KR20080087822A - 신경아교종을 진단하고, 예측하고, 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 신경아교종을 모니터링하고 진단하고 예측하고 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 신경아교종의 3개의 예후 서브클래스를 제공하고, 이는 akt 및 노치 시그날 전달 경로의 활성화와 차별적으로 연관된다. 신경 또는 전신경 PN 계통 마커 (노치 경로 요소 포함)을 나타내는 종양은 보다 긴 중앙값 환자 생존을 보인 한편, 나머지 2개의 종양 마커 Prolif 및 Mes는 단축된 생존과 연관된다. 상기 방식으로 분류된 종양은 또한 항-유사분열제, 항-혈관형성제, Akt 길항제, 및 신경 분화제와 조합하여 하위분류에 대응하는 적절한 PN-, Prolif- 또는 Mes-치료제로 치료될 수 있다. 별법으로, 본 발명은 또한 PTEN 및 DLL3의 발현 수준에 기반한 2-유전자 모델을 사용하여 신경아교종을 예측하고 진단하는 방법을 제공한다.

신경아교종, 종양 마커, PN, Prolif, Mes, 진단, 시그날 전달 경로

Description

신경아교종을 진단하고, 예측하고, 치료하는 방법 {METHOD FOR DIAGNOSING, PROGNOSING AND TREATING GLIOMA}

관련 출원

본원은 2005년 12월 16일 출원된 USSN 60/750,944를 기초로 한 미국 특허법 35 U.S.C. §119(e) 하의 우선권을 주장한다.

본 발명은 암, 구체적으로 신경아교종을 진단하고 예측하고 치료하는 방법에 관한 것이다.

악성 종양 (암)은 미국에서 심장병 다음의 주요 사망 원인이다 (Boring et al., CA Cancer J. Clin. 43:7 (1993)). 암은 정상 조직에서 유래된, 증식하여 종양 덩어리를 형성하는 비정상 또는 신생물성 세포의 수의 증가, 상기 신생물성 종양 세포에 의한 인접 조직의 침습, 및 궁극적으로 혈액 또는 림프계를 통해 부위 림프절로, 및 전이로 불리는 과정을 통해 먼 부위로 전파되는 악성 세포의 생성을 특징으로 한다. 암성 상태에서, 세포는 정상 세포가 성장하지 못할 조건 하에서도 증식한다. 암은 상이한 침습력 및 공격성 정도를 특징으로 하는 매우 다양한 형태로 나타난다.

신경아교종은 원발성 뇌 종양의 가장 흔한 종류이고, 대개 심각한 예후와 연 관된다. 교모세포종 (GBM) 및 역형성 별아교세포종 (AA)을 포함하는 고등급 (high-grade) 별아교세포종은 성인에서 가장 흔한 내인성 뇌 종양이다. 고등급 별아교세포종의 분자 유전학에 대한 이해 정도는 증가하였지만 (Kitange et al., Curr. Opin. Oncol. 15: 197-203 (2003), 기원 세포 종류(들)은 여전히 불명확하고, 질병 공격성의 분자 결정자는 잘 이해되지 못하고 있다. 상기 종양의 세포 기원 및 분자 발병기전을 보다 잘 이해하게 되면, 거의 균일하게 치명적인 상기 신생물 치료를 위한 새로운 표적을 확인할 수 있을 것이다.

종양의 등급 결정 (grading)은 질병 진행의 정확한 진단 및 예측에 종종 중요하고, 신경아교종도 예외는 아니다. 수십 년간의 경험으로 조직학에 기초한 신경아교종의 진단 시스템을 완성하였다. 신경아교종은 일차적으로 별아교세포 또는 희소돌기 아교세포 형태학을 나타내는지에 기초하여 조직학적으로 정의되고, 세포충실성, 핵의 이형성 (atypia), 괴사, 유사분열상 (figure), 및 미세혈관 증식에 의해 등급 결정되고, 상기 모든 특색은 생물학적 공격 거동과 연관된다. 상기 진단 시스템은 수십 년의 신경아교종 임상 경험에 걸쳐 개발되었고, 현재 신경종양학의 초석이 되었다 [Kleihues, P. et al., World Health Organization ("WHO") classification of tumors, Cancer 88: 2887 (2000)]. 별아교세포 신경아교종의 WHO 분류 체계는 4개 등급으로 나누어진다. 보다 덜 악성인 종양은 등급 I (모양세포성 별아교세포종) 및 II (별아교세포 신경아교종)에 속하는 한편, 보다 악성인 종양은 등급 III (역형성 별아교세포종) 및 등급 IV (다형성 교모세포종)로 규정된다. 희소돌기신경아교종 및 혼합 신경아교종 (희소돌기 아교세포 및 별아교세포 성분을 모두 갖는)은 저등급 (low-grade) (WHO 등급 II) 및 보다 악성 변이체 (WHO 등급 III)에 존재한다.

최근까지, 별아교세포종 및 다른 신경아교종은 뇌 실질 내에 존재하는 아교세포로부터 발생하는 것으로 생각되었다. 그러나, 인간 및 동물 연구에서 새로운 증거는 신경아교종의 대안적인 세포성 기원으로서 신경 줄기 세포를 제안한다 (Caussinus and Gonzalez, Nat. Genet. 37: 1125 (2005); Singh et al., Cancer Res. 63: 5821-5828 (2003); Zhu et al., Cancer Cell 8: 119 (2005)). 마우스 모델은 별아교세포 또는 신경 줄기/전구 세포가 인간 신경아교종의 조직병리학적 특징을 나타내는 신생물을 생성할 수 있음을 증명한다 (Bachoo et al., Cancer Cell 1: 269-277 (2002); Uhrbom et al., Cancer Res. 62: 5551-5558 (2002)). 성인 인간 전뇌가 신경 줄기 세포를 풍부하게 함유하고 (Sanai et al., Nature 427: 740-744 (2004)), 인간 GBM이 종양 형성 신경 줄기 유사 세포를 함유한다는 (Galli et al., Cancer Res. 64: 7011-7021 (2004); Ignatova et al., GLIA 39: 193-206 (2002); Singh et al., Nature 432: 396-401 (2004)) 증명은 신경 줄기 및/또는 전구 세포가 인간 신경아교종에 대한 타당한 기원이라는 것을 나타내고, GBM의 줄기 세포-유사 성분을 표적화하는 것을 목적으로 하는 연구로부터 보다 효과적인 치료법이 생성될 것이라는 견해를 제공한다 (Berger et al., Lancet Oncol. 5: 511-514 (2004); Fomchenko and Holland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005); Ignatova et al., 상기 문헌; Oliver and Wechsler-Reya, Neuron 42: 885-888 (2004)). 그러나, 중요한 사실은, 질병 진행 또는 치료 반응에 대한 줄기 유사 세포의 기여가 아직 확립되지 않았고, 줄기 유사 특징을 나타내는 종양 세포의 비율이 얼마인지 불명료하다는 것이다.

환자 예후 및 치료 결정은 정확한 병리학적 등급 결정에 의지하여 이루어지므로, 일관성은 중요한 속성이다. 대부분 재현가능하지만, 현재의 조직학적 기반 시스템은 2가지 종류 및 등급에 관하여 신경병리학자들 사이에 실질적인 불일치를 일으킬 수 있다 (Louis, DN et al., Am J. Pathol. 159: 779-86 (2001); Prayson RA et al., J. Neurol. Sci. 175: 33-9 (2000); Coons et al., Cancer 79:1381-93 (1997)). 또한, 등급 결정의 정확한 방법은 시간에 따라 변화한다. 마지막으로, 분자 최종 상태보다는 형태학 [Burger, Brain Pathol. 12: 257-9 (2002)], 생물학적 상태에 기초하기 때문에, 상기 방안은 새로운 가능한 화합물을 확인하는 그의 능력에 있어서 제한된다.

현재, 미만성 침윤성 신경아교종의 조직학-기반 등급 결정은 환자 생존 시간의 최상의 예측자이다. 그러나, 조직학은 신경아교종의 병리학의 예증이 되지도 않고, 새로운 분자 마커 및 새로운 치료제를 개발하기 위한 그들의 용도를 확인하는 데에 도움이 되지도 않는다. 또한, 분자 마커 발현 및 치료 반응 모두에 관하여 미만성 신경아교종의 인지되지 않은 임상 관련 서브클래스의 존재에 대한 증거가 늘어나고 있다 [Mischel PS et al., Cancer Biol. Ther. 2:242-7 (2003)]. 다양한 치료 요법으로부터, 조직학상 동일한 종양에 대한 임상 반응이 크게 변할 수 있음이 또한 알려졌다 (Mischel et al., 상기 문헌; Cloughesy, TF et al., Cancer 97: 2381-6 (2003)). 이는 조직병리학적 평가가 근원적인 생물학을 규명하지 않는 방식을 강조한다. 종양학자들은 분자 표적화 치료를 지향하므로, 별개의 분자상 규정된 하위집단의 확인이 점점 중요해지고 있다. 그러나, 특이적 종양-연관 유전자가 연구되었지만, 개별 유전자/단백질 분석은 단독으로 또는 심지어 조직학적 특색과 조합으로 지금까지는 생존을 예측하거나 치료 결정을 지도하는데 도움이 되지 않았다 (Tortosa, A. et al., Cancer 97: 1063-71 (2003); Reavey-Cantwell, JF et al., J. Neurooncol 55: 195-204 (2001); Bouvier-Labit, C. et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 24:381-8 (1998); Stark, AM et al., Zentralbl Neurochir. 64: 30-6 (2003); Li, J. et al., Science 275: 1943-7 (1997)).

몇몇 연구에서는 AA 및 GBM (또한 각각 등급 III 및 IV 별아교세포종으로 알려짐)에서 예후 및 임상 서브클래스의 분자상 상호관련을 조사하였다. 종양 등급은 가장 잘 확립되어 있고, 질병 결과 (outcome)의 확고한 예측자이다 (Prados and Levin, Semin Oncol. 27: 1-10 (2000)). 염색체 (chr) 10q의 이종접합성 손실이 AA보다 GBM에서 더 빈번하게 발생하고, 짧은 GBM 생존과 연관되었다 (Balesaria et al., Br. J. Can. 81: 1371-1377 (1999); Schmidt et al., J. Neuropathol. Exp. Neural. 61: 321-328 (2002); Smith et al., J. Nat. Can. Inst. 93: 1246-1256 (2001)). 보다 고령에서의 진단은 GBM에 대한 부정적인 예후 인자이고 (Curran et al., J. Natl. Cancer Inst. 85; 704-710 (1993)), 생성되는 분자 마커는 나이 든 환자와 어린 환자에 있어서 상이하고 (Batchelor et al., Clin. Cancer Res. 10: 228-233 (2004); Smith et al., J. Natl. Cancer Inst. 93: 1246-1256 (2001)), 이는 연령-연관 분자 서브클래스의 존재를 제안한다. p53 돌연변이 및 EGFR 증폭은 상호 배타적인 GBM 하위집단을 규정하는 것으로 보고되었지만 [von Deimling et al., Glia 15, 328-338 (1995); Watanabe et al., Brain Pathology 6, 217-223 (1996)], 최근의 연구는 상기 분류 체계의 타당성에 이의를 제기하고 [Okada et al., Cancer Research 63, 413-416 (2003)], p53 돌연변이 또는 EGFR 로커스의 변경의 예후값은 불명료하다 (Heimberger et al., Clinical Cancer Research 11: 1462-1466 (2005); Ushio et al., Frontiers in Bioscience 8: e281-288 (2003)). 상기 질병을 보다 효과적으로 치료하기 위해 상기 종양의 생물학적 기초를 보다 잘 이해하는 것이 필요하다는 것이 명백하다.

마이크로어레이 분석은 수천개의 개별 유전자의 발현을 동시에 평가할 수 있기 때문에 편향되지 않은 정량적이고 재현가능한 종양 평가를 제공할 수 있는 도구로서 확인되었다. 상기 방안은 신경아교종을 포함한 많은 상이한 암에 적용되었다 (Mischel, P. S. et al., Oncogene 22: 2361-73 (2003); Kim, S. et al., Mol. Cancer Ther. 1:1229-36 (2002); Ljubimova et al., Cancer Res. 61: 5601-10 (2001); Nutt, CL et al., Cancer Res. 63: 1602-7 (2003); Rickman, D.S. et al., Cancer Res. 61: 6885-91 (2001); Sallinen, S.L. et al., Cancer Res. 60: 6617-22 (2000); Shai, R. et al., Oncogene 22: 4918-23 (2003). 조직학적 평가와는 달리, 마이크로어레이 분석은 종양에서 근원적인 유전자 변이를 확인할 수 있어서, 종양 분류와 환자 예후 예측을 향상시킨다. 신경아교종의 마이크로어레이 분석은 보다 균질한 집단으로 분류를 생성시킨다 [Freije et al., Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004)]. 또한, 이는 조직학적 등급 결정보다 뛰어난 생존의 예측인자인 것 으로 밝혀졌다 [Freije et al., 상기 문헌].

악성 신경아교종의 발현 프로파일링 (profiling)은 분자 서브타입 뿐만 아니라, 종양 등급 진행 및 환자 생존과 연관된 유전자를 확인하였다 (Godard et al., Cancer Res. 63: 6613-6625 (2003); Rickman et al., Can. Res. 61: 6885-6891 (2001); van den Boom et al., Am. J. Pathol. 163: 1033-1043 (2003). GBM 및 AA가 조직 외관에 기초하여 계속하여 규정되고 있지만, 발현 프로파일링이 조직학적 특징보다 더 우수한 결과를 예측한다는 발견 (Freije et al., 상기 문헌; Nutt et al., Clin. Can. Res. 11: 2258-2264 (2003))은 형태학에 기초하여 AA 및 GBM으로 규정된 신생물이 분자 유전자 서브타입의 혼합형을 나타낸다는 가설을 지지한다. 분자상 별개의 질병 단위 (entity)가 표적화된 항암제에 대해 상이한 임상 반응을 나타낼 수 있는 가능성을 가정하면, 종양의 분자상 규정된 서브세트의 거동에 대해 보다 많이 이해하면 보다 효과적인 치료제의 개발에 도움이 될 수 있다.

악성 신경아교종은 유전자 병소의 단계적 누적의 결과로서 발병하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 역형성 별아교세포종은 대개 (1) 대체로 p53 돌연변이에 의한, 기능성 p53 경로의 손실; (2) 대개 p16/ARF 로커스의 결실에 의한, 기능성 p16/pRb 경로의 손실; 및 (3) ras 돌연변이 이외의 수단에 의한 ras 경로 활성화; 및 (4) 정상 인간 별아교세포 (NHA) 또는 등급 II 신경아교종에서 거의 보이지 않는 텔로머라제 반응성을 보인다 (Cavenee et al., "Diffuse infiltrating astrocytomas," in Pathology and Genetics of Tumors of the Nervous System, W.K. Cavnee and P. Kleihues, Eds., pp. 9-51. Lyon:IRAC Press (2000); Ichimura et al., Cancer Res. 60: 417-424 (2000); Feldkamp et al., Neurosurgery 45: 1442-1453 (1999)). 또한, 다형성 교모세포종 (GBM)은 상기한 p53 및 p16/pRb 경로에서의 변경에 추가로 종종 Akt 경로의 활성화를 일으키는 PTEN 파괴를 포함한다 (Hass-Kogan et al., Curr. Biol. 8: 1195-1198 (2000), Holland et al., Nat. Genet. 25: 55-57 (2000)]. 하류 표적에 대한 효과를 통해, Akt는 세포 주기 억제제의 수준을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 (Datta et al., Cell 91: 231-241 (1997); Pap et al., J. Biol. Chem. 273: 19929-19932 (1998); Brunet et al., Cell 96: 857-868 (1999); Kops et al., Nature, 398: 630-634 (1999); Medema et al., Nature 404: 782-787 (2000)), 저산소 조건 하에 혈관 내피 성장 인자 수준을 증가시킨다 [Mazure et al., Blood 90: 3322-3331 (1997)]. Akt는 세포자멸을 억제하고, 세포 주기순환을 해제하고, 혈관신생 가능성을 변경시킬 수 있다. 또한, 모든 GBM 종양의 80%는 상승된 수준의 Akt를 발현하는 것으로 관찰된다. 세포 생리학 및 GBM에서 상승된 발현에 대한 Akt의 공지된 효과에 비추어, Akt의 활성화는 GBM의 발병에 강하게 관여한다 (Hass-Kogan, 상기 문헌; Holland, 상기 문헌).

종양 억제자 (suppressor) 유전자 Pten은 교모세포종을 포함한 각종 인간 암에서 종종 돌연변이되거나, 결실되거나 또는 체세포에서 불활성화되는 포스파타제를 코딩한다 [Li et al., Science 275: 1943 (1997)]. 발암에 추가로, Pten은 또한 배아에서 그의 편재하는 중추신경계 (CNS) 발현 패턴 (Gimm et al., Hum. Mol Genet. 9: 1633 (2000); Luukko et al., Mech. Dev. 83: 187 (1999))에 의해, 및 인간에서 Pten 생식세포 (germ-line) 돌연변이와 연관된 신경학적 질환에 의해 제 안되는 바와 같이 뇌 발달에서 중요한 역할을 할 수 있다. 통상적인 Pten^-/- 낙 아웃 (knock out) 마우스의 초기 배아 치사율로 인해 초기 뇌 발달에서 Pten의 기능에 대한 연구가 방해받지만 ([Di Cristofano et al., Nature Genet. 19: 348 (1998)] 및 [Stambolic et al., Cell 95: 29 (1998)]), 부모 동물에서 Cre 및 loxp 형질전환 유전자로부터 생성되는 것과 같은 프로모터 구동된 유전자 도입 낙아웃 동물은 Pten이 신경 줄기 세포 생산을 부정적으로 조절하는 것을 제안하였다 [Groszer et al., Science 294: 2186-2189 (2001)].

노치 (Notch) 시그날 전달 경로는 호지킨 질병, T-세포 림프종, 및 유방, 자궁경부, 췌장 및 결장암을 포함한 많은 암의 발암에 관여되었다 [40-44 Jundt, F. et al., Blood 99:3398-403 (2002); Pear, W.S. et al., J. Exp. Med. 183: 2283-91 (1996); Weijzen S., et al., Nat. Med. 8: 979-86 (2002); Weijzen et al., J. Cell Physiol. 194: 356-62 (2003); Miyamoto, Y., et al., Cancer Cell 3: 565-76 (2003); Nickoloff, B.J. et al., Oncogene 22: 6598-608 (2003)]. 노치 패밀리의 수용체는 세포 운명의 결정에 직접 관여되는 이종이량체 트랜스멤브레인 단백질로 이루어진다. 세포 종류에 따라, 노치 시그날 전달은 증식, 분화 및 세포자멸에 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있다 [Artavanis-Tsakonas, S. et al., Science 284: 770-6 (1992); Miele, L. et al., J. Cell Physiol. 181: 393-409 (1999)]. 지금까지, 델타 유사 1 (dll-1), 델타 유사-3 (dll-3), 델타 유사-4 (dll-4), 재기드 (jagged)-1 및 재기드-2를 포함한 5개의 상응하는 리간드를 갖는 4개의 노치 수용체가 인간에서 확인되었다 (즉, 노치 1-4). 노치 경로는 헤지호그 (hedgehog)와 같은 다른 중대한 암 경로와 상호작용하고 겹친다 ([Hallahan et al., Cancer Res. 64: 7794-7800 (2004)] 및 [Ras. Fitzgerald, K. et al., Oncogene 19: 4191-8 (2000); Ruiz-Hidalgo, R.J. et al., J. Oncol. 14: 777-83 (1999)]. 그러나, 암에서 노치의 역할은 조직 종류와 같은 인자에 따라 복잡한 것으로 나타난다. 노치-1 활성은 ras-형질전환된 인간 세포에서 암 표현형을 유지하기 위해 필요하지만 [Weijzen, S. et al., Nat. Med. 8: 979-86 (2002)], 노치-1 시그날 전달은 뮤린 피부 종양에 대해 및 비-소세포 폐암에서 종양-억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Wolfer et al., Nat. Genet. 33: 416-21 (2003); Sriuranpong, V. et al., Cancer Res. 61: 3200-5 (2001)). 상기 발견은 암에서 노치 시그날 전달에 대한 다양한 역할을 제안한다.

노치 시그날 전달은 발달하는 소뇌에서 분화를 억제하고 또한 증식을 촉진한다 [Solecki, DJ. et al., Neuron 31: 557-68 (2001)]. 또한, 노치 시그날 전달은 신경아교종과 특이적으로 연관되었다. 구체적으로, 노치 리간드 델타-유사-1 및 재기드-1 및 노치-1 수용체 발현이 신경아교종 세포주 및 인간 신경아교종 종양 모두에서 향상되고, 이들의 하향 조절은 다수의 신경아교종 세포주에서 세포자멸을 유도하고 증식을 억제하고, 동물 모델에서 생존을 연장시켰다 [Purow et al., Cancer Res. 65(6): 2353-2363 (2005)].

그러나, 종양발생에서 노치 시그날 전달의 역할은 변화할 수 있다. 예를 들어, 노치-1 활성은 수모세포종 세포의 증식을 억제하는 반면, 노치-2 활성을 성장 을 촉진하는 것이 관찰되었다 [Fan et al., Cancer Res. 64: 7787-7793 (2004)]. 노치 리간드 Dll3이 노치 불활성화와 연관되는 것이 최근에 제안되어 [Ladi et al., J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005)], 노치 시그날 전달 경로에 대해 본 발명자들이 이해하기가 더욱 어렵다. 따라서, 현재, 종양발생에서 노치의 역할에 대한 이해는 기껏해야 불충분하다.

마이크로어레이 분석에 의해 제공되는 것과 같은 유전자 발현 프로파일링은 신경아교종에서 생존의 예측이 되는 유전자 발현의 패널을 확인할 수 있지만, 지금까지 분석은 개별 유전자 발현을 생존의 효과적인 예후인자인 것을 확인하지 않았다. 예를 들어, 74명의 환자로부터 제거된 단계 III 및 IV 신경아교종 종양 조직의 마이크로어레이 분석에서, 생존과 연관된 595개의 차등 발현된 유전자를 확인하였다 [Freije et al., Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004)]. 상기 군으로부터, 44개의 가장 강하고 일관되게 차등 발현된 유전자가 확인되었다. 상기 군은 16개의 개별 유전자로 더욱 좁혀졌고, 이는 역전사-PCR에 의해 더욱 평가되었다. 추가의 모델링은 노치 리간드 DLL3의 향상된 발현을 향상된 생존과 연관된 6개의 유전자 중 하나로서 확인하였다. 그러나, 상기 연구는 마이크로어레이 분석으로부터 생성된 유전적 프로파일링의 예후 및 진단값을 증명하였지만, 임의의 개별 유전자를 예후값을 갖는 것으로 확인하지 않았다.

본 발명자들은 본원에서 신경아교종의 3개의 신규한 예후 서브클래스를 확인하고, 이들이 akt 및 노치 시그날 전달 경로의 활성화와 차별적으로 연관됨을 보인다 (Prolif, Mes). 신경 또는 전신경 (PN) 계통 (lineage) 마커 및 노치 경로 요 소 (element)를 나타내는 하나의 종양 클래스는 보다 긴 중앙값 생존을 보인다. 반대로, 증식 또는 중간엽의 마커를 특징으로 하는 나머지 2개의 종양 클래스는 보다 짧은 생존과 연관된다.

본 발명자들은 본원에서 2-유전자 모델을 또한 확인하고, PTEN 및 DLL3의 보다 많은 발현이 보다 긴 생존과 연관됨을 밝히고, 이는 종양 공격성에 대한 Akt 및 노치 시그날 전달 경로의 영향을 증명한다. 또한, 재발 시, 원래 전신경 또는 증식성 표현형으로 나타난 일부 종양은 중간엽 클래스로 이동하여, 상기 분자상 규정된 집단이 종양 진행의 대안적인 분화 상태 또는 단계를 나타낼 수 있음을 제안한다. 생존의 2 유전자 모델에서 DLL3 + PTEN의 예후값은 2개의 독립적인 데이타세트에서 통계적으로 유의한 것으로 나타났으므로, 상기 2-유전자 모델은 문헌 [Freije et al.]에 개시된 예후값과 구별된다. BMP2는 문헌 [Freije et al.]에서 DLL3과 동일한 종양의 서브클래스의 마커로서 확인된 마커이다. BMP2로 2 유전자 모델에서 DLL3을 대체하면, DLL3에서 보인 발견을 재현하지 못한다.

본 발명자들은 노치 또는 Akt 경로의 활성화 상태가 종양 공격성의 주요 결정자이고, 표적화된 치료에 대한 반응을 예측할 수 있음을 추가로 발견하기에 이르렀다.

마지막으로, 본 발명자들은 불량한 예후의 종양은 신경 줄기 세포 마커 및 Akt 경로 시그날 전달 및 혈관신생 또는 증식을 특징으로 하는 것을 확인하였다. 노치 경로 시그날 전달, 및 수임 (committed) 신경세포성 전구체의 마커는 예후가 보다 양호한 종양의 특징이다. 정상 뇌는 증식, 혈관신생, 또는 노치 및 Akt 시그 날 전달이 적지만, 신경세포성 마커의 높은 발현을 특징으로 한다. 양호한 예후의 PN 종양은 불량한 예후의 Mes 마커를 갖는 세포의 단편을 보일 수 있고, PN 종양은 Mes 표현형으로 반복될 수 있어서, 불량한 예후의 종양이 적절한 생물학적 과정, 예를 들어 Akt 시그날 전달, 혈관신생 또는 증식을 차단함으로써 보다 양호한 예후의 PN-유사 종양으로 전환될 수 있음을 제안한다. 상기 발견은 Akt 시그날 전달, 혈관신생 또는 증식을 차단하는 것은 노치 시그날 전달 또는 신경세포성 분화를 유도하는 다른 처리와 조합으로 신경아교종 종양의 성장을 느리게 할 수 있음을 제안한다.

<발명의 개요>

본 발명은 일반적으로 신경아교종을 모니터링하고, 진단하고, 예측하고 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 신경아교종의 3개의 예후 서브클래스를 제공하고, 이는 akt 및 노치 시그날 전달 경로의 활성화와 차별적으로 연관된다. 신경 또는 전신경 (PN) 계통 마커 및 노치 경로 요소를 나타내는 종양 클래스는 보다 긴 중앙값 환자 생존을 보인다. 이와 대조적으로, 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes)의 마커는 보다 짧은 생존과 연관된다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 신경아교종의 2 유전자 모델을 제공하고, 여기서 PTEN 및 DLL3 모두의 비교적 높은 발현 수준은 연장된 생존을 나타내고, PTEN의 낮은 발현 (DLL3과 무관하게)은 단축된 생존을 나타낸다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (i) 종양 샘플에서 신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 세트의 발현을 측정하고, (ii) 세트의 하위분류 전신경 (PN), 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes) 발현 시그너쳐 (signature)를 결정하는 것을 포함하고, 여기서: (I) Prolif 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 길항제 및/또는 Prolif 길항제 및/또는 항-유사분열제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (II) Mes 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 및/또는 Mes-길항제 및/또는 항-혈관형성제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (III) PN 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (1) PN-길항제 및/또는 (2) 신경 분화제와, 임의로 (3) Akt 길항제, (4) 항-유사분열제, 및 (5) Mes 길항제 및/또는 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되는 것인, 신경아교종을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, Akt 길항제는 akt1, akt2, akt3의 길항제, PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR의 조절 또는 촉매 도메인의 길항제, 및 PTEN, INPP5D 또는 INPPL1의 활성화제, 자극제 또는 회복제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 다른 특정 측면에서, Prolif-길항제는 표 A에 제시된 임의의 Prolif 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 특정 측면에서, 항-유사분열제는 테모졸라미드, BCNU, CCNU, 로무스틴, 글리아델, 에토포시드, 카르무스틴, 이로노테칸, 토포테칸, 프로카르바진, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 메토트렉세이트, 시타라빈, 파클리탁셀, 오리스타틴, 메이탄시노이드로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, Mes-길항제는 표 A에 제시된 임의의 Mes 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측 면에서, 항-혈관형성제는 VEGF 길항제, 항-VEGF 항체, VEGFR1 및 VEGFR2 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 측면에서, PN-길항제는 DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR 및 ASCL1을 제외하고 표 A에 제시된 임의의 PN 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, 신경 분화제는 MAP2, 베타-튜불린, GAD65 및 GAP43으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 예시적인 신경 분화제는 레티노산, 발프로산 및 그의 유도체 (예를 들어 에스테르, 염, 레티노이드, 레티네이트, 발프로에이트 등); 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 수용체의 다른 아고니스트; 노긴; BDNF, NT 4/5, 또는 NTRK2 수용체의 다른 아고니스트; 전사 인자 ASCL1, OLIG1의 발현을 증가시키는 물질; dll3 아고니스트, 노치 1, 2, 3 또는 4 길항제, 감마 분비효소 억제제, 예를 들어 니카스트린, Aph1A, Aph1B, Psen1, Psen2 및 PSENEN의 소분자 억제제, 델타 유사 리간드 (Dll)-1 길항제, 델타 유사 리간드 (Dll)-4, 재기드 1 길항제, 재기드 2 길항제; numb 아고니스트 또는 numb-유사 아고니스트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 (1) 신경 분화제와, (3) Akt 길항제, (4) 항-유사분열제, 및 (5) Mes 길항제 및/또는 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는, 신경아교종을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, Akt 길항제는 akt1, akt2, akt3의 길항제, PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR의 조절 또는 촉매 도메인의 길항제, 및 PTEN, INPP5D 또는 INPPL1의 활성화제, 자극제 또는 회복제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 다른 특정 측면에서, Prolif-길항제는 표 A에 제시된 임의의 Prolif 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 특정 측면에서, 항-유사분열제는 테모졸라미드, BCNU, CCNU, 로무스틴, 글리아델, 에토포시드, 카르무스틴, 이로노테칸, 토포테칸, 프로카르바진, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 메토트렉세이트, 시타라빈, 파클리탁셀, 오리스타틴, 메이탄시노이드로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, Mes-길항제는 표 A에 제시된 임의의 Mes 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, 항-혈관형성제는 VEGF 길항제, 항-VEGF 항체, VEGFR1 및 VEGFR2 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 측면에서, PN-길항제는 DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR 및 ASCL1을 제외하고 표 A에 제시된 임의의 PN 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, 신경 분화제는 MAP2, 베타-튜불린, GAD65 및 GAP43으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 신경 분화제의 예는 레티노산, 발프로산 및 그의 유도체 (예를 들어 에스테르, 염, 레티노이드, 레티네이트, 발프로에이트 등); 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 수용체의 다른 아고니스트; 노긴; BDNF, NT 4/5, 또는 NTRK2 수용체의 다른 아고니스트; 전사 인자 ASCL1, OLIG1의 발현을 증가시키는 물질; dll3 아고니스트, 노치 1, 2, 3 또는 4 길항제, 감마 분비효소 억제제, 예를 들어 니카스트린, Aph1A, Aph1B, Psen1, Psen2 및 PSENEN의 소분자 억제제, 델타 유사 리간드 (Dll)-1 길항제, 델타 유사 리간드 (Dll)-4, 재기드 1 길항제, 재기드 2 길항제; numb 아고니스트 또는 numb-유사 아고니스트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (i) 종양 샘플에서 신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 세트의 발현을 측정하고, (ii) 세트에서 하위분류 전신경 (PN), 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes) 발현 시그너쳐를 결정한 후, (iii) 질병 결과를 예측 또는 진단하는 것을 포함하고, 여기서 Prolif 또는 Mes의 하위분류는 보다 불량한 예후 또는 참조 샘플 집단의 중앙값 미만의 생존 시간의 통계적으로 상승된 챈스(chance)를 나타내고, PN의 하위분류는 보다 양호한 예후 또는 참조 샘플 집단의 중앙값을 초과하는 생존 시간의 통계적으로 상승된 챈스를 나타내는 것인, 신경아교종을 예측하고/하거나 진단하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 하위분류는 계층 군집화 (hierarchical clustering)를 이용하여 수행한다. 다른 특정 측면에서, 하위분류는 k 평균 군집화 (k means clustering)를 이용하여 수행한다. 추가의 다른 특정 측면에서, 하위분류는 보팅 체계 (voting scheme)에 의해 수행한다. 추가의 다른 특정 측면에서, 하위분류는 종양에서 GDM을 종양의 참조 세트에서 GDM에 비교하여 수행한다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은

(i) 제1 시점에 제1 종양 샘플 내의 GDM의 발현을 측정하고;

(ii) 나중의 제2 시점에 제2 종양 샘플 내의 GDM의 발현을 측정하고;

(iii) 형태학적 하위분류를 종양 샘플에서 GDM의 전신경 (PN), 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes) 발현 시그너쳐로서 결정하는 것을 포함하고;

