KR20090012500A

KR20090012500A - 아라자임을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류양식용 사료첨가제

Info

Publication number: KR20090012500A
Application number: KR1020070076384A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 신동하; 허선연
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-07-30
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2009-02-04
Also published as: KR100887334B1

Abstract

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주가 생산하는 단백질 분해 효소인 아라자임을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제에 관한 것이다. 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제는 어류 및 갑각류에서 사료효율(FCR)이 높으며, 성장에 우수한 효과를 나타내므로, 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 면역력 향상에도 우수한 효과를 나타내므로 항생제 대체 물질로도 유용하게 이용될 수 있다.

아라자임, 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제, 어류 또는 갑각류 양식용 사료

Description

아라자임을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제{Feed additive for fish or crustacean breeding containing arazyme as effective ingredient}

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제에 관한 것으로, 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주가 생산하는 단백질 분해 효소인 아라자임을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제에 관한 것이다.

1980년대에 접어들면서 국내 연안 어종의 자원감소와 더불어 어류에 대한 소비자의 수요 증가를 충족시키기 위해서 해산 어류 양식의 필요성이 대두되기 시작하였다. 양식 산업에서의 외부 의존적인 여러 가지 변수들 중에서 어류의 체내 대사와 성장에 영향을 미치는 중요한 요인은 먹이(사료)로 보고 있으며, 이러한 사료는 양식 생산 단가의 매우 높은 비율을 차지하고 있으므로 양식 생산에 소요되는 사료비를 최소화시키는 것이 효율적인 양식을 위하여 무엇보다도 고려되어야 한다.

수산 생물을 효율적으로 양식하기 위해서는 영양, 수질 및 어병 관리의 세가지 요인을 잘 관리해야 한다. 그 중 영양과 수질관리를 철저히 할 경우에는 자연히 어병을 제어할 수 있기 때문에 각 수산 생물이 요구하는 영양과 수질관리는 양식의 성패를 좌우하는 중요한 요인이라 할 수 있다. 양식 대상어류의 안정적이고 지속적인 양식 산업 발전을 위해서는 양식 생물의 영양 및 이와 관련된 대사과정의 구명이 필요하다. 현재까지의 연구결과는 어류 성장에 관여하는 연구뿐만 아니라 대사기능을 활성화시키는 노력이 꾸준히 진행되어 왔다.

사료가 기본적으로 갖추어야 하는 조건은 첫째 대상어류의 생리적 조건을 충족시키면서 성장과 생존이 우수하여야 하고, 둘째 양식에 있어 경제적 측면에서 볼 때 사료비가 적어야 하며, 셋째 필요한 시기에 연중 쉽게 구할 수 있고 보관이나 제조가 용이하여야 한다. 그러나 양식이 산업화되고 환경의 보전과 이용이 중요시되면서 환경 친화적이며 고효율적인 사료 개발의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 사료의 효율성을 위해서 대부분의 양식 사료에서 항생제를 투여하고 있다. 수산용으로 가장 많이 사용되고 있는 항생제는 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline)이다. 옥시테트라싸이클린은 어류에 사용하는 항생제 판매량 기준으로 74%를 차지하고 있으며, 수하물 출하시 39 일간의 휴약기간을 준수하도록 휴약 기간을 정하고 있어 항생제 잔류량은 거의 검출되지 않고 있으나, 장기간 광 범위하게 사용해온 결과로 테트라싸이클린계 항생제에 대한 내성률은 80% 이상을 나타내고 있는 실정이다. 이상의 이유로 인해서 테트라싸이클린 대체 항생제를 사용하거나, 항생제 대체 물질 및 사료첨가제가 절실하게 요구되고 있는 실정이다.

국내 어류 양식에서 비용면으로 볼 경우, 해상가두리 양식이 종묘시, 사료비 비중이 높고, 감가상각비와 양성관리비, 인건비의 비중은 낮게 나타난다. 사료는 값비싼 외국 수입사료 및 사료첨가제를 사용해오다가 육성단계에서는 대부분 냉동 생사료 혹은 생사료와 분말상품사료를 혼합한 습사료(moist pellet)를 사용하고 있는 실정이다. 따라서, 어류 양식에서 일반 소비자들이 신뢰할 수 있는 항생제 대처 및 사료효율을 증대시킬 수 있는 경제적인 배합사료 및 사료첨가제가 절실히 요구되고 있는 실정이다. 이는 사료효율증대를 통한 양식농가의 경제 산업적 측면, 소비자들이 항생제에 대한 우려 없이 안심할 수 있는 사회 문화적 측면이 모두 결부되어 있다.

