 의미함). 식 5'-NNx aNy bNzc-3'에서, NNx aNy 및 bNzc의 트리플릿은 ZFP 중 3개의 핑거에 의해 결합한 표적 가닥 상의 염기의 트리플릿을 나타낸다. x, y 및 z 중 단 하나가 G이고, 이 G에 K가 이어질 경우, 표적 부위는 단일 D-가능 아부위(subsite)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 징크 핑거 리컴비나제" 또는 "RecZFs"는 서열-특이적 결합 활성을 지닌 합성 또는 천연 발생 징크 핑거 또는 징크-핑커 유사 단백질로부터 유도된 뉴클레오티드 결합 도메인을 갖는 리컴비나제(recombinase)를 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전사 조절 도메인 또는 인자"는 유전자 전사를 조절하는 기능을 하는 본 명세서에 제공된 융합 폴리펩티드의 부분을의미한다. 예시적이고 바람직한 전사 억제자 도메인으로는 ERD, KRAB, SID, 탈아세틸화효소, 및 이들의 유도체, 다량체 및 조합체, 예컨대 KRAB-ERD, SID-ERD, (KRAB)2, (KRAB)3, KRAB-A, (KRAB-A)2, (SID)2, (KRAB-A)-SID 및 SID-(KRAB-A)가 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드 결합 도메인 또는 영역"은 특이적 핵산 결합 성능을 제공하는 본 명세서에서 제공된 폴리펩티드 또는 조성물의 부분을 의미한다. 그 뉴클레오티드 결합 영역은 대상 폴리펩티드를 특이적 유전자로 표적화하는 기능을 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 연결된"은 폴리펩티드의 원소들이, 예를 들면 각각 의도한 바 대로 수행하거나 기능을 하도록 연결된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 임의의 억제자는 결합 도메인에 부착되는데, 그 결합 도메인을 통해 표적 뉴클레오티드에 결합될 때, 그 억제자가 전사를 저해하거나 방지하는 작용을 하는 방식으로, 그 결합 도메인에 부착된다. 원소들 간의 연결 및 원소들 중의 연결은 예컨대 "링커"를 통해 직접적 또는 간접적일 수 있다. 원소들은 반드시 인접할 필요가 없다. 억제자 도메인은 해당 기술 분야에 잘 알려진 임의의 연결 절차를 이용하여 뉴클레오티드 결합 도메인에 연결될 수 있다. 2개의 도메인 사이에 링커 부위를 포함하는 것이 필요할 수 있다. 그러한 링커 부위는 전형적으로 도메인들 간의 이격을 제공하는 아미노산 잔기의 짧은 서열이다. 링커가 결합 또는 억제자 도메인의 기능 중 어느 것이든 방해하지 않는 한, 어떠한 서열이라도 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "조절(하는)"은 과다-활성화되어 있는 경우 징크 핑커-뉴클레오티드 결합 모티프를 함유하는 프로모터로부터 유래한 발현을 저해 또는 억제한다는 것, 또는 미활성화되어 있는 경우 그러한 프로모터로부터 유래한 발현을 증대 또는 강화한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 아미노산은, 본 명세서에서 나타나 있는 다양한 아미노산 서열에 존재하며, 아미노산의 잘 알려진, 3 문자 또는 1 문자 약어에 따라 확인된다. 뉴클레오티드는, 다양한 DNA 단편에 존재하며, 해당 기술 분야에서 일상적으로 사용된 표준 단일 문자 명칭에 따라 지정된다.
펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 해당 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 일반적으로 결과로 형성된 분자의 생물학적 활성을 변경하는 일 없이 이루어질 수 있다. 해당 기술 분야의 당업자라면, 일반적으로 폴리펩티드의 비-본질적인 영역에서 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 변경시키지 않는다는 점을 인식할 것이다[예를 들면, 문헌(Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, Benjamin/Cummings, p. 224) 참조]. 특히, 그러한 보존적 변형(conservative variant)은, 그 변경(들)이 단백질의 (보존적 변형의 ) 구조 및/또는 활성, 예를 들면 항체 활성, 효소 활성, 또는 수용체 활성을 실질적으로 변경시키지 않도록, 변성된 아미노산 서열을 갖는다. 그것은 아미노산 서열의 보존적 변성된 이형(modified variation), 즉 단백질 활성에 중요하지 않는 잔기의 아미노산 치환, 첨가 또는 삭제, 또는 심지어는 중요한 아미노산의 치환이 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경시키지 않도록 유사한 특성(예를 들면, 산성, 염기성, 양 또는 음 하전된 특성, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 잔기에 의한 아미노산의 치환을 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 목록은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 보존적 치환을 선택하기 위한 하나의 예시적인 가이드라인은 (최초 잔기/예시적인 치환에 의한 것): Ala/Gly 또는 Ser; Arg/Lys; Asn/Gln 또는 His; Asp/Glu; Cys/Ser; Gln/Asn; Gly/Asp; Gly/Ala 또는 Pro; His/Asn 또는 Gln; Ile/Leu 또는 Val; Leu/Ile 또는 Val; Lys/Arg 또는 Gln or Glu; Met/Leu 또는 Tyr or Ile; Phe/Met 또는 Leu 또는 Tyr; Ser/Thr; Thr/Ser; Trp/Tyr; Tyr/Trp 또는 Phe; Val/Ile 또는 Leu를 포함한다. 대안적인 예시적 가이드라인은 다음의 6가지 군을 사용하며, 각각은 서로에 대하여 보존적 치환인 아미노산: (1) 알라닌 (A 또는 Ala), 세린 (S 또는 Ser), 트레오닌 (T 또는 Thr); (2) 아스파르트산 (D 또는 Asp), 글루탐산 (E 또는 Glu); (3) 아스파라긴 (N 또는 Asn), 글루타민 (Q 또는 Gln); (4) 아르기닌 (R 또는 Arg), 리신 (K 또는 Lys); (5) 이소류신 (I 또는 Ile), 류신 (L 또는 Leu), 메티오닌 (M 또는 Met), 발린 (V 또는 Val); 및 (6) 페닐알라닌 (F 또는 Phe), 티로신 (Y 또는 Tyr), 트립토판 (W 또는 Trp)을 함유한다[또한 예를 들면 문헌(Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company; Schulz and Schimer (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag) 참조할 수 있다]. 해당 기술 분야의 당업자라면, 상기 확인된 치환은 유일하게 가능한 보존적 치환이 아니다는 점을 이해할 것이다. 예를 들면, 몇가지 목적으로, 당업자는 모든 하전된 아미노산을 이들이 양성이든 음성이든지 간에 서로에 대하여 보존적 치환으로서 간주할 수 있다. 또한, 단일 아미노산 또는 코딩된 서열내 아미노산의 작은 백분율을 변경, 첨가 또는 삭제하는 개별적인 치환, 삭제 또는 첨가도, 전달하고자 하는 단백질의 3차원 구조 및 기능이 그러한 이형에 의해 보존될 때, "보존적 변성된 이형"으로서 간주될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 플라스미드, 바이러스, 파지미드, 또는 이종 DNA, 예컨대 본 명세서에서 융합 단백질을 코딩하는 핵산 또는 본 명세서에서 제공된 발현 카세트의 삽입 또는 혼입에 의해 조작되는 해당 기술 분야에 공지된 기타 비히클(vehicle)을 의미한다. 그러한 발현 벡터는 전형적으로 세포내 삽입된 핵산의 효율적인 전사를 위한 프로모터 서열을 함유한다. 그 발현 벡터는 전형적으로 복제 기원, 프로모터 뿐만 아니라 형질전환된 세포의 표현형 선택을 허용하는 특이적 유전자를 함유한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포(host cell)"는 벡터가 증식될 수 있고 그 DNA가 발현될 수 있는 세포를 의미한다. 그 용어는 또한 대상 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 모든 자손은 복제 동안 발생하는 돌연변이가 존재할 수 있기 때문에 부모 세포와 동일하지 않을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 그러한 자손은 용어 "숙주 세포"가 사용되는 경우에도 포함된다. 외래 DNA가 숙주에서 연속적으로 유지되는 경우 안정한 전달의 방법은 해당 기술 분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자 치료법은 이러한 치료법이 추구되는 장애 또는 증상을 지닌 포유류, 특히 인간의 특정 세포, 표적 세포로의 이종 DNA의 전달을 포함한다. 그 DNA는 이종 DNA가 발현되고 따라서 코딩된 치료적 생성물이 생성되는 방식으로 선택된 표적 세포 내로 도입된다. 대안으로, 그 이종 DNA는 몇몇 방식에서 치료적 생성물을 코딩하는 DNA의 발현을 매개할 수 있거나, 또는 그것은 몇몇 방식에서 치료적 생성물의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 펩티드 또는 RNA와 같은 생성물을 코딩할 수 있다. 유전자 치료법은 또한 결함 유전자를 대체하는 유전자 생성물 또는 그것이 도입되는 포유류 또는 세포에 의해 생성된 유전자 생성물을 보충하는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산을 전달하는데 이용할 수 있다. 그 도입된 핵산은, 포유류 숙주에서 정상적으로 생성되지 않거나, 치료적으로 유용한 양에서 또는 치료적 유용한 시간에서 생성되지 않는 치료적 화합물, 예컨대 그것의 성장 인자 저해제, 또는 그것의 종양 괴사 인자 또는 저해제, 예컨대 그 것을 위한 수용체를 코딩할 수 있다. 치료적 생성물을 코딩하는 이종 DNA는 그의 생성물 또는 발현을 강화시키거나 달리 변경시키기 위해서 고통받고 있는 숙주의 세포 내로 도입하기 전에 변성될 수 있다. 유전자 치료법은 또한 유전자 발현의 저해자 또는 억제자 또는 조절자의 전달을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이종 DNA는 이것이 발현되는 세포에 의해 생체내에서 정상적으로 생성되지 않는 RNA 및 단백질을 코딩하는 DNA, 또는 전사, 번역 또는 다른 조절가능한 생화학적 과정에 영향을 미침으로써 내인성 DNA의 발현을 변경시키는 조정자를 매개 또는 코딩하는 DNA이다. 이종 DNA는 또한 외래 DNA라고도 칭할 수 있다. 임의의 DNA, 즉 해당 기술 분야의 당업자라면 그 DNA가 발현되는 세포에 대하여 이종성이거나 외래인 것으로서 인식하거나 간주하는 임의의 DNA는 본 명세서에서 이종 DNA에 포함된다. 이종 DNA의 예로는 미량 추적가능한 마커 단백질, 예컨대 약물 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 DNA, 치료적으로 유효한 물질, 예컨대 항암제, 효소 및 호르몬을 코딩하는 DNA 및 단백질의 기타 유형, 예컨대 항체를 코딩하는 DNA가 포함되지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 이종 DNA에 의해 코딩되는 항체는 그 이종 DNA가 도입되는 세포 표면 상에 분비되거나 발현될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 이종 DNA 또는 외래 DNA는 게놈에서 발견된 대응(counterpart) DNA 분자로서 정확한 배향 및 위치로 존재하지 않는 DNA 분자를 포함한다. 또한, 그 이종 DNA 또는 외래 DNA는 다른 유기체 또는 종(즉, 외인성)으로부터 유래한 DNA 분자를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 치료적으로 유효한 생성물은 이종 핵산, 전형적으로 DNA에 의해 코딩되는 생성물이며, 즉 숙주 내로의 핵산의 도입시, 증후, 선천적 또는 후천적 질환의 징후을 개선 또는 제거하거나, 또는 그 질환을 치료하는 생성물이 발현된다. 전형적으로, 소정의 유전자 생성물을 코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내로 클로닝되고, 일반적인 방법, 예컨대 칼슘-포스페이트 매개된 DNA 흡수(calcium-phosphate mediated DNA uptke)[문헌((1981) Somat. Cell. Mol. Genet. 7:603-616) 참조] 또는 미세주입( microinjection)에 의해, 프로듀서 세포, 예컨대 팩킹 세포 내로 도입된다. 프로듀서 세포에서 증폭 후, 이종 DNA를 함유하는 벡터는 선택된 표적 세포 내로 도입된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 발현 또는 전달 벡터는 외래 또는 이종 DNA가 적합한 숙주 세포에서 발현하기 위해 삽입될 수 있는, 즉 그 DNA에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드가 숙주 세포 시스템에서 합성되는 임의의 플라스미드 또는 바이러스를 의미한다. 하나 이상의 단백질을 코딩하는 DNA 분절(유전자)의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"라고 칭한다. 또한, 역전사 효소를 사용하여 생성된 mRNA로부터 cDNA(상보적 DNA)의 클로닝을 허용하는 벡터도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자는 핵산 분자, 즉 그 분자의 뉴클레오티드 서열이 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 유전자는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 유전자는 코딩 영역을 선행하는 영역 및 그 코딩 영역을 후행하는 영역(리더 및 트레일러 영역) 뿐만 아니라 개별 코딩 분절들(엑손) 간의 개입 서열(인트론)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 폴리펩티드 또는 기타 생분자와 관련하여 용어 "단리된"은 핵산 또는 폴리펩티드가 얻어지는 유전자적 환경으로부터 그 핵산 또는 폴리펩티드가 분리된다는 것을 의미한다. 또한, 그 용어는 생분자가 그 천연 상태로부터 변경된다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들면, 살아 있는 동물 내에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 천연 상태의 공존 물질으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "단리된" 것이다. 따라서, 재조합 숙주 세포 내에서 생성되고/되거나 그 세포 내에 함유되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것으로 간주한다. 또한, "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"라는 것은 재조합 숙주 세포로부터 또는 천연 공급원으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 화합물의 재조합 생성된 버젼은 문헌[Smith et al. (1988) Gene 67:3140]에 기술된 원-스텝 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. 용어 "단리된" 및 "정제된"은 경우에 따라 상호 교환가능하게 사용된다.
따라서, "단리된"은 핵산이 천연 발생 게놈에서 중요한 핵산을 코딩하는 유전자에 바로 측접하는 유전자의 코딩 서열을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 단리된 DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있으며, 게놈 DNA, cDNA, 재조합 하이브리드 DNA 또는 합성 DNA일 수 있다. 그것은 천연 DNA 서열과 동일할 수 있거나, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 삭제, 첨가 또는 치환에 의해 그러한 서열과는 상이할 수 있다.
이러한 "단리된" 또는 "정제된" 용어는 생물학적 세포 또는 숙주로부터 제조된 제제가 중요한 DNA 또는 단백질의 미정제 추출물을 비롯한 지시된 DNA 또는 단백질을 함유하는 임의의 세포 추출물을 의미한다는 것을 언급하는데 사용된다. 예를 들면, 단백질의 경우, 정제된 제제는 개별 기법 또는 제조 또는 생화학 기법의 시리즈를 수행하여 얻을 수 있으며, 중요한 DNA 또는 단백질은 이들 제제내 다양한 정도의 순도로 존재할 수 있다. 특히 단백질의 경우, 그 절차는 예를 들면 황산암모늄 분별화, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리, 일렉트로포커싱(electrofocusing), 크로마토포커싱(chromatofocusing), 및 전기영동을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
"실질적으로 순수한" 또는 "단리된" DNA 또는 단백질의 제제는 그러한 DNA 또는 단백질이 일반적으로 사실상 회합되어 있는 천연 발생 물질이 없는 제제를 의미하는 것으로 이해해야 한다. "본질적으로 순수한"은 중요한 DNA 또는 단백질의 95% 이상을 함유하는 "고도로" 정제된 제제를 의미하는 것으로 이해해야 한다.
중요한 DNA 또는 단백질을 함유하는 세포 추출물은 단백질을 발현하거나 중요한 DNA를 함유하는 세포로부터 얻어지는 균질 제제 또는 무세포 제제를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "세포 추출물"은 세포가 제거된 배양 배지, 특히 소모된 배양 배지를 포함한다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "조절한다"는 기능의 억제, 강화 또는 유도를 의미한다. 예를 들면, 징크 핑커-핵산 결합 도메인 및 이의 변형은 프로모터 내의 모티프에 결합하여 프로모토 서열을 조절할 수 있으며, 이로써 프로모터 세포 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 유전자의 전사를 강화 또는 억제한다. 대안으로, 조절은 징크 핑커-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 변형이 구조 유전자에 결합하고 그 유전자를 통한 판독으로부터 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 차단함으로써 유전자 전사를 저해하는 경우의 유전자 전사의 저해를 포함할 수 있다. 그 구조 유전자는 예를 들면 정상 세포 유전자 또는 종양 유전자일 수 있다. 대안으로, 조절은 전사물(transcript) 번역의 저해를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "저해한다"는 프로모터에 작동가능하게 연결된 구조 유전자의 전사의 활성화 수준의 억제를 의미한다. 예를 들면, 본 명세서의 방법의 경우, 유전자는 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 모티프를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "전자 조절 영역"은 표적 세포에서 유전자 발현을 유도하는 영역을 의미한다. 본 명세서에서 사용하기에 적합한 전사 조절 영역은 인간 거대세포바이러스(CMV) 극초기 인핸서/프로모터(human cytomegalovirus (CMV) immediate-early enhancer/promoter), the SV40 초기 인핸서/프로모터, JC 폴리오마 바이러스 프로모터, 알부민 프로모터, PGK 및 CMV 인핸서에 커플링된 α-액틴 프로모터를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 기타 전사 조절 영역도 해당 기술 분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자의 프로모터 영역은 구조 유전자에 대하여 5'에 전형적으로 존재하는 조절 원소 또는 원소들을 포함할 수 있으며; 복수 조절 원소들은 개입 뉴클레오티드 서열에 의해 분리되게 존재할 수 있다. 유전자가 활성화되는 경우, 전사 인자로서 공지된 단백질은 유전자의 프로모터 영역에 부착한다. 이러한 조립체는 효소가 제2 유전자 분절을 DNA에서 RNA로 전사하는 것을 가능하게 함으로써 "온 스위치(on switch)" 상태와 유사하다. 대부분의 경우, 결과로 형성된 RNA 분자는 특이적 단백질의 합성을 위한 주형으로서 작용을 한다: 경우에 따라서는 RNA가 자체 최종 생성물이다. 프로모터 영역은 정상 세포 프로모터일 수 있거나, 또는 종양-프로모터일 수 있다. 종양-프로모터는 일반적으로 바이러스 유도된 프로모터이다. 징크 핑커 결합 폴리펩티드가 표적화될 수 있는 바이러스 프로모터는 레트로바이러스 LTR(long terminal repeat) 및 렌티바이러스 프로모터, 예컨대 인간 T-세포 림프친화성 바이러스(HTLV) 1 및 2, 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1 또는 2를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "절단된" 또는 유사 용어는 천연 징크 핑커 결합 단백질에서 발견된 징크 핑커의 전체 수 미만을 함유하거나, 원하지 않는 서열을 삭제한 징크 핑커- 뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 유도체를 의미한다. 예를 들면, 천연적으로 9개의 징크 핑거를 함유하는 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 단백질 TFIIIA의 절단은 결과적으로 1개 내지 3개의 징크 핑거만을 지닌 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 용어 "연장된" 또는 유사한 용어는 추가의 징크 핑거 분자가 첨가되는 징크 핑거 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, TFIIIA는 3개의 징크 핑거 도메인을 첨가함으로써 12개의 징크 핑거로 연장될 수 있다. 또한, 절단된 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드는 1 초과의 야생종 폴리펩티드로부터 유래한 징크 핑거 분자를 함유할 수 있으며, 이로써 결과적으로 "하이브리드" 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드를 형성하게 된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "돌연변이 생성된, 돌연변이된(mutagenized)"은 단백질을 암호화하는 DNA의 무작위 또는 부위-유도된 돌연변이생성을 달성하기 위한 공지된 방법 중 어느 것이든 이용하여 얻어지는 징크 핑거 유도된 뉴클레오티드 결합 폴리펩티드를 의미한다. 실례를 들면, TFIIIA에서, 돌연변이생성은 공통 서열(consensus sequence)의 하나 이상의 반복부에서 비보존적 잔기를 대체하기 위해서 수행할 수 있다. 절단되거나 연장된 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 단백질은 또한 돌연변이생성될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 폴리펩티드 "변이체" 또는 "유도체"는 폴리펩티드의 돌연변이된 형태 또는 재조합을 통하여 생성되는 것이지만 리간드 또는 핵산 분자에 대한 결합능 또는 전사 조절능과 같은 소정 활성을 여전히 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 사용될 때, 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 "변이체" 또는 "유도체"는 징크 핑거 단백질의 돌연변이된 형태 또는 재조합을 통하여 생성된 것인 폴리펩티드를 의미한다. 변이체는 예컨대 제2 단백질의 징크 핑거 도메인(들)에 연결된 한 단백질로부터의 징크 핑거 도메인(들)을 함유하는 하이브리드일 수 있다. 상기 도메인은 야생형 또는 돌연변이형일 수 있다. "변이체" 또는 "유도체"는 야생형 단백질에 있는 본래의 수보다 적은 수의 핑거를 함유하는 야생형 징크 핑거 단백질의 절두형을 포함할 수 있다. 유도체 또는 변이체가 생성될 수 있는 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드의 예에는 TFIIIA 및 zif268이 포함된다. 비슷한 용어가 "변이체" 또는 "유도체" 핵 호르몬 수용체 및 "변이체" 또는 "유도체" 전사 이펙터 도메인을 의미하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용될 때 "징크 핑거-뉴클레오티드 결합 표적 또는 모티프"는 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 유도체 폴리펩티드가 특이적으로 결합되는 뉴클레오티드 절편의 임의의 2차원 또는 3차원 특징을 의미한다. 이러한 정의에는 DNA 이중 나선의 큰 홈과 작은 홈 및 면과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 DNA 이중 나선의 3차원적 양상뿐만 아니라 일반적으로 5 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 상기 모티프는 일반적으로 징크 핑거 폴리펩티드가 결합될 수 있는 적당한 길이의 임의의 서열이다. 예컨대, 3 핑거 폴리펩티드는 일반적으로 약 9개 내지 약 14개의 염기쌍을 갖는 모티프에 결합된다. 바람직하게는, 인식 서열은 게놈 내 특이성이 확보되도록 약 16개 이상의 염기쌍이다. 따라서, 임의의 특이성의 징크 핑거-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드가 제공된다. 징크 핑거 결합 모티프는 실험적으로 설계되거나 또는 징크 핑거 단백질이 결합되는 임의의 서열일 수 있다. 상기 모티프는 조절 서열, 엑손, 인트론 또는 임의의 비코팅 서열을 포함하는 임의의 DNA 또는 RNA 서열에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "약학적으로 허용 가능한", "생리학적으로 허용 가능한" 및 이의 문법적 변형은, 이것이 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 의미할 때, 상호 교체적으로 사용되며 물질이 조성물의 투여를 방해하는 정도의 메스꺼움, 현기증, 위장 장애 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 영향의 발생 없이 인간에게 투여될 수 있음을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 이것이 작동적으로 연결된 또다른 핵산을 상이한 유전 환경 간에 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 DNA 절편에 존재하는 구조적 유전자 생성물의 발현 및 자율 복제가 가능한 것들이다. 따라서, 벡터는 앞에서 개시한 선택적 마커 및 레플리콘을 포함하는 것이 바람직하다. 벡터는 발현 벡터를 포함하지만 반드시 이에 한정되지는 않는다.
DNA 단편을 포함하는 핵산 분자와 관련하여 본원에서 사용될 때, "작동적으로 연결된"이란 구는 작동적으로 연결된 부분이 의도하는 대로 기능하도록 단일 가닥 형태이든 또는 이중 가닥 형태이든 서열 또는 절편이 바람직하게는 종래의 인산이에스테르 결합에 의하여 DNA의 한 가닥에 공유 결합되었음을 의미한다. 본원에서 제공되는 전사 단위 또는 카세트가 작동적으로 연결된 벡터의 선택은, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 소정의 기능적 특성(예컨대, 벡터 복제 및 단백질 발현) 및 형질전환되는 숙주 세포에 직접적으로 의존하는데, 이것은 업계에서 재조합 DNA 분자의 구축에 대한 본질적인 한계이다.
본원에서 사용될 때, 치료 조성물의 투여는 임의의 수단으로 실시될 수 있으며 경구 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 흉골내 투여, 주입 기술, 복강내 투여 및 비경구 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 언급한 SSR의 개질 한계를 결정하는 인자를 인식하고, 외인성 DNA 결합 도메인의 모듈형 라이브러리를 사용하여 내인성 부위에 대한 재조합을 새로운 목표로 하였다. 친화도가 높고 109 이상의 상이한 18 염기쌍 서열에 대한 결합 특이성이 높아, 다중절 징크 핑거 단백질은 이러한 적용에 매우 적합하다. Cys2-His2 징크 핑거 모티프에 의하여 가능한 특유의 DNA 인지 방법으로부터, 우리 실험실은 트리뉴클레오티드 서열(23)을 결합시키는 모듈형 빌딩 블록을 유도하였다. 대부분의 CNN 및 TNN과 더불어 모든 GNN 및 ANN 트리플렛(22, 23, 55)에 상응하는 비천연 징크 핑거를 발견하였으므로, 이제 6∼18 bp DNA 부위를 우선적으로 결합시키는 다중절 단백질을 구축할 수 있다. 이들 신규 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질은 효과적으로 표적화된 전사 활성 및 억제(13, 14, 23, 27, 28, 40, 42, 56), DNA 절단(10, 11, 12, 20, 33, 39, 49, 57, 58) 및 유전자 통합(64)을 가진다. 최근에 Stark와 동료들은 천연 징크 핑거 단백질 Zif268을 초활성 Tn3 레솔바제 촉매 도메인(6)에 융합함으로써 제1 기능성 징크 핑거-리컴비나제를 구축하였다.
Stark의 Z-레솔바제는, 우리 실험실에서 동시에 회합시킨 징크 핑거-리컴비나제(RecZF)(데이터 비공개)와 더불어, Tn3 레솔바제의 모듈 구조로부터 영감을 얻었다. 세린 리컴비나제(59)의 '레솔바제/인버타제'의 구성원인 이러한 단백질은 [DNA(66)에 결합된 고도로 상동성인 γδ 레솔바제의 결정 구조에서 발견되는 바와 같이] 공간적으로 분리된 촉매 및 DNA 결합 도메인으로 구성된다. 기계학적인 연구(17, 19, 21, 30, 37, 44, 45, 52), 구조적 특성화(46) 및 기능적 키메라(3)는 모든 시냅스 상호작용이 리컴비나제 촉매 도메인에 의하여 매개되는 시냅시스의 'DNA-아웃사이드' 모델을 확인하였다(도 1). 고도로 배위 결합되는 절단 사례 및 대규모 복합체 재배열에 관한 많은 상세 사항이 알려지지 않고 있지만, DNA 결합 도메인은 대부분 중요하지 않은 역할을 하는 것이 명백한 것으로 보인다.
우리는 서열 특이적 리컴비나제가 새로운 유전자 요법의 중요한 성분일 수 있다고 예상한다. 우리의 1차적 연구는 징크 핑거-리컴비나제 융합 단백질이 효율적으로 부위 특이적 분해, 역위 및 통합을 촉매함을 밝힌다(도 1). 고등 진핵생물(41)에서 이미 관찰된 세린 인버타제 활성으로, RecZF는 생체내에서 포유동물 세포의 내인성 게놈을 부위 특이적으로 배열 바꿈할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 이들 단백질은 크기가 작아(~700 bp) 단일의 벡터를 사용한 수 개의 레솔바제 전달을 고려할 수 있으므로, 두 비대칭 재조합 부위 사이에서 DNA 절단이 유도된다. RecZF는 게놈의 영구적 변화에 영향을 주므로, 이들의 존재는 단지 일시적이어야 한다. 따라서, 이러한 방법은 현재 유전자 요법 분야에서 문제가 되는 안정한 통합과 관련된 위험을 회피할 수 있다. 이러한 치료적 응용 외에, RecZF는 또한 모델 유기체의 유전자 조작을 용이하게 할 수도 있다. 상동성 재조합의 복잡한 응용이 현대 생물학에 혁신을 일으켰지만, 이 기술은 종종 매우 비효율적이고 다수의 종 및 세포 유형에 대하여 부적합하다. 이들 결함은 RecZF의 잠재적 중요성의 범위를 시사한다.
기능성 징크 핑거-Tn3 레솔바제 키메라의 구축 및 평가
그 기능을 위한 교차 결합 부위(6, 29, 34) 또는 보조 인자를 더이상 필요로 하지 않는 몇몇 인버타제/레솔바제 세린 리컴비나제의 돌연변이가 발견되었다. 이들 초활성 변이체의 최소 재조합 부위는 DNA 결합 도메인에 대한 역위 반복 인지 서열만을 포함한다. 각 서열에 단량체가 고정되면, 이량체 형성, 가닥 분할, 교환 및 리게이션을 비롯한 모든 후속 단계는 촉매 도메인에 의해서만 매개된다. 이러한 작업의 기능적 분배는 이들 두 도메인 단백질의 구조적 모듈성에 반영된다. 우리는 내인성 DNA 결합 도메인이 다중절 징크 핑거 도메인으로 대체된 경우 부위 특이적 재조합 부위가 임의의 유전적 환경에 대하여 설계될 수 있다고 추론하였다.
징크 핑거-리컴비나제 융합 단백질(RecZF)의 기능을 평가하기 위하여, Tn3 레솔바제(D102Y, E124Q)(6)로부터의 초활성 촉매 도메인을 서열 GAGGAG에 우선적으로 결합하는 이중절 징크 핑거 단백질에 융합시켜 Tn3GAGGAG를 생성한다. 링커 부위(145T), 링커의 길이(6 아미노산) 및 조성물의 선택은 컴퓨터 모델링(도 2A, INSIGHT II) 및 관련 DNA/단백질 상호작용66,51,32에 대한 고찰에 의하여 정보를 얻었다. Zif268-γδ 레솔바제 키메라(γδZif268)에 대한 우리의 모델은 역위 결합 부위 사이에서 20 염기쌍의 최적 거리를 시사하였다. 따라서, 제1 RecZF 재조합 부위는 역위 반복 부분에 Tn3 재조합 부위 "20T"[GAGGAGTGATAATTTATAATATTTCGCTCCTC (서열 번호 2); 징크 핑거 결합 부위는 밑줄침]의 중심 20 bp에 의하여 분리된 GAGGAG를 함유하였다. 이러한 2개의 32 bp 재조합 부위에 측접하는 GFPuv (CLONTECH) 리포터 유전자를 함유하는 기질 플라스미드를 pBluescript II SK-(Stratagene)로부터 에스케리치아 콜라이(E. 콜라이)에 구축하였다(도 2B). Tn3GAGGAG를 이 플라스미드 상의 lac 프로모터 뒤에 리게이션하고 형질전환된 세포를 37℃에서 밤새 성장시켰다.
초활성 촉매 도메인은 조절 환경과 무관하게 기능하기 때문에, Tn3GAGGAG는 자유 시냅시스를 거칠 수 있다고 생각되었다. 각 RecZF 이량체는 재조합 부위에 결합하면 또다른 이량체와 회합하여 플라스미드내 또는 플라스미드간 시냅스를 형성한다. 사량체 시냅스는 무작위 회합에 의하여 형성되므로, RecZF는 다양한 재조합 사례를 촉매할 가능성이 있다(도 1). 중심 염기쌍(AT)은 그 자신의 역전된 상보적 결합이므로, 20T 스페이서 서열은 동일한 방향 또는 반대 방향으로 부위간 재조합을 가능하게 한다.
Tn3GAGGAG에 의하여 촉매된 재조합 사례를 검출하기 위하여, 세 PCR 분석, 즉 분해, 역위 및 통합을 개발하였다 (도 3A). 각 경우, 생성물 형성은 한천 겔 상에서 영상화하였을 때 독특한 밴드의 출현과 관계가 있다. 분해 분석은 그 상대적 농후도에 따라 기질 및 생성물 밴드(각각 1814 bp 및 1039 bp; 도 2B)를 증폭시킨다. 그러나, 역위 및 통합은 각각 단일 밴드(각각 1263 bp 및 370 bp)의 출현으로 입증된다. 이것은 이들 두 반응의 생성물이 오직 상보적 프라이머 쌍을 함유하기 때문에 일어난다. 따라서, 이들 두 분석은 감도가 높지만 반응 범위에 대한 정보를 거의 제공하지 않는다. 분해 및 역위 시스템은 GFPuv 영역의 조작에 대한 정보를 줄지라도, RecZF 촉매된 통합 반응의 검출은 제2의 비상동성 플라스미드를 필요로 한다. 이러한 목적에서, 단일의 재조합 부위를 pACYC184(New England Biolabs사)로 리게이팅하였다. pBluescript II SK-분해 생성물은 개질된 pACYC184로 동시 형질전환시켰다. 이들 두 상용성 플라스미드는 카르베니실린 및 클로르암페니콜 선별 하에 동시 유지되었다. 플라스미드 상에 단리된 프라이머가 서로 상보적 결합을 할 수 있는 경우 통합 생성물이 검출된다. 도 3의 3b 레인에 도시된 이 반응에 대한 대조군을 개질되지 않은 pACYC184(임의의 잠재적 재조합 부위 결여)로 동시 형질전환한다.
세 분석 모두에서의 긍정적인 결과는 우리가 가정한 Tn3GAGGAG에 의한 자유 시냅시스를 확인시켜 주었다(도 3B). 예상되는 부위 특이적 분해 생성물을 단리하고 그 정체를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 통합은 안정한 생성물을 생성하지 않지만, 상응하는 PCR 밴드를 한천 겔로부터 정제할 수 있었다. 상기 밴드의 시퀀싱으로써, 공유 RecZF 재조합 부위에 의하여 함께 연결된 두 기질 플라스미드의 부위 특이적 융합이 밝혀졌다.
우리의 초기 실험은 신규한 32 염기쌍 서열에 대한 부위 특이적 재조합이 목적이었다. 원칙적으로, 대부분의 임의의 서열은 RecZF 기질이 될 수 있었다. 공개된 32 GNN 및 ANN 징크 핑거 도메인만을 고려하면, 무작위화된 100 bp 영역은 평균 9개의 최소 재조합 부위를 함유한다[예컨대, 20 bp 서열에 측접하는 역위 GAGGAG (서열 번호 1)]. 실제로, 이들 효소의 적용은 필수 스페이서-단백질 상호작용에 의하여 제한될 수 있다. γδ 레솔바제 결정 구조에서는 재조합 부위(66)의 중심으로부터 4∼8 bp의 A/T 풍부 작은 홈 및 아르기닌 142 사이에 다중적인 상호작용이 존재한다. 돌연변이 연구에 의하면 이들 요소는 둘다 Tn3 레솔바제(51) 및 Hin 인버타제(32)가 적절히 기능하는 데 필요하다. 이러한 A/T 풍부 영역의 중요성은 이것이 이러한 리컴비나제 패밀리(59)에 대하여 특성화된 다수의 부위에 존재하는 것으로 더 명백해진다.
마찬가지로 Tn3GAGGAG 재조합이 어느 정도 억제되는지를 판단하기 위하여, 길이 또는 서열에서 스페이서를 변화시킨 기질 패널을 구축하였다(도 12). 분해 분석은 스페이서 길이에 대한 강한 기능적 의존성을 드러내었고, 18 bp 스페이서 영역을 갖는 부위 사이에서는 재조합이 거의 검출되지 않았으며 20 bp 스페이서 영역에서 (및 5' 및 3' 부위가 상이한 미스매치 20/20 배열에서) 가장 빠르고 22 bp 부위에서 중간이었다. 더 상세한 사항은 이하의 실시예 1에 개시된다.
우리의 제1 스페이서 서열 변이체는, 대조적으로, RecZF가 놀라운 정도로 기능적으로 혼합되었음을 드러냈다. 야생형 Tn3과는 대조적으로, Tn3GAGGAG는 A/T 풍부 홈을 비롯한 스페이서 영역 전체를 통해 점돌연변이를 허용하였다(도 12; 이하 실시예 1에서 추가로 상세히 설명함). 우리는 상대적으로 강한 결합의 징크 핑거 도메인의 존재시 2차 DNA 결합 상호작용이 불필요할 수 있다고 가정하였다. 이러한 낙관적인 전망은 두 스페이서 영역 중 하나가 Gin 인버타제[TCCAAAACCATGGTTTACAG (서열 번호 632); 도 4B, 11 레인]의 스페이서 영역으로부터 유도되는 키메라 기질(20G-GFP-20T)로 얻은 결과에 의하여 불투명해졌다. 여기서 불완전 재조합은 중요한 스페이서 서열 의존성-잠재적 Tn3GAGGAG 재조합 부위의 수(및 따라서 빈도)의 제한을 시사한다.
Hin 및 Gin 징크 핑거-리컴비나제의 구축 및 진화
스페이서 서열 의존성 문제에 직면하여, 우리는 기질 범위가 Tn3GAGGAG의 기질 범위와 상보적인 추가의 RecZF를 생성시키고자 하였다. 우리는 돌연변이 Tn3 촉매 도메인에 대한 선별보다는 세린 리컴비나제의 레솔바제/인버타제의 자연적인 차이를 유도하고자 하였다. 다양한 스페이서 서열 바이어스를 확보하는 외에, 상이한 촉매 도메인을 사용하여 RecZF로 병행적으로 (예컨대, 상이한 유전자의 동시 분해) 또는 더 흥미롭게는 순차적으로 (예컨대, 카세트 교환) 교차 재조합 사례를 실현할 수 있다.