여기서 제1에서 제2 종양 샘플로 PN에서 Prolif 하위분류로, 다시 Mes 하위분류로의 전이는 상기 종양의 심도 증가 또는 진행을 나타내는 것인, 환자로부터 적어도 2개의 종양 샘플 내의 신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 세트의 발현 시그너쳐를 비교하는 것을 포함하는, 신경아교종을 모니터링 또는 진단하는 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (i) 종양 샘플에서 신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 세트의 발현을 측정하고, (ii) 세트의 하위분류 전신경 (PN), 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes) 발현 시그너쳐를 결정하는 것을 포함하고, 여기서: (I) Prolif 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 길항제 및/또는 Prolif- 길항제 및/또는 항-유사분열제, (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (II) Mes 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 및/또는 Mes-길항제 및/또는 항-혈관형성제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (III) PN 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (1) PN-길항제 및/또는 (2) 신경 분화제와, 임의로 (3) Akt 길항제, (4) 항-유사분열제, 및 (5) Mes 길항제 및/또는 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; 여기서 결과는 종양의 크기 또는 성장 감소인, 신경아교종 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, Akt 길항제는 akt1, akt2, akt3의 길항제, PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR의 조절 또는 촉매 도메인의 길항제, 및 PTEN, INPP5D 또는 INPPL1의 활성화제, 자극제 또는 회복제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 다른 특정 측면에서, Prolif-길항제는 표 A에 제시된 임의의 Prolif 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 특정 측면에서, 항-유사분열제는 테모졸라미드, BCNU, CCNU, 로무스틴, 글 리아델, 에토포시드, 카르무스틴, 이로노테칸, 토포테칸, 프로카르바진, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 메토트렉세이트, 시타라빈, 파클리탁셀, 오리스타틴, 메이탄시노이드로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, Mes-길항제는 표 A에 제시된 임의의 Mes 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, 항-혈관형성제는 VEGF 길항제, 항-VEGF 항체, VEGFR1 및 VEGFR2 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 측면에서, PN-길항제는 DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR 및 ASCL1을 제외하고 표 A에 제시된 임의의 PN 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 추가의 다른 특정 측면에서, 신경 분화제는 MAP2, 베타-튜불린, GAD65 및 GAP43으로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 신경 분화제의 예는 레티노산, 발프로산 및 그의 유도체 (예를 들어 에스테르, 염, 레티노이드, 레티네이트, 발프로에이트 등); 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 수용체의 다른 아고니스트; 노긴; BDNF, NT 4/5, 또는 NTRK2 수용체의 다른 아고니스트; 전사 인자 ASCL1, OLIG1의 발현을 증가시키는 물질; dll3 아고니스트, 노치 1, 2, 3 또는 4 길항제, 감마 분비효소 억제제, 예를 들어 니카스트린, Aph1A, Aph1B, Psen1, Psen2 및 PSENEN의 소분자 억제제, 델타 유사 리간드 (Dll)-1 길항제, 델타 유사 리간드 (Dll)-4, 재기드 1 길항제, 재기드 2 길항제; numb 아고니스트 또는 numb-유사 아고니스트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 상기 접촉의 결과는 종양 세포의 감소된 증식 또는 사멸이다. 다른 측면에서, 길항제는 항체 또는 항원 결합 항체 단편이다. 추가의 다른 특정 측면에서, 길항 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체이다. 추가의 다른 특정 측면에서, 길항 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 독소, 예를 들어, 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신, 오리스타틴, 항생제, 방사성 동위원소, 뉴클레오티드 분해 (nucleolytic) 효소 등에 컨쥬게이팅된다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 (i) 종양 샘플에서 신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 세트의 발현을 측정하고, (ii) 세트의 하위분류 전신경 (PN), 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes) 발현 시그너쳐를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 (I) Prolif 하위분류를 보이는 종양은 포유동물에게 치료 유효량의 (a) Akt 길항제 및/또는 Prolif 길항제 및/또는 항-유사분열제, 및 (b) 신경 분화제를 투여하는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (II) Mes 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 및 Mes-길항제 및/또는 항-혈관형성제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (III) PN 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (1) PN-길항제 및/또는 (2) 신경 분화제와, 임의로 (3) Akt 길항제, (4) 항-유사분열제, 및 (5) Mes 길항제 및/또는 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; 여기서 결과는 종양의 치료적 처치인 것인, 신경아교종 종양에 걸린 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 길항제는 항체, 항원 결합 항체 단편, 올리고펩티드, 소분자 길항제, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 특정 측면에서, 항체는 모노클로날 항체, 항원 결합 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 단일쇄 항체이다. 추가의 다른 측면에서, 길항제 또는 본 방법에 사용하기 적합한 물질은 임의로 성장 억제제 또는 세포독성제, 예를 들어 독소, 예를 들어, 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신, 항생제, 방사성 동위원소, 뉴클레오티드 분해 효소 등에 컨쥬게이팅될 수 있다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 샘플에서 PN-, Prolif- 또는 Mes-GDM의 발현 수준을 결정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 샘플을 PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제에 노출시키고, 샘플에서 각각의 개별 결합제의 결합의 양을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 결합량은 샘플에서 각각의 PN-, Prolif- 또는 Mes-GDM의 발현 수준을 나타낸다. 특정 측면에서, PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제는 (1) 항-PN-, 항- Prolif- 또는 항-Mes-항체, (2) PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 항체 단편, (3) PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 올리고펩티드, (4) PN-, Prolif- 또는 Mes-소분자 길항제, 또는 (5) PN-, Prolif- 또는 Mes-안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 특정 측면에서, 상기 항체는 (a) 모노클로날 항체, (b) 항원 결합 항체 단편, (c) 키메라 항체, (d) 인간화 항체, 또는 (e) 단일쇄 항체이다. 추가의 다른 특정 측면에서, 상기 항체는 PN-, Prolif- 또는 Mes-GDM의 결합의 위치 및/또는 양을 정성적 및/또는 정량적으로 결정하기 위해 유용한 분자 또는 화합물로 검출가능하게 표지된다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 신경아교종 종양에 걸린 포유동물에서 생존 가능성을 예측하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 종양의 시험 샘플을 제거하고, (b) 시험 샘플에서 및 그에 대한 환자 생존 시간이 공지된 30개 이상의 고등 급 신경아교종의 세트에서 PTEN 및 DLL3 유전자 산물 발현의 수준을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 시험 샘플에서 PTEN 및 DLL3 모두의 보다 높은 수준의 발현은 참조 샘플 집단의 중앙값을 초과하는 생존 시간의 통계적으로 상승된 챈스를 나타내고, 시험 샘플에서 PTEN 또는 DLL3의 보다 낮은 수준의 발현은 참조 샘플 집단의 중앙값 미만의 생존 시간의 통계적으로 상승된 챈스를 나타낸다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 포유동물에서 신경아교종 종양의 심도를 진단하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 신경아교종 종양 세포 또는 포유동물로부터 얻은 DNA, RNA, 단백질 또는 다른 유전자 산물의 추출물을 포함하는 시험 샘플을 (i) PTEN GDM에 결합하는 항체, 항원 결합 항체 단편, 올리고펩티드 또는 유기 소분자인 제1 시약, 및 (ii) DLL3 GDM에 결합하는 항체, 항원 결합 항체 단편, 올리고펩티드 또는 유기 소분자인 제2 시약과 접촉시키고; (b) 제1 및 제2 시약과 각각 시험 샘플 내의 PTEN GDM 및 DLL3 GDM 사이의 복합체 형성의 양을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 높은 수준의 PTEN GDM 복합체 형성 및 높은 수준의 DLL3 GDM 복합체 형성은 경증 종양을 나타내고, 낮은 수준의 PTEN GDM 복합체 또는 DLL3 GDM 복합체의 형성은 중증 종양을 나타낸다. 특정 측면에서, 제1 및/또는 제2 시약은 검출가능하게 표지되거나, 고체 지지체에 부착된다. 다른 특정 측면에서, 제1 시약은 항-PTEN 항체, PTEN-결합 항체 단편, 또는 PTEN 결합 올리고펩티드, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 추가의 다른 특정 측면에서, 제2 시약은 항-DLL3 항체, DLL3 결합 항체 단편, 또는 DLL3 결합 올리고펩티드, 소분자 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다. 추가의 다른 특정 측면에서, 항-PTEN 항 체 또는 항-DLL3 항체는 모노클로날 항체, 항원 결합 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체일 수 있다. 추가의 다른 특정 측면에서, 상기 항체는 세포에 대한 PTEN 또는 DLL3 결합제의 결합의 위치 및/또는 양을 정성적 및/또는 정량적으로 결정하기 위해 유용한 분자 또는 화합물로 표지된다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) PTEN, 또는 DLL3 폴리펩티드, 또는 (b) 상기 (a)를 코딩하는 핵산의, 신경아교종 종양의 진단적 검출을 위해 유용한 의약의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다. 특정 측면에서, 의약은 PTEN 결합제 또는 DLL3 결합제일 수 있다. 다른 특정 측면에서, PTEN 결합제는 항-PTEN 항체, PTEN-결합 항체 단편, 또는 PTEN 결합 올리고펩티드, 소분자 길항제, 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있는 한편, DLL3 결합제는 항-DLL3 항체, DLL3-결합 항체 단편, 또는 DLL3 결합 올리고펩티드, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 추가의 다른 특정 측면에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체일 수 있다. 추가의 다른 특정 측면에서, 상기 PTEN 또는 DLL3 결합제는 세포에 대한 PTEN 또는 DLL3 결합제의 결합의 위치 및/또는 양을 정성적 및/또는 정량적으로 결정하기 위해 유용한 분자 또는 화합물로 표지된다.

추가의 다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) PN-, Prolif- 또는 Mes-GDM, 또는 (b) 상기 (a)를 코딩하는 핵산의, 신경아교종 종양의 진단적 검출에 유용한 의약의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다. 특정 측면에서, 의약은 PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제이다. 다른 특정 측면에서, PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제는 (1) 항- PN, 항-Prolif 또는 항-Mes 항체, (2) PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 항체 단편, (3) PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 올리고펩티드, (4) PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 소분자, (5) PN-, Prolif- 또는 Mes-안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 추가의 다른 특정 측면에서, 항-PN-, 항-Prolif- 또는 항-Mes-항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체일 수 있다. 추가의 다른 특정 측면에서, 상기 PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제는 세포에 대한 PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제의 결합의 위치 및/또는 양을 정성적 및/또는 정량적으로 결정하기 위해 유용한 분자 또는 화합물로 표지된다.

도 1. 발현 프로파일링은 고등급 신경아교종에서 생존과 관련된 유전자 발현의 3개의 주요 패턴을 밝힌다. A. 생존과 양성적으로 또는 음성적으로 상호관련된 108개의 유전자의 발현에 의한 76개의 MDA 원발성 등급 III & IV 별아교세포종의 무감독 (unsupervised) 군집화 (양 또는 음으로 표지된 유전자 클러스터 (cluster))로 3개의 샘플 클러스터 (암회색선)가 밝혀진다. B. 동일한 76개 샘플의 PN, Prolif 및 Mes 종양 서브세트 (표시된 바와 같이)가 35개의 시그너쳐 유전자를 사용하여 확인된다. k-평균 군집화로부터의 중심값 (centroid)은 z 스코어-표준화 유전자 발현값을 사용하여 도시된다 (-1 내지 +1의 척도 (scale)). C-E. MDA, UCSF, 및 UCLA 샘플 집단으로부터의 데이타의 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 그래프. 로그-순위검정 (log-rank) 시험으로부터의 p값이 도시된다. 연회색, 흑색 및 회색 선은 각각 PN, Prolif, 및 Mes 서브클래스에 대응한다. 수직 표 식 (tick)은 중도절단된 (censored) 생존 관찰을 나타낸다. F. & G. PN 및 Mes 마커의 강한 발현은 상호 배타적이다. 각각의 막대는 개별 샘플 내의 4개의 마커 유전자의, 마이크로어레이 (F) 또는 Taqman 실시간 PCR (G)에 의한 mRNA 결정을 보여준다. 유전자는 표시된 바와 같이 BCAN, DLL3, CHI3l1/YKL40 (YKL40), 및 CD44를 포함한다. 표시된 값은 전체 샘플 세트에 상대적인 개별 샘플의 유전자 발현에 대한 Z 스코어를 나타낸다. H. 5개의 신경아교종 환자의 조직 마이크로어레이 코어 (core)에서 BCAN 및 CHI3L1/YKL40 (YKL40)의 계내 (in situ) 혼성화. 화살표는 BCAN 양성 코어에서 초점상 (focal) CHI3L1/YKL40 발현을 나타낸다.

도 2. 대부분의 고등급 신경아교종은 시그너쳐 유전자 발현의 3개의 패턴 중 하나에 대한 강한 유사성을 특징으로 하고, 질병 진행시 서브클래스 이동은 Mes 표현형을 향한다. A-C. 각각의 점이 차지하는 위치가 개별 샘플과 참조 (MDA) 샘플 세트의 k-평균 군집화에 의해 정의된 각각의 3개의 중심값 사이의 유사성 (스피어만 (Spearman) r)을 나타내는 3차원 그래프도. A. 별아교세포 (흑색점) 또는 희소돌기 아교세포 (연회색점) 형태학의 등급 III 종양은 거의 모두 PN 중심값에 가장 유사한 한편, 등급 IV 종양 (회색점)의 집단은 중심값에 대한 유사성에 의해 보다 균등하게 나누어진다. B. 상이한 세트의 정상 세포 또는 조직은 각각의 3개의 중심값에 유사하다. 샘플은 다음과 같다: 태아 뇌, 성인 뇌 (뇌), 태아 조직에서 유래된 2개의 신경 줄기 세포주 (NSC1, NSC2), Jurkat, 조혈 줄기 세포 (HSC), 평활근 (SmoMusc), 내피세포 (endothel), 활막 (synov), 및 뼈. 성장 인자 BDNF에 대 한 노출 및 중지에 의해 처리된 신경 줄기 세포주를 NSC1^* & NSC2^*로 지정한다. C. 26쌍의 매칭된 (matched) 원발성 및 재발 별아교세포종 (회색 = 등급 IV, 흑색 = 등급 III)을 나타낸다. 각각의 쌍의 매칭된 시료는 시그너쳐 클래스 이동의 경우에 굵은 채워진 표시의 화살표로 연결된다. D. 재발시 Mes 서브클래스로 이동하는 환자에서 유전자는 유의하게 상향조절된다. FC = 배수 (fold) 변화. E. PN에서 Mes 표현형으로 이동하는 환자로부터의 매칭된 원발성 및 재발 종양에서 CHI3L1/YKL40 및 OLIG2의 IHC.

도 3. 종양 서브클래스는 증식, 혈관신생, 및 신경발생에 대한 마커의 발현에 의해 구분된다. A-E. 속이 빈 원 = 뇌, 회색 원 또는 막대 = PN, 흑색 삼각형 또는 막대 = Prolif., 회색 정사각형 또는 막대 = Mes. A. Prolif 종양은 PCNA 및 TOP2A의 발현이 풍부하다 (다른 모든 집단과의 비교를 위해 p< 1 x 10^-6). B. Mes 종양은 PECAM, VEGF, VEGFR1, 및 VEGFR2의 증가된 발현에 의해 구분된다 (다른 모든 집단과의 비교를 위해 p<0.O5). C & D. PN 종양에 비해, Prolif 및/또는 Mes 종양은 신경 줄기 및 전이-증폭 마커 VIM, NES, TLX, CD133, MELK, 및 DLX2의 보다 강한 발현 (D) 및 신경모세포 및 신경세포성 마커 OLIG2, MAP2, DCX, NeuN, ERBB4, 및 GAD2의 보다 약한 발현을 보인다 (E). 별표는 PN으로부터의 유의한 차이를 나타낸다 (p<0.O5 ANOVA 후 Bonferroni 사후검정 (post-hoc)). E. GFAP 발현은 PN 또는 MES 종양에 비해 Prolif 종양에서 유의하게 감소되었다.

도 4. 염색체 7, 10, 및 19 상에서 카피수 변화는 종양 서브클래스에서 상이 하고, 상기 차이는 발현 시그너쳐에 반영된다.

A. 종양 시그너쳐 서브클래스의 함수로서 염색체 10, 7 및 19q의 카피수 변화의 빈도. chr 10에 대해, 종양은 손실 없음, PTEN 로커스를 포함하는 10q에 한정된 손실, 및 본질적으로 모든 로커스의 손실을 나타내는 것으로 보고된다. chr 7에 대해, 환자는 증대 (gain) 없음, chr 7의 임의의 부분의 증대, 또는 모든 로커스의 증대로서 채점된다. chr 19q에 대해, 환자는 로커스의 1/2 초과가 카피수 변화를 보이는 경우 증대 또는 손실로서 채점된다. B. 염색체 위치의 함수로서 플로팅된 모든 U133 A&B 프로브세트에 비교한 PN, Prolif, 또는 Mes 종양 마커 목록 (표지된 바와 같이) 내의 프로브 세트의 수.

도 5. Prolif 및 Mes 종양은 Akt 및 노치 시그날 전달 케스케이드의 차별적인 활성화를 나타낸다. PN, Prolif 및 Mes 종양은 각각 연회색원, 흑색 삼각형 및 회색 정사각형으로 표시된다. (A.) PTEN 손실 및 (B.) EGFR 증폭은 PN 시그너쳐와 음성적으로 연관되는 한편, (C.) PIK3R3 로커스의 증대는 Prolif 시그너쳐와 양성적으로 연관된다. A-C. 각각의 샘플에 대해, x축은 샘플링된 로커스에서 증대 또는 손실을 나타내는 CGH Iog2 비를 표시하는 한편, y축은 표시된 바와 같이 PN 또는 Prolif 중심값에 대한 상관성을 표시한다. r 값은 CGH 비와 발현 시그너쳐 중심값 유사성 사이의 피어슨 (Pearson) 및 스피어만 상관 계수를 표시한다. D. 표준화 PTEN mRNA 수준은 PN 종양 서브클래스에 비해 불량한 예후의 종양 서브타입에서 더 낮다. 수평선은 집단 평균을 나타낸다. E.-H. PN 종양은 노치 경로 요소 DLL3, DLL1, HEY2, 및 ASCL1의 강한 과다발현을 보인다. I. & J. 종양 서브클래스 는 p-Akt 및 핵 노치에 대한 염색에 대해 상이하다. 각각의 종양 서브타입에 대해, p-Akt (J) 또는 핵 노치 (K) 면역염색에 대해 0, 1, 또는 2로서 평가된 샘플의 비율이 표시된다. PN, Prolif 및 Mes 서브타입은 각각 3개의 막대 그래프로 표시된다.

도 6. PTEN 및 DLL3의 발현은 2개의 독립적인 샘플 세트에서 고등급 별아교세포종의 생존을 예측한다 (A & B). 좌측 및 우측 패널의 그래프는 각각 20^th 및 80^th 백분위수 (%-ile)에서 PTEN 발현의 경우에 대해 모델링한 각각의 샘플 집단의 추정된 생존 함수를 표시한다 (A에 대해 n= 76, B에 대해 n=34). 흑색 및 회색 선은 각각 발현의 20^th 및 80^th %-ile에서 DLL3 발현을 갖는 샘플에 대한 추정된 생존을 보여준다.

도 7. 신경아교종 세포주의 발현 시그너쳐는 EGF/FGF-독립적 신경구 (neurosphere) 성장을 예측한다. A. 신경구 배양액의 예는 5개의 세포주로부터 유래되고, EGF+FGF의 존재 또는 부재 하에 유지된다. 세포주의 예는 EGF+FGF의 부재 하에 성장에 대해 0-4 (표시된 바와 같이)로 평가된다. B. 발현 시그너쳐의 Mes 또는 Prolif 중심값에 대한 상관성의 함수로서 16개의 세포주에 대한 신경구 성장 평가.

도 8. 종양 서브타입의 요약. (A) 종양 서브타입의 주요 특색 및 (B) 종양 서브타입과 신경발생에서 단계 사이의 평행성을 표시하는 모델.

I. 정의

용어 "신경아교종"은 뇌 또는 척수의 아교세포 또는 그들의 전구체에서 발생하는 종양을 나타낸다. 신경아교종은 일차적으로 별아교세포 또는 희소돌기 아교세포 형태학을 나타내는지에 기초하여 조직학적으로 정의되고, 세포충실성, 핵의 이형성, 괴사, 유사분열상, 및 미세혈관 증식에 의해 등급 결정되고 - 상기 모든 특색은 생물학적 공격 거동과 연관된다. 별아교세포종은 2개의 주요 종류의 것이다 - 고등급 및 저등급. 고등급 종양은 빠르게 성장하고, 혈관형성이 잘 되고, 뇌를 통해 쉽게 확산할 수 있다. 저등급 별아교세포종은 대체로 국소화되고, 오랜 기간에 걸쳐 느리게 성장한다. 고등급 종양은 훨씬 더 공격적이고, 매우 집중적인 치료를 필요로 하고, 저등급 종양보다 더 짧은 생존 시간 길이와 연관된다. 아동의 대부분의 별아교세포 종양은 저등급인 반면, 성인의 대부분은 고등급이다. 상기 종양은 뇌 및 척수에서 어디에나 발생할 수 있다. 보다 흔한 저등급 별아교세포종의 일부는 연소성 털모양 별아교세포종 (JPA), 원섬유성 별아교세포종, 다형 황색 별아교세포종 (PXA) 및 배아형성 장애 신경상피종 (DNET)이다. 2개의 가장 흔한 고등급 별아교세포종은 역형성 별아교세포종 (AA) 및 다형성 교모세포종 (GBM)이다.

본원에서 사용되는 용어 "신경아교종 결정 마커(들)" ("GDM")은 신경아교종과 일반적으로 연관되는 세포 마커(들)을 나타낸다. 상기 용어는 마커를 코딩하는 유전자 (예를 들어, DNA, 유전자 증폭) 및 그의 전사로부터 생성되는 유전자 산물 (예를 들어, mRNA, 코딩된 폴리펩티드)을 모두 포괄하여 포함한다. GDM 마커는 표 A에 나타낸 바와 같이 전신경 (PN), 증식 (Prolif) 또는 중간엽 (Mes) 하위분류로 구분될 수 있다.

"천연 서열 GDM 폴리펩티드"는 자연에서 유도되는 대응하는 GDM 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 천연 서열 GDM 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 GDM 폴리펩티드"는 구체적으로 천연 말단 절단된 (truncated) 또는 분비된 형태의 특이적 GDM 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 천연 변이체 형태 (예를 들어, 교대 스플라이싱된 형태) 및 천연 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본원에 개시된 천연 서열 GDM 폴리펩티드는 표 A에 제시된 폴리펩티드에 대응하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다.

"GDM 폴리펩티드 변이체"는 GDM 폴리펩티드, 바람직하게는 본원에 개시된 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 본원에서 규정되는 바와 같은 그의 활성 형태, 및 본원에서 언급된 것과 같은 시그날 펩티드, 세포외 도메인, 또는 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드의 임의의 다른 단편이 결여된 그의 변이체 형태를 의미한다. 상기 변이체 폴리펩티드는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 특정 측면에서, 상기 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드 서열, 및 본원에서 언급된 것과 같은 시그날 펩티드, 세포외 도메인, 또는 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드의 임의의 다른 단편이 결여된 그의 변이체 형태와 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 측면에서, 상기 변이체 폴리펩티드는 대응하는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300개 이상의 아미노산 잔기의 길이가 상이할 것이다. 별법으로, 상기 변이체 폴리펩티드는 대응하는 천연 폴리펩티드 서열에 비해 하나 이하의 보존적 아미노산 치환, 별법으로 천연 폴리펩티드 서열에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.

본원에서 확인된 GDM 폴리펩티드 서열에 대해 "아미노산 서열 동일성 비율 (%)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후 특정 GDM 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 공개된 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 비율값은 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드가 하기 표 1에 제시된 서열 비교 컴퓨터 프로그램 "ALIGN-2"를 사용하여 얻을 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. (Genentech. Inc.) 소유로서, 표 1에 제시된 소스 코드는 미국 저작국 (United States Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 입수가능하거나, 하기 표 1에 제시된 소스 코드로부터 컴파일링할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.

"GDM 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "GDM 변이체 핵산 서열"은 GDM 폴리펩티드, 바람직하게는 본원에서 규정되는 바와 같은 그의 활성 형태를 코딩하고 본원에서 확인된 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드 서열, 또는 본원에서 확인된 각각의 전장 GDM 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편 (예를 들어, 전장 GDM 폴리펩티드의 완전 코딩 서열의 일부만을 제시하는 핵산에 의해 코딩되는 것)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 통상적으로, 상기 변이체 폴리뉴클레오티드는 각각의 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드 서열 또는 본원에서 확인된 각각의 전장 GDM 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과 적어도 약 80%의 핵산 서열 동일성, 별법으로 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다. 상기 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.

통상적으로, 상기 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 50개의 뉴클레오티드의 길이가 상이할 것이다. 별법으로 상기 차이는 적어도 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 이와 관련하여 용어 "약"은 참조된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 상기 참조된 길이의 10%를 의미한다.

본원에서 확인된 핵산 서열을 코딩하는 GDM 폴리펩티드에 대한 "핵산 서열 동일성 비율 (%)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭을 도입시킨 후 목적하는 GDM 핵산 서열 내의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율로서 본원에서 정의된다. 핵산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 공개된 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 핵산 서열 동일성 비율은 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 소스 코드가 하기 표 1에 제시된 서열 비교 컴퓨터 프로그램 "ALIGN-2"를 사용하여 얻을 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.의 소유로서, 표 1에 제시된 소스 코드는 미국 저작국에 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크로부터 입수가능하거나, 하기 표 1에 제시된 소스 코드로부터 컴파일링할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.

ALIGN-2를 핵산 서열 비교에 사용하는 경우, 제시된 핵산 서열 C의 제시된 핵산 서열 D에 대한 핵산 서열 동일성 % (별법으로 제시된 핵산 서열 D에 대해 특정 핵산 서열 동일성 %를 갖는 제시된 핵산 서열 C로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다:

100 × W/Z

상기 식에서, W는 C 및 D의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 것으로 평가된 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D의 뉴클레오티드의 총수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않을 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 핵산 서열 동일성 % 계산의 예로서, 표 4 및 5는 "REF-DNA"로 명명된 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 명명된 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 %의 계산 방법을 보여주고, 여기서 "REF-DNA"는 목적하는 가상 GDM-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 목적하는 "REF-DNA" 핵산 분자가 그에 대해 비교되는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가상 뉴클레오티드를 나타낸다. 달리 구체적으로 언급되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 핵산 서열 동일성 %값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 문단에서 설명한 바와 같이 얻는다.

다른 실시태양에서, GDM 변이체 폴리뉴클레오티드는 GDM 폴리펩티드를 코딩하고, 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건 하에 본원에 개시된 전장 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자이다. 상기 변이체 폴리펩티드는 상기 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

본원에 개시된 다양한 GDM 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용될 때, "단리된"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 일반적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 상기 단리된 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 GDM 폴리펩티드의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 대응하는 계내 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"단리된" GDM 폴리펩티드-코딩 핵산은 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원에서 그와 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 임의의 상기 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다른 것이다. 임의의 상기 핵산 분자는 따라서 천연 세포에 존재하는 특이적인 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 구별된다.

용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵세포에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이스 (reading phase)로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 용례에 따라 사용된다.

혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요구되는 상동성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.

본원에서 규정되는 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도의 사용; 50℃의 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안 변성제의 사용, 예를 들어 50% (v/v) 포름아미드 + 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% Ficoll/O.1% 폴리비닐피롤리돈/5O mM 인산나트륨 버퍼 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃); 또는 (3) 42℃의 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)를 사용한 세척, 이어서 55℃의 EDTA 함유 0.1 x SSC로 구성된 고엄격성 세척과 함께, 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M/시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용한 철야 혼성화에 의해 확인될 수 있다.

"중등 엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중등 엄격성 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단 처리 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 약 37-50℃의 1 x SSC를 사용한 필터의 세척을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인식할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "에피토프 태깅된 (tagged)"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 GDM 폴리펩티드 또는 GDM 결합제를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 의미한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 작용할 수 있는 에피토프를 제공하도록 충분한 잔기를 갖지만, 그가 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 상기 항체가 다른 에피토프에는 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 특이적이다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 약 20개의 잔기)를 갖는다.

본 발명의 목적을 위해 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생 GDM 폴리펩티드의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유하는 GDM 폴리펩티드의 형태(들)를 의미하고, "생물학적" 활성은 천연 또는 자연 발생 GDM 폴리펩티드가 갖는 항원 에피토프에 대해 작용하는 항체의 생산을 유도하는 능력 이외의 다른, 천연 또는 자연 발생 GDM에 의해 유발되는 생물학적 기능 (억제성 또는 자극성)을 의미하고, "면역학적" 활성은 천연 또는 자연 발생 GDM 폴리펩티드가 갖는 항원 에피토프에 대해 작용하는 항체의 생산을 유도하는 능력을 의미한다. 본원에서 사용되는 활성 GDM 폴리펩티드는 신경아교종이 침범하지 않은 유사한 조직에서의 그의 발현에 비해, 신경아교종 종양 상에서 정성적 또는 정량적 배경으로부터 차등 발현되는 항원이다.

용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 본원에 개시된 천연 GDM 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 길항제 분자는 구체적으로 길항 항체 또는 항체 단편, 천연 GDM 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등을 포함한다. GDM 길항제를 확인하기 위한 방법은 그를 발현하는 세포를 포함하여 GDM 폴리펩티드를 후보 아고니스트 또는 길항제 분자와 접촉시키고 GDM 폴리펩티드와 통상적으로 관련되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.

"치료하는" 또는 "치료" 또는 "완화"는 신경아교종을 억제하거나 그의 진행 속도를 느리게 하는 (완화하는) 치료적 처치 및 예방 또는 억제 처리를 모두 의미한다. "예측하는"은 신경아교종 종양의 가능한 경과 및 결과의 결정 또는 예측을 의미한다. "진단하는"은 신경아교종 종양을 확인하거나 그 구별되는 특징을 결정하는 과정을 의미한다. 진단하는 과정은 때때로 심도 또는 질병 진행을 기초로 하여 병기 분류 (staging) 또는 종양 분류로 표현된다.

치료, 예측 또는 진단이 필요한 대상은 신경아교종이 이미 발생한 대상 및 신경아교종을 갖기 쉬운 대상 또는 신경아교종이 억제되어야 하는 대상을 포함한다. 대상 또는 포유동물은 본 발명의 방법에 따라, 치료량의 GDM 길항제 (예를 들어, PN 길항제, Prolif 길항제 또는 Mes 길항제)를 투여한 후, 환자가 다음 중 하나 이상의 관찰가능한 및/또는 측정가능한 감소 또는 부재를 보일 경우에 GDM 폴리펩티드-발현 신경아교종에 대해 성공적으로 "치료된다": 신경아교종 종양 세포의 수 감소 또는 상기 세포의 부재; 종양 크기의 감소; 암의 연조직 및 뼈 내로의 전이를 포함하여 말초 장기 내로 신경아교종 종양 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장의 어느 정도의 억제 및/또는 특이적인 암과 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감; 이환률 및 사망률 감소, 및 삶의 질 개선. 상기 GDM 길항제가 암세포 성장을 억제하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 정도로, 상기 길항제는 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 또한, 상기 징후 또는 증상의 감소는 환자가 지각할 수 있다.

질병의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 상기 파라미터는 의사에게 잘 알려진 통상적인 절차에 의해 쉽게 측정가능하다. 암 치료를 위해, 효능은 예를 들어 질병 진행시까지의 시간 (TTP)의 평가 및/또는 반응 속도 (RR)의 결정에 의해 측정할 수 있다. 전이는 병기 분류 시험 및 칼슘 수준 및 전이의 정도를 결정하기 위한 다른 효소의 시험에 의해 결정될 수 있다. 또한, 아교세포 외부 영역으로 전파되는 것을 관찰하기 위해 CT 스캔을 수행할 수 있다. 예측 및/또는, 진단 및/또는 치료 방법에 관한 본원에서 설명되는 발명은 GDM (예를 들어, PN, Prolif, Mes, Pten 및 DLL3) 증폭 및 발현의 결정 및 평가를 수반한다.

암 증상의 치료, 완화 또는 암 진단을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 양, 염소, 토끼, 흰족제비 등을 포함하는, 포유동물로 분류된 임의의 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

하나 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (병행) 및 임의의 순서의 연속적인 투여를 포함한다.

본원에서 사용되는 "담체"는 사용된 투여량 및 농도에 노출된 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 종종 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 버퍼, 예를 들어 인산염, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN(등록상표), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 PLURONICS(등록상표)를 포함한다.

"고체상" 또는 "고체 지지체"는 본 발명의 GDM 길항제 또는 GDM 결합제가 점착 또는 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스이다. 본원에 포함되는 고체상의 예는 부분적으로 또는 전적으로 유리 (예를 들어, 제어된 공극 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 문맥에 따라, 고체상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 부분에서는 정제 컬럼 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피 컬럼)일 수 있다. 또한, 이 용어는 미국 특허 4,275,149에 기재된 것과 같은, 별개 입자의 비연속적 고체상을 포함한다.

"리포좀"은 약물 (예를 들어 GDM 길항제)을 포유동물에게 전달하기 위해 유용한 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 베지클이다. 리포좀의 성분은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 2층 구조로 배열된다.

"소분자" 또는 "유기 소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 규정된다.

GDM 길항제 또는 GDM 결합제의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 달성하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급한 목적과 관련하여 통상적으로 방식으로 실험적으로 결정될 수 있다.

용어 "치료 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질병 또는 질환의 "치료"에 효과적인 GDM 길항제 또는 다른 약물을 지칭한다. 신경아교종의 경우에, 약물의 치료 유효량은 신경아교종 세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 말초 조직 또는 장기 내로 신경아교종 종양 세포의 침윤을 억제하고 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제하고 (즉, 어느 정도 지연시키고 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나 신경아교종과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 상기 "치료"에 대한 본원의 정의를 참고한다. 약물이 암세포 성장을 억제하고/하거나 존재하는 암세포를 사멸시킬 정도로, 상기 약물은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.

GDM 길항제의 "성장 억제량"은 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암 세포의 성장을 시험관 내에서 또는 생체 내에서 억제할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위해, 상기 양은 통상적으로 방식으로 실험적으로 결정될 수 있다.

GDM 길항제의 "세포독성량"은 세포, 특히 신경아교종 세포, 예를 들어, 암 세포를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 파괴할 수 있는 양이다. 신생물성 세포 성장을 억제하기 위해, 상기 양은 통상적으로 방식으로 실험적으로 결정될 수 있다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 예를 들어 항-PN, 항-Prolif 및 항-Mes GDM 모노클로날 항체 (길항제 및 중화 항체 포함), 다중에피토프 특이성을 갖는 항-PN, 항-Prolif 및 항-Mes GDM 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-GDM 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적) 및 목적하는 생물학적 또는 면역학적 활성을 보이는, 상기 언급한 모든 항체의 항원 결합 단편 (하기 참조)을 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 항체와 상호 교환가능하게 사용된다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

기본적인 4개 사슬의 항체 단위는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J 사슬로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 이종사량체 단위로 구성되고, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 포함하고, 분비된 IgA 항체는 중합되어 J 사슬과 함께 2-5개의 기본적인 4개 사슬 단위를 포함하는 다가 회합체를 형성할 수 있다). IgG의 경우에, 4개 사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 디술파이드 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 두개의 H 사슬은 H 사슬의 이소형에 따라 하나 이상의 디술파이드 결합에 의해 서로에게 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 디술파이드 다리를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (V_H), 이어서 각각의 α 및 γ 사슬에 대해 3개의 불변 도메인 (C_H) 및 μ 및 ε 이소형에 대해 4개의 C_H 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (V_L), 이어서 그의 다른 말단에 불변 도메인 (C_L)을 갖는다. V_L은 V_H와 정렬되고, C_L은 중쇄 (C_H1)의 제1 불변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. V_H 및 V_L의 페어링은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 상이한 클래스의 구조 및 특성에 대해서는 문헌을 참고한다 [예를 들어, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6].

임의의 척추동물종에서 유래한 L 사슬은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 분명하게 상이한 종류 중의 하나로 분류될 수 있다. 그들의 중쇄 (C_H)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉, 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 명명된 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재한다. γ 및 α 클래스는 C_H 서열 및 기능의 비교적 작은 차이를 기초로 하여 서브클래스로 추가로 나누어질 수 있다. 예를 들어, 인간은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2의 서브클래스를 발현한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체 내의 서열에서 크게 상이함을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 약 110개 아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각의 9-12개 아미노산 길이의 "초가변 영역"으로 불리는 고가변성의 보다 짧은 영역에 의해 이격된, 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 비교적 비가변적인 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는, 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.

