KR20080056688A - Ｈｉｖ－ｉ용 만노스 면역원 - Google Patents

Ｈｉｖ－ｉ용 만노스 면역원 Download PDF

Info

Publication number
KR20080056688A
KR20080056688A KR1020077023635A KR20077023635A KR20080056688A KR 20080056688 A KR20080056688 A KR 20080056688A KR 1020077023635 A KR1020077023635 A KR 1020077023635A KR 20077023635 A KR20077023635 A KR 20077023635A KR 20080056688 A KR20080056688 A KR 20080056688A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
glycoprotein
cells
antibody
hiv
vaccine
Prior art date
Application number
KR1020077023635A
Other languages
English (en)
Inventor
레이몬드 에이 드윅
폴린 엠 러드
게일 리치
크리스토퍼 스캔런
엠 디 막스 크리스핀
Original Assignee
유니버시티 오브 옥스퍼드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 옥스퍼드 filed Critical 유니버시티 오브 옥스퍼드
Publication of KR20080056688A publication Critical patent/KR20080056688A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

탄수화물 HIV 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하는 방법이 제공되어 있다. 하나의 방법은 2G12 항체에 당단백질의 결합을 용이하게 하도록 변형된 글라이코실화를 갖는 당단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 또다른 방법은 2G12 항체에 대한 고 친화력을 갖는 세포들을 반복하여 선별하는 단계를 포함한다.

Description

ＨＩＶ－Ｉ용 만노스 면역원{MANNOSE IMMUNOGENS FOR HIV-1}
본 출원은 탄수화물 공학(carbohydrate engineering)에 관한 것으로, 구체적으로는 탄수화물 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 이러한 백신 및 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
항-탄수화물 인식은 적응면역 및 자연면역 모두에 있어서 주요 요소이다. 그러나, 오직 제한된 수의 케이스에서만 표면 탄수화물에 대한 항체들의 보호 특성이 백신 설계상 이용되어 왔다. 글라이코실화의 항원적 역할은 인간 면역 결핍 바이러스 유형 (HIV-1)의 케이스에 특히 중요하다. HIV-1의 표면은 유연성이 있으면서 면역화를 불완전하게 하는 대규모의 N-연결된 탄수화물로 덮여 있으며, 상기 탄수화물은 체액성 면역회피를 조성하는 '진화하는 차폐물'을 형성한다. (예컨대, X. Wei et. al. "Antibody neutralization and escape by HIV-1", Nature, 422(6929), pp. 307-312, 2003를 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다). HIV 글리칸의 면역원성이 불충분한 것에 대한 3개 주요 설명이 제안되어 왔다. 첫째, HIV에 부착되어 있는 글리칸은 숙주 세포에 의해 합성되고 면역학적으로 숙주세포 자신의 것(self)이기 때문이다. 둘째, 통상 탄수화물에 단백질은 약하게 결합하고, 이로인해 고친화성 항-탄수화물 항체들에 대한 잠재능력을 제한시킨다. 마지막으로 다양하게 상이한 당사슬 형태(glycoforms)가 임의의 주어진 iV-연결된 부착 부위에 결합될 수 있어서, 이로 인해 고도의 이종성 혼합물로 잠재 항원들을 생산할 수 있다. 광범위한 복합 올리고만노스 및 하이브리드형 글리칸은 모두 HIV 상에 존재하며, 이때 올리고만노스 글리칸은 gp120의 노출된 외부 도메인 상에 밀집되게 클러스터를 이루고 있다. 그러나, HIV 탄수화물에 대한 항체들은 감염 시 보통은 관찰되지 않는다.
HIV-1 gp120 분자는 광범위하게 N-글라이코실화되어 있으며, 공유결합으로 부착된 N-글리칸들에 의해 대략 분자량의 1/2를 차지한다. N-글리칸이 당단백질 표면상에 설계된 gp120 코어의 결정 구조를 통해 N-글리칸 클러스터를 함유하는 gp120 분자의 일면을 확인한다 (예컨대, P.D. Kwong 등 "Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody", Nature, 393(6686) pp.648-659, 1998 를 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다). 지금까지 당단백질 분자의 상기 영역을 인식할 수 있는 것으로 오직 하나의 항체(2G12)만이 동정되었기 때문에 이러한 일면은 면역학적으로 침묵인 것을 의미한다. HIV-1 gp120 분자의 N-글라이코실화는 N-글리이코실화 부위들의 하부에 있는 항원성 단백질 에피토프에 항체들이 접근하는 것을 방해함으로써 면역 회피에 주요 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 이러한 예에서, 만일 하부에 위치한 gp120 분자가 항체 인식으로부터 차폐된다면, N-글리칸의 정확한 구조들은 거의 중요하지 않다. 따라서, gp120 글리칸 차폐물은 바이러스 게놈의 돌연변이에 수반되는 신규 N-글라이코실화 부위들의 도입에 의해 진 화될 수 있다. 이는 숙주 면역 회피를 증진시킨다.
HIV의 탄수화물들에 대한 항체들이 드문 것임에도 불구하고, 강력한 항체 반응을 도출하는 탄수화물 부분을 가진 다른 많은 병인체들이 있다. 게다가, 인간 체액성 항-탄수화물 반응성의 중요한 특징은 α1->2 연결 만노스 올리고당에 특이적인 항-만노스 항체들이 널리 퍼져 존재하는 것이다. 그러나, 2G12와 달리, 이들 항체들은 자기 올리고만노스 글리칸들로서 발현되는 만노스에는 결합하지 않는다. 천연 항-만노스 항체들의 가능성 있는 표적은 통상 발생하는 다수의 효모들의 리피드 및 단백질 상에 존재하는 세포벽 만난들이다. 효모 만난들로 면역화하는 것은 gp120 탄수화물과의 몇몇 체액성 교차-반응성을 제공할 수 있다(예컨대, W. E. Muller 등 "Polyclonal antibodies to mannan from yeast also recognize the carbohydrate structure of gp120 of the AIDS virus: an approach to raise neutralizing antibodies to HIV-1 infection in vitro", AIDS. 1990 Feb; 4(2), pp. 159- 62., incorporated hereby by reference in its entirety; 및 W. E. Muller 등 "Antibodies against defined carbohydrate structures of Candida albicans protect H9 cells against infection with human immunodeficiency virus- 1 in vitro", J Acquir Immune Defic Syndr. 1991;4(7) pp. 694-703을 참조하라. 상기 문헌들 전체는 본 명세서에 통합되어 있다). 그러나, 관찰된 역가 및 친화도가 확실한 예방법으로 사용하기에 충분하지 않다.
그럼에도 불구하고, 상기 하나의 드문 중화 항-gp120 항체, 즉 2G12는 HIV 엔벨로프(envelope) 상의 특이적인 탄수화물 에피토프에 결합한다. 상기 2G12에 의 해 인식되는 에피토프는 gp120의 외부 도메인에 존재하는 이례적인 고도의 클러스터의 만노스 잔기들이다(예컨대, C. N. Scanlan 등 "The Broadly Neutralizing Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antibody 2G12 Recognizes a Cluster of α1->2 Mannose Residues on the Outer Face of gρl20 J. Virol. 76 (2002) 7306-7321를 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다). 2G12 결합에 사용되는 1차 분자 결정기는 gp120 중 Asn332 및 Asn392에 부착된 글리칸들의 α1->2 연결 만노스 말단들이다. 이러한 클러스터는 자기 글리칸들로 구성되어 있지만 밀집하게 배열되어 있고 고도로 변종된 포유류 글라이코실화되어 있는 것이므로, 2G12에 의한 비자기 구별을 위한 구조적 기초를 제공한다. 2G12 Fab의 구조적 연구에 의하면, 2개의 Fab 중쇄가 이전에 관찰되지 아니한 도메인-교환 배향을 통해 연동되는 것이 밝혀졌다(예컨대, D. Calarese 등 "Antibody domain exchange is an immunological solution to carbohydrate cluster recognition", Science, vol. 300, pp. 2065-2071, 2003을 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다). 이렇게 도메인 교환된 Fab에 의해 형성된 확장된 파라토프(paratope)는 다가의 탄수화물을 결합하는 고도의 친화력을 발휘하게 하는 대규모의 표면을 제공한다.