한편, 아라자임(arazyme)은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐만 아니라 사람의 체온인 37℃에서 가장 높은 활성을 보이며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 단백질 분해효소이다(WO 01/57222호).

이에, 본 발명자들은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 어류 및 갑각류에서 사료효율(FCR)을 증가시키며, 성장에 우수한 효과를 나타내고, 면역 력을 향상시키는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단백질 분해효소인 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 포함하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 사료첨가제 또는 상기 사료를 갑각류 또는 어류에 투여하여 어류 또는 갑각류의 면역력을 증강시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아라자임(arazyme)을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 어류 또는 양식용 사료첨가제에 포함되는 아라자임(arazyme)은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주가 생산하는 효소로서, 1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계; 2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및 3) 상등액내 포함된 상기 아라자임을 수 지를 이용하여 정제하는 단계로 제조할 수 있다. 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(WO 01/57222호).

또한, 본 발명의 아라자임은, (a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; (b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질; (c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및 (d) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질 중 어느 하나이면 바람직하다.

상기 혼성화를 엄격한 조건하에서 실시하면 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA가 선별되어 결과적으로 분리되는 단백질에는 아라자임과 기능적으로 동일한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들면, 서 열번호 2에 기재된 염기 서열과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 가진 서열을 의미한다. 또한 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 높은 상동성의 서열이라면 가능하다. 상기의 상동성 비율은 당업계의 당업자에 의해 선택된 보통의 알고리즘으로 결정될 수 있다.

상기 혼성화는 당해업계에 잘 알려진 엄격한 조건(Hames and Higgins, Eds. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, U.K.)하의 DNA-DNA 혼성화로 제공된다.

본 발명의 사료첨가제에는 아라자임(arazyme)이 0.1 ~ 20% 중량부, 지방분해효소(Lipase)가 0.001 ~ 0.01 % 중량부, 제 3 인산칼슘이 1 ~ 20% 중량부, 비타민 E가 0.01 ~ 0.1 % 중량부, 효소분말이 1 ~ 10% 중량부, 유산균이 0.1 ~ 10 % 중량부, 바실러스(Bacillus) 배양액이 0.01 ~ 10 % 중량부 및 포도당은 20 ~ 90 % 중량부로 구성되어 있는 것이 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니며, 아라자임이 유효량으로 첨가되어 있다면, 본 발명의 사료첨가제로서 가능하다.

본 명세서에 유효량이란, 어류 또는 갑각류의 체중을 증가시키거나, 사료효율(FCR), 소화율 또는 면역력을 향상시키는 양을 의미한다. 또한, 첨가에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다.

또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 어류 및 갑각류에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또은 공지의 담체, 안 정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 어류 또는 갑각류에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

본 발명의 대상이 되는 어류는 도미, 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 뱀장어, 은어, 산천어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류인 것이 바람직하며, 도미인 것이 더욱 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 갑각류는 흰다리 새우(Litopenaeus Vannamei), 보리새우(Marsupenaeus japonicus), 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon), 대하(Penaeus chinensis), 피나에우스 모르기엔시스(Penaeus morguiensis) 등을 포함하는 새우류 및 상해 게, 꽃게 등의 게류 등 인 것이 바람직하며, 흰다리 새우인 것이 더욱 바람직하며, 남미 흰다리 새우(Penaeus vannanei)인 것이 가장 바람직하나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 사료첨가제를 도미(tilapia, Oreochromis niloticus)에 첨가하면 무첨가구에 비하여 체중 및 사료효율(FCR)이 증가된다(표 3 참조).

또한, 본 발명의 사료첨가제를 첨가한 첨가구에서는 무첨가구에 비하여 소화율이 증가되었고(표 4 참조), 이는 본 발명의 사료첨가제가 사료의 전환율이 높음을 의미한다. 아울러, 첨가구의 도미 혈청에서 LZM(lysozyme) 및 SOD(Super Peroxidase)가 높아지므로(표 5), 본 발명의 사료첨가제는 어류의 생체 면역력 향 상에 유의적인 효과가 있음을 알 수 있다.