본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 필요한 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, V_L의 대략 카바트 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 V_H의 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, V_L의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 V_H의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 모노클로날 항체의 생산 동안 생성될 수 있는 가능한 자연 발생 변이체를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프(들)에 결합한다. 상기 모노클로날 항체는 일반적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 방법에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선택 방법은 복수의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양액에서 그의 생산을 개선시키고, 생체 내에서 그의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성시키기 위해서 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임이 이해될 것이다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체 제제는 일반적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어, 하이브리도마 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004) 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 인간 또는 인간-유사 항체를 동물에서 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 미국 특허 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (모두 겐팜 (GenPharm)); 5,545,807; WO 1997/17852; 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, U: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13:65-93 (1995) 참조)에 의해 제조할 수 있다.

모노클로날 항체는 목적하는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 사용되는 인간화 항체는 키메라 항체의 서브세트이다.

비-인간 (예, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 또는 수용 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 항체 성능, 예를 들어 결합 친화도를 보다 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응하지만, FR 영역은 결합 친화도를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. FR에서의 상기 아미노산 치환의 수는 일반적으로 H 사슬에서 6개 이하 및 L 사슬에서 3개 이하이다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 일부의 인간 면역글로불린을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편, 디아바디 (diabody); 선형 항체 (예를 들어, 미국 특허 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체를 파파인으로 분해하면, "Fab" 단편으로 언급되는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편이 생성되고, 이 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한다. Fab 단편은 전체 L 사슬과 H 사슬의 가변 영역 도메인 (V_H), 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)으로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이고, 즉, 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원 결합 활성을 갖는 2개의 디술파이드 연결 Fab 단편에 거의 대응하고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 하나의 큰 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.

Fc 단편은 디술파이드에 의해 함께 유지되는 두 H 사슬의 카르복시 말단을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 종류의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 구성된다. 이들의 폴딩으로부터, 두 도메인은 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (각각 H 및 L 사슬로부터 3개의 루프)를 생성시킨다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.

"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 V_H 및 V_L 항체 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 연결된다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대해서는, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995]을 참조한다.

"GDM 결합제"는 GDM 폴리펩티드 (예를 들어, PN, Prolif, Mes, Pten 및 DLL3)에 결합하는 분자이다. 그 분자의 예는 항-GDM 항체, GDM-결합 항체 단편, GDM 결합 올리고펩티드, GDM 센스 및 안티센스 핵산 및 GDM 소분자 길항제를 포함한다.

"GDM 길항제"는 예를 들어 GDM이 시그날을 전달하는 능력을 차단함으로써, 예를 들어 천연 리간드를 결합으로부터 차단하거나 GDM을 천연 리간드로부터 신경아교종 종양의 하류 성분으로 전달하는 것을 차단함으로써 GDM 폴리펩티드의 활성화 또는 시그날 전달 능력을 길항 (예를 들어 중화 또는 방해)하는 분자이다. 그 분자의 예는 항-GDM 항체, GDM-결합 항체 단편, GDM 결합 올리고펩티드, GDM 센스 및 안티센스 핵산 및 GDM 소분자 길항제를 포함한다.

"GDM 결합 올리고펩티드"는 본원에서 설명되는 수용체, 리간드 또는 시그날 전달 성분을 각각 포함하여 GDM 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. 상기 올리고펩티드는 공지의 올리고펩티드 합성 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있거나 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. 상기 올리고펩티드는 길이가 대체로 적어도 약 5개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 이상의 아미노산이다. 상기 올리고펩티드는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험을 수행하지 않으면서 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 WO 84/03506 및 WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens. 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol. 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry. 30:10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature. 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363 (1991), 및 Smith, G. P., Current Opin. Biotechnol., 2:668 (1991) 참조).

"GDM 소분자 길항제"는 바람직하게는 본원에서 설명된 GDM 폴리펩티드의 GDM 시그날 전달 경로를 특이적으로 억제하는, 본원에서 규정되는 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 다른 유기 분자이다. 상기 GDM 시그날 전달 경로 억제는 바람직하게는 GDM 폴리펩티드를 발현하는 신경아교종 종양 세포의 성장을 억제한다. 상기 유기 분자는 공지의 방법으로 확인하여 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO2000/00823 및 WO2000/39585 참조). 상기 유기 분자는 대체로 크기가 약 2000 달톤 미만, 별법으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이고, 바람직하게는 본원에서 설명된 GDM 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있고, 과도한 실험을 수행하지 않으면서 공지의 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO00/00823 및 WO00/39585 참조).

목적하는 표적 항원, 예를 들어 GDM에 "결합하는" GDM 길항제 또는 GDM 결합제 (예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 소분자)는 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화할 때 유용한 진단제, 예측제 및/또는 치료제가 될 수 있도록 충분한 친화도로 표적에 결합하고 다른 단백질과 유의하게 교차반응하지 않는 것이다. 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사선면역침전 (RIA)과 같은 통상적인 기술에 의해 측정가능한, 목적하지 않는 마커 폴리펩티드에 결합하는 정도는 목적하는 특정 표적에 대한 결합의 약 10% 미만일 것이다.

또한, 용어 "특이적 결합" 또는 특정 GDM 폴리펩티드 또는 특정 GDM 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은 비-특이적인 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합에 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 표적과 유사한 대조 분자, 예를 들어, 과량의 표지되지 않은 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 특이적인 결합은 프로브에 대한 표지된 표적이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제될 경우에 표시된다. 한 실시태양에서, 상기 용어는 분자가 실질적으로 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 별법으로, 상기 용어는 표적에 대한 Kd가 적어도 약 10^-4 M, 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M, 10^-12 M 이상인 분자로 설명될 수 있다.

"GDM 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는" GDM 길항제 (예를 들어, PN-, Prolif- 또는 Mes-길항제) 또는 "성장 억제량"의 임의의 상기 분자는 적절한 GDM 폴리펩티드를 발현 또는 과다발현하는 암 세포의 측정가능한 성장 억제를 야기하는 것이다. 처리에 사용하기 바람직한 조성물은 신경아교종 종양 세포의 성장을 적절한 대조군에 비해 20% 초과, 바람직하게는 약 20% 내지 약 50%, 훨씬 더 바람직하게는 50% 초과 (예를 들어, 약 50% 내지 약 100%)의 수준으로 억제하기 위해 성장 억제량의 적어도 한 종류의 GDM 길항제 (예를 들어, 항-GDM 항체, GDM-결합 항체 단편, 올리고펩티드 또는 소분자)를 포함한다. 한 실시태양에서, 성장 억제는 세포 배양액 중에서 약 0.1 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 농도에서 측정할 수 있고, 성장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시키고 1-10일 후에 결정한다. 신경아교종 종양 세포의 생체 내에서의 성장 억제는 하기 실험 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 방식으로 결정할 수 있다. 본 문단의 임의의 상기 분자의 양은 상기 분자를 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 체중으로 투여한 후, 항체의 처음 투여로부터 약 5일 내지 3개월, 바람직하게는 약 5 내지 30일 내에 종양 크기 또는 종양 세포 증식을 감소시킬 경우에 생체 내에서 성장을 억제하는 것이다.

"세포자멸 (apoptosis)을 유도하는" GDM 길항제는 애넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체 확장, 세포 단편화, 및/또는 막 베지클 (세포자멸체로 칭함)의 형성에 의해 결정되는 신경아교종 종양 세포의 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 세포는 대체로 GDM 폴리펩티드를 과다발현하는 것이다. 세포자멸과 연관된 세포성 사건을 평가하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 애넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링 (laddering)을 통해 평가할 수 있고; DNA 단편화와 함께 핵/크로마틴 축합은 저이배체 (hypodiploid) 세포의 임의의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸을 유도하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 애넥신 결합 분석에서 비처리 세포에 비해 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배의 애넥신 결합을 유도하는 것이다.

"세포 사멸을 유도하는" GDM 길항제는 생존가능한 신경아교종 종양 세포를 비생존가능한 것으로 만드는 것이다. 상기 신경아교종 종양 세포는 이환되지 않은 세포에 비해 GDM 폴리펩티드를 발현하는, 바람직하게는 과다발현하는 것이다. GDM 폴리펩티드는 상기 암세포의 표면에 발현된 트랜스멤브레인 폴리펩티드일 수 있거나 또는 상기 세포에 의해 생산되어 분비된 폴리펩티드일 수 있다. 시험관 내 세포 사멸은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸을 구별하기 위해서 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 결정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸에 대한 분석은 열 불활성화된 혈청을 사용하여 (즉, 보체의 부재 하에) 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. 세포 사멸을 유도하는 능력은 적합한 기술, 예를 들어 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 (Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995) 참조) 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가되는 막 통합성의 상실에 의해 비처리 세포와 비교하여 평가할 수 있다. 바람직한 세포 사멸-유도 GDM 길항제는 BT474 세포에서의 PI 흡수 분석에서 PI 흡수를 유도하는 것이다.

"Prolif-길항제" 및 "Mes-길항제"는 각각 표 A에 제시된 Prolif 또는 Mes GDM 마커에 특이적으로 결합하거나 상기 마커의 활성을 특이적으로 억제하는 GDM 길항제이다. "PN-길항제"는 DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR 및 ASCL1을 제외하고 표 A에 제시된 PN GDM 마커에 특이적으로 결합하거나 상기 마커의 활성을 특이적으로 억제하는 GDM 길항제이다.

Akt 길항제는 Akt 시그날 전달 경로의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자이다. 적합한 Akt 길항제는 길항 항체 또는 항체 단편, 시그날 전달 경로의 천연 성분의 단편 또는 아미노산 서열 변이체 ("Akt 폴리펩티드"), 펩티드 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등을 포함한다. Akt 길항제를 확인하기 위한 방법은 Akt 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고 Akt 폴리펩티드와 통상적으로 관련되는 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. Akt 길항제의 추가의 예는 akt1, akt2, 또는 akt3에 대해 특이적으로 작용하는 길항제; 촉매 또는 조절 도메인에 대해 작용하는 길항제 (서로의 상호작용 포함), PIK3 키나제, 예를 들어 PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R4; PDK1; FRAP (예를 들어, 라파마이신); RPS6KB1; SGK; EGFR (예를 들어 에를로니팁 TARCEVA(등록상표), IGFR을 포함한다. 별법으로, Akt 길항제는 PTEN, INPP5D 또는 INPPL1의 활성을 작용, 자극 또는 회복시키는 분자를 포함한다.

"항-유사분열제"는 세포 분열 동안 발생하는 유사분열을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 방해하는 분자를 포함한다. 상기 물질의 예는 테모졸라미드, BCNU, CCNU, 로무스틴, 글리아델, 에토포시드, 카르무스틴, 이로노테칸, 토포테칸, 프로카르바진, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 메토트렉세이트, 시타라빈, 파클리탁셀. 오리스타틴, 메이탄시노이드를 포함한다.

"항-혈관형성제"는 특히 질병 또는 질환과 연관된 혈관신생 또는 혈관 형성 과정을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 분자이다. 문헌 [Brem, Cancer Control 6(5): 436-458 (1999)]에 나열된 것을 포함하여 많은 혈관신생 길항제가 확인되었고, 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 혈관신생 길항제는 특이적 혈관형성 인자 또는 혈관신생 경로를 표적화하는 분자를 포함한다. 특정 측면에서, 혈관신생 길항제는 단백질 조성물, 예를 들어 혈관형성 인자를 표적으로 하는 항체이다. 예시적인 혈관형성 인자는 문헌 [Leung et al. Science, 246:1306 (1989), 및 Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같은 VEGF (때때로 "VEGF-A"로도 공지됨), 즉 165개 아미노산의 혈관 내피세포 성장 인자 및 관련 121개, 189개 및 206개 아미노산의 혈관 내피세포 성장 인자 및 그의 천연 대립유전자 및 가공된 형태이다. 용어 "VEGF"는 또한 165개 아미노산의 인간 혈관 내피세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. 천연 VEGF의 상기 말단절단된 형태는 천연 VEGF와 동등한, Flt-1 (VEGF-R1) 및 KDR (VEGF-R2) 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.

예시적인 항-혈관신생 인자는 중화성 항-VEGF 항체이다. "항-VEGF 항체"는 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관련되는 질병 또는 병태를 표적으로 하여 이를 회복시키고자 할 때 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 항-VEGF 항체는 대체로 다른 VEGF 상동체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C에 결합하지 않고, 다른 성장 인자, 예를 들어 PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1와 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직하게는, 항-VEGF 항체는 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역 및 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합 상보성 결정 영역을 포함하고 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에 따라 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이고, 베바치주맙 (BV; 아바스틴 (Avastin)™)으로 알려진 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

별법으로, 항-혈관형성제는 그의 하나 이상의 VEGF 수용체 (예를 들어, VEGFR1 및 VEGFR2)에 대한 결합을 포함하여 VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 제거, 저하 또는 방해할 수 있는 임의의 소분자일 수 있다.

"신경 분화제"는 신경세포성 전구체 (예를 들어, 신경 줄기 세포, 전이 증폭 세포, 신경모세포 등)의 신경세포로의 분화를 촉진, 야기, 자극 또는 유도하는 분자이다. 신경세포 전구체는 태아 신경계, 성인 뇌 또는 신경 능선으로부터 유도된 세포이고, 세포 분열 및 신경세포 생성이 모두 가능하다. 신경세포는 축삭 돌기, 활동 전위 증식, 및 시냅스 전달에 관련되는 단백질을 발현하는 유사분열후 (비분열성) 세포이다. 신경 분화제는 그의 증식 속도를 감소시키고 축삭 성장, 활동 전위 증식, 및 시냅스 전달에 관련되는 단백질의 발현을 증가시키도록 신경세포성 전구체를 유도하는 분자이다. 신경 분화의 마커의 예는 MAP2, 베타-튜불린, GAD65 및 GAP43을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 신경 분화제의 예는 레티노산, 발프로산 및 그의 유도체 (예를 들어 에스테르, 염, 레티노이드, 레티네이트, 발프로에이트 등); 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 수용체의 다른 아고니스트; 노긴; BDNF, NT 4/5 또는 NTRK2 수용체의 다른 아고니스트; 전사 인자 ASCL1, OLIG1의 발현을 증가시키는 물질; dll3 아고니스트, 노치 1, 2, 3 또는 4 길항제, 감마 분비효소 억제제, 예를 들어 니카스트린, Aph1A, Aph1B, Psen1, Psen2 및 PSENEN의 소분자 억제제, 델타 유사 리간드 (Dll)-1 길항제, 델타 유사 리간드 (Dll)-4, 재기드 1 길항제, 재기드 2 길항제; numb 아고니스트 또는 numb-유사 아고니스트를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인한 생물학적 활성을 의미하고, 항체 이소형에 따라 상이하다. 예시적인 "효과기 기능은" C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.

"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 특정 세포독성의 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig가, 상기 세포독성의 효과기 세포가 항원 보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 의미한다. 항체는 세포독성의 세포에 존재하고, 상기 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 교대 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) 참고). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아의 수용체 FcRn를 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들어, 혈액으로부터 단리할 수 있다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적 세포의 용해를 의미한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 서브클래스의)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"GDM-발현 신경아교종"은 GDM 폴리펩티드 길항제가 그에 대해 결합할 수 있거나 또는 GDM 소분자 길항제가 신경아교종을 표적화하여 신경아교종에 대한 치료 효과를 가질 수 있도록 그의 세포의 표면 상에 충분한 수준의 GDM 폴리펩티드를 임의로 생산한다.

또다른 실시태양에서, "GDM-발현 신경아교종"은 GDM 폴리펩티드 길항제가 그에 대해 결합할 수 있거나 또는 GDM 소분자 길항제가 암을 표적화하여 암에 대한 치료 효과를 가질 수 있도록 충분한 수준의 GDM 폴리펩티드를 임의로 생산하고 분비한다. 길항제에 있어서, 상기 분자는 종양 세포에 의한 분비된 GDM 폴리펩티드의 생산 및 분비를 감소, 억제 또는 방지하는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

GDM 폴리펩티드를 "과다발현하는" 신경아교종 종양은 동일한 조직 종류의 비암성 세포에 비해 그의 세포 표면에 유의하게 더 높은 수준의 GDM을 갖거나, 또는 생산하고 분비하는 것이다. 상기 과다발현은 유전자 증폭 또는 전사 또는 번역 증가에 기인할 수 있다. 세포 표면에서 또는 분비된 상태에서 그 수준을 증가시키는 GDM의 향상된 발현을 측정하는 다양한 진단 또는 예측 분석, 예를 들어 항-GDM 항체를 사용한 면역조직화학 분석, FACS 분석 등을 수행할 수 있다. 별법으로, GDM 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준은 예를 들어 GDM-코딩 핵산 또는 그의 상보체에 대응하는 핵산 기반 프로브를 사용한 형광 계내 혼성화 (FISH; 1998년 10월 공개된 WO98/45479), 서던 블로팅, 노던 블로팅, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통해 세포에서 측정할 수 있다. 별법으로, GDM 폴리펩티드 과다발현은 예를 들어 항체 기반 분석 (또한, 예를 들어, 1990년 6월 12일 등록된 미국 특허 4,933,294; 1991년 공개된 WO91/05264; 1995년 3월 28일 등록된 미국 특허 5,401,638; 및 Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990) 참조)을 사용하여 생물학적 유체, 예를 들어 혈청 내의 발산된 항원을 측정하여 결정할 수 있다. 상기 분석에 추가로, 다양한 생체 내 분석을 당업자는 이용할 수 있다. 예를 들어, 환자의 신체 내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 노출시킨 후, 예를 들어, 방사성의 외부 스캐닝에 의해 또는 치료제에 기노출된 환자로부터 얻은 생검의 분석에 의해, 환자에서 항체의 세포에 대한 결합을 평가할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 "결합 특이성"을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 조합한 항체 유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 아미노산 서열과, 항체 (즉, "이종") 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 다른 목적하는 결합 특이성의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 일반적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표지"는 "표지된" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 생성시키기 위해 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이팅된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 검출가능하거나 (예를 들어 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능의 억제 또는 제한 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At²¹¹, I^l31, I^l25, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제, 뉴클레오티드 분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체, 및 아래에 제시되는 상이한 항종양제 또는 항암제를 포함하고자 한 것이다. 다른 세포독성제는 아래에 기재된다. 살종양제는 종양 세포를 파괴시킨다.

"화학치료제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 히드록시우레아 탁산 (예를 들어 파클리탁셀 및 독세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제; 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 부툴린산; 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN(등록상표) 포함); CPT-11 (이로노테칸, CAMPTOSAR(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 염산염, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마ll 및 칼리케아미신 오메가ll (예를 들어, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참조); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 (chromophore) 및 관련 발색단백질 에네디와인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN(등록상표) 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항-대사산물, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테치미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 폴리사카라이드 복합체 (제이에이치에스 내쳐럴 프로덕츠 (JHS Natural Products, 미국 오레곤주 유진)); 로족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE(등록상표), FILDESIN(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL(등록상표) 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), ABRAXANE(등록상표) 크레모포르-프리 (Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-처리된 나노입자 제제 (아메리칸 마파슈티칼 파트너스 (American Pharmaceutical Partners, 미국 일리노이주 샤윰버그)), 및 TAXOTERE(등록상표) 독세탁셀 (롱-쁘랑 로러 (Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)); 클로람부실; 겜시타빈 (GEMZAR(등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN(등록상표)); 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN(등록상표)); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE(등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈 (XELODA(등록상표)); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체 및 상기 물질의 2 이상의 조합물, 예를 들어 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 플레드니솔론의 조합 요법의 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보빈과 조합한 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)을 사용한 치료의 약어)를 포함한다.

또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진시킬 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 저하, 차단 또는 억제하는, 종종 전신 또는 신체 전체 치료 형태로 사용되는 항호르몬제가 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수 있다. 그 예는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX(등록상표) 타목시펜 포함), 랄록시펜 (EVISTA(등록상표)), 드로록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (FARESTON(등록상표)); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향조절제 (ERD); 난소를 억제하거나 기능을 차단하는 물질, 예를 들어, 황체화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 아고니스트, 예를 들어 LUPRON(등록상표) 및 ELIGARD(등록상표) 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신선에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테치미드, MEGASE(등록상표) 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN(등록상표) 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR(등록상표) 보로졸, FEMARAO(등록상표) 레트로졸, 및 ARIMIDEX(등록상표) 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 상기 화학치료제의 정의는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS(등록상표) 또는 OSTAC(등록상표)), DIDROCAL(등록상표) 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA(등록상표) 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX(등록상표) 알렌드로네이트, AREDIA(등록상표) 팔미드로네이트, SKELID(등록상표) 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL(등록상표) 리세드로네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 부착성 세포 증식에 연관되는 시그날 전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE(등록상표) 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(등록상표) 백신, LEUVECTIN(등록상표) 백신, 및 VAXID(등록상표) 백신; LURTOTECAN(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX(등록상표) rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (ErbB-2 및 GW572016로도 알려진 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 상기 임의의 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 GDM-발현 신경아교종 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 GDM-발현 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 억제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다. 탁산 또는 히드록시우레아탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 모두 주목나무로부터 유도된 항암약물이다. 유럽 주목에서 유도된 도세탁셀 (TAXOTERE(등록상표), 롱-쁘랑 로러)은 파클리탁셀 (TAXOL(등록상표), 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 상기 분자는 튜불린 이량체로부터 미세관의 조립을 촉진시키고, 탈중합을 억제하여 미세관을 안정화시켜 세포의 유사분열을 억제한다.

"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 전체적인 화학 명칭은 (8S-cis)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.

용어 "시토킨"은 세포간 매개자로서 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 관용어이다. 상기 시토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-성장인자; 전환 성장인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 시토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.

용어 "포장 삽입물"은 적응증, 사용, 투여량, 투여에 대한 정보, 금기사항 및/또는 상기 치료 제품 사용에 대한 경고를 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장에 통상적으로 포함되는 사용 지시물을 지칭하기 위해 사용된다.

용어 "계층 군집화"은 샘플의 세트를 그들의 유전자 발현의 유사성을 기준으로 집단으로 나누는 방법을 의미한다. 사용되는 표준 알고리즘은 상관성 매트릭스로부터 출발하여 모든 성분을 트리 (tree)로 조립하는 계통수를 반복적으로 계산한다 [Eisen, M.B. et al., P.N.A.S. 95:14863-14868 (1998)].

용어 "k 평균 군집화"는 샘플의 세트를 그들의 유전자 발현의 유사성을 기준으로 집단으로 나누는 방법을 의미한다. k-평균 군집화에서, 모든 샘플은 초기에 많은 클러스터 중의 하나에 무작위로 할당된다. 이어서, 각각의 샘플 클러스터에서의 유전자 발현의 대표적인 또는 평균 값을 계산하고, 각각의 샘플을 가장 가까운 유사성을 보이는 클러스터에 재할당한다. 이 과정을 안정한 구조가 달성될 때까지 반복한다 [Duda, R.O. and Hart, P.E., Pattern Classification and Scene Analysis, Wiley, New York (1973)].

용어 "보팅 체계"는 특정 발현 수준으로 발현되거나 또는 이 수준을 초과하여 발현되는 각각의 종양 서브타입에 대한 GDM의 수를 비교하는 것을 기초로 하여 종양을 군에 할당하는 방법을 의미한다 [Freije et al., 상기 문헌]

참조	XXXXXXXXXXXXXXX	(길이 = 15 아미노산)
비교 단백질	XXXXXYYYYYYY	(길이 = 12 아미노산)
% 아미노산 서열 동일성 = (ALIGN-2에 의해 결정된, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 동일하게 일치하는 아미노산 잔기의 수)/(참조 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수) = 5/15 = 33.3%

참조	XXXXXXXXXX	(길이 = 10 아미노산)
비교 단백질	XXXXXYYYYYYZZYZ	(길이 = 15 아미노산)
% 아미노산 서열 동일성 = (ALIGN-2에 의해 결정된, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 동일하게 일치하는 아미노산 잔기의 수)/(참조 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수) = 5/10 = 50%

참조-DNA	NNNNNNNNNNNNNN	(길이 = 14 뉴클레오티드)
비교 DNA	NNNNNNLLLLLLLLLL	(길이 = 16 뉴클레오티드)
% 핵산 서열 동일성 = (ALIGN-2에 의해 결정된, 2개의 핵산 서열 사이의 동일하게 일치하는 뉴클레오티드의 수)/(참조-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드의 총수) = 6/14 = 42.9%

참조-DNA	NNNNNNNNNNNN	(길이 = 12 뉴클레오티드)
비교 DNA	NNNNLLLVV	(길이 = 9 뉴클레오티드)
% 핵산 서열 동일성 = (ALIGN-2에 의해 결정된, 2개의 핵산 서열 사이의 동일하게 일치하는 뉴클레오티드의 수)/(참조-DNA 핵산 서열의 뉴클레오티드의 총수) = 4/12 = 33.3%

II . 본 발명의 조성물 및 방법

A. 방법 및 의미

현재, 고등급 신경아교종은 조직병리학적 기준에 의해 진단되고, 대부분의 상기 종양에 대한 공지의 확고한 예후 인자는 종양 등급 및 환자 연령으로 제한된다. chrs 1p 및 19q의 손실이 희소돌기신경아교종의 예후값이라는 널리 인정된 개념 (Cairncross et al., J. Natl Cancer Inst. 90: 1473-1479 (1998))은 보다 넓은 신경아교종 집단에 걸쳐 처리에 대한 결과 및 반응을 예측하기 위한 분자 마커의 개발에 대한 관심을 촉발시켰다. 수많은 유전자 변경이 GBM에서 설명되었고, 일부, 예를 들어 EGFR 증폭 및 p53 돌연변이는 1차 및 2차 GBM을 구분하는 것으로 보이지만 (von Deimling et al., Glia 15: 328-338 (1995); Watanabe et al., Brain Pathol 6: 217-223 (1996)), 상기 마커는 결과를 예측하거나 질병 관리에 대한 결정을 지도할 때 그다지 유용하지 않다. 중요한 사실은, 최근의 발현 프로파일링 연구가 신경아교종의 분자 분류가 예후값일 수 있음을 보여주었다는 것이다 (Freije et al., Cancer Res. 64: 6503-6510 (2004); Nutt et al., Cancer Res. 63: 1602-1607 (2003)). 현재의 연구에서, 본 발명자들은 종양 공격성 및 질병 진행에 연관된 분자 변경을 확인하고, 분자 분류가 표적화된 치료에 대한 반응의 예측에 사용될 수 있음을 시사하는 증거를 제공한다.

종양 서브클래스는 예후값을 갖고 질병 진행의 패턴을 설명한다.

본 발명자들은 본원에서, 종양을 규정된 발현 시그너쳐에 대한 유사성에 기초한 서브타입에 배정하는 고등급 별아교세포종에 대한 신규한 예후적 분류 체계를 설명한다. 신경아교종의 각각의 3개의 분자 서브타입은 별개의 조직 세트에 유사하고, 상이한 측면의 조직 성장의 마커가 풍부하다. 현재의 분석은 35개 시그너쳐 유전자의 세트를 이용하지만, 상기 마커는 각각의 종양 서브타입을 확인하기 위해 사용될 수 있는 훨씬 더 긴 마커의 목록를 대표한다. 본 발명자들이 전신경 (PN)으로 명명한 하나의 종양 서브타입은 현저하게 더 양호한 예후에 의해 구분되고, 정상 뇌 및 신경발생의 과정과 연관된 유전자를 발현한다. 고도 증식성 세포주 또는 중간엽 기원의 조직에 대한 유사함을 특징으로 하는 2가지 불량한 예후의 서브타입은 각각 세포 증식 또는 혈관신생을 나타내는 유전자 발현 프로그램의 활성화를 보인다. 본 발명자들은 Mes 및 Prolif 종양 종류와 연관된 불량한 생존이 빠른 속도의 세포 분할 또는 혈관신생에 의해 제공된 종양 세포의 생존 향상에 의해 부여된 성장 이점에 관련되는 것으로 생각한다. 단지 존재나 부재 또는 혈관신생 또는 유사분열상은 서브클래스를 구분하지 않았지만, 상기 특색은 거의 모든 다형성 교모세포종의 특징이므로 그러한 것으로 예상된다. 선행 연구에서는 신경아교종에서 증식 또는 혈관신생의 마커의 예후 값을 제안하였지만 (Ho et al., Am. J. Clin. Pathol. 119: 715-722 (2003); Hsu et al., Cancer Res. 56: 5684-5691 (1996); Osada et al., Anticancer Res. 24: 547-552 (2004)), 상기 과정과 차별적으로 연관된 별개의 종양 서브세트의 존재를 나타내지 않았다. 본 발명자들의 Prolif 및 Mes 신경아교종 서브타입은 몇몇 상피 종양 종류에서 불량한 결과와 연관된 상처-치유 시그너쳐의 마커의 서브세트의 발현을 특징으로 함에 주목한다 (표 A; 문헌 [Chang et al., P.N.A.S. (USA) 85: 704-710 (2005)] 참조).

현재의 연구에서 확인된 종양 서브타입은 발현 프로파일링에 의해 확인된 앞서 보고된 예측 서브타입에 겨우 유사하다. 특히, 3개의 앞서 공개된 연구에서는 본 발명자들이 설명하는 PN 및 Mes 종양 서브타입에 거의 유사한 표현형을 보고한다 (Freije et al., 상기 문헌; Liang et al., P.N.A.S. (USA) 102: 5814-5819 (2005); Nigro et al., Cancer Res. 65: 1678-1686 (2005)). 또한, 선행 문헌 (Godard et al., Cancer Res. 63: 6613-6625 (2003))에서는 본 발명자들의 Mes 종양 서브타입에 유사하게 보이는 종양 하위집단을 규정하는 혈관형성 유전자의 클러스터를 강조한다. 본 발명에서 PN 대 Mes 마커의 발현의 상호 배타적인 패턴의 관찰은 상기 2가지 종양 서브타입의 존재에 관한 합의를 설명하는 것을 돕는다. 심지어 PN 및 Mes 마커를 모두 발현하는 종양 시료 내에서, 본 발명자들은 발현의 겹치지 않는 공간 분포를 발견한다. LOH10 및 Mes와 PN 시그너쳐 사이의 구별 사이의 강한 연관은 LOH10을 예후적 발현 시그너쳐에 연결시키는 선행 발견과 일치하고 (Nigro et al., Cancer Res. 65: 1678- 1686 (2005)), 혈관형성 표현형과 LOH10 사이의 연관은 GBM 세포주 내로 chr 10 도입의 항-혈관형성 작용의 증명과 일치한다 (Hsu et al., Cancer Res. 56: 5684-5691 (1996).

증식의 마커가 풍부한 별개의 종양 서브타입의 존재가 하나의 선행 문헌에서 인지되었지만 (Freije et al., 상기 문헌), 다른 연구에서 설명되지 않았다. 본 발명자들의 발견은 Prolif 시그너쳐가 PN 또는 Mes 시그너쳐보다 덜 배타적이고, Prolif 시그너쳐와 함께 발생하는 신경아교종의 비율이 상이한 시설에서 얻은 샘플 집단들 사이에서 변화한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들이 Prolif 종양 서브클래스를 종양의 별개의 분자 서브타입으로서 분류하는 것을 지지하여, 본 발명자들은 Prolif 종양 내에 상기 종양 서브타입을 구분하는 게놈 변경의 패턴의 존재를 지적한다. 가장 특히, chr 1 상에서 PIK3R3 로커스의 증대는 Prolif 클래스의 종양에 특유한 특색인 것으로 보인다. Prolif 시그너쳐를 갖는 종양에 특유한 게놈 변경의 존재는 상기 종양을 별개의 서브클래스로서 지정하는 것에 찬성하고, 조사된 집단에서 상기 서브클래스의 발생에 대해 역학 인자가 역할을 미칠 수 있음을 제안한다.

PN 및 Mes 종양 시그너쳐의 놀라운 상호 배타성은 상기 종양 서브타입이 아마도 상이한 기원의 세포 종류로부터 발생하는 별개의 질병 단위를 반영하는 가능성을 제안한다. 그러나, 동일한 환자의 원발성 및 재발 종양의 매칭된 쌍을 연구함으로써, 본 발명자들은 원래 PN 또는 Prolif 서브타입으로서 발생한 일부 종양이 Mes 시그너쳐로 재발하는 것을 관찰하였다. Mes 표현형의 마커인 CHI3L1/YKL40의 초점상 발현이 재발시 Mes 클래스로 이동하는 것을 포함하여 원발성 종양에서 보인다. 특히, 초기 제시와 재발 사이에 감지가능한 PN 캐릭터를 얻는 종양은 경우는 보이지 않는다. PN에서 Mes 시그너쳐로 이동하는 신경 줄기 세포주의 능력과 함께 살펴보면, 서브클래스가 변화하는 종양의 능력은 종양 서브타입이 질병의 대안적인 분화 상태를 나타낼 수 있음을 제안한다. 그러나, 본 발명자들은 일부 명백한 이동이 종양 캐릭터에서 일시적인 변화보다는 종양 비균질성을 반영할 수 있다는 가능성을 무시할 수 없다. 또한, 본 발명자들의 실험 설계에 의해서는 질병 진행을 반영하는 유전자 발현에서 변경을 치료 효과에 의해 나타난 것과 구분할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들의 편방향 종양 서브클래스 이동의 발견은 종양 세포가 유전자 또는 후성유전자 (epigenetic) 이상의 누적의 결과로서 Mes 표현형을 획득할 수 있다는 가능성을 제안한다. Mes 서브타입 종양을 갖는 보다 고령의 환자가 상기 가설과 일치한다.

본 발명자들은 종양 세포 시그너쳐에서 겉보기 이동의 근원이 되는 분자 사건에 대한 직접적인 증거를 갖지 않지만, chr 10의 손실과 Mes 시그너쳐의 강한 상관성은 질병 진행의 생물학에 중요한 견해를 제공할 수 있다. 근원 메카니즘에 무관하게, Mes 표현형으로의 이동은 질병 진행의 공통 패턴인 것으로 보이고, 상피 종양의 증가된 악성 거동과 연관된 상피-중간엽 전이 (EMT)를 암시한다. EMT에서 Akt 활성화의 중심 역활과 일치하게 [Larue and Bellacosa, Oncogene 24: 7443 (2005)], 본 발명자들의 데이타는 Akt가 신경아교종에서 중간엽 전이를 유도하는데 역할을 한다는 것을 제안한다.

