KR20080021115A - 에리트로포이에틴 수용체 펩타이드 제형 및 용도 - Google Patents

에리트로포이에틴 수용체 펩타이드 제형 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴 수용체 (EPO-R)의 작용제인 펩타이드 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 펩타이드 화합물을 사용하여 부전(不全) 또는 결손 적혈구 세포 집단과 관련된 질환을 치료하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 투여량도 역시 제공된다.

Description

에리트로포이에틴 수용체 펩타이드 제형 및 용도 {ERYTHROPOIETIN RECEPTOR PEPTIDE FORMULATIONS AND USES}
2005년 6월 3일 출원된 미국 특허 가출원 번호 60/687,655에 대한 우선권을 주장한다. 이 우선 출원의 내용은 참조로서 그 내용 전체가 본 명세서에 통합된다.
본 발명은 에리트로포이에틴 수용체(erythropoietin receptor, EPO-R)의 작용제인 펩타이드 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 부전(不全) 또는 결손 적혈구 생산과 관련된 질병을 치료하기 위하여 그러한 펩타이드 화합물을 사용한 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 화합물을 포함하는 약학 조성물도 역시 제공된다.
에리트로포이에틴 (EPO)은 분자량이 약 34 킬로달톤 (kD)이고, 바람직하게는 24, 38, 83 및 126번 아미노산 위치가 글리코실화 자리인 165개의 아미노산으로 된 당단백질 호르몬이다. 그것은 23개 아미노산의 신호 펩타이드를 가진 전구체 단백질로서 최초로 생산된다. EPO는 α, β 및 아시알로(asialo)의 세 가지 형태로 발생할 수 있다. α 및 β 형은 그들의 탄수화물 성분에 있어서 약간의 차이가 있지만, 동일한 성능, 생물학적 활성 및 분자량을 갖는다. 아시알로형은 말단 탄수화물(시알산)이 제거된 α 또는 β 형태이다. EPO를 암호화하는 DNA 서열이 보고된바 있다 [미국 특허 번호 제4,703,008호 to Lin].
EPO는 유사분열과 적혈구(erythrocyte) 전구체 세포의 분화를 자극하여 적혈구가 생산되게 한다. 그것은 저산소 상태가 우세할 때 신장에서 생산된다. 적혈구 전구체 세포의 EPO 유도 분화가 일어나는 동안, 글로빈(globin) 합성이 유도되고; 헴(heme) 복합체 합성이 자극되며; 페리틴(ferritin) 수용체의 수가 증가한다. 이러한 변화는 세포가 좀더 많은 철을 흡수하도록 하여 성숙한 적혈구에 산소를 결합시키는 기능적인 헤모글로빈을 합성하도록 한다. 따라서, 적혈구 및 그들의 헤모글로빈은 신체에 산소를 공급하는 핵심 역할을 한다. 이러한 변화들은 EPO와 적혈구 전구체 세포의 표면에 존재하는 적절한 수용체 사이의 상호작용에 의해 개시된다 [예컨대, Graber and Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29:51-66를 참조].
신체가 건강한 상태일 때에는 EPO는 혈장에 매우 저 농도로 존재하여 존재하고 있는 수의 적혈구로부터 조직들이 충분한 산소를 받도록 한다. 이 정상적으로 낮은 EPO 농도는 노화로 인하여 통상적으로 상실되는 적혈구의 대체를 자극하는데 충분하다.
혈액 순환(circulation)에 있어서 EPO의 양은 혈액 순환에서 혈액 세포들에 의한 산소 수송이 감소할 때 저산소증(hypoxia) 상태 하에서 증가된다. 저산소증은 예를 들어 출혈을 통한 실재적인 혈액 손실에 의해, 방사선 과잉 노출에 의한 적혈구 세포의 파괴에 의해, 고소(high altitude) 또는 무의식의 지속에 의한 산소 흡입의 감소에 의해 또는 다양한 형태의 빈혈에 의해 야기될 수 있다. 그러한 저산소 스트레스에 대한 반응으로, 증가된 EPO 수치는 에리트로이드 전구 세포(erythroid progenitor cells)의 증식을 자극함으로써 적혈구 세포 생산을 증가시킨다. 혈액 순환에서 적혈구 세포의 수가 정상 조직의 산소 요구량보다 더 클 때, 혈액 순환에서 EPO 수준은 감소한다.
EPO가 적혈구 세포 형성 과정에서 필수적이기 때문에, 이 호르몬은 낮은 또는 불완전한 적혈구 세포 생산에 의해 특징지어지는 혈액 질환의 진단 및 치료 모두에 있어서 잠재적으로 유용한 적용성을 가진다. 최근 연구들이 다양한 질병 상태, 질환 및 혈액 불규칙 상태에 대한 EPO 치료법의 효능의 예측을 위한 기초를 제공해 주고 있으며, 여기에는 베타-지중해빈혈(beta-thalassemia) [Vedovato, et al. (1984) Acta. Haematol. 71:211-213 참조]; 낭성 섬유증(cystic fibrosis) [Vichinsky, et al. (1984) J. Pediatric 105:15-21 참조]; 임신 및 월경 질환 [Cotes, et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90:304-311 참조]; 미숙아 조기 빈혈 [Haga, et al (1983) Acta Pediatr. Scand. 72; 827-831 참조]; 척수 손상 [Claus-Walker, et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65:370-374 참조]; 우주 비행 [Dunn, et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52:178-182 참조]; 급성 혈액 손실 [Miller, et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52:545-590 참조]; 노화 [Udupa, et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103:574-580 and 581-588 및 Lipschitz, et al. (1983) Blood 63:502-509 참조]; 비정상적인 적혈구 생성에 의해 동반되는 다양한 종양 질병 상태들 [Dainiak, et al. (1983) Cancer 5:1101-1106 및 Schwartz, et al. (1983) Otolaryngol. 109:269-272 참조]; 및 신부전 [Eschbach. et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316:73-78 참조]이 포함된다.
정제된 균질 EPO가 특징지어진바 있다 [U.S. Pat. No. 4,677,195 to Hewick]. EPO를 암호화하는 DNA 서열이 정제, 클로닝 및 발현되어 천연 EPO와 동일한 생화학적 및 면역학적 특성을 가진 재조합 폴리펩타이드가 생산되었다. 천연 EPO에서의 올리고당류와 동일한 올리고당류를 가진 재조합 EPO 분자가 또한 생산된 바 있다 [Sasaki, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059-12076 참조].
EPO의 생물학적 효과는 부분적으로 세포막 결합 수용체와의 상호작용을 통하여 매개되는 것으로 나타난다. 마우스의 지라에서 분리한 미성숙 에리트로이드 세포를 이용한 초기 연구들은 EPO 결합 세포 표면 단백질이 각각 대략 85,000 달톤과 100,000 달톤의 분자량을 가진 두 개의 폴리펩타이드를 포함한다는 것을 제시하였다 [Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694]. EPO 결합 위치의 수는 세포 표면당 평균 800 내지 1000 개로 계산되었다. 이들 결합 부위들 중에서, 약 300 개는 약 90 pM (피코몰)의 Kd로 EPO와 결합하였고, 나머지는 약 570 pM의 감소된 친화도로 EPO에 결합하였다 [Sawyer, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5554-5562]. 또 다른 연구에서는 프랜드 백혈병 바이러스(Friend leukemia virus)의 빈혈 균주(FVA)를 마우스에 주입하여 제조된 EPO 반응성 지라 적혈구 모세포(EPO-responsive splenic erythroblasts)는 각각 약 100 pM 및 800 pM의 Kd 값을 가진 총 약 400개 이상의 낮은 친화도의 EPO 결합 위치를 가진다는 것을 제안하였다 [Landschulz, et al. (1989) Blood 73:1476-1486].
그 이후의 연구들은 두 가지 형태의 EPO 수용체 (EPO-R)가 하나의 유전자에 의해 암호화된다는 것을 보여주었다. 이 유전자는 클로닝된 바 있다 [예컨대 Jones, et al. (1990) Blood 76, 31-35; Noguchi, et al. (1991) Blood 78:2548-2556; Maouche, et al. (1991) Blood 78:2557-2563 참조]. 예를 들어, 마우스 및 인간의 EPO-R 단백질의 DNA 서열 및 암호화된 펩타이드 서열은 디앙드레 등 (D'Andrea, et al.)의 PCT 공개 번호 WO 90/08822에 기재되어 있다. 현재의 모델들은 EPO와 EPO-R의 결합이 두 개의 EPO-R 분자들의 이량체화 및 활성화를 가져오고, 이는 신호 전달의 후속 단계들을 초래한다는 것을 제시한다 [예컨대, Watowich, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2140- 2144 참조].
EPO-R의 클로닝된 유전자들의 이용은 이 중요한 수용체의 작용제 및 길항제에 대한 검색을 용이하게 해준다. 재조합 수용체 단백질의 이용은 다양한 랜덤 및 준랜덤 펩타이드 다양성 생성 시스템(random and semi-random peptide diversity generation systems)에 있어서 수용체-리간드 상호작용의 연구를 가능하게 해준다. 이들 시스템은 다음을 포함한다: "플라스미드 상의 펩타이드" 시스템, [미국 특허 제6,270,170호에 기재되어 있음]; "파아지 상의 펩타이드" 시스템 [미국 특허 제5,432,018호 및 Cwirla, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382에 기재되어 있음]; "암호화된 합성 라이브러리" (ESL) 시스템 [1992년 9월 16일 출원된 미국 특허 출원 제946,239호에 기재되어 있음]; 및 "대규모의 고정된 폴리머 합성" 시스템 [미국 특허 제5,143,854호; PCT 공개 90/15070호; Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773; Dower and Fodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem. 26:271-180; 및 미국 특허 제5,424,186호].
적어도 어느 정도로는 EPO-R과 상호작용하는 펩타이드가 동정되었고, 예를 들어 링톤 등(Wrighton et al.)의 미국 특허 제5,773,569호, 제5,830,851호 및 제5,986,047호; 링톤 등(Wrighton et al.)의 PCT 공개 WO 96/40749; 존슨 및 지빈(Johnson and Zivin)의 미국 특허 제5,767,078호 및 PCT 공개 96/40772; 발루(Balu)의 PCT 공개 WO 01/38342; 및 스미스-스윈토스키 등(Smith-Swintosky et al.)의 WO 01/91780 등의 문헌에 기재되어 있다. 특히, 펩타이드 모티프를 함유하는 펩타이드 그룹이 동정된 바 있는데, 이러한 그룹의 일원들은 EPO-R에 결합하고 EPO 의존 세포 증식을 자극한다. 그 모티프를 함유하는 것으로 동정된 펩타이드는 EC50 값이 약 20 나노몰(nM) 내지 250 nM으로 시험관 내(in vitro)에서 EPO 의존 세포 증식을 자극한다. 따라서, 20 nM 내지 250 nM의 펩타이드 농도가 EPO에 의해 자극되는 최대 세포 증식의 50%를 자극하는데 요구된다. EPO 수용체에 결합하는 또 다른 펩타이드 및 그의 구조물(constructs)이 미국 가출원 제60/470,244호, 제60/470,245호 및 제60/469,993호 (모두 2003년 5월 12일에 출원됨); 미국 가출원 제60/627,432호 및 제60/627,433호 (모두 2004년 11월 11에 출원됨); 미국 출원 제10/844,968호 (2004년 5월 12일에 출원됨); 및 국제출원 PCT/US2004/14886 및 PCT/US2004/014889 (모두 2004년 5월 12일에 출원되고, 각각 WO 2004/101611 및 WO 2004/101606로 공개됨)에 기재된 바 있다. 이들 각각의 출원들은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.
EPO-R 작용제의 막대한 잠재력을 감안하면, 이 수용체에 의해 매개되는 중요한 생물학적 활성의 연구 및 질병의 치료 양쪽 모두를 위하여, 강화된 능력 및 활 성을 갖는 펩타이드 EPO-R 작용제의 동정이 요구된다. 본 발명은 그러한 화합물을 제공한다.
이번 섹션에서 및 명세서 전체를 통하여 인용된 참조문헌의 인용 및/또는 논의는 단지 본 발명의 기재 내용을 명확히 하기 위하여 제공되는 것이고, 그러한 모든 인용문헌이 본 발명의 "선행 기술"임을 자인하는 것이 아니다.
발명의 요약
본 발명은 극적으로 증가된 능력 및 활성이 있는 EPO-R 작용제인 신규한 펩타이드 화합물을 제공한다. 이들 펩타이드 화합물은 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)인 펩타이드 단량체의 동종이량체(homodimers), 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)인 펩타이드 단량체의 동종이량체 또는 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO: 3)인 펩타이드 단량체의 동종이량체로서, 여기서 각 아미노산은 표준 1 문자 약어에 의하여 표시된 것이고, "(AcG)"는 N-아세틸글리신이며, "(1-nal)"은 1-나프틸알라닌이고, "(MeG)"는 사르코신으로도 알려져 있는 N-메틸글리신이다. 펩타이드 이량체의 각 펩타이드 단량체는 단량체의 시스테인 잔기들 사이에서 분자 내 이황화결합을 함유한다.
펩타이드 단량체는 분지형 3차 아미드 링커(branched tertiary amide linker)에 공유적인 부착에 의하여 이량체화될 수 있다. 상기 3차 아미드 링커는 다음과 같이 나타낼 수 있다.
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
식 중, X는 NCO-(CH2)2-N1H- 이고, 링커의 C1은 제1 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며, 링커의 C2는 제2 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하고, X의 N1은 카르바메이트(carbamate) 결합 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티(moiety)에 결합되는데, 여기서 상기 PEG는 분자량이 약 20,000 내지 약 40,000 달톤인 것이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다).
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 링커의 N1이 카르바메이트 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00001
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 링커의 N1이 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00002
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 링커의 N1이 카르바메이트 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00003
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 링커의 N1이 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00004
펩타이드 단량체는 또한 분지형 3차 아미드 링커에 공유적인 부착에 의해 이량체화 될 수 있다. 상기 3차 아미드 링커는 다음과 같이 나타낼 수 있다.
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
식 중, X는 NCO-(CH2)2-NH-C3O- 이고, 링커의 C1은 제1 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며, 링커의 C2는 제2 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성한다. 본 발명의 펩타이드 이량체는 다음과 같은 구조의 스페이서 모이어티를 더 포함한다:
-N1H-(CH2)4-C4H-N2H-
식 중, 상기 스페이서의 C4는 X의 C3에 공유적으로 결합되고, 상기 스페이서의 N1은 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 공유적으로 부착되며, 상기 스페이서의 N2는 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티(moiety)에 결합되는데, 여기서 상기 PEG는 분자량이 약 10,000 내지 약 50,000 달톤인 것이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 각각의 PEG 모이어티는 독립적으로 10,000 달톤 (10 kD), 20 kD, 30 kD, 40 kD 또는 50 kD일 수 있다.
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 상기 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 카르바메이트 결합을 통하여 활성화된 PEG 모이어티에 공유적으로 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00005
바람직한 구체적인 예에 있어서, 두 개의 펩타이드 단량체의 C-말단 리신은 L-리신이다. 또한, 당해 기술 분야의 숙련자는 상기 화학 구조식으로부터 두 개의 선형 PEG 부분이 바람직하게는 역시 L-리신이고 다음과 같은 입체화학을 만드는 리신 (예컨대, mPEG2-Lys-NHS 또는 mPEG2-리신올-NPC로서)에 의하여 연결된다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
Figure 112008000507936-PCT00006
그 대신에, 상기 1개 이상의 리신 잔기는 또 다른 입체 화학들을 만드는 D-리신일 수 있고, 이는 당해 기술 분야의 숙련자에게 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 상기 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 아미드 결합을 통하여 활성화된 PEG 모이어티에 공유적으로 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00007
또한, 바람직하게는 이러한 분자에서의 리신 분자들이 모두 L-리신일 때, 다음과 같은 입체화학을 만든다.
Figure 112008000507936-PCT00008
그 대신에, 상기 1개 이상의 리신 진기들을 D-리신일 수 있고, 이때에는 당해 기술 분야의 숙련자들이라면 용이하게 인식할 수 있는 또 다른 입체화학들을 만들 수 있다.
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 상기 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 카르바메이트 결합을 통하여 활성화된 PEG 모이어티에 공유적으로 부착되며, 여기서 Y는 카르바메이트기일 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00009
바람직하게는, 이러한 분자에서 펩타이드 단량체와 선형 PEG 모이어티를 연결하는 상기 라이신 잔기들은 모두 L-리신이고, 이때 다음과 같은 입체화학을 만든다:
Figure 112008000507936-PCT00010
그 대신에, 1 이상의 상기 리신 잔기는 D-리신일 수 있고, 이때에는 당해 기술 분야의 숙련자들이라면 용이하게 인식할 수 있는 또 다른 입체화학들을 만들 수 있다.
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 상기 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 아미드 결합을 통하여 활성화된 PEG 모이어티에 공유적으로 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00011
바람직하게는, 이러한 분자에서 펩타이드 단량체와 선형 PEG 모이어티를 연결하는 상기 라이신 잔기들은 모두 L-리신이고, 이때 다음과 같은 입체화학을 만든다:
Figure 112008000507936-PCT00012
하나의 구체적인 예에서, 1 이상의 상기 리신 잔기는 D-리신일 수 있고, 이때에는 당해 기술 분야의 숙련자들이라면 용이하게 인식할 수 있는 또 다른 입체화학들을 만들 수 있다.
상기 펩타이드 단량체들은 또한 리신 링커에 부착에 의하여 이량체화 될 수 있는데, 그에 따라 제1 펩타이드 단량체는 그의 C-말단에서 리신의 ε-아미노기에 부착되고, 제2 펩타이드 단량체는 그의 C-말단에서 리신의 α-아미노기에 부착된다.
상기 본 발명의 펩타이드 이량체는 다음과 같은 구조의 스페이서 모이어티를 더 포함한다:
-N1H-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N2H-
한쪽 말단에서, 상기 스페이서의 N1은 아미드 결합을 통하여 리신 링커의 카르보닐 탄소에 부착된다. 반대쪽 말단에서, 상기 스페이서의 N2는 카르바메이트 결합 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는데, 여기서 상기 PEG는 분자량이 약 20,000 내지 약 40,000 달톤인 것이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다).
상기 스페이서가 카르바메이트 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물 (SEQ ID NO: 3)은 다음과 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112008000507936-PCT00013
상기 스페이서가 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착될 때, 본 발명의 신규한 펩타이드 화합물 (SEQ ID NO: 3)은 다음과 같이 나타낼 수 있다.
Figure 112008000507936-PCT00014
본 발명은 상기 펩타이드 화합물들을 사용하여 다양한 의학적 상태들을 치료하기 위한 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 상기 화합물 중 하나를 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것에 의하여, 에리트로포이에틴의 결핍 또는 낮은 또는 결함있는 적혈구 세포 집단으로 특징지어지는 질환을 가진 환자를 치료하는 것을 포함한다. 구체적인 예에서, 상기 질환은 말기 신부전 또는 투석; AIDS, 자가 면역 질환 또는 악성종양(malignancy)과 관련된 빈혈; 베타-지중해빈혈; 낭성섬유증; 미숙아의 조기 빈혈 (early anemia of prematurity); 만성 염증성 질병과 관련된 빈혈; 척수손상; 급성실혈(急性失血); 노화; 또는 적혈구생성 이상과 관련된 종양성 질환이다. 더욱이, 특정 구체적인 예에서, 상기 질환은 신부전 또는 투석이고, 상기 치료적 유효량은 환자 몸무게 1 kg 당 상기 화합물 0.025 내지 0.2 mg의 투여량이다. 다른 구체적인 예에서, 상기 질환은 신부전 또는 투석이고, 상기 치료적 유효량은 환자 몸무게 1 kg 당 상기 화합물 0.05 내지 0.1 mg의 투여량이다. 특정 구체적인 예에서, 상기 질환은 악성종양과 관련된 빈혈이고, 상기 치료적 유효량은 환자 몸무게 1 kg 당 상기 화합물 0.075 내지 0.5 mg의 투여량이다. 다른 구체적인 예에서, 상기 질환은 악성종양과 관련된 빈혈이고, 상기 치료적 유효량은 환자 몸무게 1 kg 당 상기 화합물 0.02 내지 0.4 mg의 투여량이다. 상기 치료적 유효량은 매 3∼4 주에 한 번씩 투여될 수 있다.
본 발명은 상기 펩타이드 화합물들을 포함하는 약학적 조성물을 또한 제공한다. 특정 구체적인 예에서, 상기 PEG는 분자량이 약 20,000 달톤이다. 다른 구체적인 예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 화합물들 중의 어느 하나 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
발명의 상세한 설명
정의:
펩타이드의 아미노산 잔기는 다음과 같이 약어로 표시된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F; 루신은 Leu 또는 L; 이소루신은 Ile 또는 I; 메티오닌은 Met 또는 M; 발린은 Val 또는 V; 세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P; 트레오닌은 Thr 또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A; 티로신은 Tyr 또는 Y; 히스티딘은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q; 아스파라긴은 Asn 또는 N; 리신은 Lys 또는 K; 아스파르트산은 Asp 또는 D; 글루탐산은 Glu 또는 E; 시스테인은 Cys 또는 C; 트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R; 글리신은 Gly 또는 G. 펩타이드 내의 비통상적인 아미노산은 다음과 같이 약어로 표시된다: 1-나프틸알라닌은 1-nal 또는 Np; N-메틸글리신 (사르코신으로도 알려짐)은 MeG 또는 Sc; 아세틸화 글리신 (N-아세틸글리신)은 AcG.
본 명세서에서 사용되는 "폴리펩타이드" 또는 "프로테인"이라는 용어는 알파 아미노산들이 아미드 결합을 통하여 서로 연결된 아미노산 단량체의 중합체를 말한다. 따라서, 폴리펩타이드는 길이가 적어도 2개의 아미노산 잔기인 것 및 통상적으로 더 긴 것이다. "펩타이드"라는 용어는 통상적으로 길이가 단지 수개의 아미노산 잔기인 폴리펩타이드를 말한다. 본 발명의 신규의 EPO-R 작용제 펩타이드는 바람직하게는 길이가 50개 아미노산 잔기 이하이다. 이들은 길이가 약 17개 내지 약 40개 아미노산 잔기인 것이 더욱 바람직하다. 펩타이드와 대조적으로 폴리펩타이드는 어떠한 수의 아미노산 잔기도 모두 포함할 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드라는 용어는 펩타이드 뿐만 아니라 더 긴 아미노산들의 서열도 포함한다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한"이라는 표현은 "일반적으로 안전한 것으로 간주되는", 예컨대 생리학적으로 관용되고, 인간에게 투여되었을 때 급성위연동이상항진(gastric upset), 현기증 등과 같은 알레르기성 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 일반적으로 일으키지 않는 분자적 실재(molecular entities) 및 조성물을 말한다. 바람직하게는 본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한"이라는 용어는 미국 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전 또는 동물에게의 사용을 위한 및 더 구체적으로는 인간에게의 사용을 위한 기타의 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. "담체"라는 용어는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 운반체(vehicle)를 말한다. 이러한 약학적 담체는 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일을 포함하는 오일과, 물 등의 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 용액, 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 담체로서 바람직하게 사용되고, 특히 주사 용액으로서 사용된다. 적절한 약학적 담체는 E.W. 마틴 (E.W. Martin)의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "작용제"라는 용어는 그의 상보적인 생물학적 활성 수용체에 결합하고, 상기 수용체를 활성화시켜 수용체에서 생물학적 반응을 일으키거나 수용체에 이미 존재하는 생물학적 반응을 증강시키는 생물학적으로 활성인 리간드를 말한다.
EPO -R 작용제인 신규의 펩타이드
본 발명은 극적으로 증강된 능력 및 활성의 EPO-R 작용제인 신규의 펩타이드 화합물을 제공한다. 이들 펩타이드 화합물은 아미노산 서열 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)를 가지는 펩타이드 단량체의 동종이량체 또는 아미노산 서열 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)를 가지는 펩타이드 단량체의 동종이량체로서, 여기서, 각각의 아미노산은 표준 1 문자 약어로서 표현된 것이고, "(AcG)"는 N-아세틸글리신이며, "(1-nal)"은 1-나프틸알라닌이고, "(MeG)"는 사르코신으로도 알려져 있는 N-메틸글리신이다. 펩타이드 이량체의 각 펩타이드 단량체는 그 단량체의 시스테인 잔기들 사이에 분자내 이황화결합을 함유한다. 이러한 단량체는 다음과 같이 도식적으로 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00015
이들 단량체 펩타이드는 이량체화되어 증가된 EPO-R 작용제 활성의 펩타이드 이량체를 제공한다. 링커 (LK) 모이어티는 각각의 단량체의 C-말단 리신 잔기에 동시에 부착되어 두 개의 펩타이드 단량체의 C-말단을 연결하는 분지형 3차 아미드이다. 상기 3차 아미드 링커는 다음과 같이 표현할 수 있다:
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
식 중, X는 NCO-(CH2)2-N1H- 이고, 링커의 C1은 제1 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며, 링커의 C2는 제2 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하고, X의 N1은 카르바메이트(carbamate) 결합 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티(moiety)에 결합되는데, 여기서 상기 PEG는 분자량이 약 20,000 내지 약 40,000 달톤인 것이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다).
상기 3차 아미드 링커는 또한 다음과 같이 표현할 수 있다:
-C1O-CH2-X-CH2-C2O-
식 중, X는 NCO-(CH2)2-NH-C3O- 이고, 링커의 C1은 제1 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성하며, 링커의 C2는 제2 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기와 아미드 결합을 형성한다. 본 발명의 펩타이드 이량체는 다음과 같은 구조의 스페이서 모이어티를 더 포함한다:
-N1H-(CH2)4-C4H-N2H-
식 중, 상기 스페이서의 C4는 X의 C3에 공유적으로 결합되고, 상기 스페이서의 N1은 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 공유적으로 부착되며, 상기 스페이서의 N2는 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통하여 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 결합되는데, 여기서 상기 PEG는 분자량이 약 10,000 내지 약 60,000 달톤인 것이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다).
따라서, 본 발명의 신규의 펩타이드는 카르바메이트 결합 또는 아미드 결합을 통하여 펩타이드 이량체의 3차 아미드 링커에 공유적으로 부착된 PEG 모이어티를 또한 함유할 수 있다. PEG는 약학적으로 허용가능한 수용성(水溶性) 중합체이다. 본 발명에서의 사용을 위한 PEG는 분자량이 약 20 킬로달톤 (20 K) 내지 약 60 K인 선형, 비분지형 PEG일 수 있다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 가장 바람직하게는, PEG는 분자량이 약 30 K 내지 약 40 K인 것이다. 당해 기술 분야의 숙련자는 목적하는 투여량; 순환 시간; 단백질 분해에 대한 저항성; 만약 존재한다면 생물학적 활성에 대한 효과; 취급의 용이성; 항원성의 정도 및 결핍; 및 치료적 펩타이드에 대한 PEG의 기타의 알려진 효과 등의 고려에 기초하여 목적하는 중합체 크기를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 펩타이드, 펩타이드 이량체 및 기타의 펩타이드 기재 분자는 수용성(水溶性) 중합체 (예컨대, PEG)를 그 분자의 수용체 결합 부분에 결합시키기 위한 모든 다양한 화학을 사용하여 수용성 중합체에 부착시킬 수 있다 (예컨대, 펩타이드 + 스페이서). 일반적인 구체적인 예에서는 수용성 중합체의 수용체-결합 부분에 공유적 부착을 위한 단일 부착 정션(single attachment junction)을 사용하지만, 또 다른 구체적인 예에서는 별개의 부착 정션에서 수용체 결합 부분에 부착되는 추가의 변형을 포함하는 다중 부착 정션을 사용할 수 있고, 이는 스페이서 및/또는 하나 또는 양쪽 펩타이드 사슬에 공유적 부착 정션(들)을 포함할 수 있다. 일부 구체적인 예에서는, 이량체 또는 더 높은 차수의 다합체는 다른 종의 펩타이드 사슬을 포함할 것이다 (즉, 이종이량체 또는 기타의 이종다합체). 한정을 위해서가 아니라 예로서, 이량체는 PEG 부착 정션을 가지는 제1 펩타이드 사슬을 포함할 수 있고, 제2 펩타이드 사슬은 PEG 부착 정션이 결핍되거나 또는 제1 펩타이드 사슬과 상이한 결합 화학을 이용할 수 있으며, 일부 변형들에 있어서 스페이서는 PEG 부착 졍션을 함유하거나 결핍될 수 있고, 상기 스페이서는 만약 PEG화(PEGylated) 되었다면 제1 및/또는 제2 펩타이드 사슬의 그것과 상이한 결합 화학을 이용할 수 있다. 또 다른 구체적인 예에서는 수용체 결합 부분의 스페이서 부분에부착된 PEG 및 분자의 펩타이드 부분의 아미노산 중 하나의 측쇄에 접합된(conjugated) 다른 수용성 중합체 (예컨대, 탄수화물)를 사용한다.