2G12에 대한 수동적 트랜스퍼 연구에 의하면, 이러한 항체는 HIV-1의 동물 모델에 있어서, 바이러스 공격을 방어할 수 있다. HIV-1 1차 분리체의 범위에 대한 2G12의 폭넓은 특이성에 대한 분자적 기초가 밝혀져 왔다. 따라서, 2G12 에피토프의 알려진 구조에 기초하여, 2G12-유사 항체들을 이끌어 낼 수 있고 HIV-1에 대응 한 살균 면역을 제공할 수 있는 면역원을 개발하고자 하는 욕구가 크다. 그러나, 이러한 면역원의 설계는 gp120 상 글리칸 에피토프의 항원성 모방품에 필요한 구조적 제한 및 HIV의 불충한 면역원성을 갖는 N-연결된 글리칸 고유의 제한 모두를 극복하여야 한다.
gp120 면역원 설계의 한 방법은 2G12가 결합하는 gp120의 항원성 부위를 합성하여 개조하는 것이다(예컨대, H.K Lee 등 "Reactivity-Based One-Pot Synthesis of Oligomannoses: Defining Antigens Recognized by 2G12, a Broadly Neutralizing Anti-HIV-1 Antibody", Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 43(8), pp. 1000-1003, 2004을 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다. H. Li 등 "Design and synthesis of a template-assembled oligomannose cluster as an epitope mimic for human HIV-neutralizing antibody 2G12", Org. Biomol. Chem., 2 (4), pp. 483 - 488, 2004을 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다. 또 L.-X. Wang, "Binding of High-Mannose-Type Oligosaccharides and Synthetic Oligomannose Clusters to Human Antibody 2G12: Implications for HIV-1 Vaccine Design", Chem. Biol. 11(1), pp. 127-34, 2004을 참조하라. 상기 문헌 전체는 본 명세서에 통합되어 있다). 다가 포맷(multivalent format)으로 합성 만노사이드들을 제시하는 것은 거의 100배 정도 2G12에 대한 이들의 친화력을 증가시킬 수 있다 (예컨대, L.-X. Wang, "Binding of High- Mannose-Type Oligosaccharides and Synthetic Oligomannose Clusters to Human Antibody 2G12: Implications for HIV-1 Vaccine Design", Chem. Biol. 11(1), pp. 127-34, 2004를 참조하라).
면역원 설계를 위한 합성 접근법이 잠재적으로 강력한 것임에도 불구하고, 면역원의 합리적인 설계에 심각한 장벽이 있다. 가장 근본적인 것으로, 면역원으로 사용될 때 유사 항체들의 진화를 이끌어 내는 가능성과 항체에 대한 항원의 친화성이 필연적으로 연결된 것은 아니라는 것이다. 따라서, 글리칸 항원성 및 글리칸 면역원성 모두에 대한 고유의 한계에 대처할 HIV 백신을 설계하는 또다른 방법을 개발하는 것이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 HIV 백신 및 면역원성 조성물, 상기 백신 및 조성물을 제조하는 방법, 이와 관련된 백신화 및/또는 면역화 방법을 제공한다. 일구체예에 따르면, HIV 백신 또는 면역원성 조성물의 제조 방법은 I) (A) 발현계의 글라이코실화 경로를 변경시키는 단계; 및 (B) 상기 발현계에서 당단백질을 발현시켜, 상기 발현된 당단백질이 2G12 항체에 대한 친화력을 증가시키는 변형된 글라이코실화를 갖게 하는 단계를 포함하거나; II) 당단백질의 천연 발현계 이외의 다른 발현계에서 상기 당단백질을 발현시켜, 발현된 당단백질이 2G12에 대한 친화력을 증가시키는 변형된 글라이코실화를 갖게 하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에 따르면, HIV 백신 또는 면역원성 조성물의 제조 방법은, (i) 제1 풀의 세포들에서 제1 풀의 세포들보다 2G12 항체에 대한 친화력이 더 높은 하위 풀의 세포들을 선별하는 단계; 및 (ii) 상기 하위 풀의 세포들을 복제하여 제2 풀의 세포들을 생산하는 단계를 포함하는 반복 수행을 1회 이상 실시하는 것을 포함하고, 상기 백신 또는 조성물은 최종 반복 수행에서 나온 제2 풀의 세포들을 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예는 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질을 함유하는 것인 HIV 백신 또는 면역원성 조성물이다.
본 발명의 또다른 구체예는 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 만난을 포함하는 것인 HIV 백신 또는 면역원성 조성물이다.
또한 본 발명은 (i) 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 인위적으로 선별된 만난; 및 (ii) 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질을 포함하는 것인 HIV 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명은 HIV에 대한 백신화 및/또는 면역화 방법에 있어서, 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질을 함유하는 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 백신화 및/또는 면역화 방법을 제공한다.
또다른 구체예는 HIV에 대한 백신화 및/또는 면역화 방법에 있어서, 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 인위적으로 선별된 만난을 함유하는 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 백신화 및/또는 면역화 방법이다.
또다른 구체예는, HIV에 대한 백신화 및/또는 면역화 방법에 있어서, 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질을 함유하는 제1 조성물; 및 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 인위적으로 선별된 만난을 함유하는 제2 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제1 조성물 및 제2 조성물은 동시에 또는 분리되어 투여되는 것이 특징인 백신화 및/또는 면역화 방법이다.
또다른 구체예는 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물에 의해 형성된 항체이다.
상세한 설명
본 발명은 HIV 백신, 항체 및 면역원성 조성물에 관한 것이고, 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 탄수화물 HIV 백신 및 면역원성 조성물, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
발현된 당단백질의 2G12 항체에 대한 친화력이, 변형되지 않은 천연 글라이코실화를 갖는 동일 유형의 당단백질과 비교하여, 증가하는 방식으로 변형된 글라이코실화를 갖도록 당단백질을 발현시킴으로써 HIV 백신 또는 면역원성 조성물을 제조할 수 있다.
변경된 글라이코실화 경로를 갖는 발현계에서 당단백질들을 발현시킴으로써 또는 당단백질의 천연 발현계가 아닌 다른 발현계에서 당단백질을 발현시킴으로써 글라이코실화를 변형시킬 수 있다.
본 명세서에서, 글라이코실화 경로를 변경한다는 것은 발현계 내 글리칸 합성에 대한 유전적 토대를 변경하고/시키거나 글리칸 프로세싱 효소들의 활성을 파괴/변형시키는 화학적 억제제(들)에 상기 발현계를 노출시킴으로써 변경하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "변형된 글라이코실화"는 변경된 글라이코실화 경로를 갖는 발현계에서 발현된 당단백질의 글리칸들(올리고당들)이 상기 당단백질 상에서 천연적으로 발견되는 글리칸들과 적어도 하나 이상 바람직하게는 2개 이상의 글리칸이 상이한 것을 의미한다.