전에는 공동 인자 없이 최소 재조합 부위에 대하여 기능적인 초활성 돌연변이를 Hin(29) 및 Gin(34)의 인버타제에 대하여 특성화하였다. 밀접하게 관련된 Hin 및 Gin 인버타제는 1차 구조에서 Tn3 레솔바제와 유의적으로 상이하다. 그러나, 다수의 보존 요소가 존재하여, 이들 세 단백질의 서열 정렬 및 HinGAGGAG(145N) 및 GinGAGGAG(144T) 구축을 위한 유사 링커 부위의 결정이 가능하였다. 이러한 단순 융합에 의하여 생성된 키메라는 검출 가능한 수준의 분해를 촉매하지 않았다. 그러나, PCR 역위 분석 결과, HinGAGGAG 및 GinGAGGAG는 모두 이들의 본래의 촉매 활성을 일부 보유하는 것으로 밝혀졌다. Tn3GAGGAG를 포함하여, 세 RecZF 모두, 징크 핑거 리컴비나제 부위가 측접된 GFPUV 리포터 유전자를 부위 특이적으로 역전시킬 수 있다. 초활성 촉매 도메인은 조절 환경과는 무관하게 기능하므로, 키메라는 자유 시냅시스를 거친다. 재조합 부위에 결합하면, 각 RecZF 이량체는 또다른 이량체와 회합하여 플라스미드내 또는 플라스미드간 시냅스를 형성할 수 있다. 시냅시스에 의하여 가능한 가닥 분할은 전체적으로 단백질-단백질 상호작용에 의하여 함께 유지되는 중간 복합체를 생성한다. 이러한 중간체 내부에서 회전은 조절되지 않으므로, RecZF 효소는 분해, 역위 및 통합을 포함하는 모든 가능한 재조합 사례를 촉매할 수 있다. 따라서, HinGAGGAG 및 GinGAGGAG 기능에 대한 우리의 연구는, 역위 PCR 분석(생성물만 증폭됨)이 분해 분석(생성물과 기질이 모두 증폭됨, 도 3A, B)보다 유의적으로 더 고감도이므로 역위 활성만을 간단히 밝힐 수 있었다.
초기 HinGAGGAG 및 GinGAGGAG 키메라로부터, 본 발명자들은 기질-연결된 단백질 진화법(SLiPE)의 전략을 이용하여 활성이 높은 레솔바제를 생성시켰다. 이 접근법은 각각의 리컴비나제 유전자 부근에 재조합 부위를 놓는다. 따라서, 성공적인 리컴비나제를 코딩하는 유전자는 이 효소의 작요에 의해 물리적으로 표지된다. 이 구별되는 표지로 인해 유전자가 PCR 증폭에 의해 비성공적인 후보물의 큰 배경으로부터 용이하게 회수 가능하다. 다양한 기질에 대해 Tn3GAGGAG 활성이 관찰되었지만, 본 발명자는 2개의 상이한 스페이서 서열(20T 및 Gin 스페이서 유도체, 20G, TCCAAAACCATGGTTTACAG(서열 번호 632)) 사이의 재조합을 선별하였다. 개재 GFP 스터퍼(stuffer)의 절단으로 하이브리드 스페이서 서열(20G/T, TCCAAAACCATAATATTTCG(서열 번호 633))과의 단일 재조합 부위가 남는다. 이 신규한 서열에 상보적인 올리고핵산을 사용하여 부위 특이적 분할을 촉매화하는 RecZF를 선택적으로 증폭시켰다(도 13; 하기 실시예 1에 추가 상세 설명). Cre 리컴비나제(18)에 대해 Buchholz 및 Stewart에 의해 개발된 원래의 SLIPE 전략(18)과 비교하여, 본 명세서에 채택된 접근법은 배경 감소 및 감수성 개선을 위한 우선적인 생성물 증폭, 서열 특이적 선별성, 및 마지막으로 상동성 재조합의 가능성 없음이라는 3 가지 주요한 이점을 갖는다.
Zaccolo 및 동료들의 방법(67)에 의해 에러-프론 PCR에 의해 RecZF 돌연변이의 라이브러리를 생성시켰다. dNTP 유사체인 dPTP(12.5 μM) 및 8-옥소-dGTP(12.5 μM)의 존재 하의 과활성 Hin 및 Gin 촉매 도메인을 증폭시키자 무작위로 위치하는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 주형이 생성되었다. 후속 오버랩 PCR은 각각의 촉매 도메인(평균 3.2 개의 아미노산 변화물 함유)을 에러 없는 징크 핑거 도메인에 융합시켰다. 이 RecZF 라이브러리를 이어서 기능적 선별의 제1 라운드 동안 기질 플라스미드에 클로닝시켰다. 3 라운드의 선별 후, 각각의 풀에 있는 나머지 돌연변이를 Stemmer가 제일 먼저 기술한 PCR 셔플링 방법(63)을 이용하여 재조합시켰다. 몇 번의 추가 라운드의 PCR 선별로 각각의 RecZF 풀에서 가장 활성인 키메라를 코딩하는 유전자가 풍부해졌다(도 13b; 하기 실시예 1에 추가 상세 설명). 각각의 라운드로부터의 6개의 클론을 각각 분석하고, 가장 빠른 레솔바제를 서열 분석하였다. 이들 클론의 분석은, Hin 및 Gin 촉매 도메인 모두에서 동등한 단일 돌연변이에 대한 선별을 시사한다. 제2 위치에서, 진화된 Gin 촉매 도메인은 선천 Hin 내 동등한 잔기와 매칭되는 돌연변이를 갖고 있었다. 돌연변이의 기능적 중요성은 불명확하지만, 2개의 최고의 클론으로 HinL6C4 및 GinL7C7이 잠재적인 레솔바제임이 발견되었다(도 13b; 하기 실시예 1에 추가 상세 설명). 예비 작업은, 이들 2개의 효소가 Tn3GAGGAG에 대해 발견된 것과 유사한 스페이서 거리 바이어스(20 bp>22 bp>18 bp, 활성 감소 순서)를 가짐을 시사한다.
Rec ZF 매개 안정한 통합에 대한 전략. Cre-lox 시스템은 유전자 조작을 위한 강력한 다용도 도구이다. Cre 리컴비나제는 loxP 부위 사이의 절단을 우선적으로 촉매화하지만, 돌연변이 lox 부위는 통합 반응을 촉진하는 데에 사용할 수 있다. 이를 목적으로, 다음 2 종의 재조합 부위를 개발하였다: "약한 것"과 "직교의 것"(4, 5, 9, 15, 25, 26, 35, 61). loxP 부위 또는 이의 돌연변이를 이용하지 않고 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 대한 유사 부위를 개발할 수 있다.
상당히 저하된 친화성으로 Cre에 결합하는 하프 사이트(LE 돌연변이 lox, lox71 및 RE 돌연변이 lox, lox66)를 loxP(4)로부터의 선천 하프 사이트로 보완할 수 있다. Cre를 결합시키는 부위 또는 loxP 부위를 이용하지 않고 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제와 함께 유사한 접근법을 이용할 수 있다. 이종 부위는 재조합을 위해 작용하는 한편, 통합에 의해 생성된 "약한" 부위 동종이량체는 재조합을 위해 작용하지 않는다(도 4a). 준최적 징크 핑거 DNA 상호 작용을 갖는 RecZF 부위는 이러한 우측 요소/좌측 요소(LE/RE) 전략에 필요한 조건적인 재조합을 가능하게 할 수 있다. GAG 외에, Tn3GAGGAG 내 반복 징크 핑거는 3개의 다른 삼뉴클레오티드 서열을 상당히 낮은 친화성으로 결합시킨다(GGG>GTG>GCG, 친화성 감소 순서). 3개의 기질을 제조하였는데, 여기서 GFPuv는 GXGGAG 이종 부위에 측접된다(도 4b, 2-4). 각각의 경우, Tn3GAGGAG 매개 용해가 빠르게 진행되었다(도 4c, 레인 1-4). 이 결과는, 재조합에 작용하는 채로 남는 준최적 부위(이종 부위의 환경에서만 작용할 수 있는 부분)가 상당 수 존재할 수 있음을 시사한다. 불행하게도, 이러한 특별한 약한 부위 동종이량체(도 4b, 6-8)는 제2 플라스미드 상에 위치하는 GAGGAG 동종이량체에 효율적으로 통합되는 완전한 기능성을 나타냈다(도 4c, 레인 5-8)).
안정한 통합을 위한 제2 전략은 loxP(9, 15, 25, 61)와 상용성이 없는 돌연변이 lox 부위를 포함한다. 이러한 완전한 부위(예, lox511, lox2272 및 lox5171)(36)가 선천 Cre 부위에는 기능적으로 직교하기 때문에, 2개는 연속적 재조합 반응을 위한 협동에 이용할 수 있다. 재차, Cre를 결합시키는 임의의 부위 또는 돌연변이 lox 부위를 이용하지 않고 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제와 함께 직교 부위를 이용하는 유사한 전략을 이용할 수 있다. 직교 부위는 상이하고 오버랩되지 않는 특이성을 갖는 키메라 리컴비나제와의 상호 작용에 의해 직교성이 부여된다. 한 부위에서의 통합 후에 다른 부위에서의 절단이 이루어지는 경우, 결과는 카세트 교환이다 (도 5a). 안정한 유전자 통합을 위한 이 전략은 직교 스페이서 서열을 직교 촉매 도메인으로 대체하여 RecZF에 용이하게 채택할 수 있다. 그러나, 이 접근법을 평가할 수 있기 전에, 우선 본 발명자들은 상이한 징크 핑거 결합 도메인에 의해 높은 특이성으로 RecZF를 표적화할 수 있음을 확인할 필요가 있다. 2개의 삼중절 징크 핑거 단백질인 H1(동족 9 bp 서열이 GGAGGCGTG(서열 번호 634)임) 및 P2(GCAGTGGCG(서열 번호 635))를 이 임무를 위해 선별하였다. Hin 및 Gin 진화(20G-GFP-20T)에 사용하는 것과 유사한 기질을 H1 및 P2 징크 핑거 결합 부위를 이용하여 구성하였다. H1 및 P2의 GinL7C7 촉매 도메인으로의 PCR 융합으로 각각 GinL7C7H1 및 GinL7C7P2를 코딩하는 유전자가 생성되었다. 이 새로운 RecZF를 매칭된 2개 및 매칭되지 않는 2개의 4개쌍이 생기도록 양쪽 기질에 결찰시켰다. 다행히도, RecZF는 양쪽 모두 활성이 높고 선별성이 높았고, 역위(도 5b) 및 분할(도 5c)은 징크 핑거가 재조합 부위와 매칭될 때에만 관찰되었다. 필요한 관계물 모두와 유사하지만, 이 단계는 RecZF 매개 카세트 교환의 평가를 위한 세로운 세트이다.
서열 환경의 다양성에 있어서 작용하는 고활성 징크 핑거-리컴비나제(Rec ZF )의 생성. 치료 재조합을 수행하는 RecZF의 능력은 내재성 게놈 내의 잠재적인 재조합 부위의 빈도에 따라 직접적으로 달라진다. 이 빈도는 고특이성 DNA 결합 도메인의 수와 임의의 스페이서 서열 의존성의 함수이다. 본 발명자들은 GinL7C7H1 및 GinL7L7P2에 대한 이 2개 제한 중 첫번째 것을 해결하였다(도 5). (고유의 기질에 특이적인) 각각의 RecZF의 높은 활성은 촉매 및 DNA 결합 도메인의 모듈 방식을 증명한다. GNN 및 ANN 결합 도메인만을 이용시, 2개의 적절하게 간격을 둔 9 bp 징크 핑거 결합 부위가 무작위 서열에서 매 64 bp마다 생긴다. 불행히도, 이 빈도는 스페이서 서열 의존성에 의해 보상될 수 있다. 예비 데이터는 각각의 촉매 도메인이 분명한 바이어스를 보유함을 시사한다. Tn3GAGGAG는 단일 Tn3에서 유도된 하프 사이트 내 점 돌연변이에 의해 크게 영향받지 않지만, 이의 GFPUV 절단능은 Gin에서 유도된 스페이서에 의해 상당히 손상되었다(도 12; 하기 실시예 1에 추가 상세 설명). 유사하게, GinL7C7 및 HinL6C4는 이들이 선별된 위치인 기질 20G-GFP-20T를 향해 바이어스를 나타냈다.
본 발명자들이 관찰한 서열 바이어스는 기질 결합 또는 촉매화 수준에서 생길 수 있다. 낮은 친화성이 속도에 의해 제한을 받는 경우, 더 많은(그리고 더 타이트한 결합의) 징크 핑거 도메인을 보유하는 RecZF는 적은 스페이서 서열 의존성을 나타낼 것이다. 본 발명자들은 이 간단한 해결책을 조사하기 위해 빨리 움직일 것이다. 본 발명자들 그룹은 이 작업에 적절한, 다수의 잘 특성화된 삼중절 및 육중절 징크 핑거 단백질을 보유하고 있다. 각각의 도메인의 동족 결합 서열을 이용하여 제조한 RecZF 기질은 리컴비나제 활성의 직접 비교를 위해 생성될 수 있다. 바이어스가 이러한 방식으로 해결되지 않을 경우, 스페이서를 특정 촉매 도메인의 공지된 기질 내성에 매칭해야 할 것이다.
본 발명자들은 모든 3개의 기존의 RecZF 촉매 도메인에 원래 있던 바이어스를 우선 특성화하여 기계적인 스페이서 서열 의존성에 대한 도전을 해결할 수 있다. 이를 목적으로, 재조합 부위의 라이브러리를 무작위 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 이용하여 생성할 수 있다. 서열 스페이스의 초기 조사는 3개의 변경되지 않은 하프 사이트(도 6)의 환경에서 하나의 완전 무작위 하프 사이트를 분석할 것이다. RecZF로 배양한 후, 역위 생성물을 서열 분석을 위해 단리할 수 있다. 본 발명자들의 초기 결과는 후속 라이브러리 및 시험 기질의 설계를 알려줄 수 있다. 이 방법에 의해, 본 발명자들은 각각의 촉매 도메인의 스페이서 서열 바이어스를 효율적으로 특성화할 수 있다.
현재의 제한에 대한 지식은 본 발명자들의 새로운 RecZF 촉매 도메인의 설계와 관련될 수 있다. 신규한 스페이서 서열을 위한 촉매 도메인은 다음의 3 가지 방식 중 하나로 생성시킬 수 있다: 추가의 세린 리컴비나제의 채택, 새로운 Hin, Gin 또는 Tn3 RecZF 돌연변이의 선별, 및 기존의 RecZF의 합리적인 변형. 5개의 과활성 촉매 도메인이 이미 보고되었지만, 본 발명자들은 레솔바제/역위 효소 패밀리(59) 중 30 개 초과의 세린 리컴비나제 중 전부는 아니더라도 다수가 RecZF에 사용하기에 적절할 수 있을 것으로 예상된다. 선천 기질을 조사하여 광범위한 스페이서 서열을 포괄하기 위해 태핑할 수 있는 자연 다양성이 밝혀진다. 구조적으로 동종인 촉매 도메인의 채택은 상기 설명한 Hin 및 Gin으로의 작업과 직접적으로 유사할 수 있다.
2개의 역위 효소를 이용한 본 발명자들의 경험은 또한 리컴비나제를 비자연적인 환경에서 작용하도록 훈련시킬 수 있는 편의성을 증명한다. 스페이서 서열 의존성에 대해 더 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 SLIPE 기질을 구성하여 변경된 특이성을 갖는 촉매 도메인 또는 바람직하게는 광범위한 기질에 대해 높은 활성을 갖는 제너럴리스트(generalist)를 선별할 수 있다. 이 목표를 향해, 본 발명자들은 RecZF 라이브러리를 6개의 상이한 기질 사이에 분배한 다른 진화 실험을 개시할 수 있다. 일단 각각의 기질로부터 나온 출력물을 정규화하면, 활성 리컴비나제를 다음 라운드의 선별에 대해 풀링할 수 있다. 이 진화적인 선별은 스페이서 영역 서열과 유사하지만 징크 핑거 단백질 부위에의 측접에 선택적인 리컴비나제의 선별을 용이하게 해야 한다.
증가하는 수의 RecZF의 특성화는 스페이서 서열 의존성을 부여하는 특정 단백질 원소에 빛을 발산하게 해야 한다. 이 이해 수준이 본 발명자들로 하여금 촉매 도메인을 합리적으로 변형하고 포화 돌연변이의 좌위를 갖는 초점 라이브러리를 생성시킬 수 있게 할 것이다.
포유류 세포에서 정제된 효소를 이용하고 일과성 발현을 통한 게놈 분할의 증명. 본 발명자들은 시험관내 동력학의 특성화를 위해 RecZF 단백질을 정제할 수 있다. (pMal Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs로부터 채택한) 말토오스 컬럼 상에서의 친화성 정제를 위해, 리컴비나제-징크 핑거-말토오스 결합 단백질(MBP) 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 크기가 큰 C-말단 MBP 도메인이 (에스케리치아 콜라이에서) 리컴비나제 활성을 억제하는 것으로 보이는 경우, 인자 Xa 단백 분해 효소 부위를 이용하여 벌키한 태그를 각각의 정제된 RecZF로부터 제거할 수 있다. 대안적으로, 변형되지 않은 RecZF는 DNA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 활성 RecZF를 단리하는 데에 일단 성공하면, 본 발명자들은 Scripps의 Ian Wilson과 함께 구조적 특성화를 위한 결정학 연구를 수행할 것이다. 효율적인 정제 전략이 일단 개발되면, 이 능력은 RecZF가 미세 주입에 의해 세포로 직접 전달되는 추가의 연구를 가능하게 할 수 있다. 게놈 테일러링(tailoring)을 위한 이 전략을 발현 벡터가 부적절하거나 이용 가능하지 않은 상황에 이용할 수 있다.
인간 게놈으로부터의 RecZF 절단을 간단화 트랜스젠 절단의 환경에서 우선 검사할 수 있다. 모든 판독 프레임(43, 60)에서 해독 정지 코돈과 결합된 인접 STOP 카세트(4개의 Simian Virus 40(SV40) polyA 서열의 머리꼬리 어레이)와 함께 리포터 유전자 RFP(Clontech)를 RecZF 재조합 부위에 측접시킬 수 있다. 각각의 하프 사이트는 동일한 징크 핑거 결합 부위를 보유할 수 있어, RFP-STOP이 RecZF 호모-테트라머에 의해 절단될 수 있다. 이 영역의 일측에 구성 촉진자(CMV)가 존재하고, 다른 측에 리포터 유전자 EGFP(Clontech)가 존재할 수 있다. 이 배열은 분할 전에는 RFP 발현만을 촉진하고 후에는 EGFP 발현만을 촉진해야 한다(도 7). 이 전체 RecZF-반응 영역은 레트로바이러스 벡터 pMX(47)를 이용하여 293개의 T 세포에 안정하게 통합될 수 있다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 RFP 발현에 양성인 세포를 단리할 수 있다. 그 다음 이 풀을 RecZF 발현 벡터(pcDNA3.1, Invitrogen)로 감염시킬 수 있다. 후속 FACS 분석으로 게놈 절단 정도에 비례하는 GFP 대 RFP 발현 비를 정량할 수 있다.
RecZF가 게놈 재조합을 매개할 수 있음을 본 발명자들이 증명할 수 있다면, 본 발명자들은 내재성 환경에서 이의 기능 분석을 진행할 수 있다. 그 때에는, (상기 논의한 바와 같이) 스페이서 서열에 대한 동시 제한으로 본 발명자들이 절단을 위해 어떤 유전자를 선별할지를 결정할 수 있다. 이러한 제약을 충족시키는 재조합 부위를 GCG PATTERNFINDER 프로그램(1)을 이용하여 밝힐 수 있다. 유전자 절단을 위한 최근의 후보물은 ICAM-1 및 CCR5를 포함한다. 본 발명자들의 연구실은 이들 단백질 양쪽의 기능을 조정한 경험이 있으며, 접근법(8, 42, 62)의 성공을 평가하기 위해 어세이를 용이하게 이용 가능하다. 유전자가 일단 선별되면, 관련 게놈 영역을 보유하는 기질 벡터를 에스케리치아 콜라이에서의 재조합을 위해 제조할 수 있다(도 8). 헤테로-테트라머 시냅스에 필요한 RecZF 단량체 중 2개를 각각 발현하는 2개의 추가의 플라스미드가 생성될 것이다. 동종 재조합을 방지하기 위해 RecZF 코돈 사용을 변화시킬 수 있다. 모든 3개의 플라스미드를 에스케리치아 콜라이로 형질전환시켜 항생제 선별 하에서 공동 유지시킬 수 있다. 상기 설명한 방식으로 PCR 어세이에 의해 성공적인 분할 이벤트를 검출할 수 있다. 이 시험이 양성 결과를 얻는 경우, 본 발명자들은 (표적 단백질을 연속 발현하는) 적절한 포유류 세포를 4개의 RecZF 단량체를 각각 코딩하는 발현 벡터로 공동 감염시킬 수 있다. FACS 분석 및 게놈 PCR에 의해 절단 이벤트를 검출할 수 있다. 성공을 나타내는 실험 결과를 비롯한, 접근법에 대한 추가의 상세 설명을 하기 실시예 1에 나타낸다.
Rec ZF 로 촉매화된 안정한 부위 특이적 통합을 위한 전략의 평가. 본 발명자들은 상기 설명한 안정한 통합, "약한" 부위 동종이량체 형성(도 4a) 및 직교 재조합에 의한 카세트 교환(도 4a)을 위한 2 가지 전략을 계속 개발할 것이다. 일부 준최적 징크 핑거 결합 부위는 재조합에 대해 충분함이 증명되었지만, 약한 부위에 대한 연구는 2개 트랙과 함께 진행할 수 있다. GXGGXG(서열 번호 636) 서열의 체계적인 평가 외에, 본 발명자들은 cis 활성화 징크 핑거 결합 부위를 빨리 발견하기 위한 고처리량 전략을 제안한다(도 11). 2개의 상용성 플라스미드에서, 단일 하프 사이트 라이브러리(GNNGNN(서열 번호 637) 부위 무작위화에 대해 6.6×104 변이체, NNNNNN(서열 번호 638)에 대해 1.7×107)가 무작위 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머와 함께 생성될 수 있다. 이들 2개의 풀을 에스케리치아 콜라이로 공동 형질전환시키고 카르베니실린 및 클로르암페니콜 선별 하에서 공동 유지시킬 수 있다. 이 배양물로부터 정제한 플라스미드를 낮은 농도에서 재형질전환시키고 양쪽 항생제를 함유하는 플레이트 상에서 성장시킬 수 있다. 이 선별적인 매질 위에서 성장하는 집락을 단일방향 통합을 위해 PCR에 의해 스크리닝할 수 있다. 추가의 엄중도가 필요한 경우, 다른 리포터 유전자를 첨가할 수 있는데, 그 중 하나는 통합 생성물에 의해서만 발현된다.
RecZF 단백질(>1024 변이체)의 라이브러리는 인조의 징크 핑거 도메인의 수집물로부터 공통의 촉매 도메인(13, 40, 42)으로 빼낸 징크 핑거 도메인의 융해로부터 회합할 수 있다. 그 다음 이 RecZF 라이브러리를 한정된 DNA 결합 서열과 면역성 테스트하여 적절하게 약한 바인더를 발견한다. GXGGXG(서열 번호 636)의 특징이 적절히 약한 부위의 존재를 수립하기에 잘 적합한 한편, RecZF 라이브러리는 내재성 게놈 내의 특정 부위를 처리하는 데 우수한 전략이 될 수 있다. 이 선별을 조사하기 위해, 본 발명자들은 유사한 2개의 플라스미드 선별 시스템을 구축할 것이다. 이 경우에, 하나의 플라스미드는 리컴비나제의 라이브러리를 발현하고, 다른 것은 단일 RecZF를 발현할 것이다. 이러한 효소가 작용할 부위는 이종이량체- 6 bp 표적에 해당하는 하나의 결합 부위 및 공통된 RecZF의 동족 서열인 하나일 것이다(도 10). 선별 및 분석은 앞서 기재한 방식으로 수행될 것이다.
약한 부위가 발견되면, 본 발명자들은 징크 핑거-DNA 상호작용의 친화성을 측정할 것이다. 이 지식으로 본 발명자들은 약한 부위 전략의 내재성 적용에 있어서 서열과 RecZF를 빠르게 짝지을 수 있다.
선별적인 징크 핑거 표적화가 이제 결론적으로 (GinL7C7H1 및 GinL7C7P2, 도 5, B 및 C)를 증명하면, RecZF 조정된 카세트 상호교환이 평가될 수 있다. 이 시스템은 차별화 촉매 및 징크 핑거 도메인으로 구성된 2개의 RecZF의 발현을 요구한다. 상동성 재조합을 위한 가능성을 최소화하기 위해, 벡터 서열이 최적화될 것이다. 각각의 플라스미드는 카르베니실린 및 클로람페니콜 선별하에 그들의 공동유지를 가능하게 하기 위하여 유일한 항생제 내성을 줄 것이다. 2개의 카세트는 측접 GFPuv 및 비반복 동종이량체 RecZF 부위를 가지는 mCD2 코딩하는 영역에 의해 회합될 것이다; 이 배열에 있어서, 2개의 직교 RecZF에 의한 플라스미드내 절단 가능성이 존재하지 않아야 한다. 재조합 부위의 배치에 따라, 본 발명자들은 플라스미드간 카세트 교환(도 11A), 또는 두 카세트의 손실을 수반하는 플라스미드 융해(도 11B) 중 하나를 증진시킬 수 있다. 2개의 플라스미드 중간체를 상호전환하는 역위 반응은 AT와 다른 중심 염기쌍이 그 자신의 상반되는 보체인 직접 반복되는 부위를 이용하여 방지될 것이다. 마지막으로, 통합하는 산물은 항생물질 선별 및 PCR 스크리닝에 의해 동정될 것이다.
하기의 문헌들은 실시예 1을 제외한 명세서에 적용가능하고, 참고로 본원에 포함되며; 이들 문헌들은 그들에 부여된 참조 번호로 언급된다. 추가적인 문헌들 또한 명세서에서 인용되고, 또한 참고로 포함된다. 실시예 1에 대한 문헌은 그들 자신의 번호로 하기 실시예 부분에 주어진다.
그러므로, 본 발명은 임의의 이중가닥 DNA 기질의 변형을 위한 그러한 촉매 도메인과, 임의의 환경에서 이에 국한되는 것은 아니나, 분해 또는 절단, 역위, 통합, 전좌, 이중 가닥 쪼개짐, 공유 결합, 상동성 재조합의 자극 및 유동효소 표적화를 비롯한 임의의 방식으로 회합된 모든 키메라에 관한 것이다. 상기 환경은 생체 밖, 임의의 종류의 세포 또는 임의의 종류의 유기체일 수 있다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 부위 특이적 재조합의 모든 적용, 즉 표적화 또는 비표적화 및 보존적 또는 비보존적인 재조합에 관한 것이다. 각각의 반응은 협력하여 작용하는 1-4개의 상이한 키메라 리컴비나제(본원에서 "RecZF"라고도 함)에 의해 수행될 것이다. 특히, 상응하는 RecZF가 구조화될 수 있는 내재성 게놈 서열에서 "발견되는" 내재성 재조합의 적용이다. (이것은 외재성 부위(예를 들어 lox, FRT)가 게놈 안으로 도입되어 앞서 존재하는 리컴비나제(예를 들어 Cre, Flp)를 적합하게 한다는 현재의 패러다임의 정반대이다). 그러므로, 키메라 리컴비나제의 사용은 재조합을 위해 외재성 부위를 게놈에 도입할 필요없이 더 큰 유연성을 제공한다. 이는 그러한 외재성 부위의 도입이 해롭거나, 어렵거나 또는 불편하기에 특히 이롭다.
이에 따라, 본 발명의 일 측면은, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합한 DNA 부위에서 키메라 리컴비나제 단백질이 부위 특이적 재조합을 촉진시키도록, 그리고 세린 리컴비나제가 선별되거나 또는 진화하여 키메라 단백질의 환경에서 효과적으로 재조합을 촉진시키도록, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 작동적으로 연결된 세린 리컴비나제를 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질이다. 전형적으로, 상기 세린 리컴비나제 도메인은 일반적인 가닥 교환 기전을 촉진하는 촉매 세린 친핵체를 가진 리컴비나제 도메인이다. 전형적으로, 상기 세린 리컴비나제는 Gin, Hin, Tn3, Sin, 베타, Pin, Min, Din, 및 Cin 및 Gin의 뮤테인, Hin의 뮤테인, Sin의 뮤테인, 베타의 뮤테인, Pin의 뮤테인, Min의 뮤테인, Din의 뮤테인, Cin의 뮤테인, Tn3의 뮤테인으로 이루어진 군에서 선별된다. 하지만, 다른 적절한 세린 리컴비나제가 하기에 기술된다. 전형적으로, 상기 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 헥사뉴클레오티드를 특이적으로 결합하는 이중절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인이다. 다른 대안에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 9개의 염기쌍을 결합하는 삼중절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인, 12개의 염기쌍을 결합하는 4절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인, 15개의 염기쌍을 결합하는 5절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인, 또는 18개의 염기쌍에 결합하는 6절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인이다. 결합한 염기쌍의 수가 많을수록, 리컴비나제의 특이성을 더 커지고 그것이 작용할 부위의 수는 더 적어진다. 하지만, 앞서 정의한 바와 같이, 용어 "징크 핑거", "징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인" 등은 특정화된 아미노산 서열이 실질적인 징크 핑거로부터 기인하거나 또는 천연 발생 또는 구조화된 징크 핑거 단백질과 실질적인 상동성을 가질 필요는 없다. 그것들은 단백질 도메인의 일반적인 특성을 기술하는 데 사용되며, 단백질 구조에서 아연 이온의 참여를 반드시 요구하지는 않는다.
본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 포함된 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 2개의 서브도메인을 포함한다.
제1의 이러한 서브도메인은 DNA 결합 서브도메인이다. 이하 기술한 바와 같이, 전형적으로 이 서브도메인은 약 7개∼약 10개 아미노산, 가장 일반적으로 7개 또는 8개 아미노산을 포함하고, 하기에 기술한 특이적 DNA 결합 능력을 가진다. DNA 결합 서브도메인은 대신 도메인으로도 언급될 수 있으며 본원에서도 그렇게 언급된다.
제2의 이러한 서브도메인은 골격 서브도메인이다. 일 대체예에 있어서, 천연 발생 징크 핑거 단백질의 구조를 기초로, 상기 골격 서브도메인은 2개의 하프, DNA 결합 서브도메인의 아미노 말단이 상기 골격 서브도메인의 제1 하프의 카르복실 말단에 위치하도록 위치되는 제1 하프, 및 DNA 결합 서브도메인의 카르복실 말단이 상기 골격 서브도메인의 제2 하프의 아미노 말단에 위치하도록 위치되는 제2 하프로 나뉜다.
이 대체예에 있어서, 상기 골격 서브도메인은 야생형 징크 핑거 단백질에서 공통적으로 발견되는 2개의 시스테인 잔기 및 2개의 히스티딘 잔기를 포함할 수 있다. 배열은 본원에서 C2H2로서 명시된다. C2H2 배열의 야생형 징크 핑거 단백질에 있어서, 상기 2개의 시스테인 잔기는 상기 DNA 결합 서브도메인의 아미노 말단 측면으로 위치되고, 상기 2개의 히스티딘 잔기는 상기 DNA 결합 서브도메인의 카르복실 말단 측면에 위치된다. 시스테인 및 히스티딘은 징크 핑거 단백질에서 아연 이온에 결합한다.
야생형 징크 핑거 단백질은 일반적으로 C2H2 배열을 가지나, 독점적인 것은 아니며, 약간의 천연 발생 징크 핑거 단백질로 알려진, 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기(C3H)를 가진 골격 도메인, 4개의 시스테인 잔기(C4)를 가진 골격 도메인을 발생시키기 위해서 상기 골격 서브도메인에서 시스테인과 히스티딘 잔기를 상호교환하는 것이 가능하다. 또한, 돌연변이 생성은 이들 골격 서브도메인의 H4 및 CH3 배열을 발생시키는 데 이용되고 있다. 상기 CH3 배열에 있어서, 4개의 관련된 잔기 중 하나는 시스테인일 수 있고; 다른 3개는 모두 히스티딘이다. 이러한 돌연변이된 징크 핑거 단백질은 본원에 참고로 포함된 문헌[S. Neri et al., "Creation and Characteristics of Unnatural CysHis3-Type Zinc Finger Protein", Biochem. Biophys. Res. Commun. 325: 421-425 (2004)]에 개시되어 있다. 유사한 돌연변이된 징크 핑거 단백질은 또한 본원에 참고로 포함된 문헌[Y. Hori et al., "The Engineering, Structure, and DNA Binding Properties of a Novel His4-Type Zinc Finger Peptide," Nucleic Acids Symp. 44: 295-296 (2000)]에 개시되어 있다.
또한, C6(6개의 시스테인 잔기) 배열을 가지는 징크 핑거 단백질이 존재하고, 그 배열은 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에서 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인의 부분을 형성하는 골격 서브도메인으로 포함될 수 있다(Y. Hori et al., "The Engineering, Structure, and DNA Binding Properties of a Novel His4-Type Zinc Finger Peptide, "Nucleic Acids Symp. 44: 295-296 (2000)).
추가적인 골격 서브도메인은 새의 췌장 폴리펩티드(aPP)를 기초로 하는 것이다. 소단백질 aPP는 용매 노출된 하나의 나선형 면 및 용매 노출된 II형 폴리프롤린 나선형 면을 가진다. aPP를 기초로 하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인으로부터의 DNA 결합 서브도메인은, 앞서 기술한 바와 같이, aPP의 용매 노출된 하나의 나선형 면 또는 용매 노출된 II형 폴리프롤린 나선형 면 중 하나로 합체된다. 잔기는 돌연변이되어 더 단단하거나 더욱 특이적인 DNA 결합을 제공할 수 있다. 이 접근은 본원에 참고로 포함된 문헌[L. Yang & A. Schepartz, "Relationship Between Folding and Function in a Sequence-Specific Miniature DNA-Binding Protein", Biochemistry 44: 7469-7478 (2005)], 및 문헌[N.J. Zondlo & A. Schepartz, "Highly Specific DNA Recognition by a Designed Miniature Protein", J. Am. Chem. Soc. 121: 6938-6939 (1999)]에 기재되어 있다. 전형적으로, 잔기는 aPP의 용매 노출된 하나의 나선형 면으로 합체된다. 이 접근에 있어서, 상기 DNA 결합 서브도메인은 하나의 나선형 잔기에 변화를 줄 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 리컴비나제의 구조화에 적절한 세린 리컴비나제는 본원에 참고로 포함된 문헌[N.D.F. Grindley et al., "Mechanisms of Site-Specific Recombination", Annu. Rev. Biochem. 75: 567-605 (2006)]에 기재된 일반적인 가닥 교환 기전에서 작용하는 것들을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 포함된 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 의해 결합된 9개의 염기 서열의 예는 GGAGGGGTG(서열 번호 3) 및 GCAGTGGCG(서열 번호 4)를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 특이적 키메라 리컴비나제는, 6개 bp의 서열(서열 번호 1)에 우선적으로 결합하는 이중절 징크 핑거 단백질에 링커를 통해 융합된 Tn3로부터의 도메인을 가지는 Tn3GAGGAG이다. 상기 키메라 리컴비나제 Tn3GAGGAG는 20개 bp의 스페이서 부위(GAGGAGTGATAATTTATAATATTTCGCTCCTC)(서열 번호 2)(징크 핑거 결합 부위는 밑줄을 그었음)에 의해 구분되는 DNA 서열에서 재조합을 촉진시키는 데 효과적이다.
본 발명에 따른 다른 키메라 리컴비나제는 HinGAGGAG 및 GinGAGGAG를 포함한다. 이러한 키메라 리컴비나제는 각각 헥사뉴클레오티드 GAGGAG(서열 번호 1)에 결합하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 융합된 리컴비나제 Hin 및 Gin이다.
따라서, 실시예 1에서 보다 상세히 기재된 다음의 키메라 리컴비나제: Tn3Ch15G, GinL7C7H1 및 GinL7C7P2는 이들의 변이체와 함께 본 발명의 범주 내에 있고, 다른 리컴비나제 촉매 도메인은 Tn3 또는 Gin 세린 리컴비나제를 대체한다.
