KR20080082994A

KR20080082994A - 알파 질소 기를 갖는 활성 폴리머의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080082994A
Application number: KR1020087017359A
Authority: KR
Inventors: 홍 자오; 드춘 우
Original assignee: 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-08
Publication date: 2008-09-12
Also published as: TW200745340A; IL192607A0; WO2007084808A3; JP2009523898A; CA2636284A1; CN101405018A; EP1988912A2; AU2007206070A1; EP1988912A4; WO2007084808A2; JP5324226B2; EP1988912B1; US8133707B2; US20070166808A1

Abstract

본 발명은 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 실질적 비항원성 폴리머를 고순도로 제조하는 방법을 제공한다. 상기 폴리머는 아민계 폴리머의 합성용 중간체로서 그리고 친핵체와의 콘쥬게이션을 위한 활성 폴리머의 형성에 유용하다. 콘쥬게이트 및 이의 제조 방법 및 콘쥬게이트에 의한 처리도 개시되어 있다. 수득한 폴리머-아민은 충분한 순도가 가능하기 때문에, 약학 등급의 폴리머에 요구되는 비용이 들고 시간이 필요한 정제 단계를 피할 수 있다.

폴리알킬렌 옥사이드의 제조

Description

알파 질소 기를 갖는 활성 폴리머의 제조 방법 {METHODS OF PREPARING ACTIVATED POLYMERS HAVING ALPHA NITROGEN GROUPS}

본 발명은 활성 폴리머, 예컨대 폴리알킬렌 옥사이드의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 고순도로 알파 질소 기 함유 선형 폴리머를 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

수용성 폴리알킬렌 옥사이드과 치료 성분, 예컨대 단백질 및 폴리펩티드의 콘쥬게이션은 공지되어 있다. 참조, 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,179,337, 이는 참고로 본 명세서에 포함되어 있다. 상기 특허에는, PEG 로 변성된 생리학적 활성 폴리펩티드가 생체 내에서 장기간 순환하고 저하된 면역원성 및 항원성을 갖는다는 것을 개시하고 있다.

폴리알킬렌 옥사이드를 콘쥬게이션하기 위해, 폴리머의 히드록실 말단 기는 반응성 작용기로 먼저 전환되어야 한다. 이 과정은 자주 "활성화"로 불리며, 생성물은 "활성 폴리알킬렌 옥사이드"라 한다. 마찬가지로, 다른 폴리머도 활성화된다.

U.S. 특허 No. 5,730,990 는 일부 폴리머 콘쥬게이션 반응과 관련된 문제 중의 일부에 과한 하나의 해결책을 개시하고 있다. 특히, 폴리머 콘쥬게이트는 비변성 단백질, 효소 등과는 달리 상이한 pI 를 갖는다는 것이 확정되었다. 예를 들어, 페그화(PEGylation), 즉 폴리머의 리신(lysine) 엡실론 아미노기에의 부착의 결과, 등전점이 낮게 되고, pH 최적, 즉 최대 생체 활성이 관찰되는 pH 을 변화시킨다. 상기 특허에 기재된 바와 같이, 생리 pH 에서 생물활성을 최적화하기 위해 최초 pI 를 회복시키거나 심지어 폴리머 콘쥬게이트의 pI 값을 변경하는 것이 유익하다.

수년 동안에, U.S. 고순도가 요구될 때, 특허 No. 5,730,990 에 기재된 활성 폴리머를 제조하기 위한 합성 절차의 개선은 바람직하다는 것이 결정되었다. 상기 특허의 실시예 10 에는, PEG-Cl 및 사크코신을 75 ℃ 에서 4일 동안 반응시킨 결과, 단지 순도 80 % 의 N-메틸 글리신 PEG 중간체가 생성되었다는 것을 기재하고 있다. 일부의 PEG-Cl 를 PEG-OH 로 되돌림으로써, 고순도의 활성 링커(링커), 또는 이로부터 얻은 PEG 콘쥬게이트를 얻기 어렵게 된다는 것을 발견했다.

상기 견해에서, 알파 질소 기를 갖는 활성 폴리머를 제조하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명은 이러한 필요에 초점을 맞춘 것이다.

발명의 요약

본 발명의 바람직한 태양에서, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머를 제조하는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 알파 질소 기를 갖는 활성 폴리머 및 폴리머 콘쥬게이트를 제공한다. 상기 방법은 온도 약 10 - 약 80 ℃ 및 반응 시간 약 24시간 미만에서 하기 식 (I) 의 실질적 비항원성 폴리머를, 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 화합물과 수성 염기에서 반응시키는 것을 포함한다.

(식 중,

R₁ 는 실질적 비항원성 폴리머이고;

R₂ 는 캡핑 기(capping group), LG 또는 LG-(L₁)_n- 이고;

L₁ 는 이중작용 링커이고;

LG 는 토실레이트 기 또는 하기의 다른 기와 같은 이탈 기이고,

n = 0 또는 양의 정수임).

본 발명의 더욱 바람직한 태양에서, R₁ 는 분자량 약 2,000 - 약 100,000 을 갖는 PEG 이다.

본 발명의 일부 바람직한 태양에서, 식 (I) 의 폴리머는 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 식 (Ⅲ) 의 화합물과 반응한다:

[화학식 Ⅲ]

(식 중,

Z 는 O, S, 또는 NR₇;

X 는 O, S 또는 NR₈;

m 은 양의 정수, 바람직하게는 1;

R₄, R₅ _,R₆, R₇ 및 R₈ 는 H, C₁ _-6 알킬, C₃ _-12 분지 알킬, C₃ _-8 시클로알킬, C₁ _-6 치환 알킬, C₃ _-8 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 아르알킬, C₁ _-6헤테로알킬, 치환 C_1-6헤테로알킬, C₁ _-6알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 단, Z 가 NR₇ 일 때, R₄ 및 R₇ 는 모두 H 가 아님).

