KR20080083072A - Ｖｅｇｆ-ｘ 또는 그의 길항제에 의한 평활근 세포 증식의 조절 - Google Patents

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안나 고슈스카
진 쥬
로버트 고돈
제프 욘
스리데비 나이듀 드하나라즈
이안 하리스
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Abstract

본 발명은 혈관 내피 성장 인자의 신규 용도를 제공하고, 여기서, 디자인된 VEGF-X, 및 CUB 도메인은 VEGF-X의 서열내에 존재하고, 평활근 세포 증식을 증가하며, 감소된 평활근 세포 증식에 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다. VEGF-X 및 CUB 도메인은 또한 조직 기능 또는 구조물을 재생하기 위해 특이적 조직내로 평활근 세포의 수를 증가하기 위한 조직 엔지니어링에 사용될 수 있다. 본 발명은 VEGF-X 생물학적 활성의 억제제의 동정하기 위한 선별 방법을 또한 개시하고, 상기 억제제는 VEGF-X 생물학적 활성과 길항하는 중화 VEGF-X 항체, 안티센스 VEGF-X 서열 또는 비-단백질 길항제를 포함한다. 또한 본 발명은 평활근 세포 과증식과 관련된 질병을 치료하는 치료적 방법 및 평활근 세포 과증식과 관련된 병리학적 질환 또는 병리학적 질환의 감수성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
VEGF-X, CUB 도메인, 평활근 세포 증식

Description

ＶＥＧＦ-Ｘ 또는 그의 길항제에 의한 평활근 세포 증식의 조절{Modulation of smooth muscle cell proliferation by VEGF-X or antagonists thereof}
본 발명은 평활근 세포 증식의 조절, 특히 평활근 세포 증식을 증가시키기 위한, 감소된 평활근 세포 증식에 관련된 질병을 치료하기 위한 혈관 내피 성장 인자의 신규한 용도에 관한 것이다.
PDGF/VEGF 성장 인자류는 다수의 구조적으로 관련된 성장 인자를 포함한다. 다수의 류는 디설파이드 결합에 의해 공유적으로 결합된 다이머를 형성하고 (Potgens 등 1994, Andersson 등 1992), 보존된 시스테인-리치 부위, 시스테인 매듭(knot) (Sun, P. D. 1995)을 포함한다. 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF)는 섬유모세포 및 평활근 세포를 포함하는 결합 조직 세포에 대해 유사분열 촉진성이다 (Heldin 등에서 리뷰, 1999). PDGF는 구별되는 A 및 B 체인의 호머- 및 헤테로다이머로 구성되고, 두개의 수용체 티로신 키네이즈, PDGFR-α 및 PDGFR-β를 활성화한다. PDGF mRNA는 정상 세포 형태의 범위에서 발현되고, 종양발생 및 다른 질병 진행에서 포함될 수 있다(Heldin 등 1999). 또한 PDGF-B 유전자는 v-sis 종양유전자로서 레트로바이러스를 형질변환에 의해 운반되고, 과발현은 종양발생성을 나타낸 다 (Devare 등, 1983).
혈관 내피 세포 성장 인자는 신혈관생성 및 혈관 투과성에 관련된다 (Ferrara & Davis-Smyth, 1997, Neufeld 등, 1999에서 리뷰). 상기 문헌은 5개의 내생성 VEGF (VEGF-A,-B,-C,-D 및 태반 성장 인자 (PLGF))를 기술하고 있다. VEGF 시그날은 수용체 티로신 키네이즈류를 경유하고 (Ferrara & Davis-Smyth, 1997, Neufeld 등, 1999), 최근에는 뉴로필린-1은 VEGF-A의 몇 개의 이소폼에 대한 수용체인 것으로 나타났다(Soker 등, 1998).
VEGF-A는 심장, 태반 및 췌장을 포함하는 수 개의 정상 조직에서 발현한다 (Berse 등, 1992). 많은 종양에서 과발현된 것이 나타났고(Takahashi 등, 1995), 및 VEGF-A 작용의 억제는 동물 모델에서 종양의 감소를 일으키는 것으로 나타났다(Kim 등, 1993). VEGF-A는 또한 부적절한 혈관형성을 포함되는 다른 질병의 진행에 관련된다(Folkman 1995). 정상 조직에서 VEGF-B mRNA 발현은 VEGF-A의 발현과 오버랩되지만, 중추신경계에서 또한 검출할 수 있다(Lagercrantz 등, 1998). VEGF-C는 VEGF A 및 B 보다 낮은 수준으로 발현하지만(Lagercrantz 등, 1998), 조직의 범위에서 검출할 수 있다 (Lee 등 1996, Fitz 등, 1997). VEGF-D는 폐, 심장 및 소장에서 많이 발형하고, 다수의 다른 조직에서 검출할 수 있다(Yamada 등, 1997).
EST 데이타베이스의 서치에서 새로운 멤버의 VEGF/PDGF 류가 동정된 것으로 나타났다. 상기 동정된 폴리펩타이드 서열은 N-말단 CUB 도메인 및 C-말단 PDGF 도메인을 포함하고, 혈관 내피 성장 인자-X로 명명되었다 (VEGF-X; 특허 WO 0037641; EMBL 기탁번호: AX028032). 같은 서열이 최근에 공개되고, PDGF 활성을 갖는 것으 로 나타나고(Li 등, 2000), PDGF-C로 명명되고, 상기 두개의 명칭이 상호 사용된다. Li 등은 PDGF-C의 C-말단 PDGF 도메인이 PDGFR 결합 섬유모세포 증식의 자극에 활성인 것을 발견하였고, 전체 길이 PDGF-C는 상기 활성을 나타내지 않았다. 이들은 CUB 도메인이 PDGF 도메인의 억제제로서 작용하는 모델을 제시하였다: 활성은 단백질 분해를 경유하고 활성 PDGF-C를 유리한다.
