KR20080032027A - Novel water-soluble nanocrystals comprising a low molecular weight coating reagent, and methods of preparing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 신규 수용성 나노크리스탈 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 in vitro 또는 in vivo 에서, 생물학적 물질의 검출 및/또는 시각화 또는 그 과정(예컨대, 조직 또는 세포 영상화)과 같은 다양한 분석 및 생물 의학의 적용을 포함하나 이에 한정되지 않는 상기 나노크리스탈의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산, 단백질 또는 다른 생분자와 같은 분석물의 검출에 이용될 수 있는 상기 나노크리스탈을 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to novel water soluble nanocrystals and methods for their preparation. In addition, the present invention includes, but is not limited to, the application of various analytical and biomedical applications, such as but not limited to the detection and / or visualization of biological material or processes thereof (eg, tissue or cell imaging), in vitro or in vivo. It relates to the use of. The invention also relates to compositions and kits comprising said nanocrystals that can be used for detection of analytes such as nucleic acids, proteins or other biomolecules.
반도체 나노크리스탈(양자 점)은 발광 장치(Colvin et al, Nature 370, 354-357, 1994; Tessler et al, Science 295, 1506-1508, 2002), 레이저(Klimov et al, Science 290, 314-317, 2000), 태양 전지(Huynh et al, Science 295, 2425-2427, 2002) 또는 세포 생물학과 같은 생화학적 연구 분야에서 형광 생물학적 표지와 같은, 다양한 기술분야에서 그 용도에 대한 근본적이고 기술적인 큰 관심을 받고 있다. 예를 들어, Bruchez et al, Science, Vol. 281 , 페이지 2013- 2015, 2001; Chan & Nie, Science, Vol. 281 , 페이지 2016-2018, 2001 ; 미국 특허 번호 6,207,392, summarized in Klarreich, Nature, Vol. 43, 페이지 450-452, 2001에서 알 수 있고; 또한, Mitchell, Nature Biotechnology, 페이지 1013-1017, 2001 , 및 미국 특허 번호 6,423,551 , 6,306,610, 및 6,326,144에서 알 수 있다.Semiconductor nanocrystals (quantum dots) are light emitting devices (Colvin et al, Nature 370, 354-357, 1994; Tessler et al, Science 295, 1506-1508, 2002), lasers (Klimov et al, Science 290, 314-317). , 2000), solar cells (Huynh et al, Science 295, 2425-2427, 2002) or in the field of biochemical research such as cell biology. I am getting it. See, eg, Bruchez et al, Science, Vol. 281, pages 2013- 2015, 2001; Chan & Nie, Science, Vol. 281, pages 2016-2018, 2001; U.S. Pat.No. 6,207,392, summarized in Klarreich, Nature, Vol. 43, pages 450-452, 2001; Also, Mitchell, Nature Biotechnology, pages 1013-1017, 2001, and US Pat. Nos. 6,423,551, 6,306,610, and 6,326,144.
생물학적 분석에 이용하기 위한 민감한 비-방사성 동위원소 검출 시스템의 개발은 DNA 시퀀싱, 임상 진단 분석, 및 기초 세포 및 분자 생물학 프로토콜과 같은, 다양한 연구 및 진단 분야에 상당한 영향을 주었다. 현재 비-방사성 동위원소 검출 방법은 색상이 변하거나, 형광 또는 발광인 유기 리포터 분자에 주된 기초를 두고 있다. 분자의 형광 표지는 생물학에서 표준 기술이다. 상기 표지는 종종 넓은 스펙트럼 특성, 짧은 수명, 포토블리칭 및 세포에 잠재적 독성의 문제점을 발생시키는 유기 염료이다. 최근 대두하는 양자 점 기술은 비유기 복합체 또는 입자를 이용하는 형광 표지 개발의 새로운 시대를 열었다. 상기 물질은 유기 염료 보다 큰 스톡 쉬프트(Stocks shift), 보다 긴 방출 반감기, 좁은 방출 피크 및 최소 포토-블리칭을 포함하는 상당한 장점을 제공한다(참조: 상기 인용 문헌)The development of sensitive non-radioactive isotope detection systems for use in biological assays has had a significant impact on various research and diagnostic fields, such as DNA sequencing, clinical diagnostic assays, and basic cell and molecular biology protocols. Current non-radioactive isotope detection methods are based primarily on organic reporter molecules that are color changing, fluorescent or luminescent. Fluorescent labeling of molecules is a standard technique in biology. Such labels are often organic dyes that cause problems of broad spectral properties, short lifespan, photobleaching and potential toxicity to cells. The emerging quantum dot technology has opened a new era in the development of fluorescent labels using inorganic complexes or particles. The material offers significant advantages over organic dyes, including greater Stocks shift, longer emission half-life, narrow emission peak and minimal photo-bleaching (see above cited).
지난 수 십년 동안, 다양한 반도체 나노크리스탈의 합성 및 특성 부여에 상당한 진보가 있었다. 최근 진보는 상대적으로 모노분산 양자 점의 대규모 제조를 이끌어왔다.(Murray et al., J. Am. Chem. Soc, 115, 8706-15, 1993; Bowen Katari et al., J. Phys. Chem. 98, 4109-17, 1994; Hines, et al., J. Phys. Chem. 100, 468-71 , 1996. Dabbousi, et al., J. Phys. Chem. 101 , 9463-9475,1997.)Over the last few decades, significant advances have been made in the synthesis and characterization of various semiconductor nanocrystals. Recent advances have led to the relatively large scale production of monodisperse quantum dots (Murray et al., J. Am. Chem. Soc, 115, 8706-15, 1993; Bowen Katari et al., J. Phys. Chem. 98, 4109-17, 1994; Hines, et al., J. Phys. Chem. 100, 468-71, 1996. Dabbousi, et al., J. Phys. Chem. 101, 9463-9475, 1997.)
발광 양자 점 기술에서의 보다 큰 진보는 결과적으로 형광 효율 및 상기 양 자 점의 안정성을 개선시켰다. 양자 점의 뛰어난 발광 특성은 양자 크기 제한으로부터 발생하는데, 이는 금속 및 반도체 코어 입자가 이들의 들뜸 보어 반지름, 약 1 내지 5 nm 보다 더 작을 때 발생한다.(Alivisatos, Science, 271, 933-37, 1996; Alivisatos, J. Phys. Chem. 100, 13226- 39, 1996; Brus, Appl Phys., A53, 465-74, 1991; Wilson et al., Science, 262, 1242-46, 1993.) 최근 연구 결과는 크기-조절 가능한 보다 작은 밴드갭 코어 입자를 보다 큰 밴드갭 비유기 물질 쉘로 캡핑함으로써 개선된 발광을 달성할 수 있다고 보고 되고 있다. 예를 들어, ZnS 층으로 패시베이팅된 CdSe 양자 점은 실온에서 강력히 발광하고, 이들의 방출 파장은 입자 크기를 변화시킴으로써 청색에서 적색으로 조절될 수 있다. 또한, 상기 ZnS 캡핑 층은 표면 비방사성 재결합 부분을 패시베이팅하고 상기 양자 점에 보다 큰 안정성을 제공한다.(Dabbousi et al., J. Phys. Chem. B101 , 9463-75, 1997. Kortan, et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 1327-1332, 1990.)Greater advances in luminescent quantum dot technology have resulted in improved fluorescence efficiency and stability of the quantum dots. The excellent luminescence properties of quantum dots arise from quantum size limitations, which occur when metal and semiconductor core particles are smaller than their raised bore radius, about 1-5 nm (Alivisatos, Science, 271, 933-37, 1996; Alivisatos, J. Phys. Chem. 100, 13226-39, 1996; Brus, Appl Phys., A53, 465-74, 1991; Wilson et al., Science, 262, 1242-46, 1993.) The results are reported to be able to achieve improved luminescence by capping size-adjustable smaller bandgap core particles into a larger bandgap inorganic material shell. For example, CdSe quantum dots passivated with a ZnS layer luminesce strongly at room temperature and their emission wavelength can be adjusted from blue to red by changing the particle size. The ZnS capping layer also passivates surface non-radioactive recombination moieties and provides greater stability to the quantum dots. (Dabbousi et al., J. Phys. Chem. B101, 9463-75, 1997. Kortan, et al., J. Am. Chem. Soc. 112, 1327-1332, 1990.)
발광 양자 점 기술의 진보에도 불구하고, 종래 캡핑된 발광 양자 점은 수용성이 아니기 때문에 생물학적 적용에 부적절하였다.Despite advances in luminescent quantum dot technology, conventionally capped luminescent quantum dots are not suitable for biological applications because they are not water soluble.
이러한 문제점을 극복하기 위해서, 상기 양자 점의 유기 패시베이팅 층을 수용성 부분으로 대체하였다. 그러나 결과적으로 생기는 양자 점은 상당히 발광적이지 못하다(Zhong et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 8589, 2003). 2-머캡토에탄올 및 1-티오-글리세롤과 같은 짧은 사슬의 티올은 수용성 CdTe 나노크리스탈의 제조에 있어 안정제로서 사용되었다.(Rogach et al., Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100, 1772, 1996; Rajh et al., J. Phys. Chem. 97, 11999, 1993). 다른 접근법 으로, Coffer 등은 수용성 캡핑 화합물로서 데옥시리보핵산(DNA)의 용도를 설명하였다(Coffer, et al., Nanotechnology 3, 69, 1992). 이러한 모든 시스템에서, 상기 코팅 나노크리스탈은 불안정하고, 발광 특성은 시간이 지나면서 감소했다.To overcome this problem, the organic passivating layer of the quantum dots was replaced with a water soluble moiety. However, the resulting quantum dots are not quite luminescent (Zhong et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 8589, 2003). Short chain thiols, such as 2-mercaptoethanol and 1-thio-glycerol, have been used as stabilizers in the preparation of water soluble CdTe nanocrystals (Rogach et al., Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100, 1772, 1996 Rajh et al., J. Phys. Chem. 97, 11999, 1993). In another approach, Coffer et al. Described the use of deoxyribonucleic acid (DNA) as a water soluble capping compound (Coffer, et al., Nanotechnology 3, 69, 1992). In all these systems, the coated nanocrystals were unstable and the luminescence properties decreased over time.
다른 연구에서, Spanhel 등은 Cd(OH)2-캡핑된 CdS 졸을 개시하고 있다 (Spanhel, et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 5649, 1987). 그러나 콜로이드 같은 나노크리스탈은 매우 좁은 pH 범위(pH 8-10)에서만 제조될 수 있고 10 보다 큰 pH 범위에서 좁은 형광 밴드를 나타내었다. 상기 pH 의존성은 상기 물질의 유용성을 제한하고, 특히, 생물학적 시스템에서의 사용은 부적절하다.In another study, Spanhel et al. Disclose Cd (OH) 2 -capped CdS sols (Spanhel, et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 5649, 1987). However, nanocrystals such as colloids can be produced only in very narrow pH ranges (pH 8-10) and show narrow fluorescence bands in pH ranges greater than 10. The pH dependence limits the usefulness of the material and, in particular, its use in biological systems is inappropriate.
PCT 공개 WO 00/17656은 나노크리스탈의 수용성을 부여하기 위해, 각각 화학식 SH(CH2)n-COOH 및 SH(CH2)H-SO3H을 가지는 카르복실산 또는 술폰산으로 캡핑된 코어-쉘 나노크리스탈을 개시한다. 유사하게, PCT 출원 WO 00/29617 및 영국 특허 출원 GB 2342651은, 머캡토아세트산 또는 머캡토-운데카노산과 같은 유기산을 나노크리스탈의 표면에 결합시켜 나노크리스탈을 수용성화 하고 단백질 또는 핵산과 같은 생분자와의 컨쥬게이션에 적합하도록 한 내용을 개시한다. 또한, GB 2342651은 나노크리스탈의 수용성을 부여하는 캡핑 물질로서 트리옥틸포스핀의 용도를 개시하고 있다.PCT publication WO 00/17656 discloses core-shells capped with carboxylic or sulfonic acids having the formulas SH (CH 2 ) n -COOH and SH (CH 2 ) H-SO 3 H, respectively, to impart water solubility of the nanocrystals. A nanocrystal is disclosed. Similarly, PCT application WO 00/29617 and British patent application GB 2342651 combine organic acids such as mercaptoacetic acid or mercapto-undecanoic acid to the surface of the nanocrystals to solubilize the nanocrystals and biomolecules such as proteins or nucleic acids. Disclosed is a content suitable for conjugation with a. GB 2342651 also discloses the use of trioctylphosphine as a capping material to impart water solubility of nanocrystals.
다른 접근법은 수용화제로서 디아미노카르복실산의 용도를 보고한 PCT 공개 WO 00/27365에서 습득하였다. 상기 PCT 공개문헌에서, 상기 디아미노산은 1가의 캡핑 화합물에 의해 나노크리스탈 코어에 결합되어 있다.Another approach was learned in PCT publication WO 00/27365, which reported the use of diaminocarboxylic acids as solubilizers. In the PCT publication, the diamino acid is bound to the nanocrystal core by a monovalent capping compound.
PCT 공개 WO 00/17655는 친수성 부분 및 소수성 부분을 가지는 가용화제의 사용에 의해 수용성이 부여된 나노크리스탈을 개시하고 있다. 가용화제는 소수성기에 의해 상기 나노크리스탈에 결합하고, 반면에 카르복실산 또는 메타크릴산과 같은, 친수성기는 수용성을 제공한다.PCT publication WO 00/17655 discloses nanocrystals imparted water solubility by the use of solubilizers having hydrophilic and hydrophobic moieties. Solubilizers bind to the nanocrystals by hydrophobic groups, while hydrophilic groups, such as carboxylic acids or methacrylic acid, provide water solubility.
다른 PCT 출원(WO 02/073155)에서, 수용성을 부여하기 위해 트리옥틸포스핀 옥사이드 하이드록사메이트, 하이드록사미산 유도체 또는 에티렌디아민과 같은 여러자리 착화제와 같은 다양한 분자가 직접적으로 나노크리스탈의 표면에 결합된 수용성 반도체 나노크리스탈이 개시되어 있다. 상기 나노크리스탈은 그 다음 EDC에 의해 단백질에 결합된다. 다른 접근법에서, PCT 출원 WO 00/58731은 혈액 세포군의 분석을 위해 이용되는 나노크리스탈 및 약 3,000 내지 약 3,000,000의 분자량을 가지는 아미노-유래 다당류가 상기 나노크리스탈에 결합되었음을 개시하고 있다.In other PCT applications (WO 02/073155), various molecules such as trioctylphosphine oxide hydroxamate, hydroxamic acid derivatives or multidentate complexing agents such as ethylenediamine, directly impart the surface of nanocrystals to impart water solubility. A water soluble semiconductor nanocrystal bonded to is disclosed. The nanocrystals are then bound to the protein by EDC. In another approach, PCT application WO 00/58731 discloses that nanocrystals used for analysis of blood cell populations and amino-derived polysaccharides having a molecular weight of about 3,000 to about 3,000,000 are bound to the nanocrystals.
미국 특허 US 6,699,723는 바이오틴 및 스트렙타비딘과 같은 생분자를 발광 나노크리스탈 프로브에의 결합을 촉진하기 위한 결합제로서 실란-베이스 화합물의 용도를 개시하고 있다. 미국 특허 출원 번호 2004/0072373 A1은 실란-베이스 화합물을 이용하는 생화학적 표지 방법을 개시하고 있다. 실란-결합 나노입자는 분자를 각인함으로써 주형 분자에 결합되고, 이어 매트릭스를 형성하기 위하여 중합된다. 그 후, 상기 주형 분자는 상기 매트릭스로부터 제거된다. 상기 주형 분자의 제거로 매트릭스에 형성된 구멍은 표지 하는데 이용할 수 있는 특성을 가진다.US Pat. No. 6,699,723 discloses the use of silane-based compounds as binders to promote binding of biomolecules such as biotin and streptavidin to luminescent nanocrystal probes. US Patent Application No. 2004/0072373 A1 discloses a biochemical labeling method using a silane-based compound. Silane-bonded nanoparticles are bonded to the template molecules by imprinting the molecules and then polymerized to form a matrix. The template molecule is then removed from the matrix. The hole formed in the matrix due to the removal of the template molecule has properties that can be used for labeling.
최근에, 수용성 나노크리스탈을 안정화하기 위한 합성 폴리머의 사용은 보고 되어 있다. 미국 특허 출원 2004/0115817 A1은 표면이 트리옥틸포스핀 또는 트리옥틸포스핀 옥사이드로 코팅된, 나노크리스탈에 양쪽성, 이중블록 중합체가 소수성 상호작용에 의해 비공유적으로 결합될 수 있음을 개시하고 있다. 유사하게, Gao 등(Nature Biotechnology, Vol. 22, 969-976, August 2004)은 비 공유 소수성 상호작용에 의해 양쪽성, 삼중-블록 공중합체로 둘러싸여진 수용성 반도체 나노크리스탈을 개시하고 있다.Recently, the use of synthetic polymers to stabilize water soluble nanocrystals has been reported. U.S. Patent Application 2004/0115817 A1 discloses that amphoteric, diblock polymers can be noncovalently bound by hydrophobic interaction to nanocrystals whose surfaces are coated with trioctylphosphine or trioctylphosphine oxide. . Similarly, Gao et al. (Nature Biotechnology, Vol. 22, 969-976, August 2004) disclose water soluble semiconductor nanocrystals surrounded by amphoteric, tri-block copolymers by non-covalent hydrophobic interactions.
이러한 발달에도 불구하고, 생물학적 분석에 있어 검출 목적으로 이용될 수 있는 발광 나노크리스탈의 필요성이 여전히 남아있다. 이러한 점에서, 생분자의 생물학적 활성을 보존하는 방식으로 생분자에 결합될 수 있는 나노크리스탈을 가지는 것은 바람직할 것이다. 또한, 수성 매체에 안정하고, 견고한 현탁액 또는 용액으로 제조되고 보관될 수 있는 수용성 반도체 나노크리스탈을 가지는 것은 바람직할 것이다. 마지막으로, 상기 수용성 나노크리스탈 양자 점은 높은 양자 효율로 에너지를 방출할 수 있어야 하고, 좁은 입자 크기를 가져야한다.Despite these developments, there remains a need for luminescent nanocrystals that can be used for detection purposes in biological analysis. In this regard, it would be desirable to have nanocrystals capable of binding to biomolecules in a manner that preserves the biological activity of the biomolecules. It would also be desirable to have a water soluble semiconductor nanocrystal that can be prepared and stored in a stable, rigid suspension or solution in an aqueous medium. Finally, the water soluble nanocrystal quantum dots must be able to release energy with high quantum efficiency and have a narrow particle size.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 요구를 만족하는 나노크리스탈을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a nanocrystal that satisfies the above requirements.
상기 목적은 각각 독립항의 특징을 가지는 상기 나노크리스탈 및 나노크리스탈을 제조하는 과정에 의해 해결된다.The object is solved by a process for producing the nanocrystals and nanocrystals each having the features of the independent claims.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 수용성 나노크리스탈을 제공한다:According to one aspect of the invention, the invention provides a water soluble nanocrystal comprising:
원소 주기율표(PSE)의 Ib 족, IIb 족, IVb 족, Vb 족, VIb 족, VIIb 족, VIIIb 족, II 족, III 족 또는 IV 족 원소로부터 선택되는 최소 하나의 금속 M1을 포함하는 나노크리스탈 코어 및 다음을 추가적으로 포함한다:Nanocrystal core comprising at least one metal M1 selected from Group Ib, IIb, IVb, Vb, VIb, VIIb, VIIIb, II, III, or IV elements of the Periodic Table of the Elements (PSE) And further include:
나노크리스탈 코어의 표면에 부착된 캡핑 시약을 포함하는 첫 번째 층, 상기 캡핑시약은 최소 두개의 결합기를 가진다, First layer comprising a capping reagent attached to the surface of the nanocrystal core, the capping reagent has at least two bond groups,
그리고 코팅 시약과 공유적으로 결합된 최소 두개의 결합 부분, 및 두 번째 층에 수용성을 부여하기 위한 최소 하나의 수용성 기를 가지는 저 분자량 코팅 시약 을 포함하는 두 번째 층. And a low molecular weight coating reagent having at least two binding moieties covalently bound to the coating reagent, and at least one water soluble group for imparting water solubility to the second layer.
본 발명의 수용성 나노크리스탈은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있다:The water soluble nanocrystals of the present invention can be obtained by a method comprising the following steps:
상기 정의된 나노크리스탈 코어를 캡핑 시약과 반응시켜, 상기 캡핑 시약을 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 결합시키고 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 첫 번째 층을 형성하는 단계,Reacting the defined nanocrystal core with a capping reagent to bind the capping reagent to the surface of the nanocrystal core and to form a first layer surrounding the nanocrystal core,
그리고And
상기 캡핑 시약의 최소 두개의 결합기에 대하여 반응하는 최소 두개의 결합 부분, 및 상기 두 번째 층에 수용성을 부여하기 위한 최소 하나의 수용성기를 가지는 저 분자량의 코팅 시약과 상기 캡핑 시약을 결합시켜, 상기 첫 번째 층에 공유 결합된 두 번째 층을 형성하고 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 수용성 쉘을 형성하는 단계.Combining the capping reagent with a low molecular weight coating reagent having at least two binding moieties that react to at least two bond groups of the capping reagent, and at least one water soluble group to impart water solubility to the second layer, Forming a second layer covalently bonded to the first layer and forming a water-soluble shell surrounding the nanocrystal core.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 수용성 나노크리스탈을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a water-soluble nanocrystal comprising:
원소 주기율표(PSE)의 II 족, VIIA 족, VIIIA 족, IB 족, IIB 족, III 족 또는 IV 족 원소로부터 선택되는 최소 하나의 금속 M1 및 상기 PSE의 V 족 또는 VI 족으로부터 선택되는 최소 하나의 원소 A를 포함하는 나노크리스탈 코어 및 다음을 추가적으로 포함한다:At least one metal M1 selected from Group II, VIIA, VIIIA, IB, IIB, III, or IV elements of the Periodic Table of Elements (PSE) and at least one selected from Groups V or VI of the PSE Nanocrystal cores containing element A and additionally include:
나노크리스탈 코어의 표면에 부착된 캡핑 시약을 포함하는 첫 번째 층, 상기 캡핑 시약은 최소 두개의 결합기를 가진다, A first layer comprising a capping reagent attached to the surface of a nanocrystal core, the capping reagent having at least two bond groups,
그리고 코팅 시약과 공유적으로 결합된 최소 두개의 결합 부분, 및 두 번째 층에 수용성을 부여하기 위한 최소 하나의 수용성 기를 가지는 저 분자량 코팅 시약 을 포함하는 두 번째 층. And a low molecular weight coating reagent having at least two binding moieties covalently bound to the coating reagent, and at least one water soluble group for imparting water solubility to the second layer.
본 발명의 수용성 나노크리스탈은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있다:The water soluble nanocrystals of the present invention can be obtained by a method comprising the following steps:
상기 정의된 나노크리스탈 코어를 캡핑 시약과 반응시켜, 상기 캡핑 시약을 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 결합시키고 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 첫 번째 층을 형성하는 단계,Reacting the defined nanocrystal core with a capping reagent to bind the capping reagent to the surface of the nanocrystal core and to form a first layer surrounding the nanocrystal core,
그리고And
상기 캡핑 시약의 최소 두개의 결합기에 대하여 반응하는 최소 두개의 결합 부분, 및 상기 두 번째 층에 수용성을 부여하기 위한 최소 하나의 수용성기를 가지는 저 분자량의 코팅 시약과 상기 캡핑 시약을 결합시켜, 상기 첫 번째 층에 공유 결합된 두 번째 층을 형성하고 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 수용성 쉘을 형성하는 단계.Combining the capping reagent with a low molecular weight coating reagent having at least two binding moieties that react to at least two bond groups of the capping reagent, and at least one water soluble group to impart water solubility to the second layer, Forming a second layer covalently bonded to the first layer and forming a water-soluble shell surrounding the nanocrystal core.
전형적으로 나노크리스탈을 코팅하는 종래 방법은 상기 나노크리스탈 코어을 덮고 있는 수용성 쉘의 경계에 공유 결합을 포함하지 않는다. 본 발명에 있어, 작은 모노머 또는 저 분자량의 올리고머 분자를 포함하는 캡핑 시약은 상기 첫 번째 층으로 알려진, 캡핑 시약 층을 형성하기 위해서, 상기 나노크리스탈 표면을 캡핑하기 위해서 먼저 이용된다. 상기 첫 번째 층은 상기 나노크리스탈 코어에 공유적으로 결합된다. 상기 단계 이후에 결합제의 존재 하에서 폴리머(수용성기를 가짐)를 상기 캡핑 시약에 결합한다. 상기 결합에 의해 나노크리스탈 코어 위에 수용성 쉘을 형성한다. 상기 쉘은 나노크리스탈 코어 표면에 결합되어 고정화 된다(참조: 도 1). 저 분자량의 코팅 시약은 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 공유적으로 교차-결합된 층을 형성하기 되기 때문에, 상기 쉘은 손상되지 않은 채로 상기 나노크리스탈 코어에 결합되어, 나노크리스탈로부터 수용성 쉘이 분리될 수 있는 가능성을 감소시킨다.Conventional methods of coating nanocrystals typically do not include covalent bonds at the boundaries of the water-soluble shells covering the nanocrystal cores. In the present invention, a capping reagent comprising small monomers or low molecular weight oligomer molecules is first used to cap the nanocrystal surface to form a capping reagent layer, known as the first layer. The first layer is covalently bound to the nanocrystal core. After this step, the polymer (having a water-soluble group) is bound to the capping reagent in the presence of a binder. The bond forms a water soluble shell on the nanocrystal core. The shell is bonded to and immobilized on the surface of the nanocrystal core (see FIG. 1). Since the low molecular weight coating reagent forms a covalently cross-linked layer surrounding the nanocrystal core, the shell remains intact and binds to the nanocrystal core to separate the water soluble shell from the nanocrystal. Reduce the likelihood
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 상기 정의된 코어를 가지는 수용성 나노크리스탈 제조 방법을 제공한다:According to another aspect of the invention, the invention provides a process for producing a water soluble nanocrystal having a core as defined above comprising the following steps:
상기 정의된 나노크리스탈 코어를 제공하는 단계,Providing a nanocrystal core as defined above,
상기 정의된 나노크리스탈 코어를 캡핑 시약과 반응시켜, 상기 캡핑 시약을 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 결합시키고 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 첫 번째 층을 형성하는 단계,Reacting the defined nanocrystal core with a capping reagent to bind the capping reagent to the surface of the nanocrystal core and to form a first layer surrounding the nanocrystal core,
그리고And
상기 캡핑 시약의 최소 두개의 결합기에 대하여 반응하는 최소 두개의 결합 부분, 및 상기 두 번째 층에 수용성을 부여하기 위한 최소 하나의 수용성기를 가지는 저 분자량의 코팅 시약과 상기 캡핑 시약을 결합시켜, 상기 첫 번째 층에 공유 결합된 두 번째 층을 형성하고 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 수용성 쉘을 형성하는 단계.Combining the capping reagent with a low molecular weight coating reagent having at least two binding moieties that react to at least two bond groups of the capping reagent, and at least one water soluble group to impart water solubility to the second layer, Forming a second layer covalently bonded to the first layer and forming a water-soluble shell surrounding the nanocrystal core.
본 발명은 수용성 나노크리스탈은 상기 나노크리스탈을 둘러싸는 수용성 쉘을 형성함으로써 효과적으로 안정화 될 수 있다는 발견에 기초한다. 상기 쉘은 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 공유적으로 결합된 첫 번째 층(캡핑 시약 포함), 및 첫 번째 층에 공유적으로 결합되거나 공유적으로 교차-결합된 저 분자량의 코팅 시약을 포함하는 두 번째 층을 포함한다. 상기 방법으로 합성된 수용성 쉘은 상기 나노크리스탈을 실질적인 발광의 손실 없이 상당히 긴 시간 동안 수성 환경에 머무르게 함을 알 수 있다. 이론에 구애받지 않는다는 것을 가정하면, 상기 나노크리스탈의 개선된 안정성은 상기 수용성 쉘의 보호 기능 때문 인 것으로 판단된다. 상기 쉘은 상기 나노크리스탈 코어와 존재하는 이온, 라디칼 또는 분자와 같은 반응적인 수용성 종 사이의 접촉을 감소시키는 허메틱 박스 또는 보호막으로서 작용한다. 이러한 것은 수용액 상태에서 나노크리스탈의 응집을 방지하는데 유용하다. 이러한 나노크리스탈의 응집의 방지는 전기학적으로 서로 분리되어 , 자체의 광발광을 연장하기 때문이라고 판단된다. 상기 코팅 시약과 같은 저-분자량 화합물을 이용함으로써, 상기 첫 번째 층과 두 번째 층 사이의 반응은 쉽게 조절될 수 있다. 또한, 상기 코팅 시약으로서 저-분자량 화합물을 이용함으로써, 나노크리스탈은 크기가 작고 부드러운 표면 형태를 가지게 된다. 다른 장점은 형성된 쉘이 조직 및 기관 타깃과 같은 다양한 생물학적 물질의 인식을 촉진할 수 있는 적합한 생물학적 분자 또는 분석물과의 결합에 의하여 유리하게 기능화 될 수 있다는 점이다. 상기 수용성 쉘을 형성하기 위한 다른 조합의 캡핑 시약 및 저 분자량 코팅 시약으로 실시함으로써, 본 발명은 폭 넓은 적용에 유용한 개선된 화학적 및 물리적 특성을 가지는 새로운 분류의 수용성 나노크리스탈에 세련된 경로를 제시한다.The present invention is based on the discovery that water soluble nanocrystals can be effectively stabilized by forming a water soluble shell surrounding the nanocrystals. The shell comprises a first layer (including a capping reagent) covalently bound to the surface of the nanocrystal core, and a low molecular weight coating reagent covalently bound or covalently cross-linked to the first layer. Second layer. It can be seen that the water-soluble shell synthesized in this manner keeps the nanocrystals in the aqueous environment for a fairly long time without substantial loss of luminescence. Assuming no theory, it is believed that the improved stability of the nanocrystals is due to the protective function of the water-soluble shell. The shell acts as a hermetic box or protective membrane that reduces the contact between the nanocrystal core and reactive water soluble species such as ions, radicals or molecules present. This is useful for preventing agglomeration of nanocrystals in aqueous solution. The prevention of aggregation of such nanocrystals is thought to be because they are electrically separated from each other and extend their own photoluminescence. By using a low-molecular weight compound such as the coating reagent, the reaction between the first layer and the second layer can be easily controlled. In addition, by using a low-molecular weight compound as the coating reagent, the nanocrystals are small in size and have a smooth surface shape. Another advantage is that the formed shell can be advantageously functionalized by combining with suitable biological molecules or analytes that can facilitate the recognition of various biological materials such as tissue and organ targets. By practicing with other combinations of capping reagents and low molecular weight coating reagents to form the water soluble shells, the present invention provides a refined route to a new class of water soluble nanocrystals with improved chemical and physical properties useful for a wide range of applications.
본 발명에 따르면, 상기 나노크리스탈의 표면이 캡핑 시약과 결합될 수 있는 한 적합한 형태의 나노크리스탈(양자점)은 수용성이 부여될 수 있다. 이러한 점에 있어서, 용어 “나노크리스탈” 및 “양자점”은 서로 바꾸어 사용된다.According to the present invention, nanocrystals (quantum dots) of suitable forms can be imparted with water solubility as long as the surface of the nanocrystals can be combined with a capping reagent. In this regard, the terms “nanocrystal” and “quantum dot” are used interchangeably.
일 구현예에서, 적합한 나노크리스탈은 금속 만을 포함하는 나노크리스탈을 가진다. 이러한 목적에, M1은 원소 주기율표(PSE)의 II 족, VIIA 족, VIIIA 족, IB 족, IIB 족, III 족 또는 IV 족 원소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 상기 나노크리스탈 코어는 오직 금속 원소 M1 만으로 이루어질 수 있다; 아래에 정의된 바와 같이, 비-금속 원소 A 또는 B는 부존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노크리스탈은 금, 은 또는 구리(제 Ib 족), 티타늄(제 IVb 족), 테르븀(제 IIIb 족), 코발트, 플라티늄, 로듐, 루테늄(제 VIIIb 족), 납(제 IV 족) 또는 이들의 합금과 같은, PSE의 상기 족으로부터 순수 금속만으로 이루어진다. 아래에서, 카운터 원소 A를 포함하는 나노크리스탈에 관하여 주로 설명되지만, 순수 금속 또는 순수 금속의 혼합물로 이루어진 나노크리스탈도 본 발명에 이용될 수 있는 것으로 이해된다. 다른 구현예에서, 본 발명에 이용되는 상기 나노크리스탈 코어는 두개의 원소를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 나노크리스탈 코어는 Zn, Cd, Hg, Mg, Mn, Ga, In, Al, Fe, Co, Ni, Cu, Ag, Au 및 Au와 같은 금속으로 형성된 잘 알려진 코어-쉘과 같은, 두개의 금속 원소, M1 및 M2를 포함하는 이원의 나노크리스탈 합금일 수 있다. 본 발명에 적합한 다른 형태의 이원 나노크리스탈은 하나의 금속 원소 M1 및 상기 PSE의 V 족 또는 VI 족으로부터 선택되는 최소 하나의 원소 A를 포함 할 수 있다. 따라서, 본 qkfaudd 이용하기에 적합한 나노크리스탈의 한 형태는 화학식 M1A를 가진다. 이러한 나노크리스탈의 예는 II-VI 족 반도체 나노크리스탈(즉, II 족 또는 IIB 족 금속, 및 VI 족 원소를 포함하는 나노크리스탈)일 수 있고, 상기 코어 및/또는 쉘(본 명세서에서 사용된 용어“쉘”은 상기 나노크리스탈을 둘러싸는 유기 분자로 만들어진 수용성“쉘”과는 다르고 개별적이다)은 CdS, CdSe, CdTe, MgTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, HgS, HgSe 또는 HgTe을 포함한다. 상기 나노크리스탈 코어는 또한 III-V 족 반도체 나노크리스탈(즉, III 족 금속 및 V 족 원소를 포함하는 나노크리스탈)일 수 있다. 상기 코어 및/또는 쉘은 GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, AIN, AIP, AIAs 또는 AISb을 포함한다. 본 발명에 사용되는 코어 쉘 나노크리스탈의 구체예는 ZnS 쉘을 가지는 (CdSe)-나노크리스탈 뿐만아니라 ZnS 쉘을 가지는 (CdS)-나노크리스탈을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment, suitable nanocrystals have nanocrystals containing only metals. For this purpose, M1 can be selected from the group consisting of Group II, VIIA, Group VIIIA, Group IB, Group IIB, Group III or Group IV elements of the Periodic Table of Elements (PSE). Thus, the nanocrystal core may consist only of the metal element M1; As defined below, the non-metallic elements A or B are absent. In one embodiment of the invention, the nanocrystals are gold, silver or copper (Group Ib), titanium (Group IVb), terbium (Group IIIb), cobalt, platinum, rhodium, ruthenium (Group VIIIb), It consists solely of pure metals from this group of PSE, such as lead (Group IV) or alloys thereof. In the following, although mainly described with respect to nanocrystals comprising the counter element A, it is understood that nanocrystals made of pure metals or mixtures of pure metals can also be used in the present invention. In another embodiment, the nanocrystal core used in the present invention may include two elements. Thus, the nanocrystal core is two, such as the well-known core-shell formed of metals such as Zn, Cd, Hg, Mg, Mn, Ga, In, Al, Fe, Co, Ni, Cu, Ag, Au and Au. It may be a binary nanocrystal alloy containing a metal element of, M1 and M2. Other forms of binary nanocrystals suitable for the present invention may include one metal element M1 and at least one element A selected from Group V or Group VI of the PSE. Thus, one form of nanocrystal suitable for use with the present qkfaudd has the formula M1A. Examples of such nanocrystals may be group II-VI semiconductor nanocrystals (ie, nanocrystals comprising Group II or IIB metals, and Group VI elements), and the core and / or shell (terms used herein "Shells" are different and distinct from water-soluble "shells" made of organic molecules surrounding the nanocrystals), including CdS, CdSe, CdTe, MgTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, HgS, HgSe or HgTe. The nanocrystal core may also be a III-V semiconductor nanocrystal (ie, a nanocrystal comprising a Group III metal and a Group V element). The core and / or shell comprises GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, AIN, AIP, AIAs or AISb. Specific examples of the core shell nanocrystals used in the present invention include, but are not limited to, (CdSe) -nanocrystals having ZnS shells, as well as (CdS) -nanocrystals having ZnS shells.
본 발명은 상술한 코어-쉘 나노크리스탈에 한정되는 것은 아니다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노크리스탈은 조성 M11 -x-M2XA를 가지는 균일 삼원 합금으로 이루어진 코어를 가질 수 있고, 여기에서The invention is not limited to the core-shell nanocrystals described above. In another preferred embodiment, the nanocrystals of the present invention may have a core consisting of a homogeneous ternary alloy having the composition M1 1- x -M2 X A, wherein
a) A가 상기 PSE의 VI 족 원소를 나타내는 경우, 상기 M1 및 M2는 각각 독립적으로 원소 주기율표(PSE)의 IIb 족, VIIa 족, VIIIa 족, Ib 족 또는 II 족 원소로부터 선택되며, 또는a) when A represents a Group VI element of the PSE, M1 and M2 are each independently selected from Group IIb, Group VIIa, VIIIa, Group Ib or Group II elements of the Periodic Table of the Elements (PSE), or
b) A가 상기 PSE의 (V) 족 원소를 나타내는 경우, M1 및 M2는 모두 상기 PSE의 (III) 족 원소로부터 선택된다.b) When A represents a group (V) element of the PSE, both M1 and M2 are selected from the group (III) elements of the PSE.
다른 구현예에서, 균질 사원 합금으로 이루어진 나노크리스탈이 사용될 수 있다. 상기 형태의 사원 합금은 조성 M11 - xM2xAyB1 -y를 가지고, 여기에서In other embodiments, nanocrystals made of homogeneous quaternary alloys may be used. The temple alloy of this type has the composition M1 1 - x M2 x A y B 1 -y , where
a) A 및 B 모두가 상기 PSE의 VI 족 원소를 나타내는 경우, 상기 M1 및 M2는 각각 독립적으로 원소 주기율표(PSE)의 IIb 족, VIIa 족, VIIIa 족, Ib 족 또는 II 족 원소로부터 선택되며, 또는a) when both A and B represent a Group VI element of the PSE, the M1 and M2 are each independently selected from Group IIb, Group VIIa, Group VIIIa, Group Ib or Group II elements of the Periodic Table of the Elements (PSE), or
b) A 및 B 모두가 상기 PSE의 (V) 족 원소를 나타내는 경우, M1 및 M2는 각각 독립적으로 상기 PSE의 (III) 족 원소로부터 선택된다.b) When both A and B represent group (V) elements of the PSE, M1 and M2 are each independently selected from group (III) elements of the PSE.
상기 형태의 균질 삼원 또는 사원 나노크리스탈의 예는, 예를 들어, Zhong et al, J. Am. Chem. Soc, 2003 125, 8598-8594, Zhong et al, J. Am. Chem. Soc, 2003 125, 13559- 13553, 또는 국제 특허 출원 WO 2004/054923에 설명되어 있다.Examples of homogeneous ternary or quaternary nanocrystals of this type are described, for example, in Zhong et al, J. Am. Chem. Soc, 2003 125, 8598-8594, Zhong et al, J. Am. Chem. Soc, 2003 125, 13559-13553, or international patent application WO 2004/054923.
상술한 화학식에 사용된 M1 및 M2의 지정은 본 명세서 전반에 걸쳐 서로 바꾸어 사용될 수 있다. 예를 들어, Cd 및 Hg를 포함하는 합금은 각각, M1 또는 M2 뿐만 아니라 M2 및 M1으로 지정될 수 있다. 마찬가지로, 상기 PSE의 V 족 또는 VI 족 원소에 대한 A 및 B의 지정은 서로 바꾸어 사용할 수 있다; 따라서 본 발명의 사원 합금에서, Se 또는 Te는 모두 원소 A 또는 B로서 명명될 수 있다.The designations of M1 and M2 used in the above-described formula may be used interchangeably throughout this specification. For example, alloys comprising Cd and Hg may be designated M2 or M1 as well as M1 or M2, respectively. Likewise, the designations of A and B for the Group V or Group VI elements of the PSE may be used interchangeably; Thus, in the alloy of the invention, Se or Te can both be named as element A or B.
상기 삼원 나노크리스탈은 다음의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득할 수 있다; The ternary nanocrystals can be obtained by a process comprising the following steps;
ⅰ) 적합한 온도 T1에서 나노크리스탈의 생성에 적합한 형태로 원소 M1을 포함하는 반응 혼합물을 가열하고, 상기 온도에서 나노크리스탈의 생성에 적합한 형태로 원소 A를 첨가하며, 상기 이원 나노크리스탈 M1A를 형성하기에 적합한 온도에서 충분한 시간동안 반응혼합물을 가열한 다음 상기 반응 혼합물을 냉각하여 이원 나노크리스탈 M1A를 형성하는 단계, 및Iii) heating the reaction mixture comprising element M1 in a form suitable for the production of nanocrystals at a suitable temperature T1, adding element A in a form suitable for the production of nanocrystals at this temperature and forming the binary nanocrystal M1A Heating the reaction mixture for a sufficient time at a temperature suitable for to cool the reaction mixture to form binary nanocrystals M1A, and
ⅱ) 상기 형성된 이원 나노크리스탈 M1A를 침전하거나 분리하는 과정 없이, 상기 반응 혼합물을 적합한 온도 T2에서 재가열하고, 나노크리스탈의 생성에 적합한 형태로 상기 원소 M2의 충분한 양을 상기 온도에서 상기 반응 혼합물에 첨가하며, 그 다음 상기 삼원 나노크리스탈 M11 - XM2XA를 형성하기에 적합한 온도에서 충분한 시간 동안 상기 반응 혼합물을 가열한 다음 상기 반응 혼합물을 실온에서 냉각하고, 삼원 나노크리스탈 M11 - XM2XA를 분리하는 단계.Ii) reheating the reaction mixture at a suitable temperature T2, without precipitating or separating the formed binary nanocrystal M1A, and adding a sufficient amount of the element M2 to the reaction mixture at that temperature in a form suitable for the production of nanocrystals Then, the reaction mixture is heated for a sufficient time at a temperature suitable to form the ternary nanocrystals M1 1 - X M2 X A and the reaction mixture is cooled at room temperature, and the ternary nanocrystals M1 1 - X M2 X Separating A.
상기 삼원 나노크리스탈에서, 상기 인덱스 x는 0.001 < x < 0.999, 바람직하게는 0.01 < x < 0.99, 0.1 < 0.9 또는 보다 바람직하게는 0.5 < x < 0.95의 값을 가진다. 보다 더욱 더 바람직한 구현예에서, x는 약 0.2 또는 약 0.3에서 약 0.8 또는 약 0.9까지의 값을 가질 수 있다. 이용되는 사원 나노크리스탈에서, y는 0.001 < y < 0.999, 바람직하게는 0.01 < y < 0.99, 또는 보다 바람직하게는 0.1 < x <0.95 또는 약 0.2에서 약 0.8까지의 값을 가진다.In the ternary nanocrystals, the index x has a value of 0.001 <x <0.999, preferably 0.01 <x <0.99, 0.1 <0.9 or more preferably 0.5 <x <0.95. In even more preferred embodiments, x can have a value from about 0.2 or about 0.3 to about 0.8 or about 0.9. In the quaternary nanocrystals used, y has a value of 0.001 <y <0.999, preferably 0.01 <y <0.99, or more preferably 0.1 <x <0.99 or from about 0.2 to about 0.8.
상기 II-VI 삼원 나노크리스탈에서, 여기에 포함되는 원소 M1 및 M2는 Zn, Cd 및 Hg로 구성된 군으로부터 바람직하게 독립적으로 선택된다. 상기 삼원 합금에서 상기 PSE의 VI 족 원소 A는 S, Se 및 Te로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택된다. 따라서, 상기 원소 M1, M2 및 A의 모든 조합은 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 구현예에서, 이용되는 나노크리스탈은 조성 ZnxCd1 - xSe, ZnxCd1-xS, ZnxCd1 - xTe, HgxCd1 - xSe, HgxCd1 - xTe, HgxCd1 - xS, ZnxHg1 - xSe, ZnxHg1 - xTe 및 ZnxHg1 - xS를 가진다.In the II-VI ternary nanocrystals, the elements M1 and M2 included therein are preferably independently selected from the group consisting of Zn, Cd and Hg. Group VI element A of the PSE in the ternary alloy is preferably selected from the group consisting of S, Se and Te. Therefore, all combinations of the elements M1, M2 and A are within the scope of the present invention. In a preferred embodiment, the nanocrystals used are compositions Zn x Cd 1 - x Se, Zn x Cd 1-x S, Zn x Cd 1 - x Te, Hg x Cd 1 - x Se, Hg x Cd 1 - x Te , Hg x Cd 1 - x S, Zn x Hg 1 - x Se, Zn x Hg 1 - x Te and Zn x Hg 1 - x S.
어떤 바람직한 구현예에서, 상기 화학식에 사용된 x는 0.10 < x < 0.90 또는 0.15 < x < 0.85, 및 보다 바람직하게는 0.2 < x < 0.8의 값을 가진다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 나노크리스탈은 조성 ZnxCd1 - xS 및 ZnxCd1 - xSe를 가진다. 상기 나노크리스탈은 바람직하게는 x가 0.10 < x < 0.95, 그리고 보다 바람직하게는 0.2 < x < 0.8의 값을 가진다.In certain preferred embodiments, x used in the above formula has a value of 0.10 <x <0.90 or 0.15 <x <0.85, and more preferably 0.2 <x <0.8. In a particularly preferred embodiment, the nanocrystals have the compositions Zn x Cd 1 - x S and Zn x Cd 1 - x Se. The nanocrystals preferably have x values of 0.10 <x <0.95, and more preferably 0.2 <x <0.8.
상기 나노크리스탈 코어가 본 발명의 III-V 나노크리스탈로부터 만들어지는 어떤 구현예에서, 원소 M1 및 M2 각각은 독립적으로 Ga 및 In로부터 선택된다. 원소 A는 바람직하게는 P, As 및 Sb로부터 선택된다. 상기 원소 M1, M2 및 A의 모든 가능한 조합은 본 발명의 범위 내에 있다. 어떤 바람직한 구현예에서, 나노크리스탈은 조성 Gaxln1 - xP, Gaxln1 - xAs 및 Gaxln1 - xAs를 가진다.In certain embodiments wherein the nanocrystal cores are made from III-V nanocrystals of the present invention, each of the elements M1 and M2 is independently selected from Ga and In. Element A is preferably selected from P, As and Sb. All possible combinations of the elements M1, M2 and A are within the scope of the present invention. In certain preferred embodiments, the nanocrystals have compositions Ga x ln 1 - x P, Ga x ln 1 - x As and Ga x ln 1 - x As.
본 발명에서, 상기 나노크리스탈 코어는 두개의 주 성분을 포함하는 수용성 폴리머 쉘에 둘러싸여진다. 상기 수용성 쉘의 첫 번째 성분은 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 친화력을 가지고 상기 폴리머 쉘의 첫 번째 층을 형성하는 캡핑 시약이다. 두 번째 성분은 상기 캡핑 시약에 결합되고 수용성 쉘의 두 번째 층을 형성하는 저 분자량 코팅 시약이다.In the present invention, the nanocrystal core is surrounded by a water soluble polymer shell comprising two main components. The first component of the water soluble shell is a capping reagent that has an affinity for the surface of the nanocrystal core and forms the first layer of the polymer shell. The second component is a low molecular weight coating reagent that binds to the capping reagent and forms a second layer of the water soluble shell.
나노 물질의 표면에 결합 친화력을 가지는 작은 분자 또는 올리고머의 모든 형태는 첫 번째 층을 형성하기 위한 캡핑 시약으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 오직 한 형태의 화합물만이 캡핑 시약으로 이용된다. 다른 구현예에서, 2, 3, 4 또는 그 이상의 (또는 최소 2) 다른 화합물의 혼합물이 상기 캡핑 시약으로 이용된다. 바람직한 캡핑 시약은 유기 분자이고, 첫째로, 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 고정될 수 있도록 결합할 수 있거나 공유적으로 결합할 수 있는 최소 하나의 부분을 가지고, 둘째로, 상기 코팅 시약과 연속적인 결합을 제공하는 최소 두개의 결합기를 가진다. 상기 결합기는 상기 코팅 시약에 존재하는 결합 부분에 직접적으로 반응할 수 있거나, 결합 반응을 일으키게 하기 위해서, 예를 들어, 결합제에 의한 활성화를 필요로 하는, 간접적으로 반응할 수 있다. 상기 부분의 각각은 분자의 말단 위치 또는 분자의 주 사슬을 따라 비-말단 위치의 상기 캡핑 시약에 존재할 수 있다.Any form of small molecule or oligomer that has a binding affinity to the surface of the nanomaterial can be used as a capping reagent to form the first layer. In one embodiment, only one type of compound is used as the capping reagent. In another embodiment, a mixture of 2, 3, 4 or more (or at least 2) other compounds is used as the capping reagent. Preferred capping reagents are organic molecules, firstly having at least one moiety that can bind or covalently bind to be immobilized on the surface of the nanocrystal core, and secondly, continuous binding with the coating reagent. It has at least two couplers that provide The linking group may react directly with the binding moiety present in the coating reagent or may react indirectly, for example, requiring activation by a binder to cause the binding reaction. Each of the moieties may be present in the capping reagent in the terminal position of the molecule or in a non-terminal position along the main chain of the molecule.
일 구현예에서, 상기 캡핑 시약은 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 친화력을 가지는 하나의 부분을 포함하고, 상기 부분은 상기 캡핑 시약 분자의 말단에 위치하고 있다. 상기 나노크리스탈 코어 및 상기 부분간의 상호작용은 소수성 또는 정전기적 상호작용, 또는 공유 또는 배위 결합으로 인해 발생한다. 적절한 말단기는 자유(비결합된) 전자쌍을 가지는 부분을 포함하여, 상기 캡핑 시약을 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 결합될 수 있도록 한다. 대표적인 말단기는 S, N, P 원자 또는 P=O 기를 함유하는 부분을 포함한다. 상기 부분의 구체예는 예를 들어, 아민, 티올, 아민-옥사이드 및 포스핀을 포함한다.In one embodiment, the capping reagent comprises a portion having an affinity for the surface of the nanocrystal core, wherein the portion is located at the end of the capping reagent molecule. Interaction between the nanocrystal core and the portion occurs due to hydrophobic or electrostatic interaction, or covalent or coordination bonds. Suitable end groups include moieties having free (unbound) electron pairs to enable the capping reagent to be bound to the surface of the nanocrystal core. Representative end groups include moieties containing S, N, P atoms or P═O groups. Embodiments of this portion include, for example, amines, thiols, amine-oxides and phosphines.
다른 구현예에서, 상기 캡핑 시약은 소수성 영역에 의해 말단기로부터 멀리 떨어져서 위치한 최소 하나의 결합기를 추가적으로 포함한다. 각 결합기는 수용성 쉘의 두 번째 층을 형성하기 위하여 사용되는 상기 코팅 시약 상의 상보적인 결합 부분과 반응할 수 있는 적합한 수의 주 사슬 탄소 원자 및 적절한 작용기를 포함 할 수 있다. 대표적인 결합 부분은 하이드록시(-OH), 아미노(-NH2), 카르복실(-COOH), 카르보닐(-CHO) 및 시아노(-CN)기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.In another embodiment, the capping reagent further comprises at least one linker located away from the end group by a hydrophobic region. Each linker may comprise a suitable number of main chain carbon atoms and appropriate functional groups capable of reacting with the complementary linking moiety on the coating reagent used to form the second layer of the water soluble shell. Representative binding moieties can be selected from the group consisting of hydroxy (-OH), amino (-NH 2 ), carboxyl (-COOH), carbonyl (-CHO) and cyano (-CN) groups.
바람직한 구현예에서, 상기 캡핑 시약은 하기 일반식(G1)으로 표시된 바와 같이, 소수성 영역에 의해 말단기로부터 멀리 떨어져서 위치한 두개의 결합기를 포함한다:In a preferred embodiment, the capping reagent comprises two bonding groups located away from the end group by a hydrophobic region, as represented by the general formula (G1):
일반식 General formula G1G1
여기에서From here
TG - 말단기TG-terminal group
HR - 소수성 영역HR-hydrophobic region
CM1& CM2 - 결합기CM 1 & CM 2 -Combiner
상기 일반식 G1에서, 상기 결합기 CM1 및 CM2는 친수성일 수 있다. 대표적인 친수성 결합기는 -NH2, -COOH 또는 OH 작용기를 포함한다. 다른 예는 니트릴기, 니트로, 이소시아네이트기, 안하이드라이드, 에폭사이드 및 할라이드기를 포함한다. 상기 결합기는 또한 소수성일 수 있다. 소수성 및 친수성기의 조합을 가지는 캡핑 시약이 이용될 수 있다. 소수성기의 예는 알킬 부분, 방향족 고리 또는 메톡시기를 포함한다. 각 결합기는 독립적으로 선택될 수 있고, 친수성 캡핑 시약 및 소수성 캡핑 시약의 조합이 동시에 사용될 수 있다.In Formula G1, the linking groups CM 1 and CM 2 may be hydrophilic. Representative hydrophilic linking groups include -NH 2 , -COOH or OH functional groups. Other examples include nitrile groups, nitros, isocyanate groups, anhydrides, epoxides and halide groups. The linking group may also be hydrophobic. Capping reagents having a combination of hydrophobic and hydrophilic groups can be used. Examples of hydrophobic groups include alkyl moieties, aromatic rings or methoxy groups. Each linker may be selected independently and a combination of hydrophilic capping reagent and hydrophobic capping reagent may be used simultaneously.
이론에 구애받지 않는다는 것을 가정하면, 일반식 (G1)로 정의된 상기 캡핑 시약의 소수성 영역은 수성 환경에 존재하는 전하를 띄는 종으로부터 나노크리스탈 코어를 보호 할 수 있다고 판단된다. 상기 수성 환경에서 나노크리스탈 코어의 표면으로의 전하 이동은 상기 소수성 영역에 의해 방해되어, 합성 동안의 나노크리스탈 중간체(즉, 상기 캡핑 시약으로 캡핑된 나노크리스탈)의 미성숙 쿠엔칭(quenching)을 최소화할 수 있다. 따라서, 상기 캡핑 시약에서 소수성 영역의 존재는 상기 나노크리스탈의 최종 양자 수율을 개선하는데 도움을 줄 수 있다. 상기 목적에 적절한 소수성 부분의 예는 모든 지방족 직쇄, 고리형 또는 방향족 탄화수소 부분을 포함하는, 탄화수소 부분을 포함한다.Assuming that it is not bound by theory, it is believed that the hydrophobic region of the capping reagent defined by formula (G1) can protect the nanocrystal core from the charged species present in the aqueous environment. The charge transfer to the surface of the nanocrystal cores in the aqueous environment is disturbed by the hydrophobic region, thereby minimizing immature quenching of the nanocrystal intermediates (ie, nanocrystals capped with the capping reagent) during synthesis. Can be. Thus, the presence of hydrophobic regions in the capping reagent may help to improve the final quantum yield of the nanocrystals. Examples of hydrophobic moieties suitable for this purpose include hydrocarbon moieties, including all aliphatic straight chain, cyclic or aromatic hydrocarbon moieties.
일 구현예에서, 본 발명의 상기 나노크리스탈에 사용되는 상기 캡핑 시약은 일반식 (I)을 갖는다:In one embodiment, the capping reagent used in the nanocrystals of the present invention has formula (I):
일반식 IFormula I
상기 화학식에서, X는 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 친화력을 가지는 말단기를 나타낸다. X는 S, N, P 또는 O=P로부터 선택될 수 있다. 상기 부분 Hn-X-의 구체예는 다음 중 어느 하나를 포함 할 수 있다: 예컨대, H-S-, O=P- 및 H2N- 이다. Ra는 최소 두개의 주 사슬 탄소 원자를 포함하는 부분이고, 이에 소수성을 가진다. 만일, Ra가 소수성이 우세하다면, 예컨대 Ra가 탄화수소인 경우, Ra는 상기 나노크리스탈 코어로부터 Z 부분을 분리하는 소수성 영역을 제공한다. 상기 부분 Y는 N, C, -COO- 또는 -CH2O-로부터 선택된다. Z는 연속한 중합을 위한 최소 하나의 결합 부분을 포함하여, 상기 친수성 캡핑 시약의 일부에 우세한 친수성을 부여하는 부분이다. 대표적인 극성 작용기는 -OH, -COOH, -NH2, -CHO, -CONHR, -CN, -NCO, -COR 및 할라이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 화학식에서 숫자는 기호 k, n, n’및 m으로 나타낸다. k는 O 또는 1이다. 상기 숫자 n은 0 내지 3의 정수이고 n’은 0 내지 2의 정수이다; 모두 X 및 Y 각각의 원자가전자 요건을 만족시키기 위해서 선택된다. 숫자 m은 1 내지 3의 정수이다. 숫자 k 는 O 또는 1이다. 상기 조건은 만약 k가 0 이라면, Z는 Ra에 결합할 수 있다는 것에 적용한다. 결합기 Z가, 예를 들어 고리부분, 예컨대 지방족 사이클로알칸, 방향족 탄화수소 또는 헤테로사이클과 같은 Ra에 직접적으로 결합되는 경우를 k=0 값이 충족시킨다. 그러나, 예컨대, 벤젠 고리에 결합된 3차 아미노기, 또는 고리형 탄화수소와 같이, k=1일 때 Ra가 고리 부분이라는 것은 가능하다. 본 발명의 상기 화학식에서, Z는 아미노, 하이드록실, 카르보닐, 카르복실, 니트릴, 니트로, 이소시아네이트, 에폭사이드, 안하이드라이드 및 할라이드기로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기이다. Y 또는 Z는 결합기로서 작용할 수 있다. 만약 Z가 결합기로서 존재한다면, 이어 Y는 결합기 Z에 결합하기 위한 구조 성분으로서 작용할 수 있다. 만약 Z가 없다면, Y는 그 다음 결합기의 일부를 형성할 수 있다.In the above formula, X represents an end group having an affinity for the surface of the nanocrystal core. X may be selected from S, N, P or O = P. Embodiments of the portion H n -X- may include any of the following: HS-, O = P- and H 2 N-. R a is a moiety containing at least two main chain carbon atoms and is therefore hydrophobic. If R a is hydrophobic, for example, if R a is a hydrocarbon, R a provides a hydrophobic region that separates the Z portion from the nanocrystal core. The part Y is selected from N, C, -COO- or -CH 2 O-. Z is a moiety that imparts predominant hydrophilicity to some of the hydrophilic capping reagents, including at least one binding moiety for continuous polymerization. Representative polar functional groups include, but are not limited to, -OH, -COOH, -NH 2 , -CHO, -CONHR, -CN, -NCO, -COR and halides. Numbers in the formulas are represented by the symbols k, n, n 'and m. k is 0 or 1; The number n is an integer from 0 to 3 and n 'is an integer from 0 to 2; Both are selected to satisfy the valence electron requirements of X and Y respectively. The number m is an integer from 1 to 3. The number k is 0 or 1. The condition applies that if k is zero, then Z can bind to R a . The k = 0 value satisfies when the linking group Z is bonded directly to R a , for example a ring moiety such as an aliphatic cycloalkane, aromatic hydrocarbon or heterocycle. However, it is possible that R a is a ring moiety when k = 1, such as, for example, a tertiary amino group bonded to a benzene ring, or a cyclic hydrocarbon. In the above formula of the present invention, Z is a functional group selected from the group consisting of amino, hydroxyl, carbonyl, carboxyl, nitrile, nitro, isocyanate, epoxide, anhydride and halide groups. Y or Z may act as a bonding group. If Z is present as a linking group, then Y may act as a structural component for binding to linking group Z. If Z is absent, then Y may form part of the next linker.
상기 화학식에서 부분 Ra는 약 10 내지 약 100개의 주 사슬 원자를 포함할 수 있다. 특히 일 구현예에서, Ra 및 Z 각각은 독립적으로 2 내지 50 개의 주 사슬 원자를 포함한다. Z는 하나 또는 그 이상의 아미드 또는 에스테르 결합을 포함할 수 있다. Ra에 이용될 수 있는 적절한 부분의 예는 알킬, 알케닐, 알콕시 및 아릴 부분을 포함한다.In the above formula, part R a may include from about 10 to about 100 main chain atoms. In one embodiment in particular, R a and Z each independently comprise from 2 to 50 main chain atoms. Z may comprise one or more amide or ester linkages. Examples of suitable moieties that can be used for R a include alkyl, alkenyl, alkoxy and aryl moieties.
본 명세서에 사용된 용어 “알킬”은 일반적으로 2 내지 50개의 탄소 원자를 포함하는, 분지쇄 또는 비분지쇄, 직쇄 또는 고리형 포화 탄화수소기를 의미한다. 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 옥틸, 데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 뿐만 아니라 사이클로펜틸, 사이클로헥실과 같은 사이클로알킬기이다. 본 명세서에서 사용된 “알케닐”은 일반적으로 2 내지 50개의 탄소 원자 및 최소 하나의 이중결합을 포함하는 분지쇄 또는 비분지쇄 탄화수소기를 의미한다. 전형적으로 1 내지 6의 이중 결합, 보다 전형적으로는 1 내지 2의 이중 결합을 포함한다. 예를 들어, 에테닐, n-프로페닐, n-부테닐, 옥테닐, 데세닐, 뿐만 아니라 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐과 같은 사이클로알케닐기 이다. 본 명세서에서 사용된 용어 “알콕시”는 치환기 --O-R을 의미하고 상기 R 은 상기 정의된 알킬이다. 본 명세서에서 사용된 용어 “아릴”은, 다른 언급이 없는 한, 하나 또는 그 이상의 방향족 고리를 포함하는 방향족 부분을 의미한다. 아릴기는 방향족 고리에 하나 또는 그 이상의 불활성, 비-수소 치환기로 선택적으로 치환될 수 있고, 적절한 치환기는 예를 들어, 할로, 할로알킬(바람직하게는 할로-치환 저분자 알킬), 알킬(바람직하게는 저분자 알킬), 알케닐(바람직하게는 저분자 알케닐), 알키닐(바람직하게는 저분자 알키닐), 알콕시(바람직하게는 저분자 알콕시), 알콕시카보닐(바람직하게는 저분자 알콕시카보닐), 카르복시, 니트로, 시아노 및 술포닐을 포함한다. 모든 구현예에서, Ra는 헤테로방향족 부분을 포함할 수 있고, 이는 일반적으로 질소, 산소 또는 황과 같은 헤테로원자를 포함한다.As used herein, the term “alkyl” generally refers to a branched or unbranched, straight or cyclic saturated hydrocarbon group containing from 2 to 50 carbon atoms. For example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, t-butyl, octyl, decyl, tetradecyl, hexadecyl, eicosyl, tetracosyl as well as cyclopentyl, cyclohexyl It is a cycloalkyl group. As used herein, “alkenyl” generally refers to a branched or unbranched hydrocarbon group containing from 2 to 50 carbon atoms and at least one double bond. Typically includes 1 to 6 double bonds, more typically 1 to 2 double bonds. For example, ethenyl, n-propenyl, n-butenyl, octenyl, desenyl, as well as cycloalkenyl groups such as cyclopentenyl, cyclohexenyl. As used herein, the term “alkoxy” means a substituent —OR and R is alkyl as defined above. As used herein, the term “aryl” means an aromatic moiety that includes one or more aromatic rings, unless otherwise noted. The aryl group can be optionally substituted with one or more inert, non-hydrogen substituents on the aromatic ring, and suitable substituents are, for example, halo, haloalkyl (preferably halo-substituted low molecular alkyl), alkyl (preferably Low molecular alkyl), alkenyl (preferably low molecular alkenyl), alkynyl (preferably low molecular alkynyl), alkoxy (preferably low molecular alkoxy), alkoxycarbonyl (preferably low molecular alkoxycarbonyl), carboxy, Nitro, cyano and sulfonyl. In all embodiments, R a may comprise a heteroaromatic moiety, which generally includes heteroatoms such as nitrogen, oxygen or sulfur.
바람직한 구현예에서, Ra 는 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로-옥틸, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 벤질, 퓨린, 피리딘 및 이미다졸 부분으로 구성된 군으로부터 선택된다.In a preferred embodiment, R a is selected from the group consisting of ethyl, propyl, butyl and pentyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclo-octyl, ethoxy, propoxy, butoxy, benzyl, purine, pyridine and imidazole moieties .
다른 구현예에서, 상기 캡핑 시약의 최소 두개의 결합기는 각각, 최소 두개의 동일한 결합기 또는 두개의 다른 결합기를 포함할 수 있음을 의미하는 두개의 동종 작용기 또는 두개의 이종 작용기일 수 있다. 두개 또는 세 개의 결합기를 가지는 적합한 캡핑 시약의 설명적 예는 다음과 같은 각각의 구조를 가진다:In other embodiments, the at least two linkers of the capping reagent may each be two homologous groups or two heterologous groups, meaning that they may include at least two identical linkers or two different linkers. Illustrative examples of suitable capping reagents having two or three bond groups have the respective structures as follows:
- 
상기 코팅 시약이 두개의 이종 작용기인, 즉 두개의 다른 결합기가 존재하는, 대표적인 캡핑 시약은 다음의 화합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:Representative capping reagents in which the coating reagent is two heterofunctional groups, ie two different linking groups are present, include, but are not limited to:
다른 구현예에서, 상기 캡핑 시약은 C=C 이중 결합과 같은, 중합가능한 불포화기에 의해, 자유 라티칼 중합 메카니즘을 매개로 하여 상기 코팅 시약과 결합한다. 상기 캡핑 시약의 구체예는 ω-티올 말단 메틸 메타크릴에이트, 2-부텐에티올, (E)-2-부텐-1-티올, S-(E)-2-부테닐 티오아세테이트, S-3-메틸부테닐 티오아세테이트, 2-퀴놀린메탄에티올, 및 S-2-퀴놀린메틸 티오아세테이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment, the capping reagent is bound to the coating reagent via a free radical polymerization mechanism by a polymerizable unsaturated group, such as a C═C double bond. Specific examples of the capping reagent include ω-thiol terminated methyl methacrylate, 2-buteneethol, ( E ) -2-butene-1-thiol, S- ( E ) -2-butenyl thioacetate, S- 3 -Methylbutenyl thioacetate, 2-quinolinemethanethiol, and S -2-quinolinemethyl thioacetate.
상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 수용성 쉘의 두 번째 성분은 수용성기를 가지는 저 분자량 코팅 시약을 상기 캡핑 시약에 결합함으로써 형성된다. 결합제는 상기 캡핑 시약에 존재하는 결합기를 활성화하기 위하여 선택적으로 사용될 수 있다.상기 결합제 및 상기 결합 부분을 가지는 상기 코팅 시약은 연속적으로 첨가 될 수 있다. 즉, 활성화가 일어난 후에 상기 코팅 시약은 첨가된다; 또는 상기 코팅 시약은 상기 결합제와 동시에 첨가될 수 있다.The second component of the water soluble shell surrounding the nanocrystal core is formed by binding a low molecular weight coating reagent having a water soluble group to the capping reagent. A binder may optionally be used to activate the binder present in the capping reagent. The binder and the coating reagent having the binding moiety may be added sequentially. That is, the coating reagent is added after activation occurs; Or the coating reagent may be added simultaneously with the binder.
원칙적으로, 상기 결합제가 첫 번째 층을 형성하는데 이용되는 상기 캡핑 시약 및 두 번째 층을 형성하기 위하여 이용되는 상기 코팅 시약과 화학적으로 양립 가능하다면, 즉 상기 결합제가 이들의 구조를 바꾸기 위하여 이들과 반응을 하지 않는다면, 상기 캡핑 시약의 결합기를 활성화하는 어떠한 결합제도 사용될 수 있다. 이상적으로, 상기 결합제 분자는 코팅 시약 분자에 의해 완전히 치환되어야 하기 때문에 미반응 결합제는 나노크리스탈에 존재할 수 없다. 그러나, 실제로는, 그럼에도 불구하고 상기 결합제의 미반응 잔기가 최종 나노크리스탈에 존재할 가능성이 있다.In principle, if the binder is chemically compatible with the capping reagent used to form the first layer and the coating reagent used to form the second layer, ie the binder reacts with them to change their structure. If not, any binder that activates the linking group of the capping reagent may be used. Ideally, the unreacted binder cannot be present in the nanocrystals because the binder molecule should be completely substituted by the coating reagent molecule. In practice, however, it is nevertheless possible that unreacted residues of the binder are present in the final nanocrystals.
적절한 결합제의 결정은 본 발명 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자의 지식 범위 내에 있다. 적합한 결합제의 일예는 술포-N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 함께 사용되는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드(EDC) 이다. 사용될 수 있는 다른 형태의 결합제는 이미드 및 아졸을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 이미드의 예는 카보디이미드, 숙신이미드 및 프탈이미드이다. 이미드의 명시적 예는 N-하이드록시숙신이미드 또는 다른 활성 분자와 함께 사용되는, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드(EDC), 술포-N-하이드록시숙신이미드, N,N’- 디사이크로헥실카보디이미드(DCC), N,N’-디사이클로헥실 카보디이미드, N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드를 포함한다. Determination of appropriate binders is within the knowledge of those of ordinary skill in the art. One example of a suitable binder is 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide (EDC) used with sulfo-N-hydroxysuccinimide (NHS). Other forms of binder that may be used include, but are not limited to, imides and azoles. Examples of imides that can be used are carbodiimides, succinimides and phthalimides. Explicit examples of imides are 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide (EDC), sulfo-N-hydroxysuccinate, used with N-hydroxysuccinimide or other active molecules. Imides, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N, N'-dicyclohexyl carbodiimide, N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide do.
결합기가 불포화 C=C 결합을 포함하는 캡핑 시약의 경우, 상기 결합제는 tert-부틸 퍼아세테이트, tert-부틸 퍼아세테이트, 벤조일 퍼옥사이드, 포타슘 퍼설페이트 및 퍼아세트산을 포함한다. 또한, 결합을 일으키기 위해서 상기 결합기의 불포화 결합을 활성화하는데 광개시가 적용될 수 있다.For capping reagents in which the bond group comprises unsaturated C═C bonds, the binder includes tert-butyl peracetate, tert-butyl peracetate, benzoyl peroxide, potassium persulfate and peracetic acid. In addition, photoinitiation may be applied to activate the unsaturated bonds of the linking groups in order to generate bonds.
수용성 쉘의 두 번째 층을 형성하기 위하여 사용되는 상기 코팅 시약은 상기 캡핑 시약의 활성화된 결합기와 반응할 수 있는 결합 부분을 가지는 하나 또는 그 이상의 적합한 결합 부분을 포함 할 수 있다. 전형적으로, 적합한 코팅 시약은, 상기 캡핑 시약의 활성화된 결합기에 반응성이 있는 작용기 2, 3, 4개 또는 어떤 구현예에서는 최소 2개의 작용기를 갖는 결합기를 갖는다. 도 2에서 확인 할 수 있듯이, 상기 코팅 시약의 최소 두개의 결합 부분이 상기 캡핑 시약과 반응하는 경우, 상기 코팅 시약은 상기 캡핑 시약에 예컨대, 에스테르 또는 아미드 결합의 형성에 의해 공유적으로 결합(“교차-결합”)되어, 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 수용성 쉘을 형성한다.The coating reagent used to form the second layer of the water soluble shell may comprise one or more suitable binding moieties having a binding moiety capable of reacting with an activated bonder of the capping reagent. Typically, suitable coating reagents have two, three, four, or in some embodiments, bonding groups having at least two functional groups that are reactive to the activated bonding group of the capping reagent. As can be seen in FIG. 2, when at least two binding portions of the coating reagent react with the capping reagent, the coating reagent is covalently bound to the capping reagent by, for example, the formation of an ester or amide bond (“ Cross-linked ”) to form a water-soluble shell surrounding the nanocrystal core.
상기 캡핑 시약과 상기 코팅 시약의 결합은 어떤 적절한 결합 반응 기구에 의하여 실시될 수 있다. 적절한 반응기구의 예는 자유-라디칼 결합, 아미드 결합 또는 에스테르 결합 반응을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 캡핑 시약에 결합된 상기 코팅 시약은 카보디이미드 매개 결합 반응에 의해 캡핑 시약의 노출된 결합기에 결합된다. 바람직한 결합 반응은 캡핑 시약 결합기의 카르복실 작용기 및 아미노 작용기, 그리고 상기 코팅 시약의 결합부분이 공유 결합을 형성하기 위하여 반응하는, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드]에 의해 제공되고 술포-N-하이드록시숙신이미드에 의해 촉진되는 상기 카보디이미드 결합 반응이다. The binding of the capping reagent and the coating reagent may be carried out by any suitable coupling reaction mechanism. Examples of suitable reactor tools include free-radical bonds, amide bonds or ester bond reactions. In one embodiment, the coating reagent bound to the capping reagent is bound to the exposed bonder of the capping reagent by a carbodiimide mediated binding reaction. Preferred binding reactions are to 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide, in which the carboxyl and amino functional groups of the capping reagent linking group and the binding portion of the coating reagent react to form a covalent bond. Is a carbodiimide binding reaction provided by and promoted by sulfo-N-hydroxysuccinimide.
본 발명에 있어서, 상기 수용성 쉘의 두 번째 층을 형성하기 위해서 사용된 용어 “저분자량 코팅 시약”은 비-폴리머(‘작은’) 분자를 포함한다. 상기 코팅 시약의 분자량은 상기 코팅 시약 분자에 존재하는 그룹의 형태에 따라, 작거나 클 수 있다. 예컨대, 상기 코팅 시약이 작은 측쇄를 가지는 경우, 상기 코팅 시약의 분자량은 작을 것이다. 벌키 측쇄가 존재하는 코팅 시약의 경우, 상기 코팅 시약 분자의 분자량은 보다 클 것이다. 따라서, 구현예에서, 상기 코팅 시약 분자량의 상한값은 약 200, 약 400, 약 600 달톤 또는 약 1000 일 수 있다. 큰 분자량 또는 큰 공간적 부피를 가지는 캡핑 시약이 이용되는 다른 구현예에서, 상한값은 예컨대, 약 1200, 또는 약 1500 또는 약 2000 달톤으로 보다 클 것이다. 상기 정의에 따라, 용어 “저 분자량 코팅 시약”은 그 외에 예컨대 약 2000 달톤 까지의 분자량을 가지는 올리고머 화합물을 포함한다. 용어 “결합” 및 “공유 결합”은 서로 바꾸어 사용되고, 에스테르를 형성하기 위하여 산 및 알코올을 결합하거나, 아미드를 형성하기 위하여 산 및 아민을 결합하는 것과 같이, 두 분자를 함께 연결하여 한 분자의 보다 큰 분자를 형성하는 어떤 형태의 반응을 일반적으로 의미한다. 따라서, 상기 캡핑 시약 및 상기 코팅 시약에 존재하는 결합기 및 결합부분을 결합할 수 있는 어떠한 반응도 상기 용어의 의미 내에 있다. 또한,‘결합’은 상기 코팅 시약을 상기 캡핑 시약 층에 공유적으로 결합시키기 위한 자유 라디칼 결합에 의해 상기 캡핑 시약의 상응하는 결합 부분과 상기 캡핑 시약에 결합기로서 존재하는 하나 또는 그 이상의 불포화기(예컨대, -C=C- 이중 결합)를 반응시키는 것도 포함한다.In the present invention, the term “low molecular weight coating reagent” used to form the second layer of the water soluble shell includes non-polymeric (“small”) molecules. The molecular weight of the coating reagent may be small or large, depending on the type of group present in the coating reagent molecule. For example, if the coating reagent has a small side chain, the molecular weight of the coating reagent will be small. For coating reagents with bulky side chains, the molecular weight of the coating reagent molecules will be greater. Thus, in embodiments, the upper limit of the molecular weight of the coating reagent may be about 200, about 400, about 600 daltons, or about 1000. In other embodiments where a capping reagent having a large molecular weight or large spatial volume is used, the upper limit will be greater, for example, about 1200, or about 1500 or about 2000 Daltons. In accordance with the above definition, the term “low molecular weight coating reagent” further includes oligomeric compounds having a molecular weight up to about 2000 Daltons, for example. The terms “bond” and “covalent bond” are used interchangeably and refer to the combination of two molecules together to form a molecule, such as combining an acid and an alcohol to form an ester or an acid and an amine to form an amide. Generally refers to any form of reaction that forms a large molecule. Accordingly, any reaction capable of binding the bonding groups and binding moieties present in the capping reagent and the coating reagent is within the meaning of the term. In addition, 'bonding' means one or more unsaturated groups present as a bonding group in the corresponding binding portion of the capping reagent and the capping reagent by free radical bonding to covalently bind the coating reagent to the capping reagent layer. For example, -C = C- double bond).
상기 캡핑 시약과 코팅 시약은 중합을 위해 서로 반응하는 작용기를 각각 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 코팅 시약은 상기 캡핑 시약의 결합기와 반응할 수 있는 최소 하나의 공중합이 가능한 작용기를 가지는, 최소 두개의 결합 부분을 포함하는 수용성 분자이다. 구체예에서, 상기 코팅 시약은 다음의 화학식 (II)을 가지는 수용성 분자일 수 있다:The capping reagent and the coating reagent may each have functional groups that react with each other for polymerization. In one embodiment, the coating reagent is a water soluble molecule comprising at least two binding moieties, having at least one copolymerizable functional group capable of reacting with the bonding group of the capping reagent. In an embodiment, the coating reagent can be a water soluble molecule having the formula (II)
화학식 Chemical formula IIII
상기 T는 수용성을 조절하기 위한 부분이고,T is a part for controlling water solubility,
Rc는 최소 세개의 주 사슬 탄소 원자를 포함하는 부분이며,R c is a moiety containing at least three main chain carbon atoms,
G는 N 또는 C로부터 선택되고,G is selected from N or C,
Z’은 공중합 가능한 부분이며,Z ’is a copolymerizable moiety,
n은 1 또는 2의 정수이고,n is an integer of 1 or 2,
n’은 0 또는 1 이며, 상기 n’은 G의 원자가 요건을 만족시키도록 선택된다.n 'is 0 or 1 and n' is selected to satisfy the valence requirement of G.
바람직한 특성을 가지는 수용성 쉘은 Rc가 30 이하를 가지는 캡핑 시약으로 수득될 수 있고, 바람직하게는 20 이하, 또는 보다 바람직하게는 12 이하의 주 사슬 탄소 원자이다. 바람직한 구현예에서, Rc는 3 내지 12의 주 사슬 탄소 원자를 포함한다. 특별한 실험 조건하에서, 상기 범위는 나노크리스탈의 합성 중에 높은 결합 효율을 제공한다. 상기 부분 T는 놓여진 환경에서 나노크리스탈의 용해도를 조정하기 위한 극성/친수성 작용기일 수 있다. 따라서, 상기 쉘에 친수성 또는 소수성 특성을 부여하여, 상기 나노크리스탈이 수성 환경 뿐만 아니라 비-수성 환경에서도 안정되게 한다. T는 예컨대, 하이드록실기, 카르복실기, 카르보닐기, 설포네이트기, 포스페이트기, 아미노기, 카르복사미드기와 같은 극성기로부터 선택될 수 있다. 부분 T는 수용액 상태에서 불용성인 나노크리스탈을 수득하기 위하여, 지방족 또는 방향족 탄화수소(예컨대, 지방산 또는 벤젠 유도체)와 같은 소수성이거나, 다른 유기 부분일 수 있다. T가 소수성인 경우, 상기 코팅 시약이 상기 캡핑 시약과 공중합 된 후에 친수성 부분의 삽입을 통하여 변성될 수 있다. 상기 부분 Z'는 상기 캡핑 시약의 결합 부분과 공중합가능한 작용기를 가지는 공중합 할 수 부분이다. 적합한 작용기는 예컨대, -NH2, -COOH 또는 -OH, -Br 또는 -C=C-을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Z' 은 바람직하게 최소 두개의 주 사슬 탄소 원자를 가지고, 지방족 또는 고리형 탄소 사슬을 추가적으로 포함한다.A water soluble shell having desirable properties can be obtained with a capping reagent having R c of 30 or less, preferably 20 or less, or more preferably 12 or less main chain carbon atoms. In a preferred embodiment, R c comprises from 3 to 12 main chain carbon atoms. Under special experimental conditions, this range provides high binding efficiency during the synthesis of nanocrystals. The portion T may be a polar / hydrophilic functional group for adjusting the solubility of the nanocrystals in the environment in which they are placed. Thus, hydrophilic or hydrophobic properties are imparted to the shell, making the nanocrystals stable in non-aqueous as well as aqueous environments. T may be selected from polar groups such as, for example, hydroxyl groups, carboxyl groups, carbonyl groups, sulfonate groups, phosphate groups, amino groups, carboxamide groups. Part T may be hydrophobic, such as aliphatic or aromatic hydrocarbons (eg fatty acids or benzene derivatives), or other organic moieties, to obtain nanocrystals that are insoluble in aqueous solution. If T is hydrophobic, the coating reagent may be denatured through insertion of a hydrophilic moiety after copolymerization with the capping reagent. The portion Z ′ is a copolymerizable moiety having a functional group copolymerizable with the binding moiety of the capping reagent. Suitable functional groups include, but are not limited to, for example, -NH 2 , -COOH or -OH, -Br or -C = C-. Z 'preferably has at least two main chain carbon atoms and further comprises an aliphatic or cyclic carbon chain.
일 구현예에서, T는 사이클로덱스트린 분자로부터 유래될 수 있다. 사이클로덱스트린 분자는 상기 결과적으로 생기는 공중합체의 수용성을 개선시키는 많은 수의 하이드록실기를 가지고, 또한 생물학적 표지 목적으로 하는 생분자와 쉽게 컨쥬게이트 될 수 있다. 적절한 사이클로덱스트린의 예는 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, 디메틸-α-사이클로덱스트린, 트리메틸-α-사이클로덱스트린, 디메틸-β-사이클로덱스트린, 트리메틸-β-사이클로덱스트린, 디메틸-γ-사이클로덱스트린 및 트리메틸-γ-사이클로덱스트린을 포함한다.In one embodiment, T can be derived from a cyclodextrin molecule. Cyclodextrin molecules have a large number of hydroxyl groups that improve the water solubility of the resulting copolymer and can also be easily conjugated with biomolecules for biological labeling purposes. Examples of suitable cyclodextrins are α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, dimethyl-α-cyclodextrin, trimethyl-α-cyclodextrin, dimethyl-β-cyclodextrin, trimethyl-β-cyclodextrin, dimethyl -γ-cyclodextrin and trimethyl-γ-cyclodextrin.
또 다른 구현예에서, 상기 코팅 시약은 아미노산, 바람직하게는 디아미노산 또는 디카르복실 아미노산으로부터 선택되는 수용성 분자이다. 본 발명에서 고려되는 디아미노산의 구체예는 단지 몇 개만을 열거하면, 2,4-디아미노부틸산, 2,3-디아미노프로피온산 또는 2,5-디아미노펜탄산을 포함한다. 본 발명에서 고려되는 디카르복실산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.In another embodiment, the coating reagent is a water soluble molecule selected from amino acids, preferably diamino acids or dicarboxylic amino acids. Specific examples of diamino acids contemplated by the present invention include 2,4-diaminobutyl acid, 2,3-diaminopropionic acid or 2,5-diaminopentanoic acid, when only a few are listed. Dicarboxylic acids contemplated herein include, but are not limited to, aspartic acid and glutamic acid.
다른 구현예에서, 상기 코팅 시약은 다음 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 수용성 분자이다: In another embodiment, the coating reagent is a water soluble molecule selected from the group consisting of:
상기 CD 는 사이클로덱스트린 이고,The CD is cyclodextrin,
상기 캡핑 시약이 불포화기(예컨대, C=C 이중 결합)를 포함하는 다른 구현예에서, 결합을 위하여 이용될 수 있는 적절한 코팅 시약은 1,4-부타디엔, 1,5-펜타디엔, 및 1,6-헥사디엔과 같은 디엔 및 트리-엔을 포함한다.In other embodiments wherein the capping reagent comprises an unsaturated group (eg, a C═C double bond), suitable coating reagents that may be used for binding include 1,4-butadiene, 1,5-pentadiene, and 1, Dienes such as 6-hexadiene and tri-enes.
상기 나노크리스탈을 기능화함으로써, 본 발명의 나노크리스탈을 이용하여 다양한 적용이 가능하게 되었다. 다른 구현예에서, 친화성 리간드를 수용성 쉘에 결합함으로써 상기 수용성 쉘은 기능화가 되었다. 상기 나노크리스탈은 친화성 리간드가 결합 특이성을 가지는 기질의 존재 또는 부존재를 검출 할 수 있다. 상기 기능화된 나노크리스탈의 친화성 리간드 및 샘플에 존재하는 타깃 기질 간의 접촉, 및 연속적인 결합은 다양한 용도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 기능화된 나노크리스탈-기질을 포함하는 복합체 형성은 양자화, 가시화 또는 다른 형태의 검출을 위한 검출 가능한 신호를 방출할 수 있다. 고려되는 친화성 리간드는 키메릭 또는 유전적으로 변형된 모노클로날 항체를 포함하는 모노클로날 항체, 펩타이드, 앱타머, 핵산 분자, 스트렙타비딘, 아비딘 또는 렉틴 등을 포함한다.By functionalizing the nanocrystals, various applications are possible using the nanocrystals of the present invention. In another embodiment, the water soluble shell is functionalized by binding an affinity ligand to the water soluble shell. The nanocrystals can detect the presence or absence of a substrate having binding specificity to an affinity ligand. Contact and subsequent binding between the affinity ligands of the functionalized nanocrystals and the target substrate present in the sample can serve a variety of applications. For example, complex formation comprising functionalized nanocrystal-substrate can emit a detectable signal for quantization, visualization or other forms of detection. Affinity ligands contemplated include monoclonal antibodies, peptides, aptamers, nucleic acid molecules, streptavidin, avidin or lectins, and the like, including chimeric or genetically modified monoclonal antibodies.
상술한 바와 같이, 본 발명의 다른 양태는 수용성 나노크리스탈 제조 방법에 관한 것이다.As mentioned above, another aspect of the present invention relates to a method for producing a water soluble nanocrystal.
수용성 쉘의 합성은 먼저 상기 캡핑 시약을 상기 나노크리스탈 코어와 접촉하여반응시킴으로써 실시될 수 있다. 상기 접촉 단계는 직접적 또는 간접적으로 이루어 질 수 있다. 직접적 접촉은 배위 리간드(coordinating ligand)의 사용 없이 상기 캡핑 시약을 함유하는 용액으로의 침지를 의미한다. 간접적 접촉은 상기 캡핑 시약과 접촉하는 단계 이전에 상기 나노크리스탈 코어를 준비하기 위하여 배위 리간드의 사용을 의미한다. 전형적으로 간접 접촉은 두 단계를 포함한다. 접촉 방법 둘 다 본 발명에서 실행가능하다. 그러나 배위 리간드가 캡핑 시약이 나노크리스탈 코어의 표면에 결합하는데 기여하기 때문에 후자인 간접 접촉 방법이 바람직하다.Synthesis of the water-soluble shell can be carried out by first reacting the capping reagent with the nanocrystal core. The contacting step can be done directly or indirectly. Direct contact means dipping into a solution containing the capping reagent without the use of a coordinating ligand. Indirect contact refers to the use of a coordinating ligand to prepare the nanocrystal core prior to contacting the capping reagent. Indirect contact typically involves two steps. Both contact methods are viable in the present invention. However, the latter indirect contact method is preferred because the coordinating ligand contributes to the capping reagent binding to the surface of the nanocrystal core.
간접 접촉은 다음과 같이 상세히 설명될 것이다. 간접 접촉의 첫 번째 단계에서, 배위 리간드를 유기용매에 용해함으로써 준비된다. 그 다음, 상기 나노크리스탈 코어를 미리 결정된 시간동안 유기 용매에 침지하여, 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 충분히 안정한 패시베이팅층(passivating layer)을 형성하였다(이하, “패시베이팅된 나노크리스탈”로서 의미 됨). 상기 패시베이팅층은 상기 나노크리스탈 코어에 접촉할 수 있는 친수성 종을 억제하여, 상기 나노크리스탈의 어떠한 분해도 방지할 수 있도록 한다. 상기 패시베이팅된 나노크리스탈을 분리하고, 바람직하다면, 배위 리간드를 함유하는 유기 용매에 원하는 시간동안 보관한다. 바람직하다면, 예컨대, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 또는 테트라하이드로퓨란과 같은 적절한 중성 유기 용매가 첨가될 수 있다.Indirect contact will be described in detail as follows. In the first step of indirect contact, the coordination ligand is prepared by dissolving in an organic solvent. The nanocrystal core was then immersed in an organic solvent for a predetermined time to form a sufficiently stable passivating layer on the surface of the nanocrystal core (hereinafter referred to as “passivated nanocrystal”). being). The passivating layer inhibits hydrophilic species that may contact the nanocrystal cores, thereby preventing any degradation of the nanocrystals. The passivated nanocrystals are separated and, if desired, stored in an organic solvent containing a coordinating ligand for the desired time. If desired, suitable neutral organic solvents can be added, for example chloroform, methylene chloride or tetrahydrofuran.
간접 접촉의 두 번째 단계에서, 리간드 교환은 유기용매의 존재 또는 수용액에서 실시될 수 있다. 리간드 교환(치환)은 패시베이팅된 나노크리스탈과 상기 캡핑 시약의 접촉을 촉진시키기 위하여 과잉의 상기 캡핑 시약을 패시베이팅된 나노크리스탈에 첨가함으로써 실시된다. 높은 수준의 치환을 달성하기 위하여 요구되는 접촉 시간은 요구되는 시간동안 반응 혼합물을 교반 또는 소니케이팅 함으로써 감축될 수 있다. 충분히 긴 시간이 지난 후, 상기 캡핑 시약은 패시베이팅된 층을 치환하고, 나노크리스탈에 결합하게 되어, 폴리머의 연속적 결합을 위해 상기 나노크리스탈 코어의 표면을 캡핑한다.In the second step of indirect contact, ligand exchange can be carried out in the presence of an organic solvent or in an aqueous solution. Ligand exchange (substitution) is performed by adding an excess of the capping reagent to the passivated nanocrystals to facilitate contact of the passivated nanocrystals with the capping reagent. The contact time required to achieve a high level of substitution can be reduced by stirring or sonicating the reaction mixture for the required time. After a sufficiently long time, the capping reagent displaces the passivated layer and binds to the nanocrystals, capping the surface of the nanocrystal core for continuous bonding of the polymer.
간접 접촉에서 이용되는 상기 배위 리간드는 상기 나노크리스탈 코어의 표면에 대하여 친화력을 가지는 부분을 포함하는 어떠한 분자일 수 있다. 이러한 친화력은 예컨대, 정전기적 상호작용, 공유 결합 또는 배위 결합의 형태로 분명히 나타날 수 있다. 적절한 배위 리간드는 소수성 분자, 또는 극성 작용기와 같은, 친수성 부분에 결합되는 소수성 사슬을 포함하는 양쪽성 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분자의 예는 트리옥틸포스핀, 트리옥틸포스핀 옥사이드 또는 머캡토운데카노산을 포함한다. 이용될 수 있는 다른 형태의 배위 리간드는 티올, 아민 또는 실란을 포함한다.The coordinating ligand used in indirect contact may be any molecule including a moiety having an affinity for the surface of the nanocrystal core. Such affinity can be manifested, for example, in the form of electrostatic interactions, covalent or coordinating bonds. Suitable coordinating ligands include, but are not limited to, hydrophobic molecules, or amphoteric molecules comprising hydrophobic chains attached to hydrophilic moieties, such as polar functional groups. Examples of such molecules include trioctylphosphine, trioctylphosphine oxide or mercaptodecanoic acid. Other forms of coordinating ligands that can be used include thiols, amines or silanes.
간접 접촉 방법에 의해 캡핑 시약과 코팅 시약의 결합을 실시하기 위한 개요는 도 4에서 확인할 수 있다. 우선, 나노크리스탈 코어를 트리옥틸 포스핀 옥사이드(TOPO)와 같은 배위 용매(coordination solvents)에서 준비하여, 그 결과 상기 나노크리스탈 코어 표면에 패시베이팅 층을 형성한다. 그 결과, 상기 TOPO 층은 상기 캡핑 시약에 의해 치환된다. 고농도의 상기 캡핑 시약을 함유하는 미디엄에서 TOPO-층 나노크리스탈의 분산에 의해 치환은 발생할 수 있다. 상기 단계는 전형적으로 유기용매 또는 수용액에서 실시된다. 바람직한 유기용매는 피리딘, 디메틸포름아미드(DMF), DMSO, 디클로로메탄, 에테르, 클로로포름 또는 테트라하이드로퓨란과 같은 극성 유기 용매를 포함한다. 그 후, 상기 캡핑 시약에 결합될 상기 코팅 시약을 준비하고 상기 캡핑된 나노크리스탈 코어에 첨가한다.An overview for carrying out the coupling of the capping reagent and the coating reagent by the indirect contact method can be seen in FIG. 4. First, a nanocrystal core is prepared in coordination solvents such as trioctyl phosphine oxide (TOPO), resulting in the formation of a passivating layer on the surface of the nanocrystal core. As a result, the TOPO layer is replaced by the capping reagent. Substitution can occur by dispersion of the TOPO-layer nanocrystals in medium containing high concentrations of the capping reagent. This step is typically carried out in an organic solvent or an aqueous solution. Preferred organic solvents include polar organic solvents such as pyridine, dimethylformamide (DMF), DMSO, dichloromethane, ether, chloroform or tetrahydrofuran. Thereafter, the coating reagent to be bound to the capping reagent is prepared and added to the capped nanocrystal core.
본 발명의 방법은 일단 수용성 쉘의 첫 번째 층이 형성되면, 상기 캡핑 시약으로 캡핑된 상기 나노크리스탈과 수용성기를 가지는 코팅 시약을 결합하는 추가적인 단계를 실시한다. 결합은 바람직하다면, 결합제의 존재에서 실시 될 수 있다. 상기 결합제는 코팅 시약에 대한 반응성을 부여하기 위한 상기 캡핑 시약을 준비하는데 이용될 수 있거나, 상기 캡핑 시약에 대한 반응성을 부여하기 위한 상기 코팅 시약의 결합 부분을 준비하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드)는 결합제로서 이용될 수 있고, 선택적으로 술포NHS(술포-N-하이드록시숙신이미드)에 의해 원조될 수 있다. 교차-결합제를 포함하여, 다른 형태의 결합제가 또한 사용될 수 있다. 예는 디이소프로필카보디이미드, 카보디사이클로헥실이미드, N,N’-디사이클로헥실카보디이미드(DCC; Pierce), N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-3-(2- 피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 오쏘-페닐엔디말레이미드(o-PDM), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실에이트(술포-SMCC) 및 아졸과 같은 카보디이미드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 결합제는 O-요소 유도체를 형성하기 위해서 카르복실기를 활성화함으로써 카르복실산과 아민 사이의 아미드 결합 형성을 촉매한다. 상기 유도체는 친핵성 아민기와 쉽게 반응하여 상기 결합 반응을 촉진한다.The method of the present invention performs an additional step of combining the nanocrystals capped with the capping reagent and the coating reagent having a water soluble group once the first layer of the water soluble shell is formed. Bonding can be carried out in the presence of a binder, if desired. The binder may be used to prepare the capping reagent to impart reactivity to the coating reagent, or may be used to prepare a binding portion of the coating reagent to impart reactivity to the capping reagent. In a preferred embodiment, EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide) can be used as a binder and optionally aided by sulfoNHS (sulfo-N-hydroxysuccinimide) Can be. Other forms of binder may also be used, including cross-linkers. Examples are diisopropylcarbodiimide, carbodicyclohexylimide, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC; Pierce), N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate (SATA), N Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), ortho-phenylenedimaleimide (o-PDM), and sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane Carbodiimides such as -1-carboxylate (sulfo-SMCC) and azoles, including but not limited to. The binder catalyzes the formation of an amide bond between the carboxylic acid and the amine by activating a carboxyl group to form an O-urea derivative. The derivative readily reacts with nucleophilic amine groups to promote the binding reaction.
설명을 위해, 결합기의 x 몰을 가지는 캡핑 시약의 x 몰이 1 몰의 나노크리스탈 코어에 결합될 수 있다고 가정한다. y 몰의 코팅 시약이 1 몰의 나노크리스탈 코어(x 몰의 캡핑 시약과 결합 됨)와 완전히 반응하는데 x 몰의 결합 부분을 포함한다면, 코팅 시약 대 나노크리스탈의 혼합비는 나노크리스탈 몰 당 최소 y 몰의 코팅 시약이다. 실제로, 캡핑 시약은 나노크리스탈의 완전한 캡핑을 보장하기 위해 보통 과잉으로 반응된다. 비반응된 캡핑 시약은 예컨대, 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 상기 캡핑된 나노크리스탈과 결합하기 위하여 첨가되는 코팅 시약의 양은 또한 과잉으로 첨가될 수 있고, 전형적으로 캡핑된 나노크리스탈의 몰 당 약 10, 또는 약 20 또는 약 30 내지 1000 몰의 코팅 시약의 범위이다.For illustrative purposes, assume that x moles of capping reagent with x moles of linker can be bound to 1 mole of nanocrystal cores. If y moles of coating reagent reacts completely with 1 mole of nanocrystal cores (combined with x moles of capping reagent) and contain x moles of binding moiety, the mixing ratio of coating reagent to nanocrystals is at least y moles per mole of nanocrystals. Coating reagent. In practice, the capping reagent is usually overreacted to ensure complete capping of the nanocrystals. Unreacted capping reagent can be removed, for example, by centrifugation. The amount of coating reagent added to bind with the capped nanocrystals may also be added in excess, typically in the range of about 10, or about 20 or about 30 to 1000 moles of coating reagent per mole of capped nanocrystals. .
나노크리스탈 코어의 표면에 포함된 캡핑 시약에 코팅 시약을 결합하기 위해서, 상기 코팅 시약은 결합제의 존재에서 상기 캡핑 시약과 혼합된다. 상기 결합제 및 상기 코팅 시약은 첫 번째 층을 포함하는 상기 나노크리스탈을 함유하는 용액에 동시에 첨가될 수 있거나(참조. 실시예 1 및 2), 상기 결합제 이후에 상기 코팅 시약을 첨가하는 것과 같이, 연속적으로 첨가될 수 있다. 상기 결합제는 상기 캡핑 시약 및 코팅 시약에 각각 존재하는 상기 결합기 및 결합 부분을 활성화하기 위한 개시제로서 작용한다. 이 후, 상기 코팅 시약은 상기 나노크리스탈 코어를 둘러싸는 두 번째 층을 형성하기 위하여 상기 캡핑 시약과 결합된다.In order to bind the coating reagent to the capping reagent contained on the surface of the nanocrystal core, the coating reagent is mixed with the capping reagent in the presence of a binder. The binder and the coating reagent may be added simultaneously to the solution containing the nanocrystals comprising the first layer (see Examples 1 and 2), or continuously, such as by adding the coating reagent after the binder. Can be added. The binder acts as an initiator to activate the linker and binding moiety present in the capping reagent and the coating reagent, respectively. Thereafter, the coating reagent is combined with the capping reagent to form a second layer surrounding the nanocrystal core.
상기 결합 반응은 수용액 또는 유기용매에서 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합 반응은 중합속도를 개선시키기 위하여 개시제, 안정제 또는 상전이 시약을 포함하는, 적절한 첨가제와 함께 물과 같은 수용액에서 실시될 수 있다. 또한, 인산 또는 암모늄 완충 용액과 같은, 완충 용액에서 실시 될 수 있다. 게다가, 상기 중합은 결합 시약 및 촉매와 같은, 적절한 첨가제와 함께 무수의 유기용매에서 실시될 수 있다. 일반적으로 사용되는 유기용매는 DMF, DMSO, 클로로포름, 디클로로메탄 및 THF를 포함한다.The coupling reaction may be carried out in an aqueous solution or an organic solvent. For example, the binding reaction can be carried out in an aqueous solution such as water with suitable additives including initiators, stabilizers or phase transfer reagents to improve the rate of polymerization. It may also be practiced in a buffered solution, such as a phosphoric acid or ammonium buffered solution. In addition, the polymerization can be carried out in anhydrous organic solvents with suitable additives such as binding reagents and catalysts. Commonly used organic solvents include DMF, DMSO, chloroform, dichloromethane and THF.
마지막으로, 일단 상기 수용성 쉘의 코팅 시약 층이 상기 캡핑 시약에 결합되면, 마지막 단계는 두 번째 층에 포함된 상기 코팅 시약과 두 번째 층에 존재하는 수용성 기를 노출시키기에 적합한 시약과 반응시키는 단계를 포함하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 이용되는 코팅 시약이 에스테르 결합을 포함하는 경우(두 번째 층의 형성을 간섭하는 카르복실기를 보호하기 위함), 상기 에스테르는 상기 나노크리스탈에 알칼리성 용액(예컨대, 소듐 하이드록사이드)을 첨가함으로써 가수분해될 수 있다. 이렇게 하는 것은 상기 두 번째 층의 카르복실기를 상기 용액에 노출될 수 있도록 하여, 상기 나노크리스탈에 수용성을 부여하기 위한 것이다.Finally, once the coating reagent layer of the water soluble shell is bound to the capping reagent, the last step is to react with the coating reagent included in the second layer and a reagent suitable for exposing the water soluble groups present in the second layer. It can be carried out including. For example, if the coating reagent used contains ester bonds (to protect carboxyl groups that interfere with the formation of the second layer), the ester may be added an alkaline solution (eg sodium hydroxide) to the nanocrystals. By hydrolysis. Doing so allows the carboxyl groups of the second layer to be exposed to the solution, thereby imparting water solubility to the nanocrystals.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 추가적으로 분석물에 대한 결합 친화력을 가지는 분자에 컨쥬게이트 되는 나노크리스탈에 관한 것이다. 상기 나노크리스탈을 분석물에 결합 친화력을 가지는 분자에 컨쥬게이팅 함으로써, 마커 화합물 또는 프로브가 형성된다. 상기 프로브에서, 본 발명의 나노크리스탈은 분석물의 검출을 위해 사용될 수 있도록, 예컨대, 전자기 스펙트럼의 가시광선 영역 내 또는 적외선 영역 근처의 방사선을 방출하는 라벨 또는 태그의 역할을 한다.As described herein, the present invention further relates to nanocrystals conjugated to molecules having a binding affinity for the analyte. By conjugating the nanocrystals to a molecule having a binding affinity to the analyte, a marker compound or probe is formed. In such probes, the nanocrystals of the present invention serve as labels or tags that emit radiation in the visible or near infrared region of the electromagnetic spectrum, such that they can be used for detection of analytes.
원칙적으로, 최소한 어느 정도 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합 파트너 때문에 모든 분석물은 검출될 수 있다. 상기 분석물은 약제와 같은 화학적 화합물(예컨대, 아스피린? 또는 리바비린), 또는 단백질(예컨대, 트로포닌 또는 세포 표면 단백질에 특이적인 항체) 또는 핵산분자와 같은 생화학 분자일 수 있다. 리바비린과 같은, 목적 분석물에 대하여 결합 친화력을 가지는 적절한 분자(이는 또한 분석물 결합 파트너로 부름)에 결합될 때, 그 결과로서 생기는 프로브는 환자의 혈장에 존재하는 약제의 정도를 모니터링하기 위한 형광 면역분석에서 표본으로 이용될 수 있다. 심근의 손실에 대한 마커 단백질이고, 일반적으로 심장병에 대한 마커 단백질인 트로포닌의 경우에 항-트로포닌 항체 및 본 발명의 나노크리스탈을 함유하는 컨쥬게이트는 심장병의 진단에 사용될 수 있다. 본 발명의 나노크리스탈과 종양 관련 세포 표면 단백질에 특이적인 항체와의 컨쥬게이트의 경우에, 상기 컨쥬게이트는 종양 진단 또는 영상화에 이용될 수 있다. 다른 예는 상기 나노크리스탈과 스트렙타비딘의 컨쥬게이트이다.In principle, all analytes can be detected because of specific binding partners that can specifically bind to the analyte to some extent. The analyte may be a biological molecule such as a chemical compound (for example, aspirin,? Or Ribavirin), or protein (e.g., troponin or a cell surface, an antibody specific to a protein) or a nucleic acid molecule such as a drug. When bound to an appropriate molecule (which is also called an analyte binding partner) with binding affinity for the analyte of interest, such as ribavirin, the resulting probe is a fluorescent light to monitor the level of agent present in the patient's plasma. Can be used as a sample in immunoassays. In the case of troponin, which is a marker protein for myocardial loss and generally a marker protein for heart disease, a conjugate containing an anti-troponin antibody and the nanocrystals of the invention can be used for the diagnosis of heart disease. In the case of conjugates of the nanocrystals of the invention with antibodies specific for tumor-associated cell surface proteins, the conjugates can be used for tumor diagnosis or imaging. Another example is a conjugate of the nanocrystals and streptavidin.
또한, 상기 분석물은 바이러스 입자, 크로모좀 또는 전체 세포를 포함하나 이에 한정되지 않은 복잡한 생물학적 구조일 수 있다. 예를 들어, 상기 분석물 결합 파트너가 세포막에 결합하는 지질인 경우, 상기 지질에 결합된 본 발명의 나노크리스탈을 포함하는 컨쥬게이트는 전체 세포의 검출 및 시각화에 사용될 수 있다. 세포 염색 또는 세포 영상화와 같은 목적으로, 가시광선을 방출하는 나노크리스탈은 바람직하게 사용된다. 상술한 바와 같이, 분석물 결합 파트너에 컨쥬게이트된 본 발명의 나노입자를 포함하는 마커 화합물의 사용에 의해 검출될 분석물은 바람직하게는 생분자이다.In addition, the analyte may be a complex biological structure, including but not limited to viral particles, chromosomes or whole cells. For example, when the analyte binding partner is a lipid that binds to the cell membrane, a conjugate comprising the nanocrystal of the present invention bound to the lipid can be used for detection and visualization of whole cells. For purposes such as cell staining or cell imaging, nanocrystals that emit visible light are preferably used. As described above, the analyte to be detected by the use of a marker compound comprising a nanoparticle of the invention conjugated to an analyte binding partner is preferably a biomolecule.
따라서, 보다 바람직한 구현예에서, 상기 분석물에 대한 결합 친화력을 가지는 상기 분자는 단백질, 펩타이드, 면역원성 햅텐의 특성을 가지는 화합물, 핵산, 탄수화물 또는 유기분자이다. 분석물 결합 파트너로서 이용되는 상기 단백질은 예컨대, 항체, 항체 단편, 리간드, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 효소일 수 있다. 유기분자의 예는 바이오틴, 디곡시제닌, 세로트로닌, 포레이트 유도체, 항원, 펩타이드, 단백질, 핵산 및 효소 등과 같은 화합물이다. 핵산은 DNA, RNA 또는 PNA 분자, 10 내지 50 bp의 짧은 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 보다 긴 핵산으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Thus, in a more preferred embodiment, the molecule having a binding affinity for the analyte is a compound, nucleic acid, carbohydrate or organic molecule having the properties of a protein, peptide, immunogenic hapten. The protein used as an analyte binding partner can be, for example, an antibody, antibody fragment, ligand, avidin, streptavidin or an enzyme. Examples of organic molecules are compounds such as biotin, digoxigenin, serotonin, formate derivatives, antigens, peptides, proteins, nucleic acids, enzymes and the like. The nucleic acid may be selected from DNA, RNA or PNA molecules, short oligonucleotides of 10 to 50 bp, as well as longer nucleic acids, but is not limited thereto.
생분자의 검출에 사용되는 경우, 본 발명의 나노크리스탈은 숙주 분자의 표면 노출된 그룹을 매개로하여 결합 활성을 가지는 상기 분자에 컨쥬게이트 될 수 있다. 이러한 목적으로, 아민, 하이드록실 또는 카르복실에이트기와 같은 상기 코팅 시약 상의 표면 노출된 작용기는 결합제와 반응될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 결합제는 어떤 생물학적 타깃에 대한 결합 친화력을 가지는 분자에 본 발명의 나노크리스탈을 결합할 수 있는 화합물을 의미한다. 나노크리스탈을 상기 분석물 결합 파트너에 컨쥬게이트하는데 사용될 수 있는 결합제의 예는 에틸-3-디메틸아미노카보디이미드 또는 당업자에게 알려진 다른 적절한 결합 화합물과 같은 (두개의 작용기를 가지는) 결합제이다. 적절한 결합제의 예는 N-(3-아미노프로필)3-머캡토-벤즈아미드, 3-아미노프로필-트리메톡시실란, 3-머캡토프로필-트리메톡시실란, 3-(트리메톡시시릴)프로필-말레이미드, 및 3-(트리메톡시시릴)프로필-히드라지드이다. 또한, 상기 폴리머 코팅은 의도된 결합 친화력 또는 분석물 결합 파트너를 가지는 선택된 분자에 결합되는 적절한 결합제와 컨쥬게이트 될 수 있다. 예를 들어, 상기 코팅 시약이 사이클로덱스트린 부분을 포함하는 경우, 이용될 수 있는 적절한 결합제는 페로센 유도체, 아다만탄 화합물, 폴리옥시에틸렌 화합물, 관심 분자와 공유 결합을 형성하기 위하여 적합한 반응기를 가지는 모든 방향족 화합물을 포함할 수 있나, 이에 한정되는 것은 아니다.When used for the detection of biomolecules, the nanocrystals of the invention can be conjugated to such molecules having binding activity via the surface exposed groups of the host molecule. For this purpose, surface exposed functional groups on the coating reagent, such as amine, hydroxyl or carboxylate groups, can be reacted with a binder. As used herein, a binder means a compound capable of binding the nanocrystal of the present invention to a molecule having a binding affinity for a certain biological target. An example of a binder that can be used to conjugate nanocrystals to the analyte binding partner is a binder (with two functional groups) such as ethyl-3-dimethylaminocarbodiimide or other suitable binding compound known to those skilled in the art. Examples of suitable binders are N- (3-aminopropyl) 3-mercapto-benzamide, 3-aminopropyl-trimethoxysilane, 3-mercaptopropyl-trimethoxysilane, 3- (trimethoxysilyl) Propyl-maleimide, and 3- (trimethoxysilyl) propyl-hydrazide. In addition, the polymer coating may be conjugated with a suitable binder that binds to the selected molecule having the intended binding affinity or analyte binding partner. For example, where the coating reagent comprises a cyclodextrin moiety, suitable binders that may be employed include any suitable reactor having a covalent bond with ferrocene derivatives, adamantane compounds, polyoxyethylene compounds, molecules of interest. It may include an aromatic compound, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 최소 한 형태의 나노크리스탈을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 나노크리스탈은 플라스틱 비드, 마그네틱 비드 또는 라텍스 비드에 삽입될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 정의된 나노크리스탈을 포함하는 검출 키트도 본 발명의 일부이다.In addition, the present invention provides compositions comprising at least one type of nanocrystals as defined herein. The nanocrystals may be inserted into plastic beads, magnetic beads or latex beads. In addition, detection kits comprising nanocrystals as defined herein are also part of the present invention.
본 발명은 다음의 제한되지 않은 실시예 및 첨부된 도면에 의해서 보다 상세히 설명된다:The invention is illustrated in more detail by the following non-limiting examples and the accompanying drawings:
도 1a는 본 발명의 수용성 나노크리스탈의 일반도를 나타내고, 도 1b는 캡핑 시약 헵탄-(4-N-에틸티올)-1,7-디카르복실산(첫 번째 층을 형성하기 위하여 이용됨) 및 두 번째 층을 형성하기 위한 코팅 시약으로 이용된 디-(3-아미노프로필)-6-N-헥사노익산 메틸 에스테르 사이에 형성된 교차-결합 경계를 보여주는 확대된 개략도를 나타낸다(참조: 도 2). 도 1b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 나노크리스탈은 상기 캡핑 시약의 최소 두개(이웃하는)의 분자와 상기 코팅 시약의 하나의 분자 사이의 공유결합으로 형성된 경계 영역을 포함하여, 그 결과 상기 코팅 시약 분자는 상기 캡핑 시약 분자와 함께 가교 결합의 역할을 한다.1A shows a general view of the water soluble nanocrystals of the present invention, FIG. 1B shows the capping reagent heptane- (4-N-ethylthiol) -1,7-dicarboxylic acid (used to form the first layer) and Shown is an enlarged schematic showing the cross-linking boundary formed between di- (3-aminopropyl) -6-N-hexanoic acid methyl ester used as coating reagent to form the second layer (see FIG. 2). . As can be seen in FIG. 1B, the nanocrystals comprise a boundary region formed by a covalent bond between at least two (neighboring) molecules of the capping reagent and one molecule of the coating reagent, resulting in the coating reagent. The molecule serves as a crosslink with the capping reagent molecule.
도 2a-2b는 코팅시약으로 디아민 카르복실 에스테르(디-(3-아미토프로필)-6-N-헥사노익산 메틸 에스테르) 및 캡핑 시약으로 헵탄-(4-N-에틸티올)-1,7-디카르복실산을 이용하여 교차-결합에 의해 형성된, 폴리아미드 쉘에 둘러싸여진 수용성 나노크리스탈을 합성하는 방법을 보여주는 개략도이다. 상기 예에서, 상기 형성된 두 번째 층은 노출된 카르복실산기를 포함한다.2a-2b shows diamine carboxyl ester (di- (3-amitopropyl) -6-N-hexanoic acid methyl ester) as coating reagent and heptane- (4-N-ethylthiol) -1 as capping reagent; Schematic showing how to synthesize a water soluble nanocrystal surrounded by a polyamide shell formed by cross-linking using 7-dicarboxylic acid. In this example, the second layer formed comprises exposed carboxylic acid groups.
도 3a-3b는 첫 번째 층을 형성하기 위한 캡핑 시약으로 펜탄-(3-N-에틸티올)-1,5-디아민 및 두 번째 층을 형성하기 위한 코팅 시약으로 펜탄-3,3-디에틸-카르복실 에스테르-1,5-디카르복실산을 이용하여 교차-결합에 의해 형성된, 폴리아미드 수용성 쉘에 둘러싸여진 수용성 나노크리스탈을 합성하는 방법을 보여주는 개략도이다. 상기 예에서, 상기 형성된 두 번째 층은 노출된 카르복실산기를 포함한다.3A-3B show pentane- (3-N-ethylthiol) -1,5-diamine as the capping reagent to form the first layer and pentane-3,3-diethyl as the coating reagent to form the second layer. Schematic showing how to synthesize a water soluble nanocrystal surrounded by a polyamide water soluble shell formed by cross-linking using a -carboxy ester-1,5-dicarboxylic acid. In this example, the second layer formed comprises exposed carboxylic acid groups.
도 4는 머캡토프로피온산(MCA) 또는 아미노에탄티올(AET)만으로 캡핑된 (CdSe)-ZnS 코어 쉘 나노크리스탈과 비교하여 화학적 산화에 대하여 쉘이 형성된 본 발명 나노크리스탈의 안정성을 나타낸다.4 shows the stability of the inventive nanocrystals with their shells formed against chemical oxidation compared to (CdSe) -ZnS core shell nanocrystals capped with mercaptopropionic acid (MCA) or aminoethanethiol (AET) only.
실시예Example 1: One: 수용액에서 교차-Cross-in aqueous solution 결합된Combined 쉘을Shell 가지는 수용성 Water soluble 나노크리스탈의Nanocrystal 제조 Produce
우선, 다음의 과정에 따라 TOPO 캡핑된 나노크리스탈을 제조하였다.First, TOPO capped nanocrystals were prepared according to the following procedure.
트리옥틸포스핀 옥사이드(TOPO)(3O g)를 플라스크에 넣고 1 시간동안 180℃에서 진공(~ 1 Torr) 하에 건조시켰다. 이어, 상기 플라스크를 질소로 채우고 350℃까지 가열하였다. 불활성 대기 드라이 박스에서, 다음의 주입 용액을 준비하였다: CdMe2 (0.35 ml), 1 M 트리옥틸포스핀-Se(TOPSe) 용액(4.0 ml) 및 트리옥틸포스핀(TOP)(16 ml). 상기 주입 용액을 완전히 혼합하고, 시린지(syringe)에 로딩하며, 드라이 박스로부터 제거하였다.Trioctylphosphine oxide (TOPO) (30 g) was placed in a flask and dried under vacuum (˜1 Torr) at 180 ° C. for 1 hour. The flask was then filled with nitrogen and heated to 350 ° C. In an inert atmospheric dry box, the following injection solutions were prepared: CdMe 2 (0.35 ml), 1 M trioctylphosphine-Se (TOPSe) solution (4.0 ml) and trioctylphosphine (TOP) (16 ml). The injection solution was thoroughly mixed, loaded into a syringe and removed from the dry box.
반응으로부터 열을 제거하고 상기 반응 혼합물을 한번의 연속적인 주입으로 격렬하게 교반하는 TOPO로 옮겼다. 열이 상기 반응 플라스크에 모여 온도는 점차적으로 260-280℃ 까지 상승하였다. 반응 후, 상기 반응 플라스크를 ~ 60℃까지 냉각하고, 20 ml의 부탄올을 상기 TOPO의 고체화를 방지하기 위해서 첨가하였다. 과잉의 메탄올의 첨가는 입자의 응집을 야기한다. 응집물은 원심분리에 의해 상층액으로부터 분리하였다; 결과적으로 생기는 분말은 육안으로 투명한 용액을 만들기 위해서 다양한 유기 용매에서 분산시킬 수 있다.Heat was removed from the reaction and the reaction mixture was transferred to TOPO which was vigorously stirred in one continuous injection. Heat gathered in the reaction flask and the temperature gradually rose to 260-280 ° C. After the reaction, the reaction flask was cooled to ˜60 ° C. and 20 ml of butanol was added to prevent solidification of the TOPO. The addition of excess methanol causes aggregation of the particles. Aggregates were separated from the supernatant by centrifugation; The resulting powder can be dispersed in a variety of organic solvents to make the solution clear to the naked eye.
5 g 의 TOPO을 포함하는 플라스크를 몇 시간 동안 진공 하에서 190℃까지 가열하고 0.5 ml 트리옥틸포스핀(TOP)을 첨가한 후 60℃까지 냉각 하였다. 헥산에서 분산된 약 0.1-0.4 μmol의 CdSe 점을 시린지를 이용하여 반응 용기로 옮겼고 용매는 펌핑으로 제거하였다. 디에틸 징크(ZnEt2) 및 헥사메틸디실라티안((TMS)2S)을 각각, Zn 및 S 전구체로서 사용하였다. 상기 전구체의 등 몰량을 불활성 글로브 박스 내부의 2-4 ml TOP에서 용해하였다. 상기 전구체 용액을 시린지에 로딩하고 반응 플라스크에 결합된 보충 깔때기로 옮겼다. 상기 첨가가 모두 끝난 후, 상기 혼합물은 90℃까지 냉각하고 몇 시간동안 교반하였다. 실온까 지 냉각할 때 상기 TOPO가 고체화되는 것을 방지하기 위해 부탄올을 상기 혼합물에 첨가하였다.The flask containing 5 g of TOPO was heated to 190 ° C. under vacuum for several hours and 0.5 ml trioctylphosphine (TOP) was added and then cooled to 60 ° C. About 0.1-0.4 μmol of CdSe point dispersed in hexanes was transferred to the reaction vessel using a syringe and the solvent was removed by pumping. Diethyl zinc (ZnEt 2 ) and hexamethyldisilatiane ((TMS) 2 S) were used as Zn and S precursors, respectively. Equimolar amounts of the precursor were dissolved in 2-4 ml TOP inside an inert glove box. The precursor solution was loaded into a syringe and transferred to a supplemental funnel bound to the reaction flask. After the addition was complete, the mixture was cooled to 90 ° C. and stirred for several hours. Butanol was added to the mixture to prevent the TOPO from solidifying when cooled to room temperature.
형성된 상기 (CdSe)-ZnS 코어 쉘 나노크리스탈을 피리딘 몇 방울과 과잉의 3-머캡토프로피온산과 함께 클로로포름에 용해하였다. 상기 혼합물을 2시간 동안 초음파 처리하고, 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 형성된 침전물은 원심분리로 수집하고 과잉의 산을 제거하기 위하여 아세톤으로 세척하였다. 잔여물은 아르곤으로 짧게 건조하였다. 그 다음, 나노크리스탈 코어를 덮는/둘러싸는 첫 번째 층을 형성하는 카르복실산 분자로 코팅된, 결과적으로 생기는 나노크리스탈을 물 또는 완충 용액에 용해하였다(참조: 도 2, 1 단계). 수용액에 있는 상기 나노크리스탈을 한 번 더 원심분리하고 0.2 μm 필터로 여과하며, 아르곤으로 가스를 제거하고, 사용하기 전에 25℃에서 보관하였다.The (CdSe) -ZnS core shell nanocrystals formed were dissolved in chloroform with several drops of pyridine and excess 3-mercaptopropionic acid. The mixture was sonicated for 2 hours and stirred at room temperature overnight. The precipitate formed was collected by centrifugation and washed with acetone to remove excess acid. The residue was briefly dried with argon. The resulting nanocrystals, then coated with carboxylic acid molecules to form the first layer covering / enclosing the nanocrystal cores, were dissolved in water or a buffer solution (see FIG. 2, step 1). The nanocrystals in aqueous solution were once more centrifuged and filtered through a 0.2 μm filter, degassed with argon and stored at 25 ° C. before use.
교차-결합 경계의 형성 및 두 번째 층에 포함된 코팅 시약 층의 연속적 중합을 위하여, 상기 카르복실산-캡핑 나노크리스탈을 수성 완충 시스템에 용해하였다. EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드) 및 술포NHS(술포-N-하이드록시숙신이미드)를 교차-결합제로서 500-1000 배 과잉으로 상기 나노-크리스탈 용액에 첨가하였다. 결과적으로 생기는 상기 용액을 교차-결합 경계의 형성과 관련된 작용기의 활성화를 위해 30분 동안 실온에서 교반하였다(참조: 도 2, 2 단계). 첨가된 카르복실산-캡핑 나노크리스탈, EDC 및 술포NHS를 함유하는 상기 혼합물을 디아미노-카르복실 메틸 에스테르의 동일한 완충용액에 교반하면서 적상으로 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였고, 이어 교차-결합 경계 형성 및 두 번째 층에 포함된 코팅 시약을 첫 번째 층에 공유적으로 결합하기 위하여 하룻밤 동안 4℃에 두었다 (참조: 도 2, 3 단계). 상기 디아미노-카르복실 에스테르의 수용성 카르복실기를 방출하여(즉, 메틸 에스테르 결합의 가수분해) 두 번째 수용성 층을 형성한 다음, 0.1 N NaOH 및 에탄올을 첨가하고, 상기 용액은 6시간 동안 실온에서 교반하였다(참조: 도 2, 4 단계). 고체를 제거하기 위하여 상기 용액을 원심분리하고 4℃에서 스톡 용액으로서 수용액에 보관하였다.The carboxylic acid-capped nanocrystals were dissolved in an aqueous buffer system for the formation of cross-linked boundaries and for the continuous polymerization of the coating reagent layer included in the second layer. EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide) and sulfoNHS (sulfo-N-hydroxysuccinimide) were added to the nano-crystal solution in a 500-1000 fold excess as a cross-linker. Added. The resulting solution was stirred for 30 minutes at room temperature for activation of the functional groups associated with the formation of cross-linked boundaries (see Figures 2, 2). The mixture containing the added carboxylic acid-capped nanocrystals, EDC and sulfoNHS was added dropwise with stirring to the same buffer of diamino-carboxyl methyl ester. The mixture was stirred at room temperature for 2 hours and then left at 4 ° C. overnight to covalently bind the first layer with the cross-linking boundary formation and the coating reagent included in the second layer (see FIGS. 2, 3). step). Release the water soluble carboxyl group of the diamino-carboxyl ester (ie hydrolysis of the methyl ester linkage) to form a second water soluble layer, then add 0.1 N NaOH and ethanol and stir the solution for 6 hours at room temperature (See FIG. 2, step 4). The solution was centrifuged to remove solids and stored in aqueous solution at 4 ° C. as stock solution.
수득한 상기 양자 점을 유기 용매 추출에 의해 또한 정제할 수 있다. 상기 반응(교차-결합 경계 및 상기 두 번째 층에 포함된 코팅 시약을 첫 번째 층에 공유 결합 형성) 완결 후, 유기 용매로부터 에스테르 표면을 가지는 폴리머-쉘 양자 점을 추출하기 위하여 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수득된 유기용매를 합하고, 건조한 다음, 회전 증발기로 제거하고 에스테르 결합의 가수분해 및 수용성 나노크리스탈의 형성을 위하여 에탄올 및 0.1 N NaOH에 용해하였다. 상기 용액을 실온에서 4 시간 동안 일정하게 교반한 다음 중화하였다. 상기 수득한 투명 용액을 원심분리하여 소량의 고체를 제거하고 가스를 제거한 이후 실온에서 수용액에 보관하였다.The quantum dots obtained can also be purified by organic solvent extraction. After completion of the reaction (covalent bond formation in the first layer with the cross-linking boundary and the coating reagent contained in the second layer), the solution was extracted with ethyl acetate to extract polymer-shell quantum dots having an ester surface from the organic solvent. Extracted with. The organic solvents obtained were combined, dried and then removed by rotary evaporator and dissolved in ethanol and 0.1 N NaOH for hydrolysis of ester bonds and formation of water soluble nanocrystals. The solution was stirred constantly at room temperature for 4 hours and then neutralized. The obtained clear solution was centrifuged to remove a small amount of solids and degassed and then stored in an aqueous solution at room temperature.
본 발명의 수득한 교차-결합 수용성 쉘 나노크리스탈의 물리-화학적 특성을 다음과 같이 머캡토프로피온산(MCA) 또는 아미노에탄티올(AET)만으로 캡핑된 (CdSe)-ZnS 코어 쉘 나노크리스탈과 비교하였다: 상기 나노크리스탈의 수용액에, H2O2를 최종 농도 0.15 mol/L 로 첨가하고 화학적 거동을 분광광도법으로 분석하였 다. MCA 또는 AET 만으로 코팅된 상기 나노크리스탈의 경우, 상기 나노크스탈의 산화가 즉시 검출되었고 30분 내로 상기 나노크리스탈은 침전되었다. 반대로, 상기 쉘이 형성된 본 발명의 나노크리스탈은 천천히 발생한 화학적 산화에 대하여 상당히 안정하였다.The physical-chemical properties of the obtained cross-linked water soluble shell nanocrystals of the present invention were compared with (CdSe) -ZnS core shell nanocrystals capped with mercaptopropionic acid (MCA) or aminoethanethiol (AET) only as follows: To the aqueous solution of the nanocrystals, H 2 O 2 was added at a final concentration of 0.15 mol / L and the chemical behavior was analyzed spectrophotometrically. For the nanocrystals coated with MCA or AET alone, oxidation of the nanocrystals was detected immediately and within 30 minutes the nanocrystals precipitated. In contrast, the nanocrystals of the present invention with the shells formed were quite stable against slowly occurring chemical oxidation.
다른 실험에서(데이터는 없음), 0.1 M CdSO4 용액을 MCA만으로 캡핑된 (CdSe)-ZnS 코어 쉘 나노크리스탈 또는 쉘 형성된 본 발명의 나노크리스탈에 첨가하였을 때, 상기 MCA 캡핑 나노크리스탈은 용액으로부터 빠르게 침전되었다. 한편, 본 발명의 상기 나노크리스탈은 용액에 안정하게 유지되었으며, 이는 카드뮴 이온의 첨가가 안정성에 상당한 영향을 미치지 않았음을 의미한다.In other experiments (no data), 0.1 M CdSO 4 When the solution was added to (CdSe) -ZnS core shell nanocrystals capped with MCA alone or to the shelled nanocrystals of the present invention, the MCA capping nanocrystals rapidly precipitated out of solution. On the other hand, the nanocrystals of the present invention remained stable in solution, which means that the addition of cadmium ions did not significantly affect the stability.
유사하게, MCA 캡핑 나노크리스탈과 비교하여 상기 쉘 형성 나노크리스탈의 광화학 안정성은 또한 상당히 개선되었다(데이터는 없음). 254 nm의 UV광을 노출 시켰을 때, 상기 MCA 캡핑 나노크리스탈은 48시간 내에 용액에 침전되는 것을 발견하였으나, 본 발명의 쉘 형성 나노크리스탈은 4일 동안 안정하였다. 또한, 형광 세기도 긴 시간 동안 안정하였음을 발견하였다.Similarly, the photochemical stability of the shell forming nanocrystals was also significantly improved compared to MCA capping nanocrystals (data not available). When exposed to UV light at 254 nm, the MCA capping nanocrystals were found to precipitate in solution within 48 hours, but the shell-forming nanocrystals of the present invention were stable for 4 days. It was also found that the fluorescence intensity was also stable for a long time.
실시예Example 2: 2: 유기용액에서 교차-결합 Cross-linking in Organic Solution 쉘을Shell 가지는 수용성 Water soluble 나노크리스탈의Nanocrystal 제조 Produce
TOPO 캡핑 나노크리스탈을 실시예 1과 같이 준비하고 첫 번째 층을 형성하기 위한 과량의 펜탄-(3- N-에틸티올)-1,5-디아민과 함께, 클로로포름에서 용해하였다(참조: 도 3, 1 단계). 상기 혼합물을 하룻밤 동안 실온에 두었다. 원심분리 로 형성된 침전물을 수집한 다음 메탄올로 세척하고, 아르곤 가스로 짧게 건조하였다. 상기 수득한 나노크리스탈을 무수 DMF(50 ml)에 용해하였다.TOPO capping nanocrystals were prepared as in Example 1 and dissolved in chloroform, with excess pentane- (3-N-ethylthiol) -1,5-diamine to form the first layer (see Figure 3, Stage 1). The mixture was left at room temperature overnight. The precipitate formed by centrifugation was collected and washed with methanol and dried briefly with argon gas. The obtained nanocrystals were dissolved in anhydrous DMF (50 ml).
다른 플라스크에서, 펜탄-3,3-디에틸-카르복실 에스테르-1,5-디카르복실산(두 번째 층에 포함된 코팅 시약)을 5 당량의 EDC 및 NHS와 함께 DMF에 용해하고, 실온에서 20분 동안 질소 보호 하에서 교반하였다(참조: 도 3, 2 단계). 코팅 시약과 공유 결합을 형성하기 위해 상기 용액을 상기 나노크리스탈 용액에 천천히 첨가하였다(참조: 도 3, 3 단계). 상기 결과 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 후, DMF 용매를 회전 증발기를 이용하여 감압 하에서 증발하였다. 수득한 슬러리는 5 ml의 물에 용해한 다음 5 ml의 1 M EtONa/EtOH 용액을 첨가하고 두 번째 층에 용매-노출 수용성 결합을 형성하기 위하여 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 소량의 첨가제 또는 미-반응 출발 물질을 제거하기 위하여 상기 결과 용액을 에테르로 두 번(5 ml x 2) 세척하였다. 그 다음, 보관하기 위해 0.1 N HCl 용액으로 중화하였다. 산성 용액에서 폴리머-코팅 나노크리스탈의 원심분리하여 추가적 정제를 실시하고 용액의 pH 값을 조정하여 물에 상기 나노크리스탈을 재용해 하였다.In another flask, pentane-3,3-diethyl-carboxyl ester-1,5-dicarboxylic acid (coating reagent contained in the second layer) is dissolved in DMF with 5 equivalents of EDC and NHS, and room temperature Stir under nitrogen protection for 20 minutes at (see FIG. 3, step 2). The solution was slowly added to the nanocrystal solution to form a covalent bond with the coating reagent (see Figures 3, 3). After stirring the resulting solution for 2 hours at room temperature, the DMF solvent was evaporated under reduced pressure using a rotary evaporator. The resulting slurry was dissolved in 5 ml of water and then 5 ml of 1 M EtONa / EtOH solution was added and stirred for 2 hours at room temperature to form a solvent-exposed water soluble bond in the second layer. The resulting solution was washed twice with ether (5 ml x 2) to remove small amounts of additives or unreacted starting material. It was then neutralized with 0.1 N HCl solution for storage. Further purification was performed by centrifugation of the polymer-coated nanocrystals in acidic solution and the pH of the solution was adjusted to redissolve the nanocrystals in water.
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