식 (Ⅲ) 에서, Z 는 바람직하게는 NR₇ 이고, X 는 바람직하게는 O 이다. 식 (Ⅲ) 의 하나의 특히 바람직한 화합물은 N-메틸-글리신 또는 사르코신이다. 반응의 결과, 식 IV(a) 및 IV(b)의 화합물이 형성된다:

(IVa)

(IVb)

일단 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머가 고순도로 형성되었다면, 알파 질소 또는 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 활성 폴리머를 형성하기 위해 활성 기를 갖는 임의의 화합물과 반응될 수 있다. 활성 기를 갖는 하나의 특히 바람직한 화합물은 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 이고, 수득한 활성 폴리머는 하기이다:

종래의 활성 기 중의 하나는 고순도의 중간체에 부착될 수 있고, 이에 따라 활성 폴리머는 다양한 생물학적 활성 친핵체에 부착하고 PEG 콘쥬게이트를 형성하기 위해 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 특히 바람직한 생물학적 활 성 친핵체는 아스파라기나제(asparaginase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase) 및 아르기닌 데이미나제(arginine deiminase)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 태양과 관련된 주된 이점 중의 하나는, 수득한 알파 질소 함유 폴리머, 예컨대 그의 폴리알킬렌 옥사이드 유도체는 고순도로 제조된다. 따라서, 생성물 오염물, 즉, 개시 물질 및 mPEG-OH 는 상당한 양으로 발견되지 않는다. 사실상, 본 발명의 태양에서, 약 5% 미만, 바람직하게는 약 2 % 미만의 양으로 존재한다. 바람직한 알파 질소 함유 PEG 유도체가 더욱 경제적으로 고순도로 형성될 때, 당업자는 더욱 효율적으로 그리고 저비용으로 PEG 유도체를 포함하는 최종 생성물을 만들 수 있다. 효율의 결과, 부분적으로는 원하는 알파 질소 함유 중간체 (예를 들어, 사르코신)의 분리가 필요하지 않고 PEG-OT 의 PEG-OH 의 전화이 실질적으로 제거되기 때문이다. 또, 지루한 이온 교환 또는 RP HPLC 기술은 원하는 폴리머를 제공하는 것을 필요하지 않는다. 따라서, 본 발명은 칼럼 정제 비용없이 고순도의 알파 질소 함유 PEG-아민을 제공한다.

다른 이점은, 상기의 공정으로부터 만들어진 알파 질소 함유 폴리머는 전혀 PEG 의 골격을 변화시키지 않을 것이라는 사실에 있다. 따라서 모든 현재 및 미래의 활성 PEG 와 양립할 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 방법은 통상 하나 이상의 알파 질소 기를 함유하는 폴리머의 형성에 관한 것이다. 본 발명의 최고 태양에서, 본 명세서에 기재된 공정을 사용하여 변성될 수 있는 폴리머는 실질적 비항원성 폴리머이다. 이러한 종류의 폴리머 내에, 폴리알킬렌 옥사이드가 바람직하고, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 더욱 바람직하다. 제한보다는 설명을 목적으로, 원형 폴리머로서 PEG 를 사용하는 공정이 때대로 기재되어 있다. 그러나, 상기 공정은 선형, 실질적 선형, 분지형 등일 수 있는 다양한 폴리머에 적용될 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 필요조건 중의 하나는, 폴리머가 본 명세서의 조건 하에서 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 부분을 공유 부착하기 위한 수단을 함유한다는 것이다.

상기에 따라, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머를 제조하기 위한 본 발명의 바람직한 태양은

온도 약 10 - 약 80 ℃ 및 반응 시간 약 24시간 미만에서 하기 식 (I) 의 폴리머를, 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 화합물과 수성 염기에서 반응시키는 것을 포함한다:

[화학식 I]

(식 중,

R₁ 는 실질적 비항원성 폴리머이고;

R₂ 는 캡핑 기(capping group), LG 또는 LG-(L₁)_n- 이고;

L₁ 는 이중작용 링커이고;

n = 0 또는 양의 정수임).

어떤 바람직한 태양에서, 상기 온도는 약 30 - 약 60℃ 의 범위이고, 다른 태양에서, 온도는 약 45 - 약 50℃ 의 범위이다. 바람직한 반응 시간은 약 18시간 미만, 더욱 바람직하게는 12시간 이하이다. 필요한 최소 시간은 반응의 실질적 완결에 충분한 시간이다. 최고 태양에서, 반응이 약 4시간 이상 동안 진행하는 것이 바람직하다.

식 (I) 의 어떤 바람직한 폴리머는 하기를 포함한다:

(IIa)

, 및

(IIb)

(식 중, R₂ 는 메톡시이고, R₁ 는 폴리알킬렌 옥사이드임).

놀랍게도, 이탈기가 본 명세서의 특정 기로 한정되고 반응 온도 및 반응 시간 조건이 조절될 때, 고순도의 알파 질소 함유 폴리머가 형성될 수 있다는 것을 발견했다. 이들 생성물은 종래 방법으로 만든 것과 관련된 단점이 실질적으로 없다.

캡핑 기( Capping Groups )

상기에서 언급한 바와 같이, R₂ 는 캡핑 기, 다른 이탈기 (LG) 또는 다른 이탈기 및 이중작용 링커일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 캡핑 기는 폴리머의 말단에 발견되는 기를 의미하는 것을 이해된다. 최고 태양에서, 바람직하게는 메톡시이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 다른 말단 기는 대체물로서 사용될 수 있다.