평활근 세포는 방광기능을 조절하기 위해 요도 및 방광벽에서 중요하다. 다수의 평활근 세포의 증가는 요실금 및 방광 부전의 스트레스를 치료하는 것으로 증명되었다(Yokoyama 등, 2000). 치료에 사용하기 위한 세포 수의 증가는 직접 요도 및 방광 벽에 평활근 세포(myoblasts)를 주입하는 것이었다.
다른 한편, 인공 평활근 세포 증식은 다양한 질병을 일으키는 것으로 알려졌고, 이러한 원치않는 세포의 수치를 막는 약물이 이러한 질환에 대한 표적 치료에서 사용될 수 있었다. 대동맥의 질환인 죽상 동맥 경화증은 심질환 및 뇌졸중의 1차 윈인이다. 서구 사회에서, 그것은 모든 사망의 약 50%의 근본적인 원인이다. 죽상 동맥 경화증은 대동맥에서 지질 및 섬유성 요소의 축적으로 특징되는 진행성 질환이다. 혈관벽의 세포, 특히 평활근 세포 (SMC)에서의 세포의 과증식은 죽상 동맥 경화증의 병인성에 기인한다 (Lusis, AJ, 2000). 평활근 세포 증식 및 이동을 막는 치료는 내막 과형성을 예방하는데 충분하고, 혈관 치유과정에 기여할 것이다. 흐르는 혈관의 간섭 환경에서, 높은 재협착 속도는 내막 협착 및 맥관 폐색을 가져오게 할 수 있는, 내막 과형성, 혈관벽 손상후에 생기는 만성 구조적 병변의 유의성의 인식을 증가시킨다. 내막 증식은 비정상적인 이동 및 세포외 결합 조직 매트 릭스의 침전에 관련된 혈관 평활근 세포의 증식으로 정의된다(Hagen P. O., 등 1994). 심장성 동종 이식 동맥 경화증은 수용체의 장수를 제한하는 주된 원인의 하나이다. 이것은 증식성 평활근 세포를 포함하는 내막의 비후를 특징으로 하고, 동맥 벽에서 상당한 손상 때문에 문합술의 부위에서 발생할 수 있다(Suzuki J, 등 2000). 평활근 세포의 병리학적 과증식의 예방은 마이크로동맥성 문합술 및 동종 이식 동맥성 내막 증식의 치료를 위한 내막 증식의 감소에 사용될 수 있다 (Robert C, 등 1995). 평활근 세포 혈관주위세포의 성장의 저지는 관상 혈관 혈관 성형술에 의해 유도되는 신내막 증식을 감소하는데 도움이 된다. 방광 또는 신장 비대 및 증식가 당뇨병성 방광병증에 자주 인정된다. 평활근 세포의 과증식은 또한 만성 및/또는 심한 유출구 폐쇄를 일으키는 방광 방광 및 신장 기능의 회복불가능한 변경을 일으킨다(Mumtaz FH, 등 2000).
본 발명에서 놀랍게도 재조합 전체 길이 VEGF-X 및 CUB 도메인 단백질의 양자가 PDGF 도메인의 잠복기를 유지하는 그의 기능을 넘어 CUB 도메인의 기능을 의미하는, 인비트로에서의 인간 동맥 평활근 세포에 대해 유사분열 촉진성 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 따라서 평활근 세포 증식을 증가하는 VEGF-X 및 CUB 도메인은 요실금, 방광 부전 및 평활근 세포로 구성된 다른 괄약근의 부전의 치료에 유익할 수 있다. VEGF-X 및 CUB 도메인은 또한 평활근 기능을 개선을 위한 골반기저의 재구성동안에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 제1면에 따르면, 생체내 또는 시험관내에서 평활근 세포 증식을 자극하는 약제를 제조할 수 있는, VEGF-X 폴리펩타이드 또는 그의 기능성 등가물, 유도체 또는 변이체를 암호화하는 핵산 분자의 용도를 제공한다. 바람직하게, VEGF-X 폴리펩타이드의 서열은 도 1 (a)와 같다. 또한 바람직하게는 도 1 (a)에서 나타난 40위 내지 150위로부터의 아미노산 서열로 구성된 VEGF-X의 CUB 도메인 또는 그의 기능성 등가물, 유도체 또는 변이체의 용도를 제공한다.
상기한 폴리펩타이드, CUB 도메인 및 핵산 분자는 또한 요도 부전, 방광 부전, 괄약근 부전 또는 기능성 VEGF-X 또는 CUB 도메인 단백질의 감소된 발현에 관련된 다른 질환 또는 질병 또는 골반기저의 재구성(pelvic floor reconstruction) 의 치료를 위한 약제 또는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 면은 생체내 또는 시험관내 조직 엔지니어링 적용을 위한 평활근 세포를 갖는 매트릭스를 생산(populating)하기 위한 VEGF-X 또는 그의 CUB 도메인의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 DNA 분자는 바람직하게는 적합한 숙주에서 이들로부터 암호화된 VEGF-X를 발현하기 위한 적합한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 상기 세포의 계속적인 형질전환 및 형질전환된 세포의 계속적인 선별을 위한 클론된 DNA의 적합한 발현 벡터내의 삽입은 당업자에게 공지이고, Sambrook 등 (1989), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press에 제공된다.
본 발명에 따른 발현 벡터는 상기 DNA 단편의 발현을 할 수 있는 프로모터 부위와 같은 조절서열에 실시가능하게 연결된 본 발명에 따른 핵산을 갖는 벡터를 포함한다. 용어 "실시가능하게 연결된(operably linked)"은 기술된 구성요소가 의도된 방법으로 기능을 허여하는 관계로 병렬된 것을 말한다. 이같은 벡터는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현을 제공하기 위해 적합한 숙주 세포내로 형질전환될 수 있다.
상기 발현 벡터는 또한 평활근 세포 증식을 자극하기 위해 사용될 수 있고, 또한 요도 부전, 방광 부전 또는 기능성 VEGF-X 단백질의 감소된 발현과 관련된 다른 질병을 포함하는 본 발명에 따른 질환 또는 질병의 치료에 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 재조합, 합성 또는 천연적으로 생성된 것일 수 있고, 바람직하게 재조합된 것이다. 유사하게 본 발명에 따른 핵산 서열도 예컨대, PCR 클로닝 메카니즘을 사용하는 것과 같은 재조합 또는 합성 기술를 사용하여 생산할 수 있다.
추가적인 면에 있어, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 결합된 상기 핵산 분자가 삽입된 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 분자 또는 벡터의 가용성 형태와 같은, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 상기 담체는 제한되지는 않지만, 식염수, 버퍼화 식염수, 덱스트로즈, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 조합을 포함한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 조직 및 기관에서 평활근 세포 증식을 자극하기 위해 사용할 수 있고, 또는 다르게는 요도, 방광 또는 괄약근 부전 또는 본 발명의 VEGF-X 폴리펩타이드의 이상성(aberrant) 내생 활성과 관련된 부전의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명의 상기한 조성물의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로, 치료적 화합물과 같은 다른 화합물과 결합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드(상기 용어는 본 명세서에서 교체되어 사용될 수 있음)는 본 명세서에서 상기 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 포함하고, 보전성(conservative) 아미노산 변화를 갖는 본 발명에 따른 핵산 분자 에 의해 암호화된 모든 아미노산 변이체를 포함하는 것으로 정의된다. 보전성 아미노산 치환은 단백질의 기능 또는 발현에 영향을 미치지 않는 단백질내의 하나 이상의 아미노산의 변경을 말한다. 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드는 또한 상기 단백질 또는 폴리펩타이드에 실질적으로 상동인 알렐성 변이체를 천연적으로 생성하는 것을 포함하는 상기 서열의 변이체를 포함한다고 정의된다. 본 명세서에서, 실질적인 동질성은 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질 또는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 바람직하게 80 또는 90% 및 바람직하게 95% 아미노산 동질성을 갖는 서열을 말한다. 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드의 "기능성 등가물"은 본 발명의 방법 및 용도에 필요로 하는 상기 VEGF-X 활성을 나타난 다고 예견되는 모든 아미노산 및 알렐성 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드는 재조합, 합성 또는 천연적으로 생성된 것일 수 있고, 바람직하게 재조합된 것이다.
본 명세서에 정의된 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드는 또한 상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 생체전구체(bioprecusor)를 포함한다. 생체전구체는 본 발명에서 필요한 VEGF-X 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드로 생체적 과정으로 전환할 수 있는 분자이다. 본 발명에 따른 핵산 또는 단백질은 암 또는 다른 질병 또는 VEGF-X 단백질의 발현에 관련된 질병의 치료를 위한 약제 또는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
이롭게는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 단백질은 약리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 안티센스(antisense) 기술의 사용에 의한 생체내 VEGF-X를 저해에 관한 것이다.
안티센스 기술은 유전자 발현 안티센스 DNA 또는 RNA의 트리플-헤릭스를 통해 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 양자 방법은 DNA 또는 RNA로 폴리뉴클레오타이드의 결합에 기초한다. 예컨대, 본 발명의 단백질을 암호화하는 5' 코딩 부위 또는 성숙 DNA 서열은 길이가 10 내지 50개의 염기쌍인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인하기 위해 사용된다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자의 부위에 상보적으로 디자인되고(triple-helix - 참고 Lee 등 Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney 등, Science, 241: 456 (1988); 및 Dervan 등, Science, 251: 1360 (1991), VEGF-X의 전자 및 생산을 예방한다.
따라서, 본 발명은 도 1 (a)에 따른 핵산 또는 높는 엄격(high stringency) 상태하의 그것의 보체에 하이드리드화할 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오타이드 분자와 같은 VEGF-X 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산분자에 대해 하기 질환을 치료 또는 예방하기 위해 충분한 농도로 폴리뉴클레오타이드 분자 안티센스의 함량을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 동맥 문합술에 의해 발생하는 신내막 증식 또는 풍선 카테터, 경피 경관 관상동맥 성형술 이후 동맥성 스텐팅(stenting)에 유발되는 포스트혈관 성형술 재협착을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
높는 엄격 상태는 일반적으로 30℃ 이상, 일반적으로 37℃ 이상, 및 바람직하게 45℃ 이상의 온도를 포함한다. 엄격 염 상태는 통상 1000mM 이하, 이반적으로 500mM 이하 및 바람직하게 200mM 이하이다.
상기 조성물은 예컨대, 전신적 또는 경구 경로에 의한 투여 경로를 통해 주입될 수 있다. 전신적 투여의 바람직한 형태는 주사, 일반적으로 정맥 주사를 포함한다. 다른 주사 경로는 예컨대, 피하, 근육내 또는 복강이 사용될 수 있다.
전신적 투여의 대체적 수단은 담즙산 또는 푸시딘 산 또는 다른 계면 활성제과 같은 침투제를 사용한 경점막 및 경피 투여를 포한한다. 또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 다른 화합물은 장용제 또는 캡솔화 제제, 경구 투여제로 제제화하는 것도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국소적 및/또는 부분적일 수 있다.
필요한 용량 범위는 본 발명의 펩타이드 또는 다른 화합물의 선택, 투여 경로, 제제의 특성, 대상체의 질환의 특성 및 참가하는 임상의의 판단에 따른다. 그러나 적합한 용량은 0.1-100 mg/대사체의 kg 범위이다. 필요한 용량의 넓은 변화는 사용가능한 화합물의 변화 및 다양한 투여경로의 다른 효과의 관점에서 기대된다.
예컨대, 정맥 주사에 의한 투여보다 높은 용량이 경구투여시 기대된다. 이들 용량 수준의 변화는 공지의 방법에 따라 최적화를 위한 실험적 관례를 사용하여 조정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 요법에 따라 투여할 때, 원하는 치료적 효과 또는 반응을 일으키거나 원하는 이익을 제공하는 본 발명의 VEGF-X 또는 다른 활성체의 함량을 의미한다.
바람직한 치료적 유효량은 평활근 세포의 증식을 자극하는 양이다.
본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용되는"은 독성 또는 안정성 관점으 로부터 인간을 포함하는 포유동물에 투여를 위해 적합함을 일반적으로 의미한다.
본 발명에서, VEGF-X 단백질은 일반적으로 원하는 치료 효과를 얻기전까지 충분한 기간동안 투여한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "원하는 치료 효과를 얻기전까지"는 조절되는 질병 또는 질환에 관찰되는 임상적 또는 의학적 효과가 임상의 또는 관찰자에 의해 관찰되는 시간까지의 용량 스케쥴의 선택에 따라 치료적 약제 또는 약제들이 계속하여 투여되는 것을 의미한다. 본 발명의 치료방법에서, 상기 화합물은 골 질량 또는 구조에서 원하는 변화가 관찰될 때까지 연속해서 투여한다. 예컨대, 평활근 세포의 증가의 달성이 원하는 목적이다. 질병의 상태 또는 질환의 위험을 감소시키는 방법으로, 상기 화합물은 원하지 않은 질환을 예방하기에 필요할 때까지 계속하여 투여한다.
평활근 세포 증식의 2개 이상의 자극제의 병용은 결합은 본 발명의 범위내에 또한 포함된다.
"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 모든 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시뉴클레오티드을 말한다. "폴리뉴클레오타이드"는 제한되지는 않지만, 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 부위의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA, 및 단일- 및 이중-나선 부위의 혼합물인 RNA, 단일 나선일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자 또는 보다 일반적으로, 이중나선 또는 단일- 및 이중 나선 부위의 혼합물을 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 양자를 포함하는 3중 나선 부위를 말한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유에 의해 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염는 예컨대, 트리틸레이드된 염기 및 이노신과 같은 드문 염기를 포함한다. 변경의 다양성은 DNA 및 RNA로 만들어질 수 있다; 이와같이, "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 천연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태, 뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다. "폴리뉴클레오타이드"는 또한 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드, 종종 올리고뉴클레오티드라고도 하는 것을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 펩타이드 골격 또는 변경된 펩타이드 골격, 즉, 펩타이드 동배체(isostere)에 의해 각각 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 모든 펩타이드 또는 단백질을 말한다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드로 언급되는 짧은 체인 또는 단백질로 언급되는 올리고머 및 긴 체인 양자를 말한다. 폴리펩타이드는 20개의 유전자를 암호화하는 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다.
"폴리펩타이드"는 전사후 가공과 같은 자연적 방법 또는 공지인 화학적 변경 기술에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 변경은 폴리펩타이드의 펩타이드 골격, 아미노산 사이드-체인 및 아미노 또는 카복시 말단과 같은 어느 곳에서도 발생할 수 있다. 같은 형태의 변경이 주어진 폴리펩타이드에서 여러 부위에서 같은 또는 다른 정도로 존재할 수 있다고 인정된다. 또한 주어진 폴리펩타이드는 많은 형태의 변경을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 유비퀴틴화(ubiquitination) 의 결과로서 분지화될 수 있고, 분지화 또는 분지화 없이 환화될 수 있다. 환화, 분지화 및 분지된 환화 폴리펩타이드는 후번역 천연 과정 또는 합성 방법에 의해 형성될 수 있다. 변경은 아세틸화, 아실화, ADP리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴 부위의 공유적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유적 부착, 가교 결합, 환화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유적 가교결합의 형성, 시스테인의 형성, 폴리글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토릴화, 산화, 단백질 가수분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라시미화, 셀레노일화, 황화, 알지닐화 같은 단백질에 아미노산의 전이-RNA 변경된 부가, 및 유비퀴틴화를 포함한다 (예컨대, PROTEIN-STRUCTURE 및 MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman 및 Company, New York, 1993; Wold, F., Post-trnaslational protein Modifications: Perspectives 및 Prospects, pages. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEIN, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Selfter 등,"Aanlysis for protein modifications 및 nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182: 626- 646 및 Rattan 등,"Protein Synthesis: Post-trnaslational Modifications 및 Aging", Ann NYAcad Sci (1992) 663: 48-62 참조).
상기 모든 변경에서 포함되는 폴리펩타이드는 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드의 "유도체"로서 기술될 수 있다.
본 발명은 또한 VEGF-X 생물학적 활성의 억제제를 동정하는 선별 방법에 관한 것이다. 상기 억제제는 중화된 VEGF-X 항체, 안티센스 VEGF-X 서열 또는 VEGF-X 생물학적 활성과 경쟁하는 비-단백질 길항제를 포함한다. 적합한 항체는 분리된 및/또는 재조합 항원 또는 그의 부분(합성 펩타이드와 같은 합성 분자 포함)과 같은 적합한 면역원에 대해 또는 재조합 항원으로 발현되는 숙주세포에 대해 증가한다. 또한 혈질감염 세포와 같은 재조합 항원을 발현하는 세포는 면역원으로 사용할 수 있거나 수용체의 결합하는 함체의 선별에 사용할 수 있다(예컨대, Chuntharapai 등, J Immunol., 152.- 17831-1789 (1994)참조).
항체를 생산하는 세포, 바람직하게 비장 또는 림프절의 세포는 원하는 항체로 면역화한 동물로부터 얻어질 수 있다. 융합된 세포(하이브리도마스)는 선별적 배양 조건을 사용하여 분리할 수 있고, 제한 희석에 의해 클론될 수 있다. 원하는 특성을 갖는 항체를 생산하는 세포는 적합한 어세이 (예, ELISA)에 의해 선별될 수 있다.
따라서, 본 발명은 죽상 동맥 경화증, 동맥 문합술에 의해 발생하는 신내막 증식 또는 풍선 카테터, 경피 경관 관상동맥 성형술 이후 동맥성 스텐팅하는 것에 기인하는 포스트혈관 성형술 재협착 의 치료 또는 예방 방법을 제공하고, 상기 방법은 도 1 (a) 또는 그의 에피토프와 같은 VEGF-X 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체의 상기 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 농도의 함량을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항-VEGF-X 항체는 VEGF-X 수용체의 고친화성 결합을 특징으로 한다.
VEGF-X 대한 항체는 흡입에 의해 투여될 수 있다 (예, 안개화된 연무으로서의 흡입제 또는 분무제로). 다른 투여 경로는 비강, 경구, 주입 및/또는 볼러스 주사를 포함하는 정맥내, 피내, 경피(예, 서방성 폴리머 내의), 근육내, 복강, 피하, 국소, 경막외, 버칼 등의 경로를 포함한다. 다른 적합한 투여 경로는 또한 사용될 수 있고, 예컨대, 상피성 또는 점막피부의 내막을 통합 흡수에 의해 달성될 수 있다. 항체는 또한 유전자 치료에 의해 투여될 수 있고, 여기서, 특정 치료 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 분자가 예컨대, 벡터를 통해 환자에 투여되고, 생체내에서 치료적 수준으로 발현되고 분비되는 특정 단백질 또는 펩타이드를 유발한다. 또한 항-VEGF-X 항체는 예컨대, 약제학적으로 허용되는 계면활성제류 (예, 글리세라이들류), 부형제류 (예, 락토즈), 담체, 희석제 및 비히클을 포함하는 생물학적 활성 시약의 다른 구성물과 동시에 투여될 수 있다. 항-VEGFX 항체는 다른 치료적 요법 또는 약물 전, 동시에 또는 계속하에 개별적으로 예방적 또는 치료적으로 투여할 수 있다 (예, 다중 약물 요법). 다른 치료적 약물과 동시에 투여되는 항-VEGF-X 항체는 동일 또는 다른 조성물로 투여될 수 있다. 항-VEGF-X 항체는 약제학적으로 허용되는 비경구적 비히클과 결합된 용제, 현탁제, 에멀젼, 동결건조된 분말로 제제화될 수 있다.
VEGF-X 항체의 치료적 유효량은 증상 및 목적하는 치료 및 효과의 특성 및 정도에 의존하여 단일 또는 분할된 용량으로 투여될 수 있거나 (예, 일, 주 또는 달의 간격에 의해 분리된 일련의 용량), 서방성 형태로 할 수 있다.
다른 면에서, 효능제 및 길항제에 대한 선별 어세이는 본 VEGF-X 수용체에 대한 발명에 따른 VEGF-X 또는 CUB 도메인 폴리펩타이드의 결합에 대한 후보 화합물의 효과를 측정하는 것을 포함한다. 특히, 상기 방법은 VEGF-X 수용체와 본 발명에 따른 VEGF-X 또는 CUB 도메인 폴리펩타이드 및 후보 화합물을 접촉 및 VEGF-X 수용체에 대한 VEGF-X 또는 CUB 도메인 폴리펩타이드의 결합이 후보 화합물의 존재에 의해 증가 또는 감소하는 지의 측정을 포함한다. 상기 어세이에서, 표준 결합상의 VEGF-X 또는 CUB 도메인 폴리펩타이드의 결합의 증가는 후보 화합물이 VEGF-X 또는 CUB 도메인의 효능제인 것을 나타낸다. 표준에 비교한 VEGF-X 또는 CUB 도메인 폴리펩타이드의 결합의 감소는 VEGF-X 또는 CUB 도메인의 항효능제인 것을 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예 및 부가된 도면을 참고하여 보다 명백하게 이해될 수 있다.
실시예
물질 및 방법
cDNA 및 VEGF -X의 부분적 게놈성 클로님
공지의 VEGF 서열 (VEGF-A, B, C 및 D)에서 PDGF-유사 도메인에 기초하여 프로필을 개발하고(Lee 등, 1996), LifeSeqTM 인간 EST 데이타베이스의 서치하기 위해 사용하였다(Incyte Genomics Inc. Palo Alto, CA, USA). 상기 서치는 VEGF 류의 잠재적인 신규 멤버의 부분적 서열을 밝혔다. cDNA 서열을 확장하기 위해, 5'RACE 를 Marathon-Readya 태반 및 골격근 cDNA (Clontech, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 전체 코딩 서열은 포준 폴리머레이즈 체인 반응 방법을 사용하여 증폭하였다(Fitz 등, 1997). PCR 단편을 벡터 pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA. USA) 또는 pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA. USA)내로 클론하였다. 코딩 서열을 측정하기 위해, 다중 클론을 서열화하였다; 또 모든 하부클론을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 부분적 게놈성 클론을 얻기 위해, 인간 게놈성 BAC 라이브러리 (Genome Systems, Inc., St Louis, MI, USA)를 PDGF-C cDNA 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화에 의해 선별한다. 인트론/엑손 경계의 측정을 위해, BAC DNA는 공지의 known cDNA 서열에 기초한 20-단량체 서열을 직절 사용해서 서열화하였다. BAC DNA는 Qiagen plasmid midi 키트를 사용하여 제조하였다 (Qiagen GmbH, Dusseldorf, Germany).
VEGF -X 유전자의 크로모좀성 국소화
이미 기술된 것(Yamada 등, 1997; Gribsteor 등, 1987, Ausabel 등, 1997)과 같이 바이오틴화된 2.7kb 프로브을 갖는 FISH 분석을 사용하여 크로모좀성 맵핑 연구를 수행하였다.
노던 블롯 및 RT - PCR 에 의한 VEGF -X mRNA 발현의 분석
다른 인간 조직으로부터 유도된 2㎍의 폴리(A)+리치RNA를 포함하는 노던 블롯 (Clontech Laboratories; MTNTM 블롯, MTNTM 블롯 II 및 암 세포주 MTNTM 블롯) 을 a a-[32p]-dCTP 램덤-프라이밍 표지화된(Multiprime labelling kit, Roche Diagnostics) 293 bp 특이적 PDGF-C 분획 (3'말단 코딩 부위의 92 bp 및 PDGF-C의 3' 비번역된 부위의 201 bp를 포함하는 PinAI-StuI 분획)으로 하이브리드화하였다. 블롯을 68℃에서 밤새 하이브리드화하고, 고 엄격에서 0.1 x SSC/0.1 % SDS에서 68℃에서 최종적으로 세척하였다. 막을 증감성 스크린으로 1 내지 3일동안 오토래디오그래프하였다. RT-PCR 분석을 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머 GTTTGATGAAAGATTTGGGCTTG 및 CTGGTTCAAGATATCGAATAAGGTCTTCC를 PDGF-C로부터 350 bp 분획의 특이적 PCR 증폭을 위해 사용하였다. PCR 증폭을 6개의 다른 하우스키핑 유전자의 mRNA 발현 수준으로 표준화된 인간 다중 조직 cDNA (MTCTM) 패널 (Clontech 인간 MTC 패널 I 및 II 및 인간 암 MTC 패널) 에서 수행하였다. 추가적으로, cDNA를 다른 암 세포 배양물 (Caco-2 결장직장 선암암; T-84 결장직장암; MCF-7 가슴 선암종; T-47D 가슴 관 선암종; HT1080 뼈 섬유육종; SaOS-2 골육종; SK-N-MC 신경모세포종; HepG2 간모세포종; JURKAT T-세포 백혈병 및 THP-1 골수 단구성 백혈병)로부터 제조하였다. 암 세포 cDNA를 제조하기 위해, 세포를 동질화하고, 전체 RNA를 RNeasy 미니 키트(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 제조하였다. 1 ㎍의 전체 RNA를 프라이머로서 올리고(dT)15 및 50 U의 Expand™를 사용하여 역전사하였다.
역전사효소 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). PDGF-C-특이적 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게네이즈 (G3PDH)-특이적 프라이머을 사용 한 PCR을 그후 1 ㎕의 상기 cDNA에서 수행하였다. 전체 cDNA에 대해, PDGF-C 특이적 프라이머를 사용한 PCR 반응을 전체 부피 50 ㎕에서 수행하였다. 샘플을 95℃에서 30초동안 가열하고, 사이클링을 95℃에서 30초동안 25, 30 또는 35 사이클동안수행하였다. 하우스키핑 유전자 G3PDH의 1 kb 분획을 증폭하는 특이적 프라이머를 사용한 콘트롤 반응을 또한 수행하였다.
재조합 단백질의 발현, 정제 및 검출
포유동물 세포 발현을 위해, 전체 코딩 서열을 증폭하고, 벡터 pcDNA6/V5-His (Invitrogen, Leek, Netherlands) 내로 클론하여 C-말단 His6 펩타이드 태그를 검출 및 정제을 돕기위해 첨가하였다. 이. 콜라이(E. coli ) 발현을 위해, 예측되는 성숙 단백질 (Glu23-Gly345)의 코딩 부위를 PCR 증폭하여, C-말단 His6 태그를 첨가하고, 그후 벡터 pMAL-p2 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA)로 클론화하였다. 생성된 MBP 융합 단백질을 우선 Nickel 킬레이트 수지상(Ni-NTA, Qiagen GmbH, Dusseldorf, Germany)에서 정제하고, 그후 아밀로즈 수지(New England Biolabs, Beverly, MA)에서 정제하였다. PDGF-C의 CUB 도메인 분획을 암호화하는 DNA 서열 (Glu23-Vall71)을 PCR 증폭하여 N-말단 His6 태그를 첨가하고, 이. 콜라이 선별을 위해 pET22b (Novagen, Madison, WI)내로 클론화하였다. CUB 도메인 단백질을 표준 방법(Fitz 등, 1997)에 의해 유도된 배지의 페리플라즘 또는 세포-없는 배지로부터 제조하였다. 단백질을 20% 포화 암모늄 설페이트를 사용하여 침강반응에 의해 초기적으로 정제하였다. 20 mM Tris pH 8.0에 대해 밤새 투석한 후에, 300 mM NaCl 로 암모늄 설페이트를 제거하고, 단백질을 상기한 니켈 킬레이트 수지상에서 추가적으로 정제하였다. 단백질 글리코실화의 분석은 N-글리코시데이즈 F (Roche Molecular Biochemicals, Brussels, Belgium)를 사용하여 수행하였다. 헤파린 Sepharose 컬럼(HiTrap, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 세포-기초한 어세이에 사용하기 전에, 단백질 샘플을 상업적으로 구입가능한 키트 (COATESTs Endootoxin, Chromogenix AB, Sweden)를 사용하여 엔도톡신 감염을 테스트하였다.
세포 배양
인간 배꼽 정맥 내피 세포(HWEC) (Clonetics, San Diego, CA)를 EGM-2 성장 배지 (Clonetics, San Diego, CA)에서 유지하고, 인간 골격근 세포 (SkMC) (Clonetics, San Diego, CA)를 골격근 성장 배지 (Clonetics, San Diego, CA)에서 배양하였다. HCASMs (Clonetics, San Diego, CA), 쥐 심근 H9c2 (American Type Cell Collection, Rockville, MD), 및 인간 신생아 피부 섬유모세포 (39-SK) (American Type Cell Collection, Rockville, MD)을 포함하는 세포를 10% 소태아 (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 6 mM Hepes, 50 I.U./ml의 페니실린 및 50 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco's 변형된 Eagle 배지 (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD)에서 유지하였다. 상기 세포는 통로 4-6 사이에서 사용되었다. 인간 골모세포 (MG 63) (American Type Cell Collection, Rockville, MD)를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 유지하였 다. 1차 연골세포를 상기한 문헌(Masure 등, 1998)과 같이 소 어께에서 분리하였다. 1차 소 연골세포를 10% FBS, 10 mM HEPES, 0.1 mM 비필수 아미노산, 20 ㎍/ml L-프롤린, 50 ㎍/ml 아스코르브산, 100 ㎍/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/ml 암포테리신 B (연골세포 성장 배지)이 첨가된 DMEM (고 글루코스)에서 배양하였다, 모든 세포 배양은 5% CO2 및 95% 공기의 대기에서 습윤화된 인큐베이터에서 37℃에서 수행하였다.
세포 증식 어세이
HUVEC를 0.05 % 트립신/0.53 mM EDTA (Gibco, Gaithersburg, MD)을 사용하여 트립신화하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에 세포/웰로 분배하였다. 세포 부착 및 단층 형성 후에(16 시간), 세포를 지시한 것과 같이 0.5% 내지 2% FBS를 포함하는 DMEM에서 VEGF-X의 다양한 농도로 자극하였다. 인간 표피 섬유모세포에 대해, 성장 배지를 다양한 농도의 VEGF-X가 있거나 없는 0.1% BSA를 포함하는 DMEM에 의해 치환하였다. MG63, 인간 SkMC, H9c2 또는 HCASMC에 대해, 배지를 0.5% FBS를 포함하는 DMEM를 포함하는 DMEM으로 치환하였다. 소 연골세포를 10% FBS가 첨가된 고 글루코스 DMEM 배지에서 5,000 세포/웰로 96-웰 조직 배양 플레이트에 접종하고, 72시간동안 부착하게 두었다. 배지를 처리를 하거나, 처리 없이 2일동안 2% BSA를 포함하는 DMEM로 교체하였다. 모든 세포 처리에 있어, 처리를 하고 배양 후에, 배양 배지를 5% FBS 및 3 μCi/ml의 [3H]-티미딘을 포함하는 100 ml의 DMEM로 교체하였 다. 펄스 라벨화후, 세포를 메탄올/아세트산 (3: 1, vol/vol)으로 상온에서 1시간동안 고정하였다. 세포를 250 ml/웰의 80% 메탄올로 2번 세척하였다. 세포를 30분동안 0.05% 트립신 (lOOml/웰)에서 가용화하고, 그후, 0.5% SDS (100 ml/웰)에서 추가적으로 30분간 가용화하였다. 세포 용균액 (180 ml)의 부분 표본을 2 ml 의 신틸레이션 칵테일로 합치고, 세포 용균액의 방사활성을 리퀴드 신틸레이션 계수기(Wallac 1409)로 측정하였다.
크로모좀성 국소화 및 PDGF -C 유전자의 인트론 /엑손의 구조
VEGF-X를 FISH 분석에 의해 인간 크로모좀 4, 부위 q31-q32의 긴 암에 대해 국소화하였다(도 2). 하이브리드화 효율은 상기 프로브에 대해 ∼70%였다. 데이타베이스 서치는 VEGF-X 서열 (EMBL accession numbers AC009582 및 AC015837)을 운반하는 2개의 게놈성 BAC 클론을 동정하였다. 상기 BAC 클론은 크로모좀 4에서 유래되며, FISH 데이타에서 지지된다. BAC 클론을 cDNA의 3' 부위를 포함하게 분리하였다. 상기 클론을 직접 시퀀싱하는 것에 의해, cDNA의 PDGF 도메인 부위에서 스플라이싱 현성의 위치를 추론하였다(도 1에서 nt. 위치 1179/1180). 상기 스플라이스 부위의 위치는 VEGF-A 및 VEGF-D에 관해서 보존된다 (Heng 등, 1993, Hagen 등, 1994). 도 1에 나타낸 다른 스플라이스 부위의 위치는 상기한 데이타베이스 BAC 클론 AC009582 및 AC015837의 서열에서 추론하였다.
VEGF -X 및 CUB 도메인 시험의 요약
VEGF-X 또는 CUB 도메인 어느 것도 인간 피부 섬유모세포, 인간 배꼽 내피 세포, 소 연골세포 또는 인간 골모세포 세포 (MG 63)의 증식을 증가시키지 않았다. 그러나, 전체 길이 및 CUB 도메인 작제물 양자는 용량 의존적 방법으로 인간 관상동맥 평활근 세포의 증식을 자극할 수 있다(도 3). 최적의 자극 농도는 1-10 ㎍/ml의 범위이다. 가장 높은 농도에서 시험된 전체 길이 또는 CUB 도메인 작제물 양자의 효과는 콘트롤 수준에 비해 4배였다(도 2). 인간 골격근 세포 또는 래트 심근 (데이타 미도시)와 같은 다른 근 세포 형태에서 CUB 도메인의 이러한 유사분열 촉진성 활성을 관찰하지 못했다. 세 번째 시스테인의 결실 또는 세린 잔기의 돌연변이 후에, 인간 관상동맥 평활근 세포에 대한 CUB 도메인의 유사분열 촉진성 활성이 최고 농도(10㎍/ml)에서 약 절반으로 감소된 것을 확인하였다(데이타 미도시).
표 1. PDGF-C 및 관련된 단백질에 대한 동일성 및 유사성 쌍 비교
Figure 112008061897878-PAT00001
Figure 112008061897878-PAT00002
비교는 도 2에서 나타난 단백질 부위 사이이고, Genedoc program (http ://www. cris. com/-Ketchup/genedoc. shtml)으로 계사되었다.
참고자료
Figure 112008061897878-PAT00003
Figure 112008061897878-PAT00004
Figure 112008061897878-PAT00005
Figure 112008061897878-PAT00006
도 1은 (a) PDGF-C의 cDNA 서열을 나타낸다. 예상되는 PDGF-C 번역 생산물은 밑줄친 예상되는 신호 서열을 갖는 상기 서열로 나타난다. 예상된 mRNA 스플라이싱 현상의 부위는 폐 삼각형으로 나타난다. mRNA 스플라이싱 현상의 위치는 분리된 BAC 클론상의 직접 서열화로부터 또는 EMBL 데이타베이스 내의 부분적 BAC 서열과의 비교에 의해 추론될 수 있다(nt. AC0015837로부터 1-374로부터의 부위, release date 7 April 2000; nt. AC009582로부터 375-571375-571의 부위, release date 5 April 2000). 스플라이싱 현상에 대한 정보 없음은 이탈릭체로 지적된 nt. 900-957로부터의 부위에 대해 현재 이용할 수 있다. nt. 719/720 및 988/989 (열린 삼각형)에서 잠재성 스플라이스 공여자/수용체 부위는 PCR에 의해 분리된 변이 서열로부터 추론될 수 있다. 폴리펩타이드 서열내의 잠재적 N-결합된 글리코실화 부위는 사각형화되어 있다. (b) 변이체 PDGF-C 단백질 서열-폴리펩타이드 서열은 기대되는 크기보다 더 작은 PCR 단편으로부터 예상되었다. 상기 부위를 커버하는 PCR 단편은 도 1 (a)에 나타나는 잠재성 스플라이스 공여자/수용체 부위를 밝히기 위해 클론되고 서열화되었다.
도 2는 데이타베이스 서열을 갖는 PDGF-C 도메인의 비교를 나타낸다: (A) PDGF-C의 PDGF 도메인은 다른 인간 PDGF 및 VEGF의 PDGF 도메인과 정렬되어 있다. (B) PDGF-C의 CUB 도메인은 BMP 및 뉴로필린의 CUB 도메인과 정렬되어 있다; 단백질은 지시된 것과 같이, 엑스. 라비스(X. laevis), 마우스 또는 닭으로부터 이다.
A11 도메인 서열은 PFAMA 데이타베이스로부터 얻어지고 (Rocchigiani, M. 등, (1998) Genomics 47,204-216), CLUSTALW 정렬 프로그램을 사용하여 정렬된다 (EMBL, Heidelberg, Germany). 표 1은 도 2에 나타낸 단백질 부위의 비교 결과를 요약한 것이다. 상기 비교로부터, CUB 도메인의 다른 데이타베이스 서열과 유사성의 정도가 PDGF 도메인의 유사성에 비해 높다는 것이 명백하다.
도 3은 PDGF-C의 mRNA 발현으로부터 얻어진 결과를 나타낸다:
(A) 조직 및 암 세포주에서 PDGF-C mRNA 분포의 노던 블롯 분석. β-액틴 cDNA 프로브를 사용한 콘트롤 하이브리드화는 각각의 레인에서 동량의 mRNA를 나타낸다. PDGF-C mRNA의 부위가 나타난다.
(B) 조직 및 암 세포 부에서 cDNA에 대한 PCR 분석. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드록네이즈의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 프라이머를 사용한 콘트롤은 각각의 cDNA의 등가물 함량이 증폭 반응에서 존재함을 나타낸다(미도시).
도 4는 PDGF-C(VEGF-X) 로커스의 FISH 맵핑에 의해 얻어진 결과를 나타낸다 - 예가 나타난다: 좌측 패널은 인간 크로모좀에 대한 신호를 나타낸다. 우측은 같은 인간 크로모좀 4를 동정하기 위해 4',6-디아이디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색한 같은 유사분열성 도면이다. 또한 도식적 요약이 나타난다. 각각의 점은 크로모좀 4를 검출하기 위한 이중 FISH 신호를 나타낸다.
도 5는 PDGF C 재조합 단백질의 특성을 설명한다:
(A) 글리코실화 & 내부체인 디설파이드 형성. T. ni Hi5 세포를 전체길이 PDGF-C를 발현하는 바쿨로(baculo)바이러스로 감염하였다. 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포 배지의 샘플을 하기와 같이 처리하였다: 레인 1 - 효소 버퍼 + N-글리코 시데이즈 F; 레인 2 - 효소 버퍼, N-글리코시데이즈 F 첨가 안함; 레인 3 - 감소된; 레인 4 - 감소없음. 웨스턴 블롯팅 후에 검출은 항 C-말단 에피토프 태그의 삽입을 관찰하기 위해 His6 항체를 사용하였다.
(B) 헤파린 결합. 정제된 이. 콜라이(E. coli)-유도된 전체 길이 MBP 융합 단백질을 SDS-PAGE로 걸고, 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 레인 1 - 헤파린 컬럼에 대한 로드 분획, 레인 2 컬럼 세척, 레인 3 - 고 염 용출.
(C) 전체 길이 및 CUB 도메인
-쿠마시 염색된 SDS PDGF-C 전체 길이 융합 단백질 (레인 1) 및 CUB 도메인 (레인 2)의 샘플의 PAGE을 이. 콜라이에서 얻었다. CUB 도메인을 불용성 물질을 재로딩하여 얻었다: 20 및 25 kDa에서의 주된 밴드 항-His6 항체를 사용한 웨스턴 블롯 실험에서 관측하여, 25kDa 종은 비절단된 신호 펩타이드를 함유하는 것이 추정된다. 분자량 표준은 죄측에 kDa으로 나타난다.
도 6은 인간 관상동맥 평활근 증식의 PDGF-C (VEGF-X) 또는 PDGF-C CUB 도메인의 효과를 나타낸 그래프이다. 세포는 이. 콜라이-유도된 CUB 또는 전체 길이 PDGF-C 단백질로 지정된 농도에서 처리된다.
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Claims (2)

  1. 도 1(a)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VEGF-X 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;
    상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 또는
    도 1(a)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VEGF-X 폴리펩타이드를 포함하는,
    요도 부전, 방광 부전, 괄약근 부전의 치료 또는 예방용, 또는 골반기저 재건용 약제학적 조성물.
  2. 도 1(a)의 아미노산 위치 40 내지 150과 적어도 95% 아미노산 상동성을 가지는 CUB 도메인 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 핵산 분자;
    상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 또는
    도 1(a)의 아미노산 위치 40 내지 150과 적어도 95% 아미노산 상동성을 가지는 CUB 도메인 폴리펩타이드 변이체를 포함하는,
    요도 부전, 방광 부전, 괄약근 부전의 치료 또는 예방용, 또는 골반기저 재건용 약제학적 조성물.
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