당단백질의 글라이코실화는 당단백질의 N-글리칸들이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸들이 되도록 하는 방식으로 변형될 수 있다. "지배적으로"라는 의미는 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 N-글리칸이 고농도의 만노스 글리칸들인 것을 의미한다. 고농도의 만노스 글리칸은 하나 이상의 말단 Manα1,2Man 연결을 갖는 글리칸을 포함한다.
이러한 올리고당의 예들로 Man9GlcNAc2, Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2 또는 이들의 이성질체가 있다. 바람직하게는, 당단백질의 N-글리칸은 지배적으로 Man9GlcNAc2 또는 이의 이성질체들이다. N-글리칸 프로파일의 내용은 공지의 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 예컨대, N-글리칸은 PNGaseF에 의해 당단백질로부터 방출될 수 있고 이어서 하나 또는 그 이상의 고성능 액체 크로마토그래피, 겔 전기영동, 질량 분석기로 분석될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 발현계의 글라이코실화 경로는 글리칸 프로세싱 효소들의 활성을 파괴/변형시키는 화학적 억제제(들)에 계를 노출시킴으로써 변경될 수 있다. 이러한 억제제는 글라이코시다제 억제제, 바람직하게는 α-만노시다제 억제제일 수 있다. 표 1에는 글라이코시다제 억제제들 및 이들의 활성들에 대한 예시적인 목록이 제시되어 있다. 각각의 글라이코시다제 억제제는 단독 또는 다른 억제제와 함께 사용될 수 있다.
하기 표 1에는 N-연결된 글라이코실화 경로 중 초기 글라이코시다제들의 공통적인 억제제들이 나타나 있다.
[표 1]
글라이코시다제 억제제 글라이코시다제
오스트랄린(Australine) 카스타노스퍼민(Castanospermine) 데옥시노지리마이신(Deoxynojirimycin) 1,4-디데옥시-1,4-이미니-D-만니톨(DIM) 데옥시만노지리마이신(Deoxymannojirimycin) 키푸네신(Kifunensine) 6-데옥시-DIM 만노스타틴(Mannostatin) A 스와인소닌(Swainsonine) D-만노노락탐 아미드라존(mannonolactam amidrazone) 프로필아미노만노아미딘(Propylaminomannoamidine) α 1-2 글루코시다제 I α 1-2 글루코시다제 I α 1-2 글루코시다제 II Golgi α -만노시다제 II Golgi α 1-2 만노시다제 I Golgi α 1-2 만노시다제 I Golgi α -만노시다제 II Golgi α -만노시다제 II Golgi α -만노시다제 II α-만노시다제 α-만노시다제
글라이코시다제 억제제의 특정 농도는 억제제의 유형, 발현되는 당단백질의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 바람직한 만노시다제 억제제인 키푸넨신은 약 100 μM 이하, 또는 50μM 이하, 또는 10μM 이하, 또는 5μM 이하, 또는 1μM 이하, 또는 0.5μM 이하의 농도로 발현계의 세포들과 접촉시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 발현계는 인간 배아 신장 293T-E 및 S 세포들(HEK 293T), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 HeρG2 세포들과 같은 고수율의 포유류 발현계일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 글라이코실화 경로를 유전적으로 조작하여 발현계의 글라이코실화 경로를 변경할 수 있다. 따라서, 파괴된 N-연결된 글라이코실화를 갖는 포유류 발현계를 사용하여, 올리고만노스 글리칸을 갖는 당단백질을 생산할 수 있으며, 상기 발현계는 예컨대 알파-만노시다제 및/또는 GlcNAc-트랜스퍼라제 I 활성이 결여된 것일 수 있다. 또한 발현계는 알파-만노시다제 및/또는 GlcNAc-트랜스퍼라제 I 활성이 결여된 세포주를 포함한 렉틴-내성 세포주(lectin resistant cell line)일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 당단백질의 글라이코실화를 변형시킨, 당단백질의 천연 발현계 이외의 임의의 발현계에서 당단백질을 발현시켜, 자연에서 발견된 동일 유형의 당단백질과 비교하여 2G12에 대한 증가된 친화력을 갖게 할 수 있다. 특히, 계획된 발현계는 변경된 N-연결된 글라이코실화 유전자들, 예컨대 고농도의 만노스 구조들을 갖는 당단백질들을 발현할 수 있는 Lec-계열 변이체를 갖는 곰팡이/효모 세포주, 곤충 세포주 또는 포유류 세포라인을 포함한다. 상기 효모 세포주들은 예컨대 변이체 S. cervesiae Δ ochl, Δ mnnl일 수 있다 (Nakanishi-Shindo, Y., Nakayama, K. L, Tanaka, A., Toda, Y. 및 Jigami, Y. (1993). Journal of Biological Chemistry 268: 26338-26345)
발현된 당단백질의 글라이코실화는 2G12 항체에 대한 친화력이 천연 글라이코실화를 갖는 동일 유형의 당단백질과 비교하여 증가되는 방식으로 변형된다. 통상적인 방법은 항체에 대한 당단백질의 친화력을 측정하는 것에 있다. 이러한 방법중의 한 예는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays)일 수 있다. 본 발명에 따라 발현될 수 있는 당단백질은 gp120 당단백질 및 "자기"-당단백질들을 포함한다. 당단백질들은 임의의 입수용이한 공급원으로부터, 예컨대 당단백질들을 생산하기 위한 표준 재조합 기법에 의해 수득될 수 있다.
gp120
천연 gp120의 글라이코실화는 고도로 이종성(異種性)을 갖는다. 2G12 결합에 주요한, α1->2 연결된 구조는 더 큰 올리고만노스 글리칸들 상에서만 존재한다. 따라서, 2G12에 정상적으로 결합하는 둘 또는 세개의 gp120 글리칸들은 gp120 상에 존재하는 N-연결된 탄수화물들의 총 수 중 오직 일부(최대 30개의 N-연결된 부위들)에 해당한다.
따라서, gp120 글라이코실화의 미세-이종성 정도는 2G12에 대한 결합부위 및 다른 유사 항-글리칸 항체들의 수를 제한한다. 더 다양한 복합체, 하이브리드 및 더작은 올리고만노스 글리칸들은 2G12 결합에 조력할 수 없다. 이러한 제한은, 2G12가 결합하는 것들로 gp120 상의 글리칸 유형(들)을 제한하도록 글리칸 프로세싱 경로를 조작함으로써, 극복할 수 있다. 이러한 변형은, 2G12에 대한 유사 특이성들을 갖는 다른 항체들을 이끌어낼 수 있는 면역원에 대한 가능성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 키푸넨신의 존재 하에 생산된 gp120는 2G12뿐만 아니라 다른 형상으로 나타나질 수 있는 만노스 잔기들을 필요로 할 수 있는, 임의의 다른 항-만노스-클러스터 항체에 대한 강화된 리간드로써 작용할 수 있다.