이탈기

본 발명의 어떤 바람직한 태양에서, 이탈기 (이하, LG) 하기이다:

(식 중, R₃ 는 바람직하게는 메틸이고 LG 는 토실레이트임). 대신에, R₃ 는 할로겐, 니트로, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 치환 카르복실, 또는 멀티 할로겐 치환 벤젠설포닐이다. 적당한 대안적인 이탈기의 비제한적인 목록은 메실레이트, 브로실레이트, 트레실레이트 및 노실레이트를 포함한다. PEG-토실레이트, 및 식 (IIa) 및 (IIb) 에 해당하는 다른 화합물은 본질적으로 순수한 개시 물질로서 시중에서 얻을 수 있거나, 부적당한 실험없이 표준 기술을 사용하여 만들 수 있다.

이중작용 링커

본 발명의 폴리머는, 또한 스페이서 또는 다른 임의의 기가 PEG 부분과 LG 사이에 삽입되도록 하는 것을 포함하는 종래 목적에 사용되는 이중작용 연결 기 (L₁) 를 포함할 수 있다. 따라서, L₁ 부분은 하기 비제한적인 화합물 중의 하나와 같은 이중작용 연결기 중에서 선택될 수 있다:

(식 중,

R₉ _-13 는 C₁ _-6 알킬과 동일한 기 등으로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게 는 각각 H 또는 CH₃ 이고;

R₁₄ 는 NO₂, C₁ _-6 할로-알킬 및 할로겐뿐만 아니라 R₉ _-13 을 한정하는 것과 동일한 기로부터 선택되고;

q, t 및 y 는 1 - 12 의 양의 정수로부터 독립적으로 선택됨).

L₁ 부분은 식 (I) 으로 나타낸다:

[화학식 I]

비스(bis) 활성 폴리머를 원할 때, L₁ 기는 R₁ 과 LG 사이의 적당한 배향을 유지하기 위해 회전되는 것을 이해할 것이다.

R ₁ 및 실질적 비항원성 폴리머

R₁ 는 실온에서 수용성인 폴리머, 예컨대 폴리알킬렌 옥사이드 (PAO) 가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 mPEG 또는 비스(bis) 활성 PEG 이다. 따라서, 그와 같은 폴리머의 비제한적인 목적은 폴리알킬렌 옥사이드 호모폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 그의 코폴리머 및 그의 블록 코폴리머를 포함하고, 단, 블록 코폴리머의 수용성은 유지된다.

설명 및 비제한적 목적을 위해, R₁ 의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 잔부는 -CH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂CH₂- (여기서,×는 중합도, 즉 약 10 - 약 2,300 임) 일 수 있다.

폴리머의 중합도는 폴리머 사슬에서의 반복 단위의 수를 의미하고, 폴리머의 분자량에 좌우된다. 실질적 비항원성 폴리머, PAO 및 PEG 가 중량평균분자량에서 실질적으로 변할지라도, 바람직하게는, R₁ 는 본 발명의 최고 태양에서 약 200 - 약 100,000 달톤의 중량평균분자량을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 실질적 비항원성 폴리머는 약 2,000 - 약 48,000 달톤의 중량평균분자량을 갖는다.

R₁ 는 또한 "스타(star) PEG" 또는 멀티암(multi-armed) PEG", 예컨대 NOF Corp. Drug Delivery System catalog, 2005 에 기재된 것일 수 있고, 이는 본 명세서에 참고로 포함되어 있다. 구체적으로, R₁ 는 하기의 식일 수 있다:

(식 중,

j 는 약 12,000 - 약 40,000 의 총분자량을 갖는 폴리머를 제공하기 위해 약 10 - 약 340 의 정수이고; 잔부의 3개 이상의 말단부는 메틸 또는 다른 저급 알킬로 캐핑됨). 참조, Nektar Catalog 2005-2006, page 26 "4-arm PEG", 이의 내용은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다. 식 (Ⅲ) 의 화합물 또는 사르코신(sacosine)과의 반응 전의 상기 화합물은 바람직하게는 하기를 포함한다:

및

(식 중, LG 는 바람직하게는

또는 본 명세서의 다른 기임).

또한 본 발명의 범위 내를 고려하면, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 다른 PEG 계 화합물이 형성되고, 상기 화합물은 U.S. Patent Nos. 5,605,976, 5,643,575, 5,919,455 및 6,113,906 에 기재된 분지 폴리머 잔부를 포함하는데, 각각은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다. 식 (I) 에 해당하는 어떤 특정 폴리머의 대표적인 목록은 하기를 포함한다:

(2a)

(2b)

및

(2c)

(식 중,

LG,×및 L₁ 는 상기에서 언급한 것과 동일하고,

L₂ 및 L₃ 는 대안적으로 디아미노 알킬 또는 리신과 같은 분지 연결일 수 있고 (참조, 상기 U.S. Patent No. 6,113,906);

z 는 1 - 120 의 정수임).

추가 실시형태에서, 및 PAO 계 폴리머의 대체물로서, R₁ 는 1종 이상의 효율적인 비항원성 물질, 예컨대 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 카르보히드레이트계 폴리머, 히드록시프로필메타크릴아미드 (HPMA), 폴리알킬렌 옥사이드, 및/또는 그의 코폴리머로부터 임의로 선택된다. 참조, U.S. 특허 No, 6,153,655, 이의 내용은 참고로 본 명세서에 포함되어 있다. 동일한 형태의 활성화는 PEG 와 같은 PAO 에 대해 기재된 바와 같이 사용된다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 당업자는, 상기 목록은 단지 설명하기 위한 것이고 본 명세서에 기재된 질(質)을 갖는 모든 중합성 물질이 고려된다는 것을 추가로 이해할 것이다.