갑각류에 대한 본 발명의 사료첨가제의 효과를 알아보기 위하여, 남미 흰다리 새우(Penaeus vannanei)에 본 발명의 사료첨가제를 투여하면, 새우의 체중뿐만 아니라 사료효율(FCR)이 대조구에 비하여 유의하게 증가한다(표 7 참조).

또한, 사료첨가제를 첨가한 첨가구의 남미 흰다리 새우의 혈청 중에 ACP(Acid Phosphatase) 및 LZM(lysozyme)이 현저히 증가하며(표 8 참조), 이는 본 발명의 사료첨가제가 갑각류의 면역력 향상에 유의적인 효과가 있음을 의미한다.

본 발명의 사료첨가제를 어류에 투여하면, 상기와 같이 체중, 사료효율(FCR), 소화율 및 면역력을 증가시키며, 갑각류에 투여하면, 상기와 같이 체중, 사료효율(FCR) 및 면역력을 증가시키므로, 본 발명의 사료첨가제는 어류 및 갑각류 양식용으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 포함하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료 및 상기 사료첨가제 또는 상기 사료를 갑각류 또는 어류에 투여하여 어류 또는 갑각류의 면역력을 증강시키는 방법을 제공한다.

상기와 같이 본 발명의 사료첨가제를 어류 또는 갑각류에 투여하면, 어류 및 갑각류의 면역력을 향상시키므로, 본 발명의 사료첨가제는 어류 또는 갑각류의 면역력을 향상시켜 성장률의 증가에 영향을 미치며, 더 나아가 개체수를 증가시키는데 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 사료는 특별히 한정되는 것은 아니고, 분말사료, 고형사료, 모이 스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다.

본 발명에 있어서 사료첨가제 또는 사료의 1회 투여량은 어류 또는 갑각류 섭취를 위한 사료양의 0.05 ~ 10%인 것이 바람직하며, 0.1 ~ 5%인 것이 더욱 바람직하며, 0.1 ~ 2%인 것이 가장 바람직하며, 하루에 3회에 걸쳐 투여하는 것이 바람직하나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 사료첨가제 또는 사료 내의 아라자임의 농도는 0.1 ~ 20%인 것이 바람직하며, 1 ~ 20%인 것이 더욱 바람직하며, 10 ~ 20%인 것이 가장 바람직하다.

아라자임을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 천연 사료첨가제는 통상의 사료에 비해 비교적 낮은 가격으로 양식 어류 생산 단가에서 매우 높은 비율을 차지하는 사료에 대한 비율을 낮출 수 있으며, 면역력 향상을 통한 항생제 투여 회수 및 양을 줄여, 양식업체에서의 과도한 항생제 사용을 대체 할 수 있다.

본 발명의 아라자임을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제는 어류에서는 사료효율(FCR) 및 소화율을 증가시키며, 성장에 우수한 효과를 나타내고, 면역력을 향상시키며, 갑각류에서는 사료효율(FCR)을 증가시키고, 성장에 우수한 효과를 나타내므로, 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 면역력 향상에도 우수한 효과를 나타내므로 항생제 대체 물질로도 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 아라자임 ( arazyme )의 제조

본 발명의 유효성분인 아라자임(arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolycius) HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화 나트륨 0.1 %, 염화 칼륨 0.05 %, 염화 칼슘 0.02 %, 황산 마그네슘 0.02 %)에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. 배양액을 2 ㎛ 막여과(2 ㎛ filter, Satorius, USA)를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막여과(10 kDa Memebrane filter, Pall sept, PALL Corporation, USA)를 이용하여 농축한 후 냉동건조기를 이용하여 건조하여 사용을 하였다. 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다. 단, 아라자임 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠수 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다(WO 01/57222호). 본 발명에 이용되는 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 가진다.

< 제제예 1> 사료첨가제의 제조

본 발명자들을 상기 <실시예 1>에서 제조한 아라자임을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 사료첨가제를 제조하였다.