자기-단백질들
gp120에 대한 면역 반응은 통상 단백질 코어에 특이적인 항체들에 의해 지배된다. N-연결된 글리칸은 통상 항체 인식에 직접적인 역할을 수행하지 않는다. 단백질 일부분에 대한 면역 반응 및 단백질 일부분에 의한 면역 조절을 제거하기 위해, 비자기 올리고만노스 클러스터들에 대한 발판으로서 자기 단백질들이 사용될 수 있다. 만노시다제 억제제들의 존재하에 또는 글라이코실화 경로가 유전적으로 조작된 세포주으로부터 재조합 자기 당단백질들을 발현시키면, 2G12 에피토프를 모방하는 올리고만노스-유형 글리칸들을 갖는 발판을 제공할 수 있다. 이러한 접근법을 통해 면역침묵인 단백질 발판에 2G12 에피토프가 나타날 수 있고 올리고만노스 클러스터에 대해서만 작용하는 임의의 항체 반응이 일어날 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 2G12 항체에 대해 특이적인 상보성을 갖는 만난들을 포함하는 HIV 백신 또는 면역원성 조성물을 제공한다. 만난들은 만노스를 함유하는 다당류이며, 바람직하게는 효모 또는 세균 세포들로부터 유래된 것이다. 만난들은 분리된 만난의 형태일 수도, 사멸된 세포 또는 감쇄된 세포일 수 있는 효모 또는 세균 전체일 수도, 또는 운반 분자 또는 단백질과 연결된 만난들일 수도 있다. 상기 만난은 2G12 항체에 대한 천연 친화력을 갖는 효모 또는 세균세표용 만난일 수 있다. 이러한 만난들의 일례는 2G12 에피토프를 모방한, 즉 2G12 항체에 천연 친화력을 갖는 효모 또는 세균 세포의 만난을 갖는 칸디다 알비칸스의 만난 구조들일 수 있다.
또한, 만난은 인위적으로 또는 유전적으로 선별된 만난일 수 있다. 이러한 만난은 2G12 항체에 대해 더 높은 친화력을 갖는 효모 또는 세균 세포를 반복적으로 선별함으로써 생산될 수 있다. 이러한 반복 공정에 사용되는 세포의 출발 풀은 제로가 아닌(non-zero) 친화력 또는 특이성을 발휘하는 세포들을 포함할 수 있다. 이러한 출발 풀로부터, 나머지 세포들보다 2G12 항체들에 더 높은 친화력을 갖는 세포들의 하부 세트가 선별될 수 있다. 이어서 상기 하부 세트의 세포들을 복제하고, 연속적인 반복 공정을 위한 출발 풀로서 사용될 수 있다. 다양한 기준이 2G12 항체에 대한 더 높은 친화력을 갖는 세포들의 하부 세트를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를들면, 제1 반복 시 2G12 항체에 대한 검출가능한 친화력을 갖는 세포들을 선별한다. 다음의 반복에서, 상기 선별된 세포들은 2G12 항체에 고 친화력을 나타내는 세포들을 선별할 수 있다. 이러한 세포들은 친화력 분리용 고정 2G12을 사용한 FACS (fluorescence activated cell sorter) 또는 직접 농축(direct enrichment)에 의해 선별될 수 있다.
출발 풀의 세포들로 사용될 수 있는 비제한적인 예는 S. 세리비시애 세포들이다. 2G12 항체는 S. 세리비시애 만난들에 결합할 수 있으며, 따라서 만난들과 gp120 당단백질 사이에서 제로가 아닌 정도의 항원성 모방을 나타낸다. S. 세리비시애 세포벽의 탄수화물 구조는 gp120의 올리고만노스 글리칸들과 항원성 구조에 있어서 공통점을 갖는다. 그러나, 천연적으로 발생된 S. 세리비시애 만난들은 면역원으로써 사용될 때 gp120 에 대한 체액성 교차 반응을 충분히 유도하지 않는다.
본 발명에 사용될 수 있는 세포들은 또한 만노실 트랜스퍼라제 유전자 생성물 Mnn2p이 결여된 세포와 같이, 만난 합성에 관여하는 하나이상의 유전자들이 결여된 세포들일 수 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 HIV에 대한 백신화 및/또는 HIV에 대한 면역화를 위해 HIV와 싸우는 사람을 포함한 포유류에 투여될 수 있다. 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 2G12 항체에 특이적인 상보성을 갖는 만난들 및/또는 상술한 방법에 따라 제조된 당단백질을 포함할 수 있다. 당단백질은 더 이상의 글라이코실화 변형 없이 분리 또는 정제된 당단백질로서 백신 내에 포함될 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물은 임의의 편리한 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를들면, 당단백질 및/또는 만난들은 약학적으로 허용가능한 조성물의 일부로써 투여될 수 있으며, 임의의 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하거나, 리포좀과 같은 전달 시스템 또는 조절된 방출 약학 조성물을 통해 투여될 수 있다. "약학적으로 허용가능한"이란 투여될 때 위장 탈 또는 현기증과 같은 알러지 등과 같이 원치 않는 반응을 전형적으로 생성하지 않고 생리학적으로 관용할 수 있는 분자들 또는 조성물을 의미한다. 바람직하게는, "약학적으로 허용가능한"은 미국 약전 또는 동물, 바람직하게는 사람에 사용되기 위한 기타 일반적으로 인식되는 약전에 목록화되어 있거나, 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인된 것을 의미한다. "운반체"는 상기 화합물과 함께 투여될 수 있는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학적 운반체는 식염수, 덱스트로즈 용액, 글리세롤 용액, 물, 석유에서 나온 오일, 동물 오일, 식물성 오일, 합성 오일(땅콩유, 두유, 광유 또는 참기름)과 같은 오일 현탁액과 같은 멸균액일 수 있다. 운반체로 특히 주사액으로, 물, 식염수, 덱스트로즈 용액 및 글리세롤 용액이 사용되는 것이 바람직하다. 백신 또는 면역원성 조성물은 당단백질 및/또는 만난과 양립할 수 있는 표준 기법에 의해 투여될 수 있다. 이러한 기법은 비경구법, 경피법, 및 예컨대 입 또는 코 투여법과 같은 점막 통과법(transmucosal)을 포함할 수 있다.
도 1A 및 1B는 키푸넨신(kifunensine) 처리된 HIV-1IIIB gp120와의 항체 결합을 보여주고 있다.
도 2A 및 2B는 5 μM 키푸넨신 존재하에 HEK 293T 세포에서 발현된 표적 당단백질(RPTPmu)에서 유래된 PNGase F-방출된 글리칸의 MALDI-MS을 보여주고 있다.
도 3은 통상적인 Man9GlcNAc2 (상부 패널) 및 키푸넨신 존재하에 발현된 당단백질들에서 유래된 MangGlcNAc2(하부 패널)의 특징적인 구조 지문(fingerprint)에 대한 질량 분광계 분석 결과를 보여주고 있다.
도 4는 5 μM 키푸넨신으로 처리된 CD48 및 RPTPmu와의 항체 결합을 보여주고 있다.
도 5는 α-연결된 만노스(원으로 표시)와 2G12의 1차 리간드: Manα1-2Manα1-2Man (상자로 표시)를 제시하는 S. 세리비시애(S. cerivisiae) 만난의 구조를 도식화한 것이다.
도 6은 3회 선별 공정 동안 효소 세포 표면에 대한 2G12 친화력을 보여주고 있다.
도 7A 및 7B는 비처리 세포(상부 패널) 및 키푸넨신 처리 세포(하부 패널)에서 발현된 CD66a 자기 당단백질에 대한 PNGase-F 방출된 글리칸의 MALDI-TOF 분석결과를 나타낸다.
도 8은 키푸넨신 존재하에 발현된 CD66a 당단백질과 2G12의 결합을 보여주는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 나타낸다.
하기 비제한적인 실시예들을 통해 본 발명을 더 설명한다.
실시예 1 - 만노시다제 억제제들의 존재하에 gp120을 생산하면 항원성이 증가됨.
본 연구의 목적은 광범위하게 중화시키는 2G12-유사 항-HIV 항체들을 우선적으로 이끌어 낼 수 있는 변형된 gp120 분자를 형성하는 것이다. 2G12에 더 높은 친화력을 갖는 올리고만노스 에피토프(들)을 보유하도록 당단백질을 변형하고자, 만노시다제 억제제들을 사용하여 HIV-1IIIB gp120 당단백질을 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 안정된 세포주에서 생산하였다.