노치 및 Akt 시그날 전달에서 마커는 신경아교종 공격성을 예측한다

본 발명자들의 발견은 게놈, mRNA 및 단백질 수준에서 불량한 예후의 서브타입의 종양에서 Akt 시그날 전달의 변경을 활성화시키기 위한 증거를 입증한다. 수많은 선행 데이타가 고등급 아교세포 악성 종양의 형성 및 성장을 촉진하는데 있어서 akt 시그날 전달의 역할을 지지한다 (Knobbe et al., Neuro-Oncology 4: 196-211 (2002); Sonoda et al., Cancer Res. 61: 6674-6678 (2001). 유전 공학 처리된 마우스 모델에서 일련의 정교한 연구는 아교세포 악성 종양의 형성 및 성장을 촉진하는데 있어서 akt의 역할을 설득력 있게 입증하였다 (Holland et al., Nature Genetics 25: 55-57 (2000); Rajasekhar et al., Mol. Cell 12: 889-901 (2003); Uhrbom et al., Cancer Res. 62: 5551-5558 (2002); Xiao et al., Cancer Res. 65: 5172-5180 (2005). 인간 종양에서, EGFR 증폭 및 PTEN 결실은 모두 akt를 활성화시키는 공지된 변경이고, GBM 대 보다 저등급 병소 사이의 구분과 특이적으로 연관된다 (Stiles et al., Mol. Cell Biol. 22: 3842-3851 (2002)). 보다 최근에, PIK3CA에서 돌연변이, 및 PIK3CA 및 PIK3CD에서 균형을 이룬 카피수 증가가 모두 AA 및 GBM에서 설명되었다 (Broderick et al., Cancer Res. 64: 5048-5050 (2004); Mizoguchi et al., Brain Pathol. 14: 372-377 (2004); Samuels et al., Science 304: 54 (2004)). EGFR 증폭 또는 PI3K 서브유닛에서 유전자 변화의 예후값은 불명료하지만, 몇몇 연구에서는 chr 10 상의 손실, PTEN 로커스의 손실, 또는 향상된 PI3K 시그날 전달이 모두 GBM에서 불량한 결과와 연관됨을 보여주었다 (Chakravarti et al., J. Clin. Oncol. 22: 1926-1933 (2004); Lin et al., Clin. Cancer Res. 4: 2447-2454 (1998); Schmidt et al., J. Neur. Exp. Neurol. 61: 321-328 (2002); Smith et al., J. Nat. Cancer Inst. 93: 1246-1256 (2001); Tada et al., J. Neurosurg. 95: 651-659 (2001)). PI3K/akt 시그날 전달의 활성화는 증식, 생존, 및 혈관신생을 포함하는 성장 잇점을 부여하는 몇몇 생물학적 과정에 관여된다 (Abe et al., Cancer Res. 63: 2300-2305 (2003); Pore et al, Cancer Res. 63: 236-241 (2003); Su et al., Cancer Res. 63: 3585-3592 (2003)). 따라서, 본 발명자들은 Prolif 및 Mes 서브타입 종양의 불량한 결과가 각각 고속의 증식 또는 혈관신생을 특징으로 하는 보다 공격적인 성장 패턴을 촉진하도록 PI3K/akt 시그날 전달의 작용으로부터 인한 것으로 생각한다. 현재의 발견은 2가지 불량한 예후의 서브타입에서 akt 시그날 전달의 증식성 대 혈관형성 표명의 차이를 설명하기 위해 명료한 가설을 제공하지 않지만, 하나의 가능성은 Mes 종양에서 chr 10p 상의 로커스의 보다 빈번한 손실 또는 chr 7 상의 증대가 상기 구분에 기여할 수 있다는 것이다. 이와 관련하여 ch19 상에 코딩된 마커의 높은 빈도는 흥미롭다.

노치1 시그날 전달의 활성화는 최근에 신경아교종을 포함한 몇몇 악성 종양과 연관되었다 (Fan et al., Cancer Res. 64: 7787-7793 (2004); Purow et al., Cancer Res. 65: 2353-2363 (2005); Radtke and Clevers, Science 307: 1904-1909 (2005); Weng et al., Science 306: 269-271 (2004). 본 발명의 관찰은 고등급 신경아교종에서 노치 경로 마커의 예후값을 입증한다. 구체적으로, 본 발명자들은 노치1 핵 염색 및 몇몇 노치 경로 요소에 대한 mRNA가 불량한 예후의 서브타입에 비해 보다 양호한 결과 PN 종양 서브타입에서 유의하게 풍부함을 발견하기에 이르렀다. 또한, 본 발명자들은 2개의 독립적인 샘플 집단에서, 특히 PTEN 발현이 높은 경우에 DLL3에 대한 mRNA의 발현이 보다 긴 생존과 상호관련되는 것을 발견하였다. 몇몇 해석이 가능하지만, 하나의 흥미로운 가능성은 무손상 PTEN의 존재 하에, 노치 시그날 전달에 대한 DLL3의 억제 활성 [Ladi et al., J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005)]은 보다 분화된 표현형을 촉진함으로써 종양 성장을 제한할 수 있다는 것이다. 노치 시그날 전달의 정확한 역할에 무관하게, 본 발명의 2-유전자 PTEN & DLL3 Cox 모델의 예후값은 명백하게 akt 및 노치 시그날 전달을 종양 성장의 주요 결정자로서 지적한다.

신경아교종 성장의 조절과 전뇌 신경발생 사이의 평행성 .

현재의 조사는 예후적 종양 서브타입을 신경 줄기 세포 대 신경모세포 마커의 상대적인 발현에서의 차이 및 Akt 및 노치 시그날 전달 요소에서의 차이에 연관짓는다. 인간 신경아교종에 대한 하나의 모델은 모든 분자상 규정된 서브타입이 유사한 기원 세포 종류(들)로부터 발생하지만, 일부 종양은 보다 미분화된 신경 줄기 세포-유사 (Mes) 또는 전이-증폭-유사 (Prolif) 표현형으로 유지되는 한편, 다른 것 (PN)은 신경모세포 또는 미성숙 신경세포에 보다 가까운 표현형을 채택한다는 것이다. 동물 연구 [Bachoo et al., Cancer Cell 1: 269-277 (2002); Fomchenko and Holland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005)]에 의해 지지되는 상기 모델은 고등급 신경아교종에 대한 기원 세포 종류(들)이 신경 줄기 세포로부터 신경세포성 또는 아교세포 계통(들)로의 분화축을 따라 어떤 단계(들)에 속하는지 특이적으로 예측하지 않고, 종양의 표현형이 시그날 전달 경로에서 분자 변경에 의해 지시될 수 있음을 보여준다. PTEN 및 노치가 신경 줄기 세포 또는 전구세포를 증식하는 미분화된 상태로 유지하기 위해 전뇌 신경발생을 확실히 하도록 작용하는 중대한 역할에 비추어 (Groszer et al., Science 294: 2186-2189 (2001); Sakamoto et al., J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003); Yoon and Gaiano, Nature Neurosci. 8: 709-715 (2005)), 본 발명자들의 발견은 신경아교종 성장의 공격성이 신경발생 동안 선택된 세포 운명을 조절하는 과정에 의해 크게 지배될 수 있음을 제안한다.

새로 규정된 종양 서브타입의 표현형은 성인 전뇌에서 신경발생에서 단계에 평행하다. 수임 신경세포성 (또는 신경세포성-희소돌기 아교세포) 전구체에 유사하게, PN 서브타입의 종양은 낮은 속도의 증식을 갖고, 신경모세포 및 미성숙 신경세포와 연관된 마커를 전사 인자 OLIG2 및 Ascll를 다른 신경세포성 계통 마커와 함께 발현하는 것으로 보인다. 이와 대조적으로, Mes 및 Prolif 서브타입 종양은 신경세포성 계통의 마커가 결핍되지만, 신경 줄기 세포 및/또는 전이 증폭 세포의 측면을 반복한다. Prolif 종양의 명백하게 빠른 속도의 증식과 전이 증폭 세포 사이의 평행성은 쉽게 명백하다. 또한, 본 발명자들은 다른 클래스가 아니라 Prolif 서브타입의 일부 종양은 설치류 전뇌에서 빠르게 증식하는 단능성 전구체 세포의 마커인 MELK의 확고한 발현을 특징으로 함을 밝혔다 (Nakano et al., J. Cell Biol. 170: 413 (2005)). 또한, Prolif 및 Mes 서브클래스의 종양 모두에서 EGFR 증폭은 신경 줄기 세포 및 전이 증폭 세포의 EGF에 대한 반응성에 평행하다 (Doetsch et al., Neuron 36: 1021-1034 (2002)). Mes 종양에 의한 평활근, 내피세포, 및 연골 마커의 발현은 성인 전뇌로부터의 신경 줄기 세포의 보고된 다능성을 암시한다 (Bani-Yaghoub et al., Development 131: 4287-4298 (2004); Rietze et al., Nature 412: 736-739 (2001); Sieber-Blum, Developmental Neuroscience 25:273-278 (2003); Wurmser et al., Nature 430: 350-356 (2004)). 그러나, 해석에서 하나의 경고는 종양 발현 프로필이 종양 덩어리로의 줄기 세포-유사 집단의 동원에 의해 혼동될 수 있는 가능성에 관련된다.

흥미로운 사실은, Mes 종양 표현형과 신경 줄기 세포 팽창 사이의 평행성은 신경 줄기 세포와 내피세포 사이에서 보이는 밀접한 연관의 발생 반복을 포함한다는 것이다. 다른 종양 서브타입과 반대로, Mes 종양은 VEGF, 그의 수용체, 및 내피세포의 마커의 확고한 발현을 보인다. 최근의 발견은 VEGF가 성인 전뇌 신경 줄기 세포의 증식 및 생존을 촉진하는 것을 나타내고, 내피세포로부터 분비된 인자가 또한 신경 줄기 세포 증식을 촉진하는 것을 입증한다 (Cao et al., Nature Genetics 36: 827-835 (2004); Fabel et al., Eur. J. Neurosci. 18: 2803-2812 (2003); Jin et al., P.N.A.S. (USA) 99: 11946-11950 (2002); Maurer et al., Neurosci. Lett. 344: 165-168 (2003); Schanzer et al., Brain Pathol. 14: 237-248 (2004); Shen et al., Science 304: 1338-1340 (2004); Yasuhara et al., Reviews Neurosci. 15: 293-307 (2004); Zhu et al., FASEB J. 17: 186-193 (2003)]. Mes 종양 표현형의 종양 세포의 성장이 증가된 수준의 VEGF 및/또는 내피-유래 인자의 작용에 의해 지지될 수 있음을 생각하는 것은 흥미롭다. 이와 관련하여, VEGF 또는 그의 수용체를 표적화하는 치료법은 신생혈관을 표적으로 하는데 있어서 뿐만 아니라, 또한 신경 줄기 세포-유사 생물학을 나타내는 종양 세포의 성장을 직접 억제하는데 유익한 것으로 입증될 것이다. 신경관에서 VEGF의 표적화된 불활성화는 뮤린 전뇌에서 혈관 결함 및 현저한 정도의 신경세포성 세포자멸을 일으키는 것으로 최근에 입증되었다 (Raab et al., Thrombosis Haemostasis 91: 595-605 (2004).

치료적 관련성

본 발명의 발견은 신경아교종에 대한 효과적인 치료법의 개발을 위한 몇몇 관련성을 제공한다. 먼저, 현재의 조사는 아교세포 악성 종양의 최적 치료가 별개의 분자 카테고리의 종양에 표적화된 치료 요법에 의존할 수 있다는 합의에 추가되는 것이다 (Mischel et al., Cancer Biol. Therapy 2: 242-247 (2003); Newton, Expert Rev. Antican. Ther. 4: 105-128 (2004); Rao et al., Frontier Biosci. 8: e270-280 (2003)). 본 발명자들의 시험관내 발견은 본 발명자들이 규정하는 분자 시그너쳐가 특이적 시그날 전달 경로를 표적화하는 약제에 대한 반응을 예측할 수 있음을 제안한다. 두 번째로, 본 발명자들의 발견은 고등급 신경아교종에 대한 신규한 치료 요법의 개발에서 Akt 및 노치 경로 모두를 표적화하는 가치를 지지한다. 세 번째로, 표준 치료 후 종양 재발에 중간엽, 혈관형성 상태로의 표현형 이동이 동반될 수 있다는 제안은 심지어 덜 공격적인 표현형을 갖는 종양에서도 상기 공격적인 표현형 상태를 표적화하는 가치를 강조한다. 마지막으로, 줄기 세포 생물학과 보다 공격적인 신경아교종 표현형 사이의 상관성은 전뇌 신경발생을 보다 더 이해하면 아교세포 악성 종양에서 치료적 개입을 위한 신규한 통찰력을 얻을 수 있음을 제안한다.

A. 항- GDM 항체

한 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 신경아교종의 심도 결정 및/또는 질병 과정의 예측시에 치료제, 진단제 및/또는 예측제로서 사용될 수 있는 항-GDM 항체의 용도를 제공한다. 상기 목적을 위해 사용될 수 있는 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종컨쥬게이트 항체를 포함한다.

1. 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 항원 보강제의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성시킬 수 있다. 이 항체는 관련 항원 (특히 합성 펩티드가 사용될 때)을 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질에 컨쥬게이팅시키기 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 항원은 2관능성제 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통한 컨쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서 R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여,키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제에 컨쥬게이팅될 수 있다.

동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 (Freund) 완전 보강제와 합한 후 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 항원, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후에, 동물은 프로인트 완전 보강제 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스터된다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스터한다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반을 적절하게 사용한다.

2. 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터는 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후에, 림프구는 단리된 후, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포 (융합 파트너로서도 칭함)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 선택 배양 배지는 일반적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 융합되지 않은 모세포에 대해 선택하는 선택 배지에 민감한 세포이다. 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 라인, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어 X63-Ag8-653 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나사스))에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 항원에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.

목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 마우스 내로 세포의 i.p. 주사에 의해 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.

서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 항체 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 대한 문헌은 문헌 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]을 포함한다.

추가의 실시태양에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature. 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature. 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 사슬 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.

항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (C_H 및 C_L) 서열을 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 비-면역글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산하도록 변형시킬 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.

3. 인간 및 인간화 항체

본 발명의 실시에 유용한 항-GDM 항체는 추가로 인간화 항체 또는 인간 항체를포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수여자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc), 일반적으로 일부의 인간 면역글로불린을 포함할 것이다 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].

비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 그 내부에 비-인간으로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 것이다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 일반적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.

인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항체가 인간 치료용으로 의도될 때 항원성 및 HAMA 반응의 감소를 위해 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 V 도메인 서열이 확인되고, 인간화 항체의 인간 프레임워크 구역 (FR)으로서 허용된다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위집단의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 복수개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

항체가 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.

다양한 형태의 인간화 항-GDM 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 면역컨쥬게이트를 생성시키기 위해서 하나 이상의 세포독성제(들)과 임의로 컨쥬게이팅된 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체일 수 있다.

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 유전자 도입된 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (J_H) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스 내로 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 시험접종시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); 미국 특허 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 겐팜); 5,545,807; 및 WO 97/17852] 참조).

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 비면역화된 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 또한 항체의 기능성 특성에 기초한 선별을 통해 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다 (또한, 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905 참조).

상기 논의한 바와 같이, 인간 항체는 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해서도 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).

4. 항체 단편

특정 상황에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 단편의 보다 작은 크기는 대응하는 전장 분자의 유사한 항원 결합 특이성을 보유하면서 신속한 소실을 가능하게 하고, 고형 종양에 대한 접근성을 개선시킬 수 있다.

항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985) 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 재조합 숙주세포에 의해 직접 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 분비될 수 있고, 이에 의해 다량의 상기 단편을 간편하게 생산할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의한 바와 같이 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주세포 배양액으로부터 직접 단리할 수 있다. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체 내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은 미국 특허 5,869,046에 기재되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458 참조). Fv 및 sFv는 불변 영역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종류이고, 따라서 생체 내 사용 동안 비특이적 결합 감소에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질을 융합시키도록 제조될 수 있다 (Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌). 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

5. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 별개의 PDM 항원 또는 본원에서 설명된 특정 GDM 폴리펩티드의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 상기 항체 중 다른 항체는 상기 GDM 결합 부위를 다른 단백질의 결합 부위와 조합할 수 있다. 별법으로, 항-GDM 아암 (arm)은 GDM-발현 세포에 대한 세포성 방어 메카니즘에 집중하고 편재시키기 위해 백혈구 상의 촉발 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어 CD3), 또는 IgG의 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 또한, 이중특이적 항체는 세포독성제를 GDM을 발현하는 세포에 편재시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체는 GDM-결합 아암 및 세포 독성제 (예를 들어 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

WO 96/16673에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 설명하고, 미국 특허 5,837,234에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 설명한다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463에 나타나 있다. 미국 특허 5,821,337에서는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다.

이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.

상이한 방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, C_H2, 및 C_H3 영역을 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (C_H1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 세포 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 목적하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 목적하는 사슬 조합의 생성에 유의한 영향을 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 5,731,168에 기재된 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)으로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티 (cavity)"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 통상적인 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백질 분해 방식으로 절단되어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술파이드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.

최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응에 적용되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.

이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 V_L에 연결된 V_H를 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보성 V_L 및 V_H 도메인과 페어링하고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994) 참조).

3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)).

6. 이종컨쥬 게이트 항체

또한, 이종컨쥬게이트 항체가 본 발명의 범위에 포함된다. 이종컨쥬게이트 항체는 2개의 공유연결된 항체로 이루어진다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화시키고 (미국 특허 4,676,980), HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 가교결합제를 수반하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술파이드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함하고, 예를 들어 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.

7. 다가 항체

다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스가 아닌)일 수 있고, 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.

8. 효과기 기능의 공학 처리

예를 들어 항체의 항원 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 향상시키기 위해 효과기 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 내에 도입되어, 상기 영역 내에서의 사슬내 디술파이드 결합을 형성할 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 보일 수 있다 (Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992) 참조). 향상된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체도 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 이종2관능성 가교결합기를 사용하여 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 공학처리되어 향상된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) 참조). 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.

9. 면역컨쥬게이트

또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어 화학치료제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 컨쥬게이트)에 컨쥬게이팅된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다.

a. 화학치료제

상기 면역컨쥬게이트 생산에 유용한 화학치료제는 상기 설명한 바 있다. 사용될 수 있는 효소 활성의 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 다양한 방사성핵종이 방사성 컨쥬게이팅된 항체의 생산에 이용될 수 있다. 그 예는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다. 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이 항체에 방사성 뉴클레오티드의 컨쥬게이팅을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다.

항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 상기 독소의 유도체의 컨쥬게이트도 본원에서 고려된다.

b. 메이탄신 및 메이탄시노이드

하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항-GDM 항체 (전장 또는 단편)가 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이팅된다.

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 3,896,111). 뒤이어, 특정 미생물도 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어 그 명세서가 본원에 명백하게 참고로 포함된 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.

그의 치료 지수를 개선시키기 위해서, 메이탄신 및 메이탄시노이드는 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 컨쥬게이팅되었다. 메이탄시노이드를 포함하는 면역컨쥬게이트 및 그들의 치료 용도가, 예를 들어 그 명세서가 본원에 명백하게 참고로 포함된 미국 특허 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에 인간 결장직장암에 대해 작용하는 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1로 명명된 메이탄시노이드를 포함하는 면역컨쥬게이트가 기재되어 있다. 컨쥬게이트는 배양된 결장암 세포에 대해 높은 세포독성을 보이는 것으로 밝혀졌고, 생체 내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 보였다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에서는 메이탄시노이드가 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7에 또는 HEK-2/neu 종양유전자에 결합하는 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 디술파이드 링커를 통해 컨쥬게이팅된 면역컨쥬게이트를 설명하고 있다. TA.1-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성은 3 x 10⁵ HER-2 표면 항원/세포를 발현하는 인간 유방 암세포주 SK-BR-3에 대해 시험관 내에서 시험하였다. 약물 컨쥬게이트는 유리 메이탄시노이드 약물에 유사한 수준의 세포독성을 달성하였고, 이것은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시켜 증가시킬 수 있다. A7-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.

항-GDM 항체-메이탄시노이드 또는 GDM-결합 항체 단편-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항-GDM 항체 또는 GDM-결합 항체 단편을 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 항체 분자당 컨쥬게이팅된 평균 3 내지 4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향 없이 표적 세포의 세포독성을 증대시키는 효능을 나타내지만, 독소/항체의 심지어 하나의 분자라도 네이키드 (naked) 항체의 사용에 비해 세포독성을 증대시킬 것으로 예상된다. 메이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 및 본원에서 상기 언급된 다른 특허 및 비특허 간행물에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.

예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 개시된 것을 비롯한, 항체- 또는 항체 단편-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 제조를 위한 당업계에 공지된 많은 연결기가 있다. 연결기는 상기 확인된 특허에 개시된 바와 같은 디술파이드기, 티오에테르기, 산불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함하며, 디술파이드 및 티오에테르기가 바람직하다.

항체 또는 항체 단편과 메이탄시노이드의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 디술파이드 연결을 제공하기 위해 특히 바람직한 커플링제로는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 들 수 있다.

링커는 결합의 유형에 따라서 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 이러한 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

c. 칼리케아미신

목적하는 다른 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이팅된 항-GDM 항체 또는 GDM 결합 항체 단편을 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 패밀리는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 컨쥬게이트를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (모두 아메리칸 시아나미드 컴퍼니 (American Cyanamid Company)의 특허)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체로는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다 [Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998); 및 상기 언급된 아메리칸 시아나미드사의 미국 특허). 항체에 컨쥬게이팅시킬 수 있는 또다른 항종양 약물은 안티폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA는 둘다 세포내 작용 부위를 갖고, 형질막을 용이하게 통과하지 못한다. 따라서, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 물질을 세포 내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 증진된다.

d. 다른 세포독성제

본 발명의 항-GDM 항체에 컨쥬게이팅될 수 있는 다른 항종양제로는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 5,053,394, 5,770,710호에 기재된 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 물질의 패밀리, 및 에스페라미신 (미국 특허 5,877,296)을 들 수 있다.

사용될 수 있는 효소 활성의 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다. 예를 들어 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.

본 발명은 항체와, 뉴클레오티드 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역컨쥬게이트를 추가로 고려한다.

종양을 선택적으로 파괴시키기 위해, 항체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 방사성 컨쥬게이팅된 항-GDM 항체 생성을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용가능하다. 그 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소를 들 수 있다. 컨쥬게이트를 진단용으로 사용하는 경우에는, 컨쥬게이트는 섬광조영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc^99m 또는 I¹²³을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성 표지 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 예를 들어 수소 대신, 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc^99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹과 같은 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐 (IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세히 기재되어 있다.

항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드 함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research, 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.

별법으로, 항-GDM 항체 또는 GDM 결합 항체 단편 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 일정 길이의 DNA는 컨쥬게이트의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 이격되거나 또는 서로 인접해 있는 컨쥬게이트의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위해 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 컨쥬게이팅시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 소실제를 사용하여 결합되지 않은 컨쥬게이트를 순환물로부터 제거한 후, 세포독성제 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 컨쥬게이팅된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.

10. 면역리포좀

본원에 개시된 항-GDM 항체 또는 GDM 결합 항체 단편은 면역리포좀으로서 제제화될 수도 있다. "리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하기 위해 유용한 다양한 종류의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 베지클이다. 리포좀의 성분은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 2층 구조로 배열된다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545; 및 1997년 10월 23일 공개된 WO97/38731]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술파이드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이트될 수 있다. 화학치료제는 임의로 리포좀 내에 함유된다 (Gabizon et al., J. National Gancer Inst. 81(19):1484 (1989) 참조).

B. GDM 결합 올리고펩티드

본 발명의 GDM 결합 올리고펩티드는 본원에서 설명되는 GDM 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. GDM 결합 올리고펩티드는 공지의 올리고펩티드 합성 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있거나 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. GDM 결합 올리고펩티드는 길이가 대체로 적어도 약 5개의 아미노산, 별법으로 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개 이상의 아미노산이고, 상기 올리고펩티드는 본원에서 설명되는 GDM 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. GDM 결합 올리고펩티드는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험을 수행하지 않으면서 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 WO 84/03506 및 WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens. 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol. 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352: 624; Marks, J. D. et al., (1991) J. Mol. Biol. 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363, 및 Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668 참조).

이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 멤버(들)을 확인하기 위해 큰 올리고펩티드 라이브러리의 스크리닝을 가능하게 하는 잘 알려진 기술의 하나이다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질에 융합 단백질로서 제시되는 기술이다 (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386). 파지 디스플레이의 유용성은 무작위로 선택된 단백질 변이체 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA)의 큰 라이브러리가 높은 친화도를 갖는 표적 분자에 결합하는 서열에 대해 빠르고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 있다. 파지 상의 펩티드 (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378) 또는 단백질 (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol. 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363) 라이브러리의 디스플레이는 수백만개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 특이적 결합 특성을 갖는 펩티드에 대해 스크리닝하기 위해 사용되었다 (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리 분류는 매우 많은 변이체의 제조 및 증식을 위한 전략, 표적 수용체를 사용한 친화도 정제 절차, 및 결합 농축 결과의 평가 수단을 필요로 한다 (미국 특허 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 및 5,663,143).

대부분의 파지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파지를 사용하지만, 람다상 (lambdoid) 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), T4 파지 디스플레이 시스템 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cancer Research. 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al. Infection & Immunity. 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci. 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes. 10: 173 (1995)) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905)도 알려져 있다.

기본적인 파지 디스플레이 개념에 대한 많은 다른 개선 및 변형이 이루어졌다. 이러한 개선은 선택된 표적 분자에 결합하기 위한 펩티드 라이브러리를 스크리닝하고 상기 단백질을 목적하는 특성에 대해 스크리닝하는 잠재력을 갖는 기능성 단백질을 디스플레이하는 디스플레이 시스템의 능력을 향상시킨다. 파지 디스플레이 반응을 위한 조합 반응 장치가 개발되었고 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 2분자 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 구속된 (constrained) 나선 펩티드의 특성 (WO 98/20036)을 분석하고 제어하였다. WO 97/35196에는 파지 디스플레이 라이브러리를 결합 리간드를 선택적으로 단리하기 위해 리간드가 표적 분자에 결합하는 한 용액 및 친화도 리간드가 표적 분자에 결합하지 않는 제2 용액과 접촉시키는 친화도 리간드의 단리 방법이 기재되어 있다. WO 97/46251은 무작위 파지 디스플레이 라이브러리를 친화도 정제된 항체로 바이오패닝 (biopanning)한 후, 결합 파지를 단리하고, 이어서 고친화도 결합 파지를 단리하기 위해 마이크로플레이트 웰을 사용하여 마이크로패닝 (micropanning)하는 방법을 설명한 바 있다. 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A를 친화도 태그로 사용하는 것도 보고된 바 있다 (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314에는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하기 위해 기질 차감 (substrate subtraction) 라이브러리를 사용하는 것이 기재되어 있다. 파지 디스플레이를 사용하여 세제에 사용하기 적합한 효소를 선택하는 방법이 WO 97/09446에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 추가의 방법은 미국 특허 5,498,538, 5,432,018, 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.

또한, 펩티드 라이브러리를 생성시키고 상기 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 미국 특허 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, 및 5,723,323에 개시되어 있다.

C. GDM 소분자 길항제

GDM 소분자 길항제는 본원에서 설명된 GDM 폴리펩티드의 시그날 전달 성분 (예를 들어, 수용체, 리간드, 세포내 성분 등)에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 본원에서 규정되는 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 (또는 그의 단편) 이외의 다른 작은 분자이다. 상기 유기 분자는 확인되고, 공지의 방법 (예를 들어, PCT 공개 WO00/00823 및 WO00/39585 참조)을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 유기 분자는 대체로 약 2000 달톤 미만, 별법으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만의 크기이고, 본원에서 설명된 GDM 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 상기 유기 분자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험을 수행하지 않으면서 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). GDM 분자 길항제는 예를 들어, 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, N-치환 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술파이드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 에나민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.

D. GDM 길항제의 스크리닝

본 발명의 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 유기 분자를 생성시키는 기술을 상기 설명하였다. 이제, 필요한 특정 생물학적 특징을 갖는 항체 (및 그의 항원 결합 단편), 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 추가로 선택할 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 다양한 GDM 길항제의 성장 억제 효과는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 내인성으로 또는 GDM 유전자로 형질감염된 후 GDM 폴리펩티드를 발현하는 신경아교종 세포를 이용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 적절한 종양 세포주 및 GDM-코딩 핵산으로 형질감염된 세포를 다양한 농도에서 수 일 (예를 들어, 2 내지 7일) 동안 본 발명의 GDM 길항제로 처리하고, 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나, 일부 다른 비색 분석에 의해 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또다른 방법은 상기 GDM 길항제의 존재 또는 부재 하에 처리된 세포에 의한 ³H-티미딘 흡수를 비교하는 것이다. 처리 후, 세포를 수확하고, DNA 내로 혼입된 방사능의 양을 섬광계수기에서 정량한다. 적절한 양성 대조군은 선별된 세포주를 세포주의 성장을 억제하는 것으로 공지된 성장 억제 항체로 처리하는 것을 포함한다.

생체 내에서 종양 세포의 성장 억제는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 결정할 수 있다. 바람직하게는, 종양 세포는 GDM 폴리펩티드를 과다발현하는 것이다. 바람직하게는, 상기 GDM 길항제는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 GDM-발현 종양 세포의 세포 증식을 미처리된 종양 세포에 비해, 한 실시태양에서 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서 약 25-100%, 보다 바람직하게는 약 30-100%, 훨씬 더 바람직하게는 약 50-100% 또는 70-100%까지 억제할 것이다. 성장 억제는 세포 배양액 중의 약 0.5 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 GDM 길항제 농도에서 측정될 수 있고, 여기서 성장 억제는 종양 세포를 항체에 노출시킨 후 1-10일에 결정된다. 항체는 길항제 및/또는 아고니스트를 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 체중으로 투여할 때 항체의 제1 투여로부터 약 5일 내지 3개월 내에, 바람직하게는 약 5 내지 30일 내에 종양 크기를 감소시키거나 종양 세포 증식을 감소시킬 경우에 생체 내에서 성장 억제성이다.

세포 사멸을 유도하는 항체에 대해 선별하기 위해, 예를 들어 요오드화프로피듐 (PI), 트리판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 표시되는 바와 같은 막 통합의 상실을 대조군에 비해 평가할 수 있다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. GDM 폴리펩티드 발현 종양 세포를 배지 단독으로 또는 적절한 GDM 길항제를 함유하는 배지로 인큐베이팅한다. 세포를 3일 동안 인큐베이팅한다. 각각의 처리 후에, 세포를 세척하고, 세포 클럼프 (clump)의 제거를 위해 35 mm 여과기-캡핑된 12 x 75 튜브 (1 ml/튜브, 3개의 튜브/처리군)에 분취한다. 그 후, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)를 넣는다. 샘플은 FACSCAN(상표명) 유동 세포측정기 및 FACSCONVERT(상표명) 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 이용하여 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정된 바와 같이 통계적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 GDM 길항제를 선택할 수 있다.

목적하는 항체에 의해 결합된 GDM 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 GDM 길항제를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 것과 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석은 시험 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자가 항-GDM 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 에피토프 매핑을 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열을 알라닌 스캐닝에 의해서와 같이 돌연변이시켜 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이체 항체는 초기에 완전한 폴딩을 보장하기 위해 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험된다. 상이한 방법에서, GDM 폴리펩티드의 상이한 영역에 대응하는 펩티드를 시험 항체와의, 또는 시험 항체 및 특성이 결정된 또는 공지된 에피토프를 갖는 항체와의 경쟁 분석에 이용할 수 있다.

E. 항체 의존 효소 매개 전구약물 요법 ( ADEPT )

또한, 본 발명의 GDM 길항 항체는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학치료제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물 (예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 4,975,278 참조)로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 항체를 컨쥬게이팅함으로써 ADEPT에 사용될 수 있다.

ADEPT에 유용한 면역컨쥬게이트의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 효소는 인산염 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼린 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 (serratia) 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 효소 활성을 갖는 항체 (당업계에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 알려짐)가 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Massey, Nature 328: 457-458 (1987)] 참조). 항체-아브자임 컨쥬게이트는 종양 세포 집단에 아브자임을 전달하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

본 발명의 효소는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해, 예를 들어 상기 논의된 이종2관능성 가교결합 시약을 사용하여 항-GDM 항체에 공유 결합될 수 있다. 별법으로, 적어도 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)] 참조한다).

F. GDM 폴리펩티드 변이체

본원에 기재된 GDM 폴리펩티드에 추가하여, 본 발명에 사용하기 위해 본원에서 상기 분자의 변이체를 제조할 수 있는 것이 고려된다. 상기 변이체는 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변경을 도입하고/하거나 목적하는 항체 또는 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변경이 상기 분자의 번역후 프로세싱의 변경, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막 앵커링 (anchoring) 특징의 변경을 야기할 수 있음을 이해할 것이다.

아미노산 서열은 예를 들어 임의의 기술 및 예를 들어 미국 특허 5,364,934에 제시된 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 가이드라인을 사용하여 변이시킬 수 있다. 변이는 천연 서열에 비해 아미노산 서열을 변경시키는, 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 목적하는 아미노산 서열의 하나 이상의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 어느 아미노산 잔기가 목적하는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 목적하는 아미노산 서열의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자와 비교하고 높은 상동성 영역에서 이루어지는 아미노산 서열 변경의 수를 최소화함으로써 제시될 수 있다. 아미노산 치환은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교체, 예를 들어 류신을 세린으로 교체, 즉, 보존적 아미노산 교체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에 걸칠 수 있다. 허용되는 변이는 서열에 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성되는 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열이 보이는 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.

다양한 PDM 폴리펩티드의 단편이 본원에서 제공된다. 상기 단편은 예를 들어 전장 천연 항체 또는 단백질과 비교할 때 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 내부 잔기가 결여될 수 있다. 목적하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된 상기 단편도 본원에 개시된 방법에 유용하다.

상기 폴리펩티드 단편은 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법은 효소에 의한 소화에 의해, 예를 들어 특정 아미노산 잔기에 의해 규정되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 단백질을 처리하거나, 또는 DNA를 적합한 제한 효소로 소화시켜 상기 단편을 생성시키고 목적하는 단편을 단리하는 것을 수반한다. 또다른 적합한 기술은 목적하는 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭하는 것을 수반한다. DNA 단편의 목적하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에 사용된다. 바람직하게는, 상기 단편은 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 대응하는 전장 분자와 공유한다.

특정 실시태양에서, 목적하는 보존적 치환은 바람직한 치환의 표제 하에 표 6에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 6에 예시적인 치환으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 목적하는 변이체를 확인하기 위해 생성물을 스크리닝할 수 있다.

본래 서열	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Pro; Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신	Leu
Leu (L)	노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신	Leu

GDM 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서의 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.

(1) 소수성: 노르뉴신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반한다. 상기 치환된 잔기는 보존적 치환 부위에 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위 내에도 도입될 수 있다.

변이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개 (부위 지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이 유발을 사용하여 달성할 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 대해 수행하여 항-GDM 분자를 생산할 수 있다.

스캐닝 아미노산 분석은 또한 인접한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산에는 비교적 작은, 중성 아미노산이 존재한다. 상기 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린, 및 시스테인을 포함한다. 알라닌이 상기 군 중에서 일반적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이고, 그 이유는 알라닌이 베타-탄소를 지나서 존재하는 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 입체형태를 변경시킬 가능성이 작기 때문이다 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. 알라닌은 또한 가장 흔한 아미노산이기 때문에 일반적으로 바람직하다. 또한, 알라닌은 종종 매립된 위치 및 노출된 위치 모두에서 발견된다 [Creighton, The Proteins. (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당량의 변이체를 생성시키지 않을 경우에, 이소테릭 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

GDM 폴리펩티드의 적절한 입체형태 유지에 관련되지 않은 임의의 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교결합을 억제할 수 있다. 이와 반대로, 그의 안정성 (특히 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우)을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 상기 분자에 첨가될 수 있다.