상기 실시예 1에서 수득한 아라자임을 포도당과 혼합을 통하여 중량을 맞추고 여기에 기타 조성물인 지방분해효소, 제 3 인산칼슘, 비타민 E, 효소 분말, 유산균, 바실러스 배양액을 하기와 같은 조성으로 넣는다. 다음으로 전체 중량이 100%가 되도록 포도당을 섞은 후, 믹서기를 이용하여 충분히 혼합을 한다.

<사료첨가제의 조성>

단백질분해효소(아라자임): 0.1 ~ 20% 중량부,

지방분해효소(Lipase): 0.001 ~ 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슘: 1 ~ 20% 중량부,

비타민 E: 0.01 ~ 0.1% 중량부,

효소 분말: 1 ~ 10% 중량부,

유산균 0.1 ~ 10% 중량부,

바실러스(Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10% 중량부, 및

포도당 20 ~ 90% 중량부.

< 실시예 2> 실험 어류 및 사료

상기 제제예 1에서 제조한 사료첨가제의 효과를 검정하기 위하여 민물 도미(tilapia)를 사용하였다. 이용된 도미의 평균체장은 6.50 ± 0.40 ㎝, 평균체중 은 8.67 ± 1.75 g이었다.

기본 사료로는 사료공장(코스프, 인천)에서 직접 가공한 것을 사용하였으며, 가공 조건은 하기 표 1과 같으며, 사료의 영양 성분 구성은 하기 표 2와 같다.

상기 제제예 1에서 제조한 사료첨가제를 상기 기본 사료에 0.1% 첨가하여 처리한 도미 그룹을 "첨가구"라 하였으며, 대조군으로서는 기본 사료만 처리한 도미 그룹을 "무첨가구"라 하였다.

어류 배합사료 가공조건

지표	수치
사료(pellet)-처리 온도	75 ℃
증기 압력	5 kg/cm²
사료 처리 시간	1 분
냉각 시간	10 ~ 15 분
사료의 직경	2.8 ㎜

배합사료 성분 분석

지표	%
조단백질	≥ 30.0
조섬유질	≤ 15.0
조회분	≤ 15.0
칼슘	0.5 ~ 1.2
총 인	≥ 0.6
리신	≥ 1.0
식염	0.2 ~ 0.8
수분	≤ 12.9

< 실험예 1> 어류의 성장 조사

제제예 1에서 제조한 사료첨가제가 어류의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 도미를 상기와 같이 첨가구 및 무첨가구로 나누어 크기가 1×1×1 m의 그물(망상; 網箱)에 도미를 사양하였다. 그물은 수심이 60 ㎝인 실외 시멘트 못에 설치하고 하나의 그물에 30 마리를 사양하는데 하나의 그물을 하나의 반복으로 간주하고 24 시간 산소를 공급하였다. 우선, 실험을 시작하기 전에 먼저 기본 사료로 10일 동안 길들이기 사양을 하였다. 실험의 주기는 56일로 하였다. 첨가구 및 무첨가구에 해당하는 사료를 물고기 체중의 4 ~ 6%의 용량으로 하여, 매일 정기적으로 3회(8:00, 11:00 및 17:00) 투여하였고, 물고기의 사료섭취상황과 일기변화상황에 따라 사료의 투여량을 조절하였다. 양식 기간에 물의 온도는 27.6 ~ 32.3℃로 조절하였고, DO>4.0 ㎎/ℓ, pH는 7.0 ~ 8.5로 유지하였다.

물고기의 중량을 측정하기 전, 실험 마감 전 1일은 사료투여를 중지하였고, 그 다음날, 전자저울로 물고기의 중량을 측정(0.01 g까지 정확하게)하여 상대 중량 증가율과 사료계수를 측정하였다(수학식 1 및 수학식 2). 그 결과, 본 발명의 사료첨가제의 투여로 인해서 어류의 체중 증가율이 무첨가구보다 7.48%가 높아짐을 확인할 수 있었고, 또한 사료효율(FCR)의 경우 5.07% 효율이 증가됨을 확인할 수 있었다(표 3).