2G12 에피토프의 형성 시, 키푸넨신에 의한 만노시다제 억제의 역할을 조사하기 위해 재조합 HIV-1IIIB gp120을 분비하는 EE6HCMVgp120GS로 트랜스펙트된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포들을, 태아 송아지 혈청(10%), 페니실린(50 U/ml) 및 스트렙토마이신(50 1 g/ml)가 보충된 CB2 DMEM 베이스 배양 배지에서 배양하였다. 모든 반응제는 영국 Uxbridge의 Gibco사에서 입수하였다. 메티오닌 술폭시민 (200 nM) 첨가에 의해 gp120의 고발현을 유지시켰다. 키푸넨신 존재 및 부존재하에 세포들을 성장시켰다(도 1A, 1B를 참조하라).
키푸넨신 및 데옥시만노지리마이신(DMJ, 표 1) 모두가 ER- 및 Golgi-거주 클래스 I α-만노시다제들을 억제함에도 불구하고, DMJ 보다 1000배 더 낮은 농도에서 만노시다제 억제 효과를 발휘할 수 있기 때문에 본 연구에서는 만노시다제 억제 제로 키푸넨신을 선택하였다.
만노시다제 억제제인 키푸넨신의 존재하에 CHO gp120을 생산하면 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays)에서 단클론성 항체 2G12에 더 높은 결합력으로 결합하는 것으로 나타나는 분자가 형성된다. 2회의 2G12 ELISA 결합 분석법을 통해, 키푸넨신의 존재하에 생산되는 gp120의 각 분자 상에 하나 이상의 추가 2G12 결합 부위가 존재하였다는 것이 입증되었다. 유연한 단백질-결합 플레이트 상에 당단백질들을 고정시켰다. 첫번째 실험(도 1A)으로, 2G12 (5ug/ml)를 플레이트 상에 코팅하고 4℃에서 밤새 정치하였다. 이어서 소 혈청 알부민(3% w/v)으로 1시간 동안 플레이트를 차단하였다. 이어서, gp120IIIB 발현 CHO 세포(키푸넨신 존재 또는 부존재)에서 나온 상청액을 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 이어서 PBS로 플레이트를 3번 세척하였다. 이어서, 2G12 (10yg/ml로 적정)를 첨가하였다. 세척한 후, 포스파타제-연결된 항-IgG 2차 항체로 2gl2 결합을 측정하였다. 최종 세척 단계 및 이어서 포스파타제 기질 측정(p-니트로페닐포스페이트, 405nm에서의 흡광도)을 수행하였다.
b12 결합에 의해 측정되는 추가 결합 부위(들)의 존재 여부를, 2G12 또는 b12 결합 부위들과 경쟁하지 않는 항-gp120 항체 (D7324)로 gp120를 포획하여 확인하였다. gp120의 결합 및 bl2/2G12의 측정은 다시 포스파타제-연결된 항-IgG 2차 항체로 확인하였다.
도 1은 규정된 농도(ug/ml)의 2G12 및 대조군 항체들에 대한 포스파타제-연결된 항- IgG 2차 항체로부터 나온 405nm 흡광도를 통해 검출된, 키푸넨신 처리된 gp120 당단백질에의 항체 결합을 표시하고 있다. 도 1의 패널 A는 O μM 키푸넨신(속빈 마름모), O.05 μM 키푸넨신(속빈 세모), O.1 μM 키푸넨신(속빈 정사각형), O.25 μM 키푸넨신(+), O.5 μM 키푸넨신(채워진 원), 1 μM 키푸넨신(속빈 세모), 및 5 μM 키푸넨신(채워진 정사각형)의 존재하에 생산된 CHO gp120에 대한 하나 이상의 2G12 분자 결합을 입증하는 샌드위치 ELISA 결과를 보여주고 있다. BSA (x)는 음성 대조군으로써 이들 실험에 사용되었다. 도 1의 패널 B는 키푸넨신-처리된 CHO gp120으로의 이중 항체 결합을 보여주고 있다. 비처리된 gp120에 bl2 결합 (채워진 정사각형), 비처리된 gp120에 2G12 결합 (채워진 마름모), gp120에 bl2 및 2G12 이중 항체 결합(채워진 세모); 5 μM 키푸넨신 존재하에 생산된 gp120에 bl2 결합 (속빈 정사각형) 및 2G12 결합 (속빈 마름모)을 보여주고 있다. 샌드위치 ELISA 분석으로부터 나온 결과로부터, 키푸넨신 농도가 증가함에 따라, 더 높은 비율의 gp120 분자들이 2 이상의 2G12 항체 분자들과 동시에 결합할 수 있다는 것을 알 수 있다(도 1, 패널 A). 비처리된 gp120의 이중 항체 ELISA와 키푸넨신 처리된 gp120로의 2G12 결합을 비교하면(도 1, 패널 B), 키푸넨신 처리된 gp120 상에 2G12에 대한 2개의 구별되는 에피토프가 존재하는 것을 확인할 수 있다.
결론: 키푸넨신-처리된 당단백질들의 N-글리칸 분석은, 복합 글라이코실화가 억제되어, ER 및 골지 거주 만노시다제들에 대한 키푸넨신의 알려진 억제 활성과 일치하는 올리고만노스의 당사슬 형태를 유도한다는 것을 제시한다. 그 결과, 키푸넨신의 존재하에 발현된 gp120 당단백질에 2G12의 결합은 극적으로 강화되고, 적어도 2개의 2G12 분자들은 단일 gp120 분자에 결합할 수 있다.
실시예 2. HIV 탄수화물들에 항원성 교차-반응성을 갖는 '자기' 당단백질의 생산
a) CD 48 및 RPTPmu
본 연구의 목적은 2G12 항체에 결합하고 결과적으로 HIV gp120에 항원성 교차-반응성을 발휘하는 올리고만노스 글리칸들을 갖는 '자기' 당단백질들을 형성하는 것이다. 2개의 표적 당단백질인, CD48 및 수용체 단백질 티로신 포스페이트 mu (RPTPmu)를 5 μM 농도의 만노시다제 억제제 키푸넨신의 존재하에 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 만노시다제 억제제가 올리고만노스 글리칸 함유 당단백질을 생산하는데 효과적이었다는 것을 입증하기 위해, 단백질 N- 글라이카나제 F (PNGase F)로 절단시켜 글리칸들을 방출시키고, 이어서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량분석법(MALDI-MS)로 분석하였다.