본 발명의 하나의 다른 태양에서, 비스(bis) 활성 폴리머를 원할 때, R₂ 는

일 수 있고, 수득한 반응물은 비스 알파 함유 폴리머 화합물을 만들 때 사용된다. 그와 같은 비스(bis) 활성 폴리머는 하기의 식 (Ia) 일 수 있다:

(Ia)

(식 중,×는 상기에서 정의한 바와 같음).

비공유 전자쌍 또는 알파 질소 함유 폴리머의 형성

본 발명의 어떤 태양에서, 식 (I) 의 폴리머는 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 화합물과 수성 염기에서 반응한다. 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 어떤 바람직한 화합물은 하기 식에 대응한다:

[화학식 Ⅲ]

(식 중,

Z 는 O, S, 또는 NR₇;

X 는 O, S 또는 NR₈;

m 은 양의 정수, 바람직하게는 1;

R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈ 는 H, C₁ _-6 알킬_, C₃ _-12 분지 알킬, C₃ _-8 시클로알킬, C₁ _-6 치환 알킬, C₃ _-8 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 아르알킬, C₁ _-6 헤테로알킬, 치환 C_1-6 헤테로알킬, C₁ _-6 알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6헤테로알콕시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고;

단, Z 가 NR₇ 일 때, R₄ 및 R₇ 는 모두 H 가 아님).

본 발명의 이러한 태양에서 더욱 바람직한 것은 식 (Ⅲ) (여기서, X 는 O, m 은 1, R₄ 는 메틸이고, R₅ 및 R₆ 는 각각 H 임) 의 화합물이다. 식 (Ⅲ) 의 더욱 바람직한 화합물은 N-메틸-글리신 (사르코신) 이다.

반응의 결과, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머, 예컨대 식 (IVa) 또는 (IVb) 의 화합물이 형성된다.:

(IVa)

, 또는 바람직하게는

(IVb)

.

다른 것은 하기를 포함한다:

(3a)

(3b)

및

(3c)

실시예에서의 화합물 3 은 식 (IV) 에 대응하는 바람직한 mPEG-사르코신 화합물의 예이다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 수성 염기, 예컨대 NaOH (바람직함), KOH, LiOH, Mg(OH)₂, Ca(OH)₂ 등 또는 그의 혼합물을 함유하는 것에서 수행된다. H₂O 및 테트라히드로푸란 (THF) 의 혼합 용매, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 디옥산은 필 요에 따라 보조 용매와 함께 사용될 수 있다.

그 다음, 고순도의 알파-질소 함유 PEG 유도체는 종래의 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한없이, 종래의 방법으로 활성화되고 그 다음, 효소, 단백질, 펩티드와의 직접 콘쥬게이션을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, CO₂H 유도체는 팩리택셀, 캄프토테신 등과 같은 생물학적 활성 화합물 상의 OH 잔기에의 방출성 연결을 위해 사용될 수 있다.

알파 질소 함유 폴리머의 활성

예는 본 발명의 바람직한 태양으로서 NHS (N-히드록시숙신이미드) 및 DIPC (디이소프로필카르보디이미드)에 의한 mPEG-사르코신의 활성을 보여준다. 또, 말단 CO₂H 의 종래 전환은 특정 친핵체와 반응할 수 있는 목적 작용기를 가짐으로써 선택된 화합물을 사용하여 가능하다는 것을 인식할 것이다. 대부분의 경우에, 폴리머 콘쥬게이션의 표적 상에 발견된 친핵체는 아민, 카르복실산 기, 반응성 카르보닐 기, 히드록실 기, 머캅토 기 등을 가질 것이다. 제한없이, 아민과 반응할 수 있는 적당한 작용기는 하기로부터 선택된다:

a) p-니트로페닐, 또는 숙신이미딜를 포함하는 카보네이트;

b) 카르보닐 이미다졸;

c) 아즐락톤;

d) 고리형 이미드 티온;

e) 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트; 및

f) N-히드록시숙신이미딜을 포함하는 다른 활성 에스테르.

본 발명의 태양에 따른 어떤 활성 폴리머는 하기를 포함한다:

및

마찬가지로, 카르복실산 기 및 반응성 카르보닐 기와 반응할 수 있는 적당한 작용기는 아실 히드라지드, 카르바제이트, 세미카르바제이트 및 티오카르바제이트, 예컨대

(mPEG-사르코신과 히드라진을 반응시켜 만들 수 있음) 를 포함하는 히드라진 및 히드라지드 작용기 중에서 선택될 수 있다.

콘쥬게이션용 생물학적 활성 부분

일단 활성화되면, 고순도의 알파 질소 함유 폴리머는 어떤 또는 다양한 생물학적 활성 친핵체와 반응될 수 있다. 본 발명의 생물학적 활성 친핵체는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소, 천연 및 합성 유기 분자, 예컨대 의약성 화학물질을 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

상기 효소의 예는 카르보히드레이트 특이적 효소, 단백질 가수분해 효소, 산화환원 효소, 전이효소, 가수분해효소, 리아제(lyase), 이성질화효소 및 리가제(ligase)를 포함한다. 특정 효소에 제한되지 않고, 효소의 예는 아스파라기나제(asparaginase), 아르기나제(arginase), 아르기닌데이미나제(arginine deiminase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase), 엔도톡시나제(endotoxinase), 카탈라제(catalase), 키모트립신(chymotrypsin), 리파제(lipase), 우리카제(uricase), 아데노신 디포스파타제(adenosine diphosphatase), 티로시나제(tyrosinase) 및 빌리루빈 옥시다제(bilirubin oxidase)를 포함한다. 카르보히드레이트 특이적 효소는 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제 등을 포함한다.

단백질, 폴리펩티드 및 펩티드의 예는 하기를 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다: 헤모글로빈, 혈청 단백질, 예컨대 인자 VII, VⅢ, 및 IX 를 포함하는 혈액 인자; 면역글루불린, 사이토킨, 예컨대 인터루킨, α-, β- 및 γ-인터페론, 과립구 자극 인자를 포함하는 콜로니 자극 인자, 혈소판 유도성 성장 인자 및 포스포리파제(phospholipase) 활성 단백질(PLAP). 일반적인 생물학적 또는 치료용 다른 단백질은 인슐린, 식물 단백질, 예컨대 렉틴(lectin) 및 리신(ricin), 종양 괴사 인자, 성장 인자, 조직 성장 인자, TGFα 또는 TGFβ 및 표피 성장 인자, 호르몬, 소마토메딘(somatomedin), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 색소성 호르몬, 시상하부 유리 인자, 항이뇨 호르몬, 프로락틴(prolactin), 섬모막성 생식호르몬, 난 포 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 조직 플라스미노겐(plasminogen) 활성제 등. 면역글로불린의 예는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 그의 단편을 포함한다.

어떤 단백질, 예컨대 인터루킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자는 또한 재조합 기술의 사용 결과로서 비(非)글리코실화 형태로 존재한다. 상기 비글리코실화 변형은 또한 본 발명의 생물학적 활성 친핵체 중에 있다.

본 발명의 생물학적 활성 친핵체는 폴리펩티드 증명 생체내 생물활성을 포함한다. 이는 아미노산 서열, 안티센스(antisense) 부분 등, 항체 단편, 단쇄 항원 결합 단백질(참조, U.S. 특허 No. 4,946,778 의 내용은 참조로 본 명세서에 포함되어 있음), 항체 또는 단편의 융합을 포함하는 결합 분자, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 모노클로날(monoclonal) 항체, 촉매 항체, 친핵체 및 올리고친핵체를 포함한다.

단백질 또는 그의 일부는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 조직 배양, 동물 공급원으로부터의 추출, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조 또는 분리될 수 있다. 단백질, 폴리펩티드, 아미노산 서열 등의 형질전환 공급원이 또한 고려된다. 그와 같은 물질은 형질전환 동물, 즉 마우스, 돼지, 소(cow) 등으로부터 얻고, 여기서 단백질은 밀크, 혈액 또는 조직에서 발현된다. 형질전환 곤충 및 바큘로바이러스 발현 시스템은 또한 공급원으로서 고려된다. 더욱이, 단백질의 변종 버젼, 예컨대 변종 TNF 및 변종 인터페론은 또한 본 발명의 범위 내이다.

다른 단백질은 알레르기항원 단백질, 예컨대 돼지풀, 안티전(Antigen) E, 꿀벌독, 진드기 알레르기항원 등이다.

유용한 생물학적 활성 친핵체는 단백질 및 펩티드로 제한되지 않는다. 본질적으로 어떤 생물학적 활성 화합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 화학치료 분자, 예컨대 약학적 화학물질, 즉 항종양제(anti-tumor agent), 심혈관 제제, 항종양제(anti-neoplastic), 항감염제, 항불안제, 위장약, 중추신경계 활성제, 진통제, 출산제 또는 피임제, 항염증제, 스테로이드제제, 안티 우레세믹(anti-urecemic agent), 혈관이완제, 혈관수축제 등을 포함한다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 카르복실산 유도체는 폴리머와 화학치료 부분 사이의 에스테르 결합을 제공하는 조건 하에서 반응된다. 하나의 특히 바람직한 생물학적 활성 친핵체는 대장균 발효, 즉 엘스파(Elspar), 또는 다른 박테리아, 균류, 효모 등, 또는 재조합 발현 공급원, 예컨대 무름병으로부터의 ECAR-LANS 재조합 L-아스파라기나제 또는 다른 인체 적응 재조합 L-아스파라기나제이든지 아스파라기나제(asparaginase) 이다.

상기는 본 발명의 폴리머와의 콘쥬게이션에 적합한 생물학적 활성 친핵체를 설명하는 것이다. 특별히 언급되지는 않지만 적당한 친핵성 기를 갖는 이들 생물학적 활성 물질이 의도되고 본 발명의 범위 내이라는 것이 이해될 것이다.

페그화(PEGylation) 반응이라고 종종 불리는 콘쥬게이션 반응은 콘쥬게이트될 단백질에 대해 약 등몰 - 약 몇 배 과량 몰의 활성 폴리머로 용액에서 일반적으로 수행된다. 바람직하게는, 단백질에 대한 활성화 폴리머의 몰 과량은 약 10배 이상이다. 단백질 생물활성을 유지하는 하나의 방법은 단백질의 활성 분위와 관련된 아미노산 잔기에의 결합을 실질적으로 피하는 것이다. 예를 들어, 단백질 아르기닌 데이미나제(deiminase)에 대해, 폴리머 커플링 공정에서 활성 부위와 관 련된 아르기닌 데이미나제 리신 엡실론 아미노기에의 결합을 피하는 것이 바람직하다.

커플링 반응의 통상적인 비특이적 본성이라면, 이러한 이론적 단계는 종종 실제로 달성하기 어렵다. 어떤 임의의 실시형태에서, 콘쥬게이션화될 단백질은 단백질 구조 상의 특정 부위에서 조작된 시스테인 또는 올리고리신 잔기를 삽입한 다음, 조작된 잔기에서 콘쥬게이트하는 것이 바람직한 알파 질소 함유 본 발명의 활성 폴리머를 사용하여 어떤 활성 부위에 대해 말단인 위치에서 특정 잔기를 포함하기 위해서 조작된다.

