KR20080100126A - Myocardia regeneration remedy with biocompatible polymer and composition thereof - Google Patents

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KR20080100126A
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biocompatible polymer
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김진석
최종원
김소연
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(주) 비에이치케이
최종원
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Abstract

A therapeutic agent for regenerating cardiac muscle tissue and a composition thereof are provided to enhance a treatment adaptability of patient by containing a biocompatible polymer, to enhance a engraft rate by being transplanted into a hybrid form of myoblast and a biocompatible polymer in a myocardium and to improve a cardiac function extraordinarily. A therapeutic agent for regenerating cardiac muscle tissue contains a biocompatible polymer and a cellular constituent transplanting to a myocardium in order to induce a regeneration of the damaged cardiac muscle tissue and separated and cultivated from a muscular cell. The cellular constituent is a stem cell inducing myoblasts, cardiomyocytes, endothelial cells, fibroblasts or cardiovascularization. The biocompatible polymer includes a property selected from a biodegradation property or a cell affinity and one or more components selected from hyaluronic acid, fibrin, alginic acid, methyl cellulose, collagen, poloxamer, gelatin, pluronic acid, carbopol, polyvinylpyrrolidone, polylactic acid and a derivative thereof. The biocompatible polymer is used as liposome, polymeric micelle, nanosphere or microsphere.

Description

생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제 및 그 조성물{Myocardia regeneration remedy with biocompatible polymer and composition thereof}Myocardial tissue regeneration therapies and compositions containing biocompatible polymers {Myocardia regeneration remedy with biocompatible polymer and composition

본 발명은 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제 및 그 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 손상된 심장근육의 재생 치료를 위하여 생체적합성 고분자를 사용함으로써, 이식되는 세포의 생존력을 유지하면서 이식부위에서 세포의 생착률을 높일 수 있는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제 및 그 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a therapeutic agent for myocardial tissue regeneration containing a biocompatible polymer and a composition thereof, and more particularly, by using a biocompatible polymer for the treatment of regeneration of damaged heart muscle, the site of transplantation while maintaining the viability of the transplanted cells The present invention relates to a therapeutic agent for myocardial tissue regeneration comprising a biocompatible polymer capable of increasing the engraftment rate of cells and a composition thereof.

일반적으로, 심장근육의 손상은 신체가 필요로 하는 심박출량을 유지하는데 지장을 초래하여 심부전 및 심근경색과 같은 생명에 위협을 줄 수 있는 심각한 질환이 될 수 있다. 최근 정상심장에서도 심근세포가 분열하고 소실되는 심근세포의 교체가 느리기는 하지만 일어나고 있음이 보고되고는 있으나 기존의 내과 치료법으로는 손상 받은 심근세포의 수를 늘릴 수 있는 방법이 없으며, 더구나 중증 말기 심부전 환자의 경우는 이미 심장의 기능을 회복시킬 수 없기 때문에 심장이식술(heart transplant)이나 심실 보조장치(ventricular assist device)를 사용하는 방법밖에 없다. 심근이 손상되면 이러한 심근세포의 증식과 심장줄기세포의 분열이 심근재생에 도움이 되기는 하지만, 필요한 양을 적절한 시기에 동원하여 증식시키는 것은 불가능하여 심근의 재생과 손상된 심근의 기능회복을 위해 여러 종류의 세포를 이용한 세포이식치료가 대안으로 떠오르고 있다. 최근 줄기세포의 연구가 활성화되면서 손상된 조직의 치료를 위해 미분화 상태의 줄기세포를 심근의 손상 부위에 이식한 결과 심장기능이 개선되는 것이 보고되고 있다. In general, damage to the heart muscle can be a serious disease that can interfere with maintaining the amount of cardiac output required by the body, which can pose a life threat, such as heart failure and myocardial infarction. Recently, the replacement of cardiomyocytes that divide and lose cardiomyocytes in normal heart has been reported to occur slowly, but there are no existing medical treatments that can increase the number of damaged cardiomyocytes. Since patients can not restore the function of the heart already, the only way to use a heart transplant (ventricular assist device). If myocardial damage is caused by the proliferation of cardiomyocytes and the division of cardiac stem cells, it may not be possible to proliferate the necessary amount in a timely manner. Cell transplantation therapy using cells has emerged as an alternative. Recently, as stem cell research is activated, heart function is reported to be improved as a result of transplanting undifferentiated stem cells to the damaged area of myocardium to treat damaged tissues.

세포이식치료는 배아줄기세포나 근육모세포(skeletal myoblast), 중간엽 줄기세포, 조혈줄기세포 등 골수에서 기인한 줄기세포, 간이나 신경계 등의 장기에 존재하는 성체줄기세포(adult stem cells) 등을 사용하는 자가세포이식(autologous transplantation)이 있다.Cell transplantation treatment includes stem cells derived from bone marrow such as embryonic stem cells, myeloid myoblasts, mesenchymal stem cells, and hematopoietic stem cells, and adult stem cells present in organs such as liver and nervous system. There is autologous transplantation.

심혈관 질환에서 심근손상을 복구하기 위해 줄기세포이식을 시도하고 있으며 여러 종류의 성체줄기세포를 직접 이용하거나 줄기세포로부터 심근세포로 분화시켜 투여하는 방법 등을 이용할 수 있다. Stem cell transplantation is attempted to repair myocardial damage in cardiovascular diseases, and various adult stem cells can be directly used or differentiated and administered from stem cells to cardiomyocytes.

줄기세포를 투여하는 방법으로는 심장병 환자의 심장내 주입(intramyocardial delivery)과 외과 시술적으로 심근에 직접 주사하는 방법, 카테터를 이용해 관동맥 등으로 주입하는 방법과 정맥혈관주사 같이 전신 투여하는 방법 등이 있다. Stem cells can be administered by intracardiac delivery of cardiac patients, by direct surgical injection into the myocardium, by catheter injection into the coronary arteries, or by systemic administration such as venous vascular injection. have.

하지만 주입된 세포의 생착율(bioretention)은 매우 낮은 상황이며 보고에 의하면 심장의 특수성으로 인해 주입된 심근세포의 약 10% 정도 만이 심근조직 재생에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 이러한 난점을 극복하기 위해 고분자재료를 이용하여 그 생착율을 높이는 기술들이 필요한 상황이다.However, the bioretention of the injected cells is very low, and it is reported that only about 10% of the cardiomyocytes injected affect the myocardial tissue regeneration due to the specificity of the heart. In order to overcome these difficulties, there is a need for technologies that increase the engraftment rate using polymer materials.

심근세포에 손상이 발생하여 심기능이 저하되는 경우 심근세포의 증식도 빨리 일어나야 심기능 회복에 실제적인 도움이 된다. 따라서 세포이식치료도 심혈관 질환의 특성에 맞게 줄기세포의 투여량과 전신 혹은 국소투여 등 그 투여기법을 결정하여야 하며 최종적으로 새로 형성된 심근은 기존의 심근과 융합되어 심기능의 호전을 가져올 수 있으며, 조직공학 등의 관련 연구를 통해 보면 심근의 손상이 발생한 심혈관 환자에게 줄기세포를 이용한 세포이식을 하는 것이 심기능을 호전시킬 수 있는 치료의 한 방법으로 전망되고 있다.If cardiac cells are damaged and cardiac function is degraded, cardiomyocyte proliferation should also occur quickly to help restore heart function. Therefore, cell transplantation treatment should be determined according to the characteristics of cardiovascular disease, such as stem cell dosage and systemic or local administration. Finally, newly formed myocardium may be fused with existing myocardium, resulting in improvement of cardiac function. Related studies, such as engineering, suggest that stem cell transplantation using cardiovascular patients in cardiovascular patients with myocardial injuries is one of the ways to improve cardiac function.