Kurster 등 (Anal. Biochem. 250(1)82-101)의 설명대로 단백질 N-글라이코시다제 F 절단을 한 결과, 재조합 당단백질들로부터 글리칸이 방출되었다. 요약하면, 단백질을 10% SDS PAGE로 분리하고 상기 젤로부터 나온 쿠마시에 염색 밴드들을 잘라내고, -20℃에서 동결시켰다. 이어서 동결된 젤 조각들을 아세토니트릴과 20mM 중탄산염 나트륨 완충액으로 번갈아 가며 세척하였다. 이어서, 37℃, 2OmM 중탄산 나트륨 완충액에서 PNGase F (EC 3.2.2.18, Roche Biochemicals)로 밤새 효소절단하여 탈글라이코실화(deglycosylation)시켰다. 글리칸을 함유하는 상기 반응 결과 혼합물을 보유하고, 증류수를 추가하여 젤 조각들을 초음파 분해함으로써 젤 내 임의의 나머지 글리칸들을 추출하였다. Micropure- EZ 효소 결합 컬럼들 (Millipore, Bedford, MA, USA)을 통과시킴으로써, 추출된 글리칸들을 질량분석법으로 최종 정제하였다. 게다가, 엑소- 및 엔도- 글라이코시다제들로 절단시켜 분석하였다. 도 2는 5 μM 키푸넨신 존재하에 HEK 293T 세포에서 발현된 표적 당단백질 (RPTPmu)로부터 나온 PNGase F-방출 글리칸들의 MALDI-MS을 나타내고 있다. 절단되지 않은 글리칸들의 데이터 및 엔도글라이코시다제 H로 절단된 글리칸들의 데이터는 각각 도 2의 패널 A 및 B상에 도시되어 있다. 도 2의 결과들에 의하면, 방출된 글리칸 풀이 엔도글라이코시다제 H 절단 및 잭 빈(Jack bean) 유래의 알파-만노시다제에 완전히 민감하였다는 것을 뒷받침하여 준다.
올리고만노스-유형의 N-연결된 글리칸들을 함유하는 당단백질 결과물은 ELISA에 의해 2G12 결합을 시험하였다(도 4). 특히, 15.6 μg의 CD48, 2 μg, 1 μg 및 0.4 μg의 RPTPmu를 플레이팅하였고, 키푸넨신으로 처리하지 않은 IgG 1 μg을 음성 대조군으로 플레이팅하였다. 도 4의 데이터에 의하면, 만노시다제 억제제의 존재하에 생성된 당단백질들은 2G12에 결합할 수 있고, 이로인해 HIV의 엔벨로프 당단백질인 gp120의 항원성 모방품으로 역할할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
키푸넨신 존재하에 발현된 당단백질 상에 존재하는 글리칸들의 항원적으로 중요한 특징은 비-천연적인 올리고만노스 이성질체를 형성하는 것이다. 몇몇 발현계에, 특히 HEK 293T 세포들에, 키푸넨신을 도입하면 Man9GIcNAc2 의 합성을 유도할 수 있으며, 이때 천연 이성질체와 동일한 화학 조성을 가짐에도 불구하고 단당류 성분이 상이한 배열을 갖는다. 도 3은 일반적인 Man9GlcNAc2 (상부 패널)과 키푸넨 신 존재하에 발현된 당단백질들로부터 나온 Man9GlcNAc2(하부 패널)의 특이적인 구조 지문의 질량 분광계 분석 결과를 비교한 것이고, 항원성에 있어서 신규한 Man9GlcNAc2 이성질체가 존재한다는 것을 확인시켜 준다.
키푸넨신 처리된 세포들에서 유래된 당단백질들 상에 존재하는 비-천연 이성질체들은 HIV를 포함한 포유류 세포에서 통상 발견되는 Man9GlcNAc2 와 항원성에 있어서 상이하기 때문에, 키푸넨신으로 처리된 세포들에서 유래된 당단백질은 면역원으로 사용될 때 강화된 항원성 반응을 발휘할 수 있다는 것을 예견할 수 있다. 따라서, 현존하는 Man9GlcNAc2 구조를 변형하면 전술한 클러스터링 효과에 의해 면역원성을 향상시킬 수 있다.
도 3에 나타난 바와 같이, 키푸넨신 처리된 HEK 293T 세포로부터 나온 올리고만노스 글리칸들은 항원성에 있어서 비자기 이성질체이다. 따라서, gp120의 천연 글리칸들에 항원성 교차-반응성을 유지하면서, 상기 신규 글리칸들은 증가된 면역원 능력을 발휘할 것이다.
b) CD66a
만노시다제 억제제인 키푸넨신 50 μM 농도하에 HEK293T 세포에서 CD66a (CEACAM-I) 자기 당단백질을 발현시켰다.
10% FCS, 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 및 0.6 mg/ml G418로 변형된 둘베코의 이글 배지 (DMEM)에서, 사람 Fc에 융합된 래트 CEACAMl로 트랜스펙트시킨 HEK293 세포를 배양하였다. Fc 키메라 단백질을 10일동안 축적하였고 고 속-흐름 단백질 A-세파로즈 (Amersham Biosciences)를 사용하여 정제하였다.
웨스턴 블롯 분석
용출된 단백질에 대해 10% SDS PAGE 을 수행하고, 탱크-트랜스퍼 장치(Bio-Rad, Hertfordshire, UK)를 사용하여 PVDF 멤브레인(Immobillon-P, Millipore) 상으로 전기블러팅을 하였다. 단클론성 항-CEACAMl 마우스 단클론성 항체 Be9.2 (Kindly provided by Dr B.B.Singer)의 1:500 희석액 및 HRP 결합된 항-마우스 항체의 1: 10,000 희석액을 사용하여 면역블럿팅을 수행하였다. 강화된 화학적발광법(enhanced chemiluminescence technique, ECL, Pierce, Northumberland, UK)를 사용하여 HRP-의존성 발광을 발현시켰다.
PNGase 절단 및 글리칸 추출
정제된 래트 CEACAMl 단백질을 10% SDS PAGE 로 분리하고, 상기 젤에서 쿠마시에로 염색한 밴드들을 잘라내고, -20℃에서 동결시켰다. 동결된 젤 조각을 아세토니트릴과 20mM 중탄산염 나트륨 완충액으로 번갈아 가며 세척하였다. 이어서, 37℃, 20mM 중탄산염 나트륨 완충액에서 PNGase F (EC 3.2.2.18, Roche Biochemicals)로 밤새 효소절단시켜 탈글라이코실화시켰다. 글리칸들을 함유하는 상기 반응 결과 혼합물을 보유하고, 증류수를 추가하여 젤 조각들을 초음파 분해함으로써 젤 내 임의의 나머지 글리칸들을 추출하였다.
Micropure- EZ 효소 결합 컬럼들 (Millipore, Bedford, MA, USA)을 통과시킴으로써, 추출된 글리칸들을 질량분석법으로 최종 정제하였다. 올리고만노스 글리칸 함유 당백질들을 생산하는데 만노시다제 억제제가 효과적이라는 것을 입증하기 위 해, 단백질 N-글라이카나제 F (PNGase F)로 절단하여 글리칸들을 방출시켰으며, 이어서 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량분석법(MALDI-TOF-MS)으로 분석하였다.
도 7은 CD66a 상에서, 예컨대 비처리된 세포에서 발현된 CD66a 상에서 일반적으로 발견되는 글리칸들(상부 패널)과 키푸넨신 존재하에 발현된 CD66a로부터 방출된 글리칸들 (하부 패널)에 대한 MALTI-TOF-MS 분석 결과를 나타낸 것이다. CD66a 상에서 일반적으로 발견되는 글리칸들은 복합 N-연결된 탄수화물의 다양한 풀을 형성하는 반면, 키푸넨신 존재하에 발현된 CD66a 로부터 나온 글리칸들은 올리고만노스 글리칸들이며, 대부분 GlcNAc2Man9이다. 글리칸 복합성(complexity)의 감소는 도 8상의 2G12 항체에 대한 CD66a 친화력 증가와 관련있다. 고정된 CD66a에 2G12이 결합하는 것을 ELISA로 측정하였다. 또한, 일반적으로 발견되는 CD66a (-)와 비교하여 키푸넨신 존재하에 발현된 CD66a (+)에서 더 낮으면서 더 집중화된 눈에 띄는 질량체가 관찰되었기 때문에, 젤 시프트에 의해 CD66a 상의 글리칸 다양성에 있어서 키푸넨신 처리의 효과가 입증된다.