콘쥬게이션 반응은 단백질의 비활성화를 피하기 위해 비교적 온화한 조건 하에서 수행된다. 온화한 조건은 반응 용액의 pH 를 6 - 8 의 범위로 그리고 반응 온도를 약 10 - 20 ℃ 내로 유지하는 것을 포함한다. 적당한 버퍼는 콘쥬게이션 반응의 간섭없이 바람직한 pH 범위 6 - 8 을 유지할 수 있는 버퍼 용액을 포함한다. 적당한 버퍼의 비제한적인 목록은 예를 들어 인산염 버퍼, 질산염 버퍼, 아세테이트 버퍼를 포함한다.

상기의 반응 조건으로 어떤 비변성 단백질이 생길지라도, 비변성 단백질은 쉽게 회수되고 추가 콘쥬게이션 반응용 배치로 재순환될 수 있다.

콘쥬게이션을 달성하기 위한 반응 조건은 단백질 또는 다른 표적에 대해서 약 등몰로부터 과량 몰까지의 활성 폴리머로 부착 반응을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 공정은 약 1-600배 과량 몰의 폴리머; 바람직하게는 약 1-100배 과량 몰의 폴리머, 가장 바람직하게는 약 1.75-5배 과량 몰의 폴리머로 수행될 수 있다. 당업자의 선호도에 따라, 활성 폴리머는 고형물로서 또는 용액에 표적 단백질에 포함될 수 있다. 콘쥬게이션 반응은 약 10 - 약 20℃ 의 범위에서 수행된다. 반응 시간은 또한 당업자의 선호도에 따라 변할 것이고 1시간 미만으로부터 24시간 또는 심지어 그 이상까지의 범위일 수 있고, 이는 선택된 활성 폴리머에 좌우된다. 반응의 급랭은 임의적이다.

하기 실시예는 본 발명의 추가적인 이해를 위한 것이지, 본 발명의 효과적인 범위를 임의로 제한하는 것을 의미하는 것은 아니다.

실시예 1

5k mPEG-Ts 의 제조:

5k mPEG-OH (화합물 1, 50 g, 10 μmol) 및 DMAP (5.89 g, 48 μmol) 를 300 ml 의 CH₂Cl₂ 에 용해시켰다. 별개로 p-톨루엔설포닐 클로라이드 (9.35 g, 50 μmol) 를 200 ml 의 CH₂Cl₂ 에 용해시켰다. 그 다음, 제조된 p-톨루엔설포닐 클로라이드 용액을, 추가 깔때기로 2 - 3 시간에 걸쳐 5k mPEG-OH 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 250 ml 의 CH₂Cl₂ 를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 반응 혼합물로 0.1 N HCl 로 2회 세정했다. CH₂Cl₂ 층을 분리하고, MgSO₄ 로 건조했다. 용매를 가능한 한 많이 제거했다. 잔류물을 75 ml 의 CNCH₃ 에 용해시키고, 생성물을 1500 ml 의 IPA 의 추가로 침전시켰다. 고형물을 여과하고, IPA 로 2회 그리고 에테르로 2회 세정했다. 최종 생성물 (화합물 2) 을 진공 하에서 40 ℃ 에서 건조했다 (48.4g, 96.8% 수율). 순도 > 99% (NMR 로 확인).

¹³C NMR (CDCl₃) δ 21.3 (-CH₃), 58.6 (-OCH₃), 68.2-71.4 (PEG 중 OCH₂CH₂O), 127.4, 129.3, 132.5, 144.1 (방향족 C).

실시예 2

5k mPEG-사르코신 (3) 의 제조:

NaOH (3.49 g, 87.31 μmol) 및 사르코신 (7.77 g, 87.31 μmol) 을 180 ml 의 H₂O 에 용해시켰다. 5k mPEG-Ts (화합물 2, 45 g, 8.73 μmol) 을 첨가했다. 반응 혼합물을 45 - 50 ℃ 로 가열하고, 이 온도를 12시간 동안 유지한 다음, 실온 으로 냉각했다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂ 로 2회 추출했다. 결합된 CH₂Cl₂ 층을 H₂O 로 역류 세정했다. 유기 층을 MgSO₄ 로 건조했다. 용매를 제거하고, 잔류물을 110 ml 의 0.25 N 의 HCl 에서 용해시켰다. 생성물을 CH₂Cl₂ 로 2회 추출했다. 결합된 CH₂Cl₂ 층을 MgSO₄ 로 건조했다. 용매를 제거하고, 잔류물을 130 ml 의 CH₂Cl₂ 에 용해시키고, 생성물을 900 ml 의 에틸 에테르로 침전했다. 최종 생성물 (화합물 3) 을 여과하고, 에테르로 세정하고, 진공 하에서 40 ℃ 에서 건조했다 (38.8 g, 86.2% 수율). 순도 > 95% (NMR 로 확인).

¹³C NMR (CDCl₃) δ 42.0 (-NCH₃), 54.2 (-CH₂NCH₂-), 58.6 (-OCH₃), 65.5-71.4 (PEG 중 OCH₂CH₂O), 166.0 (-C=O).

실시예 3

5k mPEG-사르코신 NHS 의 제조:

5k mPEG-사르코신 (화합물 3, 15 g, 2.958 μmol) 을 dissolved in 100 ml 의 CH₂Cl₂. N-히드록시숙신이미드 (510 mg, 4.437 μmol). 디이소프로필카르보디이미드 (559 mg, 4.437 μmol) 및 4-디메틸아미노-피리딘 (361 mg, 2.958 μmol) 을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 반응 혼합물을 여과했다. 용매를 가능한 한 많이 제거했다. 잔류 고형물을 30 ml 의 CH₂Cl₂ 에 용해시키고 350 ml 의 에틸 에테르로 침전시켰다. 고형물을 여과하고, 에테르로 세정했다. 습성 고형물을 750 ml 의 IPA 로부터 재결정화했다. 고형물을 여과하고, IPA 로 2회 그리고 에테르로 2회 세정했다. 생생물 (화합물 4) 을 진공 하에서 40 ℃ 에서 건조했다(수율 = 13.5 g). 90% 수율. 순도 > 95%.

¹³C NMR (CDCl₃) δ 25.1 (-CH₂CH₂-), 42.0 (-NCH₃), 54.8-54.9 (-CH₂NCH₂-), 58.5 (-OCH₃), 68.8-71.4 (PEG 중 OCH₂CH₂O), 165.3 (-C=O), 168.5 (-O=CNC=O-).

실시예 4

PEG-사르코신-ASN-아제:

빠른 교반과 함께, PEG : 단백질의 100:1 반응 몰비에서의 PEG 분말을, 0.1 M 인산나트륨(pH 7.6) 중 5 ml 의 5 mg/ml 아스파라기나제 (Elspar-Merck) 에 첨가했다. 반응을 30 ℃ 에서 N₂ 하에서 60분 동안 수행하고, pH 를 6.0 으로 낮게 하여 멈추거나, 크기 배제 칼럼 상에서 즉시 정제했다.

반응 혼합물을 20 mM 인산나트륨(pH 6.0 - 50 ml)로 희석하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, HiLoad Superdex 200 칼럼(Amersham, NJ) 상에서 분리했다. 칼럼을 140 mM NaCl, 20 mM NaP, pH 6.0 에서 평형을 유지하고, 콘쥬게이트를 10 ml/분획/min 에서 용리했다. SDS-PAGE 상에서 확인된 피크의 분획을 풀(pool)하고, Ultrafree 30K (Millipore Corp., Bedford, MA) 으로 농축하여 PEG-사르코신-ASNase 를 얻었다.

실시예 5

PEG-사르코신-올리고뉴클레오티드 (제나센스, Genasense)

PBS 버퍼 (5 mL, pH 7.8) 중 Genasense (25 mg, 3.9 μmol) (Genta, Berekeley Heights, New Jersey) 의 용액에 mPEG-사르코신 NHS 4 (150 mg, 39 μmol) 을 첨가하고, 실온에서 5시간 동안 교반했다. 반응 용액을 DCM (3×10 mL) 및 염수 (10 mL) 로 추출하고, 결합된 유기 층을 건조하고(MgSO₄), 여과하고, 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 이중 증류수 (5 mL) 에서 용해시키고, 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)으로 미리 평형을 이룬 DEAE 빠른 흐름의 약 음이온 교환 칼럼 (27 mm×250 mm, 베드(bed) 체적 ~ 50 mL) 상에 적재했다. 미반응 PEG 링커를 물(3 - 4 칼럼 체적)로 용리한 다음, 생생물을, 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4) 중 구배 0 - 100 % 1 M NaCl으로 10분 내에 용리하고, 그 다음 20 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4) 중 100% 1 M NaCl 로 10분 동안 유속 3 mL/min 로 용리했다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 풀하고, 분자량 컷오프 5000 이 구비된 울트라셀 멤브레인(Ultracell membrane)을 사용하는 아이콘(Amicon) 교반 셀 농축기로 탈염하고, 수득한 용액을 동결건조하여 순수한 PEG - 사르코신 ( sarcosine )-게나센스( Genasense (15.7 mg, 2.42 mmol, 60 %) 을 얻었다. ESI-MS 에 따르면, 방출된 올리고뉴클레오티드의 실측 질량 5879.1, 계산 질량 5879.8 였다.

비교예 6-7

본 발명의 순도의 개선을 증명하기 위해, US 특허 No. 5,730,990 의 실시예 10 - 11 에서 수행된 합성을 생각해 냈다. 하기 참조:

비교예 6

mPEG-사르코신의 합성:

5k mPEG-Cl (25 g, 4.98 μmol) 을, NaOH 용액 (150 ml, 0.33 M) 중 N-메틸 글리신 (사르코신) 의 용액에 첨가하고, 혼합물을 밀봉된 폴리프로필렌 병에 넣었고, 75℃ 에서 4일 동안 가열했다. 반응 혼합물을 실온에서 냉각하고, pH 를, 희석된 HCl 로 6.0/6.5 로 조정했다. 수용액을 CH₂Cl₂ 으로 추출하고, 용매를 감압 하에서 제거했다. 수득한 고형물을 2-프로판올로부터 재결정화하여 화합물을 77% 수율로 얻었다.

¹³C NMR: (CDCl₃) δ: 41.31 (NCH₃); 54.57 (CH₂N); 57.85 (CH₂C); 58.04 (OCH₃); 167.98 (CO). ¹³C-NMR 에 의한 순도 ~80%.

비교예 7

5k mPEG-사르코신 NHS 의 제조:

5k mPEG-사르코신 (18 g, 3.55 μmol) 을 무수 메틸렌 클로라이드(90 ml)에 용해시킨 다음, N-히드록시-숙신이미드 (612 mg, 5.32 μmol) 및 디이소프로필 카르보디이미드 (671 mg, 5.32 μmol) 를 첨가했다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반했다. 수득한 고형물을 여과하고, 용매를 진공에서 제거했다. 미정제 생성물을 2-프로판올로부터 재결정화하여 표제 화합물을 94% 수율로 얻었다.

¹³C NMR: (CDCl₃) δ: 24.73 (CH₂ 숙신이미드); 41.60 (N-CH₃); 54.57 (NCH₂); 54.44 (CH₂C); 58.11 (OCH₃); 165.13 (CO) 168.48 (C 숙신이미드). 측정된 순도: 80%.

비교 결과
방법	PEG-N-COOH 의 순도(%)
긴 반응 시간 및 고온의 LG 로서의 -PEG-Cl	~ 80%
짧은 반응 시간 및 낮은 반응 온도의 (신규) LG 로서의 -PEG-OTs	> 95%

상기에서 알 수 있는 바와 같이, 순도의 상당한 개선은 본 명세서의 절차에 의해 실현되었고, C-GMP 등급 활성 폴리머는 효율적으로 제조될 수 있다.

Claims

온도 약 10 - 약 80 ℃ 및 반응 시간 약 24시간 미만에서 하기 식 (I):

[화학식 I]

(식 중,

R₁ 는 실질적 비항원성 폴리머이고;

R₂ 는 캡핑 기(capping group), LG 또는 LG-(L₁)_n- 이고;

L₁ 는 이중작용 링커이고;

LG 는 이탈 기이고,

n = 0 또는 양의 정수임)

의 폴리머를, 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 화합물과 수성 염기에서 반응시키는 것을 포함하는, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머의 제조 방법.
청구항 1 에 있어서, 온도는 약 30 ℃ - 약 60 ℃ 인 방법.
청구항 1 에 있어서, 반응 시간은 약 18시간 미만인 방법.
청구항 1 에 있어서, LG 는
(식 중, R₃ 는 메틸, 할로겐, 니트로, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 치환 카르복실, 또는 멀티 할로겐 치환 벤젠설포닐; 메실레이트, 브로실레이트, 트레실레이트 및 노실레이트임)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
청구항 6 에 있어서, LG 는
인 방법.
청구항 1 에 있어서, R₂ 는 메톡시인 방법.
청구항 1 에 있어서, 비공유 전자쌍 함유 기를 갖는 화합물은 하기 식:

[화학식 Ⅲ]

(식 중,

Z 는 O, S, 또는 NR₇;

X 는 O, S 또는 NR₈;

m 은 양의 정수;

R₄, R₅ _,R₆, R₇ 및 R₈ 는 H, C₁ _-6 알킬, C₃ _-12 분지 알킬, C₃ _-8 시클로알킬, C₁ _-6 치환 알킬, C₃ _-8 치환 시클로알킬, 아릴, 치환 아릴, 아르알킬, C₁ _-6헤테로알킬, 치환 C_1-6헤테로알킬, C₁ _-6알콕시, 페녹시 및 C₁ _-6 헤테로알콕시로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; 단, Z 가 NR₇ 일 때, R₄ 및 R₇ 는 모두 H 가 아님)

을 갖는 방법.
청구항 7 에 있어서, X 는 O, m 은 1, R₄ 는 메틸, R₅ 및 R₆ 은 각각 H 인 방법.
청구항 7 에 있어서, 식 (Ⅲ) 의 화합물은 N-메틸-글리신(사르코신)인 방법.
청구항 1 에 있어서, R₂ 는
또는
인 방법.
청구항 1 에 있어서, R₁ 은 폴리알킬렌 옥시드인 방법.
청구항 1 에 있어서, 식 (I) 의 폴리머는

및

(식 중,

j 는 약 10 - 약 340 의 정수이고,

x 는 약 10 - 약 2,300 의 정수이고,

L₁, L₂ 및 L₃ 는 이중작용 링커이고,

z 는 1 - 약 120 의 정수임)

로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
청구항 12 에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 식 : - CH₂CH₂-O-(CH₂CH₂O)_x-CH₂CH₂- (식 중, x 는 약 10 - 약 2,300 의 정수임) 의 폴리에틸렌 옥사이드인 방법.
청구항 1 에 있어서, 실질적 비항원성 폴리머는 약 200 - 약 100,000 달톤의 중량평균 분자량을 갖는 방법.
청구항 14 에 있어서, 실질적 비항원성 폴리머는 약 2,000 - 약 48,000 달톤의 중량평균 분자량을 갖는 방법.
청구항 1 에 있어서, 식 (I) 의 폴리머는

(IIa)

, 또는

(IIb)

(식 중, R₂ 는 메톡시이고, R₁ 는 폴리알킬렌 옥사이드임)

인 방법.
청구항 16 에 있어서, R₁ 는 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
청구항 1 에 있어서, 수성 염기는 NaOH, KOH, LiOH, Mg(OH)₂, Ca(OH)₂ 또는 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 방법.
청구항 18 에 있어서, 수성 염기는 NaOH 를 포함하는 방법.
청구항 7 에 있어서, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머는

(IVa)

, 및

(IVb)

로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
청구항 1 에 있어서, 비공유 전자쌍 함유 부분을 활성 기 함유 화합물과 반응시켜 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 활성 폴리머를 형성함을 추가로 포함하는 방법.
청구항 21 에 있어서, 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 활성 폴리머는
인 방법.
청구항 21 에 있어서, 활성 기 함유 화합물은 친핵체와 반응할 수 있는 작용기를 갖는 방법.
청구항 1 에 있어서, 상기 방법에 의해 형성된 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머의 순도는 95 % 초과인 방법.
청구항 1 에 있어서, 상기 방법에 의해 형성된 비공유 전자쌍 함유 부분을 갖는 폴리머의 순도는 98 % 초과인 방법.
청구항 22 에 있어서, 콘쥬게이트를 형성하기에 충분한 조건 하에서
를 아스파라기나제와 반응시킴을 추가로 포함하는 방법.
청구항 26 에 있어서, 상기 아스파라기나제는 재조합 공급원에서 유래되는 방법.