심장세포(cardiomyocytes)와는 달리 근모세포는 유사분열(mitosis)을 진행 할 수 있으며 근모세포는 혈관생성이나 신경생성이 없는 환경에서도 생존 및 증식이 가능한 세포이다. 이러한 이유 때문에 자가유래 근모세포를 이용한 근육조직을 재생시키려는 많은 시도가 있었다. Law 박사는 근육성 이영양증(muscular dystrophy)과 심장질환 치료를 위해 근원성 세포(myogenic cell)를 사용하였고, 이식된 세포들이 기 존재하던 세포와 융합하여 손상된 세포에게 건강한 세포의 유전자를 전달하여 유전적 치유의 효과를 보이고, 이식된 세포들끼리 융합하여 퇴화된 세포를 대체하도록 하여 조직의 기능을 회복시킨다고 보고하였다(Gene Ther. Mol. Biol. pp. 345-363, March 1998). 근원성 세포를 카테터를 이용하여 손상된 심근에 이식하여 조직을 재생시킨 기술(국제특허 제2002-028470호)이 알려져 있다. 그러 나, 상기 기술은 대조군 보다 처리군에서 세포에 의한 심장기능이 향상된 결과를 보였지만, 박동하는 심장 근육의 특성상 세포를 이식할 때 세포의 생착을 어렵게 하여 그 효능의 한계가 존재한다. 또한, 근모세포에 내피세포 자극인자 또는 혈관 재생인자를 발현하는 유전자를 형질 도입하여 1 x 108 개 세포를 각각 손상된 심근에 이식해 허혈성 심근질환의 치료를 유도한 기술(국제특허 제2005-002916호)이 개시되어 있다. 상기 기술은 기 발명된 근모세포를 이용한 심근재생 치료에 유전자의 기능성을 추가로 부여해 효능을 높이고자 한 발명이지만, 유전자 도입 및 발현의 관한 일관성있는 결과를 각각의 경우에 따라 얻기가 어렵고, 또한 유전자 도입시 사용된 바이러스 벡터의 안전성에 아직까지 해결해야 할 문제점들이 많이 존재한다. 이 경우에서도 결국 세포의 이식시 생착정도의 차이가 심장근육 재생치료 효과에 미치는 영향은 크다고 할 수 있다. Unlike cardiomyocytes, myoblasts can undergo mitosis, and myoblasts are cells that can survive and proliferate even in the absence of angiogenesis or neurogenesis. For this reason, many attempts have been made to regenerate muscle tissue using autologous myoblasts. Dr. Law used myogenic cells to treat muscular dystrophy and heart disease, and the transplanted cells merged with existing cells to deliver healthy cell genes to damaged cells that are genetically engineered. It has been shown to have a healing effect and to restore the function of tissues by grafting the transplanted cells to replace degenerated cells (Gene Ther. Mol. Biol. Pp. 345-363, March 1998). Techniques for regenerating tissue by transplanting myogenic cells into a damaged myocardium using a catheter (International Patent No. 2002-028470) are known. However, the above technique has been shown to improve the cardiac function by the cells in the treatment group than the control group, but due to the nature of the pulsating heart muscle makes the cells difficult to engraft when transplanting cells, there is a limit of its efficacy. In addition, by introducing a gene expressing endothelial cell stimulation factor or vascular regeneration factor in myoblasts, 1 x 10 8 cells are transplanted into the damaged myocardium to induce the treatment of ischemic myocardial disease (International Patent 2005-002916). Is disclosed. Although the above technique is intended to enhance the efficacy by further adding the functionality of genes to the myocardial regeneration treatment using the previously invented myoblasts, it is difficult to obtain a consistent result of gene introduction and expression in each case, and also There are many problems that have yet to be solved for the safety of the viral vectors used in the introduction. Even in this case, the effect of engraftment on the effect of cardiac muscle regeneration can be said to be great.

앞서 기술되었다시피 심근조직의 재생이 필요한 부위에 주입된 세포의 생착율은 매우 낮은 상황이며 주입된 심근세포의 약 10% 정도 만이 심근조직재생에 영향을 미치며 90%정도는 소실되어 심근조직 재생에 아무런 효과를 나타내지 못하고 있다. 따라서 지속적인 심근조직 재생을 위해서는 환자에게 심근세포의 주입빈도를 높일 수 밖에 없으며 환자의 고통도 커지는 상황에 처하게 된다. 또한 실제 이식되는 세포의 수가 매우 적어 고농도의 세포 수를 이식 시 사용해야 하는 문제점이 있으며 고농도의 세포를 이식한다 하더라도 이식된 부위에서 분화할 때까지 세포가 머물러 있기에 열악한 환경 조건이므로 기대이상의 치료 효과를 보기에 한계가 있 는 실정이다. As described above, the engraftment rate of the cells injected into the area requiring cardiomyocyte regeneration is very low, and only about 10% of the injected cardiomyocytes affect myocardial tissue regeneration and 90% of them are lost. There is no effect. Therefore, in order to continuously regenerate myocardial tissue, the patient's frequency of injection of cardiomyocytes must be increased and the patient's pain is also increased. In addition, the actual number of cells transplanted is very small, so there is a problem that a high concentration of cells should be used for transplantation, and even if a high concentration of cells is transplanted, the cells remain in a poor environmental condition until they differentiate at the transplanted site, so the treatment effect is more than expected. There is a limit to this situation.

이에 세포의 전달체 혹은 지지체로서 고분자재료를 이용하여 그 생착율을 높이는 기술들이 최근 여러 연구자들에 의해 개발되고 있다.Accordingly, techniques for increasing the engraftment rate using polymer materials as carriers or supports of cells have been recently developed by various researchers.

연골세포를 키토산계 고분자 스캐폴드에 배양하여 연골 조직 손상을 치료하고자 하였고(미국공개특허 제2004-0044408호), 연골세포를 단백질 혹은 다당류 고분자에 혼합해 손상된 연골조직에 적용시켰다(미국공개특허 제2006-0029578호). 또한, 고분자 히드로젤로 구성된 스캐폴드(scaffold)를 연골세포, 골아세포 또는 줄기세포와 혼합해 골조직의 재생을 유도하였다(미국공개특허 제2006-0036331호). 그리고, 플루론산 30%, 히알루론산 3~4%로 제조된 생체적합성 고분자와 연골세포를 혼합한 연골손상 치료제(대한민국 특허등록 제494,265호)가 개시되어 있다. 그러나, 이와 같이 고분자 지지체를 이용하여 세포치료제의 효율을 높이고자 하는 시도는 주로 연골조직 재생용 이나 골조직 재생용으로 많이 연구되고 있다.Chondrocytes were cultured in chitosan-based polymer scaffolds to treat cartilage tissue damage (US Patent Publication No. 2004-0044408), and chondrocytes were mixed with proteins or polysaccharide polymers and applied to damaged cartilage tissue (US Patent Publication No. 2006-0029578). In addition, scaffolds composed of polymer hydrogels were mixed with chondrocytes, osteoblasts or stem cells to induce bone tissue regeneration (US Patent Publication No. 2006-0036331). In addition, there is disclosed a cartilage damage treatment agent (Korean Patent Registration No. 494,265) in which a biocompatible polymer made of 30% of pluronic acid and 3-4% of hyaluronic acid and chondrocytes are mixed. However, attempts to increase the efficiency of cell therapeutics using polymer supports have been mainly studied for cartilage tissue regeneration or bone tissue regeneration.

그리고, 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 혈관, 피부, 지방, 근육, 신경, 심장, 간장, 췌장, 장, 신장, 각막, 방광, 요관, 요도, 유방, 골수 또는 제대혈 유래 세포를 3차원 다공성 지지체에 삽입하여 조직 재생을 시도한 기술이 개시되어 있다(대한민국 특허공개 제2005-0083681호). 그러나, 상기 기술은 심근세포의 조직 재생에 대한 세부 연구는 보여주고 있지 않다. And bone, cartilage, ligament, tendon, blood vessel, skin, fat, muscle, nerve, heart, liver, pancreas, intestine, kidney, cornea, bladder, ureter, urethra, breast, bone marrow or umbilical cord blood-derived cells The technique which attempted to regenerate a tissue by inserting into the is disclosed (Korean Patent Publication No. 2005-0083681). However, the technique does not show a detailed study of tissue regeneration of cardiomyocytes.

심근조직 재생을 위한 생체적합성 고분자의 이용과 관련한 보고도 이루어지고는 있다. 세포를 생체적합성 고분자물질에 혼합하여 세포의 생착을 높이려는 시도의 일환으로 Piao등은 실험쥐에서 심근경색(myocardial infaction, MI)를 유도한 후 골수유래세포를 생체적합성을 보유한 글리콜리드와 카프로락톤계의 공중합체상에서 배양한 후, 골수유래세포를 함유하는 고분자 중합체를 심근경색부위에 이식하여 향상된 심장기능을 얻었음을 보고하였다(Biomaterials.2007;28:641-649). Cannizzaro등은 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 세포점착을 유도하는 RGD 펩티드 시퀀스를 도입하여 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 대한 내피세포의 점착성을 증대시킴으로써 심근조직 재생을 도우려는 시도를 보고한바 있으며 (Biotechnol Bioeng. 1998;58:529-535), Leor등은 심근조직 재생을 위해 사용될 수 있는 고분자 지지체가 가져야 할 물성에 대해 언급하였으며 심근조직재생을 위해 사용될 수 있는 고분자 지지체가 가져야될 물성으로써 비독성, 생분해성, 생활성(bioactive), 유연성 등을 제시한바 있다(Pharmacology & Therapeutics. 2005;105:151-163). 그러나, 상기 연구는 고분자 중합체 및 고분자 지지체의 초기 단계를 기술한 것으로 심화된 연구가 필요하다.There are also reports on the use of biocompatible polymers for myocardial tissue regeneration. In an attempt to increase the engraftment of cells by mixing the cells with biocompatible polymers, Piao et al. Induced myocardial infaction (MI) in rats and then used the biocompatible glycolide and caprolact in bone marrow-derived cells. After culturing on ton-based copolymers, it was reported that the implanted polymer containing myeloid-derived cells was implanted in the myocardial infarction area to obtain improved cardiac function (Biomaterials. 2007; 28: 641-649). Cannizzaro et al. Have reported an attempt to help myocardial tissue regeneration by introducing an RGD peptide sequence that induces cell adhesion to polyethylene glycol copolymers to increase the adhesion of endothelial cells to polyethylene glycol copolymers (Biotechnol Bioeng. 1998; 58; (529-535), Leor et al. Mentioned the physical properties of polymer supports that can be used for myocardial tissue regeneration and the properties of polymer supports that can be used for myocardial tissue regeneration. bioactive, flexibility, etc. (Pharmacology & Therapeutics. 2005; 105: 151-163). However, the study described the initial stages of the polymer polymer and the polymer support and requires further study.