실시예 3. 유전적으로 선별된 효모들의 표면 만난들에 대한 2 G12 의 결합.
효모 만난들을 선별하는 전략은 이미 면역원성을 갖는 탄수화물 구조(S. cerivisiae 만난)을 취하고 gp120에 대한 이의 항원적 유사성을 증가시키는 것이다. 본 연구에서, 야생형 S. cerivisiae (WT Mat-a B4741) 및 만노실 트랜스퍼라제 유전자 생성물 Mnn2p 이 결여된 스트레인 (ΔMnn2 Mat-a B4741) 모두를 선택하였 다. 많은 다른 병원성 표면들은 이러한 구조를 공통적으로 가질 수 있거나, 또는 그렇게 하도록 인위적으로 선별하여 이러한 병원성 표면들을 발달시킬 수 있다. 특히, 가지형 만난의 말단 Manα1-3Man 잔기들(이들 첨가에는 Mnn2p 효소가 관여함)이 2G12 인식을 방해하는 것으로 예상되기 때문에, ΔMnn2 변이체를 선별하였다 (도 5). S. cericisiae 만난들에 2G12가 결합하는 것은 FACS(fluorescence activated cell sorter)로 측정할 수 있다. 2G12에 대한 검출가능한 친화력을 나타내는 세포들을 선별하고, 딸 개체군의 시드(seed)로 사용하였다. 상기 선별을 반복하여 2G12에 더 높은 친화력을 갖는 효모 만난들을 진화시켰다.
도 6은 3회 선별에 걸쳐, 효모 세포의 2G12에 대한 친화력을 나타내고 있다. y-축의 값은 99.5% 의 초기 야생형(WT) 개체군 보다 더 높은 친화력으로 2G12에 결합하는 효모 세포 분획을 의미한다. 야생형 (clear bars) 및 ΔMnn2 (shaded bars) 개체군의 진화는 도 6 상에 제시되어 있다. 도 6의 데이터는 2G12에 결합하는 능력에 따라 효모를 선별하면 세포 표면에 대한 2G12 친화력의 증가가 유전될 수 있게 한다. 예상되는 바와 같이, ΔMnn2 스트레인은 또한 야생형 보다 선별 기준에 대한 적응성을 조력하는데 더 우수할 수 있다. 선별 및 복제를 추가적으로 계속 반복하여 만난 구조를 변경할 수 있고, 이로 인해 2G12 에피토프의 항원성 모방력을 증가시킬 수 있다. 따라서 생산되는 만난 구조들은 면역화 연구를 위해 분리된 형태로 그리고 단백질 컨쥬게이트들로서도 사용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하였지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자에 의해 다양한 변형이 개시된 구체예들에 적용될 수 있고, 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 의도될 것이다.
본 명세서 인용된 모든 공개물, 특허출원 및 특허 전체는 본 명세서에 통합되어 있다

Claims (32)

  1. HIV 백신 또는 면역원성 조성물의 제조 방법으로서,
    I) (A) 발현계의 글라이코실화 경로를 변경하는 단계; 및
    (B) 발현계에서 당단백질을 발현시켜, 발현된 당단백질이 이의 2G12 항체에 대한 친화력을 증가시키는 변형된 글라이코실화를 갖게 하는 단계를 포함하거나; 또는
    II) 당단백질의 천연 발현계 이외의 다른 발현계에서 당단백질을 발현시켜서, 여기서 발현된 당단백질이 이의 2G12에 대한 친화력을 증가시키는 변형된 글라이코실화를 갖게 하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변경 단계는 글라이코실화를 유전적으로 조작하여 만노시다제 결여 세포주를 형성하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변경 단계는 상기 발현계를 α-만노시다제 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, α-만노시다제 억제제는 오스트랄린(Australine), 카스타노스퍼민(Castanospermine), 데옥시노지리마이신(Deoxynojirimycin), 1,4-디데옥시- 1,4-이미니-D-만니톨(DIM), 데옥시만노지리마이신(Deoxymannojirimycin), 6-데옥시-DIM, 만노스타틴(Mannostatin) A, 스와인소닌(Swainsonine), D-만노노락탐 아미드라존(D-mannonolactam amidrazone) 또는 프로필아미노만노아미딘(Propylaminomannoamidine)인 방법.
  5. 제4항에 있어서, α-만노시다제 억제제는 키푸넨신(Kifunensine)인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 당단백질은 gp120 당단백질인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 당단백질은 자기 당단백질인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 자기 당단백질은 CD48, CD29, CD49a, CD66a, CD80, CD96a, 아미노펩타제 또는 RPTPmu인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 자기 당단백질은 가용성 당단백질 구성체인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 발현된 당단백질의 N-글리칸들은 지배적으로 글라이코실화되지 않은 고농도의 만노스 글리칸(high mannose glycans)인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 고농도의 만노스 글리칸은 Man9GlcNAc, Man8GlcNAc, Man7GlcNAc, Man6GlcNAc 글리칸들로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 글라이코실화가 변형된 당단백질의 발현은 고수율의 포유류 발현계에서 수행되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 고수율의 포유류 발현계는 HEK 293T 세포, CHO 세포 또는 HepG2 세포를 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, N-연결된 글라이코실화 부위를 상기 당단백질 상에 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 제1항에 기재된 방법에 의해 생산된 HIV 백신 또는 면역원성 조성물.
  16. 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸이 되도록 변형된 글라이코실화를 갖는 당단백질을 함유하는 HIV 백신 또는 면역원성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 당단백질은 gp120 당단백질인 백신 또는 면역원성 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 당단백질은 자기 당단백질인 백신 또는 면역원성 조성물.
  19. HIV 백신 또는 면역원성 조성물의 제조 방법으로서,
    (i) 제1 풀의 세포들에서 제1 풀의 세포들보다 2G12 항체에 대한 친화력이 더 높은 하위 풀의 세포들을 선별하는 단계; 및
    (ii) 상기 하위 풀의 세포들을 복제하여 제2 풀의 세포들을 생산하는 단계를 포함하는 반복 수행을 1회 이상 실시하는 것을 포함하고,
    상기 백신 또는 조성물은 최종 반복 수행으로부터의 제2 풀의 세포들을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 반복 수행을 2회 이상 실시하고, 최종이 아닌 반복 수행의 제2 풀의 세포들은 상기 최종이 아닌 반복 수행 직후의 반복 수행의 제1 풀의 세포인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 제1 풀의 세포는 효모 세포인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 효모 세포는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 세포 또는 S. 세리비시애(S. cerivisae) 세포인 것인 제조 방법.
  23. 제21항에 있어서, 효모 세포는 만난 합성에 관여하는 하나 이상의 유전자에 결함이 있는 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 선별 단계는 형광성 활성형 세포 분류기에 의해 또는 친화력 분리를 위한 고정형 2G12 항체를 사용한 직접 농축(direct enrichment)에 의해 수행되는 것인 방법.
  25. 제19항에 기재된 방법에 의해 생산된 HIV 백신 또는 면역원성 조성물.
  26. 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 만난을 포함하는 HIV 백신 또는 면역원성 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 만난은 효모 또는 박테리아 세포의 만난인 백신 또는 면역원성 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 만난은 인위적으로 선별된 만난인 백신 또는 면역원성 조성물.
  29. (i) 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 인위적으로 선별된 만 난; 및
    (ii) 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질
    을 포함하는 HIV 백신 또는 면역원성 조성물.
  30. 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질을 함유하는 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 HIV에 대한 백신화 및/또는 면역화 방법.