또한, 따라서, 다음의 돌연변이: (1) Tn3 세린 리컴비나제 촉매 도메인의 G70S, D102Y 또는 E124Q; (2) Hin 세린 리컴비나제 촉매 도메인의 H107Y; (3) Gin 세린 리컴비나제 촉매 도메인의 M70V, T96A 또는 H106Y; 또는 (4) Tn3 세린 리컴비나제 촉매 도메인의 I12V, D13G, K65R, M73V, I80M, V108A, K53E 및 K151M 중 1 이상이 Hin 및 Gin(넘버링은 Tn3의 것임(도 13 참조)의 상응하는 상동 잔기의 돌연변이와 함께 세린 리컴비나제에 도입된 키메라 리컴비나제는 본 발명의 범주 내에 있다. 본원에서 단백질의 돌연변이는 본래의 잔기, 잔기 수 및 재배치 잔기가 사용되는 표준 태그에 의해 명시하여, "I12V는 12번 위치의 이소루신(I)이 발린(V)으로 대체된 돌연변이이다. 이 태그는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
유사하게, 상기 세린 리컴비나제가 다음의 돌연변이: D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V, Y109H, M114V 및 K148MG를 포함하는 Gin 도메인인 키메라 리컴비나제는 본 발명의 범주 내에 있고, 이때 Y109H는 야생형 Gin에 반대이고, K148M은 링커 돌연변이이다. 따라서, 상기 리컴비나제 촉매 도메인이 다음의 돌연변이: D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V 및 M114V(Y109H 및 K148M 제외)를 포함하는 Gin 도메인인 키메라 리컴비나제도 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명에 따른 또 다른 키메라 리컴비나제는 스페이서 서열 의존성을 감소시키도록 구조화된 키메라 리컴비나제를 포함한다. 관찰되어온 서열 바이어스는 기질 결합 또는 촉매 작용의 수준 중 하나에서 일어날 수 있다. 낮은 친화성이 속도 제한적인 경우, 그 다음 더 많은(그리고 더 단단한 결합) 징크 핑거 도메인을 처리하는 RecZF는 더 약한 스페이서 서열 의존성을 나타낼 것이다. 그러므로, 스페이서 서열 의존성 또는 서열 바이어스는 더 많은 수의 징크 핑거 도메인 또는 그들의 표적 뉴클레오티드 서열에 더욱 단단하게 결합하는 징크 핑거 도메인을 가진 키메라를 구조화함으로써 감소될 수 있다. 다른 대체예에 있어서, 스페이서는 이 스페이서에 대한 상기 촉매 도메인의 친화성을 결정하고, 상기 스페이서를 부위 특이적 돌연변이 생성 기법에 의해 변형시켜 더 큰 친화성을 달성함으로써 특정 촉매 도메인의 공지된 기질 내성에 매치될 수 있다. 핵산-단백질 상호작용의 친화성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제를 구조화하는 데 유용한 세린 리컴비나제는 하기의 것들을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다:
(1) Tn3(EcoTn3로도 알려짐); Hin(StyHin로도 알려짐); Gin(MuGin로도 알려짐); Sin; Beta; Pin; Min; Din; Cin; EcoTn21; SfaTn917; BmeTn5083; Bme53; Cpe; SauSK1; SauSK41; SauTn552; Ran; Aac; Lla; pMER05; Mlo92; Mlo90; Rrh; Pje; Req; PpsTn5501; Pae; Xan; ISXc5; Spy; RhizY4cG; SarpNL1; SsolSC1904a; SsolSC1904b; SsoISC1913; Aam606; MjaM0014; Pab; HpylS607; MtulS_Y349; MtuRv2792c; MtuRv2979c; MtuRv3828c; MtuRv0921; MceRv0921; TnpX; TndX; WwK; 락토코커스 파지 TP901-1 세린 리컴비나제; 에스. 피오제네스 파지 f370.1 세린 리컴비나제; 에스. 피오제네스 파지 fFC1 세린 리컴비나제; 리스테리아 파지 A118 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SC3C8.24 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SC2E1.37 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCD78.04c 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SC8F4.15c 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCD12A.23 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCH10.38c 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCC88.14 세린 리컴비나제; 스트렙토마이세스 파지 fC31 세린 리컴비나제; 스트렙토마이세스 파지 R4 세린 리컴비나제; 바실러스 파지 f105 세린 리컴비나제; 바실러스 파지 SPBc2 세린 리컴비나제; 바실러스 프로파지 SKIN 세린 리컴비나제; 에스. 아우레우스 ccrA 세린 리컴비나제; 에스. 아우레우스 ccrB 세린 리컴비나제; 엠. 투버큘로시스 파지 Bxb1 세린 리컴비나제; 엠. 튜버큘로시스 프로파지 fRV1 세린 리컴비나제; YBCK_ECOLI; Y4bA; Bja; Spn; Cac 1956; 및 Cac 1954; 및
(2) (a)의 세린 리컴비나제의 뮤테인.
이러한 목적으로, 모두 3개의 현존 RecZF 촉매 도메인에서 고유한 편중성(bias)은 본 발명의 또다른 구체예인 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 특징지어진다:
(1) 무작위화 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 이용하여 복수의 재조합 부위의 라이브러리를 생성하는 단계;
(2) 3개의 비변형된 하프 사이트와 하나의 완전하게 무작위화된 하프 사이트를 포함하는 부위를 분석하여 이들 부위 상에서 하나 이상의 RecZF에 의해 수행된 재조합의 효율을 측정하는 단계; 및
(3) 서열 편중성을 특징규명하기 위한 서열분석을 위해 단계 (2)로부터 역위 생성물을 단리시키는 단계
를 포함하는 방법을 특징으로 한다.
전형적으로, 상기 방법은 각 RecZF 부위에 대한 서열 편중성에 대한 구조-활성 프로파일을 발생시킨다.
추가적으로, 본 발명에 따른 다른 키메라 리컴비나제는 (1) Hin, Gin, 또는 Tn3 이외의 세린 리컴비나제의 개조에 의해 발생되는 촉매 도메인; (2) 새로운 Hin, Gin, 또는 Tn3 RecZF 돌연변이체의 선별에 의해 발생되는 촉매 도메인; 또는 (3) 존재하는 RecZF의 논리적(rational) 변형에 의해 발생되는 촉매 도메인 중 하나인 촉매 도메인 하나 이상을 포함한다. 단백질 구조의 논리적 변형 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[J. L. Cleland & CS. Craik, eds., "Protein Engineering: Principles and Practice" (Wiley-Liss, 뉴욕, 1996)]에 기술되어 있다. 구체적으로, 그러한 방법은, 비제한적인 예로서, 분자 모델링, NMR 분광기, X-선 결정학, 또는 다른 방법에 의한 촉매 도메인 내에 기능적으로 중요한 잔기의 동정; 비제한적인 예로서, 무작위 돌연변이 유발, 결실 분석, 또는 링커 스캐닝 돌연변이 유발과 같은 방법에 의한 구조 정보로부터 동정된 잔기의 돌연변이; 기능성 잔기, 예컨대 고도로 보존된 잔기 또는 화학적 가교, 친화성 라벨링, 또는 화학적 변형으로부터의 보호와 같은 생화학적 방법에 의해 동정된 잔기를 확인하기 위한, 예를 들어 재조합 촉매 도메인 사이에서, 단백질 상동성의 용도; 또는 알라닌 하전된(charged-to-alanine) 스캐닝 돌연변이 유발을 포함한다. 논리적 고안은 또한 잔기 대 잔기 기반(residue-by-residue basis)의 결합 친화성 및/또는 특이성을 최대화하는 것으로 간주된 돌연변이를 포함할 수 있어서, 아미노산 잔기 및 핵산 기질 사이의 일시적 공유 상호작용, 및 비공유 상호작용, 예컨대 수소 결합, 소수성 상호작용, 염 링크, 및 반데르발스 상호작용을 고려하고 있다.
이미 보고된 5개의 과잉활성 촉매 도메인에 따르면, 전부는 아닐지라도, 리솔바제/인버타제(invertase) 패밀리에서 30개 이상의 세린 리컴비나제의 다수가 RecZF에서 사용하기에 적당하다. 공유 세린 중간체의 사용을 통해 작동하는 임의의 리컴비나제, 인버타제 또는 인테그라아제는 이러한 접근에 적당하다. 박테리아, 곰팡이, 및 박테리오파지를 비롯한 다양한 기원이 존재한다. 이들은 참고인용된 문헌[M.C.M. Smith & H.M. Thorpe, "Diversity in the Serine Recombinases" Mol. Microbiol. 44:299-307 (2002)]에 기술된다. 특이적 세린 리컴비나제 활성을 갖는 이러한 세린 리컴비나제의 뮤테인(Mutein)은 또한 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 사용될 수 있다. 천연 기질의 실험은 광대한 범위의 스페이서 서열을 포괄하기 위해 열 수 있는 자연적 다양성을 밝혔다. 구조적으로 상동성인 촉매 도메인의 개조는 상기 기술된 Hin 및 Gin과 작업하는 것과 직접적으로 유사할 것이다.
본 발명의 범위 내에 있는 추가적인 키메라 제조합효소는 하기 기술된 바와 같이 기질-연결된 단백질 진화법(SLiPE)의 사용에 의해 발생된 것이다. SLiPE는 특이성이 변성된 촉매 도메인을 선별하는데 사용하거나, 또는 바람직하게는 광대한 범위의 기질에 높은 활성을 갖는 일반물(generalist)에 대해 사용할 수 있다. 이후 이러한 촉매 도메인은 본 발명에 따라 키메라 리컴비나제에 도입될 수 있다.
징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 상기 기술된 바와 같이 뉴클레오티드의 임의의 선별된 서열과 결합할 수 있다. 일 대안예에서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 헥사뉴클레오티드, 예컨대 GAGGAG (서열 번호 1)와 결합하고; 이는 전형적으로 이중절(bidactyl) 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인일 것이다. 또다른 대안예에서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 9 염기쌍 서열, 예컨대 GGAGGGGTG (서열 번호 3) 또는 GCAGTGGCG (서열 번호 4)와 결합하고; 이는 전형적으로 삼중절(tridactyl) 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인일 수 있다. 다른 대안예에서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 12개의 염기쌍과 결합하는 4절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인이고; 15개의 염기쌍과 결합하는 5절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인이거나; 또는 18개의 염기쌍과 결합하는 6절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인이다.
적절한 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 ANN형, CNN형, GNN형, 또는 TNN형의 트리뉴클레오티드와 결합하는 개별 도메인으로부터 형성될 수 있다. ANN형의 트리뉴클레오티드 서열과 결합하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 본원에 참고 인용되어 있는 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0165356(Barbas 등, 2002년 11월 7일 공개; "Zinc Finger Binding Domains for Nucleotide Sequence ANN")에 개시된다. CNN형의 트리뉴클레오티드 서열과 결합하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 본원에 참고 인용되어 있는 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0224385(Barbas, 2004년 11월 11일 공개; "Zinc Finger Binding Domains for CNN")에 개시된다. GNN형의 트리뉴클레오티드 서열과 결합하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 본원에 참고 인용되어 있는 미국 특허 번호 6,610,512(Barbas, 2003년 8월 26일 출원; "Zinc Finger Binding Domains for GNN")에 개시된다. TNN형의 트리뉴클레오티드 서열과 결합하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 본원에 참고 인용되어 있는 미국 특허 출원 번호 11/564,141(Barbas 등, 2006년 11월 28일 출원; "Zinc Finger Binding Domains for TNN")에 개시된다. 추가적으로, AGC형의 트리뉴클레오티드 서열과 결합하는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 본원에 참고 인용되어 있는 미국 특허 출원 번호 11/613,075(Barbas 등, 2006년 12월 19일 출원; "Zinc Finger Domains Specifically Binding AGC")에 개시된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제 단백질에 도입되는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인으로부터 형성되는 ANN형, CNN형, GNN형, 또는 TNN형의 트리뉴클레오티드 서열과 결합하는 각 징크 핑거 뉴클레오티드 도메인은 아미노산 잔기가 5∼10개, 바람직하게는 약 7개인 뉴클레오티드 결합 도메인이다. 전형적으로, 뉴클레오티드 결합 도메인은 그 구조가 주로 α-나선이고 "트리플렛 결합 도메인"으로 본원에 언급된 7개의 아미노산 서열이다. 이러한 트리플렛 결합 도메인의 구조는 추가 상세한 설명으로 하기 기술된다. 하지만, 뉴클레오티드 결합 영역은 각 사이드 상에서 최대 5개의 아미노산이 측접될 수 있고 본원에 사용된 용어 "트리플렛 결합 도메인"은 이들 추가 아미노산을 포함한다.
ANN에 대해 바람직한 결합 도메인은 STNTKLHA (서열 번호 5); SSDRTLRR (서열 번호 6); STKERLKT (서열 번호 7); SQRANLRA (서열 번호 8); SSPADLTR (서열 번호 9); SSHSDLVR (서열 번호 10); SNGGELIR (서열 번호 11); SNQLILLK (서열 번호 12); SSRMDLKR (서열 번호 13); SRSDHLTN (서열 번호 14); SQLAHLRA (서열 번호 15); SQASSLKA (서열 번호 16); SQKSSLIA (서열 번호 17); SRKDNLKN (서열 번호 18); SDSGNLRV (서열 번호 19); SDRRNLRR (서열 번호 20); SDKKDLSR (서열 번호 21); SDASHLHT (서열 번호 22); STNSGLKN (서열 번호 23); STRMSLST (서열 번호 24); SNHDALRA (서열 번호 25); SRRSACRR (서열 번호 26); SRRSSCRK (서열 번호 27); SRSDTLSN (서열 번호 28); SRMGNLIR (서열 번호 29); SRSDTLRD (서열 번호30); SRAHDLVR (서열 번호 31); SRSDHLAE (서열 번호 32); SRRDALNV (서열 번호 33); STTGNLTV (서열 번호 34); STSGNLLV (서열 번호 35); STLTILKN (서열 번호 36); SRMSTLRH (서열 번호 37); STRSDLLR (서열 번호 38); STKTDLKR (서열 번호 39); STHIDLIR (서열 번호 40); SHRSTLLN (서열 번호 41); STSHGLTT (서열 번호 42); SHKNALQN (서열 번호 43); QRANLRA (서열 번호 44); DSGNLRV (서열 번호 45); RSDTLSN (서열 번호 46); TTGNLTV (서열 번호 47); SPADLTR (서열 번호 48); DKKDLTR (서열 번호 49); RTDTLRD (서열 번호 50); THLDLIR (서열 번호 51); QLAHLRA (서열 번호 52); RSDHLAE (서열 번호 53); HRTTLLN (서열 번호 54); QKSSLIA (서열 번호 55); RRDALNV (서열 번호 56); HKNALQN (서열 번호 57); RSDNLSN (서열 번호 58); RKDNLKN (서열 번호 59); TSGNLLV (서열 번호 60); RSDHLTN (서열 번호 61); HRTTLTN (서열 번호 62); SHSDLVR (서열 번호 63); NGGELIR (서열 번호 64); STKDLKR (서열 번호 65); RRDELNV (서열 번호 66); QASSLKA (서열 번호 67); TSHGLTT (서열 번호 68); QSSHLVR (서열 번호 69); QSSNLVR (서열 번호 70); DPGALRV (서열 번호 71); RSDNLVR (서열 번호 72); QSGDLRR (서열 번호 73); 및 DCRDLAR (서열 번호 74)을 포함한다.
ANN에 대해 특히 바람직한 결합 도메인은 서열 번호 44 내지 53을 포함한다.
AGC에 대해 바람직한 추가 도메인은 DPGALIN (서열 번호 75); ERSHLRE (서열 번호 76); DPGHLTE (서열 번호 77); EPGALIN (서열 번호 78); DRSHLRE (서열 번호 79); EPGHLTE (서열 번호 80); ERSLLRE (서열 번호 81); DRSKLRE (서열 번호 82); DPGKLTE (서열 번호 83); EPGKLTE (서열 번호 84); DPGWLIN (서열 번호 85); DPGTLIN (서열 번호 86); DPGHLIN (서열 번호 87); ERSWLlN (서열 번호 88); ERSTLIN (서열 번호 89); DPGWLTE (서열 번호 90); DPGTLTE (서열 번호 91); EPGWLIN (서열 번호 92); EPGTLIN (서열 번호 93); EPGHLIN (서열 번호 94); DRSWLRE (서열 번호 95); DRSTLRE (서열 번호 96); EPGWLTE (서열 번호 97); EPGTLTE (서열 번호 98); ERSWLRE (서열 번호 99); ERSTLRE (서열 번호 100); DPGALRE (서열 번호 101); DPGALTE (서열 번호 102); ERSHLIN (서열 번호 103); ERSHLTE (서열 번호 104; DPGHLIN (서열 번호 105); DPGHLRE (서열 번호 106); EPGALRE (서열 번호 107); EPGALTE (서열 번호 108); DRSHLIN (서열 번호 109); DRSHLTE (서열 번호 110); EPGHLRE (서열 번호 111); ERSKLIN (서열 번호 112); ERSKLTE (서열 번호 113); DRSKLIN (서열 번호 114); DRSKLTE (서열 번호 115); DPGKLIN (서열 번호 116); DPGKLRE (서열 번호 117); EPGKLIN (서열 번호 118); EPGKLRE (서열 번호 119); DPGWLRE (서열 번호 120); DPGTLRE (서열 번호 121); DPGHLRE (서열 번호 122); DPGHLTE (서열 번호 123); ERSWLTE (서열 번호 124); ERSTLTE (서열 번호 125); EPGWLRE (서열 번호 126); EPGTLRE (서열 번호 127); DRSWLIN (서열 번호 128); DRSWLTE (서열 번호 129); DRSTLIN (서열 번호 130); 및 DRSTLTE (서열 번호 131)를 포함한다.
AGC에 대한 특히 바람직한 결합 도메인은 서열 번호 75 내지 84를 포함한다.
CNN에 대한 바람직한 결합 도메인은 QRHNLTE (서열 번호 132); QSGNLTE (서열 번호 133); NLQHLGE (서열 번호 134); RADNLTE (서열 번호 135); RADNLAI (서열 번호 136); NTTHLEH (서열 번호 137); SKKHLAE (서열 번호 138); RNDTLTE (서열 번호 139); RNDTLQA (서열 번호 140); QSGHLTE (서열 번호 141); QLAHLKE (서열 번호 142); QRAHLTE (서열 번호 143); HTGHLLE (서열 번호 144); RSDHLTE (서열 번호 145); RSDKLTE (서열 번호 146); RSDHLTD (서열 번호 147); RSDHLTN (서열 번호 148); SRRTCRA (서열 번호 149); QLRHLRE (서열 번호 150); QRHSLTE (서열 번호 151); QLAHLKR (서열 번호 152); NLQHLGE (서열 번호 153); RNDALTE (서열 번호 154); TKQTLTE (서열 번호 155); 및 QSGDLTE (서열 번호 156)를 포함한다.
GNN에 대한 바람직한 결합 도메인은 QSSNLVR (서열 번호 157); DPGNLVR (서열 번호 158); RSDNLVR (서열 번호 159); TSGNLVR (서열 번호 160); QSGDLRR (서열 번호 161); DCRDLAR (서열 번호 162); RSDDLVK (서열 번호 163); TSGELVR (서열 번호 164); QRAHLER (서열 번호 165); DPGHLVR (서열 번호 166); RSDKLVR (서열 번호 167); TSGHLVR (서열 번호 168); QSSSLVR (서열 번호 169); DPGALVR (서열 번호 170); RSDELVR (서열 번호 171); TSGSLVR (서열 번호 172); QRSNLVR (서열 번호 173); QSGNLVR (서열 번호 174); QPGNLVR (서열 번호 175); DPGNLKR (서열 번호 176); RSDNLRR (서열 번호 177); KSANLVR (서열 번호 178); RSDNLVK (서열 번호 179); KSAQLVR (서열 번호 180); QSSTLVR (서열 번호 181); QSGTLRR (서열 번호 182); QPGDLVR (서열 번호 183); QGPDLVR (서열 번호 184); QAGTLMR (서열 번호 185); QPGTLVR (서열 번호 186); QGPELVR (서열 번호 187); GCRELSR (서열 번호 188); DPSTLKR (서열 번호 189); DPSDLKR (서열 번호 190); DSGDLVR (서열 번호 191); DSGELVR (서열 번호 192); DSGELKR (서열 번호 193); RLDTLGR (서열 번호 194); RPGDLVR (서열 번호 195); RSDTLVR (서열 번호 196); KSADLKR (서열 번호 197); RSDDLVR (서열 번호 198); RSDTLVK (서열 번호 199); KSAELKR (서열 번호 200); KSAELVR (서열 번호 201); RGPELVR (서열 번호 202); KPGELVR (서열 번호 203); SSQTLTR (서열 번호 204); TPGELVR (서열 번호 205); TSGDLVR (서열 번호 206); SSQTLVR (서열 번호 207); TSQTLTR (서열 번호 208); TSGELKR (서열 번호 209); QSSDLVR (서열 번호 210); SSGTLVR (서열 번호 211); TPGTLVR (서열 번호 212); TSQDLKR (서열 번호 213); TSGTLVR (서열 번호 214); QSSHLVR (서열 번호 215); QSGHLVR (서열 번호 216); QPGHLVR (서열 번호 217); ERSKLAR (서열 번호 218); DPGHLAR (서열 번호 219); QRAKLER (서열 번호 220); QSSKLVR (서열 번호 221); DRSKLAR (서열 번호 222); DPGKLAR (서열 번호 223); RSKDLTR (서열 번호 224); RSDHLTR (서열 번호 225); KSAKLER (서열 번호 226); TADHLSR (서열 번호 227); TADKLSR (서열 번호 228); TPGHLVR (서열 번호 229); TSSHLVR (서열 번호 230); TSGKLVR (서열 번호 231); QPGELVR (서열 번호 232); QSGELVR (서열 번호 233); QSGELRR (서열 번호 234); DPGSLVR (서열 번호 235); RKDSLVR (서열 번호 236); RSDVLVR (서열 번호 237); RHDSLLR (서열 번호 238); RSDALVR (서열 번호 239); RSSSLVR (서열 번호 240); RSSSHVR (서열 번호 241); RSDELVK (서열 번호 242); RSDALVK (서열 번호 243); RSDVLVK (서열 번호 244); RSSALVR (서열 번호 245); RKDSLVK (서열 번호 246); RSASLVR (서열 번호 247); RSDSLVR (서열 번호 248); RIHSLVR (서열 번호 249); RPGSLVR (서열 번호 250); RGPSLVR (서열 번호 251); RPGALVR (서열 번호 252); KSASKVR (서열 번호 253); KSAALVR (서열 번호 254); KSAVLVR (서열 번호 255); TSGSLTR (서열 번호 256); TSQSLVR (서열 번호 257); TSSSLVR (서열 번호 258); TPGSLVR (서열 번호 259); TSGALVR (서열 번호 260); TPGALVR (서열 번호 261); TGGSLVR (서열 번호 262); TSGELVR (서열 번호 263); TSGELTR (서열 번호 264); TSSALVK (서열 번호 265); 및 TSSALVR (서열 번호 266)을 포함한다.
GNN에 대한 특히 바람직한 결합 도메인은 서열 번호 157 내지 172를 포함한다.
TNN에 대한 바람직한 결합 도메인은 QASNLIS (서열 번호 267); SRGNLKS (서열 번호 268); RLDNLQT (서열 번호 269); ARGNLRT (서열 번호 270); RKDALRG (서열 번호 271); REDNLHT (서열 번호 272); ARGNLKS (서열 번호 273); RSDNLTT (서열 번호 274); VRGNLKS (서열 번호 275); VRGNLRT (서열 번호 276); RLRALDR (서열 번호 277); DMGALEA (서열 번호 278); EKDALRG (서열 번호 279); RSDHLTT (서열 번호 280); AQQLLMW (서열 번호 281); RSDERKR (서열 번호 282); DYQSLRQ (서열 번호 283); CFSRLVR (서열 번호 284); GDGGLWE (서열 번호 285); LQRPLRG (서열 번호 286); QGLACAA (서열 번호 287); WVGWLGS (서열 번호 288); RLRDlQF (서열 번호 289); GRSQLSC (서열 번호 290); GWQRLLT (서열 번호 291); SGRPLAS (서열 번호 292); APRLLGP (서열 번호 293); APKALGW (서열 번호 294); SVHELQG (서열 번호 295); AQAALSW (서열 번호 296); GANALRR (서열 번호 297); QSLLLGA (서열 번호 298); HRGTLGG (서열 번호 299); QVGLLAR (서열 번호 300); GARGLRG (서열 번호 301); DKHMLDT (서열 번호 302); DLGGLRQ (서열 번호 303); QCYRLER (서열 번호 304); AEAELQR (서열 번호 305); QGGVLAA (서열 번호 306); QGRCLVT (서열 번호 307); HPEALDN (서열 번호 308); GRGALQA (서열 번호 309); LASRLQQ (서열 번호 310); REDNLlS (서열 번호 311); DASNLIS (서열 번호 312); EASNLIS (서열 번호 313); RASNLIS (서열 번호 314); TASNLIS (서열 번호 315); SASNLIS (서열 번호 316); QASTLIS (서열 번호 317); QASDLIS (서열 번호 318); QASELIS (서열 번호 319); QASHLIS (서열 번호 320); QASKLIS (서열 번호 321); QASSLIS (서열 번호 322); QASALIS (서열 번호 323); DASTLIS (서열 번호 324); DASDLIS (서열 번호 325); DASELIS (서열 번호 326); DASHLIS (서열 번호 327); DASKLIS (서열 번호 328); DASSLIS (서열 번호 329); DASALIS (서열 번호 330); EASTLIS (서열 번호 331); EASDLIS (서열 번호 332); EASELIS (서열 번호 333); EASHLIS (서열 번호 334); EASKLIS (서열 번호 335); EASSLIS (서열 번호 336); EASALIS (서열 번호 337); RASTLIS (서열 번호 338); RASDLlS (서열 번호 339); RASELIS (서열 번호 340); RASHLIS (서열 번호 341); RASKLIS (서열 번호 342); RASSLIS (서열 번호 343); RASALiS (서열 번호 344); TASTLIS (서열 번호 345); TASDLIS (서열 번호 346); TASELIS (서열 번호 347); TASHLIS (서열 번호 348); TASKLIS (서열 번호 349); (서열 번호 350); TASALIS (서열 번호 351); SASTLIS (서열 번호 352); SASDLIS (서열 번호 353); SASELIS (서열 번호 354); SASHLiS (서열 번호 355); SASKLIS (서열 번호 356); SASSLIS (서열 번호 357); SASALIS (서열 번호 358); QLDNLQT (서열 번호 359); DLDNLQT (서열 번호 360); ELDNLQT (서열 번호 361); TLDNLQT (서열 번호 362); SLDNLQT (서열 번호 363); RLDTLQT (서열 번호 364); RLDDLQT (서열 번호 365); RLDELQT (서열 번호 366); RLDHLQT (서열 번호 367); RLDKLQT (서열 번호 368); RLDSLQT (서열 번호 369); RLDALQT (서열 번호 370); QLDTLQT (서열 번호 371); QLDDLQT (서열 번호 372); QLDELQT (서열 번호 373); QLDHLQT (서열 번호 374); QLDKLQT (서열 번호 375); QLDSLQT (서열 번호 376); QLDALQT (서열 번호 377); DLDTLQT (서열 번호 378); DLDDLQT (서열 번호 379); DLDELQT (서열 번호 380); DLDHLQT (서열 번호 381); DLDKLQT (서열 번호 382); DLDSLQT (서열 번호 383); DLDALQT (서열 번호 384); ELDTLQT (서열 번호 385); ELDDLQT (서열 번호 386); ELDELQT (서열 번호 387); ELDHLQT (서열 번호 388); ELDKLQT (서열 번호 389); ELDSLQT (서열 번호 390); ELDALQT (서열 번호 391); TLDTLQT (서열 번호 392); TLDDLQT (서열 번호 393); TLDELQT (서열 번호 394); TLDHLQT (서열 번호 395); TLDKLQT (서열 번호 396); TLDSLQT (서열 번호 397); TLDALQT (서열 번호 398); SLDTLQT (서열 번호 399); SLDDLQT (서열 번호 400); SLDELQT (서열 번호 401); SLDHLQT (서열 번호 402); SLDKLQT (서열 번호 403); SLDSLQT (서열 번호 404); SLDALQT (서열 번호 405); ARGTLRT (서열 번호 406); ARGDLRT (서열 번호 407); ARGELRT (서열 번호 408); ARGHLRT (서열 번호 409); ARGKLRT (서열 번호 410); ARGSLRT (서열 번호 411); ARGALRT (서열 번호 412); SRGTLRT (서열 번호 413); SRGDLRT (서열 번호 414); SRGELRT (서열 번호 415); SRGHLRT (서열 번호 416); SRGKLRT (서열 번호 417); SRGSLRT (서열 번호 418); SRGALRT (서열 번호 419); QKDALRG (서열 번호 420); DKDALRG (서열 번호 421); EKDALRG (서열 번호 422); TKDALRG (서열 번호 423); SKDALRG (서열 번호 424); RKDNLRG (서열 번호 425); RKDTLRG (서열 번호 426); RKDDLRG (서열 번호 427); RKDELRG (서열 번호 428); RKDHLRG (서열 번호 429); RKDKLRG (서열 번호 430); RKDSLRG (서열 번호 431); QKDNLRG (서열 번호 432); QKDTLRG (서열 번호 433); QKDDLRG (서열 번호 434); QKDELRG (서열 번호 435); QKDHLRG (서열 번호 436); QKDKLRG (서열 번호 437); QKDSLRG (서열 번호 438); DKDNLRG (서열 번호 439); DKDTLRG (서열 번호 440); DKDDLRG (서열 번호 441); DKDELRG (서열 번호 442); DKDHLRG (서열 번호 443); DKDKLRG (서열 번호 444); DKDSLRG (서열 번호 445); EKDNLRG (서열 번호 446); EKDTLRG (서열 번호 447); EKDDLRG (서열 번호 448); EKDELRG (서열 번호 449); EKDHLRG (서열 번호 450); EKDKLRG (서열 번호 451); EKDSLRG (서열 번호 452); TKDNLRG (서열 번호 453); TKDTLRG (서열 번호 454); TKDDLRG (서열 번호 455); TKDELRG (서열 번호 456); TKDHLRG (서열 번호 457); TKDKLRG (서열 번호 458); TKDSLRG (서열 번호 459); SKDNLRG (서열 번호 460); SKDTLRG (서열 번호 461); SKDDLRG (서열 번호 462); SKDELRG (서열 번호 463); SKDHLRG (서열 번호 464); SKDKLRG (서열 번호 465); SKDSLRG (서열 번호 466); VRGTLRT (서열 번호 467); VRGDLRT (서열 번호 468); VRGELRT (서열 번호 469); VRGHLRT (서열 번호 470); VRGKLRT (서열 번호 471); VRGSLRT (서열 번호 472); VRGTLRT (서열 번호 473); QLRALDR (서열 번호 474); DLRALDR (서열 번호 475); ELRALDR (서열 번호 476); TLRALDR (서열 번호 477); SLRALDR (서열 번호 478); RSDNRKR (서열 번호 479); RSDTRKR (서열 번호 480); RSDDRKR (서열 번호 481); RSDHRKR (서열 번호 482); RSDKRKR (서열 번호 483); RSDSRKR (서열 번호 484); RSDARKR (서열 번호 485); QYQSLRQ (서열 번호 486); EYQSLRQ (서열 번호 487); RYQSLRQ (서열 번호 488); TYQSLRQ (서열 번호 489); SYQSLRQ (서열 번호 490); RLRNIQF (서열 번호 491); RLRTIQF (서열 번호 492); RLREiQF (서열 번호 493); RLRHlQF (서열 번호 494); RLRKIQF (서열 번호 495); RLRSIQF (서열 번호 496); RLRAIQF (서열 번호 497); DSLLLGA (서열 번호 498); ESLLLGA (서열 번호 499); RSLLLGA (서열 번호 500); TSLLLGA (서열 번호 501); SSLLLGA (서열 번호 502); HRGNLGG (서열 번호 503); HRGDLGG (서열 번호 504); HRGELGG (서열 번호 505); HRGHLGG (서열 번호 506); HRGKLGG (서열 번호 507); HRGSLGG (서열 번호 508); HRGALGG (서열 번호 509); QKHMLDT (서열 번호 510); EKHMLDT (서열 번호 511); RKHMLDT (서열 번호 512); TKHMLDT (서열 번호 513); SKHMLDT (서열 번호 514); QLGGLRQ (서열 번호 515); ELGGLRQ (서열 번호 516); RLGGLRQ (서열 번호 517); TLGGLRQ (서열 번호 518); SLGGLRQ (서열 번호 519); AEANLQR (서열 번호 520); AEATLQR (서열 번호 521); AEADLQR (서열 번호 522); AEAHLQR (서열 번호 523); AEAKLQR (서열 번호 524); AEASLQR (서열 번호 525); AEAALQR (서열 번호 526); DGRCLVT (서열 번호 527); EGRCLVT (서열 번호 528); RGRCLVT (서열 번호 529); TGRCLVT (서열 번호 530); SGRCLVT (서열 번호 531); QEDNLHT (서열 번호 532); DEDNLHT (서열 번호 533); EEDNLHT (서열 번호 534); SEDNLHT (서열 번호 535); REDTLHT (서열 번호 536); REDDLHT (서열 번호 537); REDELHT (서열 번호 538); REDHLHT (서열 번호 539); REDKLHT (서열 번호 540); REDSLHT (서열 번호 541); REDALHT (서열 번호 542); QEDTLHT (서열 번호 543); QEDDLHT (서열 번호 544); QEDELHT (서열 번호 545); QEDHLHT (서열 번호 546); QEDKLHT (서열 번호 547); QEDSLHT (서열 번호 548); QEDALHT (서열 번호 549); DEDTLHT (서열 번호 550); DEDDLHT (서열 번호 551); DEDELHT (서열 번호 552); DEDHLHT (서열 번호 553); DEDKLHT (서열 번호 554); DEDSLHT (서열 번호 555); DEDALHT (서열 번호 556); EEDTLHT (서열 번호 557); EEDDLHT (서열 번호 558); EEDELHT (서열 번호 559); EEDHLHT (서열 번호 560); EEDKLHT (서열 번호 561); EEDSLHT (서열 번호 562); EEDALHT (서열 번호 563); TEDTLHT (서열 번호 564); TEDDLHT (서열 번호 565); TEDELHT (서열 번호 566); TEDHLHT (서열 번호 567); TEDKLHT (서열 번호 568); TEDSLHT (서열 번호 569); TEDALHT (서열 번호 570); SEDTLHT (서열 번호 571); SEDDLHT (서열 번호 572); SEDELHT (서열 번호 573); SEDHLHT (서열 번호 574); SEDKLHT (서열 번호 575); SEDSLHT (서열 번호 576); SEDALHT (서열 번호 577); QEDNLIS (서열 번호 578); DEDNLIS (서열 번호 579); EEDNLIS (서열 번호 580); SEDNLlS (서열 번호 581); REDTLIS (서열 번호 582); REDDLIS (서열 번호 583); REDELIS (서열 번호 584); REDHLlS; (서열 번호 585); REDKUS (서열 번호 586); REDSLIS (서열 번호 587); REDALIS (서열 번호 588); QEDTLIS (서열 번호 589); QEDDLIS (서열 번호 590); QEDELIS (서열 번호 591); QEDHLIS (서열 번호 592); QEDKLIS (서열 번호 593); QEDSLIS (서열 번호 594); QEDALIS (서열 번호 595); DEDTLlS (서열 번호 596); DEDDLIS (서열 번호 597); DEDELIS (서열 번호 598); DEDHLIS (서열 번호 599); DEDKLIS (서열 번호 600); DEDSLIS (서열 번호 601); DEDALIS (서열 번호 602); EEDTLIS (서열 번호 603); EEDDLIS (서열 번호 604); EEDELIS (서열 번호 605); EEDHLIS (서열 번호 606); EEDKLIS (서열 번호 607); EEDSLIS (서열 번호 608); EEDALIS (서열 번호 609); TEDTLIS (서열 번호 610); TEDDLIS (서열 번호 611); TEDELIS (서열 번호 612); TEDHLlS (서열 번호 613); TEDKLIS (서열 번호 614); TEDSLIS (서열 번호 615); TEDALIS (서열 번호 616); SEDTLIS (서열 번호 617); SEDDLIS (서열 번호 618); SEDELlS (서열 번호 619); SEDHLIS (서열 번호 620); SEDKLIS (서열 번호 621); SEDSLlS (서열 번호 622); SEDALIS (서열 번호 623); TGGWLQA (서열 번호 653); SGGWLQA (서열 번호 654); DGGWLQA (서열 번호 655); EGGWLQA (서열 번호 656); QGGWLQA (서열 번호 657); RGGTLQA (서열 번호 658); RGGDLQA (서열 번호 659); RGGELQA (서열 번호 660); RGGNLQA (서열 번호 661); RGGHLQA (서열 번호 662); RGGKLQA (서열 번호 663); RGGSLQA (서열 번호 664); RGGALQA (서열 번호 665); TGGTLQA (서열 번호 666); TGGDLQA (서열 번호 667); TGGELQA (서열 번호 668); TGGNLQA (서열 번호 669); TGGHLQA (서열 번호 670); TGGKLQA (서열 번호 671); TGGSLQA (서열 번호 672); TGGALQA (서열 번호 673); SGGTLQA (서열 번호 674); SGGDLQA (서열 번호 675); SGGELQA (서열 번호 676); SGGNLQA (서열 번호 677); SGGHLQA (서열 번호 678); SGGKLQA (서열 번호 679); SGGSLQA (서열 번호 680); SGGALQA (서열 번호 681); DGGTLQA (서열 번호 682); DGGDLQA (서열 번호 683); DGGELQA (서열 번호 684); DGGNLQA (서열 번호 685); DGGHLQA (서열 번호 686); DGGKLQA (서열 번호 687); DGGSLQA (서열 번호 688); DGGALQA (서열 번호 689); EGGTLQA (서열 번호 690); EGGDLQA (서열 번호 691); EGGELQA (서열 번호 692); EGGNLQA (서열 번호 693); EGGHLQA (서열 번호 694); EGGKLQA (서열 번호 695); EGGSLQA (서열 번호 696); EGGALQA (서열 번호 697); QGGTLQA (서열 번호 698); QGGDLQA (서열 번호 699); QGGELQA (서열 번호 700); QGGNLQA (서열 번호 701); QGGHLQA (서열 번호 702); QGGKLQA (서열 번호 703); QGGSLQA (서열 번호 704); 및 QGGALQA (서열 번호 705)를 포함한다.
TNN에 대해 특히 바람직한 결합 도메인은 서열 번호 267-311을 포함한다. TNN에 대해 보다 특히 바람직한 결합 도메인은 서열 번호 267-272를 포함한다.
키메라 리컴비나제의 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인 내에, 트리플렛 결합 도메인은 바람직하게는 올리고펩티드 링커 또는 링커들이 트리플렛 결합 도메인들 사이에 위치하도록 하나 이상의 올리고펩티드 링커와 연결된다. 이러한 링커는 바람직하게는 천연 발생 징크 핑거 단백질에서 발견되는 링커와 비슷하다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 링커는 아미노산 잔기 서열 TGEKP(서열 번호 624)이다. 이러한 링커의 변형을 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 링커의 3위치에서의 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로 대체할 수 있다. 1위치에서의 트레오닌(T)은 세린(S)으로 대체할 수 있다. 2위치에서의 글리신(G)은 알라닌(A)으로 대체할 수 있다. 4위치에서의 리신(K)은 아르기닌(R)으로 대체할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 또 다른 바람직한 링커는 아미노산 잔기 서열 TGGGGSGGGGTGEKP(서열 번호 625)이다. 이러한 보다 긴 링커의 변형을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 4개의 글리신(G) 잔기의 폴리글리신 반복부 각각은 더 긴 또는 더 짧은 길이(즉, 각각 3개 또는 5개의 글리신 잔기)일 수 있다. 폴리글리신 반복부 사이의 세린 잔기(S)는 트레오닌(T)으로 대체할 수 있다. 링커 TGGGGSGGGGTGEKP(서열 번호 625)의 일부를 포함하는 TGEKP(서열 번호 624) 잔기는 TGEKP(서열 번호 624) 링커 단독에 대해 상기 기재된 바대로 변형될 수 있다. 글리신 또는 세린과 같은 다른 링커 반복단위는 펩티드(예를 들면, 단일쇄 항체 도메인)를 연결하기 하는 것으로 당해 분야에 널리 공지되어 있고 본 발명의 조성물에서 사용할 수 있다. 링커의 사용은 모든 목적을 위해 필요하지 않고 임의로 생략할 수 있다.
다른 링커는 당해 분야에 공지되어 있고 대안적으로 사용할 수 있다. 이들 링커는 링커 LRQKDGGGSERP(서열 번호 626), LRQKDGERP(서열 번호 627), GGRGRGRGRQ(서열 번호 628), QNKKGGSGDGKKKQHI(서열 번호 629), TGGERP(서열 번호 630), ATGEKP(서열 번호 631), 및 GGGSGGGGEGP(서열 번호 706) 뿐만 아니라, 아미노산 치환이 TGEKP(서열 번호 624) 및 TGGGGSGGGGTGEKP(서열 번호 625)에 대해 상기 기재된 바대로 이루어진 이들 링커의 유도체를 포함한다. 예를 들면, 이들 링커에서 QNKKGGSGDGKKKQHI(서열 번호 629) 또는 GGGSGGGGEGP(서열 번호 706)에서의 디글리신 또는 폴리글리신 반복부 사이의 세린(S) 잔기는 트레오닌(T)으로 대체할 수 있다. GGGSGGGGEGP(서열 번호 706)에서 9위치에서의 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로 대체할 수 있다. 이들 링커 및 이들 링커의 유도체를 포함하는 폴리펩티드 조성물은 본 발명의 폴리펩티드 조성물 중에 포함된다.
통상적으로, 키메라 리컴비나제의 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 헥사뉴클레오티드를 결합시키고 따라서 2개의 트리플렛 결합 도메인을 포함한다. 그러나, 키메라 리컴비나제의 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 적절한 특이성을 수득하기 위해 3개 또는 4개와 같은 더 많은 수의 트리플렛 결합 도메인을 포함할 수 있다. 물론, 키메라 리컴비나제의 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인 내로 혼입되는 트리플렛 결합 도메인의 수가 더 많을수록, 게놈에서 잠재 부위에 대한 특이성이 더 커진다. 따라서, 트리플렛 결합 도메인의 수가 증가하면, 재조합은 특정한 게놈에서 더 적은 부위에서 일어날 수 있다.
트리플렛 결합 도메인은 α-나선 도메인 내에 독특한 7합체(7개의 아미노산 잔기의 연속 서열)를 포함하고, 7합체 서열은 표적 뉴클레오티드에 대한 결합 특이성을 결정한다. 이러한 7합체 서열은 α-나선 도메인 내에 어디에서든 위치할 수 있지만, 종래에 잔기는 당해 분야에서 번호가 매겨지므로, 7합체는 -1위치로부터 6위치로 확장되는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리펩티드는 적절한 특이성을 보장하기 위해 필요한, 징크 핑거 단백질의 일부로서 기능하는 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 β-시트 및 구조체 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 키메라 리컴비나제는 비천연 발생 변체이다. 본원에 사용된 용어 "비천연 발생"은, 예를 들면, 다음: (a) 비천연 발생 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (b) 천연적으로 발생하는 폴리펩티드와 연관되지 않는 비천연 발생 2차 구조를 갖는 폴리펩티드; (c) 폴리펩티드가 천연적으로 발생하는 유기체의 종과 통상적으로 연관되지 않는 하나 이상 아미노산을 포함하는 폴리펩티드; (d) 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 아미노산의 입체이성체(여기서, 입체이성체는 천연적으로 발생하는 폴리펩티드와 연관되지 않는다)를 포함하는 폴리펩티드; (e) 천연 아미노산의 화학 잔기 이외의 하나 이상의 화학 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 또는 (f) 천연 발생 아미노산 서열의 단리 부분(예를 들면, 절단 서열) 중 하나 이상을 의미한다. 본 발명의 키메라 리컴비나제는 단리 형태로 존재하고 정제되어 물질 오염으로부터 실질적으로 자유롭다. 키메라 리컴비나제는 천연 공급원으로부터 단리시키고 정제할 수 있다; 대안적으로, 키메라 리컴비나제는 유전 공학 또는 고상 펩티드 합성과 같은 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 신생(de novo) 제조할 수 있다. 키메라 리컴비나제를 제조할 수 있는 징크 핑거 단백질의 예로는 SP1C, TFIIIA 및 Zif268 뿐만 아니라, C7(Zif268의 유도체) 및 당해 분야에 공지된 다른 징크 핑거 단백질을 포함한다. 임의의 천연 발생 징크 핑거 도메인은 본 발명에서 사용하기 위해 보충할 수 있다. 운송과 같은 일부 이용분야에서, 제한된 특이성을 갖는 징크 핑거 도메인이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따르는 키메라 리컴비나제는, 추가 도메인이 단백질의 리컴비나제 활성을 방해하지 않는 한, 다른 단백질로부터의 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가 도메인은 스페이서(spacer) 요소와 같이 또는 그 요소를 갖지 않고 혼입할 수 있다. 스페이서 요소의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 융합 단백질은 키메라 리컴비나제의 특이적 리컴비나제 활성을 상당히 변경하지 않고 당해 분야에 널리 공지된 다양한 추가 도메인, 예를 들면, 정제 태그, 효소 도메인, 리간드 결합 도메인, 세포 침투 도메인, 또는 다른 도메인을 포함할 수 있다. 효소 도메인의 예로는 형광 또는 생물발광을 통한 검출가능한 광의 생성을 촉매화하는 효소 도메인을 포함한다. 형광 단백질의 예로는 일시적 형질감염 이후의 FAC 분류화 또는 키메라 리컴비나제를 세포 내로 도입시키는 다른 절차의 수행을 허용하는, EGFP가 있다. 리간드 결합 도메인은 RecZF의 핵 존재를 적정하는 능력을 허용하는 에스트로겐 수용체를 포함한다. 세포 침투 도메인의 예로는 RGD 모티프가 있다. 하나의 예에서, 폴리펩티드는 서열이 세포 내에서 또는 생체 내에서 감지(sense)되는 것을 허용하는 β-락타마제와 같은 스플릿트 효소의 2의 하프 내로 혼입할 수 있다. 이어서, 이러한 스플릿트 효소의 2의 하프의 결합은 스플릿트 효소의 회합을 허용한다(J.M. Spotts et al. "Time-Lapse Imaging of a Dynamic Phosphorylation Protein-Protein Interaction in Mammalian Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 15142-15147 (2002)). 본 발명에 따라 키메라 리컴비나제를 혼입하여 제조할 수 있는 융합 단백질의 예로는 리컴비나제-징크 핑거-말토스 결합 단백질(MBP) 융합 단백질이 있다. 통상적으로, MBP는 단백질의 카르복실- 또는 아미노-말단에 위치한다. MBP는 말토스 컬럼에서 친화성 정제에 사용할 수 있다. 원하는 경우, 큰 C-말단 MBP 도메인이 에스케리치아 콜라이에서 리컴비나제 활성을 억제하는 것으로 보이는 상황에서 리컴비나제 활성을 향상시키기 위해, 인자 Xa 프로테아제 부위는 정제된 RecZF로부터 벌키 태그를 개열시키는데 사용할 수 있다.
상기 기재된 바대로, 단백질 화학에서 일반적으로 "보존 아미노산 치환"으로서 지칭되는 많은 아미노산 서열 변화는 2차 구조, 3차 구조, 4차 구조, 이용가능한 경우, 또는 단백질의 기능에 실질적인 붕괴 없이 단백질에서 일어날 수 있는 것으로 널리 공지되어 있다. 따라서, 1회 내지 5회의 보존적 아미노산 치환에 의해 상기 기재된 키메라 리컴비나제로부터 유도된 키메라 리컴비나제는 본 발명의 범위 내에 있으며, 단 1회 내지 5회의 보존적 아미노산 치환에 의한 키메라 리컴비나제는 재조합에 대해 동일한 DNA 서열 특이성을 갖고, 비변형 키메라 리컴비나제의 기질에 대해 약 80% 이상의 결합 친화성의 기질에 대한 결합 친화성을 가지며, 비변형키메라 리컴비나제의 약 80% 이상의 Vmax의 Vmax를 갖는다. 1회 내지 5회 보존적 아미노산 치환은 각각 다음의 치환: Ala/Gly 또는 Ser; Arg/Lys; Asn/Gln 또는 His; Asp/Glu; Cys/Ser; Gln/Asn; Gly/Asp; Gly/Ala 또는 Pro; His/Asn 또는 Gln; Ile/Leu 또는 Val; Leu/Ile 또는 Val; Lys/Arg 또는 Gln 또는 Glu; Met/Leu 또는 Tyr 또는 Ile; Phe/Met 또는 Leu 또는 Tyr; Ser/Thr; Thr/Ser; Trp/Tyr; Tyr/Trp 또는 Phe; Val/Ile 또는 Leu로부터 선택된다. 바람직하게는, 2개 이하의 보존적 아미노산 치환이 존재한다. 보다 바람직하게는, 1개 이하의 아미노산 치환이 존재한다.
상기 기재된 바의 동일한 뉴클레오티드 결합 특성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하여 또 다른 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 키메라 리컴비나제에서 사용할 수 있거나, 뉴클레오티드 표적에 대한 결합에 대해 상기 기재된 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인과 경쟁하거나, 또는 경쟁적 방식으로 상기 기재된 하나 이상의 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인의 결합을 대체한다. 경쟁적 결합 친화성을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
추가로, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 당해 분야에 공지된 바대로 분자로 모형화할 수 있다. 분자 모형화에 대해 하나의 적합한 컴퓨터 프로그램은 인사이트(Insight) II이다. 분자 모형화는 본원에 기재되어 있고 본 발명의 범위 내에 있는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인의 변형을 기초로 하는 다른 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인을 생성시키는데 사용할 수 있다. 모형화가 이러한 변형이 본 발명의 범위 내에 있는 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인의 수소 결합 패턴과 실질적으로 유사하고 모형화를 위한 기초로서 사용되는 수소 결합 패턴을 갖는다는 것을 증명할 때, 이러한 변형은 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 수소 결합 패턴과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로 유사한"은 동일한 수의 수소 결합이 존재하고, 각각의 수소 결합의 결합 각은 약 10° 이하로 변하며, 각각의 수소 결합의 결합 길이는 약 0.2 Å 이하로 변한다는 것을 의미한다.
통상적으로, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인과 적절한 서열의 DNA 사이의 결합은 1 mM 내지 10 mM의 KD로 발생한다. 바람직하게는, 결합은 10 mM 내지 1 mM, 10 pM 내지 100 nM, 100 pM 내지 10 nM의 KD로, 보다 바람직하게는 1 nM to 10 nM의 KD로 발생한다. 또 다른 대안으로, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인과 적절한 서열의 DNA 사이의 결합은 10 pM 이하의 KD로 발생할 수 있다.
본 발명에 따르는 폴리펩티드에서 혼입할 수 있는 또 다른 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 상기 기재된 도메인, 즉 서열 번호 5 내지 서열 번호 623으로부터 특정부위 유발 돌연변이 및 스크리닝에 의해 유도할 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 기술로도 호칭되는 특정부위 지시 돌연변이 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 본원에 자세히 기재할 필요는 없다. 이러한 기술은, 예를 들면, 문헌[J. Sambrook & D.W. Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001), v.2, ch. 13, pp. 13.1-13.56]에 기재되어 있다.
본 발명에 따르는 키메라 리컴비나제는 황상암모늄과 같은 염에 의한 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 등전점 전기영동, 등속전기이동, 크로마토포커싱과 같은 기술을 비롯(이에 제한되지는 않음)한 종래 단백질 정제 기술에 의해 정제할 수 있고, 다른 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 문헌[R.K. Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice" (3rd ed., Springer-Verlag, New York, 1994)]에 기재되어 있다. 하나의 특히 유용한 단백질 정제 절차는 키메라 리컴비나제 및 MBP를 혼입하는 융합 단백질의 정제에 대해 말토스 컬럼에서 친화성 크로마토그래피의 사용이다. 또 다른 유용한 단백질 정제 절차는 비변형 RecZF를 정제하는데 사용할 수 있는 DNA 친화성 크로마토그래피이다.
추가로, 본 발명의 또 다른 양태는 상기 기재된 바대로 본 발명에 따르는 키메라 리컴비나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 정의된 바대로, 뉴클레오티드 서열은 DNA 및 RNA 둘 다를 포함하지만, 증가된 안정성으로 인해 보다 통상적으로 핵산으로부터 형성된 DNA로서 제조하고 취급할 수 있다. 본 발명의 키메라 리컴비나제를 코딩하는 DNA 서열은 몇몇 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들면, DNA는 당해 분야에 널리 공지된 이종교배(hybridization) 절차를 사용하여 단리시킬 수 있다. 이는 다음의: (1) 공유된 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 대한 탐침의 이종교배; (2) 공유된 구조 특징을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝; 및 (3) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 합성을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 RNA 서열은 당해 분야에 공지된 방법[참조, 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., 1989]에 의해 수득할 수 있다.
본 발명의 키메라 리컴비나제를 코딩하는 특이적 DNA 서열의 전개는 다음의: (1) 게놈 DNA로부터의 이중 가닥 DNA 서열의 단리; (2) 해당 폴리펩티드에 대해 필요한 코돈을 제공하기 위한 DNA 서열의 화학 제조; 및 (3) 진핵생물 공여 세포로부터 단리된 mRNA의 역전사에 의한 이중 가닥 DNA 서열의 생체내 합성에 의해 수득할 수 있다. (3)의 경우에, 일반적으로 cDNA로 호칭되는 mRNA의 이중 가닥 DNA 보체가 결국 형성된다. 재조합 절차에서 사용하기 위한 특이적 DNA 서열을 전개하기 위한 이런 3가지 방법 중에서, 게놈 DNA의 단리는 가장 덜 일반적이다. 이는 인트론의 존재로 인해 포유류 폴리펩티드의 미생물 발현을 수득하는 것이 바람직한 경우 특히 사실이다. 본 발명에 따르는 키메라 리컴비나제를 수득하기 위해, DNA 서열의 합성은 흔히 원하는 폴리펩티드 생성물의 아미노산 잔기의 전체 서열이 공지되어 있는 경우 선택 방법이다. 원하는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 전체 서열이 공지되어 있지 않은 경우, DNA 서열의 직접 합성은 가능하지 않고 선택 방법은 cDNA 서열의 형성이다. 해당 cDNA 서열을 단리시키기 위한 표준 절차 중에서 높은 수준의 유전 발현을 갖는 공여 세포에서 풍부한 mRNA의 역전사로부터 유도된 플라즈미드 보유 cDNA 라이브러리의 형성이 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 기술과 조합하여 사용할 때, 훨씬 드문 발현 생성물은 클론일 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열의 상당한 부분이 공지되어 있는 경우에, 표적 cDNA에 존재하는 것으로 추정되는 서열을 복제하는 표식된 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 탐침 서열의 제조는 단일 가닥 형태로 변형된 cDNA의 클로닝된 복사본에서 수행되는 DNA/DNA 이종교배 절차에서 이용할 수 있다(Jay, et al., Nucleic Acid Research 11:2325, 1983).
본 발명의 범위 내에 있는 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 상기 기재된 바대로 본 발명의 실시양태인 폴리펩티드를 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 범위 내에 있는 뉴클레오티드 서열 중에 포함된다. 이는 상기 정의된 바의 보존적 아미노산 치환을 혼입하는 본 발명에 따르는 폴리펩티드를 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이는 상기 기재된 융합 단백질을 포함하여 키메라 리컴비나제를 혼입시키는 더 큰 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 본 발명에 따르는 모든 키메라 리컴비나제는 명확히 융합 단백질이므로, 본원에 사용된 용어 융합 단백질은 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인 및 리컴비나제 도메인 이외의 도메인을 혼입시키는 단백질 분자를 의미한다는 것에 주의한다.
본 발명의 핵산 서열은 상기 서열과 95% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하나, 단, 상기 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 임의의 단백질 활성 및 핵산 수준에서 발현되는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 전사에 영향을 주는 단백질 결합 부위의 임의의 활성을 비롯한, 염기 치환 이전의 활성을 유지해야 한다. 상기 핵산 서열은 97.5% 이상 동일한 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 서열은 99% 이상 동일하다. 이러한 목적으로, '동일성'은 니들만-분취 알고리즘(S. B. Needleman & CD. Wunsch, "A General Method Applicable to the Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins," J. MoI. Biol. 48: 443-453 (1970))에 따라 정의된다.
본 발명에 포함되는 뉴클레오티드 서열은 또한 발현 벡터를 비한정적으로 포함하는 벡터로 혼입되고, 당업계에 공지된 바와 같이 적합한 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 포함되는 뉴클레오티드 서열을 혼입하는 벡터는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 벡터 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클리오티드에 의해 형질전환 또는 형질감염되는 숙주 세포 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있으며; 진핵 세포인 경우, 상기 숙주 세포는 포유류 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 원핵 세포인 경우, 상기 숙주 세포는 전형적으로 박테리아 세포이다.
재조합형 DNA로 숙주 세포를 형질전환시키는 것은 당업자에게 공지된 바와 같이 통상의 기법에 의해 실시할 수 있다. 상기 숙주가 원핵 세포인 경우, DNA 수취가 가능한 원핵, 예컨대 에스케리치아 콜라이 능력 세포는 지수 성장기 후에 수집된 후, 당업계에 공지된 절차에 의한 CaCl2 방법에 의해 처리된 세포로부터 생성된다. 형질전환은 또한 숙주 세포의 원형질체를 형성한 후, 또는 전기 천공법에 의해 실시할 수 있다.
상기 숙주가 진핵생물인 경우, 인산칼슘 공침전물과 같은 DNA의 형질감염 방법과 같은, 통상의 기계적 절차, 예컨대 미량주사법, 전기 천공법, 리포솜에 포위된 플라스미드의 주입, 또는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템을 사용하여 징크 핑거 유도된 뉴클레오티드 결합 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 이는 미생물, 예컨대 징크 핑거 유도된 뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합형 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 박테리아; 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 코팅 서열을 함유하는 재조합형 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모; 재조합형 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMW; 담배 모자이크 바이러스, TMW)에 의해 감염되거나, 징크 핑거 유도된 DNA 결합 코딩 서열을 함유하는 재조합형 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)에 의해 형질전환되는 식물 세포 시스템; 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 코딩 서열을 함유하는 재조합형 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바귤로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 또는 징크 핑거 유도된 뉴클레오티드 결합 코팅 서열을 함유하는 재조합형 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스)에 의해 감염된 동물 세포 시스템, 또는 적합한 발현을 위해 고안된 형질전환된 동물 세포 시스템을 비한정적으로 포함한다. 글리코실화가 중요할 수 있는 이러한 경우에, 번역 및 번역후 변형을 제공하는 발현 시스템, 예를 들어, 포유류, 곤충, 효모 또는 식물 발현 시스템을 사용할 수 있다.
사용된 숙주/벡터 시스템에 따라서, 항시성 및 유도성 프로모터, 전사 증대제 성분, 전사 종결제 등을 포함하는 임의의 다수 적합한 전사 및 번역 성분을 발현 벡터에서 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter, et al., Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987] 참조). 예를 들어, 박테리아 시스템에서 복제하는 경우, 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등과 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 포유류 세포 시스템에서 복제하는 경우, 포유류 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유도된 프로모터(예를 들어, 레트로바이러스 장말단 반복; 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 사용할 수 있다. 재조합형 DNA 또는 합성 기술에 의해 생성된 프로모터를 또한 사용하여 삽입형 키메라 리컴비나제 코딩 서열의 전사를 제공할 수 있다.
박테리아 시스템에서 많은 발현 벡터가, 발현되는 키메라 리컴비나제에 대해 의도되는 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 대량 생산하는 경우, 용이하게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 단백질 회수 시에 도움이 되는 개열 부위를 함유하도록 고안된 것들이 바람직하다. 이러한 벡터로는 비한정적으로 에스케리치아 콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther, et al., EMBO J., 2:1791 , 1983)(여기서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 단백질 코드 서열을 lac Z 코딩 영역을 갖는 프레임 중의 벡터에 결합시켜 하이브리드 징크 핑거 lac Z 단백질을 생성할 수 있음); pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109, 1985; Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989) 등을 들 수 있다.
효모에서는 항시성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다. 확인을 위해, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C, Ch. 3; and Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II]를 참조할 수 있다. ADH 또는 LEU2와 같은 항시성 효모 프로모터 또는 GAL과 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다(Cloning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D. C). 대안적으로, 외래 DNA 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진하는 벡터를 사용할 수 있다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 다수의 프로모터 중 임의의 것으로 유도할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터, 예컨대 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터(Brisson, et al., Nature, 310:511-514, 1984) 또는 TMV로의 코트 단백질 프로모터(coat protein promoter)(Takamatsu, et al., EMBO J., 6:307-311 , 1987)를 사용할 수 있으며; 대안적으로 식물 프로모터, 예컨대 RUBISCO의 소규모 하위단위(Coruzzi, et al., EMBO J. 3:1671-1680, 1984; Broglie, et al., Science 224:838-843, 1984); 또는 열 충격 프로모터, 예를 들어 콩 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B(Gurley, et al., MoI. Cell. Biol., 6:559-565, 1986)를 사용할 수 있다. 상기 구조물들을 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, DNA 직접 형질전환, 미량주사법, 전기 천공법 등을 사용하여 식물 세포에 도입할 수 있다. 이러한 기법들의 확인을 위해, 예를 들어 문헌[Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section Ⅷ, pp. 421-463, 1988; and Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9, 1988]을 참조할 수 있다.
본 발명의 키메라 리컴비나제를 발현시키는 데 사용될 수 있는 대안적인 발현 시스템은 곤충 시스템이다. 이러한 한 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV)를 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 사용한다. 상기 바이러스는 스포돕테라 플루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 징크 핑거 뉴크레오티드 결합 폴리펩티드 코팅 서열은 상기 바이러스의 불필요 영역(스포돕테라 프루기페르다에서, 예를 들어 다각체 단백질 유전자)에 복제될 수 있고, AcNPV 프로모터(예를 들어, 다각체 단백질 프로모터)에 의해 제어된다. 키메라 리컴비나제 코딩 서열의 성공적인 삽입으로 다각체 단백질 유전자의 불활성화 및 비폐쇄 재조합형 바이러스(즉, 다각체 단백질 유전자에 의해 코딩되는 단백질성 코트가 없는 바이러스)의 생성을 유도하게 된다. 이어서, 이러한 재조합형 바이러스는 삽입된 유전자가 발현되는 세포를 감염시키는 데 사용된다(예를 들어, 문헌[Smith, et al., J. Biol. 46:584, 1983; Smith, U.S. Pat. No. 4,215,051] 참조).
진핵생물성 시스템, 및 바람직하게는 포유류 발현 시스템은 발현된 포유류 단백질의 적절한 번역 후 변형이 발생하도록 한다. 따라서, 진핵 세포, 예컨대 유전자 생성물의 1차 전사, 글리코실화, 인산화 및 이롭게는 분비의 적절한 처리를 위한 세포 기계를 처리하는 포유류 세포가 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포계로는 비한정적으로 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 및 WI38를 들 수 있다.
재조합형 바이러스를 사용하는 포유류 세포 시스템 또는 발현을 유도하는 바이러스 성분이 고안될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 경우, 키메라 리컴비나제의 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3부 리더 서열(tripartite leader sequence)에 결합할 수 있다. 이어서, 이러한 결합된 복합체는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 불필요 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 징크 핑거 폴리펩티드를 발현시키는 것이 실질적으로 가능하도록 유도하게 된다(예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659, 1984] 참조). 대안적으로, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터를 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Mackett, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419, 1982; Mackett, et al., J. Virol. 49:857-864, 1984; Panicali, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931, 1982] 참조). 염색체외 성분으로서 복제할 수 있는 소 유두종 바이러스를 기반으로 하는 벡터가 특히 관심의 대상이다(Sarver, et al., Mol. Cell. Biol. 1 :486, 1981 ). 상기 DNA의 마우스 세포 진입 직후에, 플라스미드는 세포당 약 100∼200 복사체로 복제할 수 있다. 삽입된 cDNA의 전사는 숙주의 염색체로의 플라스미드의 통합을 필요로 하지 않기 때문에, 높은 수준의 발현을 산출한다. 이러한 벡터는 플라스미드에 선택가능한 표지, 예컨대 neo 유전자를 포함함으로써 안정한 발현을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 게놈을 숙주 세포에서의 키메라 리컴비나제 유전자의 발현을 도입하고 유도할 수 있는 벡터로서 사용하기 위해 변형시킬 수 있다(Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353, 1984). 또한, 높은 수준의 발현은 메탈로티오네인 HA 프로모터 및 열 충격 프로모터를 비한정적으로 포함하는 유도성 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다.
장기간 재조합형 단백질을 높은 수율로 생성하기 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 복제의 원래 바이러스를 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 제어 성분(예를 들어, 프로모터, 증대제, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어된 cDNA 및 선택가능한 표지에 의해 형질전환될 수 있다. 재조합형 플라스미드에서의 선택가능한 표지는 선택에 따라 저항성을 부여하며, 세포가 플라스미드를 이의 염색체에 안정적으로 통합하도록 하고, 성장하여 결국 세포계로 복제되고 전이될 수 있는 병소를 형성한다. 예를 들어, 외래 DNA의 도입 후에, 고안된 세포를 풍부한 배지 중에서 1∼2일 동안 성장하도록 할 수 있고, 이어서 선택 배지로 교체한다. 단순포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler, et al., Cell 11:223, 1977), 히포크산틴-구아닌 인산리보전이효소(phosphoribosyltransferase)(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, 1962) 및 아데닌 인산리보전이효소(Lowy, et al., Cell, 22:817, 1980) 유전자를 비한정적으로 포함하는 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있으며, 이들은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 이용할 수 있다. 또한, 항대사물질 저항성을 부여하는 유전자를 선택에 따라 사용할 수 있다; 예를 들어 메토트렉사트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr(Wigler, et al., Natl. Acad. Sci. USA,77:3567, 1980; O'Hare, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527, 1981); 미코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, 1981); 아미노글리코시드 G418에 대한 저항성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin, et al., J. Mol. Biol., 150:1, 1981); 및 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro(Santerre, et al., Gene, 30:147, 1984)를 위한 유전자가 있다. 최근, 추가적인 선택가능한 유전자, 소위, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 하는 hisD(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:804, 1988); 및 오르니틴 디카르복실라제 억제제에 저항성을 부여하는 ODC(오르니틴 디카르복실라제), 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO(McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., 1987)가 기술되었다.
본 발명에 의해 제공된 미생물 발현된 단백질 또는 이의 단편의 단리 및 정제를 분취용 크로마토그래피 및 단일클론 또는 다클론 항체를 포함하는 면역학적 분리를 포함하는 전형적인 수단에 의해 실시할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항체는 본 발명의 키메라 리컴비나제와 면역반응성이 있다. 상이한 에피톱 특이성을 갖는 풀링된 단일클론 항체로 실질적으로 구성된 항체뿐만 아니라 별개의 단일클론 항체의 제조가 제공된다. 단일클론 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 단백질 단편을 함유하는 항원으로부터 제조된다(Kohler, et al., Nature, 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., ed,, 1989).
본 발명의 또다른 양태는 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제를 사용하여 부위 특이적 재조합 사건을 실시하는 방법이다.
본 발명에 따른 재조합 반응에서, 가장 중요한 기질은 하기 추가로 기술되는 바와 같이, 관심의 대상인 내재성 게놈, 예컨대 비한정적으로 인간 게놈 또는 사회적으로 또는 경제적으로 중요한 동물종, 예컨대 소, 말, 양, 돼지, 염소, 고양이 또는 개뿐만 아니라, 물고기, 무척추 동물, 식물 또는 원핵생물이 있다. 거의 대부분의 경우에, 이러한 내재성 RecZF 부위는 공통의 촉매 도메인을 갖지만 상이한 징크 핑거 단백질을 공유하는 2개의 상이한 RecZF 단백질, 헤테로다이머에 의해 결합되게 된다. 게놈 이외에, RecZF는 이중 가닥의 DNA로 구성된 임의의 유전 물질(예를 들어, 플라스미드, 에피솜, 선형화 단편, PCR 단편, 및 DNA 합성과 같은 기타 기법에 의해 발생하는 단편)을 변형시킬 수 있었다. 비게놈성 기질의 좋은 예로는 플라스미드가 있으며, 이는 RecZF 재조합에 의해 숙주 게놈으로 통합된다. 이러한 경우, 2개의 재조합 부위(플라스미드에서 하나 및 게놈에서 하나)가 발생하고, RecZF 단백질에 의해 변형된다.
일반적으로 상기 방법은
(1) 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제 또는 다중 키메라 리컴비나제를 특이적으로 결합시키고 스페이서에 의해 분리되는 2 이상의 부위를 갖는 DNA 서열을 제공하는 단계; 및
(2) 키메라 리컴비나제가 부위 특이적 재조합 사건을 촉진시키는 조건 하에서 상기 DNA 서열을 키메라 리컴비나제 또는 다중 키메라 리컴비나제와 반응시키는 단계로서, 여기서 DNA 서열의 가닥 둘 모두가 키메라 리컴비나제를 특이적으로 결합시키는 2개의 부위 사이에서 분리되어 부위 특이적 재조합 사건이 발생하는 단계
를 포함한다.
일반적으로, 상기 재조합 반응에서, 상기 2개의 기질 조합 부위는 동일한 DNA 분자(분자간 분해 또는 역위) 상에서, 또는 상이한 DNA 분자(분자간 통합 또는 전좌) 상에 위치할 수 있다. 이러한 종류의 재조합은 1∼4개의 상이한 RecZF에 의해 실시되며, 상기 차이는 징크 핑거 융합 단백질에 있으나, 이들은 모두 동일한 촉매 도메인을 공유한다. 일부 경우에서 상이한 촉매 도메인(예컨대 Hin 및 Gin)이 기능적으로 상용가능하기 쉽다. 이러한 단순한 반응은 본질적으로 양방향성이고, 반응 속도 면에서는 통합보다는 절단하기 쉽다.
어떤 문맥에서, RecZF 부위에 결합한 RecZF를 자연 부위에 결합한 정상의 세린 리컴비나제와 반응시키는 것이 유리할 수 있다. 이 연합은 내재성 보조 인자가 만드는 상호작용을 유지함으로써 재조합을 촉진하여야 하고, 또한 하나의 기질 부위만이 내재성 서열에 의해 지시되는 통합에 특히 유용할 수 있다.
대안으로, 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 의해 수행되는 재조합 반응의 다른 양태는 RecZF에 더 낮은 친화도로 결합하는 RecZF 부위를 포함한다. 혼합 부위(하나의 강한 그리고 하나의 약한 하프 사이트(half-site)로 구성된 것. 여기에서 "하프 사이트"는 하나의 징크 핑거 결합 부위 및 스페이서 영역의 근위 절반을 포함함)는 DNA의 두 별개 가닥에서 반응을 개시한다. 통합은 새로운 사이트가 생성되도록 이들 두 가닥을 융합한다(생성물 재조합 사이트는 언제나 기질 재조합 사이트의 키메라이다). 이 전략은 역반응(절단(excision))을 방지하는데, 그 이유는 두 생성물 사이트 중 하나는 약한 하프 사이트로만 구성되고(다른 것은 두 강한 하프 사이트를 함유함), RecZF 이량체에의 결합 무능에 의해 불능이 되기 때문이다(준최적(suboptimal) 인식 서열 및 DNA에 대한 준최적 DNA 결합 단백질 친화도(예컨대 내재적으로 더 약한 1절 징크 핑거 도메인을 포함)를 비롯한 임의의 이유에 의해). 준최적 징크 핑거 상호작용(결합 친화도) 대신에, 협동적으로 촉매 기능을 낮추는 준최적 스페이서 서열을 필적하는 하프 사이트 전략에서 이용할 수 있다. 이러한 "약한/강한 하프 사이트" 반응의 이용은 단일방향 재조합의 일반적 전략이고, 결과적으로 임의의 재조합 반응에 적용할 수 있다. 따라서, 만일 두 사이트가 동일 DNA 가닥 내에 존재한다면, 이 전략은 단일방향 역위(inversion)를 촉진하는 데 이용할 수 있다. 이의 한 응용이 소위 "자살 기질"의 이용으로서, 이것의 재조합 사이트는 비보존성 재조합을 촉진한다. 즉, 효소의 부분에서의 메커니즘적 오류 때문에 일부 DNA가 손실 또는 추가되어, 생성물 사이트가 상용성(compatible) 기질이 되지 않는다. 이는 이것이 그저 서로 반응할 수 없음을 의미하거나, 하나 또는 두 사이트가 임의의 RecZF 사이트와 반응할 수 없음을 의미할 수 있다.
후술하는 카세트 교환 전략은 이중 가닥 DNA의 임의의 분자에 적용할 수 있으나, 플라스미드 단편의 게놈에의 통합에서 그 응용을 주로 찾게 될 것이다. 항생제 내성 유전자 및 마커 유전자를 이용하여 통합 생성물(integrative product)이 풍부해지게 할 수 있으나, 이는 본 전략에서 필수적이지는 않다. 같은 방식으로, 교환된 카세트는 임의의 유전 물질을 함유할 수 있다. 두 카세트 교환 기질 각각은 두 오르소고날(orthogonal) 재조합 사이트로 구성된다. 사이트들은 서로 다른 촉매 도메인의 RecZF에 의해 결합되기 때문에 오르소고날이다. 결과적으로, 각 카세트는 2-4개의 서로 다른 RecZF에 의해 결합되고, 최대 8개의 RecZF가 반응에 참여한다(오르소고날 스페이서 서열도 이용할 수 있고, 이때 오르소고날은 기질 사이트를 재조합을 위해 모으는 능력의 부재가 아니라 RecZF의 재조합 생성물 형성 능력 부재로부터 유래한다. 이 경우, 각 카세트는 1-4개의 서로 다른 RecZF에 의해 결합될 수 있다). 두 기질상의 한 쌍의 상용성 사이트(즉 동일한 촉매 도메인을 공유하는 RecZF에 의해 결합된 사이트)가 재조합하여, 두 기질을 통합에 의해 융합한다. 2단계에서, 상용성 사이트의 다른 쌍이 재조합하고, 한 기질의 골격 및 다른 기질의 카세트로 구성되는 생성물을 절단한다. 이 접근법은 한 단편이 다른 단편으로 대체되는 서열 맞교환(swap)을 달성한다. 분해(resolution)가 다른 쌍 사이에서 뒤따르는 한, 사이트의 어느 쌍이 통합을 실행하는지는 관계없다. 만일 통합 및 결과적인 분해가 동일한 사이트들 사이에서 일어난다면, 최초의 기질이 재생된다.
상기 기술한 단일방향 전략, 즉 "강-약 하프 사이트" 및 "자살 기질"의 이용은 카세트 교환 전략과 조합되어 후자의 통합 생성물을 트랩할 수 있다. 이 경우, 한 쌍, 또는 두 쌍의 상용성 재조합 사이트가 단일방향 재조합에 적합하다.
사이트의 배향 및 절개된 DNA 가닥의 재결합의 배향에 따라, 사이트 특이적 재조합 사건은 역위, 통합 또는 분해가 될 수 있다. 역위에서, DNA의 절편은 배향이 역전된다. 통합에서, DNA의 절편은 두 사이트 사이에 삽입된다. 분해에서, DNA의 절편은 제거되어, 갭을 남기고 이는 폐쇄된다. 반대 배향의 사이트와의 시냅시스는 역위를 가능케 하는 반면, 동일 배향의 사이트와의 시냅시스는 분해를 가능케 한다(도 3).
재조합 사건, 적어도 분해의 경우의 효율은 스페이서 길이에 좌우된다. 상기 기술한 Tn3GAGGAG의 경우, 재조합은 20-bp 스페이서 영역의 경우 또는 5'-사이트 및 3'-사이트가 상이한 부정합 22/20 배열의 경우 가장 빠르고, 22-bp 스페이서 영역의 경우 덜 빠르며, 18-bp 스페이서 영역의 경우 간신히 검출가능하다.
어떤 문맥에서, 스페이서 서열 의존성이 있는데, 다만 Tn3GAGGAG의 경우 점 돌연변이는 A/T 풍부 그루브도 포함하여 스페이서 영역을 통해 용인된다. 특히, 2차 DNA 상호작용은 상대적으로 강한 결합의 징크 핑거 도메인의 존재하에 불필요할 수 있다. 그러나, 두 스페이서 영역 중 하나는 GIn 인버타제로부터 유도되는 키메라 기질 20G-GFP-20T의 경우(TCCAAAACCATGGTTTACAG(서열번호 632); 도 4B, 11레인), 재조합은 손상되었다.
본 방법의 추가 예는
(1) 제1서열 및 제2서열의 2개의 DNA 서열을 제공하는 단계로서, 제1서열 및 제2서열 각각은 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 결합하는 사이트를 내부에 갖는 단계,
(2) 사이트 특이적 재조합 사건이 제1서열 및 제2서열을 포함하여 수행되도록 제1서열 및 제2서열 모두의 가닥이 절개되는 사이트 특이적 재조합 사건을 키메라 리컴비나제가 촉매화하는 조건하에서 제1서열 및 제2서열을 하나 이상의 키메라 리컴비나제와 반응시키는 단계를 포함한다.
본 방법의 적용에서, 제1서열 및 제2서열을 포함하여 수행되는 재조합 사건은 일부 DNA가 손실 또는 추가되도록 그리고 생성물 사이트가 하나 이상의 키메라 리컴비나제와의 반응을 위한 상용성 기질이 아니도록 하는 비보존성 재조합 사건이다. 재조합 사건은 한 쌍 또는 두 쌍의 상용성 재조합 사이트가 단일방향 재조합에 적합하도록 카세트 교환일 수 있다.
본 방법의 추가 예는
(1) 제1서열 및 제2서열의 2개의 DNA 서열을 제공하는 단계로서, 제1서열 및 제2서열 중 하나는 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 결합하는 사이트를 내부에 갖고, 제1서열 및 제2서열 중 다른 하나는 하나 이상의 자연 발생 세린 리컴비나제에 결합하는 사이트를 내부에 갖는 단계,
(2) 사이트 특이적 재조합 사건이 제1서열 및 제2서열을 포함하여 수행되도록 제1서열 및 제2서열 모두의 가닥이 절개되는 사이트 특이적 재조합 사건을 키메라 리컴비나제 및 자연 발생 세린 리컴비나제가 촉매화하는 조건하에서 제1서열 및 제2서열을 하나 이상의 키메라 리컴비나제 및 자연 발생 세린 리컴비나제와 반응시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 안정한 통합을 달성하는 데 이용할 수 있다. 안정한 통합을 달성하는 데 이용할 수 있는 본 발명에 따른 한 방법은
(1) (a) 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 최적 결합 부위와 비교하여 실질적으로 낮은 친화도로 하나 이상의 키메라 리컴비나제와 결합하는 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제를 위한 돌연변이된 결합 부위; 및
(b) 최적 결합인 하나 이상의 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 결합 부위를 각각 포함하는 재조합을 위한 두 사이트를 내부에 갖는 DNA 서열을 제공하는 단계로서, 사이트들은 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제에 특이적으로 결합하고, 사이트들은 스페이서에 의해 분리되어 있는 단계; 및
(2) 사이트 특이적 재조합 사건이 수행되고 사이트 특이적 재조합 사건은 통합이며, 통합의 결과가 안정하도록 재조합에 기능적이지 않은 키메라 리컴비나제 하프 사이트를 위한 돌연변이된 결합 부위의 동종 이량체(homodimer)가 형성되도록, DNA 서열 둘 모두의 가닥이 키메라 리컴비나제에 특이적으로 결합하는 두 부위 사이에서 절개되는 부위 특이적 재조합 사건을 하나 이상의 키메라 리컴비나제가 촉매화하는 조건하에서 DNA 서열을 하나 이상의 키메라 리컴비나제와 반응시키는 단계를 포함한다.
적합한 하프 사이트는 RecZF의 서열, 그리고 DNA 서열 및 구체적인 염기에 결합하는 아미노산과의 공지된 구조-친화도 관계를 기반으로 구축할 수 있다.
안정한 통합을 달성하는 대안적인 방법은 RecZF에 대한 자연 결합 부위와 비상용성인 RecZF 부위에 대한 돌연변이 결합 부위의 이용을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은
(1) 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제와 반응성인 재조합을 위한 제1부위를 내부에 갖는 제1 DNA 서열을 제공하는 단계;
(2) 제1부위 및 제2부위가 기능적으로 오르소고날이 되도록 제1항의 하나 이상의 제2 키메라 리컴비나제와 반응성인 재조합을 위한 제2부위를 내부에 갖는 제2 DNA 서열을 제공하는 단계;
(3) 제1 DNA 서열을 하나 이상의 제1 키메라 리컴비나제와 반응시키고 제2 DNA 서열을 하나 이상의 제2 키메라 리컴비나제와 반응시켜 재조합을 일으키는 단계를 포함한다.
본 방법의 한 대안에서, 카세트 교환을 수행하기 위해, 통합에 이용되지 않는 제1 및 제2부위 중 하나에서의 절단이 재조합을 위한 제1부위 또는 재조합을 위한 제2부위에서의 통합을 뒤따른다. 재조합은 역위 또는 분해를 일으킬 수 있다.
재조합을 촉진하기 위한 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제의 다른 이용은
(1) (a) 제1 촉매 도메인 및 제1 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제를 발현하고 제1 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1플라스미드; 및
(b) 제2 촉매 도메인 및 제2 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제를 발현하고 제2 항생제 내성 유전자를 발현하는 제2플라스미드의 두 플라스미드를 생성하되, 제1 촉매 도메인과 제2 촉매 도메인이 상이하고 제1 징크 핑거 도메인과 제2 징크 핑거 도메인이 상이하도록, 그리고 제1 및 제2 항생제 내성 유전자가 두 상이한 항생제에 대한 내성을 부여하도록 하는 단계;
(2) 제1유전자의 코딩 영역 및 제2유전자의 코딩 영역을 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제 및 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제 중 하나에 각각 결합하는 비반복성 동종 이량체 부위에 측위시키되(flank), 두 키메라 리컴비나제에 의한 플라스미드 내 절단은 배제되도록 하여 두 카세트를 회합하는 단계;
(3) 한 카세트를 각 플라스미드에 삽입하여 내부에 카세트를 포함하는 두 플라스미드를 생성하는 단계; 및
(4) 카세트를 포함하는 제1플라스미드 및 카세트를 포함하는 제2플라스미드로 세균 숙주를 공감염(co-transfect)시켜 재조합이 일어나도록 하는 단계를 포함하는 카세트 교환을 촉진하는 방법이다.
이 방법의 한 대안에서, 재조합은 플라스미드간 카세트 교환이다. 다른 대안에서, 재조합은 염색체 유전자와 플라스미드 사이이다. 또다른 대안에서, 재조합은 도입된 DNA와 염색체 유전자 사이이다. 또다른 대안에서, 재조합은 카세트 교환에 의해 촉진되는 절단이다.
본 발명에 따른 카세트 교환을 촉진하는 다른 방법은
(1) (a) 제1 촉매 도메인 및 제1 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제를 발현하고 제1 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1플라스미드로서, 제1 키메라 리컴비나제는 제1유전자의 내재성 측위(flank) 서열에 결합하도록 돌연변이 또는 선택된 제1플라스미드; 및
(b) 제2 촉매 도메인 및 제2 징크 핑거 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제를 발현하고 제2 항생제 내성 유전자를 발현하는 제2플라스미드로서, 제2 키메라 리컴비나제는 제2유전자의 내재성 측위 서열에 결합하도록 돌연변이 또는 선택된 제2플라스미드의 두 플라스미드를 생성하되, 제1 촉매 도메인과 제2 촉매 도메인이 상이하고 제1 징크 핑거 도메인과 제2 징크 핑거 도메인이 상이하도록, 그리고 제1 및 제2 항생제 내성 유전자가 두 상이한 항생제에 대한 내성을 부여하도록 하는 단계;
(2) 제1내재성 측위 영역의 측면에 위치하는 제1유전자를 포함하는 제1카세트 및 제2내재성 측위 영역의 측면에 위치하는 제2유전자를 포함하는 제2카세트의 두 카세트를, 본 발명에 따른 제1 키메라 리컴비나제 및 본 발명에 따른 제2 키메라 리컴비나제 중 하나에 각각 결합하는 비반복성 동종 이량체 부위를 내부에 포함하는 두 내재성 측위 영역 각각에 의해 회합하되, 두 키메라 리컴비나제에 의한 플라스미드 내 절단은 배제되도록 하는 단계;
(3) 한 카세트를 각 플라스미드에 삽입하여 내부에 카세트를 포함하는 두 플라스미드를 생성하는 단계; 및
(4) 카세트를 포함하는 제1플라스미드 및 카세트를 포함하는 제2플라스미드로 세균 숙주를 공감염시켜 재조합이 일어나도록 하는 단계를 포함한다.
이 방법에서, 한 대안에서, 재조합은 플라스미드간 카세트 교환이다. 유사하게, 상기 기술한 바와 같이, 재조합은 염색체 유전자 및 플라스미드간, 도입된 DNA 및 염색체 유전자간일 수 있고 또는 카세트 교환에 의해 절단 촉진될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는
(1) 무작위화 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 이용하여 두 상용성 플라스미드 내에 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 단일의 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;
(2) (1) 단계에서 생성된 단일의 하프 사이트 라이브러리를 적합한 숙주에 공전환(co-transform)시켜 형질전환체(transformant)를 생성하는 단계;
(3) 선택을 위해 두 항생제를 이용하여 형질전환체를 공동 유지하는 단계;
(4) 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;
(5) 적합한 숙주를 낮은 농도에서 재전환시키는 단계;
(6) 재전환된 숙주를 두 항생제를 함유하는 배양 배지상에서 성장하도록 하는 단계; 및
(7) 단일방향 통합을 위해 PCR에 의해 두 항생제를 함유하는 배양 배지상에서 성장하는 콜로니를 스크리닝하여 cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위를 식별하는 단계를 포함하는 cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위를 식별하는 방법이다.
숙주는 박테리아 숙주, 효모 세포 숙주, 곤충 세포 숙주, 및 포유류 세포 숙주로 이루어진 군으로부터 선별될 수 있다. 적절한 박테리아 숙주는 에스케리치아 콜라이이다. 각 항생물질에 대한 내성이 쌍을 이룬 다른 항생물질에 대한 내성을 부여하지 않는 한, 다른 쌍의 항생물질이 사용될 수 있으나, 상기 선별에 적절한 항생물질은 클로람페니콜 및 카르베니실린이다.
cis-불활성화 DNA 결합 도메인 인지 부위의 선별은, (임의의 DNA 합성법에 의해 부분적으로 또는 전체적으로) 상기 결합 부위가 무작위화되어 있는 기질 라이브러리를 생성시킨다. 이들 "단일 하프 사이트" 라이브러리에서, 상기 두 결합 부위의 하나만이 무작위화되고, 나머지는 (RecZF 융합 단백질내의 DNA 결합 도메인에 완벽히 상보적으로) 고정된 채로 있다. 이 선별에 있어서, 상기 분석은 두 개의 공동 유지된 플라스미드 상의 이러한 두 하이브리드 부위의 능력을 측정하여 단일방향 통합을 유지시킨다. 이 방법은 앞서 논의된 "약/강 하프 사이트"의 전략을 따른다: 단일 하프 사이트 라이브러리의 구성요소는 RecZF에 감소된 친화성으로 결합하여, 이들이 (동일한 재조합 부위의 다른 면 위의 인접한 "강한" 징크 핑거 결합 부위에 의해 보충된) trans에서 기능성이나, (또 다른 이러한 "약한" 결합 부위에 인접한) cis에서 비활성이 된다. 모든 기능성 재조합 부위는 전이 통합을 유지할 것이므로, 최종 PCR 스크리닝은 그 반대 반응, 분해를 유지하지 않는 징크 핑거 결합 부위를 찾을 것이 요구된다. 이 선별 전략은 cis-불활성화 스페이서 서열(여기서 스페이서 영역은 DNA 결합 도메인 인지 서열 대신에 무작위화됨)을 찾는데 사용될 수 있다. 이 전략은 cis-불활성화 DNA 결합 도메인의 선별에도 사용될 수 있다. 이 경우, 표적 기질이 일정하게 유지된다(각 재조합 부위가 두 개의 다른 DNA 결합 도메인 인지 서열, 선별 표적("약한") 및 트랜스활성인자("강한")을 포함한다). 이들 기질은 상기 트랜스활성인자 DNA 결합 부위에 완전히 상보적인 RecZF의 일정한 존재하에, 다른 DNA 결합 도메인을 갖는 RecZF의 라이브러리로 배양된다.
본 방법은 하기의 단계를 더욱 포함할 수 있다:
(8) 상기 재조합 산물에 의해서만 발현되는 또 다른 리포터 유전자를 포함하는 단계; 및
(9) 상기 리포터 유전자의 활성을 스크리닝하는 단계.
본 발명의 또 다른 태양은 상기 방법에 의해 발견된 cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위이다.
본 발명의 또 다른 태양은 하기 단계를 포함하는 cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 유사한 방법이다:
(1) 무작위화 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 사용하는 두 개의 상용성 플라스미드 내에 스페이서 서열을 포함하는 단일 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 생성된 상기 단일 하프 사이트 라이브러리를 적절한 숙주내로 공-형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;
(3) 선별을 위한 두 항생물질을 사용하여 상기 형질전환체를 공동 유지하는 단계;
(4) 상기 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;
(5) 낮은 농도에서 적절한 숙주를 재형질전환하는 단계;
(6) 상기 재형질전환된 숙주를 상기 두 항생물질을 포함하는 배양 배지위에서 성장시키는 단계; 및
(7) 상기 두 항생물질을 포함하는 배양 배지 위에서 성장하는 콜로니를 단일방향 통합용 PCR에 의해 스크리닝하여, cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 단계.
cis-불활성화 DNA 결합 도메인을 동정하는 유사한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 두 개의 다른 DNA 결합 도메인 인지 서열, 선별 표적 서열 및 트랜스활성인자 서열를 포함하는 재조합 부위를 포함하는 표적 기질을 생성하는 단계;
(2) 상기 트랜스활성인자 서열에 완전히 상보적인 본 발명에 따른 고정된 키메라 리컴비나제의 존재 하에서, 다른 DNA 결합 도메인을 갖는 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제 라이브러리로 상기 표적 기질을 배양하여, 단일 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;
(3) 단계 (2)에서 생성된 상기 단일 하프 사이트 라이브러리를 적절한 숙주내로 공-형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;
(4) 선별을 위한 두 항생물질을 사용하여 상기 형질전환체를 공동 유지하는 단계;
(5) 상기 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;
(6) 낮은 농도에서 적절한 숙주를 재형질전환하는 단계;
(7) 상기 재형질전환된 숙주를 상기 두 항생물질을 포함하는 배양 배지위에서 성장시키는 단계; 및
(8) 상기 두 항생물질을 포함하는 배양 배지 위에서 성장하는 콜로니를 단일방향 통합용 PCR에 의해 스크리닝하여, cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 단계.
일반적으로, 이 방법에서, 하나의 플라스미드는 프라이밍을 위한 무작위화 뉴클레오티드를 사용하여, 상기한 바와 같이 리컴비나제의 라이브러리를 발현하고, 다른 하나의 플라스미드는 단일 RecZF를 발현한다. 그 위에서 두 효소가 이러한 선택으로 기능할 부위는 이종이량성이다: 하나의 결합 부위는 6-bp 표적에 상응하고, 다른 결합 부위는 통상의 RecZF의 유사 서열이다.
본 발명의 또 다른 태양은 기질 연결된 단백질 진화법(SLiPE)을 사용하여, 기존의 키메라 리컴비나제로부터 신규 키메라 리컴비나제를 생성하는 방법이다. 이러한 시도는 재조합 부위를 각 리컴비나제 유전자에 인접하게 위치시킨다. 따라서, 성공적인 리컴비나제를 코딩하는 유전자는 그 효소의 활동에 의해 물리적으로 표시된다. 이러한 구별되는 표시는 PCR 증폭에 의해 비성공적인 후보물의 거대한 배경으로부터 상기 유전자를 용이하게 회수하게 한다.
이 방법은 모든 DNA 결합 도메인, 임의의 라이브러리 생성 방법 및 유전자 기질에 적용 가능하다. 이는 특히 인간 게놈을 변형하는 이들의 능력에 기초한 RecZF의 선별과 관련된다. 이 선별은 두 방법 중 하나로 수행될 수 있다: (1) 두 재조합 부위의 게놈내로의 도입 후, RecZF 라이브러리의 도입/발현, 분해, 역위, 또는 전좌 유도; 또는 (2) 하나의 재조합 부위의 게놈내로의 도입 후, 제2 부위(예를 들어, 형질감염된 플라스미드 위)의 도입과 동시에 상기 RecZF 라이브러리의 도입/발현, 통합 유도. 따라서, 본 방법에 있어서 선별 프라이머에 대한 언급은 여기서 임의의 이종 스페이서 영역을 포함하고, 또한 이러한 스페이서간의 임의의 소정의 재조합 산물에 어닐링하는 프라이머를 포함하는 것으로 정의된다. 선별 프라이머의 역할은 소정의 재조합 산물 부위(상기 RecZF 라이브러리의 활성 구성요소에 바로 인접)에 결합함으로써 소정의 RecZF를 특이적으로 증폭하는 것이다.
기질-연결된 단백질 진화법을 사용하여 기존의 키메라 리컴비나제로부터 신규의 키메라 리컴비나제를 생성하는 일 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(1) 리컴비나제 변이의 라이브러리를 만들어 변이된 리컴비나제 도메인을 생성하는 단계;
(2) 상기 변이된 리컴비나제 도메인을 변이되지 않은 DNA 결합 도메인에 융합시켜 변이된 융합 단백질의 라이브러리를 생성하는 단계;
(3) 상기 변이된 융합 단백질의 라이브러리를 기능성 선별을 위해, 리컴비나제 기질을 포함하는 플라스미드내로 클로닝하는 단계; 및
(4) 리컴비나제의 활성에 의해 변형된 플라스미드를 선별함으로써 활성화 변이된 융합 단백질을 선별하는 단계.
일반적으로, 리컴비나제 변이의 라이브러리를 만드는 단계는 무작위 돌연변이 유발 과정을 통해 수행된다. 기질은 게놈일 수 있다. 다른 DNA 결합 도메인이 사용될 수도 있지만, DNA 결합 도메인은 일반적으로 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인이다.
무작위 돌연변이 유발 과정을 통한 리컴비나제 변이의 라이브러리를 만드는 바람직한 일 방법은 에러-프론 PCR에 의한 것이다. 이는 하나 이상의 dNTP 유사체의 존재 하에서, 리컴비나제 도메인의 증폭에 의해 수행될 수 있다. 특히 바람직한 dNTP 유사체는 하기 도시한 dPTP 및 8-옥소-dGTP이다. 바람직하게는, dPTP 및 8-옥소-dGTP 둘 다가 에러-프론 PCR에 사용된다.
변이된 리컴비나제 도메인을 변이되지 않은 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 융합하는 바람직한 방법은 오버랩 PCR이다.
추가적으로, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 변이될 수 있다.
바람직한 선별 방법은, 하나는 Tn3와의 사용에 적합하고 다른 하나는 Gin과의 사용에 적합한, 두개의 다른 스페이서 서열간의 재조합에 기초하여, 하이브리드 스페이서 서열을 갖는 단일 재조합 부위를 남긴 후, 상기 하이브리드 스페이서 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 증폭하는 것이다. 이는 부위-특이적 인지를 촉매화한 RecZF를 선택적으로 증폭한다. 특히 바람직한 하나의 선택으로, 하이브리드 스페이서 서열은 20G/T로 지정된 TCCAAAACCATAATATTTCG (서열 번호 633)이다. 바람직하게는, 선별 방법은 동종 재조합의 가능성을 제거하도록 설계된다.
본 방법은 PCR 셔플링을 사용한 수회의 선별 후, 활성화 변이체의 재조합을 더욱 포함할 수 있다. PCR 셔플링은 일반적으로 3회의 선별 후에 수행되나, 더 많은 또는 더 적은 수의 선별 이후에 수행될 수도 있다.
일반적으로, 본 방법은 활성화 변이된 융합 단백질의 재클로닝을 더욱 포함한다. 일반적으로, 본 방법은 또한 선별에 의해 생성된 하나 이상의 융합 단백질의 서열분석을 더욱 포함한다; 서열분석된 융합 단백질은 촉매 재조합에서 가장 활성화된 것이다.
적어도 한 가지 경우에 있어서, 선별은 Hin 및 Gin 도메인 둘 다에 동등한 단일 변이를 위한 것이다. 또 다른 경우에서, 선별은 고유의 Hin 내 동등한 잔기에 부합되는 Gin 도메인내의 변이를 위한 것이다. 일반적으로, 선별된 변이된 융합 단백질은 실질적으로 Tn3GAGGAG 키메라 리컴비나제에 동일한 스페이서 서열 길이(20 bp>22 bp>18 bp, 감소하는 활성의 순서로)에 대한 선호 또는 성향을 갖는다.
따라서, 본 발명의 또 다른 태양은 상기 방법에 의해 생성된 리컴비나제의 뮤테인이다.
일 적용예에서, 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제는 적절한 게놈으로부터 부위-특이적 절단을 촉진하는데 사용될 수 있다. 적절한 게놈은 인간 게놈일 수 있다. 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제가 인간 게놈으로부터 부위-특이적 절단을 촉진하는데 사용될 수 있는 일 구성은, 상기한 바와 같은 형질 전환 유전자 절단에서이다. 대안적으로, ICAM-5 및 CCR5와 같은, 그러나 이들에 한정되지 않는 유전자는 절단 표적일 수 있다. 절단 현상은 FACS 분석 및 유전체 PCR에 의해 측정될 수 있다. 부위-특이적 절단은 또한 적절히 특이적인 본 발명에 따른 정제된 키메라 리컴비나제 단백질을 직접 사용하여 수행될 수도 있다.
또 다른 재조합의 시도에서, RecZF 라이브러리가 사용될 수 있다. RecZF 단백질(>1024 변이체)의 라이브러리는 상기한 바와 같은 인위적인 징크 핑거 도메인의 융합으로부터 통상의 촉매 도메인으로 회합될 수 있다. 이후 적절한 약한 바인더는 한정된 DNA 결합 서열을 갖는 이 RecZF 라이브러리에 면역성 테스트를 하여 발견될 수 있다. GXGGXG(서열 번호 636)의 특성은 적절히 약한 부위의 존재를 확인하기에 적합하나, RecZF 라이브러리가 내재성 게놈 내의 특정 부위를 찾는 우수한 전략일 수 있다. 이는 상기한 바와 같이 "약한" 부위에 재조합을 촉진하는 데 특히 유용하다.
유사하게, 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제는 상기한 바와 같이 카세트 교환을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 이는 다른 촉매 및 징크 핑거 도메인을 포함하는 두 RecZF의 발현을 필요로 한다. 일반적으로, 벡터 서열은 동종 재조합의 가능성을 최소화하도록 최적화된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 부위-특이적 절단 및 카세트 교환에 사용될 수 있다.
또한, 두 유전자에 측접하는 내재성 부위가 표적화되고, 재조합 될 유전자 자체 내에서 재조합을 발생하지 않고 게놈이 변형될 수 있도록, 독특한 리컴비나제가 구성될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 유전자 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 유해한 유전자를 제거하고 이로운 유전자를 통합시키는 목적으로 유전자 치료에 사용될 수 있다.
제거될 수 있는 유해한 유전자 중에, 악성 종양 관련 종양유전자 및 연접부 수포성 표피박리증 및 듀센 근이영양증과 관련된 결함 유전자, 또한 겸상 적혈구 빈혈증, 탈라세미아, 및 기타 혈색소병증, 중증 복합 면역결핍 질환(SCID), 고셔병, 낭성 섬유증, 헤모필리아, 가족성 고콜레스테롤혈증, 및 기타 증상과 관련된 결함 유전자가 있다. 이들 예에서, 상기 질환이 겸상 적혈구 빈혈증에서와 같이 비기능성 또는 유해 단백질을 발현하고 생성하는 유전자에 기인한 것이고, 상기 유전자가 동형이면, 상기 유전자는 연속되는 통합에 의해 야생형 또는 기타 기능성 유전자로 대체될 수 있다.
유전자 치료가 재조합성 절단에 의한 유해 유전자의 제거를 포함할 때, 일반적으로, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1) 게놈내에 유해 유전자를 갖는 개체에 본 발명에 따른 부위-특이적 리컴비나제를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 부위-특이적 리컴비나제는 발현될 때, 상기 게놈으로부터 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 것인 단계; 및
(2) 상기 부위-특이적 리컴비나제를 발현시켜 상기 게놈으로부터 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 단계.
대안적으로, 이들 방법은 그들을 코딩하는 유전자 또는 유전자들의 도입 없이, 정제된 키메라 리컴비나제 단백질을 직접 사용하여 수행될 수 있다.
유전자 치료가 재조합 절단에 의한 유해 유전자의 제거 및 이후 재조합 통합에 의한 유해 유전자의 교체를 포함하는 경우, 본 발명에 따른 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(1) 게놈 내에 유해 유전자를 보유하는 개체에게 발현시 게놈으로부터 유해 유전자를 제거하는 부위 특이적 리컴비나제를 코딩하는 핵산을 투여하는 단계;
(2) 부위 특이적 리컴비나제를 발현시켜 게놈으로부터 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 단계;
(3) 개체에 그 안에 유해 유전자에 대한 기능적 치환 유전자를 함유하는 핵산을 투여하는 단계; 및
(4) 부위 특이적 리컴비나제에 의해 촉매된 재조합 통합에 의해 게놈 내로 기능성 교체 유전자를 삽입하는 단계.
본 발명에 따른 또 다른 유전자 치료 방법으로서 가장 명쾌한 것은 유해 유전자의 구조 또는 기능을 방해하고 선택된 게놈 좌위 내로 향상된 기능을 가진 유전자를 전달하도록 치료적 통합이 수행되는 유전자 치료 방법으로서, 게놈 중 유해 유전자를 가진 개체에
(1) 향상된 기능을 가진 유전자를 그 안에 포함하는 DNA 절편; 및
(2) 유해 유전자의 게놈 좌위 내로 향상된 기능을 가진 유전자를 그 안에 포함하는 DNA 절편을 통합하도록 작용하는 본 발명에 따른 하나 이상의 키메라 리컴비나제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 천연 재조합 부위에서 작용하는 하나 이상의 천연 발생 세린 리컴비나제를 투여하는 것을 더 포함한다.
또 다른 적용으로서, 원하는 기능을 부여하는 대립 유전자 또는 기능성 대립 유전자로 손상 또는 결함 대립 유전자를 직접 교체하는데 치료적 카세트 교환이 사용될 수 있다.
유전자 치료법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 본 명세서에 참고로서 포함되어 있는 문헌[B.R. Glick & J.J. Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (2nd ed., 1998, ASM Press, Washington DC), ch. 21, pp. 555-588]에 기재되어 있다. 간략하게는, 유전자 치료에 사용될 수 있는 바이러스성 유전자 전달 시스템은 레트로바이러스 벡터 시스템, 아데노바이러스 벡터 시스템, 아데sh 관련 바이러스 벡터 시스템, 및 헤르페스 바이러스 벡터 시스템을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 유전자 치료에 사용될 수 있는 비바이러스성 유전자 전달 시스템은 유전자 총 등을 이용한 직접 미량 주사법, 리포좀 형질 감염, 특정 세포 수용체에 콘쥬게이션된 폴리-L-리신에 결합된 DNA의 이용, 소염색체의 이용 및 기타 당업계에 공지된 기술을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은 약학 조성물이다.
일 대안예로서, 본 발명은 하기를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
(1) 전술한 본 발명에 따른 치료적 유효량의 키메라 리컴비나제; 및
(2) 약학적으로 허용가능한 담체.
또 다른 대안예로서, 본 발명은 하기를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
(1) 전술한 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제를 코딩하는 치료적 유효량의 뉴클레오티드 서열; 및
(2) 약학적으로 허용가능한 담체.
약학 조성물이 치료적 유효량의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 뉴클레오티드 서열은 DNA인 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 서열은 바이러스성 또는 비바이러스성 시스템과 같이 전술한 유전자 치료용 전달 시스템 내에 혼입될 수 잇다.
그 안에 용해되거나 분산된 활성 성분을 함유하는 약학 조성물 제제는 당업계에 잘 이해되어 있다. 일반적으로 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 수성 또는 비수성으로서 멸균 주사가능물질(injectable)로 제조되나, 사용 전 액체 중 용액 또는 현탁액에 적절한 고체 형태도 제조될 수 있다. 제제는 또한 에멀션화될 수 있다. 활성 성분은 약학적으로 허용가능하고 활성 성분과 융화성이 있으며 본원에 기재된 치료법에서 사용하는데 적절한 양의 부형제와 혼합될 수 있다. 적절한 부형제로는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 조합이 있다. 기타 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 각종 당 또는 형태의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 생리학적으로 융화성이 있는 용매를 포함하나 이에 한정될 필요는 없다. 또한, 원한다면 조성물은 활성 성분의 효과를 향상시키는 습윤 또는 에멀션화제 뿐만 아니라 pH 완충제 등과 같은 소량의 보조 물질을 포함할 수 있다. 또한, 약학 분야에 통상적인 기타 성분, 예컨대 킬레이트제, 방부제, 항균제, 항산화제, 색소제, 착향료 등이 조성물의 의도된 투여 경로 및 조성물의 특성에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 성분의 약학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 타르타르산, 만델산 등과 형성되는 산 부가염(폴리펩티드의 유리 아미노기와 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기와 형성되는 염은 또한 무기 염기, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 공지되어 있다. 액체 담체의 예는 활성 성분 및 물 이외에는 아무런 물질도 함유하지 않거나, 버퍼, 예컨대 생리학적 pH 값에서의 인산나트륨, 생리학적 식염수 또는 이들 모두, 예컨대 포스페이트 완충 식염수를 함유하는 멸균 수성 용액이다. 또한, 수성 담체는 나트륨 및 칼륨 클로리드, 덱스트로스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타 용질과 같은 염 뿐만 아니라 하나 이상의 완충염을 포함할 수 있다. 또한 액체 조성물은 물에 추가하여, 그리고 물을 제외한 액체 상을 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 액체상의 예는 글리세린, 식물성 오일, 예컨대 면실유, 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 물-오일 에멀션이 있다.
약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 수성 또는 비수성 용매를 포함하는 임의의 및/또는 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및/또는 항진균제, 등장 및/또는 흡수 지연제 및/또는 기타를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 약학적 활성 성분에 대한 시약 및/또는 매질의 이용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질, 담체 또는 시약이 활성 성분 또는 성분들과 융화성이 아닌 경우를 제외하고, 본 발명에 따른 조성물에서 그 사용이 예상된다. 본 발명에 사용되는 임의의 화합물의 투여를 위해, 제제는 Biologics Standards의 FDA 사무국에 의해 또는 기타 약물을 규제하는 규제 기관에 의해 요구되는 바와 같은 무균성(sterility), 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 경구, 서방형 경구, 구강, 설하, 흡입(inhalation), 통기(insufflation), 또는 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 만일 조성물이 경구적으로 투여된다면, 일반적으로 용액, 현탁액, 팅크제 또는 시럽과 같은 액체, 또는 정제, 캡슐, 환약, 트로키, 웨이퍼, 분말과 같은 종래의 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 경구 제제는 일반적으로 사용되는 부형제, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트, 및 기타 통상적인 약학적 부형제와 같은 것을 통상적으로 함유한다. 일부 제한된 구체예에서, 경구 약학적 조성물은 불활성 희석제 및/또는 동화할 수 있고 식용가능한 담체를 포함하고/포함하거나, 이들은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐로 둘러싸여질 수 있다. 대안적으로, 이들은 정제 내로 압착될 수 있다. 다른 대안으로서, 특히 수의학적 실무를 위해, 이들은 직접 식품 내로 혼입될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 이들은 부형제와 혼합되거나 섭취가능한 정제, 구강 정제, 당의정, 환약, 트로키, 캡슐, 웨이퍼, 또는 기타 통상적인 투여 형태의 형태로 사용될 수 있다.
정제, 환약, 트로키, 캡슐, 웨이퍼, 또는 기타 통상적인 투여 형태는 또한 다음과 같은 것들을 함유할 수 있다: 바인더, 예컨대 트래거캔스 검, 아카시아, 옥수수 전분, 솔비톨, 전분의 점액, 폴리비닐피롤리돈, 또는 젤라틴; 부형제 또는 충전제, 예컨대 디칼슘 포스페이트, 락토오스, 미정질 셀룰로오스, 또는 당; 붕해제, 예컨대 감자 전분, 크로스카멜로오스 소디움, 또는 소디움 전분 글리콜레이트, 또는 알긴산; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 실리카; 감미료, 예컨대 수크로오스, 락토오스, 또는 사카린; 습윤제, 예컨대 소디움 라우릴 설페이트; 또는 착향료, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린의 오일, 오렌지 향료, 또는 체리 향료. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이것은 상술한 종류의 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 각종 기타 물질들이 코팅으로서 또는 그렇지 않으면 투여 단위의 물리적 형태 및 성질을 변화시키도록 존재할 수 있다. 예컨대, 정제, 환약, 또는 캡슐은 셀락, 당 또는 이들 모두로 코팅될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 예컨대 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정화, 레비테이팅(levitating), 에멀션화, 캡슐화, 트랩화(entrapping) 또는 동결건조 공정에 의해, 그 자체로 공지되어 있는 방식으로 제조될 수 있다.
경구용 약학적 제제는 활성 화합물을 고형 부형제와 조합하고, 선택적으로는 얻어진 혼합물을 분쇄하고, 원한다면 정제 또는 당의정 코어를 수득하기 위해 적절한 보조제를 첨가한 후에 과립의 혼합물을 가공함으로써 수득될 수 있다. 적절한 부형제로는 특히 충전제, 예컨대 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 또는 솔비톨을 포함하는 당; 셀룰로오스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 검, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스,소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 등이 있다. 원한다면 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다.
당의정 코어에는 적절한 코팅이 제공된다. 이를 위해, 선택적으로 아라비아 고무, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 투여의 상이한 조합을 특성화하기 위해 또는 확인을 위해 염료 또는 안료가 정제 또는 당의정 코팅에 첨가되어질 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학 제제는 젤라틴으로 만들어진 압입식(push-fit) 캡슐과 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 솔비톨로 이루어진 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 압입식 캡슐은 락토오스와 같은 충전제, 전분과 같은 바인더 및/또는 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 및, 선택적으로 안정화제와 혼합하여 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 예컨대 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다.
일 대안예로서, 서방형 제제가 사용된다. 서방형 제제는 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 이들은 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국특허 제6,039,980호(Baichwal)에 기재되어 있는 바와 같이, 미분화된 해초, 및 잔탄, 만난 및 갈락탄의 혼합물, 규산, 디메틸실록산과 같은 담체와 함께 잔탄검 및 로커스트 빈 검과 같은 폴리사카라이드를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 기타 서방형 제제는 본 명세서에 참고로서 포함되어 있는 미국특허 제6,740,634호(Saikawa 등)에 기재되어 있는 락트산-글리콜산 중합체와 같은 생분해성 중합체를 혼합한다. 또 다른 서방형 제제는 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국특허 제4,428,926호(Keith)에 기재되어 있는 바와 같이, 폴리비닐 알콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 기재로 하는 중합체를 포함하는 팽창가능한 격자(expandable lattice)를 혼합한다. 또 다른 서방형 제제는 중성 에스테르기를 가진 에틸아크릴레이트 메틸메타크릴레이트 공중합체 뿐만 아니라 작용기로서 4차 암모늄기를 가진 메타크릴레이트 및 아크릴레이트의 공중합체를 함유하는 Rohm & Haas사의 EudragitTM 중합체를 기재로 한다.
경구용 액체 제제는 예컨대 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀션, 시럽, 팅크제, 또는 엘릭시르의 형태일 수 있거나, 사용 전에 물 또는 기타 적절한 비히클로 재구성하기 위한 건조 생성물로 주어질 수 있다. 그러한 액체 제제는 통상의 첨가제, 예를 들어 침강방지제(suspending agent), 예컨대 솔비톨 시럽, 메틸셀룰로오스, 글루코오스/당 시럽, 젤라틴, 히드록시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 또는 수소화된 식용가능한 지방; 유화제, 예를 들어 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트, 또는 아카시아; 비수성 비히클(식용가능한 오일을 함유할 수 있음), 예를 들어, 아몬드 오일, 분별된 코코넛 오일, 유성 에스테르, 프로필렌 글리콜, 또는 에틸 알코올; 또는 방부제, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 또는 소르브산을 포함할 수 있다. 이 제제는 또한 완충염, 향료, 색소 또는 감미료(예컨대 만니톨)를 경우에 따라 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위해, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 병변내, 또는 복강내 경로를 통해 주사하기 위해 화합물을 제제화하는 경우, 많은 선택사항이 가능하다. 유효량의 키메라 리컴비나제 또는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당업자에게 공지될 것이다. 일반적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 및/또는 현탁액으로서 주사가능물질로 제조될 수 있다. 주사 전에 액체를 첨가하여 용액 및/또는 현탁액으로 제조하는데 사용하기 적절한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 또한 제제는 유화될 수 있다.
주사가능물질로 사용하기에 적절한 약학적 형태는 멸균 수성 용액 및/또는 분산액; 참기름, 피넛 오일, 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 트리글리세리드, 및/또는 수성 프로필렌 글리콜을 함유하는 제제; 및/또는 멸균 주사가능물질 용액 및/또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨, 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시키는 성분을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 고농축 용액이 제조되도록 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 시약 또는 안정화제를 함유할 수 있다. 모든 경우에서 형태는 멸균이어야 하고/하거나, 용액이 투여를 위해 적절한 직경의 시린지 및 니들을 통해 용이하게 통과될 정도의 유체이어야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 박테리아나 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다.
유리 염기 또는 약물학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이의 혼합물 중에서, 및/또는 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 억제하는 방부제를 함유한다. 적절한 비민감성 및 비알러지성 방부제가 당업계에 공지되어 있다.
담체는 또한 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및/또는 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 기타), 이의 적절한 혼합물, 및/또는 식물성 기름을 함유하는 분산매 및/또는 용매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용하여, 분산액의 경우 적절한 입자 크기를 유지하여, 및/또는 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 미생물의 활동을 예방하는 것은 다양한 항균제 및/또는 항곰팡이제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 또는 티메로살을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 많은 경우에, 행크액(Hanks's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리식염수와 같은 생리학적으로 상용되는 버퍼로 용액을 제조하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기 흡수(prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴을 조성물 내에 사용함으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 상기한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 내에 혼입하고, 필요에 따라, 멸균함으로써 제조된다. 멸균은 일반적으로 여과에 의해 수행된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산매 및/또는 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가 목적 성분의 분말이 얻어지는 진공 건조 및/또는 냉동 건조 기법이다. 직접 주사하기 위한 더욱 농축되거나 고도로 농축된 용액의 제조 역시 고려되며, 여기서 용매로서 디메틸 술폭사이드(DMSO)를 사용하는 것은 매우 빨리 투과되고, 목적하는 좁은 부위에 활성 물질이 고농도로 전달되게 할 것으로 예상된다.
수용액으로 비경구 투여하기 위해, 예를 들어, 용액은 필요하다면 적절하게 완충되고 및/또는 액체 희석제가 충분한 식염수, 글루코오스, 또는 다른 강장제(tonicity agent)로 먼저 등장화되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥 내, 근육 내, 피하, 또는 복강내 투여에 적절하다. 이와 관련하여, 사용가능한 멸균 수성 매질은 본 출원에 비추어 당업자에 공지되었다. 예를 들어, 일회 투약량은 1 mL의 등장 NaCl 용액에 용해될 수 있고, 1000 mL의 피하주입액(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나, 주입의 목적 부위 내로 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences"(15th ed.), pp. 1035-1038, 1570-1580" 참조). 투약량의 일부 변동은 치료받을 대상의 상태에 따라 필수적으로 일어날 것이다. 투여 책임자는 임의의 경우마다 개별 환자에 따른 적절한 용량을 결정할 것이다. 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 또한 대량(bolus) 주사 또는 지속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있고, 1회용량 형태, 예를 들어, 앰플, 바이알, 작은 용량의 주입액, 또는 미리 충진된 주사기, 또는 보존제가 추가된 다회 용량 용기로 존재할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물 투여의 다른 경로는 비강 용액, 비강 분무제, 에어로졸, 또는 흡입제와 같은 투약 형태를 사용하는 비강투여이다. 비강 용액은 일반적으로 점적 또는 분무로 비강 경로로 투여하기 위해 고안된 수용액이다. 비강 용액은 일반적으로 비강 분비액과 다양한 면에서 유사하여 보통의 섬모 작용(ciliary action)이 유지될 수 있도록 제조된다. 따라서, 수성 비강 용액은 일반적으로 등장성이거나 및/또는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지하기 위해 약간 완충된 것이다. 또한, 점안 제제에 사용되는 것과 유사한 항미생물 보존제, 및/또는 적절한 약물 안정화제가 필요한 경우 제형 내에 포함될 수 있다. 다양한 상업적 비강 제제는 공지되었고, 예를 들어, 항생제 또는 항히스타민제를 포함할 수 있다. 분무 조성물은 적절한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적절한 가스를 사용하여 예를 들어, 압력 팩으로부터 전달되는 에어로졸, 현탁액 또는 수용액으로 제형화될 수 있다.
다른 투여 모드로 적절한 추가 제형은 질 좌제 및/또는 페서리(pessary)를 포함한다. 직장 페서리 또는 좌제 또한 사용가능하다. 좌제는 일반적으로 직장, 질, 또는 요로 내로 삽입하기 위해 투약되는 다양한 중량 또는 형태의 고체 투약 형태이다. 삽입 후, 좌제는 강액(cavity fluid) 내로 연화되거나, 용융하거나, 및/또는 용해된다. 일반적으로, 좌제용 통상적 바인더 또는 담체는 폴리알킬렌 글리콜, 코코아 버터, 또는 트리글리세라이드를 포함할 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나 리포좀 제형, 연고, 크림, 로션, 분말 또는 크림을 포함하는 다른 투약 형태가 대안적으로 사용될 수 있다. 연고 및 크림은 적절한 겔화제 및/또는 용매의 첨가로 수성 또는 유성 기제 등으로 제형화될 수 있다. 이러한 기제는 예를 들어, 물 및/또는 오일, 예를 들어, 액체 파라핀 또는 식물유, 예를 들어, 아라키스(피넛) 오일 또는 캐스터 오일 또는 용매, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 증점제는 연화 파라핀, 알루미늄 스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 미세결정성 왁스, 및 밀랍(beeswax)을 포함한다. 로션은 수성 또는 유성 기제로 제형화될 수 있고, 일반적으로 또한 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁화제 또는 증점제를 함유할 것이다.
외용 분말은 임의의 적절한 분말 기제, 예를 들어, 탈크, 락토오스, 또는 전분의 도움으로 제형화될 수 있다.
정확한 제형, 투여 경로 및 투약량은 환자 상태에 따라 개별 의사가 선택할 수 있다(Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, Ch. 1 p. 1 참조). 주치의는 독성 또는 기관 기능 장애 때문에 어떻게 그리고 언제 투여를 종료하거나, 중단하거나, 또는 조정할 것인지를 알 것이다. 반대로, 주치의는 또한 임상적 반응이 적절하지 않다면(독성 제외) 더 높은 농도로 치료를 조정할 줄 알 것이다. 관심 질환의 처치시 투여되는 용량의 크기는 치료되어야 하는 상태의 심각성 및 투여 경로에 따라 다를 것이다. 상태의 심각성은 예를 들어, 부분적으로, 표준 예후 평가법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 아마도 복용 빈도는 또한 나이, 체중, 및 개별 환자의 반응에 따라 다를 것이다. 상기 논의된 것과 동종의 프로그램이 수의학에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 리컴비나제 및 이를 포함하는 약학적 조성물 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 이중 가닥 DNA를 갖는 모든 유기체, 특히, (모든 식물을 포함하여 많은 수가 존재하는) 상동성 재조합에 적합하지 않은 것의 유전자 조작에 사용될 수 있다. 이는 시험관 내 및 생체 내에서 모두 이루어질 수 있다. 키메라 리컴비나제의 이러한 사용은 농업(예를 들어, GMO의 개발), 약학(예를 들어, 트랜스제닉 동물에 의해 제조되는 치료제), 의학(예를 들어, 질병 모델), 시험관 내 수정(예를 들어, 배아 줄기 세포 내 질병 유전자의 교정), 및 연구(예를 들어, 순유전학(forward genetics) 및 역유전학(reverse genetics))를 포함하는 산업 생물공학의 대부분의 모든 양상과 관련된다.
순유전학을 위한 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제의 사용에서, 일 적용은 최소 DNA 결합 도메인(예를 들어, 이중절 징크 핑거 단백질)을 갖는 RecZF를 사용하여, RecZF가 주어진 게놈 내에서 많은 포텐셜 재조합 부위를 갖게 되는 것이다. 각각의 이러한 단백질이 단일 부위 변형에는 부적절할 수 있는 반면, (예를 들어, 유전자 근처에서 활성 또는 비활성인 플라스미드를 통합함으로써) 순유전학 선별에 유용한 재조합 돌연변이생성의 특별한 패턴을 생성하는데 사용될 수 있다. 이중절 징크 핑거 단백질의 예에서, 이는 ~2000의 서로 다른 돌연변이성 패턴을 나타내고, 각각은 RecZF DNA 특이성과 관련된다.
치료받을 대상은 인간 환자 또는 이에 한정되지는 않으나 개, 고양이, 말, 암소, 염소, 양, 염소, 또는 돼지를 포함하는 사회적으로 또는 경제적으로 중요한 동물일 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 인간의 치료에만 한정되지는 않는다.
본 발명의 다른 양상은 본 발명에 따른 키메라 리컴비나제에 의해 촉매화되는 재조합 작용에 의해 생성된 트랜스제닉 유기체이다.
일 대안에서, 트랜스제닉 유기체는 진핵생물이다. 진핵생물은 포유동물, 예를 들어, 트랜스제닉 포유동물이 속하는 포유동물의 종에 의해 일반적으로 생성되지 않는 생성물을 생성하는 트랜스제닉 포유동물일 수 있다. 다른 대안에서, 진핵생물은 곤충, 예를 들어, 곤충의 생식이 감소되도록 변형된 또는 질병을 일으키거나 경제적인 해를 끼치는 곤충의 능력이 감소되도록 변형된 트랜스제닉 곤충일 수 있다. 예를 들어, 이러한 기법은 수정가능한 해충의 교배를 막아 결과적으로 번식을 통한 해충의 퍼짐을 예방할 수 있는 불임 해충을 생성하기 위해 조사(irradiation) 대신 사용될 수 있다. 이러한 기법이 사용될 수 있는 해충의 예는 메디테라니안 프루트 플라이(Mediterranean fruit fly) 또는 "메드플라이(medfly)"이다. 또 다른 대안에서, 트랜스제닉 진핵생물은 식물일 수 있다. 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물이 속하는 식물 종에 의해 일반적으로 생성되지 않는 생성물을 생성할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 식물은 항체와 같은 치료학적으로 중요한 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 대안으로, 트랜스제닉 식물은 개선된 성장 특성, 감소된 영양 요구량, 또는 개선된 영양 함량을 보유하도록 변형될 수 있다. 이러한 식물은 개선된 식료품의 기초로서 사용될 수 있다.
다른 대안에서, 트랜스제닉 유기체는 트랜스제닉 효모 또는 트랜스제닉 박테리아일 수 있다. 이러한 트랜스제닉 효모 또는 박테리아는 산업적 발효 공정과 같은 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 기술된다. 이러한 실시예는 설명을 위한 것이지 본 발명을 한정하고자 함이 아니다.
실시예 1
키메라 징크 핑거 리컴비나제의 구성, 분석 및 활성
Cre-lox, Flp-FRT, 및 φC31-att를 포함하는 부위 특이적 리컴비나제는 연구자로 하여금 시험관내 및 생체내에서 정확하게 염색체 DNA를 조작하는 것을 가능하게 해준다. 재조합 자리가 상동성 재조합에 의해 내재성 좌위에 도입되면, 부위 특이적 리컴비나제(SSRs)가 절단, 역위 또는 통합을 촉매화할 수 있다. 내재성 게놈 변형을 위한 이러한 2단계 방법은 포워드 및 리버스 유전학으로 개발되어 왔다. SSRs이 생체내에서 선택적으로 활성화되는 경우, 얻어지는 조건성 넉아웃은 적절한 공간 및 시간적 특이성을 갖는 유전자의 기능을 밝힐 수 있다.
통상적으로 사용되는 티로신 리컴비나제(Cre 및 Flp) 및 라지(large) 세린 인테그라제(φC31)와 달리, 세린 리컴비나제의 리졸바제/인버타제 패밀리의 맴버는 형태 및 기능 모두에서 기본단위가 된다. 이량체가 재조합 자리에 결합하는 경우, 사량체화, 가닥 절단, 교환 및 결찰과 같은 모든 후속 단계들은 촉매 도메인에 의해 단독으로 매개된다. 이러한 기준성(modularity)은 내재성 DNA 결합 도메인을 대체함으로써 재조합을 재표적화하는 것을 가능하게 한다(1,2).
다중절(polydactyl) 징크 핑거 단백질은 높은 친화도와 특이성으로 DNA에 결합된다. Cys2-His2 징크 핑거 모티브로부터, 본 실험실은 모든 GNN 트리플렛, 대부분의 ANNs 및 CNNs, 및 일부 TNNs에 특이적으로 결합하는 기본단위 빌딩 블록을 개발하여왔다. 6 내지 18 bp DNA 자리에 대해 특이적인 DNA 결합 도메인은 이러한 빌딩 블록을 사용하여 쉽게 구성된다(3-6). 이러한 신규한 DNA 결합 도메인을 함유하는 키메라 단백질은 전사 활성화 및 억제(3, 7-14), DNA 절단(15-24), 및 유전 통합(25)을 효과적으로 지시하였다.
Stark 및 동료들에 의해 동시에 회합된 Z-리졸바제(1)와 유사한, 본 제1 RecZF는 하이브리드 재조합 자리(20-bp 중심 스페이서 영역과 측접한 2개의 역위 징크 핑거 결합 자리)를 효과적으로 재조합하였다. 그러나, 이러한 단순한 융합은, 부모 리컴비나제에 의해 인식되는 서열과 밀접히 관련된 자리로 활성이 제한되는 고유 서열 바이어스와의 키메라를 형성한다. 이 연구에서, 본 발명자는 기질 연결된 단백질 진화법(Substrate Linked Protein Evolution, SLiPE)(26)을 사용하여 소정의 서열 특이성을 갖는 RecZF의 개발을 수행하였다. 본 발명자는 추론적 디자인과 직접적인 진화법을 조합하여 내재성 부분에서 부위 특이적 재조합이 일어날 것으로 예측하였다.
결과
RecZFs의 디자인
세린 리컴비나제는 헤드-투-헤드(head-to-head) 이량체로 이들의 동족 크로스오버 자리에 결합한다. 본질적으로, 이들 이량체와 인접한 DNA-결합 보조인자 단백질은 큰 다량체 시냅시스로 회합되며, 선택적인 생성물 형성에 있어 위상적인 제약이 존재한다. 지난 수십년간의 기계적 연구(27-34), 구조적 특징(35-36), 및 기능적 키메라의 분석(1,2) 결과 재조합의 훌륭한 메카니즘이 밝혀졌다. 촉매적 사량체가 2개의 크로스오버 자리 사이에 형성되고, 세린 친핵성 공격에 의해 총 4개의 DNA 가닥의 동시 절단을 매개하여, 각각의 가닥이 별개의 단량체에 공유적으로 연결된다. 뒤이어 일어나는 중간체는 사량체를 나누어 주는 크고, 평면이며, 소수성인 표면을 함유하며, 이는 가닥 교환에 요구되는 180도 회전을 가능하게 해준다. 재조합 반응은 4개의 유리 DNA 3' 히드록실이 세린 에스테르를 공격하여 새로운 포스포디에스테르 결합을 생성하는 경우에 완료된다.
여러 인버타제/리졸바제 세린 리컴비나제의 돌연변이체는 이들의 작용을 위해 보조적인 인자들이나 직각 결합 자리를 필요로 하지 않는 것으로 밝혀졌다(37-40). 이러한 변이체를 위한 최소한의 재조합 자리는, DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 2개의 역으로 반복되는 DNA 서열만으로 구성된다. 본 발명자는 과활성 세린 리컴비나제의 내재성 DNA 결합 도메인이 폴리닥틸 징크 핑거 단백질로 대체되는 경우, 부위 특이적 재조합은 임의의 소정 서열로 표적화될 수 있다고 판단하였다.
RecZF 구성에 앞서, 본 발명자는 징크 핑거 단백질 ZIF268(41)와 감마델타 리졸바제(42)의 결정 구조를 중복시켜, INSIGHTII를 사용한 리컴비나제/징크 핑거 키메라를 모델링하였다(도 12a). 이 분석은 징크 핑거 단백질을 Tn3, Hin, 또는 Gin 촉매 도메인에 융합시키는데 사용되는 링커를 합리적으로 디자인하는 것을 가능하게 해주었다. 본 발명자는 특정 징크 핑거의 개시 이전에, 각각의 리컴비나제를 이의 가요성 링커의 C-말단(Tn3의 잔기 145, Hin의 143, Gin의 142) 근처에서 절단하고, 추가적으로 3개의 잔기(SGS)를 첨가하였다. 융합을 위해 선택된 제1 징크 핑거 단백질(이하, 'G'로 언급되는 디닥틸 단백질)은, DNA 뉴클레오티드 GAGGAG(서열번호 1)에 결합하는 것으로 예상되었다. G 징크 핑거 단백질이 과활성 Tn3 리졸바제 촉매 도메인(돌연변이 G70S, D102Y, E124Q를 갖음)(38)과 융합하면 Rec ZF Tn3Ch15G를 생산하였다.
도 12에 RecZF 디자인 및 기능 분석을 나타낸다. (a) 감마 델타 리졸바제와 이량화된 트리닥틸 RecZF 키메라의 모델. (b) 분해 및 역위 분석, 및 직접적인 진화법에 사용된 복합된 기질 및 RecZF 발현 플라스미드. (c-e) Tn3Ch15G에 의한 20T 재조합 자리 사이에서의 부위 특이적 분해(c), 역위(d), 및 통합(e)의 PCR 분석에 관한 도면이 삽입된 설명. (f) Tn2Ch15G에 의한 20T 재조합 자리 사이에서의 재조합에 대한 PCF 분석. 레인 1은 250, 500, 750, 1000, 4500 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 및 10,000 bp (Promega 1 kb 래더)에서의 분자량 마커를 함유한 다. 분해 분석의 결과(Res)는 레인 2 및 7에 나타낸다(Res(B), PCR 음성 대조군). 분해가 일어나면 생성물 밴드의 강도가 증가된다. (1.0 kb)가 기질 밴드(1.8 kb)에 대응된다. 역위 분석의 결과(Inv)는 레인 3 및 8에 나타낸다(Inv(B), PCR 음성 대조군). 역위가 일어나면 생성물 밴드가 생성된다(0.4 kb). 통합 반응은 제2 플라스미드의 존재하에 수행하였으며, G20T 재조합 자리를 함유하거나(Int(+), 레인 4), 함유하지 않는다(Int(-), 레인 5). 레인 6은 100, 200, 300, 400, 500, 600 700, 800, 900, 1000, 1200, 및 1500 bp(Roche 100 bp 래더)에서의 분자량 마커를 함유한다. 모든 분석에서 플라스미드는 대장균에 일렉트로포레이션에 의해 도입되었으며, 배양은 37℃에서 밤새 지속하였다. PCR을 30 ng 플라스미드 DNA로 수행하였으며, 1% 아가로즈 젤 상에서 분석하였다. PCR 음성 대조군 반응은 주형없이 수행하였다(레인 7, 8 및 9). (g) 20T 스페이서 유도체(표 1): G18T-G-G18T(레인 1, 18-18), G18-T-G20T(레인 2, 18-20) G20T-G-G20-T(레인 3, 20-20), G22T-G-G20T(레인 4, 22-20, G22T-G-G22T(레인 5, 22-22) G20TC-G-G20T(레인 7, TC), G20TC4-G-G20T(레인 8, C4), G20TC5-G-G20T(레인 9, C5), G20TC6-G-G20T(레인 10, C6), G20TC7-G-G20T(레인 11, C7), G20G-G-G20T(레인 12, g)을 함유하는 카셋트의 분해 분석은 동일한 방식으로 수행하였다. 레인 6은 Promega 1 kb 래더를 함유한다. 주형없이 수행된 음성 대조군 PCR 반응은 f, 레인 7에 나타낸다.
징크 핑거-리컴비나제 융합 단백질(RecZFs)은 하이브리드 재조합 자리에서 결합하여 작용한다. 이들 자리는 중심 스페이서 영역(~20 bp)과 측접하는 2개의 징 크 핑거 도메인 결합 자리(역위 리피트)로 구성된다(도 12b). G20T 자리는 예를 들어, GAGGAGTGATAATTTATAATATTTCGCTCCTC(서열번호 2)이며, G 징크 핑거 단백질에 대한 각각의 결합 자리(GAGGAG(서열번호 1))에 밑줄을 그었다. 간섭 스페이서 영역 20T는, 천연 Tn2 트랜스포존(43)의 res 재조합 자리 내의 자리 I의 중심 20 bp이다. 징크 핑거 도메인 H1(GGAGGCGTG)(서열번호 634) 및 P2(GCAGTGGCG)(서열번호 635)에 대응되는 기질 또한 회합되었다. 추가적인 스페이서는 gix 재조합 자리의 중심 20 bp로부터 적용된 20T 및 20G의 점 돌연변이체를 포함하였다(표 1)(44). 3개의 플라스미드에 기초한 PCR 분석을 개발하여 RecZFs에 의해 촉매화되는 분해, 역위 및 통합을 검출하였다(도 12c-e). Tn3Ch15G를 코딩하는 유전자를 G20T를 갖는 플라스미드 상에서 대장균에 일렉트로포레이션한 경우, 3개의 모든 반응에 대해 현저한 수준이 관찰되었다(도 12f). 대조적으로, 과활성 Hin(H107Y)(45) 및 Gin(H106Y)(37) 촉매 도메인으로부터 회합된 키메라(각각 HinG 및 GinG)는, G20T로 동일한 분석을 수행한 결과 단지 약한 인버타제 활성만을 보였다(데이터는 나타내지 않음).
징크 핑거 결합 자리(ZFBSs)간의 최적의 거리를 기질 패널 상에서 Tn3Ch15G 활성을 평가함으로써 결정하였다. 각각의 RecZF 자리는 18-, 20-, 또는 22-bp 스페이서로 분리되는 2개의 역위 징크 핑거 결합 자리로 구성되었다(표 1, 도 12b). 컴퓨터 모델로 먼저 추론된 스페이서 거리의 범위는, 다양한 크기의 2개의 재조합 자리를 갖는 일련의 기질 플라스미드상에서 분해 분석을 수행하여 평가하였다(도 12g). 분해 분석의 최종 단계는 기질과 생성물 단편이 동시에 증폭되는 PCR 반응이였기 때문에(도 12c), 아가로즈 젤 상에서 각각의 밴드의 상대 강도는 RecZF 촉매화된 분해 속도에 비례하였다. 이러한 정량적인 속도의 비교결과는 Tn3CH15G가 18- 내지 22-bp 스페이서 배열에 내성을 가지나, 20 bp가 반응에 최적이었음을 제안해주었다. 이러한 결과는 다른 징크 핑거-리컴비나제에 대해 이미 보고된 22-bp 최적값과 유사한 것이다(1). 미소한 차이점은 링커 길이가 상이함으로 인해 발생할 수 있다: Tn3Ch15G 리졸바제는 5개의 아미노산(aa), 최적의 Z-리졸바제는 14 aa. 또한, Tn3Ch15G은 징크 핑거 결합 자리 사이의 다양한 거리에 내성을 갖는 능력이 있었다. 이러한 효소의 최종 응용시, 이는 내재성 서열이 존재하는 RecZF 자리의 갯수 및/또는 유용성을 증가시킬 것이다.
| 스페이서 서열 09876543211234567890 20T TGATAATTTATAATATTTCG (서열번호 639) 20 (T L/ T L) TGATAATTTATAAATTATCA (a, b) (서열번호 640) 20 (T R/ T R) CGAAATATTATAATATTTCG (a, b) (서열번호 641) 18 T GATAATTTATAATATTTC (서열번호 642) 22T CTGATAATTTATAATATTTCGA (서열번호 643) 20TTC TGATAATTTTCAATATTTCG (a) (서열번호 644) 20TC4 TGATAACTTATAATATTTCG (a) (서열번호 645) 20TC5 TGATACTTTATAATATTTCG (a) (서열번호 646) 20TC6 TGATCATTTATAATATTTCG (a) (서열번호 647) 20TC7 TGACAATTTATAATATTTCG (a) (서열번호 648) 20G TCCAAAACCATGGTTTACAG (a) (서열번호 632) 20 (G L/ T R) TCCAAAACCATAATATTTCG (a, c) (서열번호 633) 20 (T L/ G R) TGATAATTTATGGTTTACAG (a, c) (서열번호 649) 20 (G L/ T L) TCCAAAACCATAAATTATCA (a, d) (서열번호 650) 20 (G R/ T R) CTGTAAACCATAATATTTCG (a, d) (서열번호 651) |
| ZF 결합 자리 G GAG GAG (서열번호 1) H1 GGA GGC GTG (서열번호 634) P2 GCA GTG GCG (서열번호 635) |
| 각각의 RecZF 재조합 자리는 스페이서 영역에 측접하는 2개의 징크 핑거 결합 자리를 역위 리피트로 포함한다(예. G-20T-G는 GAGGAGTGATAATTTATAATATTTCG CTCCTC(서열번호 652)이며, 결합 자리에 밑줄을 그었다) (a) 볼드체는 20T 스페이서 서열의 돌연변이를 나타낸다. (b) 스페이서 20T와 20T 사이의 역위 생성물 (c) 스페이서 20G와 20T 사이의 분해 생성물 (d) 스페이서 20G와 20T 사이의 역위 생성물 |
Tn3Ch15G의 스페이서 서열 내성은 또한 비교 분해 분석을 사용하여 평가하였다(도 12g). 이 경우, 2개의 재조합 자리 중 하나는 20T(천연 Tn3 재조합 자리 서열) 내의 돌연변이를 함유하였다(표 1). 이전 연구에서는 이 영역 내에서 돌연변이에 대한 세린 리컴비나제의 내성을 밝혔으며(46-47), 크로스오버 자리의 중심으로부터 2, 3, 4, 7, 8, 및 9 bp 떨어진 돌연변이(표 1에 나타낸 위치)가 내성을 갖는 반면, 1, 5, 6, 및 10 위치의 변형은 천연 Hin 및 감마델타 리컴비나제의 기능을 현저히 저해한다. 위치 1에서의 돌연변이는 생성물 자리의 효과적인 결찰을 방해한다(48). 위치 5 또는 6에서의 시토신 및 구아노신 치환은 리컴비나제 링커 내 보존된 아르기닌과 마이너 그루브 사이의 중요한 상호작용을 간섭한다(142, Tn3; 140, Hin; 139, Gin). 위치 10에서의 특이성은 내재성 헬릭스-턴-헬릭스 DNA 결합 도메인에 의해 제공된다. Tn3Ch15G은 조사된 모든 위치에서의 점 돌연변이를 갖는 기질에 내성을 가지나(G20T (C4), G20T (C5), C20T (C6), 및 G20T (C7)), 위치 1만은 제외된다(G20T (TC)). 그러나, 다중 위치에서의 동시 돌연변이는 내성을 갖지 못했다. 20 위치의 12에서 20T와 상이한 천연 Gin 위치(44)에서 유래된 스페이서 서열(20G)를 함유하는 기질과의 분해는 효율적이지 않았다. 이러한 실험으로부터, 본 발명자는 과활성 활성 도메인이 징크 핑거 단백질과 직접적으로 융합되는 경우, 이의 부모 리컴비나제의 제한 서열 바이어스를 유전받은 키메라가 형성된다는 결론을 내렸다.
최적의 기질 특이성을 갖는 RecZFs의 진화
내재성 게놈 재조합을 위한 도구를 생성하기 위해, 본 발명자는 RecZF 스페이서 서열 바이어스를 제거하고자 하였다. RecZFs는 2개의 비상동성 스페이서 서열인 20T 및 20G를 효과적으로 재조합하는 능력을 갖는 단백질에 대해, 기질 연결된 단백질 진화법(SLiPE)(26)으로 농축하였다. 이러한 SLiPE 접근법은 대장균에서 발현되는 각각의 리졸바제가 이의 부모 플라스미드를 변형시키는 기회를 제공하도록, 동일한 플라스미디 상에서 리컴비나제와 기질을 결합시켰다(도 13a). 이러한 방법으로, 각각의 분해 생성물은 활성 리컴비나제를 코딩하였으며, 기질 플라스미드와 물리적으로 구별가능하였다. 이후 PCR 증폭으로, 이들의 적응도에 비해 강화된 돌연변이체의 집단을 포함하는 특이한 생성물 밴드가 생성되었다. 본 기질이 비상동성 자리를 함유하기 때문에, 본 발명자는 하이브리드 재조합 자리 G20(GL/TR)에서 선택적으로 분해 생성물로 어닐링되도록 프라이머 G20S3를 디자인할 수 있었다(표 1). 측접 프라이머(26)로의 선택 PCR과 비교시, G20S3는 생성물 증폭의 현저한 강화 및 소정의 부위 특이적 재조합의 선택적 강화라는 두가지의 장점을 부여하였다.
Hin, Gin, Tn3 촉매 영역은 에러-프론 PCR(error-prone PCR)에 의하여 증폭되고, 이어서 (오류 없는) 징크핑거 단백질 G와 융합되어 돌연변이 RecZFs의 세개의 라이브러리를 생성시켰다: HinL1G, GinL1G, Tn3L1G. SLiPE를 3회 수행한 후, 각 선별된 풀 내의 RecZFs가 Stemmer (49)에 의하여 기술된 DNA 셔플링(shuffling) 방법을 이용하여 재조합되었다. 추가적인 5회 선별로 작용성 G20G-G-G20T 레솔바제(resolavses, 도 13b)를 충분히 풍부하게 하였다. 각 풀로부터 콜로니 PCR 및 분해 분석을 통하여 여덟 개의 활성 클론이 동정되었다. 이 클론의 50% 이상에 돌연변이가 존재하고(도 13c 및 d), 네 개의 영역으로 집단화된다: 촉매성 세린 잔기를 포함하는 활성 부위 루프(I12V, D13G; 여기서 모든 수는 Tn3 동등 위치에 대응한다), 긴 E-헬릭스 및 코어 하부영역의 기부 측면(K65R, G70S, M72V, I80M, TI08A), 용매 노출된 하부-영역 표면(53E), 및 유연성 있는 링커(K151M). D13G는 Hin, 및 Gin 촉매 영역에서 관찰되는 가장 빈번한 돌연변이였다. 이 치환은 인접하는 A-헬릭스를 불안정화해서, 이 지역의 유연성을 증가시키는 것 같다. 돌연변이 효소에서 전개되는 비율 증가는 가닥의 분열에 대한 촉매 활성 부위 잔기의 보다 최적의 위치 선정으로부터 일어날 수 있다. 동일한 효과가 E-헬릭스(잔기 103-137)와 코어 하부영역(1-102)의 상대적 위치를 변경하는 돌연변이로 달성될 수 있다. Gin (M70V, T96A) 및 Tn3(180M, V108A) 영역에서 선별된 수 개의 돌연변이가 이 분자내 상호작용을 매개하는 잔기에서 일어났다. 촉매성 세린 및 나선형 접촉면 주변의 치환이 차선의 스페이서에 4량의 시냅틱 중간체를 형성하는데 필요한 유연성을 제공할 수 있다. 가장 촉매활성이 큰 영역 중 하나, GinL7C7(D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V, Y109H, M114V, K148M; 여기서 Y109H는 야생형 Gin으로의 역돌연변위이고, K148M는 링커 돌연변이다)는 추가적인 특성화를 위하여 선별되었다.
도 13은 RecZF G20G-G-G20T 레솔바제의 방향화된 진화(directed evolution)를 나타낸다. (a) 생성물 특이적 선별 프라이머로 기질 연관된 방향화된 진화(SLiPE). 레인 1은 Promega 1 kb 크기 마커를 함유한다. 선별 분석의 결과가 레인 2-4에 나타내어진다. 성공적인 분해가 생성물 밴드 (0.8kb)를 생성한다. 레인 2) pB-GinL7C7G-G20G-G-G20T를 37℃에서 E.coli에 밤새 배양한 후의 생성물 혼합물 (RecZF(+)); 레인 3) RecZF 기질 플라스미드 pBSS-G20G-G-G20T (RecZF(-)); 레인 4) 주형 없이 수행한 PCR 음성 대조군((RecZF(B)). (b) 상호 작용하는 연속 선별(2-8)을 통한, 출발 클론(sc; Tn3Ch15G, GinG, HinG) 및 원시 라이브러리 (naive library, 1; Tn3L1G, GinL1G, HinL1G)으로부터 고도 활성 클론 (*;Tn3L8C18G, GinL7C7G, HinL6C4G)으로의 기능적인 향상. 레인 1은 Promega 1 kb 크기 마커를 함유한다. 주형없이 수행된 음성 대조군 PCR 반응이 f, 레인 7에 나타내어진다. 분해 분석이 이미 기술된 방법으로 수행되었다. (c,d) 고 활성 클론의 50% 이상에서 선별된 돌연변이가 1차 서열 매열(c) 내에 묘사되고 DNA- 결합된 감마 델타 레솔바제 2량체의 결정 구조(d)에 지도화되었다. 청색, 신규한 Tn3 촉매 영역 돌연변이; 녹색, 신규한 Gin 촉매 영역 돌연변이; 주황, 신규한 Hin 촉매 영역 돌연변이; 분홍, 최초 클론에 존재하는 고활성화 돌연변이; 적색, 촉매성 세린, S10.
RecZF 특이성 및 기질 내성의 특성화
특정한 스페이서 서열 (20T 및 20G)에 대한 연속적 선별이 신규한 기질 편향을 갖는 RecZF를 발생시킬 수 있고, 측접된 징크 핑거 결합 위치 없이도 그러한 서열에 재조합할 수 있는 능력을 일으키기도 한다. 후자의 가능성을 알아보기 위하여, 두 개의 새로운 징크 핑거 단백질을 촉매 영역 GinL7C7에 융합시켰다. 생성되는 RecZFs, GinL7C7H1, 및 GinL7C7P2 는 서열 5'-GGAGGCGTG-3'(서열 번호 634) 및 서열 5'-GCAGTGGCG-3'(서열 번호 635)에 각각 결합할 것으로 예상되었다. 이러한 서열이 서열 5'-GAGGAG-3'(서열 번호 1)(H120G-G-H120T, P220G-G-P220T)를 대치한 기질이 제조되었다 (표 1). RecZFs이 각 기질로 클론되고 분해 및 역위 에 대하여 분석되었다 (도14a). 결합 부위와 징크 핑거 단백질이 매치된 샘플에서만 재조합이 일어났다. 이 결과는 RecZF 기능이 동족 징크 핑거 결합 부위에 의하여 측접된 위치에 한정된다는 것을 제안한다.
GinL7C7 촉매 영역의 스페이서 서열 편향성을 신속하게 특성화하기 위하여, 5-염기쌍 스페이서 영역이 무작위화된 기질 라이브러리가 제조되었다. GinL7C7G 가 각 라이브러리로 클론되어 역외에 대하여 분석되었다. 역위 PCR 생산물을 순수분리한 후, 기능적인 재조합 부위의 집합 집단의 서열을 결정하였다 (도 14b). 생성된 크로마토그램은, 특히 징크 핑거 결합 부위에 인접한 5개의 염기 쌍 내에서 예상외로 광범위한 기질 내성을 나타내었다 (도 14c). 이 결과는 RecZFs가 성공적으로 모 재조합 위치에 관련되지 않은 서열을 목표화할 수 있음을 보여준다.
도 14는 GinL7C7 촉매 영역의 특성화를 나타낸다. (a) 이미 기술된 방법으로 수행된, GinL7C7H1 (H1) 및 GinL7C7P2 (P2)의 기질 H120G-G-H120T(H1), P220G-G-P220T(P2)에 대한 분해 및 역위 분석. 분해 분석 결과는 레인 1-t에 나타내어진다. 성공적 분해가 기질 밴드 (1.9kb)에 대한 생성물의 밴드(1.1kb)의 강도를 증가시킨다. 레인 6은 Promega 1 kb 사이즈 마커를 함유한다. 역위 분석의 결과가 레인 7-11에 나타내어진다. 성공적 역위가 생성물 밴드 (1.4kb)를 생성시킨다. PCR 음성 대조 반응이(-,-) 주형 없이 분해(레인 1) 및 역위 (레인 11) 두 분석에 대하여 수행되었다. (b-c) RecZF 기질 라이브러리를 이용한 스페이서 서열 편향성 분석. 5bp 영역이 무작위화된 기질 4개의 풀과 GinL7C7를 반응시킨 역위 분석이 전술된 방법으로 수행되었다 (b). 역위 관련된 PCR 생성물이 겔 순수분리되고 서열결정되었다. 기능적 스페이서의 각 집합의 시퀀싱 크로마토그램 (c, 왼쪽). 스페이서 전 영역(20T 및 20G)은 5 bp 무작위화된 영역이 하나의 뉴클레오티드에서 중복되는 두 개의 기질 라이브러리로부터의 크로마토그램 복합에 의하여 나타내어진다(위치 6, 표 1).
인간 게놈에서의 Rec
ZF
재조합
궁극적인 목적은 인간 게놈의 원하는 위치에 표적화되고 부위-특이적인 재조합을 촉매하는 RecZFs를 고안하는 것이다. 인간 세포에서 우리의 RecZFs에 의한 재조합을 평가하기 위하여, CMV 프로모터에 의하여 작동되고 재조합 부위 H120G 및 H120T에 의하여 측접된 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 암호화 하는 리포터 카세트를 Invitrogen Flp-In 시스템을 통하여 293 배아 신장 세포에 삽입하였다 (도 15a). 카세트의 한 카피만이 각 세포에 존재하기 때문에(50), 부위 특이적 분해는 EGFP 낙아웃(knocout)을 일으키고 재조합효소 활성은 형광이 감소된 세포의 비율에 직접적으로 비례할 것이다. GinL7C7H1 및 GinL7C7P2 을 pBabe-퓨로마이신 발현 벡터(pBP)에 클론하였다(51). 두 작제물과 빈 벡터를 레트로바이러스 형질 도입에 의하여 리포터 세포 주에 도입하고, 퓨로마이신 선별로 풍부화하였다. 형질 도입후 9일 후 형질도입된 세포가 콘플루언스(confluence)에 도달하였을 때, FACS 분석(도 15b, c) 및 게놈 PCR(도 15d)을 수행하였다. 두 분석 결과가 일치하였다: RecZFs는 게놈 재조합을 효율적이고 징크 핑거-매개 특이적으로 촉매하였다. GinL7C7H1 는 17.0% ± 0.8%의 형질도입된 세포에서 예상된 PCR 밴드 생산물 (~200) 을 생성하고 EGFP 형광을 저하시켰다. 반대로, GinL7C7P2 및 빈 벡터(pBP)는 생성물 밴드도 유의미한 수의 비 형광 세포도 발생시키지 않았다 (각각 1.7% ± 0.2% 및 2.3% ± 0.4%). ~200 bp 밴드 시퀀싱으로 PCR 결과를 확인하여 그것이 예상되었던 부위 특이적 분해의 생성물임을 확인하였다. 유전형과 표현형의 보다 정확한 연결을 위하여, pBPGinL7C7H1 로 형질 도입된 EFGP 및 EFGP+ 세포의 집단을 분리하였다. 계속된 게놈 PCR 분석으로 부위 특이적 절단의 수단으로 FACS를 사용하는 것을 실질화하였다 (도 15d).
도 15는 인간 게놈의 표적화되고 부위특이적 분해를 나타낸다. (a) GinL7C7H1 분해를 위한 리포터 카세트 한 카피가 Flp-In 시스템을 사용하여 Flp-InTM 293 인간 배아 신장 세포에 도입되었다. (b, c, d) 리포터 세포 주는 빈 pBabe-퓨로마이신 벡터 (RecZF (-)), GinL7C7P2 및 GinL7C7H1로 형질 도입되고, 퓨로마이신 선별(2 ㎍/㎖)로 풍부화되었다. 형질 도입 후 9일에, 각 샘플의 형광이 FACS에 의하여 측정되었다 (b). 3번의 독립된 실험을 통하여 형광이 감소된 세포의 비율의 평균을 구하였다 (c). FACS 샘플이 게놈 DNA 정제를 위하여 용해되었다. 단리된 DNA (100 -400 ng)가 게놈 분해 분석을 위한 PCR 주형으로 사용되고 ((a)에 도시된 프라이머를 사용하여), 결과가 1% 아가로스 겔로 분석되었다 (d). 레인 1은 Promega 1 kb 사이즈 마커를 함유한다. 분해 분석 결과는 레인 2-6 및 8(Res(B), PCR 음성 대조군)에 나타내어진다. 성공적인 분해는 기질 밴드(1.6 kb pb)에 대한 생성물 밴드 (0.2 kb)의 강도를 증가시킨다. 레인 6은 Roche사의 100bp 크기 마커를 포함한다.
논의
표적 내재성 게놈 변형에 현재 사용되는 기술은 대부분 상동성 재조합(HR) 또는 부위 특이적 재조합(SSR)에 기초한다. HR은 임의의 유전자 서열에 용이하게 표적화할 수 있지만, 재조합의 빈도가 매우 낮다. HR은 내재성 DNA 복구 장치에 의존하기 때문에, 재조합의 빈도는 세포 유형에 의존적이고, 기질 사이의 동종성의 정도에 비례한다. 대조적으로 SSR은 임의의 세포 환경에서 관련되지 않은 기질 사이의 재조합을 촉진시킨다. 그러나, 부위 특이적 재조합의 응용은 공지된 리컴비나제의 서열 특이성에 의해 제한된다. 이중가닥 절단(52), 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드(53), 또는 아데노-연관된 바이러스(54)의 도입에 의해 HR의 효율성을 개선하기 위한 조사 및 SR 기질 선호도(26, 55, 56)를 변경하기 위한 조사에 많은 노력이 들었지만, 이러한 제한은 게놈 유전공학 및 유전자 치료에서의 다수의 응용을 계속적으로 방해하였다.
다수의 방법에서, RecZF는 임의의 세포 유형에서 관련되지 않은 기질의 효율적이고, 표적화된 재조합인 HR 및 SSR의 최선의 요소를 결합한다. 이제 관심있는 유전자 좌위에서 또는 그 사이에서 분해, 역위 또는 통합을 시도하는 것이 실행 가능하게 된다. 그러나, 이는 동시에 일어나는 제어 손실에 의해 상쇄되는 것으로 보일 수 있는 기능성을 얻는다. HR은 목적하는 위치 및 방향에서 안정한 생성물을 발생시키나, C31 같은 세린 인테그라제는 단일방향 재조합과 동일한 결과를 달성할 수 있다. 단순한 RecZF 반응은 이러한 정밀성이 부족한데, 이는 기질 방향 및 기하학에 영향받지 않는 과활성 촉매 도메인에 의해 매개되기 때문이다. 본 발명자들은 RecZF 매개 재조합을 제어하기 위한 다양한 전략을 계획한다. 세린 재조합의 방향은 크로스오버 부위(48, 58)의 중심에서, 2-bp 돌출부에 의해 유도된다. 이의 고유 역전된 보체(스페이서 20G 및 20T에서, AT와 상이)가 아닌 돌출부는 동일한 방법으로 RecZF 반응을 유도하여야 한다; 직접 리피트 내 부위는 분해를 가능하게 하는 반면, 역위 리피트 내 부위는 역위를 가능하게 한다. 단일방향 RecZF 시스템이 미래에 생성될 수 있다는 가능성이 있지만, 더 당면한 제어의 정도는 차선의 하프 사이트(59, 60) 및 재조합 매개 카세트 교환(RMCE)(62)을 포함하는 Cre 및 Flp에 대해 사전 개발된 전략을 채용함으로써 얻을 수 있다. 이러한 기술 외에도, 안정한 통합은 RecZF 표적 전위(62)를 통해 달성될 수 있을 것이다.
RecZF의 새로운 기능은 현 SSR 계통적 분류법이 임의의 유전자 환경에서 사용되는 것을 가능하게 하여야 한다. 본 발명자들은 내재성 게놈을 시험관 내 및 생체 내에서 빠르게 조정하는 편안함은 기초 및 응용 리서치 모두에서 광범위한 응용을 가질 것이라고 예상한다. 특정 유전자의 고의 파괴는 RecZF의 명백한 용도이고, 이러한 역할에서 HR이 효과가 없는 다수의 종의 리버스 유전학을 용이하게 할 수 있다. 비특이적 파괴 또는 활성화는 이중절 RecZF에 의해 매개될 수 있고, 트랜스포아제와 비교할 때, >200 RecZF 돌연변이체 각각은 게놈 돌연변이생성의 특이한 패턴을 발생시킬 것이다. 또한, RecZF는 미생물 모델의 게놈을 조작하는 데 이용될 수 있고, 이로써 HR(63) 및 SSR(64-66)과 유사한 방식으로 유용한 질병 모델을 발생시킨다.
마지막으로 RecZF는 유전자 결함을 정정하고, 삶의 질 향상 유전자를 전달하기 위해 치료적 "게놈 조사"에서 이용될 수 있다. RecZF 유전자의 작은 사이즈(~800 bp)는 단일 벡터(67)가 내재성 절단 또는 통합에 필요한 4개의 상이한 키메라를 발현시키게 한다. 건강 위험도가 치료 이익을 초과하였기 때문에, 유사한 유전자 치료법은 실패하였다. 레트로바이러스성 인테그라제는 높은 효율로 유전자를 전달할 수 있지만, 비특이적 통합은 종양유전자를 활성화시킬 수 있다. HR의 특이성은 유전자 정정에 대한 우수한 후보자일 수 있게 하나, 연관된 DNA 손상 반응은 처리된 세포(68)의 생존력을 감소시킬 수 있다. SSR은 DNA 손상 반응을 자극하지 않고, 치료 유전자를 위한 우수한 벡터인 것으로 보인다. 실제로, 부위 특이적 인테그라아제 φC31은 마우스 및 인간 게놈(55, 69, 70) 내 슈도(pseudo) 부위를 표적할 수 있고, 연접부 수포성 표피박리증(71), 듀센 근이영양증(72) 및 1형 유전성 타이로신혈증(73)에 대한 쥐과 질병 모델의 성공적인 생체 내 치료를 가능하게 한다. 불행하게도, φC31은 인간 세포(70, 74) 내에서 상당한 수준의 독성 및 염색체간 재조합을 나타낸다.
본 발명자들은 RecZF 시스템 내 독성이 특정 단백질과 문제가 되는 경우, 핑거 도메인을 신중하게 선택함으로써 완화시킬 수 있을 것으로 예상한다. 이 연구에서 삼중절 단백질은 오직 9 bp를 결합하지만, 18 bp에 결합하는 육중절 징크 핑거 단백질은 인간 게놈 내 단일 부위를 표적할 수 있다. 이들 단백질의 특이성은 시험관 내에서 증명되었다(75); 육중절 ZF는 인간 세포 및 전체 식물(76, 77) 내 단일 유전자의 조절을 매개한다. DNA 결합 도메인 변형을 통해 활성을 급격하게 조정하는 능력은 이 리컴비나제의 특이한 특징이다. 중간생성물 해리(78), 슈도 부위 존재 및 하프 사이트 활성(79)을 포함하는 다른 이슈들은 RecZF가 치료 용도를 위해 평가되는 것으로서 다루어야 한다. 그러나, 이 연구에서 증명된 현저한 기능적 가요성의 관점에서, RecZF는 현재까지 접근할 수 없었던 수준의 유전자 변형을 용이하게 하여야 하고, 유전자 기능 및 치료의 연구를 할 수 있게 하는 유망한 수단이다.
방법
달리 기재하지 않는다면, PCR 단편 및 소화물은 PCR 정제 키트(QIAGEN, Valecia, CA)를 사용하여 정제하였다. 벡터는 송아지 장 포스파타제(calf intestinal phosphatase:CIP, 37℃에서 1시간 동안 1㎕; New England Biolabs, Ipswich, MA)로 처리하여 결찰 백그라운드를 제거하였고, 중간 PCR 생성물은 오버랩 PCR 이전에 겔 정제하였다(Zymoclean; Zymo Research, Orange, CA). 모든 프라이머 서열은 [Supplementary Experimental Protocol 1 online]으로부터 입수 가능하다.
Rec
ZF
기질의 구조
각각의 기질 플라스미드는 각각 특정한 RecZF 부위(예를 들어, G20T-GFP-5' 및 GFP-G20T-3')를 코딩하는 프라이머를 사용하여 GFPUV 유전자에 측접하는 두개의 RecZF 재조합 부위로 구성되는 재조합 카세트(예를 들어, G20T-G-G20T)를 함유하였다. PCR 생성물(XbaI, HindIII)은 pBSS, 다양한 pBluescriptII SK(-)(pB; Stratagene, La Jolla, CA)로 클로닝하였고, 이때, 1.2 kb SS 스터퍼(80)가 SacI 및 XbaI 제한 효소 부위 사이에 삽입된다.
Rec
ZF
유전자의 구조
Tn3 리졸바제 촉매 도메인은 플라스미드 pWL625(ATCC, Manassas, VA)으로부터 2개의 단편: N-말단(프라이머 Tn3Cat6-Prim1 및 Tn3-resba102Y124Q 사용) 및 C-말단(프라이머 Tn3-resfo102Y124Q-2 및 Tn3Cat6-Prim2 사용)으로 PCR 증폭하였다. 이 단편은 징크 핑거 단백질 G(프라이머 Tn3Cat8-2-Prim1 및 Tn3Cat8-2-Prim2를 사용하여 pRTBV2-HS2#11로부터 증폭함)를 코딩하는 추가 단편과 함께 융합하여 오버랩 PCR하였다. 완성된 Tn3G 유전자는 SacI 및 XbaI를 이용하여 소화시켰고, 유사하게 소화된 pBSS-G20T-G-G20T로 결찰시켰다. 분해 분석법에 의해 집단을 스크리닝한 후, 과활성 단일 클론인 Tn3Ch15G를 추가 작업을 위해 선별하였다. Arnold 및 동료들(38)에 의해 특성화된 과활성 돌연변이 D102Y 및 E124Q 외에도, Tn3Ch15G는 또한 신규 돌연변이 S70G를 함유하였다.
Gin 인버타제 촉매 도메인은 박테리오파지 Mu(ATCC)의 게놈으로부터 2개의 단편: N-말단(프라이머 ResGin-Cat-Fo1-Prim1 및 GinbaH106Y 사용) 및 C-말단(프라이머 GinfoH106Y 및 ResGin-Cat-Prim2 사용)으로 PCR 증폭하였다. 이 단편은 징크 핑거 단백질 G(프라이머 Tn3Cat8-2-Prim1 및 Tn3Cat8-2-Prim2를 사용하여 pRTBV2-HS2#11로부터 증폭함)를 코딩하는 추가 단편과 함께 오버랩 PCR에 의해 융합하였다. 완성된 GinG 유전자는 SacI 및 XbaI를 이용하여 소화시켰고, 유사하게 소화된 pBSS-G20T-G-G20T에 결찰시켰다. 역위 분석법에 의해 집단을 스크리닝한 후, 추가 작업을 위해 과활성 단일 클론인 GinG를 선별하였다. GinG는 Klippel 및 동료들(37)에 의해 특성화된 과활성 돌연변이 H106Y를 함유하였다.
Hin 인버타제 촉매 도메인은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)(ATCC)의 게놈으로부터 3개의 단편: N-말단(프라이머 ResHin-Cat-Fo1-Prim1 및 HinSac1-Prim2 사용), 중간부(프라이머 HinSacI-Prim1 및 HinbaH107Y 사용) 및 C-말단(프라이머 HinfoH107Y 및 ResHin-Cat-Prim2 사용)으로 PCR 증폭하였다. 이들 단편은 징크 핑거 단백질 G(프라이머 Tn3Cat8-2-Prim1 및 Tn3Cat8-2-Prim2를 사용하여 pRTVV2-HS2#11로부터 증폭함)를 코딩하는 추가 단편과 함께 오버랩 PCR에 의해 융합하였다. 완성된 HinG 유전자는 SacI 및 XbaI를 이용하여 소화시켰고, 유사하게 소화된 pBSS-G20T-G-G20T에 결찰되었다. 역위 분석법에 의해 집단을 스크리닝한 후, 추가 작업을 위해 과활성 단일 클론인 HinG를 선별하였다. GinG은 Merickel 및 동료들(45)에 의해 특성화된 과활성 돌연변이 H107Y를 함유하였다.
진화의 각 단계에서 선택된 촉매 도메인은 프라이머 pUC18-Prim2 및 ResCat-Prim2에 의해 PCR 증폭하였고, PCR에 의해 pUC18-Prim1 및 pUC18-Prim2의 존재 하에서 징크 핑거 단백질 G(프라이머 RecZF-Prim 1 및 pUC18-Prim 1에 의해 증폭함)의 에러 없는 카피에 융합하였다. 이러한 신규 RecZF 유전자 풀은 SacI 및 XbaI를 사용하여 소화시켰고, 다음 선별 단계를 위해 유사하게 소화된 pBSS-G20G-G-G20T에 결찰시켰다.
삼중절 RecZF(GinL7C7H1)는 GinL7C7 촉매 도메인 및 H1 징크 핑거 단백질을 융합함으로써 구성하였다. GinL7C7 촉매 도메인은 프라이머 pUC18-Prim2 및 ResCat-Prim2를 사용하여 분해 생성물(pB-G20(GL/TR)-GinL7C7)로부터 PCR 증폭하였다. 삼중절 징크 핑거 단백질 H1은 프라이머 ResZF-Prim1 및 Res3ZF-Prim2를 사용하여 pMal-HLTR3-HS1#4로부터 PCR 증폭하였다. 이러한 두 단편은 pUC18-Prim2 및 Res3ZF-Prim2의 존재 하에서 PCR에 의해 융합하였고, SacI 및 XbaI를 사용하여 소화시켰고, 유사하게 소화된 기질 벡터에 결찰시켰다. P2 징크 핑거 단백질이 pMal-PBS-(s)HS2-J2(프라이머 Res 2ZF-Prim1 및 Res3ZF-Prim2를 사용)로부터 PCR 증폭하였다면, GinL7C7 P2의 구조는 동일한 방식으로 발생하였다. 인간 세포에서 형질 도입 및 발현을 위해 GinL7C7H1 및 GinL7C7P2를 클로닝하는 경우, 프라이머 HBS-KOX-GinL7C7-Prim1 및 Res3ZF-SEX-Prim2를 사용하는 융합 PCR을 수행하였다. 얻은 단편은 BG1II 및 EcoRI를 사용하여 소화시켰고, pBabe-퓨로마이신(51) 내 BamHI 및 ECoRI 사이에 결찰시켜 pBP-GinL7C7H1 및 pBP-GinL7C7P2를 생성하였다.
재조합 분석법
기질 플라스미드 상 lac 프로모터 뒤에 결찰된 RecZF를 이. 콜라이 세포에 전기 영동하였다. 고체 및 액체 배지 상에서, 이들 세포가 37℃(IPTG의 부재)에서 밤새도록 성장되게 두었다. 다음 날 (단일 집단로부터 또는 미니프렙(QIAGEN)에 의해) 단리된 플라스미드를 사용하여 RecZF 기능을 특성화하였다. RecZF에 의해 촉진된 재조합 사건을 검출하기 위해, 본 발명자들은 분해, 역위 및 통합을 위한 PCR 분석법을 개발하였다(도 12c-f). 각 경우에서, 생성물 정보는 아가로스 겔 상에 나타나는 것과 같이 특이한 밴드의 존재와 연관되었다. 분해 분석법(도 12c; 프라이머 pUC18-Prim1 및 pUC18-Prim2)은 각각의 상대적인 존재에 비례하여 기질(1814 bp) 및 생성물(1039 bp)로부터 플라스미드 단편을 증폭하였다. 역위(도 12d; 프라이머 pUC18-Prim2 및 I-GFP-Mid-Prim2) 및 통합(도 12e; 프라이머 pUC18-Prim1 및 pACYC184-Prim3)은 단일 밴드(각각 1263 bp 및 370 bp)의 존재에 의해 증명되었다. 각 경우에서, 생성물 플라스미드만이 상보성 프라이머 결합 부위(PBS)를 함유하였다. 따라서, 역위 및 통합 분석법은 매우 민감성이었으나, 반응의 정도에 관한 정보는 거의 제공하지 않았다. 분해 및 역위 시스템이 GFPUV 영역의 촉진을 보고하는 반면, RecZF 촉진된 통합 반응의 검출은 제2 비상동성 플라스미드를 요구하였다. 이러한 목적을 위해, pB-G20T-G-G20T 및 pACYC184(New England Biolabs)는 ZbaI 및 HindIII를 사용하여 모두 소화시켰고, 재조합 카세트 G20T-G-G20T는 pACYC184에 결찰되어 pA-G20T-G-G20T를 발생시켰다. 이 구조는 분해 생성물인 pB-20T-Tn3Ch15g로 동시 형질변환시켰고, 카르베니실린 및 클로람페니콜 선별 하 37℃에서 밤새도록 동시 유지하였고, 미니프렙에 의해 정제하였고, BglII를 사용하여 소화시켰고, CIP로 처리하였고, 이. 콜라이로 다시 형질변환시켰다. 클로람페니콜 선별 배지 상에서 모두 성장한 집단은 새로운 분해 생성물인 pA-20T를 함유하였다. pB-20T-Tn3Ch15는 pA-20T로 동시 형질변환시켰고, 두개의 친화성 플라스미드는 카르베니실린 및 클로람페니콜 선별 하에서 동시 유지하였다. 통합성 생성물은 각 플라스미드 (pUC18-Prim1 내지 pBluescript 및 pACYC184-Prim3 내지 pACYC184)에 대하 어닐링된 프라이머가 서로 보완할 수 있었던 경우에 검출되었다. 이 반응에 대한 대조군은, 도 14의 레인 3b에 도시한 바와 같이, 변형되지 않은 pACYC184(임의의 가능한 재조합 부위가 결여됨)으로 동시 형질전화되었다. 모든 PCR 분석법은 30 ng의 플라스미드 DNA 및 프로그램(94℃에서 5분의 1 순환; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 90초의 30순환; 및 72℃에서 6분의 최종 순환)을 사용하여 수행하였다.
방향성 진화(directed evolution)
RecZF 돌연변이체의 라이브러리는 Zaccolo 및 동료들(81)의 방법에 의해 에러 프론 PCR에 의해 생성하였다. dNTP 유사체, dPTP (12.5 mM) 및 8-옥소-dGTP(12.5 mM)의 존재하에서 프라이머 pUC18-Prim2 및 ResCat-Prim2를 사용하여 수행된 과활성 Hin, Gin, 및 Tn3 촉매 도메인의 증폭은 무작위로 위치된 뉴클레오티드 유사체를 갖는 주형을 발생시켰다. 후속 오버랩 PCR(프라이머 pUC18-Prim2 및 Res2ZF-Prim2 사용)을 각 촉매 도메인(평균 3.2개의 아미노산 치환 함유)을 징크 핑거 단백질 G의 에러 없는 카피에 융합하였다(이전에 기술한 방식으로). 이러한 RecZF 라이브러리는 후속적으로 SacI 및 XbaI를 사용하여 소화시켰고, 유사하게 소화된 pBSS-G20G-G-G20T에 결찰시켰고, 기능 선별의 제1 단계를 위해, 플라스미드를 이. 콜라이 세포에 전기영동하였고(결찰 당 ~108 변형체), 액체 배양액에서 37℃에서 밤새도록 성장하게 두었고, 미니프렙에 의해 단리하였다. 이 반응 응집물은 선별을 위한 주형으로서 사용되었고, PCR(프라이머 G20S3 및 pUC18-Prim2)은 100-400 ng의 플라스미드 DNA 및 프로그램(94℃에서 5분의 1순환; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 90초의 30순환; 및 72℃에서 7분의 최종 순환)을 사용하여 수행하였다. 선별의 세 단계 후, 각각의 풀에 남아 있는 잔여 돌연변이체는 Stemmer(49)에 기재된 PCR 셔플링 방법을 사용하여 재조합하였다. 몇번의 추가 선별 단계 후, 본 발명자들은 각 촉매 도메인으로부터 특히 과활성인 클론을 분리하고자 하였다. 동시에, 50-200개의 집단은 분해 활성을 위해 스크리닝하였다. 각 풀 내 10-20개의 가장 활성인 RecZF를 PCR 증폭하였고(프라이머 pUC18-Prim1 및 pUC18-Prim2 사용), 겔 정제하였고, 분해 분석을 위해 pBSS-G20G-G-G20T로 클로닝하였다. 이 방법에서 발견된 8개의 가장 활성인 Hin, Gin 및 Tn3 돌연변이체의 서열이 전체적으로 도 2 c 및 d에 나타낸다.
기질 내성 어세이(substrate tolerance assay)
기질 라이브러리, G(15T/5N), G(11T/5N/4T), G(15G/5N), 및 G(11G/5N/4G)은 각각 무작위화된 3'스페이서의 구역(GFP-G(15T/5N)-3', GFP-G(11T/5N/4T)-3', GFP-G(15G/5N)-3', 및 GFP-G(11G/5N/4G)-3')에 있는 프라이머를 이용하여 생성되었다. 각 라이브러리는 기질 G20G-G-G20T 및 G20T-G-G20G의 유도체였다. G15T/5N의 경우, 프라이머 G20G-GFP-5' 및 GFP-G15T/5N-3'로 한 증폭은 무작위화된 20T의 Z말단상의 무작위된 5 염기쌍의 기질 풀을 생성하였다. 이전에 기술된 방법으로 수행된 클로닝은 가능 서열의 수를 훨씬 많이 초과하는 평균 분자 수(~105)의 라이브러리를 산출하였다. 서열 무작위화(randomization)는 pUC18 Prim1를 이용한 응집 개체군 서열화에 의해 확인되었다. GinL7G7G는 각 기질 라이브러리내로 연결되고 형질전환된 E.coli를 선택 액체 배지(5μL 카베니실린), 2mL SOC 배지, 3mL SB 배지에서 밤새동안 37℃에서 배양하였다. 응집 배양액내 기질 및 생성물 플라스미드를 미니프렙(miniprep)으로 분리하였다. GFPUV유전자(I-GFP-Mid-Prim1)내의 1개의 프라이머 및 3'재조합 부위(pUC18-Prim1) 외부의 1개의 프라이머로 수행된, 정제 플라스미드를 수반한 역위 PCR는 기질 라이브러리의 기능적 요소만을 함유하는 생성물 밴드를 생성하였다. 이 혼합물을 연속적으로 서열화하고, 응집 크로마토그램(chromatogram)의 피크는 이 개체군의 뉴클레오티드 표본과 비례하는 것으로 추정되었다. PCR 기법은 무작위화된 스페이서 서열의 더 연장된 부분에 있는 라이브러리의 사용이 배제된 역위 능력 서열(inversion competent sequence)을 선택하기 위해 사용되었다. 중심 염기쌍의 무작위화가 응집 크로마토그램의 사용에 필수적인 부위 특이 정도를 절충한다는 점 또한 주목할만하다.(데이타 보이지 않음)
Rec
ZF
부위 특이적 유전자 재조합
EGFP유전자(Clontech)를 RecZF 부위(B-H120G-SII-EGFP-5' 및 EGFP-Z-H120T-H-3')를 함유하는 프라이머로 PCR 증폭시키고, BamHI 및 HindIII로 절단하고, pcDNA5/FRT (Invitrogen, 캐나다, 칼즈배드)의 bgIII 및 HindIII사이로 연결하였다. pcDNA 3.1/Hygro(Invitrogen)의 CMV 프로모터를 프로모터 SacII-CMV-5' 및 CMV-SacII-3'로 증폭하고, SacII로 절단하고, EGFP 기질 플라스미드내의 SacII 자리에 연결하고, 방향을 스크리닝하였다. CMV-EGFP 기질 플라스미드와 Flp 발현 플라스미드(pOG44, Invitrogen)의 공혈질감염은 FIp-InTM 293 세포계(Invitrogen)내에 존재하는 단일 FLP 재조합 표적(FRT) 부위내로 부위 특이적 통합이 이루어졌다. 이 동질 유전자형, 하이그로마이신 내성 개체군으로부터 얻은 단일 콜로니를 추출, FACS로 특정하였으며, 모든 연속 실험에서 기질 세포계(SubC)로서 사용하였다. 세포를 10% FBS 및 항생제를 함유하는 DMEM내에 유지하였다. 조직 배양액 배지 및 시약은 Gibco/BRL(Invitrogen)이었다.
pBP-GinL7C7H1 및 pBP-GinL7C7P2를 제조사의 지시서에 따라 Lipofectamine Plus(Invitrogen)를 이용하여 293 패키징 세포(12)내로 형질감염시켰다. 생성물 레트로바이러스성 입자가 2 x 105개의 SubC 세포를 감염시키는데 사용되었다. 감염 48시간 이후, 세포를 2ng/mL 푸로마이신에 노출시켰다. 이 선택 배지에서, 비감염된 세포는 48시간이내에 죽었고, 형질도입된 개체군은 9일이후 컨플루언시(confluency)로 성장하였다. 푸로마이신 내성 개체군을 유세포분석((FACSCalibur 이중 레이저 유세포분석기 이용) 또는 분류(EGFP 고 개체군 및 저 개체군에 대한 FACS Vantage DiVa 이용)을 하였다. 다른 경우에서, 유전 DNA를 QIAamp DNA 미니 키트(QIAGEN)를 이용하여 분리하고, 프라이머 pcDNA-5'CMV-Prim1 및 PrimSeq2로 PCR증폭하여 분석용 어세이를 하였다. 어세이는 세가지 분리 실험에서 3배로 실시하였다. 분류된 샘플 및 응집 세포 개체군의 유전 PCF를 각각 400ng 및 100ng의 유전 DNA를 이용하여 수행하였고, 94℃에서 5분 1주기; 94℃에서 30초, 55.7℃에서 30초, 72℃에서 30초의 35주기, 및 72℃에서 7분의 최종 주기의 프로그램을 수행하였다.
참고문헌
다음의 참고문헌은 구체적으로는 실시예 1에 적용가능하며, 여기 참고로서 포함된다; 이들 참고문헌은 이들에 할당된 참고 번호에 의해 실시예1에 참고된다.
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본 발명의 장점
본 발명은 부위 특이적 유전자 재조합을 수행하기에 적합한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조성물 및 방법은 유해 유전자를 제거하고 정상 기능을 제공하는 유전자로 대체하는 유전자 치료에 사용될 수 있다. 이들 조성물 및 방법은 이의 활동에 있어서 다방면에 사용가능하며 매우 특이적이며, 의도하지 않은 재조합 사고를 최소화한다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법은 유전 구조 및 기능 연구에 대한 추가 도구를 제공할 뿐만 아니라, 내인성 유전자에 대한 SSRs의 적용을 일반적으로 억제하는, 이의 천연 기질에 존재하는 ~28bp 재조합 자리에 대해 널리 이용가능한 SSRs의 제한적인 선택성을 극복하기 위한 방법을 제공한다.
수치 범위와 관련하여, 본문의 다른 지시가 없는 한 본 발명은 상한선 및 하한선의 단위의 10번째 이상에 대한 하한선 사이의 각 매개 수치를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 언급한 범위로부터 특별히 배제되는 경우가 아닌한, 상기 범위의 상한선 및 하한선 모두, 또는 둘중 하나를 포함하는 범위 및 다른 임의의 언급된 매개 수치를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 여기 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어의 의미는 본 발명이 속한 당해 분야의 기술자에게 일반적으로 이해된다. 또한 당해 기술 분야의 통상적인 기술자는 여기 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질을 본 발명을 실시하거나 시험하기 위해 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 여기 개시된 문헌 및 특허 공보는 본 출원의 출원일 전에 개시하기 위한 목적으로만 제공된다. 본 발명이 종래 발명의 이러한 문헌들에 의해 앞서는 것이 부여되는 것이 아닌, 승인으로서 해석되지는 않는다. 추가적으로 제공된 문헌의 날짜는 따로 확인이 필요할 수 있는, 실제 개시일과 다를 수 있다.
모든 공개된 특허공보, 특허 출원, 학술 참고문헌 뿐만 아니라 공개된 문서에 포함된 문헌들을 포함하는 모든 문헌들은 이의 전체 내용이 여기 참고로서 포함된다. 그러나, 참고로서 여기 포함된 임의의 문헌과 관련하여, 출원인은 이 출원의 출원일 이후, 개시된 임의의 어떠한 정보가 종래 기술이 되는 것을 허용하지 않는다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형은 복수 형을 포함한다. 예를 들어, 본문에 다른 지시가 없는 한, 용어 "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "본(상기)"는 복수 관계를 포함한다. 또한, 일련의 성분 이전(이후)에 용어 "이상"은 일련의 모든 원소를 언급하는 것으로 이해된다. 여기 예시적으로 기술된 발명은 여기 구체적으로 기술되지 않은, 임의의 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들의 부재에서도 충분히 실시될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는"등은 제한없이 확장적으로 이해될 것이다. 또한, 여기 사용된 용어 및 표현들은 제한이 아니라 설명의 용어로서 사용되며, 향후 이의 특정 부분 또는 기술되고 보여지는 대응어를 제외한 이러한 용어 및 표현의 사용에의 의도는 없으며, 다양한 변이는 청구되는 발명의 범주내에서 가능하다는 것이 이해된다. 그러므로, 본 발명이 바람직한 구체예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 기술되어 있을지라도, 여기 기술된 발명의 변형 및 변이는 당해 분야의 기술자에 의해 자주 사용될 수 있으며, 이러한 변형 및 변이는 여기 기술된 본 발명의 범주내인 것으로 사료된다. 본 발명은 여기 일반적이며 폭넓게 기술되어 있다. 일반적인 문헌의 범주내 일치하는 보다 좁은 종(species) 및 아속(subgeneric) 그룹 각각은 또한 이들 발명의 일부를 형성한다. 잘려진 물질이 구체적으로 거기 존재하는지 여부와 무관하게, 이것은 단지 속(genus)으로부터 임의의 특정 물질을 제거하는 부정적인 제한 또는 각 발명의 속의 설명을 포함한다. 또한, 발명의 특징 또는 양태가 마퀴시 그룹의 표현으로 기술된 경우, 당해 분야에서 교시되는 것들은 또한 본 발명이 마퀴시 그룹의 임의의 개별적인 요소 또는 요소들의 아군(subgroup)의 표현으로 기술되는 것을 이해할 것이다. 또한 상기 설명은 예시적인 것일 뿐 제한적인 의도는 아닌 것으로 이해된다. 상기 설명에서 재검토되는 많은 구체예들은 당해 분야의 기술자들에게 자명할 것이다. 그러므로, 본 발명의 범주는 상기 설명에 관련하여 결정되지 않고, 대신 이러한 청구항에서 포함되는 것과 동일한 전체 범주내에 따라 첨부된 청구항과 관련하여 결정해야 한다. 당해 분야의 기술자들은 일반적인 실험만을 이용하여 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 많은 실험을 규명할 수 있거나 확인할 것이다. 이러한 대응물은 다음의 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
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<220>
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
<400> 148
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<212> PRT
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<400> 153
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<400> 154
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<400> 155
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
<400> 160
Thr Ser Gly Asn Leu Val Arg
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<220>
<223> Synthetic construct
<400> 162
Asp Cys Arg Asp Leu Ala Arg
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<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic construct
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<212> PRT
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<400> 164
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 581
Ser Glu Asp Asn Leu Ile Ser
1 5
<210> 582
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 582
Arg Glu Asp Thr Leu Ile Ser
1 5
<210> 583
<211> 7
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 583
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<223> Synthetic construct
<400> 584
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> Synthetic construct
<400> 620
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 621
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 622
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 623
Ser Glu Asp Ala Leu Ile Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 624
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 625
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<210> 626
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 626
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
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<210> 627
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 627
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 628
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 628
Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gln
1 5 10
<210> 629
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 629
Gln Asn Lys Lys Gly Gly Ser Gly Asp Gly Lys Lys Lys Gln His Ile
1 5 10 15
<210> 630
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 630
Thr Gly Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 631
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 631
Ala Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 632
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 632
tccaaaacca tggtttacag 20
<210> 633
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 633
tccaaaacca taatatttcg 20
<210> 634
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 634
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<210> 635
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 635
gcagtggcg 9
<210> 636
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 636
Gly Xaa Gly Gly Xaa Gly
1 5
<210> 637
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 637
gnngnn 6
<210> 638
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 638
nnnnnn 6
<210> 639
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 639
tgataattta taatatttcg 20
<210> 640
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 640
tgataattta taaattatca 20
<210> 641
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 641
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1 5 10 15
Thr Thr Cys Gly
20
<210> 642
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 642
gataatttat aatatttc 18
<210> 643
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 643
ctgataattt ataatatttc ga 22
<210> 644
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 644
tgataatttt caatatttcg 20
<210> 645
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 645
tgataactta taatatttcg 20
<210> 646
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 646
tgatacttta taatatttcg 20
<210> 647
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 647
tgatcattta taatatttcg 20
<210> 648
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 648
tgacaattta taatatttcg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 649
tgataattta tggtttacag 20
<210> 650
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 650
tccaaaacca taaattatca 20
<210> 651
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 651
ctgtaaacca taatatttcg 20
<210> 652
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 652
gaggagtgat aatttataat atttcg 26
<210> 653
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 654
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
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<223> Synthetic construct
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
<400> 659
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 660
Arg Gly Gly Glu Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
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<223> Synthetic construct
<400> 662
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 663
Arg Gly Gly Lys Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 664
Arg Gly Gly Ser Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 665
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 666
Thr Gly Gly Thr Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 667
Thr Gly Gly Asp Leu Gln Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 668
Thr Gly Gly Glu Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 669
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1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 670
Thr Gly Gly His Leu Gln Ala
1 5
<210> 671
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 671
Thr Gly Gly Lys Leu Gln Ala
1 5
<210> 672
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 672
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1 5
<210> 673
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 673
Thr Gly Gly Ala Leu Gln Ala
1 5
<210> 674
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 674
Ser Gly Gly Thr Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 675
Ser Gly Gly Asp Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 676
Ser Gly Gly Glu Leu Gln Ala
1 5
<210> 677
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 677
Ser Gly Gly Asn Leu Gln Ala
1 5
<210> 678
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 678
Ser Gly Gly His Leu Gln Ala
1 5
<210> 679
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 679
Ser Gly Gly Lys Leu Gln Ala
1 5
<210> 680
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 680
Ser Gly Gly Ser Leu Gln Ala
1 5
<210> 681
<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 681
Ser Gly Gly Ala Leu Gln Ala
1 5
<210> 682
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 682
Asp Gly Gly Thr Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 683
Asp Gly Gly Asp Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
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<400> 684
Asp Gly Gly Glu Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
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Glu Gly Gly Asp Leu Gln Ala
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Glu Gly Gly Glu Leu Gln Ala
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Glu Gly Gly Asn Leu Gln Ala
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Glu Gly Gly His Leu Gln Ala
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Glu Gly Gly Lys Leu Gln Ala
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Glu Gly Gly Ser Leu Gln Ala
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<211> 7
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Glu Gly Gly Ala Leu Gln Ala
1 5
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<212> PRT
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Gln Gly Gly Thr Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
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<400> 699
Gln Gly Gly Asp Leu Gln Ala
1 5
<210> 700
<211> 7
<212> PRT
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<400> 700
Gln Gly Gly Glu Leu Gln Ala
1 5
<210> 701
<211> 7
<212> PRT
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<400> 701
Gln Gly Gly Asn Leu Gln Ala
1 5
<210> 702
<211> 7
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<400> 702
Gln Gly Gly His Leu Gln Ala
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<400> 703
Gln Gly Gly Lys Leu Gln Ala
1 5
<210> 704
<211> 7
<212> PRT
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<400> 704
Gln Gly Gly Ser Leu Gln Ala
1 5
<210> 705
<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<400> 705
Gln Gly Gly Ala Leu Gln Ala
1 5
<210> 706
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 706
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Gly Pro
1 5 10
Claims (134)
- 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 작동적으로 연결된 세린 리컴비나제를 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질로서, 상기 키메라 리컴비나제 단백질은 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인을 통해 특이적으로 결합된 DNA 부위에서 부위 특이적 재조합을 촉진하고, 상기 세린 리컴비나제는 키메라 단백질에서 효과적으로 재조합을 촉매하도록 선택되거나 또는 진화된 것인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 세린 리컴비나제 도메인은 일반적인 가닥 교환 기전을 촉진하는 촉매성 세린 친핵체를 갖는 리컴비나제 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 세린 리컴비나제는 하기 (a) 및 (b)로 구성된 군으로부터 선택된 키메라 리컴비나제 단백질:(a) Tn3(EcoTn3라고도 함); Hin(StyHin이라고도 함); Gin(MuGin이라고도 함); Sin; Beta; Pin; Min; Din; Cin; EcoTn21; SfaTn917; BmeTn5083; Bme53; Cpe; SauSK1; SauSK41; SauTn552; Ran; Aac; Lla; pMER05; Mlo92; Mlo90; Rrh; Pje; Req; PpsTn5501; Pae; Xan; ISXc5; Spy; RhizY4cG; SarpNL1; SsolSC1904a; SsolSC1904b; SsoISC1913; Aam606; MjaM0014; Pab; HpylS607; MtulS_Y349; MtuRv2792c; MtuRv2979c; MtuRv3828c; MtuRv0921; MceRv0921; TnpX; TndX; WwK; 락토코커스 파지 TP901-1 세린 리컴비나제; 에스. 피오제네스(S. pyogenes) 파지 φ 370.1 세린 리컴비나제; 에스. 피오제네스 파지 φFC1 세린 리컴비나제; 리스테리아(Listeria) 파지 A118 세린 리컴비나제; S. coelicolor chromosome SC3C8.24 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러(S. coelicolor) 염색체 SC2E1.37 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러(S. coelicolor) 염색체 SCD78.04c 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SC8F4.15c 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCD12A.23 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCH10.38c 세린 리컴비나제; 에스. 코엘리컬러 염색체 SCC88.14 세린 리컴비나제; 스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지 φC31 세린 리컴비나제; 스트렙토마이세스 파지 R4 세린 리컴비나제; 바실러스(Bacillus) 파지 φ105 세린 리컴비나제; 바실러스 파지 SPBc2 세린 리컴비나제; 바실러스 프로파지 SKIN 세린 리컴비나제; 에스. 아우레우스(S. aureus) ccrA 세린 리컴비나제; 에스. 아우레우스 ccrB 세린 리컴비나제; 엠. 튜버큘로시스 파지(M. tuberculosis) Bxb1 세린 리컴비나제; 엠. 튜버큘로시스 프로파지 φRV1 세린 리컴비나제; YBCK_ECOLI; Y4bA; Bja; Spn; Cac 1956; 및 Cac 1954; 및(b) (a)의 세린 리컴비나제의 뮤테인.
- 제3항에 있어서, 세린 리컴비나제는 Gin, Hin, Tn3, Sin, Beta, Pin. Min, Din 및 Cin, 및 Gin의 뮤테인, Hin의 뮤테인, Sin의 뮤테인, Beta의 뮤테인, Pin의 뮤테인, Min의 뮤테인, Din의 뮤테인, Cin의 뮤테인, Tn3의 뮤테인으로 구성된 군으로부터 선택된 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 헥사뉴클레오티드에 결합하는 이중절(bidactyl) 징크 핑거 결합 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 Tn3GAGGAG이고, 6 bp 서열 GAGGAG(서열 번호 1)에 우선적으로 결합하는 이중절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 링커를 통해 융합된 Tn3 유래 도메인을 갖는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 HinGAGGAG이고, 6 bp 서열 GAGGAG(서열 번호 1)에 우선적으로 결합하는 이중절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 링커를 통해 융합된 Hin 유래 도메인을 갖는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 GinGAGGAG이고, 6 bp 서열 GAGGAG(서열 번호 1)에 우선적으로 결합하는 이중절 징크 핑거 뉴클레오티드에 링커를 통해 융합된 Gin 유래 도메인을 갖는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 Tn3Ch15G이고, Tn3에서 유도된 돌연변이된 세린 리컴비나제를 갖는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 GinL7C7H1이고, Gin에서 유도된 돌연변이된 세린 리컴비나제를 갖는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 GinL7C7P2이고, Gin에서 유도된 돌연변이된 세린 리컴비나제를 갖는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 하기 돌연변이를 세린 리컴비나제에 도입한 키메라 리컴비나제 단백질: (1) Tn3 세린 리컴비나제 촉매 도메인에 G70S, D102Y 또는 E124Q; (2) Hin 세린 리컴비나제 촉매 도메인에 H107Y; (3) Gin 세린 리컴비나제 촉매 도메인에 M70V, T96A 또는 H106Y; 또는 (4) Hin 및 Gin의 상응하는 상동성 잔기의 돌연변이와 함께, Tn3 세린 리컴비나제 촉매 도메인에 I12V, D13G, K65R, M73V, I80M, V108A, K53E 및 K151M.
- 제1항에 있어서, 세린 리컴비나제는 하기의 모든 돌연변이를 포함하는 Gin 도메인인 키메라 리컴비나제: D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V, Y109H, M114V 및 K148M.
- 제1항에 있어서, 세린 리컴비나제는 하기의 모든 돌연변이를 포함하는 Gin 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질: D12G, N14S, N20D, K50E, M70V, I94V 및 M114V.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 9 염기쌍에 결합하는 삼중절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 12 염기쌍에 결합하는 4절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 15 염기쌍에 결합하는 5절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 18 염기쌍에 결합하는 6절 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제15항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 9 bp 서열GGAGGGGTG(서열 번호 3)에 결합하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제15항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 9 bp 서열 GCAGTGGCG(서열 번호 4)에 결합하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 5 내지 서열 번호 74로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 ANN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제21항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 44 내지 서열 번호 53으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 ANN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 75 내지 서열 번호 131로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 AGC의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 뉴클레오티드 단백질.
- 제23항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 75 내지 서열 번호 84로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 AGC의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 132 내지 서열 번호 156으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 CNN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 157 내지 서열 번호 266으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 GNN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제26항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 157 내지 서열 번호 172로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 GNN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 267 내지 서열 번호 623 및 서열 번호 653 내지 서열 번호 705로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 TNN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제28항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 서열 번호 267 내지 서열 번호 311로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 TNN의 트리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 서열을 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항에 있어서, 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인은 트리플렛(triplet) 결합 도메인 사이에 위치하는 하나 이상의 올리고펩티드 링커를 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제30항에 있어서, 올리고펩티드 링커는 TGEKP(서열 번호 624), TGGGGSGGGGTGEKP(서열 번호 625), LRQKDGGGSERP(서열 번호 626), LRQKDGERP(서열 번호 627), GGRGRGRGRQ(서열 번호 628), QNKKGGSGDGKKKQHI(서열 번호 629), TGGERP(서열 번호 630), ATGEKP(서열 번호 631) 및 GGGSGGGGEGP(서열 번호 706)로 구성된 군으로부터 선택되는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제31항에 있어서, 올리고펩티드 링커는 TGEKP(서열 번호 624)인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 1 내지 5의 보존 아미노산 치환에 의해 제1항의 키메라 리컴비나제 단백질로부터 유도된 키메라 리컴비나제 단백질로서, 여기서 보존 아미노산 치환은 각각 하기 치환으로부터 선택되고, 이때 보존 아미노산 치환에 의해 유도된 키메라 리컴비나제 단백질은 재조합에 대하여 비돌연변이된 키메라 리컴비나제와 동일한 DNA 서열 특이성을 가지고, 비돌연변이된 키메라 리컴비나제의 기질에 대한 결합 친화성의 약 80%를 넘는 기질에 대한 결합 친화성을 가지며, 비돌연변이된 키메라 리컴비나제의 Vmax의 약 80%를 넘는 Vmax를 갖는 키메라 리컴비나제 단백질: Ala/Gly 또는 Ser; Arg/Lys; Asn/Gln 또는 His; Asp/Glu; Cys/Ser; Gln/Asn; Gly/Asp; Gly/Ala 또는 Pro; His/Asn 또는 Gln; Ile/Leu 또는 Val; Leu/Ile 또는 Val; Lys/Arg 또는 Gln 또는 Glu; Met/Leu 또는 Tyr 또는 Ile; Phe/Met 또는 Leu 또는 Tyr; Ser/Thr; Thr/Ser; Trp/Tyr; Tyr/Trp 또는 Phe; Val/Ile 또는 Leu.
- 제1항에 있어서, 키메라 리컴비나제 단백질은 하나 이상의 추가 도메인을 더 포함하는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제34항에 있어서, 추가 도메인은 정제 태그, 효소 도메인, 리간드 결합 도메인 및 세포 침투 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제35항에 있어서, 추가 도메인은 효소 도메인이고, 상기 효소 도메인은 형광 발광 또는 생물 발광을 통한 검출가능한 빛 생성을 촉진하는 것인 키메라 리컴비나제 단백질.
- 제1항의 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열.
- 제37항에 있어서, DNA인 뉴클레오티드 서열.
- 제6항의 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열.
- 제39항에 있어서, DNA인 뉴클레오티드 서열.
- 제7항의 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열.
- 제41항에 있어서, DNA인 뉴클레오티드 서열.
- 제8항의 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열.
- 제43항에 있어서, DNA인 뉴클레오티드 서열.
- (a) (i) 키메라 리컴비나제 단백질이 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인을 통해 특이적으로 결합된 DNA 부위에서 부위 특이적 재조합을 촉진하도록 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인에 작동적으로 연결된 세린 리컴비나제;(ii) 키메라 리컴비나제 Tn3GAGGAG;(iii) 키메라 리컴비나제 HinGAGGAG; 및(iv) 키메라 리컴비나제 GinGAGGAG;로 구성된 군으로부터 선택된 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열; 및(b) (a)의 서열과 서열 동일성이 95% 이상인 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열로서, 단 상기 핵산 서열은 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 임의 활성 및 핵산 수준에서 발현되는 뉴클레오티드 서열의 임의 활성을 포함하여, 염기 치환이 이루어지기 전 서열의 활성을 보유하는 것인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 단리 및 정제된 뉴클레오티드 서열.
- 제45항에 있어서, DNA인 뉴클레오티드 서열.
- 제38항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
- 제47항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제40항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
- 제49항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제42항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
- 제51항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제44항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
- 제53항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제46항의 DNA 서열을 포함하는 벡터.
- 제55항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
- 제37항의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제39항의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제41항의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제43항의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제45항의 뉴클레오티드 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제47항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제49항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제51항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제53항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 제55항의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 방법으로서,(a) 스페이서에 의해 분리되어 있고, 제1항의 하나 이상의 키메라 리컴비나제 단백질이 결합하는 둘 이상의 부위를 갖는 DNA 서열을 제공하는 단계; 및(b) DNA 서열의 양 가닥이 키메라 리컴비나제가 특이적으로 결합하는 2 부위 사이에서 절단되는 부위 특이적 재조합 사건을 하나 이상의 키메라 리컴비나제가 촉진하는 조건하에서 DNA 서열과 키메라 리컴비나제를 반응시켜 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
- 제67항에 있어서, 부위 특이적 재조합 사건은 역위인 방법.
- 제67항에 있어서, 부위 특이적 재조합 사건은 통합인 방법.
- 제67항에 있어서, 부위 특이적 재조합 사건은 분해(resolution)인 방법.
- 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 방법으로서,(a) 각각 하나 이상의 제1항의 키메라 리컴비나제가 결합하는 부위를 갖는 제1 서열 및 제2 서열의 2 DNA 서열을 제공하는 단계, 및(b) 제1 서열 및 제2 서열의 양 가닥이 절단되는 부위 특이적 재조합 사건을 키메라 리컴비나제가 촉진하는 조건하에서 제1 서열 및 제2 서열과 하나 이상의 키메라 리컴비나제를 반응시켜 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
- 제71항에 있어서, 제1 및 제2 서열을 포함하여 수행된 재조합 사건은 일부 DNA가 결실 또는 부가되고, 생성물 부위가 하나 이상의 키메라 리컴비나제와의 반응에 대하여 상용성 기질이 아니도록 비보존 재조합 사건인 방법.
- 제72항에 있어서, 재조합 사건은 상용성 재조합 부위의 한쌍 또는 두쌍이 단일방향 재조합에 적합하도록 카세트 교환인 방법.
- 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 방법으로서,(a) 제1 서열 및 제2 서열의 2 DNA 서열을 제공하는 단계로서, 제1 서열 및 제2 서열 중 하나는 하나 이상의 제1항의 키메라 리컴비나제가 결합하는 부위를 가지며, 제1 서열 및 제2 서열 중 나머지는 하나 이상의 천연 발생 세린 리컴비나제가 결합하는 부위를 갖는 것인 단계; 및(b) 제1 서열 및 제2 서열의 양 가닥이 절단되는 부위 특이적 재조합 사건을 키메라 리컴비나제 및 천연 발생 세린 리컴비나제가 촉진하는 조건하에서 제1 서열 및 제2 서열과 하나 이상의 키메라 리컴비나제 및 천연 발생 세린 리컴비나제를 반응시켜 제1 서열 및 제2 서열을 포함하는 부위 특이적 재조합 사건을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
- DNA 분자에서 안정한 통합을 수행하는 방법으로서,(a) 각각의 부위가(i) 키메라 리컴비나제 하프 사이트(half-site)에 대한 최적 결합 부위와 비교하여 실질적으로 낮은 친화성에서 하나 이상의 키메라 리컴비나제가 결합하는 하나 이상의 제1항의 키메라 리컴비나제에 대한 돌연변이된 결합 부위; 및(ii) 스페이서에 의해 분리되어 있고, 하나 이상의 제1항의 키메라 리컴비나제가 특이적으로 결합하며, 최적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 결합 부위를 포함하는 재조합에 대한 2 부위를 갖는 DNA 서열을 제공하는 단계; 및(b) DNA 서열의 양 가닥이 키메라 리컴비나제가 특이적으로 결합하는 2 부위 사이에서 절단되는 부위 특이적 재조합 사건을 하나 이상의 키메라 리컴비나제가 촉진하는 조건하에서 DNA 서열과 하나 이상의 키메라 리컴비나제를 반응시켜, 통합인 부위 특이적 재조합 사건을 수행하고, 재조합에 대하여 기능성이 아닌 키메라 리컴비나제 하프 사이트에 대한 돌연변이된 결합 부위의 동종이량체가 형성되어 통합 결과가 안정한 것인 단계를 포함하는 방법.
- DNA 분자에서 재조합을 수행하는 방법으로서,(a) 하나 이상의 제1항의 제1 키메라 리컴비나제와 반응성인 재조합을 위한 제1 부위를 갖는 제1 DNA 서열을 제공하는 단계;(b) 하나 이상의 제1항의 제2 키메라 리컴비나제와 반응성인 재조합을 위한 제2 부위를 갖는 제2 DNA 서열을 제공하는 단계로서, 제1 부위 및 제2 부위는 기능적으로 오르소고날(orthogonal)인 단계; 및(c) 제1 DNA 서열과 하나 이상의 제1 키메라 리컴비나제를 반응시키고, 제2 DNA 서열과 하나 이상의 제2 키메라 리컴비나제를 반응시켜 재조합을 실시하는 단 계를 포함하는 방법.
- 제76항에 있어서, 재조합을 위한 제1 부위 또는 재조합을 위한 제2 부위에서의 통합은 카세트 교환을 수행하기 위하여, 통합을 위해 사용되지 않은 제1 부위 및 제2 부위 중 하나에서의 절단이 후속되는 것인 방법.
- 제77항에 있어서, 재조합은 역위를 일으키는 방법.
- 제77항에 있어서, 재조합은 분해를 일으키는 방법.
- 카세트 교환을 촉진하는 방법으로서,(a) (i) 제1 촉매 도메인 및 제1 징크 핑거 도메인을 포함하고 제1 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1항의 제1 키메라 리컴비나제를 발현하는 제1 플라스미드; 및(ii) 제2 촉매 도메인 및 제2 징크 핑거 도메인을 포함하고 제2 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1항의 제2 키메라 리컴비나제를 발현하는 제2 플라스미드의 2 플라스미드를 생성하는 단계로서,제1 촉매 도메인과 제2 촉매 도메인은 상이하고, 제1 징크 핑거 도메인과 제2 징크 핑거 도메인은 상이하며, 제1 및 제2 항생제 내성 유전자는 상이한 2종 항 생제에 대한 내성을 부여하는 것인 단계;(b) 2 키메라 리컴비나제에 의한 플라스미드내 절단은 배제되도록 제1항의 제1 키메라 리컴비나제 및 제1항의 제2 키메라 리컴비나제 중 하나가 각각 결합하는 비반복 동종이량체를 가지는 제1 유전자의 코딩 영역 및 제2 유전자의 코딩 영역을 측접시켜 2 카세트를 회합시키는 단계;(c) 각각의 플라스미드에 하나의 카세트를 삽입하여 카세트를 포함하는 2 플라스미드를 생성하는 단계; 및(d) 카세트를 포함하는 제1 플라스미드 및 카세트를 포함하는 제2 플라스미드로 박테리아 숙주를 공동형질감염시켜 재조합을 일으키는 단계를 포함하는 방법.
- 제80항에 있어서, 재조합은 플라스미드간 카세트 교환인 방법.
- 제80항에 있어서, 재조합은 염색체 유전자와 플라스미드 사이에서 일어나는 방법.
- 제80항에 있어서, 재조합은 도입된 DNA와 염색체 유전자 사이에서 일어나는 방법.
- 제80항에 있어서, 재조합은 카세트 교환에 의해 촉진된 절단인 방법.
- 카세트 교환을 촉진하는 방법으로서,(a) (i) 제1 촉매 도메인 및 제1 징크 핑거 도메인을 포함하고 제1 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1항의 제1 키메라 리컴비나제를 발현하는 제1 플라스미드로서, 제1 키메라 리컴비나제는 제1 유전자의 내재성 측접 서열에 결합하도록 선택되거나 돌연변이된 것인 제1 플라스미드; 및(ii) 제2 촉매 도메인 및 제2 징크 핑거 도메인을 포함하고 제2 항생제 내성 유전자를 발현하는 제1항의 제2 키메라 리컴비나제를 발현하는 제2 플라스미드로서, 제2 키메라 리컴비나제는 제2 유전자의 내재성 측접 서열에 결합하도록 선택되거나 돌연변이된 것인 제2 플라스미드의 2 플라스미드를 생성하는 단계로서, 상기 제1 촉매 도메인과 제2 촉매 도메인은 상이하고, 제1 징크 핑거 도메인과 제2 징크 핑거 도메인은 상이하며, 제1 및 제2 항생제 내성 유전자는 상이한 2종 항생제에 내성을 부여하는 것인 단계;(b) 제1 내재성 측접 영역이 측접한 제1 유전자를 포함하는 제1 카세트 및 제2 내재성 측접 영역이 측접한 제2 유전자를 포함하는 제2 카세트의 2 카세트를, 2 키메라 리컴비나제에 의한 플라스미드내 절단은 배제되도록 제1항의 제1 키메라 리컴비나제 및 제1항의 제2 키메라 리컴비나제 중 하나가 각각 결합하는 비반복 동종이량체 부위를 포함하는 각각의 2 내재성 측접 영역에 의해 회합하는 단계;(c) 각 플라스미드에 하나의 카세트를 삽입하여 카세트가 포함된 2개의 플라스미드를 생성하는 단계; 및(d) 카세트를 포함하는 제1 플라스미드 및 카세트를 포함하는 제2 플라스미드로 박테리아 숙주를 공동형질감염시켜 재조합을 일으키는 단계를 포함하는 방법.
- 제85항에 있어서, 재조합은 플라스미드간 카세트 교환인 방법.
- 제85항에 있어서, 재조합은 염색체 유전자와 플라스미드 사이에서 일어나는 것인 방법.
- 제85항에 있어서, 재조합은 도입된 DNA와 염색체 유전자 사이에서 일어나는 것인 방법.
- 제85항에 있어서, 재조합은 카세트 교환에 의해 촉진되는 절단인 방법.
- cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위를 동정하는 방법으로서,(a) 무작위화된 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 이용하여 2개의 상용성 플라스미드에 징크 핑거 결합 부위를 포함하는 단일한 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;(b) 단계 (a)에서 생성된 단일한 하프 사이트 라이브러리로 적절한 숙주를 공동형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;(c) 선별을 위한 2종 항생제를 사용하여 형질전환체를 공동 유지시키는 단계;(d) 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;(e) 적절한 숙주를 저농도에서 재형질전환시키는 단계;(f) 재형질전환된 숙주가 2종 항생제를 함유하는 배양 배지 상에서 성장하도록 하는 단계; 및(g) 단일방향 통합에 대하여 PCR을 통해 2종 항생제를 함유하는 배양 배지 상에서 성장한 콜로니를 스크리닝하여 cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위를 동정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제90항에 있어서, 숙주는 박테리아 숙주, 효모 세포 숙주, 곤충 세포 숙주 및 포유류 세포 숙주로 구성된 군으로부터 선택하는 방법.
- 제91항에 있어서, 숙주는 박테리아 숙주이고, 상기 박테리아 숙주는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)인 방법.
- 제90항에 있어서,(h) 재조합 생성물에 의하여 단독으로 발현되는 다른 리포터 유전자를 포함하는 단계; 및(i) 리포터 유전자의 활성에 대하여 스크리닝하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제90항의 방법을 통해 발견한 cis-불활성화 징크 핑거 결합 부위.
- cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 방법으로서,(a) 무작위화된 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 이용하여 2개의 상용성 플라스미드에 스페이서 서열을 포함하는 단일한 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;(b) 적절한 숙주를 단계 (a)에서 생성된 단일한 하프 사이트 라이브러리로 공동형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;(c) 선별을 위한 2종 항생제를 사용하여 형질전환체를 공동 유지시키는 단계;(d) 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;(e) 적절한 숙주를 저농도에서 재형질전환시키는 단계;(f) 재형질전환된 숙주가 2종 항생제를 함유하는 배양 배지 상에서 성장하도록 하는 단계; 및(g) 단일방향 통합에 대하여 PCR을 통해 2종 항생제를 함유하는 배양 배지 상에서 성장한 콜로니를 스크리닝하여 cis-불활성화 스페이서 서열을 동정하는 단계를 포함하는 방법.
- cis-불활성화 DNA 결합 도메인을 동정하는 방법으로서,(a) 상이한 2 DNA 결합 도메인 인식 서열, 선별 표적 서열 및 트랜스활성인자 서열을 포함하는 재조합 부위를 포함하는 표적 기질을 생성하는 단계;(b) 트랜스활성인자 서열에 완벽하게 상보성인 제1항의 고정된 키메라 리컴비나제 존재하에 상이한 DNA 결합 도메인을 갖는 제1항의 키메라 리컴비나제 라이브러리와 표적 기질을 항온처리하여 단일한 하프 사이트 라이브러리를 생성하는 단계;(c) 적절한 숙주를 단계 (b)에서 생성된 단일한 하프 사이트 라이브러리로 공동형질전환시켜 형질전환체를 생성하는 단계;(d) 선별을 위한 2종 항생제를 이용하여 형질전환체를 공동 유지시키는 단계;(e) 공동 유지된 형질전환체로부터 플라스미드를 정제하는 단계;(f) 적절한 숙주를 저농도에서 재형질전환시키는 단계;(g) 재형질전환된 숙주가 2종 항생제를 함유하는 배양 배지 상에서 성장하도록 하는 단계; 및(h) 단일방향 통합에 대하여 PCR을 통해 2종 항생제를 함유하는 배양 배지 상에서 성장한 콜로니를 스크리닝하여 cis-불활성화 DNA 결합 도메인을 동정하는 단계를 포함하는 방법.
- 현존하는 키메라 리컴비나제로부터 신규한 키메라 리컴비나제를 생성하기 위하여 기질-연결된 단백질 진화법(substrate-linked protein evolution)을 사용하는 방법으로서,(a) 돌연변이된 리컴비나제 도메인이 생성되도록 리컴비나제 돌연변이체의 라이브러리를 형성하는 단계;(b) 돌연변이되지 않은 DNA 결합 도메인에 돌연변이된 리컴비나제 도메인을 융합시켜 돌연변이된 융합 단백질의 라이브러리를 생성하는 단계;(c) 돌연변이된 융합 단백질의 라이브러리를 기능성 선별을 위한 리컴비나제 기질을 포함하는 플라스미드에 클로닝하는 단계; 및(d) 리컴비나제의 활성에 의해 변형된 플라스미드를 선별하여 활성이 있는 돌연변이된 융합 단백질을 선별하는 단계를 포함하는 방법.
- 제97항에 있어서, 리컴비나제 돌연변이체의 라이브러리를 형성하는 단계는 무작위 돌연변이화 방법을 통해 수행하는 방법.
- 제97항에 있어서, 돌연변이된 리컴비나제 도메인을 생성하기 위하여 무작위 돌연변이화 방법을 통하여 리컴비나제 돌연변이체의 라이브러리를 형성하는 단계는 에러-프론(error-prone) PCR을 통해 수행하는 방법.
- 제99항에 있어서, 에러-프론 PCR은 하나 이상의 dNTP 유사체의 존재하에 리컴비나제 도메인을 증폭하여 수행하는 방법.
- 제100항에 있어서, dNTP 유사체는 dPTP 및 8-옥소-dGTP인 방법.
- 제97항에 있어서, 돌연변이되지 않은 DNA 결합 도메인에 돌연변이된 리컴비나제 도메인을 융합시켜 돌연변이된 융합 단백질의 라이브러리를 생성하는 단계는 오버랩 PCR을 이용하여 수행하는 방법.
- 제97항에 있어서, 단계 (d)의 선별 방법은 Tn3을 사용하기 적합한 스페이서 서열 및 Gin을 사용하기 적합한 다른 스페이서 서열인 상이한 2개 스페이서 서열간의 재조합을 적용하여 하이브리드 스페이서 서열을 갖는 단일한 재조합 부위를 남긴 후, 상기 하이브리드 스페이서 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭하는 것인 방법.
- 제103항에 있어서, 하이브리드 스페이서 서열은 TCCAAAACCATAATATTTCG(서열 번호 633)인 방법.
- 제97항에 있어서, 선별 방법은 상동성 재조합의 가능성을 제거하는 것인 방법.
- 제97항에 있어서, PCR 셔플링을 이용한 다수회의 선별 이후 활성이 있는 돌연변이체의 재조합 단계를 더 포함하는 방법.
- 제106항에 있어서, PCR 셔플링은 3회의 선별 이후 수행하는 방법.
- 제97항에 있어서, 활성이 있는 돌연변이된 융합 단백질을 재클로닝하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제97항에 있어서, 선별을 통해 생성된 하나 이상의 융합 단백질을 서열분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제97항에 있어서. 기질은 게놈으로 된 것인 방법.
- 제97항에 있어서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거 뉴클레오티드 결합 도메인인 방법.
- 재조합 절단을 통해 유해 유전자를 제거하는 유전자 치료 방법으로서,(a) 발현시 게놈으로부터 유해 유전자를 특이적으로 제거하는 제1항의 부위 특이적 리컴비나제를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 게놈에 유해 유전자를 갖는 개체에게 투여하는 단계; 및(b) 부위 특이적 리컴비나제를 발현시켜 게놈으로부터 유해 유전자를 특이적으로 제거하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
- 제112항에 있어서, 유해 유전자는 악성종양 관련 종양유전자; 연접부 수포성 표피박리증과 관련된 결함 유전자; 듀센형 근이영양증과 관련된 결함 유전자; 겸상 적혈구 빈혈증, 탈라세미아 및 다른 혈색소병증으로 구성된 군에서 선택된 혈색소병증; 중증 복합 면역결핍 질환(SCID)과 관련된 결함 유전자; 고셔병과 관련된 결함 유전자; 낭성 섬유증과 관련된 결함 유전자; 헤모필리아와 관련된 결함 유전자; 및 가족성 고콜레스테롤혈증과 관련된 결함 유전자로 구성된 군으로부터 선택하는 방법.
- 유해 유전자를 재조합 절단에 의해 제거한 후 재조합 통합에 의해 교체하는 유전자 치료 방법으로서,(a) 발현시 게놈으로부터 유해 유전자를 제거하는 제1항의 부위 특이적 리컴비나제를 코딩하는 핵산을 게놈에 유해 유전자를 갖는 개체에게 투여하는 단계;(b) 부위 특이적 리컴비나제를 발현시켜 게놈으로부터 유해 유전자를 특이적 으로 제거하도록 하는 단계;(c) 유해 유전자에 대한 기능성 교체 유전자를 포함하는 핵산을 개체에게 투여하는 단계; 및(d) 부위 특이적 리컴비나제에 의해 촉진되는 재조합 통합을 통해 게놈에 기능성 교체 유전자를 삽입하는 단계를 포함하는 방법.
- 제114항에 있어서, 유해 유전자는 악성종양 관련 종양 유전자; 연접부 수포성 표피박리증과 관련된 결함 유전자; 듀센형 근이영양증과 관련된 결함 유전자; 겸상 적혈구 빈혈증, 탈라세미아 및 다른 혈색소병증으로 구성된 군에서 선택된 혈색소병증; 중증 복합 면역결핍 질환(SCID)과 관련된 결함 유전자; 고셔병과 관련된 결함 유전자; 낭성 섬유증과 관련된 결함 유전자; 헤모필리아와 관련된 결함 유전자; 및 가족성 고콜레스테롤혈증과 관련된 결함 유전자로 구성된 군으로부터 선택하는 방법.
- 유해 유전자의 구조 또는 기능을 파괴하고 개선된 기능을 갖는 유전자를 선택된 게놈 좌위에 전달하기 위하여 치료적 통합을 수행하는 유전자 치료 방법으로서,(1) 개선된 기능을 갖는 유전자를 포함하는 DNA 절편; 및 (2) 개선된 기능을 갖는 유전자를 포함하는 DNA 절편을 유해 유전자의 게놈 좌위에 통합시키도록 작용 하는 하나 이상의 제1항의 키메라 리컴비나제를 게놈에 유해 유전자를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제116항에 있어서, 천연 재조합 부위에서 작용하는 하나 이상의 천연 발생 세린 리컴비나제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
- (a) 제1항의 키메라 리컴비나제 단백질의 치료적 유효량; 및(b) 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
- (a) 제1항의 키메라 리컴비나제 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치료적 유효량; 및(b) 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
- 제119항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 DNA인 약학 조성물.
- 제119항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 유전자 치료법을 위한 전달 시스템에 도입된 것인 약학 조성물.
- 제121항에 있어서, 유전자 치료법을 위한 전달 시스템은 바이러스 시스템인 약학 조성물.
- 제121항에 있어서, 유전자 치료법을 위한 전달 시스템은 비바이러스 시스템인 약학 조성물.
- 제1항의 키메라 리컴비나제에 의해 촉진되는 재조합 작용으로 생성된 트랜스제닉 유기체.
- 제124항에 있어서, 트랜스제닉 유기체는 진핵생물인 트랜스제닉 유기체.
- 제125항에 있어서, 진핵생물은 포유류인 트랜스제닉 유기체.
- 제126항에 있어서, 트랜스제닉 포유류는 트랜스제닉 포유류가 속하는 포유류 종에 의해서 정상적으로 생성되지 않는 생성물을 생성하는 트랜스제닉 포유류.
- 제125항에 있어서, 진핵생물은 곤충인 트랜스제닉 유기체.
- 제128항에 있어서, 트랜스제닉 곤충은 곤충의 번식능 또는 질병 또는 경제적 손해를 야기하는 곤충의 능력을 줄이도록 변형된 트랜스제닉 곤충.
- 제125항에 있어서, 진핵생물은 식물인 트랜스제닉 유기체.
- 제130항에 있어서, 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물이 속하는 식물종에 의해서 정상적으로 생성되지 않는 생성물을 생성하는 트랜스제닉 식물.
- 제130항에 있어서, 트랜스제닉 식물은 개선된 성장 특성, 감소된 영양 요구성 또는 개선된 영양 함량을 보유하도록 변형된 트랜스제닉 식물.
- 제124항에 있어서, 효모인 트랜스제닉 유기체.
- 제124항에 있어서, 박테리아인 트랜스제닉 유기체.
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