상대 중량증가율(%) = (실험 마감시 물고기의 평균체중 - 실험 초기 물고기의 평균체중)/실험 초기 물고기의 평균체중 × 100

사료효율( FCR ) = 사료 섭취량/(실험 마감시 물고기의 총체중 - 실험 초기 물고기의 총체중 )

어류의 성장에 미치는 영향

지표	무첨가구(대조군)	첨가구
평균 체중/g	8.17 ± 0.95	8.55 ± 0.41
실험 마감시 평균 체중/g	44.18 ± 1.54	49.16 ± 8.97
체중 증가율/%	445.61 ± 60.97	478.93 ± 133.98
사료효율(FCR)	1.45 ± 0.10	1.38 ± 0.11

< 실험예 2> 사료첨가제의 소화율 조사

사료첨가제의 소화율을 측정하기 위하여, 상기 실험예 1과 같이 두개의 구로 나누어, 69×48×60 ㎝ 규격의 비닐 박스 속에서 실험을 수행하였다. 박스 속에 2개의 평행대를 설치하고 각각의 평행대에 10 마리의 물고기를 투여하였으며 24 시간 동안 산소를 공급하였고, 매일 1%의 Cr₂O₃가 첨가된사료를 2회(오전 09:00 및 오후 16:30) 투여하였다. 6일 동안 사료를 투여하고 7일부터 소화된 사료 분석을 위하여 어류에서 배출되는 대변을 수집하였다. 매일 사료투여 1 시간 후, 잔류 사료와 흩어진 대변을 걸러내었고 사료투여 2 시간 후, 사이펀(siphon)으로 형태가 보존되어 있는 대변을 끌어올리고 그 중의 완전한 형태의 대변을 증류수로 세척하고 여과지로 여과시킨 후 즉시 냉동(-20℃) 보관하였다. 약 1주일 동안 상기와 같이 대변을 수집하였다. 이렇게 매일 수집된 대변을 먼저 햇볕에 말린 후, 항온 건조기(80℃)에 넣고 건조시킨 후, 조단백질의 함유량을 케달법(Kjeldahl method)으로 측정하였다. Cr₂O₃의 함유량은 습식 분해 정량법을 사용하여 측정하였으며, 사료 건(乾)물질의 소화율(%) 및 단백질 소화율(%)을 하기 수학식 3 및 4를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 사료첨가제를 첨가한 첨가구에서 단백질 소화율과 건 물질의 소화율이 무첨가구에 비하여 증가됨을 확인하였고(표 4), 이는 본 발명의 사료를 첨가함으로써 사료의 전환율을 높여 줌을 의미한다.

사료 건(乾)물질의 소화율(%)=(1-사료 중 Cr ₂ O ₃ 의 함유량/대변 중 Cr ₂ O ₃ 의 함유량)×100

단백질 소화율(%)=(1-사료 중 Cr ₂ O ₃ 의 함유량×대변 중 영양성분 함유량/대변 중 Cr ₂ O ₃ 의 함유량×사료영양성분 또는 에너지함유량)×100

단백질의 소화율 비교

	단백질 소화율	건 물질의 소화율
무첨가구	81.09 ± 0.78	47.21 ±2.04
첨가구	83.20 ± 3.71	54.37 ±9.17

< 실험예 3> 면역획득 조사

본 발명의 사료첨가제를 섭취함으로써 획득된 면역 반응을 확인하기 위하여, 상기 실험예 2의 실험을 수행한 그 다음날에 그물마다 무작위적으로 8마리의 도미를 취하여 1 ㎖의 일회성 무균 주사기로 물고기 측선(Side Line)의 2번째 비늘 부위에 깊숙이 찌르고 척추 바로 밑의 혈관에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액, 1.5 ㎖의 살균 원심분리기 튜브(Centrifuge tube)에 주입하고 실온에서 1 시간 동안 방치한 후, 4℃의 냉장고에 넣고 하룻밤 지난 후 저온 원심분리기로 원심분리하여(4,000 rpm, 5분) 그 탈리액을 채취하였고 각각 그룹마다(무첨가구 및 첨가구) 4마리의 탈리액을 혼합시킨 혼합액을 -20℃ 냉장고에 비치해 두었다. 상기의 혼합액에 대해서 SOD(Super Peroxidase), LZM(lysozyme)을 측정하였다.

그 결과, 첨가구에서 LZM 및 SOD가 높아짐을 확인할 수 있었다(표 5). 이는 본 발명의 사료첨가제의 첨가에 의해서 어류 혈청의 LZM 활력과 SOD 활력을 향상시키며, 이로써 어류의 생체 면역력 향상에 적극적인 효과가 있음을 알 수 있었다.

LZM 및 SOD

	SOD (U/㎖)	LZM (㎍/㎖)
무첨가구	49.81 ± 1.46	8.60 ± 0.29
첨가구	59.33 ± 0.63	8.82 ± 2.37

< 실시예 3> 실험 조건 및 사료

갑각류에 대한 본 발명의 사료첨가제의 효율을 조사하기 위하여, 실외의 시멘트 못(6.4×1.6×1.2 m)에서 실험을 수행하였으며, 시멘트 못에는 규격이 2.0×1.0×1.0 m이고, 체적이 2.0×1.0×0.8 m인 3개의 망상(網箱)을 설치하였다.

양식 용수(水)는 침전과 여과를 거친 연못의 물을 사용하고 인공 바닷물로 염도를 1 ~ 2%로 조절한 후, 실험을 시작하였다. 실험기간 동안 물의 온도는 25 ~ 30℃로 유지하였고 실험하는 과정에서 24 시간 동안 산소를 공급하였다.

사료는 새우 사료공장(코스프, 인천)에서 생산한 것으로 사료에 본 발명의 사료첨가제를 0.1 %를 첨가한 그룹(첨가구)과 첨가하지 않은 그룹(무첨가구)의 두개의 그룹으로 나누었다. 실험용 사료 중의 영양성분은 조단백질 40.0%, 조지방 4.0%, 조회분 15.0%, 수분 12.0%, 조섬유 5.0%, 총 인(燐) 1.0%, 칼슘 4.0%이며, 사료가공조건은 하기 표 6과 같다.

남미 흰다리새우 배합사료 가공조건

지표	수치
사료 처리 온도	95 ~ 105 ℃
사료 처리 시간	1 시간
사료의 직경	0.18 ㎜

< 실험예 4> 갑각류의 성장 조사

상기 제제예 1에서 제조한 사료첨가제가 갑각류의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 남미 흰다리 새우의 생존율, 체중증가율, 사료계수에 대한 영향을 조사하였다.

남미 흰다리 새우는 번우 양식장에서 제공받았으며 상기 새우는 연구소에 반입한 후, 10일 동안 사양하고, 그 중에서 개체가 균일하고 건강한 새우를 하기 실험예에 사용하였다. 실험은 사료 첨가군 마다 각각 3회 반복하였다. 매 그물(망상; 網箱)에 100마리의 남미 흰다리 새우를 투여하고 무작위적으로 20마리 새우를 취하여 체중을 측정하고 그 수치를 실험용 새우의 초기 체중으로 하였다. 실험기간 동안에 사료의 투여량은 새우 체중의 3 ~ 8%로 하였고 매일 8:00, 16:00 및 22:00 각각 3회로 나누어서 투여하고, 15일마다 무작위적으로 새우의 체중과 체장을 측정하여 이에 따라 사료 투여량은 조절하였다. 구체적으로, 새우의 사료섭취 상황에 따라 조절하였으며, 매일 용존산소(dissolved oxygen, DO) 및 pH를 측정하였고, 매 10일마다 화학적 산소요구량(chemical oxygen demand, COD), NH₄-N 및 NO₂-N을 1회 측정하였며, 사료효율(FCR)은 하기 수학식 5와 같이 하여 측정하였다.

그 결과, 새우의 총 중량은 대조구보다 17.61% 증가함을 확인할 수 있었다. 이와 함께 평균 사료효율은 3.29% 증가함을 확인하였고, 새우의 평균 생존율은 대조구 보다 10.13% 증가함을 확인할 수 있었다. 이상과 같이, 본 발명의 사료첨가제 투여로 인해서, 새우의 체중뿐만 아니라 사료효율(FCR)에서 월등함을 확인할 수 있었다(표 7).