  31. 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 인위적으로 선별된 만난을 함유하는 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 HIV에 대한 백신화 및/또는 면역화 방법.
  32. 당단백질의 N-글리칸이 지배적으로 고농도의 만노스 글리칸인 당단백질을 함유하는 제1 조성물; 및 2G12 항체의 에피토프에 특이적인 상보성을 갖는 인위적으로 선별된 만난을 함유하는 제2 조성물을 피험체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제1 조성물 및 제2 조성물은 동시에 또는 별도로 투여되는 것인 백신화 및/또는 면역화 방법.
KR1020077023635A 2005-03-16 2006-03-16 Ｈｉｖ－ｉ용 만노스 면역원 KR20080056688A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US66193305P 2005-03-16 2005-03-16
US60/661,933 2005-03-16
US73001905P 2005-10-26 2005-10-26
US60/730,019 2005-10-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080056688A true KR20080056688A (ko) 2008-06-23

Family

ID=36910961

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077023635A KR20080056688A (ko) 2005-03-16 2006-03-16 Ｈｉｖ－ｉ용 만노스 면역원

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20060251680A1 (ko)
EP (2) EP2058004A1 (ko)
JP (1) JP2008533175A (ko)
KR (1) KR20080056688A (ko)
CA (1) CA2601797A1 (ko)
WO (1) WO2006099592A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007033329A1 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 University Of Maryland Biotechnology Institute Off. Of Research Admin./ Tech.Dev. Synthetic polyvalent carbohydrates as components of microbicides
CN101313216A (zh) * 2005-09-22 2008-11-26 普洛茨股份有限公司 酵母突变体中产生的糖基化多肽及其使用方法
WO2008063982A2 (en) * 2006-11-13 2008-05-29 Procell Corp High mannose glycoprotein epitopes
CN101622010A (zh) * 2007-01-29 2010-01-06 联合治疗公司 糖免疫原
KR20120042716A (ko) 2009-02-23 2012-05-03 유나이티드 세러퓨틱스 코오포레이션 이미노슈가 및 바이러스성 질환을 치료하는 방법
WO2010099064A1 (en) * 2009-02-24 2010-09-02 United Therapeutics Corporation Iminosugars and methods of treating arenaviral infections
WO2010111687A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Academia Sinica Methods and compositions for immunization against virus
EP2440205B1 (en) 2009-06-12 2014-08-27 United Therapeutics Corporation Iminosugars for use in the treatment of bunyaviral and togaviral diseases
BR112012004676A2 (pt) * 2009-09-04 2019-09-24 United Therapeutics Corp método de tratar infecções orotomixovirais.
CN105748476A (zh) * 2009-09-04 2016-07-13 联合治疗公司 亚氨基糖以及治疗丝状病毒性疾病的方法
CN102625801B (zh) * 2009-09-04 2015-09-09 联合治疗公司 治疗痘病毒感染的方法
WO2011035205A2 (en) 2009-09-18 2011-03-24 Calmune Corporation Antibodies against candida, collections thereof and methods of use
CN102417515B (zh) * 2010-09-28 2014-03-19 河北大学 噻唑(嗪)烷酮并氮杂糖衍生物及合成方法和其在药物制剂中的应用
TWI537385B (zh) * 2010-11-04 2016-06-11 中央研究院 產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6069235A (en) * 1994-02-23 2000-05-30 Monsanto Company Method for carbohydrate engineering of glycoproteins
US6537785B1 (en) * 1999-09-14 2003-03-25 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods of treating lysosomal storage diseases
US6770468B1 (en) * 1999-09-14 2004-08-03 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway
US7138262B1 (en) * 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
US6413177B1 (en) * 2000-12-16 2002-07-02 Wilson Sporting Goods Co. Sports ball with floating cover
US6628135B2 (en) * 2001-09-18 2003-09-30 Sun Microsystems, Inc. Analog-based on-chip voltage sensor
US7232670B2 (en) * 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
US6800472B2 (en) * 2001-12-21 2004-10-05 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase
AU2003282821B2 (en) * 2002-10-11 2010-12-16 University Of Maryland, Baltimore Carbohydrate-based synthetic vaccines for HIV
WO2004050711A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Gp120 specific antigens, conjugates thereof, methods for their preparation and uses thereof
US20060094017A1 (en) * 2003-02-14 2006-05-04 Conley Anthony J Immunogens for hiv vaccine
CN101313216A (zh) * 2005-09-22 2008-11-26 普洛茨股份有限公司 酵母突变体中产生的糖基化多肽及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006099592A2 (en) 2006-09-21
CA2601797A1 (en) 2006-09-21
JP2008533175A (ja) 2008-08-21
US20060251680A1 (en) 2006-11-09
US20100183669A1 (en) 2010-07-22
WO2006099592A3 (en) 2007-12-21
EP2058004A1 (en) 2009-05-13
EP1863527A2 (en) 2007-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080056688A (ko) Ｈｉｖ－ｉ용 만노스 면역원
Seabright et al. Protein and glycan mimicry in HIV vaccine design
Behrens et al. Structural principles controlling HIV envelope glycosylation
Scanlan et al. The broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody 2G12 recognizes a cluster of α1→ 2 mannose residues on the outer face of gp120
Doores et al. Variable loop glycan dependency of the broad and potent HIV-1-neutralizing antibodies PG9 and PG16
Wang et al. Binding of high-mannose-type oligosaccharides and synthetic oligomannose clusters to human antibody 2G12: implications for HIV-1 vaccine design
EP1934605B1 (en) Glycosylated polypeptides produced in yeast mutants and methods of use thereof
Kong et al. Expression-system-dependent modulation of HIV-1 envelope glycoprotein antigenicity and immunogenicity
Abdel-Motal et al. Increased immunogenicity of human immunodeficiency virus gp120 engineered to express Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R epitopes
Go et al. Glycosylation site-specific analysis of clade C HIV-1 envelope proteins
Crooks et al. Enzyme digests eliminate nonfunctional Env from HIV-1 particle surfaces, leaving native Env trimers intact and viral infectivity unaffected
Luallen et al. An engineered Saccharomyces cerevisiae strain binds the broadly neutralizing human immunodeficiency virus type 1 antibody 2G12 and elicits mannose-specific gp120-binding antibodies
Shivatare et al. Unprecedented role of hybrid N-glycans as ligands for HIV-1 broadly neutralizing antibodies
Yang et al. HIV-1 virus-like particles produced by stably transfected Drosophila S2 cells: a desirable vaccine component
Hariharan et al. Glycosylation as a tool for rational vaccine design
Schoen et al. Impact of protein glycosylation on the design of viral vaccines
Zhang et al. Antibodies elicited by yeast glycoproteins recognize HIV-1 virions and potently neutralize virions with high mannose N-glycans
Liu et al. Altering the Specificity of the Antibody Response to HIV gp120 with a Glycoconjugate Antigen
Margolin et al. Augmenting glycosylation‐directed folding pathways enhances the fidelity of HIV Env immunogen production in plants
Zhao et al. Variability in the glycosylation patterns of gp120 proteins from different human immunodeficiency virus type 1 isolates expressed in different host cells
US20110045021A1 (en) Sugar immunogens
Seabright The impact of sequence diversity on the glycan shield of HIV-1 immunogens
US20230104050A1 (en) Inducing production of anti-oligomannose antibodies
D'Addabbo et al. Impact of Glycan Depletion, Glycan Debranching and Increased Glycan Charge on HIV-1 Neutralization Sensitivity and Immunogenicity
CN101351222A (zh) 针对hiv-1的甘露糖免疫原

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid