KR20080044909A - Pharmaceutical compositions for delivery of ribonucleic acid to a cell - Google Patents

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KR20080044909A
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쿤유안 쿠이
마이클 이. 주니어 휴스톤
리산 첸
사라 제이. 메이어
유칭 첸
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나스텍 파마수티컬 컴퍼니 인코포레이티드
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Abstract

A composition, method for causing uptake in animal cells of double stranded RNA (dsRNA) and reduction of a target mRNA and a use of a mixture for the production of a medicament for the treatment for Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-alpha) associated inflammatory condition(s) in an animal subject comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and a dsRNA, wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is amphipathic and comprises nucleic acid binding properties are described.

Description

세포 내로 리보핵산의 전달을 위한 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF RIBONUCLEIC ACID TO A CELL}Pharmaceutical composition for delivery of ribonucleic acid into cells {PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF RIBONUCLEIC ACID TO A CELL}

본 발명은 세포들 내로 리보핵산들을 전달하는 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 표적 유전자들의 발현을 변형하여 질병 상태 또는 질병 발생 소지와 같은 세포들의 표현형을 바꾸기 위하여 세포들 내로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드들을 전달하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to methods and compositions for delivering ribonucleic acids into cells. More specifically, the present invention relates to methods and compositions for delivering double-stranded polynucleotides into cells in order to alter the expression of target genes to alter the phenotype of cells such as disease state or disease predisposition.

동물 및 식물 세포들 내로의 리보핵산 전달은 오랫동안 분자 생물학 연구 및 개발의 중요한 목적이었다. 유전자 요법, 안티센스 요법 및 RNA 간섭(RNAi) 요법 분야들에서의 최근의 발전들은 세포들 내로 핵산들을 도입시키는 더 효율적인 수단의 개발에 대한 요구를 창출하였다.Delivery of ribonucleic acid into animal and plant cells has long been an important goal of molecular biology research and development. Recent developments in the fields of gene therapy, antisense therapy and RNA interference (RNAi) therapy have created the need for the development of more efficient means of introducing nucleic acids into cells.

대형 폴리뉴클레오티드 분자들을 세포들 내로 전달하기 위하여 다양한 플라스미드들 및 기타 핵산 "벡터들"이 개발되어 왔다. 통상적으로 이러한 벡터들은 과학적 또는 치료상으로 중요한 유전자를 발현하기 위하여 표적 세포들을 변형시킬 목적으로 손상되지 않은 유전자들을 포함하는 대형 DNA 분자들을 혼입시킨다.Various plasmids and other nucleic acid “vectors” have been developed for delivering large polynucleotide molecules into cells. Typically, these vectors incorporate large DNA molecules containing intact genes for the purpose of modifying target cells to express scientific or therapeutically important genes.

외생성(exogeneous) 핵산들이 세포들 내로 인공적으로 전달되는 공정은 일반적으로 형질감염(transfection)이라고 칭한다. 다양한 기법들과 물질들을 이용하여 외생성 원천으로부터 기능성 핵산을 흡수하도록 세포들을 형질감염할 수 있다. 가장 흔히 이용되는 형질감염 방법들은 인산 칼슘 형질감염 및 전기천공법이다. 바이러스-매개성 형질도입(transduction), 양이온 지질 또는 리포솜 전달 및 기계적 또는 생화학적 막 파괴/침입(예컨대, 세척제, 현미주입법(microinjection) 또는 입자 총을 이용함)를 표적으로 하는 수많은 방법들을 포함하여 외생성 DNA 또는 RNA 분자들의 전달을 위해 세포들을 형질도입하는 다양한 다른 방법들이 개발되었다.The process by which exogenous nucleic acids are artificially delivered into cells is commonly referred to as transfection. Various techniques and materials can be used to transfect cells to absorb functional nucleic acids from exogenous sources. The most commonly used transfection methods are calcium phosphate transfection and electroporation. Including numerous methods that target virus-mediated transduction, cationic lipid or liposome delivery, and mechanical or biochemical membrane disruption / invasion (eg, using washes, microinjection or particle guns). Various other methods have been developed for transducing cells for delivery of produced DNA or RNA molecules.

RNA 간섭은 표적된 메신저 RNA(mRNA)의 일 부분에 서열상 상동성으로 주로 dsRNA인 이중-가닥(ds) 폴리뉴클레오티드에 의해 개시되는 세포들에서의 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵의 공정이다. 세포들 내로 적절한 dsRNA를 도입하면 내생성, 동족 mRNA들(즉, 도입된 dsRNA와 실질적 서열 동일성을 공유하는 mRNA들)의 파괴로 이어진다. 상기 dsRNA 분자들은 길이가 19 내지 23 뉴클레오티드(nt)인 단-간섭 RNA들(short-interfering RNAs: siRNA들) 내로 다이서(dicer)로 불리는 RNA 가수분해효소 III 군 뉴클레아제(RNA들e III family nuclease)에 의해 분열된다. 이후 상기 siRNA들은 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex) 또는 "RISC"로 알려진 다성분 뉴클레아제 복합체로 혼합된다. 상기 RISC는 mRNA 기질들을 상기 siRNA와의 상동성을 통해 동정하며(identify), 상기 표적된 mRNA와의 결합 및 상기 표적된 mRNA를 파괴함으로써 유전자 발현의 침묵을 이루게 된다.RNA interference is a process of gene silencing following sequence-specific transcription in cells initiated by double-stranded (ds) polynucleotides that are primarily dsRNAs in sequence homology to a portion of the targeted messenger RNA (mRNA). Introducing the appropriate dsRNA into cells leads to disruption of endogenous, cognate mRNAs (ie, mRNAs that share substantial sequence identity with the introduced dsRNA). The dsRNA molecules are RNA hydrolase III group nucleases (RNAs) called dicers into short-interfering RNAs (siRNAs) of length 19 to 23 nucleotides (nt). family nuclease). The siRNAs are then mixed into an RNA-induced silencing complex or multicomponent nuclease complex known as "RISC". The RISC identifies mRNA substrates through homology with the siRNAs, resulting in silencing of gene expression by binding to the targeted mRNAs and disrupting the targeted mRNAs.

RNA 간섭은 식물 및 동물 세포들에서의 특이적 유전자들의 발현을 수정하는 유망한 기술로 떠오르고 있으므로, 내생성 유전자 발현의 변형에 의한 치료를 요하는 다양한 범위의 질병들 및 장해들을 치료하기 위한 유용한 도구들을 제공할 것으 로 기대된다.Since RNA interference has emerged as a promising technique for modifying the expression of specific genes in plant and animal cells, it is useful to treat a wide range of diseases and disorders that require treatment by modification of endogenous gene expression. It is expected to provide.

특히, 핵산들을 세포들 내로 전달하는 기존 기법들은 낮은 효율 및/또는 전달 시약들의 강한 독성으로 인하여 제한받는다는 사실을 고려해 본다면, 업계에서는 siRNA들 및 기타 소저해성 핵산들(siNA들)을 세포들 내로 전달하는 더 나은 도구들 및 방법들에 대한 오래 지속된 요구가 상존한다. 표적 세포들의 표현형 또는 질병 상태를 변형시킬 방식으로 유전자 발현의 조절을 매개하기 위하여 선택된 세포들, 조직들, 또는 소실들(compartments)에 siNA들를 유효량으로, 활성 및 지속성 상태로 비독성 전달 운반체들을 사용하여 전달시킬 개선된 방법들 및 제형들에 대한 관련된 요구들이 존재한다.In particular, given the fact that existing techniques for delivering nucleic acids into cells are limited due to low efficiency and / or strong toxicity of delivery reagents, the industry delivers siRNAs and other inhibitory nucleic acids (siNAs) into cells. There is a long lasting need for better tools and methods to do this. Use of nontoxic delivery vehicles in an active and sustained state with effective amounts of siNAs in selected cells, tissues, or compartments to mediate the regulation of gene expression in a manner that will modify the phenotype or disease state of the target cells. There is a related need for improved methods and formulations for delivery.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명의 일 태양은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성(amphiphathic)이고 핵산 결합 성질을 포함한다. 관련된 일 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 폴리(라이신(Lys), 트립토판(Tryp)) 4:1 분자량(MW) 20,000 내지 50,000, 폴리(오르니틴(Orn), 트립토판(Trp)) 4:1 분자량 20,000 내지 50,000, 멜리틴(Mellitin), 히스톤(Histone) H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4, 서열 번호: 27 내지 31, 35 내지 42, 45, 47, 50 내지 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 내지 87, 89 내지 92, 94 내지 108, 164 내지 178 및 180 내지 186으로 구성된 군(group)으로부터 선택된 서열의 전부 또는 일부를 가진다.One aspect of the invention is a composition comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA), wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is amphiphilic and includes nucleic acid binding properties. In one related embodiment, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide comprises about 5 to about 40 amino acids and comprises poly (lysine (Lys), tryptophan (Tryp)) 4: 1 molecular weight (MW) 20,000 to 50,000, poly ( Ornithine (Orn), Tryptophan (Trp)) 4: 1 molecular weight 20,000 to 50,000, melittin, histone H1, histone H3 and histone H4, SEQ ID NOs: 27 to 31, 35 to 42, 45, All of the sequences selected from the group consisting of 47, 50-59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78-87, 89-92, 94-108, 164-178 and 180-186 Or have some.

다른 실시예에서, 상기 조성물은 동물 세포 내로 상기 dsRNA의 흡수를 유발한다. 다른 실시예에서, 상기 동물 세포는 포유류 세포이다. 다른 실시예에서, 상기 조성물은 동물에게 투여된다. 관련된 일 실시예에서, 상기 동물은 포유류이다. 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 아세틸화된다(acetylated). 관련된 일 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 페질화된다(pegylated). 또 다른 실시예에서, 상기 dsRNA는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 유전자의 일 부분에 상보적인 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 소간섭(small interfering) 리보핵산(siRNA)이다. 관련된 일 실시예에서, 상기 dsRNA는 서열 번호: 109 내지 163 및 187로 구성된 군으로부터 선택된 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 siRNA이다. 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 혼합되거나(admixed), 복합체를 형성하거나(complexed), 또는 접합체를 형성한다(conjugated). 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 결합한다. 또 다른 실시예에서, 상기 조성물들 중 임의의 것은 양이온 지질을 더 포함한다. 관련된 일 실시예에서, 상기 양이온 지질은 In another embodiment, the composition causes uptake of the dsRNA into animal cells. In another embodiment, the animal cell is a mammalian cell. In another embodiment, the composition is administered to the animal. In a related embodiment, the animal is a mammal. In another embodiment, the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is acetylated. In one related embodiment, the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is pegylated. In another embodiment, the dsRNA is small interfering ribonucleic acid (siRNA) consisting of about 10 to about 40 base pair sequences complementary to a portion of the tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene. In one related embodiment, the dsRNA is an siRNA consisting of about 10 to about 40 base pair sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 to 163 and 187. In another embodiment, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is admixed with, complexed with, or conjugated with the dsRNA. In another embodiment, the polynucleotide delivery-promoting polypeptide binds to the dsRNA. In yet another embodiment, any of the above compositions further comprises a cationic lipid. In a related embodiment, the cationic lipid is

N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판(1,2-bis(oleoyloxy)-3-3-(trimethylammonium)propane), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트(2,3-dioleyloxy-N- [2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetate), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드(1,3-dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid), 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드(5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide), 테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민(tetramethyltetrapalmitoyl spermine), 테트라메틸테트라올레일 스퍼민(tetramethyltetraoleyl spermine), 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민(tetramethyltetralauryl spermine), 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민(tetramethyltetramyristyl spermine) 및 테트라메틸디올레일 스퍼민(tetramethyldioleyl spermine), DOTMA (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드), DDAB (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드). 다가(Polyvalent) 양이온 지질들, 리포스퍼민들(lipospermines), DOSPA (2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트), DOSPER (1,3-디올릴옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드), 디- 및 테트라-알킬-테트라-메틸 스퍼민들(di- and tetra-alkyl-tetra- methyl spermines), TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스퍼민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스퍼민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민), TMDOS (테트라메틸디올레일 스퍼민), DOGS (디옥타데실-아미도글리실스퍼민(dioctadecyl-amidoglycylspermine)(TRANSFECTAM®), 비-양이온 지질들과 결합된 양이온 지질들, DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine)), DPhPE(디피타노일포스파티딜에탄올아민(diphytanoylphosphatidylethanolamine)) 또는 콜레스테롤, DOSPA과 DOPE의 3:1 (w/w) 혼합물로 이루어진 양이온 지질 조성물, 및 DOTMA과 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride ), 1,2-bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) propane (1,2-bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) propane), 1,2-dimyristyloxy Propyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide), dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [2 (spermineca 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetate, 1 , 3-dioleoyloxy-2- (6-carboxysperyl) -propylamide (1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxyspermyl) -propylamid), 5-carboxysperylglycine dioctadecylamide (5 -carboxyspermylglycine dioctadecylamide), tetramethyltetrapalmitoyl Tetramethyltetrapalmitoyl spermine, tetramethyltetraoleyl spermine, tetramethyltetralauryl spermine, tetramethyltetramyristyl spermine and tetramethyldioletramethyl spermine (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleoyloxy) -3,3- (trimethylammonium ) Propane), DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide), DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide). Polyvalent Cationic Lipids, Lipospermines, DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N- [2 (Sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium Trifluoroacetate), DOSPER (1,3-diolyloxy-2- (6-carboxyspermil) -propylamide), di- and tetra-alkyl-tetra-methyl spermines (di- and tetra-alkyl-tetra methyl spermines), TMTPS (tetramethyltetrapalmitoyl spermine), TMTOS (tetramethyltetraoleyl spermine), TMTLS (tetramethyltetralauryl spermine), TMTMS (tetramethyltetramyristyl spermine), TMDOS (tetramethyldiol Rail spermine), DOGS (dioctadecyl-amidoglycylspermine) (TRANSFECTAM®), cationic lipids combined with non-cationic lipids, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DPhPE (diphytanoylphosphatidylethanolamine) or Reseuterol, DOSPA and DOPE in 3: is selected from the group consisting of 1 (w / w) mixture: 1 (w / w) mixture of the cationic lipid composition consisting of DOTMA and DOPE and one of the.

본 발명의 다른 태양에서 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 포함하는 혼합물로 동물 세포들의 배양을 포함하는 동물 세포 내로 dsRNA의 흡수를 유발하는 방법이 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 성질을 포함한다.In another aspect of the invention there is a method of causing uptake of dsRNA into an animal cell comprising a culture of animal cells with a mixture comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA), the polynucleotide delivery- Enhancing polypeptides are amphiphilic and include nucleic acid binding properties.

본 발명의 다른 태양에서 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 포함하는 혼합물로 동물 세포의 배양을 포함하는 동물 세포 내의 표적 유전자의 표현을 변형시키는 방법이 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 성질을 포함하며, 상기 dsRNA가 상기 표적 유전자의 영역에 상보적이다.In another aspect of the invention there is a method of modifying the expression of a target gene in an animal cell comprising a culture of the animal cell with a mixture comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA), said polynucleotide delivery -Enhancing polypeptides are amphiphilic and include nucleic acid binding properties, wherein the dsRNA is complementary to the region of the target gene.

관련된 일 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 동물 세포가 포유류 세포인 방법이 있다.In one related embodiment, there is a method in any of the above methods wherein the animal cell is a mammalian cell.

본 발명의 다른 태양에서 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)의 혼합물을 동물 피검물에 투여하는 것을 포함하는 동물 피검물의 표현형을 변경하는 방법이 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 성질을 포함하며, 상기 dsRNA는 상기 피검물 내의 표적 유전자의 영역에 상보적이다. 관련된 일 실시예에서, 상기 동물은 포유류일 수 있다.In another aspect of the invention there is a method of altering the phenotype of an animal specimen comprising administering to the animal specimen a mixture of a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and a double stranded ribonucleic acid (dsRNA), said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide Is amphiphilic and includes nucleic acid binding properties, wherein the dsRNA is complementary to the region of the target gene in the specimen. In one related embodiment, the animal may be a mammal.

다른 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 폴리(라이신, 트립토판) 4:1 분자량(MW) 20,000 내지 50,000, 폴리(오르니틴, 트립토판) 4:1 분자량 20,000 내지 50,000, 멜리틴, 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4, 서열 번호: 27 내지 31, 35 내지 42, 45, 47, 50 내지 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 내지 87, 89 내지 92, 94 내지 108, 164 내지 178 및 180 내지 186으로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 전부 또는 일부를 가지는 방법이 있다. 관련된 일 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 아세틸화되는 방법이 있다. 관련된 다른 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 페질화되는 방법이 있다. 다른 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 dsRNA는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 유전자의 일 부분에 상보적인 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 소간섭 리보핵산(siRNA)인 방법이 있다. 관련된 일 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 dsRNA는 서열 번호: 109 내지 163 및 187로 구성된 군으로부터 선택된 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 siRNA인 방법이 있다. 다른 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA에 혼합, 복합되거나 접합되는 방법이 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 결합하는 방법이 있다. 다른 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서, 양이온 지질을 더 포함하는 방법이 있다. 관련된 일 실시예에서, 상기 방법들 중 임의의 것에서 상기 양이온 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판(1,2-bis(oleoyloxy)-3,3-(trimethylammonium)propane), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트(2,3-dioleyloxy-N- [2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetate), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드(1,3-dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid), 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드(5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide), 테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민(tetramethyltetrapalmitoyl spermine), 테트라메틸테트라올레일 스퍼민(tetramethyltetraoleyl spermine), 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민(tetramethyltetralauryl spermine), 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민(tetramethyltetramyristyl spermine) 및 테트라메틸디올레일 스퍼민(tetramethyldioleyl spermine), DOTMA (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드), DDAB (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드). 다가(Polyvalent) 양이온 지질들, 리포스퍼민들(lipospermines), DOSPA (2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트), DOSPER (1,3-디올릴옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드), 디- 및 테트라-알킬-테트라-메틸 스퍼민들(di- and tetra-alkyl-tetra- methyl spermines), TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스퍼민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스퍼민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민), TMDOS (테트라메틸디올레일 스퍼민), DOGS (디옥타데실-아미도글리실스퍼민(dioctadecyl-amidoglycylspermine)(TRANSFECTAM®), 비-양이온 지질들과 결합된 양이온 지질들, DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine)), DPhPE(디피타노일포스파티딜에탄올아민(diphytanoylphosphatidylethanolamine)) 또는 콜레스테롤, 및 DOSPA과 DOPE의 3:1 (w/w) 혼합물로 이루어진 양이온 지질 조성물, 및 DOTMA과 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법이 있다.In another embodiment, the polynucleotide delivery-promoting polypeptide in any of the above methods comprises about 5 to about 40 amino acids and comprises a poly (lysine, tryptophan) 4: 1 molecular weight (MW) 20,000 to 50,000, poly ( Ornithine, tryptophan) 4: 1 molecular weight 20,000 to 50,000, melittin, histone H1, histone H3 and histone H4, SEQ ID NOs: 27 to 31, 35 to 42, 45, 47, 50 to 59, 62, 63, 67, There are methods having all or part of a sequence selected from the group consisting of 68, 73, 74, 76, 78 to 87, 89 to 92, 94 to 108, 164 to 178 and 180 to 186. In one related embodiment, there is a method in any of the above methods wherein the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is acetylated. In another related embodiment, in any of the above methods, there is a method in which the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is pegylated. In another embodiment, the dsRNA in any of the above methods is a small interfering ribonucleic acid (siRNA) consisting of about 10 to about 40 base pair sequences complementary to a portion of a tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene There is a way. In one related embodiment, there is a method in any of the above methods wherein the dsRNA is an siRNA consisting of about 10 to about 40 base pair sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 to 163 and 187. In another embodiment, in any of the above methods, there is a method in which the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is mixed, complexed or conjugated to the dsRNA. In another embodiment, there is a method in any of the above methods wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide binds to the dsRNA. In another embodiment, in any of the above methods, there is a method further comprising a cationic lipid. In one related embodiment, in any of the above methods, the cationic lipid is N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (N- [1- ( 2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), 1,2-bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) propane (1,2-bis (oleoyloxy) -3 , 3- (trimethylammonium) propane), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide), dimethyldioctadecylammonium bromide , 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium trifluoroacetate (2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido ) ethyl] -N, N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetate), 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxycisyl) -propylamide (1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxyspermyl ) -propylamid), 5-carboxyspermilglycine di 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide, tetramethyltetrapalmitoyl spermine, tetramethyltetraoleyl spermine, tetramethyltetralauryl spermine, tetramethyltetramyris tetramethyltetramyristyl spermine and tetramethyldioleyl spermine, DOTMA (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2 -Bis (oleoyloxy) -3,3- (trimethylammonium) propane), DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide), DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide) . Polyvalent Cationic Lipids, Lipospermines, DOSPA (2,3-Dioleyloxy-N- [2 (Sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium Trifluoroacetate), DOSPER (1,3-diolyloxy-2- (6-carboxyspermil) -propylamide), di- and tetra-alkyl-tetra-methyl spermines (di- and tetra-alkyl-tetra methyl spermines), TMTPS (tetramethyltetrapalmitoyl spermine), TMTOS (tetramethyltetraoleyl spermine), TMTLS (tetramethyltetralauryl spermine), TMTMS (tetramethyltetramyristyl spermine), TMDOS (tetramethyldiol Rail spermine), DOGS (dioctadecyl-amidoglycylspermine) (TRANSFECTAM®), cationic lipids combined with non-cationic lipids, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DPhPE (diphytanoylphosphatidylethanolamine) or A method selected from the group consisting of: 1 (w / w) mixture reseuterol, and DOSPA and DOPE in 3: 1 (w / w) cationic lipid composition comprising a mixture, and 1 of DOTMA and DOPE.

본 발명의 다른 태양은 동물 피검물 내에서 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 관련 염증 질환(들)의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)를 포함하는 혼합물의 사용에 관한 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 성질을 포함하며, 상기 약제는 TNF-α RNA 수준들을 감소시켜 TNF-α 관련 염증 질환(들)의 하나 이상의 증상(들)의 발병 또는 심화되는 것을 방지하거나 감소시킬 수 있는 혼합물의 사용에 관한 것이다. 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 폴리(라이신, 트립토판) 4:1 분자량(MW) 20,000 내지 50,000, 폴리(오르니틴, 트립토판) 4:1 분자량 20,000 내지 50,000, 멜리틴, 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4, 서열 번호: 27 내지 31, 35 내지 42, 45, 47, 50 내지 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 내지 87, 89 내지 92, 94 내지 108, 164 내지 178 및 180 내지 186으로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 전부 또는 일부를 가진다. 관련된 일 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 아세틸화된다. 관련된 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 페질화된다. 다른 실시예에서, 상기 dsRNA는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 유전자의 일 부분에 상보적인 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열을 구성하는 소간섭 리보핵산(siRNA)이다. 관련된 일 실시예에서, 상기 dsRNA는 서열 번호: 109 내지 163 및 187로 구성된 군으로부터 선택된 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 siRNA이다. 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 혼합되거나, 복합체를 형성하거나, 또는 접합체를 형성한다. 다른 실시예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 결합한다. 다른 실시예에서, 상기 피검물은 포유류이다.Another aspect of the invention is a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for the manufacture of a medicament for the treatment of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) related inflammatory disease (s) in an animal specimen. Wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is amphiphilic and includes nucleic acid binding properties, wherein the medicament reduces TNF-α RNA levels to prevent TNF-α related inflammatory disease (s). It relates to the use of a mixture that can prevent or reduce the onset or intensification of one or more symptom (s). In another embodiment, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide comprises about 5 to about 40 amino acids and comprises poly (lysine, tryptophan) 4: 1 molecular weight (MW) 20,000 to 50,000, poly (ornithine, tryptophan) 4: 1 molecular weight 20,000 to 50,000, melittin, histone H1, histone H3 and histone H4, SEQ ID NOs: 27 to 31, 35 to 42, 45, 47, 50 to 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76 , 78 to 87, 89 to 92, 94 to 108, 164 to 178 and 180 to 186 have all or part of a sequence selected from the group consisting of. In one related embodiment, the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is acetylated. In another related embodiment, the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is phenylated. In another embodiment, the dsRNA is small interfering ribonucleic acid (siRNA) that comprises about 10 to about 40 base pair sequences complementary to a portion of the tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene. In one related embodiment, the dsRNA is an siRNA consisting of about 10 to about 40 base pair sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 to 163 and 187. In another embodiment, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is mixed with, complexed with, or conjugated with the dsRNA. In another embodiment, the polynucleotide delivery-promoting polypeptide binds to the dsRNA. In another embodiment, the subject is a mammal.

도 1은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드(서열 번호: 35)와 복합체 또는 접합체를 형성한 siRNA들의 펩티드-매개성 흡수율 및 siRNA들의 세포 생존도(cell viability)에 미치는 영향을 도시한다. 세포 흡수율 및 세포 생존도는 퍼센트로 표시된다.FIG. 1 shows the effect on the peptide-mediated uptake of siRNAs and the cell viability of siRNAs in complex or conjugated form with the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide (SEQ ID NO: 35) of the present invention. Cell uptake and cell viability are expressed in percent.

도 2는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드(서열 번호: 35)와 복합체 또는 접합체를 형성한 siRNA들의 펩티드-매개성 흡수율을 더 도시한다. 세포 흡수율은 평균 형광 세기(MFI)로 표시된다.Figure 2 further illustrates the peptide-mediated uptake of siRNAs that form a complex or conjugate with the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide (SEQ ID NO: 35) of the present invention. Cell uptake is expressed in mean fluorescence intensity (MFI).

도 3은 인간 단구세포들(monocytes) 내에서 몇 개의 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들로 siRNA들의 펩티드-매개성 흡수율을 도시한다.3 shows the peptide-mediated uptake of siRNAs with several different polynucleotide delivery-enhancing polypeptides in human monocytes.

도 4는 몇 개의 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들과 복합체를 형성한 siRNA들에 노출시킨 후에 인간 단구세포 생존도에 미치는 효과를 도시한다.4 shows the effect on human monocyte viability after exposure to siRNAs complexed with several other polynucleotide delivery-enhancing polypeptides.

도 5는 siRNA/펩티드가 주입된 쥐들은 라미케이드(Ramicade)-처리된 피검물들의 RA 진행(progression)과 비교하여 지연된 RA 진행을 가진다는 것을 보여준다. RA 진행은 포 스코어링(paw scoring) 지수에 의해 측정되었다.FIG. 5 shows that mice injected with siRNA / peptide have a delayed RA progression compared to RA progression of Ramicade-treated specimens. RA progression was measured by paw scoring index.

도 6은 본 발명의 PN73 합리적으로 설계된(rationally-designed) 유도성 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 대해 쥐의 꼬리 섬유아세포 세포들(mouse tail fibroblast cells) 내에서의 흡수 효율 및 생존도 연구들의 결과들 을 제공한다.FIG. 6 shows the results of absorption efficiency and viability studies in mouse tail fibroblast cells for the PN73 rational-designed inducible polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the present invention. To provide them.

도 7은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 복합체를 형성하는 siRNA들의 펩티드-매개성 흡수는 siRNA들의 리포펙타민(lipofectamine) 매개성 전달과 비교하여 인터페론 반응을 도출하지 않는다는 것을 도시한다. 도 7A는 리포펙타민과 복합체를 형성한 siRNA이고, 도 7B는 PN73(1:5)과 복합체를 형성한 siRNA이다.FIG. 7 shows that peptide-mediated uptake of siRNAs complexed with the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the present invention does not elicit an interferon response compared to lipofectamine mediated delivery of siRNAs. Fig. 7A shows siRNA complexed with lipofectamine, and Fig. 7B shows siRNA complexed with PN73 (1: 5).

도 8은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 접합체를 형성한 siRNA들은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 복합체를 형성한 siRNA들 보다 생체 외에서 더 높은 넉 다운(knockdown) 활성을 가진다는 것을 도시한다.FIG. 8 shows that siRNAs conjugated with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides have higher knockdown activity in vitro than siRNAs complexed with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides.

도 9는 콜레스테롤에 접합된 siRNA와 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 미접합된 siNA들과의 세포 흡수율의 비교를 도시한다.FIG. 9 shows a comparison of cellular uptake rate with siRNA conjugated to cholesterol and siNAs unconjugated to polynucleotide delivery-enhancing polypeptide.

도 10은 콜레스테롤에 접합된 siRNA들의 세포 흡수의 혈청 억제가 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드로 향상될 수 있음을 도시한다.10 shows that serum inhibition of cellular uptake of siRNAs conjugated to cholesterol can be enhanced with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 결합한 짧은 간섭 핵산(siNA) 또는 그 전구체를 이용하는 신규한 조성물들 및 방법들을 제공하여 이러한 요구들을 만족시키고 다른 목적들 및 장점들을 충족시킨다. 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 siNA들 및 그 전구체들을 포함하여, 폴리뉴클레오티드들의 세포간 전달 또는 흡수를 향상시키는 능력으로 인하여 선택된 천연 또는 인공 폴리펩티드이다.The present invention provides novel compositions and methods using short interfering nucleic acids (siNAs) or precursors thereof in combination with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides to meet these needs and to meet other objects and advantages. The polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is a natural or artificial polypeptide selected because of its ability to enhance intercellular delivery or uptake of polynucleotides, including siNAs and their precursors.

본 발명의 신규한 조성물들 내에서, 상기 siNA를 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 혼합, 복합하거나 또는 접합하여 있는 그대로의(naked) siNA(즉, 전달-증진 폴리펩티드가 존재하지 않는 siNA)와 표적 세포들을 접촉시켜 얻게 되는 전달과 비교하여 siNA의 세포간 전달을 향상시키는 조성물을 형성할 수 있다.In the novel compositions of the invention, the siNA is mixed, complexed or conjugated with a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide (ie, siNA without a delivery-enhancing polypeptide) and a target cell. To form a composition that enhances intercellular delivery of siNAs as compared to the delivery obtained by contacting them.

본 발명의 몇몇 실시예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 히스톤(histone) 단백질, 또는 폴리펩티드 또는 펩티드 단편, 유도체, 유사체, 또는 그 접합체이다. 이러한 실시예들 내에서, 상기 siNA는 하나 이상의 전-길이(full length) 히스톤 단백질들 또는 적어도 부분적으로는 히스톤 단백질의 일부 서열에 해당하는 폴리펩티드들과 혼합체, 복합체 또는 접합체를 형성한다. 하나 이상의 히스톤의 예로는, 히스톤 H1, 히스톤 H2A, 히스톤 H2B, 히스톤 H3 또는 히스톤 H4, 또는 히스톤 단백질의 적어도 일부의 서열, 통상적으로 적어도 5 내지 10 개 또는 10 내지 20 개의 천연 히스톤 단백질의 인접 잔기를 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 유도체가 있다. 더 상세한 실시예들에서, 상기 siRNA/히스톤 혼합물, 복합체 또는 접합체는 양친매성(amphipathic) 혼합물들이 실질적으로 존재하지 않는다. 다른 상세한 실시예들에서, 상기 히스톤 단백질 또는 폴리펩티드와 혼합체, 복합체 또는 접합체를 형성하는 siNA는 예를 들어, 30 개 이하의 뉴클레오티드들을 가지는 이중-가닥 RNA와 같은 이중-가닥 RNA를 포함할 것이고, 짧은 간섭 RNA(siRNA)이다. 대표적인 실시예들에서, 히스톤 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 하기에 설명된 PN73으로 지정된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 에 의하여 대표되는 바와 같이 히스톤 H2B의 단편을 포함한다. 또 다른 상세한 실 시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 페질화되어(pegylated) 특히, 생체 내 투여의 맥락에서 안정성 및/또는 효율을 개선시킬 수 있다.In some embodiments of the invention, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is a histone protein, or polypeptide or peptide fragment, derivative, analog, or conjugate thereof. Within these embodiments, the siNA forms a mixture, complex or conjugate with one or more full length histone proteins or polypeptides corresponding at least in part to some sequence of histone protein. Examples of one or more histones include histone H1, histone H2A, histone H2B, histone H3 or histone H4, or sequences of at least some of histone proteins, typically at least 5 to 10 or 10 to 20 contiguous residues of natural histone proteins. Including polypeptide fragments or derivatives. In more detailed embodiments, the siRNA / histone mixture, complex or conjugate is substantially free of amphipathic mixtures. In other detailed embodiments, the siNA forming a mixture, complex or conjugate with the histone protein or polypeptide will comprise a double-stranded RNA such as, for example, a double-stranded RNA having up to 30 nucleotides, and short Interfering RNA (siRNA). In exemplary embodiments, the histone polynucleotide delivery-enhancing polypeptide comprises a fragment of histone H2B as represented by the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide designated PN73 described below. In another detailed embodiment, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide can be pegylated, particularly to improve stability and / or efficiency in the context of in vivo administration.

본 발명의 추가적인 실시예들 내에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성 아미노산 서열을 포함하도록 선택되거나 합리적으로 설계된다. 예를 들어, 소수성 서열 도메인 또는 모티프(motif)를 형성하는 복수의 비극성 또는 소수성 아미노산 잔기들을 포함하거나 대전된(charged) 서열 도메인 또는 모티프를 형성하는 복수의 대전된 아미노산 잔기들에 연결되어 양친매성 펩티드들 배출하는 유용한 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 선택할 수 있다.Within further embodiments of the invention, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is selected or reasonably designed to include an amphipathic amino acid sequence. For example, an amphiphilic peptide comprising a plurality of nonpolar or hydrophobic amino acid residues that form a hydrophobic sequence domain or motif or linked to a plurality of charged amino acid residues that form a charged sequence domain or motif. Useful polynucleotide delivery-enhancing polypeptides can be selected.

다른 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain) 또는 모티프 및 유전자 융합성(fusogenic) 펩티드 도메인 또는 모티프를 포함하도록 선택된다. 단백질 전달 도메인은 세포들의 막으로 삽입하고 바람직하게는 세포들의 막을 통과할 수 있는 펩티드 서열이다. 유전자융합성 펩티드는 낮은 pH에서 향상될 수 있는 예를 들어, 원형질막 또는 엔도솜(endosome)을 둘러싸는 막과 같은 지질막을 불안정하게 하는 펩티드이다. 대표적인 유전자융합성 도메인들 또는 모티프들은 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자4(FGF4)와 같이 광범위하게 다양한 바이러스성 융합 단백질들 및 다른 단백질들에서 발견된다.In other embodiments, the polynucleotide transfer-enhancing polypeptide is selected to include a protein transduction domain or motif and a fusogenic peptide domain or motif. The protein delivery domain is a peptide sequence that can insert into the membrane of cells and preferably pass through the membrane of cells. Gene fusion peptides are peptides that destabilize lipid membranes such as, for example, plasma membranes or membranes that surround endosomes that can be enhanced at low pH. Representative gene fusion domains or motifs are found in a wide variety of viral fusion proteins and other proteins such as, for example, fibroblast growth factor 4 (FGF4).

본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 합리적으로 설계하기 위하여, 단백질 전달 도메인을 핵산을 원형질막을 통하여 세포 내로 용이하게 들어가게 하는 모티프로서 이용한다. 몇몇 실시예들에서, 수송된 핵산은 엔도솜 내에서 캡슐화될 것이다. 엔도솜들의 내부는 pH가 낮아서 유전자융합성 펩티드 모티프로 하여금 엔도솜의 막을 불안정하게 한다. 엔도솜막의 불안정 및 파열은 siNA가 RISC 복합체와 결합되어 있고 그 표적 mRNA쪽으로 향할 수 있는 세포질 내로 siNA를 방출하게 된다.In order to reasonably design the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the present invention, the protein delivery domain is used as a motif to easily enter nucleic acid into the cell through the plasma membrane. In some embodiments, the transported nucleic acid will be encapsulated in an endosome. The interior of the endosomes is low in pH, causing the fusion peptide motif to destabilize the membrane of the endosome. Instability and rupture of the endosome membrane causes the siNA to release into the cytoplasm where it is bound to the RISC complex and can be directed towards its target mRNA.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들 내로 선택적 혼입을 위한 단백질 전달 도메인들의 예는 하기를 포함한다:Examples of protein delivery domains for selective incorporation into polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention include:

1. TAT 단백질 전달 도메인(PTD) (서열 번호: 1 ) KRRQRRR;1. TAT protein transfer domain (PTD) (SEQ ID NO: 1) KRRQRRR;

2. 침입(Penetratin) PTD (서열 번호: 2) RQIKIWFQNRRMKWKK;2. Penetratin PTD (SEQ ID NO: 2) RQIKIWFQNRRMKWKK;

3. VP22 PTD (서열 번호: 3) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;3. VP22 PTD (SEQ ID NO: 3) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;

4. 카포시(Kaposi) FGF 신호 서열들 (서열 번호: 4) AAVALLPAVLLALLAP, 및4. Kaposi FGF signal sequences (SEQ ID NO: 4) AAVALLPAVLLALLAP, and

서열 번호: 5) AAVLLPVLLPVLLAAP;   SEQ ID NO: 5) AAVLLPVLLPVLLAAP;

5. 인간 β3 인테그린(integrin) 신호 서열(서열 번호: 6) VTVLALGALAGVGVG;5. Human β3 integrin signal sequence (SEQ ID NO: 6) VTVLALGALAGVGVG;

6. gp41 융합(fusion) 서열 (서열 번호: 7) GALFLGWLGAAGSTMGA;6. gp41 fusion sequence (SEQ ID NO: 7) GALFLGWLGAAGSTMGA;

7. 카이만 크로크딜러스(Caiman crocodylus) Ig(v) 경사슬 (서열 번호: 8)7. Caiman crocodylus ) Ig (v) light chain (SEQ ID NO: 8)

MGLGLHLLVLAAALQGA;   MGLGLHLLVLAAALQGA;

8. hCT-유도성 펩티드(서열 번호: 9) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;8. hCT-derived peptide (SEQ ID NO: 9) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;

9. 트란스포르탄(Transportan)(서열 번호: 10) GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;9. Transportan (SEQ ID NO: 10) GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;

10. 롤리고머(Loligomer)(서열 번호: 11) TPPKKKRKVEDPKKKK;10. Loligomer (SEQ ID NO: 11) TPPKKKRKVEDPKKKK;

11. 아르기닌 펩티드(Arginine peptide)(서열 번호: 12) RRRRRRR; 및11. Arginine peptide (SEQ ID NO: 12) RRRRRRR; And

12. 양친매성 모델 펩티드(Amphiphilic model peptide)(서열 번호: 13)12. Amphiphilic model peptide (SEQ ID NO: 13)

KLALKLALKALKAALKLA.    KLALKLALKALKAALKLA.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들 내로 선택적 혼입을 위한 바이러스 융합 펩티드들의 유전자 융합성 도메인의 예들은 하기를 포함한다:Examples of gene fusion domains of viral fusion peptides for selective incorporation into polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention include:

1. 인플루엔자 HA2(서열 번호: 14) GLFGAIAGFIENGWEG;1. Influenza HA2 (SEQ ID NO: 14) GLFGAIAGFIENGWEG;

2. 센다이(Sendai) Fl(서열 번호: 15) FFGAVIGTIALGVATA;2. Sendai Fl (SEQ ID NO: 15) FFGAVIGTIALGVATA;

3. 호흡기 합포체 바이러스 Fl(서열 번호: 16) FLGFLLGVGSAIASGV;3. Respiratory syncytial virus Fl (SEQ ID NO: 16) FLGFLLGVGSAIASGV;

4. HIV gp41(서열 번호: 17) GVFVLGFLGFLATAGS; 및4. HIV gp41 (SEQ ID NO: 17) GVFVLGFLGFLATAGS; And

5. 에볼라 GP2(서열 번호: 18) GAAIGLAWIPYFGPAA.5. Ebola GP2 (SEQ ID NO: 18) GAAIGLAWIPYFGPAA.

본 발명의 또 다른 실시예들 내에서, 본 발명의 방법들 및 조성물들 내의 폴리펩티드-siNA 복합체 형성을 용이하게 하고/하거나 siNA들의 전달을 향상시키는 DNA-결합 도메인 또는 모티프를 혼입하는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들이 제공된다. 이러한 맥락에서 대표적인 DNA 결합 도메인들은 하기 표 1에서 확인된 DNA-결합 조절 단백질들 및 기타 단백질들에 대하여 설명된 바와 같은 다양한 "징크 핑거(zinc finger)" 도메인들을 포함한다(예, Simpson, et al., J. Biol . Chem. 278:28011-28018, 2003).Within still other embodiments of the present invention, polynucleotide delivery-incorporating DNA-binding domains or motifs that facilitate the formation of polypeptide-siNA complexes and / or enhance the delivery of siNAs in the methods and compositions of the present invention. Enhancing polypeptides are provided. Representative DNA binding domains in this context include various “zinc finger” domains as described for the DNA-binding regulatory proteins and other proteins identified in Table 1 below (eg, Simpson, et al. , J. Biol . Chem . 278: 28011-28018, 2003).

하기 표 1은 다양한 DNA-결합 단백질들의 대표적인 징크 핑거 모티프들에 관한 것이다:Table 1 below relates to representative zinc finger motifs of various DNA-binding proteins:

Figure 112008025338980-PCT00001
Figure 112008025338980-PCT00001

*상기 표는 본 발명에 따른 추가적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 선택하고 설계하기 위하여 사용될 수 있는 C-x(2,4)-C-x(12)-H-x(3)-H 모티프 패턴(서열 번호: 188)로 특징되는 이중 나선 DNA 결합에 대한 보존적인 징크 핑거 모티프를 실증한다.The table above shows a Cx (2,4) -Cx (12) -Hx (3) -H motif pattern (SEQ ID NO: 188) that can be used to select and design additional polynucleotide delivery-enhancing polypeptides according to the present invention. Demonstrate the conservative zinc finger motif for double helix DNA binding characterized by.

**표 1에서 Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, DrosBtd, DrosSp, CeT22C8.5 및 Y4pB1A.4로 도시된 서열들은 여기에 각각 서열 번호: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로 지정되어 있다.** The sequences shown in Table 1 as Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, DrosBtd, DrosSp, CeT22C8.5 and Y4pB1A.4 are shown here as SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 and 26, respectively. It is designated as.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 제작에 유용한 다른 DNA 결합 도메인들은 예를 들어, HIV Tat 단백질 서열의 일부들(하기의 예들 참조)을 포함한다.Other DNA binding domains useful for the fabrication of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention include, for example, portions of the HIV Tat protein sequence (see examples below).

이하에 설명된 본 발명의 대표적인 실시예들 내에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 siNA들을 표적 세포들 내로의 향상된 전달을 매개하는 데 효과적인 선행하는 구조적 요소들, 도메인들 또는 모티프들 중 임의의 것을 단일 폴리펩티드로 결합하여 합리적으로 설계되고 제작될 수 있다. 예를 들어, TAT 폴리펩티드의 단백질 전달 도메인을 HA2라고 명명된 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 단백질의 N-터미널 20 개의 아미노산들로 융합시켜 여기에 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 배출하였다. 다양한 상이한 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 구성들이 본 개시물에 제공되어 본 발명의 개념들이 siNA 전달을 향상시키기 위하여 효과적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 다양한 조립(assemblage)을 생성하고 이용하도록 광범위하게 적용 가능하다는 것을 명시하고 있다.Within the representative embodiments of the present invention described below, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides can incorporate any of the preceding structural elements, domains or motifs effective to mediate enhanced delivery of siNAs into target cells. By combining into a single polypeptide, it can be reasonably designed and constructed. For example, the protein delivery domain of a TAT polypeptide was fused to the N-terminal 20 amino acids of the influenza virus hemagglutinin protein named HA2 to release a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide to it. A variety of different polynucleotide delivery-enhancing polypeptide constructs are provided in this disclosure to provide that the concepts of the present invention are broadly applicable to create and exploit various assemblies of effective polynucleotide delivery-enhancing polypeptides to enhance siNA delivery. It is specified.

본 발명 내의 또 다른 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 하기의 펩티드들로부터 선택될 수 있다:Still other exemplary polynucleotide delivery-enhancing polypeptides within the present invention may be selected from the following peptides:

WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(서열 번호: 27);WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (SEQ ID NO: 27);

GKINLKALAALAKKIL(서열 번호: 28), RVIRVWFQNKRCKDKK(서열 번호: 29), GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(서열 번호: 30),GKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 28), RVIRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 29), GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 30),

GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (서열 번호: 31), Poly Lys-Trp, 4:1, 분자량 20,000-50,000; 및 Poly Orn-Trp, 4:1, 분자량 20,000-50,000. 여기의 조성물들 및 방법들 내에서 유용한 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 멜리틴(mellitin) 단백질 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (SEQ ID NO: 31), Poly Lys-Trp, 4: 1, molecular weight 20,000-50,000; And Poly Orn-Trp, 4: 1, molecular weight 20,000-50,000. Other polynucleotide delivery-enhancing polypeptides useful within the compositions and methods herein include all or part of a melittin protein sequence.

또 다른 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 하기의 예들에서 확인된다. 이러한 펩티드들의 임의의 것 또는 그 결합은 효과적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 시약들을 배출하도록 선택되거나 결합되어 본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 siNA들의 세포간 전달을 유도하거나 용이할 수 있다.Another exemplary polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is identified in the examples below. Any of these peptides, or combinations thereof, may be selected or coupled to release effective polynucleotide delivery-enhancing polypeptide reagents to induce or facilitate intercellular delivery of siNAs within the methods and compositions of the present invention.

본 발명의 더 상세한 태양들에서, siRNA 및 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 포함하는 혼합물, 복합체 또는 접합체는 LIPOFECTIN

Figure 112008025338980-PCT00002
과 같은 양이온 지질과 선택적으로 결합될 수 있다(예컨대, 혼합체 또는 복합체를 형성한다). 이러한 맥락에서, 단독으로 siRNA와 복합체 또는 접합체를 형성한 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 RNAi에 의해 유전자 침묵을 매개하기에 충분한 siNA의 전달을 이루리라는 것이 예상외로 여기에 개시된다. 그러나, siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 복합체 또는 접합체는 리포펙틴(lipofectin)과 같은 양이온 지질과 혼합체 또는 복합체를 형성하는 경우 siNA 전달 및 유전자 침묵을 매개하는 더 나은 활성을 보일 것이라는 사실이 예상외로 여기에 더 개시된다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드, siRNA 및 양이온 지질로 구성된 이러한 조성물들을 생성하기 위하여, siRNA 및 펩티드가 세포 배양 배지(cell culture medium)와 같은 적절한 배지 내에 우선 혼합될 수 있으며, 이후 상기 양이온 지질은 상기 혼합물에 첨가되어 siRNA/전달 펩티드/양이온 지질 조성물을 형성한다. 선택적으로, 펩티드 및 양이온 지질을 세포 배양 배지와 같은 적절한 배지 내에 우선 혼합될 수 있으며, 이후 상기 siRNA는 첨가되어 siRNA/전달 펩티드/양이온 지질 조성물을 형성할 수 있다.In more detailed aspects of the invention, a mixture, complex or conjugate comprising a siRNA and a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00002
May optionally be combined with a cationic lipid such as (eg, form a mixture or complex). In this context, it is unexpectedly disclosed herein that polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, which alone form a complex or conjugate with an siRNA, will achieve sufficient siNA delivery to mediate gene silencing by RNAi. However, it is unexpected here that siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide complexes or conjugates will show better activity in mediating siNA delivery and gene silencing when they form a mixture or complex with a cationic lipid such as lipofectin. It is further disclosed. In order to produce such compositions consisting of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, siRNAs and cationic lipids, siRNAs and peptides may first be mixed into a suitable medium such as a cell culture medium, and then the cationic lipids may be mixed in the mixture. Added to form siRNA / delivery peptide / cation lipid composition. Optionally, the peptide and cationic lipids can be mixed first in a suitable medium, such as a cell culture medium, and then the siRNA can be added to form siRNA / delivery peptide / cationic lipid composition.

본 발명의 이러한 태양들 내에서 유용한 양이온 지질들의 예들은, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판, 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트, 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드, 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드, 테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민, 테트라메틸테트라올레일 스퍼민, 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민, 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민 및 테트라메틸디올레일 스퍼민. DOTMA (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드), DDAB (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드). 다가 양이온 지질들은 리포스퍼민들을 포함하는데, 특히 DOSPA (2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트), DOSPER (1,3-디올릴옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드), 디- 및 테트라-알킬-테트라-메틸 스퍼민들(di- and tetra-alkyl-tetra-methyl spermines), TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스퍼민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스퍼민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민), TMDOS (테트라메틸디올레일 스퍼민), DOGS (디옥타데실-아미도글리실스퍼민(dioctadecyl-amidoglycylspermine)(TRANSFECTAM®)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 다른 유용한 양이온 지질들은 예를 들어, 미국 특허 제6,733,777호; 미국 특허 제6,376,248호; 미국 특허 제5,736,392호; 미국 특허 제5,686,958호; 미국 특허 제5,334,761호 및 미국 특허 제5,459,127호에 설명되어 있다.Examples of cationic lipids useful within these aspects of the invention are N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride, 1,2-bis (oleoyl). Oxy) -3-3- (trimethylammonium) propane, 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide, dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [ 2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium trifluoroacetate, 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxyspermil) -propylamide, 5- Carboxylic cisperylglycine dioctadecylamide, tetramethyltetrapalmitoyl spermine, tetramethyltetraoleyl spermine, tetramethyltetralauryl spermine, tetramethyltetramyristyl spermine and tetramethyldioleyl spermine. DOTMA (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleoyloxy) -3,3- (trimethyl Ammonium) propane), DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide), DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide). Polyvalent cationic lipids include liphosphfermines, in particular DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium trifluoroacetate) , DOSPER (1,3-diolyloxy-2- (6-carboxycismilyl) -propylamide), di- and tetra-alkyl-tetra-methyl spermines , TMTPS (tetramethyltetrapalmitoyl spermine), TMTOS (tetramethyltetraoleyl spermine), TMTLS (tetramethyltetralauryl spermine), TMTMS (tetramethyltetramyristyl spermine), TMDOS (tetramethyldioleyl spermine), DOGS (dioctadecyl-amidoglycylspermine) (TRANSFECTAM®), including but not limited to. Other useful cationic lipids are described, for example, in US Pat. No. 6,733,777; US Pat. No. 6,376,248. US Patent 5,736,392 US Patent 5,686,958 US Patent 5,334,761 and US Pat. No. 5,459,127.

양이온 지질들은 비-양이온 지질들, 특히 중성 지질들, 예를 들어, DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine)), DPhPE(디피타노일포스파티딜에탄올아민(diphytanoylphosphatidylethanolamine)) 또는 콜레스테롤과 같은 지질들과 선택적으로 결합된다. DOSPA 및 DOPE의 3:1 (w/w) 혼합물 또는 DOTMA 및 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물(LIPOFECTIN

Figure 112008025338980-PCT00003
, Invitrogen)로 구성된 양이온 지질 조성물은 일반적으로 본 발명의 조성물들을 형질감염 시키는데 유용하다. 바람직한 형질감염 조성물들은 고등 진핵 세포계의 실질적인 형질감염을 유도하는 조성물들이다.Cationic lipids are non-cationic lipids, in particular neutral lipids, for example lipids such as DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DPhPE (diphytanoylphosphatidylethanolamine) or cholesterol. Optionally combined. 3: 1 (w / w) mixture of DOSPA and DOPE or 1: 1 (w / w) mixture of DOTMA and DOPE (LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00003
Cationic lipid compositions consisting of Invitrogen) are generally useful for transfecting compositions of the present invention. Preferred transfection compositions are those that induce substantial transfection of the higher eukaryotic cell line.

대표적인 실시예들에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 혼합, 복합되거나 접합된 짧은 간섭 핵산(siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-나선 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(mRNA) 또는 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA)와 같은 작은 핵산 분자를 포함하는 조성물들을 특징으로 한다.In exemplary embodiments, the present invention relates to short interfering nucleic acids (siNAs), short interfering RNAs (siRNAs), double-helix RNAs (dsRNAs), micro-RNAs (mRNAs) mixed, complexed or conjugated with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides. Or compositions comprising small nucleic acid molecules such as short hairpin RNA (shRNA).

여기에 사용된 "짧은 간섭 핵산", "siNA", "짧은 간섭 RNA", "siRNA", "짧은 간섭 핵산 분자", "짧은 간섭 올리고뉴클레오티드 분자", 또는 "화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산 분자"라는 용어는 예를 들어, 서열-특이적 방식으로 RNA 간섭 "RNAi" 또는 유전자 침묵을 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제하거나 하향 조절(down regulate)할 수 있는 임의의 핵산 분자를 의미한다. 대표적인 실시예들 내에서, 상기 siNA는 자기-상보적(self-complementary) 센스 및 안티센스 영역들을 포함하는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자이며, 상기 안티센스 영역은 발현을 하향 조절하기 위하여 표적 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 그 일 부분을 포함하며 상기 센스 영역은 상기 표적 핵산 서열에 해당하는(즉, 서열 내에서 실질적으로 동일함) 뉴클레오티드 서열 또는 일부를 포함한다.As used herein, "short interfering nucleic acid", "siNA", "short interfering RNA", "siRNA", "short interfering nucleic acid molecule", "short interfering oligonucleotide molecule", or "chemically modified short interfering nucleic acid molecule" The term refers to any nucleic acid molecule that can inhibit or down regulate gene expression or viral replication, for example by mediating RNA interference “RNAi” or gene silencing in a sequence-specific manner. In exemplary embodiments, the siNA is a double-stranded polynucleotide molecule comprising self-complementary sense and antisense regions, wherein the antisense region is a nucleotide sequence in the target nucleic acid molecule to down regulate expression. A nucleotide sequence complementary to or a portion thereof and the sense region comprises a nucleotide sequence or portion corresponding to (ie, substantially identical in sequence) the target nucleic acid sequence.

"siNA"는 짧은-길이의 이중-나선 핵산(또는 선택적으로는 그것의 길이가 더 긴 전구체)이며 표적 세포들 내에서 수용할 수 없을 만큼 독성이 아닌 예를 들어, siRNA 같은 소간섭 핵산을 의미한다. 본 발명 내의 유용한 siNA들의 길이는 몇몇 실시예들에서 약 21 내지 23 bp 정도의 길이에서 최적화될 것이다. 그러나, siRNA들을 포함하여 유용한 siNA들의 길이에는 특정한 제한이 없다. 예를 들어, siNA들은 표적 세포에 전달시 또는 전달 후 존재하며 유전자 침묵 활성을 가하게 될 최종 또는 가공된 형태의 siNA와는 실질적으로 상이한 전구체 형태로 세포들에 최초로 제시될 수 있다. siNA들의 전구체 형태들은 예를 들어, 전달 시 또는 전달 후에 유전자 침묵을 매개하는 세포 내에서 활성인 siNA를 배출해 내도록 가공, 퇴화, 변경 또는 분열되는 전구체 서열 요소들을 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시예들에서, 본 발명 내의 유용한 siNA들은 표적 세포 내에서 활성인 가공된 siNA를 배출해 낼 예를 들어, 약 100 내지 200 염기쌍들, 50 내지 100 염기쌍들 또는 약 50 염기쌍 미만의 길이의 전구체를 가질 것이다. 다른 실시예들에서, 유용한 siNA 또는 siNA 전구체는 길이가 약 10 내지 49 bp, 15 내지 35 bp 또는 약 21 내지 30 bp일 것이다."siNA" means a short-length double-stranded nucleic acid (or optionally a longer precursor thereof) and a small interfering nucleic acid such as, for example, siRNA that is not toxic enough to be unacceptable in target cells do. The length of the useful siNAs within the present invention will be optimized in the length of about 21 to 23 bp in some embodiments. However, there is no particular limitation on the length of useful siNAs, including siRNAs. For example, siNAs may be first presented to cells in precursor form substantially different from the final or processed form of siNA, which will be present at or after delivery to the target cell and will exert gene silencing activity. Precursor forms of siNAs may include, for example, precursor sequence elements that are processed, degraded, altered or cleaved to release active siNAs in cells that mediate gene silencing upon or after delivery. Thus, in some embodiments, useful siNAs within the present invention may, for example, have a length of less than about 100 to 200 base pairs, 50 to 100 base pairs, or less than about 50 base pairs, to release the processed siNA active in the target cell. Will have a precursor. In other embodiments, a useful siNA or siNA precursor will be about 10 to 49 bp, 15 to 35 bp or about 21 to 30 bp in length.

상술한 바와 같이, 본 발명의 몇몇 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 siNA들의 대형 핵산 전구체들을 포함하여, 종래 siNA들보다 더 큰 핵산 분자들의 전달을 용이하게 하도록 사용된다. 예를 들어, 여기의 방법들 및 조성물들은 원하는 siNA들에 "전구체들"을 나타내는 더 큰 핵산들의 전달을 향상시키기 위하여 이용될 수 있으며, 상기 전구체 아미노산들은 분열되거나 표적 세포에 전달 전, 전달 도중 또는 전달 후에 가공되어 상기 표적 세포 내에서 유전자 발현을 조절하기 위하여 활성 siNA를 형성할 수 있다. 예를 들어, siNA 전구체 폴리뉴클레오티드는 두 개 이상의 루프(loop) 구조들과 자기-상보적 센스 및 안티센스 구들을 포함하는 줄기(stem)를 가지는 원형 단일-가닥 폴리뉴클레오티드로 선택될 수 있으며, 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그 일부 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며 상기 센스 영역은 상기 표적 핵산 서열 또는 그 일부에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 원형 폴리뉴클레오티드는 생체 내 또는 생체 외에서 가공되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siNA 분자를 발생시킬 수 있다.As mentioned above, in some embodiments of the present invention, polynucleotide delivery-enhancing polypeptides are used to facilitate the delivery of larger nucleic acid molecules than conventional siNAs, including large nucleic acid precursors of siNAs. For example, the methods and compositions herein can be used to enhance delivery of larger nucleic acids that represent “precursors” to desired siNAs, wherein the precursor amino acids are cleaved or delivered to, or before delivery to, a target cell. It may be processed after delivery to form active siNAs to regulate gene expression in said target cells. For example, the siNA precursor polynucleotide may be selected as a circular single-stranded polynucleotide having a stem comprising two or more loop structures and self-complementary sense and antisense spheres, wherein the antisense The region comprises a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence in a target nucleic acid molecule or portion thereof and the sense region has a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or portion thereof, and the circular polynucleotide is processed in vivo or ex vivo. It is possible to generate active siNA molecules that can mediate RNAi.

포유류 세포들 내에서, 30 염기쌍들보다 더 긴 dsRNA들은 주로 인터페론에 의해 유도되는 dsRNA-의존성 키나아제 PKR 및 2'-5'-올리고아데닐레이트 신테테이스(oligoadenylate synthetase)를 활성화시킬 수 있다. 상기 활성화된 PKR은 번역 인자 진핵 개시 인자 2α(eIF2α)의 인산화에 의해 일반적인 번역을 억제하는 반면에, 2'-5'-올리고아데닐레이트 신테테이스는 RNAse L의 활성화를 통해 비특이적 mRNA 분해를 유발한다. 주로 30 염기쌍들 미만 및 가장 흔하게는 약 17 내지 19, 19 내지 21 또는 21 내지 23 염기쌍들인 작은 크기로 인하여(특히 비-전구체 형태를 의미함), 본 발명의 상기 siNA들은 인터페론 반응의 활성화을 회피한다.In mammalian cells, dsRNAs longer than 30 base pairs can activate dsRNA-dependent kinase PKR and 2'-5'-oligoadenylate synthetase, mainly induced by interferon. The activated PKR inhibits general translation by phosphorylation of translation factor eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), whereas 2'-5'-oligoadenylate synthetase induces nonspecific mRNA degradation through activation of RNAse L. do. Due to their small size, which is predominantly less than 30 base pairs and most often about 17 to 19, 19 to 21 or 21 to 23 base pairs (meaning specifically non-precursor forms), the siNAs of the present invention avoid activation of the interferon response. .

길이가 긴 dsRNA의 비특이적 효과와 대조적으로, siRNA는 포유류 시스템 내에서 선택적인 유전자 침묵을 매개할 수 있다. 짧은 루프 및 줄기 내에서의 19 내지 27 개 염기쌍들을 지닌 헤어핀 RNA들은 또한 이중-나선 줄기 내에서의 서열과 상동성인 유전자들의 발현을 선택적으로 침묵시킨다. 포유류 세포들은 짧은 헤어핀 RNA를 siRNA로 변환시켜 선택적 유전자 침묵을 매개할 수 있다.In contrast to the nonspecific effects of long dsRNAs, siRNAs can mediate selective gene silencing in mammalian systems. Hairpin RNAs with 19 to 27 base pairs in short loops and stems also selectively silence expression of genes homologous to sequences in double-helix stems. Mammalian cells can convert short hairpin RNA into siRNA to mediate selective gene silencing.

RISC는 siRNA 듀플렉스(duplex)의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 가지는 단일 가닥 RNA의 분열을 매개한다. 상기 표적 RNA의 분열은 상기 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 중앙에서 발생한다. 연구들에 의하면 21 개의 뉴클레오티드 siRNA 듀플렉스들은 두 개의 뉴클레오티드 3'-오버행(overhang)들을 포함할 때 가장 활성이 있는 것을 보인다. 또한, 하나 또는 양쪽 RNA 가닥들을 2'-디옥시(2'-H) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드들로 완전히 치환하게 되면 RNAi 활성을 제거하는 반면에 상기 3'-터미널 siRNA 오버행 뉴클레오티드들을 디옥시 뉴클레오티드들(2'-H)로의 치환은 견디는 것으로 보고되었다.RISCs mediate cleavage of single-stranded RNAs having sequences complementary to the antisense strands of siRNA duplexes. Cleavage of the target RNA occurs at the center of the region complementary to the antisense strand of the siRNA duplex. Studies show that the 21 nucleotide siRNA duplexes are most active when they include two nucleotide 3'-overhangs. In addition, complete substitution of one or both RNA strands with 2'-deoxy (2'-H) or 2'-0-methyl nucleotides eliminates RNAi activity while decomposing the 3'-terminal siRNA overhang nucleotides. Substitution with oxy nucleotides (2'-H) has been reported to withstand.

연구들에 의하면 두 개의 뉴클레오티드 3' 오버행들을 지닌 21-량체(mer) siRNA 듀플렉스의 3'-오버행 세그먼트들(segments)을 디옥시리보뉴클레오티드들로 교체하면 RNAi 활성에는 불리한 효과를 가지지 않는 것을 보였다. 상기 siRNA의 각 말단 상에 최대 네 개의 뉴클레오티드들을 디옥시리보뉴클레오티드들로 교체하면 상당히 잘 견디는 것으로 보고된 반면에 디옥시뉴클레오티드들로 완전히 교체하면 RNAi 활성을 전혀 보이지 않았다.Studies have shown that replacing 3'-overhang segments of a 21-mer siRNA duplex with two nucleotide 3 'overhangs with deoxyribonucleotides has no adverse effect on RNAi activity. Replacement of up to four nucleotides with deoxyribonucleotides on each end of the siRNA was reported to be fairly well tolerated, whereas complete replacement with deoxynucleotides showed no RNAi activity at all.