그리고, 반고성 3차원적 생체적합성 고분자 물질에 줄기세포 또는 근모세포, 심근세포를 심어서 반고성 생체재료 상태로 일정기간 체외배양을 통해 세포가 세포 외 기질을 만들도록 한 후, 외과적으로 개흉하고 심근의 손상부위에 조성물을 패취 형태로 부착하여 심장의 기형화 및 심장근육의 수축력 상실을 억제하기 위한 기술(미국공개특허 제2005-0042254호)이 기재되어 있다. 하지만 발명품을 심장에 직접 부착시키기 위한 외과적 개흉시술이 수반되어야 하고 이로 인해 환자들의 시술의 적응성이 떨어진다. 따라서 실제 환자에 적용하기 용이하지 않아서 그 적응에 한계가 있으며, 실제 심근의 재생치료 효과도 한정적이다. 따라서 외과적 개흉시술이 필요없고 시술이 보다 용이하며 환자의 투여적응성이 높은 직접 주사투여 혹은 카테터를 이용하여 투여될 수 있는 조성으로 이루어진 발명이 요구된다. 또한, 가교 연결된 알긴산류 고분자 물질을 근모세포, 심근세포와 혼합하고 카테터를 이용해 심근에 이식 후 심장근육을 재생 치료하고자 시도한바 있다(미국공개특허 제2005-0003010호). 이 발명에서 알긴산은 글루콘산 칼슘(calcium gluconate)와 혼합하여 가교화를 이루어지도록 하였다. 글루콘산 칼슘은 일반적으로 저칼슘혈증 (Hypocalcemia), 고초열등의 증상완화 및 치료에 사용되는 의약품 제제이며 일반적으로 혈관투여된다. 단, 구토, 발한 등의 부작용이 알려져 있으며 신결석이나 신장장애 환자에는 적용 시 주의를 요하여지고 있다. 특히 이 제제는 혈관 밖의 조직으로 들어갔을 때 조직괴사가 발생하는 문제를 야기할 수 있다. 따라서 알긴산의 가교제로서 사용되어 지더라도 가교화에 기여하지 못하고 잔류되어 있는 글루콘산 칼슘은 위와 같은 심각한 문제를 일으킬 수 있는 여지를 내포하고 있다.Then, stem cells, myoblasts, and cardiomyocytes are planted in a semi-solid 3D biocompatible polymer material to allow cells to make extracellular matrix through in vitro culture for a certain period of time in a semi-solid biomaterial state, and then surgically thoracic And a technique for attaching the composition in the form of a patch to the damaged part of the myocardium to suppress the malformation of the heart and the loss of contractile force of the heart muscle (US Patent Publication No. 2005-0042254). However, surgical thoracotomy to attach the invention directly to the heart must be accompanied, which makes the patient less adaptable to the procedure. Therefore, it is not easy to apply to the actual patient has its limitations in adaptation, the actual effect of regenerative treatment of myocardium is limited. Therefore, there is a need for an invention that requires no surgical thoracotomy, is easier to perform, and has a composition that can be administered using a direct injection or catheter. In addition, crosslinked alginic acid polymer material has been mixed with myoblasts and cardiomyocytes and attempted to regenerate cardiac muscle after transplantation into myocardium using a catheter (US Patent Publication No. 2005-0003010). Alginate in this invention was mixed with calcium gluconate (calcium gluconate) to achieve crosslinking. Calcium gluconate is a pharmaceutical preparation generally used for symptomatic treatment and treatment of hypocalcemia, hyperthermia, etc., and is generally administered by vascular administration. However, side effects such as vomiting and sweating are known, and care has to be taken in patients with kidney stones or kidney disorders. In particular, the agent may cause a problem of tissue necrosis when entering the tissue outside the blood vessels. Therefore, even when used as a crosslinking agent of alginic acid, calcium gluconate remaining without contributing to crosslinking has room for such serious problems.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 개흉수술과 같은 시술이 필요치 않아 환자의 치료적응성이 높으며, 사용되는 고분자의 가교를 위해 부가적인 물질이 사용되지 않는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제를 제공하는 데 그 목적이 있다.The present invention is to solve the problems of the prior art as a cardiomyopathy tissue containing a biocompatible polymer that does not require a procedure such as thoracotomy, the treatment adaptability of the patient is high, and additional materials are not used for the crosslinking of the polymer used The purpose is to provide a therapeutic for regeneration.

본 발명의 상기 목적은 손상된 심근조직의 재생을 유도하기 위하여 심근부위에 이식되는, 근육세포로부터 분리, 배양된 세포성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제를 형성함으로써 달성할 수 있다.The object of the present invention is to form a therapeutic agent for myocardial tissue regeneration containing a biocompatible polymer comprising a cell component and a biocompatible polymer, isolated from the muscle cells, implanted in the myocardial site to induce regeneration of the damaged myocardial tissue This can be achieved by.

또한, 본 발명은 심근세포 부위에 주입하는, 근육세포에서 분리, 증식된 세포성분 및 생체적합성 고분자로 조성된 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.In addition, an object of the present invention is to provide a composition for regenerating myocardial tissue containing a biocompatible polymer composed of a cell component and a biocompatible polymer isolated and expanded from muscle cells, injected into the cardiomyocyte site.

본 발명의 상기 목적은 심근부위에 이식되는 1ml 당 1 x 105 ~ 1 x 109 개(단위 세포)의 근육세포로부터 분리, 배양된 세포성분과 0.01 ~ 70 중량부의 생체적합성 고분자를 포함하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물을 형성함으로써 달성할 수 있다.The object of the present invention is a living body comprising a cell component and 0.01 to 70 parts by weight of a biocompatible polymer isolated and cultured from 1 x 10 5 to 1 x 10 9 (unit cells) muscle cells per 1 ml implanted in the myocardium region This can be achieved by forming a composition for myocardial tissue regeneration containing a suitable polymer.

또한, 본 발명은 외과적으로 개흉하지 않고, 패취를 사용하는 것도 아니어서 환자의 고통이 감소되는 심근조직 재생 치료방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.It is also an object of the present invention to provide a method for treating myocardial tissue regeneration in which the pain of the patient is reduced because there is no surgical opening and no patch is used.

본 발명의 상기 목적은 심근부위에 상기 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물을 주사, 주입, 카테터를 이용한 투여 또는 캡슐 투여하는 심근조직 재생 치료방법을 제공함으로써 달성할 수 있다.The above object of the present invention can be achieved by providing a myocardial tissue regeneration treatment method of injection, infusion, administration using a catheter or capsule administration of a composition for myocardial tissue regeneration containing the biocompatible polymer in the myocardium.

본 발명은 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제에 있어서, 상기 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제가 손상된 심근조직의 재생을 유도하기 위하여 심근부위에 이식되는, 근육세포로부터 분리, 배양된 세포성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다. The present invention provides a therapeutic agent for myocardial tissue regeneration containing a biocompatible polymer, wherein the therapeutic agent for regenerating myocardial tissue containing the biocompatible polymer is implanted in a myocardial region to induce regeneration of the damaged myocardial tissue, isolated from muscle cells, It comprises a cultured cell component and a biocompatible polymer.

세포를 이용한 심근형성술(Cellular cardiomyoplasty)은 심근경색에 따르는 심장질환의 치료를 위한 새로운 치료상의 접근법으로 여겨지고 있으며, 골격근세포를 포함한 근육세포의 이식은 심근기능의 향상에 효과적인 것으로 알려져 있다. 하지만 여전히 주입된 세포의 생착율은 매우 낮은 상황이며 이에 생체재료를 이용하여 그 생착율을 높이는 기술이 본 발명으로부터 제공된다.Cellular cardiomyoplasty is considered to be a novel therapeutic approach for the treatment of heart disease following myocardial infarction. Transplantation of muscle cells, including skeletal muscle cells, is known to be effective in improving myocardial function. However, the engraftment rate of the injected cells is still very low, and thus a technique for increasing the engraftment rate using biomaterials is provided from the present invention.

상기 근육세포의 이식은 상기 근육세포로부터 분리, 배양된 세포성분을 이용한다. 상기 세포성분은 성체줄기세포로부터 분리된 근모세포(myoblasts), 심근세포(cardiomyocytes), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 심혈관 형성을 유도하는 줄기세포이다.Transplantation of the muscle cells uses a cell component isolated and cultured from the muscle cells. The cellular component is myoblasts, cardiomyocytes, endothelial cells, fibroblasts, or stem cells that induce cardiovascular formation isolated from adult stem cells.

상기 근모세포, 심근세포, 내피세포, 섬유아세포, 또는 심혈관 형성을 유도하는 줄기세포는 허벅지, 겨드랑이, 팔뚝 또는 대퇴부에서 채취한 소량의 근육으로부터 근육 줄기세포를 분리, 심장근육에 맞게 분화시켜 배양한다. The myoblasts, cardiomyocytes, endothelial cells, fibroblasts, or stem cells that induce cardiovascular formation are cultured by separating muscle stem cells from a small amount of muscle collected from the thighs, armpits, forearms or thighs, and adapting them to the heart muscle. .

일예로 근모세포의 분리 및 증식은 다음과 같다.As an example, the isolation and proliferation of myoblasts are as follows.

백서의 하지 근육을 생검하여 세척 후, 잘게 근육조직을 분쇄하고 0.4% 교원질 분해효소(collagenase) 용액으로 처리하여 세포 현탁액을 분리해내고 세척, 원심분리 후, 배지를 이용해 적절한 밀도로 세포들을 배양용기에 심어 배양한다. 24시간 배양 후 배양 용기에 부착되지 않은 세포들만을 새로운 배양용기에 옮겨서 배양을 계속한다. 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는지를 역상현미경을 이용해 관찰하고, 적정 밀도에 도달하면 새로운 배지와 배양 용기를 이용해 계대 배양을 한다. 상기한 바와 같이 배양하여 얻어진 세포들을 세척하고 배지에 현탁하여 이후의 단계에서 생체적합성 고분자와 혼합될 수 있도록 준비한다.After biopsy of the lower limb muscles of the white paper, the muscle tissue is finely crushed and treated with 0.4% collagenase solution to separate the cell suspension, washed, centrifuged, and cultured to cells at appropriate density using a medium. Incubate in culture. After 24 hours of incubation, only cells not attached to the culture vessel are transferred to a new culture vessel to continue the culture. Observation of the proliferation of cells in a single layer using an inverted microscope is performed, and passages are carried out using fresh medium and culture vessel when the proper density is reached. The cells obtained by culturing as described above are washed, suspended in medium and prepared to be mixed with the biocompatible polymer in a later step.

그리고, 생착율을 높이기 위한 고분자 지지체인 상기 생체적합성 고분자는 혈액친화성, 생분해성, 항응고성, 점성, 세포 기질 형성능 등의 특성을 지녀야 한다.In addition, the biocompatible polymer, which is a polymer support for increasing engraftment rate, should have characteristics such as blood affinity, biodegradability, anticoagulability, viscosity, and cell substrate formation ability.

상기 생체적합성 고분자는 생분해성 또는 세포점착성 중에서 선택된 하나 이상의 특성을 포함한다.The biocompatible polymer includes one or more properties selected from biodegradable or cell adhesive.

그 중 생분해성 고분자를 선택하기 위하여는 고분자 주쇄에 가수분해 가능한 결합과 수용성인 분해효소가 접근을 쉽게 할 수 있도록 친수성의 세그먼트(segment)가 있어야 좋다. 많은 단백질 분해효소에서 보면 치환된 장소의 이웃을 특정하게 분해시키는 경향이 있으므로 하이드록실(hydroxyl), 카르복실(carboxyl), 메틸(methyl), 그리고 페닐(phenyl)기 등의 치환된 형태가 유리하다. 특정한 카이럴 이성질체만 분해하는 경향이 많으므로 분해되는 쪽 이성체가 많아야 좋다. 분해효소의 접근을 쉽게 하기 위하여 비정형 고분자가 유리하고, 가교가 되어 있거나 가지가 있는 구조보다는 선형의 고분자로 반복단위가 약간 긴 쪽이 유리하다. 방향족 사슬 보다는 지방족 사슬이 유연성이 좋아 분해성이 더 좋다. Among them, in order to select a biodegradable polymer, it is necessary to have a hydrophilic segment so that a hydrolyzable bond and a water soluble degrading enzyme can easily access the polymer backbone. In many proteases, there is a tendency to specifically decompose the neighbors of the substituted sites, so substituted forms of hydroxyl, carboxyl, methyl, and phenyl groups are advantageous. . Many chiral isomers tend to decompose only, so more isomers are decomposed. In order to facilitate the access of the degrading enzymes, amorphous polymers are advantageous, and linear polymers are slightly longer than linearly crosslinked or branched structures. Aliphatic chains are more flexible than aromatic chains and thus more degradable.

그리고, 세포 점착성 단백질과 폴리펩타이드와의 상호작용에 의해 생체적합성 고분자가 흡착되지 않은 표면보다는 흡착된 표면에서의 세포의 점착과 성장이 우수하다. In addition, due to the interaction between the cell-adhesive protein and the polypeptide, the cell adhesion and growth on the adsorbed surface are superior to those on which the biocompatible polymer is not adsorbed.

이러한 상기 생체적합성 고분자는 음이온성, 비이온성 또는 음이온과 양이온을 동시에 가지고 있는 폴리사카라이드류 및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜계 공중합체 및 그의 유도체, 폴리아크릴레이트, 지방족 폴리에스테르계 고분자 및 그의 유도체, 아카시아 검(gum)등의 천연 또는 합성 검, 또는 폴리비닐계 고분자 및 그의 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.Such biocompatible polymers are anionic, nonionic or polysaccharides having both anions and cations simultaneously, derivatives thereof, polyethylene glycol copolymers and derivatives thereof, polyacrylates, aliphatic polyester polymers and derivatives thereof, acacia gum natural or synthetic gums, such as (gum), or polyvinyl polymers and derivatives thereof.

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 피브린, 알긴산, 덱스트란, 메틸셀룰로오즈, 콜라겐, 젤라틴, 폴록사머, 플루론산, 카보폴, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락트산 및 그 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.      The biocompatible polymer includes one or more components selected from hyaluronic acid, fibrin, alginic acid, dextran, methylcellulose, collagen, gelatin, poloxamer, pluronic acid, carbopol, polyvinylpyrrolidone, polylactic acid and derivatives thereof. .

그리고, 상기 생체적합성 고분자는 리포좀(liposome), 고분자 마이셀(polymeric micelle), 나노 스피어(nanosphere), 또는 마이크로스피어(microsphere) 등의 형태로 사용되어 질 수 있다. The biocompatible polymer may be used in the form of liposomes, polymeric micelles, nanospheres, or microspheres.

일반적으로 콜로이드 시스템은 약물전달체계(drug delivery system)에서 약물의 전달수단으로 혹은 난용성 약물의 수용화 기법으로 많이 사용되어 지고 있는 기술로서 이러한 기술에는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 마이셀, 고분자 마이셀, 나노스피어, 마이크로 스피어, 리포좀과 같은 형태의 기법을 사용한다.In general, colloidal systems are widely used as drug delivery means or drug-accepting techniques in drug delivery systems. Such techniques include emulsions, microemulsions, micelles, polymer micelles, and nanospheres. Use techniques such as microspheres and liposomes.

상기 리포좀은 구조적으로 활성물질을 봉입(encapsulation)할 수 있으며 구형의 인지질로 구성되어 진다. 상기 리포좀은 지질이중층과 유사한 구조를 가지고 있고, 세포성분을 내부에 함유하며 안정화시켜 세포막에 리포좀이 붙은 후 내부의 세포성분을 심근세포내로 유입시키게 된다. The liposome can structurally encapsulate the active substance and consist of spherical phospholipids. The liposomes have a structure similar to the lipid bilayer, and contain cellular components and stabilize the cells to attach liposomes to cell membranes, and then introduce cellular components into cardiomyocytes.

상기 고분자 마이셀은 약물 및 유전자 운송을 위한 나노운송자로써 재조합되거나 분해될 수 있는 역동적 회합을 하며 내부의 세포성분을 심근세포내로 유입한다.The polymer micelle is a dynamic association that can be recombined or degraded as a nano-carrier for drug and gene transport and introduces the cellular components inside the cardiomyocytes.

상기 나노 스피어는 아주 미세한 굴곡 구조를 띄게 되며 신축성을 가지며 내부의 세포성분을 심근세포내로 유입시킨다.The nano spheres have a very fine curved structure, have elasticity, and introduce internal cellular components into cardiomyocytes.

상기 마이크로스피어는 약품방출을 조절할 수 있는 균일한 구형의 형태로 내부의 세포성분을 심근세포내로 유입시키는 작용을 한다.The microspheres act to introduce cellular components into the cardiomyocytes in a uniform spherical form that can control drug release.

또한, 본 발명의 생체적합성 고분자 물질을 함유하는 심근조직 재생용 조성물은 심근부위에 이식되는 1ml 당 1 x 105 ~ 1 x 109 개(단위 세포)의 근육세포로부터 분리, 배양된 세포성분과 0.01 ~ 70 중량부의 생체적합성 고분자를 포함하는 것 을 특징으로 한다. In addition, the composition for myocardial tissue regeneration containing the biocompatible polymer material of the present invention is separated from and cultured from 1 x 10 5 ~ 1 x 10 9 (unit cells) muscle cells per 1ml implanted in the myocardial region and Characterized in that it comprises 0.01 to 70 parts by weight of the biocompatible polymer.

상기 생체적합성 고분자의 농도가 상기 단위 세포의 세포성분에 대해 0.01 중량부 미만일 때에는 착화가 어렵고, 70 중량부를 초과할 때에는 점도 증가와 물리적인 차단에 의해 상기 세포성분의 방출이 어렵다.When the concentration of the biocompatible polymer is less than 0.01 part by weight relative to the cell component of the unit cell, complexing is difficult, and when it exceeds 70 parts by weight, the release of the cell component is difficult due to the increase in viscosity and physical blockage.

상기 세포성분은 성체줄기세포로부터 분리된 근모세포(myoblasts), 심근세포(cardiomyocytes), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 심혈관 형성을 유도하는 줄기세포이다.The cellular component is myoblasts, cardiomyocytes, endothelial cells, fibroblasts, or stem cells that induce cardiovascular formation isolated from adult stem cells.

상기 생체적합성 고분자는 음이온성, 비이온성 또는 음이온과 양이온을 동시에 가지고 있는 폴리사카라이드류 및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜계 공중합체 및 그의 유도체, 폴리아크릴레이트, 지방족 폴리에스테르계 고분자 및 그의 유도체, 아카시아 검(gum)등의 천연 또는 합성 검, 또는 폴리비닐계 고분자 및 그의 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.The biocompatible polymer is an anionic, nonionic or polysaccharide having both anions and cations simultaneously, derivatives thereof, polyethylene glycol copolymers and derivatives thereof, polyacrylates, aliphatic polyester polymers and derivatives thereof, acacia gum ( natural or synthetic gums such as gum), or polyvinyl-based polymers and derivatives thereof.

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 피브린, 알긴산, 덱스트란, 메틸셀룰로오즈, 콜라겐, 폴록사머, 젤라틴, 플루론산, 카보폴, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락트산 및 그 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.The biocompatible polymer includes one or more components selected from hyaluronic acid, fibrin, alginic acid, dextran, methylcellulose, collagen, poloxamer, gelatin, pluronic acid, carbopol, polyvinylpyrrolidone, polylactic acid and derivatives thereof. .

상기 히알루론산은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 10 중량부인 것을 특징으로 한다. 상기 히알루론산의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 1 중량부 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화가 되기 어렵고, 10 중량부를 초과할 때에는 수분의 함유량이 많아 상기 심근부위에 착화되기 어렵다. The hyaluronic acid is characterized in that the concentration of 1 to 10 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of hyaluronic acid is less than 1 part by weight with respect to the cell component of the unit cell, it is difficult to be complexed to the myocardial region, and when the concentration of the hyaluronic acid exceeds 10 parts by weight, it is difficult to complex to the myocardial region.

상기 피브린은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 50㎕ ~ 500㎕/ml인 것 을 특징으로 한다. 상기 피브린의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 50㎕/ml 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 500㎕/ml를 초과할 때에는 상기 세포성분이 상기 피브린으로부터 방출되기 어렵다.The fibrin is characterized in that the concentration of 50㎛ ~ 500㎛ / ml when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of the fibrin is less than 50 µl / ml relative to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when the concentration of the fibrin exceeds 500 µl / ml, the cellular component is difficult to be released from the fibrin.

상기 폴록사머는 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 5 ~ 45 중량부인 것을 특징으로 한다. 상기 폴록사머의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 5 중량부 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 45 중량부를 초과할 때에는 미끈거려 상기 심근부위에 착화되기 어렵다(도 1). 도 1과 같이 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)이 최대인 최적의 상기 폴록사머 농도는 10 중량부 정도인 것으로 나타나고, 10 중량부 전후로 좌심실 구출율이 감소하는 것으로 나타난다.The poloxamer is characterized in that the concentration of 5 to 45 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of the poloxamer is less than 5 parts by weight relative to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when it exceeds 45 parts by weight, it is hard to complex to the myocardial region (Fig. 1). As shown in FIG. 1, the optimal poloxamer concentration having a maximum left ventricular ejection fraction (LVEF) is about 10 parts by weight, and the left ventricular ejection rate decreases around 10 parts by weight.

상기 젤라틴은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 20 중량부인 것을 특징으로 한다. 상기 젤라틴의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 1 중량부 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 20 중량부를 초과할 때에는 점도가 커 상기 세포성분이 방출되기 어렵다(도 2). 도 2와 같이 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)이 최대인 최적의 상기 젤라틴 농도는 10 중량부 정도인 것으로 나타나고, 10 중량부 전후로 좌심실 구출율이 감소하는 것으로 나타난다.The gelatin is characterized in that the concentration of 1 to 20 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of the gelatin is less than 1 part by weight relative to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when the concentration of the gelatin exceeds 20 parts by weight, the cell component is difficult to be released (FIG. 2). As shown in FIG. 2, the optimal gelatin concentration with the highest left ventricular ejection fraction (LVEF) is about 10 parts by weight, and the left ventricular ejection rate decreases around 10 parts by weight.

또한, 상기 폴록사머와 상기 젤라틴의 혼합조성물을 단위 세포의 세포성분과 혼합하여 사용한다. 상기 5% 폴록사머와 상기 5% 젤라틴의 혼합조성물 중 폴록사머의 중량분율은 1 ~ 99 중량%인 것을 특징으로 한다. 상기 폴록사머의 중량분율의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 1 중량% 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 99 중량%를 초과할 때에는 점도가 커 상기 세포성분이 방출되기 어렵다(도 3). 도 3과 같이 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)이 최대인 최적의 상기 폴록사머의 중량분율은 50 중량% 정도인 것으로 나타나고, 50 중량% 전후로 좌심실 구출율이 미미하게 감소하는 것으로 나타난다. 즉, 상기 폴록사머와 상기 젤라틴을 동일한 농도로 함유할 때, 같은 중량 비율에서 최대의 좌심실 구출율이 나타난다.In addition, the mixed composition of the poloxamer and the gelatin is used by mixing with the cell components of the unit cell. The weight fraction of poloxamer in the mixed composition of the 5% poloxamer and the 5% gelatin is characterized in that 1 to 99% by weight. When the concentration of the weight fraction of the poloxamer is less than 1% by weight relative to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when it exceeds 99% by weight, the cell component is hard to be released (FIG. 3). . As shown in FIG. 3, the weight fraction of the optimal poloxamer having a maximum left ventricular ejection fraction (LVEF) is about 50 wt%, and the left ventricular ejection rate is slightly decreased around 50 wt%. In other words, when the poloxamer and the gelatin are contained in the same concentration, the maximum left ventricular rescue rate appears at the same weight ratio.

상기 카보폴은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 0.05 ~ 5 중량부인 것을 특징으로 한다. 상기 카보폴의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 0.05 중량부 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 5 중량부를 초과할 때에는 점도가 커 상기 세포성분이 방출되기 어렵다.Carbopol is characterized in that the concentration of 0.05 to 5 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of the carbopol is less than 0.05 parts by weight relative to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when the carbopol concentration exceeds 5 parts by weight, the cell component is difficult to be released.

상기 폴리비닐피롤리돈은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 45 중량부인 것을 특징으로 한다. 상기 폴리비닐피놀리돈의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 1 중량부 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 45 중량부를 초과할 때에는 수분 증가에 의해 착화되기 어렵다. The polyvinylpyrrolidone is characterized in that the concentration of 1 to 45 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of the polyvinylpinolidon is less than 1 part by weight relative to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when it exceeds 45 parts by weight, it is difficult to complex by the increase of water.

상기 덱스트란은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 15 중량부인 것을 특징으로 한다. 상기 덱스트란의 농도가 단위 세포의 세포성분에 대해 1 중량부 미만일 때에는 상기 심근부위에 착화되기 어렵고, 15 중량부를 초과할 때에는 점도가 높아 상기 세포성분이 방출되기 어렵다.The dextran is characterized in that the concentration of 1 to 15 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. When the concentration of dextran is less than 1 part by weight with respect to the cell component of the unit cell, it is difficult to complex to the myocardial region, and when the concentration of the dextran is greater than 15 parts by weight, the cellular component is difficult to be released.

또한, 본 발명의 심근조직 재생 치료방법은 심근부위에 상기 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물을 주사, 주입, 카테터를 이용한 투여 또는 캡슐 투여하는 것을 포함한다. 외과적으로 개흉하지 않고, 패취를 사용하는 것도 아니어서 환자의 고통이 감소된다. In addition, the method for treating myocardial tissue regeneration of the present invention includes injection, infusion, administration using a catheter or capsule administration of a composition for myocardial tissue regeneration containing the biocompatible polymer in the myocardium. The patient's pain is reduced because there is no surgical opening and no patch is used.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제 및 그 조성물은 생체적합성 고분자와 근모세포의 혼합형태로 심근내 이식되어 생착율이 높아지고 심장기능이 월등히 향상된다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 심장근육 재생 치료방법은 기존의 카테터를 이용하여 간단한 시술 방법으로 심근내막에 이식할 수 있기 때문에, 종래의 외과적 개흉시술을 이용한 치료방법에 비해 환자의 고통이 덜하며, 소요되는 시간과 비용을 감소시키는 장점이 있다.As described above, the therapeutic agent for myocardial tissue regeneration containing the biocompatible polymer and the composition according to the present invention is implanted in the myocardium in a mixed form of the biocompatible polymer and myoblasts to increase the engraftment rate and significantly improve the cardiac function. In addition, since the method for treating cardiac muscle regeneration using the composition of the present invention can be implanted into the myocardial endocardium by a simple procedure using a conventional catheter, the patient suffers less than the conventional method using a surgical thoracotomy. And it has the advantage of reducing the time and cost required.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1 One

실험용 쥐를 마취시키고 인공호흡기로 호흡을 유지시킨 후, 왼쪽 갈비뼈 두번째와 세번째 사이를 개흉술하였다. 심막을 잘라서 흉곽의 압력에 의해 심장이 외부로 나오게 한 후 좌측 관상 동맥(left coronary artery)을 실크로 묶어 결찰하고 심장을 원위치에 놓은 후 가슴을 봉합하여 심근경색을 유도하였다. The rats were anesthetized and breathed with a ventilator, and thoracotomy between the second and third left ribs. After the pericardium was cut out and the heart was pushed out by the pressure of the rib cage, the left coronary artery was ligated with silk, and the heart was returned to its original position.

근모세포의 분리 및 증식은 다음과 같이 하였다.Isolation and proliferation of myoblasts were performed as follows.

백서의 하지 근육을 생검하여 세척 후, 잘게 근육조직을 분쇄하고 0.4% 교원질 분해효소(collagenase) 용액으로 처리하여 세포 현탁액을 분리해내고 세척, 원심분리 후, 배지를 이용해 적절한 밀도로 세포들을 배양용기에 심어 배양하였다. 24시간 배양 후 배양 용기에 부착되지 않은 세포들만을 새로운 배양용기에 옮겨서 배양을 계속하였다. 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는지를 역상현미경을 이용해 관찰하고, 적정 밀도에 도달하면 새로운 배지와 배양 용기를 이용해 계대 배양을 하였다. 상기한 바와 같이 배양하여 얻어진 세포들을 세척하고 배지에 현탁하여 이후의 단계에서 생체적합성 고분자와 혼합될 수 있도록 준비하였다.After biopsy of the lower limb muscles of the white paper, the muscle tissue is finely crushed and treated with 0.4% collagenase solution to separate the cell suspension, washed, centrifuged, and cultured to cells at appropriate density using a medium. It was planted in and incubated. After 24 hours of incubation, only cells not attached to the culture vessel were transferred to a new culture vessel to continue the culture. Observation of the proliferation of cells in a single layer was performed using an inverted microscope, and passaged using a fresh medium and a culture vessel when the proper density was reached. Cells obtained by culturing as described above were washed and suspended in media to prepare for mixing with biocompatible polymers in subsequent steps.

2주 후 심초음파 기기를 이용하여 심장근육의 기능 이상을 확인한 후, 1 X 106 개의 근모세포와 3 중량부 폴리사카리드류 히아루론산을 혼합하여 허혈성 좌심실부위에 주입하고 5주 후, 심초음파기로 좌심실의 흉골 가까이에 있는 장축상, 단축상을 보여 주는 2차원 모드 (2-dimensional mode)로 이미지화 하여 좌심실 단축율(fractional shortening, FS) 및 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)을 측정, 기록하였다. After 2 weeks, the cardiac muscle function was confirmed by using an echocardiogram, and then 1 X 10 6 myoblasts and 3 parts by weight of polysaccharides hyaluronic acid were mixed and injected into the ischemic left ventricular region. Image in 2-dimensional mode showing the long axis and short axis near the sternum of the left ventricle to measure fractional shortening (FS) and left ventricular ejection fraction (LVEF) Recorded.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 45±3.8이고, 좌심실 구출율은 76±2.4로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)과 매우 유사한 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 1의 좌심실 단축율은 173.1이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 1의 좌심실 구출율은 143.4로 매우 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1, the left ventricular shortening rate was 45 ± 3.8, and the left ventricular ejection rate was 76 ± 2.4, which was very similar to normal (left ventricular shortening rate was 46 ± 2.3, and the left ventricular ejection rate was 84 ± 3.1) (FIG. 4). ). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 1 is 173.1, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricle rescue rate of Example 1 was 143.4, very good results were obtained (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상에 매우 가까워 상기 근모세포와 상기 히아루론산을 함께 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 매우 향상시키는 것을 알 수 있었다(도 6). In the gross findings, the color and shape were very close to normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the hyaluronic acid were found to greatly improve the heart function (FIG. 6).

실시예Example 2 2

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 4 중량부의 콜라겐을 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.After 2 weeks after inducing myocardial infarction and injecting 1 X 10 6 myoblasts and 4 parts by weight of collagen into the ischemic left ventricular site, the left ventricular shortening rate and left ventricular ejection rate were measured as in Example 1 after 5 weeks. It was.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 40±3.4이고, 좌심실 구출율은 69±2.5로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)보다 조금 낮은 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 2의 좌심실 단축율은 153.8이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 2의 좌심실 구출율은 130.2로 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1, the left ventricular shortening rate was 40 ± 3.4, and the left ventricular ejection rate was 69 ± 2.5, which was slightly lower than normal (left ventricular shortening rate was 46 ± 2.3, and the left ventricular ejection rate was 84 ± 3.1) (FIG. 4). ). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 2 is 153.8, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricular ejection rate of Example 2 was 130.2 obtained excellent results (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 유사하여 상기 근모세포와 상기 콜라겐을 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were similar to those of the normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the collagen were shown to improve the heart function (FIG. 6).

실시예Example 3 3

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 2 중량부의 폴리에틸렌글리콜계 공중합체인 플루로닉을 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.After 2 weeks of induction of myocardial infarction and injecting 1 × 10 6 myoblasts and 2 parts by weight of Pluronic, which is a polyethylene glycol copolymer, into the ischemic left ventricular region, the left ventricular shortening was performed as in Example 1 Rate and left ventricular rescue rate were measured.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 43±1.1이고, 좌심실 구출율은 74±3.3로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)보다 조금 낮지만 실시예 2보다 좋은 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 3의 좌심실 단축율은 165.4이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 3의 좌심실 구출율은 139.6으로 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1 below, the left ventricular shortening rate is 43 ± 1.1, and the left ventricular ejection rate is 74 ± 3.3, which is slightly lower than normal (left ventricular shortening rate is 46 ± 2.3, and the left ventricular ejection rate is 84 ± 3.1) but better than Example 2. The result was obtained (FIG. 4). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 3 is 165.4, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricle rescue rate of Example 3 was 139.6 to obtain excellent results (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 유사하여 상기 근모세포와 상기 플루로닉을 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were similar to those of the normal one, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the pluronic acid were shown to improve heart function (FIG. 6).

실시예Example 4 4

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 4 중량부 의 폴리락티드를 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.Induced myocardial infarction as in Example 1, 2 weeks after injection of 1 X 10 6 myoblasts and 4 parts by weight of polylactide in the ischemic left ventricular region, and after 5 weeks of suture, left ventricular shortening rate, left ventricular rescue as in Example 1 The rate was measured.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 42±1.8이고, 좌심실 구출율은 67±3.1로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)보다 조금 낮고 실시예 2와 유사한 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 4의 좌심실 단축율은 161.5이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 4의 좌심실 구출율은 126.4로 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1, the left ventricular shortening rate is 42 ± 1.8, the left ventricular ejection rate is 67 ± 3.1, which is slightly lower than normal (left ventricular shortening rate is 46 ± 2.3, the left ventricular ejection rate is 84 ± 3.1) and is similar to that of Example 2. Was obtained (FIG. 4). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 4 is 161.5, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricular rescue rate of Example 4 was 126.4 obtained excellent results (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 유사하여 상기 근모세포와 상기 폴리락티드를 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were similar to those of the normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the polylactide were shown to improve heart function (FIG. 6).

실시예Example 5 5

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 5 중량부의 덱스트란을 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.After 2 weeks after inducing myocardial infarction and injecting 1 × 10 6 myoblasts and 5 parts by weight of dextran into the ischemic left ventricular site, and after 5 weeks of suture, left ventricular shortening rate and left ventricular ejection rate were Measured.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 40±6.0이고, 좌심실 구출율은 75±4.2로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)보다 조금 낮고 실시예 2와 유사한 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 5의 좌심 실 단축율은 153.8이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 5의 좌심실 구출율은 141.5로 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1 below, the left ventricular shortening rate is 40 ± 6.0, the left ventricular ejection rate is 75 ± 4.2, which is slightly lower than normal (left ventricular shortening rate is 46 ± 2.3, and the left ventricular ejection rate is 84 ± 3.1) and is similar to that of Example 2. Was obtained (FIG. 4). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 5 is 153.8, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 Left ventricular rescue rate of Example 5 when it was 100 was 141.5 obtained excellent results (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 유사하여 상기 근모세포와 상기 덱스트란을 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were similar to those of the normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the dextran were shown to improve heart function (FIG. 6).

실시예Example 6 6

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 2 중량부의 젤라틴을 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.After 2 weeks after inducing myocardial infarction and injecting 1 X 10 6 myoblasts and 2 parts by weight of gelatin into the ischemic left ventricular site, the left ventricular shortening rate and left ventricular ejection rate were measured as in Example 1 after 5 weeks. It was.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 40±3.8이고, 좌심실 구출율은 65±4.1로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)보다 조금 낮고 실시예 2와 유사한 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 6의 좌심실 단축율은 153.8이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 6의 좌심실 구출율은 122.6로 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1 below, the left ventricular shortening rate is 40 ± 3.8, the left ventricular ejection rate is 65 ± 4.1, which is slightly lower than normal (left ventricular shortening rate is 46 ± 2.3, and the left ventricular ejection rate is 84 ± 3.1) and is similar to that of Example 2. Was obtained (FIG. 4). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 6 is 153.8, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricular rescue rate of Example 6 was 122.6 obtained excellent results (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 유사하여 상기 근모세포와 상기 젤라틴을 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were similar to normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the gelatin were found to improve heart function (FIG. 6).

실시예Example 7 7

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 음이온과 양이온성을 동시에 가지는 천연고분자인 피브린 실란트 20 ㎕를 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.Two weeks after induction of myocardial infarction as in Example 1, 20 μl of fibrin sealant, a natural polymer having both 1 × 10 6 myoblasts, anions and cationics, was injected into the ischemic left ventricular region and then sutured. Left ventricular shortening rate and left ventricular rescue rate were also measured.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 46±1.6이고, 좌심실 구출율은 78±3.1로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)과 매우 유사한 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 7의 좌심실 단축율은 176.9이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 7의 좌심실 구출율은 147.2로 매우 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1, the left ventricular shortening rate was 46 ± 1.6, and the left ventricular ejection rate was 78 ± 3.1, which was very similar to normal (left ventricular shortening rate was 46 ± 2.3, and left ventricular ejection rate was 84 ± 3.1) (FIG. 4). ). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 7 is 176.9, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricular ejection rate of Example 7 was 147.2 was obtained very good results (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 매우 유사하여 상기 근모세포와 상기 피브린 실란트를 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 매우 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were very similar to normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the fibrin sealant were found to significantly improve heart function (FIG. 6).

제조예Production Example 1 One

Dimethyldioctadecyl-ammonium bromide(DDAB)와 콜레스테롤 각 10mM씩 클로로포름용액에 용해시킨 후 증발시키고 다시 에테르 1ml를 가한 후 다시 증발시킨 5주 후 PBS를 이용하여 현탁된 리포좀을 제조하였다Dimethyldioctadecyl-ammonium bromide (DDAB) and 10 mM each of cholesterol were dissolved in chloroform solution and evaporated. Then, 1 ml of ether was added and evaporated again. After 5 weeks, liposomes were suspended using PBS.

실시예Example 8 8

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 2주 후 1 X 106 근모세포와 제조예 1과 같이 제조된 리포좀 50 ㎕를 허혈성 좌심실부위에 주입하고 봉합한 5주 후 실시예 1과 같이 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.Exemplary induce myocardial infarction as shown in Examples 1 and 2 weeks after 1 X 10 6 left ventricular shortening rate, such as muscle cells and Production Example 1 performed after the injection of the prepared liposome 50 ㎕ ischemic left ventricular site and sutures five weeks, as in Example 1 Left ventricular rescue rate was measured.

하기 표 1에서 보면 좌심실 단축율은 46±2.5이고, 좌심실 구출율은 79±2.8로 정상(좌심실 단축율은 46±2.3이고, 좌심실 구출율은 84±3.1)과 매우 유사한 결과를 얻었다(도 4). 비교예 1(좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심실 구출율은 53±3.0)의 좌심실 단축율을 100이라 하였을 때 실시예 8의 좌심실 단축율은 176.9이고, 비교예 1의 좌심실 구축율을 100이라 하였을 때 실시예 8의 좌심실 구출율은 149.1로 매우 우수한 결과를 얻었다(도 5).In Table 1, the left ventricular shortening rate was 46 ± 2.5, and the left ventricular ejection rate was 79 ± 2.8, which was very similar to normal (left ventricular shortening rate was 46 ± 2.3, and the left ventricular ejection rate was 84 ± 3.1) (FIG. 4). ). When the left ventricular shortening rate of Comparative Example 1 (left ventricular shortening rate is 26 ± 1.3, left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0) is 100, the left ventricular shortening rate of Example 8 is 176.9, and the left ventricular contraction rate of Comparative Example 1 is 100 When the left ventricular rescue rate of Example 8 was 149.1, very good results were obtained (Fig. 5).

육안소견에서는 색과 형상이 정상과 매우 유사하여 상기 근모세포와 상기 제조된 리포좀을 혼합한 치료제와 조성물은 심장기능을 매우 향상시키는 것으로 나타났다(도 6).In the gross findings, the color and shape were very similar to normal, and the therapeutic agent and the composition mixed with the myoblasts and the prepared liposomes were found to greatly improve heart function (FIG. 6).

비교예Comparative example 1 One

실시예 1과 같이 심근경색을 유도하고 6주 후 좌심실 단축율, 좌심실 구출율을 측정하였다.Myocardial infarction was induced as in Example 1, and left ventricular shortening rate and left ventricular rescue rate were measured 6 weeks later.

하기 표 1에서 보면 환자인 비교예 1의 좌심실 단축율은 26±1.3이고, 좌심 실 구출율은 53±3.0이다(도 4). 적출된 심장 조직의 육안 소견에서는 심근경색이 유도된 손상된 심장근육은 정상 심장근육에 비해 색이 하얀색으로 허혈에 의한 심근 손상이 관찰되었으며, 실제 일부 심근이 손상되었을 때 발생하는 심근의 보상기전에 의해 심장이 정상보다 비대해져 있음을 알 수 있었다(도 6).In the following Table 1, the left ventricular shortening rate of the patient in Comparative Example 1 is 26 ± 1.3, and the left ventricular ejection rate is 53 ± 3.0 (FIG. 4). The gross findings of the extracted cardiac tissue showed that the myocardial infarction-induced damaged heart muscle was whiter than myocardial heart muscle, and myocardial damage was observed due to ischemia. It can be seen that the heart is larger than normal (FIG. 6).

표 1은 본 발명의 조성물에 의해 손상된 심근부위에 주입하고 5주 후 심초음파기를 이용하여 좌심실 단축율(fractional shortening, FS)과 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)을 측정한 표이다.Table 1 is a table measuring left ventricular shortening (FS) and left ventricular ejection fraction (LVEF) by using echocardiography after 5 weeks after injection into the myocardial region damaged by the composition of the present invention.

*FS (%)± **SD* FS (%) ± ** SD ***LVEF(%)± SD*** LVEF (%) ± SD 정 상normal 46± 2.346 ± 2.3 84± 3.184 ± 3.1 비교예1Comparative Example 1 26± 1.326 ± 1.3 53± 3.053 ± 3.0 실시예1Example 1 45± 3.845 ± 3.8 76± 2.476 ± 2.4 실시예2Example 2 40± 3.440 ± 3.4 69± 2.569 ± 2.5 실시예3Example 3 43± 1.143 ± 1.1 74± 3.374 ± 3.3 실시예4Example 4 42± 1.842 ± 1.8 67± 3.167 ± 3.1 실시예5Example 5 40± 6.040 ± 6.0 75± 4.275 ± 4.2 실시예6Example 6 40± 3.840 ± 3.8 65± 4.165 ± 4.1 실시예7Example 7 46± 1.646 ± 1.6 78± 3.178 ± 3.1 실시예8Example 8 46± 2.546 ± 2.5 79± 2.879 ± 2.8

* FS : Fractional Shortening(좌심실 단축률)* FS: Fractional Shortening

** SD : Standard Deviation(표준편차)** SD: Standard Deviation

***LVEF : Left Ventricular Ejection Fraction(좌심실 구출률) *** LVEF: Left Ventricular Ejection Fraction

실험예 세포독성실험 Experimental Example Cytotoxicity Test

백서의 하지 근육으로부터 생검한 근육조직을 0.4% 교원질 분해효소(collagenase) 용액으로 처리하여 세포 현탁액을 분리해내고 세척, 원심분리 후, 배지를 이용해 적절한 밀도로 세포들을 배양용기에 심어 배양하였다. 24시간 배양 후 배양 용기에 부착되지 않은 세포들만을 새로운 배양용기에 옮겨서 배양을 계속하였다. 적정 밀도에 도달하면 새로운 배지와 배양 용기를 이용해 계대 배양을 하였다. 상기한 바와 같이 배양하여 얻어진 세포들을 세척하고 배지에 현탁하여 이후의 단계에서 생체적합성 고분자와 혼합될 수 있도록 준비하였다.Biopsied muscle tissue from the lower extremity muscle of the white paper was treated with 0.4% collagenase solution to separate the cell suspension, washed, centrifuged, and cultured by incubating the cells in a culture vessel at an appropriate density using a medium. After 24 hours of incubation, only cells not attached to the culture vessel were transferred to a new culture vessel to continue the culture. When the proper density was reached, subculture was performed using fresh medium and culture vessel. Cells obtained by culturing as described above were washed and suspended in media to prepare for mixing with biocompatible polymers in subsequent steps.

2.5x104세포/ml를 함유하는 현탁액을 64웰(well)로 옮겨 배양하였다. 선택된 고분자 생체재료를 함유하는 근모세포액을 각 웰에 이동시키고 배양액 200ml를 첨가하여 4일간 인큐베이트에 두었다. 생체재료에 기인하는 세포독성을 알아보기 위해 각각 MTT 용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazlium bromide)을 첨가하고 추가로 4일간 배양하였고, 550nm에서 ELIZA 분석기를 이용하여 흡광도를 측정하였다(도 7).The suspension containing 2.5 × 10 4 cells / ml was transferred to 64 wells and incubated. Myoblasts containing the selected polymeric biomaterials were transferred to each well and incubated for 4 days with the addition of 200 ml of culture. MTT solution (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazlium bromide) was added to incubate for additional 4 days to examine the cytotoxicity caused by biomaterials. Absorbance was measured using an analyzer (FIG. 7).

순수한 근모세포의 흡광도는 0.83이고, 폴리비닐피롤리돈을 함유한 근모세포의 흡광도는 0.88, 젤라틴을 함유한 근모세포의 흡광도는 0.82, 폴록사머를 함유한 근모세포의 흡광도는 0.82로서, 순수한 근모세포와 비교하여 세포 독성이 없거나 매우 적음을 알 수 있었다. The absorbance of pure myoblasts was 0.83, the absorbance of myoblasts containing polyvinylpyrrolidone was 0.88, the absorbance of myoblasts containing gelatin was 0.82, and the absorbance of myoblasts containing poloxamer was 0.82. It was found that there was no or very low cytotoxicity compared to the parental cells.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.The above description is merely illustrative of the technical idea of the present invention, and those skilled in the art to which the present invention pertains may make various modifications and changes without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the embodiments disclosed in the present invention are not intended to limit the technical idea of the present invention but to describe the present invention, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. The protection scope of the present invention should be interpreted by the following claims, and all technical ideas within the equivalent scope should be interpreted as being included in the scope of the present invention.

도 1은 본 발명의 조성물에 의해 사용되어지는 폴록사머의 농도에 따른 좌심실구출율을 측정한 그래프이다.1 is a graph measuring left ventricular ejection rate according to the concentration of poloxamer used by the composition of the present invention.

도 2는 본 발명의 조성물에 의해 사용되어지는 젤라틴의 농도에 따른 좌심실구출율을 측정한 그래프이다.Figure 2 is a graph measuring the left ventricular ejection rate according to the concentration of gelatin used by the composition of the present invention.

도 3은 본 발명의 조성물에 의해 사용되어지는 폴록사머/젤라틴 혼합조성물중 폴록사머가 차지하는 중량분율에 따른 좌심실구출율을 측정한 그래프이다.3 is a graph measuring left ventricular ejection rate according to the weight fraction of poloxamer in the poloxamer / gelatin mixture composition used by the composition of the present invention.

도 4는 본 발명의 조성물에 의해 치유된 심장기능을 좌심실 단축율(fractional shortening, FS) 및 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)을 나타내는 그래프이다.4 is a graph showing left ventricular shortening (FS) and left ventricular ejection fraction (LVEF) of cardiac function healed by the composition of the present invention.

도 5는 본 발명의 조성물에 의해 심근경색(myocardial infaction, MI) 모델을 치유한 후 심근경색 모델 대비 향상된 좌심실 단축율(fractional shortening, FS) 및 좌심실 구출율(left ventricular ejection fraction, LVEF)을 나타내는 그래프이다. (MI 모델(비교예1) =100일 때)FIG. 5 shows improved fractional shortening (FS) and left ventricular ejection fraction (LVEF) compared to myocardial infarction model after healing myocardial infaction (MI) model by the composition of the present invention. It is a graph. (When MI model (Comparative Example 1) = 100)

도 6은 본 발명의 조성물을 이용하여 실험 쥐의 손상된 심근부위에 주입하고 5주 후 심장조직 상태를 보여주는 사진이다.Figure 6 is a photograph showing the state of the heart tissue 5 weeks after injection into the damaged myocardial region of the experimental rat using the composition of the present invention.

도 7은 본 발명의 조성물에 의해 사용되는 폴리비닐피놀리돈, 젤라틴, 폴록사머를 사용한 경우의 세포독성을 측정한 그래프이다.Figure 7 is a graph measuring the cytotoxicity when using polyvinylpinolidon, gelatin, poloxamer used by the composition of the present invention.

Claims (18)

손상된 심근조직의 재생을 유도하기 위하여 심근부위에 이식되는, 근육세포로부터 분리, 배양된 세포성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제.A therapeutic agent for myocardial tissue regeneration comprising a biocompatible polymer comprising a cell component and a biocompatible polymer isolated and cultured from muscle cells implanted in the myocardial region to induce regeneration of damaged myocardial tissue. 제1항에 있어서, 상기 세포성분은 성체줄기세포로부터 분리된 근모세포(myoblasts), 심근세포(cardiomyocytes), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 심혈관 형성을 유도하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제.The method of claim 1, wherein the cell component is myoblasts (cardiomyocytes), endothelial cells (endothelial cells), fibroblasts, or stem cells that induce cardiovascular formation isolated from adult stem cells A therapeutic agent for myocardial tissue regeneration containing a biocompatible polymer, characterized in that the. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 생분해성 또는 세포점착성 중에서 선택된 하나 이상의 특성을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제.The therapeutic agent for myocardial tissue regeneration according to claim 1, wherein the biocompatible polymer comprises at least one of biodegradable or cell adhesive properties. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 음이온성, 비이온성 또는 음이온과 양이온을 동시에 가지고 있는 폴리사카라이드류 및 그의 유도체, 폴 리에틸렌글리콜계 공중합체 및 그의 유도체, 폴리아크릴레이트, 지방족 폴리에스테르계 고분자 및 그의 유도체, 아카시아 검(gum)등의 천연 또는 합성 검, 또는 폴리비닐계 고분자 및 그의 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제.According to claim 1 or 3, wherein the biocompatible polymer is anionic, nonionic or polysaccharides having an anion and a cation simultaneously, derivatives thereof, polyethylene glycol-based copolymers and derivatives thereof, polyacrylate, Myocardial tissue regeneration containing a biocompatible polymer comprising an aliphatic polyester-based polymer and derivatives thereof, natural or synthetic gums such as acacia gum, or polyvinyl-based polymers and derivatives thereof. For treatment. 제4항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 피브린, 알긴산, 덱스트란, 메틸셀룰로오즈, 콜라겐, 폴록사머, 젤라틴, 플루론산, 카보폴, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락트산 및 그 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제.The method of claim 4, wherein the biocompatible polymer is selected from hyaluronic acid, fibrin, alginic acid, dextran, methylcellulose, collagen, poloxamer, gelatin, pluronic acid, carbopol, polyvinylpyrrolidone, polylactic acid and derivatives thereof. A therapeutic agent for regeneration of myocardial tissue containing a biocompatible polymer comprising at least one component. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 리포좀(liposome), 고분자 마이셀(polymeric micelle), 나노 스피어(nanosphere), 또는 마이크로스피어(microsphere) 등의 형태로 사용되어 지는 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 치료제.According to claim 1 or 3, wherein the biocompatible polymer is characterized in that it is used in the form of liposome (liposome), polymeric micelle (nanosphere), microsphere (microsphere), etc. A therapeutic agent for myocardial tissue regeneration containing a biocompatible polymer. 심근부위에 이식되는 1ml 당 1 x 105 ~ 1 x 109 개(단위 세포)의 근육세포로 부터 분리, 배양된 세포성분과 0.01 ~ 70 중량부의 생체적합성 고분자를 포함하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.Isolation from 1 x 10 5 to 1 x 10 9 (unit cells) of muscle cells per ml implanted in the myocardium, containing the biocompatible polymer containing the cell components and 0.01 to 70 parts by weight of the biocompatible polymer Myocardial tissue regeneration composition. 제7항에 있어서, 상기 세포성분은 성체줄기세포로부터 분리된 근모세포(myoblasts), 심근세포(cardiomyocytes), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 심혈관 형성을 유도하는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.   The method of claim 7, wherein the cell component is myoblasts (cardiomyocytes), endothelial cells (endothelial cells), fibroblasts, or stem cells that induce cardiovascular formation isolated from adult stem cells Composition for myocardial tissue regeneration comprising a biocompatible polymer, characterized in that. 제7항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 음이온성, 비이온성 또는 음이온과 양이온을 동시에 가지고 있는 폴리사카라이드류 및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜계 공중합체 및 그의 유도체, 폴리아크릴레이트, 지방족 폴리에스테르계 고분자 및 그의 유도체, 아카시아 검(gum)등의 천연 또는 합성 검, 또는 폴리비닐계 고분자 및 그의 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.8. The method of claim 7, wherein the biocompatible polymer is an anionic, nonionic or polysaccharide having both an anion and a cation simultaneously, derivatives thereof, polyethylene glycol copolymers and derivatives thereof, polyacrylates, aliphatic polyester polymers and A composition for regenerating myocardial tissue containing a biocompatible polymer comprising a derivative thereof, a natural or synthetic gum such as acacia gum, or a polyvinyl polymer and at least one component thereof. 제9항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 피브린, 알긴산, 덱스트란, 메틸셀룰로오즈, 콜라겐, 폴록사머, 젤라틴, 플루론산, 카보폴, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리락트산 및 그 유도체 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.10. The method of claim 9, wherein the biocompatible polymer is selected from hyaluronic acid, fibrin, alginic acid, dextran, methylcellulose, collagen, poloxamer, gelatin, pluronic acid, carbopol, polyvinyl pyrrolidone, polylactic acid and derivatives thereof. A composition for myocardial tissue regeneration comprising a biocompatible polymer comprising at least one component. 제10항에 있어서, 상기 히알루론산은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 10 중량부인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition of claim 10, wherein the hyaluronic acid has a concentration of 1 to 10 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. 제10항에 있어서, 상기 피브린은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 50㎕ ~ 500㎕/ml인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition of claim 10, wherein the fibrin has a concentration of 50 μl to 500 μl / ml when mixed with the cell component of the unit cell. 제10항에 있어서, 상기 젤라틴은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 20 중량부인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition according to claim 10, wherein the gelatin has a concentration of 1 to 20 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. 제10항에 있어서, 상기 폴록사머는 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 5 ~ 45 중량부인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition according to claim 10, wherein the poloxamer has a concentration of 5 to 45 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. 제10항에 있어서, 상기 카보폴은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 0.05 ~ 5 중량부인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition of claim 10, wherein the carbopol has a concentration of 0.05 to 5 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. 제10항에 있어서, 상기 폴리비닐피롤리돈은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 45 중량부인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition according to claim 10, wherein the polyvinylpyrrolidone has a concentration of 1 to 45 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. 제10항에 있어서, 상기 덱스트란은 단위 세포의 세포성분과 혼합시 농도가 1 ~ 15 중량부인 것을 특징으로 하는 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물.The composition according to claim 10, wherein the dextran has a concentration of 1 to 15 parts by weight when mixed with the cell component of the unit cell. 심근부위에 제 7항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 상기 생체적합성 고분자를 함유하는 심근조직 재생용 조성물을 주사, 주입, 카테터를 이용한 투여 또는 캡슐 투여하는 심근조직 재생 치료방법.A myocardial tissue regeneration treatment method in which a composition for myocardial tissue regeneration containing the biocompatible polymer according to any one of claims 7 to 17 is injected, infused, administered using a catheter or capsule administered to a myocardium.
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