KR20080031167A - 알츠하이머병 치료용의 고도로 안전한 비강투여용 유전자백신 - Google Patents

알츠하이머병 치료용의 고도로 안전한 비강투여용 유전자백신 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 알츠하이머병에 대한 안전하고 효과적인 백신 치료요법을 제공한다. 아밀로이드 유전자를 수반하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 작제하여 24- 내지 25-개월된 APP 유전자도입 마우스내로 비강내 투여하였다. 혈청 항-A42 항체의 수준을 측정한 결과 대조군보다 현저히 높음을 나타내었다. 조직학적 연구의 결과는, 본 발명의 벡터의 투여가 전두엽, 두정엽 및 해마 모두에서 노인성 반점을 현저히 감소시켰음을 나타낸다. 뇌 A 수준도 또한 현저히 감소되었다. 또한, 본 발명의 벡터의 투여는 중추 신경계내에서 림프세포 침윤을 초래하지 않았다.
알츠하이머병, 유전자 백신, 비강 투여, (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터

Description

알츠하이머병 치료용의 고도로 안전한 비강투여용 유전자 백신{Highly safe intranasally administrable gene vaccines for treating alzheimer's disease}
본 발명은 알츠하이머병 치료용의 (-) 쇄 RNA 바이러스를 기본으로 하는 백신에 관한 것이다.
일본의 급속한 노령화 사회에서, 노인성 치매는 환자의 간호 문제를 포함하여 심각한 사회 문제가 되고 있다. 게다가, 일본에서 65세 이상 연령의 인구 중 대략 10%가 노인성 치매인 것으로 보고되어 있다. 치매의 2개 근본 원인 중 하나인 알츠하이머병은 병이 있는 집단 중 대략 50%에서 계수되지만, 지금까지 이용가능한 효과적인 치료방법이 존재하지 않는다.
알츠하이머병의 병리학적 발견은 3가지 특징을 지닌다: 신경세포 위축/손실; 아밀로이드 β(이후, 때때로 또한 "Aβ"로 축약함)의 응집 및 침착으로 인한 노인성 반점(senile plaque) 형성; 및 비정상적인 Tau 단백질로 인한 신경섬유 매듭. 알츠하이머병 환자의 뇌에서 생성된 주요 아밀로이드 β 단백질은 β 및 γ 세크레타제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질의 분해로 초래되는 40 내지 43개 아미노산 이다. 노인성 반점은 중심 아밀로이드 β 및 주변의 미세아교세포, 섬유성 아스트로글리아(astroglia) 및 비정상적 조직 신경돌기로 구성되어 있다. 현재, 알츠하이머병에 대한 가장 확신하는 병리학적 가설은, 질병의 원인이 아밀로이드 β 응집 및 침착에 의한 노인성 반점 형성에 있음을 제안하고 있는 "아밀로이드 캐스케이드 가설(amyloid cascade hypothesis)"이다.
이러한 가설에 기초한 백신(면역) 치료요법은 알츠하이머병에 대한 신규의 치료 방법으로서 관심이 집중되고 있다. 알츠하이머병에 대한 백신 치료요법은 면역학적 기술에 의해 뇌로부터 아밀로이드 β를 제거하는 방법이다. 엘란 코포레이션(Elan Corporation)의 쉥크(Schenk) 등은 예비-응집된 Aβ42를 보조제와 함께 PDAPP-유전자삽입 마우스에게 근육내 투여하고 뇌에서 아밀로이드 침착의 감소를 확인하였다(특허 문헌 1 및 비-특허 문헌 1). 엘란 코포레이션 및 와이어쓰 코포레이트(Wyeth Corporate)에 의해 수행된 임상 시도에서는, 합성 Aβ42 펩타이드(AN-1792)를 보조제(QS21)와 함께 근육내 주사하고, 아밀로이드의 β시트 구조를 인식하는 항-Aβ 항체를 대상체 혈청 속에서 검출하였다(비-특허 문헌 2). 고등 동물 뇌 작용에서의 개선 또한 보고되었다(비-특허 문헌 3). 불행하게도 제II상 임상 시도는, 환자 중 6%(298명의 환자중 18명)가 부작용으로서 수막뇌염으로 진행되었고, 1명의 사망이 보고되었기 때문에 중단되었다. 환자의 뇌 조직의 사후 병리학적 시험으로 신피질내 노인성 반점의 부재가 확인되었으며, 이러한 사실은 백신의 효능을 제안하고 있다. 도면은, Aβ 분해 산물의 미세아교 포식작용이, 노인성 반점이 사라진 영역에서 관측되었음을 나타낸다. 이러한 발견은, 미세아교세 포 포식작용 항체가 Fc 수용체를 통해 Aβ에 결합함을 제안한다.
상기 기술된 항-Aβ 항체는 뉴우런, 아교 세포, 아밀로이드 전구체 단백질(APPs) 및 세포내 Aβ에 대해 비-반응성인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상술한 부작용은 항체에 의해 유발된 뇌 염증으로부터 초래되는 것 같지 않다. AN-1792 백신을 투여하기 위해서는, 보조제가 요구된다. 보조제는 면역성에 있어서 강력한 활성화 효과를 지니며 T 림프세포-매개된 세포 면역성을 유발한다. 상술한 부작용은 보조제-유도된 세포 면역성에 기인한 뇌속에서 Aβ- 또는 APP-반응성 Th1 형 CD4+ T 세포의 침윤에 의해 유발된 시험적 알레르기성 뇌척수염-유사 수막뇌염일 가능성이 있다(비-특허 문헌 4).
따라서, Aβ 펩타이드를 사용한 백신 치료요법의 병리학적 효과가 AN-1792 백신을 사용함에 의해 확인되었다. 그러나, 백신의 임상적 적용을 위해서는, 수막뇌염과 같은 부작용을 감소시키는 것이 필수적이다. 이러한 관측을 기초로 하여, T 세포에 의해 인지가능한 담체 단백질에 연결된 Aβ 펩타이드 N-말단 단편과 Th2 보조제의 조합 사용(특허 문헌 2)을 포함하는 면역화 방법, 및 Aβ 펩타이드 및 콜레라 독소 B 소단위로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 벡터(특허 문헌 3)를 포함하는 개선된 백신화 방법이 고안되어 오고 있다. 또한, 본 발명자들은 Aβ 펩타이드의 펩타이드 단편을 암호화하는 DNA를 포함함으로써 체액 면역성을 유발시키는 고도로 안전한 경구용 백신인, 아데노-관련 바이러스 벡터를 개발하였다(특허 문헌 4). 위에서 언급한 아데노-관련 바이러스 벡 터 백신은, Th2 T 세포가 용이하게 유도될 수 있는 장내 점막 면역계를 이용하기 때문에 어떠한 보조제도 필요로 하지 않는다. 또한, APP 유전자도입 마우스를 사용한 시험에 의해 장관 속에서 6개월의 비교적 장기간 지속하는 항원의 존재가 단일 투여로 가능하고; 뇌 아밀로이드 침착 및 노인성 반점 형성을 감소시키는 효과를 지니며; 다른 기관속에서 어떠한 관측가능한 염증이 부재하는 등의 탁월한 특성이 확인되었다. 그럼에도 불구하고, 보다 더 안전하고 효과적인 백신이 알츠하이머병에 대한 백신 치료요법의 실제 적용을 위해 요구된다.
특허 문헌 1 : WO 99/27944
특허 문헌 2: WO 02/096350
특허 문헌 3: WO 2004/050876
특허 문헌 4: WO 2004/111250
특허 문헌 5: WO 00/70070
특허 문헌 6: 일본 공개 특허공보 (JP-A) 2000-253876
특허 문헌 7: WO 2001/072340
비-특허 문헌 1 : Schenk D. et al, Nature 400: 173-177, 1999
비-특허 문헌 2: Hock C. et al, Nat. Med. 8: 1270-1275, 2002
비-특허 문헌 3: Hock C. et al, Neuron 38, 547-554, 2003
비-특허 문헌 4: Clinical Research (Rinsho to Kenkyu) 82(3): 439-444, 2005
본 발명은 위에서 기술한 상황의 관점에서 달성되었다. 본 발명의 목적은 알츠하이머병에 대해 고도로 안전하고 효과적인 백신 치료요법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 알츠하이머병에 대한 신규의 백신 치료요법을 개발하는데 목적을 둔 전용 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 센다이 바이러스(Sendai virus: SeV)를 사용하여, 유전자 도입을 위해 및 유전자 치료요법에 적용가능한 벡터를 개발하는 것에 익숙하다. 센다이 바이러스는 (-) 쇄 RNA 바이러스이다. 당해 바이러스는 단지 숙주 세포 세포질 속에서만 증식하며 이들의 생 주기에서 DNA 상을 지니지 않으므로 염색체내로 통합되지 않는다. 따라서, 당해 바이러스는 유전자 도입을 위한 벡터로서 사용되는 경우 높은 수준의 유전적 안전성을 보증한다. 유전자 도입을 위한 센다이 바이러스계 벡터를 개발하는데 있어서, 본 발명자들은 센다이 바이러스 게놈으로부터 유전자(들)을 결실시켜 안전성을 추가로 개선시키고 표적 질병에 적합한 벡터를 제조하였다. 본 발명자들은 벡터를 보다 안전하게 하고, 게놈으로부터 숙주 세포내로 바이러스가 침입하는데 관여하는 막 융합 단백질(F 단백질)의 유전자를 결실시켜 2차 감염을 유발시키지 못하고 효율적인 바이러스 벡터 재작제 시스템을 확립하는데 성공하였다(참조: 제WO 00/70070호). 또한, 본 발명자들은 센다이 바이러스 벡터를 사용하여 인플루엔자 백신(일본 특허 공개공보 (JP-A) 2000-253876) 및 AIDS 백신(제WO 2001/072340호)를 성공적으로 개발하였다.
IL-10과 같은 Th2 사이토킨은 체내에서 면역 반응과 밀접하게 관련된 Th1/Th2 균형에 있어 중요한 역활을 담당한다. Th1 세포는 IFN-γ를 생산함으로써 세포 면역성을 증진시킨다. Th1 세포에 의해 생산된 IFN-γ는 Th2 세포에서 IL-10 생산을 제어한다. 한편, Th2 세포는 IL-10을 생산하여 체액 면역성을 증진시킨다. Th2 세포에 의해 생산된 IL-10은 IFN-γ의 생산을 제어하며 Th1 세포에서도 그러하다. 수막뇌염과 같은 세포 면역성-매개된 부작용을 제어하는 알츠하이머병용 백신을 제조하기 위한 시도에서, 본 발명자들은 상기-언급한 센다이 바이러스 벡터내로 Th2 사이토킨과 Aβ를 암호화하는 유전자를 도입시키는 것을 고려하였다. 이후에, 본 발명자들은 Aβ1-43 및 IL-10을 암호화하는 센다이 바이러스 벡터를 작제하고 이의 효과를 시험하였다. 우선, 벡터를 24- 내지 25개월된 APP 유전자도입 마우스내로 비강 투여하였다. 혈청중 항-Aβ42 항체 수준은 치료 후 4주 및 8주째에 측정하였다. 단지 낮은 수준의 항-Aβ 항체만이 대조군 그룹 마우스에서 검출되었으며 시간에 따라 당해 수준은 증가하였다. 대조적으로, 본 발명의 벡터를 투여한 마우스 그룹에서는, 높은 수준의 항-Aβ 항체가 혈액속에서 검출되었으며, 항체 수준은 4주째보다 8주째에 약간 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 조직학적 시험은, 전두엽, 두정엽 및 해마에서 노인성 반점이 본 발명의 벡터 투여시 모두 현저히 감소되었음을 나타내었다. 또한, 뇌 조직속에서 Aβ의 양은 ELISA로 측정하였다. 당해 결과는 뇌 조직속에서 Aβ의 현저한 감소를 나타내었다. 또한, CD3 및 Iba-1을 색인으로 사용하여 당해 벡터의 투여가 중추신경계에서 림프세포 침윤을 유발시켰는지를 시험하였다. 당해 결과는, 어떠한 림프세포 침윤 또는 비정상적인(과도한) 미세아교 활성화가 발생되지 않았음을 나타내었다.
상기 연구는 Aβ펩타이드를 발현하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터의 탁월한 특성을 나타내었다. 우선, 당해 벡터는 매우 연령이 높은 알츠하이머병 모델 마우스에서 Aβ를 감소시키는데 있어 현저한 효과를 나타내었다. 상기 기술한 시험에 사용된 Tg2576 마우스는 24 내지 25개월 된 것으로 이들의 생애의 거의 말기였다. 알츠하이머병에 대한 치료 방법에 가능한 근접하도록 수행된 연구에서는, 기껏해야 18개월 이하의 마우스가 사용되었다. 따라서 이렇게 늙은 연령의 마우스에서 치료 효과를 확인하였던 것은 처음이다. 이러한 고령의 마우스는 뇌속에 침착된 Aβ의 양이 많다. 즉, 본 발명의 벡터는 보다 진전된 알츠하이머병을 지닌 환자에 대해 매우 효과적일 수 있다. 둘째로, 본 발명의 벡터는, 통상의 백신 치료요법과 비교하여 보다 낮은 용량 및 투여 횟수에서 효과적이었다. 예를 들어, Aβ 펩타이드와 보조제를 함께 사용하는 통상의 방법을 채택하는 경우, 면역성을 달성하기 위하여 다수-투여량의 투여가 일반적으로 요구된다. 더구나, 투여는 AN-1792의 임상 시도시 수회 내지 12회 근처까지 수행되었다. 대조적으로, 본 발명의 벡터는 단일-투여량의 투여 후 현저한 효능을 입증하였다. 더욱이, 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용한 백신 치료요법(제WO 2004/111250호)에서, 백신화는 본원에 기술된 실시예에서 사용된 것과 동일한 단일 투여량 투여 과정에 의해 수행되었으며, 용량은 5 x 1011 게놈/신체였다. 대조적으로, 본원에 기술된 실시예에 적용된 용량은 5 x 106 CIU(세포 감염 단위)/신체(게놈 카피 수로 전환시키는 경우 약 5 x 107 게놈/신체)이었다. 이들 2개 벡터의 용량은 약 104으로서 크게 상이하다. 셋째로, 실시예에서 벡터 투여는 마우스 모델에서 수막뇌염을 유발하지 않았다. AN-1792 임상 시도에서 관측된 수막뇌염은 또한 마우스 모델에서 발견되었다(참조: M. Shoji, et al., 44th Annual Meeting of Japanese Society of Neurology, May 15-17, 2003). Aβ 펩타이드 및 보조제를 사용하여 면역화시킨 정상의 비-모델 마우스(C57B6 마우스)에서 수막뇌염의 개발이 또한 보고되었다(참조: Furlan R, et al., Vaccination with amyloid-beta peptide induces autoimmune encephalomyelitis in C57/BL6 mice, Brain 126:285-291, 2003). 본원에 기술된 결과는, 본 발명의 벡터가 또한 사람에게 투여하는 경우 안전함을 제시한다.
위에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 낮은 용량 및 투여 횟수에서 높은 Aβ-제거 효과를 나타낸다. 센다이 바이러스 벡터-계 AIDS 백신의 효과는 부분적으로 세포 면역성에 기인함이 확인되었다(참조: 제WO 2001/072340호). 비록 실시예에서 사용된 벡터가 부작용을 예방하기 위해 세포 면역성이 아닌 체액 면역성에 주로 의존하도록 설계되었다고 해도, 본원에서 증명된 탁월한 백신 효과는 알츠하이머병에 대한 백신 치료요법에서 체액 면역성의 중요성을 내포한다. 부작용은 Th2 사이토킨 또는 Th2 보조제의 사용을 통해 체액 면역성 우성을 제조함으로써 감소시킬 수 있다. 즉, 본 발명은 Aβ를 암호화하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터 및 이의 용도, 특히 하기 기술된 발명을 제공한다:
[1] 아밀로이드 β-암호화 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
[2] Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 [1]의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
[3] [2]의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터(여기서, Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드는 IL-10 또는 이의 부분 펩타이드이다).
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 벡터(여기서, (-) 쇄 RNA 벡터는 파라믹소바이러스 벡터이다).
[5] [4]의 벡터(여기서, 파라믹소바이러스 벡터는 센다이 바이러스 벡터이다).
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 벡터(여기서, 아밀로이드 β는 Aβ43 또는 이의 부분 펩타이드이다).
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 벡터(여기서, 아밀로이드 β는 사람으로부터 기원한다).
[8] [3] 내지 [7] 중 어느 하나의 벡터(여기서, IL-10은 마우스 또는 사람으로부터 기원한다).
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나의 벡터(여기서, 아밀로이드 β는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 또는 이의 일부분(portion)이다).
[10] [3] 내지 [9] 중 어느 하나의 벡터(여기서, IL-10은 서열번호 2 또는 서열 3의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다).
[11] 서열번호 5의 핵산을 포함하는 [1] 내지 [10] 중 어느 하나의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
[13] (i) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 발현가능한 방식으로 암호화하는 핵산, (ii) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드, 또는 (iii) Th2 보조제를 추가로 포함하는 [12]의 조성물.
[14] Th2 사이토킨, 이의 부분 펩타이드, 또는 Th2 보조제를 포함하는 [13]의 조성물.
[15] Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 발현가능한 방식으로 포함하는 [13]의 조성물.
[16] [15]의 조성물(여기서, Th2 사이토킨은 아밀로이드 β-암호화 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터에 의해 암호화되어 있다).
[17] [15]의 조성물(여기서, Th2 사이토킨은 아밀로이드 β를 암호화하는 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터이외의 벡터에 의해 암호화되어 있다).
[18] [12] 내지 [17] 중 어느 하나의 조성물(여기서, 당해 조성물은 약제학적 조성물이다).
[19] 알츠하이머병의 치료 또는 예방시 사용하기 위한 약제학적 조성물(여기서, 당해 조성물은 [1] 내지 [18] 중 어느 하나의 벡터를 포함한다).
[20] (i) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 발현가능한 방식으로 암호화하는 핵산, (ii) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드, 또는 (iii) Th2 보조제를 추가로 포함하는 [19]의 조성물.
[21] 비강내 투여로 사용하기 위한 [18] 또는 [20]의 약제학적 조성물.
[22] 아밀로이드 β의 침착을 감소시키는 방법(여기서, 당해 방법은 [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 벡터 또는 당해 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다).
[23] 알츠하이머병의 치료 또는 예방 방법(여기서, 당해 방법은 [1] 내지 [11] 중 어느 하나의 벡터 또는 당해 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다).
[24] [22] 또는 [23]의 방법(여기서, 투여는 비강내 투여이다).
[25] [22] 또는 [23]의 방법(여기서, 투여는 근육내 주사이다).
[26] Th2 사이토킨, 이의 부분 펩타이드, Th2 보조제, 또는 Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 암호화하는 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, [22] 내지 [25] 중 어느 하나의 방법.
[27] [26]의 방법(여기서, Th2 사이토킨, 이의 부분 펩타이드, 또는 Th2 보조제가 투여된다).
[28] [26]의 조성물(여기서, Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 암호화하는 벡터가 투여된다).
본 발명은 낮은 용량 및 투여 횟수에서 아밀로이드 β침착 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있는 신규의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 제공한다. 본원의 실시예에 기술된 벡터는 중추 신경계에서 염증을 유발하지 않는 것으로 확인되었으므로, 본 발명의 벡터의 투여는 통상의 백신을 투여하는 경우 유발되는 것과 같은 수막뇌염을 유발할 것으로 전혀 고려되지 않는다. 본 발명의 벡터는 알츠하이머병을 치료하기 위한 매우 효과적인 수단으로 사용될 수 있다.
본 발명은 아밀로이드 β를 암호화하는 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 벡터에 관한 것이다.
본원에서, 유전자는 전사 단위를 암호화하는 유전 물질 또는 핵산을 말한다. 당해 유전자는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본원에서, 단백질을 암호화하는 핵산은 단백질 유전자로서 언급된다. 유전자는 단백질을 암호화하지 않을 수 있으며, 예를 들면, 리보자임 또는 안티센스 RNA와 같은 기능성 RNA를 암호화할 수 있다. 당해 유전자는 천연적으로 발생하거나 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 본원에서, "DNA"는 일본쇄 및 이본쇄 DNA를 포함한다. 상 "단백질을 암호화하는"은, 폴리뉴클레오타이드가 단백질의 아미노산 서열을 센스 또는 안티센스 방향으로 암호화하는 ORF를 포함함으로써 적절한 상태에서 단백질을 발현할 수 있음을 의미한다.
(-) 쇄 RNA 바이러스는 게놈과 같은 (-) 쇄 RNA(바이러스 단백질을 암호화하는 센스 쇄에 대해 상보성 안티센스 쇄)를 포함하는 바이러스를 말한다. (-) 쇄 RNA 바이러스는 소위 네가티브 쇄 RNA 바이러스로 불린다. 특히, 본 발명에서 바람직하게 사용된 (-) 쇄 RNA 바이러스는 일본쇄 (-) 쇄 RNA 바이러스(또한, 비-분획화된 (-) 쇄 RNA 바이러스로 언급)이다. "일본쇄 (-) 쇄 RNA 바이러스"는 게놈으로서 일본쇄 (-) 쇄 RNA를 지닌 바이러스를 말한다. 이러한 바이러스는 예를 들면, 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과[파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 모르빌리바이러스(Morbillivirus), 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 뉴모바이러스(Pneumovirus)와 같은 속 포함], 라브도비리다에(Rhabdoviridae) 과[베시쿨로바이러스(Vesiculovirus), 리싸바이럿(Lyssavirus) 및 에페메로바이러스(Ephemerovirus)와 같은 속 포함], 필로비리다에(Filoviridae), 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae)[인플루엔자 바이러스 A형, B형 및 C형, 및 토고토-유사 바이러스(Thogoto-like virus) 등을 포함], 부니야비리다에[부니야바이러스(Bunyavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus) 및 플레보바이러스(Phlebovirus)와 같은 속 포함] 및 아레나비리다에(Arenaviridae) 속에 속하는 바이러스를 포함한다.
본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있는 (-) 쇄 RNA 바이러스의 구체적인 예는 파라믹소비리다에 과에 속하는, 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 볼거리 바이러스(Mumps virus), 풍진 바이러스(Measles virus), RS 바이러스[호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus)], 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(Monkey parainfluenza virus: SV5), 사람 파라인플루엔자 제1형, 제2형 및 제3형 바이러스; 오르토믹소비리다에 과에 속하는 인플루엔자 바이러스; 라브도비리다에 과에 속하는 소수포구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus) 및 라비에스 바이러스(Rabies virus) 등을 포함한다.
본 발명에서, 파라믹소바이러스가 바람직하게 사용된다. 파라믹소바이러스는 파라믹소비리다에에 속하는 바이러스 또는 이의 유도체를 말한다. 파라믹소바이러스는 자체 게놈으로서 분절화되지 않은 (-) 쇄 RNA를 지닌 바이러스 그룹이며 파라믹소비리나에[파라믹소바이러스, 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 모르빌리바이러스(Morbillivirus)로 또한 언급되는 레스피로바이러스(Respirovirus) 포함] 및 뉴모비리나에(Pneumovirinae)[뉴모바이러스(Pneumovirus) 및 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 포함]을 포함한다. 본 발명에 적용가능한 파라믹소바이러스의 특정 예는 센다이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RS 바이러스), 우역 바이러스, 디스템퍼 바이러스(Distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(Simian parainfluenza virus)(SV5), 및 사람 파라인플루엔자 바이러스 제1형, 제2형 및 제3형이다. 보다 상세하게, 이러한 예는 센다이 바이러스(SeV), 사람 파라인플루엔자 바이러스-1(HPIV-1), 사람 파라인플루엔자 바이러스-3(HPIV-3), 포신 디스템퍼 바이러스(Phocine distemper virus: PDV), 카닌 디스템퍼 바이러스(CDV), 돌핀 몰빌리바이러스(DMV), 페스트-데스-페티츠-루미난츠 바이러스(PDPR), 풍진 바이러스(MV), 린더페스트 바이러스(RPV), 헨드라 바이러스(Hendra), 니파 바이러스(Nipah), 사람 파라인플루엔자 바이러스-2(HPIV-2), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 5(SV5), 사람 파라인플루엔자 바이러스-4a(HPIV-4a), 사람 파라인플루엔자 바이러스-4b(HPIV-4b), 볼거리 바이러스(Mumps), 및 뉴캐슬병 바이러스(NDV)를 포함한다. 보다 바람직한 예는 센다이 바이러스(SeV), 사람 파라인플루엔자 바이러스-1(HPIV-I), 사람 파라인플루엔자 바이러스-3(HPIV-3), 포신 디스템퍼 바이러스(PDV), 카닌 디스템퍼 바이러스(CDV), 돌핀 몰빌리바이러스(DMV), 페스트-데스-페티츠-루미난츠 바이러스(PDPR), 풍진 바이러스(MV), 린더페스트 바이러스(RPV), 헨드라 바이러스(Hendra), 및 니파 바이러스(Nipah)이다. 본 발명의 바이러스는 바람직하게는 파라믹소비리나에[레스피로바이러스(Respirovirus), 루불라바이러스(Rubulavirus) 및 모르빌리바이러스(Morbillivirus)]에 속하는 것들 또는 이의 유도체이며, 보다 바람직하게는 레스피로바이러스 속(또한 파라믹소바이러스로서 언급)에 속하는 것들 또는 이의 유도체이다. 본 발명에 적용가능한 레스피로바이러스 종의 바이러스의 예는 사람 파라인플루엔자 바이러스-1(HPlV-1), 사람 파라인플루엔자 바이러스-3 (HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스-3 (BPIV-3), 센다이 바이러스(또한 쥐 파라인플루엔자 바이러스-1으로도 언급), 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스-10 (SPIV-10)이다. 센다이 바이러스가 본 발명에 사용되는 것이 가장 바람직하다. 이들 바이러스는 천연 균주, 야행형 균주, 돌연변이체 균주, 시험실-계대배양된 균주, 인공적으로 작제된 균주 등으로부터 기원할 수 있다.
본 발명에서, "벡터"는 핵산을 세포내로 도입시키기 위한 담체이다. (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 핵산을 세포내로 도입시키기 위해 (-) 쇄 RNA 바이러스로부터 기원한 담체이다. SeV와 같은 (-) 쇄 RNA 바이러스는 탁월한 유전자 전달 벡터이다. (-) 쇄 RNA 바이러스는 DNA 상을 지니지 않으며 숙주 세포의 세포질에서만 전사 및 복제를 수행하며, 염색체 통합은 일어나지 않는다. 따라서, 이들은 암화(canceration) 및 면역화와 같은 염색체 이상에 의해 유발된 안전성 문제를 야기하지 않는다. (-) 쇄 RNA 바이러스의 이러한 특징은 (-) 쇄 RNA 바이러스를 벡터로서 사용하는 경우 안전성에 현저히 기여한다. 외부 유전자 발현에 사용되는 경우, SeV는 다수의 연속적인 계대이후에서조차 어떠한 뉴클레오타이드 돌연변이를 나타내지 않았으며, 이는 이의 게놈의 높은 안전성 및 삽입된 외부 유전자의 장기간의 안정한 발현을 나타낸다(참조: Yu, D. et al, Genes Cells 2: 457-466, 1997). SeV내 캡시드 구조 단백질의 결여는 삽입될 유전자의 크기 및 이의 패키징에 있어서 융통성과 같은 추가의 질적 장점을 제공한다. 전달성 SeV 벡터는 5.5kb 이상의 크기의 외부 유전자를 도입시킬 수 있으며, 전사 단위를 가함에 의해 동시에 2개 이상의 유전자를 발현시킬 수 있다.
센다이 바이러스는 설치류에 대해 병원성이어서 폐렴을 유발하는 것으로 알려져 있으나; 사람에서는 병원성인 것으로 보고되지 않았다. 이는, 야생형 센다이 바이러스를 비-사람 영장류 및 사람에게 비강 투여하는 것이 심각한 부작용을 유발시키지 않았다는 앞서의 보고에 의해 뒷받침되었다(참조: Hurwitz, J. L. et al., Vaccine 15: 533-540, 1997; Slobod, K. S. et al, Vaccine 22: 3182-3186, 2004). 2개의 관점, 즉 "고 감염성" 및 "고 발현 수준"은 장점의 예로서 제공될 수 있다. SeV 벡터는 세포막의 당지질 및 당단백질내 시알산에 결합함으로써 세포를 감염시킨다. 이러한 시알산은 대부분의 모든 포유동물 세포 및 조류 세포내에서 발현되어 광범위한 감염 스펙트럼, 예를 들면, 높은 감염성을 유발한다. 전달성 SeV 레플리콘-계 벡터가 바이러스를 방출하는 경우, 이들은 이웃하는 세포를 재-감염시킨다. 다수의 RNP는 감염된 세포의 세포질내에서 복제하며 세포 분열에 의해 딸 세포내로 분산됨으로써 연속적인 발현이 예측될 수 있다. 또한, SeV 벡터는 매우 광범위한 범위의 조직에 적용될 수 있다. 또한, 이들의 특징적인 발현 기계(여기서, 전사 및 복제는 단지 세포질에서만 일어난다)는 삽입된 유전자를 매우 고 수준으로 발현시키는 것으로 밝혀졌다(참조: Moriya, C. et al, FEBS Lett. 425(1): 105-111, 1998; WO 00/70070). 또한, 엔벨로프 유전자를 결실시킴에 의해 비-전달성으로 된 SeV 벡터는 성공적으로 회수되었다(참조: WO 00/70070; Li, HO. et al, J. Virol. 74(14): 6564-6569, 2000). 따라서, SeV 벡터는 자체의 "고 감염성" 및 "고 발현 수준"을 유지하면서, 이들의 "안전성"을 추가로 증진시키기 위해 개선되었다.
본 발명의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈성 RNA를 포함한다. 게놈성 RNA는 (-) 쇄 RNA 바이러스의 특정의 바이러스 단백질을 포함하는 RNP를 형성하기 위한 작용을 지니며, 이는 게놈내에서 유전자의 발현을 유발시킨다. 따라서, 핵산은 복제되어 딸 RNP를 형성한다. (-) 쇄 RNA 바이러스의 RNA는 안티센스 서열로서의 유전자를 암호화한다. 일반적으로, (-) 쇄 RNA 바이러스 게놈에서, 바이러스 유전자는 3'-리더 영역 및 5'-트레일러 영역사이에 안티센스 서열로서 정렬되어 있다. 각각의 유전자의 ORF 사이는 전사 종결 서열(E 서열) - 인터베닝 서열(intervening sequence: I 서열) - 전사 출발 서열(S 서열)로 되어 있으므로, 각각의 유전자의 ORF를 암호화하는 RNA는 개개의 시스트론으로서 전사된다. 본 발명의 벡터내 게놈성 RNA는 RNA에 의해 암호화된 유전자 그룹의 발현 및 RNA 자체의 자가 복제에 필수적인 바이러스 단백질인 N[뉴클레오켑시드, 또한 핵단백질(NP)로서 언급됨]-, P(포스포)- 및 L(거대)-단백질을 암호화하는 안티센스 RNA 서열을 포함한다. RNA는 또한 비리온 형성에 필수적인 M(매트릭스) 단백질을 암호화할 수 있다. 또한, RNA는 비리온 감염에 필수적인 엔벨로프 단백질을 암호화할 수 있다. (-) 쇄 RNA 바이러스의 엔벨로프 단백질은 세포 막 융합을 유발하는 F(융합) 단백질, 및 바이러스를 세포에 부착시키는데 필수적인 HN(헤마글루티닌-뉴라미니다제) 또는 H(헤마글루티닌) 단백질을 포함한다. 그러나, HN 단백질은 특정 유형의 세포에 대한 감염시 요구되지 않으며(참조: Markwell, M.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(4): 978-982, 1985), 감염은 F 단백질 단독으로 달성된다. RNA는 F 및/또는 HN 단백질외에 다른 엔벨로프 단백질을 암호화할 수 있다.
본 발명의 (-) 쇄 RNA 단백질은 예를 들면 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈성 RNA와 바이러스 단백질, 즉, 리보뉴클레오단백질(RNP)의 복합체일 수 있다. RNP는 예를 들면, 바람직한 감염 시약과 함께 세포내로 도입시킬 수 있다. 특히, 이러한 RNP는 (-)쇄 RNA 바이러스, N 단백질, P 단백질 및 L 단백질의 게놈성 RNA를 포함하는 복합체이다. RNP의 세포내 도입시, 바이러스 단백질을 암호화하는 시스트론이 바이러스 단백질의 작용에 의해 게놈성 RNA로부터 전사되며, 동시에, 게놈 자체는 복제하여 딸 RNP를 형성한다. 게놈성 RNA의 복제는 RT-PCR, 노던 블롯 하이브리드화 등으로 확인함으로써 RNA 카피수에 있어서의 증가를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 바람직하게는 (-) 쇄 RNA 바이러스 비리온이다. "비리온"은 핵산을 포함하는 마이크로-입자를 말하며 바이러스 단백질의 작용에 의해 세포로부터 방출된다. (-) 쇄 RNA 바이러스의 비리온은, 게놈성 RNA 및 바이러스 단백질을 포함하는 상술한 RNP가 세포막-기원한 지질 막(엔벨로프로 언급됨)속에 봉입되어 있는 구조를 갖는다. 비리온은 감염성을 지닐 수 있다. 감염성은 세포 부착을 기준으로 이들이 부착하는 세포내로 운반된 핵산을 도입시키는 비리온의 능력 및 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터의 막-융합 능력을 말한다. 본 발명의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 전달성일 수 있거나 또는 비-전달성 벡터일 수 있다. "전달성"은, 바이러스 벡터가 숙주 세포를 감염시키는 경우, 바이러스가 세포내에서 자체로 복제하여 감염성 비리온을 생산할 수 있음을 의미한다.
예를 들어, 파라믹소비리나에에 속하는 바이러스에서 각각의 유전자는 일반적으로 다음과 같이 기술된다. 일반적으로, N 유전자는 또한 "NP"로 기술된다.
레스피로바이러스 NP P/C/V M F HN - L
루불라바이러스 NP P/V M F HN (SH) L
모르빌리바이러스 NP P/C/V M F HN - L
예를 들면, 각각의 센다이 바이러스 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대한 데이타베이트 수탁 번호는 다음과 같다: N 유전자의 경우 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, 및 Xl7218; P 유전자의 경우 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, Xl7007, 및 Xl7008; M 유전자의 경우 Dl1446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, 및 X53056; F 유전자의 경우 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, 및 X02131; HN 유전자의 경우 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, 및 X56131; 및 L 유전자의 경우 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, 및 X58886. 다른 바이러스에 의해 암호화된 바이러스 유전자의 예는 다음과 같다: N 유전자의 경우, CDV, AFO14953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; 마푸에라(Mapuera), X85128; 볼거리, D86172; MV, K01711 ; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 및 투파이아(Tupaia), AF079780; P 유전자의 경우, CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-I, M74081; HPIV-3, X04721 ; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; 볼거리, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 및 투파이아, AF079780; C 유전자의 경우, CDV, AFOl4953; DMV, Z47758; HPIV-I, M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 및 투파이아, AF079780; M 유전자의 경우 CDV, M12669; DMV, Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; 볼거리, D86171; MV, ABO12948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248; F 유전자의 경우, CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303; HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; 볼거리, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962; 및 HN(H 또는 G) 유전자의 경우, CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2, D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; 볼거리, X99040; MV, K01711 ; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876. 그러나, 다수의 균주가 각각의 바이러스에 대해 알려져 있고, 위에서 언급한 것들외에 다른 서열을 포함하는 유전자도 균주에 있어서의 차이로 인하여 존재한다.
이들 바이러스 단백질의 ORF는 상술한 E-I-S 서열을 사용하여 게놈 RNA 속에서 안티센스 서열로서 정렬된다. 게놈 RNA의 3'-말단에 가장 근접한 ORF는 단지 3'-리더 영역 및 ORF사이의 S 서열을 필요로 하며 E 및 I 서열을 필요로 하지 않는다. 또한, 게놈 RNA의 5'-말단에 가장 근접한 ORF는 5'-트레일러 영역 및 ORF 사이에 E 서열만을 필요로 하며, I 및 S 서열을 필요로 하지 않는다. 또한, 2개의 ORF는 단일 시스트론으로서, 예를 들면 IRES 서열을 사용하여 전사시킬 수 있다. 이러한 경우, E-I-S 서열은 이들 2개의 ORF사이에 요구되지 않는다. 예를 들어, 야생형 파라믹소바이러스에서, 통상의 RNA 게놈은 3'-리더 영역, N, P, M, F, HN 및 L 단백질을 암호화하는 6개의 ORF, 및 5'-트레일러 영역을 안티센스 순서로 포함한다. 야생형 바이러스에서와 같이, 본 발명의 게놈 RNA는 바람직하게는 선행하는 3'-리더 영역 및 연속된 5'-트레인러 영역과 함께 N, P, M, F, HN 및 L 단백질을 이러한 정렬 순서로 암호화하는 ORF를 가지나; 유전자 정렬은 이에 한정되지 않는다. 특정 유형의 (-) 쇄 RNA 바이러스는 모두 6개의 바이러스 유전자를 포함하지 않지만, 심지어 이러한 경우에서 조차, 위에서 기술한 야생형에서와 같이 이들의 바이러스 유전자를 정렬하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, N, P 및 L 유전자를 운반하는 벡터는 세포내에서 RNA 게놈으로부터 유전자를 자동적으로 발현하여 게놈 RNA의 복제를 초래할 수 있다. 또한, 엔벨로프-구성 단백질을 암호화하는 F 및 HN(또는 H) 유전자 및 M 유전자와 같은 유전자들의 작용으로 인해, 감염성 비리온이 형성되어 세포의 외부로 방출된다. 따라서, 이러한 벡터는 전달가능한 바이러스 벡터이다. Aβ 또는 IL-10을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 하기 기술한 바와 같이 이러한 게놈내에서 비-단백질 암호화 영역내로 삽입될 수 있다.
또한, 본 발명의 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터는 야생형 (-)쇄 RNA 바이러스의 특정 유전자(들)을 상실할 수 있다. 바이러스 게놈 RNA가 RNP 재작제에 필수적인 바이러스 단백질(N, L 및 P)을 암호화하는 한, 이는 심지어 엔벨로프-구성 단백질을 암호화하고 있는 경우에도 세포내에서 복제하여 유전자를 발현할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 유형에 따라, F, H, HN, G, M 및 M1과 같은 엔벨로프-구성 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자가 결실된 벡터가 예시될 수 있다(참조: WO 00/70055 및 WO00/70070; Li, H. -O. et al., J. Virol. 74(14): 6564-6569, 2000). 예를 들어, M, F 또는 HN 유전자 또는 어떠한 이의 조합을 포함하지 않는 벡터도 본 발명의 바이러스 벡터로서 적합하게 사용될 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 예를 들면, 외부로부터 결여된 유전자(들)의 생성물(들)을 공급함에 의해 재작제될 수 있다. 이렇게 제조된 바이러스 벡터는 숙주 세포에 부착하여 세포 융합 및 야생형 바이러스를 유도할 수 있으나, 이들은, 세포내로 도입된 벡터 게놈이 특정의 원래의 바이러스 유전자를 상실하고 있기 때문에 원래의 바이러스와 동일한 감염성을 갖는 딸 비리온을 형성할 수 없다. 따라서, 이러한 벡터는 단지 1회 유전자를 도입시키기 위한 안전하고 유용한 바이러스 벡터이다. 게놈이 결여할 수 있는 유전자의 예는 F 유전자 및/또는 HN 유전자이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 숙주 세포를 F 유전자가 결여된 재조합 (-)쇄 RNA 바이러스 게놈을 발현하는 플라스미드 벡터, 및 F 단백질 발현 벡터 및 NP, P 및 L 단백질용 발현 벡터와 함께 숙주 세포를 형질감염시켜 재작제할 수 있다(참조: WO 00/70055 및 W00/70070; Li, H. -O. et al., J. Virol. 74(14): 6564-6569, 2000). 바이러스는 또한 예를 들면, 이들의 염색체내로 혼입된 F 유전자를 갖는 숙주 세포를 사용하여 제조할 수 있다. 외부로부터 이들 단백질이 공급되는 경우, 이들의 아미노산 서열은 원래의 바이러스 서열과 동일할 필요가 없으며, 다른 바이러스로부터의 돌연변이체 또는 동종 유전자도, 핵산-도입 활성이 천연형의 것과 동일하거나 또는 크다면, 치환체로서 사용될 수 있다.
또한, 벡터 게놈이 기원한 바이러스의 것 외의 다른 엔벨로프 단백질을 포함하는 벡터도 본 발명의 바이러스 벡터로서 제조될 수 있다. 예를 들면, 바이러스를 재작제하는 경우, 목적한 엔벨로프 단백질을 포함하는 바이러스 벡터는 벡터의 원래의 바이러스의 엔벨로프 단백질이외의 엔벨로프 단백질을 패키징 세포상에서 발현시킴으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 단백질은 특히 제한되어 있지 않으며, 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질, 예를 들면, 소수포구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus: VSV-G)(참조: J. Virology 39: 519-528, 1981)의 G 단백질을 포함한다. 본 발명의 바이러스 벡터는, 게놈이 기원한 바이러스 이외의 바이러스로부터 기원한 VSV-G 단백질과 같은 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도-형 바이러스 벡터를 포함한다. 엔벨로프 단백질(들)이 바이러스 RNA 게놈내에 암호화되어 있지 않은 이러한 바이러스 벡터를 설계함으로써, 단백질(들)은, 비리온이 세포를 감염시킨 후에도 발현되지 않을 것이다.
또한, 본 발명의 바이러스 벡터는 예를 들면, 엔벨로프 표면상에, 부착 인자, 리간드, 수용체, 항체 또는 이의 단편과 같은 특수 세포에 부착할 수 있는 단백질을 지닌 벡터; 또는 세포외 도메인에서 이러한 단백질과 세포내 도메인에서 바이러스 엔벨로프로부터 기원한 폴리펩타이드를 지닌 키메라 단백질을 포함하는 벡터일 수 있다. 즉, 특수 조직을 표적화하는 벡터가 또한 제조될 수 있다. 이러한 단백질은 바이러스 게놈내에서 암호화될 수 있거나, 또는 바이러스 벡터 재작제시기에 바이러스 게놈이외의 유전자(예를 들면, 숙주 세포 염색체내에 존재하는 다른 발현 벡터 또는 유전자)를 발현시킴에 의해 공급될 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터내에서, 벡터내 포함된 특정의 바이러스 유전자는 바이러스 단백질에 의해 유발된 면역원성을 감소시키거나, 또는 예를 들면, RNA 전사 또는 복제 효능을 증진시키기 위하여 야생형 유전자로부터 변형될 수 있다. 상세하게는, 예를 들면, (-)쇄 RNA 바이러스 벡터에서, 하나 이상의 복제 인자, N, P 및 L 유전자의 변형은 전사 또는 복제 효능을 증진시키는 것으로 고려된다. 또한, 엔벨로프 단백질인 HN 단백질은 헤마글루티닌 활성 및 뉴라미니다제 활성 둘다를 가지고 있다. 따라서, 경우에 따라, 전자의 활성이 약화되는 경우 혈액속에서 바이러스 안정성을 개선시키고 후자의 활성이 변형되는 경우 감염성을 조절하는 것이 가능하다. 또한, F 단백질을 변형시킴에 의해 막 융합능을 조절하는 것이 가능하다. 예를 들어, 둘다 강력한 세포 표면 항원 분자인, F 단백질 및 HN 단백질의 항원-표시 에피토프의 분석은 이들 단백질의 항원성이 감소된 바이러스 벡터의 제조를 가능하도록 한다. 또한, 감온성 돌연변이를 바이러스 유전자내로 도입시켜 2차적으로 방출된 입자 또는 바이러스 유사 입자(VLP)의 방출을 제어할 수 있다(참조: WO 2003/025570). 예를 들어, G69E, T116A 및 A183S와 같은 돌연변이체를 M 유전자에 도입시키고; A262T, G264 및 K461G를 HN 유전자내로 도입시키며; L511F를 P 유전자로 도입시키고; 및 N1197S 및 K1795E를 L 유전자로 도입시킬 수 있다. 도입될 수 있는 감온성 돌연변이체는 상술한 돌연변이체에 한정되지는 않는다(참조: WO 2003/025570).
또한, 본 발명의 벡터는 보조 유전자가 결여될 수 있다. 예를 들면, SeV 보조 유전자중 하나인 V 유전자를 녹아웃(knockout)시킴에 의해, 마우스와 같은 숙주에 대한 SeV의 병원성은 유전자 발현 및 배양된 세포내에서의 복제를 방해하지 않으면서도 현저히 감소될 수 있다(참조: Kato, A. et al, J. Virol. 71: 7266-7272, 1997; Kato, A. et al., EMBO J. 16: 578-587, 1997; Curran, J. et al, WO 01/04272, EP 1067179). 이러한 약화된 벡터는 생체내 또는 생체외 전달용의 무독성 바이러스 벡터로서 특히 유용하다.
본 발명의 벡터는 상술한 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터의 게놈내에 외부 유전자로서 Aβ-암호화 핵산을 포함한다. Aβ를 암호화하는 아미노산의 수에 있어서 제한은 없다. 예를 들어, Aβ1-40, Aβ1-42, 및 Aβ1-43이 모두 허용가능하다. 천연적으로 존재하는 완전한 길이의 Aβ의 항원성을 갖는 특정의 바람직한 단편 또는 단편을 포함하는 특정의 폴리펩타이드가 또한 Aβ로서 사용될 수 있다. Aβ에 대한 항원성을 나타내기 위해, 이러한 폴리펩타이드는 천연적으로 존재하는 Aβ, 예를 들면, Aβ43(참조: Harlow, Antibodies: A laboratory Manual, 1998; Chapter 5 page 76)의 아미노산 서열로부터 기원한, 6개 이상의 연속된 아미노산, 바람직하게는 7개 이상의 연속된 아미노산, 또는 8개 이상의 연속된 아미노산을 포함하여야 한다. 예를 들어, Aβ42에 대한 B 세포 에피토프의 대부분(서열번호 27의 1 내지 42번)은 N-말단 영역의 1번 내지 15번 아미노산내에 농축되어 있다(참조: Cribbs, D. H. et al., Int. Immunol. 15(4): 505-14, 2003). 즉, Aβ42의 1번 내지 15번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드는 벡터로부터 발현될 Aβ 펩타이드로서 적합하게 사용될 수 있다. 달리는, Aβ42의 1번 내지 21번 아미노산 또는 4번 내지 10번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다(참조: JP-A No. 2005-21149). 또한, 아밀로이드 원섬유 형성을 억제하고 뉴우런을 보호하는 이들의 능력에 대해 알려져 있는 항-Aβ 모노클로날 항체 10D5 및 6C6은 Aβ42의 3번 내지 6번 아미노산에 상응하는 4개의 아미노산-에피토프(EFRH; 서열번호 27의 3 내지 6번)를 인지하는 것으로 보고되어 있다(참조: Frenkel, D. et al, J. Neuroimmunol. 88: 85-90, 1998; Frenkel, D. et al, J. Neuroimmunol. 95: 136-142, 1999). 동일한 에피토프를 인지하는 모노클로날 항체 508F는 또한 Aβ신경독성을 제어한다(참조: Frenkel, D. et al, J. Neuroimmunol. 106: 23-31 , 2000). 따라서, 이러한 서열을 포함하는 Aβ 서열내 6 내지 8개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드가 적합하게 사용될 수 있다. 세포 면역성에 상응하는 에피토프는 Aβ의 C-말단 영역내에 농축되어 있다. 따라서, Aβ22-43(서열번호 27의 22번 내지 43번 아미노산)으로서 C-말단 근처의 서열이 아닌 Aβ1-21과 같은 N-말단 단편을 포함하는 단편을 발현시킴에 의해 체액 면역성을 세포 면역성보다도 상대적으로 우세하게 할 수 있다. 천연적으로 존재하는 Aβ 펩타이드(서열번호 27의 1번 내지 39번, 1번 내지 40번, 1번 내지 41번, 1번 내지 42번 및 1번 내지 43번에 각각 상응하는 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42, 및 Aβ43)의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터도 본 발명의 벡터로서 적합하게 사용할 수 있다. 짧은 Aβ 펩타이드 단편은 적절한 담체 단백질과 융합된 폴리펩타이드를 제조하는데 시용되어 이들의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 암부민(BSA), 티로글로불린(TG) 등을 포함한다. 짧은 펩타이드는 약 1 내지 5개의 아미노산의 스페이서를 통해 담체 단백질과 융합될 수 있다. 항원 폴리펩타이드(분비형인 경우 성숙한 폴리펩타이드)의 길이(담체 단백질 부위를 제외한 아미노산 길이)는 바람직하게는 10 내지 200개 아미노산, 보다 바람직하게는 15 내지 100개 아미노산, 여전히 바람직하게는 20 내지 80개 아미노산의 범위이다.
또한, 벡터내에 암호화된 Aβ 폴리펩타이드는 바람직하게는 분비 시그날을 포함함으로써 세포로부터 이의 분비를 보증한다. 분비 시그날 서열로서, 인터류킨(IL)-2 또는 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA)와 같은 목적한 분비 단백질의 시그날 서열을 사용할 수 있으며, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 N-말단 시그날 서열이 바람직하게 사용된다. 상세하게는, 이러한 분비 시그날 서열은 예를 들면, 수탁 번호 제NP_958817호(뉴클레오타이드 서열의 경우, 예를 들면, 수탁번호 제NM_201414호를 참조)의 분비 시그날 서열을 포함한다. 달리는, 본 발명의 적합한 벡터는, 분비 시그날이 부착된 Aβ 펩타이드를 암호화한다.
또한, 본 발명의 벡터는 외부 유전자로서 Th2 사이토킨 및/또는 소염 사이토킨을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. Th2 사이토킨은 제1형 헬퍼 T 세포(Th1 세포)보다는 제2형 헬퍼 T 세포(Th2 세포)에 의해 주로 생산된 사이토킨을 말한다. 상세하게는, 이러한 Th2 사이토킨은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, 및 IL-13을 포함한다. 본 발명에서, 벡터내에 암호화된 사이토킨은 바람직하게는 IL-4, IL-10, 및 IL-13로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 가장 바람직하게는, IL-10이 암호화된다. 각각의 사이토킨 유전자 및 이의 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 서열은 이미 공지되어 있다(IL-4: NM_000589, NP_000580, AAH66277, AAH67515, NP_758858, NP_067258, NP_958427; IL-5: NM_000879, NP_000870, CAA31210, NP_034688, NP_068606; IL-6: NM_000600, NP_000591, XP_518992, AAB30962, NP_112445; IL-9: NM_000590, NP_000581, AAH66284, AAH66287, NP_032399, XP_341488; IL-10: NM_000572, NP_000563, CAG46825, NP_034678, NP_036986; IL-13: NM_002188, NP_002179, AAB01681, NP_032381, NP_446280).
벡터내에 암호화된 IL-10과 같은 Th2 사이토킨은 완전하거나(예를 들면, 야생형) 또는 활성을 보유하는 한 부분 펩타이드(예를 들면, 활성 단편)일 수 있다. 예를 들어, N-말단 시그날 서열은 다른 시그날 서열에 의해 적절히 대체될 수 있다. 달리는, 사이토킨은 다른 펩타이드와 융합된 단백질로서 발현될 수 있다.
벡터내에 암호화된 IL-10과 같은 사이토킨 및 Aβ의 기원에는 제한이 없으며, 이는 마우스, 랫트, 기니아 피그, 토끼, 돼지, 소, 말, 오리, 염소, 개, 침팬지, 원숭이 및 사람을 포함하는 특정의 포유동물일 수 있다. Aβ 및 사이토킨의 기원은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 투여 대상과 동일한 종으로부터 기원한 Aβ 및 사이토킨을 사용하는 것이 적합하다. 이러한 사이토킨을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 데이타베이스로부터 이용가능하다. 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 AY410237 및 NM_010548는 마우스 IL-1O에 대해 이용가능하며; 진뱅크 수탁번호 AY029171 및 NM_000572는 사람 IL-10에 대해 이용가능하다. 본 발명의 벡터로서 적합하게 사용될 수 있는 "Aβ-암호화 핵산"의 예는 사람 AβcDNA(서열번호 1)이다. 적합하게 사용될 수 있는 "IL-10-암호화 핵산"의 예는 마우스 IL-1O cDNA 서열(서열번호 2) 및 사람 IL-1O cDNA 서열(서열번호 3)이다. 서열번호 1 내지 3의 상기 뉴클레오타이드 서열과는 상이한 서열을 가진 핵산이 또한 서열번호 1 내지 3의 서열과 같이 본 발명의 벡터에 적합하게 사용될 수 있으며, 단, 이들은 코돈 축퇴(degeneracy)의 결과로서 상기-언급한 뉴클레오타이드 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 상기 외부 유전자의 삽입 부위는 예를 들면, 게놈내에서 비-단백질 암호화된 영역내 바람직한 부위에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 이들은 3'-리더 영역 및 3'-말단에 근접한 바이러스 단백질 ORF사이; 각각의 바이러스 단백질 ORF 사이; 및/또는 5'-말단 및 5'-트레일러 영역과 근접한 바이러스 단백질 ORF 사이에 삽입될 수 있다. 또한, F 또는 HN 유전자 등이 결여된 게놈에서, 외부 유전자(들)은 이들이 결여된 영역내로 삽입될 수 있다. 외부 유전자가 파라믹소바이러스내로 도입되는 경우, 게놈내로 삽입될 폴리뉴클레오타이드의 쇄 길이는 바람직하게는 6배이다(참조: J. Virology 67 (8): 4822-4830, 1993). 하나의 세트의 E-I-S 서열은 삽입된 외부 유전자 및 바이러스 ORF사이에 정렬되어야 한다. 2개 이상의 외부 유전자는 E-I-S 서열을 사용하여 무작위적 방식으로 삽입시킬 수 있다. 달리는, 목적한 외부 유전자를 IRES를 사용하여 삽입시킬 수 있다.
벡터에 의해 운반될 외부 유전자의 발현 수준은 유전자의 상부((-)쇄의 3'-측에 대해)에 가해진 전사 개시 서열의 유형에 따라 조절될 수 있다(참조: WO 01/18223). 발현 수준은 또한, 외부 유전자가 게놈내 삽입된 위치에 따라 조절될 수 있다: 삽입 위치가 (-) 쇄의 3'-말단에 근접할 수록, 발현 수준이 높으며; 삽입 위치가 5'-말단에 근접할수록, 발현 수준이 낮다. 따라서, 외부 유전자를 삽입하는 위치는 목적한 유전자 발현 수준을 수득하기 위해서 또는 외부 유전자 주변에서 바이러스 단백질을 암호화하는 유전자와의 가장 바람직한 조합을 달성하기 위해 적절히 조절할 수 있다. 일반적으로, Aβ의 높은 발현 수준을 달성하는 것이 유리한 것으로 고려되는 경우, Aβ를 암호화하는 외부 유전자를 고-효능 전사 개시 서열에 연결시키고 이를 (-) 쇄 게놈의 3'-말단 근처에 삽입하는 것이 바람직하다. 상세하게는, 외부 유전자는 3'-리더 영역 및 3'-말단에 근접한 바이러스 단백질 ORF 사이에 삽입된다. 달리는, 외부 유전자는 3'-말단에 근접한 바이러스 유전자의 ORF 및 다음 바이러스 유전자 사이에 삽입될 수 있다. 야생형 파라믹소바이러스에서, 게놈의 3'-말단에 가장 근접한 바이러스 단백질 유전자는 N 유전자이며, 2번째로 근접한 유전자는 P 유전자이다. 달리는, 도입된 유전자의 높은 수준의 발현이 바람직하지 않은 경우, 예를 들면, 외부 유전자를 (-) 쇄 게놈의 5'-측에 가능한 근접하는 벡터내 위치내에 삽입시키거나, 또는 저-효능 전사 개시 서열을 선택함으로써 바이러스 벡터로부터 유전자 발현의 수준을 제어하여 적절한 효과를 달성할 수 있다.
2개의 폴리펩타이드, 즉, 벡터로부터 Aβ를 포함하는 하나와 Th2를 포함하는 다른 것을 발현시키기 위해서는, 각각의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 벡터 게놈내로 삽입한다. 2개의 핵산은 별개의 부위내로, 또는 단일 부위내로 E-I-S 서열을 통해 무작위적 방식으로 삽입시킬 수 있다. S 서열로서 고-효능 전사 개시 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 3'-UCCCACUUU-5'((-) 쇄 RNA; 서열번호 6), 3'-UCCCAGUUU-5' ((-) 쇄 RNA; 서열번호 7), 또는 3' -UCCCACUUA-5' ((-) 쇄 RNA; 서열번호 8)을 S 서열로서 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터는, Aβ 및 Th2 사이토킨을 암호화하는 유전자가 삽입된 위치이외의 위치에서 다른 외부 유전자를 수반할 수 있다. 이러한 외부 유전자는 제한되지 않는다. 예를 들면, 이들은 바이러스 감염을 모니터링하기 위한 마커 유전자, 또는 사이토킨 및 호르몬과 같은 면역계-조절 유전자일 수 있다. 본 발명의 벡터는 이러한 시그날 형질도입 조절인자, 사이토킨, 호르몬, 수용체, 항체 및 이의 단편을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 수반할 수 있다. 본 발명의 벡터는 살아있는 체내 표적 부위에 직접(생체내) 투여하거나 또는 간접(생체외) 투여함으로써 유전자를 도입시킬 수 있으며, 간접 투여시, 벡터는 환자의 세포 또는 다른 세포에 감염된 후 세포가 표적 부위로 주사된다.
본 발명의 벡터는 알츠하이머병의 치료, 예방, 또는 진행을 억제시키기 위한 매우 유리한 수단으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 일반적으로 대량의 축적된 Aβ를 가진 24- 내지 25개월된 APP Tg 마우스에서 현저한 Aβ-제거 효과를 나타내었다. 이러한 효과는 단지 단일의 비강 투여로 입증되었기 때문에, 본 발명의 벡터는 환자에 대해 거의 침입성이 없는 치료방법이 될 수 있다. 염증이 중추 신경계에서 관측되지 않은 발견은 또한 사용하기에 매우 안정한 벡터를 입증한다.
본 발명의 벡터를 제조하기 위해서는, 본 발명의 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 cDNA를 포유동물 세포내에서 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA(또는 이의 상보성 쇄)를 포함하는 RNP의 재작제에 필수적인 바이러스 단백질(예: N, P 및 L 단백질)의 존재하에 전사시킨다. 바이러스 RNP는 (-) 쇄 게놈(즉, 바이러스 게놈 안티센스 쇄와 동일) 또는 플러스 쇄(바이러스 단백질-암호화 센스 쇄)을 전사를 통해 생성시킴으로써 재작제할 수 있다. 플러스 쇄의 생성이 벡터 재작제 효능을 증가시키는데 바람직하다. RNA 말단은 천연 바이러스 게놈과 같이 가능한 정교하게 3'-리더 서열 및 5'-트레일러 서열의 말단을 반영한다. 전사 산물의 5'-말단을 정확하게 조절하기 위해서는, 예를 들면, T7 RNA 폴리머라제에 의해 인지가능한 서열을 전사 개시 부위로서 사용할 수 있으며 RNA 폴리머라제가 세포내에서 발현될 수 있다. 전사 산물의 3'-말단을 조절하기 위해, 예를 들면, 자가분해형 리보자임은 전사 산물의 3'-말단에서 암호화되어 당해 리보자임에 의한 3'-말단을 정확하게 분해할 수 있다(참조: Hasan, M. K. et al, J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al, EMBO J. 16: 578-587, 1997; and Yu, D. et al, Genes Cells 2: 457-466, 1997).
예를 들어, 문헌(참조: Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al, EMBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al, Genes Cells 2: 457-466, 1997) 등의 기술을 기초로 하여, 외부 유전자를 수반하는 재조합 센다이 바이러스 벡터를 다음과 같이 작제할 수 있다:
첫째로, 흥미있는 외부 유전자의 cDNA 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 샘플을 제조한다. DNA 샘플은 바람직하게는 25ng/㎕ 미만의 농도에서 전기영동에 의해 단일 플라스미드로서 확인될 수 있는 것이다. 다음은 NotI 부위를 사용하여 외부 유전자를 바이러스 게놈 RNA를 암호화하는 DNA내로 삽입시키는 예를 설명한다. NotI 인지 부위가 흥미있는 cDNA 뉴클레오타이드 서열내에 함유되는 경우, 뉴클레오타이드 서열은 부위-지시된 돌연변이유발 등을 사용하여 변경시킴으로써 암호화된 아미노산 서열이 변화되지 않고, NotI 부위가 바람직하게는 먼저 절개되도록 한다. 흥미있는 유전자 단편은 이러한 샘플로부터 PCR에 의해 증폭된 후 회수된다. NotI 부위를 2개의 프라이머의 5' 영역내로 가함에 의해, 증폭된 단편의 말단 둘다는 NotI 부위가 된다. E-I-S 서열, 또는 이의 일부분은 프라이머내에 포함됨으로써 외부 유전자가 바이러스 게놈내로 삽입된 후 하나의 E-I-S 서열이 외부 유전자의 ORF 및 바이러스 유전자의 ORF사이에 각각의 측면에 위치한다.
예를 들면, NotI 분해를 보증하기 위해, 전방 합성 DNA 서열은, 2개 미만의 뉴클레오타이드(바람직하게는 GCG 및 GCC와 같은 NotI 인지 부위-기원한 서열을 포함하지 않는 4개의 뉴클레오타이드, 및 보다 바람직하게는 ACTT)의 무작위 서열이 5'-부위에서 선택되고, NotI 인지 부위 gcggccgc가 이의 3'-측면에 가해진 형태를 갖는다. 이의 3'-측면으로, 9개의 무작위 뉴클레오타이드, 또는 9 + 다수의 6개 뉴클레오타이드가 스페이서 서열로서 추가로 가해진다. 또한 3'-측면에, 개시 코돈 ATG를 포함하는 목적한 cDNA의 ORF의 약 25개 뉴클레오타이드에 상응하는 서열이 가해진다. 25개 뉴클레오타이드는 바람직하게는 목적한 cDNA로부터 선택됨으로써 전방 합성 올리고 DNA의 3'-말단에서 최종 뉴클레오타이드는 G 또는 C이다.
역 합성 DNA 서열의 경우, 2개 미만의 무작위 뉴클레오타이드(바람직하게는 GCG 및 GCC와 같은 NotI 인지 부위-기원한 서열을 포함하지 않는 4개의 뉴클레오타이드, 및 보다 바람직하게는 ACTT)가 5'-측면에서 선택되며, NotI 인지 부위 'gcggccgc'가 이의 3'-측면에 가해지고, 추가로 올리고 DNA 단편이 길이 조절을 위해 3'-측면에 가해진다. 이러한 올리고 DNA의 길이는, 최종 PCR-증폭 생성물인, NotI 단편의 쇄 길이가 가해진 E-I-S 서열을 포함하는 다수의 6개 뉴클레오타이드가 될 것이다(소위 "6개의 규칙": 참조: Kolakofski, D., et al, J. Virol. 72: 891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993). E-I-S 서열이 당해 프라이머의 삽입된 올리고 DNA 단편의 3'-측면에 가해지는 경우, 센다이 바이러스 S 서열, 바람직하게는 5'-TTTCACCCT-3'(서열번호 9), 5'-TTTGACCCT-3' (서열번호 10), 또는 5'-ATTCACCCT-3' (서열번호 11), I 서열의 상보성 쇄 서열, 바람직하게는 5'-AAG-3', E 서열의 상보성 쇄 서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(서열번호 12)가 가해진다. 또한 이러한 3'-측면에, 마지막 뉴클레오타이드로서 G 또는 C를 지닌 상보성 쇄 서열이 가해지며, 여기서, 길이는 목적한 cDNA 서열의 말단 코돈으로부터 역방향으로 계수하여 약 25개 뉴클레오타이드가 되도록 선택되었다. 이렇게 해서, 역 합성 DNA의 3'-말단이 제조된다.
PCR은 Taq 폴리머라제 또는 기타 DNA 폴리머라제를 사용하는 표준 방법으로 수행할 수 있다. 목적한 증폭 단편은 NotI로 분해한 후 pBluescriptTM[스트라타젠(Stratagene) 제조원]과 같은 플라스미드 벡터의 NotI 부위내로 삽입된다. 이렇게 수득된 PCR 생성물의 뉴클레오타이드 서열은 서열분석기로 확인하며 정확한 서열을 포함하는 플라스미드를 선택한다. 삽입된 단편은 이들 플라스미드로부터 NotI을 사용하여 절개하여, 게놈 cDNA를 포함하는 플라스미드의 NotI 부위내로 클로닝한다. 재조합 센다이 바이러스 cDNA도 또한 플라스미드 벡터의 사용없이 NotI 부위내로 단편을 직접 삽입시켜 수득할 수 있다.
예를 들어, 재조합 센다이 바이러스 게놈 cDNA는 문헌[참조: Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al, J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997)에 기술된 방법에 따라 작제할 수 있다. 예를 들어, NotI 제한 부위를 포함하는 18 bp 스페이서 서열(5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3') (서열번호 13)은 리더 서열 및 클로닝된 센다이 바이러스 게놈 cDNA(pSeV(+))내 N 단백질의 ORF사이에 삽입시켜 델타 간염 바이러스의 항원성 쇄로부터 기원한 자가분해 리보자임 부위를 포함하는 플라스미드 pSeV18+b(+)를 수득한다(참조: Hasan, M. K. et al, J. General Virology 78: 2813-2820, 1997). 목적한 외부 유전자를 포함하는 재조합 센다이 바이러스 cDNA는 외부 유전자 단편을 pSeV18+b(+)의 NotI 부위내로 삽입시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 벡터는 이렇게 제조된 재조합 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 세포내에서 상술한 바이러스 단백질(L, P 및 N)의 존재하에 전사시켜 재작제할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 벡터를 제조하기 위해 본 발명의 벡터의 바이러스 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 제조하는데 적용하기 위한 벡터의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA의 용도에 관한 것이다. 재조합 바이러스는 문헌(참조: WO 97/16539; WO 97/16538; WO 00/70055; WO 00/70070; WO 01/18223; WO 03/025570; Durbin, A. P. et al, Virology 235: 323-332, 1997; Whelan, S. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M. J. et al., EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, F. et al., EMBO J. 14: 5773-5784, 1995; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481, 1995; Garcin, D. et al, EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato, A. et al, Genes Cells 1 : 569-579, 1996; Baron, M. D. and Barrett, T., J. Virol. 71 : 1265-1271 , 1997; Bridgen, A. and Elliott, R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404, 1996; Hasan, M. K. et al, J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al, EMBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al, Genes Cells 2: 457-466, 1997; Tokusumi, T. et al, Virus Res. 86: 33-38, 2002; Li, H.-O. et al, J. Virol. 74: 6564-6569, 2000)에 공지된 방법으로 재작제할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 파라인플루엔자 바이러스, 소수포구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 풍진 바이러스, 우역 바이러스 및 센다이 바이러스를 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스를 DNA로부터 재작제할 수 있다. 본 발명의 벡터는 이들 방법에 따라 재작제할 수 있다. F 유전자, HN 유전자 및/또는 M 유전자가 결여되도록 제조된 바이러스 벡터 DNA는 감염성 비리온을 형성하지 않는다. 그러나, 감염성 비리온은 다른 바이러스의 엔벨로브 단백질(들)을 암호화하는 유전자(들) 및/또는 결실 유전자(들)을 도입시킨 후 유전자(들)을 발현시킴으로써 형성시킬 수 있다.
상세하게는, 바이러스는 (a) (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA((-) 쇄 RNA) 또는 이의 상보성 쇄((+) 쇄)를 암호화하는 cDNA를 N, P, 및 L 단백질을 발현하는 세포내에 전사시키는 단계 및 (b) 이들 세포 또는 이의 배양 상층액으로부터 게놈 RNA를 포함하는 RNP 복합체를 수집하는 단계에 따라 제조할 수 있다. 전사를 위해, 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 적절한 프로모터의 하부에 연결시킨다. 이렇게 전사된 게놈 RNA는 N, L, 및 P 단백질의 존재하에 복제시켜 RNP 복합체를 형성시킨다. 이후에, M, HN, 및 F 단백질의 존재하에서, 엔벨로브내에 봉입된 비리온이 형성된다. 예를 들면, 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 T7 프로모터의 하부에 연결시켜 T7 RNA 폴리머라제에 의해 RNA로 전사시킬 수 있다. T7 폴리머라제 인지 서열을 포함하는 것외에 목적한 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 달리는, 시험관내에서 전사된 RNA를 세포내로 형질감염시킬 수 있다. N, L, 및 P 단백질은 플라스미드와 같은 적절한 발현 벡터를 사용하여 세포내에서 발현시킬 수 있다. 프로모터의 예는 CMV 프로모터 및 CAG 프로모터를 포함한다(참조: Niwa, H. et al, Gene. 108: 193-199, 1991; 일본 특허 공개공보 (JP-A H3-168087)).
T7 RNA 폴리머라제와 같이, DNA로부터 게놈 RNA의 초기 전사에 필수적인 효소는 이들을 발현하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 도입시키거나, 또는 예를 들면, 이들 효소의 유전자를 세포 염색체내로 혼입시켜 이들의 발현을 유도시킨 후, 바이러스 재작제시기에 발현을 유도시킴으로써 공급할 수 있다. 또한, 벡터 재작제에 필수적인 게놈 RNA 및 바이러스 단백질은 예를 들면, 이들을 발현하는 플라스미드를 도입시킴에 의해 공급된다. 이들 바이러스 단백질을 공급하는데 있어서, 야생형 (-) 쇄 RNA 바이러스의 헬퍼 바이러스 또는 특정 유형의 이의 돌연변이체를 사용할 수 있지만, 이들 바이러스의 오염이 일어날 수 있으므로 바람직하지는 않다.
게놈 RNA를 발현하는 DNA를 세포내로 도입시키는 방법은 예를 들면, (i) 목적하는 세포에 의해 취할 수 있는 DNA 침전물을 제조하는 방법; (ii) 세포독성이 낮고 흥미있는 세포에 의해 흡수되기에 적합한 DNA를 포함하는 양성적으로 하전된 복합체를 제조하는 방법; 및 (iii) 전기 펄스를 사용하여 DNA 분자가 흥미있는 세포내로 통과할 수 있기에 충분한 크기를 지닌 세포 막상의 공극을 순간적으로 뚫는 방법을 포함한다.
각종의 감염 시약, 예를 들면, DOTMA[로슈(Roche) 제조원], 슈퍼펙트[퀴아겐(QlAGEN) 제조원 #301305], DOTAP, DOPE, DOSPER(로슈 제조원 #1811169)을 방법 (ii)에서 사용할 수 있다. (i)의 예는 칼슘 포스페이트를 사용하는 형질감염 방법이며, 비록 당해 방법에 의해 세포내로 형질감염된 DNA가 포식소체내로 섭취된다고 해도, 충분한 양의 DNA가 또한 핵내로 도입되는 것으로 알려져 있다(참조: Graham, F. L. and Van Der Eb, J., Virology 52: 456, 1973; Wigler, M. and Silverstein, S., Cell 11 : 223, 1977). 첸(Chen) 및 오카야마(Okayama)는 형질전환 기술의 최적화를 시험하고 (1) 공-침전물과 함께 세포를 항온처리하기 위한 조건이 2 내지 4% CO2, 35℃, 및 15 내지 24 시간이고, (2) 환형 DNA가 선형 DNA보다 높은 활성을 가지며, (3) 최적의 침전이, 침전물 혼합물이 20 내지 30㎍/ml의 DNA 농도를 가지는 경우에 수득됨을 보고하였다(참조: Chen, C. and Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 7: 2745, 1987). (ii)의 방법은 일시적인 형질감염에 적합하다. DEAE-덱스트란[시그마(Sigma) 제조원 #D-9885 M. W. 5x 105] 혼합물을 목적한 DNA 농도를 기준으로 하여 제조하는 경우의 형질감염 방법은 이미 알려져 있다. 대부분의 복합체는 엔도솜내에서 분해되므로, 클로로퀴논을 또한 가하여 효능을 증진시킬 수 있다(참조: Calos, M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015, 1983). (iii)의 방법은 전기천공 방법으로 언급되며, (i) 및 (ii)의 방법이 세포 선택적이지 않기 때문에 이들 방법보다 더욱 일반적인 방법이다. 이들 방법의 효능은 펄스 전기 전류, 펄스 유형, 전기장 효능(전극간의 갭, 전압), 완충액 전도성, DNA 농도 및 세포 밀도의 최적 조건하에서 우수한 것으로 고려된다.
상기 3개의 범주중에서, (ii)의 방법이 작동시키기에 간단하며 대량의 세포가 있는 많은 샘플을 시험할 수 있으므로, 형질감염 시약은 벡터 재작제시 DNA를 세포내로 도입시키는데 적합하다. 슈퍼펙트 형질감염 시약(Superfect Transfection Reagent)(퀴아젠 제조원, 제품 번호 301305), DOSPER 리소좀 형질감염 시약(로슈 제조원, 제품 번호 1811169), 및 트랜스IT[미루스(Mirus) 제조원,제품 번호 MIR2300)를 바람직하게 사용할 수 있다. 그러나, 이에 한정되지는 않는다.
상세하게는 cDNA로부터의 바이러스 재작제는 예를 들면, 다음과 같이 수행할 수 있다:
약 6- 내지 24-웰의 플라스틱 플레이트 또는 100-mm 페트리 디쉬 등에서, 원숭이 신장-기원한 LLC-MK2 세포를 10% 태 송아지 혈청(FCS) 및 항체(100단위/ml 페니실린 G 및 100㎍/ml 스트렙토마이신)을 함유하는 최소 필수 배지(MEM) 속에서 100% 합류(confluency) 근처에 이르도록 배양하고, 예를 들면 T7 RNA 폴리머라제를 발현하며 1㎍/ml의 프소랄렌의 존재하에 20분의 UV 조사로 불활성화시킨 재조합 백시니아 바이러스 vTF7-3으로 2PFU/세포에서 형질감염시킨다(참조: Fuerst, T. R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986; Kato, A. et el., Genes Cells 1 : 569-579, 1996). 가해진 프소랄렌의 양 및 UV 조사 시간은 적절히 조절할 수 있다. 감염시킨지 1시간 후, 2 내지 60㎍ 및 보다 바람직하게는 3 내지 20㎍의 재조합 센다이 바이러스의 게놈 RNA를 암호화하는 DNA를 바이러스 RNP 제조에 필수적인 트랜스-작용성 바이러스 단백질(0.5 내지 24 ㎍의 pGEM-N, 0.25 내지 12㎍의 pGEM-P, 및 0.5 내지 24㎍의 pGEM-L)(참조: Kato, A. et al, Genes Cells 1: 569-579, 1996)을 발현하는 플라스미드와 함께 슈퍼펙트(퀴아젠 제조원) 등을 사용하는 리포펙션(lipofection) 방법으로 형질감염시킨다. N, P, 및 L 단백질을 암호화하는 발현 벡터의 양 비율은 바람직하게는 2:1:2이며; 플라스미드의 양은 1 내지 4㎍의 pGEM-N, 0.5 내지 2㎍의 pGEM-P, 및 1 내지 4㎍의 pGEM-L의 범위내에서 적절히 조절하였다.
형질감염된 세포는 100㎍/ml의 리팜피신[시그마(Sigma) 제조원] 및 사이토신 아라비노사이드(AraC)(시그마 제조원), 보다 바람직하게는 경우에 따라, 40㎍/ml의 사이토신 아라비노사이드(AraC) 단독을 함유하는 혈청-유리된 MEM 속에서 배양한다. 최적 약물 농도는 백시니아 바이러스에 의해 유발된 세포독성을 최소화시키고, 바이러스 회수율을 최대화시키도록 설정한다(참조: Kato, A. et al, Genes Cells 1: 569-579, 1996). 형질감염시킨 후 48 내지 72시간의 배양후, 세포를 수거한 후 동결-해동을 3회 하여 붕해시킨다. LLC-MK2를 RNP를 함유하고 추가로 배양된 붕해된 물질로 형질감염시킨다. 달리는, 배양 상층액을 수집하여 감염을 위해 LLC-MK2 세포의 배양 배지에 가한 후 세포 배양한다. 형질감염은 예를 들면, 리포펙타민, 다가양이온성 리포좀 등과 복합체를 형성시킨 후, 복합체를 세포내로 도입시킴으로써 수행할 수 있다. 상세하게는, 각종의 형질감염 시약, 예를 들면, DOTMA(로슈 제조원), 슈퍼펙트(퀴아젠 제조원, #301305), DOTAP, DOPE, 및 DOSPER (로슈 제조원, #1811169)을 사용할 수 있다. 클로로퀸을 또한 가하여 엔도소옴내 분해를 예방할 수 있다(참조: Calos, M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015, 1983). RNP가 도입된 세포에서, 벡터는 RNP 및 RNP 복제로부터 바이러스 유전자의 발현의 결과로서 증폭된다. 이렇게 수득된 바이러스 유액(상층액)을 희석(예를 들면, 106-배)시킨 후 새로운 세포를 사용하여 증폭을 반복함으로써, 백시니아 바이러스 vTF7-3이 완벽하게 제거될 수 있다. 이러한 증폭은 예를 들면, 3회 이상 반복한다. 이렇게 수득한 벡터는 -80℃에서 저장할 수 있다. 투과할 수 없고 엔벨로프 단백질(들)을 암호화하는 유전자(들)이 결여된 바이러스 벡터를 재작제하기 위해, 엔벨로프 단백잴(들)을 발현시키는 LLC-MK2 세포를 형질감염에 사용할 수 있거나, 또는 엔벨로프 단백질(들)을 발현하는 플라스미드(들)을 공-형질감염시킬 수 있다. 달리는, 결여성 바이러스 벡터는 엔벨로프 단백질(들)을 발현하는 LLK-MK2 세포가 추가로 덮여진 형질감염된 세포를 배양함으로써 증폭시킬 수 있다(참조: WO 00/70055 및 WO 00/70070).
회수된 바이러스의 역가는 예를 들면, CIU(세포 형질감염성 단위) 또는 헤마글루틴화 활성(HA)를 측정함으로써 결정할 수 있다(참조: WO 00/70070; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases, Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999). GFP(녹색 형광성 단백질) 마커 유전자를 수반하는 벡터의 역가는 감염된 세포를 지시인자로서 마커(예를 들면, GFP-CIU)를 사용하여 직접 계수함으로써 적량화할 수 있다. 이렇게 측정된 역가는 CIU와 동일한 방식으로 취급될 수 있다(참조: WO 00/70070).
바이러스 벡터가 재작제될 수 있는 한, 재작제에 사용된 숙주 세포는 특히 한정되지 않는다. 예를 들어, 센다이 바이러스 벡터 등을 재작제하는 경우, 원숭이 신장에서 기원한 LLC-MK2 세포(ATCC CCL-7) 및 CV-1 세포(예를 들면, ATCC CCL-70), 햄스터 신장으로부터 기원한 BHK 세포(예를 들면, ATCC CCL-1O), 및 사람으로부터 기원한 세포를 사용할 수 있다. 이들 세포에서 적합한 엔벨로프 단백질(들)을 발현시킴에 의해, 이의 엔벨로프내에서 단백질(들)을 함유하는 감염성 비리온을 수득할 수 있다. 또한, 다량의 센다이 바이러스 벡터를 수득하기 위해, 상술한 숙주로부터 수득한 바이러스 벡터를 사용하여 벡터의 증폭용 수정된 달걀을 감염시킬 수 있다. 달걀을 사용하여 바이러스 벡터를 생성시키는 방법은 이미 개발되어 있다(참조: Nakanishi,M. et al. ed. "State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III (Shinkei Kagaku Kenkyu-no Sentan Gijutu Protocol III); Molecular Neuron Physiology (Bunshi Sinkeisaibou Seirigaku)", Koseisha, Osaka, pp. 153-172,1993). 상세하게는, 예를 들면, 수정된 달걀을 항온처리기속에 두고 9 내지 12일 동안 37 내지 38℃에서 배양함으로써 배아를 성장시킨다. 바이러스 벡터를 요막 공간내로 접종한 후, 달걀을 수일(예를 들면, 3일) 동안 배양하여 바이러스 벡터가 증식하도록 한다. 항온처리 기간과 같은 조건은 증폭되는 재조합 센다이 바이러스에 따라 변할 수 있다. 이후에, 벡터를 포함하는 요막액을 수집한다. 센다이 바이러스 벡터를 분리하고 표준 방법에 따라 요막액으로부터 정제할 수 있다(참조: Tashiro, M., "Virus Experiment Protocol", Nagai, Ishihama, ed., Medical View Co., Ltd., pp. 68-73, 1995).
예를 들면, F 유전자가 결여된 센다이 바이러스 벡터의 재작제 및 제조는 하기 기술된 바와 같이 수행할 수 있다(참조: WO 00/70055 및 WO 00/70070):
<1> F-유전자가 결여된 센다이 바이러스 게놈 cDNA 및 F 유전자-발현 플라스미드의 작제
센다이 바이러스(SeV)의 완전한 길이의 게놈 cDNA(SeV), pSeV18+ b(+) cDNA (참조: Hasan, M. K. et al, J. General Virology 78: 2813-2820, 1997) ("pSeV18+ b(+)"는 또한 "pSeV18+"로서 언급된다)를 Sphl/KpnI로 분해하여 단편(14673 bp)을 생성시킨다. 이후에, 당해 단편을 pUC18내로 클로닝하여 플라스미드 pUC18/KS를 제조하며, 당해 플라스미드상에 F 유전자-결여 부위를 작제한다. F 유전자 결실은 PCR 및 연결 방법을 조합하여 생성시킨다. 그 결과, F 유전자 ORF(ATG-TGA = 1698 bp)가 제거된다. 이후에, 예를 들면, atgcatgccggcagatga (서열번호 14)를 연결하여 F 유전자-결여 유형의 SeV 게놈 cDNA(pSeV18+/△F)를 작제한다. F의 상부 영역에 대한 프라이머[상부: 5'-gttgagtactgcaagagc/서열번호 15, 역: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/서열번호 16]을 사용하여 형성시킨 PCR 생성물, 및 F의 하부 영역에 대한 프라이머[상부: 5'-atgcatgccggcagatga/서열번호 17, 역: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/서열번호 18]를 사용하여 형성시킨 PCR 생성물을 EcoT22I 제한 부위를 통해 연결하였다. F 유전자-결여 부위를 포함하는 영역을 포함하는 4931 bp 단편은 이렇게 수득된 플라스미드를 SacI 및 SaII으로 분해하여 회수하고, pUC18내로 클로닝하여 pUC18/dFSS를 형성시킨다. 당해 pUC18/dFSS는 DraIII으로 분해하고, 회수된 단편을 사용하여 연결을 통해 pSeV18+의 F 유전자를 포함하는 영역을 포함하는 DraIII 단편을 대체시킴으로써 플라스미드 pSeV18+/△F를 수득한다.
외부 유전자는 예를 들면, pUC18/dFSS의 F 유전자-결실된 부위내 NsiI 및 NgoMIV 제한 효소 부위내로 삽입된다. 이를 위해, 외부 유전자 단편은 예를 들면, NsiI-테일의 프라이머 및 NgoMIV-테일의 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.
<2> SeV-F 단백질을 발현하는 헬퍼 세포의 제조
센다이 바이러스 F 유전자(SeV-F)를 발현하는 Cre/loxP-유도된 발현 플라스미드를 작제하기 위해, SeV-F 유전자를 PCR로 증폭시키고 Cre DNA 레콤비나제에 의해 유전자 생성물을 발현시켜 pCALNdLw/F 플라스미드를 작제할 수 있도록 설계된 플라스미드 pCALNdlw(참조: Arai, T. et ah, J. Virology 72: 1115-1121, 1998)의 유일한 SwaI 부위내로 삽입한다.
F 유전자-결여 게놈으로부터 감염성 비리온을 회수하기 위해, SeV-F 단백질을 발현하는 헬퍼 세포주를 확립한다. 예를 들면, 통상적으로 SeV 증폭에 사용되는 원숭이 신장으로부터 기원한 LLC-MK2 세포를 사용할 수 있다. LLC-MK2 세포는 10% 열-불활성화된 태 송아지 혈청(FBS), 페니실린 G 나트륨(50 단위/ml) 및 스트렙토마이신(50㎍/ml)가 보충된 MEM 속에서 37℃로 5% CO2 속에서 배양한다. SeV-F 유전자 생성물은 세포독성이므로, LLC-MK2 세포는, Cre DNA 레콤비나제를 사용하여 F 유전자 생성물을 발현하도록 설계된 상술한 pCALNdLw/F 플라스미드를 사용하여 잘 공지된 프로토콜에 따라 포유동물 형질감염 키트(스트라타젠 제조원)를 사용하는 칼슘 포스페이트 방법으로 형질감염시킨다.
pCALNdLw/F 플라스미드(10㎍)을 10-cm 플레이트속에서 40% 합류로 성장시킨 LLC-MK2 세포내로 도입한 후, 세포를 5% CO2 항온처리기속에서 37℃로 24시간 동안 10% FBS/MEM (10 ml) 속에서 배양한다. 이후에, 세포를 분리시키고 배지(10ml) 속에 현탁시킨다. 이후에, 현탁액을 5개의 10-cm 디쉬상에: 1개의 디쉬에 5ml, 2개의 디쉬에 대해 각각 2ml, 및 2개의 디쉬에 대해 각각 0.2ml로 씨딩한다. 세포를 G418[기브코-비알엘(GIBCO-BRL) 제조원](1200㎍/ml) 및 10% FBS를 함유하는 MEM (10 ml) 속에서 14일 동안 배양하고 배지를 2일마다 교환한다. 유전자가 안정하게 형질도입된 세포주를 선별한다. 상기 배지에서 성장하는 세포는 G418에 대해 내성이며, 이후에 클로닝 환으로 회수한다. 이렇게 회수된 각각의 세포 클론을 합류가 될 때까지 10-cm 플레이트속에서 계속 배양한다.
세포가 6-cm 디쉬속에서 합류로 성장한 후, 세포를 아데노바이러스 AxCANCre를 사용하여 예를 들면, MOI = 3에서, 사이토(Saito) 등의 문헌(참조: Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821,1995; Arai, T. el al., J. Virol 72: 1115-1121, 1998)에 따라 형질감염시켜 F 단백질 발현을 유도한다..
<3> F 유전자-결여 센다이 바이러스(SeV/△F)의 재작제 및 증폭
외부 유전자가 삽입되어 있는 상술한 pSeV18+/△F 플라스미드를 사용하여 다음과 같이 LLC-MK2 세포를 형질감염시킨다. LLC-MK2 세포를 5x 106 세포/디쉬로 100-mm 디쉬속에서 씨딩한다. 게놈 RNA 전사를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 수행하는 경우, 세포를 24시간 동안 배양한 후 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 박시니아 바이러스를 사용하여 MOI = 2에서 1시간 동안 실온으로 형질감염시키며, 여기서, 바이러스는 프소랄렌 및 장-파장 자외선(365 nm)으로 20분동안 처리한다(참조: PLWUV- VacT7: Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986). 박시니아 바이러스의 자외선 조사를 위해, 예를 들면, 15-와트 벌브(bulb)가 장착된 UV StratalinkerTM 2400을 사용할 수 있다(제품 번호 400676 (100V), 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타젠 제조원). 세포를 혈청-유리된 MEM으로 세척한 후 게놈 RNA를 발현하는 플라스미드 및 파라믹소바이러스의 N, P, L, 및 F + HN 단백질을 발현하는 발현 플라스미드로 적절한 리포펙션 시약을 사용하여 형질감염시킨다. 이들 플라스미드의 양은 바람직하게는 6 : 2 : 1 : 2 : 2의 순서로 설정될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 게놈 RNA-발현 플라스미드 및 N, P, L, 및 F + HN 단백질을 발현하는 발현 플라스미드(pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, 및 pGEM/F-HN; 참조: WO 00/70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1 : 569-579, 1996)를 12, 4, 2, 4 및 4㎍/디쉬의 각각의 양에서 형질감염시킨다. 수시간 동안 배양한 후, 세포를 혈청-유리된 MEM으로 2회 세척하고 40㎍/ml의 사이토신 β-D-아라비노푸라노사이드(AraC: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 제조원) 및 7.5㎍/ml의 트립신(메릴랜드주 록크빌 소재의 기브코-비알엘 제조원)을 함유하는 MEM 속에서 배양한다. 이들 세포를 회수하고, 펠렛을 Opti-MEM(107 세포/ml)속에서 현탁시킨다. 현탁액을 3회 동결-해동시키고, 리포펙션 시약 DOSPER[베링거 만하임(Boehringer Mannheim) 제조원](106 세포/25㎕ DOSPER)와 혼합하고, 실온에서 15분 동안 방치하고, 상술한 클로닝된 F-발현 헬퍼 세포를 형질감염시키는데 사용하며(12-웰 플레이트속에서 106 세포/웰), 이를 혈청-유리된 MEM(40㎍/ml의 AraC 및 7.5㎍/ml의 트립신 함유) 속에서 배양하여 상층액을 회수한다. F이외의 유전자, 예를 들면, HN 및/또는 M 유전자가 결여된 어떠한 바이러스도 또한 이와 유사한 방법으로 제조할 수 있다.
바이러스 유전자-결여 벡터를 제조하는데 있어서, 예를 들어, 상이한 바이러스 유전자가 바이러스 게놈으로부터 결실된 2개 이상의 유형의 벡터를 동일한 세포내로 도입시키는 경우, 각각의 벡터의 바이러스 단백질 결여는 다른 벡터의 발현을 통해 공급함으로써 이러한 상호 보완이 감염성 비리온의 작제 및 바이러스 벡터의 증폭이 복제 주기를 통해 허용되도록 한다. 그 결과, 개개의 바이러스 유전자-결여 바이러스 벡터의 혼합물이 저 비용 및 대규모로 제조될 수 있다. 이러한 바이러스는 특정의 바이러스 게놈(들)을 상실하고 있으므로, 이들의 게놈 크기는 완전한 바이러스의 것보다 작다. 따라서, 이러한 바이러스는 보다 큰 외부 유전자를 보유할 수 있다. 또한, 바이러스 유전자(들)의 결여성을 기초로 비-전달성인 이러한 바이러스는 세포의 외부로 일단 방출된 후 단순히 희석시키면 감염을 유지시키는데 있어서의 어려움으로 인해 멸균상태로 되기 때문에, 이러한 바이러스는, 환경내로 이의 방출이 조절된다는 점에서 유리하다. 예를 들어, Aβ 및 Th2 사이토킨을 암호화하는 벡터를 별도로 작제하여 서로 상보성이도록 할 수 있으며, 공-형질감염을 위해 사용할 수 있다. 본 발명은 Aβ를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터 및 Th2 사이토킨을 암호화하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 Aβ를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터 및 Th2 사이토킨을 암호화하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 조성물 및 키트를 사용하여 아밀로이드 β침착을 감소시킬 수 있다.
전달성 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 개개인 또는 세포에 투여한 후, 바이러스 벡터의 증식이 예를 들면, 처리 완료후 정지될 필요가 있는 경우, 숙주에 대해 어떠한 손상을 유발하지 않으면서, RNA-의존성 RNA 폴리머라제 억제제를 투여함으로써 바이러스 벡터의 증식만을 특정하게 정지시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 바이러스-생산 세포의 배양 배지내로 예를 들면, 1 x 105 CIU/ml 이상, 보다 바람직하게는 1 x 106 CIU/ml 이상, 보다 바람직하게는 5 x 106 CIU/ml 이상, 보다 바람직하게는 1x 107 CIU/ml 이상, 보다 바람직하게는 5x 107 CIU/ml 이상, 보다 바람직하게는 1 x 108 CIU/ml 이상 및 보다 바람직하게는 5x 108 CIU/ml 이상의 역가로 방출시킬 수 있다. 바이러스 역가는 본 발명의 명세서 및 기타 문헌(참조: Kiyotani, K. et al, Virology 177(1): 65-74, 1990; WO 00/70070)에 기술된 방법으로 측정할 수 있다.
회수된 바이러스 벡터는 실질적으로 순수하게 되도록 정제할 수 있다. 벡터의 정제는 여과, 원심분리 및 컬럼 정제, 또는 이의 특정 조합을 포함하는, 문헌에 잘 공지된 정제 및 분리 방법으로 수행할 수 있다. "실질적으로 순수한"은, 바이러스 벡터가 성분으로서 존재하는 샘플의 주요 비율에 대해 바이러스 벡터가 계수되는 정도를 의미한다. 통상적으로, 실질적으로 순수한 바이러스 벡터는, 바이러스 벡터로부터 기원한 단백질의 비율이 샘플중 모든 단백질의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 및 심지어 보다 바람직하게는 90% 이상(그러나, 담체 및 안정화제로서 가해진 단백질을 제외한다)임을 확인함으로써 동정할 수 있다. 바이러스를 정제하기 위한 특정 방법의 예는 셀룰로즈 설페이트 에스테르 또는 가교-결합된 폴리사카라이드 설페이트 에스테르를 사용하는 것들(참조: 일본 특허원 공개 공보 (JP-B) S-62-30752, JP-B S-62-33879, 및 JP-B S-62-30753), 및 바이러스를 푸코스 설페이트 및/또는 이의 분해 생성물을 포함하는 폴리사카라이드에 부착시키는 방법(참조: WO 97/32010)이다.
벡터를 포함하는 조성물을 제조하는데 있어서, 벡터는 경우에 따라, 목적한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클과 결합시킬 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클"은 벡터-매개된 유전자 도입을 현저히 억제하지 않으면서 벡터와 함께 투여될 수 있는 물질을 말한다. 예를 들어, 벡터는 생리학적 염수 또는 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 적절하게 희석시켜 조성물을 형성할 수 있다. 벡터가 달걀 속에서 성장하는 경우, "약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클"은 요막액을 포함할 수 있다. 또한, 벡터를 함유하는 조성물은 탈이온수 및 5% 덱스트로즈 수용액과 같은 담체 또는 비히클을 포함할 수 있다. 추가로, 조성물은 상기이외에, 야채 오일, 현탁화제, 표면활성제, 안정화제, 생균제 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 방부제 또는 기타 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물은 시약 및 약제로서 유용하다. 본 발명은 항-아밀로이드 침착제를 제조하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 Aβ 펩타이드를 암호화하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터 또는 당해 벡터가 도입된 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 항-아밀로이드 침착제를 제조하는데 있어서, (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터, 당해 벡터를 생산하는 세포, 또는 벡터가 도입된 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 벡터를 포함하는 조성물은 담체로서의 배합물속에, 생중합체와 같은 유기 물질 및 하이드록시아파타이트, 특히, 콜라겐 매트릭스, 폴리락테이트 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 또는 공중합체, 및 이의 화학적 유도체와 같은 무기 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 Th2 사이토킨 및/또는 Th2 사이토킨을 발현가능한 방식으로 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다. 이러한 Th2 사이토킨은 완전한 길이(야생형) 폴리펩타이드이거나 또는 활성을 유지하는 한 부분 단편일 수 있다. 예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단 아미노산(예를 들면, 1 내지 30개 아미노산, 상세하게는, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25개 아미노산)의 결실은 사이토킨 활성에 영향을 미치지 않을 것이다. 또한, N-말단 시그날 서열은 다른 시그날 서열로 적절히 대체할 수 있다. 달리는, 사이토킨은 다른 펩타이드와의 융합된 단백질로서 발현될 수 있다. Th2 사이토킨을 암호화하는 핵산은 발현 벡터내로 삽입되거나, 액틴 프로모터, EFl 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터 등과 같은 적절한 프로모터에 연결시킬 수 있다. 핵산은 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터 또는 특정의 다른 발현 벡터속에 함유될 수 있다. Th2 사이토킨이 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터내에서 암호화된 경우, Th2 사이토킨은 Aβ와 동일한 벡터내에 암호화될 수 있거나, 달리는 Th2 사이토킨은 다른 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터내에 암호화될 수 있다. 상세하게는, 본 발명의 Aβ-암호화 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터가 Th2 사이토킨을 암호화하지 않는 경우, Thl/Th2 균형은 Th2 사이토킨 또는 Th2 사이토킨 벡터를 본 발명의 Aβ-암호화 벡터와 함께 공-투여함으로써 Th2로 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 Th2 사이토킨은 IL-4, IL-5, IL-6, 1L-9, IL-1O, 및 IL-13, 또는 이의 조합이다. Th2 사이토킨은 바람직하게는 IL-4, IL-IO, 및 IL-13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 조성물은 또한 보조제를 포함할 수 있다. 상세하게는, 본 발명의 벡터가 Th2 사이토킨을 암호화하지 않는 경우에도, Thl/Th2 균형은 Th2 보조제를 포함하는 Th2 조성물을 사용하여 Th2로 이동시킬 수 있다. Th2 보조제는 제1형 헬퍼 T 세포(Th1 세포)보다 제2형 헬퍼 T 세포(Th2 세포)를 우세하게 활성화시키는 보조제를 말한다. 상세하게는, 보조제는 수산화알루미늄(alum), 콜레라 독소(B 소단위), 만손주혈흡충 알로부터의 단백질 추출물(예를 들면, 락토-N-푸코펜타오즈 III) 등을 포함한다(참조: Grun, J. L. and P. H. Maurer, Cellular Immunol. 121 : 134-145, 1989; Holmgren, J. et al., Vaccine 11 :1179-1184, 1993; Wilson, A.D. et al, Vaccine 11 : 113-118, 1993; Lindsay, D.S. et al, Int. Arch. Allergy Immunol. 105: 281-288, 1994; Xu-Amano, J. et al, J. Exp. Med. 178: 1309-1320, 1993; Okano, M. et al, J. Immunol. 167(1): 442-50, 2001). 본 발명의 조성물은 다른 어떠한 성분도 함유할 수 있다. 예를 들어, 이들은 투여를 모니터하기 위한 마커, 또는 면역계-조절인자, 시그날 형질도입 조절인자, 사이토킨, 호르몬, 수용체, 항체 및 이의 단편과 같은 하나 이상의 화합물을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 시그날 형질도입 조절인자, 시그날 형질도입 조절인자, 사이토킨, 호르몬, 수용체, 항체 및 이의 단편과 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 함유할 수 있다.
이렇게 생성된 (-) 쇄 RNA 바이러스 또는 당해 바이러스를 포함하는 조성물의 개개인에 대한 투여는 Aβ에 대한 면역 반응을 유도함으로써 Aβ 침착을 감소시킨다. 벡터는 Th2 사이토킨, Th2 사이토킨-발현 벡터 또는 Th2 보조제와 함께 투여될 수 있다. 벡터 투여는 생체내 투여 또는 세포-매개된 생체외 투여일 수 있다. 접종에 사용된 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 감염성 비리온일 필요는 없으며, 게놈 RNA에 의해 수반된 항원 폴리펩타이드를 발현하는 능력을 지닌 한, 비-감염성 비리온, 비리온 코어(게놈 및 게놈-결합 바이러스 단백질을 포함하는 RNP 복합체) 등일 수 있다. 여기서, (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 (-) 쇄 RNA 바이러스로부터 기원한 게놈 RNA를 함유하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 및 게놈 RNA의 복제 및 당해 바이러스에 의해 수반된 유전자의 발현에 요구되는 바이러스 단백질을 포함하는 복합체를 말하며, 여기서, 당해 복합체는 감염된 세포내에서 게놈 RNA를 복제하여 수반된 유전자를 발현시킨다. RNP는 예를 들면, 게놈 RNA 및 (-) 쇄 RNA 바이러스의 N, L, 및 P 단백질을 포함하는 복합체이다. 상세하게는, 본 발명의 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 감염성 비리온, 비-감염성 비리온(또한 바이러스 유사 입자(VLP)로 언급됨) 및 게놈 RNA와 (-) 쇄 RNA 바이러서의 뉴클레오캡시드와 같은 게놈 RNA에 결합하는 바이러스 단백질을 포함하는 RNP를 포함한다. 세포내로 도입되는 경우, 심지어 엔벨로프가 비리온으로부터 제거된 RNP(바이러스 코어)는 세포내에서 게놈 RNA를 복제할 수 있다(참조: WO 97/16538; WO 00/70055). RNP 또는 VLP는 예를 들면 형질감염 시약 등과 함께 접종시 바람직하게 사용된다(참조: WO 00/70055; WO 00/70070).
벡터 접종이 세포를 통하는 경우, (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터는 적절한 배양 세포, 또는 접종 동물 대상자로부터 수집한 세포 등에 도입된다. 시험관내(예를 들면, 시험관 또는 디쉬)에서 (-) 쇄 RNA 바이러스로 세포를 형질감염시키는 경우, 감염은 예를 들면 배양 배지 또는 생리학적 염수와 같은 바람직한 생리학적 용액속에서 시험관내(또는 생체외)로 수행할 수 있다. MOI(감염 다중성; 예를 들면, 세포당 감염된 바이러스의 수)는 바람직하게는 1 내지 1000, 보다 바람직하게는 2 내지 500, 심지어 보다 바람직하게는 3 내지 300, 여전히 보다 바람직하게는 5 내지 100의 범위이다. (-) 쇄 RNA 바이러스와 세포사이에는 단지 단기간의 접촉이면 충분하다. 이러한 접촉은 예를 들면, 1분 이상, 바람직하게는 3분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 또는 20분 이상, 예컨대 1 내지 60분 상세하게는 약 5분 내지 30분일 수 있다. 달리는, 이러한 접촉은 장기간, 예를 들면, 수일 이상에 걸쳐 일어날 수 있다.
RNP 또는 바이러스 게놈 RNA를 포함하는 비-감염성 비리온(바이러스-유사 입자(VLP))는 통상의 형질전환 방법에 의해 세포내로 도입시킬 수 있다. 상세하게는, 세포에 대한 감염은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 각종의 기술, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 방법(참조: Chen, C. & Okayama, H., BioTechniques 6:632-638, 1988; Chen, C. and Okayama, H., MoI. Cell. Biol. 7: 2745, 1987), DEAE-덱스트란 방법(참조: Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152:704-709, 1987), 각종의 리포좀-계 형질감염 시약(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989), 및 전기천공 방법(참조: Ausubel, F. et al., In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, Vol. 1, Ch. 5 and 9, 1994)으로 달성할 수 있다. 클로로퀸을 형질감염시 가하여 엔도솜 붕해를 제어할 수 있다(참조: Calos, M. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015, 1983). 형질감염 시약은 DOTMA(로슈 제조원), 슈퍼펙트 형질감염 시약(퀴아젠 제조원, 제품 번호 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(로슈 제조원 #1811169), 트랜스IT-LTl(미루스 제조원, 제품 번호 MIR 2300), CalPhosTM 포유동물 형질감염 키트(클론테크 제조원 #K2051-l), CLONfectinTM(클론테크 제조원 #8020-1) 등을 포함한다. 봉입된 바이러서는 바이러스 입자 형성동안 숙주 세포-기원한 단백질을 취하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 단백질은 약간의 항원성을 지니며 세포내로 도입되는 경우 세포독성을 유발할 수 있다(참조: J. Biol. Chem., 272: 16578-16584, 1997). 따라서, 엔벨로프-유리된 RNP(참조: WO 00/70055)를 사용하는 것이 유리하다.
바이러스 RNP는 바이러스 게놈 RNA의 발현 벡터 및 게놈 RNA의 세포내로의 복제에 요구되는 바이러스 단백질(N, P, 및 L 단백질)을 암호화하는 발현 벡터를 도입시킴에 의해 세포내에서 직접 형성될 수 있다. 바이러스 벡터가 도입된 세포는 이러한 과정으로 제조할 수 있다.
제조되면, (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터가 도입된 세포를 약 12 시간 내지 5일(바람직하게는 1 내지 3일) 동안 배양하여 Aβ 펩타이드를 발현시킬 수 있다. 수거된 세포를 직접 사용하거나 또는 동물을 접종시키기 위한 세포 분해물로서 사용할 수 있으나; Aβ 펩타이드-발현 세포가 접종에 바람직하게 사용된다. 시그날 펩타이드를 가진 Aβ는 벡터로부터 발현시켜 세포의 외부로 분비될 수 있다. 벡터가 도입된 세포의 분해물은 세포막을 세제로 분해하는 과정 또는 동결-해동 주기의 반복을 포함하는 과정에 의해 제조할 수 있다. 트리톤 X-100 및 노니데트 P-40과 같은 비-이온성 세제를 0.1 내지 1%의 농도 범위내에서 적용시킬 수 있다. 이러한 분해물은 예를 들면, 세포 클러스터를 PBS 세척 후 원심분리 및 TNE 완충액[25 mM 트리스-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% 노니데트 P-40]속에 재현탁시킨 후 원심분리로 수집하고, 세포 현탁액을 배양하여 빙상에 10 내지 30분 동안 정치시킴으로써 수득할 수 있다. 항원으로서 사용될 단백질이 세포질속에서 가용성인 경우, 제조된 분해물을 원심분리(10,000xg에서 10분 동안)하여 침전물로서 불필요한 불용성 분획을 제거하고 수득되는 상층액을 면역화를 위해 사용할 수 있다. 분해물을 세제가 바람직하지 않은 부위에 투여하는 경우, 분해물은 세포를 세척하고 5 내지 6회의 동결-해동 주기를 통해 파괴한 후 세포를 재-현탁시켜 제조할 수 있다. 분해물은 형질감염 시약과 함께 투여할 수 있다.
달리는, 면역성은 Aβ 펩타이드-암호화 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 생산하는 핵산을 동물에게 투여하여 (-) 쇄 RNA 벡터에 의해 동물의 체내에서 발현된 Aβ 펩타이드를 생산함으로써 유도시킬 수 있다. (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 생성하는 핵산은 RNA의 발현 및 재조합 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터의 제조에 필요한 단백질의 그룹의 발현을 허용하는 핵산 세트를 말한다. 상세하게는, 핵산은 Aβ-암호화 (-) 쇄 바이러스의 게놈 RNA 또는 이의 상보성 쇄(항게놈 RNA; 즉 (+) 쇄), 및 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 작제하는 바이러스 단백질의 그룹을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산의 세트를 말한다. 이러한 핵산은 적절한 프로모터를 포함함으로써 암호화된 RNP 또는 단백질을 발현한다. 이러한 프로모터는 예를 들면 CMV 프로모터(참조: Foecking, M.K, and Hofstetter H., Gene 45: 101-105, 1986), 레트로바이러스 LTR(참조: Shinnik, T. M. et al., Nature, 293: 543-548, 1981), EFl 프로모터, 및 CAG 프로모터(참조: Niwa, H. et al, Gene. 108: 193-199, 1991. JP-A No. H3-168087)를 포함한다. 플라스미드 벡터는 핵산으로서 적합하게 사용할 수 있다. (-)쇄 RNA 바이러스의 게놈은 바람직하게는 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 작제하는 바이러스 단백질(통상적으로 N, L, 및 P)의 그룹을 암호화하는 유전자, 및 모 야생형 바이러스의 엔벨로프-구성 단백질의 모든 유전자를 수반한다. (-) 쇄 RNA 바이러스 게놈이 엔벨로프-구성 단백질의 특정 유전자(들)을 결실하고 있는 경우, 감염성 비리온의 형성을 보충하는 엔벨로프 단백질(들)(예를 들면, 게놈에 의해 상실된 엔벨로프 단백질(들), 또는 VSV-G와 같은 다른 엔벨로프 단백질(들))을 암호화하는 핵산을 상술한 핵산의 세트내에 포함시킬 수 있다. 이러한 핵산의 동물에 대한 투여는 동물내에서 재조합 (-) 쇄 RNA 바이러스의 제조를 초래한다. (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 작제하는 바이러스 단백질의 그룹은 바이러스 게놈 RNA와 함게 RNP를 형성하고 뉴클레오캡시드를 구성하는 단백질을 말한다. 이들은 게놈 복제 및 유전자 발현에 요구되는 단백질의 그룹이며, 통상적으로 N, P, 및 L 단백질을 포함한다. 상세하게는, 본 발명은 또한 (i) Aβ-암호화 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 이의 상보성 쇄를 암호화하는 핵산; 및 (ii) N, P, 및 L을 암호화하는 핵산을 동물에게 접종시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 동물에서, 게놈 RNA를 포함하는 RNP가 형성되며 Aβ가 발현된다. 게놈은 또한 Th2 사이토킨을 암호화할 수 있다.
달리는, 게놈 RNA 또는 이의 상보성 쇄를 암호화하는 핵산 또는 상술한 RNP를 구성하는 바이러스 단백질의 그룹이 이미 도입된 세포 또는 이의 분해물의 접종을 또한 수행할 수 있다. (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 생성하는 핵산에 대한 보다 상세한 정보에 대해서는 하기 문헌을 참조하라:
WO 97/16539; WO 97/16538; WO 00/70055; WO 00/70070; WO 01/18223; WO 03/025570; Durbin, A. P. et al, Virology 235: 323-332, 1997; Whelan, S. P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M. J. et al, EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, F. et al, EMBO J. 14: 5773-5784, 1995; Lawson, N. D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481 , 1995; Garcin, D. et al, EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato, A. et al, Genes Cells 1: 569-579, 1996; Baron, M. D. and Barrett, T., J. Virol. 71 : 1265-1271, 1997; Bridgen, A. and Elliott, R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404, 1996; Hasan, M. K. et al, J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al, EMBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Tokusumi, T. et al, Virus Res. 2002: 86; 33-38, 1997; Li, H.-O. et al, J. Virol., 74: 6564-6569, 2000.
동물을 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터를 생성하는 핵산으로 접종시키는 경우, Aβ-암호화 (-) 쇄 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 이의 상보성 쇄를 암호화하는 핵산, 및 N, P, 및 L 단백질을 암호화하는 핵산을 5:0.5:0.5:2의 중량비로 동물내에 도입시킬 수 있다. 핵산비는 적합하게 조절할 수 있다. 예를 들어, 발현 플라스미드를 사용하는 경우, 투여는 Aβ-암호화 바이러스 게놈 RNA((+) 및 (-) 쇄)를 암호화하는 플라스미드 5 내지 1000 ㎍, 및 N-발현 플라스미드 0.5 내지 200 ㎍, P-발현 플라스미드 0.5 내지 200 ㎍, 및 L-발현 플라스미드 2 내지 500㎍을 사용하여 수행할 수 있다. 핵산의 투여는 예를 들면, 비가공의 DNA를 직접 주사하거나, 또는 형질감염 시약과 결합시킨 후 수행할 수 있다. 형질감염 시약은 예를 들면, 리포펙타민 및 다가양이온성 리포좀을 포함한다. 상세하게는 DOTMA(로슈 제조원), 슈퍼펙트(퀴아젠 제조원 #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(로슈 제조원 #1811169), 트랜스IT-LTl(미루스 제조원, 제품 번호 MIR 2300) 등을 사용할 수 있다.
투여될 본 발명의 벡터의 용량은 질병의 유형, 환자의 체중, 연령, 성별 및 증상, 투여 목적, 조성물이 도입되는 투여형, 투여방법, 도입될 유전자의 유형 등에 따라 변한다. 당해 분야의 숙련가들은 적절한 용량을 결정할 수 있다. 투여 경로는 적합하게 선택할 수 있으며 경피내, 비강내, 경기관지로, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 경로는 근육내 주사(예를 들면, 비복근 근육), 피하 주사, 비강내 점적 또는 분무, 손바닥 또는 발바닥내로 경피내 주사, 비장내로 직접 주사, 복강내 주사 등이다. 하나 이사의 접종 부위, 예를 들면, 2 내지 15개 부위일 수 있다. 접종 용량은 동물 대상체, 접종 부위 및 접종 횟수 등에 따라 적합하게 조절할 수 있다. 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약 105 내지 약 l011 CIU/ml, 보다 바람직하게는 약 107 내지 약 109 CIU/ml, 가장 바람직하게는 1 x 108 내지 약 5x 108 CIU/ml의 범위내의 투여량에서 투여하는 것이 바람직하다. 바이러스 역가의 측면에서, 사람에 대한 단일 투여량은 1 x 104 CIU 내지 5x 1011 CIU (세포 감염성 단위)이며, 바람직하게는 2x 105 CIU 내지 2x 1010 CIU의 범위이다. 투여 횟수는 1회이거나, 또는 부작용이 임상적으로 허용되는 범위내인 한, 수회이다. 1일당 투여 수도 또한 동일한 방식으로 결정할 수 있다. 단일 투여가 현저한 효과를 생성한다 하더라도, 1회 이상 벡터를 도입시킴에 의해 보다 강력한 효과를 수득할 수 있다.
벡터를 1회 이상 투여하는 경우, 예를 들어, 두번째 투여는 첫번째 투여 후 대략 1년만에 수행할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 예를 들면, 비강내 또는 근육내 투여이다. 투여는 보다 강력한 효과를 위해 반복할 수 있다. Aβ-암호화 핵산, 바이러스 벡터를 생성하는 핵산을 수반하는 상술한 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터, 당해 바이러스 백터 또는 당해 벡터를 생성하는 핵산이 도입된 세포 또는 세포의 분해물의 접종은 바람직하게는 다수-투여량 투여를 위해 사용할 수 있다.
벡터를 세포(생체외 투여), 예를 들면, 사람 세포를 통해 접종하고, 바람직하게는 자가 세포를 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터로 형질감염시키는 경우, 104 내지 109 세포, 및 바람직하게는 105 내지 108 세포, 또는 이의 분해물을 사용할 수 있다. 벡터를 또한 사용하여 비-사람 동물을 접종할 수 있거나, 투여 용량을 사람의 것에 대한 대상체 동물의 투여의 표적 부위의 용적 비(예를 들면, 평균 값) 또는 체중을 기초로 하여 상술한 용량으로부터 전환시킬 수 있다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 투여하기 위한 대상체는 면역계를 가진 목적한 척추동물(사람 및 비-사람 척추동물), 예를 들면, 조류 및 포유동물, 보다 바람직하게는 포유동물(사람 및 비-사람 동물 포함)을 포함한다. 상세하게는, 포유동물은 사람 및 원숭이와 같은 비-사람 영장류, 마우스 및 랫트와 같은 설치류, 및 토끼, 염소, 양, 돼지, 소 및 개와 같은 모든 다른 포유동물을 포함한다. 투여를 위한 표적 동물은 예를 들면, 알츠하이머병을 지닌 개개인, Aβ의 수준이 상승된 개개인, Aβ 침착이 증진된 개개인, 알츠하이머-형 돌연변이체 유전자를 수반하는 개개인 등을 포함한다.
Aβ에 대한 면역 반응은 본 발명의 방법으로 유도된다. Aβ에 대한 면역반응은 항-Aβ 항체 생산, 뇌 조직에서 Aβ의 양의 감소 및 Aβ 침작의 감소 등으로 확인할 수 있다. 항-Aβ 항체의 생산은 혈액 샘플속에서 항-Aβ 항체의 검출에 의해 평가할 수 있다. 항체 수준은 ELISA(효소-연결된 면역흡착 검정) 또는 오우크터를로니 방법(Ouchterlony's method)으로 측정할 수 있다. ELISA 방법은 예를 들면, 항원을 미세플레이트에 부착시키고, 항혈청을 제조하며 제조된 항혈청의 일련의 2-배 희석물을 제조하고(출발 용액 1:1000), 희석된 항혈청을 항원-항체 반응이 일어나도록 플레이트에 가함으로써 수행한다 이후에, 발색을 위해, 면역화된 동물의 항체를 퍼옥시다제로 효소적으로 표지되어 있고 제2 항체로 공급되는 이종 항체와 반응시킨다. 항체 역가는, 흡광도가 최대 색 흡광도의 1/2인 경우 항체의 희석 배를 기준으로 계산할 수 있다. 달리는, 오우크터를로니 방법에서, 항원 및 항체는 아가 겔내에서 확산되어 백색 침전 라인이 면역침전 반응의 결과로 형성된다. 침전 라인을 사용하여 항체 역가를 측정할 수 있으며, 이는, 면역침전 반응이 일어나는 경우 항혈청의 희석 배이다. 뇌 조직에서 Aβ 수준은 예를 들면, 뇌 조직 추출물 및 바이오소스(BioSource) ELISA 키트 등을 사용하여 측정할 수 있다.
Aβ 침착(노인성 반점)을 감소시키는 효과는 예를 들면 다음 과정으로 측정할 수 있다: 뇌 조직 단면을 70% 포름산으로 처리하고 내인성 퍼옥시다제를 5% H2O2로 불활성화시킨 후, 당해 단면을 항-Aβ 항체와 반응시키고 퍼옥시다제-표지된 제2 항체를 사용하여 DAB 염색을 수행한다. 염색 후, Aβ 축적된 부위의 면적은 현미경적 관측으로 측정할 수 있다. 축적된 부위의 면적 분획이 본 발명의 벡터를 투여하지 않는 경우의 것과 비교하여 감소한 경우, Aβ 침착의 수준은 감소된 것으로 판단할 수 있다. 달리는, 살아있는 대상체에서 노인성 반점을 아밀로이드 등에 대해 친화성을 가진 1-플루오로-2,5-비스-(3-하이드록시카보닐-4-하이드록시)스티릴벤젠(FSB)과 같은 화합물의 정맥내 투여 후 MRI를 사용하여 관측할 수 있다(참조: Higuchi M et al., Nat. Neurosci. 8(4):527-33, 2005; Sato, K. et al, Eur. J. Med. Chem. 39: 573, 2004; Klunk, W. E. et al, Ann. Neurol. 55(3):306-19, 2004). 본 발명의 벡터의 효과는 아밀로이드에 대한 이러한 비-침입성 영상 기술로 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 아밀로이드 β에 대한 면역 반응을 측정하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 본 발명의 벡터 또는 당해 벡터를 포함하는 조성물을 아밀로이드 β침착을 지닌 대상체에 도입시키고 대상체에서 항-아밀로이드 β항체를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터 또는 당해 벡터를 포함하는 조성물을 아밀로이드 β 침착을 지닌 대상체에게 투여하는 단계 및 대상체에서 아밀로이드 β침착의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 아밀로이드 β에 대한 면역 반응 및/또는 모니터링될 아밀로이드 β 침착을 감소시키는 효과를 허용한다.
도 1은 리트머스 Sall/Nhelfrg-MtsHNtsPLmut-dF mIL1O(이후, 리트머스 TS-dF mILlO로 약술함)를 작제하는 방법을 나타내는 전개도이다. 돌연변이는 리트머스 TS-dF의 F 유전자-결실된 부위내로 도입시켜 NotI 부위를 생성시키고, 여기에, NotI을 사용하여 절개한 mIL-10 유전자를 삽입하였다.
도 2는 pSeV18+Aβ/MtsHNtsP511Lmut-dF(이후, pSeV18+Aβ/TS-dF로 약술)을 작제하는 방법을 나타내는 전개도이다. pBluescriptTM의 NotI 부위내로 삽입된 Aβ 유전자를 절개하여 pSeV18+NotI/TS-dF의 NotI 부위내로 삽입시켰다.
도 3은 pSeV18+Aβ/MtsHNtsP511Lmut-dF mILlO(이후, pSeV18+Aβ/TS-dF mILlO로 약술)을 작제하는 과정을 나타내는 전개도이다. 필수적인 단편을 pSeV18+Aβ/TS-dF 및 리트머스 TS-dF mILlO으로부터 SalI 및 NheI을 사용하여 절개하고 스위칭하였다.
도 4는 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여 후 4 및 8주째에 APP 유전자도입 마우스에서 혈청 항-Aβ 항체의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5는 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스의 전두엽내 노인성 반점을 나타내는 사진이다.
도 6은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여후 8주째에 APP 유전자도입 마우스의 두정엽에서 노인성 반점을 나타내는 사진이다.
도 7은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스의 해마내에서 노인성 반점을 나타내는 사진이다.
도 8은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스(전두엽, 두정엽 및 해마)에서 노인성 반점의 정량화 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스에서 중추 신경계내 림프세포 침윤을 시험한 결과를 도시한다. 전두엽에서 T 세포 침윤은 지시인자로서 CD3을 사용하여 검출한다. 해마에서 미세아교 변형은 지시인자로서 Iba-1을 사용하여 검출하였다.
도 10은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 비강내 투여후 8주째에 APP 유전자 도입 마우스의 뇌 조직에서 Aβ의 양을 나타내는 그래프의 세트이다.
도 11은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스의 혈청 Aβ 항체의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 12는 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 APP 유전자 도입 마우스이 전두엽에서 노인성 반점을 나타내는 사진이다.
도 13은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 APP 유전자 도입 마우스의 두정엽내에서 노인성 반점을 나타내는 사진이다.
도 14는 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스의 해마내에서 노인성 반점을 나타내는 사진이다.
도 15는 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 APP 유전자도입 마우스(전두엽, 두정엽 및 해마)에서 노인성 반점의 적량화 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 전두엽내 림프세포 침윤을 시험한 결과를 나타내는 사진이다.
도 17은 SeV-Aβ1-43/mIL-10 또는 대조군 벡터의 근육내 투여 후 8주째에 뇌 조직에서 Aβ의 양을 나타내는 그래프의 세트이다.
도 18은 SeV-Aβ1-43/mIL-10의 비강내 투여 후 정상 마우스의 혈청 항-Aβ 항체의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 19는 사이토킨을 암호화하는 센다이 바이러스 치료 벡터의 비강내 투여 후 정상 마우스의 혈청 항-Aβ 항체의 수준을 나타내는 그래프이다.
발명을 수행하기 위한 최선의 모드
본원의 하기에서, 본 발명은 실시예를 사용하여 상세히 기술하나, 본 발명이 이에 한정되는 것으로 고려되어서는 안된다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 본원에 참조로 혼입된다.
실시예 1. Aβ 유전자를 수반하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 게놈 cDNA 의 작제
(1-1) NotI 단편의 작제((-) 쇄 RNA 바이러스의 전사 시그날의 도입)
PCR을 주형으로서, 아밀로이드 전구체 단백질(APP: 수탁 번호 AF282245)의 분비 시그날(아미노산 1 내지 18개)를 사람 Aβ 펩타이드 1-43(서열번호 27)에 가함으로써 분비형으로 제조한 Aβ 펩타이드(서열 28)을 암호화하는 유전자(참조: JP-A No. 2005-21149; 서열번호 1), 및 2개의 프라이머, 즉, phAbeta-NnotI(서열 19) 및 phAbeta-CnotI(서열번호 20)을 사용하여 수행하였다. 수득되는 PCR 생성물을 NotI을 사용하여 분해한 후 pBluescripTMII KS(스트라타젠 제조원)내로 아클로닝하여 센다이 바이러스 전사 시그날(서열번호 21)을 포함하는 Aβ 펩타이드 유전자 의 NotI 단편을 작제하였다. 유사하게, 마우스 IL-10(mIL10)의 경우, PCR을 주형으로서 mIL10 cDNA(수탁 번호 제NM_O 10548; 서열번호 2), 및 2개의 프라이머, pmIL10-N(서열번호 22) 및 pmILlO-C(서열번호 23)을 사용하여 수행하였다. 수득되는 PCR 생성물을 NotI으로 분해한 후, pBluescriptTMII KS(스트라타젠 제조원)내로 아클로닝하여 센다이 바이러스 전사 시그날을 포함하는 mIL10 유전자의 NotI 단편(서열번호 24)을 작제하였다.
서열번호 1:
ATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCT
TGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTG
GTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCA
TGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACTTAA
서열번호 19:
ATTGCGGCCGCCAAGGTTCACTTATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTG
서열번호 20:
ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAGTCG
CTATGACAACACCGCCCACCATGAGTCC
서열번호 21:
gcggccgccaaggttcacttATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGA
CGGCTCGGGCGCTTGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCA
TCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCA
ATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACTTAAccgtagtaagaaaaactt
agggtgaaagttcatcgcggccgc
서열번호 2:
ATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTGGCATGAGGAT
CAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCACTTCCCAGTC
GGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACTGCCTTCAGCCAGGTGAAGA
CTTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAACCGACTCCTTA
ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGGAAATGATCC
AGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGCCCAGAAAT
CAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCAGGATGCGG
CTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAGGCAGTGG
AGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCTACAAGGC
CATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGATGATC
AAAATGAAAAGCTAA
서열번호 22:
ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTG
서열번호 23:
ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAGCTT
TTCATTTTGATCATCATGTATGCTTC
서열번호 24:
gcggccgccaaagttcaATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG
GCATGAGGATCAGCAGGGGCCAGTACAGCCGGGAAGACAATAACTGCACCCA
CTTCCCAGTCGGCCAGAGCCACATGCTCCTAGAGCTGCGGACTGCCTTCAGCC
AGGTGAAGACTTTCTTTCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGCTAAC
CGACTCCTTAATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTTGCCAAGCCTTATCGG
AAATGATCCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCAGAGAAGCATGGC
CCAGAAATCAAGGAGCATTTGAATTCCCTGGGTGAGAAGCTGAAGACCCTCA
GGATGCGGCTGAGGCGCTGTCATCGATTTCTCCCCTGTGAAAATAAGAGCAAG
GCAGTGGAGCAGGTGAAGAGTGATTTTAATAAGCTCCAAGACCAAGGTGTCT
ACAAGGCCATGAATGAATTTGACATCTTCATCAACTGCATAGAAGCATACATGA TG ATC AAAATG
AAAAGCTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc
(1-2) F 유전자-결실된 부위내로 mILlO NotI 단편의 삽입
9개 점에서 아미노산 돌연변이(M 단백질, G69E, T116A 및 A183S; HN 단백질, A262T, G264R 및 K461G; P 단백질, L511F; L 단백질, N1197S 및 K1795E)가 도입된 F 유전자-결여 SeV 벡터(참조: WO 2003/025570)의 cDNA(pSeV18+NotI/TS△F)를 SalI 및 NheI으로 분해하여 리트머스38[뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 제조원]내로 아클로닝하였다. 이후에, NotI 분해 부위를 삽입하기 위한 돌연변이를 M 및 HN 유전자를 포함하는 수득되는 리트머스 TS△F 플라스미드의 F 유전자-결실된 부위내로 도입시켰다. 상세하게는 NotI 분해 부위의 삽입(참조: 도 1, 상부 도면)의 삽입은 주형으로서 리트머스 TS△F와 2개의 프라이머 F_lit3008_NotI (서열번호 25) 및 R_lit3020_NotI (서열번호 26)를 사용하는 PCR로 수행하였다. 수득되는 리트머스 TS△F NotI을 NotI으로 분해한 후, mILlO 유전자 NotI 단편을 삽입하였다(참조: 도 1, 하부 도면).
서열번호 25: AAGCGGCCGCCTCAAACAAGCACAGATCATGGATG
서열번호 26: AGGCGGCCGCTTAATTAACCAAGCACTCACAAGG
(1-3) Aβ 유전자를 수반하는 F 유전자 결여성 SeV cDNA의 작제
Aβ 펩타이드 유전자 NotI 단편을 NotI으로 분해한 pSeV18+NotI/TS△F상의 NotI내로 삽입하여 Aβ 유전자를 수반하는 F 유전자-결여성 SeV cDNA(pSeV18+Aβ/TS△F)를 작제하였다(도 2).
(1-4) Aβ 및 IL-IO 유전자를 수반하는 F 유전자-결여성 SeV 게놈 cDNA의 작제
pSeV18+Aβ/TS△F를 SalI 및 NheI으로 분해한 후, M 및 HN 유전자를 포함하지 않는 단편을 회수하였다. 한편, 리트머스 TS△F-mlLlO을 SalI 및 NheI으로 분해하여 M 및 FIN 유전자 둘다를 포함하는 단편을 제조하였다. 2개의 단편을 연결하여 Aβ 및 IL-10 유전자 둘다를 수반하는 F 유전자-결여성 SeV 게놈 cDNA(pSeV18+Aβ/TS△F-mIL10)을 작제하였다(도 3).
실시예 2. 센다이 바이러스 벡터의 재작제 및 증폭
바이러스 재작제 및 증폭은 리(Li) 등의 문헌(참조: Li, H.-O. et al, J. Virology 74: 6564-6569, 2000; WO 00/70070) 및 이의 변형된 방법(참조: PCT/JP2005/00705)에 의해 보고된 방법을 사용하여 수행하였다. 바이러스 벡터는 F 유전자-결여성이므로, F 단백질을 공급하기 위한 헬퍼 세포를 사용하였다. 헬퍼 세포는 Cre/loxP 유도된 발현 시스템을 사용하여 제조하였다. 당해 시스템은 플라스미드 pCALNdLw(참조: Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121, 1988)를 사용하며, 이 플라스미드는 Cre DNA 레콤비나제, 및 Cre DNA 레콤비나제를 발현하여 pCALNdLw 플라스미드를 사용하여 사이토(Saito) 등의 방법(참조: Saito, I. et al., Nucl. Acid Res. 23: 3816-3821, 1995; Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121, 1998)에 따라 형질전환된 형질전환체를 감염시키는 재조합 아데노 바이러스(AxCANCre)의 발현을 유도하도록 설계되어 있다.
Aβ유전자를 수반하는 F 유전자-결여성 SeV 벡터(SeVl8+Aβ/TS△F) 및 Aβ와 IL-IO 유전자 둘다를 수반하는 F 유전자-결여성 SeV 벡터(SeV18+Aβ/TS△F-mIL10)를 상술한 방법으로 제조하였다. SeV18+Aβ/TS△F-mIL10의 (+) 쇄를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 4에 나타내고 게놈 RNA((-) 쇄의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 나타낸다. F 유전자-결실된 부위내에 Aβ 및 IL-IO 유전자대신 LacZ 유전자를 수반하는 SeV 벡터(SeV18+LacZ/TS△F; 또한 "SeV LacZ"로도 언급)를 대조군으로서 제조하였다.
실시예 3. 알츠하이머병 동물 모델에서 비강내 투여된 SeV -Aβ1-43/ mILlO 의 효과
(3-1) 동물 및 투여 방법
본 발명의 SeV18+Aβ/TS△F-mIL10(이후 "SeV-Aβ1-43/mIL-10"로 또한 언급) 을 24- 내지 25-개월된 APP 유전자도입 마우스(Tg2576)(참조: Hsiao, K., et al, Science 274:99-102, 1996)를 사용하여 시험하였다. 마우스를 2개 그룹, 즉, 처리 그룹 및 대조군 그룹으로 분리하며, 각각의 그룹은 4마리의 마우스로 이루어진다. SeV-Aβ1-43/mIL-10(5x 106 ClU/두부)를 치료 그룹에게 비강내 투여하고, SeV LacZ (5x 106 CIU/두부)를 대조 그룹에 비강내 투여하였다.
(3-2) 혈청에서 항-Aβ 항체의 측정
혈액을 상술한 치료후 4 및 8주째에 마우스로부터 수집하여 혈청중 존재하는 항-Aβ42 항체의 양을 측정하였다. Aβ1-42 펩타이드(5㎍/mL)를 96-웰 플레이트(Nunc, MaxiSorp)의 각각의 웰상에 흡착시켰다. 5% 탈지유/TBS-T 완충액으로 차단시킨 후, 마우스 혈청(500배 희석됨)을 가하고 퍼옥시다제-표지된 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 검출을 수행하였다. 항체 역가는 ELISA 판독기를 사용하여 흡광도 측정(O.D.450)으로 평가하였다.
결과는 도 4에 나타낸다. 항체 역가는 대조군 그룹과 비교하여 처리 그룹의 모든 대상체에서 현저히 상승하는 것으로 밝혀졌다.
(3-3) SeV-Aβ1-43/mIL-10의 노인성 반점-제거 효과
상술한 센다이 바이러스 벡터를 비강 투여받은 마우스를 투여한지 8주 후에 사멸(26 또는 27개월)시키고, 전두엽, 두정엽 및 해마의 피질의 뇌 조직 단면을 제조하였다. 상술한 조직의 동결된 단면을 하기 기술한 바와 같이 처리하였다. Aβ단백질 또는 노인성 반점을 검출하기 위하여, 조직 단면을 70% 포름산으로 처리하 고 내인성 퍼옥시다제를 5% H2O2로 불활성화시켰다. 이후에, 조직 단면은 토끼 항-판-Aβ 항체(1000배 희석됨)와 반응시키고, 퍼옥시다제-표지된 제2 항체를 가한 후 DAB 염색을 수행하였다. 염색된 단면은 현미경에 연결된 3CCD 카메라속에서 관측하고, Aβ 축적 부위를 각각의 영역내에서 측정하고 부위 단편을 계산하였다.
단면 염색의 결과를 도 5(전두엽), 도 6(두정엽) 및 도 7(해마)에 나타낸다. Aβ 침탁의 부위 비는 도 8에 나타낸다. SeV-Aβ1-43/mIL-10 투여가 모든 전두엽 및 두정엽과 해마에서 대조군의 10 내지 20%까지 노인성 반점을 현저히 감소시킴을 입증하였다.
(3-4) SeV-Aβ1-43/mIL 투여의 안정성 평가
전두엽 및 해마의 동결된 조직 단면을 (3-3)에서 상기 기술된 동일한 과정을 사용하여 투여(26- 내지 27-개월)후 8주째에 치료 그룹 및 대조군 그룹으로부터 제조하였다. 동결된 단면을 항-CD3 항체(T 세포) 및 항-Iba-1 항체(미세아교)를 사용하는 ABC 방법으로 염색하여 중추 신경계내 림프 세포 침윤 및 아교 변형이 일어났는지를 평가하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, T 림프세포(판 T 세포 마커인, CD3에 대해 양성인 세포)의 침윤을 치료 그룹 또는 대조군 그룹에서 전두엽 및 해마 둘다에서 관측되지 않았다. 따라서, 중추 신경게의 염증은 치료를 위한 본 발명의 벡터를 사용함에 의해 유발될 수 있는 가능성이 매우 낮은 것으로 제안된다. 또한, 미세아교 마커인 IBA-1에 대해 양성인 세포의 양은 대조군 그룹 및 치료 그룹사이에서 비교될 수 있으며, 이는, 치료가 치료 그룹에서 극도의 활성(축적)을 초래하지 않았음을 입증한다.
(3-5) 뇌 조직에서 Aβ의 측정
마우스의 대뇌 및 소뇌를 중간 틈새를 따라 절개하고 해마를 신속하게 동결시키고 -80℃로 저장하였다. 뇌 해마를 1 ml의 TBS 용액 속에서 균질화하고, 100,000g에서 1시간 동안 벤크톱 한외여과기를 사용하여 원심분리하였다. 가용성 분획(TBS 분획)을 저장하였다. 불용성 분획을 2% SDS 속에 용해하고 균질화시킨 후, 100,000g에서 1시간 동안 다시 원심분리하였다. 수득되는 가용성 분획(2% SDS 분획)을 저장하였다. 불용성 분획을 70% 포름산 속에 용해하고 균질화한 후 100,000g에서 1시간 동안 다시 원심분리하였다. 수득되는 가용성 분획(포름산 분획)을 저장하였다. 뇌 조직내 Aβ40 및 42를 바이오소스 ELISA 키트로 측정하였다. 1M 트리스 용액을 사용하여 TBS 분획을 4배 희석시키고; 2% SDS 분획을 400 내지 2000배로 희석시키며; 포름산 분획을 1000배 희석시켰다. 이후에, 희석된 분획을 측정용 ELISA 희석 용액을 사용하여 추가로 희석(2 내지 10배)시켰다.
도 10에 나타낸 바와 같이, SeV-Aβ1-43/mIL-10 투여는 모든 SDS, 포름산 및 TBS 분획에서 뇌 조직내 Aβ의 수준을 현저히 감소시켰다.
실시예 4. 알츠하이머병 동물 모델에서 근육내 투여된 SeV -Aβ1-43/ mIL -10의 효과
(4-1) 동물 및 투여 방법
투여 경로를 제외하고는, 모든 과정은 상술한 비강 투여에서 사용된 것과 동 일하였다. SeV-Aβ1-43/mIL-10 벡터를 뒤쪽 넓적다리 근육에 5 x 106 CIU의 투여량으로 투여하였다.
(4-2) 혈청에서 항-Aβ 항체의 측정
SeV-Aβ1-43/mIL-10 벡터를 근육내 투여받은 마우스의 혈청중 항-Aβ 항체의 양을 상술한 비강 투여에 사용된 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 도 11에 나타낸다.
(4-3) SeV-Aβ1-43/mIL의 노인성 반점-제거 효과
SeV-Aβ1-43/mIL-10 벡터를 근육내 투여한 후 전두엽, 두정엽 및 해마에서 노인성 반점-제거 효과를 상술한 비강내 투여에 사용된 것과 동일한 방법으로 평가하였다. 결과는 도 12(전두엽), 도 13(두정엽) 및 도 14(해마)에 나타낸다. Aβ 침착의 부위 비는 도 15에 나타낸다. 각각의 영역은, 특정 정도의 Aβ 침착이 감소되었음을 나타낸다.
(4-4) SeV-Aβ1-43/mIL-10 투여의 안정성 평가
SeV-Aβ1-43/mIL-10 벡터의 근육내 투여후 중추 신경계내 림프세포 침윤의 존재를 상술한 비강내 투여에 사용된 것과 동일한 방법으로 평가하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 전두엽내 T 림프세포의 침윤은 대조군 그룹 또는 치료 그룹에서 관측되지 않았다.
(4-5) 뇌 조직에서 Aβ의 측정
SeV-Aβ1-43/mIL-10 벡터의 근육내 투여 후 뇌 조직에서 Aβ40 및 Aβ42를 상술한 비강내 투여에 사용된 것과 동일한 방법으로 측정하였다. 결과는 도 17에 나타낸다. Aβ의 수준은 일부 가용성 분획에서 감소된 것으로 확인되었다.
실시예 5. 정상 마우스에서 SeV -Aβ1-43/ hIL -10의 비강내 투여에 의한 항체 역가의 평가
(5-1) 동물 및 투여 방법
본 발명의 SeV18+Aβ1-43/TS△-hIL10(이후, "SeV-Aβ1-43/hIL-10"으로 언급)의 효과를 6주된 C57BL/6N 마우스에서 시험하였다. 마우스를 3개의 그룹으로 나누며, 이들 각각은 6마리의 마우스로 이루어졌다. SeV-Aβ1-43/hIL-10(그룹 1: 5x 105 ClU/두부, 그룹 2: 5x 106, 그룹 3: 5x 107 ClU/두부)을 각각의 마우스에 비강내 투여하였다.
(5-2) 혈장에서 항-Aβ 항체의 측정
투여전, 및 투여한지 2, 4 및 8주 후에 마우스로부터 혈액을 수집하여 혈장내 존재하는 항-Aβ42 항체의 양을 측정하였다. Aβ-42 펩타이드(4㎍/mL)을 96-웰 플레이트(Nunc, MaxiSorp)의 각각의 웰상에 흡착시켰다. 1% BSA/2% 염소 혈청/TBS-T 완충액으로 차단시킨 후, 마우스 혈장(300배 희석시킴)을 가하고 검출을 퍼옥시다제-표지된 항-마우스 IgG 항체로 수행하였다. 항체 역가를 ELISA 판독기를 사용하여 흡광도 측정(O.D.450)으로 평가하였다.
결과는 도 18에 나타낸다. 항-Aβ 항체의 양은 모든 3개 그룹에서 시간 경과동안 증가하였다. 항체의 양이 벡터 투여에 의해 투여량 의존적 방식으로 증가 하였지만, 항체의 양의 현저한 차이는 그룹 2(5x 106 ClU/두부) 및 그룹 3(5x 107 ClU/두부)사이에 관측되지 않았다. 당해 결과는, 본 발명의 시약(SeV-Aβ1-43/hIL-10)의 투여에 의해 항-Aβ 항체의 도입이 알츠하이며병 모델 마우스(APP Tg 마우스)에서는 특이적이지 않으나, 정상 마우스에서 현저히 달성됨을 나타낸다.
실시예 6. 정상 마우스에 비강 투여시 알츠하이머 병의 사이토킨 -암호화하는 치료 벡터의 효과
(6-1) 동물 및 투여 방법
몇가지 사이토킨을 암호화하는 유전자를 위에서 기술한 알츠하이머병용 치료 벡터내로 삽입하였다. 센다이 바이러스 벡터의 효과는 6-주된 C57BL/6N 마우스를 사용하여 시험하였다. 마우스를 3개 그룹으로 분리하였으며, 각각은 6마리의 마우스로 이루어졌다. 센다이 바이러스 벡터(Aβ 펩타이드 및 마우스 IL-4, IL-5 또는 IL-6을 암호화하는 유전자를 수반; SeV-Aβ1-42/mIL-4, SeV-Aβ1-42/mIL-5 또는 SeV-Aβ1-42/mIL-6으로 각각 언급함)를 각각의 마우스에 비강내 투여하였다(5 x 106 ClU/lO㎕).
(6-2) 혈장내 항-Aβ항체의 측정
투여 후 1 및 2주째에 마우스로부터 혈액을 수집하여 혈장중에 존재하는 항-Aβ 항체의 양을 측정하였다. Aβ1-42 펩타이드(4㎍/mL)를 96-웰 플레이트(Nunc, MaxiSorp)의 각각의 웰상에 흡착시켰다. 1% BSA/2% 염소 혈청/TBS-T 완충액으로 차단시킨 후, 마우스 혈장(300배 희석시킴)을 가하고 검출을 퍼옥시다제-표지된 항 -마우스 IgG 항체를 사용하여 수행하였다. 항체 역가는 ELISA 판독기를 사용하여 흡광도 측정(O.D.450)으로 평가하였다.
결과는 도 19에 나타낸다. 항-Aβ 항체의 양은 모든 3개 그룹에서 시간 경과동안 증가하였다. 결과는, IL-4, IL-5, 및 IL-6이 항 Aβ 항체를 유도하는데 효과적이며, Aβ 항원을 암호화하는 핵산 및 IL-4, IL-5, 및 IL-6으로부터 선택된 하나 이상의 사이토킨 둘다를 수반하는 센다이 바이러스 벡터를 포함하는 제형이 알츠하이머병의 치료시 항-Aβ 항체를 유도시키는데 바람직함을 나타낸다.
본 발명은 아밀로이드 β 침착의 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있는 신규의 (-) 쇄 RNA 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 알츠하이머병을 치료하는데 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC CORPORATION JAPAN AS REPRESENTED BY PRESIDENT OF NATIONAL CENTER FOR GERIATRICS AND GERONTOLOGY <120> HIGHLY SAFE INTRANASALLY ADMINISTRABLE GENE VACCINES FOR TREATING ALZHEIMER'S DISEASE <130> D4-A0503P <150> JP 2005-123015 <151> 2005-04-20 <150> US 60/727,690 <151> 2005-10-18 <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 186 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga cggctcgggc gcttgatgca 60 gaattccgac atgactcagg atatgaagtt catcatcaaa aattggtgtt ctttgcagaa 120 gatgtgggtt caaacaaagg tgcaatcatt ggactcatgg tgggcggtgt tgtcatagcg 180 acttaa 186 <210> 2 <211> 537 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atgcctggct cagcactgct atgctgcctg ctcttactga ctggcatgag gatcagcagg 60 ggccagtaca gccgggaaga caataactgc acccacttcc cagtcggcca gagccacatg 120 ctcctagagc tgcggactgc cttcagccag gtgaagactt tctttcaaac aaaggaccag 180 ctggacaaca tactgctaac cgactcctta atgcaggact ttaagggtta cttgggttgc 240 caagccttat cggaaatgat ccagttttac ctggtagaag 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cugagggucu 8940 ucagcuucuc acccagggaa uucaaaugcu ccuugauuuc ugggccaugc uucucugccu 9000 ggggcaucac uucuaccagg uaaaacugga ucauuuccga uaaggcuugg caacccaagu 9060 aacccuuaaa guccugcauu aaggagucgg uuagcaguau guuguccagc ugguccuuug 9120 uuugaaagaa agucuucacc uggcugaagg caguccgcag cucuaggagc auguggcucu 9180 ggccgacugg gaagugggug caguuauugu cuucccggcu guacuggccc cugcugaucc 9240 ucaugccagu caguaagagc aggcagcaua gcagugcuga gccaggcauu gaacuuuggc 9300 ggccgcuuaa uuaaccaagc acucacaagg gacuuuaucc cuaaguuuuu cuuauuuaag 9360 acaaggagug acccgguggc uccgacugcc aggugguguc ugcuuggggc auugucgcag 9420 gucucugaug ggugcacauu uacagcuuuc ugauccuucc gauguucuua gccacaacau 9480 uaggguagua gcggaaauca cgagggaugg ccgguuggaa caccgcaucg acgccuguga 9540 uuucuacaga ugccgcccaa aucaccaugu ucauaugggg auucacaucc auuaauggga 9600 agcagacugc ccucuuccau gcgagcugac ucaugaaugu cuuagauagu gucccauuaa 9660 ccugaacaug gaagcuuaua ccgccgauua acccaaguga gaaaaucagc cgcauucucu 9720 caaucuugcu cuugcaguac ucaacagagu auaucuuccc gaccuuucuc 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ggaucuaguu ggucagugac 10620 ucuauguccu cuucuacgag uuccaugacu gccuuaaccu cuuggucugu cuugcacuug 10680 gauaaugauu ucacauaugc uacuuucuca gcucugcuua ggggacugcu cucuaugacg 10740 agccugagag agugcauugu gggcuucucu uuggagggaa agagacguga ugcguuugag 10800 gcccuggguu cugugucccu cucuugguac accggguugc ggaucucauc ucuaaauuca 10860 uccucucgga uuagguccgg uuuguacuuc auaucuucua gggucuccau agauggguca 10920 aaccugguag ccuuagucuu guucucuuuu gauuuugcaa aaacggaggg ggaccuugua 10980 agggagucug uguugucagu cuugccaccu cuaucuguga ugauaugaag uguagauagg 11040 uuggacauca gcaaugaguu cuguucuuuc ugauacucag agaaucucuu guaaauaucc 11100 cggaaugauu ccacgcucuc uuggaucugu uugagcaguu guuuguucuc aucuaccuua 11160 cgagcggaag auuucucggc agaaaggauc aggccgcaua cauugaaugu caucucugca 11220 uaguuugcag acuuuagggc acgucuugca aacacauaac ucgcgucucg ggaugauucg 11280 aauucuugag cagacuggau uacaccaaga cucgucaaca auguagccau cucuuucaua 11340 gaugaugugu ucucuccuau gcccuuuuuu guugagucgg ucucuagacc cggguggauu 11400 gggcggccgu uggcuggaca aucugagaca gagcgggucc cuauuggugg uuuccggucu 11460 uugacccuga cggcgggggu guccccagag uugaugugcu cauccugugu agaugggggu 11520 uuuccuggug gugacccugu gcuguuguaa cgauucagcg guggggaccg ggugccaggc 11580 acgguugcug gaguaagagg uuuggaccca cuguugguag gucuucuuuu guuccuccgu 11640 agcacagccu cuucaaguuc ggggcuagga aucaccagga ccccaguuac ucuugcacua 11700 ugugagcugc caggcuccau gcuucuucca uuauuacuug cuccaccuuc uccuucauca 11760 gguagggaug uacuuccucg uaccucuucu ggaaguccuu cagcuugguc uucuccccuc 11820 uuaucagggu gcgcagccau cucucuguuu ucaucuucaa uaccugaucu cggauauccu 11880 cucucauuug gaggauuuuc aaggauuccg gagucuccuc caucgcccag auccugagau 11940 acagaguuug uaccaguucu ucccccaaag gcccggugua uauuuuguuu aucaagguuu 12000 ccagcaugug cuucugccuc uggcuugcuu guucucccag agacucuacu cuccucaccu 12060 gaucgauuau cuugggucga cgguguugag acuucuccuu cgcccucacu uuuggcucua 12120 ugagcagagc cugguccuug gggaguguug augguguugu ggagccagcu ucuguccccu 12180 ccgaugucag uugguucacu cgacaggaca gcaucgagga auccgauaac auccgagagc 12240 gacucucguc cuccuggcgc cucccucuca acuucagaau cuucuuuaag aaugaaggca 12300 ucuugaucca ugcgguaagu guagccgaag ccguggcugu cucgacugcu gggugugguc 12360 ggugggguug gguguggccu ugccugagcc gaucggugga ugaacuuuca cccuaaguuu 12420 uucuuacuac ggaucaagua ccuugaagcc ucguaugauc cuagauuccu ccuaucccag 12480 cuacugcugc ggcaucguca ucuucgucau gaucgacacc guuauugcgg ccuucaucuc 12540 cauggguugc agaauccucu ugccgucucu cugcgagucu cauggcuauu cuucucucua 12600 ugucugauac auccucauca uugguuuccu ccucuaaccg uucagcccca uguaguguga 12660 caaaguggcc accacucacc ugacgugccc aucuuucacc acuaucucca ccccaacccc 12720 uagcguccug guccgcaugg gcuuuuguuu cuaggucgau gucggcauug ucuagagcua 12780 ccucaauugc accaccgccu guugguuugu gguaagcacc auccccaccg gacaaguuug 12840 ccagaugaug ucugagccuc cccuuggcug uauccgucac uccuaacuca ucuuccaagg 12900 cacugcugau cuucgauuca gcauccuuug ccacggcuug uccuaguaag aacauuucca 12960 uaucaaggua uguccucccu gugacguacu gcugcauugc cuuguucugu acgacggcga 13020 cucccauggc guaacuccau agugcaggau aauugccugg agcaaauuca ccaugaacag 13080 gguccuugag gauacagaua aagggagcuc uggggccuuu ugacagguag gugucuauga 13140 ggcuucuaag cuuauuaaua ucgggccuca gguuugacaa cguuagagcu gccaucuuug 13200 uuuccacccc auauuuaaua guguucauga aggaagccag cccugcaucu cggauguagu 13260 ucccaacgau cuggauguuc uucucuaaug uggugagauc agaucuugca guauucauag 13320 ucacaagggu cucaaccaug agagauacaa ggcuuugcug agaucucaua accgagccua 13380 uccccucaac ugucucccca gugaaaacua aggcaccuuu cacggugccg ucuugucuga 13440 acgccucuaa ccuguugaag aacccuuucc uuaagccggc gcugcuugug auggccuuca 13500 ccagcacaau ccagacuugg acaauuauug cuccuaggca ugcaggauac ccauagauuu 13560 gaaggagugu gucagggucu gcagcauccc guugacccug gaagaguggg cucuuguuga 13620 ccauaggucc aaacagccau ucuguggucc ucucauauuc cauaucucuc gucuucacaa 13680 ugaauccguc ugucuucguc cucuuagggu cuuucucuau guuguagauc acauauuuga 13740 caucggcguu uacuccguuu guugucaagu acaauucugg acuacuguaa gccauggcaa 13800 gcagagagac gaggaacccc ccucucugag agugcugcuu aucugugucc aaugagugag 13860 cuaggaaggu aguugcaaug aauaacuugu cugcaucauc agucacacuu gggccuagua 13920 cgaacacuga gacugugcuc cucuggccgg ggauaacagc accuccuccc gacuuauuaa 13980 uacuuucgcu ccuccuagag cuaaauguau cgaaggugcu caacaacccg gccaucguga 14040 agaucugcgg ccgcgaugaa cuuucacccu aaguuuuucu uacuacgguu aagucgcuau 14100 gacaacaccg cccaccauga guccaaugau ugcaccuuug uuugaaccca caucuucugc 14160 aaagaacacc aauuuuugau gaugaacuuc auauccugag ucaugucgga auucugcauc 14220 aagcgcccga gccguccagg cggccagcag gagcagugcc aaaccgggca gcauaaguga 14280 accuuggcgg ccgcgugaac uuuggcagca aagcaaaggg ucuggaaccu gcuccucagg 14340 guggauacuu ugacccuaaa auccuguaua acuucauuac auaucccaua cauguuuuuu 14400 cucuuguuug gu 14412 <210> 6 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> a start (S) sequence of minus strand RNA virus <400> 6 uuucacccu 9 <210> 7 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> a start (S) sequence of minus strand RNA virus <400> 7 uuugacccu 9 <210> 8 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> a start (S) sequence of minus strand RNA virus <400> 8 auucacccu 9 <210> 9 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a start (S) sequence of minus strand RNA virus <400> 9 tttcaccct 9 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a start (S) sequence of minus strand RNA virus <400> 10 tttgaccct 9 <210> 11 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a start (S) sequence of minus strand RNA virus <400> 11 attcaccct 9 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an end (E) sequence of minus strand RNA virus <400> 12 tttttcttac tacgg 15 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a spacer sequence <400> 13 cggccgcaga tcttcacg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a spacer sequence <400> 14 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplifing a Sendai virus genomic fragment <400> 15 gttgagtact gcaagagc 18 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplifing a Sendai virus genomic fragment <400> 16 tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplifing a Sendai virus genomic fragment <400> 17 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> a primer for amplifing a Sendai virus genomic fragment <400> 18 tgggtgaatg agagaatcag c 21 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 19 attgcggccg ccaaggttca cttatgctgc ccggtttggc actgctcctg 50 <210> 20 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 20 attgcggccg cgatgaactt tcaccctaag tttttcttac tacggttaag tcgctatgac 60 aacaccgccc accatgagtc c 81 <210> 21 <211> 248 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 21 gcggccgcca aggttcactt atgctgcccg gtttggcact gctcctgctg gccgcctgga 60 cggctcgggc gcttgatgca gaattccgac atgactcagg atatgaagtt catcatcaaa 120 aattggtgtt ctttgcagaa gatgtgggtt caaacaaagg tgcaatcatt ggactcatgg 180 tgggcggtgt tgtcatagcg acttaaccgt agtaagaaaa acttagggtg aaagttcatc 240 gcggccgc 248 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 22 acttgcggcc gccaaagttc aatgcctggc tcagcactgc tatgctgcct g 51 <210> 23 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 23 atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggttag cttttcattt 60 tgatcatcat gtatgcttc 79 <210> 24 <211> 596 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 24 gcggccgcca aagttcaatg cctggctcag cactgctatg ctgcctgctc ttactgactg 60 gcatgaggat cagcaggggc cagtacagcc gggaagacaa taactgcacc cacttcccag 120 tcggccagag ccacatgctc ctagagctgc ggactgcctt cagccaggtg aagactttct 180 ttcaaacaaa ggaccagctg gacaacatac tgctaaccga ctccttaatg caggacttta 240 agggttactt gggttgccaa gccttatcgg aaatgatcca gttttacctg gtagaagtga 300 tgccccaggc agagaagcat ggcccagaaa tcaaggagca tttgaattcc ctgggtgaga 360 agctgaagac cctcaggatg cggctgaggc gctgtcatcg atttctcccc tgtgaaaata 420 agagcaaggc agtggagcag gtgaagagtg attttaataa gctccaagac caaggtgtct 480 acaaggccat gaatgaattt gacatcttca tcaactgcat agaagcatac atgatgatca 540 aaatgaaaag ctaaccgtag taagaaaaac ttagggtgaa agttcatcgc ggccgc 596 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 25 aagcggccgc ctcaaacaag cacagatcat ggatg 35 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 26 aggcggccgc ttaattaacc aagcactcac aagg 34 <210> 27 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40 <210> 28 <211> 61 <212> PRT <213> artificial <220> <223> a polypeptide containing an A-beta fragmnet <400> 28 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His 20 25 30 Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala 35 40 45 Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 50 55 60 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 29 tgcttggtta attaagcttt cacctcaaac aagca 35 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 30 tgcttggtta attaagcggc cgcctcaaac aagca 35

Claims (28)

  1. 아밀로이드 β-암호화 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드가 IL-10 또는 이의 부분 펩타이드인 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터가 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 벡터인 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스(Sendai virus) 벡터인 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 아밀로이드 β가 Aβ43 또는 이의 부분 펩타이드인 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 아밀로이드 β가 사람으로부터 유래된 벡터.
  8. 제3항에 있어서, IL-10이 마우스 또는 사람으로부터 유래된 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 아밀로이드 β가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부분에 의해 암호화된 폴리펩타이드인 벡터.
  10. 제3항에 있어서, IL-10이 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드인 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 서열번호 5의 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, (i) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 발현가능한 방식으로 암호화하는 핵산, (ii) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드, 또는 (iii) Th2 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, Th2 사이토킨, 이의 부분 펩타이드, 또는 Th2 보조제를 포함하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 발현가능한 방식으로 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, Th2 사이토킨이 아밀로이드 β-암호화 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터에 의해 암호화된 조성물.
  17. 제15항에 있어서, Th2 사이토킨이 아밀로이드 β-암호화 핵산을 포함하는 (-) 쇄 RNA 바이러스 벡터이외의 다른 벡터에 의해 암호화된 조성물.
  18. 제12항에 있어서, 약학적 조성물인 조성물.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는, 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, (i) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 발현가능한 방식으로 암호화하는 핵산, (ii) Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드, 또는 (iii) Th2 보조제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 비강 투여용 약학 조성물.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 β의 침착을 감소시키는 방법.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 치료 또는 예방하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 투여가 비강내 투여인 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 투여가 근육내 투여인 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, Th2 사이토킨, 이의 부분 펩타이드, Th2 보조제, 또는 Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 암호화하는 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, Th2 사이토킨, 이의 부분 펩타이드, 또는 Th2 보조제를 투여하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, Th2 사이토킨 또는 이의 부분 펩타이드를 암호화하는 백터를 투여하는 방법.
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