사료효율 ( FCR ) = 사료소비량 / (최후 체중- 초기 체중)

남미 흰다리새우의 생존율, 체중증가율, 사료계수에 대한 영향

		초기 체중 (g)	최후 체중 (g)	평균 체중 (g)	생존율 (%)	평균 생존율(%)	FCR	평균 FCR
대 조 구	1	27.53	342.96	413.27 ±61.11	74	82.33 ±7.23	1.50	1.52 ±0.10
	2	31.02	443.28		86		1.63
	3	33.41	453.57		87		1.44
첨 가 구	1	32.46	491.34	486.03 ±6.88	90	90.67 ±1.15	1.40	1.47 ±0.15
	2	27.55	488.48		92		1.61
	3	35.45	478.26		90		1.33

< 실험예 5> 갑각류의 면역학적 조사

본 발명의 사료첨가제에 의한 갑각류의 면역학적인 영향을 조사하기 위하여,본 발명의 사료첨가제에 의한 남미 흰다리 새우의 비특이성 면역기능에 대한 영향을 조사하였다.

그 결과, 사료첨가제를 첨가함으로써, 남미 흰다리 새우의 혈청 중에 ACP(Acid Phosphatase), LZM(lysozyme)이 현저히 증가함을 확인할 수 있었으나 SOD(Super Peroxidase)의 활성은 비슷하였다(표 8).

ACP ( Acid Phosphatase ), LZM ( lysozyme ) 및 SOD ( Super Peroxidase )의 활성

면역지표	대조구	첨가구
ACP	4.12 ±0.63	7.54 ±0.32
LZM	10.26 ±3.11	15.13 ±5.63
SOD	114.36 ±7.08	113.70 ±9.86

<110> Berna Biotech AG <120> Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides of serotype IATS O6 of Pseudomonas aeruginosa <130> 5fpi-10-07 <150> EP20030010836 <151> 2003-05-14 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Val 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Tyr Trp Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Val Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Arg Pro Gly Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Glu Val Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Val 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 100 105 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Ala Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Val Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Trp Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Arg Pro Gly Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Glu Val Leu Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctctt gatctataag gcatctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccattagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataaaagtt atcccgtgtt tggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaagg a 321 <210> 10 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 caggcgcagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgtaagg cttctggata caccttcatc ggctattgga tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcctgagtg gatgggacgg atcaacccta acagtggtgg cacaaagtat 180 gtacagaagt ttcagggcag ggtcaccgtg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga actggctgac atctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagcaagg 300 cctggttgtg gtggtgattg ctatgaggtc ttagattact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gccacgctgc tcgtatccga cg 22 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agcaggcaca caacagaggc agttcc 26 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gctgctcgta tccgacgg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cacaacagag gcagttcc 18

Claims

아라자임을 유효성분으로 함유하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료첨가제.
제 1항에 있어서, 상기 아라자임은,

(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질;

(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및

(d) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1항에 있어서, 어류 및 갑각류의 면역력 향상 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1 항에 있어서, 추가적으로 어류 및 갑각류에 허용되는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1항에 있어서, 아라자임(arazyme)은 0.1 ~ 20% 중량부, 지방분해효소(Lipase)는 0.001 ~ 0.01 % 중량부, 제 3 인산칼슘은 1 ~ 20% 중량부, 비타민 E는 0.01 ~ 0.1 % 중량부, 효소분말은 1 ~ 10% 중량부, 유산균은 0.1 ~ 10 % 중량부, 바실러스(Bacillus) 배양액은 0.01 ~ 10 % 중량부 및 포도당은 20 ~ 90 % 중량부로 구성되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1항에 있어서, 상기 어류는 도미, 넙치, 우럭, 참돔, 민어, 숭어, 능성어 등의 해산어류 및 뱀장어, 은어, 산천어, 송어, 쏘가리 등의 육상어류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1항에 있어서, 상기 어류는 도미인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1항에 있어서, 상기 갑각류는 흰다리 새우(Litopenaeus vannamei), 보리새우(Marsupenaeus japonicus), 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon), 대하(Penaeus chinensis), 피나에우스 모르기엔시스(Penaeus morguiensis) 등을 포함하는 새우류 및 상해 게, 꽃게 등의 게류로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 8항에 있어서, 상기 흰다리 새우는 남미 흰다리 새우(Penaeus vannanei)인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1항의 사료첨가제를 포함하는 어류 또는 갑각류 양식용 사료.
제 1항의 사료첨가제 또는 제 9항의 사료를 갑각류 또는 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 면역력 증강 방법.
제 11항에 있어서, 상기 사료첨가제 또는 사료의 1회 투여량이 어류 또는 갑 각류 섭취를 위한 사료양의 0.05 ~ 10%인 것을 특징으로 하는 면역력 증강 방법.