또한, 상기 siNA들은 단일 또는 복수의 siNA들을 엔코딩하고 표적 세포들 내에서 그 발현을 지시하는 폴리뉴클레오티드 벡터에 의하여 발현되는 단일 또는 복수의 전사 산물들로서 전달될 수 있다. 이러한 실시예들에서, 상기 표적 세포 내에서 발현되는 siRNA들의 최종 전사 산물의 이중-가닥 부분은 예를 들어, 15 내지 49 bp, 15 내지 35 bp 또는 약 21 내지 30 bp 길이일 수 있다. 대표적인 실시예들 내에서, 두 개의 가닥이 쌍을 이루는 siNA들의 이중-가닥 부분들은 완전히 쌍을 이룬 뉴클레오티드 세그먼트들에 한정되지 않으며 부정합(mismatch)(해당하는 뉴클레오티드들이 상보적이지 않음), 부풀음(bulge)(한쪽 가닥 상에 해당하는 상보적 뉴클레오티드가 부족), 오버행 등으로 인하여 쌍을 이루지 않는 부분들을 포함할 수 있다. 쌍을 이루지 않는 부분들은 이들이 siNA 형성을 간섭하지 않을 정도로 포함될 수 있다. 더 상세한 실시예들에서, "부풀음"은 한 개 내지 두 개의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드들 포함할 수 있으며, 두 개의 가닥들이 쌍을 이루는 siNA들의 이중-가닥 영역은 약 1 내지 7 또는 약 1 내지 5 개의 부풀음들을 포함할 수 있다. 또한, siNA들의 이중-가닥 영역 내에 포함된 "부정합" 부분들은 약 1 내지 7 또는 약 1 내지 5 개의 숫자로 존재할 수 있다. 부정합의 경우 가장 흔한 것은 뉴클레오티드들의 하나는 구아닌이고 나머지는 우라실이다. 그러한 부정합은 예를 들어, 센스 RNA로 코딩하는 해당 DNA 내에서 C가 T로의 돌연변이, G가 A로의 돌연변이 또는 그 혼합들로 원인을 돌릴 수 있지만 다른 원인들도 고려된다. 또한, 본 발명에서 두 개의 가닥들이 쌍을 이루는 siNA들의 이중-가닥 영역은 특정된 숫자 근사 범위들 내에서 부풀음 및 부정합된 부분들 양쪽 모두를 포함할 수 있다.In addition, the siNAs may be delivered as single or multiple transcription products expressed by a polynucleotide vector that encodes a single or multiple siNAs and directs its expression in target cells. In such embodiments, the double-stranded portion of the final transcription product of siRNAs expressed in the target cell may be, for example, 15 to 49 bp, 15 to 35 bp or about 21 to 30 bp in length. Within representative embodiments, the double-stranded portions of the two stranded siNAs are not limited to fully paired nucleotide segments and mismatch (the corresponding nucleotides are not complementary), bulge. ) (Ie, lack of complementary nucleotides on one strand), overhangs, etc. Unpaired portions may be included such that they do not interfere with siNA formation. In more detailed embodiments, “blowing” may comprise one to two unpaired nucleotides, wherein the double-stranded region of siNAs that pair the two strands is about 1 to 7 or about 1 to 5 Dog swelling. In addition, “mismatched” portions included in the double-stranded region of siNAs may be present in about 1 to 7 or about 1 to 5 numbers. The most common case of mismatch is one of the nucleotides is guanine and the other is uracil. Such mismatches can be attributed, for example, to mutations in C to T, mutations in A to G, or mixtures thereof in the corresponding DNA encoding the sense RNA, but other causes are also contemplated. In addition, in the present invention, the double-stranded region of siNAs paired with two strands may include both bloated and mismatched portions within specified numerical approximation ranges.

본 발명의 siNA들의 터미널 구조는 siNA가 표적 유전자들의 표현을 침묵시키는 활성을 유지하는 한 무디거나(blunt) 응집성(cohesive)(오버행)일 수 있다. 상기 응집성(오버행) 말단 구조는 다른 이들이 보고한 바와 같이 3' 오버행에만 한정되지 않는다. 오히려, RNAi에 의한 것과 같이 유전자 침묵 효과를 유도할 수 있는 한 5' 오버행 구조는 포함될 수 있다. 또한, 오버행 뉴클레오티드들의 숫자는 2 또는 3 개의 뉴클레오티드들의 보고된 제한들에 한정되지 않지만, 상기 오버행이 siNA의 유전자 침묵 활성을 부여하지 않는 한 임의의 숫자일 수 있다. 예를 들어, 오버행들은 약 1 내지 8 개의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있지만, 더 흔하게는 약 2 내지 4 개의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 응집성 말단 구조를 가지는 siNA들의 총 길이는 쌍을 이루는 이중-가닥 부분의 길이와 양쪽 말단들에서 오버행 단일-가닥들을 포함하는 쌍의 길이의 합으로 표현된다. 예를 들어, 양쪽 말단에서 4 개의 뉴클레오티드 오버행들을 지닌 19 bp 이중-가닥 RNA의 대표적인 경우에 총 길이는 23 bp로 표현된다. 또한, 상기 오버행 서열은 표적 유전자에 낮은 특이성을 가질 수 있으므로, 상기 표적 유전자 서열에 반드시 상보적(안티센스) 또는 동일(센스) 하지는 않다. 또한, 상기 siNA가 상기 표적 유전자상에 유전자 침묵 효과를 유지할 수 있는 한, 예를 들어, 일 말단의 오버행 부분에서 저 분자량 구조(예를 들어, tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA 같은 천연 RNA 분자 또는 인공 RNA 분자)를 포함할 수 있다.The terminal structure of the siNAs of the invention can be blunt or cohesive (overhang) as long as the siNA maintains its activity of silencing expression of target genes. The cohesive (overhang) end structure is not limited to 3 'overhangs as others have reported. Rather, 5 'overhang structures can be included as long as they can induce gene silencing effects, such as by RNAi. In addition, the number of overhang nucleotides is not limited to the reported limits of 2 or 3 nucleotides, but may be any number as long as the overhang does not confer gene silencing activity of siNA. For example, overhangs may include about 1 to 8 nucleotides, but more often may include about 2 to 4 nucleotides. The total length of siNAs with a cohesive end structure is expressed as the sum of the length of the paired double-stranded portion and the length of the pair including the overhang single-strands at both ends. For example, in the representative case of 19 bp double-stranded RNA with four nucleotide overhangs at both ends, the total length is expressed as 23 bp. In addition, the overhang sequence may have low specificity to the target gene, and thus, the overhang sequence is not necessarily complementary (antisense) or identical (sense) to the target gene sequence. In addition, as long as the siNA can maintain a gene silencing effect on the target gene, for example, a low molecular weight structure (e.g., a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA or viral RNA or artificial RNA) in the overhang portion of one end Molecules).

또한, siNA들의 터미널 구조는 이중-가닥 핵산의 일면의 말단부들이 예컨대, 링커 RNA와 같은 링커 핵산에 의해 연결되는 스템-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있다. 상기 이중-가닥 영역(스템-루프 부분)의 길이는 예를 들어, 15 내지 49 bp, 종종 15 내지 35 bp, 및 더 흔하게는 약 21 내지 30 bp 길이일 수 있다. 또한, 표적 세포 내에서 발현되는 siNA들의 최종 전사 산물인 이중-가닥 영역의 길이는 예를 들어, 약 15 내지 49 bp, 15 내지 35 bp, 또는 약 21 내지 30 bp 길이일 수 있다. 링커 세그먼트들을 이용하면, 링커가 스템 부분의 쌍 이룸을 방해하지 않는 한 링커의 길이에 특정한 제한은 없다. 예를 들어, 스템 부분의 안정한 쌍 이룸과 이 부분을 코딩하는 DNA들 사이의 재조합을 억제하기 위하여, 상기 링커 부분은 클로버-잎(clover-leaf) tRNA 구조를 가질 수 있다. 상기 링커가 스템 부분의 쌍 이룸을 방해하게 될 길이를 가진다 해도, 예를 들어, 전구체 RNA의 성숙한 RNA로의 가공 도중에 인트론들이 절제되도록 상기 링커 부분이 인트론들을 포함하도록 구성하는 것이 가능하며, 이로 인하여 상기 스템 부분이 쌍을 이루게 된다. 스템-루프 siRNA의 경우에, 루프 구조를 가지지 않는 RNA의 어느 한쪽 말단(머리 또는 꼬리)은 저분자량 RNA를 가질 수 있다. 상술한 바와 같이, 이러한 저분자량 RNA들은 tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA와 같은 천연 RNA 분자 또는 인공 RNA 분자를 포함할 수 있다.In addition, the terminal structure of siNAs may have a stem-loop structure in which the terminal portions of one side of the double-stranded nucleic acid are linked by a linker nucleic acid such as, for example, linker RNA. The length of the double-stranded region (stem-loop portion) can be, for example, 15 to 49 bp, often 15 to 35 bp, and more often about 21 to 30 bp in length. In addition, the length of the double-stranded region, which is the final transcription product of siNAs expressed in the target cell, may be, for example, about 15 to 49 bp, 15 to 35 bp, or about 21 to 30 bp in length. Using linker segments, there is no specific limitation on the length of the linker as long as the linker does not interfere with pairing of stem portions. For example, the linker moiety may have a clover-leaf tRNA structure in order to inhibit stable pairing of stem portions and recombination between the DNAs encoding the moiety. Even if the linker has a length that will interfere with the pairing of stem portions, it is possible to configure the linker portion to include introns such that the introns are ablated during processing of precursor RNA into mature RNA, thereby Stem parts are paired. In the case of a stem-loop siRNA, either end (head or tail) of the RNA without the loop structure may have low molecular weight RNA. As mentioned above, such low molecular weight RNAs may comprise natural or artificial RNA molecules such as tRNA, rRNA or viral RNA.

상기 siNA는 또한 표적 핵산 분자 또는 그 일 부분의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며(예를 들어, 그러한 siNA 분자는 상기 표적 핵산 서열 또는 그 일 부분에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 siNA 분자 내에서 그 존재를 필요로 하지 않는다), 상기 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 5'-인산염(예를 들어, Martinez, et al., Cell. 110:563-574, 2002, 및 Schwarz, et al., Molecular Cell 70:537-568, 2002 참조)또는 5',3'-이인산염(diphosphate)와 같은 터미널 인산염 기(group)를 더 포함할 수 있다.The siNA may also comprise a single stranded polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence of a target nucleic acid molecule or portion thereof (eg, such a siNA molecule corresponds to the target nucleic acid sequence or portion thereof). The single stranded polynucleotide does not require its presence in the siNA molecule of the nucleotide sequence; 5'-phosphate (eg, Martinez, et al., Cell . 110: 563-574, 2002, and Schwarz, et al., Molecular Cell 70: 537-568, 2002) or 5 ', 3'-diphosphate may further comprise a terminal phosphate group (group).

여기에 사용된 바와 같이, siNA 분자라는 용어는 자연발생적 RNA 또는 DNA만 포함하는 분자들에 한정하는 것이 아니고, 화학적으로-변형된 뉴클레오티드들 및 비-뉴클레오티드들도 포함한다. 몇몇 실시예들에서, 본 발명의 짧은 간섭 핵산 분자들은 뉴클레오티드들을 포함하는 2'-하이드록시(2'-OH)가 부족하다. 몇몇 실시예들에서, 짧은 간섭 핵산들은 RNAi를 매개하기 위한 2'-하이드록시 기를 가지는 뉴클레오티드들의 존재를 필요로 하지 않으며, 본 발명의 짧은 간섭 핵산 분자들은 선택적으로 임의의 리보뉴클레오티드들(예컨대, 2'-OH 기를 가지는 뉴클레오티드들)을 포함하지 않는다. 그러나, RNAi를 지원하는 siNA 분자 내에서 리보뉴클레오티드들의 존재를 필요로 하지 않는 그러한 siNA 분자들은 부착된 링커나 링커들 또는 2'-OH 기들을 가지는 하나 이상의 뉴클레오티드들을 포함하는 다른 부착되거나 결합된 기들, 모이어티들(moieties) 또는 사슬들을 가질 수 있다. 선택적으로, siNA 분자들은 뉴클레오티드 위치들의 약 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50 %에서 리보뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.As used herein, the term siNA molecule is not limited to molecules containing only naturally occurring RNA or DNA, but also includes chemically-modified nucleotides and non-nucleotides. In some embodiments, short interfering nucleic acid molecules of the invention lack 2'-hydroxy (2'-OH) comprising nucleotides. In some embodiments, short interfering nucleic acids do not require the presence of nucleotides having a 2'-hydroxy group to mediate RNAi, and the short interfering nucleic acid molecules of the present invention may optionally contain any ribonucleotides (eg, 2 Nucleotides having an '-OH group). However, such siNA molecules that do not require the presence of ribonucleotides in the siNA molecule supporting RNAi are attached or linked groups comprising one or more nucleotides having an attached linker or linkers or 2′-OH groups, It may have moieties or chains. Optionally, siNA molecules may comprise ribonucleotides at about 5, 10, 20, 30, 40, or 50% of the nucleotide positions.

여기에 사용된 바와 같이, siNA라는 용어는 예를 들어, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(mRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 핵산, 짧은 간섭 변형된 올리고뉴클레오티드, 화학적으로-변형된 siRNA, 전사 후 유전자 침묵 RNA(ptgsRNA) 등과 같은 서열 특이적 RNAi를 매개할 수 있는 핵산 분자들을 설명하는 데 사용되는 다른 용어들과 동등한 것을 의미한다.As used herein, the term siNA refers to, for example, short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), micro-RNA (mRNA), short hairpin RNA (shRNA), short interfering oligonucleotide, short Equivalent to other terms used to describe nucleic acid molecules that can mediate sequence specific RNAi such as interfering nucleic acids, short interfering modified oligonucleotides, chemically-modified siRNAs, post-transcriptional gene silencing RNAs (ptgsRNAs), etc. it means.

다른 실시예들에서, 본 발명 내에서 사용되는 siNA 분자들은 분리된 센스 및 안티센스 서열들 또는 영역들을 포함할 수 있으며, 상기 센스 및 안티센스 영역들은 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커 분자들에 의해 공유적으로 연결되거나 또한 이온화 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용 및/또는 쌓임 상호작용(stacking interaction)에 의해 비공유적으로 연결된다.In other embodiments, siNA molecules used within the present invention may comprise isolated sense and antisense sequences or regions, wherein the sense and antisense regions are covalently linked by nucleotide or non-nucleotide linker molecules. Or non-covalently by ionization interactions, hydrogen bonding, van der Waals interactions, hydrophobic interactions and / or stacking interactions.

"안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 가지며 상기 표적 유전자 mRNA와 결합하여 RNAi를 유도하는 것으로 생각되는 RNA 가닥이다. "센스 RNA"는 안티센스 RNA에 상보적이며 그 상보적 안티센스 RNA에 복원되어 siRNA를 형성하는 서열을 가진다. 이러한 안티센스 및 센스 RNA들은 통상적으로 RNA 합성기로 합성되었다.An “antisense RNA” is an RNA strand that has a sequence complementary to a target gene mRNA and is thought to bind RNA with the target gene mRNA to induce RNAi. A "sense RNA" has a sequence that is complementary to antisense RNA and that is restored to its complementary antisense RNA to form siRNA. Such antisense and sense RNAs were conventionally synthesized with an RNA synthesizer.

여기에 사용된 "RNAi 컨스트럭트(construct)"는 명세서 전반에 걸쳐서 소간섭 RNA들(siRNAs), 헤어핀 RNA들 및 생체 내에서 분열되어 siRNA들을 형성할 수 있는 다른 RNA 종들을 포함하는 데 사용되는 일반적인 용어이다. 여기의 RNAi 컨스트럭트들은 또한 세포들 내에서 dsRNA들 또는 헤어핀 RNA들을 형성하는 전사체들 및/또는 생체 내에서 siRNA들을 생성할 수 있는 전사체들을 발생시킬 수 있는 발현 벡터들(RNAi 발현 벡터들이라고도 칭함). 선택적으로, 상기 siRNA는 siRNA의 단일 가닥들 또는 이중 가닥들을 포함한다.As used herein, “RNAi construct” is used throughout the specification to include small interfering RNAs (siRNAs), hairpin RNAs, and other RNA species that can cleave in vivo to form siRNAs. General term. The RNAi constructs herein also express expression vectors that can generate transcripts that form dsRNAs or hairpin RNAs in cells and / or transcripts that can generate siRNAs in vivo (RNAi expression vectors). Also called). Optionally, said siRNA comprises single strands or double strands of siRNA.

siHybrid 분자는 siRNA에 유사한 기능을 가지는 이중-가닥 핵산이다. 이중-가닥 RNA 분자 대신에, siHybrid는 RNA 일 가닥과 DNA 일 가닥으로 구성되어 있다. 바람직하게는, 상기 RNA 가닥은 표적 mRNA와 결합하는 가닥과 같은 안티센스 가닥이다. 상기 DNA와 RNA 가닥들의 혼성화로 발생되는 siHybrid는 혼성화된 상보적 부분과 바람직하게는 적어도 하나의 3'오버행 말단을 가진다.siHybrid molecules are double-stranded nucleic acids with functions similar to siRNA. Instead of double-stranded RNA molecules, siHybrid consists of one strand of RNA and one strand of DNA. Preferably, the RNA strand is an antisense strand, such as a strand that binds a target mRNA. SiHybrid resulting from hybridization of the DNA and RNA strands preferably has at least one 3 ′ overhang end with the hybridized complementary moiety.

본 발명 내에서 사용되는 siNA들을 두 개의 분리된 올리고뉴클레오티드들로부터 결합할 수 있으며, 한 가닥은 센스 가닥이고 나머지는 안티센스 가닥으로서 상기 안티센스 및 센스 가닥들은 자기-상보적이다(즉, 각각의 가닥은 나머지 가닥에 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며; 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 듀플렉스 또는 이중 가닥 구조를 형성하며, 예를 들어 상기 이중 가닥 영역은 약 19 염기쌍들이다). 상기 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 그 일 부분에 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 센스 가닥은 상기 표적 핵산 서열 또는 그 일 부분에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 siNA는 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있으며, 상기 siNA의 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역들은 핵산계(nucleic acid-based) 또는 비-핵산계 링커(들)을 통해 연결된다.The siNAs used within the present invention can bind from two separate oligonucleotides, one strand is the sense strand and the other is the antisense strand, wherein the antisense and sense strands are self-complementary (ie, each strand is A nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence in the remaining strand; the antisense strand and sense strand form a duplex or double stranded structure, eg, the double stranded region is about 19 base pairs). The antisense strand may include a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence in a target nucleic acid molecule or a portion thereof, and the sense strand may include a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or a portion thereof. In addition, the siNA may be assembled from a single oligonucleotide, and the self-complementary sense and antisense regions of the siNA are linked through a nucleic acid-based or non-nucleic acid linker (s).

다른 실시예들 내에서, 본 발명의 방법들 및 조성물들에 따른 세포간 전달에 이용되는 siNA들은 듀플렉스, 비대칭적 듀플렉스, 헤어핀 또는 비대칭적 헤어핀 2차 구조의 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역들을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 안티센스 영역은 분리된 표적 핵산 분자 또는 그 일 부분 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 센스 영역은 상기 표적 핵산 서열 또는 그 일 부분에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.Within other embodiments, siNAs used for intercellular delivery according to the methods and compositions of the present invention have self-complementary sense and antisense regions of duplex, asymmetric duplex, hairpin or asymmetric hairpin secondary structure. Wherein the antisense region comprises a nucleotide sequence complementary to an nucleotide sequence within an isolated target nucleic acid molecule or portion thereof, and the sense region comprises a nucleotide sequence corresponding to the target nucleic acid sequence or portion thereof do.

siNA 내에서 이루어질 수 있는 화학적 변형물들의 비-제한적 예들은 제한 없이 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들(phophorothioate internucleotide linkages), 2'-디옥시리보뉴클레오티드들(deoxyribonucleotides), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드들, 2'-디옥시'-2'-플루오로 리보뉴클레오티드들, "유니버셜 염기(universal base)" 뉴클레오티드들, "비사이클릭(acyclic)" 뉴클레오티드들, 5-C-메틸 뉴클레오티드들, 및 터미널 글리세릴(terminal glyceryl) 및/또는 역위 디옥시 무염기 잔기 혼입(inverted deoxy abasic residue incorporation)을 포함한다. 이러한 화학적 변형물들은 다양한 siNA 컨스트럭츠에 사용되는 경우, 세포들 내에서 RNAi 활성을 보존하는 것을 보이면서 동시에 이러한 화합물들의 혈청 안정성을 극적으로 증가시킨다.Non-limiting examples of chemical modifications that can be made in siNA include, but are not limited to, phosphorothioate internucleotide linkages, 2'-deoxyribonucleotides, 2'-O-methyl ribonucleotides , 2'-deoxy'-2'-fluoro ribonucleotides, "universal base" nucleotides, "acyclic" nucleotides, 5-C-methyl nucleotides, and terminal glycerol Terminal glyceryl and / or inverted deoxy abasic residue incorporation. These chemical modifications, when used in various siNA constructs, have shown to preserve RNAi activity in cells while at the same time dramatically increasing the serum stability of these compounds.

비-제한적 예에서, 화학적으로-변형된 뉴클레오티드들을 핵산 분자들 내로 도입하면 외생적으로 전달되는 천연 RNA 분자들에 고유한 생체 내 안정성 및 생체이용도(bioavailability)의 잠재적 제한들을 극복하는 데 있어서 강력한 도구를 제공한다. 예를 들어, 화학적으로-변형된 핵산 분자들을 사용하면 화학적으로 변형된 핵산 분자들이 혈청 내에서 더 긴 반감기를 가지는 경향이 있으므로 주어진 약학적 효과를 위해 특정한 핵산 분자를 투여하는 투여량을 더 낮출 수 있다. 또한, 몇몇 화학적 변형물들은 특정한 세포들 또는 조직들을 표적하고/하거나 핵산 분자의 세포 흡수를 향상시킴으로써 핵산 분자들의 생체이용도를 증가시킬 수 있다. 그러므로, 화학적으로-변형된 핵산 분자의 활성이 천연 핵산 분자와 비교하여 예를 들어, 전체(all)-RNA 핵산 분자와 비교할 경우에 비해서 감소 된다 할지라도, 변형된 핵산 분자의 총체적 활성은 분자의 개선된 안정성 및/또는 전달로 인하여 천연 분자의 활성보다 더 높을 수 있다. 변형되지 않은 천연 siNA과는 달리, 화학적으로 변형된 siNA는 또한 인체 내의 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수 있다.In a non-limiting example, the introduction of chemically-modified nucleotides into nucleic acid molecules is potent in overcoming the potential limitations of in vivo stability and bioavailability inherent in exogenously delivered natural RNA molecules. Provide tools. For example, using chemically-modified nucleic acid molecules can lower the dosage of administering a particular nucleic acid molecule for a given pharmaceutical effect since chemically modified nucleic acid molecules tend to have longer half-lives in the serum. have. In addition, some chemical modifications may increase the bioavailability of nucleic acid molecules by targeting specific cells or tissues and / or enhancing cellular uptake of the nucleic acid molecule. Therefore, although the activity of a chemically-modified nucleic acid molecule is reduced compared to a natural nucleic acid molecule, for example compared to an all-RNA nucleic acid molecule, the overall activity of the modified nucleic acid molecule is It may be higher than the activity of the natural molecule due to improved stability and / or delivery. Unlike unmodified native siNAs, chemically modified siNAs can also minimize the possibility of activating interferon activity in the human body.

본 발명의 siNA 분자의 안티센스 영역인 여기에 설명된 siNA 분자들은 상기 안티센스 영역의 3'-말단에서 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 여기에 설명된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 안티센스 영역은 상기 안티센스 영역이 5' 말단에서 약 한 개 내지 약 다섯 개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 여기에 설명된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 본 발명의 siNA 분자의 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들은 핵산 당, 염기, 또는 골격(backbone)에서 화학적으로-변형된 리보뉴클레오티드들 또는 디옥시리보뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 여기에 설명된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들은 하나 이상의 유니버셜 염기 리보뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 여기에 설명된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들은 하나 이상의 비사이클릭 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.The siNA molecules described herein, which are antisense regions of the siNA molecules of the present invention, may comprise phosphorothioate internucleotide chains at the 3′-end of the antisense region. In any of the embodiments of siNA molecules described herein, the antisense region may comprise about 1 to about 5 phosphorothioate internucleotide chains at the 5 'end of the antisense region. In any of the embodiments of siNA molecules described herein, the 3'-terminal nucleotide overhangs of the siNA molecule of the invention are chemically-modified ribonucleotides or deoxyribonucleotides at the nucleic acid sugar, base, or backbone. Can include them. In any of the embodiments of siNA molecules described herein, the 3′-terminal nucleotide overhangs may comprise one or more universal base ribonucleotides. In any of the embodiments of siNA molecules described herein, the 3′-terminal nucleotide overhangs may comprise one or more acyclic nucleotides.

예를 들어, 비 한정 예에서, 본 발명은 하나의 siNA 가닥 내에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 가지는 화학적으로-변형된 짧은 간섭 핵산(siNA)을 특징으로 한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 양쪽 siNA 가닥들 내에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 개별적으로 가지는 화학적으로-변형된 짧은 간섭 핵산(siNA)을 특징으로 한다. 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들은 siNA 듀플렉스의 한쪽 또는 양쪽 올리고뉴클레오티드 가닥들 내에서 예를 들어, 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들 내에서 존재할 수 있다. 본 발명의 siNA 분자들은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들의 3'-말단, 5'-말단 또는 3'- 및 5'-말단들에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 대표적인 siNA 분자는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들의 5'-말단에서 약 1 내지 약 5 개 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5 개 이상) 연속적인 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 대표적인 siNA 분자는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들 내에서 하나 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상) 피리미딘 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 대표적인 siNA 분자는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들 내에서 하나 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상) 퓨린 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다.For example, in a non-limiting example, the present invention provides chemically-modified having about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more phosphorothioate internucleotide chains in one siNA strand. Short interfering nucleic acids (siNAs). In another embodiment, the present invention provides a chemically-modified short having individually at least about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more phosphorothioate internucleotide chains in both siNA strands. It is characterized by an interfering nucleic acid (siNA). Phosphorothioate internucleotide chains may be present in one or both oligonucleotide strands of an siNA duplex, for example in the sense strand, antisense strand or both strands. The siNA molecules of the invention may comprise one or more phosphorothioate internucleotide chains at the 3'-terminus, 5'-terminus or 3'- and 5'-terminus of the sense strand, antisense strand or both strands. For example, an exemplary siNA molecule of the invention is about 1 to about 5 or more (eg, about 1, 2, 3, 4, 5 or more) consecutive at the 5'-end of the sense strand, antisense strand or both strands. Phosphorothioate internucleotide chains. In another non-limiting example, an exemplary siNA molecule of the invention is one or more (eg, about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) in the sense strand, antisense strand or both strands. Or more) pyrimidine phosphorothioate internucleotide chains. In another non-limiting example, an exemplary siNA molecule of the invention is one or more (eg, about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, within the sense strand, antisense strand or both strands). 10 or more) purine phosphorothioate internucleotide chains.

siNA 분자는 원형 핵산 분자로 구성될 수 있으며, 상기 siNA는 약 18 내지 약 23 개(예컨대, 약 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 개) 염기쌍을 가지는 길이가 약 38 내지 약 70 (예컨대, 약 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70) 뉴클레오티드들이며, 상기 원형 올리고뉴클레오티드는 약 19 염기쌍 및 2 개 루프들을 가지는 아령체 모양의 구조를 형성한다.siNA molecules may be composed of circular nucleic acid molecules, wherein the siNA is about 38 to about 70 (eg, about 18 to about 23 (eg, about 18, 19, 20, 21, 22, or 23) base pairs in length , About 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 or 70) nucleotides, the circular oligonucleotides form a dumbbell-like structure with about 19 base pairs and two loops.

원형 siNA 분자는 두 개의 루프 모티프들을 포함하며, 상기 siNA 분자의 하나 또는 양쪽 루프 부분들은 생분해성이다. 예를 들어, 본 발명의 원형 siNA 분자는 siNA 분자의 루프 부분들의 생체 내 분해가 약 2 뉴클레오티드들을 포함하는 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들과 같은 3'-터미널 오버행들을 지닌 이중-가닥 siNA 분자를 발생시킬 수 있다.The circular siNA molecule contains two loop motifs, one or both loop portions of the siNA molecule are biodegradable. For example, the circular siNA molecule of the present invention produces a double-stranded siNA molecule with 3'-terminal overhangs, such as 3'-terminal nucleotide overhangs, wherein the in vivo degradation of the loop portions of the siNA molecule includes about 2 nucleotides. You can.

siNA 분자들 내에서, 바람직하게는 siNA 분자들의 안티센스 가닥 내에서, 또한 선택적으로는 센스 및/또는 안티센스 및 센스 가닥들 양쪽 내에서 존재하는 변형된 뉴클레오티드들은 자연발생적 리보뉴클레오티드들과 유사한 성질 또는 특성을 지닌 변형된 뉴클레오티드들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 노던 입체구조(Northern conformation)(예컨대, 노던 유사회전(pseudorotation) 사이클에서 처럼, 예를 들어, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer- Verlag ed., 1984를 참조)를 가지는 수정된 뉴클레오티드들을 포함하는 siNA 분자들을 특징으로 한다. 그와 같이, 본 발명의 siNA 분자들 내에서, 바람직하게는 본 발명의 siNA 분자들의 안티센스 가닥 내에서, 또한 선택적으로는 센스 및/또는 안티센스 및 센스 가닥들 양쪽 내에서 존재하는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드들은 뉴클레아제 분해에 내성을 가지면서 동시에 RNAi를 매개하는 능력을 유지한다. 노던 배치를 가지는 뉴클레오티드들의 비제한적인 예들은 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오티드들(예컨대, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오티드들(2'-O, 4'-C-methylene-(D-ribofuranosyl) nucleotides)); 2'-메톡시에톡시(MOE) 뉴클레오티드들; 2'-메틸-티오-에틸(2'-methyl-thio-ethyl), 2'-디옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드들(2'-deoxy-2'-fluoro nucleotides), 2'-디옥시-2'-클로로 뉴클레오티드들(2'-deoxy-2'-chloro nucleotides), 2'-아지도 뉴클레오티드들(2'-azido nucleotides) 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드들(2'-O-methyl nucleotides)을 포함한다.Modified nucleotides present in siNA molecules, preferably in the antisense strand of siNA molecules, and optionally in both the sense and / or antisense and sense strands, exhibit similar properties or properties as naturally occurring ribonucleotides. Containing modified nucleotides. For example, the present invention can be used in Northern conformation (eg, in Northern pseudorotation cycles, for example in Saenger, Principles). of Nucleic Acid SiNA molecules comprising modified nucleotides having a structure , see Springer- Verlag ed., 1984). As such, chemically modified nucleotides are present in the siNA molecules of the invention, preferably in the antisense strand of the siNA molecules of the invention, and optionally in both the sense and / or antisense and sense strands. They are resistant to nuclease degradation while maintaining their ability to mediate RNAi. Non-limiting examples of nucleotides having a northern configuration include locked nucleic acid (LNA) nucleotides (eg, 2′-O, 4′-C-methylene- (D-ribofuranosyl) nucleotides (2′-O, 4 ′) -C-methylene- (D-ribofuranosyl) nucleotides)); 2'-methoxyethoxy (MOE) nucleotides; 2'-methyl-thio-ethyl, 2'-deoxy-2'-fluoro nucleotides, 2'-deoxy 2'-deoxy-2'-chloro nucleotides, 2'-azido nucleotides and 2'-O-methyl nucleotides (2'-O-methyl nucleotides).

이중 가닥 siNA 분자의 센스 가닥은 센스 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 3' 및 5'-말단들 양쪽에서 역위 디옥시베이식(deoxybasic) 모이어티와 같은 말단 캡 모이어티를 가질 수 있다.The sense strand of a double stranded siNA molecule may have a terminal cap moiety such as an inverted deoxybasic moiety at the 3'-end, 5'-end or both 3 'and 5'-ends of the sense strand. .

접합체들의 비제한적인 예들은 도면들을 포함하여 여기에 그대로 참조로 포함된 Vargeese, et al.,이 2003년 4월 30일에 출원한 U.S. Application Serial No. 10/427,160에서 설명된 접합체들 및 리간드들을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 접합체는 생분해성 링커를 통하여 화학적으로-변형된 siNA 분자에 공유적으로 부착된다. 일 실시예에서, 접합체 분자는 화학적으로-변형된 siNA 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들 중 어느 하나의 3'-말단에 부착된다. 다른 실시예에서, 접합체 분자는 화학적으로 변형된 siNA 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들 중 어느 하나의 5'-말단에 부착된다. 또 다른 실시예에서, 접합체 분자는 화학적으로 변형된 siNA 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들 중 어느 하나 또는 그 임의의 결합된 것의 3'-말단 및 5'-말단 양쪽에 부착된다. 일 실시예에서, 본 발명의 접합체 분자는 화학적으로-변형된 siNA 분자를 세포와 같은 생물학적 시스템 내로의 전달을 용이하게 하는 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 화학적으로-변형된 siNA 분자에 부착된 접합체 분자는 폴리 에틸렌 글리콜, 인간 혈청 알부민, 또는 세포 흡수를 매개할 수 있는 세포 수용체용 리간드이다. 본 발명에 의해 고찰되는, 화학적으로-변형된 siNA 분자들에 부착될 수 있는 특이적 접합체 분자들의 예들은 Vargeese et al., 2003년 7월 10일에 출간된 U.S. Patent Application Publication 20030130186 및 2004년 6월 10일에 출간된 U.S. Patent Application Publication 20040110296에 기재되어 있다. 본 발명에 사용된 접합체들의 유형 및 siNA 분자들의 접합 정도를 siNA 컨스트럭트들의 약동학적(pharmacokinetic) 프로파일, 생체이용도 및/또는 안정성의 개선 여부를 평가하는 동시에 RNAi 활성을 매개하는 siNA의 능력의 유지 여부에 대하여 평가할 수 있다. 그와 같이, 당업자는 예를 들어, 업계에서 일반적으로 알려진 동물 모델들에서 siNA 접합 복합체는 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서 개선된 성질을 보유하는지의 여부를 결정하기 위하여 다양한 접합체들로 변형된 siNA 컨스트럭트들을 스크리닝할 수 있다.Non-limiting examples of conjugates include U.S. Patent Application, filed April 30, 2003 to Vargeese, et al., Incorporated herein by reference in its entirety, including the drawings. Application Serial No. Conjugates and ligands described in 10 / 427,160. In other embodiments, the conjugates are covalently attached to chemically-modified siNA molecules via biodegradable linkers. In one embodiment, the conjugate molecule is attached to the 3'-terminus of either the sense strand, the antisense strand, or both strands of the chemically-modified siNA molecule. In other embodiments, the conjugate molecule is attached to the 5'-terminus of either the sense strand, the antisense strand, or both strands of the chemically modified siNA molecule. In another embodiment, the conjugate molecule is attached to both the 3'-end and 5'-end of the sense strand, the antisense strand, or both strands of a chemically modified siNA molecule. In one embodiment, the conjugate molecules of the invention include molecules that facilitate delivery of chemically-modified siNA molecules into biological systems such as cells. In another embodiment, the conjugate molecule attached to a chemically-modified siNA molecule is polyethylene glycol, human serum albumin, or a ligand for cell receptor that can mediate cellular uptake. Examples of specific conjugate molecules that can be attached to chemically-modified siNA molecules contemplated by the present invention are described in U.S., published on Vargeese et al., July 10, 2003. U.S. Patent Application Publication 20030130186 and June 10, 2004. Patent Application Publication 20040110296. The type of conjugates used and the degree of conjugation of siNA molecules used in the present invention assess the pharmacokinetic profile, bioavailability and / or stability of the siNA constructs, while at the same time the ability of the siNA to mediate RNAi activity. Can be evaluated for maintenance. As such, those skilled in the art will appreciate that siNA conjugate complexes, for example, in animal models generally known in the art, may be modified with various conjugates to determine whether or not the siNA conjugate complex retains improved properties while retaining the ability to mediate RNAi. Constructs can be screened.

siNA는 siNA 센스 영역을 siNA의 안티센스 영역과 연결하는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커로 더 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 예를 들어, 길이가 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오티드들인 길이가 2 뉴클레오티드들을 초과하는 링커일 수 있다. 다른 실시예에서, 뉴클레오티드 링커는 핵산 앱타머(aptamer)일 수 있다. 여기에 사용된 "앱타머" 또는 "핵산 앱타머"는 표적 분자와 특이적으로 결합하는 핵산 분자로서 자연적 세팅(setting)에서 표적 분자에 의해 인식되는 서열을 포함하는 서열을 가지는 핵산 분자를 의미한다. 또한, 앱타머는 표적 분자가 자연적으로 핵산과 결합하지 않는 그러한 표적 분자와 결합하는 핵산 분자일 수 있다. 표적 분자는 중요한 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 단백질의 리간드-결합 도메인과 결합하여 자연발생적 리간드의 단백질과의 상호작용을 방지하는 데 이용될 수 있다. 이는 비제한적인 예이며 당업자는 다른 실시예들이 업계에서 일반적으로 알려진 기법들을 이용하여 용이하게 발생될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 예를 들어, Gold, et al., Annu . Rev . Biochem. 64:763, 1995; Brody and Gold, J. Biotechnol. 74:5, 2000; Sun, Curr . Opin . MoI . Ther. 2:100, 2000; Kusser, J. Biotechnol. 74:27, 2000; Hermann and Patel, Science 287:820, 2000; 및 Jayasena, Clinical Chemistry 45:1628, 1999를 참조.The siNA may further consist of nucleotides, non-nucleotides, or mixed nucleotide / non-nucleotide linkers that link the siNA sense region with the antisense region of the siNA. In one embodiment, for example, it may be a linker that is greater than 2 nucleotides in length that is about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides in length. In other embodiments, the nucleotide linker may be a nucleic acid aptamer. As used herein, “aptamer” or “nucleic acid aptamer” refers to a nucleic acid molecule that has a sequence that includes a sequence that is recognized by the target molecule in its natural setting as a nucleic acid molecule that specifically binds to the target molecule. . In addition, aptamers can be nucleic acid molecules that bind to such target molecules that the target molecule does not naturally bind to the nucleic acid. The target molecule can be any molecule of interest. For example, aptamers can be used to bind the ligand-binding domains of a protein to prevent interaction of naturally occurring ligands with the protein. This is a non-limiting example and those skilled in the art will recognize that other embodiments may be readily generated using techniques generally known in the art. See, eg, Gold, et al., Annu . Rev. Biochem . 64: 763, 1995; Brody and Gold, J. Biotechnol . 74: 5, 2000; Sun, Curr . Opin . MoI . Ther . 2: 100, 2000; Kusser, J. Biotechnol . 74:27, 2000; Hermann and Patel, Science 287: 820, 2000; And Jayasena, Clinical Chemistry 45: 1628, 1999.

비-뉴클리오티드 링커는 무염기 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리하이드로카본(polyhydrocarbon) 또는 다른 고분자 화합물들(예컨대, 2 내지 100 개 사이의 에틸렌 글리콜 유니트들을 가지는 폴리에틸렌 글리콜들)로 구성될 수 있다. 특이적인 예들은 Seela and Kaiser의 [Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990]과 [Nucleic Acids Res. 75:3113, 1987]; [Cload and Schepartz, J. Am . Chem . Soc. 113:6324, 1991]; [Richardson and Schepartz, J. Am . Chem . Soc. 113:5109, 1991]; Ma 등의 [Nucleic Acids Res. 21:2585, 1993]과 [Biochemistry 32:1751, 1993]; [Durand, et al., Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990]; [McCurdy, et al., Nucleosides & Nucleotides 10:281, 1991]; [Jschke, et al., Tetrahedron Lett. 34:301, 1993]; [Ono, et al., Biochemistry 30:9914, 1991]; Arnold 등의 국제공개 제WO 89/02439호; Usman 등의 국제공개 제WO 95/06731호; Dudycz 등의 국제공개 제WO 95/11910호 및 [Ferentz and Verdine, J. Am . Chem . Soc. 113:4000, 1991]에 설명된 예들을 포함한다. "비-뉴클레오티드(non-nucleotide)"는 당 및/또는 인산염 치환을 포함하여 하나 이상의 뉴클레오티드 유니트들 대신에 핵산 사슬로 혼입될 수 있는 임의의 그룹 또는 화합물을 더 의미하며 나머지 염기들이 그 효소적 활성을 보이도록 한다. 상기 그룹 또는 화합물은 예를 들어, 당의 C1 위치에서 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티미딘과 같은 흔히 인식되는 뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는다는 점에서 무염기성일 수 있다.Non-nucleotide linkers are base nucleotides, polyethers, polyamines, polyamides, peptides, carbohydrates, lipids, polyhydrocarbons or other high molecular compounds (e.g. between 2 and 100 ethylene glycol units). Polyethylene glycols). Specific examples are from Seela and Kaiser's [Nucleic Acids Res. 18: 6353, 1990] and [Nucleic Acids Res. 75: 3113, 1987; Load and Schepartz,J. Am . Chem . Soc. 113: 6324, 1991; Richardson and Schepartz,J. Am . Chem . Soc. 113: 5109, 1991; Ma et al. [Nucleic Acids Res. 21: 2585, 1993] and [Biochemistry 32: 1751, 1993; Durand, et al.,Nucleic Acids Res. 18: 6353, 1990; McCurdy, et al.,Nucleosides & Nucleotides 10: 281, 1991; Jschke, et al.,Tetrahedron Lett. 34: 301, 1993; Ono, et al.,Biochemistry 30: 9914, 1991; International Publication No. WO 89/02439 to Arnold et al .; International Publication No. WO 95/06731 by Usman et al .; International Publication No. WO 95/11910 by Dudycz et al. And [Ferentz and Verdine,J. Am . Chem . Soc. 113: 4000, 1991]. "Non-nucleotide" further refers to any group or compound that can be incorporated into a nucleic acid chain instead of one or more nucleotide units, including sugar and / or phosphate substitutions, with the remaining bases being enzymatically active Make it visible. The group or compound may be baseless in that it does not include commonly recognized nucleotide bases such as, for example, adenosine, guanine, cytosine, uracil or thymidine at the C1 position of the sugar.

화학적으로-변형될 수 있는, 본 발명의 siNA 분자의 합성은 (a) siNA 분자의 두 개의 상보적 가닥들의 합성; (b) 이중-가닥 siNA 분자를 얻는 데 적절한 조건하에서 상기 두 개의 상보적 가닥들의 어닐링(annealing)를 포함한다. 다른 실시예에서, siNA 분자의 두 개의 상보적 가닥들의 합성은 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것이다. 또 다른 실시예에서, siNA 분자의 두 개의 상보적 가닥들의 합성은 고체상 탄뎀(tandem) 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것이다.Synthesis of siNA molecules of the invention, which may be chemically-modified, includes (a) the synthesis of two complementary strands of siNA molecules; (b) annealing the two complementary strands under conditions suitable for obtaining a double-stranded siNA molecule. In another embodiment, the synthesis of two complementary strands of an siNA molecule is by solid phase oligonucleotide synthesis. In yet another embodiment, the synthesis of two complementary strands of an siNA molecule is by solid phase tandem oligonucleotide synthesis.

뉴클레오티드들(예컨대, 몇몇 변형된 올리고뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들이 부족한 올리고뉴클레오티드들의 부분들)은 예를 들어, 문헌[Caruthers, et al., Methods in Enzymology 211:3-19, 1992]; Thompson 등의 국제 PCT 공개 제WO 99/54459호; [Wincott, et al., Nucleic Acids Res. 25:2677-2684, 1995]; [Wincott, et al., Methods MoI . Bio. 74:59, 1997]; [Brennan, et al., Biotechnol Bioeng. 61:33-45, 1998]; 및 Brennan의 미국 특허 제6,001,311호에 설명된 바와 같이 업계에서 알려진 프로토콜들을 이용하여 합성된다. 본 발명의 몇몇 siNA 분자들을 포함한 RNA 합성은 예를 들어, 문헌 [Usman, et al., J. Am . Chem . Soc. 109:7845, 1987]; [Scaringe, et al., Nucleic Acids Res. 18:5433, 1990]; 및 [Wincott, et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995]; [Wincott, et al., Methods Mol . Bio. 74:59, 1997]에 설명된 바와 같은 일반적인 절차들을 따른다.Nucleotides (eg, portions of oligonucleotides lacking some modified oligonucleotides or ribonucleotides) are described, for example, in Carurthers, et al., Methods in Enzymology 211: 3-19, 1992; International PCT Publication No. WO 99/54459 to Thompson et al .; Wincott, et al., Nucleic Acids Res . 25: 2677-2684, 1995; Wincott, et al., Methods MoI . Bio . 74:59, 1997; Brennan, et al., Biotechnol Bioeng . 61: 33-45, 1998; And protocols known in the art as described in US Pat. No. 6,001,311 to Brennan. RNA synthesis comprising several siNA molecules of the invention is described, for example, in Usman, et al., J. Am . Chem . Soc . 109: 7845, 1987; Scaringe, et al., Nucleic Acids Res . 18: 5433, 1990; And Wincott, et al., Nucleic Acids Res . 23: 2677-2684, 1995; Wincott, et al., Methods Mol . Bio . 74:59, 1997], followed by general procedures.

본 발명 내에서 사용되는 핵산 분자들의 전달을 위한 추가적 또는 보완적인 방법들은 예를 들어, 문헌 [Akhtar, et al., Trends Cell Bio. 2:139, 1992]; [Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995]; [Maurer, et al., Mol . Membr . Biol. 16:129-140, 1999]; [Hofland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol. 137:165-192, 1999]; 및 [Lee, et al., ACS Symp. Ser. 752:184-192, 2000]에 설명되어 있다. Sullivan 등의 국제 PCT 공개 제WO 94/02595호는 효소적 핵산 분자들의 전달을 위한 일반적인 방법들을 더 설명한다. 이러한 프로토콜들은 본 발명 내에서 고찰된 실질적으로 임의의 핵산 분자의 전달을 추가하거나 보완하는 데 이용될 수 있다.Additional or complementary methods for the delivery of nucleic acid molecules used within the present invention are described, for example, in Akhtar, et al., Trends Cell Bio. 2: 139, 1992; [ Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics , ed. Akhtar, 1995; Maurer, et al., Mol . Membr . Biol . 16: 129-140, 1999; Hofland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol . 137: 165-192, 1999; And Lee, et al., ACS Symp . Ser. 752: 184-192, 2000. International PCT Publication No. WO 94/02595 to Sullivan et al. Further describes general methods for the delivery of enzymatic nucleic acid molecules. Such protocols can be used to add or complement delivery of substantially any nucleic acid molecule contemplated within the present invention.

핵산 분자들 및 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 siNA 및 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 단독을 포함하거나 약학적으로 수용 가능한 담체(carrier), 희석제, 부형제(excipient), 보강제(adjuvant), 유화제(emulsifier), 완충제, 안정제, 보존제 등과 같은 하나 이상의 추가적인 요소들을 더 포함하는 제형들 내에서의 투여를 포함하지만 그에 한정되지 않는 다양한 방법들에 의해 세포들에 투여될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, siNA 및/또는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 리포솜들 내에서 캡슐화 되거나, 이온영동법(iontophoresis)에 의해 투여되거나, 히드로겔들(hydrogels), 사이클로덱스트린들, 생분해성 나노캡슐들, 생접착성 미세구들(bioadhesive microsphere) 또는 단백성 벡터들과 같은 다른 운반체들 내로 혼입될 수 있다(O'Hare and Normand, InteRNAtional PCT Publication No. WO 00/53722 참조). 또한, 핵산/펩티드/운반체 결합물은 직접 주입 또는 주입 펌프를 사용하여 국소적으로 전달될 수 있다. 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 또는 피내(intradermal)에 의하든 본 발명의 핵산 분자들의 직접 주입은 표준 바늘 및 주사기 방법을 이용하거나 Conry, et al, Clin . Cancer Res. 5:2330-2337, 1999, 및 Barry, et al, InteRNAtional PCT Publication No. WO 99/31262에 설명된 바늘을 사용하지 않는(needle-free) 방법에 의해 주입될 수 있다.Nucleic acid molecules and polynucleotide delivery-enhancing polypeptides include siNA and polynucleotide delivery-enhancing polypeptides alone or as pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients, adjuvants, emulsifiers, The cells can be administered by a variety of methods, including but not limited to administration in formulations further comprising one or more additional elements such as buffers, stabilizers, preservatives, and the like. In some embodiments, siNA and / or polynucleotide delivery-enhancing polypeptides are encapsulated in liposomes, administered by iontophoresis, hydrogels, cyclodextrins, biodegradable nanocapsules , Bioadhesive microspheres or other carriers such as protein vectors (O'Hare and Normand, InteRNAtional PCT Publication No. WO 00/53722). In addition, nucleic acid / peptide / carrier combinations may be delivered topically using direct infusion or infusion pumps. Direct injection of nucleic acid molecules of the invention, whether subcutaneous, intramuscular, or intradermal, can be carried out using standard needle and syringe methods or by Conry, et al, Clin . Cancer Res . 5: 2330-2337, 1999, and Barry, et al, InteRNAtional PCT Publication No. It can be injected by a needle-free method described in WO 99/31262.

본 발명의 조성물들은 약학적 제제들로 효과적으로 사용될 수 있다. 약학적 제제들은 환자의 질병 상태 또는 다른 바람직하지 않은 조건을 방지하거나 발생 또는 심화를 조정하거나 치료(하나 이상의 증상(들)의 검출 또는 측정 가능할 정도로 완화시킴)한다.The compositions of the present invention can be effectively used in pharmaceutical formulations. The pharmaceutical agents prevent, modulate, or treat (mitigate to the extent that one or more symptom (s) are detectable or measurable) to prevent disease conditions or other undesirable conditions of the patient.

따라서, 추가적인 실시예들 내에서 본 발명은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 결합, 복합되거나 접합되어, 희석제, 안정제, 완충제 등과 같은 약학적으로-수용 가능한 담체와 선택적으로 제형된 통상적으로 하나 이상의 siNA들인 하나 이상의 폴리핵산(들)의 존재 또는 투여를 특징으로 하는 약학 조성물들 및 방법들을 제공한다.Thus, within additional embodiments, the present invention is typically one or more siNAs, optionally formulated with pharmaceutically-acceptable carriers such as diluents, stabilizers, buffers, etc., in combination, complexed or conjugated with a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide. Pharmaceutical compositions and methods are characterized by the presence or administration of one or more polynucleic acid (s).

본 발명은 피검물의 특정한 질병 상태 또는 다른 바람직하지 않은 조건과 관련된 유전자들의 발현을 조절하는 짧은 간섭 핵산(siNA) 분자들을 제공함으로써 다른 목적들 및 장점들을 충족시킨다. 통상적으로, siNA는 피검물의 질병 상태 또는 바람직하지 않은 조건과 관련된 유발(causal) 또는 기여 인자(contributing factor)로서 격상된(elevated) 수준에서 발현되는 유전자를 표적으로 할 것이다. 이러한 맥락에서, siNA는 하나 이상의 관련된 질병 증상이 심화되거나 재발되는 것을 방지, 완화 또는 감소시킬 수준으로까지 유전자의 발현을 효과적으로 하향 조절할 것이다. 또한, 표적 유전자의 표현이 질병 또는 다른 바람직하지 않은 조건의 결과 또는 후내로서 언제나 격상되는 것은 아닌 다양한 질병 모델들에 대하여, 표적 유전자의 하향 조절은 그럼에도 유전자 발현을 하향함으로써(즉, 선택된 mRNA 및/또는 표적 유전자의 단백질 산물의 수준을 낮추어서) 치료되는 결과로 나타날 것이다. 또한, 본 발명의 siNA들은 유전자의 발현을 낮추어서, 그러한 표적 유전자의 산물 또는 활성에 의하여 그 발현이 억제적으로 조절되는 "하위(downstream)" 유전자의 상향조절로 결과가 나타날 수 있다.The present invention fulfills other objects and advantages by providing short interfering nucleic acid (siNA) molecules that regulate the expression of genes associated with a particular disease state or other undesirable condition of the subject. Typically, siNA will target genes that are expressed at elevated levels as causal or contributing factors associated with the disease state or undesirable condition of the subject. In this context, siNA will effectively down regulate the expression of genes to a level that will prevent, alleviate or reduce one or more related disease symptoms intensifying or recurring. In addition, for various disease models in which expression of the target gene is not always upgraded as a result or post-mortem of a disease or other undesirable condition, down regulation of the target gene nevertheless downgrades gene expression (ie, selected mRNA and / or Or by lowering the level of the protein product of the target gene). In addition, siNAs of the present invention may result in upregulation of "downstream" genes by lowering the expression of the gene, whereby its expression is repressively regulated by the product or activity of such a target gene.

대표적인 실시예들 내에서, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis: RA) 증세를 치료하거나 방지하기 위하여 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 발현을 조절하는 치료적 도구로서 유용하다. 이러한 맥락에서, 본 발명은 소 핵산 분자들을 이용한 RNA 간섭(RNAi)에 의해 TNF-α의 발현 및 활성을 조절하는 데 유용한 화합물들, 조성물들 및 방법들을 더 제공한다. 더 상세한 실시예들에서, 본 발명은 포유류 피검물들의 RA 증세를 방지하거나 완화시킬 TNF-α 및/또는 TNF-α 유전자들의 표현을 조절하는 데 효과적인 짧은 간섭 핵산(siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(mRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 관련 방법들을 제공한다. 이러한 것들 및 관련된 치료 조성물들 및 방법들 내에서, 화학적으로-변형된 siNA들을 사용하면 예를 들어, 생체 내 뉴클레아제 분해에 내성을 증가시키고/증가시키거나 세포 흡수의 개선을 통하여 천연 siNA 분자들의 성질과 비교하여 변형된 siNA들의 성질을 종종 개선 시킬 것이다. 본 개시물에 따라서 용이하게 결정될 수 있는 바와 같이, 다수의 화학적 변형들을 가지는 유용한 siNA들은 그 RNAi 활성을 유지할 것이다. 따라서 본 발명의 siNA 분자들은 다양한 치료, 진단, 표적 효과검증(target validation), 유전적 발견, 유전 공학 및 약제유전학적(pharmacogenomic) 응용들을 위한 유용한 시약들 및 방법들을 제공한다.Within exemplary embodiments, the compositions and methods of the present invention provide a therapeutic tool for modulating the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) to treat or prevent rheumatoid arthritis (RA) symptoms. useful. In this context, the present invention further provides compounds, compositions and methods useful for modulating the expression and activity of TNF-α by RNA interference (RNAi) using small nucleic acid molecules. In more detailed embodiments, the present invention provides short interfering nucleic acid (siNA), short interfering RNA (siRNA) effective to modulate the expression of TNF-α and / or TNF-α genes that will prevent or alleviate RA symptoms in mammalian specimens. ), Double-stranded RNA (dsRNA), micro-RNA (mRNA), and short hairpin RNA (shRNA) and related methods. Within these and related therapeutic compositions and methods, the use of chemically-modified siNAs can result in natural siNA molecules, for example, by increasing resistance to nuclease degradation in vivo and / or improving cell uptake. It will often improve the properties of the modified siNAs compared to their properties. As can be readily determined according to the present disclosure, useful siNAs with multiple chemical modifications will retain their RNAi activity. The siNA molecules of the present invention thus provide useful reagents and methods for a variety of therapeutic, diagnostic, target validation, genetic discovery, genetic engineering and pharmacogenomic applications.

본 발명의 이러한 siNA들은 예를 들어, 경피적으로 또는 국소 주입(예컨대, 건선(poriasis)을 치료하기 위하여 건선 플라크(psoriatic plaques)의 부위에 또는 건선 간절염(psoriatic arthritis) 또는 RA로 고통받는 환자들의 관절들 내로 국소 주입)과 같은 임의의 형태로 투여될 수 있다. 더 상세한 실시예들에서, 본 발명은 TNF-α의 mRNA에 대하여 siNA들을 치료적으로 유효량을 투여하여 TNF-α RNA를 효과적으로 하향-조절함으로써 하나 이상의 TNF-α- 관련 염증 상태(들)을 감소시키거나 방지하도록 제형들 및 방법들을 제공한다. 그 발현이 선택된 질병 조건과 관련된 유발 또는 기여 인자로서 비정상적으로 증대된 것으로 알려져 있는 수많은 유전자들 중 임의의 것을 포함하여, 동물 피검물들의 선택된 질병 조건과 관련된 하나 이상의 상이한 유전자들의 표현을 표적하는 유사한 방법들 및 조성물들이 제공된다.Such siNAs of the present invention are for example in patients suffering from psoriatic arthritis or RA or at the site of psoriatic plaques, for example, for the treatment of percutaneous or topical infusions (eg, psoriasis). And topical infusion into the joints). In more detailed embodiments, the present invention reduces the one or more TNF-α-related inflammatory state (s) by effectively down-regulating TNF-α RNA by administering a therapeutically effective amount of siNAs against TNF-α mRNA. Formulations and methods are provided to make or prevent. Similar methods of targeting expression of one or more different genes associated with selected disease conditions in animal specimens, including any of numerous genes whose expression is known to be abnormally enhanced as a trigger or contributing factor associated with the selected disease condition And compositions are provided.

본 발명의 siNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 혼합물들이 예를 들어, RA 또는 건선과 같은 염증성 질병들에 대해 효과적인 치료제들과 함께하는 것과 같이, 표적된 질병 조건에 대한 다른 표준 치료제들과 함께 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 병용적으로 유용하고 효과적인 제제들의 예들은 비-스테로이드성 소염제들(NSAID들), 메토트렉세이트(methotrexate), 금 화합물들, D-페니실라민(penicillamine), 항말라리아제들(antimalarials), 설파살라진(sulfasalazine), 글루코코르티코이드들(glucocorticoids) 및 인플릭시맵(infliximab)과 엔트라셉트(entracept)와 같은 다른 TNF-α 중화제들을 포함한다.The siNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide mixtures of the present invention may be administered in combination with other standard therapies for the targeted disease condition, such as with effective therapies for inflammatory diseases such as, for example, RA or psoriasis. have. Examples of concomitantly useful and effective agents in this context are non-steroidal anti-inflammatory agents (NSAIDs), methotrexate, gold compounds, D-penicillamine, antimalarials, sulfasalazine sulfasalazine, glucocorticoids and other TNF-α neutralizers such as infliximab and entracept.

본 발명의 음으로 대전된 폴리뉴클레오티드들은 약학 조성물을 형성하도록 안정제들 및 완충제등을 사용하거나 사용하지 않는 임의의 표준 수단들에 의하여 환자에게 투여될 수 있다. 리포솜 전달 메커니즘의 이용이 바람직한 경우에, 리포솜들의 형성을 위한 표준 프로토콜들을 따를 수 있다. 본 발명의 조성물들은 또한 경구 투여용의 정제들(tablets), 캡슐들(capsules) 또는 일릭서들(elixirs), 직장 투여용의 좌약들, 주입식 투여용 살균액들, 현탁액들 및 업계에 알려진 다른 조성물들로서 제형되고 사용될 수 있다.The negatively charged polynucleotides of the present invention may be administered to a patient by any standard means, with or without stabilizers, buffers, and the like, to form a pharmaceutical composition. If the use of liposome delivery mechanisms is desired, standard protocols for the formation of liposomes can be followed. The compositions of the present invention may also be used in tablets, capsules or elixirs for oral administration, suppositories for rectal administration, sterile solutions for injectable administration, suspensions and other known in the art. It can be formulated and used as compositions.

본 발명은 또한 여기에 설명된 조성물들의 약학적으로 수용가능한 제형들을 포함한다. 이러한 제형들은 예를 들어, 염화수소산, 브롬화수소산, 아세트산 및 벤젠 술폰산의 염들처럼 산 첨가 염들과 같은 상기 화합물들의 염들을 포함한다.The invention also includes pharmaceutically acceptable formulations of the compositions described herein. Such formulations include salts of these compounds, such as acid addition salts, for example, salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, acetic acid and benzene sulfonic acid.

약학적 조성물 또는 제형은 예를 들어, 인간을 포함하는 세포 또는 환자 내로 전신성(systemic) 투여와 같은 투여에 적절한 형태로의 조성물 또는 제형을 칭한다. 적절한 형태들이란 예를 들어, 경구, 경피 또는 주입에 의한 사용 및 입수(entry) 경로에 부분적으로 의존한다. 그러한 형태들은 조성물 또는 제형이 표적 세포(즉, 음으로 대전된 핵산이 바람직하게 전달되는 세포)에 이르지 못하도록 해서는 안 된다. 예를 들어, 혈류 내로 주입되는 약학 조성물들은 가용성이어야 한다. 다른 인자들이 업계에 알려져 있고 독성과 같은 고려사항들을 포함한다.A pharmaceutical composition or formulation refers to a composition or formulation in a form suitable for administration such as, for example, systemic administration into cells or patients, including humans. Appropriate forms depend in part on the use and entry route, for example by oral, transdermal or infusion. Such forms should not prevent the composition or formulation from reaching the target cell (ie, the cell to which the negatively charged nucleic acid is preferably delivered). For example, pharmaceutical compositions injected into the bloodstream should be soluble. Other factors are known in the art and include considerations such as toxicity.

"전신성 투여(systemic administration)"라고 하면 혈류 내에 약물을 생체 내 전신 흡수 또는 축적하고 신체 전체를 통한 분산이 뒤따르는 것을 의미한다. 전신 흡수되는 투여 경로들은 제한 없이 정맥내(intravenous), 피하(subcutaneous), 복강내(intraperitoneal), 흡입(inhalation), 경구, 폐내(intrapulmonary) 및 근육내(intramuscular)를 포함한다. 이러한 투여 경로들의 각각은 예컨대, 핵산들과 같이 바람직한 음으로 대전된 고분자들을 접근가능한 병든 조직으로 노출시킨다. 약물이 입수되어 순환되는 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것을 보여준다. 본 발명의 화합물들을 포함하는 리포솜 또는 다른 약물 담체를 사용하게 되면 예를 들어, 망상 내피 계통(reticular endothelial system: RES)의 조직들과 같은 몇몇 조직 유형들 내에 약물을 잠재적으로 국소화할 수 있다. 림프구들 및 대식세포들(macrophages)과 같은 세포들의 표면과 약물의 결합을 용이하게 할 수 있는 리포솜 형성도 유용하다. 이러한 접근법은 암 세포들과 같은 비정상 세포들의 대식 세포 및 림프구 면역 인식의 특이성을 이용함으로써 표적 세포들에 약물의 향상된 전달을 제공할 수 있다."Systemic administration" means the systemic absorption or accumulation of the drug in vivo in the bloodstream followed by dispersion throughout the body. Systemic absorption routes of administration include, without limitation, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation, oral, intrapulmonary and intramuscular. Each of these routes of administration exposes the desired negatively charged polymers, such as nucleic acids, to accessible diseased tissue. The rate at which the drug is obtained and circulated shows that it is a function of molecular weight or size. The use of liposomes or other drug carriers comprising the compounds of the present invention can potentially localize the drug within several tissue types, such as, for example, tissues of the reticular endothelial system (RES). Liposomal formation is also useful, which can facilitate the drug's binding to the surface of cells such as lymphocytes and macrophages. This approach can provide enhanced delivery of the drug to target cells by exploiting the specificity of macrophage and lymphocyte immune recognition of abnormal cells such as cancer cells.

"약학적으로 수용가능한 제형"이라는 의미는 본 발명의 핵산 분자들을 그 바람직한 활성에 매우 적절한 신체적 위치에 효과적으로 분산시키게 하는 조성물 또는 제형을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자들과의 제형에 적절한 제제들의 비-제한적 예들은 중추 신경계로 약물들의 입수를 향상시킬 수 있는 P-당단백질(glycoprotein) 억제제들(플루로닉(pluronic) P85 등)(Jolliet-Riant and Tillement, Fundam . Clin . Pharmacol. 13:16-26, 1999); 뇌내 이식 후 서방성 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜리드(coglycolide)) 미세구들과 같은 생분해성 고분자들(Emerich, D.F., et al., Cell Transplant 8:47-58, 1999) (Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); 및 혈액 뇌관문(blood brain barrier)을 관통하여 약물을 전달하고 뉴런성 흡수 메커니즘들(neuronal uptake mechanisms)을 변경시킬 폴리부틸사이아노아크릴레이트(polybutylcyanoacrylate)로 구성된 것과 같은 혼합된 나노파티클들(loaded nanoparticles)을 포함한다(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 23:941-949, 1999).By “pharmaceutically acceptable formulation” is meant a composition or formulation that allows for the effective dispersal of the nucleic acid molecules of the invention in a physical location that is well suited for their desired activity. Non-limiting examples of agents suitable for formulation with nucleic acid molecules of the invention include P-glycoprotein inhibitors (pluronic P85, etc.) (Jolliet) that can improve the availability of drugs into the central nervous system. -Riant and Tillement, Fundam . Clin . Pharmacol . 13: 16-26, 1999); Biodegradable polymers such as poly (DL-lactide-coglycolide) microspheres for sustained release delivery after brain implantation (Emerich, DF, et al., Cell Transplant 8: 47-58, 1999) (Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); And loaded nanoparticles such as those consisting of polybutylcyanoacrylate, which will deliver drugs through the blood brain barrier and alter neuronal uptake mechanisms. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 23: 941-949, 1999).

본 발명의 핵산 분자들에 대한 전달 전략들의 다른 비-제한적 예들은 Boado, et al., J. Pharm . Sci. 87:1308-1315, 1998; Tyler, et al., FEBS Lett. 421:280-284, 1999; Pardridge, et al., PNAS USA. 92:5592-5596, 1995; Boado, Adv . Drug Delivery Rev. 15:73-107, 1995; Aldrian-Herrada, et al., Nucleic Acids Res. 26:4910-4916, 1998; 및 Tyler, et al., PNAS USA. .96:7053-7058, 1999에 설명된 물질을 포함한다.Other non-limiting examples of delivery strategies for nucleic acid molecules of the invention are described in Boado, et al., J. Pharm . Sci . 87: 1308-1315, 1998; Tyler, et al., FEBS Lett . 421: 280-284, 1999; Pardridge, et al., PNAS USA . 92: 5592-5596, 1995; Boado, Adv . Drug Delivery Rev. 15: 73-107, 1995; Aldrian-Herrada, et al., Nucleic Acids Res . 26: 4910-4916, 1998; And Tyler, et al., PNAS USA . .96: 7053-7058, 1999.

본 발명은 또한 약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제 내에 원하는 화합물들을 약학적으로 유효량 포함하는, 저장 또는 투여를 위해 제조된 조성물들을 포함한다. 치료용 사용을 위한 수용가능한 담체 또는 희석제들은 약학 업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro ed., 1985에 설명되어 있다. 예를 들어, 보존제들, 안정제들, 염색제들 및 향미료들(flavoring agents)이 제공될 수 있다. 이러한 것들은 벤조산 나트륨, 소르브산(sorbic acid) 및 p-하이드록시 벤조산의 에스테르들을 포함한다. 또한, 항산화제들 및 현탁제들이 사용될 수 있다.The invention also includes compositions prepared for storage or administration, comprising a pharmaceutically effective amount of the desired compounds in a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. Acceptable carriers or diluents for therapeutic use are well known in the pharmaceutical art and are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences , Mack Publishing Co., AR Gennaro ed., 1985. For example, preservatives, stabilizers, colorants and flavoring agents may be provided. These include esters of sodium benzoate, sorbic acid and p-hydroxy benzoic acid. In addition, antioxidants and suspending agents may be used.

약학적으로 유효한 투여량은 질병 상태의 발생을 방지, 억제하거나 치료(증상을 어느 정도, 바람직하게는 모든 증상들을 완화시킴)하는 데 필요한 투여량이다. 약학적으로 유효한 투여량은 질병 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유류의 유형, 고려되는 특이적 포유류의 신체적 특징, 공동작용 약제(concurrent medication) 및 의약 업계의 당업자들이 인식할 다른 요인들에 의존한다. 일반적으로, 음으로 대전된 폴리머의 약효(potency)에 따라 0.1 내지 100 mg/kg 체중(body weight)/일(day)의 활성 성분의 양이 투여된다.Pharmaceutically effective dosages are those required to prevent, inhibit or treat (to some extent, preferably alleviate, the symptoms) of a disease state. Pharmaceutically effective dosages may include the type of disease, composition used, route of administration, type of mammal being treated, physical characteristics of the specific mammal under consideration, concurrent medications and other factors that will be recognized by those skilled in the pharmaceutical industry. Depends on Generally, depending on the potency of the negatively charged polymer, an amount of active ingredient of 0.1 to 100 mg / kg body weight / day is administered.

수용성 현탁물들은 수용성 현탁물들의 제조에 적절한 부형제들과 혼합된 활성 물질들을 포함한다. 그러한 부형제들은 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오스, 하이드로프로필-메틸셀룰로오스(hydropropyl-methylcellulose), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 트라가칸트 검(gum tragacanth) 및 아카시아 검(gum acacia)이며; 분산제들 또는 습윤제들(dispersing or wetting agents)은 예를 들어, 레시틴과 같은 자연발생적 인지질(phosphatide) 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트(polyoxyethylene stearate)와 같은 지방산들과의 알킬렌 산화물의 축합물들(condensation products) 또는 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같은 장쇄(long chain) 지방족 알코올과의 에틸렌 산화물의 축합물들 또는 지방산들 및 폴리에틸렌 소르비톨 모노올레에이트(polyethylene sorbitol monooleate)와 같은 헥시톨(hexitol)로부터 유도된 일부 에스테르들과 에틸렌 산화물의 축합물들 또는 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(polyethylene sorbitan monooleate)와 같은 지방산들 및 헥시톨 안하이드라이드들(hexitol anhydrides)로부터 유도된 일부 에스테르들과 에틸렌 산화물의 축합물들일 수 있다. 수용성 현탁물들은 또한 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트(hydroxybenzoate)와 같은 하나 이상의 보존제들, 하나 이상의 착색제들, 하나 이상의 향미료들 및 설탕 또는 사카린(saccharin)과 같은 하나 이상의 감미료들을 포함할 수 있다.Aqueous suspensions include the active materials in admixture with excipients suitable for the manufacture of aqueous suspensions. Such excipients are, for example, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydropropyl-methylcellulose, sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, tragacanth gum gum tragacanth and gum acacia; Dispersing or wetting agents are condensation of alkylene oxides with naturally occurring phosphatides such as lecithin or fatty acids such as polyoxyethylene stearate, for example. Condensates of ethylene oxide with long chain aliphatic alcohols such as condensation products or heptadecaethyleneoxycetanol or hexitols such as fatty acids and polyethylene sorbitol monooleate some esters derived from hexitol and condensates of ethylene oxide or fatty acids such as, for example, polyethylene sorbitan monooleate and some esters derived from hexitol anhydrides And condensates of ethylene oxide. The water soluble suspensions may also be, for example, one or more preservatives such as ethyl, or n-propyl p-hydroxybenzoate, one or more colorants, one or more flavors and one or more such as sugar or saccharin. May include sweeteners.

예를 들어, 낙화생 기름(arachis oil), 올리브 기름, 참기름, 또는 코코넛 기름과 같은 식물성 기름 또는 액체 파라핀과 같은 미네랄유(mineral oil)에 활성 성분들을 현탁하여 유성 현탁액들을 제형할 수 있다. 상기 유성 현탁액들은 예를 들어, 밀랍, 경파라핀 또는 세틸 알코올(cetyl alcohol)과 같은 증점제를 포함할 수 있다. 입에 맞는 경구 제제를 제공하기 위하여 감미료들 및 향미료들이 첨가될 수 있다. 이러한 조성물들은 아스코르브산과 같은 항-산화제를 첨가하여 보존될 수 있다.For example, oily suspensions may be formulated by suspending the active ingredients in vegetable oils such as arachis oil, olive oil, sesame oil, or mineral oil such as liquid paraffin. The oily suspensions may include thickening agents, for example beeswax, light paraffin or cetyl alcohol. Sweeteners and flavorings may be added to provide oral formulations that are suitable for mouth. Such compositions can be preserved by the addition of an anti-oxidant such as ascorbic acid.

물을 첨가하여 수용성 현탁액의 제제에 적절한 분산성 분말들 및 과립들은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제들과 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적절한 분산제들 또는 습윤제들 또는 현탁제들은 상기에서 이미 언급된 제제들에 의해 실증된다. 예를 들어, 감미료, 향미 및 착색제들과 같은 다른 부형제들도 존재할 수 있다.Dispersible powders and granules suitable for the preparation of an aqueous suspension by addition of water provide the active ingredient in admixture with the dispersing or wetting agent, suspending agent and one or more preservatives. Suitable dispersants or wetting agents or suspending agents are exemplified by the agents already mentioned above. For example, other excipients may also be present, such as sweeteners, flavors and colorants.

본 발명의 약학 조성물들은 또한 수중유적형(oil-in-water) 유탁액들(emulsions)의 형태일 수 있다. 유상(oily phase)은 식물성 기름 또는 미네랄유 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적절한 유화제들(emulsifying agents)은 예를 들어, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검과 같은 자연발생적 검들, 예를 들어 대두(soy bean), 레시틴 및 지방산들 및 헥시톨로부터 유도된 에스테르들 또는 일부 에스테르들과 같은 자연발생적 인지질들, 예를 들어 소르비탄 모노올레이트와 같은 무수물들, 및 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은 에틸렌 산화물과의 상기 일부 에스테르들과의 축합물들일 수 있다. 상기 유탁액들은 감미 및 향미제들도 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may also be in the form of oil-in-water emulsions. The oily phase may be vegetable oil or mineral oil or mixtures thereof. Suitable emulsifying agents are, for example, naturally occurring gums such as acacia gum or tragacanth gum, for example soy bean, lecithin and fatty acids and esters derived from hexitol or some esters. Naturally occurring phospholipids such as, for example, anhydrides such as sorbitan monooleate, and condensates with some of the esters with ethylene oxide such as, for example, polyoxyethylene sorbitan monooleate. The emulsions may also include sweetening and flavoring agents.

약학 조성물들은 살균된 주입가능한 수용성 또는 유성 현탁물의 형태일 수 있다. 이러한 현탁물은 상기에 언급된 적절한 분산제들 또는 습윤제들 및 현탁제들을 이용한 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 상기 살균된 주입가능한 제제는 또한 예를 들어, 1,3-부탄디올(butanediol)에 녹은 용액과 같이 비-독성인 비경구적으로 수용가능한 희석제 또는 용매에 녹은 살균된 주입가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 이용될 수 있는 수용가능한 운반체들 및 담체들 중에는 물, 링거 용액(Ringer's solution) 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 살균된 고정유들(fixed oils)은 용매 또는 분산 매체(suspending medium)로 통상적으로 이용된다. 본 목적을 위하여, 합성 모노-또는 디글리세라이드들(diglycerides)을 포함한 임의의 완화성 지방유(bland fixed oil)가 이용될 수 있다. 또한, 올레산(oleic acid)과 같은 지방산들은 주사용 제제에 이용된다.The pharmaceutical compositions may be in the form of sterile injectable water soluble or oily suspensions. Such suspensions may be formulated according to the known art using those suitable dispersing or wetting agents and suspending agents which have been mentioned above. The sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension dissolved in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, such as, for example, a solution dissolved in 1,3-butanediol. Among the acceptable carriers and carriers that may be employed are water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution. Sterilized fixed oils are also commonly used as a solvent or suspending medium. For this purpose any bland fixed oil can be employed including synthetic mono- or diglycerides. In addition, fatty acids such as oleic acid are used in the preparation of injectables.

siNA들은 예컨대, 약물의 직장 투여를 위해 좌약들의 형태로도 투여될 수 있다. 이러한 조성물들은 상온에서는 고체이지만 직장에서의 온도에서는 액체가 되어 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적절한 비-자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제제될 수 있다. 그러한 물질들은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜들을 포함한다.siNAs can also be administered, eg, in the form of suppositories for rectal administration of the drug. Such compositions may be formulated by mixing the drug with a suitable non-irritating excipient which is solid at room temperature but liquid at rectal temperature and will melt in the rectum to release the drug. Such materials include cocoa butter and polyethylene glycols.

siNA들은 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2-O-메틸, 2'-H와 같은 뉴클레아제 내성 기들(nuclease resistant groups)로의 변형에 의해 안정성을 향상시키도록 광범위하게 변형될 수 있다. 검토를 위해 Usman and Cedergren, TIBS 17:34, 1992; Usman, et al., Nucleic Acids Symp . Ser. 31:163, 1994를 참조하시오. siNA 컨스트럭트들은 일반적인 방법들을 이용한 겔 전기이동법(gel electrophoresis)에 의해 정제되거나 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제되고 수중 재-현탁될 수 있다(re-suspended).siNAs, for example, by modification to nuclease resistant groups such as 2'-amino, 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2-O-methyl, 2'-H It can be widely modified to improve stability. For review, Usman and Cedergren, TIBS 17:34, 1992; Usman, et al., Nucleic Acids Symp . Ser . See 31: 163, 1994. siNA constructs can be purified by gel electrophoresis using conventional methods or purified by high pressure liquid chromatography and re-suspended in water.

변형물들(염기, 당 및/또는 인산)로 핵산 분자들을 화학적으로 합성하면 약효를 증가시킬 수 있는 혈청 리보뉴클레아제들에 의해 분해되는 것을 방지할 수 있다. 예를 들어, Eckstein 등의 국제공개 제WO 92/07065호; 문헌 [Perrault, et al., Nature 344:565, 1990]; [Pieken, et al., Science 253:314, 1991]; [Usman and Cedergren, Trends in Biochem . Sci. 17:334, 1992]; [Usman 등의 국제공개 제 WO 93/15187호; 및 Rossi 등의 국제공개 제WO 91/03162호; Sproat의 미국 특허 제 5,334,711호; Gold 등의 미국특허 제6,300,074호는 핵산 분자들의 염기, 인산염 및/또는 당 모이어티들에 가할 수 있는 다양한 화학적 변형들을 설명한다.Chemically synthesizing nucleic acid molecules with modifications (bases, sugars and / or phosphoric acid) can prevent degradation by serum ribonucleases that can increase drug efficacy. See, eg, WO 92/07065 to Eckstein et al .; Perrault, et al., Nature 344: 565, 1990; Pieken, et al., Science 253: 314, 1991; Usman and Cedergren, Trends in Biochem . Sci . 17: 334, 1992; International Publication WO 93/15187 to Usman et al .; And International Publication No. WO 91/03162 by Rossi et al .; US Patent No. 5,334,711 to Sproat; US Pat. No. 6,300,074 to Gold et al. Describes various chemical modifications that can be made to the base, phosphate and / or sugar moieties of nucleic acid molecules.

업계에서는 뉴클레아제 안정성 및 효율에서 상당히 향상된 핵산 분자들 내로 도입될 수 있는 당, 염기 및 인산염 변형물들을 설명하는 몇몇 예들이 있다. 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-H, 뉴클레오티드 염기 변형물들과 같은 뉴클레아제 내성 기들로 변형하여 안정성을 향상시키고/향상시키거나 생물학적 활성을 향상시키기 위하여 올리고뉴클레오티드들을 변형한다. 예컨대, 문헌 [Usman and Cedergren, TIBS 17:34, 1992]; [Usman, et al, Nucleic Acids Symp . Ser. 31:163, 1994] 및 [Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996]에 기재되어 있다. 핵산 분자들의 당 변형은 업계에서 광범위하게 설명되어 왔다. 예를 들어, Eckstein 등의 PCT 국제공개 제WO 92/07065호; 문헌 [Perrault, et al. Nature 344:565-568, 1990]; [Pieken, et al., Science 253:314-317, 1991]; [Usman and Cedergren, Trends in Biochem . Sci. 17:334-339, 1992]; Usman 등의 PCT 국제공개 제WO 93/15187호; Sproat의 미국 특허 제 5,334,711호 및 문헌 [Beigelman, et al., J Biol . Chem. 270:25702, 1995]; Beigelman 등의 국제 PCT 공개 제WO 97/26270호; Beigelman 등의 미국 특허 제 5,716,824호; Usman 등의 미국 특허 제5,627,053호; Woolf 등의 국제 PCT 공개 제 WO 98/13526호; 문헌[Thompson, et al., Karpeisky, et al., Tetrahedron Lett. 39:1131, 1998]; [Earnshaw and Gait, Biopolymers(Nucleic Acid Sciences) 48:39-55, 1998]; [Verma and Eckstein, Annu . Rev . Biochem. 67:99-134, 1998]; 및 [Burlina, et al., Bioorg . Med . Chem. 5:1999-2010, 1997]를 참조할 수 있다. 상기 간행물들은 촉매작용 조절 없이 핵산 분자들 내로의 당, 염기 및/또는 인산염 변형물들 등의 혼입 위치를 결정하기 위한 일반적인 방법들 및 전략들을 설명한다. 이러한 내용으로 볼 때, 세포들 내에서 RNAi를 증진시키는 siNA의 능력이 상당히 억제되지 않는 한, 본 발명의 siNA 핵산 분자들을 변형하기 위하여 여기에 설명된 바와 같이 유사한 변형물들을 이용할 수 있다.There are several examples in the art describing sugar, base and phosphate modifications that can be introduced into nucleic acid molecules that are significantly improved in nuclease stability and efficiency. Nucleases such as, for example, 2'-amino, 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2'-0-methyl, 2'-0-allyl, 2'-H, nucleotide base modifications Modifications to resistant groups modify oligonucleotides to enhance stability and / or enhance biological activity. See, eg, Usman and Cedergren,TIBS 17:34, 1992; Usman, et al,Nucleic Acids Symp . Ser. 31: 163, 1994 and Burgin, et al.,Biochemistry 35: 14090, 1996. Sugar modifications of nucleic acid molecules have been described extensively in the art. See, eg, PCT International Publication No. WO 92/07065 to Eckstein et al .; Perrault, et al.Nature 344: 565-568, 1990; Pieken, et al.,Science 253: 314-317, 1991; Usman and Cedergren,Trends in Biochem . Sci. 17: 334-339, 1992; PCT International Publication No. WO 93/15187 to Usman et al .; US Pat. No. 5,334,711 to Sproat and Beigelman, et al.,J Biol . Chem. 270: 25702, 1995; International PCT Publication No. WO 97/26270 by Beigelman et al .; US Patent No. 5,716,824 to Beigelman et al .; US Pat. No. 5,627,053 to Usman et al .; International PCT Publication No. WO 98/13526 to Woolf et al .; See Thompson, et al., Karpeisky, et al.,Tetrahedron Lett. 39: 1131, 1998; Earnshaw and Gait,Biopolymers(Nucleic Acid Sciences48: 39-55, 1998; Verma and Eckstein,Annu . Rev . Biochem. 67: 99-134, 1998; And Burlina, et al.,Bioorg . Med . Chem. 5: 1999-2010, 1997. These publications describe common methods and strategies for determining the site of incorporation of sugar, base and / or phosphate modifications, etc. into nucleic acid molecules without controlling catalysis. In view of this, similar modifications may be used as described herein to modify siNA nucleic acid molecules of the present invention, unless the ability of siNA to enhance RNAi in cells is significantly inhibited.

올리고뉴클레오티드 인터뉴클레오티드 연쇄들(linkages)을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate) 및/또는 5'-메틸포스포네이트(methylphosphomate) 연쇄들로 화학적 변형을 시키면 안정성을 개선하는 반면에, 과도한 변형들로 인하여 약간의 독성 또는 활성 감소를 유발할 수 있다. 그러므로, 핵산 분자들을 설계하는 경우, 이러한 인터뉴클레오티드 연쇄들의 양은 최소화하여야 한다. 이러한 연쇄들의 농도를 감소시키면 독성을 낮추고 이러한 분자들의 효능이 증대되고 더 높은 특이성을 얻게 된다.Chemical modification of oligonucleotide internucleotide linkages with phosphorothioate, phosphorodithioate and / or 5'-methylphosphomate chains improves stability, while Excessive modifications may cause some toxicity or reduced activity. Therefore, when designing nucleic acid molecules, the amount of such internucleotide chains should be minimized. Reducing the concentration of these chains lowers toxicity, increases the efficacy of these molecules and results in higher specificity.

일 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르(phosphotriester), 모폴리노(morpholino), 아미데이트 카르바메이트(amidate carbamate), 카복시메틸, 아세트아미데이트(acetamidate), 폴리아미드, 술폰산염(sulfonate), 술폰아미드(sulfonamide), 포름아세탈(formacetal), 티오포름아세탈 및/또는 알킬시릴(alkylsilyl) 치환들을 포함하는 인산염 골격 변형물들로서 변형된 siNA 분자들을 특징으로 한다. 올리고뉴클레오티드 골격 변형에 대해 문헌 [Hunziker and Leumann, "Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods," VCH, 1995, pp. 331-417] 및 [Mesmaeker, et al., "Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research," ACS, 1994, pp. 24-39]을 참조할 수 있다. In one embodiment, the invention relates to one or more phosphorothioates, phosphorodithioates, methylphosphonates, phosphorotriesters, morpholino, amidate carbamate, Phosphate backbone modifications including carboxymethyl, acetamidate, polyamide, sulfonate, sulfonamide, formacetal, thioformacetal and / or alkylsilyl substitutions As modified siNA molecules. For oligonucleotide backbone modifications see Hunziker and Leumann, "Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods," VCH , 1995, pp. 331-417 and Mesmaeker, et al., "Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research," ACS , 1994, pp. 24-39.

핵산 분자들의 전달에 대한 방법들은 문헌 [Akhtar, et al., Trends Cell Bio. 2:139, 1992; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Maurer, et al., Mol . Membr . Biol. 16:129-140, 1999]; [Hofland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol. 137:165-192, 1999]; 및 [Lee, et al.. ACS Symp . Ser. 752:184-192, 2000]에 설명되어 있다. Beigelman 등의 미국 특허 제6,395,713호 및 Sullivan 등의 국제공개 제WO 94/02595호는 핵산 분자들의 전달에 대한 일반적인 방법들을 더 설명한다. 이러한 프로토콜들은 거의 모든 핵산 분자의 전달에 대해 이용될 수 있다. 핵산 분자들은 리포솜들 내에서 캡슐화 되거나, 이온영동법에 의하거나, 생분해성 고분자들, 히드로겔들, 사이클로덱스트린들(예를 들어, Gonzalez, et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Wang 등의 PCT 국제 공개 제WO 03/47518호 및 제WO 03/46185호 참조), 폴리(락틱-코-글리콜릭)산(poly(lactic-co-glycolic)acid)(PLGA) 및 PLCA 미세구들(예를 들어, 미국 특허 제6,447,796호 및 미국 특허출원공개 제 US 2002130430 호 참조), 생분해성 나노캡슐들 및 생접착성 미세구들과 같은 다른 운반체들 내로 혼입에 의하거나 단백질성 벡터들(proteinaceous vectors)(O'Hare 및 Normand의 국제 PCT 공개 제WO 00/53722호)에 의한 방법들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 또한, 핵산/운반체 조합은 직접 주입에 의하거나 주입 펌프의 사용에 의하여 국소적으로 전달된다. 피하, 근육내, 또는 피내에 의하든 본 발명의 핵산 분자들의 직접 주입은 표준 바늘 및 주사기 방법들을 이용하거나 문헌 [Conry, et al, Clin . Cancer Res. 5:2330-2337, 1999], 및 Barry 등의 국제 PCT 공개 제WO 99/31262호에 설명된 바늘을 사용하지 않는(needle-free) 방법에 의해 주입할 수 있다. 본 발명의 분자들은 약학적 제제들로 이용될 수 있다. 약학적 제제들은 피검물의 질병 상태의 발생을 방지, 조절하거나 치료(증상를 어느 정도, 바람직하게는 모든 증상을 완화시킴)한다.Methods for delivery of nucleic acid molecules are described in Akhtar, et al., Trends Cell Bio . 2: 139, 1992; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics , ed. Akhtar, 1995; Maurer, et al., Mol . Membr . Biol . 16: 129-140, 1999; Hofland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol . 137: 165-192, 1999; And Lee, et al. ACS Symp . Ser . 752: 184-192, 2000. US Patent No. 6,395,713 to Beigelman et al. And WO 94/02595 to Sullivan et al. Further describe general methods for the delivery of nucleic acid molecules. Such protocols can be used for the delivery of almost all nucleic acid molecules. Nucleic acid molecules are encapsulated in liposomes, by iontophoresis, biodegradable polymers, hydrogels, cyclodextrins (eg, Gonzalez, et al., Bioconjugate) . Chem . 10: 1068-1074, 1999; See PCT International Publications WO 03/47518 and WO 03/46185 by Wang et al., Poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and PLCA microspheres (See, eg, US Pat. No. 6,447,796 and US Patent Application Publication No. US 2002130430), by incorporation into other carriers such as biodegradable nanocapsules and bioadhesive microspheres, or by proteinaceous vectors. (O'Hare and Normand's International PCT Publication No. WO 00/53722), but may be administered by a variety of methods known to those skilled in the art, including but not limited to those. In addition, nucleic acid / carrier combinations are delivered locally by direct infusion or by use of an infusion pump. Direct injection of nucleic acid molecules of the invention, whether subcutaneously, intramuscularly, or intradermally, can be performed using standard needle and syringe methods or by Conry, et al, Clin . Cancer Res . 5: 2330-2337, 1999, and Barry et al., International PCT Publication No. WO 99/31262, which may be infused by a needle-free method. The molecules of the invention can be used in pharmaceutical formulations. Pharmaceutical agents prevent, control, or treat (to some extent, preferably alleviate, the symptoms) of the subject's disease state.

"리간드(ligand)"라는 용어는 수용체와 같은 다른 화합물과 직접 또는 간접적으로 상호 작용할 수 있는 약물, 펩티드, 호르몬, 또는 신경전달물질(neurotransmitter)과 같은 임의의 화합물 또는 분자를 의미한다. 리간드와 상호작용하는 수용체는 세포의 표면상에 존재할 수 있거나 또한 세포간 수용체일 수 있다. 리간드와 수용체의 상호작용으로 인하여 생화학적 반응이 일어날 수 있거나 단순히 물리적 상호작용 또는 결합일 수 있다.The term "ligand" refers to any compound or molecule, such as a drug, peptide, hormone, or neurotransmitter that can interact directly or indirectly with another compound, such as a receptor. Receptors that interact with the ligand may be present on the surface of the cell or may be intercellular receptors. The interaction of the ligand with the receptor may result in a biochemical reaction or simply a physical interaction or binding.

여기에 사용된 "비대칭 헤어핀"이란 안티센스 영역, 뉴클레오티드들 또는 비-뉴클레오티드들을 포함할 수 있는 루프 부분, 및 센스 영역이 안티센스 영역과 염기쌍에서 충분한 상보적 뉴클레오티드들 가지고 있어 루프를 지닌 듀플렉스를 형성할 정도로 안티센스 영역보다 더 적은 수의 뉴클레오티드들을 포함하는 센스 영역을 포함하는 선형 siNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 T-세포 내에서 RNAi를 매개하기에 충분한 길이를 가지는 안티센스 영역(예컨대, 약 19 내지 약 22 개(예컨대, 약 19, 20, 21 또는 22 개)의 뉴클레오티드들 및 약 4 개 내지 약 8 개(예컨대, 약 4, 5, 6, 7 또는 8 개)의 뉴클레오티드를 포함하는 루프 영역) 및 상기 안티센스 영역에 상보적인 약 3 개 내지 약 18 개(예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개)의 뉴클레오티드들을 가지는 센스 영역을 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 화학적으로 변형될 수 있는 5'-터미널 인산염 기도 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자의 루프 부분은 여기에 설명된 바와 같이 뉴클레오티드들, 비-뉴클레오티드들, 링커 분자들, 또는 접합체 분자들을 포함할 수 있다.As used herein, “asymmetric hairpin” refers to an antisense region, a loop portion that may comprise nucleotides or non-nucleotides, and a sense region having sufficient complementary nucleotides in the antisense region and base pairs to form a duplex with a loop. By linear siNA molecules comprising a sense region comprising fewer nucleotides than the antisense region. For example, the asymmetric hairpin siNA molecules of the present invention may have antisense regions (eg, about 19 to about 22 (eg, about 19, 20, 21, or 22) that have a length sufficient to mediate RNAi in T-cells. And a loop region comprising about 4 to about 8 (eg, about 4, 5, 6, 7, or 8) nucleotides of and about 3 to about 18 (eg, complementary to the antisense region) , About 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 or 18 nucleotides. Asymmetric hairpin siNA molecules can include 5'-terminal phosphate groups that can be chemically modified. The loop portion of an asymmetric hairpin siNA molecule may comprise nucleotides, non-nucleotides, linker molecules, or conjugate molecules as described herein.

여기에 사용된 "비대칭 듀플렉스(asymmetric duplex)"는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함하는 두 개의 분리된 가닥들을 가지는 siNA 분자로서, 상기 센스 영역이 상기 안티센스 영역과 염기쌍에서 충분한 상보적 뉴클레오티드들 가지고 있어 듀플렉스를 형성할 정도로 상기 안티센스 영역보다 더 적은 수의 뉴클레오티드들을 포함하는 siNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 비대칭 듀플렉스 siNA 분자는 T-세포 내에서 RNAi를 매개하기에 충분한 길이를 가지는 안티센스 영역(예컨대, 약 19 개 내지 약 22 개(예컨대, 약 19, 20, 21 또는 22 개)의 뉴클레오티드들) 및 상기 안티센스 영역에 상보적인 약 3 개 내지 약 18 개(예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 개)의 뉴클레오티드들을 가지는 센스 영역을 포함할 수 있다.As used herein, an “asymmetric duplex” is an siNA molecule having two separate strands comprising a sense region and an antisense region, wherein the sense region has sufficient complementary nucleotides in the antisense region and base pairs. It means an siNA molecule containing fewer nucleotides than the antisense region to form a. For example, the asymmetric duplex siNA molecules of the present invention may comprise an antisense region (eg, about 19 to about 22 (eg, about 19, 20, 21 or 22) having a length sufficient to mediate RNAi in T-cells. Nucleotides) and about 3 to about 18 complementary to the antisense region (eg, about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16) , 17, or 18) nucleotides.

"유전자 발현을 조절하다(modulate)"라는 것은 세포 내에 존재하는 mRNA 수준들의 상향조절(upregulation)이나 하향조절(downregulation) 또는 mRNA 번역의 상향조절이나 하향조절 또는 상기 표적 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질 또는 단백질 서브유니트들(subunits)들의 합성의 상향조절이나 하향조절을 포함할 수 있는 표적 유전자의 발현이 상향조절 또는 하향조절되는 것을 의미한다. 상기 피검물 단백질 또는 서브유니트의 발현, 수준 또는 활성이 조절자(예컨대, siRNA)의 부재시에 관찰되는 것보다 더 초과하거나 더 미달하도록 상기 표적 유전자에 의해 상향조절되거나 하향조절되도록 엔코딩되는 하나 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유니트들의 존재, 수량 또는 활성에 대하여 유전자 발현의 조절을 결정할 수 있다. 예를 들어, "조절하다"라는 용어는 "억제하다"를 의미할 수 있지만, "조절하다"라는 단어의 사용은 이러한 정의에 한정되지 않는다."Modulate gene expression" means the upregulation or downregulation of mRNA levels present in a cell or the upregulation or downregulation of mRNA translation or the protein or protein encoded by the target gene. The expression of a target gene, which may include upregulation or downregulation of the synthesis of subunits, means upregulation or downregulation. One or more proteins encoded to be upregulated or downregulated by the target gene such that the expression, level or activity of the test protein or subunit is greater than or less than observed in the absence of a modulator (eg siRNA) Regulation of gene expression can be determined for the presence, quantity, or activity of these or protein subunits. For example, the term "regulate" may mean "inhibit," but the use of the word "regulate" is not limited to this definition.

발현을 "억제하다", "하향조절하다" 또는 "감소시키다"라는 것은 유전자의 발현 또는 하나 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유니트들을 엔코딩하는 RNA 분자들 또는 동등한(equivalent) RNA 분자들의 수준이나 표적 유전자에 의해 엔코딩되는 하나 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유니트들의 수준 또는 활성이 본 발명의 핵산 분자들(예컨대, siNA)이 부재시에 관찰되는 것 미만으로 감소되는 것을 의미한다. 일 실시예에서, siNA 분자로의 억제, 하향조절 또는 감소는 비활성이나 약독화된(attenuated) 분자가 존재시에 관찰되는 수준 이하이다. 다른 실시예에서, siNA 분자들로의 억제, 하향조절 또는 감소는 예를 들어, 뒤섞인(scrambled) 서열 또는 부정합들을 지닌 siNA 분자가 존재시에 관찰되는 수준 이하이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산 분자로의 유전자 발현의 억제, 하향조절 또는 감소는 상기 핵산 분자가 부존재시 보다는 존재시에 더 크다."Inhibit", "downregulate" or "reduce" expression refers to the expression of a gene or the level of RNA molecules or equivalent RNA molecules that encode one or more proteins or protein subunits or to the target gene. It means that the level or activity of one or more proteins or protein subunits encoded by it is reduced below that observed in the absence of the nucleic acid molecules (eg siNA) of the invention. In one embodiment, inhibition, downregulation or reduction with siNA molecules is below the level observed in the presence of inactive or attenuated molecules. In another embodiment, inhibition, downregulation or reduction to siNA molecules is below the level observed in the presence of, for example, a siNA molecule with scrambled sequences or mismatches. In another embodiment, the inhibition, downregulation or reduction of gene expression into the nucleic acid molecule of the invention is greater in the presence of the nucleic acid molecule than in the absence.

유전자 "침묵"은 세포 내에서 유전자 발현의 표적된 억제를 통하여 기능의 부분적 또는 전체적 손실을 의미하며 또한 "넉 다운(knock down)"으로 불릴 수 있다. 해결해야 할 상황 및 생물학적 문제에 따라 유전자 발현을 부분적으로 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 유전자 발현을 가능한 최대로 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 침묵의 정도는 국제공개 제WO 99/32619호에 그 일부가 요약되어 있는 업계에 알려진 방법들에 의하여 결정될 수 있다. 시험법에 따라서, 유전자 발현의 정량화는 특정한 질병 상태들 또는 치료를 표적으로 하는 다른 조건들과 연관될 수 있는 격상된 발현 수준들을 포함하여 mRNA 수준들 또는 단백질 수준들 또는 활성으로 환산해 보건대 예를 들어, 기준(예컨대, 정상)의 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 90 %, 95 % 또는 95 % 이상 또는 다른 대조군 수준들로 표적 유전자 발현을 넉 다운할 수 있는 예방 및 치료 방법들을 포함하여, 본 발명의 몇몇 실시예들에서 원하는 만큼의 다양한 억제량을 검출할 수 있게 한다.Gene "silence" means a partial or total loss of function through targeted inhibition of gene expression in a cell and may also be referred to as "knock down." It may be desirable to partially reduce gene expression depending on the situation and biological problem to be solved. It may also be desirable to reduce gene expression to the maximum possible. The degree of silence can be determined by methods known in the industry, some of which are summarized in WO 99/32619. Depending on the assay, quantification of gene expression can be achieved in terms of mRNA levels or protein levels or activity, including elevated expression levels that may be associated with specific disease states or other conditions that target the treatment. For example, prophylactic and therapeutic methods that can knock down target gene expression to at least 10%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95% or 95% or other control levels of a reference (eg normal) In some embodiments of the present invention, it is possible to detect as many different inhibitory amounts as desired.

"표적 유전자의 표현을 억제하는"이란 표적 유전자의 유전자 침묵을 개시하는 본 발명의 siNA의 능력을 의미한다. 유전자 침묵의 정도를 검사하기 위하여, 중요한 기관 또는 배지 내에서 특정한 컨스트럭트를 표현하는 세포들의 표본들이나 시험법들을 상기 컨스트럭트의 발현이 부족한 대조군 표본들과 비교한다. 대조군 표본들(컨스트럭트 발현이 부족함)은 100 %의 상대 수치로 지정된다. 상기 대조군과 비교한 시험 수치가 약 90 %, 종종 50 % 그리고 몇몇 실시예들에서 25 내지 0 %일 경우 표적 유전자의 발현의 억제가 달성된다. 적절한 시험법들은 당업자에게 알려진 표현형 시험법들(phenotypic assays)뿐만 아니라 예컨대, 도트 블롯(dot blots), 노던 블롯(Northern blots), 제자리 혼성화(in situ hybridization), ELISA, 면역침강반응(immunoprecipitation), 효소 기능(enzyme function)과 같은 당업자에게 알려진 기법들을 이용한 단백질 또는 mRNA 수준들의 검사를 포함한다.By "inhibiting the expression of a target gene" is meant the ability of the siNA of the invention to initiate gene silencing of the target gene. To examine the extent of gene silencing, samples or assays of cells expressing a particular construct in an important organ or medium are compared to control samples lacking the expression of the construct. Control samples (lack of construct expression) are designated as relative values of 100%. Inhibition of expression of the target gene is achieved when the test value compared to the control is about 90%, often 50% and in some embodiments 25 to 0%. Suitable assays are phenotypic assays known to those skilled in the art (phenotypic assays) as well as, for example, dot blot (dot blots), Northern blot (Northern blots), place hybridization (in testing of protein or mRNA levels using techniques known to those skilled in the art such as situ hybridization, ELISA, immunoprecipitation, enzyme function.

"피검물"이라는 것은 피검물 또는 외식된 세포들(explanted cells) 또는 스스로 siNA 전달에 대한 피검물들인 세포들의 공여자 또는 피이식자로서의 유기체를 포함할 수 있는 유기체, 조직 또는 세포를 의미한다. 그러므로, "피검물"은 본 발명의 핵산 분자들이 여기에 설명된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 투여되고 향상되는 생체 외(in vitro or ex vivo) 기관, 조직 또는 세포 피검물들을 포함하는 유기체, 기관, 조직 또는 세포를 뜻할 수 있다. 대표적인 피검물들은 예를 들어 인간 환자들 또는 세포들과 같은 포유류 개체들 또는 세포들을 포함한다.By "subject" is meant an organism, tissue or cell that may include the organism as a donor or transplant of a subject or explanted cells or cells that are themselves specimens for siNA delivery. Thus, "test specimen" refers to an organism comprising in vitro or ex vivo organ, tissue or cellular specimens in which the nucleic acid molecules of the present invention are administered and enhanced to the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides described herein, It can mean an organ, tissue or cell. Representative specimens include mammalian subjects or cells, such as, for example, human patients or cells.

여기에 사용된 "세포"는 일상적인 생물학적 의미로 사용되고, 예컨대, 특이적으로 인간을 뜻하지 않는 것과 같이 완전한 다세포 유기체를 뜻하는 것이 아니다. 상기 세포는 예컨대, 조류, 식물 및 인간, 암소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개 및 고양이와 같은 포유류처럼 유기체 내에 존재할 수 있다. 상기 세포는 원핵성(예컨대, 박테리아 세포) 또는 진핵성(예컨대, 포유류 또는 식물 세포)일 수 있다. 상기 세포는 체세포 또는 생식 계통 기원, 분화 전능(totipotent) 또는 분화 다능(pluripotent), 분할 또는 비-분할일 수 있다. 상기 세포는 또한 배우체(gamete) 또는 배아, 줄기 세포 또는 완전히 분화된 세포로부터 유도될 수 있고 이들을 포함할 수 있다.As used herein, "cell" is used in the everyday biological sense and is not meant to be a fully multicellular organism, such as not specifically referring to humans. The cells may be present in organisms such as, for example, birds, plants and mammals such as humans, cows, sheep, apes, monkeys, pigs, dogs, and cats. The cell may be prokaryotic (eg, bacterial cell) or eukaryotic (eg, mammalian or plant cell). The cells may be of somatic or germ line origin, totipotent or pluripotent, split or non-divided. The cells may also be derived from and include gametes or embryos, stem cells or fully differentiated cells.

"벡터들"은 원하는 핵산을 전달하는 데 이용된 임의의 핵산-계 및/또는 바이러스-계 기법을 의미한다."Vectors" means any nucleic acid-based and / or virus-based technique used to deliver a desired nucleic acid.

"포함하는(comprising)"은 "포함하는"이라는 단어를 따르는 것은 어느 것이나 포함하지만, 거기에 한정되지 않음을 의미한다. 따라서, "포함하는"이라는 용어의 사용은 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적을 의미하지만, 다른 요소들은 선택적이며 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. "구성된(consisting of)"은 "구성된"이라는 어귀를 따르는 것은 어느 것이나 포함하고, 거기에 한정됨을 의미한다. 따라서, "구성된"이라는 어귀는 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적이지만 다른 요소들이 전혀 존재할 수 없는 것을 나타낸다. "필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 상기 어귀 다음에 나열된 임의의 요소들을 포함하고 본 개시물에서 상기 나열된 요소들을 위하여 명시된 활성 또는 행동에 간섭하거나 기여하지 않는 다른 요소들에 한정되는 것을 의미한다. 따라서, "필수적으로 구성된"이라는 어귀는 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적이지만, 다른 요소들은 선택적이고 나열된 요소들의 활성 또는 행동에 영향을 주느냐의 여부에 따라 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다."Comprising" means including, but not limited to, anything that follows the word "comprising". Thus, the use of the term "comprising" indicates that the listed elements are mandatory or compulsory, while other elements are optional and may or may not be present. "Consisting of" means including and limited to anything that follows the phrase "consisted of". Thus, the phrase “configured” indicates that the listed elements are essential or compulsory, but no other elements can exist at all. "Consisting essentially of" means to include any elements listed after the phrase and to be limited to other elements that do not interfere or contribute to the activity or behavior specified for the elements listed above in this disclosure. . Thus, the phrase “essentially configured” indicates that the listed elements are mandatory or compulsory, while other elements are optional and may or may not be present depending on whether they affect the activity or behavior of the listed elements.

"RNA"는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기들을 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보푸라노즈(ribofuranose) 모이어티의 2' 위치에서 하이드록시 기를 지닌 뉴클레오티드를 의미한다. 상기 용어들은 하나 이상의 뉴클레오티드들의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변성(alteration)에 의하여 자연발생적 RNA와는 다른 변성된 RNA뿐만 아니라 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA와 같은 분리된 RNA를 포함한다. 그러한 변성들은 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드들에서 siNA의 말단(들) 또는 내부적으로 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자들에서의 뉴클레오티드들은 자연발생적 뉴클레오티드들이나 화학적으로 합성된 뉴클레오티드들 또는 디옥시뉴클레오티드들과 같은 비-표준 뉴클레오티드들도 포함할 수 있다. 이러한 변성된 RNA들은 유사체 또는 자연발생적 RNA의 유사체라 칭할 수 있다."RNA" means a molecule comprising at least one nucleotide residues. "Ribonucleotide" means a nucleotide having a hydroxyl group at the 2 'position of the beta-D-ribofuranose moiety. The terms refer to double-stranded RNA, single-stranded RNA, partially purified RNA, essentially pure as well as denatured RNA other than naturally occurring RNA by addition, deletion, substitution and / or alteration of one or more nucleotides. Isolated RNA, such as RNA, synthetic RNA, recombinantly produced RNA. Such denaturations may include, for example, the addition of non-nucleotide material internally or at the end (s) of the siNA at one or more nucleotides of RNA. Nucleotides in RNA molecules of the invention may also include non-standard nucleotides such as naturally occurring nucleotides or chemically synthesized nucleotides or deoxynucleotides. Such denatured RNAs may be referred to as analogs or analogs of naturally occurring RNAs.

"고도로 보존된 서열 영역(highly conserved sequence region)"은 표적 유전자 내에서 한 세대로부터 다른 세대로 또는 하나의 생물학적 시스템으로부터 다른 시스템으로 상당히 변하지 않는 표적 유전자 내에서의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 의미한다."Highly conserved sequence region" means one or more nucleotide sequences in a target gene that do not vary significantly from one generation to another in the target gene or from one biological system to another.

"센스 영역"은 siNA 분자의 안티센스 영역에 상보성을 가지는 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 또한, siNA 분자의 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열과 상동성을 지닌 핵산 서열을 포함할 수 있다."Sense region" means the nucleotide sequence of an siNA molecule having complementarity to the antisense region of the siNA molecule. In addition, the sense region of the siNA molecule may comprise a nucleic acid sequence having homology with a target nucleic acid sequence.

"안티센스 영역"은 표적 핵산 서열에 상보성을 가지는 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 또한, siNA 분자의 상기 안티센스 영역은 siNA 분자의 센스 영역에 상보성을 가지는 핵산 서열을 선택적으로 포함할 수 있다."Antisense region" refers to the nucleotide sequence of an siNA molecule having complementarity to a target nucleic acid sequence. In addition, the antisense region of the siNA molecule may optionally include a nucleic acid sequence having complementarity with the sense region of the siNA molecule.

"표적 핵산"은 그 표현 또는 활성이 조절될 수 있는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다."Target nucleic acid" means any nucleic acid sequence whose expression or activity can be modulated. The target nucleic acid may be DNA or RNA.

"상보성"은 통상적인 왓슨-크리크 유형들 또는 다른 비-통상적인 유형들 중 어느 하나에 의하여 다른 핵산 서열과 핵산이 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자들을 참조하면, 그 상보적 서열과 핵산 분자에 결합 자유 에너지는 예컨대, RNAi 활성과 같은 핵산 분자들의 적절한 기능이 처리되게 하기에 충분하다. 핵산 분자들에 대한 결합 자유 에너지들의 측정은 업계에 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌 [Turner, et al., CSH Symp . Quant . Biol., LII, 1987, pp. 123-133]; 및 [Frier, et al., Proc . Nat . Acad . Sd . USA 83:9373-9377, 1986]; [Turner, et al., J Am . Chem . Soc. 109:3783-3785, 1987] 참조). 퍼센트 상보성은 제 2 핵산 서열과 수소 결합들(예컨대, 왓슨-크리크 염기쌍)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내에서 인접한(contiguous) 잔기들의 퍼센티지를 나타낸다(예컨대, 10 개의 뉴클레오티드들을 가지는 제 2 핵산 서열에 제 1 올리뉴클레오티드의 전체 10 개의 뉴클레오티드들 중 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드들이 염기쌍을 이루는 경우 각각 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 % 상보성을 나타낸다). "완전히 상보적"이라는 것은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기들이 제 2 핵산 서열 내의 동일한 수의 인접한 잔기들과 수소 결합을 이루는 것을 의미한다."Complementarity" means that the nucleic acid can form hydrogen bond (s) with another nucleic acid sequence by either of the conventional Watson-Crick types or other non-conventional types. Referring to the nucleic acid molecules of the present invention, the complementary sequence and binding free energy to the nucleic acid molecule is sufficient to allow the proper functioning of the nucleic acid molecules such as, for example, RNAi activity to be processed. Measurement of binding free energies for nucleic acid molecules is well known in the art (eg, Turner, et al., CSH) . Symp . Quant . Biol ., LII, 1987, pp. 123-133; And Frier, et al., P roc . Nat . Acad . Sd . USA 83: 9373-9377, 1986; Turner, et al., J Am . Chem . Soc . 109: 3783-3785, 1987). Percent complementarity refers to the percentage of contiguous residues in a nucleic acid molecule capable of forming hydrogen bonds (eg, Watson-Crick base pairs) with the second nucleic acid sequence (eg, in a second nucleic acid sequence having 10 nucleotides). Of the total 10 nucleotides of the first oligonucleotide, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 nucleotides show 50%, 60%, 70%, 80%, 90% and 100% complementarity, respectively, when base paired ). By “completely complementary” it is meant that all adjacent residues of the nucleic acid sequence are hydrogen bonded to the same number of adjacent residues in the second nucleic acid sequence.

여기에 사용된 "유니버셜 염기(universal base)"라는 용어는 천연 DNA/RNA 염기들 각각과 그들 사이에 차이가 거의 없이 염기쌍들을 형성하는 뉴클레오티드 염기 유사체들을 뜻한다. 유니버셜 염기들의 비-제한적적 예들은 C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족 유도체들, 이노신(inosine), 아졸 카복사마이드들(azole carboxamides) 및 업계에 알려진 3-니트로피롤(nitropyrrole), 4-니트로인돌(nitroindole), 5-니트로인돌 및 6-니트로인돌과 같은 니트로아졸(nitroazole) 유도체들을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Loakes, Nucleic Acids Research 29:2437-2447, 2001 참조).The term "universal base" as used herein refers to nucleotide base analogs that form base pairs with little difference between each of the natural DNA / RNA bases and between them. Non-limiting examples of universal bases include C-phenyl, C-naphthyl and other aromatic derivatives, inosine, azole carboxamides and 3-nitropyrrole known in the art, Nitroazole derivatives such as 4-nitroindole, 5-nitroindole and 6-nitroindole (see, eg, Loakes, Nucleic). Acids Research 29: 2437-2447, 2001).

여기에 사용된 "비사이클릭 뉴클레오티드(acyclic nucleotide)"라는 용어는 예를 들어, 리보오스 탄소들의 임의의 것(C1, C2, C3, C4 또는 C5)이 뉴클레오티드로 독립적으로 또는 결합하여 부재하는 곳의 비사이클릭 리보오스 당을 가진 임의의 뉴클레오티드를 뜻한다.The term "acyclic nucleotide" as used herein refers to, for example, where any of the ribose carbons (C1, C2, C3, C4 or C5) is independently or in combination with nucleotides and is absent. By any nucleotide having a bicyclic ribose sugar.

여기에 사용된 "생분해성"이라는 용어는 예를 들어, 효소적 분해 또는 화학적 분해와 같이 생물학적 시스템 내에서의 분해를 의미한다.The term "biodegradable" as used herein refers to degradation in a biological system, such as, for example, enzymatic degradation or chemical degradation.

여기에 사용된 "생물학적 활성 분자"라는 용어는 시스템 내에서 생물학적 반응을 이끌어 내거나 변형시킬 수 있는 화합물들 또는 분자들을 뜻한다. 단독으로 또는 본 발명에 의해 고려되는 다른 분자들과 결합된 생물학적 활성 siNA 분자들의 비제한적인 예들은 항체들, 콜레스테롤, 호르몬들, 항바이러스제들, 펩티드들, 단백질들, 화학요법제들, 소분자 물질들, 비타민들, 보조인자들, 뉴클레오시드들, 뉴클레오티드들, 올리고뉴클레오티드들, 효소적 핵산들, 안티센스 핵산들, 트리플렉스(triplex) 형성 올리고뉴클레오티드들, 2,5-A 키메라들, siNA, dsRNA, 알로자임들, 앱타머들, 유인물들(decoys) 및 그 유사체들과 같은 치료 활성 분자들을 포함한다. 본 발명의 생물학적 활성 분자들은 기타 생물학적 분자들, 예를 들어, 지질들 및 폴리아민들, 폴리아미드들, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 폴리에테르들과 같은고분자들의 약동학 및/또는 약역학을 조절할 수 있는 분자들도 포함한다.As used herein, the term "biologically active molecule" refers to compounds or molecules capable of eliciting or modifying a biological response within a system. Non-limiting examples of biologically active siNA molecules, alone or in combination with other molecules contemplated by the present invention, include antibodies, cholesterol, hormones, antiviral agents, peptides, proteins, chemotherapeutic agents, small molecule substances. , Vitamins, cofactors, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, enzymatic nucleic acids, antisense nucleic acids, triplex forming oligonucleotides, 2,5-A chimeras, siNA, therapeutically active molecules such as dsRNA, allozymes, aptamers, decoys and analogs thereof. The biologically active molecules of the present invention may also contain other biological molecules such as lipids and molecules that can modulate the pharmacokinetics and / or pharmacodynamics of polymers such as polyamines, polyamides, polyethylene glycols and other polyethers. Include.

여기에 사용된 "인지질"이라는 용어는 적어도 하나의 인 기(phosphorus group)를 포함하는 소수성 분자를 뜻한다. 예를 들어, 인지질은 OH, COOH, 옥소(oxo), 아민 또는 치환 또는 비치환된 아릴 기들로 선택적으로 치환된 인-함유기 및 포화 또는 불포화된 알킬기를 포함할 수 있다.The term "phospholipid" as used herein refers to a hydrophobic molecule containing at least one phosphorus group. For example, phospholipids may include phosphorus-containing groups and saturated or unsaturated alkyl groups optionally substituted with OH, COOH, oxo, amine or substituted or unsubstituted aryl groups.

"캡 구조(cap structure)"는 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽 터미널에서 혼입될 수 있는 화학적 변형물들을 의미한다(예를 들어, 여기에 참조로 포함된 Adamic, et al., U.S. Patent No. 5,998,203 참조). 이러한 터미널 변형물들은 엑소뉴클레아제(exonuclease) 분해로부터 핵산 분자를 보호하고 새포 내에서 전달 및/또는 편재화(localization)에 보조할 수 있다. 상기 캡은 5'-터미널(5'-캡) 또는 3'-터미널(3'-캡) 중 어느 하나 또는 양쪽 터미널상에 존재할 수 있다. 비제한적인 예들에서, 상기 5'-캡은 글리세릴, 역위 디옥시 무염기 잔기(모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실(erythrofuranosyl))뉴클레오티드, 4'-티오(thio) 뉴클레오티드; 카보사이클릭 뉴클레오티드(carbocyclic nucleotide); 1,5-안하이드로헥시톨(anhydrohexitol) 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드들; 알파-뉴클레오티드들; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연쇄; 트레오-펜토푸라노실(threo-pentofuranosyl) 뉴클레오티드; 비사이클릭 3',4'-세코(seco) 뉴클레오티드; 비사이클릭 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 비사이클릭 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역위 무염기 모이어티; 3'-2'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역위 무염기 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포라미데이트(phosphoramidate); 헥실포스페이트(hexylphosphate); 아미노헥실포스페이트; 3-인산염; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티(bridging or non-bridging methylphosphonate moiety)를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다."Cap structure" means chemical modifications that can be incorporated at either terminal of an oligonucleotide (see, eg, Adamic, et al., US Patent No. 5,998,203, incorporated herein by reference) . Such terminal modifications may protect nucleic acid molecules from exonuclease degradation and assist in delivery and / or localization in the cells. The cap may be present on either or both terminals of a 5'-terminal (5'-cap) or 3'-terminal (3'-cap). In non-limiting examples, the 5'-cap can be selected from the group consisting of glyceryl, inverse deoxy free base residues (moieties); 4 ', 5'-methylene nucleotides; 1- (beta-D-erythrofuranosyl) nucleotide, 4'-thio nucleotide; Carbocyclic nucleotides; 1,5-anhydrohexitol nucleotides; L-nucleotides; Alpha-nucleotides; Modified base nucleotides; Phosphorodithioate chains; Threo-pentofuranosyl nucleotides; Acyclic 3 ', 4'-seco nucleotides; Bicyclic 3,4-dihydroxybutyl nucleotides; Bicyclic 3,5-dihydroxypentyl nucleotides, 3'-3'-inverted nucleotide moieties; 3'-3'-reversal base-free moiety; 3'-2'-inverted nucleotide moiety; 3'-2'-reversal base-free moiety; 1,4-butanediol phosphate; 3'-phosphoramidate; Hexylphosphate; Aminohexyl phosphate; 3-phosphate; 3'-phosphothioate; Phosphorodithioate; Or cross-linked or non-bridging methylphosphonate moiety.

상기 3'-캡의 비제한적인 예들은 글리세릴, 역위 디옥시 무염기 잔기(모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드;1-(베타-D-에리트로푸라노실)뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드; 카보사이클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트; 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실(aminododecyl) 포스페이트; 하이드록시프로필(hydroxypropyl) 포스페이트; 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비사이클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드; 5'-5'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역위 무염기 모이어티; 5'-포스포라미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비가교 5'-포스포라미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트, 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토(mercapto) 모이어티들(더 상세한 부분들을 보려면 여기에 참조로 포함된 Beaucage and Lyer, Tetrahedron 49:1925, 1993을 참조).Non-limiting examples of such 3'-caps include glyceryl, inverted deoxy free base residues (moieties); 4 ', 5'-methylene nucleotide; 1- (beta-D-erythrofuranosyl) nucleotide, 4'-thio nucleotide; Carbocyclic nucleotides; 5'-amino-alkyl phosphate; 1,3-diamino-2-propyl phosphate; 3-aminopropyl phosphate; 6-aminohexyl phosphate; 1,2-aminododecyl phosphate; Hydroxypropyl phosphate; 1,5-anhydrohexitol nucleotide; L-nucleotides; Alpha-nucleotides; Modified base nucleotides; Phosphorodithioate; Threo-pentofuranosyl nucleotides; Acyclic 3 ', 4'-seco nucleotides; 3,4-dihydroxybutyl nucleotide; 3,5-dihydroxypentyl nucleotide; 5'-5'-inverted nucleotide moiety; 5'-5'-reversible baseless moiety; 5'-phosphoramidate;5'-phosphothioate; 1,4-butanediol phosphate; 5'-amino; Crosslinked and / or uncrosslinked 5'-phosphoramidate, phosphorothioate and / or phosphorodithioate, crosslinked or uncrosslinked methylphosphonate and 5'-mercapto moieties (more detailed See Beaucage and Lyer, Tetrahedron 49: 1925, 1993, which is hereby incorporated by reference.

"비-뉴클레오티드"라는 용어는 당 및/또는 인산염 중 어느 하나의 치환을 포함하여 하나 이상의 뉴클레오티드 유니트들을 대신하여 핵산 사슬에 혼입될 수 있으며, 나머지 염기들이 그 효소적 활성을 보이도록 하는 임의의 기 또는 화합물을 의미한다. 상기 기 또는 화합물은 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민과 같은 흔히 인식되는 뉴클레오티드 염기를 함유하지 않아서 1'-위치에서 염기가 부족하다는 점에서 무염기성이다.The term "non-nucleotide" may be incorporated into a nucleic acid chain on behalf of one or more nucleotide units, including the substitution of either sugar and / or phosphate, and any group that causes the remaining bases to exhibit their enzymatic activity. Or a compound. The group or compound is baseless in that it lacks a base at the 1'-position because it does not contain commonly recognized nucleotide bases such as adenosine, guanine, cytosine, uracil or thymine.

여기에 사용된 "뉴클레오티드"는 천연 염기들(표준) 및 업계에 잘 알려진 변형된 염기들을 포함하는 것으로 업계에서 인식된다. 그러한 염기들은 일반적으로 뉴클레오티드 당 부분의 1'-위치에 위치한다. 뉴클레오티드들은 일반적으로 염기, 당 및 인산염 기를 포함한다. 상기 뉴클레오티드들은 당, 인산염 및/또는 염기 모이어티에서 변형되지 않거나 변형될 수 있다(또한 뉴클레오티드 유사체들, 변형된 뉴클레오티드들, 비-천연 뉴클레오티드들, 비-표준 뉴클레오티드들 등으로 서로 혼용해서 칭해지며; 예를 들어, 여기에 모두 참조로 포함된 Usman and McSwiggen, supra; Eckstein, et al., InteRNAtional PCT Publication No. WO 92/07065; Usman, et al., InteRNAtional PCT Publication No. WO 93/15187; Uhlman & Peyman, supra를 참조하시오. Limbach, et al., Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994에서 요약한 업계에 알려진 변형된 핵산 염기들의 몇몇 예들이 있다. 핵산 분자들 내로 도입될 수 있는 염기 변형물들의 일부 비제한적인 예들은 이노신, 퓨린, 피리딘-4-원(pyridin-4-one), 피리딘-2-원, 페닐, 슈도우라실(pseudouracil), 2, 4, 6-트리메톡시 벤젠(2, 4, 6-trimethoxy benzene), 3-메틸 우라실, 디하이드로우리딘(dihydrouridine), 나프틸(naphthyl), 아미노페닐(aminophenyl), 5-알킬시티딘들(alkylcytidines) (예컨대, 5-메틸시티딘(methylcytidine)), 5-알킬우리딘들(alkyluridines) (예컨대, 리보티미딘(ribothymidine)), 5-할로우리딘(halouridine) (예컨대, 5-브로모우리딘(bromouridine)) or 6-아자피리미딘들(azapyrimidines) 또는 6-알킬피리미딘들(alkylpyrimidines) (예컨대, 6-메틸우리딘(methyluridine)), 프로핀 등(Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996; Uhlman & Peyman, supra)을 포함한다. 이러한 태양에서 "변형된 염기들"은 1' 위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신 및 구아닌 또는 그 동등물들이 아닌 뉴클레오티드 염기들을 의미한다.As used herein, a “nucleotide” is recognized in the art to include natural bases (standards) and modified bases well known in the art. Such bases are generally located at the 1'-position of the nucleotide sugar moiety. Nucleotides generally include base, sugar and phosphate groups. The nucleotides may or may not be modified in sugar, phosphate and / or base moieties (also referred to interchangeably with nucleotide analogues, modified nucleotides, non-natural nucleotides, non-standard nucleotides, etc.); For example, Usman and McSwiggen, supra; Eckstein, et al., InteRNAtional PCT Publication No. WO 92/07065; Usman, et al., InteRNAtional PCT Publication No. WO 93/15187; Uhlman, all of which are hereby incorporated by reference. & Peyman, supra Limbach, et al., Nucleic Acids Res . There are several examples of modified nucleic acid bases known in the art summarized in 22: 2183, 1994. Some non-limiting examples of base modifications that can be introduced into nucleic acid molecules include inosine, purine, pyridin-4-one, pyridine-2-one, phenyl, pseudouracil, 2 , 4, 6-trimethoxy benzene, 3-methyl uracil, dihydrouridine, naphthyl, aminophenyl, 5-alkylcytidine Alkylcytidines (eg, 5-methylcytidine), 5-alkyluridines (eg, ribothymidine), 5-halouridine (eg, 5-bro) Mouridine) or 6-azapyrimidines or 6-alkylpyrimidines (eg 6-methyluridine), propine and the like (Burgin, et al., Biochemistry 35: 14090, 1996; Uhlman & Peyman, supra ). "Modified bases" in this aspect means nucleotide bases that are not adenine, guanine, cytosine and guanine or their equivalents at the 1 'position.

"표적 사이트"는 표적 서열에 상보적인 안티센스 영역 내에서 서열들을 포함하는 siNA 컨스트럭트에 의해 매개되는 분열을 위해 "표적되는" 표적 RNA 내에서의 서열을 의미한다."Target site" means a sequence in a target RNA that is "targeted" for cleavage mediated by an siNA construct comprising sequences in an antisense region complementary to the target sequence.

"검출가능한 분열 수준"은 표적 RNA의 무작위 분해에 의해 생성된 RNA들의 백그라운드(background)를 초과하여 분열 생성물들을 구별하기에 충분한 정도로 표적 RNA의 분열(및 분열된 RNA 생성물들의 형성)을 의미한다. 표적 RNA의 1 내지 5 %로부터 분열 생성물들의 생성은 대부분의 검출 방법들에 대하여 백그라운드를 초과하여 검출하기에 충분하다.By "detectable cleavage level" is meant the cleavage of the target RNA (and the formation of cleaved RNA products) to a degree sufficient to distinguish cleavage products beyond the background of RNAs produced by random degradation of the target RNA. Production of cleavage products from 1-5% of the target RNA is sufficient to detect beyond the background for most detection methods.

"생물학적 시스템"은 인간, 동물, 식물, 곤충, 박테리아, 바이러스 또는 다른 원천을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 상기 시스템이 RNAi 활성에 필요한 성분들을 포함하는 생물학적 원천들로부터 정제되거나 정제되지 않은 형태의 물질을 의미한다. "생물학적 시스템"이라는 용어는 예를 들어, 세포, 조직, 또는 유기체 또는 그 추출물을 포함한다. 생물학적 시스템이라는 용어는 생체 외 세팅에서 사용될 수 있는 재구성된 RNAi 시스템들도 포함한다.A "biological system" includes, but is not limited to, humans, animals, plants, insects, bacteria, viruses, or other sources, and substances in a form that is purified or unpurified from biological sources that include components necessary for RNAi activity. Means. The term "biological system" includes, for example, cells, tissues, or organisms or extracts thereof. The term biological system also includes reconstituted RNAi systems that can be used in in vitro settings.

여기에 사용된 "생분해성 링커"라는 용어는 예를 들어, 생물학적 활성 분자를 본 발명의 siNA 분자에 생물학적 활성 분자 또는 본 발명의 siNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥들로 연결하는 것과 같이, 하나의 분자를 다른 분자들로 연결하는 생분해성 링커로 지정되는 핵산 또는 비핵산 링커 분자를 의미한다. 생분해성 링커는 그 안정성이 특정한 조직 또는 세포 유형에 전달되는 것과 같이 특정한 목적을 위하여 조절될 수 있도록 설계된다. 핵산계 생분해성 링커 분자의 안정성은 예를 들어, 리보뉴클레오티드들, 디옥시리보뉴클레오티드들 및 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-O-아미노, 2'-C-알릴, 2'-O-알릴, 및 다른 2'-변형 또는 염기 변형 뉴클레오티드들과 같은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드들의 결합과 같은 다양한 화학종들을 이용하여 조절될 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 다이머, 트리머, 테트라머 또는 길이가 더 긴 핵산 분자, 예를 들어, 길이가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드들의 올리고뉴클레오티드일 수 있거나 예를 들어, 포스포라미데이트 또는 포스포디에스테르 연쇄와 같은 포스포러스계 연쇄를 지닌 단일 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 핵산 골격, 핵산 당, 또는 핵산 염기 변형물들도 포함할 수 있다.The term "biodegradable linker" as used herein refers to a single molecule, such as, for example, linking a biologically active molecule to the siNA molecule of the invention with the sense and antisense strands of the biologically active molecule or the siNA molecule of the invention. A nucleic acid or non-nucleic acid linker molecule designated as a biodegradable linker linking to other molecules. Biodegradable linkers are designed such that their stability can be adjusted for specific purposes, such as being delivered to specific tissues or cell types. The stability of the nucleic acid based biodegradable linker molecule is for example ribonucleotides, deoxyribonucleotides and 2'-0-methyl, 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-0-amino, 2'-C. It can be regulated using a variety of species, such as binding of chemically modified nucleotides such as allyl, 2'-0-allyl, and other 2'-modified or base modified nucleotides. Biodegradable nucleic acid linker molecules may be dimers, trimmers, tetramers or longer nucleic acid molecules, eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, It may be an oligonucleotide of 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 nucleotides or may comprise a single nucleotide having a phosphorus-based chain such as, for example, phosphoramidate or phosphodiester chains. Biodegradable nucleic acid linker molecules may also include nucleic acid backbones, nucleic acid sugars, or nucleic acid base modifications.

"무염기성"은 1' 위치에서 염기가 부족하거나 1' 위치에서 염기 대신에 다른 화학기들을 가지는 당 모이어티들을 의미한다. Adamic, et al., U.S. Patent No. 5,998,203를 참조."Non-basic" means sugar moieties that lack a base at the 1 'position or have other chemical groups in place of the base at the 1' position. Adamic, et al., U.S. Patent No. See 5,998,203.

"변형되지 않은 뉴클레오시드"는 베타-D-리보-푸라노즈(beta.-D-ribo-furanose)의 1' 탄소에 결합되는 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민 또는 우라실의 염기들 중 하나를 의미한다."Unmodified nucleoside" means one of the bases of adenosine, cytosine, guanine, thymine or uracil that is bound to the 1 'carbon of beta-D-ribo-furanose. do.

"변형된 뉴클레오시드"는 변형되지 않은 뉴클레오티드 염기, 당 및/또는 인산염의 화학 구조에서 변형을 포함하는 임의의 뉴클레오티드 염기를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드들의 비제한적인 예들은 공식 I 내지 VII 및/또는 여기에 설명된 다른 변형들에 의해 도시되어 있다."Modified nucleoside" means any nucleotide base that includes modifications in the chemical structure of unmodified nucleotide bases, sugars and / or phosphates. Non-limiting examples of modified nucleotides are shown by Formulas I-VII and / or other modifications described herein.

본 발명을 위하여 설명된 2'-변형된 뉴클레오티드들과 연계하여, "아미노"는 변형되거나 변형될 수 있는 2'-NH2 또는 2'-O--NH2를 의미한다. 그러한 변형된 기들은 예를 들어, Eckstein et al., U.S. Patent No. 5,672,695 및 Maralic-Adamic, et al., U.S. Patent No. 6,248,878에 설명되어 있다.In connection with the 2'-modified nucleotides described for the present invention, "amino" refers to 2'-NH 2 or 2'-0-NH 2 which can be modified or modified. Such modified groups are described, for example, in Eckstein et al., US Pat. 5,672,695 and Maralic-Adamic, et al., US Patent No. 6,248,878.

상기 siNA 분자들은 양이온 지질들과 복합되거나, 리포솜들 내에 패키지 되거나 그렇지 않으면 표적 세포들 또는 조직들에 전달될 수 있다. 핵산 또는 핵산 복합체들은 주사, 주입 펌프 또는 스텐트(stent)를 생고분자들 내에 혼입되거나 혼입되지 않으면서 국소적으로 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 본 발명의 siNA 화합물들, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 또는 양쪽 모두에 공유적으로 부착될 수 있다. 부착된 PEG는 바람직하게는 약 2,000 내지 약 50,000 돌턴(daltons: DA)의 임의의 분자량일 수 있다.The siNA molecules may be complexed with cationic lipids, packaged in liposomes or otherwise delivered to target cells or tissues. Nucleic acids or nucleic acid complexes may be administered topically with or without incorporation of an injection, infusion pump or stent into the biopolymer. In another embodiment, polyethylene glycol (PEG) may be covalently attached to siNA compounds of the invention, polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, or both. The attached PEG may preferably be of any molecular weight of about 2,000 to about 50,000 daltons (DA).

센스 영역은 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커와 같은 링커 분자를 통해 안티센스 영역에 연결될 수 있다.The sense region may be linked to the antisense region via a linker molecule, such as a polynucleotide linker or a non-nucleotide linker.

"역위 반복(inverted reapeat)"은 반복배열이 전사되는 경우 이중 가닥 siRNA를 형성할 수 있도록 위치되는 센스 및 안티센스 요소를 포함하는 핵산 서열을 뜻한다. 역위 반복은 상기 반복배열의 두 요소들 사이에 링커 또는 자가-분열(self-cleaving) 리보자임과 같은 비상동 서열을 포함한다. 역위 반복의 요소들은 이중 가닥 RNA를 형성하기에 충분한 길이를 가진다. 일반적으로, 역위 반복의 각각의 요소는 길이가 약 15 내지 약 100 뉴클레오티드들, 바람직하게는 약 20 내지 30 염기 뉴클레오티드들, 예컨대 길이가 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드들과 같이 바람직하게는 약 20 내지 25 뉴클레오티드들이다."Inverted reapeat" refers to a nucleic acid sequence comprising sense and antisense elements positioned to form double stranded siRNAs when the repeat is transcribed. Inversion repeats include nonhomologous sequences, such as linkers or self-cleaving ribozymes, between two elements of the repeat sequence. The elements of the inversion repeat are of sufficient length to form a double stranded RNA. In general, each element of an inversion repeat is about 15 to about 100 nucleotides in length, preferably about 20 to 30 base nucleotides, such as 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, Preferably about 20 to 25 nucleotides, such as 28, 29 or 30 nucleotides.

"핵산"은 디옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들 및 단일- 또는 이중-가닥 형태로 된 이들의 고분자들을 뜻한다. 상기 용어는 합성, 자연발생적 및 비자연발생적이며, 기준 핵산과 유사한 결합 성질들을 가지며, 기준 뉴클레오티드들과 유사한 방식으로 물질대사 되는 공지된 뉴클레오티드 유사체들 또는 변형된 골격 잔기들 또는 연쇄들을 포함하는 핵산들을 포함한다. 그러한 유사체들의 예들은 제한 없이 포스포로티오에이트들, 포스포라미데이트들, 메틸 포스포네이트들, 카이랄-메틸 포스포네이트들, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드들, 펩티드-핵산들(PNA들)을 포함한다."Nucleic acid" refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides and their polymers in single- or double-stranded form. The term refers to nucleic acids comprising known nucleotide analogues or modified backbone residues or chains that are synthetic, naturally occurring and non-naturally occurring, have similar binding properties as the reference nucleic acid, and are metabolized in a manner similar to the reference nucleotides. Include. Examples of such analogues include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methyl phosphonates, chiral-methyl phosphonates, 2-O-methyl ribonucleotides, peptide-nucleic acids (PNAs). ).

"큰 이중-가닥 RNA"는 약 40 염기쌍(bp) 보다 더 큰 크기를 가지며 예를 들어, 100 bp 보다 더 크며 더 구체적으로는 300 bp 보다 더 큰 임의의 이중-가닥 RNA를 뜻한다. 큰 dsRNA의 서열은 mRNA의 세그먼트 또는 전체 mRNA를 나타낼 수 있다. 큰 dsRNA의 최대 크기는 여기에 한정되지 않는다. 이중-가닥 RNA는 인산염 당 골격 또는 뉴클레오시드에 변형될 수 있는 변형된 염기들을 포함할 수 있다. 그러한 변형들은 질소 또는 황 헤테로원자 또는 업계에 알려진 임의의 다른 변형을 포함할 수 있다."Large double-stranded RNA" refers to any double-stranded RNA having a size greater than about 40 base pairs (bp), for example, greater than 100 bp and more specifically greater than 300 bp. The sequence of large dsRNA may represent a segment of the mRNA or the entire mRNA. The maximum size of large dsRNA is not limited thereto. Double-stranded RNA can include modified bases that can be modified to the phosphate sugar backbone or nucleoside. Such modifications may include nitrogen or sulfur heteroatoms or any other modification known in the art.

이중-가닥 구조는 헤어핀 또는 마이크로 RNA에 대해 발생하는 것과 같은 자기-상보적 RNA에 의하거나 두 개의 상이한 상보적 RNA 가닥들을 어닐링하여 형성될 수 있다.The double-stranded structure can be formed by self-complementary RNA such as occurs for hairpins or microRNAs or by annealing two different complementary RNA strands.

"오버래핑(overlapping)"은 두 개의 RNA 단편들이 하나의 가닥 상에서 다수의 뉴클레오티드들에 의하여 중첩되는 서열들을 가지는 경우를 칭하는 것으로서, 여기서 다수의 뉴클레오티드들(nt) 수들은 2 내지 5의 뉴클레오티드들만큼 적거나 혹은 5 내지 10 또는 그 이상의 뉴클레오티드들이다."Overlapping" refers to the case where two RNA fragments have sequences overlapped by multiple nucleotides on one strand, where the multiple nucleotides (nt) numbers are as small as 2 to 5 nucleotides. Or 5 to 10 or more nucleotides.

"하나 이상의 dsRNA들"은 서열을 기본으로 서로 다른 dsRNA들을 뜻한다."One or more dsRNAs" means different dsRNAs based on sequence.

"표적 유전자 또는 mRNA"는 중요한 임의의 유전자 또는 mRNA를 뜻한다. 유전학에 의하거나 순서결정(senquecing)에 의해 이전에 확인된 임의의 유전자들은 표적을 나타낼 수 있다. 표적 유전자들 또는 mRNA는 대사 또는 구조 유전자들 또는 효소를 엔코딩하는 유전자들뿐만 아니라 발달 유전자들 및 조절 유전자들을 포함할 수 있다. 표적 유전자는 표현형이 조사되고 있는 세포들 내에서나 표현 특성을 직접 또는 간접으로 부여하는 방식으로 유기체 내에서 발현될 수 있다. 조절 유전자는 내생성 또는 외생성일 수 있다. 그러한 세포들은 배우체 불멸성 세포주(immortal cell line) 또는 원시 세포 배양(primary cell culture) 내에서 발생하는 임의의 독립된 세포를 포함하여 성체 또는 배아 상태 동물 또는 식물의 몸체 내에 있는 임의의 세포를 포함한다."Target gene or mRNA" means any gene or mRNA of interest. Any genes previously identified by genetics or by sequencing may represent a target. Target genes or mRNA may include developmental and regulatory genes as well as metabolic or structural genes or genes encoding enzymes. Target genes can be expressed in organisms in which the phenotype is being investigated or in a manner that directly or indirectly imparts expression properties. Regulatory genes may be endogenous or exogenous. Such cells include any cells within the body of an adult or embryonic animal or plant, including any independent cells that occur in an embryonic immortal cell line or primary cell culture.

본 명세서 및 동봉된 청구항들에서 "하나" 및 "상기"의 단수 형태들은 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수형의 언급을 포함한다.In this specification and the appended claims, the singular forms “a,” “an,” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise.

실시예Example

상기 개시는 일반적으로 하기의 실시예들에 의해 더 예시되는 바와 같이 일반적으로 본 발명을 설명한다. 이러한 실시예들은 예시의 목적으로만 설명되는 것이지 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다. 여기에 특이적인 용어들과 수치들이 사용된다 할지라도 그러한 용어들과 수치들은 예시적이고 발명의 범위에 비-제한적으로 이해될 것이다.The above disclosure generally describes the invention as further illustrated by the following examples. These embodiments are described for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. Although specific terms and numbers are used herein, such terms and numbers are illustrative and will be understood without limitation to the scope of the invention.

실시예Example 1 : 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 복합체를 형성한 siRNA를 포함하는 조성물들의 제조 및 특성화( 1: Preparation and Characterization of Compositions Comprising siRNA Complexed with Polynucleotide Delivery-Enhancing Polypeptide characterizationcharacterization ))

본 발명의 후보(candidate) siRNA들과 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들 사이에서 복합체들을 형성하기 위하여, 적절한 양의 siRNA를 예를 들어, Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00004
세포 배지(Invitrogen)에서 소정량의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드과 정해진 비율로 결합하고 상온에서 약 10 내지 30 분 동안 배양한다. 이후 이러한 혼합물을 예컨대, 약 50 ㎕와 같이 부피를 선택하여 상기 혼합물을 표적 세포들과 접촉시키고 상기 세포들을 본 실시예에서는 약 2 시간 정도인 소정의 배양 시간 동안 배양하였다. 상기 siRNA/펩티드 혼합물은 세포 배지 또는 우태혈청(fetal bovine serum)과 같은 다른 첨가제들을 선택적으로 포함할 수 있다. H3, H4 및 H2b에 대하여, 일련의 실험들을 실시하여 이러한 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 siRNA와 다른 비율들로 복합하였다. 일반적으로 이는 siRNA/히스톤 비율을 1:0.01 내지 1:50으로 시작하였다. 96-웰(well) 마이크로타이터 플레이트 내의 각각의 웰에 40 pm siRNA를 첨가하였다. 각각의 웰은 50 % 콘플루언시(confluency)의 베타-갈(beta-gal) 세포들을 포함하였다. 형질감염 효율에 대한 대표적인 최적화된 비율들이 하기 표 2에 도시된다.In order to form complexes between candidate siRNAs of the invention and polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, an appropriate amount of siRNA may be used, for example, Opti-MEM.
Figure 112008025338980-PCT00004
In a cell medium (Invitrogen), a predetermined amount of polynucleotide transfer-enhancing polypeptide is bound at a predetermined ratio and incubated at room temperature for about 10-30 minutes. This mixture was then contacted with the target cells by selecting a volume such as, for example, about 50 μl and the cells were incubated for a predetermined incubation time, which in this example is about 2 hours. The siRNA / peptide mixture may optionally include other additives such as cell medium or fetal bovine serum. For H3, H4 and H2b, a series of experiments were conducted to combine these polynucleotide delivery-enhancing polypeptides at different ratios with siRNA. Generally this started with an siRNA / histone ratio of 1: 0.01 to 1:50. 40 pm siRNA was added to each well in a 96-well microtiter plate. Each well contained beta-gal cells of 50% confluency. Representative optimized ratios for transfection efficiency are shown in Table 2 below.

9L/베타-갈 세포들 상에 상기-확인된 히스톤 단백질들 중 하나와 복합된 정규의(regular) siRNA 또는 siRNA 중 어느 하나로 형질감염을 실시하였다. 상기 siRNA는 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) mRNA를 특이적으로 넉 다운하도록 설계되었으며, 활성들은 대조군(대조군 세포들은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드가 없이 리포펙타민을 이용하여 형질감염 되었다)로부터의 베타-갈 활성들의 퍼센티지로 표현된다.9L / beta-gal cells were transfected with either regular siRNA or siRNA complexed with one of the above-identified histone proteins. The siRNA was designed to specifically knock down beta-galactosidase mRNA, and the activities were control (control cells were transfected with lipofectamine without polynucleotide delivery-enhancing polypeptide). Expressed as a percentage of beta-gal activities from.

siRNA 전달의 효율을 검출하고/하거나 수량화하는 시험법들은 예를 들어, 베타-갈락토시다아제 시험법 또는 유동 세포계측법들(flow cytometry methods)과 같은 통상적인 방법들을 이용하여 수행한다.Assays for detecting and / or quantifying the efficiency of siRNA delivery are performed using conventional methods such as, for example, beta-galactosidase assays or flow cytometry methods.

베타-갈락토시다아제 시험법들에 대하여 베타-갈락토시다아제를 성분으로 표현하는 세포 계통인 9L/LacZ 세포들을 사용하였다. 9L/LacZ 세포들은 LacZ를 성분으로 발현하는 쥐 신경교육종 섬유아세포 세포들(rat gliosarcoma fibroblast cells)이며 ATCC(#CRL-2200)으로부터 입수하였다. 9L/LacZ 세포들은 1 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수(nonessential) 아미노산들 및 20 % 우태혈청을 보충한 Dulbecco's Modified Essential Medium(DMEM) 배지 내에서 성장하였다. 세포들은 37 ℃ 및 100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin) 및 0.25 ㎎/㎖ 푼지존(Fungizone)(Invitrogen)을 포함하는 항생제 혼합물로 보충된 5 % CO2에서 배양되었다. 베타-갈 mRNA에 대해 설계된 siRNA 듀플렉스는 화학적으로 합성되었고 전달 시약들과 함께 사용하여 넉 다운 효율을 평가하였다.For the beta-galactosidase assays 9L / LacZ cells, a cell line expressing beta-galactosidase as a component, were used. 9L / LacZ cells were rat gliosarcoma fibroblast cells expressing LacZ as a component and were obtained from ATCC (# CRL-2200). 9L / LacZ cells were grown in Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) medium supplemented with 1 mM sodium pyruvate, nonessential amino acids and 20% fetal calf serum. Cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 supplemented with antibiotic mixtures containing 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 0.25 mg / ml Fungizone (Invitrogen). SiRNA duplexes designed for beta-gal mRNA were chemically synthesized and used with delivery reagents to assess knock down efficiency.

펩티드 합성Peptide synthesis

레이닌 심포니 합성기(Rainin Symphony synthesizer)를 이용하여 CLEAR-아미드 수지상에서 고체-상 Fmoc 화학에 의하여 펩티드들을 합성하였다. HCTU 및 Fmoc 아미노산의 5 당량을 과량의 N-메틸모폴린(methylmorpholine)과 함께 사용하여 40 분 동안 결합(coupling) 단계를 수행하였다. 상기 펩티드 수지를 DMF 내에서 20 % 피페리딘(piperidine)으로 10 분 사이클의 2 회 동안 처리하여 Fmoc를 제거하였다. 전체 펩티드를 완료시에, 상기 Fmoc 기를 피페리딘으로 제거하고 DMF로 광범위하게 세척하였다. N-메틸모폴린의 6 당량들이 존재시에 3-말레이미도프로피온산(maleimidopropionic acid) 및 HCTU의 3.0 당량들을 펩티드 수지의 N-터미널에 결합시켜 말레이미도(maleimido) 변형된 펩티드들을 제제하였다. 결합 정도는 Kaiser 시험에 의해 모니터되었다. 2.5 % 물(water) 및 2.5 트리이소프로필 실란(triisopropyl silane)을 첨가하여 수지로부터 펩티드들을 분열시키고 이후 상온에서 2 시간 동안 가볍게 교반하였다. 이로 인해 생긴 정제되지 않은 펩티드들을 에테르로 분쇄(trituration)하고 회수하여 여과시킨다. 정제되지 않은 생성물은 Millipore water에 용해시켜 건조해질 때까지 동결건조시킨다. 0.05 % TFA 및 3 mL 아세트산을 포함하는 15 mL의 물에 정제되지 않은 펩티드를 녹이고 5 mL/min의 유내로 5 mL 주입 루프를 통하여 Zorbax RX-C8 역상(reversed-phase)(22 mm ID x 250 mm, 5 ㎛ 입자 크기)으로 담았다. 용매 A가 물에 0.05 %이고 용매 B가 아세토나이트릴(acetonitrile)에 0.05 % TFA인 0.1 % B/min의 선형 AB 구배(gradient)를 진행하여 정제를 실시하였다. HPLC 및 ESMS로 정제된 펩티드들을 분석하였다.Peptides were synthesized by solid-phase Fmoc chemistry on CLEAR-amide resin using a Rainin Symphony synthesizer. A coupling step was performed for 40 minutes using 5 equivalents of HCTU and Fmoc amino acids with excess N-methylmorpholine. The peptide resin was treated with 20% piperidine in DMF for two 10 minute cycles to remove Fmoc. Upon completion of the entire peptide, the Fmoc group was removed with piperidine and washed extensively with DMF. Maleimido modified peptides were prepared by binding 3 equivalents of maleimidopropionic acid and HCTU in the presence of 6 equivalents of N-methylmorpholine to the N-terminal of the peptide resin. The degree of binding was monitored by the Kaiser test. Peptides were cleaved from the resin by the addition of 2.5% water and 2.5 triisopropyl silane and then gently stirred at room temperature for 2 hours. The resulting crude peptide is triturated with ether, recovered and filtered. The crude product is dissolved in Millipore water and lyophilized until dry. Dissolve the crude peptide in 15 mL of water containing 0.05% TFA and 3 mL acetic acid and Zorbax RX-C8 reversed-phase (22 mm ID x 250) through a 5 mL injection loop into a 5 mL / min oil. mm, 5 μm particle size). Purification was carried out by performing a linear AB gradient of 0.1% B / min with solvent A of 0.05% in water and solvent B of 0.05% TFA in acetonitrile. Peptides purified by HPLC and ESMS were analyzed.

siRNAsiRNA 합성 및 제제 Synthesis and Formulation

정선한 5'-O-디메틸트리틸-2'-O-t-부틸디메틸실릴-3'-O-숙시닐 리보뉴클레오시드(5'-O-dimethyltrityl-2'-O-t-butyldimethylsilyl-3-O-succinyl ribonucleoside) 또는 적용가능한 5'-O-디메틸트리틸-2'-디옥시-3'-O-숙시닐 티미딘(5'-O-dimethyltrityl-2'-deoxy-3-O-succinyl thymidine) 지지체(support)로 유도된 장쇄(long chain) 알킬아민 조절 공극 유리(controlled pore glass)상에 표준 2-사이아노에틸 포스포라미디테(cyanoethyl phosphoramidite) 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드들의 합성을 실시하였다. ABI 3400 DNA/RNA 합성기를 이용하여 0.2 또는 1 μmol 스케일 중 어느 하나로 모든 올리고뉴클레오티드들을 합성하고, 농축 NH4OH를 사용하여 고체 지지체로부터 분열시켜 NH4OH:EtOH가 3:1인 혼합물을 이용하여 55 ℃에서 디프로텍트시켰다(deprotected). 염기-디프로텍티드된 RNA를 N-메틸피롤리돈/트리에틸아민/트리에틸아민 트리스(하이드로플루오라이드)(N-methylpyrrolidone/triethylamine/triethylamine tris(hydrofluoride)) (부피비 6:3:4)의 용액과 65 ℃에서 2.5 시간 동안 배양하여 2'-TBDMS 보호기들(protecting groups)의 디프로텍션을 실시하였다. 해당 빌딩 블록들인 A, U, C 및 G의 5'-디메톡시트리틸-N-(택)-2'-O-(t-부틸디메틸실릴)-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디테들뿐만 아니라 변형된 5'DMTr-5-메틸-U-TOM-CE-포스포라미디테(5'DMTr-5-methyl-U-TOM-CE-Phosphoramidite), 5'-DMTr-OMe-Ac-C-CE 포스포라미디테, 5'-DMTr-2'-OMe-G-CE-포스포라미디테, 5'-DMTr-2'-OMe-U-CE 포스포라미디테, 5'-DMTr-2'-OMe-A-CE 포스포라미디테와 같은 변형된 라미디테들(Glen Research)을 공급자들로부터 직접 구매하였다. 트리에틸아민-트리하이드로플루리드(triethylamine-trihydrofluride), N-메틸피롤리돈 및 농축 수산화 암모늄은 Aldrich사로부터 구매하였다. XterraTM 칼럼들을 지닌 Waters 2690 상에 모든 HPLC 분석 및 정제를 실시하였다. 다른 모든 시약들은 Glen Research Inc로부터 구매하였다. RP-HPLC로 측정하여 97 %를 초과한 순도까지 올리고뉴클레오티드들을 정제하였다. 생체 내 주입을 위해 수용가능한 엔도톡신(endotoxin) 수준으로 어닐링한 후에 쥐에 주사하기 위한 HPLC 정제시킨 siRNA들은 Qiagen사로부터 구매하였다.Choice 5'-O-dimethyltrityl-2'-Ot-butyldimethylsilyl-3'-O-succinyl ribonucleoside (5'-O-dimethyltrityl-2'-Ot-butyldimethylsilyl-3-O- succinyl ribonucleoside) or applicable 5'-O-dimethyltrityl-2'-dioxy-3'-O-succinyl thymidine (5'-O-dimethyltrityl-2'-deoxy-3-O-succinyl thymidine) Oligonucleotides were synthesized using a standard 2-cyanoethyl phosphoramidite method on long chain alkylamine controlled pore glass induced with support. All oligonucleotides were synthesized on either 0.2 or 1 μmol scale using an ABI 3400 DNA / RNA synthesizer and cleaved from the solid support using concentrated NH 4 OH to 55 ° C. using a mixture of NH4OH: EtOH 3: 1. Deprotected at. Base-diprotected RNA was dissolved in N-methylpyrrolidone / triethylamine / triethylamine tris (hydrofluoride) (N-methylpyrrolidone / triethylamine / triethylamine tris (hydrofluoride)) (volume 6: 3: 4) And incubation at 65 ° C. for 2.5 hours to deprotect 2′-TBDMS protecting groups. 5'-dimethoxytrityl-N- (tack) -2'-0- (t-butyldimethylsilyl) -3 '-[(2-cyanoethyl) of corresponding building blocks A, U, C and G -(N, N-diisopropyl)]-phosphoramidates as well as modified 5'DMTr-5-methyl-U-TOM-CE-phosphoramidate (5'DMTr-5-methyl-U- TOM-CE-Phosphoramidite), 5'-DMTr-OMe-Ac-C-CE phosphoramidate, 5'-DMTr-2'-OMe-G-CE-phosphoramidate, 5'-DMTr-2 ' Modified lamidites (Glen Research) such as -OMe-U-CE phosphoramidate, 5'-DMTr-2'-OMe-A-CE phosphoramidate, were purchased directly from suppliers. Triethylamine-trihydrofluride, N-methylpyrrolidone and concentrated ammonium hydroxide were purchased from Aldrich. All HPLC analysis and purification was performed on Waters 2690 with Xterra ™ columns. All other reagents were purchased from Glen Research Inc. Oligonucleotides were purified to purity greater than 97% as measured by RP-HPLC. HPLC purified siRNAs for injection into mice after annealing to acceptable endotoxin levels for in vivo injection were purchased from Qiagen.

세포 배양Cell culture

제 1 인간 First human 단구세포들Monocytes ::

건강한 기증자들로부터 얻은 신선한 인간 혈액 표본들을 Golden West Biologicals 사로부터 구매하였다. 단구세포들의 분리를 위해, 혈액 표본들을 수취한 후 즉시 1:1의 비율로 PBS와 희석시켰다. 전혈로부터 피콜(Ficoll)(Amersham) 그래디언트(gradient)에 의해 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)을 우선 분리하였다. 단구세포들을 밀테니(Miltenyi) CD14 포지티브 선택 키트 및 지급된 프로토콜(MILTENYI BIOTEC)을 이용하여 PBMC들로부터 단구세포들을 더 정제하였다. 단구세포 제제의 순도를 평가하기 위해, 안티-CD14 항체(BD Biosciences)로 세포들을 배양하였고 이후 유동 세포계측법으로 정렬하였다. 상기 단구세포 제제의 순도는 95 %를 초과하였다.Fresh human blood samples from healthy donors were purchased from Golden West Biologicals. For the isolation of monocytes, blood samples were taken and immediately diluted with PBS in a ratio of 1: 1. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first isolated from whole blood by Ficoll (Amersham) gradients. Monocytes were further purified from PBMCs using the Miltenyi CD14 positive selection kit and the issued protocol (MILTENYI BIOTEC). To assess the purity of monocyte preparations, cells were incubated with anti-CD14 antibody (BD Biosciences) and then sorted by flow cytometry. The purity of the monocyte preparation was above 95%.

종양 괴사 인자-±(TNF-±) 생성을 자극하도록 세포 배양액에 Liposaccharides, LPS(Sigma, St Louis, MO) 0.1 내지 1.0 ng/ml을 첨가하여 인간 단구세포들의 활성화를 실시하였다. LPS로 배양한 3 시간 후에 세포들을 회수하였고 제작자 지침에 따른 Quantigene 시험법(Genospectra, Fremont, CA)에 의해 mRNA 수준들을 측정하였다.Human monocytes were activated by adding Liposaccharides, LPS (Sigma, St Louis, MO) 0.1-1.0 ng / ml to the cell culture medium to stimulate tumor necrosis factor- ± (TNF- ±) production. Cells were harvested 3 hours after incubation with LPS and mRNA levels were measured by Quantigene assay (Genospectra, Fremont, CA) according to the manufacturer's instructions.

쥐의 꼬리 섬유아세포 세포들:Rat tail fibroblast cells:

쥐의 꼬리 섬유아세포(MTF) 세포들은 C57BL/6J 쥐들의 꼬리들로부터 유도되었다. 꼬리들을 제거하여, 70 % 에탄올에 담근 다음 면도날로 절단하여 작은 부분들로 나눈다. 나눠진 부분들을 PBS로 3 회 세척한 후에 0.5 mg/mL 콜라게나아제(collagenase), 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신과 함께 교반기에서 37 ℃로 배양하여 조직을 분열시켰다. 이후 꼬리 부분들을 세포들이 안정될 때까지 완전 배지(20 % FBS, 1 mM 소듐 피루베이트, 비필수 아미노산들 및 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 된 Dulbecco's Modified Essential Medium)에서 배양하였다. 상술한 바와 같이 완전 배지에서 37 ℃, 5 % CO2에서 세포들을 배양시켰다.Rat tail fibroblast (MTF) cells were derived from the tails of C57BL / 6J mice. The tails are removed, soaked in 70% ethanol, cut with a razor blade and divided into small portions. The divided portions were washed three times with PBS and then incubated at 37 ° C. in a stirrer with 0.5 mg / mL collagenase, 100 units / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin to divide tissue. The tail sections were then incubated in complete medium (20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, non-essential amino acids and Dulbecco's Modified Essential Medium with 100 units / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin) until the cells were stable. . Cells were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 in complete medium as described above.

형질감염(Transfection ( transfectiontransfection ) 절차) step

절차의 첫번째 날에, T75 플라스크들로부터 포화된 9L/LacZ 배양액들을 취하여 세포들을 떼어내고 완전 배지(DMEM, 1xPS, 1x소듐 피루베이트, 1x NEAA) 10 ml 로 희석시켰다. 상기 세포들을 1:15로 더 희석시키고, 이 제제의 100 ㎕를 96 웰 플레이트들의 웰들 내로 분취시키면, 형질감염의 다음날까지 약 50 % 세포 합류(confluence)를 산출하게 될 것이다. 웰들의 가장자리들은 비워두고 250 ㎕ 물로 채우며 상기 플레이트들은 37 ℃의 온도로 하룻밤 동안 배양기 내에서 적층되지 않은 상태로 놔둔다(5 % CO2 배양기).On the first day of the procedure, saturated 9 L / LacZ cultures were taken from T75 flasks and the cells were removed and diluted with 10 ml of complete medium (DMEM, 1 × PS, 1 × sodium pyruvate, 1 × NEAA). Diluting the cells further 1:15 and aliquoting 100 μl of this preparation into wells of 96 well plates will yield about 50% cell confluence by the day following transfection. The edges of the wells are left empty and filled with 250 μl water and the plates are left unlaminated in the incubator overnight at a temperature of 37 ° C. (5% CO 2 incubator).

두번째 날에, 상기 형질감염 복합물을 웰당 Opti-MEM, 50 ㎕ 내에 제제한다. 상기 배지를 플레이트들로부터 제거하고 웰들을 200 ㎕ PBS 또는 Opti-MEM으로 1 회 세척한다. 상기 플레이트들을 블로팅하고 뒤집어서 티슈로 완전히 건조시킨다. 이후 상기 형질감염 혼합물을 각각의 웰에 첨가하고(50 ㎕/웰), 250 ㎕ 물을 가장자리 상의 웰들에 첨가하여 건조되는 것을 방지한다. 이후 세포들을 37 ℃에서(5 % CO2 배양기) 적어도 3 시간 동안 배양한다. 상기 형질감염 혼합물을 제거하고 완전 배지(DMEM, 1xPS, 1x소듐 피루베이트, 1x NEAA) 100 ㎕로 교체한다. 상기 세포들을 소정의 시간 동안 배양한 후에 효소 시험을 위해 회수한다.On the second day, the transfection complex is formulated in 50 μl Opti-MEM per well. The medium is removed from the plates and the wells are washed once with 200 μl PBS or Opti-MEM. The plates are blotted and inverted to dry completely with a tissue. The transfection mixture is then added to each well (50 μl / well) and 250 μl water is added to the wells on the edges to prevent drying. Cells are then incubated at 37 ° C. (5% CO 2 incubator) for at least 3 hours. The transfection mixture is removed and replaced with 100 μl of complete medium (DMEM, 1xPS, 1x sodium pyruvate, 1x NEAA). The cells are incubated for a predetermined time and then recovered for enzyme testing.

세포 생존도(Cell viability ( MTTMTT 시험법) Test method)

MTT 시험법(MTT-100, MatTek 키트)을 이용하여 세포 생존도를 평가할 것이다. 본 키트는 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)의 포르마잔 염료(formazan dye)로의 흡수 및 전환을 측정한다. 해동시켜 희석된 MTT 농축액은 지질로서 투여하는 기간의 마지막 1 시간 전에 MTT 농축액 2 mL와 MTT 희석제 8 mL를 혼합하여 제제한다. 각각의 세포 배양 인서트(insert)를 Ca+2 및 Mg+2를 포함하는 PBS로 2 회 세척한 후에 웰당 혼합된 MTT 용액 100 ㎕를 포함하는 새로운 96-웰 트랜스포트 플레이트(transport plate)에 옮겨 넣는다. 이후 이 96-웰 트랜스포트 플레이트를 37 ℃ 및 5 % CO2에서 3 시간 동안 배양시킨다. 3 시간 배양 후에, 상기 MTT 용액을 제거하고 상기 배양물들을 웰당 250 ㎕ MTT 추출 용액을 포함하는 제 2의 96-웰 공㎚급기(feeder)로 옮겨 넣는다. 추가로 150 ㎕의 MTT 추출 용액을 각각의 배양 웰의 표면에 첨가하였고 상기 표본들을 상온 암실에서 최소 2 시간에서 최대 24 시간 동안 둔다. 이후 상기 인서트 막을 피펫 팁으로 뚫은 후에 상층 및 하층 웰들에 있는 용액들이 혼합되도록 한다. 추출된 블랭크들(음성 대조군)와 함께 혼합된 추출 용액 2 백 마이크로리터들을 마이크로플레이트 판독기로 측정을 위해 96-웰 플레이트로 옮겨 넣는다. 표본들의 흡광도(optical density: OD)를 플레이트 판독기상에서 650 ㎚로 배경 신호감산(background substraction)하여 570 ㎚에서 측정하였다. 세포 생존도는 퍼센티지로 표현되며 처리된 인서트들에 대한 OD 눈금들을 PBS 처리된 인서트들에 대한 OD 눈금들로 나눈 후에 100을 곱하여 계산하였다. 이러한 시험법의 목적을 위해서, PBS는 새포 생존도에 대한 영향이 전혀 없으므로 100 % 세포 생존도를 나타내었다고 가정하였다.Cell viability will be assessed using the MTT assay (MTT-100, MatTek kit). The kit measures the uptake and conversion of tetrazolium salt to formazan dye. MTT concentrate diluted by thawing is prepared by mixing 2 mL of MTT concentrate and 8 mL of MTT diluent before the last hour of administration as lipid. Each cell culture insert is washed twice with PBS containing Ca +2 and Mg +2 and then transferred to a new 96-well transport plate containing 100 μl of mixed MTT solution per well. . This 96-well transport plate is then incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 hours. After 3 hours of incubation, the MTT solution is removed and the cultures are transferred to a second 96-well blank feeder containing 250 μl MTT extraction solution per well. An additional 150 μl MTT extraction solution was added to the surface of each culture well and the samples were left in the dark at room temperature for at least 2 hours and up to 24 hours. The insert membrane is then drilled with a pipette tip to allow the solutions in the upper and lower wells to mix. Two hundred microliters of the extraction solution mixed with the extracted blanks (negative control) are transferred to a 96-well plate for measurement with a microplate reader. The optical density (OD) of the samples was measured at 570 nm by background substraction to 650 nm on a plate reader. Cell viability is expressed as a percentage and calculated by multiplying the OD scales for treated inserts by the OD scales for PBS treated inserts and then multiplying by 100. For the purpose of this assay, it was assumed that PBS had 100% cell viability because it had no effect on cell viability.

효소성Enzymatic 측정법 Measure

효소성 측정법을 위한 시약들을 Invitrogen 사(β-Gal Assay Kit) 및 Fisher 사(Pierce Micro BCA Protein Assay Reagent Kit, Catalog)로부터 구매하였다.Reagents for enzymatic assays were purchased from Invitrogen (β-Gal Assay Kit) and Fisher (Pierce Micro BCA Protein Assay Reagent Kit, Catalog).

A: 세포 용해A: cell lysis

● 배지를 제거하며, 200 ㎕ PBS로 1 회 세척하며 플레이트를 블로팅하며 뒤집어서 건조시킨다.• Remove the medium, wash once with 200 μl PBS, blot the plate and dry upside down.

● β-Gal Kit의 용해 완충액(lysis buffer)를 각각의 웰로 첨가한다.Add lysis buffer of β-Gal Kit to each well.

● 세포들을 2 회 동결-용해시켜 용해질을 생성한다.Cells are freeze-lysed twice to produce lysate.

B: β-Gal 분석B: β-Gal Analysis

● 분석 혼합물(assay mix)을 준비한다(50 ㎕ 1x완충액, 17 ㎕ ONPG 각각의 웰)Prepare an assay mix (50 μl 1 × buffer, 17 μl each ONPG well)

● 새로운 플레이트를 취하여 65 ㎕ 시험 혼합물을 각각의 웰로 첨가한다.Take a new plate and add 65 μL test mixture to each well.

● 각각의 웰에 세포 용해질(cell lysate) 10 ㎕를 첨가한다. 백그라운드 활성의 감산을 위한 블랭크 웰들이 있어야 한다.Add 10 μl of cell lysate to each well. There should be blank wells for subtraction of background activity.

● 37 ℃에서 약 20 분 동안 배양하여 ONPG를 모두 사용하게 되고 높은 발현을 일으키게 할 장기간의 배양을 한다. • Incubate at 37 ° C. for about 20 minutes to allow full use of ONPG and long-term incubation to produce high expression.

● 정지 용액 100 ㎕을 첨가한다.• Add 100 μl of stop solution.

● 420 ㎚에서 OD를 측정한다.• Measure OD at 420 nm.

C: BCA 분석C: BCA Analysis

● BSA 표준(웰당 150 ul)을 제제하고, 각각의 플레이트상에 포인트들을 복제한다(duplicate).Formulate BSA standard (150 ul per well) and duplicate the points on each plate.

● 각각의 웰에 물 145 ㎕를 넣고 각각의 웰에 세포 용해질 5 ㎕를 첨가한다Add 145 μl of water to each well and 5 μl of cell lysate to each well

● 제작자 지침에 따라 최종 시험 시약을 제제한다.• Prepare final test reagents according to the manufacturer's instructions.

● 분석 시약 150 ㎕를 각각의 웰에 첨가한다.• Add 150 μl of assay reagent to each well.

● 37 ℃에서 약 20 분 동안 배양한다.Incubate at 37 ° C for about 20 minutes.

● 562 ㎚에서 OD를 측정한다.• Measure OD at 562 nm.

D: 특이적 활성의 계산D: Calculation of Specific Activity

특이적 활성은 ONPG 가수분해된/t/mg 단백질의 nmol로 표현되며, 여기서 t는 37 ℃에서 분으로 측정한 배양시간이고; mg 단백질은 BCA 방법으로 측정되는 시험된 단백질이다.Specific activity is expressed as nmol of ONPG hydrolyzed / t / mg protein, where t is the incubation time measured in minutes at 37 ° C .; mg protein is a tested protein measured by the BCA method.

FITCFITC /Of FAMFAM 접합된Spliced siRNAsiRNA 의 유동 세포계측 측정Flow cytometry measurement

Beckman Coulter FC500 세포 분석기(Fullerton, CA)를 이용하여 형광 활성 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS) 분석을 실시하였다. 본 장치는 사용된 형광 탐침들에 따라 조절된다(siRNA에 대한 FAM 또는 Cy5 및 CD14에 대한 FITC 및 PE). 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)(Fluka, St Lois, MO) 및 아넥신 V(Annexin V)(R&D systems, Minneapolis, MN)을 세포 생존도 및 세포독성에 대한 지시약들로 사용하였다. 간단한 단계적(step-by-step) 프로토콜을 하기에 설명한다.Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis was performed using a Beckman Coulter FC500 cell analyzer (Fullerton, Calif.). The device is adjusted according to the fluorescence probes used (FAM for siRNA or FITC and PE for Cy5 and CD14). Propidium iodide (Fluka, St Lois, MO) and Annexin V (R & D systems, Minneapolis, MN) were used as indicators for cell viability and cytotoxicity. A simple step-by-step protocol is described below.

a) siRNA/펩티드 복합체에 노출한 후에, 세포들을 적어도 3 시간 동안 배양하였다.a) After exposure to siRNA / peptide complexes, the cells were incubated for at least 3 hours.

b) 세포들을 200 ㎕ PBS로 세척한다.b) The cells are washed with 200 μl PBS.

c) 15 ㎕ TE로 세포들을 분리하여, 37 ℃에서 배양한다.c) Separate cells with 15 μl TE and incubate at 37 ° C.

d) 5 개의 웰 내에서 30 ㎕ FACS 용액(0.5 % BSA가 함유된 PBS 및 0.1 % 아지드화 나트륨)으로 세포들을 재현탁한다.d) Resuspend cells with 30 μl FACS solution (PBS with 0.5% BSA and 0.1% sodium azide) in five wells.

e) 5 개 웰 모두를 한 개의 튜브로 합친다.e) Combine all 5 wells into one tube.

f) PI(프로피디움 요오드화물) 5 ㎕를 각각의 튜브로 첨가한다.f) 5 μl of PI (propidium iodide) is added to each tube.

g) 제작자 지침에 따라 형광 활성 세포 분류(FCAS)로 세포들을 분석한다.g) Analyze cells by fluorescence activated cell sorting (FCAS) according to the manufacturer's instructions.

베타-갈락토시다아제 mRNA를 침묵시키는 데 사용되는 siRNA 서열은 하기와 같았다:The siRNA sequences used to silence beta-galactosidase mRNA were as follows:

C.U.A.C.A.C.A.A.A.U.C.A.G.C.G.A.U.U.U.C.U.A.C.A.C.A.A.A.U.C.A.G.C.G.A.U.U.U. DTDT .. DTDT (센스) (서열 번호: 32) (Sense) (SEQ ID NO: 32)

A.A.A.U.C.G.C.U.G.A.U.U.U.G.U.G.U.A.G.dT.dT (안티센스) (서열 번호: 33)A.A.A.U.C.G.C.U.G.A.U.U.U.G.U.G.U.A.G.dT.dT (antisense) (SEQ ID NO: 33)

본 실시예에 대한 데이터는 표 2에 도시되어 있다. 형질감염 효율은 세포 용해질로부터 측정된 베타-갈락토시다아제 활성량과 반비례 관계이다. 형질감염시에, 측정된 베타-칼락토시다아제 활성이 감소하면 형질감염이 성공적으로 이루어짐을 나타낸다. 따라서, 형질감염이 일어나지 않는 경우, 측정된 베타-갈락토시다아제 활성이 100 %이고 형질감염 효율은 0 %이다. 베타-갈락토시다아제 활성이 감소함에 따라, 형질감염 효율은 증가한다. 예를 들어, 표 2에서 siRNA가 더해진 히스톤 H2B는 62.03 %의 형질감염 효율을 보이며, 이는 측정된 베타-갈락토시다아제 활성이 37.97 %로 감소했음을 의미한다. 형질감염 효율을 측정하는 동일한 접근법은 표 3에 제시된 데이터용으로 사용되었다.The data for this example is shown in Table 2. Transfection efficiency is inversely related to the amount of beta-galactosidase activity measured from cell lysates. At the time of transfection, a decrease in the measured beta-galactosidase activity indicates successful transfection. Thus, if no transfection occurs, the measured beta-galactosidase activity is 100% and the transfection efficiency is 0%. As beta-galactosidase activity decreases, transfection efficiency increases. For example, histone H2B plus siRNA in Table 2 shows a transfection efficiency of 62.03%, which means that the measured beta-galactosidase activity decreased to 37.97%. The same approach to measuring transfection efficiency was used for the data presented in Table 3.

하기 표 2는 9 L/LacZ 세포들 내에서 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 매개되는 siRNA 전달의 효율을 나타낸 것이다:Table 2 below shows the efficiency of siRNA delivery mediated by polynucleotide delivery-enhancing polypeptides in 9 L / LacZ cells:

형질감염 혼합물 Transfection Mixture 형질감염 효율 (전체 세포들의 %)Transfection Efficiency (% of Total Cells) 몰 비율: (siRNA:펩티드)Molar ratio: (siRNA: peptide) siRNA(40 pmol/well) 단독siRNA (40 pmol / well) alone 0.09 %0.09% 양이온 지질들(Invitrogen)Cationic Lipids (Invitrogen) 84.32 %84.32% unknownunknown 히스톤 H2BHistone H2B 62.03 %62.03% 1:10-151: 10-15 히스톤 H3Histone H3 85.08 %85.08% 1:10-201: 10-20 히스톤 H4Histone H4 72.07 %72.07% 1:4-81: 4-8 GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(서열 번호: 31)GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (SEQ ID NO: 31) 50.86 %50.86% 1:5-201: 5-20 WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (서열 번호: 27)WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (SEQ ID NO: 27) 98.29 % 98.29% 1:0.5-4 1: 0.5-4 폴리 Lys-Trp, 4:1, 분자량 20,000-50,000Poly Lys-Trp, 4: 1, molecular weight 20,000-50,000 71.92 %71.92% 1:2-81: 2-8 폴리 Orn-Trp, 4:1, 분자량 20,000-50,000Poly Orn-Trp, 4: 1, Molecular Weight 20,000-50,000 74.16 %74.16% 1:2-81: 2-8

siRNAsiRNA /펩티드/지질들/ Peptides / lipids

siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 혼합물, 복합체 또는 접합체 내로 양이온 지질 첨가의 효과를 평가하기 위하여, 제작자 지침에 따라 일정한 농도의 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달 제형에 리포펙타민(Invitrogen)을 첨가하는 것을 제외하고는 상기 절차들을 따랐다.To assess the effect of cationic lipid addition into siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide mixtures, complexes or conjugates, except adding lipofectamine (Invitrogen) to a constant concentration of siRNA / polynucleotide delivery formulations according to the manufacturer's instructions Followed the procedures above.

GKINLKALAALAKKIL(서열 번호: 28), siRNA 및 LIPOFECTIN

Figure 112008025338980-PCT00005
(Invitrogen)으로 구성된 조성물을 생성하기 위하여, siRNA 및 펩티드를 상온에서 Opti-MEM 세포 배지 내에 우선 혼합하고 이후, LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00006
을 상온에서 상기 혼합물에 첨가하여 siRNA/펩티드/양이온 지질 조성물을 형성하였다.GKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 28), siRNA, and LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00005
To generate a composition consisting of (Invitrogen), siRNAs and peptides were first mixed in Opti-MEM cell medium at room temperature and then LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00006
Was added to the mixture at room temperature to form a siRNA / peptide / cation lipid composition.

RVIRVWFQNKRCKDKK(서열 번호: 29), siRNA 및 LIPOFECTIN

Figure 112008025338980-PCT00007
로 구성된 조성물을 생성하기 위하여, 펩티드 및 LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00008
를 Opti-MEM 세포 배지 내에 우선 혼합하고, 이 혼합물에 siRNA를 첨가하여 siRNA/펩티드/LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00009
조성물을 형성하였다.RVIRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 29), siRNA, and LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00007
To generate a composition consisting of a peptide and LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00008
Is mixed first in Opti-MEM cell medium, and siRNA / peptide / LIPOFECTIN is added by adding siRNA to the mixture.
Figure 112008025338980-PCT00009
The composition was formed.

GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(서열 번호: 30) 또는 GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(서열 번호: 31)를 이용하여 siRNA/펩티드/양이온 지질 조성물을 생성하기 위하여 상기 구성성분들이 함께 첨가되는 순서는 중요하지 않다.The order in which the components are added together to generate siRNA / peptide / cation lipid compositions using GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 30) or GEQIAQLIAGYIDIILKKKKKSK (SEQ ID NO: 31) is not critical.

siRNA/멜리틴/LIPOFECTIN

Figure 112008025338980-PCT00010
를 생성하기 위하여, 상기 siRNA 및 멜리틴을 Opti-MEM 세포 배지 내에 우선 함께 혼합하고 나서 LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00011
을 상기 혼합물에 첨가하였다.siRNA / melittin / LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00010
In order to generate the siRNA and melittin, first mixed together in Opti-MEM cell medium and then LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00011
Was added to the mixture.

siRNA/히스톤 H1/LIPOFECTIN

Figure 112008025338980-PCT00012
조성물을 생성하기 위하여, 히스톤 H1 및 LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00013
을 Opti-MEM 세포 배지 내에 우선 함께 첨가하고 완전히 혼합한 후에 siRNA를 첨가하고 히스톤 LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00014
혼합물과 혼합하여 siRNA/히스톤 H1/LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00015
조성물을 형성하였다.siRNA / histone H1 / LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00012
To produce a composition, histone H1 and LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00013
Are added together in Opti-MEM cell medium and mixed thoroughly before addition of siRNA and histone LIPOFECTIN
Figure 112008025338980-PCT00014
SiRNA / histone H1 / LIPOFECTIN by mixing with the mixture
Figure 112008025338980-PCT00015
The composition was formed.

하기 표 3은 9 L/LacZ 세포들 내에 양이온 지질이 존재할 경우 및 존재하지 않는 경우에 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 매개되는 siRNA 전달의 효율을 나타낸 것이다:Table 3 below shows the efficiency of siRNA delivery mediated by polynucleotide delivery-enhancing polypeptides with and without cationic lipids in 9 L / LacZ cells:

형질감염 혼합물  Transfection Mixture 지질들이 존재하는 형질감염 효율(전체 세포들의 %)Transfection efficiency with lipids (% of total cells) 지질들이 존재하지 않는 형질감염 효율(전체 세포들의 %)Transfection efficiency without lipids (% of total cells) 형질감염 혼합물 내에 첨가된 siRNA:펩티드 비율SiRNA: peptide ratio added in the transfection mixture siRNA 단독siRNA alone 1.72 %1.72% 0.11 %0.11% 리포펙타민(펩티드 無)Lipofectamine (no peptide) 83.48 %83.48% GKINLKALAALAKKIL (서열 번호: 28)GKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 28) 89.67 % 89.67% 0.26 % 0.26% 1:5-20 1: 5-20 RVIRVWFQNKRCKDKK (서열 번호:29)RVIRVWFQNKRCKDKK (SEQ ID NO: 29) 89 % 89% 0.59 % 0.59% 1:1-5 1: 1-5 GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQ RRRPRQGRKKRRQRRRPPQ (서열 번호: 30)GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQ RRRPRQGRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 30) 89.99 %  89.99% 54.58 %  54.58% 1:5  1: 5 GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (서열 번호: 31)GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (SEQ ID NO: 31) 90.01 % 90.01% 50.86 % 50.86% 1:5-10 1: 5-10 멜리틴Melittin 93.1 %93.1% 5.15 %5.15% 1:201:20 히스톤 H1Histone H1 93.39 %93.39% 0.14 %0.14% 1:10-201: 10-20

선행 결과들에 근거해 볼 때, 본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 실질적으로 siRNA들의 세포 흡수를 증진시킬 수 있는 반면에, 본 발명의 몇몇 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 혼합물들에 양이온 지질을 선택적으로 첨가하면 siRNA 전달 효율을 실질적으로 개선시킬 수 있다.Based on the preceding results, representative polynucleotide delivery-promoting polypeptides of the present invention can substantially enhance the cellular uptake of siRNAs, while cations in some siRNA / polynucleotide delivery-promoting polypeptide mixtures of the present invention. Selective addition of lipids can substantially improve siRNA delivery efficiency.

실시예 2 : TAT - HA 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 접합된 siRNA 를 포함하는 조성물들의 생성 및 특징화 Example 2 Conjugated with T AT - HA Polynucleotide Delivery-Enhancing Polypeptides Generation and Characterization of Compositions Including siRNA

본 실시예는 siRNA 듀플렉스의 일 가닥에 공유적으로 접합된 특이적 펩티드들의 합성 및 흡수 활성을 설명한다. 이러한 접합체들은 siRNA를 세포질 내로 효과적으로 전달한다.This example describes the synthesis and uptake activity of specific peptides covalently conjugated to one strand of an siRNA duplex. These conjugates effectively deliver siRNA into the cytoplasm.

펩티드 합성Peptide synthesis

레이닌 심포니 합성기(Rainin Symphony synthesizer)를 이용하여 CLEAR-아미드 수지상에서 고체-상 Fmoc 화학에 의하여 펩티드들을 합성하였다. HCTU 및 Fmoc 아미노산의 5 당량을 과량의 N-메틸모폴린(methylmorpholine)과 함께 사용하여 40 분 동안 결합(coupling) 단계를 수행하였다. 상기 펩티드 수지를 DMF 내에서 20 % 피페리딘(piperidine)으로 10 분 사이클의 2 회 동안 처리하여 Fmoc를 제거하였다. 전체 펩티드를 완료시에, 상기 Fmoc 기를 피페리딘으로 제거하고 DMF로 광범위하게 세척하였다. N-메틸모폴린의 6 당량들이 존재시에 3-말레이미도프로피온산(maleimidopropionic acid) 및 HCTU의 3.0 당량들을 펩티드 수지의 N-터미널에 결합시켜 말레이미도(maleimido) 변형된 펩티드들을 제제하였다. 결합 정도는 Kaiser 시험에 의해 모니터되었다. 2.5 % 물(water) 및 2.5 트리이소프로필 실란(triisopropyl silane)을 첨가하여 수지로부터 펩티드들을 분열시키고 이후 상온에서 2 시간 동안 가볍게 교반하였다. 이로 인해 생긴 정제되지 않은 펩티드들을 에테르로 분쇄(trituration)하고 회수하여 여과시킨다. 정제되지 않은 생성물은 Millipore water에 용해시켜 건조해질 때까지 동결건조시킨다. 0.05 % TFA 및 3 mL 아세트산을 포함하는 15 mL의 물에 정제되지 않은 펩티드를 녹이고 5 mL/min의 유내로 5 mL 주입 루프를 통하여 Zorbax RX-C8 역상(reversed-phase)(22 mm ID x 250 mm, 5 ㎛ 입자 크기)으로 담았다. 용매 A가 물에 0.05 %이고 용매 B가 아세토나이트릴(acetonitrile)에 0.05 % TFA인 0.1 % B/min의 선형 AB 구배(gradient)를 진행하여 정제를 실시하였다. HPLC 및 ESMS로 정제된 펩티드들을 분석하였다.Peptides were synthesized by solid-phase Fmoc chemistry on CLEAR-amide resin using a Rainin Symphony synthesizer. A coupling step was performed for 40 minutes using 5 equivalents of HCTU and Fmoc amino acids with excess N-methylmorpholine. The peptide resin was treated with 20% piperidine in DMF for two 10 minute cycles to remove Fmoc. Upon completion of the entire peptide, the Fmoc group was removed with piperidine and washed extensively with DMF. Maleimido modified peptides were prepared by binding 3 equivalents of maleimidopropionic acid and HCTU in the presence of 6 equivalents of N-methylmorpholine to the N-terminal of the peptide resin. The degree of binding was monitored by the Kaiser test. Peptides were cleaved from the resin by the addition of 2.5% water and 2.5 triisopropyl silane and then gently stirred at room temperature for 2 hours. The resulting crude peptide is triturated with ether, recovered and filtered. The crude product is dissolved in Millipore water and lyophilized until dry. Dissolve the crude peptide in 15 mL of water containing 0.05% TFA and 3 mL acetic acid and Zorbax RX-C8 reversed-phase (22 mm ID x 250) through a 5 mL injection loop into a 5 mL / min oil. mm, 5 μm particle size). Purification was carried out by performing a linear AB gradient of 0.1% B / min with solvent A of 0.05% in water and solvent B of 0.05% TFA in acetonitrile. Peptides purified by HPLC and ESMS were analyzed.

접합체들의 합성Synthesis of Conjugates

고체상 합성법들을 이용하여 펩티드들 및 RNA들을 제제한다. 상기 펩티드 및 RNA 분자들은 특이적 모이어티들로 관능화되어 서로 간에 공유 부착(covalent attachment)이 일어나도록 해야한다. 펩티드에 대하여, N-터미널은 예를 들어, 3-말레이미도프로피온산으로 관능화된다. 그러나, 브롬이나 이오도아세틸(iodoacetyl) 모이어티들과 같은 다른 작용기들도 작용할 것이라고 인식된다. RNA 분자에 대하여, 센스 가닥의 5' 말단이나 안티센스 가닥의 3' 말단은 예를 들어, 하기의 합성법에 따라 1-O-디메톡시트리틸-헥실-디설파이드 링커(1-O-methoxytrityl-hexyl-disulfide linker)로 관능화된다.Solid phase synthesis methods are used to prepare peptides and RNAs. The peptide and RNA molecules must be functionalized with specific moieties such that covalent attachment occurs between each other. For peptides, the N-terminal is functionalized with 3-maleimidopropionic acid, for example. However, it is recognized that other functional groups, such as bromine or iodoacetyl moieties, will also work. For RNA molecules, the 5 'end of the sense strand or the 3' end of the antisense strand is, for example, a 1-O-dimethoxytrityl-hexyl-disulfide linker (1-O-methoxytrityl-hexyl- according to the following synthesis method). disulfide linker).

5' 변형된 C6SS-올리고뉴클레오티드(GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU(서열 번호: 34); 3.467 mg; 0.4582 μmol)를 상온에서 3 시간 동안 0.1 M 트리에틸아민 아세테이트(triethylamine acetate: TEAA) 완충액(pH 7.0) 0.3 ml에 트리스(2-카복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyehtyl)phosphine: TCEP) 0.393 mg(3 당량)로서 자유 티올기(thiol group)로 환원시켰다. 환원된 올리고뉴클레오티드를 0.1 M TEAA 완충액(pH 7)에 CH3CN의 0-30 %의 선형 구배를 20 분 이내로(tr=5.931 분) 이용하여 XTerra

Figure 112008025338980-PCT00016
MS C18 4.6x50 mm 칼럼 상에 RP HPLC에 의하여 정제하였다.Tris the 5 'modified C6SS-oligonucleotide (GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU (SEQ ID NO: 34); 3.467 mg; 0.4582 μmol) in 0.3 ml of 0.1 M triethylamine acetate (TEAA) buffer (pH 7.0) for 3 hours at room temperature. 0.393 mg (3 equiv) of (2-carboxyethyl) phosphine (tris (2-carboxyehtyl) phosphine (TCEP)) was reduced to a free thiol group. Reduced oligonucleotides in XTerra using 0.1 M TEAA buffer (pH 7) with a linear gradient of 0-30% of CH 3 CN within 20 minutes (t r = 5.931 minutes).
Figure 112008025338980-PCT00016
Purification by RP HPLC on a MS C 18 4.6x50 mm column.

정제 환원된 올리고뉴클레오티드(1.361 mg, 0.19085 μmol)를 0.1 M TEAA 완충액(pH 7) 0.2 ml에 용해시키고 이후 펩티드 N-터미널에 부착된 말레이미도 모이어티를 지닌 펩티드(0.79 mg, 1.5 당량)를 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 후, 즉시 형성된 침전은 75 %/CH3CN/0.1 M TEAA 150 ㎕를 첨가하여 사라지게 되었다. 상온에서 하룻밤 동안 교반한 후에, 그 결과로 생성된 접합체를 0.1 M TEAA 완충액(pH 7)에 CH3CN의 0-30 %의 선형 구배를 20 분 이내로 100 % C를 다음 5 분(tr=21.007 분) 이내로 이용하여 XTerra

Figure 112008025338980-PCT00017
MS C18 4.6x50 mm 칼럼상에 RP HPLC에 의하여 정제하였다. 접합체의 양을 λ=260 ㎚에서 계산된 몰 흡광 계수에 근거한 분광 광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. MALDI 질량 분석에 의하면 상기 접합체에 대해 관찰된 피크(10 585.3 amu)는 계산된 질량과 부합하는 것을 보여 주었다. 수율: 0.509 mg, 0.04815 μmol, 25.2 %.Purified reduced oligonucleotides (1.361 mg, 0.19085 μmol) were dissolved in 0.2 ml of 0.1 M TEAA buffer (pH 7) and then the peptide (0.79 mg, 1.5 equiv) with the maleimido moiety attached to the peptide N-terminal Added to nucleotide solution. After addition of the peptide, the precipitate formed immediately disappeared by adding 150 μl of 75% / CH 3 CN / 0.1 M TEAA. After stirring at room temperature overnight, the resulting conjugate was added to 0.1 M TEAA buffer (pH 7) with a linear gradient of 0-30% of CH 3 CN within 20 minutes and then 100% C within 5 minutes (t r = Within 21.007 minutes)
Figure 112008025338980-PCT00017
Purification by RP HPLC on a MS C 18 4.6x50 mm column. The amount of conjugate was determined by spectrophotometry based on the molar extinction coefficient calculated at λ = 260 nm. MALDI mass spectrometry showed that the peak observed for the conjugate (10 585.3 amu) was consistent with the calculated mass. Yield: 0.509 mg, 0.04815 μmol, 25.2%.

펩티드 접합체 센스 가닥 및 상보적 안티센스 가닥을 50 mM 초산 칼륨, 1 mM 초산 마그네슘 및 15 mM HEPES (pH 7.4) 내에서 90 ℃ 온도로 2 분 동안 가열하여 어닐링하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이중 가닥 RNA 접합체 형성은 비 변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 전기이동법으로 확인한 후에 브롬화 에티듐 염색(staining)을 실시하였다.Peptide conjugate sense strands and complementary antisense strands were annealed by heating at 50 ° C. for 2 minutes in 50 mM potassium acetate, 1 mM magnesium acetate and 15 mM HEPES (pH 7.4) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Double stranded RNA conjugate formation was confirmed by unmodified (15%) polyacrylamide gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining.

펩티드-Peptide- siRNAsiRNA 접합체의 구조(서열 번호: 34 및 35) Structure of the conjugate (SEQ ID NOs: 34 and 35)

Figure 112008025338980-PCT00018
Figure 112008025338980-PCT00018

흡수 실험들Absorption experiments

세포들을 24-웰 플레이트들 내에 그 전날 플레이트 시켜 형질감염을 실시할 때 약 50-80 % 융합성(confluent)이 되었다. 예를 들어, siRNA 및 펩티드는 Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00019
배지(Invitrogen) 내에서 희석한 후에 혼합하여 PBS로 세척된 세포들에 첨가하기 5-10 분 전에 복합체를 형성하도록 하였다. siRNA의 최종 농도는 각각의 펩티드 농도(2-50 μM)에서 500 nM이었다. Opti-MEM
Figure 112008025338980-PCT00020
배지 내에서 희석되기도 한 접합체는 62.5 nM 내지 500 nM에 이르는 최종 농도들에서 세포들에 첨가되었다. 500 nM 농도에서, 세척된 세포들에 첨가하기 직전에 20 % FBS와 결합시켰다. 37 ℃, 5 % CO2에서 3 시간 동안 세포들을 형질감염 시켰다. 세포들을 PBS로 세척하고 트립신으로 처리한 이후 유동 세포계측법으로 분석하였다. siRNA 흡수는 Cy5 형광의 세기로 측정하였고 세포 생존도는 프로피디움 요오드화물을 첨가하여 평가하였다.Cells became about 50-80% confluent when transfected with plates the day before in 24-well plates. For example, siRNAs and peptides may be used in Opti-MEM
Figure 112008025338980-PCT00019
Dilution in medium (Invitrogen) was allowed to mix and form complexes 5-10 minutes prior to addition to cells washed with PBS. The final concentration of siRNA was 500 nM at each peptide concentration (2-50 μM). Opti-MEM
Figure 112008025338980-PCT00020
The conjugate, which was also diluted in the medium, was added to the cells at final concentrations ranging from 62.5 nM to 500 nM. At 500 nM concentration, bound to 20% FBS immediately before addition to washed cells. Cells were transfected at 37 ° C., 5% CO 2 for 3 hours. Cells were washed with PBS and treated with trypsin and analyzed by flow cytometry. siRNA uptake was measured by the intensity of Cy5 fluorescence and cell viability was assessed by addition of propidium iodide.

도 1에 도시된 바와 같이, 펩티드/siRNA 접합체들은 펩티드/siRNA 복합체들보다 쥐 꼬리 섬유아세포 세포들 내에서 더 높은 퍼센트 흡수율을 달성하였다. 또한, 펩티드/siRNA 접합체들은 펩티드/siRNA 복합체보다는 더 높은 평균 형광 세기(MFI; 도 2)를 달성하였다. 따라서, 이러한 데이터는 몇몇 실시예들에서 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 siRNA 분자에 접합시키는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다.As shown in FIG. 1, peptide / siRNA conjugates achieved higher percent uptake in mouse tail fibroblast cells than peptide / siRNA complexes. In addition, peptide / siRNA conjugates achieved higher average fluorescence intensity (MFI; FIG. 2) than peptide / siRNA complexes. Thus, these data indicate that in some embodiments it is desirable to conjugate the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide to the siRNA molecule.

실시예Example 3 :  3: siRNAsiRNA /전달 펩티드 복합체들을 스크리닝하면 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 다양한 조립에 의하여 9 L/Screening the delivery peptide complexes yields 9 L / by various assembly of reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides. LacZLacZ 세포들에  In the cells siRNAsiRNA 흡수의 효과적인 도입을 실증한다 Demonstrate effective introduction of absorption

본 실시예는 본 발명의 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 광범위하고 다양한 조립은 siRNA들과 복합될 경우에 siRNA 흡수를 향상시킨다는 다른 증거를 제공한다.This example provides other evidence that the wide variety of assembly of reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention enhances siRNA uptake when combined with siRNAs.

형질감염을 실시할 다음날에 약 50 % 융합성이 되도록 평판 96-웰 플레이트들의 웰당 약 10,000 개의 9 L/lacZ 세포들을 플레이트 시켰다. FAM-라벨된 siRNA 및 펩티드들을 최종 농도의 2-배 농도인 Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00021
배지(Invitrogen) 내에서 희석하였다. 동일한 부피의 siRNA 및 펩티드를 혼합하여 상온에서 5-10 분 동안 복합시킨 이후, 50 ㎕를 PBS로 사전에 세척된 세포들에 첨가하였다. 37 ℃, 5 % CO2에서 3 시간 동안 세포들을 형질감염시켰다. 세포들을 PBSfh 세척하고, 트립신으로 처리한 후에 유동 세포계측법으로 분석하였다. siRNA 흡수는 FAM 세기로 측정하였고 세포 생존도는 프로피디움 요오드화물을 첨가하여 평가하였다. 하기의 표 4는 다양한 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 대한 9L/LacZ 세포들 내에서의 퍼센트 세포 흡수 데이터를 요약한 것이다. 사용된 펩티드 및 siRNA의 농도가 표 4에 포함되어 있다.About 10,000 9 L / lacZ cells per well of plate 96-well plates were plated to be about 50% confluent the day after transfection. FAM-labeled siRNAs and peptides were Opti-MEM at 2-fold concentrations of final concentration
Figure 112008025338980-PCT00021
Dilution in medium (Invitrogen). After mixing the same volume of siRNA and peptide for 5-10 minutes at room temperature, 50 μl was added to the cells previously washed with PBS. Cells were transfected at 37 ° C., 5% CO 2 for 3 hours. Cells were washed with PBSfh, treated with trypsin and analyzed by flow cytometry. siRNA uptake was measured by FAM intensity and cell viability was assessed by addition of propidium iodide. Table 4 below summarizes the percent cell uptake data in 9L / LacZ cells for various reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides. The concentrations of peptide and siRNA used are included in Table 4.

하기 표 4는 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 9L/LacZ 세포들에 의해 매개되는 siRNA의 효율을 나타낸 것이다:Table 4 below shows the efficiency of siRNA mediated by 9L / LacZ cells, which are reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides:

펩티드 ID# Peptide ID # 아미노산 서열  Amino acid sequence 펩티드 농도 Peptide concentration siRNA 농도 siRNA concentration % 흡수율 % Absorption (% PI-/FAM+)(% PI- / FAM +) PN173PN173 GRKKRRQRRRPPQC(서열 번호: 36)GRKKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 36) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 84.8 %84.8% PN227PN227 말레이미드-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-아미드(SEQ ID: 37)Maleimide-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID: 37) 1 μM1 μM 400 nM400 nM 31.0 %31.0% PN27PN27 AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQC(서열 번호: 38)AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 38) 1 μM1 μM 400 nM400 nM 82.6 %82.6% PN275PN275 말레이미드-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-아미드(SEQ ID: 37)Maleimide-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID: 37) 4 μM4 μM 400 nM400 nM 95.3 %95.3%

PN28PN28 NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-아미드(서열 번호: 39)NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-amide (SEQ ID NO: 39) 2 μM2 μM 400 nM400 nM 79.3 %79.3% PN69PN69 BrAc-GRKKRRQRRRPQ-아미드(서열 번호: 40)BrAc-GRKKRRQRRRPQ-amide (SEQ ID NO: 40) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN81PN81 BrAc-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-아미드(서열 번호: 41)BrAc-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (SEQ ID NO: 41) 8 μM8 μM 800 nM800 nM 97.9 %97.9% PN250PN250 NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-아미드(서열 번호: 35)NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (SEQ ID NO: 35) 15 μM15 μM 800 nM800 nM 99.5 %99.5% PN204PN204 C(YGRKKRRQRRRG)2(서열 번호:42)C (YGRKKRRQRRRG) 2 (SEQ ID NO: 42) 1.4 μM1.4 μM 800 nM800 nM 82.5 %82.5% PN280PN280 말레이미드-GRKKRRQRRRPPQ-아미드(서열 번호: 43)Maleimide-GRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID NO: 43) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 7.9 %7.9% PN350PN350 NH2-KLWKAWPKLWKKLWKP-아미드(서열 번호: 44)NH2-KLWKAWPKLWKKLWKP-amide (SEQ ID NO: 44) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN365PN365 AAVALLPAVLLALLAPRRRRRR-아미드(서열 번호: 45)AAVALLPAVLLALLAPRRRRRR-amide (SEQ ID NO: 45) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 81.4 %81.4% PN366PN366 RLWRALPRVLRRLLRP-아미드(서열 번호: 46)RLWRALPRVLRRLLRP-amide (SEQ ID NO: 46) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN29PN29 NH2-AAVALLPAVLLALLAPSGASGLDKRDYV-아미드(서열 번호: 47)NH2-AAVALLPAVLLALLAPSGASGLDKRDYV-amide (SEQ ID NO: 47) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 86.5 %86.5% PN235PN235 말레이미드-AAVALLPAVLLALLAPSGASGLDKRDYV-아미드(서열 번호: 48)Maleimide-AAVALLPAVLLALLAPSGASGLDKRDYV-amide (SEQ ID NO: 48) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN30PN30 NH2-SGASGLDKRDYVAAVAALLPAVLLALLAP-아미드(서열 번호: 49)NH2-SGASGLDKRDYVAAVAALLPAVLLALLAP-amide (SEQ ID NO: 49) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN202PN202 NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-아미드(서열 번호: 50)NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-amide (SEQ ID NO: 50) 2 μM2 μM 400 nM400 nM 70.8 %70.8% PN225PN225 NH2-AAVACRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-아미드(서열 번호: 51)NH2-AAVACRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-amide (SEQ ID NO: 51) 2 μM2 μM 400 nM400 nM 30.9 %30.9% PN236PN236 말레이미드-RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드(서열 번호: 52)Maleimide-RQIKIWFQNRRMKWKK-amide (SEQ ID NO: 52) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 37.7 %37.7% PN58PN58 RQIKIWFQNRRMKKWKK-아미드(서열 번호: 53)RQIKIWFQNRRMKKWKK-amide (SEQ ID NO: 53) 40 μM40 μM 400 nM400 nM 75.8 %75.8% PN251PN251 NH2-RQIKIWFQNRRMKWKKDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-아미드(서열 번호: 54)NH2-RQIKIWFQNRRMKWKKDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (SEQ ID NO: 54) 4 μM4 μM 400 nM400 nM 44.5 %44.5% PN279PN279 말레이미드-SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKG-아미드(서열 번호: 55)Maleimide-SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKG-amide (SEQ ID NO: 55) 40 μM40 μM 400 nM400 nM 24.7 %24.7% PN61PN61 SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGC-아미드(서열 번호: 56)SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGC-amide (SEQ ID NO: 56) 80 μM80 μM 800 nM800 nM 86.8 %86.8% PN360PN360 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-아미드(서열 번호: 57)KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-amide (SEQ ID NO: 57) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN361PN361 NH2-KKDGGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 58)NH2-KKDGGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 58) 10 μM10 μM 400 nm400 nm 42.0 %42.0% PN73PN73 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(서열 번호: 59)KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (SEQ ID NO: 59) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 99.5 %99.5% PN64PN64 BrAc-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-아미드(서열 번호: 60)BrAc-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-amide (SEQ ID NO: 60) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 14.5 %14.5% PN159PN159 KLALKLALKALKAALKLA-아미드(서열 번호: 13)KLALKLALKALKAALKLA-amide (SEQ ID NO .: 13) .08 μM.08 μM 80 nM80 nM 16.4 %16.4% PN68PN68 BrAc-KLALKLALKALKAALKLA-아미드(서열 번호: 61)BrAc-KLALKLALKALKAALKLA-amide (SEQ ID NO: 61) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN182PN182 Ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-아미드(서열 번호: 62)Ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-amide (SEQ ID NO: 62) 1 μM1 μM 400 nM400 nM 84.9 %84.9% PN183PN183 NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRPPQ-아미드(서열 번호: 63)NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID NO: 63) 20 μM20 μM 400 nM400 nM 78.1 %78.1% PN71PN71 BrAc-RRRRRRR(서열 번호: 64)BrAc-RRRRRRR (SEQ ID NO: 64) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN87PN87 QqQqQqQqQq(서열 번호: 65)QqQqQqQqQq (SEQ ID NO: 65) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN249PN249 NH2-RRRQRRKRGGqQqQqQqQqQ-아미드(서열 번호: 66)NH2-RRRQRRKRGGqQqQqQqQqQ-amide (SEQ ID NO: 66) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.O %0.O% PN158PN158 RVIRWFQNKLRCKDKK-아미드(서열 번호: 67)RVIRWFQNKLRCKDKK-amide (SEQ ID NO: 67) 1 μM1 μM 400 nM400 nM 94.0 %94.0% PN86PN86 Ac-LGLLLRHLRHHSNLLANI-아미드(서열 번호: 68)Ac-LGLLLRHLRHHSNLLANI-amide (SEQ ID NO: 68) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 62.2 %62.2% PN162PN162 GQMSEIEAKVRTVKLARS-아미드(서열 번호: 69)GQMSEIEAKVRTVKLARS-amide (SEQ ID NO: 69) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN228PN228 NH2-KLWSAWPSLWSSLWKP-아미드(서열 번호: 70)NH2-KLWSAWPSLWSSLWKP-amide (SEQ ID NO: 70) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 6.8 %6.8% PN357PN357 NH2-KKKKKKKKK-아미드(서열 번호: 71)NH2-KKKKKKKKK-amide (SEQ ID NO: 71) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN358PN358 NH2-AARLHRFKNKGKDSTEMRRRR-아미드(서열 번호: 72)NH2-AARLHRFKNKGKDSTEMRRRR-amide (SEQ ID NO: 72) 40 μM40 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN283PN283 말레이미드-GLGSLLKKAGKKLKQPKSKRKV-아미드(서열 번호: 73)Maleimide-GLGSLLKKAGKKLKQPKSKRKV-amide (SEQ ID NO: 73) 40 μM40 μM 400 nM400 nM 36.3 %36.3% PN284PN284 말레이미드-Dmt-r-FK-아미드Maleimide-Dmt-r-FK-amide 100 μM100 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN285PN285 말레이미드-Dmt-r-FKQqQqQqQqQq-아미드(서열 번호: 74)Maleimide-Dmt-r-FKQqQqQqQqQq-amide (SEQ ID NO: 74) 8 μM8 μM 800 nM800 nM 90.7 %90.7% PN286PN286 말레이미드-WRFK-아미드(서열 번호:75)Maleimide-WRFK-amide (SEQ ID NO: 75) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN289PN289 말레이미드-WRFKKQqQqQqQqQq-아미드(서열 번호: 76)Maleimide-WRFKKQqQqQqQqQq-amide (SEQ ID NO: 76) 8 μM8 μM 400 nM400 nM 91.7 %91.7% PN267PN267 말레이미도(Maleimido)-YRFK-아미드(서열 번호: 77)Maleimido-YRFK-amide (SEQ ID NO: 77) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.3 %0.3% PN282PN282 말레이미드-YRFKYRFKYRFK-아미드(서열 번호: 78)Maleimide-YRFKYRFKYRFK-amide (SEQ ID NO: 78) 40 μM40 μM 800 nM800 nM 22.8 %22.8% PN286PN286 말레이미드-WRFK-아미드(서열 번호: 75)Maleimide-WRFK-amide (SEQ ID NO: 75) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN290PN290 말레이미드-WRFKKSKRKV-아미드(서열 번호: 79)Maleimide-WRFKKSKRKV-amide (SEQ ID NO: 79) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 5.3 %5.3% PN291PN291 말레이미드-WRFKAAVALLPAVLLALLAP-아미드(서열 번호: 80)Maleimide-WRFKAAVALLPAVLLALLAP-amide (SEQ ID NO: 80) 4 μM4 μM 800 nM800 nM 12.5 %12.5% PN243PN243 NH2-DiMeYrFK-아미드(서열 번호: 81)NH2-DiMeYrFK-amide (SEQ ID NO: 81) 40 μM40 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN244PN244 NH2-YrFK-아미드(서열 번호: 82)NH2-YrFK-amide (SEQ ID NO: 82) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN245PN245 NH2-DiMeYRFK-아미드(서열 번호: 83)NH2-DiMeYRFK-amide (SEQ ID NO: 83) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN246PN246 NH2-WrFK-아미드(서열 번호: 84)NH2-WrFK-amide (SEQ ID NO: 84) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN247PN247 NH2-DiMeYrWK-아미드(서열 번호: 85)NH2-DiMeYrWK-amide (SEQ ID NO: 85) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN248PN248 NH2-KFrDiMeY-아미드(서열 번호: 86)NH2-KFrDiMeY-amide (SEQ ID NO: 86) 80 μM80 μM 400 nM400 nM 0.0 %0.0% PN287PN287 말레이미드-WRFKWRFK-아미드(서열 번호: 87)Maleimide-WRFKWRFK-amide (SEQ ID NO .: 87) 10 μM10 μM 400 nM400 nM 8.8 %8.8% PN288PN288 말레이미드-WRFKWRFKWRFK-아미드(서열 번호: 88)Maleimide-WRFKWRFKWRFK-amide (SEQ ID NO: 88) 4 μM4 μM 400 nM400 nM 9.0 %9.0%

실시예Example 4 :  4 : siRNAsiRNA /전달은 생체 외 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 증진된다/ Delivery is promoted by ex vivo polynucleotide delivery-enhancing polypeptides

본 실시예는 LacZ 세포들, 쥐의 원발성 섬유아세포들(murine primary fibroblasts) 및 인간 단구세포들 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의한 siRNA 흡수의 향상을 도시한다. 9L/LacZ 세포들 및 쥐 섬유아세포 세포들 내에서 실시한 실험들에 이용된 물질들과 방법들은 쥐 실험에 대하여, 9L/LacZ 세포들을 쥐 꼬리 섬유아세포들(MTF)로 교체하였다는 것을 제외하고는 일반적으로 상술한 바와 동일하다. 인간 단구세포들 내에서 실시한 실험들에 이용된 물질들과 방법들을 이후에 설명할 것이다. MTF 세포들로 실시한 형질감염에 대한 결과들을 표 5에 요약해 두었다. 사용된 펩티드의 아미노산 서열과 eGFP siRNA에 접합된 펩티드 및 Cy5 라벨(label)의 농도가 표 5에 포함되어 있다. MTF 및 9L/LacZ 세포들 양쪽 모두를 가지고 실시한 형질감염들에 대한 결과들은 표 6에 요약해 두었다. 표 6에 제시된 데이터는 다양한 세포 유형들에서의 몇몇 펩티드/siRNA 복합체들에 대한 형질감염 효율들을 비교한 것을 제공한다.This example shows the enhancement of siRNA uptake by the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention in LacZ cells, mouse primary fibroblasts and human monocytes. The materials and methods used in the experiments conducted in 9L / LacZ cells and mouse fibroblast cells were replaced with mouse tail fibroblasts (MTF) for mouse experiments, except for 9L / LacZ cells. It is generally the same as described above. The materials and methods used in the experiments performed in human monocytes will be described later. The results for transfection with MTF cells are summarized in Table 5. The amino acid sequences of the peptides used and the concentrations of peptides and Cy5 labels conjugated to the eGFP siRNA are included in Table 5. The results for the transfections performed with both MTF and 9L / LacZ cells are summarized in Table 6. The data presented in Table 6 provide a comparison of transfection efficiencies for several peptide / siRNA complexes in various cell types.

하기 표 5는 쥐 꼬리 섬유아세포(MTF) 세포들 내에서 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 매개되는 siRNA 흡수의 효율을 나타낸 것이다:Table 5 below shows the efficiency of siRNA uptake mediated by reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides in rat tail fibroblast (MTF) cells:

펩티드 ID#Peptide ID # 아미노산 서열Amino acid sequence 상태(status)Status % 흡수율% Absorption PN250PN250 NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-아미드(서열 번호: 35)NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (SEQ ID NO: 35) 0.5 mM siRNA/40 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 40 mM peptide 85.9 %85.9% PN73PN73 NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 59)NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 59) 0.5 mM siRNA/5 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 5 mM peptide 94.5 %94.5% PEG-PN509PEG-PN509 Peg-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 90)Peg-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 90) 0.5 mM siRNA/25 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 25 mM peptide 91 %91% PN404PN404 NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-아미드(서열 번호: 91)NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-amide (SEQ ID NO: 91) 0.5 mM siRNA/25 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 25 mM peptide 50.4 %50.4% PN361PN361 NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 58)NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 58) 0.5 mM siRNA/50 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 50 mM peptide 65 %65% PN27PN27 AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQC(서열 번호: 38)AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 38) 0.5 mM siRNA/5 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 5 mM peptide 60.7 %60.7% PN58PN58 NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드(서열 번호: 53)NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-amide (SEQ ID NO: 53) 1 mM siRNA/20 mM 펩티드1 mM siRNA / 20 mM peptide 3.7 %3.7% PN158PN158 NH2-RVIRWFQNKRCKDKK-아미드(서열 번호; 67)NH2-RVIRWFQNKRCKDKK-amide (SEQ ID NO: 67) 0.5 mM siRNA/50 nM 펩티드0.5 mM siRNA / 50 nM Peptide 86.2 %86.2% PN316PN316 말레이미도-RVIRWFQNKRSKDKK-아미드(서열 번호: 92)Maleimido-RVIRWFQNKRSKDKK-amide (SEQ ID NO: 92) 0.5 mM siRNA/100 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 100 mM peptide 84.8 %84.8% PN289PN289 말레이미도-WRFKQqQqQqQqQq-아미드(서열 번호: 76)Maleimido-WRFKQqQqQqQqQq-amide (SEQ ID NO: 76) 0.5 mM siRNA/10 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 10 mM peptide 7 %7% PN28PN28 NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-아미드(서열 번호: 39)NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-amide (SEQ ID NO: 39) 1 mM siRNA/8 mM 펩티드1 mM siRNA / 8 mM peptide 80.5 %80.5% PN173PN173 GRKKRRQRRRPPQC(서열 번호: 36)GRKKRRQRRRPPQC (SEQ ID NO: 36) 0.5 mM siRNA/130 nM 펩티드0.5 mM siRNA / 130 nM Peptide 94.8 %94.8% PN159PN159 KLALKLALKALKAALKLA-아미드(서열 번호: 13)KLALKLALKALKAALKLA-amide (SEQ ID NO .: 13) 0.5 mM siRNA/5 mM 펩티드0.5 mM siRNA / 5 mM peptide 0 %0 % PN161PN161 NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-아미드(서열 번호: 93)NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-amide (SEQ ID NO: 93) 0.5 mM siRNA/10 nM 펩티드0.5 mM siRNA / 10 nM peptide 0 %0 %

표 6은 LacZ 세포들 및 쥐 꼬리 섬유아세포 세포들 내에서 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 매개되는 siRNA 흡수의 효율을 나타낸 것이다.Table 6 shows the efficiency of siRNA uptake mediated by reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides in LacZ cells and rat tail fibroblast cells.

펩티드 ID#  Peptide ID # 아미노산 서열  Amino acid sequence 퍼센트 흡수율Percent absorption LacZ 세포들LacZ cells 원발성(Primary) MTF 세포들Primary MTF Cells PN27PN27 NH2-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-아미드(서열 번호: 94)NH2-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID NO: 94) 86 %86% 61 %61% PN28PN28 NH2-RKKRRQRRRPPQAAVALLPAVLLALLAP-아미드(서열 번호: 89)NH2-RKKRRQRRRPPQAAVALLPAVLLALLAP-amide (SEQ ID NO: 89) 79 %79% 81 %81% PN29PN29 NH2-AAVALLPAVLLALLAPSGASGLDKRDYV-아미드(서열 번호: 47)NH2-AAVALLPAVLLALLAPSGASGLDKRDYV-amide (SEQ ID NO: 47) 87 %87% 무시험No test PN58PN58 NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드(서열 번호: 53)NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-amide (SEQ ID NO: 53) 76 %76% 6 %6% PN61PN61 NH2-SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGC-아미드(서열 번호: 56)NH2-SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGC-amide (SEQ ID NO: 56) 87 %87% 무시험No test PN73PN73 NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 59)NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 59) 91 %91% 95 %95% PN158PN158 NH2-RVIRWFQNKRCKDKK-아미드(서열 번호: 67)NH2-RVIRWFQNKRCKDKK-amide (SEQ ID NO: 67) 94 %94% 86 %86% PN173PN173 NH2-GRKKRRQRRRPPQC-아미드(서열 번호: 36)NH2-GRKKRRQRRRPPQC-amide (SEQ ID NO: 36) 85 %85% 95 %95% PN182PN182 NH2-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-아미드(서열 번호: 95)NH2-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-amide (SEQ ID NO: 95) 85 %85% 무시험No test PN202PN202 NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-아미드(서열 번호: 50)NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-amide (SEQ ID NO: 50) 71 %71% 무시험No test PN204PN204 NH2-C(YGRKKRRQRRRG)2-아미드(서열 번호: 42)NH2-C (YGRKKRRQRRRG) 2-amide (SEQ ID NO: 42) 83 %83% 무시험No test PN250PN250 NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-아미드(서열 번호: 35)NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (SEQ ID NO: 35) 99 %99% 86 %86% PN361PN361 NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 58)NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 58) 42 %42% 65 %65% PN365PN365 NH2-AAVALLPAVLLALLAPRRRRRR-아미드(서열 번호: 45)NH2-AAVALLPAVLLALLAPRRRRRR-amide (SEQ ID NO: 45) 81 %81% 무시험No test PN404PN404 NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-아미드(서열 번호: 91)NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-amide (SEQ ID NO: 91) 무시험No test 50 %50% PN453PN453 NH2-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKVC-아미드(서열 번호: 96)NH2-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKVC-amide (SEQ ID NO: 96) 무시험No test 79 %79% PN509PN509 Peg-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 90)Peg-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 90) 무시험No test 91 %91%

배양 중인 세포들을 트란스펙트하는 폴리뉴플레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 능력을 더 특성화하기 위하여, 인간 단구세포들을 다양한 농도의 PN73, PN250, PN182, PN58 및 PN158과 복합된 FITC 라벨된 siRNA 200 nM와 함께 배양하였다. 인간 단구세포들은 류마티스성 관절염의 치료에 표적 세포 유형이기 때문에 LacZ 및 쥐 섬유아세포 세포들에 더하여 인간 단구세포들을 사용하였다.To further characterize the ability of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides to transfect cells in culture, human monocytes were synthesized with FITC labeled siRNA 200 nM complexed with various concentrations of PN73, PN250, PN182, PN58 and PN158. Incubated together. Human monocytes were used in addition to LacZ and murine fibroblast cells because human monocytes are target cell types for the treatment of rheumatoid arthritis.

건강한 기증자들로부터 얻은 신선한 인간 혈액 표본들을 Golden West Biologicals 사로부터 구매하였다. 단구세포들의 분리를 위해, 혈액 표본들을 수취한 후 즉시 1:1의 비율로 PBS와 희석시켰다. 전혈로부터 피콜(Ficoll)(Amersham) 그래디언트(gradient)에 의해 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)을 우선 분리하였다. 단구세포들을 밀테니(Miltenyi) CD14 포지티브 선택 키트 및 지급된 프로토콜(MILTENYI BIOTEC)을 이용하여 PBMC들로부터 단구세포들을 더 정제하였다. 단구세포 제제의 순도를 평가하기 위해, 안티-CD14 항체(BD Biosciences)로 세포들을 배양하였고 이후 유동 세포계측법으로 정렬하였다. 상기 단구세포 제제의 순도는 95 %를 초과하였다.Fresh human blood samples from healthy donors were purchased from Golden West Biologicals. For the isolation of monocytes, blood samples were taken and immediately diluted with PBS in a ratio of 1: 1. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first isolated from whole blood by Ficoll (Amersham) gradients. Monocytes were further purified from PBMCs using the Miltenyi CD14 positive selection kit and the issued protocol (MILTENYI BIOTEC). To assess the purity of monocyte preparations, cells were incubated with anti-CD14 antibody (BD Biosciences) and then sorted by flow cytometry. The purity of the monocyte preparation was above 95%.

하기 설명은 본 실시예에 사용된 형질감염 프로토콜의 간략한 개요이다. 세포들을 부착 세포계통(adherent cell lines)에 대하여 70 ~ 90 % 콘플루언스(confluence) 및 부유 세포에 대하여 웰당 100,000 세포들로 세포들을 플레이트시켰다. siRNA/형질감염 시약 복합체들에 대하여, Cy5- 또는 FAM-접합 siRNA 및 펩티드들을 최종 농도의 2-배 농도인 Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00022
배지(Invitrogen) 내에서 따로 분리하여 희석하였다. 동일한 부피의 siRNA 및 형질감염 시약을 혼합하여 상온에서 5-10 분 동안 복합되도록 하였다. siRNA-펩티드 접합체들에 대하여, 상기 접합체들을 Opti-MEM
Figure 112008025338980-PCT00023
배지 내에 직접 희석시켰다. 이전에 PBS로 세척한 세포들에 형질감염 혼합물들을 첨가하였다. 세포들을 37 ℃, 5 % CO2에서 3 시간 동안 형질감염시켰다. RNA 흡수 분석을 위하여, 세포들을 PBS로 세척하고 트립신으로 처리(부착 세포들만 실시)한 이후 유동 세포계측법으로 분석하였다. siRNA 흡수는 세포간 Cy5 또는 FAM 형광의 세기로 측정하였다. 세포 생존도를 프로피디움 요오드화물(흡수) 또는 아넥신(Annexin) V-PE(염색)을 이용하여 측정하였다.The following description is a brief overview of the transfection protocol used in this example. The cells were plated at 100,000 cells per well for 70-90% confluence for adherent cell lines and for floating cells. For siRNA / transfection reagent complexes, the Cy5- or FAM-conjugated siRNA and peptides were optimized for Opti-MEM at a 2-fold concentration of the final concentration.
Figure 112008025338980-PCT00022
Separated and diluted in medium (Invitrogen) separately. Equal volumes of siRNA and transfection reagents were mixed and allowed to complex for 5-10 minutes at room temperature. For siRNA-peptide conjugates, the conjugates were selected from Opti-MEM.
Figure 112008025338980-PCT00023
Dilution directly into the medium. Transfection mixtures were added to cells previously washed with PBS. Cells were transfected at 37 ° C., 5% CO 2 for 3 hours. For RNA uptake analysis, cells were washed with PBS and treated with trypsin (adhered cells only) followed by flow cytometry. siRNA uptake was measured by the intensity of intracellular Cy5 or FAM fluorescence. Cell viability was measured using propidium iodide (absorption) or Annexin V-PE (staining).

선행 실험은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73이 류마치스성 관절염의 치료에 이상적인 후보라는 것을 보여준다. 도 3은 몇가지 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들이 배양중인 인간 단구세포들 내에서 siRNA 흡수를 향상시키는 능력을 도시한다. 리포펙타민에 의한 형질감염을 비교물질(comparator)로 사용하였다. 각각의 펩티드에 대하여 세포 생존도를 또한 평가하였다(도 4). 데이터에 의하면 PN73 펩티드가 높은 효율과 낮은 독성으로 인간 단구세포들을 형질감염시킨다는 경이적인 발견을 보이는데 이는 PN73이 류마티스성 관절염의 생체 내 치료에 대한 이상적인 후보라는 것을 나타낸다.Previous experiments show that PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, is an ideal candidate for the treatment of rheumatoid arthritis. 3 shows the ability of several different polynucleotide delivery-enhancing polypeptides to enhance siRNA uptake in human monocytes in culture. Transfection with lipofectamine was used as a comparator. Cell viability was also evaluated for each peptide (FIG. 4). The data show a phenomenal discovery that PN73 peptides transfect human monocytes with high efficiency and low toxicity, indicating that PN73 is an ideal candidate for in vivo treatment of rheumatoid arthritis.

실시예Example 5 :  5: siRNAsiRNA /전달은 / Delivery siRNAsiRNA 의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들로의 접합에 의하여 향상된다Is enhanced by conjugation to polynucleotide delivery-enhancing polypeptides

본 실시예는 9L/LacZ 배양 세포 계통들 및 쥐 꼬리로부터 얻은 원발성 섬유아세포 내에서 siRNA 흡수를 유도하거나 향상시키기 위하여 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 접합체들의 활성의 평가를 위한 스크리닝으로부터 얻은 결과들을 제공한다. siRNA/펩티드 복합체의 생성에 필요한 siRNA/펩티드 혼합이 요구되지 않는다는 것을 제외하고는, 본 연구들을 위해 이용된 물질들 및 방법들이 상술한 바와 같이 일반적으로 동일하다. 9L/LacZ 세포들로 실시된 형질감염들에 대한 퍼센트 흡수율을 표 7에 요약하였다. 사용된 펩티드와 펩티드/siRNA 접합체의 농도가 표 7에 포함되어 있다. siRNA 분자에 접합된 FAM-β-gal 라벨을 사용하였다. MTF로 실시한 형질감염들의 결과들을 표 8에 요약하였다. 사용된 펩티드/siRNA 접합체의 농도와 eGFP siRNA 분자에 접합된 Cy5 라벨이 표 8에 포함되어 있다.This example provides results obtained from screening for evaluation of the activity of siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide conjugates to induce or enhance siRNA uptake in primary fibroblasts from 9L / LacZ cultured cell lines and rat tails. do. The materials and methods used for the studies are generally the same as described above, except that the siRNA / peptide mixture required for generation of the siRNA / peptide complex is not required. Percent uptake rates for transfections conducted with 9L / LacZ cells are summarized in Table 7. The concentrations of peptide and peptide / siRNA conjugates used are included in Table 7. FAM-β-gal labels conjugated to siRNA molecules were used. The results of the transfections performed with MTF are summarized in Table 8. The concentration of peptide / siRNA conjugates used and the Cy5 labels conjugated to the eGFP siRNA molecules are included in Table 8.

하기 표 7은 LacZ 세포들 내에서 siRNA들에 접합되는 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 매개되는 siRNA의 효율을 나타낸 것이다:Table 7 below shows the efficiency of siRNA mediated by reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides conjugated to siRNAs in LacZ cells:

접합체 명칭Conjugate name 펩티드 ID#Peptide ID # 펩티드/siRNA 접합체 농도Peptide / siRNA Conjugate Concentration 흡수율 %Water absorption% CoP267nfR 137-1CoP267nfR 137-1 PN267PN267 최대 2.0 μM까지 시험됨Tested up to 2.0 μM 0 %0 % CoP286nfR 138-1CoP286nfR 138-1 PN286PN286 0.8 μM0.8 μM 0 %0 % CoP287nfR 138-1CoP287nfR 138-1 PN287PN287 0.8 μM0.8 μM 0 %0 % CoP284nfR 164-1CoP284nfR 164-1 PN284PN284 최대 1.0 μM까지 시험됨Tested up to 1.0 μM 0 %0 % CoP282nfR 165-1CoP282nfR 165-1 PN282PN282 최대 1.0 μM까지 시험됨Tested up to 1.0 μM 0 %0 % CoP290nfR 165-1CoP290nfR 165-1 PN290PN290 최대 1.0 μM까지 시험됨Tested up to 1.0 μM 0 %0 % CoP277nfR 167-1CoP277nfR 167-1 PN73PN73 1.0 μM1.0 μM 42.9 %42.9% CoP277nfR 167-2CoP277nfR 167-2 PN73PN73 2.0 μM2.0 μM 55.4 %55.4%

하기 표 8은 쥐 꼬리 섬유아세포 세포들 내에서 siRNA들에 접합되는 합리적으로 설계된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 매개되는 siRNA 흡수의 효율을 나타낸 것이다.Table 8 below shows the efficiency of siRNA uptake mediated by reasonably designed polynucleotide delivery-enhancing polypeptides conjugated to siRNAs in murine tail fibroblast cells.

접합체 명칭Conjugate name 아미노산 서열Amino acid sequence 펩티드/siRNA 접합체 농도Peptide / siRNA Conjugate Concentration % 흡수율% Absorption Cy5-dsCoP278nfR270Cy5-dsCoP278nfR270 말레이미드-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-아미드(서열 번호: 102)Maleimide-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (SEQ ID NO: 102) 0.5 μM0.5 μM 96.3 %96.3% dsCoP277nfR317dsCoP277nfR317 말레이미드-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 103)Maleimide-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 103) 4 μM4 μM 83.5 %83.5% dsCoP275nfR321dsCoP275nfR321 말레이미드-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-아미드(서열 번호: 37)Maleimide-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID NO: 37) 4 μM4 μM 52.1 %52.1% dsCoP285nfR322-1dsCoP285nfR322-1 말레이미드-Dmt-r-FKQqQqQqQqQq-아미드(SEQ ID N0: 74)Maleimide-Dmt-r-FKQqQqQqQqQq-amide (SEQ ID N0: 74) 4 μM4 μM 41.3 %41.3% dsCoP236nfR332dsCoP236nfR332 말레이미드-RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드(서열 번호: 52)Maleimide-RQIKIWFQNRRMKWKK-amide (SEQ ID NO: 52) 4 μM4 μM 36.3 %36.3% dsCoP317nfR320dsCoP317nfR320 말레이미도-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-아미드(서열 번호: 104)Maleimido-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-amide (SEQ ID NO: 104) 2 μM2 μM 29.6 %29.6% dsCoP316nfR347dsCoP316nfR347 말레이미도-RVIRWFQNKRSKDKK-아미드(서열 번호: 92)Maleimido-RVIRWFQNKRSKDKK-amide (SEQ ID NO: 92) 2 μM2 μM 17.1 %17.1% dsCoP289nfR268dsCoP289nfR268 말레이미드-WRFKQqQqQqQqQq-아미드(서열 번호: 76)Maleimide-WRFKQqQqQqQqQq-amide (SEQ ID NO: 76) 4 μM4 μM 3.2 %3.2% dsCoP276nfR319dsCoP276nfR319 말레이미드-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-아미드(서열 번호: 105)Maleimide-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-amide (SEQ ID NO: 105) 2 μM2 μM 3.6 %3.6% dsCoP298cfR248dsCoP298cfR248 NH2-WRFKC-아미드(서열 번호: 106)NH2-WRFKC-amide (SEQ ID NO: 106) 4 μM4 μM 4.1 %4.1% dsCoP280nfR362-1dsCoP280nfR362-1 말레이미드-GRKKRRQRRRPPQ-아미드(서열 번호: 43)Maleimide-GRKKRRQRRRPPQ-amide (SEQ ID NO: 43) 4 μM4 μM 1.8 %1.8% dsCoP458nfR363-1dsCoP458nfR363-1 말레이미도-KLALKLALKALKAALKLA-아미드(서열 번호: 107)Maleimido-KLALKLALKALKAALKLA-amide (SEQ ID NO: 107) 4 μM4 μM 10.8 %10.8% dsCoP459nfR364-1dsCoP459nfR364-1 말레이미도-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-아미드(서열 번호: 108)Maleimido-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-amide (SEQ ID NO: 108) 4 μM4 μM 54.5 %54.5%

선행 데이터는 본 발명의 siRNA/펩티드 접합체들의 다양한 조립이 siRNA들을 높은 효율로 다른 세포 유형들 내로의 전달을 매개한다는 것을 명시한다.The preceding data specify that various assembly of siRNA / peptide conjugates of the invention mediate the delivery of siRNAs into other cell types with high efficiency.

실시예Example 6 :  6: siRNAsiRNA 유전자 발현 넉  Gene expression knock 다운는Down is siRNAsiRNA 에 복합된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의해 향상된다Enhanced by polynucleotide delivery-enhancing polypeptides conjugated to

본 실시예는 본 발명의 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 복합체들에 의해 표적 유전자 발현의 효과적인 넉 다운(knockdown)을 실증한다ㅏ. 본 연구들에서, 인간 및 다른 포유류 피검물 내에서 과량발현될(overexpressed) 때 RA의 발생 또는 진행을 매개하는 것으로 함축되는 인간 종양 괴사 인자-α(hTNF-α)의 표현을 조절하는 펩티드/siRNA 복합체들의 능력을 시험하였다.This example demonstrates the effective knockdown of target gene expression by the siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide complexes of the present invention. In these studies, peptides / siRNA that regulate the expression of human tumor necrosis factor-α (hTNF-α) implied to mediate the development or progression of RA when overexpressed in human and other mammalian specimens. The ability of the complexes was tested.

건강한 인간 혈액을 Golden West Biologicals 사(CA)로부터 구매하였고, Ficoll-Pague plus(Amersham) 그래디언트를 이용하여 상기 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)을 정제하였다. 이후 Miltenyi Biotech 사의 자기 마이크로구슬들(magnetic microbeads)을 사용하여 PBMC들의 부분들로부터 인간 단구세포들을 정제하였다. 분리된 인간 단구세포들을 4 mM 글루타민, 10 % FBS, 1x 비필수 아미노산 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(pen-strep)으로 보충된 IMDM에 재현탁시켰고 사용할 때까지 4 ℃에서 저장하였다.Healthy human blood was purchased from Golden West Biologicals, Inc., and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were purified from the blood using a Ficoll-Pague plus (Amersham) gradient. The human monocytes were then purified from portions of PBMCs using magnetic microbeads from Miltenyi Biotech. Isolated human monocytes were resuspended in IMDM supplemented with 4 mM glutamine, 10% FBS, 1 × non-essential amino acids and 1 × penicillin-streptomycin (pen-strep) and stored at 4 ° C. until use.

96 웰 평판 플레이트 내에, OptiMEM 배지(Invitrogen) 내에서 웰당 100 ㎕ 당 100,000 개로 인간 단구세포들을 살포하였다(seeded). 상온에서 OptiMEM 배지의 원하는 농도에서 20 분 동안(Lipofectamine 2000; Invitrogen에 대하여) 또는 5 분 동안(펩티드에 대하여) 형질감염 시약을 siRNA와 혼합하였다. 배양 완료시에, FBS를 혼합물(최종 3 %)에 첨가하였고, 상기 혼합물 50 ㎕을 상기 세포들에 첨가하였다. 상기 세포들을 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 형질감염 후에, 세포들을 V-자형 바닥 플레이트로 옮겨 넣었고 세포들을 1500 rpm으로 5 분 동안 펠릿화하였다(pelleted). 상기 세포들을 성장 배지(글루타민, 비필수 아미노산, 및 pen-strep이 있는 IMDM) 내에서 재현탁하였다. 하룻밤 동안 배양한 후에, 상기 세포들을 1 ng/ml 농도의 LPS(Sigma)로 3 시간 동안 자극하였다(stimulate). 도입한 후에, 세포들을 mRNA 정량화를 위해 상술한 바와 같이 회수하였고 단백질 정량화를 위해 상청액을 덜어놓았다.In 96 well plate plates, human monocytes were seeded at 100,000 per 100 μl per well in OptiMEM medium (Invitrogen). The transfection reagent was mixed with siRNA for 20 minutes (Lipofectamine 2000; for Invitrogen) or 5 minutes (for peptide) at the desired concentration of OptiMEM medium at room temperature. At the completion of incubation, FBS was added to the mixture (final 3%) and 50 μl of the mixture was added to the cells. The cells were incubated at 37 ° C. for 3 hours. After transfection, the cells were transferred to a V-shaped bottom plate and the cells were pelleted at 1500 rpm for 5 minutes. The cells were resuspended in growth medium (IMDM with glutamine, non-essential amino acids, and pen-strep). After incubation overnight, the cells were stimulated with LPS (Sigma) at a concentration of 1 ng / ml for 3 hours. After introduction, cells were harvested as described above for mRNA quantification and supernatant was removed for protein quantification.

mRNA 측정을 위해, Genospectra 사(CA)의 브랜치(branch) DNA 기술을 제작자 명세서에 따라서 사용하였다. 세포들 내에서의 mRNA 수준을 정량화하기 위하여, 하우스 키핑(house keeping) 유전자(cypB) 및 표적 유전자(TNF-α) mRNA 양쪽 모두를 측정하였고, TNF-α에 대한 눈금을 cypB와 정규화하여 상대 형광 유니트를 얻었다. 단백질 수준을 정량화하기 위하여, BD Bioscience 사의 TNF-α ELISA를 제작자 지침에 따라 사용하였다.For mRNA measurements, branch DNA technology from Genospectra (CA) was used according to the manufacturer's specification. To quantify mRNA levels in cells, both house keeping gene (cypB) and target gene (TNF-α) mRNAs were measured and the scale for TNF-α normalized with cypB to relative fluorescence The unit was obtained. To quantify protein levels, TNF-α ELISA from BD Bioscience was used according to the manufacturer's instructions.

하기 표 9에 도시된 바와 같이 TNF-α mRNA의 다른 영역들을 표적하도록 siRNA들을 지시하였다. 표 9에 수록된 각각의 올리고에 대한 3' 오버행들(예컨대, dNdN에서 N은 임의의 뉴클레오티를 나타낸다)는 도시되지 않았다.SiRNAs were directed to target other regions of TNF-α mRNA as shown in Table 9 below. 3 'overhangs (eg, N in dNdN represents any nucleotide) for each oligo listed in Table 9 are not shown.

하기 표 9는 TNF-α 유전자에서의 표적 유전자의 명칭, 위치 및 TNF-α의 siRNA 표적에 대한 올리고 서열을 나타낸 것이다:Table 9 below shows the name, location and target oligo sequence of the TNF-α siRNA target in the TNF-α gene:

ID# ID # siRNA 명칭siRNA designation 표적 유전자의 위치The location of the target gene 올리고 서열Oligo Sequence 서열 번호:SEQ ID NO: N125N125 TNF-α-1TNF-α-1 516-534516-534 GCGUGGAGCUGAGAGAUAAGCGUGGAGCUGAGAGAUAA 109109 N115N115 TNF-α-2TNF-α-2 430-448430-448 GCCUGUAGCCCAUGUUGUAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA 110110 N132N132 TNF-α-3TNF-α-3 738-756738-756 GGUAUGAGCCCAUCUAUCUGGUAUGAGCCCAUCUAUCU 111111 N108N108 TNF-α-4TNF-α-4 360-378360-378 CCAGGGACCUCUCUCUAAUCCAGGGACCUCUCUCUAAU 112112 N138N138 TNF-α-5TNF-α-5 811-829811-829 GCCCGACUAUCUCGACUUUGCCCGACUAUCUCGACUUU 113113 N113N113 TNF-α-6TNF-α-6 424-442424-442 UGACAAGCCUGUAGCCCAUUGACAAGCCUGUAGCCCAU 114114 N143N143 TNF-α-7TNF-α-7 844-862844-862 GGUCUACUUUGGGAUCAUUGGUCUACUUUGGGAUCAUU 115115 N107N107 TNF-α-8TNF-α-8 359-377359-377 CCCAGGGACCUCUCUCUAACCCAGGGACCUCUCUCUAA 116116 N137N137 LC1LC1 806-828806-828 AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUUAAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU 117117 N122N122 LC2LC2 514-532514-532 AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAUAAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU 118118 N130N130 LC3LC3 673-691673-691 AACCUCCUCUCUGCCAUCAAGAACCUCCUCUCUGCCAUCAAG 119119 N101N101 LC4LC4 177-195177-195 AACUGAAAGCAUGAUCCGGGAAACUGAAAGCAUGAUCCGGGA 120120 N140N140 LC5LC5 820-838820-838 AAUCUCGACUUUGCCGAGUCUAAUCUCGACUUUGCCGAGUCU 121121 N135N135 LC6LC6 781-799781-799 AAGGGUGACCGACUCAGCGCUAAGGGUGACCGACUCAGCGCU 122122 N128N128 LC7LC7 636-654636-654 AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUCAAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC 123123 N127N127 LC8LC8 612-630612-630 AACCCAUGUGCUCCUCACCCAAACCCAUGUGCUCCUCACCCA 124124 N118N118 LC9LC9 472-490472-490 AAGCUCCAGUGGCUGAACCGCAAGCUCCAGUGGCUGAACCGC 125125 N111N111 LC10LC10 398-416398-416 AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAAAAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA 126126 N110N110 LC11LC11 363-381363-381 AAGGGACCUCUCUCUAAUCAGAAGGGACCUCUCUCUAAUCAG 127127 N105N105 LC12LC12 265-287265-287 CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGACCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA 128128 N104N104 LC13LC13 264-282264-282 AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUUAAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU 129129 N120N120 LC14LC14 495-513495-513 AACCAAUGCCCUCCUGGCCAAAACCAAUGCCCUCCUGGCCAA 130130 N153N153 LC16LC16 1535-15551535-1555 CUGAUUAAGUUGUCUAAACAACUGAUUAAGUUGUCUAAACAA 131131 N136N136 LC17LC17 787-807787-807 CCGACUCAGCGCUGAGAUCAACCGACUCAGCGCUGAGAUCAA 132132 N152N152 LC18LC18 1327-13471327-1347 CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUACUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA 133133 N114N114 LC19LC19 428-448428-448 AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUAAAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA 134134 N145N145 LC20LC20 982-1002982-1002 UAGGGUCGGAACCCAAGCUUAUAGGGUCGGAACCCAAGCUUA 135135 N101N101 YC-1YC-1 177-195177-195 CUGAAAGCAUGAUCCGGGACUGAAAGCAUGAUCCGGGA 136136 N103N103 YC-2YC-2 251-269251-269 AGGCGGUGCUUGUUCCUCAAGGCGGUGCUUGUUCCUCA 137137 N106N106 YC-3YC-3 300-318300-318 CCACCACGCUCUUCUGCCUCCACCACGCUCUUCUGCCU 138138 N109N109 YC-4YC-4 362-380362-380 AGGGACCUCUCUCUAAUCAAGGGACCUCUCUCUAAUCA 139139 N113N113 YC-5YC-5 424-442424-442 UGACAAGCCUGUAGCCCAUUGACAAGCCUGUAGCCCAU 140140 N115N115 YC-6YC-6 430-448430-448 GCCUGUAGCCCAUGUUGUAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA 141141 N117N117 YC-7YC-7 435-453435-453 UAGCCCAUGUUGUAGCAAAUAGCCCAUGUUGUAGCAAA 142142 N120N120 YC-8YC-8 495-513495-513 CCAAUGCCCUCCUGGCCAACCAAUGCCCUCCUGGCCAA 143143 N121N121 YC-9YC-9 510-528510-528 CCAAUGGCGUGGAGCUGAGCCAAUGGCGUGGAGCUGAG 144144 N123N123 YC-10YC-10 515-533515-533 GGCGUGGAGCUGAGAGAUAGGCGUGGAGCUGAGAGAUA 145145 N125N125 YC-11YC-11 516-534516-534 GCGUGGAGCUGAGAGAUAAGCGUGGAGCUGAGAGAUAA 146146 N126N126 YC-12YC-12 558-576558-576 GCCUGUACCUCAUCUACUCGCCUGUACCUCAUCUACUC 147147 N130N130 YC-13YC-13 673-691673-691 CCUCCUCUCUGCCAUCAAGCCUCCUCUCUGCCAUCAAG 148148 N132N132 YC-14YC-14 738-756738-756 GGUAUGAGCCCAUCUAUCUGGUAUGAGCCCAUCUAUCU 149149 N133N133 YC-15YC-15 772-790772-790 GCUGGAGAAGGGUGACCGAGCUGGAGAAGGGUGACCGA 150150 N134N134 YC-16YC-16 776-794776-794 GAGAAGGGUGACCGACUCAGAGAAGGGUGACCGACUCA 151151 N136N136 YC-17YC-17 787-807787-807 GCCCGACUAUCUCGACUUUGCCCGACUAUCUCGACUUU 152152 N141N141 YC-18YC-18 841-859841-859 GCAGGUCUACUUUGGGAUCGCAGGUCUACUUUGGGAUC 153153 N143N143 YC-19YC-19 844-862844-862 GGUCUACUUUGGGAUCAUUGGUCUACUUUGGGAUCAUU 154154 N144N144 YC-20YC-20 853-871853-871 UGGGAUCAUUGCCCUGUGAUGGGAUCAUUGCCCUGUGA 155155 N146N146 YC-21YC-21 985-1003985-1003 GGUCGGAACCCAAGCUUAGGGUCGGAACCCAAGCUUAG 156156 N147N147 YC-22YC-22 1179-11971179-1197 CCAGAAUGCUGCAGGACUUCCAGAAUGCUGCAGGACUU 157157 N148N148 YC-23YC-23 1198-12161198-1216 GAGAAGACCUCACCUAGAAGAGAAGACCUCACCUAGAA 158158 N149N149 YC-24YC-24 1200-12181200-1218 GAAGACCUCACCUAGAAAUGAAGACCUCACCUAGAAAU 159159 N150N150 YC-25YC-25 1250-12681250-1268 CCAGAUGUUUCCAGACUUCCCAGAUGUUUCCAGACUUC 160160 N151N151 YC-26YC-26 1312-13301312-1330 CUAUUUAUGUUUGCACUUGCUAUUUAUGUUUGCACUUG 161161 N154N154 YC-27YC-27 1547-15651547-1565 UCUAAACAAUGCUGAUUUGUCUAAACAAUGCUGAUUUG 162162 N155N155 YC-28YC-28 1568-15851568-1585 GACCAACUGUCACUCAUUGACCAACUGUCACUCAUU 163163

표 10, 11 및 12는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 복합된 특이적 올리고들이 인간 단구 세포들 내에서 TNF-α 유전자 발현 수준들을 표적하고 넉 다운하는 유효성을 도시한다.Tables 10, 11 and 12 show the effectiveness of specific oligos complexed to polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention to target and knock down TNF-α gene expression levels in human monocytes.

하기 표 10은 PN73/siRNA 복합체에 의해 매개되는 TNF-α 넉 다운(%)을 나타낸 것이다.Table 10 below shows the TNF-α knock down (%) mediated by the PN73 / siRNA complex.

펩티드/siRNA 복합체Peptide / siRNA Complex 펩티드 PN73 (1.6 μM)      Peptide PN73 (1.6 μM) siRNA(4 nM)siRNA (4 nM) KD(%)KD (%) LC1LC1 20.08 %20.08% LC2LC2 19.06 %19.06% LC3LC3 23.17 %23.17% LC4LC4 26.67 %26.67% LC5LC5 46.78 %46.78% LC6LC6 44.10 %44.10% LC7LC7 42.76 %42.76% LC8LC8 41.24 %41.24% LC9LC9 40.32 %40.32% LC10LC10 13.52 %13.52% LC11LC11 7.89 %7.89% LC12LC12 40.61 %40.61% LC13LC13 48.29 %48.29% LC14LC14 50.76 %50.76% LC16LC16 55.91 %55.91% LC17LC17 50.78 %50.78% LC18LC18 63.44 %63.44% LC19LC19 61.83 %61.83% LC20LC20 42.68 %42.68% YC12YC12 43.60 %43.60%

하기 표 11은 PN509/siRNA 복합체에 의하여 매개되는 TNF-α 넉 다운(%)을 나타낸 것이다:Table 11 below shows the TNF-α knock down (%) mediated by PN509 / siRNA complexes:

표적 유전자 TNF-α          Target gene TNF-α 펩티드/siRNA 복합체  Peptide / siRNA Complex 펩티드 PN509 (1.6 μM)        Peptide PN509 (1.6 μM) siRNA (4 nM)siRNA (4 nM) KD(%)KD (%) LC1LC1 31.13 %31.13% LC2LC2 37.04 %37.04% LC3LC3 30.14 %30.14% LC4LC4 22.71 %22.71% LC5LC5 34.93 %34.93% LC6LC6 50.19 %50.19% LC7LC7 56.11 %56.11% LC8LC8 47.35 %47.35% LC9LC9 58.20 %58.20% LC10LC10 25.62 %25.62% LC11LC11 25.65 %25.65% LC12LC12 17.03 %17.03% LC13LC13 25.04 %25.04% LC14LC14 42.78 %42.78% LC16LC16 40.06 %40.06% LC17LC17 48.94 %48.94% LC18LC18 58.13 %58.13% LC19LC19 56.38 %56.38% LC20LC20 71.12 %71.12% YC12YC12 64.37 %64.37%

하기 표 12는 PN250/siRNA 복합체에 의하여 매개되는 TNF-α 넉 다운(%)을 나타낸 것이다: Table 12 below shows the TNF-α knock down (%) mediated by PN250 / siRNA complexes:

복합체Complex 표적 유전자 TNF-α           Target gene TNF-α 펩티드 PN250 농도Peptide PN250 Concentration siRNA 20 nMsiRNA 20 nM KD(%)KD (%) 0.5 μM    0.5 μM YC11YC11 13.70 %13.70% YC12YC12 17.06 %17.06% YC17YC17 17.30 %17.30% YC18YC18 20.72 %20.72% LC13LC13 20.65 %20.65% LC20LC20 -3.80 %-3.80% TNF-4TNF-4 0.90 %0.90% 0.75 μM    0.75 μM YC11YC11 21.09 %21.09% YC12YC12 21.66 %21.66% YC17YC17 29.82 %29.82% YC18YC18 17.82 %17.82% LC13LC13 18.04 %18.04% LC20LC20 10.72 %10.72% TNF-4TNF-4 14.39 %14.39% 1 μM    1 μM YC11YC11 33.10 %33.10% YC12YC12 15.91 %15.91% YC17YC17 24.68 %24.68% YC18YC18 24.66 %24.66% LC13LC13 31.35 %31.35% LC20LC20 26.53 %26.53% TNF-4TNF-4 26.47 %26.47%

선행 결과들(표 10, 11 및 12)는 본 발명의 신규한 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 조성물들을 사용하여 포유류 세포들 내에서 TNF-α 유전자 발현 넉 다운의 효과적인 수준들이 달성될 수 있다는 것을 명시한다.The preceding results (Tables 10, 11 and 12) indicate that effective levels of TNF-α gene expression knock down can be achieved in mammalian cells using the novel siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide compositions of the present invention. Specify it.

스크리닝 및 특성화Screening and Characterization

LPS로 처리된 인간 단구세포들(CD14+)은 약 2 시간 이내에 TNF-α-특이적 mRNA를 유도하고, 2 시간 이후에 TNF-α 단백질이 최고 수준에 이르게 된다. 단구세포들을 siRNA 후보 서열들로 형질감염시키고, Lipfectamine 2000을 이용하고, 감염된 세포들을 LPS로 처리하고 약 16 시간 이후에 TNF-α mRNA 수준들을 측정하여 넉 다운 활성에 대해 siRNA들을 스크리닝하였다. 56 개 서열들을 설계하였고 활성화된 제1 인간 단구세포들 내에서의 TNF-α mRNA 및 단백질 수준들을 넉 다운하는 상기 서열들의 능력을 스크리닝하였다. 27 개의 대표적인 siRNA 서열들의 세트에 대한 활성은 80 % mRNA 넉 다운 활성으로부터 검출가능한 활성이 없는 것까지 다양하였다. 일반적으로, TNF-α 단백질 수준들은 mRNA 수준들보다 더 감소하여, 예컨대, TNF-α mRNA(TNF-α-1)에서의 50 % 넉 다운는 TNF-α 단백질 수준에서의 75 % 감소로 이어졌다. 30 % 내지 60 %의 넉 다운 수준들을 보였던 선택된 siRNA들에 대한 투여 반응 곡선들을 얻게 되었다. 계산된 IC50 수치들은 10 pMolar 내지 200 pMolar 범위에 이르렀다. 평가된 siRNA 서열들이 TNF-α 전사 전반에 걸쳐 분포되는 반면에, 확인된 가장 효과가 큰 siRNA들은 2 개 영역들 내에 위치하였다: 코딩 영역의 중앙 및 3'-UTR.Human monocytes treated with LPS (CD14 +) induce TNF-α-specific mRNA within about 2 hours and after 2 hours the TNF-α protein reaches its highest level. Monocytes were transfected with siRNA candidate sequences, Lipfectamine 2000 was used, and infected cells were treated with LPS and siRNAs were screened for knockdown activity by measuring TNF-α mRNA levels after about 16 hours. 56 sequences were designed and screened for their ability to knock down TNF-α mRNA and protein levels in activated first human monocytes. Activity on a set of 27 representative siRNA sequences varied from 80% mRNA knock down activity to no detectable activity. In general, TNF-α protein levels decreased further than mRNA levels, such as 50% knockdown in TNF-α mRNA (TNF-α-1) led to a 75% decrease in TNF-α protein levels. Dose response curves were obtained for selected siRNAs that showed knockdown levels of 30% to 60%. The calculated IC 50 values ranged from 10 pMolar to 200 pMolar. While the siRNA sequences evaluated were distributed throughout TNF-α transcription, the most effective siRNAs identified were located in two regions: the center of the coding region and the 3′-UTR.

실시예Example 7 :  7: siRNAsiRNA 유전자 발현 넉  Gene expression knock 다운는Down is siRNAsiRNA 와 Wow 접합된Spliced 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 의하여 증진된다 Promoted by polynucleotide delivery-enhancing polypeptides

본 실시예는 본 발명의 펩티드-siRNA 접합체들에 의한 표적 유전자 발현의 넉 다운을 실증한다. 본 연구를 위한 물질들 및 방법들은 siRNA 및 펩티드의 혼합이 필요하지 않는다는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일하다. 일련의 본 연구에서, 넉 다운 실험들은 리포펙타민이 존재할 때와 존재하지 않을 때의 펩티드/siRNA-매개 넉 다운의 비교를 포함하였다. 본 실시예의 결과들이 하기 표 13에 도시되어 있다.This example demonstrates knock down of target gene expression by peptide-siRNA conjugates of the invention. The materials and methods for this study are the same as described above, except that no mixing of siRNA and peptide is required. In a series of present studies, knock down experiments included a comparison of peptide / siRNA-mediated knock down with and without lipofectamine. The results of this example are shown in Table 13 below.

하기 표 13은 리포펙타민이 존재시 및 부존재시에 TNF-α 유전자 발현의 펩티드/siRNA-매개성 넉 다운(KD)을 나타낸 것이다:Table 13 below shows the peptide / siRNA-mediated knock down (KD) of TNF-α gene expression in the presence and absence of lipofectamine:

시험에 사용된 세포 유형Cell type used for the test 복합체 명칭  Complex name 펩티드+siRNA  Peptide + siRNA 리포펙타민이 존재Lipofectamine is present 리포펙타민이 부존재Lipofectamine is absent 농도(μM) Concentration (μM) KD(%) KD (%) 농도(μM) Concentration (μM) KD(%) KD (%) CD14     CD14 CoP456  CoP456 cIBR + LC20  cIBR + LC20 0.4 μM0.4 μM 무 KDKD 0.4 μM0.4 μM 무 KDKD 1.3 μM1.3 μM 무 KDKD 1.3 μM1.3 μM 무 KDKD 4 μM4 μM 무 KDKD 4 μM4 μM 무 KDKD CoP457  CoP457 펩티드 T + LC20 Peptide T + LC20 0.4 μM0.4 μM 무 KDKD 0.4 μM0.4 μM 무 KDKD 1.3 μM1.3 μM 무 KDKD 1.3 μM1.3 μM 무 KDKD 4 μM4 μM 무 KDKD 4 μM4 μM 무 KDKD CoP278  CoP278 TAT/HA + YC12 TAT / HA + YC12 0.4 μM0.4 μM 무 KDKD 0.4 μM0.4 μM 무 KDKD 1.3 μM1.3 μM 무 KDKD 1.3 μM1.3 μM 무 KDKD 4 μM4 μM 무 KDKD 4 μM4 μM 무 KDKD MTF   MTF CoP277   CoP277 PN73 + LC13   PN73 + LC13 0.19 μM0.19 μM 31.95 %31.95% 0.19 μM0.19 μM 61.61 %61.61% 0.38 μM0.38 μM 32.83 %32.83% 0.38 μM0.38 μM 76.31 %76.31% 0.75 μM0.75 μM 39.29 %39.29% 0.75 μM0.75 μM 73.94 %73.94% 1.50 μM1.50 μM 41.42 %41.42% 1.50 μM1.50 μM 73.14 %73.14% 3.00 μM3.00 μM 39.88 %39.88% 3.00 μM3.00 μM 58.14 %58.14% 6.00 μM6.00 μM 20.23 %20.23% 6.00 μM6.00 μM 50.71 %50.71% CD14   CD14 CoP277   CoP277 PN73 + LC13   PN73 + LC13 0.000 μM0.000 μM 93.06 %93.06% 0.002 μM0.002 μM 83.63 %83.63% 0.011 μM0.011 μM 72.58 %72.58% 0.053 μM0.053 μM 73.52 %73.52% 0.266 μM0.266 μM 85.01 %85.01% CD14   CD14 CoP277   CoP277 PN73 + LC20   PN73 + LC20 0.000 μM0.000 μM 75.15 %75.15% 0.002 μM0.002 μM 60.72 %60.72% 0.011 μM0.011 μM 57.09 %57.09% 0.053 μM0.053 μM 58.70 %58.70% 0.266 μM0.266 μM 62.79 %62.79%

선행 데이터(표 13)는 본 발명의 siRNA들과 접합된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 다양한 조립이 포유류 피검물들 내에서의 TNF-α 유전자 발현의 siRNA-매개성 넉 다운를 증진하는 것으로 기능 한다는 것을 명시한다.Prior data (Table 13) indicate that various assembly of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides conjugated with siRNAs of the present invention functions to enhance siRNA-mediated knockdown of TNF-α gene expression in mammalian specimens. do.

실시예Example 8 : 8 : siRNAsiRNA 유전자 발현 넉 다운의 시간 경로( Time path of gene expression knockdown timetime coursecourse ))

본 실시예는 siRNA-매개성 유전자 발현 넉 다운의 시간 경로에 관한 연구들을 제시한다. siRNA 효과의 지속성을 시험하기 위하여, eGFP 발현 쥐들로부터 유도된 섬유아세포들을 사용한 것을 제외하고는 상술한 바와 같은 siRNA 형질감염 절차들을 이용하였다. 여기에 사용된 형질감염 시약은 리포펙타민이었다. 상기 세포들은 과잉성장으로 인하여 18 일째 되는 날에 재플레이트하였다(replated). 제 1 형질감염 후 19 일째 되는 날에 제 2 형질감염을 실시하였다. 형질감염을 한 후, 19 일째 되는 날에 상기 eGFP 수준들을 측정하였다. GFPI siRNA(GFPI) 및 헤어핀 siRNA(D#21)과 함께, 스크램블 또는 논센스 siRNA(Qiagen)를 대조군으로 사용하였다. 스크램블 siRNA(Qiagen 대조군)로 넉 다운 활성들을 켈리브레이션 하였다. 높은 수치는 넉 다운 활성이 높음을 나타낸다.This example presents studies on the time course of siRNA-mediated gene expression knock down. To test the persistence of siRNA effects, siRNA transfection procedures as described above were used, except that fibroblasts derived from eGFP expressing mice were used. The transfection reagent used here was lipofectamine. The cells were replated on day 18 due to overgrowth. The second transfection was performed on the 19th day after the first transfection. After transfection, the eGFP levels were measured on day 19. Along with GFPI siRNA (GFPI) and hairpin siRNA (D # 21), scrambled or nonsense siRNA (Qiagen) was used as a control. Knockdown activities were calibrated with scrambled siRNA (Qiagen control). Higher values indicate higher knock down activity.

하기 표 13은 siRNA의 리포펙타민 매개성 형질감염에 의한 TNF-α 유전자 발현 넉 다운의 시간 경로를 나타낸 것이다:Table 13 below shows the time course of TNF-α gene expression knock down by lipofectamine mediated transfection of siRNA:

siRNA siRNA 제 1 형질감염 후의 날짜Date after first transfection 1One 33 55 77 99 1111 1313 1515 1717 스크램블 siRNAScrambled siRNA 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 GFPIGFPI 27.6127.61 60.8760.87 64.7564.75 58.4058.40 56.7256.72 40.4640.46 35.5635.56 16.5916.59 15.5015.50 D#21D # 21 28.2228.22 61.1161.11 66.9166.91 62.8662.86 57.3657.36 54.7154.71 42.9642.96 24.6624.66 9.889.88

siRNA siRNA 제 1 형질감염 후의 날짜Date after first transfection 1919 2020 2121 2525 2727 스크램블 siRNAScrambled siRNA 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 GFPIGFPI 59.6059.60 37.1037.10 57.3857.38 66.9466.94 59.6359.63 D#21D # 21 46.3646.36 35.8935.89 65.2565.25 74.1574.15 58.3958.39

선행 연구들(표 14)은 siRNA 넉 다운 활성이 약 3 일째 되는 날 정도에 현저하였고, 9 일째 되는 날까지 지속하다가, 표적 유전자 발현이 약 17 일째 되는 날 정도에 기준선 수준으로 돌아왔음을 실증한다. 18 일째 되는 제 2 형질감염 이후에, eGFP 표현의 다른 감소가 발생하였는데, 이는 상기 시약이 세포들에 반복적으로 투여되어 반복되거나 지속하는 유전자 발현 넉 다운를 보일 수 있다는 것을 나타낸다.Previous studies (Table 14) demonstrate that siRNA knock down activity was significant on day 3, lasted until day 9, and returned to baseline levels on day 17 of target gene expression. . After the second transfection at day 18, another decrease in eGFP expression occurred, indicating that the reagent could be repeatedly administered to cells to show repeated or sustained gene expression knockdown.

실시예Example 9 : 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 복합된  9: complexed with a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide siRNAsiRNA 에 의해 매개되는 Mediated by TNFTNF -α 유전자 발현 넉 다운의 투여량 의존성Dose Dependence of -α Gene Expression Knockdown

본 실시예는 활성화된 인간 단구세포들 내에서 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73과 복합된 siRNA에 의해 매개 되는 넉 다운 활성이 펩티드-siRNA 복합체의 투여 농도에 의존한다는 것을 실증한다.This example demonstrates that knock down activity mediated by siRNA complexed with PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, in activated human monocytes depends on the dose concentration of the peptide-siRNA complex.

PN73과 siRNA 사이는 PN73:siRNA = 82:1의 등비로 PN73/siRNA 복합체를 제공하였다(표 15). 400 나노몰라 siRNA를 OptiMEM 배지 내에서 5 분 동안 33 μM PN73과 복합시켰다. 복합화한 후에, 상기 복합체를 OptiMEM과 단계 희석(serial diluted)(1:2 비율) 시켰다. 형질감염을 위해 상기 복합체를 인간 단구세포들에 첨가하였다. 상기 설명에 의하여 하기의 유도 및 mRNA 정량화를 실시하였다.Between PN73 and siRNA provided the PN73 / siRNA complex in an equal ratio of PN73: siRNA = 82: 1 (Table 15). 400 nanomolar siRNA was combined with 33 μM PN73 for 5 minutes in OptiMEM medium. After complexing, the complex was serial diluted (1: 2 ratio) with OptiMEM. The complex was added to human monocytes for transfection. As described above, the following induction and mRNA quantification were performed.

표 15는 TNF-α 유전자 발현 넉 다운의 펩티드 투여 의존성을 나타낸 것이다:Table 15 shows the peptide dose dependence of TNF-α gene expression knock down:

PN73 농도 (μM)PN73 concentration (μM) siRNA 농도 (nM)siRNA concentration (nM) 유전자 발현(%) Gene expression (%) 대조군Control TNF-α2TNF-α2 TNF-α4TNF-α4 LC8LC8 0 μM0 μM 0 nM0 nM 100 %100% 100 %100% 100 %100% 100 %100% 1.2 μM1.2 μM 14.81 nM14.81 nM 99.99 %99.99% 80.28 %80.28% 70.22 %70.22% 73.44 %73.44% 3.6 μM3.6 μM 44.44 nM44.44 nM 100.11 %100.11% 69.33 %69.33% 62.97 %62.97% 63.04 %63.04% 11 μM11 μM 133.33 nM133.33 nM 99,99 %99,99% 57.82 %57.82% 62.71 %62.71% 59.57 %59.57% 33 μM33 μM 400.00 nM400.00 nM 99.99 %99.99% 64.51 %64.51% 78.48 %78.48% 51.30 %51.30%

관련된 일련의 실험들에서, siRNA를 단계 희석시켰고 PN73 정량(1.67 μM)과 결합하였다. 달리 말하자면, PN73 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 siRNA의 적정(titration) 양들과 복합하였다. PN73(1.67 μM)을 OptiMEM 배지 내에서 5 분 동안 상온에서 LC20 siRNA 각각의 적정 양과 복합하였다. 복합화한 후에, 상기 복합체를 형질감염을 위하여 인간 단구세포들에 첨가하였다. 상술한 방법들에 의하여 하기 표 16에 제공된 도입 및 mRNA 정량화 데이터를 구하였다.In a related series of experiments, siRNA was step diluted and combined with PN73 quantification (1.67 μM). In other words, the PN73 polynucleotide delivery-enhancing polypeptide was combined with titration amounts of siRNA. PN73 (1.67 μM) was combined with the appropriate amount of each LC20 siRNA at room temperature for 5 minutes in OptiMEM medium. After complexing, the complex was added to human monocytes for transfection. The introduction and mRNA quantification data provided in Table 16 below were obtained by the methods described above.

표 16은 TNF-α 유전자 발현 넉 다운의 siRNA 투여 의존성을 나타낸 것이다.Table 16 shows the siRNA dose dependence of TNF-α gene expression knock down.

siRNA 농도(nM) siRNA concentration (nM) 대조군(%) Control group (%) TNF-α 유전자 발현 (%)TNF-α gene expression (%) 0.8 nM0.8 nM 100.0 %100.0% 84.7 %84.7% 4 nM4 nM 100.0 %100.0% 59.4 %59.4% 20 nM20 nM 100.0 %100.0% 65.2 %65.2% 100 nM100 nM 100.0 %100.0% 54.7 %54.7%

실시예Example 10: 포유류 세포들 내에서  10: in mammalian cells siRNAsiRNA 넉 다운 효과의 연장을 위한 다중 투여 프로토콜( Multiple dosing protocol for prolonging knockdown effect multiplemultiple dosingdosing protocolprotocol ))

본 실시예는 다중 투여 절차들이 본 발명의 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 조성물들에 의해 매개되는 포유류 세포들 내에서 유전자 발현 넉 다운 효과들을 효과적으로 연장할 것이라는 것을 실증한다. 본 연구를 위해 이용한 물질들과 방법들은 반복 형질감염을 지시된 시간들에 수행하였다는 것을 제외하고는 상술한 바와 동일하다. 스크램블 siRNA(Qiagen)를 사이드 바이 사이드(side-by-side) 대조군들에 대하여 사용하였다. 표 17은 펩티드/siRNA 복합체로 다중 형질감염한 데이터를 요약한 것이다. TNF-α 유전자의 퍼센트 넉 다운 활성은 전체 유전자 발현의 퍼센트를 나타낸다.This example demonstrates that multiple administration procedures will effectively prolong gene expression knock down effects in mammalian cells mediated by the siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide compositions of the invention. The materials and methods used for this study are the same as described above except that repeat transfection was performed at the indicated times. Scrambled siRNA (Qiagen) was used for side-by-side controls. Table 17 summarizes data transfected with peptide / siRNA complexes. The percent knock down activity of the TNF-α gene represents the percentage of total gene expression.

표 17은 펩티드/siRNA 복합체와의 다중 형질감염 후의 TNF-α 유전자 발현 넉 다운 활성을 나타낸 것이다:Table 17 shows TNF-α gene expression knock down activity after multiple transfection with peptide / siRNA complexes:

투여 형태 (dosing regime)Dosing regime 제 1 형질감염 후 날짜Date after first transfection 44 55 66 77 88 99 1010 1111 1212 단독Exclusive 74.7 %74.7% 61.9 %61.9% 62.5 %62.5% 55.5 %55.5% 41.4 %41.4% 39.4 %39.4% 27.2 %27.2% 제 2 형질감염의 5 일째Day 5 of second transfection 66.7 % 66.7% 69.8 % 69.8% 68.3 % 68.3% 64.2 % 64.2% 63.9 % 63.9% 64.4 % 64.4% 56.5 % 56.5% 제 2 형질감염의 6 일째Day 6 of second transfection 64.2 % 64.2% 65.8 % 65.8% 67.7 % 67.7% 64.1 % 64.1% 58.6 % 58.6% 54.0 % 54.0% 제 2 형질감염의 7 일째Day 7 of second transfection 63.1 % 63.1% 62.5 % 62.5% 69.9 % 69.9% 62.6 % 62.6% 58.1 % 58.1%

선행 결과들(표 17)은 다중 형질감염들이 적절한 시기(본 경우에는 제 1 형질감염을 한 후 약 5 일 내지 7 일 사이)에 실시할 경우, 포유류 세포들 내에서의 TNF-α 유전자 발현 넉 다운 효과들이 유지되거나 재도입(re-induced)될 수 있음을 실증한다.The preceding results (Table 17) show that TNF-α gene expression in mammalian cells when multiple transfections are performed at the appropriate time (in this case between about 5 and 7 days after the first transfection). It demonstrates that down effects can be maintained or re-induced.

실시예Example 11 : 생체 내  11: in vivo siRNAsiRNA /펩티드-Peptide 매개성Intermediary TNFTNF -α 유전자 발현 넉 다운 활성-α gene expression knock down activity

본 실시예는 치료적으로 표적 유전자 발현을 조절하고 세포들의 표현형을 변형시키는 데 효과적으로, siRNA에 의한 전신성 전달 및 치료적 유전자 넉 다운를 매개하는 본 발명의 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 조성물들의 효과를 실증하는 생체 내 데이터를 제공한다.This example demonstrates the effects of the siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide compositions of the invention that mediate systemic delivery by siRNA and therapeutic gene knockdown, effectively in regulating target gene expression and modifying the phenotype of cells. Demonstrate in vivo data.

5 주 정도된 인간 TNF-α 발현 쥐들을 Hellenic Pasture Institue 사(그리스)로부터 구매하였다. 300 ㎕ 식염수를 주당 2 회(4 마리 쥐들), RA 약물 Ramicade(5 mg/kg)를 주당 1 회(2 마리 쥐들), 또는 PN73과 혼합된 LC20 siRNA(2 mg/kg)를 5:1 몰 비율로 주당 2 회(2 마리 쥐들) 정맥(intravenous: IV)을 통하여 쥐들에게 투여하였다. 주입하는 기간 동안, ELISA 시험(R & D Systems)에 대하여 혈장(plasma) 표본들을 회수하였고 RA 질병 진행 및 치료 효능의 허용되는 지수로서 포 스코어들(paw scores)을 주당 2 회 취하였다. 처리된 쥐들로부터 얻은 TNF-α 단백질 혈장 수준들을 하기 표 18에 도시하였다.Human TNF-α expressing mice about 5 weeks old were purchased from Hellenic Pasture Institue (Greece). 5: 1 mole of 300 μl saline twice per week (4 mice), RA drug Ramicade (5 mg / kg) once per week (2 mice), or LC20 siRNA (2 mg / kg) mixed with PN73 The rats were administered twice per week (2 rats) via an intravenous (IV) vein. During the infusion period, plasma samples were collected for ELISA test (R & D Systems) and paw scores were taken twice per week as an acceptable index of RA disease progression and treatment efficacy. TNF-α protein plasma levels obtained from treated mice are shown in Table 18 below.

표 18은 ELISA로 시험한 혈액 세포질 내의 TNF-α 단백질의 수량을 나타낸 것이다:Table 18 shows the quantity of TNF-α protein in blood cytoplasm tested by ELISA:

처리 process 연령(주)Age week 77 88 99 라미케이드(Ramicade)Lamicade 102.24102.24 39.2739.27 25.8025.80 LC20/PN73LC20 / PN73 25.9625.96 21.8921.89 14.2114.21 식염수Saline 33.7833.78 34.2934.29 24.4824.48

*본 데이터는 실험에서의 쥐 평균을 pg/ml로 나타낸다.* This data shows the rat mean in pg / ml in the experiment.

선행 결과들은 라미케이드(Ramicade) 또는 식염수(대조군) 처리된 쥐들에서의 수준과 비교하여 펩티드/siRNA-처리된 쥐들의 순환 혈액에서의 TNF-α 단백질 수준들의 효과적 감소를 실증한다.The preceding results demonstrate an effective reduction of TNF-α protein levels in the circulating blood of peptide / siRNA-treated mice compared to levels in Ramicade or saline (control) treated mice.

본 발명의 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 조성물들 및 방법들의 생체 내 효과의 추가적인 증거를 포 스코어들, RA 질병 상태에 대한 수용되는 표현형 지수 및 처리 효능을 이용하여 상기 쥐 피검물로부터 구한 것이다. 시작점에서의 차이로 인하여(일부 동물들은 좀더 이른 시점들에서의 스코어들이 주어짐), 상기 스코어들을 실험의 모든 동물들에 대하여 0으로 조절하였다. 각각의 포는 하기의 스코어링 지수에 따라 0 내지 3 사이의 스코어가 주어지며, 가장 높은 스코어는 12로 주어진다.Further evidence of the in vivo effects of the siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide compositions and methods of the present invention was obtained from these rat specimens using Po scores, acceptable phenotype indices for RA disease status and treatment efficacy. Due to the difference in starting point (some animals are given scores at earlier time points), the scores were adjusted to zero for all animals in the experiment. Each gun is given a score between 0 and 3 according to the scoring index below, with the highest score being 12.

0: 정상0: normal

1: 발 또는 발목 관절의 부종(edema) 또는 염좌(distortion)1: Edema or sprain of the foot or ankle joint

2: 발 또는 발목 관절의 염좌2: sprain in the foot or ankle joint

3: 손목 또는 발목 관절의 강직(ankylosis)3: ankylation of the wrist or ankle joint

이러한 포 스코어 평가의 결과들을 도 5에서 그림으로 제시하였다. 상기 데이터는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN73이 8 주에 지연된 RA 진행에 의해 도시된 바와 같이 siRNA들(예컨대, LC20, TNF-α2 및 TNF-α9(UAGCCCAUGUUGUAGCAAA (서열 번호: 187))의 치료량(therapeutic amount)을 전달할 수 있음을 실증한다. PN73/siRNA 처리된 쥐들은 라미케이드-처리된 쥐들과 비교하여 8 주에서 포 스코어링 지수상 더 나은 것으로 나타났다. 포 스코어 평가들을 11 주 후-처리까지 실시하면, PN73/LC20 복합체는 라미케이드-처리된 쥐들에 필적할 만한 포 스코어 평가를 얻었다. PN73 펩티드/LC20 siRNA를 1:5의 비율로 하여, 2 mg/kg LC20은 더 낮은 양을 투여하여 시험한 것과 비교한다면 RA 진행에서 가장 높은 상대적 관찰 지연을 달성하였다. 하기 표 19는 PN73과 siRNA들로 처리한 후에 평가된 5 개의 상이한 그룹들에 대하여 몇몇 siRNA들의 상대적 효과성을 요약한 것이다.The results of this four-score evaluation are presented graphically in FIG. The data indicate that therapeutic dose of siRNAs (eg, LC20, TNF-α2 and TNF-α9 (UAGCCCAUGUUGUAGCAAA (SEQ ID NO: 187)) as shown by RA progression in which polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN73 was delayed at 8 weeks) PN73 / siRNA treated rats were shown to be better on the Four Scoring Index at 8 weeks compared to laminated-treated rats. , The PN73 / LC20 complex obtained a po score evaluation comparable to that of the laminated-treated mice, with the PN73 peptide / LC20 siRNA in a 1: 5 ratio, 2 mg / kg LC20 tested at lower doses. The highest relative latency observed in RA progression was achieved when compared to the following Table 19 summarizes the relative effectiveness of several siRNAs for five different groups evaluated after treatment with PN73 and siRNAs. It is.

표 19는 그룹들을 요약한 것이다:Table 19 summarizes the groups:

그룹 라벨Group label 처리*process* siRNA의 상대 효과siRNA relative effects TNF #1TNF # 1 LC20, 라미케이드, PBSLC20, Laminated, PBS LC20은 라미케이드만큼 효과적이다LC20 is as effective as laminate TNF #4TNF # 4 LC20 및 LC13LC20 and LC13 전체적으로 낮은 포 스코어Overall low po score TNF #5 TNF # 5 PN73에 접합된 LC20 LC20 bonded to PN73 전체적으로 낮은 포 스코어; 접합체들은 복합체들보다 더 낮은 활성을 가진다.Overall low gun score; The conjugates have lower activity than the complexes. TNF #6 TNF # 6 LC20, YC12 및 LC17 LC20, YC12 and LC17 전체적으로 낮은 포 스코어. YC12 및 LC17은 LC20 만큼 효과적이지 않음Overall low po score. YC12 and LC17 are not as effective as LC20 TNF #7(도 5)  TNF # 7 (FIG. 5) LC20, TNF-α2 및 TNF-α9  LC20, TNF-α2 and TNF-α9 LC20 및 TNF-α9은 8 주까지 라미케이드보다 더 효과적이다; LC20은 11 주까지 라미케이드 만큼 동일하게 효과적이다LC20 and TNF-α9 are more effective than laminates up to 8 weeks; LC20 is equally effective as a laminate up to 11 weeks

*PN73이 부재할 경우에 siRNA들을 시험하였다; 라미케이드는 양성 처리 대조군이고; PBS는 음성 처리 대조군이다.SiRNAs were tested in the absence of PN73; Lamicade is a positive treatment control; PBS is a negative treatment control.

선행 결과들은 본 발명의 siRNA 및 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 조성물들이 유전자 발현을 조절하고 질병의 치료와 조정에 신규한 치료적 도구들을 제공하는 것을 실증한다. 예를 들어, 분해하기 위해 인간 TNF-α-특이적 mRNA들을 타겟팅하는 siRNA들과 같은 본 발명의 siRNA들은 현재 작은 분자, 용해성 수용체, 또는 RA에 대한 항체 요법들보다 더 높은 특이성, 더 낮은 면역원성 및 더 큰 질병 변화를 제공한다. 50 개 이상의 후보군 siRNA 서열들을 스크리닝하여 hTNF-α를 표적하고 30 내지 85 %의 단일 투여 넉 다운들을 산출하였다. 20 개 이상의 컴퓨터(in silico) 설계된 펩티드 복합체 및/또는 공유 분자들을 단구세포들로 형광 RNA 흡수에 대하여 비교하였고 상당수가 리포펙타민이나 콜레스테롤-접합된 siRNA보다 상당히 더 높은 흡수율을 가지고 10 pM IC50 미만의 수치들을 가지는 것을 보였다. 펩티드-siRNA 제형들은 생체 내 활성화된 인간 단구세포들 내에서 TNF-α mRNA 및 단백질 수준들을 효과적으로 넉 다운한다.The preceding results demonstrate that the siRNA and polynucleotide delivery-enhancing polypeptide compositions of the present invention regulate gene expression and provide novel therapeutic tools for the treatment and modulation of disease. For example, siRNAs of the present invention, such as siRNAs that target human TNF-α-specific mRNAs for degradation, currently have higher specificity, lower immunogenicity than antibody therapies for small molecules, soluble receptors, or RA. And greater disease changes. More than 50 candidate siRNA sequences were screened to target hTNF-α and yield single dose knockdowns of 30-85%. More than 20 in silico designed peptide complexes and / or covalent molecules were compared to fluorescent RNA uptake into monocytes and many had significantly higher uptake rates than lipofectamine or cholesterol-conjugated siRNAs with 10 pM IC 50. Seemed to have numbers below. Peptide-siRNA formulations effectively knock down TNF-α mRNA and protein levels in activated human monocytes in vivo.

인간 TNF-α를 구성적으로 발현하는 대표적인 후보 전달 펩티드/siRNA 제형을 류마티스성 관절염(RA)의 2 개 형질전환된 쥐 모델들 내에서 평가하였다. 6 주의 연령에 시작하여 매주 2 회 정맥 주사 또는 인플릭시맵(infliximab)에 의하여 2 mg/kg siRNA로 처리한 동물들은 이러한 질병 상태들이 10 주까지 지속하는 대조군들에 비하여 7 주 연령에서 시작하는 RA 스코어 안정화(발 및 관절 염증)를 보였다. 9 주 연령에서, siRNA 처리된 동물들은 RA 스코어에서 필적할만한 감소를 보였지만, 인플릭시맵 처리된 동물들보다 세포질 TNF-α 단백질 수준들을 상당히 더 낮추었다.Representative candidate delivery peptide / siRNA formulations constitutively expressing human TNF-α were evaluated in two transformed mouse models of rheumatoid arthritis (RA). Animals treated with 2 mg / kg siRNA by intravenous injection or infliximab twice weekly, starting at 6 weeks of age, stabilized RA scores starting at 7 weeks of age compared to controls with these disease states lasting up to 10 weeks (Foot and joint inflammation). At 9 weeks of age, siRNA treated animals showed a comparable decrease in RA score, but significantly lower cytoplasmic TNF-α protein levels than infliximab treated animals.

본 개시를 근거로, 염증과 같은 병적 상태들에서 중요한 역할을 하는 예를 들어 TNF-α와 같은 시토카인들과 같은 표적 유전자들의 발현을 억제하기 위하여 siRNA를 사용하면 포유류 피검물 내에서 RA로 예시되는 것과 같은 질병 증세들을 완화하거나 방지하는 효과적인 치료법들을 제공한다. 본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 이용된 대표적인 펩티드/siRNA 조성물들은 항체들이나 용해성 수용체들의 경우처럼 예컨대, TNF-α 같은 표적 유전자의 산물과 복합에 의한 것보다는 예컨대 TNF-α 발현과 같은 표적 유전자 발현을 감소시키거나 제거하는 능력에 대한 장점들을 제공한다.Based on the present disclosure, the use of siRNA to inhibit the expression of target genes such as, for example, cytokines such as TNF-α, which plays an important role in pathological conditions such as inflammation, is illustrated as RA in mammalian specimens. Provide effective treatments to alleviate or prevent disease symptoms such as Representative peptide / siRNA compositions used within the methods and compositions of the present invention are targeted genes, such as for example TNF-α expression, rather than in combination with products of target genes such as, for example, TNF-α, as in the case of antibodies or soluble receptors. It offers advantages for the ability to reduce or eliminate expression.

본 발명의 가르침에 따라 핵산들의 전신성 전달을 개선하면 약물들과 같은 siRNA들의 발달에 대한 또 다른 장점들을 제공한다. 이러한 맥락의 특이적 도전들은 siRNA의 안정성을 유지하며, 조직 장벽들을 통하여 표적 세포 또는 조직으로의 전달 및 세포막을 가로질러 세포들 내로 siRNA들을 효능이 발생할 만큼 충분한 양을 도달하게 하는 세포간 전달을 포함한다. 본 개시는 RA의 쥐 모델들을 이용한 연구에 의하여 예시되는 바와 같이, 표적 질병들을 예측하는 형질전환 동물 모델들에서의 질병 활성을 약화시키는, 인간 TNF-α의 표현과 같이 특이적 유전자 발현을 표적으로 하는 신규한 펩티드/siRNA 조성물들을 포함하는 효과적인 생체 내 전달 시스템을 최초로 실증한다. 관련된 연구들에서, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 RA가 있는 환자들로부터 유도된 활성 단구세포들 내에서의 TNF-α 발현을 효과적으로 억제한다. 이러한 결과들은 RNAi 경로가 TNF-경로들에 미치는 세포간 효과들을 통하여 세포 표현형 및 질병 진행의 변화를 효과적으로 매개하고 RA에 대한 현재 항체 요법들을 특징으로 하는 잔존 면역반응성(residual immunoreactivity)을 지닌 순환 항체/TNF-α 복합체들로 인하여 독성 효과들을 회피한다는 것을 나타낸다. 여기의 모든 시험들은 관련된 독성 효과들을 최소화하여 실시함으로써, 본 실시예들에서 보인 siNA들 및 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 투여량이 적어도 80-90 % 이상의 세포 생존도 수존들과 항상 관련되어 있음을 보였다.Improving systemic delivery of nucleic acids in accordance with the teachings of the present invention provides further advantages for the development of siRNAs such as drugs. Specific challenges in this context include intercellular delivery, which maintains the stability of the siRNA, delivers it to the target cell or tissue through tissue barriers and reaches an amount sufficient to effect the siRNA into cells across the cell membrane. do. This disclosure targets specific gene expression, such as expression of human TNF-α, attenuating disease activity in transgenic animal models predicting target diseases, as exemplified by studies using rat models of RA. We demonstrate for the first time an effective in vivo delivery system comprising novel peptide / siRNA compositions. In related studies, the compositions and methods of the present invention effectively inhibit TNF-α expression in active monocytes derived from patients with RA. These results indicate that circulating antibodies / residual immunoreactivity, which mediates changes in cell phenotype and disease progression through the intercellular effects of the RNAi pathway on TNF-paths, and is characterized by current antibody therapies for RA / TNF-α complexes indicate that toxic effects are avoided. All tests here have shown that the doses of siNAs and polynucleotide delivery-enhancing polypeptides shown in these examples are always associated with cell viability at least 80-90% by minimizing the relevant toxic effects. .

실시예Example 12 : 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 합리적 설계를 최적화 12: Optimizing the Rational Design of Polynucleotide Delivery-Promoting Polypeptides

본 실시예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 최적화에 대한 대표적인 설계 및 데이터를 제공한다. 히스톤 H2B-유도된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 대하여 피검물의 합리적 설계 조작을 실시하였다.This example provides representative designs and data for the optimization of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention. Rational design manipulations of the specimens were performed on histone H2B-derived polynucleotide delivery-enhancing polypeptides.

표 20은 PN73의 결실 및 변형을 나타낸 것이다:Table 20 shows deletions and modifications of PN73:

Figure 112008025338980-PCT00024
Figure 112008025338980-PCT00024

표 20은 PN73 및 PN73-계열 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 합리적 설계의 최적화를 위해 발생시킨 그 유도체들의 일차 구조의 다이어그램을 제공한다. 각각의 펩티드 중 회색의 C-터미널은 펩티드의 소수성 영역을 나타내고 각각의 펩티드의 흑색 N-터미널은 친수성 영역을 나타낸다. 세포 내로 siRNA 전달을 유도하거나 향상시키는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 예인 모 펩티드 PN73은 맨 위에 도시되어 있다.Table 20 provides a diagram of the primary structure of its derivatives generated for optimization of the rational design of PN73 and PN73-based polynucleotide delivery-enhancing polypeptides. The gray C-terminal of each peptide represents the hydrophobic region of the peptide and the black N-terminal of each peptide represents the hydrophilic region. Parent peptide PN73, which is an example of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides that induce or enhance siRNA delivery into cells, is shown at the top.

이것과 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 기능-구조적 활성 관계를 더 잘 이해하기 위하여, PN73 및 다른 화학적 모이어티들간의 접합체들의 C- 및 N-터미널 기능 및 활성에 의하여 일차 구조 연구들을 실시하였다.To better understand this and other functional-structural activity relationships of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, primary structural studies were conducted by the C- and N-terminal function and activity of the conjugates between PN73 and other chemical moieties.

인간 히스톤 2B(H2B) 단백질에 대한 아미노산 서열은 이하 도시되어 있다. PN73, PN360 및 PN361은 하기에 괄호 안에 펩티드 명칭이 뒤따라와서 확인된 H2B의 펩티드 단편들 및 H2B의 부분이다. 하기에 나열된 PN360 및 PN361에 대한 아미노산 서열들은 PN73 내에서 발견되는 해당 아미노산 서열과 정렬되어 있다. PN73 펩티드 단편은 H2B 아미노산 서열 내에서 밑줄이 쳐져 있으며 13 내지 48의 H2B 아미노산들을 나타낸다. 이는 12 내지 48의 H2B 아미노산에 의해 제시될 수도 있다. PN360은 N-터미널을 PN73과 공유하지만 PN73의 C-터미널이 부족한 반면에 PN361은 PN73과 C-터미널을 공유하지만 PN73의 N-터미널이 부족하다. PN73 접합체는 단일 siRNA 가닥(예컨대, 센스 가닥)에 공유적으로 연결된 PN73이다. PN404는 모든 라이신들이 아르기닌들로 교체된 PN73의 버젼(version)이고 PN509는 N-터미널에서 페질화되는 페질화된 PN73(PEG 분자량 1 k Dalton) 유도체이다.The amino acid sequence for human histone 2B (H2B) protein is shown below. PN73, PN360 and PN361 are the peptide fragments of H2B and portions of H2B identified below followed by the peptide name in parentheses. The amino acid sequences for PN360 and PN361 listed below are aligned with the corresponding amino acid sequences found within PN73. PN73 peptide fragments are underlined in the H2B amino acid sequence and represent 13 to 48 H2B amino acids. It may be represented by H2B amino acids of 12 to 48. The PN360 shares the N-terminal with the PN73 but lacks the C-terminal of the PN73, while the PN361 shares the C-terminal with the PN73, but lacks the N-terminal of the PN73. The PN73 conjugate is PN73 covalently linked to a single siRNA strand (eg, sense strand). PN404 is a version of PN73 in which all lysines have been replaced with arginine and PN509 is a PEGylated PN73 (PEG molecular weight 1 k Dalton) derivative that is pegylated at the N-terminal.

H2BH2B (( 히스톤Histone 2B) 아미노산 서열 2B) amino acid sequence

MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSVYVYKVLKVMPEPAKSAPAPK KGSKKAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSVYVYKVLK V

HPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRLHPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRL

LLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK(서열 번호: 164)LLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK (SEQ ID NO: 164)

PN73PN73 (13-48)(13-48)

NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 59)NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 59)

PN360PN360 (13-35;  (13-35; PN73PN73 의 N-터미널)N-terminal)

NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-아미드(서열 번호: 57)NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-amide (SEQ ID NO: 57)

PN361PN361 (24-48;  (24-48; PN73PN73 의 C-터미널)C-terminal)

NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 58)NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 58)

PN73PN73 (13-48)- (13-48)- siRNAsiRNA (센스 가닥) 접합체(Sense strand) conjugate

siRNA-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호 59) siRNA -KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 59)

PN404PN404 (모든 라이신들이 아르기닌들로 교체된  (All lysine replaced with arginine PN73PN73 ))

NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-아미드(서열 번호: 91)NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-amide (SEQ ID NO: 91)

PN509PN509 ( ( 페질화된Pegylated PN73PN73 ))

PEG- RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-아미드(서열 번호: 90).PEG-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-amide (SEQ ID NO: 90).

도 6은 선행하는 PN73의 합리적으로 설계된 유도체 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 대한 쥐 꼬리 섬유아세포 세포들 내에서의 흡수 효능 및 생존도 연구들의 결과들을 제공한다. 쥐 꼬리 섬유아세포 세포들 내에서의 변형된 PN73의 활성 변화들을 도시하였다. PN404와 달리, PN509는 독성 증가 없이도 흡수를 증가시킨다. PN73의 N-터미널이 결실된 부분은 활성을 감소시키는 반면에, C-터미널 잔존물들을 제거하면 활성을 제거한다. PN73 및 PN509는 리포펙타민(Invitrogen, CA)보다 1차 세포들에서 더 높은 활성을 보인다.6 provides the results of uptake efficiency and viability studies in rat tail fibroblast cells for reasonably designed derivative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the preceding PN73. The activity changes of modified PN73 in mouse tail fibroblast cells are shown. Unlike PN404, PN509 increases absorption without increasing toxicity. The portion of the N-terminal deleted of PN73 decreases activity, while removing C-terminal residues removes activity. PN73 and PN509 show higher activity in primary cells than lipofectamine (Invitrogen, CA).

실시예Example 13 :  13: 아세틸화된Acetylated 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 혈장 내에서 안정성을 증가시킨다. Polynucleotide delivery-enhancing polypeptides increase stability in plasma.

본 실시예의 목적은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73을 변형하면 펩티드에 안정성을 증가시켜 결과적으로 그 형질감염 활성을 향상시키는지의 여부를 결정하는 것이었다. 세포질 내에서 PN73의 무변형 형태, N-터미널 페질화된 형태 및 N-터미널 아세틸화된 형태들의 안정성을 비교하였다. PN73의 C-터미널을 아미드화시킨다. 자외선 검출기에 결합된 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 혈장 내에서의 배양 이전과 이후에 PN73의 무변형 형태와 변형된 형태의 안정성을 특징화하였다.The purpose of this example was to determine whether modifying PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, would increase the stability of the peptide and consequently its transfection activity. The stability of the unmodified, N-terminal, penylated and N-terminal acetylated forms of PN73 in the cytoplasm was compared. Amidates the C-terminal of PN73. Size exclusion chromatography coupled to an ultraviolet detector was used to characterize the stability of the unmodified and modified forms of PN73 before and after incubation in plasma.

혈장이 부재하는 경우, PN73의 무변형 형태, 페질화된 형태 및 아세틸화된 형태는 약 9 분에서 상이하지만 중첩하는 UV 자취들을 보였다. 그러나, 세포질에 4 시간 동안 노출한 후에, 무변형 PN73 및 페질화된 PN73에 특이적인 UV 자취들은 더 이상 존재하지 아니하여 상당한 분해가 일어났음을 나타내고 있다. 이에 반하여, 아세틸화된 PN73에 대해 상이한 UV 자취가 남았는데, 이는 이러한 변형이 무변형 및 페질화된 PN73 형태들과 비교하여 플라스미드 내에서 PN73의 안정성이 상당히 증가 되었음을 나타내고 있다.In the absence of plasma, the unmodified, phenylated and acetylated forms of PN73 showed different but overlapping UV traces at about 9 minutes. However, after 4 hours of exposure to the cytoplasm, the UV traces specific for the unmodified PN73 and the petrified PN73 no longer exist, indicating that significant degradation has occurred. In contrast, different UV traces remained for acetylated PN73, indicating that this modification significantly increased the stability of PN73 in the plasmid compared to the unmodified and phenylated PN73 forms.

이러한 데이터는 세포질 내에서의 PN73 안정성이 PN73 펩티드의 N-터미널 아세틸화에 의하여 향상될 수 있다는 경이적인 발견을 보여준다. 아세틸화된 PN73 펩티드의 1차 구조는 다음과 같다:These data show a marvelous finding that PN73 stability in the cytoplasm can be enhanced by N-terminal acetylation of PN73 peptides. The primary structure of the acetylated PN73 peptide is as follows:

Ac-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드(서열 번호: 59)Ac-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (SEQ ID NO: 59)

실시예Example 14: 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 인터페론 반응을 유도하지 않는다. 14: Polynucleotide delivery-enhancing polypeptides do not induce an interferon response.

본 발명의 목적은 리포솜 시약 플러스 siRNA(liposomal reagent plus siRNA) 또는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73 펩티드 플러스 siRNA와 형질감염된 세포들의 인터페론 반응을 비교하는 것이었다. 인터페론 반응성은 ELISA(단백질) 및 bDNA(mRNA 수준들)에 의하여 시험되었다.It was an object of the present invention to compare the interferon response of transfected cells with liposome reagent plus siRNA (liposomal reagent plus siRNA) or PN73 peptide plus siRNA, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide. Interferon reactivity was tested by ELISA (protein) and bDNA (mRNA levels).

전통적으로, siRNA 분자들은 리포솜 매개성 형질감염에 의하여 세포들 내로 전달된다. 그러나, 이것은 일반적으로 낮은 전달 효율, 생체 내 염증 반응 및 세포 성장을 억제시킬 인터페론 유전자 발현의 상향조절이라는 결과로 나타난다. 역으로, 표적 유전자 발현 수준들에서의 제한된 감소가 있어서 siRNA를 유전자 발현 연구에 대한 비효율적인 처리 방법 및 도구가 되게 한다. PN73에 의한 siRNA의 전달은 이러한 문제점을 극복한다.Traditionally, siRNA molecules are delivered into cells by liposome mediated transfection. However, this generally results in low delivery efficiency, upregulation of interferon gene expression to inhibit inflammatory responses and cell growth in vivo. Conversely, there is a limited reduction in target gene expression levels, making siRNA an inefficient treatment method and tool for gene expression studies. Delivery of siRNA by PN73 overcomes this problem.

도 7은 몇몇 상이한 siRNA들의 PN73 펩티드 형질감염에 대하여 리포펙타민의 bDNA 시험법의 결과들을 제공한다. siRNA들은 리포펙타민이나 PN73과 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 200 nM의 농도로 복합된다. 인터루킨 1β(IL-1β)는 분자 표지로 작용하여 인터페론 반응성을 측정하였고 Qneg는 음성 대조군으로 사용되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 100 nM 또는 200 nM TNF-α9 siRNA와 복합된 리포펙타민은 IL-1β mRNA 수준들에서의 상당한 변화를 유발시켰다. 또한, 시험된 다른 모든 siRNA들은 IL-1β mRNA 수준들에서 완만한 증가를 유발시켰다. 이에 반하여, PN73 펩티드와 복합된 동일한 siRNA들은 IL-1β mRNA 수준들에서 증가를 유발하지 않았다.7 provides the results of the bDNA assay of lipofectamine for PN73 peptide transfection of several different siRNAs. siRNAs are complexed with lipofectamine or PN73 at concentrations of 1 nM, 10 nM, 100 nM or 200 nM. Interleukin 1β (IL-1β) served as a molecular label to measure interferon reactivity and Qneg was used as a negative control. As shown in FIG. 7, lipofectamine in combination with 100 nM or 200 nM TNF-α9 siRNA caused significant changes in IL-1β mRNA levels. In addition, all other siRNAs tested induced a gentle increase in IL-1β mRNA levels. In contrast, the same siRNAs complexed with PN73 peptide did not cause an increase in IL-1β mRNA levels.

리포펙타민 또는 PN73 형질감염중 어느 하나로 형질감염된 세포간에 관찰된 인터페론 반응성에서의 차이를 더 특성화하기 위하여, ELISA 시험법을 실시하여 하기의 분자 표지들의 단백질 표현 수준들을 측정하였다: 인터루킨 1β(IL-1β), 인터페론-α(INF-α), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-12(IL-12), MIP-1α, 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α). 표 21은 siRNA와 복합된 리포펙타민 또는 siRNA와 복합된 PN73과 형질감염된 세포들의 상대적 단백질 표현 수준들을 요약한 것이다.To further characterize the differences in interferon reactivity observed between cells transfected with either lipofectamine or PN73 transfection, ELISA assays were performed to determine protein expression levels of the following molecular markers: interleukin 1β (IL- 1β), interferon-α (INF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), interleukin-12 (IL-12), MIP-1α, interferon-γ (IFN-γ ) And tumor necrosis factor-α (TNF-α). Table 21 summarizes the relative protein expression levels of lipofectamine complexed with siRNA or cells transfected with PN73 complexed with siRNA.

표 21은 인터페론 반응성의 분자 표지들의 상대적 단백질 표현 수준들을 나타낸 것이다.Table 21 shows the relative protein expression levels of the molecular markers of interferon reactivity.

리포펙타민 형질감염Lipofectamine Transfection PN73 형질감염PN73 Transfection 인터페론 반응 표지Interferon reaction markers IFN-1 siRNA IFN-1 siRNA LC17 siRNA LC17 siRNA LC20 siRNA LC20 siRNA TNF-α9 siRNA TNF-α9 siRNA 모든 siRNA들에 대하여(IFN-1; LC17; LC20; TNF-α9)For all siRNAs (IFN-1; LC17; LC20; TNF-α9) IL-1βIL-1β ++++ -- -- ++ -- INF-αINF-α 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background IL-6IL-6 ++++ -- -- ++ -- IL-8IL-8 -- -- -- -- -- IL-12IL-12 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background MIP-1αMIP-1α ++++++ -- -- ++++ -- IFN-γIFN-γ 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background 백그라운드background TNF-αTNF-α ++ -- -- -- --

표 21에 제시된 바와 같이, siRNA LC20과 LC17은 어떠한 형질감염 시약의 사용여부와 관계없이 아무런 인터페론 반응을 보이지 않았다. 그러나, IFN-1 또는 TNF-α9을 리포펙타민으로 형질감염하면 IL-1β, IL-6, 및 MIP-1α 단백질 표현 수준들에서의 증가를 유발시켰다. 이에 반하여, 모든 시험된 siRNA들을 PN73으로 형질감염하면 시험된 인터페론 반응 표지들 중 임의의 것 중에서 단백질 표현이 눈에 띌만한 도입을 유발하지 않았다.As shown in Table 21, siRNA LC20 and LC17 showed no interferon response regardless of the use of any transfection reagent. However, transfection of IFN-1 or TNF-α9 with lipofectamine caused an increase in IL-1β, IL-6, and MIP-1α protein expression levels. In contrast, transfection of all tested siRNAs with PN73 did not result in a noticeable introduction of protein expression among any of the tested interferon response markers.

ELISA 시험법으로부터 얻은 이러한 데이터는 siRNA들의 PN73 매개성 형질감염이 인터페론 반응을 도출하지 않는다는 경이적인 발견을 보여준다.These data obtained from the ELISA assay show a marvelous finding that PN73 mediated transfection of siRNAs does not elicit an interferon response.

실시예Example 15 : 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드로  15: as polynucleotide delivery-enhancing polypeptide 접합된Spliced siRNAsiRNA 는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 복합된 Complexed with a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide siRNAsiRNA 보다 더 큰 넉 다운 활성을 제공한다Provides greater knock down activity

본 실시예의 목적은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73과 접합되거나 복합된 siRNA들인 LC13 및 LC20의 인간 단구세포들에서의 넉 다운 활성들을 비교하는 것이었다. 넉 다운 활성 측정에 이용된 방법들뿐만 아니라 인간 단구세포들의 분리 및 형질감염을 이전에 다루었다. Qneg는 무작위 siRNA 서열을 의미하고 이러한 실험들 내에서의 음성 대조군으로 작용한다. 관찰된 Qneg 넉 다운 활성을 100 %로 정규화하고(100 % 유전자 발현 수준들) LC20 및 LC13의 활성을 음성 대조군의 상대적 백분율로 제시한다. LC20 및 LC13은 인간 TNF-α 유전자에 대하여 표적되는 siRNA들이다. 도 8은 siRNA들인 LC20과 LC13가 PN73이 부재시(도 8-C) 또는 PN73과 복합시에(도 8-B) 또는 PN73과 접합시에(도 8-A)의 넉 다운 활성을 도시한다. LC20 및 LC13을 0 nM 내지 2.5 nM의 농도 범위에 걸쳐서 시험하였다. PN73을 복합 및 접합 실험들의 양쪽 모두에 1:1의 비율을 유지하였다.The purpose of this example was to compare knock down activities in human monocytes of LC13 and LC20, siRNAs conjugated or complexed with PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide. Isolation and transfection of human monocytes as well as the methods used to measure knock down activity have been previously addressed. Qneg means random siRNA sequence and acts as a negative control within these experiments. The observed Qneg knock down activity is normalized to 100% (100% gene expression levels) and the activity of LC20 and LC13 is presented as relative percentage of negative control. LC20 and LC13 are siRNAs targeted to the human TNF-α gene. 8 shows knock down activity of siRNAs LC20 and LC13 in the absence of PN73 (FIG. 8 -C) or in combination with PN73 (FIG. 8 -B) or in conjugation with PN73 (FIG. 8 -A). LC20 and LC13 were tested over a concentration range of 0 nM to 2.5 nM. PN73 was maintained at a ratio of 1: 1 for both complex and conjugation experiments.

예상한 바와 같이, PN73이 부재시에 LC13 및 LC20은 넉 다운 활성을 거의 보여주지 않았다(도 8-C). LC13 및 LC20 양쪽 모두는 PN73과 복합시에 Qneg 대조군에 대한 TNF-α 유전자 발현에서 약 15 % 및 30 %의 감소를 유발시켰다. 그러나, TNF-α에 대한 넉 다운 활성은 siRNA가 PN73과 접합할 경우에 60 % 미만으로 감소하였다. 이는 PN73/siRNA 복합체와 비교할 때 siRNA 넉 다운 활성의 상당한 증가이다. 따라서, 이러한 데이터는 siRNA가 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73과 접합될 경우에 siRNA 넉 다운 활성이 상당히 향상된다는 경이적인 발견을 보여준다.As expected, LC13 and LC20 showed little knock down activity in the absence of PN73 (FIG. 8 -C). Both LC13 and LC20 caused about 15% and 30% reduction in TNF-α gene expression for the Qneg control when combined with PN73. However, knock down activity against TNF-α decreased below 60% when siRNA conjugated with PN73. This is a significant increase in siRNA knock down activity compared to the PN73 / siRNA complex. Thus, these data show a surprising discovery that siRNA knock down activity is significantly improved when siRNA is conjugated with PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide.

실시예Example 16 : 콜레스테롤- 16: cholesterol- 향상성Improvement (( cholesterolcholesterol -- enhancedenhanced ) ) siRNAsiRNA 흡수의 혈청 억제는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 의하여  Serum inhibition of uptake is determined by polynucleotide delivery-enhancing polypeptides. 증가된다Is increased

본 실시예는 콜레스테롤 모이어티에 접합된 siRNA를 포함하는 전달 제형에 투과화 펩티드(permeabilizing peptide)를 첨가하면 투여 의존성 방식으로 콜레스테롤-siRNA 흡수에 미치는 혈청의 억제 효과들을 감소시킨다는 것을 실증한다. siRNA 흡수 분석을 위해, 세포들을 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리(부착된 세포들만)한 후에 유동 세포계측법으로 분석하였다. 상술한 바와 같이, siRNA 지정된 BA의 흡수를 또한 세포들 내에서의 Cy5 또는 FAM 형광의 세기에 의해 측정하였고 세포 생존도를 프로피디움 요오드화물 또는 AnnexinV-PE를 첨가하여 평가하였다. 형광 라벨된 siRNA의 막 삽입으로부터 세포 흡수를 구별짓기 위하여, 트립판 블루(trypan blue)를 사용하여 세포막 표면상의 형광을 퀀칭하였다(quench).This example demonstrates that the addition of permeabilizing peptides to delivery formulations comprising siRNA conjugated to cholesterol moieties reduces the inhibitory effects of serum on cholesterol-siRNA uptake in a dose dependent manner. For siRNA uptake assays, cells were washed with PBS, treated with trypsin (attached cells only) and analyzed by flow cytometry. As mentioned above, uptake of siRNA designated BA was also measured by the intensity of Cy5 or FAM fluorescence in cells and cell viability was assessed by the addition of propidium iodide or AnnexinV-PE. To distinguish cell uptake from membrane insertion of fluorescently labeled siRNAs, trypan blue was used to quench fluorescence on the cell membrane surface.

표 22는 PN73 매개성 형질감염은 평균 형광 세기(MFI)에 의하여 시험된 콜레스테롤 접합된 siRNA 세포 흡수의 혈청 유도성 억제를 구제하는(rescue) 것을 나타낸 것이다: Table 22 shows that PN73 mediated transfection rescues serum inducible inhibition of cholesterol conjugated siRNA cell uptake tested by mean fluorescence intensity (MFI):

퍼센트 혈청 Percent serum 콜레스테롤 siRNA 단독 (MFI)Cholesterol siRNA alone (MFI) 20 μM PN73과 미접합 siRNA (MFI) 20 μM PN73 and unconjugated siRNA (MFI) 00 24.824.8 32.932.9 5 %5% 1.551.55 11.511.5 10 %10% 1.341.34 6.396.39 20 %20% 1.191.19 5.855.85

표 22의 데이터는 본 발명에 따른 콜레스테롤 모이어티에 접합된 siRNA의 세포 흡수를 상당히 감소시킨다. 그러나, 미접합 siRNA 세포 흡수는 대표적인 전달-증진 펩티드인 PN73의 존재하에 증가 되었다.The data in Table 22 significantly reduces the cellular uptake of siRNA conjugated to the cholesterol moiety according to the present invention. However, unconjugated siRNA cell uptake was increased in the presence of PN73, a representative delivery-enhancing peptide.

본 발명에 따라서 투과화 펩티드 전달 향상제인 PN73과 복합된 콜레스테롤-접합된 siRNA(콜레스테롤 siRNA+PN73)의 세포 흡수와 PN73과 복합된 미접합(unconjugated) siRNA의 세포 흡수의 비교 실험을 실시하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 미접합 siRNA 또는 콜레스테롤-접합된 siRNA 중 어느 하나와 PN73의 고농도에서 동등한 세포 흡수 활성을 달성할 수 있다. 이와 그 관련된 흡수 시험법들을 위하여, 콜레스테롤-접합된 siRNA 및 siRNA/PN73 복합체를 상술한 바와 같이 고정되거나 다른 농도(들)로 첨가된 혈청과 함께 Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00025
배지(Invitrogen) 내에서 쥐 꼬리 섬유아세포(MTF) 세포들 내로 형질감염시켰다. 콜레스테롤 및 복합체 양쪽 모두에 대한 siRNA의 최종 농도는 0.2 μM이었다. 흡수 효율 및 평균 형광 세피를 유동 세포계측법에 의해 평가하였다.According to the present invention, comparative experiments were performed on the cellular uptake of cholesterol-conjugated siRNA (cholesterol siRNA + PN73) complexed with PN73, a permeation peptide delivery enhancer, and the cellular uptake of unconjugated siRNA complexed with PN73. As shown in FIG. 9, equivalent cellular uptake activity can be achieved at high concentrations of PN73 with either unconjugated siRNA or cholesterol-conjugated siRNA. For this related absorption assay, Opti-MEM with cholesterol-conjugated siRNA and siRNA / PN73 complexes with serum added at fixed or different concentration (s) as described above
Figure 112008025338980-PCT00025
Transfection was performed into mouse tail fibroblast (MTF) cells in medium (Invitrogen). The final concentration of siRNA for both cholesterol and complexes was 0.2 μΜ. Uptake efficiency and mean fluorescence caps were assessed by flow cytometry.

콜레스테롤 접합된 siRNA의 세포 흡수의 혈청 억제를 구제하는 PN73 및 추가적으로 PN250의 능력을 쥐 꼬리 섬유아세포(MTF) 세포들 내에서 더 특징화하였다.The ability of PN73 and additionally PN250 to rescue serum inhibition of cellular uptake of cholesterol conjugated siRNA was further characterized in rat tail fibroblast (MTF) cells.

도 10은 우태 혈청(FBS)의 농도 증가가 siRNA 세포 흡수에 미치는 효과를 도시한다. PN73 또는 PN250이 부재시에, 콜레스테롤 접합된 siRNA의 세포 흡수는 5 % FBS에서 극적으로 감소하였다. 그러나, 40 μM PN73 또는 80 μM PN250 중 어느 하나가 존재하면, siRNA 흡수는 증가한다.10 shows the effect of increasing concentrations of fetal bovine serum (FBS) on siRNA cell uptake. In the absence of PN73 or PN250, cellular uptake of cholesterol conjugated siRNA was dramatically reduced in 5% FBS. However, if either 40 μM PN73 or 80 μM PN250 is present, siRNA uptake is increased.

선행 데이터(표 22 및 도 10)는 siRNA들의 콜레스테롤-접합은 그 세포 흡수를 상당히 향상시킬 수 있음을 실증한다. 그러나, 접합된 siRNA들은 혈청의 존재에 의하여 실질적으로 감소되거나 심지어 제거될 수 있다. 이는 표적 세포들로 들어가려는 콜레스테롤-접합 siRNA들의 능력을 억제하는 혈청 단백질들과 콜레스테롤 모이어티의 접합에 기인한 것이다. 그러나, 투과화 펩티드들인 PN73 및 PN250에 의해 예시된 바와 같이 전달 향상제가 존재하는 경우, 세포 흡수의 혈청 억제는 구제될 수 있다. 더 특이적으로는, 콜레스테롤 모이어티에 접합된 siRNA를 포함하는 전달 제형에 투과화 펩티드를 첨가하면 투여 의존성 방식으로 콜레스테롤-siRNA 흡수에 미치는 혈청의 억제 효과를 감소하게 된다.The preceding data (Table 22 and FIG. 10) demonstrate that cholesterol-conjugation of siRNAs can significantly improve their cellular uptake. However, conjugated siRNAs can be substantially reduced or even eliminated by the presence of serum. This is due to the conjugation of cholesterol moieties with serum proteins that inhibit the ability of cholesterol-conjugated siRNAs to enter target cells. However, if a delivery enhancer is present as exemplified by the permeation peptides PN73 and PN250, serum inhibition of cell uptake can be rescued. More specifically, the addition of permeable peptides to delivery formulations comprising siRNA conjugated to cholesterol moieties reduces the inhibitory effect of serum on cholesterol-siRNA uptake in a dose dependent manner.

실시예Example 17 : 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 결실 분석 17: Deletion Analysis of Representative Polynucleotide Delivery-Promoting Polypeptides

본 실시예는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 siRNA 세포-흡수 및 siRNA 매개성 표적 유전자 넉 다운 활성을 최적화하기 위하여 사용된 실험 설계를 도시한다.This example depicts the experimental design used to optimize siRNA cell-uptake and siRNA mediated target gene knock down activity of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide.

하기 표 23은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73 및 그것의 절단된 유도체들을 보여준다. 하기에 수록된 PN360 및 PN361의 아미노산 서열들을 PN73의 해당 아미노산 서열과 정렬시킨다. PN360은 PN73과 N-터미널을 공유하지만 PN73의 C-터미널이 부족한 반면에, PN361은 PN73과 C-터미널을 공유하지만 PN73의 N-터미널이 부족하다. PN766은 PN73의 15 개 C-터미널 아미노산들을 나타낸다. PN73, PN360, PN766은 C-터미널 FITC(플루오르세인-5-아이소타이오인산염(fluorescein-5-isothiocyanate)(즉, -GK[EPSILON]G-아미드)로 꼬리표를 달지 않았다. 표 23은 PN768을 제외하고 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN73의 N-터미널로부터 한번에 3 개의 잔기들을 순차적으로 결실시켜 발생되는 11 개의 절단된 형태들을 더 보여준다. 상기 펩티드를 포함하는 세포들이 형광 현미경법으로 검출되고/되거나 유동 세포계측법으로 정렬되도록 이러한 모든 펩티드들을 C-터미널 FITC(플루오르세인-5-아이소타이오사이안산염) 라벨(즉, -GK[EPSILON]G-아미드)로 꼬리를 달았다. PN766 및 PN708은 동일한 아미노산 서열을 가지지만 PN708은 C-터미널 FITC 꼬리표를 가진다는 점에서 차이가 있다는 점이 중요하다. 하기는 형질감염 활성을 위해 조사될 PN73 및 절단된 형태들의 일차 구조를 설명한 것이다.Table 23 below shows PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, and truncated derivatives thereof. The amino acid sequences of PN360 and PN361 listed below are aligned with the corresponding amino acid sequences of PN73. The PN360 shares the N-terminal with the PN73 but lacks the C-terminal of the PN73, while the PN361 shares the C-terminal with the PN73 but lacks the N-terminal of the PN73. PN766 represents the 15 C-terminal amino acids of PN73. PN73, PN360, and PN766 were not tagged with the C-terminal FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) (i.e., -GK [EPSILON] G-amide). Table 23 shows PN768. Except for 11 truncated forms resulting from the sequential deletion of three residues at a time from the N-terminal of the representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN73. Cells containing the peptide are detected by fluorescence microscopy and / or All these peptides were tailed with C-terminal FITC (Fluorocein-5-isothiocyanate) labels (ie -GK [EPSILON] G-amides) to align by flow cytometry PN766 and PN708 are identical amino acids It is important to note that although it has a sequence, PN708 differs in that it has a C-terminal FITC tag.The following is the primary of the PN73 and truncated forms to be investigated for transfection activity. The structure is described.

표 23은 PN73 결실 계열들을 나타낸 것이다:Table 23 shows the PN73 deletion sequences:

C-터미널 라벨(label) C-terminal label 펩티드 ID# Peptide ID # SEQ ID NO:SEQ ID NO: 아미노산 서열  Amino acid sequence 없음  none PN73PN73 5959 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide PN360PN360 5757 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-아미드KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-amide PN361PN361 5858 KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드           KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide PN766 (PN708)PN766 (PN708) 97 97 RKESYSVYVYKVLKQ-아미드                      RKESYSVYVYKVLKQ-amide FITC(플루 오르세인-5- 아이소타이 안산염 -GK[EPSILON]-아미드    FITC (Fluorcene-5-isotai phosphate -GK [EPSILON] -amide PN690 (PN73)PN690 (PN73) 98 98 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN661PN661 9999 KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN685PN685 100100 VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드   VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN660PN660 101101 AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드      AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN735PN735 165165 KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드         KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN655PN655 166166 KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드            KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN654PN654 167167 KRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드               KRSRKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN708PN708 168168 RKESYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드                  RKESYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN653PN653 169169 SYSVYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드                     SYSVYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN652PN652 170170 VYVYKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드                        VYVYKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN651PN651 171171 YKVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드                           YKVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide PN768PN768 172172 KVLKQ-GK[EPSILON-5CFG-아미드                            KVLKQ-GK [EPSILON-5CFG-amide

실시예Example 18 : 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 결실 분석 18: Deletion analysis of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 기능적 도메인들은 세포들 내로 siRNA들을 효과적으로 전달하는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 능력에 중요하다. 이러한 기능적 도메인들은 막 부착, 유전자 융합성 및 뉴클레오티드 결합 영역들을 포함한다. 상기 펩티드의 막 부착 및 유전자 융합성 도메인들은 기계적으로 밀접하게 연결되어 있어서(즉, 세포로 들어가는 펩티드의 능력) 실험적으로 구별 짓기 어려울 수 있다. 그러므로, 이러한 두 가지 성질들(상기 펩티드의 도메인들)을 단일 분석에 결합시킬 것이다. 마지막으로, 뉴클레오티드 결합은 뉴클레오티드들을 결합하는 펩티드의 능력을 설명한다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 상술한 도메인들의 각각을 정의하기 위하여 취한 접근법들을 하기에 더 자세히 다룬다. 표 24는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN73의 막 부착/유전자 융합성 및 뉴클레오티드 결합 도메인들을 정의하는 데이터를 요약한 것이다(시험된 모든 농도들에 대한 데이터는 주어지지 않음).The functional domains of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, are important for the ability of polynucleotide delivery-enhancing polypeptides to effectively deliver siRNAs into cells. Such functional domains include membrane adhesion, gene fusion and nucleotide binding regions. The membrane adhesion and gene fusion domains of the peptide may be mechanically intimately connected (ie, the peptide's ability to enter the cell) and may be difficult to distinguish experimentally. Therefore, these two properties (domains of the peptide) will be combined in a single assay. Finally, nucleotide binding describes the peptide's ability to bind nucleotides. The approaches taken to define each of the aforementioned domains of a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide are discussed in more detail below. Table 24 summarizes the data defining membrane adhesion / gene fusion and nucleotide binding domains of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN73 (data for all concentrations tested are not given).

하기 표 24는 PN73 펩티드 결실 계열들의 기능적 도메인 분석을 요약한 것이다:Table 24 below summarizes the functional domain analysis of PN73 peptide deletion series:

C-터미널 라벨C-terminal label 펩티드 IC#Peptide IC # % 펩티드 세포- 흡수율% Peptide cell-uptake rate 펩티드 FITC MFIPeptide FITC MFI % siRNA 세포- 흡수율% siRNA cell-uptake rate siRNA Cy5 MFIsiRNA Cy5 MFI 넉 다운 활성Knock-down active 없음  none PN73PN73 N/AN / A N/AN / A 98 %(10 μM) 98 % (10 μM) 13(10 μM) 13 (10 μM) ++ PN360PN360 N/AN / A N/AN / A 0 % 0 % NTNT NTNT PN361PN361 N/AN / A N/AN / A 55 %(20 μM) 55 % (20 μM) NTNT NTNT FITC (플루오르 세인-5-이소티오시아네이트) 라벨 (즉,-GK[EPSILON]G-아미드)    FITC (Fluorocein-5-isothiocyanate) label (ie -GK [EPSILON] G-amide) PN690 (PN73)PN690 (PN73) 100 %(10 μM) 100% (10 μM) 125(10 μM) 125 (10 μM) 58 %(2.5 μM) 58% (2.5 μM) 50(10 μM) 50 (10 μM) + + PN661PN661 100 %(10 μM100% (10 μM 128(10 μM)128 (10 μM) 49 %(2.5 μM)49% (2.5 μM) 59(10 μM)59 (10 μM) NTNT PN685PN685 100 % (2.5 μM)100% (2.5 μM) 151(10 μM)151 (10 μM) 24 %(2.5 μM)24% (2.5 μM) 61(10 μM)61 (10 μM) NTNT PN660PN660 100 %(10 μM)100% (10 μM) 121(10 μM)121 (10 μM) 41 %(2.5 μM)41% (2.5 μM) 68(10 μM)68 (10 μM) ++ PN735PN735 100 %(10 μM)100% (10 μM) 82(10 μM)82 (10 μM) 13 %(2.5 μM)13% (2.5 μM) 38(10 μM)38 (10 μM) -- PN655PN655 100 %(10 μM)100% (10 μM) 63(10 μM)63 (10 μM) 14 %(10 μM)14% (10 μM) 44(10 μM)44 (10 μM) NTNT PN654PN654 95 %(10 μM)95% (10 μM) 10(10 μM)10 (10 μM) 27 %(10 μM)27% (10 μM) 14(10 μM)14 (10 μM) ±± PN708PN708 97 %(10 μM)97% (10 μM) 10(10 μM)10 (10 μM) 42 %(10 μM)42% (10 μM) 34(10 μM)34 (10 μM) ++ PN653PN653 95 %(10 μM)95% (10 μM) 8(10 μM)8 (10 μM) 1.7 %(10 μM)1.7% (10 μM) 4(10 μM)4 (10 μM) -- PN652PN652 86 %(10 μM)86% (10 μM) 5(10 μM)5 (10 μM) 1.8 %(10 μM)1.8% (10 μM) 5(10 μM)5 (10 μM) NTNT PN651PN651 90 %(10 μM)90% (10 μM) 5(10 μM)5 (10 μM) 0 %0 % 3(0.65 μM)3 (0.65 μM) NTNT PN768PN768 91 %(50 μM)91% (50 μM) 9(50 μM)9 (50 μM) NTNT NTNT NTNT

NT = 시험하지 않음; 괄호 안의 펩티드 농도들은 %로 주어진 흡수 또는 상대 수치들로 주어진 MFI를 달성한 농도들이다.NT = not tested; Peptide concentrations in parentheses are concentrations that achieve MFI given absorption or relative values given in%.

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 막 부착 및 유전자 Membrane Attachment and Genes of Representative Polynucleotide Delivery-Promoting Polypeptides 융합성Convergence 도메인: domain:

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN73의 전체 및 절단된 형태들의 세포로 들어가는 효율을 원발성 쥐꼬리 섬유아세포(MTF) 세포들로 세포-흡수 시험법에 의하여 생체 외에서 시험하였다. 배지 내에서 FITC-라벨된 펩티드를 받아들이는 세포들의 숫자를 유동 세포계측법으로 측정하였다. 퍼센트 펩티드 세포-흡수를 배지 내에 존재하는 세포들의 총 숫자에 대하여 표현하였다. 또한, 평균 형광 세기(MFI)를 사용하여 세포들 내에서 발견되는 FITC-라벨된 펩티드의 수량을 측정하였다. MFI는 세포 내에서 FITC-라벨된 펩티드의 수량과 직접 비례한다: 더 높은 상대적 MFI 수치는 세포간 FITC-라벨된 펩티드들의 더 많은 수량과 비례한다. 표 23의 펩티드들을 0.63 μM, 2.5 μM 및 10 μM 농도들에서 평가하였다; PN768을 2 μM, 10 μM 및 50 μM에서 시험하였다.The efficiency of entry into the cells of whole and truncated forms of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN73 was tested in vitro by cell-absorption assays with primary rat tail fibroblast (MTF) cells. The number of cells that received FITC-labeled peptides in the medium was measured by flow cytometry. Percent peptide cell-uptake was expressed relative to the total number of cells present in the medium. In addition, mean fluorescence intensity (MFI) was used to determine the quantity of FITC-labeled peptide found in the cells. MFI is directly proportional to the quantity of FITC-labeled peptides in the cell: higher relative MFI values are proportional to the higher quantity of intercellular FITC-labeled peptides. The peptides in Table 23 were evaluated at 0.63 μM, 2.5 μM and 10 μM concentrations; PN768 was tested at 2 μM, 10 μM and 50 μM.

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73을 형질감염하기 전 날에 세포들에 노출시켰다. FITC-꼬리를 단 펩티드들을 상온에서 약 5 분 동안 Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00026
배지(Invitrogen) 내에서 희석시켰다. 세포들을 3 시간 동안 형질감염시키며, PBS로 세척하며 트립신으로 처리한 이후에 유동 세포계측법으로 분석하였다. 세포 생존도를 상술한 바와 같이 측정하였다. 트립판 블루를 사용하여 세포 흡수를 막 삽입과 구별하여 세포막 표면상의 임의의 형광을 퀀칭하였다.PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, was exposed to cells the day before transfection. Opti-MEM for 5 minutes at room temperature with FITC-tailed peptides
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Dilution in medium (Invitrogen). Cells were transfected for 3 hours, washed with PBS and treated with trypsin followed by flow cytometry. Cell viability was measured as described above. Trypan blue was used to quench any fluorescence on the cell membrane surface to distinguish cell uptake from membrane insertion.

세포-흡수 시험을 위하여, 전체 FITC-라벨된 PN73 펩티드(PN690)은 모든 시험된 농도들에서 거의 100 % 세포 흡수를 달성하였다(표 24 칼럼에서 보이는 10 μM 결과들은 "% 펩티드 세포-흡수"로 칭한다). 50 μM를 필요로 했던 PN768을 제외하고는 남아있는 PN73의 절단된 형태들은 10 μM 농도에서 PN690의 퍼센트 세포 흡수에 필적하는 퍼센트 세포 흡수(괄호 안에 수치)를 달성하였는데, 이는 세포 내로 들어가는 펩티드의 능력에 대하여 PN73의 N-터미널 잔기들 필요로 하지 않는다는 것을 의미한다. PN768로 확인된 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 5 개 C-터미널 잔기들은 펩티드 세포-흡수에 충분하다. 그러나, 표 24에 도시되지 않은 0.63 μM인 PN73의 절단된 형태들은 펩티드의 길이에 비례하여 세포 흡수 활성에서 증가를 보였다. 달리 말해서, 0.63 0 μM 농도에서 시험된 펩티드들을 전체적으로 관찰하면 PN73 펩티드의 길이가 감소함에 따라, 그 세포 흡수 활성은 감소하였는데 이는 펩티드 세포-흡수 활성은 투여 의존성이라는 것을 나타낸다.For the cell-absorption test, the entire FITC-labeled PN73 peptide (PN690) achieved nearly 100% cell uptake at all tested concentrations (10 μM results shown in Table 24 column were shown as “% peptide cell-uptake”). Is called). Except for PN768, which required 50 μM, the remaining truncated forms of PN73 achieved a percent cell uptake (value in parentheses) comparable to the percent cell uptake of PN690 at 10 μM concentration, indicating the peptide's ability to enter the cell. It does not require the N-terminal residues of PN73. The five C-terminal residues of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide identified as PN768, are sufficient for peptide cell-absorption. However, truncated forms of PN73, 0.63 μM, not shown in Table 24, showed an increase in cell uptake activity in proportion to the length of the peptide. In other words, overall observation of the peptides tested at a concentration of 0.63 0 μM decreased the cell uptake activity as the length of the PN73 peptide decreased, indicating that the peptide cell-uptake activity is dose dependent.

이러한 결과들은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 모든 전달된 형태들이 세포들의 높은 퍼센트가 배지 내로 들어가는 능력을 유지한다는 것을 보여 주었다.These results showed that all delivered forms of the representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide retained the ability for a high percentage of cells to enter the medium.

세포-흡수 시험법이 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 절단된 형태가 필적할 만한 세포-흡수 활성들을 가졌다는 것을 보여준 반면에, MFI 측정은 PN73 펩티드의 절단된 형태들이 세포들로 들어가는 FITC-라벨된 펩티드의 평균 수량에 근거하여 구별가능하다는 것을 나타내었다. 표 24의 "펩티드 FITC MIF"로 명명된 칼럼 내에서 보인 바와 같이, 전체 FITC-라벨된 PN73 펩티드(PN690)은 약 125 유니트들에서 가장 높은 MFI를 달성한 10 μM의 MFI 내에서 투여-의존성 증가를 보였다. PN661, PN685 및 PN660은 전체 PN73(PN690)의 수준에 필적할 만한 MFI 수준들을 가졌다. 그러나, PN735 및 PN655는 각각 약 80 MFI 유니트들 및 60 MFI 유니트들의 MFI 수준들로 감소시켰다. 그리고, PN654, PN708, PN653, PN652, PN651 및 PN768에서 MFI 검출성(detectability)의 상당한 감소를 관찰하였는데, 이는 PN73의 18 N-터미널 잔기들이 결실될 때에 세포들에 의에 펩티드를 효과적으로 흡수하지 못함을 의미한다.While cell-absorption assays showed that the truncated form of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, had comparable cell-absorbing activities, MFI measurements showed that the truncated forms of PN73 peptide enter the cells. -Distinguishable based on average quantity of labeled peptides. As shown in the column named “Peptide FITC MIF” in Table 24, the total FITC-labeled PN73 peptide (PN690) increased dose-dependently within 10 μM of MFI, which achieved the highest MFI in about 125 units. Showed. The PN661, PN685 and PN660 had MFI levels comparable to those of the overall PN73 (PN690). However, PN735 and PN655 reduced to MFI levels of about 80 MFI units and 60 MFI units, respectively. We also observed a significant decrease in MFI detectability at PN654, PN708, PN653, PN652, PN651, and PN768, which do not effectively absorb peptides into cells when the 18 N-terminal residues of PN73 are deleted. Means.

이러한 결과들은 PN73의 모든 절단된 형태들이 세포들을 높은 비율로 배양할 수 있으며 특이적으로 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 제 1의 18 N-터미널 잔기들은 배양중인 세포들에 의한 펩티드의 효과적인 흡수에 필수적이라는 것을 보여주었다.These results indicate that all truncated forms of PN73 can culture cells at a high rate and the first 18 N-terminal residues of PN73, which is a particularly representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, are effective for peptides by the cells in culture. It was shown to be essential for absorption.

요약하자면, 펩티드 세포 흡수 데이터는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 C-터미널 5 개 잔기들이 세포 입수(entry)에 충분하다는 것을 보여주었는데 이는 펩티드의 막 부착/유전자 융합성 도메인이 C-터미널 내에 위치한다는 것을 나타낸다. 그러나, 펩티드 FITC MFI 데이터는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 N-터미널 18 개 잔기들을 제거하면 펩티드가 세포들로 들어가는 효율을 제한하게 되는데, 이는 펩티드의 N-터미널이 막 부착/유전자 융합성 도메인의 효율적인 흡수 특성에 필요하다는 것을 나타낸다.In summary, peptide cell uptake data showed that the five C-terminal residues of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, were sufficient for cell entry, suggesting that the peptide adhesion / gene fusion domain of the peptide is C-terminal. It is located within. However, peptide FITC MFI data removes the N-terminal 18 residues of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, limiting the efficiency of peptide entry into cells, which means that the N-terminal of the peptide is membrane attachment / gene fusion. It is necessary for the efficient absorption properties of the sex domain.

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 뉴클레오티드 결합 도메인:Nucleotide binding domains of a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide:

결실 계열(deletion series)에서의 siRNA를 복합하며 원발성(primary) MTF 세포들로 전달하는 각각의 펩티드의 능력을 세포-흡수 시험법과 MFI에 의하여 측정하였다. 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 뉴클레오티드 결합 도메인(들)을 결실 계열에서의 다른 펩티드들의 siRNA 세포-흡수의 상대적 수량을 비교하여 특성화하였다. 펩티드들은 뉴클레오티드 결합 영역의 존재와 연관되는 높은 백분율의 siRNA 세포-흡수(40 % 이상)를 보였다. 낮은 백분율의 siRNA 세포 흡수(30 % 미만)는 뉴클레오티드 결합 도메인(들)의 존재를 반영하였다.The ability of each peptide to combine siRNAs in the deletion series and deliver them to primary MTF cells was measured by cell-absorption assay and MFI. The nucleotide binding domain (s) of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, was characterized by comparing the relative quantities of siRNA cell-uptake of other peptides in the deletion sequence. Peptides showed a high percentage of siRNA cell-absorption (> 40%) associated with the presence of nucleotide binding regions. Low percentages of siRNA cell uptake (less than 30%) reflected the presence of nucleotide binding domain (s).

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 전체 및 절단된 형태들을 시험하기 위하여, 상술한 바와 같이 Cy5- 또는 FAM_접합 siRNA 및 펩티드들로 MTF 세포들을 처리하였다. 세척한 후에, 세포들을 트립신으로 처리하였고 이후 유동 세포계측법으로 분석하였다. siRNA의 세포간 흡수를 세포간 Cy5 형광의 세기로 측정하였다; 트리판 블루를 사용하여 세포막 표면상의 임의의 형광을 퀀칭하였다. 흡수는 세포들의 총 숫자에 비례하여 표현된다.To test the entire and truncated forms of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, MTF cells were treated with Cy5- or FAM_conjugated siRNAs and peptides as described above. After washing, cells were treated with trypsin and then analyzed by flow cytometry. Intercellular uptake of siRNA was measured by the intensity of intracellular Cy5 fluorescence; Trypan blue was used to quench any fluorescence on the cell membrane surface. Uptake is expressed in proportion to the total number of cells.

표 24는 0.5 μM Cy-5 접합된 siRNA로 펩티드의 siRNA 세포-흡수 퍼센트의 결과를 보여준다. 비-FITC 라벨된 PN73(PN643) 펩티드는 거의 100 %인 siRNA 흡수를 10 μM 농도에서 달성하였다(데이터 미도시). 그러나, PN73 펩티드가 FITC 꼬리(PN690)으로 라벨될 경우, 2.5 μM에서 관찰된 최대 세포-흡수 활성은 약 60 %로 감소하였는데, 이는 FITC 라벨을 첨가하면 펩티드의 세포-흡수 기능을 방해하는 것을 의미한다. 따라서, 본 시험법에서 각각의 펩티드에 대한 관찰된 세포-흡수 활성은 펩티드의 진정한 siRNA 세포-흡수 활성을 반영할 수 없는 것으로 보인다. 그럼에도, PN661로 제시되는 바와 같이 PN73(PN690)의 3 개의 가장 N-터미널 잔기들을 제거하는 경우에 siRNA 세포-흡수 활성에 경미한 감소를 관찰하였다. 유사하게는, PN660과 PN708 양쪽 모두 전체 PN73(PN690)과 비교하여 siRNA 세포-흡수 활성에서 어느 정도의 감소가 있었다.Table 24 shows the results of the siRNA cell-absorption percentages of peptides with 0.5 μM Cy-5 conjugated siRNA. Non-FITC labeled PN73 (PN643) peptides achieved nearly 100% siRNA uptake at 10 μM concentration (data not shown). However, when the PN73 peptide was labeled with the FITC tail (PN690), the maximum cell-absorbing activity observed at 2.5 μM was reduced to about 60%, meaning that addition of the FITC label interfered with the cell-absorbing function of the peptide. do. Thus, the observed cell-absorbing activity for each peptide in this assay does not appear to reflect the true siRNA cell-absorbing activity of the peptide. Nevertheless, a slight reduction in siRNA cell-absorbing activity was observed when removing the three most N-terminal residues of PN73 (PN690) as shown by PN661. Similarly, both PN660 and PN708 had some reduction in siRNA cell-absorbing activity compared to overall PN73 (PN690).

이러한 데이터는 PN661, PN660 및 PN708을 포함하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들이 핵산들을 결합한다는 것을 보여준다. 이에 반하여, PN685, PN735, PN655 및 PN654에서는 siRNA 흡수 활성에 감소를 관찰하였다. PN653, PN652 또는 PN651에서는 상당한 siRNA 흡수 활성을 관찰할 수 없었는데, 이는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 C-터미널 12 개 아미노산들(H2B 단백질의 37-48 잔기들)은 뉴클레오티드 결합 도메인을 포함하지 않음을 나타낸다. 또한, PN661, PN660 및 PN708 펩티드들이 전체 펩티드(PN690)의 3 개 잔기 결실들을 포함하지만 추론된 siRNA 결합 활성을 유지한다. 이러한 데이터는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 내에 존재하는 뉴클레오티드 결합 도메인의 핵산과 결합하는 능력이 N-터미널 내의 특이적인 잔기들의 존재에 민감하다는 것을 의미한다.These data show that the polynucleotide delivery-promoting polypeptides of the invention, including PN661, PN660 and PN708, bind nucleic acids. In contrast, a decrease in siRNA uptake activity was observed in PN685, PN735, PN655 and PN654. No significant siRNA uptake activity could be observed in PN653, PN652 or PN651, which indicates that the C-terminal 12 amino acids (37-48 residues of H2B protein) of a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide do not contain a nucleotide binding domain. Indicates. In addition, PN661, PN660 and PN708 peptides contain three residue deletions of the entire peptide (PN690) but retain the deduced siRNA binding activity. These data mean that the ability to bind the nucleic acid of the nucleotide binding domain present in a representative polynucleotide transfer-enhancing polypeptide is sensitive to the presence of specific residues in the N-terminal.

일반적으로, 이러한 데이터는 PN73 결실 계열의 siRNA 세포-흡수 활성이 PN708(잔기 34-48)이 siRNA 세포-흡수 활성에 필요한 PN73 펩티드의 최소 C-터미널 단편을 대표한다는 것을 의미한다. 이는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 뉴클레오티드 결합 도메인이 제 1의 24 N-터미널 잔기들 내에 위치한다는 사실과 일치한다.In general, these data mean that siRNA cell-absorbing activity of the PN73 deletion family represents that PN708 (residues 34-48) represents the minimum C-terminal fragment of PN73 peptide required for siRNA cell-absorbing activity. This is consistent with the fact that the nucleotide binding domain of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, is located within the first 24 N-terminal residues.

세포들 내로 들어가는 Cy5-접합성 siRNA의 상대적 평균 수량을 결정하는 MFI에 의하여 세포들 내로 siRNA들을 형질감염시키는 능력에 대하여 PN73 펩티드 결실 계열들을 더 특성화한다. 전-길이 FITC-라벨된 PN73 펩티드(PN690)에 의한 Cy5-접합성 siRNA의 전달은 약 50 개의 상대적 유니트들의 MFI를 달성하였다. PN73 결실 계열의 펩티드들인 PN735, PN655, PN654 및 PN708은 약 34 유니트에서 44 유니트들에 이르는 감소된 MFI를 보였다. PN73 결실 계열의 PN661, PN685 및 PN660은 전-길이 PN73(PN690) 펩티드의 MFI 수준들 보다 약간 초과한 MFI 수준들을 가졌다. 이에 반하여, PN654, PN653, PN652 및 PN651는 MFI를 상대적으로 거의 없거나(3-14 유니트들) 가지지 않았는데, 이는 Cy5-접합성 siRNA가 이러한 펩티드들과 형질감염 한 후에 세포들로 들어가는 나타낸다. PN653, PN652 및 PN651로 관찰된 낮은 MFI 수치들은 PN654, PN653, PN652 및 PN651은 siRNA와 복합되지 않거나 siRNA가 세포들로의 입수를 용이하게 하지 않는다는 것을 보여주었던 siRNA 세포-흡수 데이터와 관련되어 있었다.The PN73 peptide deletion series are further characterized for their ability to transfect siRNAs into cells by MFI, which determines the relative average quantity of Cy5-conjugated siRNA entering into the cells. Delivery of Cy5-conjugated siRNA by full-length FITC-labeled PN73 peptide (PN690) achieved about 50 relative units of MFI. PN73-deleted peptides, PN735, PN655, PN654 and PN708, exhibited reduced MFI ranging from about 34 units to 44 units. PN661, PN685 and PN660 of the PN73 deletion family had MFI levels slightly above the MFI levels of full-length PN73 (PN690) peptide. In contrast, PN654, PN653, PN652 and PN651 had relatively little or no MFI (3-14 units), indicating that Cy5-conjugated siRNA enters the cells after transfection with these peptides. The low MFI values observed with PN653, PN652 and PN651 were related to siRNA cell-absorption data which showed that PN654, PN653, PN652 and PN651 were not complex with siRNA or showed that siRNA did not facilitate their entry into cells.

형광 현미경 영상을 사용하여 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73과 복합된 Cy5 라벨된 siRNA들의 세포 위치결정(localization)을 리포펙타민(Invitrogen)과 형질감염된 siRNA들의 세포 위치결정과 비교하였다. 엔도솜 위치결정(endosomal localization)의 가능성이 있음을 나타내는 리포펙타민과 함께 전달된 siRNA의 위치결정은 점상 착색(punctate staining)을 더하여 특성화될 수 있는 반면에, PN73은 더 균일한 핵 주변 염색(peri-nuclear staining)을 보였다. 엔도솜들 내에 위치하는 siRNA는 세포질 내에서의 RISC 복합체에 접근 가능하지 않으며, 표적 유전자의 발현을 침묵시킬 수 없다. 비교하건대, PN73 매개성 전달로 관찰된 siRNA의 균일한 세포질 분포는 RISC 복합체로의 접근 및 표적 유전자의 발현 감소에 필요 조건이다. 결과들에 의하면 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 양이온 지질들 상에서 siRNA 전달을 실질적으로 향상시키고 표적 유전자 침묵(넉 다운)을 실질적으로 향상시킨다는 것을 보여준다.Fluorescence microscopy images were used to compare the cell localization of Cy5 labeled siRNAs complexed with the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN73 to the cell localization of lipofectamine (Invitrogen) and transfected siRNAs. The positioning of siRNA delivered with lipofectamine, indicating the potential for endosomal localization, can be characterized by the addition of punctate staining, whereas PN73 is more uniform in nuclear periphery staining ( peri-nuclear staining). SiRNA located within the endosomes is not accessible to the RISC complex in the cytoplasm and cannot silence expression of the target gene. In comparison, the uniform cytoplasmic distribution of siRNAs observed with PN73 mediated delivery is a requirement for access to RISC complexes and reduced expression of target genes. The results show that the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides of the invention substantially enhance siRNA delivery on cationic lipids and substantially enhance target gene silencing (knock down).

이러한 데이터는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73이siRNA를 세포들 내로 높은 효율로의 전달 향상시키는 능력이 상기 펩티드의 24 개 가장 N-터미널 잔기들에 의존한다는 것을 보여준다. 이러한 데이터는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 길이가 더 짧은 유도체들(PN661; PN685; PN660; PN735; PN655; 및 PN708)이 siRNA와 효과적으로 복합되고 siRNA를 세포들 내로 전달시킬 수 있다는 것을 보여준다.These data show that PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, depends on the 24 most N-terminal residues of the peptide for its ability to enhance the delivery of siRNA into cells with high efficiency. These data show that shorter derivatives (PN661; PN685; PN660; PN735; PN655; and PN708) of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, can effectively complex with siRNA and deliver siRNA into cells. .

폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 Polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN360PN360 과 and PN361PN361 의 절단된 형태들의 분석:Analysis of the truncated forms of

상술한 바와 같이 실시한 siRNA 세포-흡수 시험법에서 PN360(C-터미널) 및 PN361(N-터미널)을 특성화하여 PN73의 C-터미널 및 N-터미널 영역들의 기능-구조적 활성 관계들을 관찰하였다.In the siRNA cell-absorption assay conducted as described above, PN360 (C-terminal) and PN361 (N-terminal) were characterized to observe the functional-structural activity relationships of the C-terminal and N-terminal regions of PN73.

표 24는 PN73의 N-터미널의 결실 부분(PN361 참조)은 siRNA 세포-흡수 활성을 50 %로 감소시켰다는 것을 보여주며; C-터미널 잔기들을 제거하면(PN360 참조) 모든 siRNA 세포-흡수 활성을 제거한다. 이러한 데이터는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 C-터미널 도메인이 상기 펩티드의 뉴클레오티드 세포-흡수 활성에 필요하다는 것을 보여준다.Table 24 shows that the deletion portion of the N-terminal of PN73 (see PN361) reduced siRNA cell-absorbing activity by 50%; Removing C-terminal residues (see PN360) removes all siRNA cell-absorbing activity. These data show that the C-terminal domain of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, is required for the nucleotide cell-absorbing activity of the peptide.

펩티드-Peptide- siRNAsiRNA 접합체들은  The conjugates 공유적으로In common 연결된  Connected 카고우(cargo)를Cargo 세포들 내로의 전달을 향상시켰다: Improved delivery into cells:

펩티드 세포-흡수 활성 및 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 절단된 형태들의 MFI 측정은 이러한 펩티드들이 다양한 분자 카고우에 대한 전달 운반체로 작용할 수 있음을 나타낸다. 이는 핵산들 및 펩티드들을 전-길이 PN73 또는 그 유도체들에 핵산들 및 펩티드들을 포함하여, 원하는 작동체 분자(effector molecule)의 공유적 연결을 포함한다. 세포들 내에서 특정한 세포 유형 및/또는 세포소기관으로 작동체 분자의 제한된 전달을 특이적인 모이어티(지질, 펩티드 및/또는 당 기)로 전달 펩티드를 변형시켜 달성할 수 있다.Peptide cell-absorbing activity and MFI measurements of truncated forms of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides indicate that these peptides can act as delivery vehicles for various molecular cargoes. This includes covalent linkage of the desired effector molecule, including nucleic acids and peptides to full-length PN73 or derivatives thereof. Limited delivery of effector molecules to specific cell types and / or organelles within cells can be achieved by modifying the delivery peptide with specific moieties (lipids, peptides and / or sugar groups).

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 결실 분석하면 N-터미널이 뉴클레오티드들(예컨대, siNA들)을 결합하고 세포들 내로 전달하는 펩티드의 능력에 중요하다는 것을 나타낸다. 그러나, N-터미널 잔기들이 부재하는 경우 조차도, 이러한 비-뉴클레오티드 결합 펩티드들과 심하게 손상된 뉴클레오티드 결합 펩티드들은 그들의 막 부착 및 유전자 융합성 도메인들(예컨대, PN361; PN735; PN655; PN654; PN653; PN652과 PN651 및 그 유도체들)을 유지한다. 펩티드들의 뉴클레오티드들을 결합에의 무능(inability)을 비추어 본다면, siNA를 펩티드의 막 부착 및/또는 유전자 융합성 도메인들에 공유적으로 연결시켜 siNA를 세포들 내로 전달하려는 목적으로 이러한 펩티드들을 여전히 사용할 수 있다. 그 결과, siNA 공유 연쇄는 뉴클레오티드들을 결합시키지 못하는 펩티드의 무능을 치유하며 siNA의 세포들 내로의 펩티드 매개성 전달이 효율적으로 일어나게 한다. 또한, siNA/펩티드 접합체들은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 절단된 형태들을 선택하도록 한정될 필요가 없지만, 전-길이 PN73 및 그 유도체들도 포함할 수 있다.Deletion analysis of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides indicates that the N-terminal is important for the peptide's ability to bind nucleotides (eg, siNAs) and deliver them into cells. However, even in the absence of N-terminal residues, these non-nucleotide binding peptides and severely damaged nucleotide binding peptides may be associated with their membrane adhesion and gene fusion domains (eg, PN361; PN735; PN655; PN654; PN653; PN652). PN651 and its derivatives). In light of the inability to bind the nucleotides of the peptides, these peptides can still be used for the purpose of covalently linking the siNA to the membrane adhesion and / or gene fusion domains of the peptide to deliver the siNA into cells. have. As a result, siNA covalent linkages heal the incapacity of peptides that do not bind nucleotides and allow the peptide-mediated delivery of siNAs into cells efficiently. In addition, siNA / peptide conjugates need not be limited to select truncated forms of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, but may also include full-length PN73 and derivatives thereof.

하기는 siNA/펩티드 공유 연쇄를 발생시키는데 이용된 방법들의 비-제한적 예이다. 펩티드 및 siRNA 분자들 양쪽 모두를 서로 간에 공유 부착이 되도록 특이적 모이어티로 관능화 시켜야 한다. 상기 펩티드에 대하여, N-터미널을 예를 들어, 3-말레이미도프로피온산으로 관능화 시킨다. 그러나 브롬 또는 요오드아세틸 모이어티와 같은 다른 관능기들도 작용할 수 있다는 것을 인지한다. RNA 분자에 대하여 센스 가닥의 5' 말단 또는 안티센스 가닥의 3' 말단을 하기의 합성법에 따라서 예를 들어, 1-O-디메톡시트리틸-헥실-디설파이드 링커로 관능화 시킨다.The following are non-limiting examples of the methods used to generate siNA / peptide covalent chains. Both peptide and siRNA molecules must be functionalized with specific moieties to allow covalent attachment to each other. For this peptide, the N-terminal is functionalized with, for example, 3-maleimidopropionic acid. However, it is recognized that other functional groups, such as bromine or an iodineacetyl moiety, may also work. The 5 'end of the sense strand or the 3' end of the antisense strand is functionalized with an 1-O-dimethoxytrityl-hexyl-disulfide linker according to the following synthesis for the RNA molecule.

상기 5' 변형된 siNA를 상온에서 3 시간 동안 0.1 M 트리에틸아민 아세테이트 완충액(pH 7.0) 0.3 ml에 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 0.393 mg(3 당량)로서 자유 티올기(thiol group)로 환원시킬 것이다. 환원된 올리고뉴클레오티드를 0.1 M TEAA 완충액 pH 7에 CH3CN의 0 내지 30 %의 선형 구배를 20 분 이내로(tr=5.931 분) 이용하여 XTerra

Figure 112008025338980-PCT00027
MS C18 4.6x50 mm 칼럼상에 RP HPLC에 의하여 정제할 것이다.The 5 'modified siNA was added to 0.3 ml of tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) in 0.3 ml of 0.1 M triethylamine acetate buffer (pH 7.0) for 3 hours at room temperature. group). Reduced oligonucleotides in XTerra using 0.1 M TEAA buffer pH 7 with a linear gradient of 0 to 30% of CH 3 CN within 20 minutes (t r = 5.931 minutes).
Figure 112008025338980-PCT00027
Purification by RP HPLC on a MS C 18 4.6x50 mm column.

상술한 접합체들을 제제하였다. 정제 환원된 siNA(1.361 mg, 0.19085 μmol)를 0.1 M TEAA 완충액 pH=7 0.2 ml에 용해시키고 말레이미도 모이어티를 지닌 펩티드를 펩티드 N-터미널에 부착시키고(0.79 mg, 1.5 당량) 이후 siNA 용액에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 후 75 %/CH3CN/0.1 M TEAA 150 ㎕를 첨가하여 침전물을 용해시켰다. 상온에서 하룻밤 동안 교반한 후에, 그 결과로 생성된 접합체를 0.1 M TEAA 완충액 pH 7에 CH3CN의 0-30 %의 선형 구배를 20 분 이내로 100 % C를 다음 5 분(tr=21.007 분) 이내로 이용하여 XTerra

Figure 112008025338980-PCT00028
MS C18 4.6x50 mm 칼럼상에 RP HPLC에 의하여 정제하였다. 접합체의 양은 λ=260 ㎚에서 계산된 몰 흡광 계수에 근거한 분광광도법으로 측정하였다. MALDI 질량 분석에 의하면 상기 접합체에 대해 관찰된 피크(10 585.3 amu)는 계산된 질량과 부합하는 것을 보여 주었다.The conjugates described above were formulated. Purified reduced siNA (1.361 mg, 0.19085 μmol) was dissolved in 0.2 ml of 0.1 M TEAA buffer pH = 7 and the peptide with the maleimido moiety was attached to the peptide N-terminal (0.79 mg, 1.5 equiv) followed by siNA solution Added. After addition of peptide, 150 μl of 75% / CH 3 CN / 0.1 M TEAA was added to dissolve the precipitate. After stirring at room temperature overnight, the resulting conjugate was then transferred to 0.1 M TEAA buffer pH 7 with a linear gradient of 0-30% of CH 3 CN within 20 minutes and then 100% C within 5 minutes (t r = 21.007 minutes). ) Within XTerra
Figure 112008025338980-PCT00028
Purification by RP HPLC on a MS C 18 4.6x50 mm column. The amount of conjugate was measured by spectrophotometry based on the molar extinction coefficient calculated at λ = 260 nm. MALDI mass spectrometry showed that the peak observed for the conjugate (10 585.3 amu) was consistent with the calculated mass.

펩티드 접합체 센스 가닥 및 상보적 안티센스 가닥을 50 mM 초산 칼륨, 1 mM 초산 마그네슘 및 15 mM HEPES 내에서 90 ℃ 온도로 2 분 동안 가열하여 어닐링하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이중 가닥 RNA 접합체 형성은 비 변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 전기이동법으로 확인한 후에 브롬화 에티듐 염색(staining)을 실시하였다.Peptide conjugate sense strands and complementary antisense strands were annealed by heating at 50 ° C. for 2 minutes in 50 mM potassium acetate, 1 mM magnesium acetate and 15 mM HEPES and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Double stranded RNA conjugate formation was confirmed by unmodified (15%) polyacrylamide gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining.

하기 표 25에 세포 흡수 활성의 결과들을 제시한다.Table 25 shows the results of cell uptake activity.

하기 표 25는 펩티드-siRNA 접합체들에 의하여 siRNA를 흡수하는 세포들의 퍼센트를 나타낸다:Table 25 below shows the percentage of cells uptake of siRNA by peptide-siRNA conjugates:

형질감염 시약Transfection Reagent 펩티드/Peptides / siRNAsiRNA 접합체 Conjugate 농도density % % siRNAsiRNA 흡수 absorption 비처리(no treatment)No treatment N/AN / A 0.5 %0.5% 리포펙타민Lipofectamine 5 ng/㎕5 ng / μl 91.9 %91.9% PN73PN73 5 μM5 μM 92.3 %92.3% PN654 (18단량체(mer) H2B)     PN654 (18 monomer H2B) 5 μM5 μM 25.4 %25.4% 10 μM10 μM 60.3 %60.3% 20 μM20 μM 83.7 %83.7% 40 μM40 μM 87.5 %87.5% 80 μM80 μM 94.3 %94.3% 0.31 μM0.31 μM 6.1 %6.1% 0.63 μM0.63 μM 10.8 %10.8% 1.25 μM1.25 μM 16.5 %16.5% 2.5 μM2.5 μM 35.7 %35.7% 5 μM5 μM 49.8 %49.8% PN654 + 리포펙타민(5 ng/㎕)PN654 + Lipofectamine (5 ng / μl) 5 μM5 μM 96.2 %96.2% PN651 (6단량체 H2B)  PN651 (hexamer H2B) 0.31 μM0.31 μM 3.4 %3.4% 0.63 μM0.63 μM 11.3 %11.3% 1.25 μM1.25 μM 14.4 %14.4% 2.5 μM2.5 μM 29.6 %29.6% 5 μM5 μM 45.6 %45.6% PN651 + 리포펙타민(5 ng/㎕)PN651 + Lipofectamine (5 ng / μl) 5 μM5 μM 93.4 %93.4%

표 25의 결과들은 PN-651-siRNA 접합체는 siRNA의 세포들로의 흡수를 향상시킨다는 것을 보여준다. 이후, MFI를 측정하였다. 결과들은 표 26에 제시되어 있다.The results in Table 25 show that PN-651-siRNA conjugates enhance the uptake of siRNA into cells. Thereafter, MFI was measured. The results are shown in Table 26.

표 26은 펩티드-siRNA 접합체들에 의해 전달되는 Cy5-siRNA의 상대적 수량(MFI)을 나타낸 것이다:Table 26 shows the relative quantities (MFI) of Cy5-siRNA delivered by peptide-siRNA conjugates:

형질감염 시약Transfection Reagent 펩티드/Peptides / siRNAsiRNA 접합체 Conjugate 농도density % % siRNAsiRNA 흡수 absorption 비처리Untreated N/AN / A 0.620.62 리포펙타민Lipofectamine 5 ng/㎕5 ng / μl 56.5056.50 PN73PN73 5 μM5 μM 47.7047.70 PN654 (18단량체(mer) H2B)     PN654 (18 monomer H2B) 5 μM5 μM 3.383.38 10 μM10 μM 12.2012.20 20 μM20 μM 28.0028.00 40 μM40 μM 35.5035.50 80 μM80 μM 68.0068.00 0.31 μM0.31 μM 1.361.36 0.63 μM0.63 μM 1.831.83 1.25 μM1.25 μM 2.452.45 2.5 μM2.5 μM 4.644.64 5 μM5 μM 6.876.87 PN654 + 리포펙타민(5 ng/㎕)PN654 + Lipofectamine (5 ng / μl) 5 μM5 μM 49.8049.80 PN651 (6단량체 H2B)  PN651 (hexamer H2B) 0.31 μM0.31 μM 1.021.02 0.63 μM0.63 μM 1.901.90 1.25 μM1.25 μM 0.620.62 2.5 μM2.5 μM 56.5056.50 5 μM5 μM 47.7047.70 PN651 + 리포펙타민(5 ng/㎕)PN651 + Lipofectamine (5 ng / μl) 5 μM5 μM 3.383.38

표 26에서 보는 MFI 결과들은 표 25에 보여진 퍼센트 siRNA 흡수 데이터와 일치한다. 이러한 데이터는 PN651-siRNA 접합체가 세포들 내로 siRNA 흡수를 향상시켰다는 것을 보여준다.The MFI results shown in Table 26 are consistent with the percent siRNA uptake data shown in Table 25. These data show that PN651-siRNA conjugates improved siRNA uptake into cells.

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 정선 절단된 형태들의 유전자 표적 넉 다운 활성:Gene target knock down activity of select truncated forms of a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide:

본 발명의 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 복합체들에 의한 표적 유전자 발현의 효과적인 넉 다운을 실증하였다. 특이적으로, 인간 종양 괴사 인자-α(hTNF-α) 유전자의 발현을 조절하는 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 복합체들의 능력을 평가하였다. hTNF-α 유전자를 표적하는 중요성은 인간 및 다른 포유류 피검물들 내에서 과잉-발현될 경우에 류마티스성 관절염의 발생 또는 진행을 조절하는데 함축되어 있다는 것이다.The effective knock down of target gene expression by the siRNA / polynucleotide delivery-enhancing polypeptide complexes of the present invention was demonstrated. Specifically, the ability of siRNA / polynucleotide delivery-enhancing complexes to regulate expression of human tumor necrosis factor-α (hTNF-α) genes was evaluated. The importance of targeting the hTNF-α gene is implied in controlling the development or progression of rheumatoid arthritis when over-expressed in human and other mammalian specimens.

인간 단구세포들을 모델 시스템으로 사용하여 hTNF-α 유전자 발현에 미치는 siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 복합체들의 효과를 측정하였다. Qneg는 무작위 siRNA 서열을 나타내며 음성 대조군으로 작용하였다. 관찰된 Qneg 넉 다운 활성을 100 %로 정규화하고(100 % 유전자 발현 수준들) 하기 siRNA들인 A19S21, 21/21 및 LC20 각각의 활성을 음성 대조군의 상대적 백분율로 제시한다. A19S21, 21/21 및 LC20은 hTNF-α mRNA를 표적하는 siRNA들이다. 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN643(전-길이 PN73에서 C-터미널 라벨이 빠짐), PN690(전-길이 PN73에 C-터미널 FITC-라벨이 첨가) 및 결실 계열로부터 PN73의 절단된 형태들인 PN660, PN735, PN654 및 PN708을 A19S21, 21/21 및 LC20 siRNA들과 복합하여 인간 단구세포들 내에서 hTNF-α 유전자 발현 수준들을 감소시키는 각각의 siRNA의 능력에 미치는 효과를 측정하였다.Human monocytes were used as a model system to determine the effect of siRNA / polynucleotide delivery-enhancing complexes on hTNF-α gene expression. Qneg represents a random siRNA sequence and served as a negative control. The observed Qneg knock down activity was normalized to 100% (100% gene expression levels) and the activity of each of the following siRNAs A19S21, 21/21 and LC20 is presented as relative percentage of negative control. A19S21, 21/21 and LC20 are siRNAs that target hTNF-α mRNA. Representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, PN643 (C-terminal label missing at full-length PN73), PN690 (added C-terminal FITC-label to full-length PN73), and PN660, the truncated forms of PN73 from the deletion family , PN735, PN654 and PN708 were combined with A19S21, 21/21 and LC20 siRNAs to determine the effect on each siRNA's ability to reduce hTNF-α gene expression levels in human monocytes.

상기 실험을 하기와 같이 실시하였다. 96 웰 평판 플레이트 내에, OptiMEM 배지(Invitrogen)에서 웰당 100 ㎕ 당 100 K로 인간 단구세포들을 살포하였다. 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 상온에서 5 분 동안 OptiMEM 배지 내에서 20 nM siRNA와 1:5의 몰 비율로 20 nM siRNA와 혼합하였다. 배양을 완료시에, FBS를 혼합물(최종 3 %)에 첨가하였고, 혼합물 50 ㎕를 세포에 첨가하였다. 세포들을 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양한 후에, 상기 세포들을 V-자형 바닥 플레이트에 옮겨넣고 1500 rpm으로 5 분 동안 펠릿화하였다. 상기 세포들을 성장 배지(글루타민, 비필수 아미노산, 및 pen-strep이 있는 IMDM) 내에서 재현탁하였다. 하룻밤 동안 배양한 후에, 상기 단구세포들을 1 ng/ml 농도의 LPS(Sigma)로 3 시간 동안 자극하여 TNF-α 발현 수준들을 증가시켰다. LPS에 의하여 도입한 후에, 세포들을 mRNA 정량화를 위해 상술한 바와 같이 회수하였고 필요하다면 단백질 정량화를 위해 상청액을 덜어놓았다.The experiment was carried out as follows. In a 96 well plate, human monocytes were sparged at 100 K per 100 μl per well in OptiMEM medium (Invitrogen). Representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides were mixed with 20 nM siRNA in a 20: 1 molar ratio of 20 nM siRNA in OptiMEM medium at room temperature for 5 minutes. Upon completion of incubation, FBS was added to the mixture (final 3%) and 50 μl of the mixture was added to the cells. Cells were incubated at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, the cells were transferred to a V-shaped bottom plate and pelleted at 1500 rpm for 5 minutes. The cells were resuspended in growth medium (IMDM with glutamine, non-essential amino acids, and pen-strep). After incubation overnight, the monocytes were stimulated with LPS (Sigma) at a concentration of 1 ng / ml for 3 hours to increase TNF-α expression levels. After introduction by LPS, cells were harvested as described above for mRNA quantification and supernatant was removed for protein quantification if necessary.

mRNA 측정을 위해, Genospectra 사의 브랜치 DNA 기술을 제작자 명세서에 따라서 사용하였다. 세포들 내에서의 mRNA 수준을 정량화하기 위하여, 하우스 키핑 유전자(cypB) 및 표적 유전자(TNF-α) mRNA 양쪽 모두를 측정하였고, TNF-α에 대한 눈금을 cypB와 정규화하여 상대 형광 단위를 얻었다.For mRNA measurement, branch DNA technology from Genospectra was used according to the manufacturer's specification. To quantify mRNA levels in cells, both housekeeping gene (cypB) and target gene (TNF-α) mRNAs were measured, and the scale for TNF-α was normalized with cypB to obtain relative fluorescence units.

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 전-길이 및 절단된 형태들에 대한 넉 다운 활성을 상기 표 24에 요약해 두었다. "넉 다운 활성" 칼럼에서 "+"는 펩티드/siRNA 복합체가 Qneg 음성 대조군 siRNAdml 80 %의 넉 다운 활성을 가졌다는 것을 나타낸다(Qneg 음성 대조군와 비교하여 mRNA 수준들에서 20 % 감소). "+/-"는 펩티드/siRNA 복합체는 Qneg 음성 대조군 siRNA의 약 90 %의 넉 다운 활성을 가졌다는 것을 나타낸다(Qneg 음성 대조군와 비교하여 mRNA 수준들에서 10 % 감소). 최종적으로, "-"는 펩티드/siRNA 복합체는 Qneg 음성 대조군와 비교하여 상당한 넉 다운 활성을 전혀 가지지 않았다는 것을 나타낸다.Knock down activity for the full-length and truncated forms of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, is summarized in Table 24 above. "+" In the "knock down activity" column indicates that the peptide / siRNA complex had a knock down activity of 80% of Qneg negative control siRNAdml (20% decrease in mRNA levels compared to Qneg negative control). "+/-" indicates that the peptide / siRNA complex had about 90% knock down activity of the Qneg negative control siRNA (10% decrease in mRNA levels compared to the Qneg negative control). Finally, "-" indicates that the peptide / siRNA complex had no significant knock down activity compared to the Qneg negative control.

일반적으로, PN643(전-길이 비-FITC-라벨된 PN73) 및 PN690(전-길이 FITC-라벨된 PN73)은 "넉 다운 활성" 칼럼 내에서 "+"로 표시된 모든 시험된 siRNA들에 대하여 동등한 siRNA 넉 다운 활성들을 가졌다는 것이다(표 24에 결과 도시). 또한, PN660은 모든 시험된 siRNA들에 대하여 PN643 및 PN690에 필적할 만한 siRNA 넉 다운 활성들을 가졌는데, 이는 PN73 펩티드의 9 개 가장 N-터미널 잔기들을 제거해도 표적된 TNF-α mRNA의 siRNA들 매개성 넉 다운 활성에 영향을 주지 않았다는 것을 나타낸다. PN654는 A19S21 및 21/21 siRNA들 양쪽 모두에 대하여 적당한 넉 다운 활성을 보였지만 LC20 siRNA에 대하여는 그렇지 못하였다(넉 다운 활성은 넉 다운 활성 칼럼 내에서 "±"로 도시된다). 그러나, PN708 또는 PN735 중 어느 하나와 복합된 siRNA들은 siRNA들의 임의의 것에 대하여 눈에 띌만한 넉 다운 활성을 나타내지 않았다.In general, PN643 (full-length non-FITC-labeled PN73) and PN690 (full-length FITC-labeled PN73) are equivalent for all tested siRNAs marked with a "+" in the "knock down active" column. siRNA knock down activities (result shown in Table 24). In addition, PN660 had siRNA knock down activities comparable to PN643 and PN690 for all tested siRNAs, which mediated siRNAs of targeted TNF-α mRNA even by removing the nine most N-terminal residues of the PN73 peptide. It does not affect sexual knock down activity. PN654 showed moderate knock down activity for both A19S21 and 21/21 siRNAs but not LC20 siRNA (knock down activity is shown as “±” in the knock down activity column). However, siRNAs complexed with either PN708 or PN735 did not show noticeable knock down activity against any of the siRNAs.

이러한 결과들은 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73의 절단된 형태들인, 구체적으로는 PN660 및 PN654는 표적 유전자의 mRNA 수준들을 감소시키는 siRNA의 능력을 간섭하지 않고 RA와 같은 인간 질병들의 치료에 치료적 siRNA들의 전달을 향상시키는 새로운 접근법이 주어진다는 것을 보여주었다.These results indicate that the truncated forms of PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, specifically PN660 and PN654, are therapeutic for the treatment of human diseases such as RA without interfering with the ability of siRNA to reduce mRNA levels of target genes. It has been shown that a new approach is given to improve the delivery of siRNAs.

실시예Example 19 : 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인  19: polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN708PN708 의 특성화Characterization of

본 실시예는 siRNA 세포-흡수 활성, PN708 펩티드와 복합된 siRNA들의 MFI 측정 및 넉 다운 활성을 더 모색한다. 이용 가능한 펩티드들의 PN73 결실 계열들이 수록되어 있다(실시예 17의 표 23 참조).This example further explores siRNA cell-absorbing activity, MFI measurement and knock down activity of siRNAs complexed with PN708 peptide. PN73 deletion series of available peptides are listed (see Table 23 in Example 17).

상술한 바와 같이, 세포-흡수 시험법은 펩티드와 복합되는 경우에 Cy5-접합성 siRNA를 수취하는 세포들의 수량을 측정한다. siRNA 세포-흡수를 유동 세포계측법으로 평가하였다. Cy5-접합성 siRNA를 포함하는 세포들의 수량을 배지에 형질감염된 세포들과 미형질감염된(untransfected) 세포들의 총 수량으로 나누어서 계산한 퍼센티지로 흡수를 표현하였다. 평균 형광 세기(MFI)를 유동 세포계측법으로 측정하여 세포들 내에서 발견되는 Cy5-접합성 siRNA의 양을 측정하였다. MFI 수치는 세포들 내의 Cy5-접합성 siRNA의 양과 직접 비례하여서, MFI 수치가 클수록 세포들 내의 Cy5-접합성 siRNA의 수량이 더 커지는 것을 나타낸다.As mentioned above, the cell-absorption assay measures the quantity of cells that receive Cy5-conjugated siRNA when complexed with a peptide. siRNA cell-absorption was assessed by flow cytometry. Uptake was expressed as a percentage calculated by dividing the number of cells containing Cy5-conjugated siRNA by the total number of cells transfected into the medium and the total number of untransfected cells. Mean fluorescence intensity (MFI) was measured by flow cytometry to determine the amount of Cy5-conjugated siRNA found in the cells. MFI levels are directly proportional to the amount of Cy5-conjugated siRNA in the cells, indicating that the higher the MFI level, the greater the quantity of Cy5-conjugated siRNA in the cells.

본 실시예에서, 이전 예보다 더 높은 범위의 펩티드 농도들을 사용하여 siRNA 세포-흡수 활성의 효율을 측정하고 MFI 측정을 실시하였다. 또한, 세포 생존도를 평가하였다. 본 실시예에서, 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN643(전-길이 PN73에서 C-터미널 라벨이 빠짐), PN690(전-길이 PN73에 C-터미널 FITC-라벨이 첨가) 및 PN708(PN73의 21 N-터미널 잔기들을 결실하여 유도된 15-량체)을 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM에서 시험하였다. PN643 및 PN690도 2.5 μM에서 시험하였고 PN690을 1.25 μM에서도 시험하였다. PN643 및 PN708 양쪽 모두를 80 μM에서 시험하였다.In this example, higher ranges of peptide concentrations were used than in previous examples to measure the efficiency of siRNA cell-absorbing activity and to perform MFI measurements. In addition, cell viability was evaluated. In this example, representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, PN643 (C-terminal label missing at full-length PN73), PN690 (added C-terminal FITC-label to full-length PN73) and PN708 (21 of PN73) 15-mers derived by deleting N-terminal residues) were tested at 5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ and 40 μΜ. PN643 and PN690 were also tested at 2.5 μM and PN690 was also tested at 1.25 μM. Both PN643 and PN708 were tested at 80 μΜ.

하기 표 27에 도시된 바와 같이, 비-FITC 라벨된 PN73(PN643) 펩티드는 10 μM에서 siRNA의 흡수를 거의 100 % 달성하였다. 그러나, PN73 펩티드를 FITC 꼬리표(PN690)으로 라벨할 경우, 그 최대 세포-흡수 활성은 약 70 %로 감소하였다. PN708은 siRNA 세포-흡수 활성에서 투여 의존성 증가를 보여주었다. PN708은 80 μM에서 95 %의 최대 siRNA 세포-흡수 활성을 달성하였다. 전-길이 PN73 펩티드들에 대하여, 펩티드의 농도가 감소함에 따라 세포 생존도가 감소하였다. 이에 반하여, PN708 펩티드로 배양한 세포들은 모든 시험된 농도들에서 90 % 초과의 세포 생존도를 유지하였다. Cy5-MFI 측정들에 의하면 절단된 펩티드인 PN708은 전-길이 PN73(PN690) 펩티드와 비교하건대 세포들로 전달되는 Cy5-siRNA의 양을 실질적으로 배가하였다는 것을 더 보여주었다.As shown in Table 27 below, the non-FITC labeled PN73 (PN643) peptide achieved nearly 100% uptake of siRNA at 10 μM. However, when the PN73 peptide was labeled with the FITC tag (PN690), its maximum cell-absorbing activity was reduced to about 70%. PN708 showed an increase in dose dependency in siRNA cell-absorbing activity. PN708 achieved 95% maximal siRNA cell-absorbing activity at 80 μM. For full-length PN73 peptides, cell viability decreased with decreasing peptide concentration. In contrast, cells incubated with PN708 peptide maintained cell viability of greater than 90% at all tested concentrations. Cy5-MFI measurements further showed that the cleaved peptide, PN708, substantially doubled the amount of Cy5-siRNA delivered to the cells as compared to the full-length PN73 (PN690) peptide.

표 27은 PN708의 siRNA 전달-증진 특성들의 요약한 것이다:Table 27 summarizes the siRNA delivery-enhancing properties of PN708:

처리 process 펩티드 농도 Peptide concentration % siRNA 세포-흡수 % siRNA cell-absorption siRNA Cy5-MFIsiRNA Cy5-MFI % 세포 생존도% Cell viability 음성 대조군 (비처리)Negative control (untreated) 0 0 0 0 0 0 98 % 98% Cy5-LC20 siRNA + PN643   Cy5-LC20 siRNA + PN643 2.5 μM2.5 μM 61 %61% 88 95 %95% 5 μM5 μM 96 %96% 1313 95 %95% 10 μM10 μM 97 %97% 1717 94 %94% 20 μM20 μM 84 %84% 1010 93 %93% 40 μM40 μM 44 %44% 77 78 %78% 80 μM80 μM 12 %12% 1414 26 %26% Cy5-LC20 siRNA + PN690   Cy5-LC20 siRNA + PN690 1.25 μM1.25 μM 30 %30% 77 95 %95% 2.5 μM2.5 μM 47 %47% 1717 97 %97% 5 μM5 μM 71 %71% 5656 94 %94% 10 μM10 μM 64 %64% 6767 92 %92% 20 μM20 μM 55 %55% 9090 91 %91% 40 μM40 μM 45 %45% 218218 71 %71% Cy5-LC20 siRNA + PN708  Cy5-LC20 siRNA + PN708 5 μM5 μM 35 %35% 99 96 %96% 10 μM10 μM 55 %55% 2323 96 %96% 20 μM20 μM 83 %83% 8585 97 %97% 40 μM40 μM 93 %93% 212212 94 %94% 80 μM80 μM 96 %96% 378378 91 %91%

이러한 결과들은 대표적인 절단된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN768(H2B 잔기들 34-38)은 세포 생존도에 나쁜 영향을 주지 않으면서 높은 효율로 siRNA를 세포들로의 전달을 향상시키는 능력을 가지고 있음을 보여주었다.These results indicate that PN768 (H2B residues 34-38), a representative truncated polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, has the ability to enhance the delivery of siRNA to cells with high efficiency without adversely affecting cell viability. Showed.

대표적인 절단된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN708을 siRNA 매개성 표적 유전자 발현 감소에 미치는 그 영향을 측정하여 더 특성화하였다. 본 실시예의 이 섹션에서, siRNA와 복합하는 경우 표적 유전자 발현 감소를 향상시키는 그 능력을 평가하기 전에 PN708 펩티드의 C-터미널 FITC-라벨을 제거하였다. FITC-라벨이 없는 경우에, 대표적인 절단된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 PN766이라고 명명하였다(실시예 17의 표 23 참조). 인간 종양 괴사 인자-α(hTNF-α) 유전자의 발현을 조절하는 siRNA/펩티드 복합체들의 능력을 평가하였다. 본 실시예에서, 무작위 siRNA 서열인 Qneg는 음성 대조군로 작용하였고 siRNA들인 LC20과 LC17을 사용하여 인간 단구세포들 내에서 hTNF-α mRNA를 표적하였다. 시험된 siRNA 대 펩티드의 몰 비율들은 1:5, 1:10, 1:25, 1:75 및 1:100이었다. LC20 및 LC17 양쪽 모두를 20 nM 농도에서 사용하였다.PN708, a representative truncated polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, was further characterized by measuring its effect on reducing siRNA mediated target gene expression. In this section of this example, the C-terminal FITC-label of the PN708 peptide was removed before evaluating its ability to enhance target gene expression reduction when combined with siRNA. In the absence of FITC-labels, a representative truncated polynucleotide delivery-enhancing polypeptide was named PN766 (see Table 23 in Example 17). The ability of siRNA / peptide complexes to regulate expression of human tumor necrosis factor-α (hTNF-α) genes was evaluated. In this example, Qneg, a random siRNA sequence, served as a negative control and siRNAs LC20 and LC17 were used to target hTNF-α mRNA in human monocytes. The molar ratios of siRNA to peptide tested were 1: 5, 1:10, 1:25, 1:75 and 1: 100. Both LC20 and LC17 were used at 20 nM concentration.

넉 다운 결과에 의하면 1:5, 1:10; 및 1:25에서 LC20/PN766 및 LC17/PN766 siRNA/펩티드 복합체들은 hTNF-α 수준들을 Qneg siRNA 음성 대조군의 약 70 %- 80 %로 감소시켰음을(즉, Qneg 음성 대조군와 비교하여 mRNA 수준들에서 20 %-30 % 감소) 보인다. 1:50; 1:75 및 1:100의 siRNA/펩티드 비율들은 Qneg 대조군와 비교하여 hTNF-α mRNA 수준들에 상당한 영향을 전혀 미치지 않았다. PN766 펩티드가 존재하는 경우 인간 단구세포들에서는 어떠한 세포독성 효과들을 관찰하지 못했다.Knockdown results indicate 1: 5, 1:10; And at 1:25 the LC20 / PN766 and LC17 / PN766 siRNA / peptide complexes reduced hTNF-α levels to about 70% -80% of the Qneg siRNA negative control (ie 20 at mRNA levels compared to the Qneg negative control). % -30% decrease). 1:50; SiRNA / peptide ratios of 1:75 and 1: 100 had no significant effect on hTNF-α mRNA levels compared to the Qneg control. No cytotoxic effects were observed in human monocytes when PN766 peptide was present.

이러한 데이터는 대표적인 절단된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN766이 siRNA와 복합되는 경우에 표적 유전자의 mRNA 수준들을 상당히 감소시키는 데 이는 PN766이 포유류 피검물들의 RA 치료에 있어서 치료적 siRNA들에 대한 이상적인 siRNA 전달 펩티드이라는 것을 나타낸다.These data significantly reduce mRNA levels of target genes when PN766, a representative truncated polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, is complexed with siRNA, which makes PN766 an ideal siRNA for therapeutic siRNAs in the treatment of RA in mammalian specimens. Indicates delivery peptide.

실시예Example 20 : 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 내에서 아미노산 치환 및 결실은 펩티드  20: Amino acid substitutions and deletions in a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide are peptides 매개성Intermediary siRNAsiRNA 세포-흡수 활성에 영향을 주지 않는다 Does not affect cell-absorbing activity

본 실시예는 하기 표 28에 수록되어 있는 잔기 치환 및/또는 결실에 의하여 발생된 대표적인 돌연변이 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 대표적인 무변형 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73과 비교하여 siRNA 세포-흡수 활성 또는 MFI 측정들에 영향을 주지 않았다는 것을 실증한다. 회색으로 강조된 아미노산들 무변형, 치환 및/또는 결실된 잔기들을 나타낸다. 회색으로 강조하여 식별을 쉽게하고 PN73 펩티드 내의 무변형 잔기들과 대표적인 돌연변이 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN644, PN645, PN646, PN647 및 PN729 내의 치환되고/되거나 결실된 잔기들과의 비교를 용이하게 해준다. 대표적인 돌연변이 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들 내의 치환된 잔기들을 굵은 글씨로 밑줄 그었다. 또한, 굵은 글씨로 밑줄친 상징인 "^"는 PN729 내에서의 결실된 잔기을 나타낸다.This example shows that the representative mutant polynucleotide delivery-promoting polypeptides generated by the residue substitutions and / or deletions listed in Table 28 are siRNA cell-absorbing activity or It demonstrates that it did not affect the MFI measurements. Amino acids highlighted in gray represent unmodified, substituted and / or deleted residues. Highlighted in gray to facilitate identification and to facilitate comparison of unmodified residues in PN73 peptides with substituted and / or deleted residues in representative mutant polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, PN644, PN645, PN646, PN647 and PN729. . Substituted residues in representative mutant polynucleotide delivery-enhancing polypeptides are underlined in bold. In addition, the bold underlined symbol "^" represents a deleted residue in PN729.

잔기 치환이나 결실에 의하여 대표적인 돌연변이 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 발생시키는 목적은 siRNA 세포-흡수 활성 및 siRNA들이 세포들 내로 들어가는 효율에 미치는 이러한 변형물들의 효과를 평가하는 것이다.The purpose of generating representative mutant polynucleotide delivery-enhancing polypeptides by residue substitution or deletion is to assess the effect of these modifications on siRNA cell-absorbing activity and the efficiency of siRNAs entering cells.

표 28은 PN73 잔기 치환 및 결실 계열들을 나타낸 것이다:Table 28 shows the PN73 residue substitutions and deletion series:

펩티드 ID#Peptide ID # 서열 번호:SEQ ID NO: 아미노산 서열Amino acid sequence PN73PN73 5959 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ PN644PN644 173173 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYWVYVYKVLKQKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESY W VYVYKVLKQ PN645PN645 174174 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKWSYSVYVYKVLKQKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK W SYSVYVYKVLKQ PN646PN646 175175 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKFSYSVYVYKVLKQKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK F SYSVYVYKVLKQ PN647PN647 176176 KGSFKAVTKAQKKDGKKRKRSFKFSYSVYVYKVLKQKGS F KAVTKAQKKDGKKRKRS F K F SYSVYVYKVLKQ PN729PN729 177177 KGSFKAVTKAQKKFGKKRKRSRK^SFSVYVYKVLKQKGS F KAVTKAQKK F GKKRKRSRK ^ S F SVYVYKVLKQ

X = 치환된 아미노산을 나타냄; ^ = 결실된 아미노산; X = represents a substituted amino acid; ^ = Deleted amino acid;

대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73 내에서의 특이적인 잔기 치환들 및/또는 결실들은 방향족 아미노산들의 숫자를 변화 또는 증가시키고/시키거나 음으로 대전된 아미노산들의 숫자를 감소시키는 것을 포함한다. 단백질 세포막 투과를 용이하게 하는 상대적 비-극성(소수성) 특성과 능력으로 인하여 방향족 관능기들을 지닌 아미노산들(예컨대, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 그 유도체들)을 단백질들의 막 횡단(membrane spanning) 도메인들 내에서 발견한다. 음으로 대전된 아미노산들은 핵산들의 음으로 대전된 포스포디에스테르 골격을 반발하여 핵산들을 결합하는 단백질의 능력을 부여한다. 따라서, PN73 펩티드 내에서의 방향족 아미노산 치환들에 대한 이론적 근거는 펩티드의 세포 관통 기능의 향상 및/또는 펩티드의 핵산 결합을 향상시키는 음으로 대전된 아미노산들의 제거를 포함한다. 단순히 음으로 대전된 아미노산들을 제거하거나 음으로 대전된 아미노산을 양으로 대전되거나 중성인 아미노산으로 치환하여 펩티드의 핵산 결합 능력들도 증진될 수 있다.Specific residue substitutions and / or deletions in PN73, an exemplary polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, include changing or increasing the number of aromatic amino acids and / or reducing the number of negatively charged amino acids. Due to the relative non-polar (hydrophobic) nature and ability to facilitate protein cell membrane permeation, amino acids with aromatic functionalities (eg, phenylalanine, tyrosine, tryptophan and derivatives thereof) are incorporated into the membrane spanning domains of proteins. Found in. Negatively charged amino acids repel the negatively charged phosphodiester backbone of nucleic acids and confer the ability of proteins to bind nucleic acids. Thus, the rationale for aromatic amino acid substitutions in PN73 peptides includes the enhancement of the peptide's cell penetrating function and / or the removal of negatively charged amino acids that enhance the peptide's nucleic acid binding. The nucleic acid binding capacities of the peptide can also be enhanced by simply removing negatively charged amino acids or replacing negatively charged amino acids with positively charged or neutral amino acids.

siRNA 세포-흡수 시험법 및 MFI 측정을 앞서 상술한 바대로 실시하였다. 하기 표 29에 그에 대한 데이터를 요약해 두었다. 0.63 μM, 1.25 μM, 2.5 μM 및 5 μM 농도들에서 각각의 펩티드를 시험하였다. 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73 내에서의 잔기 치환 및/또는 결실들이 있어도, siRNA 세포-흡수 활성 및 돌연변이 펩티드들의 MFI 측정은 무변형 PN73의 것과 동등하게 유지된다는 것을 결과들은 보여준다. 이러한 데이터는 잔기 교체들 및/또는 결실들은 핵산을 결합시키고 세포막을 관통하는 펩티드의 능력에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 세포 생존도는 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN73 내에서의 치환되고/되거나 결실된 잔기들에 의해 영향받지 않았다.siRNA cell-absorption assays and MFI measurements were performed as described above. Table 29 summarizes the data therefor. Each peptide was tested at concentrations of 0.63 μM, 1.25 μM, 2.5 μM and 5 μM. Although there are residue substitutions and / or deletions in PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, the results show that siRNA cell-absorbing activity and MFI measurements of mutant peptides remain equivalent to that of unmodified PN73. These data indicate that residue replacements and / or deletions do not affect the peptide's ability to bind nucleic acids and penetrate cell membranes. In addition, cell viability was not affected by substituted and / or deleted residues in PN73, a representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptide.

표 29는 PN73 돌연변이 매개성 siRNA 전달 특성들을 요약한 것이다:Table 29 summarizes the PN73 mutation mediated siRNA delivery properties:

펩티드 ID#Peptide ID # 농도density % siRNA 세포-흡수% siRNA cell-absorption siRNA Cy5 MFIsiRNA Cy5 MFI % 세포 생존도% Cell viability 비처리Untreated N/AN / A 0 %0 % 22 92 %92% PN73  PN73 0.63 μM0.63 μM 52 %52% 22 87 %87% 1.25 μM1.25 μM 62 %62% 44 82 %82% 2.5 μM2.5 μM 74 %74% 1414 88 %88% 5 μM5 μM 91 %91% 2222 93 %93% PN644  PN644 0.63 μM0.63 μM 67 %67% 44 88 %88% 1.25 μM1.25 μM 71 %71% 88 90 %90% 2.5 μM2.5 μM 70 %70% 2424 86 %86% 5 μM5 μM 83 %83% 3737 87 %87% PN645  PN645 0.63 μM0.63 μM 68 %68% 55 84 %84% 1.25 μM1.25 μM 70 %70% 1111 89 %89% 2.5 μM2.5 μM 78 %78% 2121 90 %90% 5 μM5 μM 88 %88% 2828 90 %90% PN646  PN646 0.63 μM0.63 μM 67 %67% 44 81 %81% 1.25 μM1.25 μM 70 %70% 1010 85 %85% 2.5 μM2.5 μM 73 %73% 2424 87 %87% 5 μM5 μM 88 %88% 2424 92 %92% PN647  PN647 0.63 μM0.63 μM 71 %71% 1313 85 %85% 1.25 μM1.25 μM 74 %74% 3434 83 %83% 2.5 μM2.5 μM 83 %83% 3939 88 %88% 5 μM5 μM 85 %85% 4141 87 %87% PN729  PN729 0.63 μM0.63 μM 61 %61% 44 82 %82% 1.25 μM1.25 μM 69 %69% 1010 91 %91% 2.5 μM2.5 μM 79 %79% 1616 92 %92% 5 μM5 μM 86 %86% 3030 90 %90%

이러한 결과들은 예를 들어 아미노산 치환들이나 결실들 또는 그 양쪽의 결합들을 통하여 발생된 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 변형물들은 높은 퍼센티지의 세포들로 siRNA를 높은 효율로 전달한다는 것을 보여주었다. These results showed that, for example, modifications of representative polynucleotide delivery-enhancing polypeptides generated through amino acid substitutions or deletions or combinations of both deliver high efficiency of siRNA to high percentage cells.

실시예Example 21 :  21: siRNAsiRNA 세포-흡수 활성을 매개하는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 Polynucleotide Delivery-Promoting Polypeptides Mediating Cell-Absorption Activity

본 실시예는 siRNA와 복합된 표 30에 수록되어 있는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 대한 siRNA 세포-흡수 활성의 효과를 도시한다. 표 31은 폴리펩티드들 각각에 대한 siRNA 세포-흡수 데이터, 평균 형광 세기(MFI) 측정 및 세포 생존도 데이터를 요약한 것이다. 75 % 이상의 퍼센트 siRNA 세포-흡수율을 달성한 폴리펩티드들을 "처리" 칼럼 내에 회색으로 강조해 두었다. 이러한 강조된 siRNA/펩티드 복합체들의 각각에 대한 특이적인 퍼센트 siRNA 세포-흡수율을 "% siRNA 세포-흡수" 칼럼에 회색으로 또한 강조해 두었다.This example shows the effect of siRNA cell-absorbing activity on the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides listed in Table 30 in combination with siRNA. Table 31 summarizes siRNA cell-absorption data, mean fluorescence intensity (MFI) measurements and cell viability data for each of the polypeptides. Polypeptides that achieved at least 75% percent siRNA cell-absorption were highlighted in gray in the "treatment" column. Specific percent siRNA cell-absorption rates for each of these highlighted siRNA / peptide complexes are also highlighted in gray in the “% siRNA cell-absorption” column.

표 30은 siRNA 세포-흡수 활성에 대하여 스크리닝된 전달-증진 폴리펩티드들을 나타낸 것이다: Table 30 shows the delivery-promoting polypeptides screened for siRNA cell-absorbing activity:

펩티드 ID#Peptide ID # 서열 번호:SEQ ID NO: 아미노산 서열Amino acid sequence 명칭designation PN680PN680 178178 RSVCRQIKICRRRGGCYYKCTNRPY-아미드RSVCRQIKICRRRGGCYYKCTNRPY-amide 안드록토닌(androctonin)Androctonin PN665PN665 179179 GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGDQE-아미드GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGDQE-amide 파라닥신(paradaxin)Paradaxin PN734PN734 180180 GTAMRILGGVIPRKKRRQRRRPPQ-아미드GTAMRILGGVIPRKKRRQRRRPPQ-amide m-칼페인(Calpain)+TATm-Calpain + TAT PN681PN681 181181 KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK-아미드KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK-amide MARCKSMARCKS PN694PN694 182182 RQIKIWFQNRRMKWKK-아미드RQIKIWFQNRRMKWKK-amide 페네트라틴(penetratin)Penetratin PN714PN714 183183 RQIRIWFQNRRMRWRR-아미드RQIRIWFQNRRMRWRR-amide PenArgPenarg PN760PN760 184184 RKKRRQRRRPVAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA-아미드RKKRRQRRRPVAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA-amide TAT+펩티드 P3aTAT + Peptide P3a PN759PN759 185185 LGLLLRHLRHHSNLLANIPRKKRRQRRRPP-아미드LGLLLRHLRHHSNLLANIPRKKRRQRRRPP-amide 빈딘(Bindin)+TATBindin + TAT PN682PN682 186186 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-아미드KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-amide Pep-1Pep-1

본 실시예에서 siRNA 세포-흡수 시험법은 펩티드가 존재하는 경우 Cy5-접합된 LC20 siRNA를 받아들이는 세포들의 숫자를 측정한다. LC20은 인간 종양 괴사 인자-알파(hTNF-α) mRNA의 siRNA 표적에 사용되는 올리고이다. 세포들에 의한 siRNA 흡수를 유동 세포계측법으로 평가하였다. Cy5-접합성 siRNA를 포함하는 세포들의 숫자를 배양중인 형질감염된 세포들과 형질감염되지 않은 세포들의 전체 숫자들로 나누어 계산한 퍼센티지로 흡수를 표현하였다. 유동 세포계측법으로 평균 형광 세기(MFI)를 측정하였고 세포들 내에서 발견되는 Cy5-접합성 siRNA의 수량을 측정하였다. MFI 수치는 세포 내에서 발견되는 Cy5-접합성 siRNA의 수량과 직접 비례하므로, MFI 수치가 높으면 높을수록 세포들 내의 Cy5-접합성 siRNA의 더 큰 숫자를 나타낸다.The siRNA cell-absorption assay in this example measures the number of cells that accept Cy5-conjugated LC20 siRNA when a peptide is present. LC20 is an oligo used for siRNA targets of human tumor necrosis factor-alpha (hTNF-α) mRNA. SiRNA uptake by cells was assessed by flow cytometry. Uptake was expressed as a percentage calculated by dividing the number of cells containing Cy5-conjugated siRNA by the total number of transfected and non-transfected cells in culture. Mean fluorescence intensity (MFI) was measured by flow cytometry and the yield of Cy5-conjugated siRNA found in the cells. Since MFI levels are directly proportional to the quantity of Cy5-conjugated siRNAs found in the cells, higher MFI levels indicate greater numbers of Cy5-conjugated siRNAs in the cells.

하기의 프로토콜을 사용하여 표 30에 수록된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 시험하였다. 약 80,000 개의 쥐 꼬리 섬유아세포(MTF) 세포들을 완전 배지 내에 형질감염하기 전날에 24-웰 플레이트들 내에서 웰당 플레이트시켰다. 양성 대조군를 제외하고는, 각각의 전달 펩티드를 0.5 μM Cy5-접합성 siRNA의 존재하에 0.63 μM, 2.5 μM, 10 μM 및 40 μM 농도들에서 시험하였다. siRNA/펩티드 복합체들에 대하여, 최종 농도의 2 배인 Opti-MEM

Figure 112008025338980-PCT00029
배지(Invitrogen) 내에서 Cy5-접합성 siRNA 및 펩티드를 따로 희석시켰다. siRNA와 펩티드 각각의 부피들을 혼합하여 상온에서 5 분 동안 복합시켰다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 사전에 세척한 세포들에 siRNA/펩티드 복합체들을 첨가하였다. 세포들을 37 ℃, 5 % CO2에서 3 시간 동안 형질감염시켰다. 세포들을 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리한 후에 유동 세포 계측법으로 분석하였다. siRNA 세포-흡수를 세포간 Cy5 형광의 세기로 측정하였다. 프로피디움 요오드화물 또는 AnnexinV-PE(BD Biosciences) 염색법을 이용하여 세포 생존도를 측정하였다. 라벨된 siRNA(또는 플루오레세인-라벨된 펩티드)의 막 삽입으로부터 세포 흡수를 구별짓기 위하여, 트립판 블루를 사용하여 세포막 표면상의 임의의 형광을 퀀칭하였다. 트립판 블루(Sigma)를 세포들에 최종 농도 0.04 %까지 첨가하였고 유동 세포 계측기 상에 재-시동하여 세포막에 편재되어 있는 형광을 나타내는 형광 세기에서 임의의 변화가 있는지의 여부를 평가하였다.The polynucleotide delivery-enhancing polypeptides listed in Table 30 were tested using the following protocol. About 80,000 rat tail fibroblast (MTF) cells were plated per well in 24-well plates the day before transfection in complete medium. Except for the positive control, each delivery peptide was tested at 0.63 μM, 2.5 μM, 10 μM and 40 μM concentrations in the presence of 0.5 μM Cy5-conjugated siRNA. For siRNA / peptide complexes, Opti-MEM at twice the final concentration
Figure 112008025338980-PCT00029
Cy5-conjugated siRNA and peptide were diluted separately in medium (Invitrogen). Volumes of each of the siRNA and peptide were mixed and combined for 5 minutes at room temperature. SiRNA / peptide complexes were added to cells previously washed with phosphate buffered saline (PBS). Cells were transfected at 37 ° C., 5% CO 2 for 3 hours. Cells were washed with PBS, treated with trypsin and analyzed by flow cytometry. siRNA cell-absorption was measured by the intensity of intracellular Cy5 fluorescence. Cell viability was measured using propidium iodide or AnnexinV-PE (BD Biosciences) staining. To distinguish cell uptake from membrane insertion of labeled siRNA (or fluorescein-labeled peptide), trypan blue was used to quench any fluorescence on the cell membrane surface. Trypan Blue (Sigma) was added to the cells to a final concentration of 0.04% and re-started on a flow cytometer to assess whether there was any change in fluorescence intensity indicating fluorescence localized on the cell membrane.

표 31은 폴리펩티드 매개성 siRNA 전달 스크린의 데이터(NT = 무시험)를 나타낸 것이다: Table 31 shows the data of the polypeptide mediated siRNA delivery screen (NT = no test):

처리 (siRNA/폴리펩티드 복합체)Treatment (siRNA / polypeptide complexes) 펩티드 농도Peptide concentration % siRNA 세포- 흡수% siRNA cell-uptake Cy5-siRNA MFI Cy5-siRNA MFI % 세포 생존도% Cell viability 비처리Untreated N/AN / A 0.0 %0.0% 0.00.0 97.6 %97.6% Cy5-LC20 + PN643 (양성 대조군)Cy5-LC20 + PN643 (positive control) 5 μM 5 μM 95.4 % 95.4% 7.2 7.2 98.8 % 98.8% Cy5-LC20 + PN680  Cy5-LC20 + PN680 0.63 μM0.63 μM 0.2 %0.2% N/TN / T 98.2 %98.2% 2.5 μM2.5 μM 1.8 %1.8% 1.41.4 98.3 %98.3% 10 μM10 μM 82.6 %82.6% 4.54.5 99.2 %99.2% 40 μM40 μM 79.1 %79.1% 5.25.2 95.7 %95.7% Cy5-LC20 + PN665  Cy5-LC20 + PN665 0.63 μM0.63 μM 0.0 %0.0% N/TN / T 97.7 %97.7% 2.5 μM2.5 μM 0.6 %0.6% N/TN / T 95.1 %95.1% 10 μM10 μM N/TN / T N/TN / T N/TN / T 40 μM40 μM N/TN / T N/TN / T N/TN / T Cy5-LC20 + PN734  Cy5-LC20 + PN734 0.63 μM0.63 μM 0.1 %0.1% N/TN / T 98.2 %98.2% 2.5 μM2.5 μM 0.2 %0.2% N/TN / T 98.7 %98.7% 10 μM10 μM 1.2 %1.2% 1.31.3 98.4 %98.4% 40 μM40 μM 4.5 %4.5% 1.61.6 97.0 %97.0% Cy5-LC20 + PN681  Cy5-LC20 + PN681 0.63 μM0.63 μM 0.2 %0.2% 1.81.8 97.1 %97.1% 2.5 μM2.5 μM 69.9 %69.9% 4.64.6 98.9 %98.9% 10 μM10 μM 97.3 %97.3% 15.315.3 98.2 %98.2% 40 μM40 μM 91.2 %91.2% 13.713.7 92.6 %92.6% Cy5-LC20 + PN694  Cy5-LC20 + PN694 0.63 μM0.63 μM 0.2 %0.2% 1.41.4 97.1 %97.1% 2.5 μM2.5 μM 0.2 %0.2% 1.81.8 97.9 %97.9% 10 μM10 μM 48.0 %48.0% 4.24.2 97.8 %97.8% 40 μM40 μM 54.0 %54.0% 3.93.9 83.6 %83.6% Cy5-LC20 + PN714  Cy5-LC20 + PN714 0.63 μM0.63 μM 0.4 %0.4% 1.21.2 95.1 %95.1% 2.5 μM2.5 μM 0.5 %0.5% 2.32.3 96.4 %96.4% 10 μM10 μM 19.1 %19.1% 2.52.5 97.6 %97.6% 40 μM40 μM 43.0 %43.0% 4.94.9 94.7 %94.7% Cy5-LC20 + PN709  Cy5-LC20 + PN709 0.63 μM0.63 μM 0.1 %0.1% 1.01.0 94.0 %94.0% 2.5 μM2.5 μM 0.2 %0.2% 1.01.0 96.6 %96.6% 10 μM10 μM 18.6 %18.6% 1.91.9 97.1 %97.1% 40 μM40 μM 76.6 %76.6% 5.85.8 97.1 %97.1% Cy5-LC20 + PN760  Cy5-LC20 + PN760 0.63 μM0.63 μM 60 %60% 2.92.9 84.7 %84.7% 2.5 μM2.5 μM 85.5 %85.5% 78.578.5 90.8 %90.8% 10 μM10 μM 90.6 %90.6% 96.996.9 91.9 %91.9% 40 μM40 μM 82.8 %82.8% 77.477.4 83.2 %83.2% Cy5-LC20 + PN759  Cy5-LC20 + PN759 0.63 μM0.63 μM 43 %43% 2.12.1 81.7 %81.7% 2.5 μM2.5 μM 72.9 %72.9% 7.37.3 85.2 %85.2% 10 μM10 μM 83.6 %83.6% 40.940.9 86.7 %86.7% 40 μM40 μM 25 %25% 10.510.5 26.6 %26.6% Cy5-LC20 + PN682  Cy5-LC20 + PN682 0.63 μM0.63 μM 52.1 %52.1% 2.42.4 86.2 %86.2% 2.5 μM2.5 μM 50.6 %50.6% 2.22.2 91.3 %91.3% 10 μM10 μM 56.9 %56.9% 2.32.3 90.6 %90.6% 40 μM40 μM 92 %92% 9.09.0 97.1 %97.1%

표 31의 "% siRNA 세포-흡수"로 명명된 칼럼 내에 보여진 바와 같이, "비처리" 음성 대조군은 siRNA 세포-흡수를 보여주지 않은 반면에 양성 대조군 펩티드는 95 %의 퍼센트 siRNA 세포-흡수 활성을 달성하였다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN680; PN681; PN709; PN760; PN759 또는 PN682와 복합된 Cy5 접합된 LC20 siRNA는 75 % 이상을 초과하는 퍼센트 siRNA 세포-흡수 활성을 달성하였다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN694 및PN714는 각각 54 % 및 43 %의 중간 정도의 siRNA 세포-흡수 활성을 보였다. 이에 반하여, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN665 및 PN734는 상당한 siRNA 세포 흡수 활성을 보여주지 않았다(5 % 미만).As shown in the column named "% siRNA cell-absorption" in Table 31, the "untreated" negative control did not show siRNA cell-absorption, whereas the positive control peptide had a 95% percent siRNA cell-absorption activity. Achieved. PN680, a polynucleotide delivery-enhancing polypeptides; PN681; PN709; PN760; Cy5 conjugated LC20 siRNA complexed with PN759 or PN682 achieved greater than 75% percent siRNA cell-absorbing activity. Polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, PN694 and PN714, showed moderate siRNA cell-absorbing activity of 54% and 43%, respectively. In contrast, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptides PN665 and PN734 did not show significant siRNA cell uptake activity (less than 5%).

평균 형광 세기(MFI)를 분석하여 세포들 내로 siRNA들을 형질감염시키는 능력에 대하여 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 더 특성화시켰다. 세포 흡수 시험법이 Cy5-접합성 siRNA를 포함하는 세포들의 퍼센티지를 측정하였던 반면에, MFI 측정은 세포들 내로 들어가는 Cy5-접합성 siRNA의 상대적 평균 수량을 측정하였다. 표 31의 "siRNA Cy5 MFI"로 명명된 칼럼 내에서 보여진 바와 같이, 양성 대조군 펩티드 PN643에 의한 Cy5-접합성 siRNA의 전달은 약 7 유니트들 정도의 MFI를 달성하였다. 예상한 바와 같이, "비처리" 음성 대조군는 측정할 만한 MFI를 가지지 않았다. MFI에 의하여 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN665를 시험하지 않았다. PN743, PN694 및 PN714는 양성 대조군의 MFI 측정보다는 상당히 더 낮은 MFI 측정을 보였다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN680, PN709 및 PN682는 PN643 양성 대조군의 MFI 측정에 필적할 만한 MFI 측정을 보인 반면에 PN681은 양성 대조군의 것보다 2 배인 MFI를 보였다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN760 및 PN759는 양성 대조군의 것보다 각각 약 13-배 및 6-배 더 높은 MFI 측정을 보였다.Mean fluorescence intensity (MFI) was analyzed to further characterize polynucleotide delivery-enhancing polypeptides for their ability to transfect siRNAs into cells. Whereas cell uptake assays measured the percentage of cells containing Cy5-conjugated siRNAs, MFI measurements determined the relative average quantity of Cy5-conjugated siRNAs entering the cells. As shown in the column named “siRNA Cy5 MFI” in Table 31, delivery of Cy5-conjugated siRNA by positive control peptide PN643 achieved about 7 units of MFI. As expected, the "untreated" negative control did not have measurable MFI. PFI, a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, was not tested by MFI. PN743, PN694 and PN714 showed significantly lower MFI measurements than the MFI measurements of the positive control. The polynucleotide delivery-enhancing polypeptides PN680, PN709 and PN682 showed MFI measurements comparable to the MFI measurements of the PN643 positive control, while PN681 showed MFI twice that of the positive control. Polynucleotide delivery-enhancing polypeptides, PN760 and PN759, showed about 13- and 6-fold higher MFI measurements than those of the positive control, respectively.

이러한 데이터는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN680; PN681; PN709; PN760; PN759 및 PN682가 siRNA와 복합될 경우 siRNA를 세포내로 효과적으로 전달한다는 것을 보여준다.Such data include PN680, a polynucleotide delivery-enhancing polypeptides; PN681; PN709; PN760; PN759 and PN682, when combined with siRNA, show effective delivery of siRNA into cells.

실시예Example 22 :폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들로 세포 내로 형질감염된  22: Transfected into cells with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides siRNAsiRNA 들의 유전자 발현 넉 다운 활성Gene knockdown activity

본 실시예는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들과 복합된 siRNA는 siRNA 표적 유전자의 넉 다운 mRNA 발현을 효과적으로 넉 다운시킨다는 것을 실증한다. 상세하게는, 인간 종양 괴사 인자-α(hTNF-α) 유전자의 발현을 조절하는 siRNA/펩티드 복합체들의 능력을 평가하였다. hTNF-α 유전자를 표적하는 중요성은 인간 및 다른 포유류 피검물들 내에서 과잉-발현될 경우에 류마티스성 관절염(RA)의 발생 또는 진행을 조절하는데 함축되어 있다는 것이다.This example demonstrates that siRNA complexed with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides effectively knock down mRNA expression of siRNA target genes. Specifically, the ability of siRNA / peptide complexes to regulate expression of human tumor necrosis factor-α (hTNF-α) genes was evaluated. The importance of targeting the hTNF-α gene is implied in controlling the development or progression of rheumatoid arthritis (RA) when over-expressed in human and other mammalian specimens.

인간 단구세포들을 모델 시스템으로 사용하여 hTNF-α 유전자 발현에 미치는 siRNA/펩티드 복합체들의 효과를 측정하였다. Qneg는 무작위 siRNA 서열을 나타내며 음성 대조군로 작용하였다. 관찰된 Qneg 넉 다운 활성을 100 %로 정규화하고(100 % 유전자 발현 수준들) 하기 siRNA들인 A19S21, 21/21 MD8 및 LC20 각각에 대한 넉 다운 활성을 음성 대조군의 상대적 백분율로 제시한다. A19S21 MD8, 21/21 MD8 및 LC20은 hTNF-α mRNA를 표적하는 siRNA들이다.Human monocytes were used as a model system to measure the effect of siRNA / peptide complexes on hTNF-α gene expression. Qneg represents a random siRNA sequence and served as a negative control. The observed Qneg knock down activity was normalized to 100% (100% gene expression levels) and the knock down activity for each of the following siRNAs A19S21, 21/21 MD8 and LC20 is shown as relative percentage of negative control. A19S21 MD8, 21/21 MD8 and LC20 are siRNAs that target hTNF-α mRNA.

폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN602는 이전 실험들에서 사용된 약성 통제의 아세틸화된 형태를 나타내고 여기에서는 siRNA의 인간 단구세포들로의 효과적인 전달 및 siRNA에 의해 매개되는 hTNF-α mRNA 수준들의 허용(permissive) 넉 다운 활성에 대한 양성 통제로 이용된다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들인 PN680 및 PN681을 상기 수록된 siRNA들과 복합하여 인간 단구세포들 내에서 hTNF-α mRNA 수준들을 감소시키는 siRNA의 각각의 능력에 미치는 그 효과를 측정하였다. 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들 3 가지 모두의 넉 다운 활성을 하기 표 32에 요약해 두었다. "넉 다운 활성" 칼럼 내의 "+"는 펩티드/siRNA 복합체는 Qneg 음성 대조군 siRNA의 80 % 넉 다운 활성(Qneg 음성 대조군와 비교하여 mRNA 수준들이 20 % 감소)을 가졌다는 것을 나타낸다. "+/-"는 펩티드/siRNA 복합체가 Qneg 음성 대조군 siRNA의 약 90 % 넉 다운 활성(Qneg 음성 대조군와 비교하여 mRNA 수준들이 10 % 감소)을 가졌다는 것을 나타낸다. 최종적으로, "-"는 펩티드/siRNA 복합체는 Qneg 음성 대조군와 비교하여 상당한 넉 다운 활성을 전혀 가지지 않았다는 것을 나타낸다.PN602, a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, represents the acetylated form of weakness control used in previous experiments where it allows for efficient delivery of siRNA to human monocytes and the acceptance of hTNF-α mRNA levels mediated by siRNA ( permissive) is used as a positive control for knock down activity. The polynucleotide delivery-enhancing polypeptides PN680 and PN681 were combined with the siRNAs listed above to determine their effect on the respective ability of siRNA to reduce hTNF-α mRNA levels in human monocytes. The knock down activity of all three polynucleotide delivery-enhancing polypeptides is summarized in Table 32 below. "+" In the "knock down activity" column indicates that the peptide / siRNA complex had 80% knock down activity (20% decrease in mRNA levels compared to Qneg negative control) of the Qneg negative control siRNA. "+/-" indicates that the peptide / siRNA complex had about 90% knock down activity of the Qneg negative control siRNA (10% decrease in mRNA levels compared to the Qneg negative control). Finally, "-" indicates that the peptide / siRNA complex had no significant knock down activity compared to the Qneg negative control.

상술한 프로토콜들에 따라서 본 실시예에서 인간 단구세포들 내에서의 형질감염들을 실시하였다.Transfections in human monocytes were performed in this example according to the protocols described above.

mRNA 측정을 위해, Genospectra 사(CA)의 브랜치 DNA 기술을 제작자 명세서에 따라서 사용하였다. 세포들 내에서의 mRNA 수준을 정량화하기 위하여, 하우스 키핑 유전자(cypB) 및 표적 유전자(TNF-α) mRNA 양쪽 모두를 측정하였고, TNF-α에 대한 눈금을 cypB와 정규화하여 상대 형광 단위를 얻었다.For mRNA measurements, branch DNA technology from Genospectra (CA) was used according to the manufacturer's specification. To quantify mRNA levels in cells, both housekeeping gene (cypB) and target gene (TNF-α) mRNAs were measured, and the scale for TNF-α was normalized with cypB to obtain relative fluorescence units.

표 32는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들과 복합된 siRNA들에 대한 siRNA 넉 다운 활성을 나타낸 것이다: Table 32 shows siRNA knock down activity for siRNAs complexed with polynucleotide delivery-enhancing polypeptides:

펩티드 Peptide IDID ## siRNAsiRNA :펩티드Peptide 비율ratio siRNAsiRNA A19S21 MD8A19S21 MD8 21/21 MD821/21 MD8 LC20LC20 PN602 (양성 대조군)PN602 (positive control) 1:51: 5 +/-+/- +/-+/- +/-+/- 1:101:10 +/-+/- +/-+/- +/-+/- PN680 PN680 1:51: 5 ++ ++ ++ 1:101:10 +/-+/- +/-+/- ++ PN681 PN681 1:51: 5 +/-+/- -- -- 1:101:10 +/-+/- -- --

표 32에 보인 결과들은 양성 대조군 PN602 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 1:5 및 1:10의 비율들로 복합된 3가지 siRNA들 모두가 동일한 폴리펩티드와 복합된 Qneg 음성 대조군와 비교하여 hTNF-α 유전자 발현 수준들을 적당히 감소시킨다는 것을 보여준다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN681과 1:5 및 1:10으로 복합된 동일한 siRNA들은 Qneg 음성 대조군 siRNA/PN681 복합체와 비교하여 넉 다운 활성을 거의 보이지 않거나 전혀 보이지 않았다. 이에 반하여, hTNF-α mRNA 특이적 siRNA들과 1:5 비율로 복합된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN680은 Qneg/PN680 대조군 복합체와 비교하여 hTNF-α mRNA의 넉 다운 활성을 상당히 보여주었다. 또한, 1:10 비율의 LC20/PN680 복합체는 Qneg/PN680 대조군 복합체와 비교하여 상당한 넉 다운 활성을 또한 보여주었다.The results shown in Table 32 show hTNF-α gene expression compared to the Qneg negative control in which all three siRNAs complexed with the positive control PN602 polynucleotide delivery-enhancing polypeptide at a ratio of 1: 5 and 1:10 were combined with the same polypeptide. It is shown that the levels are moderately reduced. However, the same siRNAs complexed with the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN681 1: 5 and 1:10 showed little or no knockdown activity compared to the Qneg negative control siRNA / PN681 complex. In contrast, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide PN680 complexed with the hTNF-α mRNA specific siRNAs in a 1: 5 ratio showed significant knockdown activity of hTNF-α mRNA compared to the Qneg / PN680 control complex. In addition, the LC20 / PN680 complex at a 1:10 ratio also showed significant knock down activity compared to the Qneg / PN680 control complex.

이러한 데이터는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드인 PN680이 siRNA들을 세포들 내로 전달하고 효과적인 siRNA 매개성 유전자 침묵을 가능하게 한다는 것을 보여준다.These data show that PN680, a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide, delivers siRNAs into cells and enables effective siRNA mediated gene silencing.

선행 발명을 이해의 명확화를 위한 목적으로 예로서 상세히 설명하였지만, 제한이 아닌 예시의 방법으로 제시된 청구항들의 범위 내에서 몇 가지 변화와 수정을 할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 맥락에서, 설명의 간략화를 위하여 다양한 출간물들 및 다른 참조문헌들을 선행 개시물 내에서 인용하였다. 모든 목적을 위하여 이러한 참조문헌들 각각이 여기에 전체가 참조로 포함되어 있다. 그러나, 여기에 논의된 다양한 출간물들을 본 출원의 출원일 전에 그 개시의 목적으로만 통합하였고, 발명자들은 선행 발명에 의한 그러한 개시에 우선하는 권리를 보유한다.While the foregoing invention has been described in detail by way of example for purposes of clarity of understanding, it will be apparent to those skilled in the art that several changes and modifications may be made within the scope of the claims set forth by way of illustration and not limitation. In this context, various publications and other references have been cited within the preceding disclosure for simplicity of explanation. For all purposes, each of these references is incorporated herein by reference in its entirety. However, the various publications discussed herein have been incorporated only for the purpose of its disclosure prior to the filing date of the present application, and the inventors reserve the right to override such disclosure by prior invention.

SEQUENCE LISTING <110> NASTECH PHARMACEUTICAL COMPANY, INC. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF RIBONUCLEIC ACID TO A CELL <130> 04-03CIP-PCT <140> <141> <150> 11/223,699 <151> 2005-09-08 <150> 60/727,216 <151> 2005-10-14 <150> 60/733,664 <151> 2005-11-04 <160> 188 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 1 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown Penetratin PTD peptide <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> herpes simplex virus <400> 3 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Asp <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo 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Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown loligomer peptide <400> 11 Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown Arginine peptide <400> 12 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Amphiphilic model peptide <400> 13 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 14 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 15 Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 16 Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 17 Gly Val Phe Val Leu Gly Phe Leu Gly Phe Leu Ala Thr Ala Gly Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 18 Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala 1 5 10 15 <210> 19 <211> 56 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 19 Ala Cys Thr Cys Pro Tyr Cys Lys Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ser Gly 1 5 10 15 Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly 20 25 30 Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His 35 40 45 Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys 50 55 <210> 20 <211> 54 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 20 Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Asp Gly Glu Lys Arg Ser Gly Glu 1 5 10 15 Gln Gly Lys Lys Lys His Val Cys His Ile Pro Asp Cys Gly Lys Thr 20 25 30 Phe Arg Lys Thr Ser Leu Leu Arg Ala His Val Arg Leu His Thr Gly 35 40 45 Glu Arg Pro Phe Val Cys 50 <210> 21 <211> 55 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 21 Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Glu Gly Gly Gly Arg Gly Thr Asn 1 5 10 15 Leu Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Pro Gly Cys Gly Lys 20 25 30 Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Ser 35 40 45 Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys 50 55 <210> 22 <211> 56 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 22 Ala Cys Ser Cys Pro Asn Cys Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Ser Asn 1 5 10 15 Glu Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Glu Gly Cys Gly 20 25 30 Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His 35 40 45 Thr Gly Glu Arg Pro Phe Ile Cys 50 55 <210> 23 <211> 60 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 23 Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Thr Asn Glu Met Ser Gly Leu Pro Pro 1 5 10 15 Ile Val Gly Pro Asp Glu Arg Gly Arg Lys Gln His Ile Cys His Ile 20 25 30 Pro Gly Cys Glu Arg Leu Tyr Gly Lys Ala Ser His Leu Lys Thr His 35 40 45 Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Leu Cys 50 55 60 <210> 24 <211> 58 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 24 Thr Cys Asp Cys Pro Asn Cys Gln Glu Ala Glu Arg Leu Gly Pro Ala 1 5 10 15 Gly Val His Ile Arg Lys Lys Asn Ile His Ser Cys His Ile Pro Gly 20 25 30 Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg 35 40 45 Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys 50 55 <210> 25 <211> 53 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 25 Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Ala Ile Lys His Gly Asp Arg Gly 1 5 10 15 Ser Gln His Thr His Leu Cys Ser Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Tyr 20 25 30 Lys Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Lys His Thr Gly Asp 35 40 45 Arg Pro Phe Val Cys 50 <210> 26 <211> 56 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc finger motif <400> 26 Pro Gln Ile Ser Leu Lys Lys Lys Ile Phe Phe Phe Ile Phe Ser Asn 1 5 10 15 Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ser Arg Ile His Ile Cys His Leu Cys Asn 20 25 30 Lys Thr Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Gly His 35 40 45 Ala Gly Asn Lys Pro Phe Ala Cys 50 55 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary polypeptide <400> 27 Trp Trp Glu Thr Trp Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn 1 5 10 15 Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg 20 25 30 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary polypeptide <400> 28 Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary polypeptide <400> 29 Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 30 <211> 39 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary polypeptide <400> 30 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys 1 5 10 15 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys Lys Arg Arg 20 25 30 Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 35 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary polypeptide <400> 31 Gly Glu Gln Ile Ala Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Ile Asp Ile Ile Leu 1 5 10 15 Lys Lys Lys Lys Ser Lys 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic siRNA <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 32 cuacacaaau cagcgauuut t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic siRNA <220> <223> Description of Unknown Organism: Synthetic siRNA <400> 33 aaaucgcuga uuuguguagt t 21 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 34 gcaagcugac ccugaaguuc au 22 <210> 35 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly 20 25 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys 1 5 10 <210> 37 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 20 25 <210> 38 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys 20 25 <210> 39 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Ala Ala Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 20 25 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 41 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly 20 25 <210> 42 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Tyr Gly Arg 1 5 10 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly 20 25 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Lys Leu Trp Lys Ala Trp Pro Lys Leu Trp Lys Lys Leu Trp Lys Pro 1 5 10 15 <210> 45 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Arg Leu Trp Arg Ala Leu Pro Arg Val Leu Arg Arg Leu Leu Arg Pro 1 5 10 15 <210> 47 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val 20 25 <210> 48 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val 20 25 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 20 25 <210> 50 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Leu Leu Glu Thr Leu Leu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg 1 5 10 15 Asn Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg 20 25 30 Arg <210> 51 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ala Ala Val Ala Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Thr Arg Gln 1 5 10 15 Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg Arg 20 25 <210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 54 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly 20 25 30 Phe Leu 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Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser 1 5 10 15 Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 20 25 <210> 59 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys 20 25 30 Val Leu Lys Gln 35 <210> 60 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 20 25 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 1 5 10 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln 20 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala 1 5 10 15 Asn Ile <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Gly Gln Met Ser Glu Ile Glu Ala Lys Val Arg Thr Val Lys Leu Ala 1 5 10 15 Arg Ser <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Lys Leu Trp Ser Ala Trp Pro Ser Leu Trp Ser Ser Leu Trp Lys Pro 1 5 10 15 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 72 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Ala Ala Arg Leu His Arg Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Ser Thr Glu 1 5 10 15 Met Arg Arg Arg Arg 20 <210> 73 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Gly Leu Gly Ser Leu Leu Lys Lys Ala Gly Lys Lys Leu Lys Gln Pro 1 5 10 15 Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 74 Xaa Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 1 5 10 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Trp Arg Phe Lys 1 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Trp Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 1 5 10 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Tyr Arg Phe Lys 1 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Trp Arg Phe Lys Lys Ser Lys Arg Lys Val 1 5 10 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Trp Arg Phe Lys Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ala Pro 20 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 81 Xaa Arg Phe Lys 1 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Tyr Arg Phe Lys 1 <210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 83 Xaa Arg Phe Lys 1 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Trp Arg Phe Lys 1 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 85 Xaa Tyr Arg Trp Lys 1 5 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> DiMethylTyrosine <400> 86 Lys Phe Arg Xaa 1 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys 1 5 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys 1 5 10 <210> 89 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ala Ala Val Ala 1 5 10 15 Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 20 25 <210> 90 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys 20 25 30 Val Leu Lys Gln 35 <210> 91 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Arg Gly Ser Arg Arg Ala Val Thr Arg Ala Gln Arg Arg Asp Gly Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Ser Arg Arg Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Arg 20 25 30 Val Leu Arg Gln 35 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 93 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 94 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 20 25 <210> 95 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 96 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val Cys 20 25 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 1 5 10 15 <210> 98 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys 20 25 30 Val Leu Lys Gln 35 <210> 99 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys 20 25 30 Gln <210> 100 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg 1 5 10 15 Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 20 25 30 <210> 101 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser 1 5 10 15 Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 20 25 <210> 102 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp 1 5 10 15 Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly 20 25 <210> 103 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys 20 25 30 Val Leu Lys Gln 35 <210> 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114 ugacaagccu guagcccau 19 <210> 115 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 115 ggucuacuuu gggaucauu 19 <210> 116 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 116 cccagggacc ucucucuaa 19 <210> 117 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 117 aaucggcccg acuaucucga cuu 23 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 118 aauggcgugg agcugagaga u 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 119 aaccuccucu cugccaucaa g 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 120 aacugaaagc augauccggg a 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> 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Sequence: Synthetic siRNA <400> 127 aagggaccuc ucucuaauca g 21 <210> 128 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 128 ccucagccuc uucuccuucc uga 23 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 129 aauccucagc cucuucuccu u 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 130 aaccaaugcc cuccuggcca a 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 131 cugauuaagu ugucuaaaca a 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 132 ccgacucagc gcugagauca a 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 133 cuugugauua uuuauuauuu a 21 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Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 140 ugacaagccu guagcccau 19 <210> 141 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 141 gccuguagcc cauguugua 19 <210> 142 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 142 uagcccaugu uguagcaaa 19 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 143 ccaaugcccu ccuggccaa 19 <210> 144 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 144 ccaauggcgu ggagcugag 19 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 145 ggcguggagc ugagagaua 19 <210> 146 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 146 gcguggagcu gagagauaa 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of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 153 gcaggucuac uuugggauc 19 <210> 154 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 154 ggucuacuuu gggaucauu 19 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 155 ugggaucauu gcccuguga 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 156 ggucggaacc caagcuuag 19 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 157 ccagaaugcu gcaggacuu 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 158 gagaagaccu caccuagaa 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA <400> 159 gaagaccuca ccuagaaau 19 <210> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 168 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 1 5 10 15 <210> 169 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 1 5 10 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 170 Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 1 5 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 171 Tyr Lys Val Leu Lys Gln 1 5 <210> 172 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 172 Lys Val Leu Lys Gln 1 5 <210> 173 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 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<211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 177 Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Phe Gly Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Ser Phe Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val 20 25 30 Leu Lys Gln 35 <210> 178 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 178 Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys 1 5 10 15 Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr 20 25 <210> 179 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 179 Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Asp Gln 20 25 30 Glu <210> 180 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 180 Gly Thr Ala Met Arg Ile Leu Gly Gly Val Ile Pro Arg Lys Lys Arg 1 5 10 15 Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 20 <210> 181 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 181 Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser 1 5 10 15 Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys 20 25 <210> 182 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 182 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 183 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 183 Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg 1 5 10 15 <210> 184 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 184 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Val Ala Tyr Ile Ser 1 5 10 15 Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe 20 25 30 Thr Arg Gln 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<223> variable residue <400> 188 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His 20                                SEQUENCE LISTING <110> NASTECH PHARMACEUTICAL COMPANY, INC. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF       RIBONUCLEIC ACID TO A CELL <130> 04-03 CIP-PCT <140> <141> <150> 11 / 223,699 <151> 2005-09-08 <150> 60 / 727,216 <151> 2005-10-14 <150> 60 / 733,664 <151> 2005-11-04 <160> 188 <170> Patent In Ver. 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 1 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg   1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Unknown       Penetratin PTD peptide <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys   1 5 10 15 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> herpes simplex virus <400> 3 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr   1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg 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Exemplary zinc       finger motif <400> 22 Ala Cys Ser Cys Pro Asn Cys Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Ser Asn   1 5 10 15 Glu Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Glu Gly Cys Gly              20 25 30 Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His          35 40 45 Thr Gly Glu Arg Pro Phe Ile Cys      50 55 <210> 23 <211> 60 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc       finger motif <400> 23 Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Thr Asn Glu Met Ser Gly Leu Pro Pro   1 5 10 15 Ile Val Gly Pro Asp Glu Arg Gly Arg Lys Gln His Ile Cys His Ile              20 25 30 Pro Gly Cys Glu Arg Leu Tyr Gly Lys Ala Ser His Leu Lys Thr His          35 40 45 Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Leu Cys      50 55 60 <210> 24 <211> 58 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Exemplary zinc       finger motif <400> 24 Thr Cys Asp Cys Pro Asn Cys Gln Glu Ala Glu Arg Leu Gly Pro Ala   1 5 10 15 Gly Val 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 35 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp   1 5 10 15 Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly              20 25 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 36 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys   1 5 10 <210> 37 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 37 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro   1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln              20 25 <210> 38 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 38 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro   1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys 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Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 47 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro   1 5 10 15 Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val              20 25 <210> 48 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 48 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro   1 5 10 15 Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val              20 25 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 49 Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val Ala Ala Val Ala   1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro              20 25 <210> 50 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 50 Leu Leu Glu Thr Leu Leu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg   1 5 10 15 Asn Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg 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58 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 58 Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser   1 5 10 15 Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln              20 25 <210> 59 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 59 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <210> 60 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 60 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu   1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu              20 25 <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 61 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys   1 5 10 15 Leu Ala         <210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 62 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys   1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val              20 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 63 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Gly   1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln              20 25 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 64 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg   1 5 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 65 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln   1 5 10 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 66 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln   1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln              20 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 67 Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys   1 5 10 15 <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 68 Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala   1 5 10 15 Asn yle         <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 69 Gly Gln Met Ser Glu Ile Glu Ala Lys Val Arg Thr Val Lys Leu Ala   1 5 10 15 Arg ser         <210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 70 Lys Leu Trp Ser Ala Trp Pro Ser Leu Trp Ser Ser Leu Trp Lys Pro   1 5 10 15 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 71 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys   1 5 <210> 72 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 72 Ala Ala Arg Leu His Arg Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Ser Thr Glu   1 5 10 15 Met Arg Arg Arg Arg              20 <210> 73 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 73 Gly Leu Gly Ser Leu Leu Lys Lys Ala Gly Lys Lys Leu Lys Gln Pro   1 5 10 15 Lys Ser Lys Arg Lys Val              20 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 74 Xaa Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln   1 5 10 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 75 Trp Arg Phe Lys   One <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 76 Trp Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln   1 5 10 <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 77 Tyr Arg Phe Lys   One <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 78 Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys   1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 79 Trp Arg Phe Lys Lys Ser Lys Arg Lys Val   1 5 10 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 80 Trp Arg Phe Lys Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala   1 5 10 15 Leu Leu Ala Pro              20 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 81 Xaa Arg Phe Lys   One <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 82 Tyr Arg Phe Lys   One <210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 83 Xaa Arg Phe Lys   One <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 84 Trp Arg Phe Lys   One <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> DiMethylTyrosine <400> 85 Xaa Tyr Arg Trp Lys   1 5 <210> 86 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> DiMethylTyrosine <400> 86 Lys Phe Arg Xaa   One <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 87 Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys   1 5 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 88 Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys   1 5 10 <210> 89 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 89 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ala Ala Val Ala   1 5 10 15 Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro              20 25 <210> 90 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 90 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <210> 91 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 91 Arg Gly Ser Arg Arg Ala Val Thr Arg Ala Gln Arg Arg Asp Gly Arg   1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Serg Ar Arg Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Arg              20 25 30 Val Leu Arg Gln          35 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 92 Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Asp Lys Lys   1 5 10 15 <210> 93 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 93 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu   1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu              20 25 <210> 94 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 94 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro   1 5 10 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln              20 25 <210> 95 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 95 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys   1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val              20 <210> 96 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 96 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly   1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val Cys              20 25 <210> 97 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 97 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln   1 5 10 15 <210> 98 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 98 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <210> 99 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 99 Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys   1 5 10 15 Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys              20 25 30 Gln     <210> 100 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 100 Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg   1 5 10 15 Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys 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Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 104 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys   1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val              20 <210> 105 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 105 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Ala Ala Val   1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro              20 25 <210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 106 Trp Arg Phe Lys Cys   1 5 <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 107 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys   1 5 10 15 Leu Ala         <210> 108 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 108 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu   1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu              20 25 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 109 gcguggagcu gagagauaa 19 <210> 110 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 110 gccuguagcc cauguugua 19 <210> 111 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 111 gguaugagcc caucuaucu 19 <210> 112 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 112 ccagggaccu cucucuaau 19 <210> 113 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 113 gcccgacuau cucgacuuu 19 <210> 114 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 114 ugacaagccu guagcccau 19 <210> 115 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 115 ggucuacuuu gggaucauu 19 <210> 116 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 116 cccagggacc ucucucuaa 19 <210> 117 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 117 aaucggcccg acuaucucga cuu 23 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 118 aauggcgugg agcugagaga u 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 119 aaccuccucu cugccaucaa g 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 120 aacugaaagc augauccggg a 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 121 aaucucgacu uugccgaguc u 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 122 aagggugacc gacucagcgc u 21 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 123 aaucagccgc aucgccgucu c 21 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 124 aacccaugug cuccucaccc a 21 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 125 aagcuccagu ggcugaaccg c 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 126 aagucagauc aucuucucga a 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 127 aagggaccuc ucucuaauca g 21 <210> 128 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 128 ccucagccuc uucuccuucc uga 23 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 129 aauccucagc cucuucuccu u 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 130 aaccaaugcc cuccuggcca a 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 131 cugauuaagu ugucuaaaca a 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 132 ccgacucagc gcugagauca a 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <133> 133 cuugugauua uuuauuauuu a 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 134 aagccuguag cccauguugu a 21 <210> 135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 135 uagggucgga acccaagcuu a 21 <210> 136 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 136 cugaaagcau gauccggga 19 <210> 137 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 137 aggcggugcu uguuccuca 19 <210> 138 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 138 ccaccacgcu cuucugccu 19 <139> <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 139 agggaccucu cucuaauca 19 <210> 140 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 140 ugacaagccu guagcccau 19 <210> 141 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 141 gccuguagcc cauguugua 19 <210> 142 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 142 uagcccaugu uguagcaaa 19 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 143 ccaaugcccu ccuggccaa 19 <210> 144 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 144 ccaauggcgu ggagcugag 19 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 145 ggcguggagc ugagagaua 19 <210> 146 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 146 gcguggagcu gagagauaa 19 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 147 gccuguaccu caucuacuc 19 <210> 148 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 148 ccuccucucu gccaucaag 19 <210> 149 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 149 gguaugagcc caucuaucu 19 <210> 150 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 150 gcuggagaag ggugaccga 19 <210> 151 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 151 gagaagggug accgacuca 19 <210> 152 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 152 gcccgacuau cucgacuuu 19 <210> 153 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 153 gcaggucuac uuugggauc 19 <210> 154 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 154 ggucuacuuu gggaucauu 19 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 155 ugggaucauu gcccuguga 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 156 ggucggaacc caagcuuag 19 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 157 ccagaaugcu gcaggacuu 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 158 gagaagaccu caccuagaa 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 159 gaagaccuca ccuagaaau 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 160 ccagauguuu ccagacuuc 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 161 cuauuuaugu uugcacuug 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 162 ucuaaacaau gcugauuug 19 <210> 163 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 163 gaccaacugu cacucauu 18 <210> 164 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys   1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Ser Lys Lys Arg Lys Arg              20 25 30 Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Val          35 40 45 His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn Ser      50 55 60 Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg Leu  65 70 75 80 Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln Thr                  85 90 95 Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser             100 105 110 Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys         115 120 125 <210> 165 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 165 Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val   1 5 10 15 Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln              20 <210> 166 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 166 Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr   1 5 10 15 Lys Val Leu Lys Gln              20 <210> 167 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 167 Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu   1 5 10 15 Lys gln         <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 168 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln   1 5 10 15 <210> 169 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 169 Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln   1 5 10 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 170 Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln   1 5 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 171 Tyr Lys Val Leu Lys Gln   1 5 <210> 172 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 172 Lys Val Leu Lys Gln   1 5 <210> 173 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 173 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Trp Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <210> 174 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 174 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Trp Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <175> 175 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 175 Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <210> 176 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 176 Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Phe Lys Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys              20 25 30 Val Leu Lys Gln          35 <210> 177 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 177 Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Phe Gly Lys   1 5 10 15 Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Ser Phe Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val              20 25 30 Leu Lys Gln          35 <210> 178 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 178 Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys   1 5 10 15 Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr              20 25 <210> 179 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 179 Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys   1 5 10 15 Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Asp Gln              20 25 30 Glu     <210> 180 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 180 Gly Thr Ala Met Arg Ile Leu Gly Gly Val Ile Pro Arg Lys Lys Arg   1 5 10 15 Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln              20 <210> 181 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 181 Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser   1 5 10 15 Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys              20 25 <210> 182 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 182 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys   1 5 10 15 <210> 183 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 183 Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg   1 5 10 15 <210> 184 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 184 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Val Ala Tyr Ile Ser   1 5 10 15 Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe              20 25 30 Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala          35 40 <210> 185 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 185 Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala   1 5 10 15 Asn Ile Pro Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro              20 25 30 <210> 186 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       peptide <400> 186 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys   1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val              20 <210> 187 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       siRNA <400> 187 uagcccaugu uguagcaaa 19 <210> 188 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic       formula peptide <220> <221> MOD_RES (222) (2) .. (5) <223> this region may encompas 2 or 4 variable residues <220> <221> MOD_RES (222) (7) .. (18) <223> variable residue <220> <221> MOD_RES (222) (20) .. (22) <223> variable residue <400> 188 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa   1 5 10 15 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His              20  

Claims (37)

폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)를 포함하는 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성(amphipathic)이고 핵산 결합 성질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.A composition comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA), wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is amphipathic and comprises nucleic acid binding properties. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 폴리(라이신(Lys), 트립토판(Tryp)) 4:1 분자량(MW) 20,000 내지 50,000, 폴리(오르니틴(Orn), 트립토판(Trp)) 4:1 분자량 20,000 내지 50,000, 멜리틴(Mellitin), 히스톤(Histone) H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4, 서열 번호: 27 내지 31, 35 내지 42, 45, 47, 50 내지 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 내지 87, 89 내지 92, 94 내지 108, 164 내지 178 및 180 내지 186으로 구성된 군(group)으로부터 선택된 서열의 전부 또는 일부를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.The polynucleotide delivery-enhancing polypeptide comprises about 5 to about 40 amino acids, poly (lysine (Lys), tryptophan (Tryp)) 4: 1 molecular weight (MW) 20,000 to 50,000, poly (ornithine (Orn), Tryptophan (Trp)) 4: 1 molecular weight 20,000 to 50,000, melittin, histone H1, histone H3 and histone H4, SEQ ID NOs: 27 to 31, 35 to 42, 45, 47, 50 to 59, Having all or part of a sequence selected from the group consisting of 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 to 87, 89 to 92, 94 to 108, 164 to 178 and 180 to 186 Composition. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 조성물은 동물 세포 내로 dsRNA의 흡수를 유발하는 것을 특징으로 하는 조성물.Wherein said composition induces uptake of dsRNA into animal cells. 청구항 3에 있어서,The method according to claim 3, 상기 동물 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.The animal cell is a composition, characterized in that the mammalian cell. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 조성물은 동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.Wherein said composition is administered to an animal. 청구항 5에 있어서,The method according to claim 5, 상기 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 조성물.The animal is a composition, characterized in that the mammal. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 아세틸화되는(acetylated) 것을 특징으로 하는 조성물.And the N-terminal of said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is acetylated. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 페질화되는(pegylated) 것을 특징으로 하는 조성물.And the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is pegylated. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 dsRNA는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 유전자의 일 부분에 상보적인 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 소간섭(small interfering) 리보핵 산(siRNA)인 것을 특징으로 하는 조성물.Wherein said dsRNA is a small interfering ribonucleic acid (siRNA) consisting of about 10 to about 40 base pair sequences complementary to a portion of a tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 dsRNA는 서열 번호: 109 내지 163 및 187으로 구성된 군으로부터 선택되는 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.Said dsRNA is an siRNA consisting of about 10 to about 40 base pair sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 to 163 and 187. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 혼합(admixed)되거나, 복합체를 형성하거나(complexed), 접합체를 형성하는(conjugated) 것을 특징으로 하는 조성물.Wherein said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is mixed with, complexed with, or conjugated with said dsRNA. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.Wherein said polynucleotide delivery-promoting polypeptide binds to said dsRNA. 청구항 1에 있어서,The method according to claim 1, 양이온 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition further comprises a cationic lipid. 청구항 13에 있어서,The method according to claim 13, 상기 양이온 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판(1,2-bis(oleoyloxy)-3-3-(trimethylammonium)propane), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트(2,3-dioleyloxy-N- [2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanaminium trifluoracetate), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드(1,3-dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid), 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드(5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide), 테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민(tetramethyltetrapalmitoyl spermine), 테트라메틸테트라올레일 스퍼민(tetramethyltetraoleyl spermine), 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민(tetramethyltetralauryl spermine), 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민(tetramethyltetramyristyl spermine) 및 테트라메틸디올레일 스퍼민(tetramethyldioleyl spermine), DOTMA (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드), DDAB (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드). 다가(Polyvalent) 양 이온 지질들, 리포스퍼민들(lipospermines), DOSPA (2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르-아세테이트), DOSPER (1,3-디올릴옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드), 디- 및 테트라-알킬-테트라-메틸 스퍼민들(di- and tetra-alkyl-tetra- methyl spermines), TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스퍼민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스퍼민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민), TMDOS (테트라메틸디올레일 스퍼민), DOGS (디옥타데실-아미도글리실스퍼민(dioctadecyl-amidoglycylspermine)(TRANSFECTAM®), 비-양이온 지질들과 결합된 양이온 지질들, DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine)), DPhPE(디피타노일포스파티딜에탄올아민(diphytanoylphosphatidylethanolamine)) 또는 콜레스테롤, DOSPA과 DOPE의 3:1 (w/w) 혼합물로 구성된 양이온 지질 조성물, 및 DOTMA과 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.The cationic lipid is N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), 1,2-bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) propane (1,2-bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) propane), 1,2- 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide, dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [2 (Spermine Carboxamido) Ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium trifluoroacetate (2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-propanaminium trifluoracetate), 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxysperyl) -propylamide (1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxyspermyl) -propylamid), 5-carboxysperylglycine diocta Decylamide (5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide), tetra Tetramethyltetrapalmitoyl spermine, tetramethyltetraoleyl spermine, tetramethyltetralauryl spermine, tetramethyltetramyristyl spermine and tetramethyldiolamine spermine), DOTMA (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleoyloxy) -3,3 -(Trimethylammonium) propane), DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide), DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide). Polyvalent cation lipids, lipospermines, DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecaboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneami Trifluor-acetate), DOSPER (1,3-diolyloxy-2- (6-carboxycismilyl) -propylamide), di- and tetra-alkyl-tetra-methyl spermines (di- and tetra-alkyl -tetra-methyl spermines), TMTPS (tetramethyltetrapalmitoyl spermine), TMTOS (tetramethyltetraoleyl spermine), TMTLS (tetramethyltetralauryl spermine), TMTMS (tetramethyltetramyristyl spermine), TMDOS (tetra Methyldioleyl spermine), DOGS (dioctadecyl-amidoglycylspermine) (TRANSFECTAM®), cationic lipids combined with non-cationic lipids, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) ), DPhPE (diphytanoylphosphatidylethanolamine) or And a cationic lipid composition consisting of a 3: 1 (w / w) mixture of cholesterol, DOSPA and DOPE, and a 1: 1 (w / w) mixture of DOTMA and DOPE. 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)를 포함하는 혼합물로 동물 세포들을 배양하는 단계를 포함하는 동물 세포 내로 dsRNA의 흡수를 유발하는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 특성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.A method of inducing uptake of dsRNA into an animal cell comprising culturing the animal cells with a mixture comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and a double stranded ribonucleic acid (dsRNA), wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is amphiphilic And nucleic acid binding properties. 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)을 포 함하는 혼합물로 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 동물 세포 내의 표적 유전자의 발현을 변형시키는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 성질을 포함하며, 상기 dsRNA가 상기 표적 유전자의 영역에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.A method of modifying the expression of a target gene in an animal cell comprising culturing the animal cell with a mixture comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA), wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is Wherein the dsRNA is complementary to a region of the target gene. 청구항 15 또는 16에 있어서,The method according to claim 15 or 16, 상기 동물 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.And said animal cell is a mammalian cell. 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)의 혼합물을 동물 피검물(animal subject)에 투여하는 단계를 포함하는 동물 피검물의 표현형을 변경하는 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 특성을 포함하며, 상기 dsRNA는 상기 피검물 내의 표적 유전자의 영역에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.A method of altering the phenotype of an animal subject, comprising administering a mixture of polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA) to an animal subject, wherein the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is a parent Wherein the dsRNA is complementary to the region of the target gene in the subject. 청구항 18에 있어서,The method according to claim 18, 상기 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 방법.And said animal is a mammal. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 폴리(라이신, 트립토판(Tryp)) 4:1 분자량(MW) 20,000 내지 50,000, 폴리(오르니틴, 트립토판) 4:1 분자량 20,000 내지 50,000, 멜리틴, 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4, 서열 번호: 27 내지 31, 35 내지 42, 45, 47, 50 내지 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 내지 87, 89 내지 92, 94 내지 108, 164 내지 178 및 180 내지 186으로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 전부 또는 일부를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.The polynucleotide delivery-enhancing polypeptide comprises about 5 to about 40 amino acids and comprises poly (lysine, tryptophan) 4: 1 molecular weight (MW) 20,000 to 50,000, poly (ornithine, tryptophan) 4: 1 molecular weight 20,000 to 50,000, melittin, histone H1, histone H3 and histone H4, SEQ ID NOs: 27 to 31, 35 to 42, 45, 47, 50 to 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 To 87, 89 to 92, 94 to 108, 164 to 178 and 180 to 186, all or part of a sequence selected from the group consisting of. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 아세틸화되는 것을 특징으로 하는 방법.And the N-terminal of said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is acetylated. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 페질화되는 것을 특징으로 하는 방법.And the N-terminal of said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is pegylated. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 dsRNA는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 유전자의 일 부분에 상보적인 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 소간섭 리보핵산(siRNA)인 것을 특징으로 하는 방법.Said dsRNA is a small interfering ribonucleic acid (siRNA) consisting of about 10 to about 40 base pair sequences complementary to a portion of a tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 dsRNA는 서열 번호: 109 내지 163 및 187로 구성된 군으로부터 선택되는 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 siRNA인 것을 특징으로 하는 방법.And said dsRNA is an siRNA consisting of about 10 to about 40 base pair sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 to 163 and 187. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 혼합되거나, 복합체를 형성하거나, 또는 접합체를 형상하는 것을 특징으로 하는 방법.Said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is mixed with said dsRNA, forms a complex, or shapes a conjugate. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.And said polynucleotide delivery-promoting polypeptide binds to said dsRNA. 청구항 15, 16 및 18 중 어느 한 항에 있어서,The method according to any one of claims 15, 16 and 18, 양이온 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.Further comprising cationic lipids. 청구항 27에 있어서,The method of claim 27, 상기 양이온 지질은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판, 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로 판아미늄 트리플루오르아세테이트, 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드, 5-카복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드, 테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민, 테트라메틸테트라올레일 스퍼민, 테트라메틸테트라라우릴 스퍼민, 테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민 및 테트라메틸디올레일 스퍼민, DOTMA (N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드), DDAB (디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드). 다가 양이온 지질들, 리포스퍼민들, DOSPA (2,3-디올레일옥시-N-[2(스퍼미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르아세테이트), DOSPER (1,3-디올릴옥시-2-(6-카복시스퍼밀)-프로필아미드), 디- 및 테트라-알킬-테트라-메틸 스퍼민들, TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스퍼민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스퍼민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스퍼민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스퍼민), TMDOS (테트라메틸디올레일 스퍼민), DOGS (디옥타데실-아미도글리실스퍼민(dioctadecyl-amidoglycylspermine)(TRANSFECTAM®), 비-양이온 지질들과 결합된 양이온 지질들, DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민), DPhPE(디피타노일포스파티딜에탄올아민) 또는 콜레스테롤, DOSPA과 DOPE의 3:1 (w/w) 혼합물로 이루어진 양이온 지질 조성물, 및 DOTMA과 DOPE의 1:1 (w/w) 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.The cationic lipids are N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride, 1,2-bis (oleoyloxy) -3-3- (trimethylammonium) Propane, 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide, dimethyldioctadecylammonium bromide, 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl]- N, N-dimethyl-1-propanealuminum trifluoroacetate, 1,3-dioleoyloxy-2- (6-carboxycismilyl) -propylamide, 5-carboxycismilglycine dioctadecylamide, tetra Methyltetrapalmitoyl spermine, tetramethyltetraoleyl spermine, tetramethyltetralauryl spermine, tetramethyltetramyristyl spermine and tetramethyldioleyl spermine, DOTMA (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) Propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DOTAP (1,2-bis (oleoyloxy) -3,3- (trimethylammonium) propane), DMRIE (1 , 2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide), DDAB (dimethyl dioctadecyl ammonium bromide). Polyvalent cationic lipids, lipospermines, DOSPA (2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanealuminum trifluoroacetate), DOSPER (1,3-Diolyloxy-2- (6-carboxycispheryl) -propylamide), di- and tetra-alkyl-tetra-methyl spermines, TMTPS (tetramethyltetrapalmitoyl spermine), TMTOS (tetramethyl Tetraoleyl spermine), TMTLS (tetramethyltetralauryl spermine), TMTMS (tetramethyltetramyristyl spermine), TMDOS (tetramethyldioleyl spermine), DOGS (dioctadecyl-amidoglycylspermine) (TRANSFECTAM®), cationic lipids combined with non-cationic lipids, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DPhPE (dipitanoylphosphatidylethanolamine) or cholesterol, 3: 1 of DOSPA and DOPE (w / w) a cationic lipid composition consisting of a mixture, and a 1: 1 (w / w) mixture of DOTMA and DOPE Wherein is selected from the generated group. 동물 피검물 내에서 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 관련 염증 질환(들)의 치 료를 위한 약제의 제조를 위한, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 및 이중 가닥 리보핵산(dsRNA)를 포함하는 혼합물의 사용으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성이고 핵산 결합 성질을 포함하며, 상기 약제는 TNF-α RNA 수준들을 감소시켜 TNF-α 관련 염증 질환(들)의 하나 이상의 증상(들)이 발병 또는 심화되는 것을 방지하거나 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.A mixture comprising a polynucleotide delivery-enhancing polypeptide and double stranded ribonucleic acid (dsRNA) for the manufacture of a medicament for the treatment of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) related inflammatory disease (s) in an animal specimen. In use, the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is amphiphilic and includes nucleic acid binding properties, wherein the agent reduces TNF-α RNA levels such that one or more symptom (s) of TNF-α related inflammatory disease (s) Use of a mixture characterized in that it can prevent or reduce the onset or intensification. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 폴리(라이신, 트립토판) 4:1 분자량(MW) 20,000 내지 50,000, 폴리(오르니틴, 트립토판) 4:1 분자량 20,000 내지 50,000, 멜리틴, 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4, 서열 번호: 27 내지 31, 35 내지 42, 45, 47, 50 내지 59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78 내지 87, 89 내지 92, 94 내지 108, 164 내지 178 및 180 내지 186으로 구성된 군으로부터 선택된 서열의 전부 또는 일부를 가지는 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.The polynucleotide delivery-enhancing polypeptide comprises about 5 to about 40 amino acids and comprises poly (lysine, tryptophan) 4: 1 molecular weight (MW) 20,000 to 50,000, poly (ornithine, tryptophan) 4: 1 molecular weight 20,000 to 50,000 , Melittin, histone H1, histone H3 and histone H4, SEQ ID NOs: 27-31, 35-42, 45, 47, 50-59, 62, 63, 67, 68, 73, 74, 76, 78-87, Use of a mixture characterized in that it has all or part of a sequence selected from the group consisting of 89 to 92, 94 to 108, 164 to 178 and 180 to 186. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 아세틸화되는 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.Use of a mixture characterized in that the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is acetylated. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드의 N-터미널은 페질화되는 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.Use of a mixture characterized in that the N-terminal of the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is pegylated. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 dsRNA는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 유전자의 일 부분에 상보적인 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열로 구성된 소간섭 리보핵산(siRNA)인 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.Said dsRNA is a small interfering ribonucleic acid (siRNA) consisting of about 10 to about 40 base pair sequences complementary to a portion of a tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) gene. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 dsRNA는 서열 번호: 109 내지 163 및 187을 구성하는 군으로부터 선택되는 약 10 내지 약 40 개의 염기쌍 서열으로 구성된 siRNA인 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.Said dsRNA is an siRNA consisting of about 10 to about 40 base pair sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 109 to 163 and 187. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 혼합되거나, 복합체를 형성하거나, 또는 접합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.And wherein said polynucleotide delivery-enhancing polypeptide is mixed with, complexed with, or conjugated with said dsRNA. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 상기 dsRNA와 결합하는 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.Using a mixture characterized in that the polynucleotide delivery-enhancing polypeptide binds to the dsRNA. 청구항 29에 있어서,The method of claim 29, 상기 동물 피검물은 포유류인 것을 특징으로 하는 혼합물의 사용.Use of a mixture, characterized in that the animal specimen is a mammal.
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