특히 바람직한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 그들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 상기 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 수반한다. 간단히 설명하면, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합체로서 필라멘트성 파지 입자로부터 1가 양식으로 디스플레이된다. 이어서 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 표적 폴리펩티드 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 상기 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.

GDM 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우에) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 천연 서열 또는 미리 제조된 변이체의 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

G. GDM 폴리펩티드의 변형

또한, 공유 변형된 GDM도 본 발명의 범위 내에서 사용하기에 적합할 수 있다. 한 종류의 공유 변형은 상기 항체 및 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기와, 상기 항체 및 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제의 반응을 포함한다. 2관능성 물질을 사용한 유도체화는 예를 들어 상기 분자를 정제에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합시키는데 유용하다. 흔히 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 동종2관능성 이미도에스테르, 예를 들어 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 2관능성 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.

다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.

GDM 폴리펩티드의 다른 종류의 공유 변형은 항체 또는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변경을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴의 변경"은 천연 서열에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 삭제 (근원적인 글리코실화 부위의 제거 또는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의한 글리코실화의 제거에 의해), 및/또는 각각의 천연 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미하고자 한 것이다. 또한, 이 구문은 천연 단백질의 글리코실화의 정성적 변화, 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 포함한다.

항체 및 다른 폴리펩티드의 글리코실화는 대개 N-연결되거나 또는 0-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티 (moiety)의 부착을 나타낸다. 트리펩티드 서열, 즉 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 0-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 당, 즉 N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나의 부착을 나타내지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.

글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기한 트리펩티드 서열을 갖도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성할 수 있다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 상기 항체 또는 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환시켜 이루어질 수 있다 (0-연결된 글리코실화 부위의 경우). 상기 항체 또는 폴리펩티드 서열은 특히 목적하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 상기 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 기선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변경을 통해 임의로 변경될 수 있다.

탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 상기 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화의 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성할 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophvs., 259:52 (1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성할 수 있다.

다른 종류의 공유 변형은 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 연결시키는 것을 포함한다. GDM 폴리펩티드는 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

GDM 폴리펩티드의 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대한 융합에 의해 키메라 분자를 형성하는 변경이 본 발명의 방법에 사용하기 위해 고려된다.

한 실시태양에서, 상기 키메라 분자는 항-태그 항체가 그에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 GDM 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 상기 항체 또는 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 항체 또는 폴리펩티드의 상기 에피토프-태깅된 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 에피토프 태그에 결합하는 항-태그 항체 또는 다른 종류의 친화도 매트릭스를 사용하는 친화도 정제에 의해 상기 항체 또는 폴리펩티드를 쉽게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 그의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering. 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science. 255:192-194 (1992)]; α-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393- 6397 (1990)]를 포함한다.

다른 실시태양에서, 키메라 분자는 GDM 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 구역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태 ("면역어드헤신"으로도 불림)의 경우, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역을 포함할 수 있다. Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 상기 항체 또는 폴리펩티드의 가용성 (트랜스멤브레인 도메인 결실된 또는 불활성화된) 형태를 사용하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합체는 힌지, IgG1 분자의 C_H2 및 C_H3, 또는 힌지, C_H1, C_H2 및 C_H3 구역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생산에 대해서는, 또한 1995년 6월 27일 등록된 미국 특허 5,428,130을 참조한다.

H. GDM 폴리펩티드의 제조

하기 상세한 설명은 주로 상기 항체, 폴리펩티드 및 올리고펩티드의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 GDM 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, 상기 항체, 폴리펩티드 및 올리고펩티드를 제조하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법도 사용할 수 있다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 그의 일부는 고체상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성 [예를 들어, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) 참조]에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화 기술에 의해 수행할 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 달성할 수 있다. 상기 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 다양한 부분은 별개로 화학적으로 합성되고, 목적하는 생성물을 생산하기 위해 화학적 또는 효소에 의한 방법을 사용하여 조합될 수 있다.

1. GDM 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 의 단리

GDM 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 상기 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드 mRNA를 갖고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것을 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리, 게놈 라이브러리 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)으로 편리하게 얻을 수 있다.

라이브러리는 목적하는 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 확인하도록 디자인된 프로브 (예를 들어 적어도 약 20-80개 염기의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 문헌에 기재된 바와 같은 표준 절차를 사용하여 수행할 수 있다 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. 별법으로, PCR 방법을 사용할 수 있다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 충분한 길이이고 가양성이 최소화되도록 충분히 분명하여야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝되는 라이브러리 내의 DNA에 대한 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지된다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, ³²P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 제공된다.

상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 공공 데이타베이스, 예를 들어 GenBank 또는 다른 사설 서열 데이타베이스에 기탁되고 이로부터 이용가능한 다른 공지의 서열과 정렬되어 비교될 수 있다. 분자의 규정된 영역 내의 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 당업계에 공지되고 본원에서 설명된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.

단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 처음으로 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여, 필요한 경우 cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 전구체 및 처리 중간체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 통상적인 프라이머 연장 절차를 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.

2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

숙주 세포는 GDM 폴리펩티드 생산을 위해 본원에서 설명된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양된다. 배양 조건, 예를 들어 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험을 수행하지 않으면서 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양액의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실용적인 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 볼 수 있다.

진핵 세포 형질감염 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl₂, CaPO₄, 리포좀-매개 및 전기천공은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 사용된 숙주세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용하는 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene. 23:315 (1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 4,399,216에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) 및 Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들어 핵 미세주사, 전기천공, 무손상 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법도 사용할 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하기 위한 다양한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature. 336:348-352 (1988)]을 참조한다.

본원에서 벡터 내에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위해 적합한 숙주세포는 원핵세포, 효모, 또는 보다 고등한 진핵 세포를 포함한다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 이용가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주세포는 엔테로박테리아세, 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이를 발생시키도록 변형될 수 있고, 상기 숙주의 예는 완전한 유전형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^r을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이가 존재하는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일 등록된 미국 특허 4,946,783에 개시된 돌연변이체 주변 세포질 (periplasmic) 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관 내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.

전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 예를 들어 치료 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 컨쥬게이팅되고 면역컨쥬게이트 자체가 종양 세포 파괴의 유효성을 보일 때 세균에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환시에 보다 긴 반감기를 갖는다. 이. 콜라이 내에서의 생산은 보다 빠르고 보다 비용 효율적이다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현은 예를 들어 U.S. 5,648,237 (Carter et. al), U.S. 5,789,199 (Joly et al.), 및 발현 및 분비의 최적화를 위한 번역 개시 구역 (TIR) 및 시그날 서열을 설명하고 있는 U.S. 5,840,523 (Simmons et al.) (상기 특허는 본원에 참고로 포함된다)을 참조한다. 발현 후에, 항체는 가용성 분획 내의 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리되고, 예를 들어 이소형에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 적합한 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 발현되는 항체를 정제하는 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있다.

원핵세포 이외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)는 흔히 사용되는 보다 저등한 진핵세포 숙주 미생물이다. 다른 숙주는 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe ) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어, 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2):737-742 [1983]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357), 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene. 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니거 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985])를 포함한다. 메탄올 자화 (methylotropic) 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로에케라 (Kloeckera), 피키아, 사카로마이세스, 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된, 메탄올로 성장할 수 있는 효모를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 효모 클래스의 예시적인 특정 종은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 제시되어 있다.

글리코실화된 GDM 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9 및 식물 세포, 예를 들어 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양액을 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 이용가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 가장 관심의 대상이 되어 왔고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.

숙주 세포는 GDM 폴리펩티드 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양된다.

3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용

각각의 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지 형태로 존재할 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터, 및 전사 종료 서열을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 하나 이상의 상기 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제작은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.

GDM 폴리펩티드는 직접 또는 시그날 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 성숙 서열을 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 시그날 서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군 중에서 선택된 원핵세포 시그날 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 시그날 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 팩터 리더 (사카로마이세스 알파-팩터 리더 및 미국 특허 5,010,182에 기재된 클루이베로마이세스 알파-팩터 리더), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 시그날일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열, 예를 들어 동일한 또는 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더가 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모, 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에 벡터를 클로닝하는데 유용하다.

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.

포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되어 증식하는, DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature. 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene. 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trpl 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).

발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하기 위해 보통 목적하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 효능있는 숙주세포에 의해 인식되는 프로모터가 공지되어 있다. 원핵세포 숙주에 사용하기 위한 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 목적하는 단백질 서열을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno (S. D.)) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-인산염 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-인산염 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-인산염 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.

포유동물 숙주세포에서 DNA 전사는 프로모터가 숙주세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.

GDM 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 대체로 약 10 내지 300 bp인 DNA의 시스 작용 (cis-acting) 성분이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 상기 아미노산 서열의 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.

진핵 숙주세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 영역은 상기 섹션에서 설명된 각각의 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다.

재조합 척추동물 세포 배양액에서 각각의 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 합성에 사용하기 적합한 다른 방법, 벡터, 및 숙주세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.

4. 숙주 세포의 배양

GDM 폴리펩티드 생산에 사용되는 숙주세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham's) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 외피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업자에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

5. 유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및/또는 발현은 예를 들어 본원에서 제공되는 서열을 기초로 하여 mRNA의 전사를 정량화하는 통상적인 서던 블로팅, 노던 블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 직접 샘플에서 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하여 특이적인 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 항체는 표지될 수 있고, 표면에 이중체의 형성시에 이중체에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록 이중체가 표면에 결합되어 분석을 수행할 수 있다.

별법으로, 유전자 발현은 면역학적 방법, 예를 들어 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량하는 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학 염색 및/또는 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 본 발명의 방법에 적합한 항체는 천연 서열 폴리펩티드 또는 올리고펩티드에 대항하여 또는 DNA에 융합되고 상기 폴리펩티드 또는 올리고펩티드의 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대항하여 제조할 수 있다.

6. 단백질 정제

GDM 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막에 결합된 경우에는, 폴리펩티드는 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하여 또는 효소에 의한 절단으로 막으로부터 방출될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포용해제에 의해 파괴될 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 이온-교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용한 겔 여과; 오염물, 예를 들어 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 목적하는 분자의 에피토프-태깅된 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼. 단백질의 다양한 정제 방법을 사용할 수 있고, 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzvmology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어 사용된 생산 방법의 특성 및 특허 청구된 방법에서 생산되는 특정 항체, 폴리펩티드 또는 올리고펩티드에 따라 결정될 것이다.

재조합 기술을 사용할 때, GDM 폴리펩티드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 상기 분자가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al. Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차가 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 세포 페이스트는 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.

정제는 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker, 미국 뉴저지주 필립스버그))가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 pH가 약 2.5-4.5인 용출 버퍼를 사용하는, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용될 수 있다.

I. 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 GDM 길항제 ("치료제")의 치료 제제는 요구되는 정도의 순도를 갖는 치료제(들)을 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington: The Science of Practice of Pharmacy, 20th edition, Gennaro, A. et al., Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000))와 혼합함으로써 보관을 위해 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 투여 대상에게 비독성이고, 버퍼, 예를 들어 인산염, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 긴장제 (tonicifier), 예를 들어 트레할로스 및 염화나트륨; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN(등록상표) PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 항체는 바람직하게는 5-200 mg/ml, 바람직하게는 10-100 mg/ml의 농도로 포함된다.

본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 상보 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 치료제(들) 이외에 추가의 항체, 예를 들어, 제2의 상기 치료제, 또는 몇몇 다른 표적, 예를 들어 신경아교종의 성장에 영향을 주는 성장 인자에 대한 항체를 제제에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 조성물은 화학치료제, 세포 독성제, 시토킨, 성장 억제제, 항-호르몬제, 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.

활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 상기 문헌]에 개시되어 있다.

지연 방출 제제를 제조할 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

J. GDM 길항제를 사용한 진단 및 치료

신경아교종에서 GDM 발현을 결정하기 위해, 다양한 진단 분석이 이용가능하다. 한 실시태양에서, GDM 폴리펩티드 과다발현은 면역조직화학 (IHC)에 의해 분석할 수 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 매립된 조직 절편을 IHC 분석에 적용하고, 다음과 같은 GDM 단백질 염색 강도 기준을 부여할 수 있다:

스코어 0 - 염색이 관찰되지 않거나, 10% 미만의 종양 세포에서 막 염색이 관찰된다.

스코어 1+ - 희미한/거의 지각할 수 없는 막 염색이 10% 초과의 종양 세포에서 검출된다. 세포는 단지 그 막의 일부에서만 염색된다.

스코어 2+ - 약한 정도 내지 중정도의 완전한 막 염색이 10% 초과의 종양 세포에서 관찰된다.

스코어 3+ - 중정도 내지 강한 정도의 완전한 막 염색이 10% 초과의 종양 세포에서 관찰된다.

GDM 폴리펩티드 발현에 대해 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 GDM을 과다발현하지 않는 것으로서 특성화될 수 있고, 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 종양은 GDM을 과다발현하는 것으로서 특성화될 수 있다.

별법으로, 또는 추가로, 종양에서 (존재할 경우) GDM 과다발현의 정도를 결정하기 위해서 INFORM(등록상표) (벤타나 (Ventana, 미국 아리조나주)에서 시판) 또는 PATHVISION(등록상표) (비시스 (Vysis, 미국 일리노이주))과 같은 FISH 분석을 포르말린-고정되고, 파라핀-매립된 종양 조직에 대해 수행할 수 있다.

GDM 과다발현 또는 증폭은 예를 들어 검출되는 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소 또는 형광 표지)로 태깅된 분자 (예를 들어 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자)를 투여하고 표지의 위치를 확인하기 위해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 생체 내 진단 분석을 사용하여 평가할 수 있다.

현재, 암의 단계에 따라, 암 치료는 암성 조직을 제거하기 위한 수술, 방사선 조사 요법, 및 화학요법 중의 어느 하나 또는 조합 요법을 포함한다. GDM 길항제를 투여하는 것을 포함하는 치료법은 특히 화학요법의 독성 및 부작용을 잘 견디지 못하는 고령의 환자 및 방사선 조사 요법의 효과가 한계를 갖는 전이성 질병에서 바람직할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법의 종양을 표적으로 하는 GDM 길항제는 질병의 초기 진단시에 또는 재발 동안 GDM-발현 암을 완화시키기 위해 사용될 수 있다. 치료 용도를 위해, 상기 GDM 길항제는 신경아교종의 치료를 위한 다른 통상적인 약제 및/또는 방법, 예를 들어 호르몬, 항혈관생성제, 또는 방사성 표지된 화합물, 또는 수술, 한랭 요법, 방사선 요법 및/또는 화학요법과 함께, 또는 그 전에 또는 후에 사용될 수 있다. 화학치료 약물, 예를 들어 TAXOTERE(등록상표) (도세탁셀), TAXOL(등록상표) (파클리탁셀), 에스트라무스틴 및 미톡산트론은 특히 발병 위험이 큰 환자에서 암 치료시에 사용된다.

특히, 파클리탁셀과 변형된 유도체의 조합 요법 (예를 들어, EP0600517 참조)이 고려된다. 상기 항체, 폴리에피토프, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 치료 유효 용량의 화학치료제와 함께 투여될 것이다. 또다른 실시태양에서, 상기 항체, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 화학치료제, 예를 들어 파클리탁셀의 활성 및 효능을 향상시키기 위해서 화학요법제와 함께 투여된다. 문헌 [Physicians' Desk Reference (PDR)]에서는 다양한 암의 치료에 사용된 상기 치료제의 투여량을 개시하고 있다. 치료상 효과적인 상기 언급된 화학치료 약물의 투여 요법 및 투여량은 치료되는 특정 암, 질병의 정도 및 해당 분야의 의사에게 잘 알려진 다른 인자에 따라 결정될 것이고, 의사에 의해 결정될 수 있다.

한 특정 실시태양에서, 세포독성제와 컨쥬게이팅된 상기 GDM 길항제를 포함하는 면역컨쥬게이트가 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 상기 면역컨쥬게이트는 세포에 의해 내재화되고, 면역컨쥬게이트가 결합하는 암세포를 사멸시킬 때 면역컨쥬게이트의 치료 효능을 증가시킨다. 바람직한 실시태양에서, 세포독성제는 암 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 방해한다. 상기 세포독성제의 예는 상기 설명한 바와 같고, 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.

상기 GDM 길항제 또는 그의 독소 컨쥬게이트는 공지의 방법에 따라, 예를 들어 정맥 내 투여, 예를 들어 볼러스로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 두개 내, 뇌척수 내, 관절 내, 경막 내, 정맥 내, 동맥 내, 피하, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다.

다른 치료 요법은 상기 GDM 길항제의 투여와 조합될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 동시-투여, 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함하고, 바람직하게는 두 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 보이는 시기가 존재한다. 바람직하게는, 상기 조합 요법은 상승적 (synergistic) 치료 효과를 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 치료적 처치 방법은 상이한 화학치료제의 칵테일의 동시 투여를 포함하여 상기 GDM 길항제와 하나 이상의 화학치료제 또는 성장 억제제의 조합 투여를 수반한다. 예시적인 화학치료제는 앞서 제시되었다. 상기 화학치료제의 제제 및 투여 계획은 제조자의 지시에 따라 또는 당업자가 실험적으로 결정한 바와 같이 사용될 수 있다. 또한, 화학요법의 제제 및 투여 계획은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다.

질병의 예방 또는 치료를 위해, 투여량 및 투여 방식은 공지된 기준에 따라 의사에 의해 선택될 것이다. GDM 길항제의 적절한 투여량은 치료될 질병의 종류, 질병의 심도 및 과정, 투여가 예방 또는 치료 목적인지의 여부, 환자 임상력 및 반응을 포함하는 선행 치료, 및 주치의의 판단에 따라 결정될 것이다. 상기 GDM 길항제는 한번에 또는 다수회에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여될 수 있다. 투여는 정맥 내 주입 또는 피하 주사에 의해 시행할 수 있다. 질병의 종류 및 심도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg 체중 (예를 들어, 약 0.1-15 mg/kg/용량)의 GDM 길항제가, 예를 들어 하나 이상의 별개의 투여, 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 투여 요법은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량, 이어서 약 2 mg/kg의 상기 GDM 길항제의 매주 유지 용량의 투여를 포함할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 요인에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 병태에 따라 수일 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 치료는 목적하는 질병 증상의 억제가 일어날 때까지 유지된다. 상기 요법의 진행은 통상적인 방법 및 분석에 의해, 의사 또는 다른 당업자에게 공지된 기준을 기초로 하여 쉽게 모니터링할 수 있다.

항체 단백질을 환자에 투여하는 것 이외에, 본원은 유전자 요법에 의한 항체의 투여를 고려한다. 상기 GDM 폴리펩티드 길항제를 코딩하는 핵산의 투여는 표현 "치료 유효량의 항체의 투여"에 포함된다. 예를 들어, 세포 내에서 항체를 생산하기 위한 유전자 요법의 사용에 대해서는 WO96/07321 (1996년 3월 14일 공개)를 참조한다.

상기 핵산 (임의로 벡터에 포함됨)을 생체 내에서 및 생체 외에서 환자 세포 내로 도입하기 위한 2가지의 주요 방법이 존재한다. 생체 내 전달을 위해, 핵산은 대체로 항체가 필요한 부위에서 환자 내로 직접 주사된다. 생체 외에서의 치료를 위해, 환자 세포를 분리하고, 핵산을 상기 단리된 세포 내로 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는, 예를 들어 환자 내로 이식되는 다공성 막 내에 봉입시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 생존가능 세포 내로 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기술이 존재한다. 기술은 핵산이 시험관 내에서 배양된 세포 내로 전달되는지, 또는 생체 내에서 의도하는 숙주의 세포 내에 전달되는지에 따라 상이하다. 시험관 내에서 포유동물 세포 내로 핵산을 전달하기 적합한 기술은 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.

현재 바람직한 생체 내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어 아데노바이러스, 제1형 단순 헤르페스 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질 기반 시스템 (유전자의 지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 치료 프로토콜에 대해서는, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한 WO 93/25673 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.

K. 제조품 및 키트

치료 용도를 위해, 제조품은 용기, 및 신경아교종의 치료를 위한 용도를 표시하는, 용기 위에 있거나 용기와 연합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 암 병태 치료에 효과적인 조성물을 보유하고 있고, 멸균 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 GDM 길항제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 신경아교종 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 포장 삽입물은 GDM 길항제의 투여를 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 추가로, 제조품은 제약상 허용되는 버퍼, 예를 들어 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 다양한 다른 목적, 예를 들어 GDM-발현 세포 사멸 분석, 세포로부터 GDM 폴리펩티드의 정제 또는 면역침전을 위해 유용한 키트가 제공될 수 있다. GDM 폴리펩티드의 단리 및 정제를 위해, 키트는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 커플링된 각각의 GDM-결합 시약을 포함할 수 있다. 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 GDM 폴리펩티드의 검출 및 정량을 위해 상기 분자를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 제조품처럼, 키트는 용기, 및 용기 위에 있거나 용기와 연합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명에서 사용가능한 적어도 하나의 상기 GDM 결합-항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 버퍼, 대조 항체를 포함하는 추가의 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물에 대한 설명 및 의도하는 시험관 내 또는 진단 용도에 대한 설명서를 제공할 수 있다.

L. 센스 및 안티센스 GDM -코딩 핵산

GDM 길항제는 표적 GDM mRNA (센스) 또는 GDM DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는, GDM-코딩 핵산, 예를 들어 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 단편을 포함한다. 본 발명에 따르면, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 각각의 GDM DNA의 코딩 구역의 단편을 포함한다. 주어진 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 기초로 하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 방법은 예를 들어 문헌 [Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 및 van der Krol et al. BioTechniques 6:958, 1988]에 기재되어 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 표적 핵산 서열에 대한 결합은 이중체의 분해 증가, 전사 또는 번역의 조기 종료를 포함하는 복수의 수단 중의 하나에 의해, 또는 다른 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중체를 형성시킨다. 상기 방법은 본 발명에 포함된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포유동물에서의 암 유발에서 일정한 기능을 수행할 수 있는 GDM 단백질의 발현을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 백본 (또는 다른 당 연결, 예를 들어 WO 91/06629에 기재된 것)을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 당 연결은 내인성 뉴클레아제에 저항성이다. 저항성의 당 연결을 갖는 상기 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 안정하지만 (즉, 효소적 분해를 견딜 수 있음), 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.

본 발명에 따라 사용되는 안티센스 화합물은 공지의 고체상 합성 기술을 통해 편리하게 및 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 상기 합성을 위한 장비는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈를 포함하여 여러 공급 회사에서 시판하고 있다. 상기 합성을 위한 당업계에 공지된 임의의 다른 수단을 추가로 또는 별법으로 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것이 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 예를 들어 리포좀, 수용체 표적화 분자, 섭취, 분배 및/또는 흡수를 돕기 위한 경구, 직장, 국소 또는 다른 제제로서 다른 분자, 분자 구조체 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 봉입되거나, 컨쥬게이팅되거나 달리 회합될 수 있다. 상기 섭취, 분배 및/또는 흡수를 돕는 제제의 제조를 개시하고 있는 특허는 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 및 5,595,756을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예는 유기 잔기, 예를 들어 WO 90/10048에 기재된 것 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키는 다른 모이어티, 예를 들어 폴리-(L-리신)에 공유 연결된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 결합 특이성을 변경시키기 위해 중격제 (intercalating agent), 예를 들어 엘립티신 및 알킬화제 또는 금속 복합체가 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.

안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 CaPO₄-매개 DNA 형질감염, 전기천공을 포함하는 임의의 유전자 전달 방법에 의해, 또는 유전자 전달 벡터, 예를 들어 엡스타인-바아 (Epstein-Barr) 바이러스를 사용하여 표적 핵산 서열을 포함하는 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 절차에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 적합한 레트로바이러스 벡터 내에 삽입된다. 표적 핵산 서열을 포함하는 세포는 생체 내에서 또는 생체 외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉한다. 적합한 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유도된 레트로바이러스)로부터 유도된 것, 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C로 명명된 이중 카피 벡터를 포함하고, 이로 제한되지 않는다 (WO 90/13641 참조).

또한, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO 91/04753에 기재된 바와 같은 리간드 결합 분자와의 컨쥬게이트 형성에 의해 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 시토킨, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 컨쥬게이션은 그의 대응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 리간드 결합 분자의 능력을 방해하거나 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 컨쥬게이팅된 형태의 세포 내로의 도입을 실질적으로 차단하지 않는다.

별법으로, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 WO 90/10448에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드-지질 복합체의 형성에 의해 표적 핵산 서열을 포함하는 세포 내로 도입될 수 있다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 바람직하게는 내인성 리파제에 의해 세포 내에서 해리된다.

안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 일반적으로 적어도 약 5개의 뉴클레오티드, 별법으로 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1000개의 뉴클레오티드이고, 이와 관련하여 용어 "약"은 참조된 뉴클레오티드 서열 길이 ± 참조된 길이의 10%를 의미한다.

M. GDM 길항제의 확인에 사용하기 위한 스크리닝 분석

분석은 당업계에서 그 특성이 잘 규명된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석, 및 세포-기반 분석을 포함하여 다양한 방식으로 수행할 수 있다.

길항제에 대한 모든 분석은 2개의 성분의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 GDM 폴리펩티드와 약물 후보를 접촉시키는 것을 필요로 한다는 점에서 공통적인 것이다.

결합 분석에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 단리되거나 반응 혼합물에서 검출될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 GDM 폴리펩티드 또는 약물 후보는 고체상, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 상에, 공유 또는 비-공유 부착에 의해 고정된다. 비-공유 부착은 일반적으로 고체 표면을 GDM 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시켜 달성한다. 별법으로, 고정된 항체, 예를 들어 고정되는 GDM 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 GDM 폴리펩티드를 고체 표면에 앵커링시킬 수 있다. 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비-고정된 성분을 고정된 성분, 예를 들어 앵커링된 성분을 포함하는 코팅된 표면에 부가하여 수행할 수 있다. 반응이 완료되면, 비-반응 성분은 예를 들어 세척에 의해 제거하고, 고체 표면에 앵커링된 복합체를 검출한다. 본래 비-고정된 성분이 검출가능한 표지를 보유할 때, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 본래 비-고정된 성분이 표지를 보유하지 않을 경우에는, 복합체 형성은 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 GDM 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지는 않을 경우에, 폴리펩티드와 그의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해 공지되어 있는 방법에 의해 분석할 수 있다. 상기 분석은 예를 들어 가교결합, 동시-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제와 같은 전통적인 방법을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 5789-5793 (1991)]에 개시된 바와 같이 문헌 [Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:9578-9582 (1991)]에 기재된 효모 기반 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성화제, 예를 들어 효모 GAL4는 2개의 물리적으로 별개의 모듈 (modular) 도메인으로 구성되고, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 다른 한 도메인은 전사-활성화 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로 "2-하이브리드 시스템"로서 칭함)은 상기 특성을 이용하고, 2개의 하이브리드 단백질을 사용하며, 여기서 한 단백질은 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합된 것이고, 다른 단백질은 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절 하에 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 결정된다. 상호작용 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출된다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2개의 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER™)를 클론텍으로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 또한, 상기 시스템은 특이적 단백질 상호작용에 관련된 단백질 도메인의 지도를 작성하고 상기 상호작용에 중요한 아미노산 잔기의 위치를 정확하게 제시하도록 확장될 수 있다.

본원에서 확인된 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다. 대체로, 2개의 산물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 하에서 충분한 시간 동안 유전자 산물 및 세포내 또는 세포외 성분을 포함하는 반응 혼합물을 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해서, 반응은 시험 화합물의 부재 및 존재 하에 실시한다. 또한, 양성 대조군으로 사용하기 위해 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가한다. 시험 화합물과 혼합물에 존재하는 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)은 본원에서 상기 설명된 바와 같이 모니터링한다. 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서가 아니라 대조 반응(들)에서 복합체의 형성은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해함을 나타낸다.

길항제에 대한 분석을 위해, GDM 폴리펩티드는 특정 활성에 대해 스크리닝되는 화합물과 함께 세포에 첨가될 수 있고, GDM 폴리펩티드의 존재 하에 목적하는 활성을 억제하는 화합물의 능력은 화합물이 GDM 폴리펩티드의 길항제임을 나타내는 것이다. 별법으로, 길항제는 경쟁적 억제 분석을 위한 적절한 조건 하에 GDM 폴리펩티드 및 효능있는 길항제를 막-결합된 GDM 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 조합함으로써 검출될 수 있다. GDM 폴리펩티드는 수용체에 결합된 GDM 폴리펩티드 분자의 수를 사용하여 효능있는 길항제의 유효성을 결정할 수 있도록 예를 들어 방사성에 의해 표지될 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지된 수많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 분류에 의해 확인될 수 있다 [Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)]. 바람직하게는, 폴리아데닐화 RNA가 GDM 폴리펩티드에 반응성인 세포로부터 제조되고, 상기 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀 (pool)로 분할하고 GDM 폴리펩티드에 비반응성인 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키기 위해 사용하는 발현 클로닝이 사용된다. 유리 슬라이드 상에서 성장한 형질감염된 세포는 표지된 GDM 폴리펩티드에 노출된다. GDM 폴리펩티드는 요오드화 또는 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 도입을 포함하여 다양한 수단에 의해 표지될 수 있다. 고정 및 인큐베이션 후에, 슬라이드를 자가방사법 분석에 적용한다. 양성 풀을 확인하고, 하위 풀을 제조하고, 상호작용성 하위 풀링 (sub-pooling)을 사용하여 재형질감염시키고, 재-스크리닝 과정을 통해 최종적으로 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론을 생성시킨다.

또다른 수용체 확인 방법으로서, 표지된 GDM 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화도-연결될 수 있다. 가교결합된 물질은 PAGE에 의해 분리하여 X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 포함하는 표지된 복합체를 절제하여 펩티드 단편으로 분리한 후, 단백질 미세 서열결정 (micro-sequencing) 과정에 적용한다. 미세 서열결정으로부터 얻은 아미노산 서열은 추정 수용체를 코딩하는 유전자를 확인하기 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 한 세트의 축퇴성 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하기 위해 사용될 것이다.

길항제에 대한 다른 분석에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 제제를 후보 화합물의 존재 하에 표지된 GDM 폴리펩티드와 함께 인큐베이팅할 것이다. 이어서, 상기 상호작용을 향상시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.

효능있는 길항제의 보다 특정한 예는 면역글로불린과 GDM 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 특히 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-개별특이형 항체, 및 상기 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화 형태, 및 인간 항체 및 항체 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 항체를 포함한다. 별법으로, 효능있는 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 보이지 못하여 GDM 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 GDM 폴리펩티드의 돌연변이된 형태일 수 있다.

다른 효능있는 GDM 폴리펩티드 길항제는 예를 들어 안티센스 RNA 또는 DNA 분자가 표적 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 하는 경우에, 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구성체이다.

효능있는 길항제는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 또는 GDM 폴리펩티드의 다른 관련 결합 부위에 결합하여 GDM 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 작은 분자를 포함한다. 작은 분자의 예는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소 활성의 RNA 분자이다. 리보자임은 상보성 표적 RNA에 대한 서열-특이적 혼성화, 이어서 엔도뉴클레아제 절단에 의해 작용한다. 효능있는 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지의 기술에 의해 확인할 수 있다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), 및 PCT 공개 WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개)]를 참고한다.

전사 억제에 사용되는 삼중 나선 형성시의 핵산 분자는 단일가닥이고 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 이중체의 한 가닥 상에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치를 필요로 하는, 훅스틴 (Hoogsteen) 염기-페어링 규칙을 통한 삼중 나선 형성을 촉진시키도록 디자인된다. 추가의 상세한 내용은 예를 들어 상기 PCT 공개 WO 97/33551을 참고한다.

상기 작은 분자는 상기 본원에서 논의된 임의의 하나 이상의 스크리닝 분석 및/또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.

하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 의도는 없다.

본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.

실시예

실시예 1:

실험 과정

종양 샘플 및 환자 특징

연구된 모든 종양 환자의 요약은 도 8A에 포함된다. 생존 분석을 위해, 3개의 발현 프로파일링 데이타세트를 분석하였다. 본 발명자들은 MDA에서 76명의 환자로부터 동결된 조직 샘플을, UCSF로부터 39명의 환자로부터 RNA를 (Nigro et al., Cancer Res. 65: 1678-1686 (2005)), UCLA로부터 앞서 공개된 연구로부터 데이타를 얻었다 (Freije et al., 상기 문헌). 2개의 제1 데이타세트에서 분석된 환자는 다음 기준에 일치하였다: 신선-동결된 샘플을 초기 외과 절제 시점에 이전에 방사선치료 또는 화학치료를 받지 않은 환자 (> 21세)로부터 얻었다. 임상 추적 조사 정보는 수술 후 적어도 2년의 기간 동안 또는 사망시까지 이용가능하였다. UCSF 및 MDA에서 이들 후향 실험실 연구를 위해 Institutional Review Board/Human Subjects 승인을 얻었다. 환자는 WHO 기준에 따라 AA 또는 GBM으로서 등급 결정되고, ≥90%의 샘플이 종양을 나타냈음을 보증하기 위해 모든 조직으로부터의 절편을 신경병리학자 (KA)가 검사하였다. 통상적이지 않은 조직학적 변이체를 배제하였다. UCLA 데이타세트로부터, 본 발명자들은 환자 연령 및 마이크로어레이 품질 대조 파라미터에 대해 본 발명의 기준을 만족하는 앞서 공개된 연구에서 모든 환자로부터의 데이타를 이용하였다. 상기 데이타세트는 희소돌기 아교세포 또는 혼합 형태학의 환자 및 2년 미만에서 중도절단된 생존 시간을 갖는 환자를 포함한다.

정상 성인 뇌 조직은 뇌 종양 또는 신경학적 질환의 병력이 없는 공여자로부터의 대뇌피질의 부검 시료로 이루어지고, National Neurological Rsearch Brain Bank (미국 캘리포니아주 로스앤젤레스)로부터 얻었다.

종양 등급 대 시그너쳐 클래스의 비교를 위해 (도 2A), 임상력이 이용가능하지 않은 추가의 샘플 시료를 포함한다. 정상 성인 뇌 조직은 뇌 종양 또는 신경학적 질환의 병력이 없는 공여자로부터의 대뇌피질의 부검 시료로 이루어지고, National Neurological Rsearch Brain Bank (미국 캘리포니아주 로스앤젤레스)로부터 얻었다. 뇌 및 태아 별아교세포의 시료를 제외하고는, 도 2B에서 분석된 샘플에 대한 데이타를 인간 샘플로부터의 아피메트릭스 (Affymetrix) 데이타의 진 로직 (Gene Logic, 미국 매릴랜드주 개터스버그)에 대한 동의를 통해 얻었다.

유전자 발현 프로파일링, 비교 게놈 혼성화 , 및 정량적 PCR

이전의 공개문헌 (Freije et al., 상기 문헌; Nigro et al., 상기 문헌)에 포함되지 않은 시료에 대해, 종양 및 정상 뇌 시료로부터의 총 세포성 RNA를 퀴아겐 (Qiagen)의 RNA 단리 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 게놈 DNA 오염물질은 온-컬럼 (on-column) DNase 소화 단계를 통해 제거하였다. 앞서 공개된 기술 (Tumor Analysis Best Practices Working, 2004)에 따라 발현 프로파일링을 위해 아피메트릭스 U133A & B 칩을 사용하였다. 품질 대조 파라미터는 샘플이 GAPDH에 대한 3'/5' 비가 <3인 것을 가정하면 액틴에 대해 >3의 3'/5' 비를 나타내도록 허용되는 것을 제외하고는 상기 공개문헌에 설명된 바와 같았다. 정량적 PCR을 각각의 샘플에 대해 2중으로 ABI Prism7700 서열 검출기 (어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 Taqman PCR Core 시약 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 수행하였다. 25 ng의 총 RNA를 각각의 50 ㎕ 반응물에서 사용하였다. Rab 14가 많은 수의 샘플을 가로질러 발현에서 매우 적은 변동을 나타내므로 이를 표준화를 위해 사용하였다. 모든 프라이머쌍은 67-79 bp의 앰플리콘을 생성하도록 설계되었다. DNA 추출 및 어레이 CGH는 앞서 설명된 바와 같이 수행하였다 (Misra et al., Clin. Cancer Res. 11(8): 2907-18 (2005)). CGH를 통해 분석된 96개의 샘플 중에서, 43개의 샘플에 대한 데이타는 앞서 공개된 연구로부터 얻었다 (Nigro et al., 상기 문헌 ).

마이크로어레이 데이타의 분석

Microarray Analysis Suite 버젼으로부터의 시그널 강도 값을 마이크로어레이 데이타의 모든 분석을 위해 500의 척도 인자 (scaling factor)로 이용하였다. K-평균 군집화 및 병합 군집화를 유사성 척도로서 피어슨 상관성을 이용하여 Spotfire Decision Site 소프트웨어 버전 7.3을 사용하여 수행하였다. 각각의 유전자에 대해, 군집화에 앞서 데이타를 Z 스코어로 표준화하였다. 종양 분류에 사용된 35개의 시그너쳐 유전자는 MDA 생존 샘플 세트에서 각각의 3개의 종양 서브세트에 대해 가장 확고한 마커를 나타낸다. 각각의 서브세트의 마커는 다음과 같이 확인된다: 각각의 76개의 샘플을 생존과 가장 강하게 상호관련된 108개의 유전자의 발현의 k-평균 군집화에 기초하여 3개의 군 중 하나에 지정한다. 1 x 10^-4의 p값 컷오프 (cutoff)를 사용하여, 그의 발현이 다른 서브클래스의 종양에 비해 각각의 서브클래스 내의 샘플들 사이에 상이한 모든 유전자를 확인하기 위해 t 테스트를 이용하였다 (표 A, GDM 참조). 이어서, 각각의 비교를 위해, 본 발명자들은 최소 p값을 갖는 500개의 프로브 세트를 배수 변화에 의해 순위-결정하였다. 각각의 종양 서브타입에 대해 시그너쳐 유전자로서 사용된 프로브 세트는 최대 배수 변화를 보이고, 최소 발현 컷오프를 만족하는 (관심있는 집단 내에서 평균 강도 400) 확인된 전장 서열에 대응하는 것이었다. k-평균 군집화를 사용하는 실험적 결정에 의해, 군집화를 위한 유전자 목록이 3개의 종양 서브타입 중 하나의 보다 적은 마커를 포함하도록 균형을 이루는 것을 가정하면 30-60개의 프로브 세트를 사용하여 군집화를 수행할 때 안정한 샘플 클러스터가 생성되었음이 밝혀졌다. 최종 35개의 시그너쳐 유전자는 15개의 PN, 15개의 Mes, 및 5개의 Prolif 마커를 포함한다. PN, Prolif 및 Mes 중심값에 대한 유사성 스코어는 76개의 MDA 생존 샘플의 k-평균 군집화에서 생성된 각각의 중심값에 대해 피어슨 상관 계수를 나타낸다. 도 4 F-I 및 도 7에 제시된 데이타의 통계학적 비교를 위해, 로그-변환된 데이타를 다수 집단 비교를 위해 교정된 t 테스트를 통해 분석하였다. 로그-변환된 발현 데이타를 또한 도 5에 대해 수행된 통계학적 분석을 위해 사용하였다.

계내 혼성화 및 면역조직화학

³³P-UTP-표지된 안티센스 리보프로브를 프로메가 (Promega)의 시험관내 전사 시스템 (프로메가)을 사용하여 전사하고, 다양한 공급처로부터 얻은 파라핀-매립된 인간 신경아교종 조직 마이크로어레이에 앞서 설명된 방법을 이용하여 혼성화하였다 (Phillips et al., Science 250: 290-294 (1990)). 도 1에 도시된 영상은 페타겐, 인크. (Petagen, Inc.)로부터 얻은 조직 마이크로어레이 내에 포함된 조직 코어의 것이다. BCAN에 대한 프로브는 668 bp 단편 (939 내지 1606)을 나타내고, CHI3L1/YKL40에 대한 프로브는 1158 bp 단편 (121 내지 1278)을 나타낸다.

파라핀-매립된 절편에 대해 면역조직화학을 앞서 설명된 바와 같이 수행하였다 (Simmons et al., Cancer Res. 61: 1122-1128 (2001)). 1차 항체는 셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology, 미국 매사추세츠주 베벌리))의 항-p-akt (ser473), 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈))의 항-노치이었다. 등급판정은 분석된 시료의 시그너쳐 군에 대해 모르는 신경병리학자가 수행하였다.

시험관내 연구

앞서 설명된 GBM 세포주를 시험관내 연구를 위해 사용한다 (Hartmann et al., Internat. J. Oncol. 15: 975-982 (1999)). 신경구 배양액을 위해, CD133 비드를 사용하여 양성적으로 분류된 세포를 원발성 GBM 시료에 대해 설명된 바와 같이 배양액 내에 유지시켰다 (Singh et al., Nature 432: 396-401 (2004)). 모든 신경구 배양액은 N2 보충물 (인비트로겐 (Invitrogen)) 및 NSF1 (캄브렉스 (Cambrex))을 갖는 Neurobasal 배지 (인비트로겐) 내에 유지한다. 존재하는 경우, EGF 및 FGF는 20 ng/ml의 농도로 첨가된다. 각각의 세포주를 세포주의 분자 시그너쳐에 대해 모르는 관찰자가 EGF+FGF의 부재 하에 신경구 성장에 대해 등급판정한다. 등급판정 척도는 다음과 같다: 0 = 생존가능한 신경구가 없음, 1 = 느리게 팽창하는 신경구, 2 = 중정도 성장율, 3 = 중정도 내지 빠르지만 EGF+FGF의 존재 하에 보이는 것보다 더 느린 성장, 4 = EGF+FGF에 의해 가속되지 않은 빠른 성장.

성장 억제 분석은 96 웰 플레이트에서 표준 세포 배양 조건을 사용하여 10% 소 태아 혈청을 갖는 DMEM 배지 내에서 수행한다. 라파마이신, LY294002, 또는 감마 분비효소 억제제 GSI-1 또는 S-2188을 사용하는 처리를 위해, 세포를 96웰 플레이트 내에 1500 또는 2000/웰의 세포 밀도로 플레이팅하고 (0일), 1일에 약물로 처리하고, 4일에 생존성에 대해 Alamar Blue 판독 (read-out)을 이용하여 평가하였다. 각각의 처리 조건은 2개의 분석에서 거의 동일한 결과를 보인 S-2188을 제외하고는 최소 3회의 실험으로 평가하였다. 도 6에 나타낸 결과는 하나의 대표적인 실험의 결과이다.

결과

분자 시그너쳐는 고등급 별아교세포종의 예후 서브클래스를 규정한다

GBM (n=55) 및 AA (n=21)의 새로 진단된 환자로부터 76개의 샘플을 MD Anderson Cancer Center (MDA)로부터 얻고, 종양을 상이한 예후를 갖는 집단으로 분류하는 유전자 발현 패턴을 확인하기 위해 DNA 마이크로어레이를 통해 프로파일링하였다 (도 1A-C). 현재의 연구에서 분석된 상기 및 모든 종양 환자에 대한 인구통계학을 도 8A에 도시한다. 본 발명자들은 먼저 그의 발현이 생존과 가장 강하게 상호관련된 프로브 세트를 확인한 후 (로그-변환된 발현 강도 값 대 생존 시간의 스피어만 r >0.45 또는 <-0.45), 108개의 생성되는 프로브 세트 및 76개의 샘플의 2-웨이 병합 (agglomerative) 군집화를 수행하였다. 상기 분석으로 생존-관련 유전자의 발현에서 현저하게 상이한 3개의 별개의 군의 샘플 세트를 확인하였다 (도 1A).

각각의 3개의 종양 서브클래스에 대한 마커의 세트를 개발하기 위해, 본 발명자들은 나머지 서브클래스 내의 종양에 비해 각각의 하위집단 내에서 종양에 의해 가장 강하게 과다발현된 프로브 세트를 확인하였다 (표 A: 신경아교종 결정 마커 참조). 각각의 3개의 종양 서브세트에 대한 가장 확고한 마커를 사용하여, 본 발명자들은 종양을 서브클래스에 지정하기 위해 계층 군집화 (도 1B) 또는 k-평균 군집화에서 사용될 수 있는 시그너쳐 유전자로서 칭하는 35개의 유전자의 세트를 얻었다. k-평균 군집화에 의해 규정된 종양 서브클래스는 각각의 서브클래스를 특징하는 마커 유전자 목록의 주된 특징을 인지하기 위해 전신경 (PN), 증식성 (Prolif) 및 중간엽 (Mes)으로 지정된다. 각각의 종양 서브클래스에 대해, 중심값을 35개의 시그너쳐 유전자의 평균 발현값으로부터 계산하였다 (도 1B). 중심값은 종양 서브타입에 대한 원형 (prototypical) 발현 패턴으로서 보일 수 있고, 추가의 샘플이 3개의 중심값에 대한 시그너쳐 유전자의 발현의 유사성에 기초하여 분류될 수 있다. MDA 데이타세트 내의 환자에 대한 카플란-마이어 그래프는 PN 서브클래스의 중앙값 생존 (174.5주)이 Prolif (60.5) 또는 Mes 서브타입 (65.0주; 도 1C)보다 현저하게 더 길었음을 보여준다.

신규한 종양 분류 체계의 예후값을 입증하기 위해, 본 발명자들은 2개의 추가의 독립적인 데이타세트를 검사하였다. 하나의 데이타세트는 University of California San Francisco (UCSF)에서 치료된 환자로부터 얻은 AA 및 GBM 샘플의 세트로부터 생성된 한편, 제2의 확인 데이타세트는 UCLA에서 보인 별아교세포, 희소돌기 아교세포 및 혼합 형태학의 등급 III & IV 종양의 환자에 대한 앞서 공개된 연구로부터 얻었다 (Freije et al., 2004). 두 확인 세트 내의 종양은 MDA 데이타 세트에서 규정된 중심값에 대한 시그너쳐 유전자의 발현의 유사성에 기초하여 PN, Prolif, 및 Mes 서브타입으로 분류되었다. 두 확인 세트 내의 종양 서브타입의 생존에 대한 카플란-마이어 그래프는 초기 데이타세트에서 관찰된 것과 매우 유사한 패턴을 보여주었다 (도 1 D&E). GBM 환자만을 고려하면, PN 대 다른 클래스 사이의 구분의 예후값은 MDA 샘플 세트 내에서 또는 합해진 모든 3개의 데이타세트를 가로질러 통계적으로 유의한 것으로 보였다 (p<0.O5, PN 대 다른 클래스의 두 비교를 위한 t 테스트).

이어서, 선택된 PN 및 Mes 마커의 발현을 마이크로어레이 및 정량적 실시간 PCR 모두에 의해 비교하였다. 본 발명자들은 시그너쳐 유전자 목록으로부터 PN 및 Mes 마커로서 각각 DLL3 (델타 유사 리간드 3) 및 CHI3L1/YKL40을 선택하고, 상기 동일한 2개의 서브클래스에 대해 마커의 보다 광범위한 목록 (표 A)으로부터 각각 BCAN 및 CD44를 선택하였다. 도 1F & G에 보이는 바와 같이, 대부분의 신경아교종 샘플은 PN 마커의 쌍 또는 Mes 마커의 쌍에 대해 집단 평균을 초과하는 발현값을 나타냈지만, PN 및 Mes 마커의 조합에 대해서는 그렇지 않았다.

독립적인 종양 환자의 세트에 대한 계내 혼성화는 BCAN 및 CHI3L1/YKL40 mRNA에 대한 발현의 상호 배타적인 패턴을 확인하였다 (도 1H). 대부분의 시료는 BCAN 또는 CHI3L1/YKL40에 대해 강한 시그날을 나타냈지만, 두 마커 모두에 대해서는 그렇지 않았다. 그러나, 일부 시료는 겹치지 않는 세포 요소 내에서 각각의 2개의 마커의 초점상 발현을 나타냈다. 가장 일반적으로, 이들은 넓은 BCAN 양성 구역을 함유하는 시료 내에서 CHI3L1/YKL40 발현의 작은 초점을 갖는 시료이었다. 상기한 경우에, CHI3L1/YKL40 발현은 종종 혈관과 연관된다.

PN , Prolif , 및 Mes 시그너쳐는 종양 등급 및 환자 연령에서 상이한 종양 하위집단을 규정한다

본 발명의 분석을 총 256개의 고등급 신경아교종을 포함하도록 확장시키면 (표 1), 대부분의 종양이 PN, Prolif 또는 Mes 중심값에 대해 강한 유사성, 및 다른 2개의 중심값과 중간 또는 음성 상관성을 나타냈음이 관찰되었다 (도 2A). 상기 발견은 샘플이 도 2A에 도시된 3차원 그래프에서 삼각형의 꼭짓점에서 군집하는 경향으로 반영된다. 일부 샘플은 2개의 중심값에 대해 중정도 유사성을 보였지만, 매우 적은 샘플은 3개의 모든 중심값에 대해 약한 또는 중간 유사성을 보였다. 따라서, 대부분의 고등급 신경아교종은 3개의 별개의 표현형 상태 중 하나로 존재하는 경향이 있지만, 보다 드물게는 2개의 조건 사이의 중간인 상태로 존재할 수 있다.

새로 규정된 종양 서브클래스는 조직학적 종양 등급과 강한 연관성을 나타냈다. 검사된 거의 모든 등급 III 종양 시료 (89%)는 이들이 희소돌기 아교세포 또는 별아교세포 형태학을 나타내는지에 무관하게 PN으로서 분류되었다. 이와 대조적으로, 유의한 비율의 등급 IV 병소 (GBM)은 각각의 3개의 분자 카테고리로 분류되었다. 검사된 184개의 GBM 샘플 중에서, 32%는 PN이고, 20%는 Prolif이고, 48%는 Mes이었다.

MDA 샘플 세트 내에 포함된 GBM 환자로부터 H&E 염색된 절편의 정성 검사는 종양의 분자 서브클래스를 균등하게 구분한 조직학적 특색을 밝히지 않았다. 그의 발생이 분자 서브클래스와 통계적으로 연관되는 유일한 형태학적 특색은 종양 괴사이고, 이는 PN 종양에서 덜 빈번하였다. PN으로 확인된 9명의 GBM 환자 중에서, 4개는 임의의 괴사 구역이 없었다. 이와 대조적으로, 22개의 Mes GBM 중 단지 2개 (p<0.O5, PN 대 Mes, 피셔 (Fischer) 정확 검정) 및 24개의 Prolif GBM 중 0개 (p=0.005, PN 대 Prolif)가 괴사를 나타내지 않았다.

환자 연령에 대한 종양 등급 및 생존 시간 모두의 잘 확립된 상관성에 일치하게, 분자 서브타입으로 종양의 지정이 환자를 연령에 기초하여 계층화하는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 생존 분석에서 185명의 새로 진단된 환자 중에서, PN 서브클래스 내의 종양을 갖는 환자는 Prolif 또는 Mes 서브클래스 내의 종양을 갖는 환자보다 유의하게 더 어렸다 (p<0.O05 두 비교를 위한 t-테스트). PN, Prolif 및 Mes 서브클래스의 종양을 갖는 환자에 대한 평균 연령±SEM은 각각 40.5±1.4세, 49.0±2.5세, 및 50.7±1.3세이었다. GBM에 대해, Mes 환자는 PN보다 유의하게 더 나이가 든 반면 (p <0.O5, t 테스트), Prolif 환자는 다른 2개의 클래스와 연령에서 상이하지 않았다.

PN , Prolif , 및 Mes 시그너쳐는 별개의 세트의 정상 조직을 특성화한다

PN, Prolif 및 Mes 중심값으로 대표되는 분자 시그너쳐의 생물학적 유의성에 대한 견해를 얻기 위해, 몇몇 인간 조직 및 세포 종류에서 35개의 시그너쳐 유전자의 발현을 검사하였다. 상기 분석으로 별개의 세트의 조직이 신경아교종 서브클래스를 규정하는 각각의 중심값에 유사하다는 것이 밝혀졌다 (도 2B). 태아 및 성인 뇌는 모두 PN (전신경) 중심값과 양성 상관성을 가졌다. 인간 태아 뇌로부터 유래된 2개의 신경 줄기 세포주는 또한 정상 배양 조건 하에 PN 시그너쳐를 보였다 (도 2B). Mes (중간엽) 시그너쳐를 보이는 조직은 뼈, 활막, 평활근, 내피세포, 및 수지상 세포를 포함하였다. 또한, 배양된 인간 태아 별아교세포의 샘플은 Mes 중심값과 명백한 양성 상관성을 보였다. 말초혈로부터 단리된 조혈 줄기 세포 및 고도 증식성 세포주 Jurkat는 Prolif 중심값과 강한 연관을 가졌다. 흥미롭게도, 2개의 신경 줄기 세포주는 향신경성 인자 BDNF의 처리 및 처리 중지에 대해 반응하여 시그너쳐 서브클래스가 PN에서 Mes 클래스로 이동하였다 (도 2B).

재발 시에, 종양은 Mes 표현형을 향해 이동하는 경향이 있다

종양 서브클래스를 규정하는 분자 시그너쳐가 각각의 종양 환자의 고정된 특색인지 또는 치료 또는 질병 진행의 함수로서 변할 수 있는지를 결정하기 위해, 동일한 환자의 원발성 및 재발 별아교세포종을 대표하는 26쌍의 매칭된 시료의 발현 시그너쳐를 비교하였다. 모든 26개의 원발성 대 재발 샘플 쌍에서 시그너쳐의 평균 변화는 PN 중심값에 대한 유사성에서 0.18±0.06의 손실 (피어슨 r에서 평균 이동±SEM), Mes 중심값에 대한 유사성에서 0.20±0.09의 증대, 및 Prolif 중심값에 대한 유사성에서 매우 적은 변화 (0.02±0.08의 증대)에 대응하였다. 26명의 환자 중 18명의 환자가 동일한 분자 서브클래스로 발병하고 재발한 반면, 8명의 종양은 재발 시에 클래스가 변하였다 (도 2C). 표현형 클래스 이동의 상기 8명의 환자 중에서, 하나를 제외한 전부가 Mes 서브클래스로 이동을 나타내고; 3명의 환자가 PN에서 Mes 서브타입으로 이동하였고, 4명이 Prolif에서 Mes 표현형으로 이동하였다. 클래스 이동의 마지막 경우는 중정도 Mes 유사성에서 중정도 Prolif 유사성으로 이동한 환자이다.

쌍 (pair-wise) 분석을 이용하여, 마이크로어레이의 유의성 분석 (SAM)으로 Mes 서브클래스로 이동된 재발 종양에서 유의하게 상향조절된 유전자를 확인하였다 (도 2D). 상향조절된 유전자는 CHI3L1/YKL-40, CD44, 및 STAT3 (GBM 생물학에서 이전에 관여된 유전자) 뿐만 아니라 중간엽 조직의 전통적인 마커인 비멘틴 (VIM)을 포함하였다 (Eibl et al, J. Neuro-Oncol. 26: 165-170 (1995); Nigro et al., 상기 문헌; Nutt et al., Cancer Res. 63: 1602-1607 (2005); Rahaman et al., Oncogene 21: 8404-8413 (2002); Tanwar et al., Cancer Res. 62: 4364-4368 (2002)). CHI3L1/YKL-40은 인간 종양에서 방사선 저항을 예측하고 (Pelloski et al., Clin. Cancer Res. 11: 3326-3334 (2005), 시험관내 방사선 조사 이후 클론원성 생존을 촉진하는 (Nigro et al., 상기 문헌) 것으로 보고되었고, 상기 발견은 치료 후 종양 재발 시에 발현에서 상대적인 증가와 일치한다. Mes 클래스로 이동하는 환자에서 유의하게 하향조절된 유전자는 발견되지 않았다.

재발 시에 PN으로부터 이동된 환자로부터의 조직에 대한 면역조직화학은 현저한 핵 OLIG2 발현의 빈번한 손실 및 CHI3L1/YKL-40의 상향조절을 제안하였다. 도 3에 나타낸 예에서, OLIG2 (저등급 병소와 우선적으로 연관되는 것으로 앞서 보고된 PN 마커)의 현저한 핵 발현을 보이는 PN 종양 (Ligon et al., J. Neuropathol Exp. Neurol. 63: 499-509 (2004))은 재발 시에 OLIG2 발현의 상대적인 손실을 나타냈다. 정상 뇌는 희소돌기 아교세포에서 단지 낮은 수준의 염색을 나타냈고, 이는 어레이 데이타에서 PN 종양에 의한 상기 마커의 상향조절이 조직 처리 동안 정상 뇌 오염의 표명이 아님을 나타낸다. 반대로, CHI3L1/YKL-40 (Mes 마커)은 원발성 샘플에서 드문 종양 세포에서만 발현되는 한편, 재발에서 풍부한 발현이 보인다. 상대적인 발현에서의 상기 변화는 재발 시에 Mes 이동을 갖는 것으로 검사된 모든 종양에서 보였다.

불량한 예후의 종양 서브타입은 증식 또는 혈관신생의 마커에 의해 구분된다

종양의 예후 서브클래스를 규정함으로써, 본 발명자들은 질병 공격성에서 차이에 기여할 수 있는 생물학의 측면을 확인하고자 하였다. 종양 서브클래스의 표현형을 검사하기 위해, 분류를 위해 사용된 중심값에 가장 강한 유사성을 보인, 본 발명자들의 생존 분석으로부터의 별아교세포종 환자의 세트를 선택하였다 (서브타입 당 n=12). 본 발명의 비교에 8개의 정상 뇌 조직 샘플을 포함시켰다. 증식의 마커를 검사하는데 있어서, 본 발명자들은 증식하는 세포 핵 항원 (PCNA) 및 토포이소머라제 II 알파 (TOP2A) 모두가 PN 또는 Mes 종양에 비해 Prolif 종양에서 유의하게 과다발현되었음을 발견하였다 (도 3A). Mes 종양이 고속 세포 분할의 부재 하에 공격적인 표현형을 표명하는 하나의 가능한 메카니즘은 혈관신생을 통한 것이다. 도 3B에 보이는 바와 같이, Mes 종양은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), flt1 또는 VEGF 수용체 1 (VEGFR1), kdr 또는 VEGF 수용체 2 (VEGFR2), 및 내피 마커 PECAM1의 과다발현을 나타냈다.

불량한 예후의 종양 서브타입은 신경 줄기 및/또는 전이 증폭 세포의 마커를 발현하는 한편, 보다 양호한 예후의 종양은 신경모세포 또는 신경세포의 마커를 발현한다.

시그너쳐 유전자 세트에서 일부 PN 마커, 예를 들어 NCAM, GABBR1 및 SNAP91은 신경세포와 연관된다. GBM의 종양 형성 세포가 신경 줄기 세포 마커 CD133을 발현한다는 최근의 발견에 비추어 (Singh et al., Nature 432: 396-401 (2004)), 본 발명자들은 신경 줄기 세포에 대한 마커 대 수임 신경세포성 계통의 마커의 발현을 비교하고자 하였다 (도 3C-E). 본 발명의 분석을 위해, 성인 전뇌 신경발생과 연관된 마커를 선택하였다 (Abrous et al., Physiol. Rev. 85: 523-569 (2005); Anton et al., Nature Neurosci. 7: 1319-1328 (2004); Nakano et al., J. Cell Biol. 170: 413 (2005); Shi et al., Nature 427: 78-83 (2004)). 신경 줄기 세포 또는 다능성 전이-증폭 세포의 6개의 마커 중 5개의 마커에 대해, 불량한 예후의 종양 서브클래스 중 하나 또는 둘 모두가 PN 종양에 비해 상승된 발현을 보였음이 밝혀졌다 (도 3C). 상기 차이는 비멘틴 (VIM), 네스틴 (NES), TLX, CD133 및 MELK에서도 보였다. DLX2 (전이-증폭 세포의 마커)는 종양 군들 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았지만, 일부 Prolif 종양은 상기 유전자의 강한 발현을 보였다. 줄기 세포 마커와 대조적으로, 신경모세포 또는 발달하는 신경세포의 마커는 Prolif 및/또는 Mes 종양에 비해 PN 종양에서 과다발현되었다 (도 3D). 상기 마커는 OLIG2, MAP2, DCX, ENC1 (NeuN), ERBB4, 및 GAD2를 포함한다. PN 종양에서 신경세포성 마커의 발현은 정상 뇌에서 종양 시료의 오염에 의한 것이 아니고, 이는 OLIG2, DCX, NeuN, 및 GAD2의 발현 수준이 정상 뇌 시료에 비해 종양에서 상승되었기 때문이다 (데이타 비제시, 종양 대 정상의 모든 t 테스트 비교에 대해 p<0.O05, 다중 비교를 위해 보정되지 않은). GFAP (신경 줄기 세포 및 별아교세포 모두의 마커)는 Prolif 종양에 비해 Mes 및 PN 서브클래스의 종양에서 더 강하게 발현되었다 (도 3E).

chr 10 상의 손실 및 chr 7 상의 증대는 Prolif 및 Mes 종양 서브타입과 연관된다.

발현 프로파일링에 의해 검사된 환자 중에서, AA 및 GBM의 96개의 시료로부터의 DNA가 어레이 비교 게놈 혼성화 (CGH)에 의한 분석에 이용가능하였다. 종양을 chr 1, 7, 10 및 19 상의 카피수 변화에 대해 채점하였다. 종양을 chr 1, 7, 10 및 19 상의 상대적인 카피수 변화에 대해 채점하였다. 대부분의 샘플은 chr 7 상의 증대 및 chr 10 상의 손실을 나타냈다 (도 4A). chr 10 상의 손실을 검사하는데 있어서, 종양 서브클래스 사이에 상기 게놈 변경의 빈도에서 놀라운 차이를 발견하였다 (도 4A). 대부분의 Prolif 및 Mes 종양이 10q23.3에 걸친 chr 10 상의 손실을 가진 반면에 (각각 78% 및 84%), 소수 (20%)의 PN 종양 서브클래스가 chr 10 상의 손실을 보였다. Mes 종양에 대해, 대부분의 환자는 본질적으로 모든 chr 10 상의 로커스를 손실하고, 단지 2명의 환자가 10q에 한정된 손실을 가졌다. 이와 대조적으로, Prolif 종양은 Chr 10 상의 보다 비균질한 손실을 가졌다. 예후 시그너쳐와 Chr 10의 상태 사이의 연관은 매우 유의하였다 (p<0.O001, 피셔 정확 검정). 종양 시그너쳐와 chr 7 또는 19q 상의 상대적인 카피수 변화 사이의 연관은 유사하지만 더 적은 반면에 (도 4A, 피셔 정확 검정에 의해 chr7 및 19q 모두에 대해 p < .01), chr1p 또는 1q 상에는 없었다 (p > .05).

상대적인 게놈 카피수 변화와 종양 서브타입 사이의 연관이 주어지면, 본 발명자들은 각각의 종양 서브타입을 규정하는 유전자가 염색체 위치에 대해 편향되었는지 결정하고자 하였다. 종양 서브클래스 마커의 확장된 목록 (표 A)에 대한 카이 제곱 (Chi square) 분석으로 각각의 3개의 목록에 대해, 염색체 위치의 관찰된 빈도가 발현 어레이 상에서 모든 프로브 세트에 대한 위치의 빈도에 의해 예상된 것과 유의하게 상이함을 밝혔다 (PN에 대해 p <1x10^-14, Prolif에 대해 p <0.O01, Mes에 대해 p <0.O005). PN 및 Mes 마커 목록은 각각 chr 10 및 19 상의 마커를 과다하게 제시한다 (72개의 비교에 대한 교정 후 두 비교에 대해 P <0.O5). 상기 발견은 chr 10 및 19q 상의 상대적인 DNA 카피수 변화에서 종양 서브타입들 사이의 차이를 입증한다.

노치 및 akt 경로는 양호한 예후 대 불량한 예후를 갖는 종양 서브클래스에서 차별적으로 활성화된다

chr 10 손실 및 종양 서브클래스의 연관과 일치하여, PTEN 로커스를 포함하는 BAC 클론에 대한 어레이 CGH 데이타의 직접 검사로 높은 비율의 Prolif 및 Mes 환자가 PTEN 로커스의 손실을 나타냈음을 확인하였다. PTEN 로커스의 손실 및 PN 중심값에 대한 유사성 사이에서 음성 연관이 보였다 (도 5A). 로커스의 증대 또는 증폭의 대부분의 환자는 Prolif 또는 Mes 서브클래스의 종양이었고, 음성 상관성은 EGFR 카피수 증대와 PN 중심값에 대한 유사성 사이에서 보였다 (도 5B). akt1, akt2, 또는 akt3에 대응하는 로커스, 또는 PBK의 촉매 서브유닛의 로커스에서 명백한 증폭 또는 결실은 보이지 않았다 (도시하지 않음). 적은 수의 샘플은 PIK3R3 (PI3K의 조절 서브유닛)에 대한 카피수에서 증대를 나타냈고, 상기 로커스에 대한 CGH 비는 Prolif 시그너쳐에 대한 유사성과 양성적으로 상호관련되었다 (도 5C).

본 발명의 결과가 akt 경로 활성화와 종양 서브타입 사이의 강한 관계를 제안한 이래로, 본 발명자들은 종양 서브타입에서 PTEN mRNA 발현 및 포스포-akt (p-akt) 면역조직화학을 비교하였다. 본 발명자들은 PN 종양에 비해 Prolif 및 Mes 종양이 약 2배 더 낮은 PTEN mRNA 및 더 강한 p-akt (ser473)를 발현하였음을 발견하였다 (도 4E; 도 4J). 결과는 매우 유의하였다 (PN 대 다른 것의 t 테스트에 대해 PTEN mRNA에 대해 p < 5×10^-5; p-akt 면역조직화학에 대해 p< 5×10^-8). PTEN 결과는 제2 독립적인 샘플 세트에서 검정하였다 (데이타 비제시).

MDA 샘플 세트에서 PN 종양 마커의 완전한 목록을 검사하는데 있어서, 본 발명자들은 노치 경로 요소 DLL3, DLL1, HEY2 및 ASCL1에 대응하는 프로브 세트가 PN 종양의 마커에 대한 본 발명의 기준을 만족함을 밝혔다 (도 5 E-H). 상기 유전자는 두 검정 데이타세트 모두의 PN 종양에서 유의하게 과다발현되는 것으로 확인되었다. 상기 4개의 노치 경로 요소는 각각 전뇌 신경발생에 관여되었고 (Campos et al., J. Neurosci. Res. 64: 590-598 (2001); Casarosa et al., Development 126: 525-534 (1999); Sakamoto et al., J. Biol. Chem. 278: 44808-44815 (2003)), ASCL1은 최근에 성인 전뇌에서 신경세포 및 희소돌기 아교세포 모두의 전문화에 연계되었다 (Parras et al., EMBO Journal, 23(22): 4495-505 (2004)). 마이크로어레이 데이타가 PN 종양에서 상향조절을 보이지 않은 노치 경로의 요소는 노치 1-4, 재기드 1 & 2, Hes 1, 2, 4, 6, 7 (비제시)을 포함한다. HEY1은 MDA PN 종양에서 작지만 유의한 상향조절을 보였다 (1.4FC, p=5 X 10^-5).

노치 시그날 전달 활성화를 위한 직접적인 증거를 검사하기 위해, 본 발명자들은 이용가능한 파라핀-매립된 절편을 사용하여 모든 MDA 환자에서 핵 노치-면역반응성의 맹검 평가를 이용하였다. 핵 염색의 완전 부재를 보인 음성 환자에 비해, 양성 환자는 핵에서 "흐림 (blush)"을 보였다. 도 4K는 노치 핵 염색에 대해 0, 1, 또는 2로 등급판정된 각각의 종양 서브타입의 빈도를 보여준다. 양성 환자에 의해 나타난 비교적 약한 시그날에도 불구하고, PN 샘플의 등급판정은 Prolif (p<0.O05, t 테스트) 또는 Mes (p<0.O01, t 테스트) 서브클래스의 것보다 유의하게 더 높은 것으로 입증되었다.

DLL3 및 PTEN 발현의 2-유전자 모델은 고등급 별아교세포종의 생존을 예측한다

본 발명의 데이타가 종양 공격성에서 노치 및 akt 경로의 역할을 제안한 이래로, 본 발명자들은 경로 마커의 발현과 생존 사이의 직접적인 연관에 대한 증거를 찾고자 하였다. 상기 분석을 위해, PTEN mRNA를 정량적 PCR에 의해, 및 DLL3 mRNA를 충분한 mRNA가 이용가능한 경우 MDA 생존 세트에서 모든 샘플로부터의 마이크로어레이 데이타에 의해 평가하였다 (n=65). 비례 위험 (proportional hazard)의 Cox 모델은 PTEN 및 DLL3 mRNA의 수준, 및 그들의 통계학적 상호작용이 모두 고등급 별아교세포종에서 생존과 연관됨을 밝혔고, 합해져서 매우 유의한 예측 모델을 형성하였다 (3 자유도의 카이 제곱 참조 분포에 비해 21.6의 가능도비 (Likelihood Ratio) 시험, p<0.O001). 도 5A에 도시된 예측된 생존 함수는 낮은 값의 PTEN mRNA를 갖는 샘플이 DLL3 발현 수준에 무관하게 불량한 생존 함수와 연관되었음을 입증한다. 높은 PTEN 발현을 갖는 샘플에 대해, 추정된 생존은 DLL3의 함수로서 변화하는 것으로 보여서, 높은 수준의 PTEN 및 DLL3 mRNA을 모두 갖는 샘플이 최선의 결과를 보였다. 이어서, 본 발명자들은 등급 III & IV 별아교세포종의 보다 작은 (n=34) 독립 세트를 갖는 동일한 모델을 피팅하였다. 예측된 생존 곡선은 MDA 샘플 세트로부터 얻은 것과 놀랍게도 유사하였고 (도 5B), 이는 상기 2-유전자 모델의 확고성을 나타낸다 (도 6B).

GBM 세포주의 발현 시그너쳐는 akt 경로 억제에 대한 EGF / FGF 독립적 신경구 성장 및 감수성을 예측한다

종양의 분자 서브타입의 잠재적인 치료 유의성을 검사하기 위해, 시그너쳐 유전자의 발현의 함수로서 신경아교종 세포주의 시험관내 반응을 검사하였다. 본 발명자들은 mRNA 발현에 대해 16개의 GBM 세포주를 프로파일링하고, EGF+FGF의 존재 또는 부재 하에 신경구를 생성하는 그들의 능력을 조사하고, 노치 및 Akt 시그날 전달에 영향을 미치는 물질에 대한 그들의 반응을 평가하였다. 모든 16개의 세포주가 PN 중심값에 관하여 음성적으로 상호관련되었지만, Mes 중심값에 대해 넓은 범위의 유사성을 보였다. 16개의 세포주 중 15개가 EGF+FGF 내에서 증식할 수 있는 신경구를 생성하였지만, EGF+FGF의 부재 하에 성장하는 신경구를 생성시키는 그들의 능력은 변화하였고 (도 6A), 부모 세포주의 발현 시그너쳐에 관련된 것으로 보였다 (도 6B). 가장 놀랍게도, 본 발명자들은 Mes 중심값에 음성적으로 상호관련된 2개의 세포주 (G112 & G122)가 EGF+FGF의 부재 하에 빠르게 성장하는 신경구를 생성하였지만 (도 6B), Mes 중심값에 강한 상관성을 갖는 세포주는 EGF+FGF의 부재 하에 쉽게 증식할 수 있는 신경구를 생성하지 못하였음을 (도 7B) 발견하였다.

종양 서브타입과 전뇌 신경 발단에서 단계 사이의 평행성을 포함한 주요 발견의 요약을 도 8 A & B에 나타낸다.

실시예 2: 암성 신경아교종 종양에서 GDM 폴리펩티드의 상향조절을 검출하기 위한 마이 크로어레이 분석

종종 수천개의 유전자 서열을 함유하는 핵산 마이크로어레이는 그들의 정상 상대물에 비해 질병에 걸린 조직에서 차등 발현된 유전자를 확인하기 위해 유용하다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, cDNA 프로브를 고체 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화한다. 어레이는 어레이의 각각의 멤버의 서열 및 위치가 공지되도록 하는 구성이다. 예를 들어, 특정 질병 상태에서 발현되는 것으로 알려진 유전자의 선택물이 고체 지지체 상에 어레이될 수 있다. 표지된 프로브의 특정 어레이 멤버와의 혼성화는 프로브가 유래되는 샘플이 상기 유전자를 발현하는 것을 나타낸다. 시험 (질병 조직) 샘플로부터의 프로브의 혼성화 시그날이 대조 (정상 조직) 샘플로부터의 프로브의 혼성화 시그날보다 더 크면, 질병 조직에서 과다발현된 유전자(들)이 확인된다. 상기 결과는 질병에 걸린 조직에서 과다발현된 단백질이 질병 상태의 존재에 대한 진단 마커로서 뿐만 아니라, 질병 상태의 치료를 위한 치료 표적으로서도 유용하다는 것을 내포한다.

핵산의 혼성화의 방법 및 마이크로어레이 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 실시예에서, 혼성화를 위한 핵산의 특이적 제조 및 프로브, 슬라이드, 및 혼성화 조건은 모두 본원에 참고로 포함된 PCT 특허 출원 PCT/US01/10482 (2001년 3월 30일 출원)에 상세히 설명되어 있다.

실시예 3: GDM mRNA 발현의 정량적 분석

본 분석에서, 5' 뉴클레아제 분석 (예를 들어, TaqMan(등록상표)) 및 실시간 정량적 PCR (예를 들어, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System(등록상표) (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer, 어플라이드 바이오시스템즈 계열사))을 다른 암성 종양 또는 정상 비-암성 조직에 비해 암성 신경아교종 종양(들)에서 유의하게 과다발현된 유전자를 찾기 위해 사용한다. 5' 뉴클레아제 분석 반응은 유전자 발현을 실시간으로 모니터링하기 위해 Taq DNA 중합효소 효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 형광 PCR-기반 기술이다. PCR 반응의 전형적인 앰플리콘을 생성하기 위해 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (그의 서열은 목적하는 유전자 또는 EST 서열에 기반한다)가 사용된다. 제3 올리고뉴클레오티드, 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 설계된다. 프로브는 Taq DNA 중합효소에 의해 비-연장성이고, 리포터 형광 염료 및 켄처 (quencher) 형광 염료로 표지된다. 2개의 염료가 프로브 상에서 함께 가까이 위치할 때, 리포터 염료로부터 임의의 레이저-유도된 방출은 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. PCR 증폭 반응 동안, Taq DNA 중합효소는 프로브를 주형-의존 방식으로 절단한다. 생성되는 프로브 단편은 용액 중에 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 시그날은 제2 형광단의 켄칭 효과로부터 자유롭다. 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 리포터 염료의 하나의 분자가 유리되고, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이타의 정성적 및 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다. 상기 분석은 당업계에서 잘 공지되어 있고, 2개의 상이한 인간 조직 샘플 사이의 유전자 발현 차이를 정량적으로 확인하기 위해 일상적으로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Higuchi et al., Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak et al., PCR Methods Appl. 4:357-362 (1995); Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996); Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(25): 14717-14722 (1998); Pitti et al., Nature 396(6712):699-703 (1998) 및 Bieche et al., Int. J. Cancer 78:661-666 (1998)] 참조).

5' 뉴클레아제 절차는 실시간 정량적 PCR 장치, 예를 들어 ABI Prism 7700TM Sequence Detection 상에서 실행된다. 시스템은 써모사이클러 (thermocycler), 레이저, 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 시스템은 샘플을 써모사이클러 상에서 96웰 포맷으로 증폭시킨다. 증폭하는 동안, 레이저-유도된 형광 시그날은 모든 96웰에 대해 광섬유 케이블을 통해 실시간으로 모이고, CCD에서 검출된다. 시스템은 기기를 작동하고 데이타를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.

스크린을 위한 출발 물질은 다양한 상이한 암성 조직으로부터 단리된 mRNA이다. mRNA는 예를 들어 형광분석으로 정밀하게 정량된다. 음성 대조군으로서, RNA는 시험되는 암성 조직과 동일한 조직 종류의 다양한 정상 조직으로부터 단리된다. 종종, 종양 샘플(들)이 동일한 조직 종류의 "매칭된" 정상 샘플(들)에 직접 비교되고, 이는 종양 및 정상 샘플(들)을 동일한 개인으로부터 얻는 것을 의미한다.

5' 뉴클레아제 분석 데이타는 초기에 Ct, 또는 역치 사이클로서 표현한다. 이는 리포터 시그날이 배경 형광 수준을 초과하여 축적되는 사이클로서 정의된다. ΔCt 값은 암 mRNA 결과를 정상 인간 mRNA 결과에 비교할 때, 핵산 샘플 내의 특정 표적 서열의 출발 카피의 상대적인 수의 정량적 측정치로서 사용된다. 1 Ct 단위는 1 PCR 사이클 또는 정상에 비해 약 2배 상대적인 증가에 대응하고, 2 단위는 4배 상대적인 증가에 대응하고, 3 단위는 8배 상대적인 증가에 대응하는 등등이므로, 2개 이상의 상이한 조직 사이의 mRNA 발현에서 상대적인 배수 증가를 정량적으로 및 정성적으로 측정할 수 있다. 이와 관련하여, 당업계에서는 상기 분석이 정상 대조군에 비해 인간 종양 샘플에서 mRNA 발현의 적어도 2배 증가를 재현가능하게 검출하기 위해 충분히 기술상 민감한 것으로 받아들여진다.

실시예 4: 계내 혼성화

계내 혼성화는 세포 또는 조직 제제 내에서 핵산 서열의 검출 및 위치 측정을 위한 강력하고 다재다능한 기술이다. 이는 예를 들어, 유전자 발현의 부위를 확인하고, 전사의 조직 분포를 분석하고, 바이러스 감염을 확인 및 위치 측정하고, 특이적 mRNA 합성에서 변화를 추적하고, 염색체 맵핑을 돕기 위해 유용할 수 있다.

계내 혼성화는 문헌 [Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994)]의 프로토콜의 최적화 버전에 따라 PCR-생성된 ³³P-표지된 리보프로브를 사용하여 수행된다. 간단히 설명하면, 포르말린-고정되고, 파라핀-매립된 인간 조직을 절개하고, 파라핀제거하고, 프로테이나제 K (20 g/ml) 내에서 15분 동안 37℃에서 탈단백화하고, 문헌 [Lu and Gillett, 상기 문헌]에 설명된 바와 같이 계내 혼성화를 위해 추가로 가공한다. [³³P] UTP-표지된 안티센스 리보프로브를 PCR 산물로부터 생성하고, 55℃에서 철야 혼성화하였다. 슬라이드를 Kodak NTB2 핵 트랙 에멀젼에 담그고, 4주 동안 노출시킨다.

³³ P- 리보프로브 합성

6.0 ㎕ (125 mCi)의 ³³P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)을 급속 진공 건조시켰다. 건조된 ³³P-UTP를 함유하는 각 튜브에, 다음 성분들을 첨가하였다:

2.0 ㎕ 5x 전사 버퍼

1.0 ㎕ DTT (10O mM)

2.0 ㎕ NTP 믹스 (2.5 mM: 10 μ; 각각 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 ㎕ H₂O)

1.0 ㎕ UTP (50 μM)

1.0 ㎕ Rnasin

1.0 ㎕ DNA 주형 (1 ㎍)

1.0 ㎕ H₂O

1.0 ㎕ RNA 중합효소 (PCR 산물에 대해 T3 = AS, 대체로 T7 = S)

튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한다. 1.0 ㎕ RQ1 DNase를 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 인큐베이팅한다. 90 ㎕ TE (10 mM Tris pH 7.6/1 mM EDTA pH 8.0)를 첨가하고, 혼합물을 DE81 페이퍼 상으로 피펫팅하였다. 나머지 용액을 Microcon-50 초여과 유닛 내에 로딩하고, 프로그램 10 (6분)을 이용하여 원심분리한다. 여과 유닛을 제2 튜브 위로 뒤집고, 프로그램 2 (3분)를 이용하여 원심분리한다. 최종 회수 원심분리 후, 100 ㎕ TE를 첨가한다. 1 ㎕의 최종 산물을 DE81 페이퍼 상에 피펫팅하고, 6 ml의 Biofluor II 내에서 계수한다 .

프로브를 TBE/우레아 겔 상에서 진행시킨다. 1-3 ㎕의 프로브 또는 5 ㎕의 RNA Mrk III을 3 ㎕의 로딩 버퍼에 첨가한다. 95℃ 히트 블록 (heat block) 상에서 3분 동안 가열한 후, 프로브를 즉시 얼음 상에 놓는다. 겔의 웰을 쏟아내고, 샘플을 로딩하고, 180-250 볼트에서 45분 동안 진행시킨다. 겔을 사란 랩 (saran wrap)에 감싸고, 증감지 (intensifying screen)를 갖는 XAR 필름에 -70℃ 냉동기 내에서 1시간 내지 철야 노출시킨다.

³³ P- 혼성화

A. 동결된 절편의 예비처리

슬라이드를 냉동기로부터 제거하고, 알루미늄 트레이 상에 놓고, 실온에서 5분 동안 해동시켰다. 응축을 감소시키기 위해 트레이를 55℃ 인큐베이터 내에 5분 동안 넣었다. 슬라이드를 흄 후드 (fume hood)에서 얼음 상에서 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시키고, 0.5 x SSC 내에서 5분 동안 실온에서 세척하였다 (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQ H₂O). 0.5 ㎍/ml 프로테이나제 K 내에서 10분 동안 37℃에서 탈단백화 후 (250 ml 예온된 RNase-비함유 RNAse 버퍼 중 12.5 ㎕의 10 mg/ml 원액), 절편을 0.5 x SSC 내에서 10분 동안 실온에서 세척하였다. 절편을 70%, 95%, 100% 에탄올 내에서 각각 2분 동안 탈수시켰다.

B. 파라핀-매립된 절편의 예비처리

슬라이드를 파라핀 제거하고, SQ H₂O 내에 놓고, 2 x SSC 내에서 실온에서 각각 5분 동안 2회 세정하였다. 절편을 20 ㎍/ml 프로테이나제 K (250 ml RNase-비함유 RNase 버퍼 중 10 mg/ml의 500 ㎕; 37℃, 15분) - 인간 배아, 또는 8 x 프로테이나제 K (250 ml Rnase 버퍼 중 100 ㎕, 37℃, 30분) - 포르말린 조직 내에서 탈단백화한다. 0.5 x SSC에서 후속적인 세정 및 탈수를 상기 설명된 바와 같이 수행한다.

C. 예비혼성화

슬라이드를 Box 버퍼 (4 x SSC, 50% 포름아미드) - 포화 여과지로 라이닝한 플라스틱 박스 내에 펼쳐 놓았다.

D. 혼성화

슬라이드당 1.0 x 10⁶ cpm 프로브 및 1.0 ㎕ tRNA (50 mg/ml 원액)을 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 슬라이드를 얼음 상에서 냉각시키고, 슬라이드당 48 ㎕ 혼성화 버퍼를 첨가하였다. 볼텍싱한 후, 50 ㎕ ³³P 믹스를 슬라이드 상의 50 ㎕ 예비혼성화에 첨가하였다. 슬라이드를 55℃에서 철야 인큐베이팅하였다.

E. 세척

세척을 2xSSC, EDTA로 실온에서 2 x 10분 수행한 후 (400 ml 20 x SSC + 16 ml 0.25M EDTA, V_f=4L), 37℃에서 30분 동안 RNaseA 처리하였다 (250 ml Rnase 버퍼 중 500 ㎕의 10 mg/ml = 20 ㎍/ml). 슬라이드를 2 x SSC, EDTA로 실온에서 2 x 10분 세척하였다. 엄격성 세척 조건은 다음과 같을 수 있다: 55℃에서 2시간, 0.1 x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDTA, V_f=4L).

F. 올리고뉴클레오티드

계내 분석을 본원에 개시된 다양한 DNA 서열에 대해 수행하였다. 상기 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 첨부 도면에 도시된 바와 같이 핵산 (또는 그의 보체)에 상보성이도록 얻었다.

실시예 5: GDM 에 결합하는 항체의 제조

모노클로날 항체을 제조하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Goding, 상기 문헌]에 설명되어 있다. 사용할 수 있는 면역원은 정제된 GDM 폴리펩티드, GDM 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질, 및 세포 표면 상에 재조합 GDM 폴리펩티드를 발현하는 세포를 포함한다. 면역원은 당업자가 과도한 실험을 수행하지 않으면서 선택할 수 있다.

마우스, 예를 들어 Balb/c를 완전 프로인트 항원보강제 내에 에멀젼화시킨 상기 면역원을 1-100 ㎍의 양으로 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시킨다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 항원보강제 (리비 이뮤노케미칼 리서치 (Ribi Immunochemical Research, 미국 몬태나주 해밀턴)) 내에 에멀젼화하고 동물의 뒷발바닥에 주사한다. 이어서, 면역화시킨 마우스를 10 내지 12일 후 선택된 항원보강제 내에 에멀젼화한 추가의 면역원으로 추가접종한다. 그 후, 수주 동안, 마우스를 또한 추가의 면역화 주사로 추가접종할 수 있다. 항-GDM 항체를 검출하도록 ELISA 분석으로 시험하기 위해 후안와 출혈에 의해 혈청 샘플을 마우스로부터 주기적으로 입수할 수 있다.

적합한 항체 역가를 검출한 후에, 항체에 대해 "양성" 동물은 GDM 폴리펩티드의 최종 정맥내 주사를 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 마우스를 희생하고, 비장 세포를 수거한다. 이어서, 비장 세포를 선택된 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 P3X63AgU.1 (ATCC로부터 이용가능함, No. CRL 1597)에 융합시킨다 (35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여). 융합체는 하이브리도마 세포를 생성하고, 이를 비-융합 세포, 골수종 하이브리드, 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제하기 위해 HAT (하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘) 배지를 함유하는 96웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅할 수 있다.

하이브리도마 세포를 GDM에 대항한 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝한다. GDM에 대항한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포의 결정은 당업계의 기술 범위 내에 있다.

항-GDM 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 생산하기 위해 양성 하이브리도마 세포를 유전적 동계의 Balb/c 마우스에 복강내 주사할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 성장시킬 수 있다. 복수 내에 생산된 모노클로날 항체의 정제는 황산암모늄 침전을 사용한 후, 겔 배제 크로마토그래피에 의해 달성할 수 있다. 별법으로, 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 항체의 결합에 기초한 친화도 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

실시예 6: GDM 에 결합하는 독소- 컨쥬게이팅된 항체의 제조

세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 암 치료에서 종양 세포를 사멸하거나 억제하는 약물의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC), 즉 면역컨쥬게이트의 사용 (Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4,975,278)은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달, 및 그 내부에서 세포내 축적을 허용하고, 여기서 상기 컨쥬게이팅되지 않은 약물 물질의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 허용되지 않는 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (Baldwin et al., (1986) Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506)). 따라서, 최소 독성을 갖는 최대 효능이 추구된다. ADC를 설계하고 정제하는 노력은 모노클로날 항체 (mAb)의 선택성 및 약물-연결 및 약물-방출 특성에 집중되었다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 모두 상기 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 상기 방법에 사용되는 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., (1986) 상기 문헌). 항체-독소 컨쥬게이트에 사용되는 독소는 세균 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconiugate Chem. 13:786-791)), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)), 및 칼리케아미신 (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342))을 포함한다.

독소를 정제된 항체에 연결시켜 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고 일상적으로 사용된다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체의 독소 DM1에 대한 컨쥬게이션은 다음과 같이 수행할 수 있다. 정제된 항체를 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)-펜타노에이트로 유도체화하여 디티오피리딜기를 도입한다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)을 함유하는 44.7 ml의 50 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 6.5) 내의 항체 (376.0 mg, 8 mg/mL)를 SPP (2.3 ml 에탄올 중 5.3 몰 당량)로 처리한다. 90분 동안 아르곤 하에 주위 온도에서 인큐베이팅한 후, 반응 혼합물을 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl 및 2 mM EDTA로 평형화시킨 Sephadex G25 컬럼을 통해 겔 여과한다. 이어서, 항체 함유 분획을 모으고 분석한다. 항체-SPP-Py (방출가능한 2-티오피리딘기를 갖는 337.0 mg)를 상기 35 mM 시트르산나트륨 버퍼, pH 6.5로 2.5 mg/ml의 최종 농도로 희석한다. 이어서, 3.0 mM 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중 3% v/v) 중 DM1 (1.7 당량, 16.1 몰)을 항체 용액에 첨가한다. 주위 온도에서 아르곤 하에 20시간 동안 반응을 진행시킨다. 반응물을 35 mM 시트르산나트륨, 154 mM NaCl, pH 6.5로 평형화시킨 Sephacryl S300 겔 여과 컬럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) 상에 로딩한다. 유속은 5.0 ml/min이고, 65개의 분획 (각각 20.0 ml)을 수집한다. 분획을 모으고 분석하고, 여기서 항체 분자당 연결된 DM1 약물 분자의 수 (p')를 252 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정한다.

예시의 목적으로, 정제된 모노클로날 항체의 독소 DM1에 대한 컨쥬게이션은 또한 다음과 같이 수행할 수 있다. 정제된 항체를 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC, 피어스 바이오테크놀로지, 인크. (Pierce Biotechnology, Inc))로 유도체화하여 SMCC 링커를 도입한다. 항체를 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA, pH 6.5 중 20 mg/ml에서 7.5 몰 당량의 SMCC (DMSO 중 20 mM, 6.7 mg/ml)로 처리한다. 2시간 동안 아르곤 하에 주위 온도에서 교반한 후, 반응 혼합물을 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA, pH 6.5로 평형화시킨 Sephadex G25 컬럼을 통해 여과한다. 항체 함유 분획을 모으고 분석한다. 이어서, 항체-SMCC를 5O mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA, pH 6.5로 10 mg/ml의 최종 농도로 희석하고, 디메틸아세트아미드 중 DM1의 10 mM 용액 (5 SMCC/항체를 가정하여 1.7 당량, 7.37 mg/ml)과 반응시킨다. 반응물을 주위 온도에서 아르곤 하에 16.5시간 동안 교반한다. 이어서, 컨쥬게이션 반응 혼합물을 1 x PBS로 pH 6.5에서 Sephadex G25 겔 여과 컬럼 (1.5 x 4.9 cm)를 통해 여과한다. 이어서, DM1/항체 비 (p)를 252 nm 및 280 nm에서 흡광도에 의해 측정한다.

세포독성 약물은 대개 종종 항체의 수많은 리신 잔기를 통해 항체에 컨쥬게이팅된다. 목적하는 항체 내에 존재하거나 그 내부로 공학처리된 티올기를 통한 컨쥬게이션을 또한 달성할 수 있다. 예를 들어, 리간드에 대한 공유 부착 부위를 형성하도록 시스테인 잔기가 유전자 공학 기술에 의해 단백질 내로 도입된다 (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconiugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology. 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; 미국 특허 6,248,564). 일단 유리 시스테인 잔기가 목적하는 항체 내에 존재하면, 독소가 상기 부위에 연결될 수 있다. 예로서, DMSO에 용해된 약물 링커 시약, 말레이미도카프로일-모노메틸 오리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE, 말레이미도카프로일-모노메틸 오리스타틴 F (MMAF), 즉 MC-MMAF, MC-val-cit-P AB-MMAE 또는 MC-val-cit-PAB-MMAF를 아세토니트릴 및 물 내에 공지된 농도로 희석하고, 인산염 완충 염수 (PBS) 중 냉각된 시스테인-유도체화 항체에 첨가한다. 약 1시간 후, 반응을 켄칭하고 임의의 반응되지 않은 항체 티올을 캡핑 (capping)하기 위해 과량의 말레이미드를 첨가한다. 반응 혼합물을 원심 초여과에 의해 농축하고, 독소 컨쥬게이팅된 항체를 정제하고 PBS 중 G25 수지를 통한 용출에 의해 탈염시키고, 0.2m 필터를 통해 멸균 조건 하에 여과하고, 저장을 위해 동결시킨다.

또한, 선택된 항체 상의 유리 시스테인은 비스-말레이미도 시약 BM(PEO)4 (피어스 케미칼 (Pierce Chemical))에 의해 변형될 수 있어서, 항체의 표면 상에 반응되지 않은 말레이미도기를 남긴다. 이는 BM(PEO)4를 50% 에탄올/물 혼합물 내에 10 mM의 농도로 용해시키고, 10배 몰 과량을 인산염 완충 염수 중 항체를 함유하는 용액에 약 1.6 mg/ml (10 마이크로몰)의 농도로 첨가하고, 1시간 동안 반응시킴으로써 달성할 수 있다. 과잉의 BM(PEO)4는 150 mM NaCl 버퍼를 사용하여 30 mM 시트레이트, pH 6 중에서 겔 여과에 의해 제거한다. 약 10배 몰 과량의 DM1를 디메틸 아세트아미드 (DMA)에 용해시키고, 항체-BMPEO 중간체에 첨가한다. 약물 모이어티 시약을 용해시키기 위해 디메틸 포름아미드 (DMF)를 또한 사용할 수 있다. 반응 혼합물을 철야 반응시킨 후, PBS 내로 겔 여과 또는 투석하여 반응되지 않은 약물을 제거한다. PBS 내의 S200 컬럼 상의 겔 여과를 이용하여 고분자량 응집물을 제거하고 정제된 항체-BMPEO-DM1 컨쥬게이트를 제공한다.

실시예 7 - 시험관내 세포 사멸 분석

목적하는 GDM 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포는 표준 발현 벡터 및 클로닝 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 별법으로, 목적하는 GDM 폴리펩티드를 발현하는 많은 종양 세포주는 예를 들어, ATCC를 통해 공개적으로 이용가능하고, 표준 ELISA 또는 FACS 분석을 이용하여 일상적으로 확인할 수 있다. 이어서, 항-GDM 폴리펩티드 모노클로날 항체 (및 독소 컨쥬게이팅된 그의 유도체)를 GDM 폴리펩티드 발현 세포를 시험관내 사멸시키는 항체의 능력을 결정하기 위한 분석에서 사용할 수 있다.

본 발명에 관하여, 그의 세포 표면 상에 GDM 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 PC3-유래된 세포주 (본원에서 PC3-gD-MDP로 칭함)는 표준 기술을 이용하여 공학처리될 수 있고, PC3-gD-MDP 세포에 의한 GDM 폴리펩티드의 발현은 표준 FACS 세포 분류, ELISA 및 면역조직화학 분석을 이용하여 확인할 수 있다. 각각의 GDM-발현 세포의 사멸을 일으키는 MMAE-컨쥬게이팅된 항-GDM 모노클로날 항체의 능력은 다음 프로토콜을 이용하는 시험관내 세포 사멸 분석을 이용하여 결정할 수 있다 (프로메가 코퍼레이션 (Promega Corp.) Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488)):

1. 성장 배지 중 약 10⁴ 세포를 함유하는 세포 배양액의 50 ㎕의 분취액 (PC3-gD-MDP 세포 또는 GDM을 발현하지 않는 형질감염되지 않은 PC3 세포)을 96웰의 불투명한 벽의 플레이트의 각각의 웰에 놓는다. 세포가 없는 50 ㎕의 성장 배지를 함유하는 추가의 대조웰을 설정한다.

2. GDM-MMAE 컨쥬게이팅된 항체, 또는 GDM에 결합하지 않는 MMAE-컨쥬게이팅된 대조 모노클로날 항체를 각각의 웰에 50 ㎕의 부피 내에 0.0001 내지 100 ㎍/ml의 다양한 농도로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 3-5일 동안 인큐베이팅한다.

3. 플레이트를 실온으로 약 30분 동안 평형화시킨다.

4. 각각의 웰 내에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동일한 부피의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Reagent (프로메가 코퍼레이션)을 첨가하고, 플레이트를 2분 동안 궤도 (orbital) 진탕기에서 진탕하여 세포 용해를 유도한다.

5. 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이팅하여 발광 시그날을 안정화시킨다.

6. 발광을 Tropix Winglow Program을 사용하여 발광계 상에서 판독하고, RLU = 상대 발광 단위로서 기록한다.

상기 설명된 분석에서 얻은 결과는 GDM-MMAE 항체가 항체-의존 양식으로 대응하는 GDM 폴리펩티드를 발현하는 세포의 사멸을 유도할 수 있음을 입증할 수 있다. 즉, GDM-MMAE 또는 MMAE-컨쥬게이팅된 대조물은 1 ㎍/ml 이하의 항체 농도에서 형질감염되지 않은 PC3 세포의 유의한 사멸을 유도할 수 없다. 1 ㎍/ml을 초과하는 항체 농도에서, 형질감염되지 않은 PC3 세포 사멸의 양은 항체-비의존 방식으로 항체 농도에 따라 선형으로 증가할 수 있다. 따라서, 1 ㎍/ml을 초과하는 항체 농도에서 형질감염되지 않은 PC3 세포의 사멸은 반응 혼합물 내에 존재하는 증가하는 수준의 MMAE 독소의 비-특이적인 결과이고, 사용된 항체의 결합 특이성의 함수가 아닌 것으로 나타날 것이다.

그러나, GDM 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 PC3-gD-MDP 세포에 관하여, MMAE-컨쥬게이팅된 대조물은 형질감염되지 않은 PC3 세포를 사멸시키는 항체의 능력과 동일한 패턴으로 세포 사멸을 유도하지만, GDM-MMAE는 유의하게 상기 수준 미만의 (예를 들어, 0.001 ㎍/ml로 낮은) 항체 농도에서 유의한 세포 사멸을 유도할 것이다. 실제로, 1 ㎍/ml의 항체 농도 (여기서, 비-GDM 특이적 MMAE-컨쥬게이팅된 대조 항체는 유의한 세포 사멸을 나타내지 않는다)에서, 실질적으로 모든 PC3-gD-MDP 세포가 GDM-MMAE에 의해 사멸될 것이다. 따라서, 상기 데이타는 GDM-특이적 모노클로날 항체가 세포의 표면 상에 발현될 때 GDM 폴리펩티드에 결합하고, 그가 결합하는 세포의 사멸을 유도할 수 있음을 입증할 것이다.

실시예 9: 생체 내 종양 세포 사멸 분석

생체 내에서 종양 세포의 사멸을 유도하는 능력에 대해 독소-컨쥬게이팅된 또는 컨쥬게이팅되지 않은 항-GDM 폴리펩티드 모노클로날 항체의 효능을 시험하기 위해, 다음 프로토콜을 사용할 수 있다.

갑상선절제 누드 마우스의 군을 5 x 10⁶의 GDM 폴리펩티드 - 발현 종양 촉진 세포로 옆구리에서 피하 접종한다. 종양이 100-200 mm³의 평균 종양 부피에 도달할 때, 마우스를 5개의 군으로 동일하게 나누고, 다음과 같이 처리한다:

1군 - PBS 대조 비히클을 4주 동안 매주 1회 투여한다;

2군 - 비-특이적인 대조 항체를 1 mg/kg에서 4주 동안 매주 1회 투여한다;

3군 - 비-특이적인 대조 항체를 3 mg/kg에서 4주 동안 매주 1회 투여한다;

4군 - 특이적 항-GDM 폴리펩티드 항체를 1 mg/kg에서 4주 동안 매주 1회 투여한다;

5군 - 특이적 항-GDM 폴리펩티드 항체를 3 mg/kg에서 4주 동안 매주 1회 투여한다.

이어서, 각각의 처리군의 마우스에서 평균 종양 부피를 주기적인 간격으로 결정할 수 있고, 항체의 효능을 결정한다.

실시예 9: 혼성화 프로브로서 GDM 의 용도

다음 방법은 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서, 즉, 포유동물에서 종양의 존재의 진단을 위한 용도를 설명한다.

본원에 개시된 전장 또는 성숙 GDM 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA가 또한 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들어, GDM의 천연 변이체를 코딩하는 것)에 대해 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.

두 라이브러리 DNA 중 하나를 함유하는 필터의 혼성화 및 세척은 다음 고엄격성 조건 하에 수행한다. 방사성 표지된 GDM-유래된 프로브의 필터에 대한 혼성화는 50% 포름아미드, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% 나트륨 파이로인산염, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2x 덴하르트 용액, 및 10% 덱스트란 술페이트의 용액 내에서 42℃에서 20시간 동안 수행한다. 필터의 세척은 O.1x SSC 및 0.1% SDS의 수용액 내에서 42℃에서 수행한다.

이어서, 전장 천연 서열 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 DNA과 목적하는 서열 동일성을 갖는 DNA는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 확인할 수 있다.

실시예 10: 이. 콜라이 내에서 GDM 의 발현

본 실시예는 이. 콜라이 내에서 재조합 발현에 의한 GDM의 글리코실화되지 않은 형태의 제조를 예시한다.

상기 GDM 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 대응하는 제한 효소 부위를 포함해야 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 암피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하는 pBR322 (이. 콜라이로부터 유도됨; Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977))이다. 벡터를 제한 효소로 소화시키고 탈인산화한다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터 내로 라이게이션시킨다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리his 리더 (제1의 6개의 STII 코돈, 폴리his 서열, 및 엔테로키나제 절단 부위 포함), GDM 코딩 구역, 람다 전사 종결자, 및 argU 유전자에 대해 코딩하는 서열을 포함할 것이다.

이어서, 라이게이션 혼합물을 사용하여 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 설명된 방법을 이용하여 선택된 이. 콜라이 균주를 형질전환시킨다. 형질전환체를 LB 플레이트 상에서 성장하는 그들의 능력에 의해 확인한 후, 항생제 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 단리하고 제한효소 분석 및 DNA 서열결정에 의해 확인할 수 있다.

선택된 클론을 항생제를 보충한 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지 내에서 철야 배양할 수 있다. 후속적으로, 철야 배양은 대규모 배양액을 접종하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 세포를 목적하는 광학 밀도로 성장시키고, 그 동안 발현 프로모터가 작동 개시된다.

세포를 수시간 더 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수거할 수 있다. 원심분리에 의해 얻은 세포 펠렛을 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용하여 가용화할 수 있고, 이어서, 가용화된 GDM 폴리펩티드는 단백질의 단단한 결합을 허용하는 조건 하에 금속 킬레이팅 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.

상기 GDM 폴리펩티드 서열은 다음 절차를 이용하여 이. 콜라이 내에서 폴리-His 태깅된 형태로 발현될 수 있다. GDM을 코딩하는 DNA를 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시킨다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 대응하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰성있는 번역 개시, 금속 킬레이션 컬럼 상의 신속한 정제, 및 엔테로키나제를 사용하는 단백 분해 제거를 제공하기 위한 다른 유용한 서열을 포함할 것이다. 이어서, PCR-증폭된, 폴리-His 태깅된 서열을 발현 벡터 내로 라이게이션시키고, 이를 균주 52에 기초한 이. 콜라이 숙주를 형질전환하기 위해 사용한다 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). 형질전환체를 먼저 50 mg/ml 카르베니실린을 함유하는 LB에서 30℃에서 진탕하면서 3-5의 O.D.600에 도달할 때까지 성장시킨다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지 (3.57 g (NH₄)₂SO₄, 0.71 g 시트르산나트륨·2H₂O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco 효모 추출물, 500 mL 물 중 5.36 g Sheffield 하이카제 SF, 및 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO₄를 혼합하여 제조함) 내에 50-100배 희석하고, 약 20-30시간 동안 30℃에서 진탕하면서 성장시킨다. SDS-PAGE 분석에 의해 발현을 증명하기 위해 샘플을 제거하고, 벌크 배양액을 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 정제 및 리폴딩 (refolding)시까지 세포 펠렛을 동결시킨다.

0.5 내지 1 L 발효 (6-10 g 펠렛)로부터의 이. 콜라이 페이스트를 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 버퍼 내에 10 부피 (w/v)로 재현탁시킨다. 고체 아황산나트륨 및 테트라티온산나트륨을 각각 0.1M 및 0.02 M의 최종 농도로 첨가하고, 용액을 4℃에서 철야 교반한다. 상기 단계는 모든 시스테인 잔기가 술피톨화 (sulfitolization)에 의해 차단된 변성 단백질을 생성시킨다. 용액을 40,000 rpm에서 Beckman Ultracentifuge 내에서 30분 동안 원심분리한다. 상등액을 3-5 부피의 금속 킬레이트 컬럼 버퍼 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)로 희석하고, 0.22 미크론 필터를 통해 여과하여 청정화한다. 청정화된 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 버퍼로 평형화시킨 5 ml 퀴아겐 Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 상에 로딩한다. 컬럼을 50 mM 이미다졸 (칼비오켐 (Calbiochem), Utrol 등급)을 함유하는 추가의 버퍼, pH 7.4로 세척한다. 단백질을 250 mM 이미다졸을 함유하는 버퍼로 용출한다. 목적하는 단백질을 함유하는 분획을 모으고 4℃에서 저장한다. 단백질 농도를 그의 아미노산 서열에 기초한 계산된 소광 계수를 이용하여 280 nm에서 그의 흡광도에 의해 추정한다.

샘플을 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 구성된 신선하게 제조된 리폴딩 버퍼 내로 느리게 희석함으로써 단백질을 리폴딩한다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/ml가 되도록 선택한다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12-36시간 동안 부드럽게 교반한다. 리폴딩 반응은 최종 농도 0.4% (pH 약 3)로 TFA의 첨가에 의해 켄칭시킨다. 단백질을 추가로 정제하기 전에, 용액을 0.22 미크론 필터를 통해 여과하고, 아세토니트릴을 2-10% 최종 농도로 첨가한다. 리폴딩된 단백질을 10%에서 80%로의 아세토니트릴 구배로 용출하면서 0.1% TFA의 이동 버퍼를 사용하여 Poros R1/H 역상 컬럼 상에서 크로마토그래피한다. A280 흡광도를 갖는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하고, 균질한 리폴딩된 단백질을 함유하는 분획을 모은다. 일반적으로, 대부분의 단백질의 적절하게 재폴딩된 종은 최저 농도의 아세토니트릴에서 용출되고, 이는 이들 종이 가장 밀집형이어서 그들의 소수성 내부가 역상 수지와의 상호작용으로부터 차폐되기 때문이다. 응집된 종은 대체로 보다 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 단백질의 잘못 폴딩된 형태를 목적하는 형태로부터 분해하는 것에 추가로, 역상 단계는 또한 샘플로부터 내독소를 제거한다.

목적하는 폴딩된 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 용액에 보내지는 부드러운 질소 스트림을 사용하여 아세토니트릴을 제거한다. 단백질을 투석에 의해 또는 제형화 버퍼 내에 평형화된 G25 Superfine (파마시아 (Pharmacia)) 수지를 사용하는 겔 여과에 의해 0.14 M 염화나트륨 및 4% 만니톨을 갖는 20 mM Hepes, pH 6.8 내로 제형화하고, 멸균 여과한다.

실시예 11: 포유동물 세포에서 GDM 폴리펩티드의 발현

본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의해 GDM 폴리펩티드의 잠재적으로 글리코실화된 형태의 제조를 예시한다.

벡터 pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 EP 307,247 참조)를 발현 벡터로서 사용한다. 임의로, 본원에 기재된 GDM 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 설명된 바와 같은 라이게이션 방법을 이용하여 상기 DNA의 삽입을 허용하는 선택된 제한 효소를 사용하여 pRK5 내로 라이게이션시킨다. 생성되는 벡터는 GDM-DNA로 불린다.

한 실시태양에서, 선택된 숙주세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 조직 배양 플레이트에서 배지, 예를 들어 태아 송아지 혈청 및 임의로 영양 성분 및/또는 항생제를 보충한 DMEM 중에서 융합 (confluence)시까지 배양한다. 약 10 ㎍ pRK5-GDM DNA를 약 1 ㎍의 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA와 혼합하고 [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)], 500 ㎕의 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl₂ 내에 용해시킨다. 상기 혼합물에 500 ㎕의 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO₄를 적가하고, 10분 동안 25℃에서 침전물을 형성시킨다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하고, 약 4시간 동안 37℃에서 침강시킨다. 배양 배지를 흡인 제거하고, 2 ml의 PBS 중 20% 글리세롤을 30초 동안 첨가한다. 이어서, 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 약 5일 동안 인큐베이팅한다.

형질감염의 약 24시간 후에, 배양 배지를 제거하고, 배양 배지 (단독으로) 또는 200 μCi/ml ³⁵S-시스테인 및 200 μCi/ml ³⁵S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 교체한다. 12시간 인큐베이션 후, 조건화된 배지를 수집하고, 스핀 필터 상에서 농축시키고, 15% SDS 겔 상에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고, GDM 폴리펩티드의 존재를 밝히기 위해 선택된 기간 동안 필름에 노출시킬 수 있다. 형질감염된 세포를 함유하는 배양액을 추가로 인큐베이팅할 수 있고 (무혈청 배지 내에서), 배지를 선택된 생물분석으로 시험한다.

대안적인 기술에서, GDM 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 293 세포 내로 문헌 [Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12:7575 (1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 일시적으로 도입할 수 있다. 293 세포를 스피너 (spinner) 플라스크 내에서 최대 밀도로 성장시키고, 700 ㎍ pRK5-GDM DNA를 첨가한다. 세포를 먼저 스피너 플라스크로부터 원심분리에 의해 농축시키고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠렛 상에서 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초 동안 처리하고, 조직 배양 배지로 세척하고, 조직 배양 배지, 5 ㎍/ml 소 인슐린 및 0.1 ㎍/ml 소 트랜스페린을 함유하는 스피너 플라스크 내로 다시 도입한다. 약 4일 후, 조건화된 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 파편을 제거한다. 이어서, 발현된 GDM을 함유하는 샘플을 임의의 선택된 방법, 예를 들어 투석 및/또는 컬럼 크로마토그래피에 의해 농축하고 정제할 수 있다.

또다른 실시태양에서, GDM 폴리펩티드는 CHO 세포 내에서 발현될 수 있다. pRK5-GDM은 공지의 시약, 예를 들어 CaPO₄ 또는 DEAE-덱스트란을 사용하여 CHO 세포 내로 형질감염될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 세포 배양액은 인큐베이팅되고, 배지는 배양 배지 (단독으로) 또는 방사성 표지, 예를 들어 ³⁵S-메티오닌을 함유하는 배지로 교체될 수 있다. GDM의 존재를 결정한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양액을 약 6일 동안 인큐베이팅한 후, 조건화된 배지를 수거한다. 이어서, 발현된 GDM 폴리펩티드를 함유하는 배지를 임의의 선택된 방법에 의해 농축하고 정제할 수 있다.

에피토프-태깅된 GDM 폴리펩티드는 또한 숙주 CHO 세포 내에서 발현될 수 있다. GDM 부분을 코딩하는 서열은 pRK5 벡터 밖으로 서브클로닝될 수 있다. 서브클론 삽입체를 PCR하여 선택된 에피토프 태그, 예를 들어 폴리-his 태그와 함께 바큘로바이러스 발현 벡터 내로 프레임 내 융합시킬 수 있다. 이어서, 상기 폴리-his 태깅된 GDM 삽입체를 안정한 클론의 선택을 위한 선택 마커, 예를 들어 DHFR을 함유하는 SV40 구동된 (driven) 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 마지막으로, CHO 세포를 SV40 구동된 벡터로 형질감염시킬 수 있다 (상기 설명한 바와 같이). 발현을 입증하기 위해 상기 설명된 바와 같이 표지를 수행할 수 있다. 이어서, 발현된 폴리-His 태깅된 GDM을 함유하는 배양 배지를 농축하고 임의의 선택된 방법, 예를 들어 Ni^{2 +}-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.

GDM 폴리펩티드는 또한 일시적 발현 절차에 의해 CHO 및/또는 COS 세포 내에서 또는 다른 안정한 발현 절차에 의해 CHO 세포 내에서 발현될 수 있다.

CHO 세포 내에서 안정한 발현은 다음 절차를 이용하여 수행한다. 단백질은 IgG 구성체 (면역어드헤신)로서 발현되고, 여기서 각각의 단백질의 가용성 형태 (예를 들어 세포외 도메인)에 대한 코딩 서열은 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 함유하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합되고/되거나 폴리-His 태깅된 형태이다.

PCR 증폭 후, 각각의 DNA를 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology. Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)]에 설명된 표준 기술을 이용하여 CHO 발현 벡터 내에서 서브클로닝한다. CHO 발현 벡터는 cDNA's의 편리한 셔틀링 (shuttling)을 허용하도록 목적하는 DNA의 상용성 제한 부위 5' 및 3'을 갖도록 구성된다. CHO 세포 내에서 발현에 사용된 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996)]에 설명된 바와 같고, 목적하는 cDNA의 발현을 구동하기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서 및 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)를 사용한다. DHFR 발현은 형질감염 후 플라스미드의 안정한 유지를 위한 선택을 허용한다.

12 ㎍의 목적하는 플라스미드 DNA를 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약 SUPERFECT® (퀴아겐 (Quiagen)), DOSPER® 또는 FUGENE® (뵈링거 만하임)을 사용하여 약 천만개의 CHO 세포 내로 도입한다. 세포를 문헌 [Lucas et al., 상기 문헌]에 설명된 바와 같이 성장시킨다. 약 3 x 10⁷ 세포를 아래에 설명된 추가의 성장 및 생산을 위해 앰플 내에서 냉동시킨다.

플라스미드 DNA를 함유하는 앰플을 수조에 넣어 해동시키고, 볼텍싱하여 혼합한다. 내용물을 10 mL의 배지를 함유하는 원심분리관 내로 피펫팅하고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 상등액을 흡인하고, 세포를 10 mL의 선택 배지 (5% 0.2 ㎛ 정용여과된 (diafiltered) 소 태아 혈청을 갖는 0.2 ㎛ 여과된 PS20) 내에 재현탁한다. 이어서, 세포를 90 mL의 선택 배지를 함유하는 100 mL 스피너 내로 분취한다. 1-2일 후, 세포를 150 mL 선택 성장 배지로 채운 250 mL 스피너 내로 옮기고, 37℃에서 인큐베이팅한다. 추가로 2-3일 후, 250 mL, 500 mL 및 2000 mL 스피너를 3 x 10⁵ 세포/mL로 접종한다. 세포 배지를 원심분리 및 생산 배지 내에 재현탁에 의해 신선한 배지로 교환한다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있지만, 미국 특허 5,122,469 (1992년 6월 16일 허여)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용할 수 있다. 3L 생산 스피너를 1.2 x 10⁶ 세포/mL로 접종한다. 0일에, 세포 수 및 pH를 결정한다. 1일에, 스피너를 샘플링하고, 여과된 공기 살포를 개시한다. 2일에, 스피너를 샘플링하고, 온도를 33℃로 변화시키고, 30 mL의 500 g/L 글루코스 및 0.6 mL의 10% 소포제 (예를 들어, 35% 폴리디메틸실록산 에멀젼, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)를 용해시킨다. 전체 생산 동안, 필요한 경우 pH를 약 7.2로 조정하여 유지한다. 10일 후에, 또는 생존성이 70% 미만으로 떨어질 때, 세포 배양액을 원심분리 및 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여 수거한다. 여액을 4℃에서 저장하거나, 정제를 위해 즉시 칼럼 상에 로딩한다.

폴리-His 태깅된 구성체에 대해, 단백질을 Ni-NTA 컬럼 (퀴아겐)을 사용하여 정제한다. 정제 전에, 이미다졸을 조건화된 배지에 5 mM의 농도로 첨가한다. 조건화된 배지를 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유하는 20 mM Hepes, pH 7.4, 버퍼 내에 평형화시킨 6 ml Ni-NTA 컬럼 상으로 4-5 ml/min의 유속으로 4℃에서 펌핑한다. 로딩한 ㅎ후, 컬럼을 추가의 평형 버퍼로 세척하고, 단백질을 0.25 M 이미다졸을 함유하는 평형 버퍼로 용출한다. 고도 정제된 단백질을 후속적으로 25 ml G25 Superfine (파마시아) 컬럼을 사용하여 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 버퍼, pH 6.8 내로 탈염시키고 -8O℃에서 저장한다.

면역어드헤신 (Fc-함유) 구성체를 조건화된 배지로부터 다음과 같이 정제한다. 조건화된 배지를 20 mM Na 인산염 버퍼, pH 6.8 내에 평형화시킨 5 ml 단백질 A 컬럼 (파마시아) 상으로 펌핑한다. 로딩한 후, 컬럼을 평형 버퍼로 광범하게 세척한 후, 100 mM 시트르산, pH 3.5로 용출한다. 용출된 단백질을 1 ml 분획을 275 ㎕의 1 M Tris 버퍼, pH 9를 함유하는 튜브 내로 수집하여 즉시 중화시킨다. 고도 정제된 단백질을 후속적으로 폴리-His 태깅된 단백질에 대해 상기 설명한 바와 같이 저장 버퍼 내로 탈염시킨다. 균질도를 SDS 폴리아크릴아미드 겔에 의해 및 Edman 분해에 의한 N-말단 아미노산 서열결정에 의해 평가한다.

실시예 12: 효모에서 GDM 의 발현

다음 방법은 효모에서 GDM 폴리펩티드의 재조합 발현을 설명한다.

먼저, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 상기 GDM 서열의 세포내 생산 또는 분비를 위해 효모 발현 벡터를 구성한다. 상기 GDM 서열을 코딩하는 DNA 및 프로모터를 GDM의 세포내 발현을 지시하도록 선택된 플라스미드 내에서 적합한 제한 효소 부위 내로 삽입한다. 분비를 위해, 상기 GDM 서열을 코딩하는 DNA를 ADH2/GAPDH 프로모터를 코딩하는 DNA, 천연 GDM 시그날 펩티드 또는 다른 포유동물 시그날 펩티드, 또는 예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 시그날/리더 서열, 및 GDM의 발현을 위한 링커 서열 (필요한 경우)과 함께 선택된 플라스미드 내로 클로닝할 수 있다.

이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기 설명된 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산을 사용하는 침전에 의해 및 SDS-PAGE에 의한 분리에 이어, 겔을 쿠마지 블루 염색으로 염색하여 분석할 수 있다.

후속적으로, 재조합 GDM은 효모 세포를 원심분리에 의해 발효 배지로부터 제거한 후, 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시킴으로써 단리하고 정제할 수 있다. GDM을 함유하는 농축물을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 추가로 정제할 수 있다.

실시예 13: 바큘로바이러스 -감염된 곤충 세포 내에서 GDM 의 발현

다음 방법은 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포 내에서 GDM 폴리펩티드의 재조합 발현을 설명한다.

상기 GDM 서열에 대해 코딩하는 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터 내에 함유된 에피토프 태그의 상류에 융합시킨다. 상기 에피토프 태그는 폴리-his 태그 및 면역글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역과 유사)를 포함한다. 상업적으로 입수가능한 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (노바겐 (Novagen))로부터 유도된 플라스미드를 포함하는 다양한 플라스미드가 사용될 수 있다. 간단히 설명하면, 상기 GDM 서열을 코딩하는 서열 또는 그의 코딩 서열의 목적하는 부분, 예를 들어 트랜스멤브레인 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열, 또는 단백질이 세포 외에 있는 경우 성숙 단백질을 코딩하는 서열을 5' 및 3' 구역에 상보성인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 5' 프라이머는 인접 (flanking) (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 산물을 상기 선택된 제한 효소로 소화시키고 발현 벡터 내로 서브클로닝한다.

재조합 바큘로바이러스를 상기 플라스미드 및 BACULOGOLD™ 바이러스 DNA (파밍겐 (Pharmingen))를 스포돕테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711) 내로 리포펙틴 (깁코-비알엘 (GIBCO-BRL)으로부터 상업적으로 입수가능함)을 사용하여 동시형질감염시켜 생성시킨다. 28℃에서 4-5일 인큐베이팅한 후, 방출된 바이러스를 수거하고 추가의 증폭을 위해 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 설명된 바와 같이 수행한다.

이어서, 발현된 폴리-his 태깅된 GDM 폴리펩티드를 예를 들어, 다음과 같이 Ni²⁺-킬레이트 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 문헌 [Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993)]에 설명된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 제조한다. 간단히 설명하면, Sf9 세포를 세척하고, 초음파 처리 버퍼 (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl₂; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) 내에 재현탁하고, 얼음 상에서 20초 동안 2회 초음파 처리한다. 초음파 처리물을 원심분리에 의해 청정화하고, 상등액을 로딩 버퍼 (50 mM 인산염, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)로 50배 희석하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과한다. Ni^{2 +}-NTA 아가로스 컬럼 (퀴아겐으로부터 상업적으로 입수가능한)을 5 mL의 층 부피를 갖도록 제조하고, 25 mL의 물로 세척하고, 25 mL의 로딩 버퍼로 평형화시킨다. 여과된 세포 추출물을 컬럼 상에 분당 0.5 mL로 로딩한다. 컬럼을 로딩 버퍼로 기준선 A₂₈₀으로 세척하고, 이때 분획 수집을 시작한다. 이어서, 컬럼을 비특이적으로 결합된 단백질을 용출하는 2차 세척 버퍼 (50 mM 인산염; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)로 세척한다. 다시 A₂₈₀ 기준선에 도달한 후, 컬럼을 2차 세척 버퍼 내의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개시킨다. 1 mL 분획을 수집하고, SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼린 포스파타제에 컨쥬게이팅된 Ni^{2 +}-NTA (퀴아겐)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석한다. 용출된 His₁₀-태깅된 GDM 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모으고 로딩 버퍼에 대해 투석한다.

별법으로, IgG 태깅된 (또는 Fc 태깅된) GDM 폴리펩티드의 정제는 공지의 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다.

실시예 14: 특이적 항체를 사용하는 GDM 폴리펩티드의 정제

천연 또는 재조합 GDM 폴리펩티드는 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 상기 GDM 서열의 프로(pro)-, 성숙 또는 프리(pre)-폴리펩티드 변이체는 상기 서열에 특이적인 항체를 사용하는 면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제된다. 일반적으로, 면역친화도 컬럼은 항-GDM 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유 커플링함으로써 제작된다.

폴리클로날 면역글로불린은 황산암모늄을 사용하는 침전에 의해 또는 고정된 단백질 A (파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지 (Pharmacia LKB Biotechnology, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)) 상의 정제에 의해 면역 혈청으로부터 제조된다. 마찬가지로, 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전 또는 고정된 단백질 A 상의 크로마토그래피에 의해 마우스 복수액으로부터 제조된다. 부분 정제된 면역글로불린은 크로마토그래피 수지, 예를 들어 CnBr-활성화된 SEPHAROSE™ (파마시아 엘케이비 바이오테크놀로지)에 공유 부착된다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 차단하고, 유도체 수지를 제조사의 지시에 따라 세척한다.

상기 면역친화도 컬럼은 상기 서열을 가용성 형태로 함유하는 세포로부터의 분획을 제조함으로써 상기 GDM 서열의 정제에서 사용된다. 상기 제제는 세제의 첨가 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의한 전체 세포의 또는 차등 원심분리를 통해 얻은 세포하 분획의 가용화에 의해 유도된다. 별법으로, 시그날 서열을 함유하는 가용성 GDM 폴리펩티드는 유용한 양으로 세포가 성장하는 배지 내로 분비될 수 있다.

가용성 GDM 폴리펩티드-함유 제제를 면역친화도 컬럼 위로 통과시키고, 컬럼을 상기 서열의 우선적 흡수를 허용하는 조건 하에 (예를 들어, 세제의 존재 하에 높은 이온 강도 버퍼) 세척한다. 이어서, 컬럼을 항체/기질간의 결합을 파괴하는 조건 하에 (예를 들어, 낮은 pH 버퍼, 예를 들어 약 pH 2-3, 또는 고농도의 카오트로프 (chaotrope), 예를 들어 우레아 또는 티오시아네이트 이온) 용출시키고, GDM 폴리펩티드를 각각 수집한다.

Claims (55)

1. (a) 종양 샘플 내의 GDM 세트의 발현을 측정하고;

   (b) 종양의 하위분류 PN, Prolif 또는 Mes를 결정하고;

   (c) 하위분류에 기초하여 적어도 유효량의 치료제와 접촉시키는 것을 포함하고;

   여기서, (I) Prolif 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 길항제 및/또는 Prolif-길항제 및/또는 항-유사분열제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (II) Mes 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 및/또는 Mes-길항제 및/또는 항-혈관형성제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (III) PN 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (1) PN-길항제; 및/또는 (2) 신경 분화제와; 임의로 (3) Akt 길항제; (4) 항-유사분열제 및 (5) 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되는 것인, 신경아교종 종양을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 하위분류가 계층 군집화 (hierarchical clustering)를 이용하여 종양을 신경아교종 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 하위분류가 k 평균 군집화 (k means clustering)를 이용하여 종양을 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 하위분류가 보팅 체계 (voting scheme)를 이용하여 종양을 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 하위분류가 앞서 분류된 신경아교종 샘플의 세트와 종양 사이의 GDM 마커의 세트의 발현의 유사성을 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, PN 길항제가 DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR 및 ASCL1을 제외하고 표 A에 제시된 PN 마커로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, Prolif 길항제가 표 A에 제시된 임의의 Prolif 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, Mes 길항제가 표 A에 제시된 임의의 Mes 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, Akt 길항제가 akt1, akt2, akt3의 길항제, PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR의 조절 또는 촉매 도메인의 길항제, 및 PTEN, INPP5D 또는 INPPL1의 활성화제, 자극제 또는 회복제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 항-유사분열제가 테모졸라미드, BCNU, CCNU, 로무스틴, 글리아델, 에토포시드, 카르무스틴, 이로노테칸, 토포테칸, 프로카르바진, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 메토트렉세이트, 시타라빈, 파클리탁셀, 오리스타틴, 메이탄시노이드로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 항-혈관형성제가 VEGF 길항제, 항-VEGF 항체, VEGFR1 및 VEGFR2 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 신경 분화제가 MAP2, 베타-튜불린, GAD65 및 GAP43로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 신경 분화제의 예가 레티노산, 발프로산 및 그의 유도체 (예를 들어 에스테르, 염, 레티노이드, 레티네이트, 발프로에이트 등); 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 수용체의 다른 아고니스트; 노긴; BDNF, NT 4/5 또는 NTRK2 수용체의 다른 아고니스트; 전사 인자 ASCL1, OLIG1의 발현을 증가시키는 물질; dll3 아고니스트, 노치 (Notch) 1, 2, 3 또는 4 길항제, 감마 분비효소 억제제, 예를 들어 니카스트린, Aph1A, Aph1B, Psen1, Psen2 및 PSENEN의 소분자 억제제, 델타 유사 리간드 (Dll)-1 길항제, 델타 유사 리간드 (Dll)-4, 재기드 (jagged) 1 길항제, 재기드 2 길항제; numb 아고니스트 또는 numb-유사 아고니스트를 포함하고, 이로 제한되지 않는 것인 방법.
13. (a) GDM 세트의 발현을 측정하고;

    (b) 종양의 하위분류 PN, Prolif 또는 Mes를 결정하고,

    (c) 질병 결과 (outcome)를 예측하고/하거나 진단하는 것을 포함하고;

    여기서, Prolif 또는 Mes의 하위분류는 보다 불량한 예후 또는 단축된 생존 시간을 나타내고, PN의 하위분류는 보다 양호한 예후 또는 연장된 생존 시간을 나타내는 것인, 신경아교종을 예측하고/하거나 진단하는 방법.
14. 제7항에 있어서, 하위분류가 계층 군집화를 이용하여 종양을 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
15. 제7항에 있어서, 하위분류가 k 평균 군집화를 이용하여 종양을 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
16. 제7항에 있어서, 하위분류가 보팅 체계를 이용하여 종양을 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
17. 제7항에 있어서, 하위분류가 앞서 분류된 신경아교종 샘플의 세트와 종양 사이의 GDM 마커의 세트의 발현의 유사성을 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
18. (a) 종양 샘플에서 PTEN 및 DLL3 종양 마커의 발현을 측정하고,

    (b) 상기 종양 마커의 발현에 기초하여 예측하고/하거나 진단하는 것을 포함하고,

    여기서, PTEN 및 DLL3 모두의 보다 높은 발현은 보다 양호한 예후 또는 연장된 생존 시간을 나타내고, PTEN의 보다 낮은 발현 수준은 DLL3 발현 수준에 무관하게 보다 불량한 예후 또는 단축된 생존 시간을 나타내는 것인, 신경아교종을 예측하고/하거나 진단하는 방법.
19. (a) 제1 시점에 제1 종양 샘플 내의 GDM의 발현을 측정하고;

    (b) 나중의 제2 시점에 제2 종양 샘플 내의 GDM의 발현을 측정하고;

    (c) 제1 및 제2 샘플에서 하위분류 PN, Prolif 또는 Mes를 결정하는 단계를 포함하고;

    여기서, 제1 종양 샘플에서 제2 종양 샘플로 PN 또는 Prolif에서 Mes 하위분류로의 전이는 상기 종양의 심도 증가 또는 진행을 나타내는 것인, 환자로부터의 적어도 2개의 샘플에서 신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 세트의 발현 시그너쳐를 비교하는 것을 포함하는, 신경아교종의 모니터링 또는 진단 방법.
20. (a) 종양 샘플 내의 GDM 세트의 발현을 측정하고;

    (b) 종양의 하위분류 PN, Prolif 또는 Mes를 결정하고;

    (c) 하위분류에 기초하여 적어도 유효량의 치료제와 접촉시키는 것을 포함하 고;

    여기서, (I) Prolif 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 길항제 및/또는 Prolif-길항제 및/또는 항-유사분열제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (II) Mes 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 및/또는 Mes-길항제 및/또는 항-혈관형성제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (III) PN 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (1) PN-길항제; 및/또는 (2) 신경 분화제와; 임의로 (3) Akt 길항제; (4) 항-유사분열제 및 (5) 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; 여기서 치료 결과는 종양의 크기 또는 성장 감소인, 신경아교종 종양의 크기 또는 성장의 억제 방법.
21. 제20항에 있어서, 하위분류가 계층 군집화를 이용하여 종양을 신경아교종 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
22. 제20항에 있어서, 하위분류가 k 평균 군집화를 이용하여 종양을 신경아교종 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
23. 제20항에 있어서, 하위분류가 보팅 체계를 이용하여 종양을 신경아교종 샘플의 세트에 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
24. 제20항에 있어서, 하위분류가 앞서 분류된 신경아교종 샘플의 세트와 종양 사이의 GDM 마커의 세트의 발현의 유사성을 비교함으로써 수행되는 것인 방법.
25. 제20항에 있어서, PN 길항제가 DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR 및 ASCL1을 제외하고 표 A에 제시된 임의의 PN 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
26. 제20항에 있어서, Prolif 길항제가 표 A에 제시된 임의의 Prolif 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 방법.
27. 제20항에 있어서, Mes 길항제가 표 A에 제시된 임의의 Mes 마커의 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
28. 제20항에 있어서, Akt 길항제가 akt1, akt2, akt3의 길항제, PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR의 조절 또는 촉매 도메인의 길항제, 및 PTEN, INPP5D 또는 INPPL1의 활성화제, 자극제 또는 회복제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
29. 제20항에 있어서, 항-혈관형성제가 VEGF 길항제, 항-VEGF 항체, VEGFR1 및 VEGFR2 길항제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
30. 제20항에 있어서, 항-유사분열제가 테모졸라미드, BCNU, CCNU, 로무스틴, 글리아델, 에토포시드, 카르무스틴, 이로노테칸, 토포테칸, 프로카르바진, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 메토트렉세이트, 시타라빈, 파클리탁셀, 오리스타틴, 메이탄시노이드로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
31. 제20항에 있어서, 신경 분화제가 MAP2, 베타-튜불린, GAD65 및 GAP43으로 이루어지는 군 중에서 선택되고, 신경 분화제의 예가 레티노산, 발프로산 및 그의 유도체 (예를 들어 에스테르, 염, 레티노이드, 레티네이트, 발프로에이트 등); 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 수용체의 다른 아고니스트; 노긴; BDNF, NT 4/5 또는 NTRK2 수용체의 다른 아고니스트; 전사 인자 ASCL1, OLIG1의 발현을 증가시키는 물질; dll3 아고니스트, 노치 1, 2, 3 또는 4 길항제, 감마 분비효소 억제제, 예를 들어 니카스트린, Aph1A, Aph1B, Psen1, Psen2 및 PSENEN의 소분자 억제제, 델타 유사 리간드 (Dll)-1 길항제, 델타 유사 리간드 (Dll)-4, 재기드 1 길항제, 재기드 2 길항제; numb 아고니스트 또는 numb-유사 아고니스트를 포함하고, 이로 제한되지 않는 것인 방법.
32. 제20항에 있어서, 길항제 및/또는 물질과의 접촉이 종양 세포의 사멸을 일으키는 것인 방법.
33. 제20항에 있어서, PN-, Prolif- 또는 Mes-길항제가 (1) 항-PN-, 항-Prolif- 또는 항-Mes 항체, (2) 항-PN-, 항-Prolif- 또는 항-Mes 항원 결합 단편, (3) PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 올리고펩티드, (4) PN-, Prolif- 또는 Mes-소분자 길항제 또는 (5) PN-, Prolif- 또는 Mes-안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
34. 제20항에 있어서, PN-, Prolif- 또는 Mes-길항제가 (1) 항-PN-, 항-Prolif- 또는 항-Mes 항체, 및 (2) 항-PN-, 항-Prolif- 또는 항-Mes 항원 결합 단편으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
35. 제20항에 있어서, 길항 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 단일쇄 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
36. 제20항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 성장 억제제 또는 세포독성제에 컨쥬게이팅되는 것인 방법.
37. 제20항에 있어서, 성장 억제제 또는 세포독성제가 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 항생제, 방사성 동위원소 및 뉴클레오티드 분해 효소로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
38. (a) 종양 샘플 내의 GDM 세트의 발현을 측정하고;

    (b) 종양의 하위분류 PN, Prolif 또는 Mes를 결정하고;

    (c) 하위분류에 기초하여 적어도 유효량의 치료제와 접촉시키는 것을 포함하고;

    여기서, (I) Prolif 하위분류를 보이는 종양은 포유동물에게 치료 유효량의 (a) Akt 길항제 및/또는 Prolif 길항제 및/또는 항-유사분열제, 및 (b) 신경 분화제를 투여하는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (II) Mes 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (a) Akt 및/또는 Mes-길항제 및/또는 항-혈관형성제, 및 (b) 신경 분화제와 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; (III) PN 하위분류를 보이는 종양은 유효량의 (1) PN-길항제; 및/또는 (2) 신경 분화제와; 임의로 (3) Akt 길항제; (4) 항-유사분열제 및 (5) 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하는 조합 치료로 치료되고; 여기서 치료 결과는 종양의 크기 또는 성장 감소인, 신경아교종 종양에 걸린 포유동물의 치료 방법.
39. 제38항에 있어서, 길항제 또는 물질의 투여가 신경아교종 종양의 사멸을 일으키는 것인 방법.
40. 제38항에 있어서, 길항제 또는 물질이 항체, 항-항원 결합 항체 단편, 올리고펩티드, 소분자 길항제 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
41. 제40항에 있어서, 길항 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 단일쇄 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
42. 제40항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 성장 억제제 또는 세포독성제에 컨쥬게이팅되는 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 성장 억제제 또는 세포독성제가 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 항생제, 방사성 동위원소 및 뉴클레오티드 분해 효소로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
44. 샘플을 PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제에 노출시키고, 샘플에서 각각의 결합의 양을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 결합량은 샘플 내의 각각의 PN-, Prolif- 또는 Mes-GDM의 발현 수준을 나타내는 것인, 샘플 내의 PN-, Prolif- 또는 Mes-신경아교종 결정 마커 ("GDM")의 발현 수준을 결정하는 방법.
45. 제44항에 있어서, PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제가 항-PN-, Prolif- 또는 Mes-항체; PN-, Prolif- 또는 Mes-결합 항체 단편; PN-, Prolif- 또는 Mes-올리고펩티드, PN-, Prolif- 또는 Mes-소분자 길항제 및 PN-, Prolif- 또는 Mes-안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
46. 제44항에 있어서, 항-PN-, 항-Prolif- 또는 항-Mes-항체가 모노클로날 항체, 항원 결합 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 및 단일쇄 항체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
47. 제45항에 있어서, PN-, Prolif- 또는 Mes-결합제가 검출가능하게 표지되는 것인 방법.
48. a) 종양의 시험 샘플을 제거하고,

    b) 시험 샘플에서 및 환자 생존 시간이 알려져 있는 30개 이상의 고등급 신경아교종의 세트에서 PTEN 및 DLL3 발현의 수준을 측정하는 것을 포함하고,

    여기서, 시험 샘플에서 PTEN 및 DLL3 둘 모두의 보다 높은 발현 수준은 참조 샘플 집단의 중앙값을 초과하는 생존 시간의 통계적으로 상승된 챈스를 나타내고, 시험 샘플에서 PTEN 또는 DLL3의 보다 낮은 발현 수준은 참조 샘플 집단의 중앙값 미만의 생존 시간의 통계적으로 상승된 챈스를 나타내는, 신경아교종 종양에 걸린 포유동물에서 생존 시간을 예측하는 방법.
49. (a) 포유동물로부터 얻은 조직을 포함하는 시험 샘플을

    (i) PTEN 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자인 제1 시약, 및

    (ii) DLL3 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 유기 소분자인 제2 시약과 접촉시키고;

    (b) 제1 및 제2 시약과 각각 시험 샘플 내의 PTEN 및 DLL3 폴리펩티드 사이의 복합체 형성의 양을 측정하는 것을 포함하고,

    여기서, PTEN 및 DLL3 복합체 둘 모두의 많은 양의 형성은 경증 종양을 나타내고, PTEN 또는 DLL3 복합체의 적은 양의 형성은 중증 종양을 나타내는 것인, 포유동물에서 신경아교종 종양의 심도를 진단하는 방법.
50. 제49항에 있어서, 제1 및/또는 제2 시약이 검출가능하게 표지되는 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 제1 및/또는 제2 시약이 고체 지지체에 부착되는 것인 방법.
52. (a) PN-, Prolif- 또는 Mes-GDM 폴리펩티드, 또는 (b) 상기 (a)를 코딩하는 핵산 서열의, 신경아교종 종양의 (i) 치료 또는 (ii) 진단 검출에 유용한 의약의 제조에 있어서의 용도.
53. 제52항에 있어서, GDM 폴리펩티드가 항체, GDM 결합 항체 단편, GDM 결합 올리고펩티드, GDM 소분자 길항제, 또는 GDM 안티센스 올리고뉴클레오티드인 용도.
54. 제52 또는 53항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 항원 결합 항체 단편, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체인 용도.
55. 유효량의 신경 분화제와; (1) Akt 길항제; (2) 항-유사분열제 및 (3) 항-혈관형성제 중 하나 이상과 조합하여 접촉시키는 것을 포함하고; 여기서 그 결과는 종양의 크기 또는 성장 감소인, 신경아교종 종양에 걸린 포유동물의 치료 방법.

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