광범위한 종류의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 수용체 결합 부분 (펩타이드 + 스페이서)의 PEG화를 위해 사용될 수 있다. 실질적으로 모든 적합한 반응성 PEG 시약이 사용될 수 있다. 바람직한 구체적인 예에서, 상기 반응성 PEG 시약은 수용체 결합 부분과의 접합에 있어서 카르바메이트 또는 아미드 결합의 형성을 가져올 것이다. 적절한 반응성 PEG 화학종들은 NOF사(社) (일본 도쿄 150-6019 시부야-구 20-3 에비수 4-쵸메 예비수 가든 플레이스 타워)의 약물 전달 시스템 카탈로그 (2003) 및 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics) (미국 알라바마 35806 헌츠빌 디스커버리 드라이브 490)의 분자 공학 카탈로그 (2003)에서 시판 중인 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 비제한적인 예로서, 다음의 PEG 시약들이 다양한 실시상태에서 빈번하게 선호된다: mPEG2-NHS, mPEG2-ALD, multi-Arm PEG, mPEG(MAL)2, mPEG2(MAL), mPEG-NH2, mPEG-SPA, mPEG-SBA, mPEG-티오에스테르, mPEG-더블 에스테르, mPEG-BTC, mPEG-ButyrALD, mPEG-ACET, 이종관능성(heterofunctional) PEGs (NH2-PEG-COOH, Boc-PEG-NHS, Fmoc-PEG-NHS, NHS-PEG-VS, NHS-PEG-MAL), PEG 아크릴레이트 (ACRL-PEG-NHS), PEG-포스포리피드 (예컨대, mPEG-DSPE), 당해 기술 분야의 숙련자에 의해서 선택된 화학에 의해 활성화된 글리세린 기재 PEGs의 GL 시리즈를 포함하는 SUNBRITE 시리즈의 멀티암(multiarmed) PEGs, 임의의 SUNBRITE 활성화 PEGs (카르복실-PEGs, p-NP-PEGs, 트레실-PEGs, 알데하이드 PEGs, 아세탈-PEGs, 아미노-PEGs, 티올-PEGs, 말레이미도-PEGs, 히드록실-PEG-아민, 아미노-PEG-COOH, 히드록실-PEG-알데하이드, 카르복실릭 안하이드라이드 타입-PEG, 관능화된 PEG-포스포리피드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 것) 및 그들의 특정 응용 및 용례를 위하여 당해 기술 분야의 숙련자에 의해서 선택된 기타의 유사한 및/또는 적합한 반응성 PEGs.
본 발명의 신규의 펩타이드는 카르바메이트 또는 아미드 결합을 통하여 스페이서 모이어티에 공유적으로 부착된 두 개의 PEG 모이어티를 또한 함유할 수 있는데, 여기서 상기 스페이서 모이어티는 펩타이드 이량체의 3차 아미드 링커에 공유적으로 결합된 것이다. 본 발명의 이러한 구체적인 예에서 사용된 상기 두 개의 PEG 모이어티 각각은 선형일 수 있고, 부착 단일 지점(single point of attachment)에서 함께 연결될 수 있다. 각각의 PEG 모이어티는 바람직하게는 분자량이 약 10 킬로달톤 (10 K) 내지 약 60 K이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 선형 PEG 모이어티는 특히 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 두 개의 PEG 모이어티 각각은 분자량이 약 20 K 내지 약 40 K이고, 또한 더욱 바람직하게는 약 20 K 내지 약 40 K이다. 더욱더 바람직하게는, 상기 두 개의 PEG 모이어티 각각은 분자량이 약 20 K이다. 당해 기술 분야의 숙련자는 목적하는 투여량; 순환 시간; 단백질 분해에 대한 저항성; 만약 존재한다면 생물학적 활성에 대한 효과; 취급의 용이성; 항원성의 정도 또는 결핍; 및 치료적 펩타이드에 대한 PEG의 기타의 알려진 효과 등의 고려에 기초하여 목적하는 중합체 크기를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명은 아미노산 서열 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG) (SEQ ID NO: 3)를 가지는 펩타이드 단량체의 동종이량체인 펩타이드 작용제를 또한 포함하는데, 여기서 각 아미노산은 표준 1 문자 약어에 의하여 표시된 것이고, "(AcG)"는 N-아세틸글리신이며, "(1-nal)"은 1-나프틸알라닌이고, "(MeG)"는 사르코신으로도 알려져 있는 N-메틸글리신이다. 상기 펩타이드 이량체의 각 펩타이드 단량체는 그 단량체의 시스테인 잔기들 사이의 분자내 이황화결합을 함유한다. 그러한 단량체는 다음과 같이 도식적으로 표현될 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00016
이들 단량체 펩타이드는 이량체화되어 증가된 EPO-R 작용제 활성의 펩타이드 이량체를 제공한다. 링커 (LK) 모이어티는 각 단량체의 C-말단 아미노산에 동시적인 부착에 의하여 두 개의 펩타이드 단량체의 C-말단들을 연결하는 리신 잔기이다. 제1 펩타이드 단량체는 그의 C-말단에서 리신의 ε-아미노기에 부착되고, 제2 펩타이드 단량체는 그의 C-말단에서 리신의 α-아미노기에 부착된다. 예를 들어, 상기 이량체는 아래 화학식 I에 표시한 것처럼 구조적으로 도해할 수 있고, 아래 화학식 II에서 표현한 것처럼 축약할 수 있다.
Figure 112008000507936-PCT00017
상기 화학식 I 및 화학식 II 중, N2는 리신의 ε-아미노기의 질소 원자를 나타내고, N1은 리신의 α-아미노기의 질소 원자를 나타낸다.
본 발명의 펩타이드 이량체은 다음 구조의 스페이서 모이어티를 더 포함한다:
-N1H-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N2H-
한쪽 말단에서, 상기 스페이서의 N1은 아미드 결합을 통하여 리신 링커의 카르보닐 탄소에 결합된다. 반대쪽 말단에서, 상기 스페이서의 N2는 카르바메이트 결합 또는 아미드 결합을 통해서 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 연결되는데, 여기서 상기 PEG는 분자량이 약 10,000 내지 약 60,000 달톤인 것이다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 더욱 바람직하게는, 상기 PEG는 분자량이 약 20,000 내지 40,000 달톤이다.
따라서, 본 발명의 신규의 펩타이드는 펩타이드 이량체에 공유적으로 부착된 PEG 모이어티를 또한 함유한다. PEG는 약학적으로 허용가능한 수용성(水溶性) 중합체이다. 본 발명에서의 사용을 위한 PEG는 분자량이 약 20 킬로달톤 (20 K) 내지 약 60 K인 선형, 비분지형 PEG일 수 있다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 가장 바람직하게는, 상기 PEG는 분자량이 약 20 K 내지 약 40 K이고, 또한 더욱 바람직하게는 분자량이 약 30 K 내지 약 40 K이다. 당해 기술 분야의 숙련자는 목적하는 투여량; 순환 시간; 단백질 분해에 대한 저항성; 만약 존재한다면 생물학적 활성에 대한 효과; 취급의 용이성; 항원성의 정도 또는 결핍; 및 치료적 펩타이드에 대한 PEG의 기타의 알려진 효과 등의 고려에 기초하여 목적하는 중합체 크기를 선택할 수 있을 것이다.
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 링커의 N1이 카르바메이트 결합을 통하여 활성화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00018
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 링커의 N1이 아미드 결합을 통하여 활성화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00019
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 링커의 N1이 카르바메이트 결합을 통하여 활성화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00020
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 링커의 N1이 아미드 결합을 통하여 활성화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00021
본 발명의 바람직한 펩타이드 이량체는 다음과 같은 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112008000507936-PCT00022
Figure 112008000507936-PCT00023
Figure 112008000507936-PCT00024
Figure 112008000507936-PCT00025
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 카르바메이트 결합을 통하여 활성화 PEG 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00026
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK (SEQ ID NO: 1)이고, 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 아미드 결합을 통하여 활성화 PEG 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00027
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 카르바메이트 결합을 통하여 활성화 PEG 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00028
동종이량체의 각 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)이고, 스페이서의 N1 및 N2 양쪽 모두가 아미드 결합을 통하여 활성화 PEG 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00029
본 발명의 바람직한 펩타이드 이량체는 아래의 것을 포함하지만, 이해 한정되는 것은 아니다.
Figure 112008000507936-PCT00030
Figure 112008000507936-PCT00031
Figure 112008000507936-PCT00032
Figure 112008000507936-PCT00033
Figure 112008000507936-PCT00034
Figure 112008000507936-PCT00035
Figure 112008000507936-PCT00036
스페이서가 카르바메이트 결합을 통하여 활성화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물 (SEQ ID NO: 3)은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00037
스페이서가 아미드 결합을 통하여 활성화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티에 부착되는 경우, 본 발명의 신규의 펩타이드 화합물 (SEQ ID NO: 3)은 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00038
이러한 이량체성 구조는 [Ac-펩타이드, 이황화]2Lys-스페이서-PEG20 -40K로 표현할 수 있는데 이는 리신의 α- 및 ε-아미노기 양쪽에 결합된 각각 분자내 이황화 고리를 함유하는 N-말단 아세틸화 펩타이드 및 리신의 C-말단과 PEG 모이어티 사이에서 공유결합을 형성시키는 스페이서 분자를 나타내고, 상기 PEG는 분자량이 약 20,000 내지 약 40,000 달톤인 것을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 펩타이드 이량체는 아래의 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112008000507936-PCT00039
Figure 112008000507936-PCT00040
20개의 일반 아미노산의 입체이성질체(stereoisomers) (예컨대, D-아미노산), 비자연적(unnatural) 아미노산, 예컨대 a,a-이치환 아미노산(a,a-disubstituted amino acids), N-알킬 아미노산, 락트산(lactic acid) 및 기타의 비통상적인 아미노산이 또한 본 발명의 화합물의 적합한 성분이 될 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는 β-알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-히드록시프롤린, O-포스포세린, N-메틸글리신, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, nor-루신 및 기타의 유사한 아미노산 및 이미노산을 를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 아미노 말단의 변형, 카르복시 말단의 변형, 1개 또는 그 이상의 자연적으로 발생하는 유전학적으로 암호화된 아미노산의 비통상적인 아미노산으로의 치환, 1개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 측쇄의 변형, 펩타이드 인산화 등을 포함하는 기타의 변형이 또한 가능하다.
본 발명의 펩타이드 서열은 단독으로 또는 펩타이드 사슬의 N-말단 및/또는 C-말단 확장(extensions)과 함께 존재할 수 있다. 그러한 확장은 필요에 따라 비자연적으로 발생하는 서열과 함께 또는 실질적으로 비자연적으로 발생하는 서열이 없는 자연적으로 암호화된 펩타이드 서열일 수 있고; 그 확장은 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 목적하는 바에 따라 임의의 첨가, 결실, 점돌연변이 또는 기타의 서열 변형 또는 조합을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 자연적으로 발생하는 서열은 전장 또는 부분 길이일 수 있고, 아미노산 치환을 포함하여 탄수화물, PEG, 기타의 중합체의 결합을 위한 자리를 제공하거나 또는 측쇄 접합을 통하여 이와 유사한 것을 제공할 수 있다. 한가지 변형에서는, 아미노산 치환은 인간 면역 시스템에 적합하도록 만들기 위한 서열의 인간화(humanization)을 가져온다. 비면역글로불린 스페이서 서열과 함께 또는 비면역글로불린 스페이서 서열 없이 본 발명의 EPO-R 활성화 서열에 인접하거나 또는 매우 근접한 면역글로불린 서열을 포함하는 모든 종류의 융합 단백질이 제공된다. 한가지 종류의 구체적인 예는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변(V) 부위 대신에 EPO-R 활성화 서열을 가지는 면역글로불린 체인이다.
본 발명의 펩타이드 화합물의 제조:
펩타이드 합성
본 발명의 펩타이드는 당해 기술 분야에 공지의 전형적인 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이들 표준적 방법은 배제 고상 합성법(exclusive solid phase synthesis), 부분적 고상 합성법(partial solid phase synthesis methods), 단편 축합(fragment condensation), 전형적인 용액 합성법 및 재조합 DNA 기술 [예컨대, Merrifield J. Am. Chem. Soc. 1963 85:2149 참조]을 포함한다.
한 가지 구체적인 예에서, 펩타이드 이량체의 펩타이드 단량체는 독립적으로 합성되고, 합성에 이어 이량체화된다.
또 다른 구체적인 예에서는, 이량체의 펩타이드 단량체는 이들의 C-말단을 통하여 펩타이드 합성을 위한 개시 자리로서 제공될 수 있는 두 개의 작용기와 또 다른 분자 모이어티 (예컨대, 고형 지지체의 표면에 존재할 수 있는 것)에 결합할 수 있는 세 번째 작용기 (예컨대, 카르복실기 또는 아미노기)를 가지는 분지형 3차 아미드 링커 LK 모이어티에 의하여 결합된다. 이러한 경우, 고상 합성 기술의 변형으로서 2개의 단량체는 링커 LK 모이어티의 2개의 반응성 질소기 위에서 직접적으로 합성될 수 있다. 이러한 합성은 순차적이거나 또는 동시적일 수 있다.
또 다른 구체적인 예에서, 상기 두 개의 펩타이드 단량체는 고상 합성 기술의 변형으로서 링커 LK 모이어티의 2개의 반응성 질소기 위에서 직접적으로 합성될 수 있다. 이러한 합성은 순차적이거나 또는 동시적일 수 있다. 이러한 구체적인 예에서, 펩타이드 합성을 위한 개시 자리로서 제공될 수 있는 2개의 아미노기와 또 다른 분자 모이어티 (예컨대, 고형 지지체의 표면에 존재할 수 있는 것)에 결합할 수 있는 세 번째 작용기 (예컨대, 리신의 카르복실기; 또는 리신 아미드의 아미노기, 카르복실기가 아미드 모이어티 -CONH2로 전환된 리신 잔기)를 함유하는 리신 링커 (LK) 모이어티가 사용된다.
링커 위에서 이량체의 펩타이드 사슬의 순차적인 합성이 수행되는 경우, 링커 분자 위의 2개의 아민 작용기는 2개의 상이한 직각으로(orthogonally) 제거될 수 있는 아민 보호기(amine protecting groups)로 보호된다. 보호된 링커는 링커의 세번째 작용기를 통하여 고체 지지체에 결합된다. 제1 아민 보호기가 제거되고, 탈보호된 제1 아민 모이어티 위에서 이량체의 제1 펩타이드가 합성된다. 그 후, 제2 아민 보호기가 제거되고, 이량체의 제2 펩타이드가 탈보호된 제2 아민 모이어티 위에서 합성된다. 예를 들어, 링커의 제1 아미노 모이어티가 Alloc으로 보호되고, 제2 아미노 모이어티가 Fmoc으로 보호될 수 있다. 이 경우, Fmoc기 (Alloc기는 아님)가 약 염기 [예컨대, 디메틸포름아미드 (DMF) 중의 20% 피레리딘]로의 처리에 의하여 제거될 수 있고, 제1 펩타이드 사슬이 합성될 수 있다. 그 이후, Alloc기가 적합한 시약 [예컨대, Pd(PPh3)/4-메틸 모르폴린 및 클로로포름]으로 제거될 수 있고, 제2 펩타이드 사슬이 합성될 수 있다. 시스테인을 위한 다양한 티올-보호기가 이황화결합의 형성을 조절하기 위하여 사용되는 경우 (아래에서 설명함)를 주의하여야 하며, 이러한 기술은 이량체의 펩타이드 사슬의 최종 아미노산 서열이 동일한 경우에도 사용되어야 한다.
링커 위로 이량체의 펩타이드 사슬의 동시적 합성을 수행하는 경우, 그 링커 분자의 2개의 아민 작용기는 동일한 제거가능한 아민 보호기로 보호된다. 상기 보호된 링커는 링커의 제3 작용기를 통하여 고체 지지체에 결합된다. 이 경우, 링커 분자의 2개의 보호된 작용기는 동시에 탈보호되고, 2개의 펩타이드 사슬은 탈보호된 아민들 위에서 동시에 합성된다. 이러한 기술을 사용하는 경우, 이량체의 펩타이드 사슬의 서열은 동일할 것이고, 시스테인 잔기들에 대한 티올 보호기는 모두 동일하다.
펩타이드 합성의 바람직한 방법은 고상 합성법(solid phase synthesis)이다. 고상 펩타이드 합성법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다 [예컨대, Stewart Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co.: San Francisco) 1969; 2002/2003 General Catalog from Novabiochem Corp, San Diego, USA; Goodman Synthesis of Peptides and Peptidomimetics (Houben-Weyl, Stuttgart) 2002 참조]. 고상 합성법에 있어서, 합성은 α-아미노 보호 레진(α-amino protected resin)을 사용하여 펩타이드의 C-말단 끝에서부터 일반적으로 수행된다. 적절한 출발 물질은, 예컨대 필요한 α-아미노산을 클로로메틸화 레진, 히드록시메틸 레진, 폴리스티렌 레진 또는 벤즈히드릴아민 레진 등에 부착시키는 것에 의하여 제조될 수 있다. 그러한 클로로메틸화 레진 중 하나는 바이오 라드 연구소 (Bio Rad Laboratories; 리치몬드, CA)에 의하여 BIO-BEADS SX-1 이라는 상품명으로 시판되는 것이다. 히드록시메틸 레진의 제조법은 문헌 [Bodonszky, et al. (1966) Chem. Ind. London 38:1597]에 기재된 바 있다. 벤즈히드릴아민 (BHA) 레진은 문헌 [Pietta and Marshall (1970) Chem. Commun. 650]에 기재된 바 있고, 그 염산염 형태가 Beckman Instruments, Inc. (Palo Alto, CA)에서 시판 중에 있다. 예를 들어, α-아미노 보호된 아미노산 (α-amino protected amino acid)은 문헌 [Gisin (1973) Helv. Chim. Acta 56:1467]에 기재되어 있는 방법에 따라 중탄산염세슘(cesium bicarbonate) 촉매의 도움으로 클로로메틸화 레진에 결합될 수 있다.
최초의 결합 후에, α-아미노 보호기를, 예컨대 실온에서 유기 용매 중의 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 염산 (HCl) 용액을 사용하여 제거한다. 그 이후, α-아미노 보호 아미노산은 신장하고 있는 지지체 결합 펩타이드 사슬에 연속적으로 결합된다. 아실형 보호기 (예컨대, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향성 우레탄형 보호기 [예컨대, 벤질옥시카르보닐 (Cbz) 및 치환된 Cbz], 지방족 우레탄 보호기 [예컨대, t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 이소프로필옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐] 및 알킬형 보호기 (예컨대, 벤질, 트리페닐메틸), 플루오레닐메틸 옥시카르보닐 (Fmoc), 알릴옥시카르보닐 (Alloc) 및 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥-1-실리덴)에틸 (dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl; Dde)를 포함하는 α-아미노 보호기는 펩타이드의 단계적 합성의 기술 분야에 있어서 유용한 것으로 알려져 있다.
측쇄 보호기 (일반적으로 에테르, 에스테르, 트리틸, PMC 등)는 결합 동안에 그대로 남아있고, 아미노-말단 보호기가 탈보호하는 동안 또는 결합하는 동안 분리되지 않는다. 측쇄 보호기는 최종 펩타이드의 합성의 완료까지 및 목적 펩타이드를 변형시키지 않는 반응 조건하에서 제거될 수 있어야만 한다. Tyr에 대한 측쇄 보호기는 테트라히드로피라닐, tert-부틸, 트리틸, 벤질, Cbz, Z-Br-Cbz 및 2,5-디클로로벤질을 포함한다. Asp에 대한 측쇄 보호기는 벤질, 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 시클로헥실을 포함한다. Thr 및 Ser에 대한 측쇄 보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라히드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질 및 Cbz를 포함한다. Arg에 대한 측쇄 보호기는 니트로, 토실 (Tos), Cbz, 아다만틸옥시카르보닐, 메시토일술포닐 (Mts), 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조퓨란-5-술포닐 (Pbf), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸-벤젠술포닐 (Mtr) 또는 Boc를 포함한다. Lys에 대한 측쇄 보호기는 Cbz, 2-클로로벤질옥시카르보닐 (2-Cl-Cbz), 2-브로모벤질옥시카르보닐 (2-Br-Cbz), Tos 또는 Boc를 포함한다.
α-아미노 보호기의 제거 후에, 남아있는 보호된 아미노산은 목적하는 순서로 단계적으로 결합된다. 각각의 보호된 아미노산을, 예컨대 메틸렌 클로라이드 (CH2Cl2), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 포름아미드 (DMF) 또는 이들의 혼합물과 같은 용액 중의, 예컨대 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 (HBTU) 또는 디시클로헥실카르보이미드 (DCC)를 비롯한 적절한 카르복시기 활성제를 약 3 배 과량으로 사용하여 일반적으로 반응시킨다.
목적하는 아미노산 서열을 완성한 후, 그 목적하는 펩타이드를 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 불화수소 (HF) 등의 시약으로 처리하여 레진 지지체로부터 분리시킨다. 상기 시약은 펩타이드를 레진으로부터 분리시킬 뿐만 아니라 모든 잔류 측쇄 보호기도 분리시킨다. 클로로메틸화 레진이 사용되는 경우, 불화수소 처리는 유리 펩타이드산(free peptide acids)을 형성하는 결과를 가져온다. 벤즈히드릴아민 수지가 사용되는 경우, 불화수소 처리는 유리 펩타이드 아미드를 직접적으로 생성한다. 또 다른 한편으로는, 클로로메틸화 수지가 사용되는 경우, 측쇄 보호된 펩타이드를 암모니아로 펩타이드 레진을 처리하는 것에 의하여 분리되어 목적하는 측쇄 보호된 아미드를 생성할 수 있고, 알킬아민으로 처리하여 측쇄 보호된 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 생성할 수 있다. 그 후, 측쇄 보호는 불화수소로의 처리에 의하여 통상적인 방식으로 제거되어 유리 아미드, 알킬아미드 또는 디알킬아미드를 생성한다.
본 발명의 에스테르의 제조에 있어서, 펩타이드 산을 제조하는데 사용되는 레진이 사용되고, 측쇄 보호된 펩타이드는 염기 또는 적절한 알콜 (예컨대, 메탄올)로 분리된다. 그 후, 측쇄 보호기는 불화수소로의 처리에 의하여 통상적인 방식으로 제거되어 목적하는 에스테르를 얻는다.
이들 방법은 20개의 자연적으로 존재하는 유전학적으로 암호환된 아미노산 이외의 아미노산으로 본 발명의 임의의 화합물의 1, 2 또는 그 이상의 자리에서 치환된 펩타이드를 합성하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 내로 치환될 수 있는 합성 아미노산은 N-메틸, L-히드록시프로필, L-3,4-디히드록시페닐알라닐, δ-아미노산, 예컨대 L-δ-히드록실리실(L-δ-hydroxylysyl) 및 D-δ-메틸알라닐, L-α-메틸알라닐, β-아미노산 및 이소퀴놀릴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. D-아미노산 및 자연적으로 만들어지지 않는 합성 아미노산이 또한 본 발명의 펩타이드 내로 포함될 수 있다.
펩타이드 변형( Peptide modifications )
본 발명의 펩타이드 화합물의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단을 변형시켜 본 발명의 다른 화합물을 또한 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노 말단은 아스트산 또는 그의 할로겐화 유도체 (예컨대, α-클로로아세트산, α-브로모아세트산 또는 α-요오드아세트산)로 아세틸화될 수 있다.
20개의 유전적으로 암호화된 아미노산 (또는 입체이성질체 D 아미노산)의 자연적으로 존재하는 측쇄를, 예컨대 알킬, 저급(lower) 알킬, 4, 5, 6, 또는 7환 시클로알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 카르복시 및 이들의 저급 에스테르 유도체와, 4, 5, 6, 또는 7환 헤테로시클릭과 같은 다른 측쇄로 치환시킬 수 있다. 특히, 프롤린 잔기의 고리 크기가 5환에서 4, 6 또는 7환으로 변화된 프롤린 유사체가 사용될 수 있다. 고리기(Cyclic groups)는 포화이거나 불포화일 수 있고, 불포화인 경우 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 헤테로시클릭기는 바람직하게는 1개 또는 그 이상의 질소, 산소 및/또는 황 헤테로원자를 함유한다. 이러한 기의 예로는 퓨라자닐, 퓨릴, 이미다졸리디닐, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이소티아졸릴, 이소크사졸릴, 모르폴리닐 (예컨대, 모르폴리노), 옥사졸릴, 피페라지닐 (예컨대, 1-피페라지닐), 피페리딜 (예컨대, 1-피페리딜, 피페리디노), 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐 (예컨대, 1-피롤리디닐), 피롤리닐, 피롤릴, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 티오모르폴리닐 (예컨대, 티오모르폴리노) 및 트리아졸릴을 들 수 있다. 이들 헤테로시클릭기는 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우에 그 치환기는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소 또는 치환된 또는 치환되지 않은 페닐일 수 있다.
포스포릴화 및 기타의 방법 [예컨대, Hruby, et al. (1990) Biochem J. 268:249-262에 기재되어 있는 방법]에 의하여 펩타이드를 또한 용이하게 변화시킬 수 있다.
본 발명의 펩타이드 화합물은 또한 유사한 생물학적 활성을 가지는 비 펩타이드성 화화물(non-peptidic compounds)을 위한 구조적 모델로서 제공된다. 당해 기술 분야의 숙련자는 다양한 기술들이 앞선 펩타이드 화합물(the lead peptide compound)과 동일한 또는 유사한 목적하는 생물학적 활성을 가지고, 용해성, 안정성 및 민감성 가수분해 및 단백질분해의 측면에서 그것보다 더 바람직한 활성을 가진 화합물을 만드는데 이용될 수 있다는 것을 인식하고 있을 것이다 [Morgan and Gainor (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243-252 참조]. 이들 기술은 펩타이드 골격을 포스포네이트, 아미데이트, 카르바메이트, 술폰아미드, 2차 아민 및 N-메틸아미노산으로 이루어지는 골격으로 치환시키는 것을 포함한다.
이황화 결합의 형성
본 발명의 화합물은 2개의 분자내 이황화 결합을 함유한다. 그러한 이황화 결합은 각 펩타이드 단량체의 시스테인 잔기의 산화에 의하여 형성될 수 있다.
한가지 구체적인 예에서, 시스테인 결합 형성의 조절은 목적하는 이성질체(isomer)의 형성을 최적화하는데 효과적인 농도 및 종류의 산화제를 선택하는 것에 의하여 수행된다. 예를 들어, 산화제가 DMSO 또는 요오드 (I2)인 경우, 분자내 이황화 결합을 형성 (각각의 펩타이드 사슬에서 하나)을 위한 펩타이드 이량체의 산화가 (분자내 이황화 결합의 형성보다) 우선적으로 이루어진다.
다른 구체적인 예에서, 시스테인 결합의 형성은 펩타이드 합성 도중에 티올 보호기의 선택적인 사용에 의하여 조절된다. 예를 들어, 2개의 분자내 이황화 결합을 가진 이량체를 소망하는 경우, 제1 단량체 펩타이드 사슬은 제1 티올 보호기 [예컨대, 트리틸(Trt), 알릴옥시카르보닐 (Alloc) 및 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥-1-실리덴)에틸 (Dde) 등]로 보호된 중심(core) 서열의 2개의 시스테인 잔기를 가지고 합성되고, 제2 단량체 펩타이드 사슬은 제1 티올 보호기와 상이한 제2 티올 보호기 [예컨대, 아세트아미도메틸 (Acm), t-부틸 (tBu) 등]로 보호된 중심(core) 서열의 2개의 시스테인 잔기를 가지고 합성된다. 그 이후, 제1 티올 보호기가 제거되어 제1 단량체의 이황화 고리화(bisulfide cyclization)를 초래하고, 제2 티올 보호기가 제거되어 제2 단량체의 이황화 고리화를 초래한다.
본 발명의 다른 구체적인 예에서는 황(sulfur) 중의 하나가 CH2기 또는 다른 황의 이소테레(isotere)에 의하여 치환된 이들 이황화 유도체의 유사체를 제공한다. 이들 유사체는 본 발명의 화합물로부터 제조될 수 있는데, 여기서 각 펩타이드 단량체는 당해 기술 분야에 공지의 방법 [예컨대, Barker, et al. (1992) J. Med. Chem. 35:2040-2048 and Or, et al. (1991) J. Org. Chem. 56:3146-3149 참조]을 사용한 분자내 또는 분자간 이동을 통하여, 적어도 제1 C 또는 제2 C 잔기 대신에 호모시스테인 잔기 및 α-아미노-γ-부티르산을 함유한다. 당해 기술 분야의 숙련자는 α-아미노-γ-부티르산 및 호모시스테인의 기타의 동족체(homologs)를 사용하여 이러한 이동이 또한 일어날 수 있다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.
전술한 고리화 전략 이외에, 기타의 비(非)이황화 펩타이드 고리화 전략이 사용될 수 있다. 그러한 또 다른 고리화 전략은 예를 들어 아미드-고리화 전략 및 티오-에테르 결합의 형성과 관련된 전략을 포함한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 분자내 아미드 결합 또는 분자내 티오-에테르 결합을 가진 고리화된 형태로 존재할 수 있다.
예를 들어, 중심 서열의 제1 시스테인이 리신으로 치환되고, 제2 시스테인이 글루탐산으로 치환된 펩타이드가 합성될 수 있고, 그 후 이들 두 잔기들의 측쇄 사이에서 아미드 결합을 통하여 고리형 단량체가 형성될 수 있다. 또 다른 것으로, 중심 서열의 제1 시스테인이 리신 (또는 세린)으로 치환된 펩타이드가 합성될 수 있고, 그 후 리신 (또는 세린) 잔기의 측쇄 및 중심 서열의 제2 시스테인 잔기 사이에서 티오-에테르 결합을 통하여 고리형 단량체가 형성될 수 있다. 이황화 고리화 전략 이외에, 그러한 아미드 고리화 전략 및 티오-에테르 고리화 전략 모두가 본 발명의 화합물의 고리화에 용이하게 사용될 수 있다. 또 다른 것으로서, 펩타이드의 아미노-말단이 α-치환된 아세트산으로 캡핑될 수 있는데, 여기서 상기 α-치환물은 α-할로아세트산(예컨대, α-클로로아세트산, α-브로모아세트산 또는 α-요오도아세트산)과 같은 이탈기이다.
분지형 3차 아미드 링커의 첨가
펩타이드 단량체는 분지형 아미드 링커 모이어티에 의하여 이량체화 될 수 있다. 한가지 구체적인 예에서, 상기 링커는 펩타이드 합성 동안에 펩타이드 내로 포함된다. 예를 들어, 링커 LK 모이어티가 펩타이드 합성을 위한 개시 자리로서 제공될 수 있는 2개의 작용기와, 1개 또는 그 이상의 다른 분자 모이어티에 결합하는 것이 가능한 1개 또는 그 이상의 다른 작용기 (예컨대, 카르복실기 또는 아미노기)를 함유하는 경우, 상기 링커는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 그 후, 변화된 고상 합성 기술로 2개의 펩타이드 단량체는 링커 LK 모이어티의 2개의 반응성 질소기 위로 직접적으로 합성될 수 있다.
또 다른 구체적인 예에서, 링커는 펩타이드 합성 후에 펩타이드 이량체의 2개의 펩타이드 단량체에 접합될 수 있다. 그러한 접합은 당해 기술 분야에서 잘 확립된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 한가지 구체적인 예에서, 링커는 합성된 펩타이드 단량체의 표적 작용기에 부착하는데 적합한 2개의 작용기를 함유한다. 예를 들어, 미리 활성화되거나 또는 적절한 커플링 시약이 존재하는 경우에 2개의 카르복실기를 함유하는 링커는 2개의 펩타이드 단량체 각각의 표적 리신 측쇄 아민기와 반응할 수 있다.
예를 들어, 펩타이드 단량체는 다음과 같이 3차 아미드 링커에 화학적으로 결합될 수 있다.
A*-C1O-CH2-X-CH2-C2O-B*
식 중, X는 NCO-(CH2)2-NH-Y이고 Y는 적절한 보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 보호기이며; A*는 링커의 C1을 제1 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기에 접합시키기 위해 사용되는 적절한 작용기, 예컨대 N-옥시 숙신이미드이고; B*는 링커의 C2를 제2 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기에 접합시키기 위해 사용되는 적절한 작용기, 예컨대 N-옥시 숙신이미드이다.
또한, 예를 들어, 펩타이드 단량체는 다음과 같이 3차 아미드 링커에 화학적으로 결합될 수 있다.
A*-C1O-CH2-X-CH2-C2O-B*
식 중, X는 NCO-(CH2)2-NH-C3O- 이고; A*는 링커의 C1을 제1 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기에 접합시키기 위해 사용되는 적절한 작용기, 예컨대 N-옥시 숙신이미드이며; B*는 링커의 C2를 제2 펩타이드 단량체의 C-말단 리신 잔기의 ε-아미노기에 접합시키기 위해 사용되는 적절한 작용기, 예컨대 N-옥시 숙신이미드이고; 상기 3차 아미드 링커는 다음의 스페이서 모이어티에 화학적으로 결합된 것으로서,
Y-NH-(CH2)4-C4H-NH-Y
식 중, X의 C3은 스페이서의 C4에 공유적으로 결합되고; Y는 적절한 보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 보호기이다.
리신 링커의 첨가
펩타이드 단량체는 리신 링커 LK 모이어티에 의하여 이량체화될 수 있다. 한가지 구체적인 예에서, 리신 링커는 펩타이드 합성 중에 펩타이드 속으로 포함될 수 있다. 예를 들어, 리신 링커 LK 모이어티가 펩타이드 합성을 위한 개시 자리로서 제공될 수 있는 2개의 작용기와, 또 다른 분자 모이어티에 결합할 수 있는 제3 작용기 (예컨대, 카르복실기 또는 아미노기)를 함유하는 경우, 링커는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 그 후, 변형 고상 합성 기술로 2개의 펩타이드 단량체가 리신 링커 LK 모이어티의 2개의 반응성 질소기 위로 직접적으로 합성될 수 있다.
또 다른 구체적인 예에서, 펩타이드 이량체가 리신 링커 LK 모이어티에 의하여 이합체화 되는 경우, 상기 링커는 펩타이드 합성 이후에 펩타이드 이량체의 2개의 펩타이드 단량체에 접합될 수 있다. 그러한 접합은 당해 기술 분야에서 잘 확립된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 한가지 구체적인 예에서, 링커는 합성된 펩타이드 단량체의 표적 작용기에 부착하기 위해 적합한 적어도 2개의 작용기를 함유한다. 예를 들어, 리신의 2개의 유리(free) 아미노 그룹은 2개의 펩타이드 단량체의 C-말단 카르복실기와 반응할 수 있다.
스페이서의 첨가
본 발명의 펩타이드 화합물은 스페이서 모이어티를 더 포함한다.
한가지 구체적인 예에서, 스페이서는 펩타이드 합성 중에 펩타이드 내로 포함될 수 있다. 예를 들어, 스페이서가 유리 아미노기 및 또 다른 분자 모이어티에 결합할 수 있는 제2 작용기(예컨대, 카르복실기 또는 아미노기)를 함유하는 경우, 스페이서는 고체 지지체에 접합될 수 있다.
한가지 구체적인 예에서, 2개의 작용기를 함유하는 스페이서는 제1 작용기를 통하여 고체 지지체에 우선 결합된다. 다음으로 펩타이드 합성을 위한 개시 자리로서 제공될 수 있는 2개의 작용기와 또 다른 분자 모이어티에 결합할 수 있는 제3 작용기 (예컨대, 카르복실기 또는 아미노기)를 가지는 리신 링커 LK 모이어티가 스페이서의 제2 작용기 및 링커의 제3 작용기를 통하여 스페이서에 접합된다. 그 후, 변형 고상 합성 기술로 2개의 펩타이드 단량체는 링커 LK 모이어티의 2개의 반응성 질소기 위로 직접적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 유리 아민기를 가진 스페이서와 결합된 고체 지지체는 링커의 유리 카르복실기를 통하여 리신 링커와 반응할 수 있다.
또 다른 구체적인 예에서, 스페이서는 펩타이드 합성 후에 펩타이드 이량체에 접합될 수 있다. 그러한 접합은 당해 기술 분야에서 잘 확립된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 한가지 구체적인 예에서, 링커는 합성된 펩타이드의 표적 작용기에 부착하기 위해 적합한 적어도 하나의 작용기를 함유한다. 예를 들어, 유리 아민기를 가지는 스페이서는 펩타이드의 C-말단 카르복실기와 반응할 수 있다. 또 다른 예에서, 유리 카르복실기를 가지는 링커는 리신 아미드의 유리 아민기와 반응할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 ( PEG )의 부착
최근 수년간, 수용성(水溶性) 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 치료적 및 진단적으로 중요한 펩타이드의 공유적 변경을 위하여 사용되어 왔다. 그러한 중합체의 부착은 생물학적 활성을 강화시키고, 혈액 순환 시간을 연장시키며, 면역원성을 감소시키고, 물에 대한 용해도를 증가시키며, 단백질분해효소의 분해에 대한 저항성을 증가시키는 것으로 생각된다. 예를 들어, 치료적 폴리펩티드, 예컨대 인터루킨 (Knauf, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263;15064; Tsutsumi, et al. (1995) J. Controlled Release 33:447), 인터페론 (Kita, et al. (1990) Drug Des. Delivery 6:157), 카탈레제 (Abuchowski, et al. (1977) J. Biol. Chem. 252:582), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (Beauchamp, et al. (1983) Anal. Biochem. 131:25) 및 아데노신 데아미나제 (Chen, et al. (1981) Biochim. Biophy. Acta 660:293)에 PEG의 공유적 부착이 그들의 생체 내 반감기의 연장 및/또는 그들의 면역원성 및 항원성의 감소를 가져온다고 보고된 바 있다
본 발명의 펩타이드 화합물은 카르바메이트 결합을 통해서 또는 아미드 결합을 통해서 분지형 3차 아미드 링커 또는 펩타이드 이량체의 스페이서에 공유적으로 결합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용되는 PEG의 예로는 분자량이 약 20 킬로달톤(20 K) 내지 약 40 K인 선형, 비분지형 PEG를 들 수 있다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 바람직하게는, 상기 PEG는 분자량이 약 30 K 내지 약 40 K이다.
본 발명에서 사용되는 또 다른 PEG의 예로는 분자량이 약 10 K 내지 약 60 K인 선형 PEG를 들 수 있다 ("약"이라는 용어는 PEG의 제조에 있어서 일부 분자의 분자량이 상기 언급한 분자량보다 더 많거나 약간 적을 수 있음을 나타내는 것이다). 바람직하게는, 상기 PEG는 분자량이 약 20 K 내지 약 40 K이다. 더욱 바람직하게는, 상기 PEG는 분자량이 약 20 K이다.
PEG의 공유적 부착 (PEG화)의 방법의 예들은 아래에 기재되어 있다. 이들 예시적 설명은 한정을 위한 것이 아니다. 당해 기술분야의 숙련자는 광범위한 PEG의 공유적 부착을 위한 다양한 방법들이 당해 기술 분야에서 잘 확립되어 있다는 것을 인식할 것이다. 그러한 것으로서, 당해 기술 분야에서 공지의 다양한 부착 방법 중 임의의 방법에 의하여 PEG가 부착된 펩타이드 화합물이 본 발명에 포함된다.
예를 들어, PEG는 활성화된 PEG 분자가 결합될 수 있는 반응성 기 (예컨대, 유리 아미노기 또는 카르복실기)를 통하여 링커에 공유적으로 결합될 수 있다. PEG 분자는 상이한 반응성 모이어티를 가진 메톡시화 PEG ("mPEG")를 사용하여 아미노기에 부착될 수 있다. 그러한 중합체는 mPEG-숙신이미딜 숙시네이트, mPEG-숙신이미딜 카르보네이트, mPEG-이미데이트, mPEG-4-니트로페닐 카르보네이트 및 mPEG-시아누릭 클로라이드를 포함한다. 이와 유사하게, PEG 분자는 유리 아민기를 가진 메톡시화 PEG (mPEG-NH2)를 사용하여 카르복실기에 부착될 수 있다.
일부 구체적인 예에서, 링커 또는 스페이서는 말단 아미노기 (즉, 스페이서의 말단에 위치한 것)를 함유한다. 이러한 말단 아미노기는 적절하게 활성화된 PEG 분자, 예컨대 mPEG-파라-니트로페닐카르보네이트 (mPEG-NPC)와 반응하여 안정한 공유적 카르바메이트 결합을 만들 수 있다. 또 다른 예로, 이러한 말단 아미노기는 적절하게 활성화된 PEG 분자, 예컨대 반응성 N-히드록실-숙신이미드 (NHS)기를 함유하는 mPEG-숙신이미딜 부티레이트 (mPEG-SBA) 또는 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA)와 반응하여 안정한 공유적 카르바메이트 결합을 만들 수 있다. 다른 구체적인 예에서, 링커 반응성 기는 적절한 반응 조건하에서 아민 함유 PEG 분자와 공유 결합을 형성하도록 활성화될 수 있는 카르복실기를 함유한다. 적절한 PEG 분자는 mPEG-NH2를 포함하고, 적절한 반응 조건은 카르보이미드-매개(媒介) 아미드 형성 등을 포함한다.
EPO -R 작용제 활성 분석:
시험관 내 기능( functional ) 분석
시험관 내 경쟁적 결합 분석으로 EPO-R에 결합에 대하여 EPO와 경쟁하는 테스트 펩타이드의 능력을 정량한다. 예를 들어 (예컨대, 미국 특허 5,773,569에 기재되어 있는 것을 참조), 인간 EPO-R의 세포외 도메인 (EPO 결합 단백질, EBP) 대장균에서 재조합적으로 생산될 수 있고, 그 제조합 단백질은 고체 지지체, 예컨대 미량역가 디쉬(micotitre dish) 또는 합성 비드 [예컨대, Sulfolink 비드, Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)]에 결합된다. 그 후, 고정화 EBP를 표지된 재조합 EPO와 함께 또는 표지된 재조합 EPO 및 테스트 펩타이드와 함께 배양한다. 테스트 펩타이드의 계단 희석(serial dilutions)을 그러한 실험에 대해 사용한다. 첨가된 테스트 펩타이드가 없는 경우의 분석 포인트는 EBP에 대한 총 EPO 결합을 설명한다. 테스트 펩타이드를 함유하는 반응의 경우, 결합된 EPO의 양을 정량하여, 대조군 (총 100%) 결합에 대한 백분률로 표현한다. 이들 값을 펩타이드 농도에 대하여 도표로 나타낸다. IC50 값은 EBP에 대한 EPO의 결합이 50% 감소된 (즉, EPO 결합의 50% 억제) 테스트 펩타이드의 농도로서 정의한다.
다른 시험관 내 경쟁적 결합 분석은 두 가지 비드, 즉 EPO-접합 비드 또는 EPO-R-접합 비드의 근접의 함수(function of the proximity)로서 생성되는 빛 신호를 측정한다. 비드의 근접은 EPO-R에 대한 EPO의 결합에 의하여 생성된다. EPO-R에 결합에 대하여 EPO와 경쟁하는 테스트 펩타이드는 이러한 결합을 막아서, 빛 방출의 감소를 야기시킨다. 빛 방출의 50% 감소를 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 IC50 값으로 정의한다.
본 발명의 펩타이드는 EPO-R과의 결합에 있어서, 매우 효율적으로 EPO와 경쟁한다. 이러한 강화된 기능은 실질적으로 낮은 농도의 펩타이드에서 (즉, 그들은 매우 낮은 IC50 값을 가진다) EPO의 결합을 억제하는 그들의 능력에 의하여 나타난다.
EPO-수용체에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단량체 및 이량체 펩타이드 EPO-R 작용제의 생물학적 활성 및 능력은 시험관 내 세포 기재 기능 분석 (in vitro cell-based functional assays)을 사용하여 측정될 수 있다.
한가지 분석법은 인간 EPO-R을 발현하고 fos 프로모터 유도 루시퍼라제 수용체 유전자 구조물로 트랜스펙션된 마우스 예비 B 세포주(pre-B-cell line)를 기초로 한다. EPO 또는 또다른 EPO-R 작용제에 노출될 때까지, 그러한 세포들은 루시퍼라제의 합성에 의하여 반응을 보인다. 루시퍼라제는 그의 기질인 루시페린의 첨가에 따라 빛을 방출을 일으킨다. 따라서, 그러한 세포에서 EPO-R 활성화의 수준은 루시퍼라제 활성의 측정을 통하여 정량될 수 있다. 테스트 펩타이드의 활성은 그 테스트 펩타이드의 계단 희석물(serial dilutions)을 그 세포에 첨가한 후, 4시간 동안의 배양하는 것에 의하여 측정된다. 배양 후, 루시페린 기질을 그 세포에 첨가하고, 빛의 방출을 측정한다. 반 최대 방출(half-maximal emission)을 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로서 기록한다.
본 발명의 펩타이드는 이러한 분석법에서 EPO-R 신호 의존 루시퍼라제(EPO-R signaling-dependent luciferase)의 발현을 촉진시키는 극적으로 증가된 능력을 보여준다. 이러한 증가된 기능은 실질적으로 낮은 농도의 펩타이드 (즉, 이들은 매우 낮은 EC50 값을 가진다)에서 최대 루시퍼라제 활성의 절반 나타내는 그들의 능력에 의하여 나타난다. 이러한 분석법은 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 능력 및 활성을 측정하는 바람직한 방법이다.
또 다른 분석법이 FDC-P1/ER 세포 [Dexter, et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047], 즉 잘 특징지어진 EPO-R이 안정적으로 트랜스펙션된 형질전환되지 않은(nontransformed) 마우스 골수 유래 세포주를 사용하여 수행될 수 있다. 이들 세포는 EPO 의존 증식(EPO-dependent proliferation)을 나타낸다.
그러한 분석법의 한 가지에서, 그 세포를 필요한 성장 인자의 존재하에서 정지 밀도의 반(half stationary density)까지 성장시킨다 (예컨대, 미국 특허 5,773,569호에 기재된 사항을 참조). 그 후, 그 세포를 PBS에서 세척하고, 16∼24 시간 동안 성장 인자 없는 완전 배지(whole media)에서 굶주리게 한다. 그 세포의 생존율을 측정 (예컨대, 트리판 블루(trypan blue) 염색에 의하여)한 후, 50 ㎕ 당 약 105 세포의 원액(stock solution) (성장 인자 없는 완전 배지 내)을 만든다. 테스트를 위한 펩타이드 EPO-R 작용제 화합물의 계단 희석물 (일반적으로, 파지(phage) 결합 또는 기타의 결합 또는 고정화된 펩타이드에 반대되는 유리형(free), 용액 상의 펩타이드)을 96-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 50 ㎕의 최종 부피로 만든다. 세포 (50 ㎕)를 각 웰에 첨가하고, 그 세포를 24∼48 시간 배양하는데, 그 시점에서 음성 대조군은 죽거나 휴지 세포가 될 것이다. 그 후, 당해 기술 분야의 공지의 기술, 예컨대 세포 증식의 지표로서 H3-히스티딘 혼입을 측정하는 MTT 분석법에 의하여 세포 증식을 측정한다 [Mosmann (1983) J. Immunol. Methods 65:55-63 참조]. EPO-R 발현 세포 및 이를 발현하지 않는 모 세포주 양쪽 모두에서 펩타이드를 평가한다. 최대 세포 증식의 1/2을 나타내기 위하여 필요한 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로 기록한다.
이러한 분석에서 본 발명의 펩타이드는 EPO-의존 세포 성장을 촉진하는 극적으로 강화된 능력을 보여준다. 이러한 강화된 기능은 실질적으로 낮은 농도의 펩타이드 (즉, 이들은 매우 낮은 EC50 값을 가진다)에서 최대 세포 증식 자극 활성의 절반 나타내는 그들의 능력에 의하여 나타난다. 이러한 분석법은 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 능력 및 활성을 측정하는 바람직한 방법이다.
또 다른 분석법에서는, 세포를 EPO가 보충된 배지에서 정지상(stationary phase)으로 성장시켜 수집하고, 그 후 EPO가 없는 배지에서 추가적으로 18 시간 동안 배양시킨다.
그 세포를 다음과 같은 동일한 세포 밀도의 3개의 군으로 나눈다: 인자(factor)를 첨가하지 않은 한 그룹 (음성 대조군), EPO를 가진 한 그룹 (양성 대조군), 테스트 펩타이드를 가진 실험군. 그 후, 그 배양된 세포를 다양한 시점에서 수집하고, 고정시킨 후, DNA 결합 형광 염료 (예컨대, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide) 또는 Hoechst 염료, 둘다 Sigma사로부터 구득 가능함)로 염색한다 그 후, 예컨대 FACS 스캔 흐름세포측정기를 사용하여 형광을 측정한다. 그 후, 세포 주기의 각 단계에서의 세포의 백분율을 예컨대, CelIFIT 소프트웨어의 SOBR 모델 (Becton Dickinson)을 사용하여 측정할 수 있다. EPO 또는 활성 펩타이드로 처리된 세포는 음성 대조군에 비하여 S 기 세포의 더 큰 비율을 보여준다 (증가된 DNA 함량의 지표로서 증가된 형광에 의하여 측정됨).
유사한 분석법이 FDCP-1 [예컨대, Dexter et al. (1980) J. Exp. Med. 152:1036-1047 참조] 또는 TF-1 [Kitamura, et al. (1989) Blood 73:375-380] 세포주를 사용하여 수행될 수 있다. FDCP-1는 WEHI-3 조건 배지(WEHI-3-conditioned media; IL-3 함유 배지, ATCC 번호 TIB-68)로 보충될 때, 증식할 수 있지만, 분화할 수 없는 성장인자 의존 마우스 다중 잠재성 원시 조혈 전구 세포주 (growth factor dependent murine multi-potential primitive hematopoietic progenitor cell line)이다. 그러한 실험에 있어서, FDCP-1 세포주를 인간 또는 마우스 EPO-R로 트랜스펙션시켜, EPO의 존재하에서 증식할 수 있지만 분화할 수 없는 FDCP-1-hEPO-R 또는 FDCP-1-mEPO-R 세포주를 각각 생산한다. EPO 의존 세포주인, TF-1가 세포 증식에 대한 펩타이드 EPO-R 작용제의 효과를 측정하는데 또한 사용될 수 있다.
또 다른 분석법으로서, 비장 세포 속으로의 H3-티미딘 혼입에 기초한 미세분석법에 관한 크리스탈(Krystal)의 문헌 (Exp. Hematol 11:649-660 (1983))에 기재된 방법을 EPO 작용제로서 제공되기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 확인하는데 사용할 수 있다. 이를 요약하면, B6C3F1 마우스에 2일 동안 매일 페닐히드라진 (60 mg/kg)을 주사한다. 3일째에, 비장 세포를 제거하여, 그들의 24시간 동안에 걸친 증식 능력을 MTT 분석을 사용하여 확인한다.
에리트로포이에틴-반응 세포주에서 EPO-R에 대한 EPO의 결합은 그 리셉터와, Shc, vav 및 JAK2 키나아제를 포함하는 수많은 세포 내 단백질 양쪽 모두의 티로신 인사화를 유도한다.따라서, 또 다른 시험관 내 분석법은 EPO-R 및 다음 경로(downstream)의 새포내 신호 전달 단백질의 티로신 인산화를 유도하는 본 발명의 펩타이드의 능력을 측정한다. 전술한 결합 및 증식 분석에 의하여 확인된 활성 펩타이드는 에리트로포이에틴 반응 세포에서 EPO의 인산화 패턴과 거의 동일한 인산화 패턴을 일으킨다. 이러한 분석법에서, FDC-P1/ER 세포 [Dexter, et al. (1980) J Exp Med 152:1036-47]를 EPO 보충된 배지(EPO-supplemented medium)에서 유지시키고, 정지상(stationary phase)에서 성장시킨다. 그 후, 이들 세포를 EPO 없는 배지에서 24시간 동안 배양한다. 그 후, 소정 개수의 그러한 세포들을 37℃에서 약 10분 동안 테스트 펩타이드와 함께 배양한다. EPO를 가진 대조군 샘플을 또한 각 분석으로 수행한다. 그 후, 그렇게 처리된 세포를 원심분리에 의하여 수집하고, SDS 용균 (lysis) 버퍼에서 재현탁시킨 후, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한다. 상기 겔에서 정기영동된 단백질을 니트로셀룰로스로 이동시키고, 블로트(blot) 상의 포스포티로신 함유 단백질을 표준 면역학적 기술에 의하여 시각화한다. 예를 들어, 상기 블로트는 항포스포티로신 항체 (예컨대, Upstate Biotechnology, Inc.의 마우스 항포스포티로신 IgG)를 탐침으로 사용하고, 세척한 후, 2차 항체 (예컨대, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (워싱턴, DC)의 퍼옥시다제 표지된 염소 항 마우스 IgG)로 탐색될 수 있다. 그 후, 포스포티로신 함유 단백질은 비색법(colorimetric), 화학발광법(chemiluminescent) 또는 형광 분석법(fluorescent assays)을 포함하는 표준 기술에 의하여 시각화될 수 있다. 예를 들어, 화학발광 분석은 Amersham의 ECL 웨스턴 블로팅 시스템을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 펩타이드의 활성을 조사하는데 사용될 수 있는 또 다른 세포 기반 시험관내 분석은 마우스 골수 또는 인간 말초 혈액 세포를 사용하는 콜로니 분석법이다. 마우스 골수는 마우스의 대퇴부에서 얻을 수 있고, 인간 말초 혈액의 샘플은 건강한 제공자로부터 얻을 수 있다. 말초 혈액의 경우, 우선 단핵 세포를, 예컨대 Ficoll-Hypaque 구배(gradient) [Stem Cell Technologies, Inc. (캐나다, 밴쿠버)]를 통한 원심분리에 의하여 혈액으로부터 분리한다. 이러한 분석을 위해서, 유핵 세포 계수(nucleated cell count)를 수행하여 최초 샘플에서 유핵 세포의 개수 및 농도를 확정한다. 소정 개수의 세포를 제조자의 설명 [Stem Cell Technologies, Inc. (캐나다, 밴쿠버)]에 따라서 메틸 셀룰로오스 상에 프레이팅한다. 실험군을 테스트 펩타이드로 처리하고, 양성 대조군을 EPO로 처리하며, 음성 대조군에 대해서는 아무 처리를 하지 않는다. 그 후, 각 군에서 성장한 콜로니의 개수를 소정의 배양 기간, 일반적으로 10일 및 18일 후에 측정한다. 활성 펩타이드는 콜로니의 형성을 촉진할 것이다.
본 발명의 화합물의 활성을 증명하는데 사용될 수 있는 기타의 시험관 내 생물학적 분석법은 문헌들 [Greenberger, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2931-2935 (EPO 의존 조혈 전구세포주); Quelle and Wojchowski (1991) J. Biol. Chem. 266:609-614 (B6SUt.EP 세포에서 단백질 티로신 인산화); Dusanter-Fourt, et al. (1992) J. Biol. Chem. 287:10670-10678 (인간 EPO 반응 세포에서 EPO 수용체의 티로신 인산화); Quelle, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17055-17060 (FDC-ER 세포에서 세포질 단밸질, pp 100의 티로신 인산화); Worthington, et al. (1987) Exp. Hematol. 15:85-92 (헤모글로빈에 대한 비색분석); Kaiho and Miuno (1985) Anal. Biochem. 149:117-120 (2,7-디아미노플루오렌으로의 헤모글로빈 검출); Patel, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:21300-21302 (c-myb의 발현); Witthuhn, et al. (1993) Cell 74:227-236 (JAK2의 결합 및 티로신 인산화); Leonard, et al. (1993) Blood 82:1071-1079 (GATA 전사 인자의 발현); 및 Ando, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9571-9575 (사이클링 D2 및 D3에 의한 G1 전이의 조절)]에 개시되어 있다.
마이크로피지오메터(microphysiometer)로 알려진 Molecular Devices Corp.에 의하여 고안된 장비가 다양한 수용체에 대한 작용제 및 길항제의 효과의 측정을 위해 성공적으로 사용된다고 보고된 바 있다. 이 장치의 원리는 수용체의 활성화에 대응하는 세포외 배지의 산화 속도의 변화를 측정하는 것이다.
생체 내 기능 분석
테스트 펩타이드의 능력을 조사하기 위해 사용될 수 있는 한가지 생체 내 기능 분석법은 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석 (polycythemic exhypoxic mouse bioassay)이다. 이러한 분석을 위해서, 마우스에게 수일 동안 교대 조건 사이클(alternating conditioning cycle)을 수행한다. 이러한 사이클에서, 그 마우스를 저압 조건 및 통상(ambient) 압력 조건의 기간을 교대시킨다. 그 후, 테스트 샘플의 투여에 앞서 그 마우스를 통상 압력에서 2∼3일 동안 유지시킨다. 테스트 펩타이드 샘플, 또는 양성 대조군 마우스의 경우 EPO 표준을 그 조건 마우스(conditioned mice)에 피하로 주사한다. 방사능표지된 철 (예컨대, 59Fe)을 2일 후에 투여하고, 방사능표지된 철의 투여 2일 후에 혈액 샘플을 채취한다. 그 후, 적혈구용적율(Hematocrits) 및 방사능활성 측정을 표준 기술에 의하여 각 혈액 샘플에 대해 수행한다. 활성의 테스트 펩타이드가 주사된 마우스로부터의 혈액 샘플은 테스트 펩타이드 또는 EPO를 투여받지 않은 마우스 보다 더 큰 방사능활성 (적혈구 헤모글로빈에 의한 Fe59의 결합에 기인함)을 보여줄 것이다.
테스트 펩타이드의 능력을 조사하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 생체 내 기능 분석법은 망상적혈구(reticulocyte) 분석법이다. 이러한 분석을 위하여, 통상의 무처리 마우스에 연속 3일 EPO 또는 테스트 펩타이드로 피하 주사한다. 3일째에, 그 마우스를 또한 철 덱스트란(ion dextran)을 복강내 주사한다. 5일째에, 그 마우스로부터 혈액 샘플을 채취한다. 그 혈액에서 망상적혈구의 백분률(%)을 티아졸 오랜지(thiazole orange) 염색 및 흐름세포측정 분석 (retic-count program)으로 측정한다. 또한, 적혈구용적율을 손으로 계산한다. 수집된 망상적혈구의 백분율을 다음의 공식을 사용하여 계산한다:
% RETIC보정 = % RETIC관찰 X (적혈구용적율 개별 / 적혈구용적율 통상)
활성의 테스트 화합물은 테스트 펩타이드 또는 EPO의 투여가 없는 마우스와 비교하여 % RETIC보정 수준의 증가를 보여줄 것이다.
본 발명의 EPO -R 작용제 펩타이드의 용도
본 발명의 펩타이드 화합물은 EPO의 생산 및 EPO와 EPO-R의 결합에 영향을 주고, 이에 의하여 영향을 받을 것으로 생각되는 많은 인자들의 평가를 포함하는 EPO의 생물학적 역할 (예컨대, EPO/EPO-R 신호 전달/수용체 활성화의 메커니즘)을 이해하기 위한 도구로서 시험관 내에서 유용하다. 본 발명의 펩타이드는 본 화합물이 개발을 촉진시키는 중요한 구조-활성화 관계(structure-activity-relationship)의 정보를 제공하기 때문에, EPO-R에 결합하는 다른 화합물의 개발에 있어서 또한 유용하다.
더욱이, EPO-R에 결합하는 그들의 능력에 기초하여, 본 발명의 펩타이드는 살아있는 세포; 고정화 세포; 생물학적 유체(fluids); 조직 쇄균액(homogenates); 정제된 천연 생물학적 물질 등에서 EPO-R을 검출하는 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 펩타이드의 표지화에 의하여, 그 표면에 EPO-R을 가지는 세포를 동정할 수 있다. 또한, EPO-R에 결합하는 그들의 능력에 기초하여, 본 발명의 펩타이드는 제자리(in situ) 염색, FACS (형광 활성화 세포 분류) 분석, 웨스턴 블로팅, ELISA (효소 연관 면역흡착 분석) 등에서 사용될 수 있다. 또한, EPO-R에 결합하는 그들의 능력에 기초하여, 본 발명의 펩타이드는 수용체의 정제 또는 세포 표면 (또는 투과성 세포의 내부)에서 EPO-R을 발현하는 세포를 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 또한 다양한 의학적 연구 및 진단 목적을 위한 상업적 시약으로서 이용될 수 있다. 그러한 용도에는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: (1) 다양한 기능 분석에서 후보 EPO-R 작용제의 활성을 정량하기 위한 측정 표준으로서의 용도; (2) 무작위 펩타이드 스크리닝, 즉 새로운 EPO-R 펩타이드 리간드의 군을 찾는데 있어서 차단 시약으로서의 용도, 상기 펩타이드는 본 발명의 EPO 펩타이드의 회수를 차단하기 위하여 사용될 수 있다; (3) EPO-R과 공동 결정화(co-crystallization)에서의 용도, 즉, X 선 결정학에 의하여 수용체/펩타이드 구조의 측정이 가능한, EPO-R에 결합된 본 발명의 펩타이드의 결정이 형성될 수 있다; (4) 적혈구 전구 세포 유도 글로빈 합성 및 헴(heme) 복합체 합성의 능력(capacity)을 측정하기 위한 용도 및 분화를 개시시키는 것에 의한 페리틴 수용체의 개수를 증가시키기 위한 용도; (5) EPO 의존 세포주, 예컨대 FDCP-1-mEPO-R 및 TF-1 세포주의 증식 및 성장을 유지시키기 위한 용도; (6) 방사능 발색단으로 본 발명의 펩타이드를 표지시키는 것에 관한 용도; 및 (7) EPO-R이 바람직하게 활성화되거나 또는 그러한 활성화가 알려진 EPO-R 작용제의 양에 대하여 편리하게 측정되는 것을 포함하는 기타의 연구 및 진단에서의 응용 등.
본 발명의 또 다른 측면에서는, 치료 방법 및 의약의 제조 방법이 제공된다. 본 발명의 펩타이드 화합물은 인간을 포함하는 온혈 동물에게 투여되어, 생체 내에서 EPO-R에 대한 EPO의 결합을 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명은 EPO의 결핍과 관련된 질환의 치료 방법을 포함하는 데, 상기 방법은 생체 내에서 EPO-R을 자극하여 EPO의 결핍과 관련된 증상을 완화하는데 충분한 양으로 본 발명의 펩타이드의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 신장 기능부족 및/또는 말기 신 부전/투석의 치료; AIDS와 관련된 빈혈; 만성 염증성 질병 (예를 들어, 류마티스 관절염 및 만성 창자 염증) 및 자가면역 질병과 관련된 빈혈의 치료; 및 수술 전에 환자의 적혈구 수의 증폭을 위한 용도를 발견할 수 있을 것이다. 본 발명의 펩타이드의 투여에 의하여 치료될 수 있는 기타의 질병 상태, 질환 및 혈액학적 불순(irregularity)에는 베타-지중해빈혈; 낭성섬유증; 임신 및 월경 장애; 미숙아의 조기 빈혈; 척수 손상; 우주비행(space flight); 급성 혈액 손실; 노화; 뇌졸중(stroke), 혀혈 (CNS 및 심장 양쪽 모두); 및 적혈구생성 이상과 연관된 다양한 종양 질병 상태가 포함된다.
다른 구체적인 예에서, 본 발명의 펩타이드 화합물은 적혈구의 저하 및 결핍을 특징으로 하지 않는 질환의 치료, 예컨대 수혈 전의 전치료(pretreatment)를 위하여 사용될 수도 있다. 또한, 본 발명의 화합물의 투여는 출혈시간의 감소를 가져올 수 있고, 따라서 수술 전에 환자에게 투여하는 용도 또는 출혈이 일어날 것으로 예상되는 경우의 조치를 위한 용도를 발견할 것이다. 또한, 본 발명의 화합물은 거대핵세포의 활성화에 있어서의 용도를 발견할 수 있을 것이다.
EPO는 혈관 내피 세포뿐만 아니라 중추 콜린성 뉴런에 분열유발 및 화학주성 효과를 가진다는 것이 증명된 바 있기 때문에 [예컨대, Amagnostou, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5978-5982 및 Konishi, et al. (1993) Brain Res. 609:29-35 참조], 본 발명의 화합물은 또한 다양한 혈관 질병의 치료, 예컨대 상처 치료 촉진; 곁관상 혈관의 성장을 촉진 (예컨대, 심근경색 이후에 발생할 수 있는 것); 외상 치료; 및 혈관 이식 후 치료를 위한 용도를 발견할 수 있을 것이다. 본 발명의 화합물은 다른 신경활성물질, 예컨대 신경전달물질과 비교하여 아세틸콜린의 낮은 절대 수준 또는 아세틸콜린의 낮은 상대 수준을 일반적으로 특징으로 하는 다양한 신경계 질환의 치료를 위한 용도를 또한 발견할 수 있을 것이다.
약학적 조성물
본 발명의 또 다른 측면에서는, 전술한 EPO-R 작용제 펩타이드 화합물의 약학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물의 투여에 의하여 완화 또는 조절된 조건은 앞에서 설명한 것을 포함한다. 그러한 약학적 조성물은 경구, 비경구 (근육내, 복막내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사), 경피 (수동적으로(passively) 또는 이온삼투요법 또는 전기천공법을 사용하여), 점막관통(transmucosal) (코, 질, 직장 또는 설하)의 투여 경로 또는 생체부식성(bioerodible) 삽입물을 사용한 투여를 위한 것일 수 있고, 각 경로의 투여에 적합한 투여형으로 제형화될 수 있다. 일반적으로, 약학적으로 허용가능한 희석제, 보존제, 용해화제, 유화제, 애주번트 및/또는 담체와 함께 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드, 또는 유도체의 효과적인 양을 포함하는 약학적 조성물이 본 발명에 의하여 이해되는 것이다. 그러한 조성물은 다양한 버퍼 함유 (예컨대, Tris-HCl, 아세트산염, 인산염), pH 및 이온 세기의 희석제; 첨가제, 예컨대 계면활성제 및 용해화제 (예컨대, Tween 20, Tween 80, Polysorbate 80), 항산화제 (예컨대, 아스코르빈산, 소듐 메타비설파이트), 보존제 (예컨대, 티메르졸, 벤질알콜) 및 충전물질 (예컨대, 락토스, 만니톨); 중합체 화합물, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 입자 조제물 속으로 그 물질의 혼입 또는 리포좀 속으로 그 물질의 혼입을 포함한다. 히알루론산(Hylauronic acid)이 또한 사용될 수 있다. 그러한 조성물은 본 발명 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 생체 내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다. 본 명세서에 참조로서 통합되는 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712]을 참조. 상기 조성물들은 액상형으로 제조되거나 건조 분말 (예컨대, 동결건조된 것) 형으로 제조될 수 있다.
경구 전달
본 명세서에 참조로서 통합되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) at Chapter 89]에서 일반적으로 기재되어 있는 경구 고체 투여형이 본 발명에서의 사용을 위하여 고려된다. 고체 투여형은 정제, 캡슐, 환제, 구내정제 또는 로젠지(lozenges), 카세제, 펠렛, 분말 또는 과립을 포함한다. 또한, 리포좀 또는 단백질유사체(proteinoid) 캡슐화가 본 발명의 조성물의 제형화에 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,925,673호에서 보고된 바 있는 단백질유사체 미세구와 같은 것). 리포좀 캡슐화가 사용될 수 있고, 그 리포좀은 다양한 중합체로부터 유도될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제5,013,556호). 치료를 위한 가능한 고체 투여형의 설명은 본 명세서에 참조로서 통합된 [Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G.S. Banker and C.T. Rhodes Chapter 10, 1979]에 기재되어 있다. 일반적으로, 그 제형은 EPO-R 작용제 펩타이드 (또는 그의 화학적으로 변형된 형태) 및 위의 환경에 대한 보호와 장에서 생물학적 활성 물질의 방출을 가능하게 하는 불활성 성분을 포함할 것이다.
또한, 본 발명에서의 사용을 위하여 불활성 희석제; 애주번트, 예컨대 습윤제, 유화제, 현탁용제; 및 감미제, 향미제 및 방향제를 포함하는 기타의 성분을 함유할 수 있는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 용액, 현탁액 및 시럽을 포함하는 경구 투여를 위한 액상 투여형이 고려된다.
상기 펩타이ㄷ는 화학적으로 변형되어 그 유도체의 경구 전달이 효과적으로 될 수 있다. 일반적으로, 고려될 수 있는 화학적 변형은 그 성분 분자 자체에 (a) 단백질분해의 억제; 및 (b) 위 또는 장으로부터 혈류 속으로의 섭취를 가능하게 하는 적어도 하나의 모이어티를 부착하는 것이다. 또한, 그 성분 또는 성분들의 전체적인 안정성의 증가 및 체내에서의 순환시간의 증가가 요구된다. 전술한 바와 같이, PEG화(PEGylation)는 약학적 사용을 위한 바람직한 화학적 변형이다. 사용될 수 있는 다른 모이어티는 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리프롤린, 폴리-1,3-디옥소란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸을 포함한다 [예컨대, Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," in Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, NY) pp. 367-383; 및 Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189 참조].
경구 제형에 있어서, 방출 위치는 위, 소장 (십이지장, 공장 또는 회장) 또는 대장일 수 있다. 당해 기술 분야의 숙련자는 위에서 용해되지 않지만 장의 십이지장 등에서 물질이 방출되는 제형을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방출은 상기 펩타이드 (또는 유도체)의 보호에 의하여 또는 위 환경을 지나서 예컨대 장에서의 상기 펩타이드 (또는 유도체)의 방출에 의하여 위 환경의 유해한 효과를 회피할 것이다.
완전한 위 저항성을 담보하기 위하여, 적어도 pH 5.0에서 불투과성인 코팅이 필수적이다. 장용 코팅으로서 사용되는 더욱 통상적인 불활성 성분의 예로는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), Eudragit L, Eudragit S 및 Shellac을 들 수 있다. 이들 코팅은 혼합된 필름(mixed films)으로서 사용될 수 있다.
코팅 또는 코팅의 혼합물은 위에 대한 보호를 의도하지 않은 정제 위에 또한 사용될 수 있다. 이것은 당 코팅 또는 연하(swallow)가 더 용이한 정제를 만드는 코팅을 포함한다. 캡슐은 건조 치료물질 (즉, 분말)의 전달을 위한 단단한 껍질 (예컨대, 젤라틴)로 이루어질 수 있고, 액상 형을 위한 연질 젤라틴 껍질이 사용될 수 있다. 카세제(cachets)의 껍질 물질은 두꺼운 전분 또는 기타의 식용 종이일 수 있다. 환제, 로젠지, 주형 정제 또는 정제 가루약(tablet triturates)을 위하여, 습윤 매싱(massing) 기술이 사용될 수 있다.
상기 펩타이드 (또는 유도체)는 입자 크기가 약 1 mm인 과립 또는 펠렛의 형태의 미세 다중입자(fine multiparticulates)의 제형에 포함될 수 있다. 캡슐 투여를 위한 물질의 제형은 또한 분말, 약하게 압축된 플러그(plugs) 또는 정제일 수 있다. 이들 치료제는 압착에 의하여 제조될 수 있다.
착색제 및/또는 감미제가 또한 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드 (또는 유도체)는 제형화 (예컨대, 리포좀 또는 미세구 캡슐화에 의하여) 된 후, 예컨대, 착색제 및 감미제를 함유하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내로 다시 함유될 수 있다.
희석 또는 불활성 물질로 펩타이드 (또는 유도체)를 희석시키거나 또는 그 부피를 증가시킬 수 있다. 이들 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, α-락토스, 무수 락토스, 셀룰로오스, 수크로스, 변형 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 삼인산칼슘, 타산마그네슘 카보네이트 및 염화나트륨을 포함하는 무기염이 충전제로서 또한 사용될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 희석제 중의 일부로 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이 있다.
붕괴제(disintegrants)가 고체 투여형 속으로 치료제의 제형에 포함될 수 있다. 붕괴제로서 사용되는 물질은 시판중인 전분 기재의 붕괴제, Explotab를 포함하는 전분을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전분글리콜산나트륨(sodium starch glycolate), 앰버라이트(Amberlite), 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 울트라아밀로펙틴, 알긴산나트륨, 젤라틴, 오렌지필(orange peel), 산 카르복시메틸 셀룰로오스(acid carboxymethyl cellulose), 천연 스폰지 및 벤토나이트(bentonite)가 모두 사용될 수 있다. 상기 붕괴제는 또한 불용성 양이온 교환 수지일 수 있다. 분말형 검(gums)이 붕괴제 및 결합제로서 사용될 수 있고, 아가, 카라야(Karaya) 또는 트라가칸트(tragacanth) 등의 분말형 검을 포함할 수 있다. 알긴산 및 그의 나트륨 염이 또한 붕괴제로서 유용하다.
결합제가 펩타이드 (또는 유도체) 제제를 함께 유지하여 경질 정제를 형성하기 위하여 사용될 수 있고, 이는 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴 등의 천연물로부터의 물질을 포함할 수 있다. 기타의 것으로 메틸 셀룰로오스 (MC), 에틸 셀룰로오스 (EC) 및 카르복시메틸 셀룰로오스 (CMC)이 포함된다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 (HPMC) 양쪽 모두가 알콜 용액 내에서 펩타이드 (또는 유도체)를 과립화 하는데 사용될 수 있다.
마찰감소제(antifrictional agent)가 제형화 공정 도중에 점착을 방지하기 위하여 펩타이드 (또는 유도체)의 제형에 포함될 수 있다. 윤활제가 펩타이드 (또는 유도체) 및 주형 벽 사이의 막으로서 사용될 수 있고, 이들은 그의 마그네슘염 및 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액상 파라핀, 식물성 오일 및 왁스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 라우릴 황산나트륨, 라우릴 황산마그네슘, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, Carbowax 4000 및 6000 등의 가용성 윤활제가 또한 사용될 수 있다.
제형화 중의 약물의 유동성을 향상시킬 수 있는 글리단트(glidants)가 압착공정 중의 재배열을 돕기 위하여 첨가될 수 있다. 글리단트에는 전분, 탈크, 발열 실리카(pyrogenic silica) 및 수화 실리코알루미네이트가 포함될 수 있다.
수성(水性) 환경 속으로 펩타이드 (또는 유도체)의 용해를 돕기 위하여 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 예컨대 라우릴 황산나트륨, 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트를 포함할 수 있다. 양이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 염화 벤즈알코늄 또는 염화 벤즈에토뮴을 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제형 내에 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 계면활성제의 목록에는 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터 오일 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스가 있다. 이들 계면활성제는 단독으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 단백질 또는 유도체의 제형 중에 존재할 수 있다.
펩타이드 (또는 유도체)의 섭취를 잠재적으로 강화시키는 첨가물은 예컨대 지방산 올레인산, 리놀산 및 리놀렌산이다.
방출이 조절된 구강 제형이 바람직할 것이다. 펩타이드 (또는 유도체)는 확산 똔느 침출 매커니즘에 의하여 방출되게 하는 불활성 매트릭스, 예컨대 검(gums) 내에 혼입될 수 있다. 서서히 분해하는 매트릭스가 제형 중에 또한 혼입될 수 있다. 일부 장용 코팅은 또한 지연 방출 효과를 가진다.
조절된 방출의 또 다른 형태는 오로스 치료 시스템(Oros therapeutic system; Alza Corp.)에 기초한 방법에 의하는데, 즉 물이 들어갈 수 있고 삼투 효과에 기인하여 단일의 작은 통로를 통하여 약물이 나올 수 있는 반투과성 막 내에 약물이 포함된다.
기타의 코팅들이 제형을 위하여 사용될 수 있다. 이들은 코팅 팬(pan) 내에 적용할 수 있는 다양한 당류를 포함한다. 펩타이드 (또는 유도체)는 또한 필름 코팅 정제로 주어질 수 있고, 이 경우 사용되는 물질은 2개의 군으로 나누어진다. 제1 군은 비장용(nonenteric) 물질이고, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 메틸히드록시-에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸 셀룰로오스, 카르복시-메틸 셀룰로오스 나트륨, 프로비돈(providone) 및 폴리에틸렌 글리콜류를 포함한다. 제2 군은 통상적으로 프탈산의 에스테르인 장용(enteric) 물질로 이루어진다. 물질의 혼합이 최적의 필름 코팅을 제공하기 위하여 사용될 수 있다. 필름 코팅은 팬 코팅기에서 또는 유동상(fluidized bed)에서 또는 압착 코팅에 의해서 수행될 수 있다.
비경구 전달
비경구 투여를 위한 본 발명에 따른 조제물은 멸균 수성(aqueous) 용액 또는 비수성(non-aqueous) 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매 또는 운반체의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 (예컨대, 올리브 오일 및 옥수수 오일), 젤라틴 및 주입가능한 유기 에스테르 (예컨대, 올레인산 에틸)을 들 수 있다. 그러한 투여형은 애주번트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 또한 함유할 수 있다. 이들은, 예를 들어 박테리아 보존 필터를 통한 여과에 의하여, 멸균제를 조성물 속으로 혼입시키는 것에 의하여, 조성물을 광조사시키는 것에 의하여 또는 조성물을 가열하는 것에 의하여 멸균될 수 있다. 이들은 또한 멸균수 또는 다른 멸균된 사용 전에 즉시 주입가능한 일부 매질을 사용하여 제조될 수 있다.
직장 또는 질 전달
직장 또는 질 투여를 위한 조성물은 활성 물질 이외에 코코아 버터 또는 좌약 왁스 등의 부형제를 함유할 수 있는 좌약 (suppositories)이 바람직하다. 또한, 코 또는 설하 투여를 위한 조성물이 당해 기술 분야에 잘 알려진 표준 부형제로 제조될 수 있다.
폐 전달
본 발명에서는 EPO-R 작용제 펩타이드 (또는 그의 유도체)의 폐 전달이 또한 고려된다. 펩타이드 (또는 유도체)는 흡입할 때 포유류의 폐로 전달되고, 폐의 상피 표면을 가로질러 혈류로 들어간다 [예컨대, Adjei, et al. (1990) Pharmaceutical Research 7:565 569; Adjei, et al. (1990) Int. J. Pharmaceutics 63:135 144 (레우프롤라이드 아세테이트); Braquet, et al. (1989) J. Cardiovascular Pharmacology 13 (sup5):143 146 (엔도텔린-1); Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206 212 (α1-안티트립신); Smith, et al. (1989) J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (α-1-프로테이나제); Oswein, et al. (1990) "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (재조합 인간 성장 호르몬); Debs, et al. (1988) J. Immunol. 140:3482 3488 (인터페론-γ 및 종양 괴사 인자 α); 및 플라츠(Platz) 등의 미국 특허 제5,284,656호 (과립구 콜로니 자극 인자) 참조]. 전신 효과용 약물의 폐 전달을 위한 방법 및 조성물이 왕(Wong) 등의 미국 특허 제5,451,569호에 기재되어 있다.
분무기, 계량흡입기 및 분말 흡입기를 비제한적으로 포함하는 치료 물질의 폐 전달을 위한 광범위한 기계적 장치가 본 발명의 실시에 있어서의 사용을 위하여 고려된며, 이들 모두는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 것이다. 본 발명의 실시에 적합한 시판중인 장치의 일부 특유한 예로는 울트라벤트(Ultravent) 분무기 (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); 아크론 II(Acorn II) 분무기 (Marquest Medical Products, Englewood, CO); 벤톨린(Ventolin) 계량 흡입기 (Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC); 및 스핀할러(Spinhaler) 분말 흡입기 (Fisons Corp., Bedford, MA)를 들 수 있다.
그러한 장치 모두는 펩타이드 (또는 유도체)의 분배(dispensing)에 적합한 제형의 사용을 요구한다. 전형적으로, 각 제형은 사용되는 장치 종류에 특이적이고, 치료에 유용한 통상의 희석제, 애주번트 및/또는 담체 이외에 적합한 분사제 물질의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 복합체(complexes)를 포함하는 리포좀, 미세캡슐 또는 미세구, 또는 다른 종류의 담체의 사용이 고려된다. 또한, 화학적으로 변형된 펩타이드가 화학 변형의 종류 또는 사용되는 장치의 종류에 의존하는 상이한 제형에 있어서 제조될 수 있다.
제트(jet) 또는 초음파 분무기로의 사용에 적합한 제형은 전형적으로 용액 ml 당 생물학적 활성 단백질 약 0.1 내지 25 mg의 농도로 물에 용해된 펩타이드 (또는 유도체)를 포함할 것이다. 그 제형은 버퍼 및 단순한 당 (예컨대, 단백질 안정화 및 삼투압의 조절을 위한 것)을 또한 포함할 수 있다. 상기 분무기 제형은 또한 계면활성제를 함유하여, 에어로졸을 형성하는 중 용액의 원자화(atomization)에 기인한 펩타이드 (또는 유도체)의 응집이 유도된 표면을 감소시키거나 예방할 수 있다.
계량 흡입 장치로의 사용을 위한 제형은 계면활성제의 조력으로 분사제 중에 현탁된 펩타이드 (또는 유도체)를 함유하는 미세하게 분할된 분말을 일반적으로 포함한다. 분사제는 이러한 목적을 위하여 사용되는 임의의 통상적인 물질일 수 있는 데, 예컨대 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 포함하는 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본 또는 탄화수소, 또는 이들의 조합물을 들 수 있다. 적합한 계면활성제는 소르비탄 트리올레이트 및 소야 레시틴(soya lecithin)을 포함한다. 올레인산이 계면활성제로서 또한 유용할 수 있다.
분말 흡입 장치로부터 분배되는 제형은 펩타이드 (또는 유도체)를 함유하는 미세하게 분할된 건조 분말을 포함할 것이고, 또한 충전제(bulking agent), 예컨대 락토스, 소르비톨, 수크로스 또는 만니톨을 상기 장치로부터 상기 분말의 분배를 촉진시킬 수 있는 양, 예컨대 상기 제형의 50 내지 90 중량%로 포함할 수 있다. 펩타이드 (또는 유도체)는 폐 말단까지 가장 효과적으로 전달하기 위하여 평균 입자크기가 10 mm (또는 미크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 mm인 미립자 형태로 매우 적절하게 제조되어야만 한다.
코 전달
EPO-R 작용제 펩타이드 (또는 유도체)의 코 전달이 또한 고려된다. 코 전달은 폐에서 상기 물질의 침착이 필요없이 치료물질을 코로 투여한 후, 직접적으로 혈류로 상기 펩타이드의 통과를 가능하게 한다. 코전달을 위한 제형은 덱스트란 또는 시클로덱스트란을 가진 것을 포함한다. 코 전달을 촉진시키기 위해 사용되는 다른 투과 증진제가 본 발명의 펩타이드로의 사용을 위해 또한 고려된다 (예컨대, 그 전체가 본 명세서에 참조로서 통합되는 2003년 12월 17일에 제출된 국제 특허 공보 WO 2004056314)
투여량
모든 상기 펩타이드 화합물에 있어서, 추가적인 연구가 수행됨에 따라 다양한 환자들에 있어서 다양한 조건들의 치료를 위한 적절한 투여량 수준에 관한 정보가 나타날 것이고, 통상의 숙련된 실시자는 수용자의 치료 상황, 연령 및 건강 상태을 고려하여 적절한 투여를 확실히 할 수 있을 것이다. 선택된 투여량은 목적하는 치료 효과, 투여 경로 및 목적하는 치료의 기간에 의존한다. 일반적으로, 매일 0.001 내지 10 mg/체중 kg의 투여량의 수준이 포유류에게 투여된다. 일반적으로, 정맥 주사 또는 주입에 있어서, 투여량은 더 낮을 수 있다.
특정의 구체적인 예에 있어서, 본 발명의 펩타이드 중 어느 하나가 투석 전 또는 투석 중인 (예비투석(pre-dialysis) 또는 투석 환자) 신부전을 가진 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 구체적인 예에서 그 치료 투여량의 범위는 그 개체의 체중 1 kg 당 화합물 0.025 내지 0.2 mg (0.025∼0.2 mg/kg)일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 투여 범위는 0.05∼0.1 mg/kg인 것이 바람직할 수 있다. 더욱이, 내과의는 처음에 단계적으로 증가하는 투여량을 사용할 수 있는데, 치료를 받는 각 개체에 있어서 그들의 개별적인 헤모글로빈 반응에 기초하여 0.025 mg/kg으로 시작하여, 약 0.025 mg/kg의 증가분으로 투여량을 적가(titrate)할 수 있다. 따라서, 적절한 헤모글로빈 반응을 얻을 때까지 각 개체에 있어서 투여량을 적가할 수 있다. 예비투석 또는 투석 환자인 개체의 경우에 있어서, 적합한 헤모글로빈 반응은 정상 헤모글로빈 수준 (14∼15 g/dL) 또는 내과의에 의하여 결정될 수 있는 또 다른 헤모글로빈 수준을 대략적으로 달성하는 것일 수 있다. 이러한 구체적인 예에서, 각각의 예비투석 또는 투석 환자에 대한 약리학적 활성 투여량 (PAD)은 0.067∼0.075 mg/kg일 것으로 예상된다. 이러한 구체적인 예의 이점은 각 개별 환자에 있어서 다른 현재의 적혈구생성 자극제 (ESAs)의 경우처럼 매주가 아니라 3 내지 4 주에 한 번인 더 낮은 투여 빈도일 것으로 예상된다. 많은 투여 경로가 사용될 수 있다 (전술한 바와 같이 경구, 정맥 내 등). 투석 환자에 있어서 바람직한 투여 경로는 정맥 내 투여일 것이다. 예비투석 환자에 있어서 바람직한 투여 경로는 피하 투여일 것이다. 다른 특정의 구체적인 예에서, 전술한 화합물 중의 하나가 악성종양과 연관된 빈혈을 가진 개체 (종양 환자)를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구체적인 예에서 치료 투여량의 범위는 예비투석 또는 투석 환자의 투여량 범위의 3 내지 5 배일 것으로 예상된다 (즉, 0.075∼0.5 mg/kg). 더 구체적으로, 상기 투여량 범위는 0.2∼0.4 mg/kg가 바람직할 것이다. 전술한 것처럼, 종양 환자를 치료하는 내과의는 0.075 mg/kg으로 시작하여, 적절한 헤모글로빈 반응을 얻을 때까지 약 0.075 mg/kg의 증가분으로 투여량을 증가시켜 그 투여량을 적가할 수 있다. 각각의 개별 종양 환자를 위한 PAD는 약 0.25 mg/kg일 것으로 예상된다. 또한, 각 개별 환자에 있어서 매 3 내지 4 주의 더 낮은 빈도의 투여량의 이점이 예상된다. 더욱이, 종양 환자에 있어서 다른 이점은 그물적혈구(reticulocyte) 자극 및 헤모글로빈 발생 사이의 지체기(lag phase) 동안 헤모글로빈의 감소를 막기 위하여 화학요법 전 (예를 들어, 3∼5 일 전)에 그 투여량이 투여되거나 또는 화학요법과 함께 공동 투여될 수 있다는 것이다. 많은 투여 경로가 사용될 수 있다 (전술한 바와 같이 경구, 정맥 내 등). 피하 투여가 종양 환자의 바람직한 투여 경로 일 수 있다. 예비투석, 투석 또는 종양환자를 치료하는데 사용되는 바람직한 화합물은 아래에 기재되어 있는 것들을 포함한다.
카르바메이트 결합, 사르코신이 없음 및 PEG 분자량의 범위 (여기서는 SEQ ID NO: 1으로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00041
카르바메이트 결합, 사르코신이 없음 및 바람직한 PEG 분자량 (여기서는 SEQ ID NO: 1으로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00042
Figure 112008000507936-PCT00043
카르바메이트 결합, 사르코신을 가짐 및 PEG 분자량의 범위 (여기서는 SEQ ID NO: 2로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00044
카르바메이트 결합, 사르코신을 가짐 및 바람직한 PEG 분자량 (여기서는 SEQ ID NO: 2으로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00045
Figure 112008000507936-PCT00046
아미드 결합, 사르코신 없음 및 PEG 분자량의 범위 (여기서는 SEQ ID NO: 1로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00047
아미드 결합, 사르코신 없음, 바람직한 PEG 분자량 (여기서는 SEQ ID NO: 1로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00048
Figure 112008000507936-PCT00049
아미드 결합, 사르코신을 가짐 및 PEG 분자량의 범위 (여기서는 SEQ ID NO: 2로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00050
아미드 결합, 사르코신을 가짐 및 바람직한 PEG 분자량 (여기서는 SEQ ID NO: 2로 나타냄)의 경우:
Figure 112008000507936-PCT00051
Figure 112008000507936-PCT00052
본 발명의 펩타이드 (또는 그들의 유도체)는 하나 또는 그 이상의 추가적인 활성 성분 또는 약학적 조성물과 함께 투여될 수 있다.
본 발명을 다음의 실시예를 통하여 다시 설명한다. 그러나, 이러한 실시예 및 본 명세서 전체에 기재된 기타의 예는 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명 또는 임의의 예시적 형태의 범위 및 의미를 제한하는 것이 아니다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 기재되어 있는 임의의 구체적인 바람직한 실시 상태로 한정되지 않는다. 사실, 본 발명의 많은 변형 및 변화가 본 명세서의 기재를 통하여 당해 기술 분야의 숙련자에게 명백할 수 있으며, 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 청구항의 용어와 청구항에 의하여 부여되는 전체 등가물의 범위에 의하여서만 한정될 것이다.
실시예 1: 고상 합성법에 의한 EPO -R 작용제 펩타이드 이량체의 합성
단계 1 - Cbz - TAP 의 합성:
무수 DCM (100 ml) 내에 시판중인 디아민 (Aldrich Chemical Co.의 "TAP") (10 g, 67.47 mmol)을 함유하는 용액을 0℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물의 온도를 계속해서 0℃로 유지하면서 적하 깔때기를 통하여 6∼7 시간에 걸쳐 무수 DCM (50 ml) 내의 벤질 클로로포르메이트 (4.82 ml, 33.7 mmol) 용액을 천천히 첨가하고, 그 후 실온으로 온도를 증가시켰다 (∼25℃). 추가로 16 시간이 지난 후에, 상기 DCM을 진공하에서 제거하고, 그 잔류물을 3N HCl 및 에테르 사이에서 분할시켰다(partitioned). 수성(水性)층을 회수하여 50% aq. NaOH로 pH 8∼9 까지 중화시키고, 아세트산 에틸로 추출하였다. 아세트산 에틸층을 무수 Na2SO4로 건조시킨 후, 진공하에서 농축시켜 크루드(crude) 모노-Cbz-TAP을 만들었다 (5g, 약 50% 수율). 이 화합물을 추가적인 정제 없이 다음 반응을 위해 사용하였다.
Figure 112008000507936-PCT00053
단계 2 - Cbz - TAP - Boc 의 합성:
핵산 (25 ml) 중의 상기 Cbz-TAP (5 g, 17.7 mmol)의 강하게 교반된 현탁액에 Boc2O (3.86 g, 17.7 mmol)을 첨가하고, 밤새 RT에서 계속하여 교반하였다. 그 반응 혼합물을 DCM (25 ml)으로 희석하고, 10% aq. 시트르산 (2X), 물 (2X) 및 염 수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 진공하에서 농축시켰다. 이러한 크루드 산물 (5g 산출)을 다음 반응에 직접적으로 사용하였다.
Figure 112008000507936-PCT00054
단계 3 - Boc - TAP 의 합성:
전술한 반응으로부터의 크루드 산물을 메탄올(25 ml)에 용해시키고, 풍선 압력(balloon pressure)하에서 16 시간 동안 탄소 상의 5% Pd (5% w/W) 존재하에 수소화시켰다. 그 혼합물을 여과하고 메탄올로 세척한 후, 그 여과물을 진공에서 농축시켜 크루드 H-TAP-Boc 산물 (3.7 g 산출)을 만들었다. 단계 1∼3 후의 Boc-TAP의 전체적인 대략적인 수율은 44%이었다 (사용된 Cbz-Cl의 양에 기초하여 계산함).
Figure 112008000507936-PCT00055
단계 4 - 텐타겔 -링커( TentaGel - Linker )의 합성:
텐타겔 브로마이드 (2.5 g, 0.48 mmol/g, 독일의 Rapp Polymere로 부터), 페놀릭 링커 (5 당량) 및 K2CO3 (5 당량)을 20 ml DMF 중에서 14 시간 동안 70℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 그 레진을 세척하고 (0.1 N HCl, 물, ACN, DMF, MeOH), 건조시켜 호박색의 레진을 만들었다.
Figure 112008000507936-PCT00056
단계 5 - 텐타겔 -링커- TAP ( Boc )의 합성:
상기 레진 2.5 gm 및 H-TAP-Boc (1.5gm, 5 당량) 및 빙초산 (34 ㎕, 5 당량)을 1:1 MeOH-THF의 혼합물 중에 넣어, 밤새 진탕시켰다. THF 중의 소듐 시아노보로하이드라이드 (5 당량)의 1 M 용액을 여기에 첨가하고, 또다시 7 시간 동안 진탕시켰다. 상기 레진을 여과하고 세척 (DMF, THF, 0.1 N HCl, 물, MeOH)한 후 건조시켰다. 소량의 레진을 DCM 중의 Bz-Cl 및 DIEA로 벤조일화 시키고, 70% TFA-DCM로 분할시킨 후, LCMS 및 HPLC로 확인하였다.
Figure 112008000507936-PCT00057
단계 6 - 텐타겔 -링커- TAP - Lys 의 합성:
얻어진 레진을 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH의 활성화 용액 (5 당량의 아미노산 및 5 당량의 HATU을 DMF 중에 0.5 M로 용해시키고, 이어서 10 당량의 DIEA를 첨가하여 제조됨)으로 처리하고, 14 시간 동안 온화하게 진탕시켰다. 잔류 아미노기를 DCM 중의 10% 무수초산, 20% 피리딘 용액으로 그 레진을 20분 동안 처리하여 보호시키고(capped), 이어서 전술한 것처럼 세척하였다. DMF 중의 30% 피페리딘에서 그 레진을 20분 동안 온화하게 진탕하여 Fmoc기를 제거하고, 이어서 세척(DMF, THF, DCM, MeOH)하여 건조시켰다.
Figure 112008000507936-PCT00058
단계 7 - 텐타겔 -링커- TAP - Lys ( 펩타이드 ) 2 의 합성:
앞에서 얻어진 레진으로 HBTU/HOBt 활성화로의 Fmoc-아미노산 커플링 및 피페리딘으로 Fmoc의 제거의 반복 사이클을 수행시켜 양쪽 펩타이드 사슬을 동시에 만들었다. 이것은 Applied Biosystems, Inc.로부터 구득한 ABI 433 자동화 펩타이드 합성장치에서 편리하게 수행되었다. 최종 Fmoc 제거 후에, 말단 아민기를 DMF에서 20분 동안 무수초산 (10 당량) 및 DIEA (20 당량)으로 아실화시킨 후, 전술한 것처럼 세척하였다.
Figure 112008000507936-PCT00059
단계 8 - 레진으로부터의 분리:
전술한 레진을 TFA (82.5%), 페놀 (5%), 에탄디티올 (2.5%), 물 (5%) 및 티오아니솔 (5%)의 용액 중에 3시간 동안 실온에서 현탁시켰다. 또 다른 분리 혼합물(cocktails), 예컨대 TFA (95%), 물 (2.5%) 및 트리이소프로필실란 (2.5%)이 또한 사용될 수 있다. TFA 용액을 5℃까지 냉각시키고, Et2O 속으로 부어 펩타이드를 침전시켰다. 감압하에서의 여과 및 건조로 목적하는 펩타이드를 얻었다. C18 칼럼을 가진 제조용 HPLC를 통한 정제로 순수한 펩타이드를 얻을 수 있었다.
Figure 112008000507936-PCT00060
단계 9 - 분자내 이황화 결합의 형성을 위한 펩타이드의 산화:
펩타이드 이량체를 20% DMSO/물 (1 mg 건조중량 펩타이드/mL)에 용해시키고, 실온에서 36 시간동안 방치하였다. 그 반응 혼합물을 C18 HPLC 칼럼 (Waters Delta-Pak C18, 15 미크론 입자 크기, 300 옹스트롬 구멍 크기, 40 mm x 200 mm 길이)으로 로딩한 후, 5 내지 95% ACN 구배의 선형 ACN/water/0.01% TFA으로 40분에 걸쳐 그 펩타이드를 정제하였다. 목적하는 펩타이드를 함유하는 분획의 동결건조(lyopholization)로 솜털 같은 백색 고체로서 생성물을 얻을 수 있었다.
Figure 112008000507936-PCT00061
단계 10 - 말단 - NH 2 기의 PEG 화:
카르바메이트 결합을 통한 PEG 화: 상기 펩타이드 이량체를 건조 DMF 중에서 1.5 당량 (몰 기준)의 활성화 PEG 화학종 (mPEG-NPC, NOF Corp., 일본)과 혼합하여 맑은 용액을 얻을 수 있었다. 5분 후에 4 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 14 시간 동안 교반한 후, C18 역상 HPLC로 정제하였다. PEG화 펩타이드의 구조를 MALDI 질량분석기(mass)에 의하여 확인하였다. 정제된 펩타이드를 아래에 개괄한 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제도 또한 수행하였다. 아래의 개요는 SEQ ID NO: 3을 사용한 mPEG-NPC PEG화를 나타낸 것이다.
Figure 112008000507936-PCT00062
아미드 결합을 통한 PEG 화: 상기 펩타이드 이량체를 건조 DMF 중에서 1.5 당량 (몰 기준)의 1 당량 활성화 PEG 화학종 (PEG-SPA-NHS, Shearwater Corp, 미국)과 혼합하여 맑은 용액을 얻을 수 있었다. 5분 후에 10 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, C18 역상 HPLC로 정제하였다. PEG화 펩타이드의 구조를 MALDI 질량분석기(mass)에 의하여 확인하였다. 정제된 펩타이드를 아래에 개괄한 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제도 또한 수행하였다. 아래의 개요는 SEQ ID NO: 3을 사용한 PEG-SPA-NHS PEG화를 나타낸 것이다.
Figure 112008000507936-PCT00063
단계 11 - 이온 교환 정제:
출발 이량체 펩타이드를 보유하는 능력 이외에, 상기 펩타이드-PEG 접합체를 미반응 (또는 가수분해된) PEG로부터 분리하는 능력에 있어서, 몇 가지 교환 지지체(exchange supports)를 조사하였다. 이온 교환 수지 (2∼3 g)를 1 cm 칼럼 속으로 로딩하고, 이어서 그 나트륨 형으로 전환시키고 (용리액(elutant)이 pH 14, 약 5 칼럼 부피에 이를 때까지 칼럼 위로 0.2 N NaOH를 로딩시킴), 그 후 수소 형으로 전환시키고 (용리액이 로딩 pH, 약 5 칼럼 부피에 대등할 때까지, 0.1 N HCl 또는 0.1 M HOAc로 용리시킴), 이어서 25% ACN/물로 pH 6에 이를 때까지 세척하였다. 접합 전의 펩타이드 또는 펩타이드-PEG 접합물을 25% ACN/물 (10 mg/mL) 중에 용해시키고, TFA로 <3으로 pH를 조절한 후, 칼럼 위에 로딩하였다. 2∼3 칼럼 부피의 25% ACN/물로 세척 및 5 ml 분획의 수집 후에, 그 펩타이드를 25% ACN/물 중의 0.1 M NH4OAc로 용리시켜 칼럼으로부터 방출시키고, 다시 5 ml 분획을 수집하였다. HPLC를 통한 분석은 목적하는 펩타이드를 함유하는 분획을 나타내었다. 증발성 빛-분산 검출기 (Evaporative Light-Scattering Detector; ELSD)로의 분석은 펩타이드가 칼럼 에 보유되고 NH4OAc 용액으로 용리되었을 때 접합되지 않은 PEG가 오염물로서 관찰되지 않았다는 것을 나타내었다. 펩타이드가 최초 세척 버퍼 (일반적으로 첫 번째 2개 분획) 중에 용리되었을 때, 목적하는 PEG-접합물 및 과량의 PEG의 분리가 없음이 관찰되었다.
다음의 칼럼은 펩타이드 및 펩타이드-PEG 접합물 양쪽 모두를 성공적으로 보유하였고, 펩타이드-PEG 접합물을 비접합 펩타이드로부터 성공적으로 정제하였다.
이온 교환 수지
지지체 출처
모노 S HR 5/5 강한 양이혼 교환 예비 로딩 칼럼 (Mono S HR 5/5 strong cation exchange pre-loaded column) Amersham Biosciences
SE53 셀룰로오스, 마이크로과립 강한 양이온 교환 지지체 (SE53 Cellulose, microgranular strong cation exchange support) Whatman
SP 세파로스 빠른 흐름 강한 양이온 교환 지지체 (SP Sepharose Fast Flow strong cation exchange support) Amersham Biosciences
실시예 2: 단편 축합에 의한 EPO -R 작용제 펩타이드 이량체의 합성
단계 1 - ( Cbz ) 2 - Lys 의 합성:
리신을 표준 조건하에서 벤질 클로로포르메이트 용액과 반응시켜 그의 두 개의 아미노기가 Cbz로 보호된 리신을 얻었다.
Figure 112008000507936-PCT00064
단계 2 - Boc - TAP 의 합성:
실시예 1의 단계 1 내지 3에 기재되어 있는 것과 같이 Boc-TAP을 합성하였다.
단계 3 - ( Cbz ) 2 - Lys 및 Boc - TAP 의 결합:
(Cbz)2-Lys 및 Boc-TAP을 표준 결합 조건하에서 결합시켜 (Cbz)2-Lys-TAP-Boc을 얻었다.
Figure 112008000507936-PCT00065
단계 4 - Lys - TAP - Boc :
상기 반응으로부터의 크루드 생성물을 메탄올 (25 ml)에 용해시킨 후, 탄소 위의 5% Pd (5% w/W)의 존재하에서 풍선 압력하에서 16 시간 동안 수소화시켰다. 그 혼합물을 여과하고, 메탄올로 세척한 후, 그 여과물을 진공에서 농축시켜 크루드 Lys-TAP-Boc 생성물을 만들었다.
Figure 112008000507936-PCT00066
단계 5 - 단편 축합에 의한 펩타이드 단량체의 합성:
펩타이드 단량체 서열의 4개의 펩타이드 단편을 표준 기술에 의하여 합성하였다. 그 후, 이들 부분적으로 보호된 단편들을 결합의 두 개의 독립적인 순환(rounds)을 수행하였다. 제1 순환에서, 단량체의 N-말단 절반을 두 개의 펩타이드 단편을 결합시키는 것에 의하여 형성시키고, 단량체의 C-말단 절반을 나머지 두 개의 펩타이드 단편을 결합시키는 것에 의하여 형성시켰다. 결합의 제2 순환에서, 상기 N-말단 및 C-말단 절반들을 결합시켜 완전히 보호된 단량체를 형성시켰다. 그 후, 그 단량체는 표준 기술에 의하여 OBn-탈보호된다.
Figure 112008000507936-PCT00067
단계 6 - 분자내 이황화 결합의 형성을 위한 펩타이드 단량체의 산화:
그 후, OBn-탈보호된 농축 펩타이드 단량체 (SEQ ID NO: 12)를 요오드화물 하에서 산화시켜 단량체의 Acm-보호 시스테인 잔기들 사이에서 분자내 이황화 결합을 형성시켰다.
Figure 112008000507936-PCT00068
단계 7 - 펩타이드 이량체의 형성을 위한 산화된 OBn - 탈보호 단량체에 Lys -TAP-Boc의 결합:
Lys-TAP-Boc를 표준 조건하에서 2 배 몰(molar) 과량의 산화된 OBn-탈보호 단량체에 결합시켜 펩타이드 이량체를 형성시켰다. 그 후, 그 펩타이드 이량체를 표준 조건하에서 탈보호시켰다.
Figure 112008000507936-PCT00069
단계 8 - 탈보호 이량체의 PEG 화:
그 후, 탈보호된 펩타이드 이량체를 실시예 1의 단계 10에서 설명한 바와 같이 PEG화 시켰다.
단계 9 - 이온 교환 정제:
그 후, PEG화 펩타이드 이량체를 실시예 1의 단계 11에서 설명한 바와 같이 정제하였다.
실시예 3: 시험관 내 활성 분석
이번 실시예에서는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 활성 및 능력을 평가하는데 유용한 다양한 시험관 내 분석법을 설명한다. 이들 분석에서의 결과들은 본 발명의 신규한 펩타이드가 EPO-R에 결합하고 EPO-R 신호를 활성화시킨다는 것을 증명한다. 더욱이, 이들 분석에서의 결과는 그 신규의 펩타이드 조성물이 이전에 기재된 바 있었던 EPO 유사 펩타이드와 비교할 때 EPO-R 결합 친화도 및 생물학적 활성의 놀랄만한 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.
EPO-R 작용제 펩타이드 이량체를 실시예 1 또는 실시예 2에서 기재된 방법에 따라 제조하였다. 이들 펩타이드 이량체의 능력을 리포터(reporter) 분석, 증식 분석, 경쟁적 결합 분석 및 C/BFU-e 분석을 포함하는 시험관 내 활성 분석법의 시리즈를 사용하여 평가하였다. 이들 4가지 분석을 아래에서 더 상세하게 설명한다.
이들 시험관 내 분석의 결과를 표 2에 요약하였다.
1. 리포터 분석
이 분석은 마우스 예비 B 세포주 (murine pre-B-cell line) 유래 리포터 세포, 즉 Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux를 기반으로 한다. 이러한 리포터 세포주는 인간 GCSF 수용체의 세포내 부분에 인간 EPO 수용체의 세포외 부분을 포함하는 키메라(chimeric) 수용체를 발현한다. 이러한 세포주는 fos 프로모터 구동(driven) 루시퍼라제 리포터 유전자 구조물로 추가적으로 트랜스펙션된다. 적혈구조혈(erythropoietic) 제제의 첨가를 통한 이러한 키메라 리포터의 활성화는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 가져오고, 따라서 루시퍼라제의 기질 루시페린의 첨가에 따라 빛을 발생시킨다. 따라서, 그러한 세포에서 EPO-R 활성화의 수준을 루시퍼라제 활성의 측정을 통하여 정량할 수 있다.
상기 Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux 세포를 10% 소태아혈청 (FBS; Hyclone), 10% WEHI-3 상청액 (WEHI-3 세포 (ATCC # TIB-68)의 배양물로부터의 상청액) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 분석하기 약 18 시간 전에, 세포를 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액으로 보충된 DMEM/F12 배지로 이동시켜 굶주리게 하였다. 분석 당일에, 세포를 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12 배지로 한 번 세척하고, 1 X 106 세포/mL를 알고 있는 테스트 펩타이드의 농도의 존재하에서, 또는 양성 대조군으로서 EPO (R & D Systems Inc., 미니애폴리스, MN)와 함께 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12 배지 중에서 배양시켰다. 테스트 펩타이드의 계단 희석물을 이 분석법으로 동시에 테스트하였다. 루시페린 (Steady-Glo; Promega, 매디슨, WI)을 각 웰에 첨가한 후, 분석 플레이트를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 5 분의 배양 다음에, 빛의 방출을 파카드 톱카운트 광측정기 (Packard Topcount Luminometer; Packard Instrument Co., 다우너스 그로브, Ill.)로 측정하였다. 테스트 펩타이드 농도에 대한 빛 수치(light counts)를 도표로 나타내고, Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 최대 빛 방출의 절반을 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로서 기록하였다 [표 2: 리포터 EC50 참조].
2. 증식 분석
이 분석법은 인간 EPO-R을 발현하도록 트랜스펙션된 마우스 예비 B 세포주, Baf3을 기반으로 한다. 최종 세포 주, BaF3/Gal4/Elk/EPOR의 증식은 EPO-R 활성화에 의존된다. 세포 증식의 정도가 MTT를 사용하여 정량되는데, 여기서 MTT 분석에서의 신호는 생존 세포의 수에 비례한다.
BaF3/Gal4/Elk/EPOR 세포를 스피너(spinner) 플라스크 내에서 10% FBS (Hyclone) 및 2% WEHI-3 상청액 (ATCC # TIB-68)으로 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 배양된 세포를 1x106 세포/ml의 세포 밀도로 스피너 플라스크 내에서 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 밤새 굶주리게 하였다. 그 후, 그 굶주린 세포를 둘베코(Dulbecco's) PBS (Gibco)로 두번 세척하고, 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12에서 1x106 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 그 후, 상기 세포 현탁액의 50 ㎕의 부분표본(aliquots) (∼50,000 세포)을 96 웰 분석 플레이트에 3중으로 플레이팅하였다. 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 I 없음) DMEM/F12 배지 중에 테스트 EPO 유사 펩타이드 연속 희석물의 50 ㎕의 부분표본, 또는 50 ㎕의 EPO (R & D Systems Inc., 미니애폴리스, MN) 또는 Aranesp™ (다르베포에이틴 알파, 시판중인 EPO-R 작용제, Amgen)를 96 웰 분석 플레이트에 첨가하였다 (최종 웰 부피는 100㎕). 예를 들어, 테스트 펩타이드의 최종 농도가 810 pM 내지 0.0045 pM 범위인 12개의 상이한 희석물이 테스트 될 수 있다. 그 후, 상기 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 10 ㎕의 MTT (Roche Diagnostics)를 각 배양 접시 웰에 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다. 그 후, 10% SDS + 0.01N HCl을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 그 플레이트를 37℃에서 밤샘 배양하였다. 그 후, 분광광도법에 의하여 파장 595 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 대 테스트 펩타이드의 농도의 도표를 만들고, Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 EC50을 계산하였다. 최대 흡광도의 절반을 나타내는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50 으로 기록하였다 [표 2: 증식 EC50 참조].
3. 경쟁적 결합 분석
빛 신호가 2개의 비드(beads), 즉 바이오티닐화 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서(tracer)를 가지는 스트렙타비딘 공여체 비드와 EPO-R이 결합된 수용체 비드의 의 근접성(proximity)의 함수로서 생성되는 분석법을 사용하여 경쟁적 결합의 계산 결과가 만들어진다. 조명(illumination)에 따라 싱글렛(singlet) 산소가 제1 비드로부터 방출되고, 그 방출된 싱글렛 산소와의 접촉이 제2 비드가 빛을 방출하도록 만드는 동안 비방사성(non-radiative) 에너지 전달에 의하여 빛이 생성된다. 이들 비드 세트는 시판중이다 (Packard). 비드 근접은 EPO-R에 대한 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서의 결합에 의하여 일어난다. EPO-R에 대한 결합에 대하여 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서와 경쟁하는 테스트 펩타이드는 이러한 결합을 막아, 빛의 방출의 감소를 가져온다.
그 방법을 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다: 테스트 EPO-R 작용제 펩타이드의 계단 희석물, 또는 양성 또는 음성 대조군 4 ㎕를 384 웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그 후, 2 ㎕/웰의 수용체/비드 칵테일을 첨가하였다. 수용체 비드 칵테일은 5 mg/ml 스트렙타비딘 공여체 비드 (Packard) 15 ㎕, 5 mg/ml 모노클로날 항체 ab179 (이 항체는 재조합 EPO-R 중에 함유된 인간 태반 알칼리성 인산분해효소 단백질의 부분을 인식한다) 15 ㎕, 단백질 A 코팅된 수용체 비드 (단백질 A는 ab179 항체에 결합할 것이다; Packard), 재조합 EPO-R (ab179 표적 에피토프를 함유하는 인간 태반 알카리성 인산분해효소 단백질의 부분에 융합된 단백질로서 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 것)의 1:6.6 희석물 112.5 ㎕ 및 알파퀘스트(Alphaquest) 버퍼 (40 mM HEPES, pH 7.4; 1 mM MgCl2; 0.1% BSA, 0.05% Tween 20) 607.5 ㎕로 이루어진다. 가볍게 두드려(tap) 혼합하였다. 2 ㎕/웰의 바이오티니롸 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서를 첨가하였다 (30 nM 최종 농도). 실시예 1에서 설명한 방법에 따라, 바이오틴-GGLYACHMGPITWVCQPLRG (SEQ ID NO: 4)의 서열을 가지는 펩타이드 트레이서, 즉 EPO-R 결합 펩타이드 (표의 "리포터 EC50 (pM)"을 참조)를 만들었다.
Figure 112008000507936-PCT00070
1분 동안 원심분리하여 혼합하였다. 팩커드 탑 실(Packard Top Seal)로 플레티트를 밀봉하고, 호일로 둘러쌌다. 실온에서 밤샘 배양하였다. 18 시간 후에, 알파퀘스트 리더 (AlphaQuest reader; Packard)를 사용하여 빛의 방출을 판독하였다. 빛 방출 대 펩타이드의 농도를 도표로 그리고, 그라프 패드(Graph Pad) 또는 엑셀(Excel)을 사용하여 분석하였다.
테스트 펩타이드가 없는 경우 관찰된 빛 방출에 대하여 빛 방출의 50% 감소를 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 IC50으로 기록하였다 [표 2: AQ IC50 참조].
4. C/ BFU -e 분석
EPO-R 신호는 척수 줄기 세포가 적혈구 세포 전구체로 증식하도록 분화하는 것을 자극한다. 이 분석법은 원시 인간 골수 다능성 줄기 세포로부터 적혈구 세포 전구체의 증식 및 분화를 자극하는 테스트 펩타이드의 능력을 측정하는 것이다.
이번 분석을 위해서, 10% FBS (Hyclone)로 보충된 IMDM 배지 (Gibco)에서 테스트 펩타이드의 계단 희석물을 만들었다. 그 후, 이들 계단 희석물, 또는 양성 대조군 EPO 펩타이드를 메틸셀룰로오스에 첨가하여 1.5 mL의 최종 부피를 만들었다. 그 후, 그 메틸셀룰로오스 및 펩타이드 혼합물을 볼텍스(vortex)로 철저하게 교반시켰다. 인간 골수 유래 CD34+ 세포 (Poietics/Cambrex)의 부분표본 (100,000 세포/mL)을 해동시켰다. 그 해동된 세포를 50 mL 튜브에서 1 mg/ml DNAse (Stem Cells) 0.1 mL에 부드럽게(gently) 첨가하였다. 이어서, 40∼50 mL IMDM 배지를 세포에 부드럽게 첨가하였다: 처음 10 mL에 대해서는 상기 배지를 50 mL 튜브의 벽면을 따라 한 방울씩 첨가한 후, 나머지 부피의 배지를 튜브의 벽면을 따라 천천히 분배하였다. 그 후, 그 세포를 900 rpm으로 20분 동안 회전(spin)시키고, 그 배지를 부드러운 흡입으로 조심스럽게 제거하였다. 그 세포를 1ml IMDM 배지에 재현탁시키고, mL 당 세포 밀도를 혈구계 슬라이더 상에서 계수하였다 (슬라이드에 세포 현탁물의 10 ㎕ 부분표본을 올림, 세포 밀도는 평균 개수 X 10,000 세포/ml임). 그 후, 그 세포를 15,000 세포/mL의 세포 밀도로 IMDM 배지에서 희석하였다. 그 후, 100 ㎕의 희석된 세포를 각각 1.5 mL의 메틸 셀룰로오스 + 펩타이드 샘플에 첨가하고 (분석에서 최종 세포 농도는 1000 세포/mL임), 그 혼합물을 볼텍스로 교반하였다. 혼합물에서 거품이 사라지도록 한 후, 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 1 mL을 흡입하였다. 각 샘플로부터의 0.25 mL의 흡입된 혼합물을 24 웰 플레이트 (Falcon brand)의 4개의 웰 각각으로 첨가하였다. 그 플레이팅된 혼합물을 5% CO2하의 37℃의 습윤 인큐베이터에서 14일 동안 배양하였다. 위상 현미경(phase microscope) (5X∼10X 대물, 100X 최종 배율)을 사용하여 적혈구(erythroid) 콜로니의 존재를 평가하였다. EPO 양성 대조군의 경우 관찰된 것과 비교하여 형성된 콜로니의 수가 최대치의 90%인 경우의 테스트 펩타이드의 농도를 EC90으로 기록하였다 [표 2: C/BFU-e EC90 참조].
5. 방사능리간드 경쟁적 결합 분석
또 다른 것으로서, 방사능리간드 경쟁적 결합 분석법이 또한 본 발명의 펩타이드의 IC50 값을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 EPOr에 대한 125I-EPO의 결합을 측정하는 것이다. 그 분석법은 바람직하게는 다음의 예시적 프로토콜에 따라 수행된다:
A. 재료
재조합 인간 EPO R/ Fc 키메라 ·식별: 재조합 인간 EPO R/Fc 키메라 ·제조자: R&D Systems (미니애폴리스, MN, US) ·카타로그 번호: 963-ER ·로트 번호: EOK033071 ·보관: 4℃
요오드화 재조합 인간 에리트로포이에틴 ·식별: (3[125I]요오도티로실)에리트로포이에틴, 인간 재조합물, 높은 특이적 활성, 370 kBq, 10 μCi ·제조자: Amersham Biosciences (피스카타웨이, NJ, US) ·카타로그 번호: IM219-10μCi ·로트 번호: ·보관: 4℃
단백질-G 세파로스 ·식별: 단백질-G 세파로스 4 페스트 플로우 ·제조자: Amersham Biosciences (피스카타웨이, NJ, US) ·카타로그 번호 17-0618-01 ·로트 번호: ·보관: 4℃
분석 버퍼 ·인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4, 0.1% 소혈청 알부민 및 0.1% 아지드화 나트륨 함유 ·보관: 4℃
B. 적합한 수용체 농도의 측정
동결 건조된 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 재조합 EPOr 세포외 도메인의 50 ㎍ 1개 바이알을 1 ml 분석 버퍼에서 복원하였다. 분석에 사용하기 위한 수용체의 정확한 양을 측정하기 위해서, 이러한 수용체 조제물의 100 ㎕ 계단 희석물을 12 x 75 mm 폴리프로필렌 테스트 튜브에서 요오드화(iodinated) 재조합 인간 에리트로포이에틴 (125I EPO) 200 ㎕ 중 약 20,000 cpm과 결합시켰다. 튜브의 뚜껑을 닫고, 4℃에서 LabQuake 회전 쉐이커 상에서 밤새 부드럽게 혼합하였다.
다음날, 단백질-G 세파로스의 50% 슬러리(slurry) 50 ㎕를 각 튜브에 첨가하였다. 그 후, 튜브를 4℃에서 2시간 동안 부드럽게 혼합하면서 배양하였다. 그 후, 튜브를 15분 동안 4000 RPM (3297 x G)으로 원심분리시켜 그 단백질-G 세파로스를 펠렛(pellet)으로 만들었다. 상청액을 조심스럽게 제거하여 폐기하였다. 4℃의 분석 버퍼 1 ml로 3번 세척한 후, 그 펠렛을 Wallac Wizard 감마 계수기에서 계수하였다. 그 후, 결과를 분석하고, 최대 결합값의 50%에 이르는데 필요한 희석을 계산하였다.
C. 펩타이드에 대한 IC 50 측정
펩타이드 I의 IC50을 측정하기 위하여, 12 x 75 mm 폴리프로필렌 테스트 튜브 내에서 그 펩타이드의 100 ㎕ 계단 희석물을 재조합 에리트로포이에틴 수용체 (100 pg/튜브) 100 ㎕와 합쳤다. 그 후, 요드화 재조합 인간 에리트로포이에틴 (125I-EPO) 100 ㎕을 각 튜브에 첨가한 후, 튜브의 뚜껑을 닫고 4℃에서 밤새 부드럽게 혼합하였다.
다음날, 결합된 125I-EPO를 전술한 바와 같이 정량하였다. 그 결과를 분석하고, Graphpad Prism 버전 4.0 (GraphPad Software, Inc., 샌디에고, CA)를 사용하여 IC50 값을 계산하였다. 총 3번 이상의 반복된 IC50 측정을 위해, 상기 분석을 테스트된 각 펩타이드에 대하여 2번 이상 반복하였다.
Figure 112008000507936-PCT00071
실시예 4: 생체 내 활성 분석
이번 실시예에서는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 활성 및 능력을 평가하는데 유용한 다양한 생체 내 분석법을 설명한다. EPO-R 작용제 펩타이드 이량체를 실시예 1 또는 실시예 2에서 설명한 방법에 따라 제조하였다. 이들 펩타이드 단량체 및 이량체의 생체 내 활성을 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석(polycythemic exhypoxic mouse bioassay) 및 망상적혈구 분석(reticulocyte assay)를 포함하는 여러가지 분석법을 사용하여 평가하였다. 이들 두 가지 분석법을 아래 더 상세히 설명한다.
1. 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석
테스트 펩타이드를 문헌 [Cotes and Bangham (1961), Nature 191: 1065-1067]에 기재되어 있는 방법을 적합하게 변형시킨 리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석에서 생체 내 활성에 대하여 분석하였다. 이 분석으로 EPO 유사체(mimetic)로서의 기능 (즉, EPO-R을 활성화시켜 새로운 적혈구 세포를 합성시키는 것)에 대한 테스트 펩타이드의 능력을 조사하였다. 합성된 적혈구 세포의 헤모글로빈 속으로 방사능표지된 철(iron)의 혼입에 기초하여 적혈구 세포의 합성을 정량하였다.
BDF1 마우스를 7∼10일 동안 주위 조건에 순응하게 하였다. 모든 마우스의 체중을 측정하여, 저체중 (<15 g)의 마우스는 사용하지 않았다. 마우스는 총 14일 동안 저압 챔버에서 연속 조건 사이클 하에 두었다. 각 14시간 사이클은 0.40±0.02% 대기압에서 18시간, 대기압에서 6시간으로 구성된다. 그 조건 이후에, 마우스는 사용하기 전에 추가로 72시간 동안 대기압 상태로 유지시켰다.
테스트 펩타이드 또는 재조합 인간 EPO 표준을 PBS+0.1% BSA 베히클 (PBS/BSA)에서 희석시켰다. 펩타이드 단량체 스톡 용액은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에서 처음으로 용해시켰다. 음성 대조군은 오직 PBS/BSA으로 주사된 마우스의 한 그룹과 1% DMSO로 주사된 다른 한 그룹을 포함한다. 각 투여 그룹은 10마리의 마우스를 포함한다. 마우스들은 적절한 샘플 0.5 mL로 피하조직 (목의 덜미)으로 주사되었다
샘플 주사 후 48시간 후에, 마우스들은 약 0.75 μCuries/마우스의 투여량을 위해, 0.2 ml의 Fe59 (Dupont, NEN)로 복막내 주사로 투여한다. 마우스 체중은 Fe59 투여 24시간 후에 측정하였고, 마우스들은 Fe59 투여 후 48시간에 희생시켰다. 혈액을 심장 뚫기(cardiac puncture)에 의해 각 동물로부터 수집하고 헤마토크릿을 측정하였다 (헤파린을 항응고제로 사용하였다). 각 혈액 샘플(0.2mL)은 Packard 감마 계수기를 이용하여 Fe59 결합을 위해 분석하였다. 비-반응자 마우스 (예를 들어 음성 대조군 미만으로 방사능 결합을 갖는 마우스)은 적절한 데이터 구성에서 제외시켰다. 음성 대조군의 53% 미만의 헤마토크릿 수치를 갖는 마우스들 또한 제외시켰다. 결과는 각 실험 투여량에 대한 10 마리의 세트로부터 유래된 것이다. 각 그룹으로부터 혈액 샘플에서 결합된 방사능의 평균 양 (CPM, counts per minute)을 계산하였다.
2. 망상적혈구 분석( Reticulocyte Assay )
정상 BDF1 마우스에 EPO 대조군 또는 테스트 펩타이드로 삼일 연속적으로 투여시켰다 (0.5mL, 피하조직으로 주사됨). 3일째 날, 마우스에게 철 덱스트란 (100 mg/ml)을 또한 투여시켰다 (0.1mL, 복막내로 주사됨). 5일째 날, 마우스를 CO2로 마비시키고, 심장 뚫기로 혈액을 채취하였다. 각 혈액 샘플의 망상적혈구의 퍼센트(%)는 티아졸 오렌지 염색과 플로우 사이토미터 분석(retic-count program)으로 측정하였다. 헤마토크릿은 메뉴얼에 따라 측정하였다. 망상적혈구의 보정된 퍼센트는 다음 공식을 이용하여 결정하였다:
% RETIC보정 = % RETIC관찰 x (Hematocrit개별/ Hematocrit통상)
3. 혈액학적 분석( Hematological Assay )
정상 CD1 마우스는 EPO 양성 대조군, 테스트 펩타이드 또는 베히클의 정맥 내 주사를 일주일 간 4회 투여하였다. 양성 대조군 및 테스트 펩타이드 투여량의 범위는 mg/kg로서 나타내고, 제형에서 활성 화합물 농도를 다양화하여 시험하였다. 주사된 부피는 5mL/kg이다. 베히클 대조군은 12 마리의 동물인 반면, 잔여 투여량 그룹은 각각 8마리 씩이다. 매일 생존을 기록하고 및 매주 체중을 기록하였다.
투여된 마우스는 금식시킨 마우스이고 이소플루란(isoflurane) 흡입으로 마취시켜 말초 혈액 샘플을 1일 째(베히클 대조군 마우스의 경우) 및 15일 및 29일째 (4마우스/그룹/day)에 심장 또는 개복 대동맥 뚫기를 통하여 수집하였다. 혈액은 Vacutainer® 튜브로 옮겼다. 바람직한 항응고제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다. 혈액 샘플은 당업계에서 잘 알려진 자동화된 임상 분석기(예를 들어 Coulter, Inc.에서 제조된 것)를 이용하여 적혈구 합성 및 헤마토크릿(Hct), 헤모글로빈(Hgb) 및 총 적혈구 수(RBC)와 같은 생리기능을 측정하는 종점에서 평가되었다.
실시예 5: 펩타이드 단량체의 아미노산 서열이 ( AcG ) GLYACHMGPIT (1-nal)VCQPLRK ( SEQ ID NO : 1)인 EPO -R 작용제 펩타이드 동종이량체의 합성
단계 1 - 펩타이드 단량체의 합성:
펩타이드 단량체를 TG-RAM 레진 (0.18 mmol/g Rapp Polymere, 독일)를 사용하는 ABI 431A 펩타이드 합성장치에서 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다. 아미드화(amidated) 카르복시 말단을 가진 펩타이드 단량체의 합성을 위하여, 완전히 조립된 펩타이드를 82.5% TFA, 5% 물, 6.25% 안니솔, 6.25% 에탄디티올을 사용하여 그 레진으로부터 분리시켰다. 그 탈보호 생성물을 레진으로부터 여과시키고, 이에틸 에테르로 침전시켰다. 완전히 건조시킨 후, 그 생성물을 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴/물의 구배를 가진 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다. 그 펩타이드 구조물을 전자스프레이 질량 분석기(electospray mass spectrometry)로 확인하였다. 그 펩타이드를 1 mg/mL의 농도로 DMSO:물 1:1의 용액에 용해시켜, 이황화 결합의 형성에 영향을 주었다. 그 생성물을 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴/물의 구배를 가진 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다. 그 펩타이드 단량체는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00072
단계 2 - 삼작용기성 ( trifunctional ) 링커의 합성:
DCM 100 ml 중의 디에틸 이미노아세테이트 (10.0g, 52.8 mmol) 및 Boc-베타-알라닌 (10.0g, 52.8 mmol)의 용액에 디이소프로필카르보디이미드 (8.0 mL, 51.1 mmol)를 실온에서 10 분에 걸쳐 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 첨가 도중에 ∼10 도까지 가열한 후, 20분에 걸쳐 실온으로 다시 냉각하였다. 그 반응혼합물을 밤새 교반시켜, 침전된 디이소프로필우레아를 여과하여 제거하였다. 용매를 감압하에 제거하여 검(gum)을 얻을 수 있었고, 그 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 다시 여과하여 추가적인 침전된 우레아를 제거하였다. 유기상을 분리 깔때기 속으로 위치시키고, 세척 (포화(sat.) NaHCO3, 염수, 0.5 N HCl, 염수)하고, 건조 (MgSO4)시킨 후, 여과하고, 감압하에서 농축시켜 무색의 오일과 같은 디에스테르 생성물을 얻을 수 있었다. 상기 디에스테르를 MeOH:THF (100 mL) 1:1 혼합물 중에 넣은 후, 여기에 물 (25 mL)을 첨가한 후 NaOH (5g, 125 mmol)를 첨가하였다. pH는 >10으로 측정되었다. 그 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시킨 다음 6N HCl로 pH 1까지 산성화시켰다. 그 수성상을 NaCl로 포화시키고, 에틸 아세테이트로 4번 추출하였다. 결합된 유기상을 세척 (염수)하고, 건조 (MgSO4)시킨 후, 감압하에서 농축시켜 백색의 반 고체(semi-solid)를 얻었다. 그 고체를 50 ml DCM에 용해시키고, 여기에 300 ml 헥산을 첨가하여 백색 슬러리를 만들었다. 용매를 감압하에 제거하여 백색의 고체인 디애시드(diacid)를 얻을 수 있었다 (14.7 g, 두 단계에서 91.5% 수율). 20 ml의 DMF 내의 디애시드 (1g, 3.29 mmol) 용액에 N-히드록시숙신이미드 (770 mg, 6.69 mmol) 및 디이소프로필카르보이미드 (1.00 mL, 6.38 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (3 mg, 0.02 mmol)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 넣고, 여과하여 침전된 우레아를 제거하였다. 유기상을 분리 깔때기 속에 위치시키고, 세척 (포화(sat.) NaHCO3, 염수, 0.5 N HCl, 염수)하고, 건조 (MgSO4)시킨 후, 여과하고, 감압하에 농축시켜 백색 고체인 di-NHS 에스테르 생성물을 얻을 수 있었다 (1.12g, 68% 수율).
Figure 112008000507936-PCT00073
단계 3 - 펩타이드 단량체에 삼작용기성 링커의 결합
상기 링커에 결합시키기 위해, 건조 DMF 중에서 2 당량의 펩타이드를 1 당량의 삼작용기성 링커와 혼합시켜 맑은 용액을 얻고, 2분 후에 5 당량의 DIEA를 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 14 시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고, 크루드 생성물을 DCM 중의 80% TFA 내에 30분 동안 용해시켜 Boc기를 제거하고, 이어서 C18 역상 HPLC로 정제하였다. 그 이량체의 구조를 전자스프레이 질량분석기로 확인하였다. 이러한 결합 반응은 링커를 각 단량체 리신 잔기의 ε-아미노기 질소 원자에 결합시킨다. SEQ ID NO: 1을 사용하는 경우 그 제조 방법을 아래에 나타내었다.
Figure 112008000507936-PCT00074
단계 4 - 펩타이드 이량체의 PEG 화:
카르바메이트 결합을 통한 PEG 화: 상기 펩타이드 이량체를 건조 DMF 중에서 동일한 양 (몰 기준)의 활성화 PEG 화학종 (mPEG-NPC, NOF Corp., 일본)과 혼합하여 맑은 용액을 얻을 수 있었다. 5분 후에 4 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 14 시간 동안 교반한 후, C18 역상 HPLC로 정제하였다. PEG화 펩타이드의 구조를 MALDI 질량분석기(mass)에 의하여 확인하였다. 정제된 펩타이드를 아래에 개괄한 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 다시 정제하였다. SEQ ID NO: 1을 사용한 mPEG-NPC PEG화를 아래에 개괄한다.
Figure 112008000507936-PCT00075
아미드 결합을 통한 PEG 화:
상기 펩타이드 이량체를 건조 DMF 중에서 동일한 양 (몰 기준)의 활성화 PEG 화학종 (PEG-SPA-NHS, Shearwater Corp, 미국)과 혼합하여 맑은 용액을 얻을 수 있었다. 5분 후에 10 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, C18 역상 HPLC로 정제하였다. PEG화 펩타이드의 구조를 MALDI 질량분석기(mass)에 의하여 확인하였다. 정제된 펩타이드를 아래에 개괄한 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제도 또한 수행하였다. SEQ ID NO: 1을 사용한 PEG-SPA-NHS PEG화를 아래에 개괄한다.
Figure 112008000507936-PCT00076
단계 5 - 펩타이드의 이온 교환 정제:
출발 이량체 펩타이드를 보유하는 능력 이외에, 상기 펩타이드-PEG 접합체를 미반응 (또는 가수분해된) PEG로부터 분리하는 능력에 있어서, 몇 가지 교환 지지체(exchange supports)를 조사하였다. 이온 교환 수지 (2∼3 g)를 1 cm 칼럼 속으로 로딩하고, 이어서 그 나트륨 형으로 전환시키고 (용리액(elutant)이 pH 14, 약 5 칼럼 부피에 이를 때까지 칼럼 위로 0.2 N NaOH를 로딩시킴), 그 후 수소 형으로 전환시키고 (용리액이 로딩 pH, 약 5 칼럼 부피에 대등할 때까지, 0.1 N HCl 또는 0.1 M HOAc로 용리시킴), 이어서 25% ACN/물로 pH 6에 이를 때까지 세척하였다. 접합 전의 펩타이드 또는 펩타이드-PEG 접합물을 25% ACN/물 (10 mg/mL) 중에 용해시키고, TFA로 <3으로 pH를 조절한 후, 칼럼 위에 로딩하였다. 2∼3 칼럼 부피의 25% ACN/물로 세척 및 5 ml 분획의 수집 후에, 그 펩타이드를 25% ACN/물 중의 0.1 M NH4OAc로 용리시켜 칼럼으로부터 방출시키고, 다시 5 ml 분획을 수집하였다. HPLC를 통한 분석은 목적하는 펩타이드를 함유하는 분획을 나타내었다. 증발성 빛-분산 검출기 (Evaporative Light-Scattering Detector; ELSD)로의 분석은 펩타이드가 칼럼에 보유되고 NH4OAc 용액으로 용리되었을 때 접합되지 않은 PEG가 오염물로서 관찰되지 않았다는 것을 나타내었다. 펩타이드가 최초 세척 버퍼 (일반적으로 첫 번째 2개 분획) 중에 용리되었을 때, 목적하는 PEG-접합물 및 과량의 PEG의 분리가 없음이 관찰되었다.
다음의 칼럼은 펩타이드 및 펩타이드-PEG 접합물 양쪽 모두를 성공적으로 보유하였고, 펩타이드-PEG 접합물을 비접합 펩타이드로부터 성공적으로 정제하였다.
이온 교환 수지
지지체 출처
모노 S HR 5/5 강한 양이혼 교환 예비 로딩 칼럼 (Mono S HR 5/5 strong cation exchange pre-loaded column) Amersham Biosciences
SE53 셀룰로오스, 마이크로과립 강한 양이온 교환 지지체 (SE53 Cellulose, microgranular strong cation exchange support) Whatman
SP 세파로스 빠른 흐름 강한 양이온 교환 지지체 (SP Sepharose Fast Flow strong cation exchange support) Amersham Biosciences
실시예 6: 펩타이드 단량체의 아미노산 서열이 ( AcG ) GLYACHMGPIT (1-nal)VCQPLR(MeG)K ( SEQ ID NO : 2)인 EPO -R 작용제 펩타이드 동종이량체의 합성
펩타이드 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)인 EPO-R 작용제 펩타이드 동종이량체를 실시예 1에 설명한 것과 같이 합성하였는데, 다만 단계 1에서의 합성된 펩타이드 단량체는 아래의 것이다.
Figure 112008000507936-PCT00077
PEG가 카르바메이트 결합을 통하여 링커에 부착되는 경우, SEQ ID NO: 2를 사용한 본 합성의 최종 생성물은 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00078
PEG가 아미드 결합을 통하여 링커에 부착되는 경우, SEQ ID NO: 2를 사용한 본 합성의 최종 생성물은 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00079
실시예 7: 시험관 내 활성 분석
이번 실시예에서는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 활성 및 능력을 평가하는데 유용한 다양한 시험관 내 분석법을 설명한다. 이들 분석에서의 결과들은 본 발명의 신규한 펩타이드가 EPO-R에 결합하고 EPO-R 신호를 활성화시킨다는 것을 증명한다. 더욱이, 이들 분석에서의 결과는 그 신규의 펩타이드 조성물이 이전에 기재된 바 있었던 EPO 유사 펩타이드와 비교할 때 EPO-R 결합 친화도 및 생물학적 활성의 놀랄만한 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.
EPO-R 작용제 펩타이드 이량체를 실시예 1 또는 실시예 2에서 기재된 방법에 따라 제조하였다. 이들 펩타이드 이량체의 능력을 리포터(reporter) 분석, 증식 분석, 경쟁적 결합 분석 및 C/BFU-e 분석을 포함하는 시험관 내 활성 분석법의 시리즈를 사용하여 평가하였다. 이들 4가지 분석을 아래에서 더 상세하게 설명한다.
이들 시험관 내 분석의 결과를 표 2에 요약하였다.
1. 리포터 분석
이 분석은 마우스 예비 B 세포주 (murine pre-B-cell line) 유래 리포터 세포, 즉 Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux를 기반으로 한다. 이러한 리포터 세포주는 인간 GCSF 수용체의 세포내 부분에 인간 EPO 수용체의 세포외 부분을 포함하는 키메라(chimeric) 수용체를 발현한다. 이러한 세포주는 fos 프로모터 구동(driven) 루시퍼라제 리포터 유전자 구조물로 추가적으로 트랜스펙션된다. 적혈구조혈(erythropoietic) 제제의 첨가를 통한 이러한 키메라 리포터의 활성화는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 가져오고, 따라서 루시퍼라제의 기질 루시페린의 첨가에 따라 빛을 발생시킨다. 따라서, 그러한 세포에서 EPO-R 활성화의 수준을 루시퍼라제 활성의 측정을 통하여 정량할 수 있다.
상기 Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux 세포를 10% 소태아혈청 (FBS; Hyclone), 10% WEHI-3 상청액 (WEHI-3 세포 (ATCC # TIB-68)의 배양물로부터의 상청액) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 분석하기 약 18 시간 전에, 세포를 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액으로 보충된 DMEM/F12 배지로 이동시켜 굶주리게 하였다. 분석 당일에, 세포를 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12 배지로 한 번 세척하고, 1 X 106 세포/mL를 알고 있는 테스트 펩타이드의 농도의 존재하에서, 또는 양성 대조군으로서 EPO (R & D Systems Inc., 미니애폴리스, MN)와 함께 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12 배지 중에서 배양시켰다. 테스트 펩타이드의 계단 희석물을 이 분석법으로 동시에 테스트하였다. 루시페린 (Steady-Glo; Promega, 매디슨, WI)을 각 웰에 첨가한 후, 분석 플레이트를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 5 분의 배양 다음에, 빛의 방출을 파카드 톱카운트 광측정기 (Packard Topcount Luminometer; Packard Instrument Co., 다우너스 그로브, Ill.)로 측정하였다. 테스트 펩타이드 농도에 대한 빛 수치(light counts)를 도표로 나타내고, Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 최대 빛 방출의 절반을 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로서 기록하였다.
2. 증식 분석
이 분석법은 인간 EPO-R을 발현하도록 트랜스펙션된 마우스 예비 B 세포주, Baf3을 기반으로 한다. 최종 세포 주, BaF3/Gal4/Elk/EPOR의 증식은 EPO-R 활성화에 의존된다. 세포 증식의 정도가 MTT를 사용하여 정량되는데, 여기서 MTT 분석에서의 신호는 생존 세포의 수에 비례한다.
BaF3/Gal4/Elk/EPOR 세포를 스피너(spinner) 플라스크 내에서 10% FBS (Hyclone) 및 2% WEHI-3 상청액 (ATCC # TIB-68)으로 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 배양된 세포를 1x106 세포/ml의 세포 밀도로 스피너 플라스크 내에서 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 밤새 굶주리게 하였다. 그 후, 그 굶주린 세포를 둘베코(Dulbecco's) PBS (Gibco)로 두번 세척하고, 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12에서 1x106 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 그 후, 상기 세포 현탁액의 50 ㎕의 부분표본(aliquots) (∼50,000 세포)을 96 웰 분석 플레이트에 3중으로 플레이팅하였다. 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 I 없음) DMEM/F12 배지 중에 테스트 EPO 유사 펩타이드 연속 희석물의 50 ㎕의 부분표본, 또는 50 ㎕의 EPO (R & D Systems Inc., 미니애폴리스, MN) 또는 Aranesp™ (다르베포에이틴 알파, 시판중인 EPO-R 작용제, Amgen)를 96 웰 분석 플레이트에 첨가하였다 (최종 웰 부피는 100㎕). 예를 들어, 테스트 펩타이드의 최종 농도가 810 pM 내지 0.0045 pM 범위인 12개의 상이한 희석물이 테스트 될 수 있다. 그 후, 상기 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 10 ㎕의 MTT (Roche Diagnostics)를 각 배양 접시 웰에 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다. 그 후, 10% SDS + 0.01N HCl을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 그 플레이트를 37℃에서 밤샘 배양하였다. 그 후, 분광광도법에 의하여 파장 595 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 대 테스트 펩타이드의 농도의 도표를 만들고, Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 EC50을 계산하였다. 최대 흡광도의 절반을 나타내는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로 기록하였다.
3. 경쟁적 결합 분석
빛 신호가 2개의 비드(beads), 즉 바이오티닐화 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서(tracer)를 가지는 스트렙타비딘 공여체 비드와 EPO-R이 결합된 수용체 비드의 의 근접성(proximity)의 함수로서 생성되는 분석법을 사용하여 경쟁적 결합의 계산 결과가 만들어진다. 조명(illumination)에 따라 싱글렛(singlet) 산소가 제1 비드로부터 방출되고, 그 방출된 싱글렛 산소와의 접촉이 제2 비드가 빛을 방출하도록 만드는 동안 비방사성(non-radiative) 에너지 전달에 의하여 빛이 생성된다. 이들 비드 세트는 시판중이다 (Packard). 비드 근접은 EPO-R에 대한 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서의 결합에 의하여 일어난다. EPO-R에 대한 결합에 대하여 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서와 경쟁하는 테스트 펩타이드는 이러한 결합을 막아, 빛의 방출의 감소를 가져온다.
그 방법을 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다: 테스트 EPO-R 작용제 펩타이드의 계단 희석물, 또는 양성 또는 음성 대조군 4 ㎕를 384 웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그 후, 2 ㎕/웰의 수용체/비드 칵테일을 첨가하였다. 수용체 비드 칵테일은 5 mg/ml 스트렙타비딘 공여체 비드 (Packard) 15 ㎕, 5 mg/ml 모노클로날 항체 ab179 (이 항체는 재조합 EPO-R 중에 함유된 인간 태반 알칼리성 인산분해효소 단백질의 부분을 인식한다) 15 ㎕, 단백질 A 코팅된 수용체 비드 (단백질 A는 ab179 항체에 결합할 것이다; Packard), 재조합 EPO-R (ab179 표적 에피토프를 함유하는 인간 태반 알카리성 인산분해효소 단백질의 부분에 융합된 단백질로서 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 것)의 1:6.6 희석물 112.5 ㎕ 및 알파퀘스트(Alphaquest) 버퍼 (40 mM HEPES, pH 7.4; 1 mM MgCl2; 0.1% BSA, 0.05% Tween 20) 607.5 ㎕로 이루어진다. 가볍게 두드려(tap) 혼합하였다. 2 ㎕/웰의 바이오티니롸 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서를 첨가하였다 (30 nM 최종 농도). SEQ ID NO: 4의 서열을 사용하여 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 펩타이드 트레이서, 즉 EPO-R 결합 펩타이드 (표의 "리포터 EC50 (pM)"을 참조)를 만들었다.
Figure 112008000507936-PCT00080
1분 동안 원심분리하여 혼합하였다. 팩커드 탑 실(Packard Top Seal)로 플레티트를 밀봉하고, 호일로 둘러쌌다. 실온에서 밤샘 배양하였다. 18 시간 후에, 알파퀘스트 리더 (AlphaQuest reader; Packard)를 사용하여 빛의 방출을 판독하였다. 빛 방출 대 펩타이드의 농도를 도표로 그리고, 그라프 패드(Graph Pad) 또는 엑셀(Excel)을 사용하여 분석하였다.
테스트 펩타이드가 없는 경우 관찰된 빛 방출에 대하여 빛 방출의 50% 감소를 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 IC50으로 기록하였다.
4. C/ BFU -e 분석
EPO-R 신호는 척수 줄기 세포가 적혈구 세포 전구체로 증식하도록 분화하는 것을 자극한다. 이 분석법은 원시 인간 골수 다능성 줄기 세포로부터 적혈구 세포 전구체의 증식 및 분화를 자극하는 테스트 펩타이드의 능력을 측정하는 것이다.
이번 분석을 위해서, 10% FBS (Hyclone)로 보충된 IMDM 배지 (Gibco)에서 테스트 펩타이드의 계단 희석물을 만들었다. 그 후, 이들 계단 희석물, 또는 양성 대조군 EPO 펩타이드를 메틸셀룰로오스에 첨가하여 1.5 mL의 최종 부피를 만들었다. 그 후, 그 메틸셀룰로오스 및 펩타이드 혼합물을 볼텍스(vortex)로 철저하게 교반시켰다. 인간 골수 유래 CD34+ 세포 (Poietics/Cambrex)의 부분표본 (100,000 세포/mL)을 해동시켰다. 그 해동된 세포를 50 mL 튜브에서 1 mg/ml DNAse (Stem Cells) 0.1 mL에 부드럽게(gently) 첨가하였다. 이어서, 40∼50 mL IMDM 배지를 세포에 부드럽게 첨가하였다: 처음 10 mL에 대해서는 상기 배지를 50 mL 튜브의 벽면을 따라 한 방울씩 첨가한 후, 나머지 부피의 배지를 튜브의 벽면을 따라 천천히 분배하였다. 그 후, 그 세포를 900 rpm으로 20분 동안 회전(spin)시키고, 그 배지를 부드러운 흡입으로 조심스럽게 제거하였다. 그 세포를 1ml IMDM 배지에 재현탁시키고, mL 당 세포 밀도를 혈구계 슬라이더 상에서 계수하였다 (슬라이드에 세포 현탁물의 10 ㎕ 부분표본을 올림, 세포 밀도는 평균 개수 X 10,000 세포/ml임). 그 후, 그 세포를 15,000 세포/mL의 세포 밀도로 IMDM 배지에서 희석하였다. 그 후, 100 ㎕의 희석된 세포를 각각 1.5 mL의 메틸 셀룰로오스 + 펩타이드 샘플에 첨가하고 (분석에서 최종 세포 농도는 1000 세포/mL임), 그 혼합물을 볼텍스로 교반하였다. 혼합물에서 거품이 사라지도록 한 후, 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 1 mL을 흡입하였다. 각 샘플로부터의 0.25 mL의 흡입된 혼합물을 24 웰 플레이트 (Falcon brand)의 4개의 웰 각각으로 첨가하였다. 그 플레이팅된 혼합물을 5% CO2하의 37℃의 습윤 인큐베이터에서 14일 동안 배양하였다. 위상 현미경(phase microscope) (5X∼10X 대물, 100X 최종 배율)을 사용하여 적혈구(erythroid) 콜로니의 존재를 평가하였다. EPO 양성 대조군의 경우 관찰된 것과 비교하여 형성된 콜로니의 수가 최대치의 90%인 경우의 테스트 펩타이드의 농도를 EC90으로 기록하였다 [표 2: C/BFU-e EC90 참조].
Figure 112008000507936-PCT00081
실시예 8: 생체 내 활성 분석
이번 실시예에서는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 활성 및 능력을 평가하는데 유용한 다양한 생체 내 분석법을 설명한다. EPO-R 작용제 펩타이드 이량체를 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 제조하였다. 이들 펩타이드 단량체 및 이량체의 생체 내 활성을 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석(polycythemic exhypoxic mouse bioassay) 및 망상적혈구 분석(reticulocyte assay)를 포함하는 여러가지 분석법을 사용하여 평가하였다. 이들 두 가지 분석법을 아래 더 상세히 설명한다.
1. 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석
테스트 펩타이드를 문헌 [Cotes and Bangham (1961), Nature 191: 1065-1067]에 기재되어 있는 방법을 적합하게 변형시킨 리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석에서 생체 내 활성에 대하여 분석하였다. 이 분석으로 EPO 유사체(mimetic)로서의 기능 (즉, EPO-R을 활성화시켜 새로운 적혈구 세포를 합성시키는 것)에 대한 테스트 펩타이드의 능력을 조사하였다. 합성된 적혈구 세포의 헤모글로빈 속으로 방사능표지된 철(iron)의 혼입에 기초하여 적혈구 세포의 합성을 정량하였다.
BDF1 마우스를 7∼10일 동안 주위 조건에 순응하게 하였다. 모든 마우스의 체중을 측정하여, 저체중 (<15 g)의 마우스는 사용하지 않았다. 마우스는 총 14일 동안 저압 챔버에서 연속 조건 사이클 하에 두었다. 각 14시간 사이클은 0.40±0.02% 대기압에서 18시간, 대기압에서 6시간으로 구성된다. 그 조건 이후에, 마우스는 사용하기 전에 추가로 72시간 동안 대기압 상태로 유지시켰다.
테스트 펩타이드 또는 재조합 인간 EPO 표준을 PBS+0.1% BSA 베히클 (PBS/BSA)에서 희석시켰다. 펩타이드 단량체 스톡 용액은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에서 처음으로 용해시켰다. 음성 대조군은 오직 PBS/BSA으로 주사된 마우스의 한 그룹과 1% DMSO로 주사된 다른 한 그룹을 포함한다. 각 투여 그룹은 10마리의 마우스를 포함한다. 마우스들은 적절한 샘플 0.5 mL로 피하조직 (목의 덜미)으로 주사되었다
샘플 주사 후 48시간 후에, 마우스들은 약 0.75 μCuries/마우스의 투여량을 위해, 0.2 ml의 Fe59 (Dupont, NEN)로 복막내 주사로 투여한다. 마우스 체중은 Fe59 투여 24시간 후에 측정하였고, 마우스들은 Fe59 투여 후 48시간에 희생시켰다. 혈액을 심장 뚫기(cardiac puncture)에 의해 각 동물로부터 수집하고 헤마토크릿을 측정하였다 (헤파린을 항응고제로 사용하였다). 각 혈액 샘플(0.2mL)은 Packard 감마 계수기를 이용하여 Fe59 결합을 위해 분석하였다. 비-반응자 마우스 (예를 들어 음성 대조군 미만으로 방사능 결합을 갖는 마우스)은 적절한 데이터 구성에서 제외시켰다. 음성 대조군의 53% 미만의 헤마토크릿 수치를 갖는 마우스들 또한 제외시켰다. 결과는 각 실험 투여량에 대한 10 마리의 세트로부터 유래된 것이다. 각 그룹으로부터 혈액 샘플에서 결합된 방사능의 평균 양 (CPM, counts per minute)을 계산하였다.
2. 망상적혈구 분석( Reticulocyte Assay )
정상 BDF1 마우스에 EPO 대조군 또는 테스트 펩타이드로 삼일 연속적으로 투여시켰다 (0.5mL, 피하조직으로 주사됨). 3일째 날, 마우스에게 철 덱스트란 (100 mg/ml)을 또한 투여시켰다 (0.1mL, 복막내로 주사됨). 5일째 날, 마우스를 CO2로 마비시키고, 심장 뚫기로 혈액을 채취하였다. 각 혈액 샘플의 망상적혈구의 퍼센트(%)는 티아졸 오렌지 염색과 플로우 사이토미터 분석(retic-count program)으로 측정하였다. 헤마토크릿은 메뉴얼에 따라 측정하였다. 망상적혈구의 보정된 퍼센트는 다음 공식을 이용하여 결정하였다:
% RETIC보정 = % RETIC관찰 x (Hematocrit개별/ Hematocrit통상)
3. 혈액학적 분석( Hematological Assay )
정상 CD1 마우스는 EPO 양성 대조군, 테스트 펩타이드 또는 베히클의 정맥 내 주사를 일주일 간 4회 투여하였다. 양성 대조군 및 테스트 펩타이드 투여량의 범위는 mg/kg로서 나타내고, 제형에서 활성 화합물 농도를 다양화하여 시험하였다. 주사된 부피는 5mL/kg이다. 베히클 대조군은 12 마리의 동물인 반면, 잔여 투여량 그룹은 각각 8마리 씩이다. 매일 생존을 기록하고 및 매주 체중을 기록하였다.
투여된 마우스는 금식시킨 마우스이고 이소플루란(isoflurane) 흡입으로 마취시켜 말초 혈액 샘플을 1일 째(베히클 대조군 마우스의 경우) 및 15일 및 29일째 (4마우스/그룹/day)에 심장 또는 개복 대동맥 뚫기를 통하여 수집하였다. 혈액은 Vacutainer® 튜브로 옮겼다. 바람직한 항응고제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
혈액 샘플은 당업계에서 잘 알려진 자동화된 임상 분석기(예를 들어 Coulter, Inc.에서 제조된 것)를 이용하여 적혈구 합성 및 헤마토크릿(Hct), 헤모글로빈(Hgb) 및 총 적혈구 수(RBC)와 같은 생리기능을 측정하는 종점에서 평가되었다.
실시예 9: 펩타이드 단량체의 아미노산 서열이 ( AcG ) GLYACHMGPIT (1-nal)VCQPLRK ( SEQ ID NO : 1)인 EPO -R 작용제 펩타이드 동종이량체의 합성
단계 1 - 펩타이드 단량체의 합성:
펩타이드 단량체를 TG-RAM 레진 (0.18 mmol/g Rapp Polymere, 독일)를 사용하는 ABI 431A 펩타이드 합성장치에서 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다. 아미드화(amidated) 카르복시 말단을 가진 펩타이드 단량체의 합성을 위하여, 완전히 조립된 펩타이드를 82.5% TFA, 5% 물, 6.25% 안니솔, 6.25% 에탄디티올을 사용하여 그 레진으로부터 분리시켰다. 그 탈보호 생성물을 레진으로부터 여과시키고, 이에틸 에테르로 침전시켰다. 완전히 건조시킨 후, 그 생성물을 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴/물의 구배를 가진 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다. 그 펩타이드 구조물을 전자스프레이 질량 분석기(electospray mass spectrometry)로 확인하였다. 그 펩타이드 단량체는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00082
단계 2 - 삼작용기성 ( trifunctional ) 링커의 합성:
DCM 100 ml 중의 디에틸 이미노아세테이트 (10.0g, 52.8 mmol) 및 Boc-베타-알라닌 (10.0g, 52.8 mmol)의 용액에 디이소프로필카르보디이미드 (8.0 mL, 51.1 mmol)를 실온에서 10 분에 걸쳐 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 첨가 도중에 ∼10 도까지 가열한 후, 20분에 걸쳐 실온으로 다시 냉각하였다. 그 반응혼합물을 밤새 교반시켜, 침전된 디이소프로필우레아를 여과하여 제거하였다. 용매를 감압하에 제거하여 검(gum)을 얻을 수 있었고, 그 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 다시 여과하여 추가적인 침전된 우레아를 제거하였다. 유기상을 분리 깔때기 속으로 위치시키고, 세척 (포화(sat.) NaHCO3, 염수, 0.5 N HCl, 염수)하고, 건조 (MgSO4)시킨 후, 여과하고, 감압하에서 농축시켜 무색의 오일과 같은 디에스테르 생성물을 얻을 수 있었다. 상기 디에스테르를 MeOH:THF (100 mL) 1:1 혼합물 중에 넣은 후, 여기에 물 (25 mL)을 첨가한 후 NaOH (5g, 125 mmol)를 첨가하였다. pH는 >10으로 측정되었다. 그 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시킨 다음 6N HCl로 pH 1까지 산성화시켰다. 그 수성상을 NaCl로 포화시키고, 에틸 아세테이트로 4번 추출하였다. 결합된 유기상을 세척 (염수)하고, 건조 (MgSO4)시킨 후, 감압하에서 농축시켜 백색의 반 고체(semi-solid)를 얻었다. 그 고체를 50 ml DCM에 용해시키고, 여기에 300 ml 헥산을 첨가하여 백색 슬러리를 만들었다. 용매를 감압하에 제거하여 백색의 고체인 디애시드(diacid)를 얻을 수 있었다 (14.7 g, 두 단계에서 91.5% 수율). 20 ml의 DMF 내의 디애시드 (1g, 3.29 mmol) 용액에 N-히드록시숙신이미드 (770 mg, 6.69 mmol) 및 디이소프로필카르보이미드 (1.00 mL, 6.38 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘 (3 mg, 0.02 mmol)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 넣고, 여과하여 침전된 우레아를 제거하였다. 유기상을 분리 깔때기 속에 위치시키고, 세척 (포화(sat.) NaHCO3, 염수, 0.5 N HCl, 염수)하고, 건조 (MgSO4)시킨 후, 여과하고, 감압하에 농축시켜 백색 고체인 di-NHS 에스테르 생성물을 얻을 수 있었다 (1.12g, 68% 수율).
Figure 112008000507936-PCT00083
단계 3 - 펩타이드 단량체에 삼작용기성 링커의 결합
상기 링커에 결합시키기 위해, 건조 DMF 중에서 2 당량의 펩타이드를 1 당량의 삼작용기성 링커와 혼합시켜 맑은 용액을 얻고, 2분 후에 5 당량의 DIEA를 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 14 시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고, 크루드 생성물을 DCM 중의 80% TFA 내에 30분 동안 용해시켜 Boc기를 제거하고, 이어서 C18 역상 HPLC로 정제하였다. 그 이량체의 구조를 전자스프레이 질량분석기로 확인하였다. 이러한 결합 반응은 링커를 각 단량체 리신 잔기의 ε-아미노기 질소 원자에 결합시킨다. SEQ ID NO: 1을 사용한 결합을 아래에 나타내었다.
Figure 112008000507936-PCT00084
단계 4 - 리신 mPEG2 - 리신올 - NPC 에 의하여 연결된 2개의 선형 PEG 사슬을 포함하는 PEG 모이어티의 합성
시판중인 리신올(lysinol)을 과량의 mPEG2-NPC로 처리하여 MPEG2-리신올을 얻은 후, NPC와 반응시켜 mPEG2-리신올-NPC를 만들었다.
mPEG2 - Lys - NHS
이러한 제품은, 예를 들어 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics; 알라바바 35806 헌츠빌, 디스커버리 드라이브 490)의 분자공학 카탈로그(Molecular Engineering catalog) (2003)의 물품 번호 2Z3X0T01로 구입가능하다.
단계 5 - 펩타이드 이량체의 PEG 화:
카르바메이트 결합을 통한 PEG 화:
상기 펩타이드 이량체 및 PEG 화학종 (mPEG2-리신올-NPC)을 1:2 몰비로 건조 DMF 중에서 혼합하여 맑은 용액을 얻을 수 있었다. 5분 후에 4 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 14 시간 동안 교반한 후, C18 역상 HPLC로 정제하였다. PEG화 펩타이드의 구조를 MALDI 질량분석기(mass)에 의하여 확인하였다. 정제된 펩타이드를 아래에 개괄한 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 다시 정제하였다. SEQ ID NO: 1을 사용한 경우 mPEG-리신올-NPC를 사용한 PEG화를 아래에 개괄한다.
Figure 112008000507936-PCT00085
아미드 결합을 통한 PEG 화:
상기 펩타이드 이량체 및 PEG 화학종 (mPEG2-Lys-NHS, Shearwater Corp, 미국)을 1:2 몰비로 건조 DMF 중에서 혼합하여 맑은 용액을 얻을 수 있었다. 5분 후에 10 당량의 DIEA를 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 주위 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, C18 역상 HPLC로 정제하였다. PEG화 펩타이드의 구조를 MALDI 질량분석기(mass)에 의하여 확인하였다. 정제된 펩타이드를 아래에 개괄한 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제도 또한 수행하였다. SEQ ID NO: 1을 사용한 PEG2-Lys-NHS PEG를 사용한 PEG화를 아래에 개괄한다.
Figure 112008000507936-PCT00086
단계 6 - 펩타이드의 이온 교환 정제:
출발 이량체 펩타이드를 보유하는 능력 이외에, 상기 펩타이드-PEG 접합체를 미반응 (또는 가수분해된) PEG로부터 분리하는 능력에 있어서, 몇 가지 교환 지지체(exchange supports)를 조사하였다. 이온 교환 수지 (2∼3 g)를 1 cm 칼럼 속으로 로딩하고, 이어서 그 나트륨 형으로 전환시키고 (용리액(elutant)이 pH 14, 약 5 칼럼 부피에 이를 때까지 칼럼 위로 0.2 N NaOH를 로딩시킴), 그 후 수소 형으로 전환시키고 (용리액이 로딩 pH, 약 5 칼럼 부피에 대등할 때까지, 0.1 N HCl 또는 0.1 M HOAc로 용리시킴), 이어서 25% ACN/물로 pH 6에 이를 때까지 세척하였다. 접합 전의 펩타이드 또는 펩타이드-PEG 접합물을 25% ACN/물 (10 mg/mL) 중에 용해시키고, TFA로 <3으로 pH를 조절한 후, 칼럼 위에 로딩하였다. 2∼3 칼럼 부피의 25% ACN/물로 세척 및 5 ml 분획의 수집 후에, 그 펩타이드를 25% ACN/물 중의 0.1 M NH4OAc로 용리시켜 칼럼으로부터 방출시키고, 다시 5 ml 분획을 수집하였다. HPLC를 통한 분석은 목적하는 펩타이드를 함유하는 분획을 나타내었다. 증발성 빛-분산 검출기 (Evaporative Light-Scattering Detector; ELSD)로의 분석은 펩타이드가 칼럼에 보유되고 NH4OAc 용액으로 용리되었을 때 접합되지 않은 PEG가 오염물로서 관찰되지 않았다는 것을 나타내었다. 펩타이드가 최초 세척 버퍼 (일반적으로 첫 번째 2개 분획) 중에 용리되었을 때, 목적하는 PEG-접합물 및 과량의 PEG의 분리가 없음이 관찰되었다.
다음의 칼럼은 펩타이드 및 펩타이드-PEG 접합물 양쪽 모두를 성공적으로 보유하였고, 펩타이드-PEG 접합물을 비접합 펩타이드로부터 성공적으로 정제하였다.
이온 교환 수지
지지체 출처
모노 S HR 5/5 강한 양이혼 교환 예비 로딩 칼럼 Amersham Biosciences
SE53 셀룰로오스, 마이크로과립 강한 양이온 교환 지지체 Whatman
SP 세파로스 빠른 흐름 강한 양이온 교환 지지체 Amersham Biosciences
실시예 10: 펩타이드 단량체의 아미노산 서열이 ( AcG ) GLYACHMGPIT (1-nal)VCQPLR(MeG)K ( SEQ ID NO : 2)인 EPO -R 작용제 펩타이드 동종이량체의 합성
펩타이드 단량체의 아미노산 서열이 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K (SEQ ID NO: 2)인 EPO-R 작용제 펩타이드 동종이량체를 실시예 1에 설명한 것과 같이 합성하였는데, 다만 단계 1에서의 합성된 펩타이드 단량체는 아래의 것이다.
Figure 112008000507936-PCT00087
PEG가 카르바메이트 결합을 통하여 스페이서에 부착되는 경우, SEQ ID NO: 2를 사용한 본 합성의 최종 생성물은 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00088
PEG가 아미드 결합을 통하여 스페이서에 부착되는 경우, SEQ ID NO: 2를 사용한 본 합성의 최종 생성물은 다음과 같은 구조식으로 나타낼 수 있다:
Figure 112008000507936-PCT00089
실시예 11: 시험관 내 활성 분석
이번 실시예에서는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 활성 및 능력을 평가하는데 유용한 다양한 시험관 내 분석법을 설명한다. 이들 분석에서의 결과들은 본 발명의 신규한 펩타이드가 EPO-R에 결합하고 EPO-R 신호를 활성화시킨다는 것을 증명한다. 더욱이, 이들 분석에서의 결과는 그 신규의 펩타이드 조성물이 이전에 기재된 바 있었던 EPO 유사 펩타이드와 비교할 때 EPO-R 결합 친화도 및 생물학적 활성의 놀랄만한 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.
EPO-R 작용제 펩타이드 이량체를 실시예 1 또는 실시예 2에서 기재된 방법에 따라 제조하였다. 이들 펩타이드 이량체의 능력을 리포터(reporter) 분석, 증식 분석, 경쟁적 결합 분석 및 C/BFU-e 분석을 포함하는 시험관 내 활성 분석법의 시리즈를 사용하여 평가하였다. 이들 4가지 분석을 아래에서 더 상세하게 설명한다.
이들 시험관 내 분석의 결과를 표 2에 요약하였다.
1. 리포터 분석
이 분석은 마우스 예비 B 세포주 (murine pre-B-cell line) 유래 리포터 세포, 즉 Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux를 기반으로 한다. 이러한 리포터 세포주는 인간 GCSF 수용체의 세포내 부분에 인간 EPO 수용체의 세포외 부분을 포함하는 키메라(chimeric) 수용체를 발현한다. 이러한 세포주는 fos 프로모터 구동(driven) 루시퍼라제 리포터 유전자 구조물로 추가적으로 트랜스펙션된다. 적혈구조혈(erythropoietic) 제제의 첨가를 통한 이러한 키메라 리포터의 활성화는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 가져오고, 따라서 루시퍼라제의 기질 루시페린의 첨가에 따라 빛을 발생시킨다. 따라서, 그러한 세포에서 EPO-R 활성화의 수준을 루시퍼라제 활성의 측정을 통하여 정량할 수 있다.
상기 Baf3/EpoR/GCSFR fos/lux 세포를 10% 소태아혈청 (FBS; Hyclone), 10% WEHI-3 상청액 (WEHI-3 세포 (ATCC # TIB-68)의 배양물로부터의 상청액) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 분석하기 약 18 시간 전에, 세포를 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액으로 보충된 DMEM/F12 배지로 이동시켜 굶주리게 하였다. 분석 당일에, 세포를 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12 배지로 한 번 세척하고, 1 X 106 세포/mL를 알고 있는 테스트 펩타이드의 농도의 존재하에서, 또는 양성 대조군으로서 EPO (R & D Systems Inc., 미니애폴리스, MN)와 함께 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12 배지 중에서 배양시켰다. 테스트 펩타이드의 계단 희석물을 이 분석법으로 동시에 테스트하였다. 루시페린 (Steady-Glo; Promega, 매디슨, WI)을 각 웰에 첨가한 후, 분석 플레이트를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 5 분의 배양 다음에, 빛의 방출을 파카드 톱카운트 광측정기 (Packard Topcount Luminometer; Packard Instrument Co., 다우너스 그로브, Ill.)로 측정하였다. 테스트 펩타이드 농도에 대한 빛 수치(light counts)를 도표로 나타내고, Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 최대 빛 방출의 절반을 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로서 기록하였다.
2. 증식 분석
이 분석법은 인간 EPO-R을 발현하도록 트랜스펙션된 마우스 예비 B 세포주, Baf3을 기반으로 한다. 최종 세포 주, BaF3/Gal4/Elk/EPOR의 증식은 EPO-R 활성화에 의존된다. 세포 증식의 정도가 MTT를 사용하여 정량되는데, 여기서 MTT 분석에서의 신호는 생존 세포의 수에 비례한다.
BaF3/Gal4/Elk/EPOR 세포를 스피너(spinner) 플라스크 내에서 10% FBS (Hyclone) 및 2% WEHI-3 상청액 (ATCC # TIB-68)으로 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 배양된 세포를 1x106 세포/ml의 세포 밀도로 스피너 플라스크 내에서 10% FBS 및 0.1% WEHI-3 상청액으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 밤새 굶주리게 하였다. 그 후, 그 굶주린 세포를 둘베코(Dulbecco's) PBS (Gibco)로 두번 세척하고, 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 없음) DMEM/F12에서 1x106 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 그 후, 상기 세포 현탁액의 50 ㎕의 부분표본(aliquots) (∼50,000 세포)을 96 웰 분석 플레이트에 3중으로 플레이팅하였다. 10% FBS로 보충된 (WEHI-3 상청액 I 없음) DMEM/F12 배지 중에 테스트 EPO 유사 펩타이드 연속 희석물의 50 ㎕의 부분표본, 또는 50 ㎕의 EPO (R & D Systems Inc., 미니애폴리스, MN) 또는 Aranesp™ (다르베포에이틴 알파, 시판중인 EPO-R 작용제, Amgen)를 96 웰 분석 플레이트에 첨가하였다 (최종 웰 부피는 100㎕). 예를 들어, 테스트 펩타이드의 최종 농도가 810 pM 내지 0.0045 pM 범위인 12개의 상이한 희석물이 테스트 될 수 있다. 그 후, 상기 플레이트를 37℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 10 ㎕의 MTT (Roche Diagnostics)를 각 배양 접시 웰에 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다. 그 후, 10% SDS + 0.01N HCl을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 그 플레이트를 37℃에서 밤샘 배양하였다. 그 후, 분광광도법에 의하여 파장 595 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 대 테스트 펩타이드의 농도의 도표를 만들고, Graph Pad 소프트웨어를 사용하여 EC50을 계산하였다. 최대 흡광도의 절반을 나타내는 테스트 펩타이드의 농도를 EC50으로 기록하였다.
3. 경쟁적 결합 분석
빛 신호가 2개의 비드(beads), 즉 바이오티닐화 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서(tracer)를 가지는 스트렙타비딘 공여체 비드와 EPO-R이 결합된 수용체 비드의 의 근접성(proximity)의 함수로서 생성되는 분석법을 사용하여 경쟁적 결합의 계산 결과가 만들어진다. 조명(illumination)에 따라 싱글렛(singlet) 산소가 제1 비드로부터 방출되고, 그 방출된 싱글렛 산소와의 접촉이 제2 비드가 빛을 방출하도록 만드는 동안 비방사성(non-radiative) 에너지 전달에 의하여 빛이 생성된다. 이들 비드 세트는 시판중이다 (Packard). 비드 근접은 EPO-R에 대한 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서의 결합에 의하여 일어난다. EPO-R에 대한 결합에 대하여 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서와 경쟁하는 테스트 펩타이드는 이러한 결합을 막아, 빛의 방출의 감소를 가져온다.
그 방법을 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다: 테스트 EPO-R 작용제 펩타이드의 계단 희석물, 또는 양성 또는 음성 대조군 4 ㎕를 384 웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 그 후, 2 ㎕/웰의 수용체/비드 칵테일을 첨가하였다. 수용체 비드 칵테일은 5 mg/ml 스트렙타비딘 공여체 비드 (Packard) 15 ㎕, 5 mg/ml 모노클로날 항체 ab179 (이 항체는 재조합 EPO-R 중에 함유된 인간 태반 알칼리성 인산분해효소 단백질의 부분을 인식한다) 15 ㎕, 단백질 A 코팅된 수용체 비드 (단백질 A는 ab179 항체에 결합할 것이다; Packard), 재조합 EPO-R (ab179 표적 에피토프를 함유하는 인간 태반 알카리성 인산분해효소 단백질의 부분에 융합된 단백질로서 중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 것)의 1:6.6 희석물 112.5 ㎕ 및 알파퀘스트(Alphaquest) 버퍼 (40 mM HEPES, pH 7.4; 1 mM MgCl2; 0.1% BSA, 0.05% Tween 20) 607.5 ㎕로 이루어진다. 가볍게 두드려(tap) 혼합하였다. 2 ㎕/웰의 바이오티니롸 EPO-R 결합 펩타이드 트레이서를 첨가하였다 (30 nM 최종 농도). SEQ ID NO: 4의 서열을 사용하여 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 펩타이드 트레이서, 즉 EPO-R 결합 펩타이드 (표의 "리포터 EC50 (pM)"을 참조)를 만들었다.
Figure 112008000507936-PCT00090
1분 동안 원심분리하여 혼합하였다. 팩커드 탑 실(Packard Top Seal)로 플레티트를 밀봉하고, 호일로 둘러쌌다. 실온에서 밤샘 배양하였다. 18 시간 후에, 알파퀘스트 리더 (AlphaQuest reader; Packard)를 사용하여 빛의 방출을 판독하였다. 빛 방출 대 펩타이드의 농도를 도표로 그리고, 그라프 패드(Graph Pad) 또는 엑셀(Excel)을 사용하여 분석하였다.
테스트 펩타이드가 없는 경우 관찰된 빛 방출에 대하여 빛 방출의 50% 감소를 가져오는 테스트 펩타이드의 농도를 IC50으로 기록하였다.
4. C/ BFU -e 분석
EPO-R 신호는 척수 줄기 세포가 적혈구 세포 전구체로 증식하도록 분화하는 것을 자극한다. 이 분석법은 원시 인간 골수 다능성 줄기 세포로부터 적혈구 세포 전구체의 증식 및 분화를 자극하는 테스트 펩타이드의 능력을 측정하는 것이다.
이번 분석을 위해서, 10% FBS (Hyclone)로 보충된 IMDM 배지 (Gibco)에서 테스트 펩타이드의 계단 희석물을 만들었다. 그 후, 이들 계단 희석물, 또는 양성 대조군 EPO 펩타이드를 메틸셀룰로오스에 첨가하여 1.5 mL의 최종 부피를 만들었다. 그 후, 그 메틸셀룰로오스 및 펩타이드 혼합물을 볼텍스(vortex)로 철저하게 교반시켰다. 인간 골수 유래 CD34+ 세포 (Poietics/Cambrex)의 부분표본 (100,000 세포/mL)을 해동시켰다. 그 해동된 세포를 50 mL 튜브에서 1 mg/ml DNAse (Stem Cells) 0.1 mL에 부드럽게(gently) 첨가하였다. 이어서, 40∼50 mL IMDM 배지를 세포에 부드럽게 첨가하였다: 처음 10 mL에 대해서는 상기 배지를 50 mL 튜브의 벽면을 따라 한 방울씩 첨가한 후, 나머지 부피의 배지를 튜브의 벽면을 따라 천천히 분배하였다. 그 후, 그 세포를 900 rpm으로 20분 동안 회전(spin)시키고, 그 배지를 부드러운 흡입으로 조심스럽게 제거하였다. 그 세포를 1ml IMDM 배지에 재현탁시키고, mL 당 세포 밀도를 혈구계 슬라이더 상에서 계수하였다 (슬라이드에 세포 현탁물의 10 ㎕ 부분표본을 올림, 세포 밀도는 평균 개수 X 10,000 세포/ml임). 그 후, 그 세포를 15,000 세포/mL의 세포 밀도로 IMDM 배지에서 희석하였다. 그 후, 100 ㎕의 희석된 세포를 각각 1.5 mL의 메틸 셀룰로오스 + 펩타이드 샘플에 첨가하고 (분석에서 최종 세포 농도는 1000 세포/mL임), 그 혼합물을 볼텍스로 교반하였다. 혼합물에서 거품이 사라지도록 한 후, 끝이 뭉툭한 바늘을 사용하여 1 mL을 흡입하였다. 각 샘플로부터의 0.25 mL의 흡입된 혼합물을 24 웰 플레이트 (Falcon brand)의 4개의 웰 각각으로 첨가하였다. 그 플레이팅된 혼합물을 5% CO2하의 37℃의 습윤 인큐베이터에서 14일 동안 배양하였다. 위상 현미경(phase microscope) (5X∼10X 대물, 100X 최종 배율)을 사용하여 적혈구(erythroid) 콜로니의 존재를 평가하였다. EPO 양성 대조군의 경우 관찰된 것과 비교하여 형성된 콜로니의 수가 최대치의 90%인 경우의 테스트 펩타이드의 농도를 EC90으로 기록하였다 [표 2: C/BFU-e EC90 참조].
Figure 112008000507936-PCT00091
실시예 12: 생체 내 활성 분석
이번 실시예에서는 본 발명의 EPO-R 작용제 펩타이드의 활성 및 능력을 평가하는데 유용한 다양한 생체 내 분석법을 설명한다. EPO-R 작용제 펩타이드 이량체를 실시예 1에서 설명한 방법에 따라 제조하였다. 이들 펩타이드 단량체 및 이량체의 생체 내 활성을 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석(polycythemic exhypoxic mouse bioassay) 및 망상적혈구 분석(reticulocyte assay)를 포함하는 여러가지 분석법을 사용하여 평가하였다. 이들 두 가지 분석법을 아래 더 상세히 설명한다.
1. 폴리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석
테스트 펩타이드를 문헌 [Cotes and Bangham (1961), Nature 191: 1065-1067]에 기재되어 있는 방법을 적합하게 변형시킨 리시테믹 엑시폭식 마우스 생체분석에서 생체 내 활성에 대하여 분석하였다. 이 분석으로 EPO 유사체(mimetic)로서의 기능 (즉, EPO-R을 활성화시켜 새로운 적혈구 세포를 합성시키는 것)에 대한 테스트 펩타이드의 능력을 조사하였다. 합성된 적혈구 세포의 헤모글로빈 속으로 방사능표지된 철(iron)의 혼입에 기초하여 적혈구 세포의 합성을 정량하였다.
BDF1 마우스를 7∼10일 동안 주위 조건에 순응하게 하였다. 모든 마우스의 체중을 측정하여, 저체중 (<15 g)의 마우스는 사용하지 않았다. 마우스는 총 14일 동안 저압 챔버에서 연속 조건 사이클 하에 두었다. 각 14시간 사이클은 0.40±0.02% 대기압에서 18시간, 대기압에서 6시간으로 구성된다. 그 조건 이후에, 마우스는 사용하기 전에 추가로 72시간 동안 대기압 상태로 유지시켰다.
테스트 펩타이드 또는 재조합 인간 EPO 표준을 PBS+0.1% BSA 베히클 (PBS/BSA)에서 희석시켰다. 펩타이드 단량체 스톡 용액은 DMSO (dimethyl sulfoxide)에서 처음으로 용해시켰다. 음성 대조군은 오직 PBS/BSA으로 주사된 마우스의 한 그룹과 1% DMSO로 주사된 다른 한 그룹을 포함한다. 각 투여 그룹은 10마리의 마우스를 포함한다. 마우스들은 적절한 샘플 0.5 mL로 피하조직 (목의 덜미)으로 주사되었다
샘플 주사 후 48시간 후에, 마우스들은 약 0.75 μCuries/마우스의 투여량을 위해, 0.2 ml의 Fe59 (Dupont, NEN)로 복막내 주사로 투여한다. 마우스 체중은 Fe59 투여 24시간 후에 측정하였고, 마우스들은 Fe59 투여 후 48시간에 희생시켰다. 혈액을 심장 뚫기(cardiac puncture)에 의해 각 동물로부터 수집하고 헤마토크릿을 측정하였다 (헤파린을 항응고제로 사용하였다). 각 혈액 샘플(0.2mL)은 Packard 감마 계수기를 이용하여 Fe59 결합을 위해 분석하였다. 비-반응자 마우스 (예를 들어 음성 대조군 미만으로 방사능 결합을 갖는 마우스)은 적절한 데이터 구성에서 제외시켰다. 음성 대조군의 53% 미만의 헤마토크릿 수치를 갖는 마우스들 또한 제외시켰다. 결과는 각 실험 투여량에 대한 10 마리의 세트로부터 유래된 것이다. 각 그룹으로부터 혈액 샘플에서 결합된 방사능의 평균 양 (CPM, counts per minute)을 계산하였다.
2. 망상적혈구 분석( Reticulocyte Assay )
정상 BDF1 마우스에 EPO 대조군 또는 테스트 펩타이드로 삼일 연속적으로 투여시켰다 (0.5mL, 피하조직으로 주사됨). 3일째 날, 마우스에게 철 덱스트란 (100 mg/ml)을 또한 투여시켰다 (0.1mL, 복막내로 주사됨). 5일째 날, 마우스를 CO2로 마비시키고, 심장 뚫기로 혈액을 채취하였다. 각 혈액 샘플의 망상적혈구의 퍼센트(%)는 티아졸 오렌지 염색과 플로우 사이토미터 분석(retic-count program)으로 측정하였다. 헤마토크릿은 메뉴얼에 따라 측정하였다. 망상적혈구의 보정된 퍼센트는 다음 공식을 이용하여 결정하였다:
% RETIC보정 = % RETIC관찰 x (Hematocrit개별/ Hematocrit통상)
3. 혈액학적 분석( Hematological Assay )
정상 CD1 마우스는 EPO 양성 대조군, 테스트 펩타이드 또는 베히클의 정맥 내 주사를 일주일 간 4회 투여하였다. 양성 대조군 및 테스트 펩타이드 투여량의 범위는 mg/kg로서 나타내고, 제형에서 활성 화합물 농도를 다양화하여 시험하였다. 주사된 부피는 5mL/kg이다. 베히클 대조군은 12 마리의 동물인 반면, 잔여 투여량 그룹은 각각 8마리 씩이다. 매일 생존을 기록하고 및 매주 체중을 기록하였다.
투여된 마우스는 금식시킨 마우스이고 이소플루란(isoflurane) 흡입으로 마취시켜 말초 혈액 샘플을 1일 째(베히클 대조군 마우스의 경우) 및 15일 및 29일째 (4마우스/그룹/day)에 심장 또는 개복 대동맥 뚫기를 통하여 수집하였다. 혈액은 Vacutainer® 튜브로 옮겼다. 바람직한 항응고제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
혈액 샘플은 당업계에서 잘 알려진 자동화된 임상 분석기(예를 들어 Coulter, Inc.에서 제조된 것)를 이용하여 적혈구 합성 및 헤마토크릿(Hct), 헤모글로빈(Hgb) 및 총 적혈구 수(RBC)와 같은 생리기능을 측정하는 종점에서 평가되었다.
실시예 13: 동물 및 건강한 정상의 인간 자원자 ( NHV )에서 헤모글로빈 수준의 증가
1. 일반론
비임상적 및 임상적 데이터에 기초할 때, 펩타이드 I, 즉 완전한 합성 EPO 수용체 작용제는 불충분한 EPO 생산에 부차적인 빈혈을 안전하고 효과적으로 경감시키는 잠재력을 가진다. 펩타이드 I은 현재 이용중인 EPO 제품에 비하여 다음과 같은 몇 가지 잠재적 이점을 가질 것이다: 매 3 내지 4 주로 예상되는 투여 간격을 가진 연장된 반감기 및 약역학(pharmacodynamic) 활성, 이로 인해 향상된 편리성 및 순응성을 가져올 수 있다; 내인성 EPO와 공유하는 공통의 아미노산 서열이 없기 때문에, 항체 매개 순수적혈구 무형성증(pure red cell aplasia; PRCA)에 대한 발생 가능성의 감소; 내인성 EPO와 교차 반응(cross-react)하는 시판중인 EPOs에 대한 항체에 의해 일어나는 PRCA를 가진 환자의 치료에 대한 잠재력; 단백질 치료제에 비하여 실온에서 연장된 저장 기간을 가지는 향상된 안정성.
펩타이드 I의 첫번째(primary) 아미노산 서열이 재조합 인간 EPO (rHuEPO)의 서열과 상이하기 때문에, 내인성 EPO에 대한 교차 반응성 면역 반응을 유도할 가능성이 더 낮다. 비록 매우 드물지만, 재조합 인간 ESAs 및 내인성 EPO 양쪽 모두에 대한 능력의 손실과 관련된 심각한 부작용으로서 교차 반응성 면역 반응이 일어날 수 있다. 또한, 펩타이드 I은 합성 펩타이드이기 때문에, 그의 생산은 재조합 단백질 제품에서 일어날 수 있는 숙주 세포 물질로의 약물의 감염의 잠재적 위험을 회피한다.
2. 동물에서 펩타이드 I의 약역학
펩타이드 I은 마우스, 래트 (노르모시테믹(normocythemic) 및 신장절제된(nephrectomized)), 개, 토끼 및 원숭이에서 단일 또는 반복 투여량 투여에 따라 관찰된 투여량 의존적 활성을 가진 적혈구 생성(erythropoiesis)의 강력한 자극제(stimulator)이다. 래트 및 원숭이에서의 약리학적 연구는 헤모글로빈 수준이 투여량에 비례하는 것에 의하여 측정된 것으로서 망상 적혈구 (미성숙 RBCs) 및 RBCs의 증가를 보여주었다.
래트, 개 및 원숭이에서의 약역학 연구는 현재 시판중인 rHuEPO 제품과 비교하여 펩타이드 I의 지속된 혈장 존속성(persistence)을 증명하였다. 제거 반감기 (Elimination half time; t1/2)의 범위는 래트의 경우 21.5∼30.7 시간이고, 개의 경우 73.7 시간까지였다. 펩타이드 I의 생체분포(biodistribution)는 주로 혈장 부분(plasma fraction)이다. 5/6의 신장절제 래트에 9.87 mg 펩타이드 I/kg의 IV 투여에 따라, 그 t1/2는 약 48시간이었고, 제거는 (노르모시테믹 래트에서의 1.44 mL/h/kg과 비교하여) 0.763 mL/h/kg로 낮아서, 1.8의 증가된 AUC 규모를 가져왔다.
2. 인간에서 펩타이드 I의 약동학 및 약역학
2.1. 개요 및 방법
펩타이드 I을 1 상 1 연구(one Phase 1 study)에서 20 NHV에서 테스트하였다. 펩타이드 I으로의 이러한 제1 인간 연구(first-in-human study)는 무작위, 이중맹검, 플라세보 대조군, 일회량(single-dose), IV, 단계적 상승 투여량, 안전성 및 내인성 시험이었다. 이 연구의 주요 목표는 펩타이드 I의 안전성 및 약동학을 평가하는 것과, 약리학적 활성 투여량 (PAD)를 확립하는 것이다. 7명의 남성 자원자의 코호트(cohorts)를 5:2의 비율로 펩타이드 I 또는 플라세보의 일회량을 투여하도록 계획하였다. 코호트를 기준 값으로부터 헤모글로빈의 증가가 관찰되는 것에 의해 측정되는 PAD 까지 증가시킨 투여 수준으로 첨가하였고, 그 PAD로서 확인된 투여량 수준의 지점은 도 다른 자원자들의 코호트에서 반복될 것이다.
각각 펩타이드 I 투여 0.025, 0.05, 0.1 mg/kg 및 0.1 mg/kg (코호트 당 일회량)의 연속 방식으로 들어간 4개의 코호트에서 연구를 개시하였다. 연구의 결과는 망상 적혈구 개수 및 해모글로빈 수준의 증가가 0.1 mg/kg의 펩타이드 I을 투여받은 제3 코호트 이후에 달성되었다는 것을 보여주었다. 이러한 투여량을 제4 코호트에서 반복하여, 제3 코호트에서 관찰된 결과를 확인하였다. 그것으로서 연구를 종료하였다. 비맹검(unblinded) 결과를 아래에 요약한다.
2.2. 약역학적 ( pharmacodynamic ) 결과
망상적혈구 개수 (절대 수 및 백분율)는 펩타이드 I 투여의 증가에 따라 투여량 의존 증가를 보여주었다. 망상적혈구 개수는 최대 약 7일 모든 투여 코호트에서 투여 후 약 7일에 최대값에 도달하였다. 최대 망상적혈구 반응과, 망상적혈구 대 시간 곡선 (AUC0 ∼14일 및 AUC0 ∼28일)의 비교는 투여 군들 간에 유의미한 차이를 보여주었다 (p<0.05).
적혈구 생성의 부수적 외인성 자극이 없는 혈액의 제거(blood draws)에 관련된 연구 다음으로, 투여 후 28일에 걸친 헤모글로빈 반응 및 기준 선으로부터의 변화 (평균 및 최대 양쪽 모두)는 펩타이드 I의 투여량 증가에 따라 투여량 의존 증가를 보여준 반면, 대조군은 시간에 따라 헤모글로빈의 약간의 감소를 나타내었다 [일방향 분산 분석(one-way Analysis of Variance; ANOVA) 0.0001의 p-값]. 혼합된 모델을 사용한 일방향 공분산 분석(one-way Analysis of Covariance; ANCOVA)을 사용하여 모든 4개의 군들 간의 시간에 따른 기준선으로부터의 개별적 변화를 비교하였다. 이러한 분석의 결과는 0.025 대 0.1 mg/kg 군들 사이 (p=0.0027)에서 및 0.05 대 0.1 mg/kg 군들 사이 (p=0.0113)에서 유의미한 차이를 가지고, 4개의 투여량 군(p =0.0001) 모두에서 유의미한 투여량 반응을 보여주었다. 헤모글로빈의 적어도 1.0 g/dL 증가와 관련된 펩타이드 I의 PAD는 0.1 mg/kg이었다.
추가적으로, 코호트 3 및 4 (0.1 mg/kg 펩타이드 I 또는 플레세보)에서의 대상을 투여 후 42일 동안 추적하였다. 42일째에, 평균 헤모글로빈 수준은 0.1 mg/kg 펩타이드 I으로 처리한 환자에서의 기준선으로 되돌아왔지만, 플라세보 환자에서는 여전히 기준선 값 아래였다. 따라서, 그 연구 기간 전부로서, 42일째에서의 기준선 헤모글로빈으로부터의 변화에서 차이는 0.1 mg/kg 펩타이드 I로 투여된 환자와 플라세보로 투여된 환자 사이에서 ≥0.5 g/dL이었다.
혈청 EPO 수준은 펩타이드 I 투여의 증가에 따라 일시적으로 감소하였다. 다른 약역학적 변수에서의 변화 (증가된 적혈구 개수 및 헤마토크릿, 페리틴 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량의 일시적 감소, 가용성 트랜스페린 수용체 단백질의 일시적 증가 및 EPO의 일시적 감소)는 적혈구 생성의 자극과 일치하였다.
2.3 약동학적( Pharmacokinetic ) 결과
5분에 걸친 펩타이드 I 0.025, 0.05 및 0.1 mg/kg의 IV 투여 다음, 약물 농도는 주입의 개시 후 일반적으로 약 5분 내지 1 시간 사이에 피크가 되었다. 0.025 mg/kg 투여 군에서 펩타이드 I 농도는 5∼15 분 사이에서 피크가 되고, 반면 0.1 mg/kg 투여량에 대한 tmax는 1 시간 근처였다. Cmax가 얻어진 후, 플라즈마 농도가 감소하였는데, 0.025 mg/kg 투여 후 96 시간까지 일반적으로 정량할 수 있었고 (>25 ng/mL), 0.05 mg/kg 투여의 경우 5 일째까지, 그리고 0.1 mg/kg 투여의 경우 7일째까지 정량할 수 있었다. 계산된 반감기는 0.025 mg/kg 투여의 경우 16.7∼21.9 시간 (평균 19.2 시간); 0.05 mg/kg 투여의 경우 15.3∼25.1 시간 (평균 18.7 시간); 및 0.1 mg/kg 투여의 경우 17.7∼33.1 시간 (평균 23.5 시간)의 범위를 가지는데, 0.1 mg/kg 투여에서 약간 증가함을 보여주었다.
약물의 분포 및 제거는 표준 1 또는 2 성분 속도론(standard one or two compartment kinetics)를 따르지 않는 것으로 나타났다. 낮은 약물 농도에서만 1차 반응 속도(First order kinetics)가 관찰되었고, 이는 약 400 ng/mL를 초과하는 혈장 농도에서 대사/제거 공정의 포화가 일어난다는 것을 제시한다. 분포의 부피(volume of distribution)는 투여량에 따라 거의 변화하지 않음을 보여주었다(0.025, 0.05 및 0.1 mg/kg 투여량에 대해 각각 평균 2165, 1903 및 2010 mL). 혈장 제거(plasma clearance)는 투여량에 따라 약간의 감소를 보여주었다 (0.025, 0.05 및 0.1 mg/kg 투여에 대하여 각각 기하 평균으로 78.0, 70.7 및 59.2 mL/시간). Cmax를 표준화한 투여량의 ANOVA(ANOVA of dose normalized Cmax), 및 AUC(0-infinity) 데이터는 Cmax가 투여량과 1차 관계(linear relationship)를 가진다는 것을 보여주었다. 그러나, AUC(0- infinity )는 아마도 더 높은 투여량에서의 약물 제거에서 관찰된 작은 감소와 관련된, 최고 투여량 0.1 mg/kg에서의 비선형성(non-linearity)의 증거를 보여주었다.
2.4. 안전성 결과
15명의 환자 (플라세보를 투여받은 8명 중의 4명과 펩타이드 I을 투여받은 20명 중 11명)가 총 28개의 유해 사례 (AEs)를 경험하였다 (플라세보 군에서 6 및 펩타이드 I 군에서 22). 펩타이드 I이 투여된 환자의 경우, 두통 (4/20, 20.0%) 및 복통 (2/20, 10.0%), 구역(嘔逆) (2/20, 10.0%) 및 비인두염 (2/20, 10.0%)이 매우 빈번하게 보고된 사례였다.
한 가지를 제외한 모든 AEs는 경증상(mild) (등급 1)으로 등급매겨졌다. 펩타이드 I 수령자 중 관찰된 대부분의 AEs (15/22)는 본 연구 약물, 즉 펩타이드 I과는 아마도 관련이 없는 것으로 판단되었다. 4개 군 사이에 AEs의 빈도, 심각성 또는 패턴에서 차이가 없었다. 심각한 유해 사례 (SAEs) 또는 AE에 기인한 연구의 취소는 없었다; 그러나, 펩타이드 I의 0.025 mg/kg 투여량으로 할당된 1명의 환자에 대해서 경증의 약물 작용(mild drug reaction) 때문에 약물 연구가 중단되었다. 주입 2분 내에 시작된 이러한 작용은 뜨거운 느낌, 불편함 및 따끔거리는 목의 감각과 함께 가슴에서 시작되어 얼굴로 확장된 홍조(flush)였다. 안전성을 위한 조치로서, 이 환자에 대한 주입을 중단하였다. 증상은 자연적으로 신속하게 해결되었다. 치료적인 개입은 필요하지 않았다. 바이탈 사인에 변화는 없었다. 실험 변수는 추가적인 면역학적 테스트를 포함하여 정상이었고, 따라서, 이러한 반응의 특별한 특징을 밝힐 수 없었다. 다른 ESAs를 포함하는 많은 약물에 있어서 유사한 (또는 더 심각한) 약물 작용들이 관찰된 바 있다. 더욱이, 펩타이드의 IV 투여 도중에 환자들을 관찰하여야 한다. 만약 환자에게 유사한 증상이 발생하면, 주입을 중단해야만 한다.
1명의 플라세보 수용자 및 1명의 펩타이드 I 수용자에게 각각 경증의 두통 및 경증의 복부 경련에 대한 투약을 동시에 하였다. 바이탈 사인, 심전도 (ECGs) 또는 실험값(laboratory values)에 임상적으로 중요한 변화는 없었다. 이러한 실험의 환자 중 누구도 펩타이드 I에 대해 특이적인 항체를 생성시키지 않았다.
2.5. 요약
요약하면, 펩타이드 I은 안전하고, 플라세보에 유사한 안전성 특성(pofile)을 가지며 0.025, 0.05 또는 0.1 mg/kg의 일회 IV 투여 후에 잘 관용(well tolerated)되는 것으로 나타났다. 약동학적 결과는 0.1 mg/kg 투여시 약 15 내지 33 시간의 범위이고, 평균 23.5 시간인 반감기를 나타내었다. 그 중앙값(median)은 주입 시작 후 15분에 일어나며 모든 투여량에 있어서 유사하다. Cmax는 투여량과 선형 관계를 가지는 것으로 나타났고; AUC(0- infinity )는 0.1 mg/kg 투여량에서 비선형인 것으로 나타났다. 1차 반응 속도는 더 낮은 약물 농도에서만 관찰되었고, 이는 혈장 농도 > 400 ng/mL에서 대사/제거 단계가 포화됨을 제시하는 것이다. 펩타이드 I은 평가된 모든 투여량에서 망상적혈구에 대한 약리학적 활성을 보여주었다; 일반적으로 반응은 증가하는 투여량에 따라 더 크고 더 오랜 반응을 가져 투여량 의존적이었다. 10명의 펩타이드 I 수용자 중의 기준선인 1.36±0.39 g/dL로부터의 평균 최대 증가가 그 기준으로부터 헤모글로빈의 임상적 및 통계학적으로 유의미한 증가와 관련하여 0.1 mg/kg 투여 군에서 NHV에서 PAD를 규정하였다. 다른 약역학적 변수에서의 변화 (적혈구 세포수 및 헤마토크릿의 증가, 페리틴 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량의 일시적 감소, 가용성 트랜스페린 수용체 단백질의 일시적 증가 및 EPO의 일시적 감소)는 적혈구 생성의 자극과 일치한다.
2005년 6월 4일 스톡홀름에서 열린 유럽 혈액학회 10주년 기념 회의에서 제공된 포스터 및 요약 #0470은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.
실시예 14: 예비투석, 투석 및 종양 환자의 헤모글로빈 수준의 증가
1. 예비투석( pre - dialysis ) 환자
투석중이 아니고, 이전에 적혈구 생성 자극제 (ESA) 치료를 받은 적이 없는 만성 신질환 (CKD)을 가진 환자에 있어서, 무작위, 이중맹검, 플라세보 대조군, 일회량의 정맥내 펩타이드 I 주사의 안전성, 약역학 및 약동학의 연속적인 투여량 상승 연구를 수행할 것이다. 이 연구는 투석 중이 아닌 CKD 환자 (예비 투석 환자)에 있어서 펩타이드 I의 일회량 정맥내(IV) 투여 수준의 안전성 프로파일(profile)을 평가할 것이다. 이 연구는 또한 헤모글로빈, 망상적혈구 및 철 보유를 포함하는 약동학적 변수에 있어서 펩타이드 I의 일회량의 용량 반응 관계(dose response relationships)을 평구하고; 예비 투석 환자에 있어서 정맥 내로의 펩타이드 I의 일회량 수준의 약역학적 프로파일을 평가하며; 예비 투석 환자에 있어서 정맥 내 투여의 약리학적 활성 투여량 (PAD), 예컨대, 그 투여량은 환자의 >70%이 기준선으로부터 ≥ 1 g/dL의 헤모글로빈 증가를 달성하는 것을 결과를 가져오는 투여량을 결정할 것이다.
본 연구의 최종 목적은 유해 사례 (AEs); 심각한 유해 사례 (SAES); Cmax, AUC0-t, AUC0 - infinity, t1 /2β, Vd 및 CL을 포함하는 약동학적 변수; 망상적혈구, 헤모글로빈, 망상적혈구 헤보글로빈 함량 및 철 보유의 혈청 측정 (예컨대, 혈청 페리틴, 트랜스헤린 포화 및 트랜스페린 수용체 단백질)을 포함하는 약리학적 변수; 기준선으로부터 평균 헤모글로빈 변화; 기준선으로부터 최대 헤모글로빈 변화; 기준선으로부터 ≥ l g/dL의 헤모글로빈 증가를 얻은 치료 환자의 비율; 및 적혈구 세포 수혈의 빈도를 포함한다.
본 연구를 위해 선택된 환자들은 헤모글로빈이 ≥9 g/dL 및 ≤ 11 g/dL인 연령이 18∼75세인 만성 신질환에 버금가는 예비 투석 환자로서 ESAs로 이전에 치료받은 적이 없고, 적격 기준에 부합하는 자로 포함시킬 것이다. 9명 환자의 각각의 코호트에서, 환자들은 펩타이드 I (n=7) 또는 플라세보 (n=2)의 일회량을 투여받은 것을 무작위로 할당될 것이다. 코호트 당 5명의 펩타이드 I 치료 환자에서 최소 22일 동안의 테이터의 유용성을 확인하기 위하여, 22일 전에 연구가 종료된 코호트 내의 제3의 다음의 환자들로 대체할 것이다. 각각의 대체 환자는 취소된 환자와 동일한 치료군으로 할당될 것이다. 22일 후에 연구가 종료된 환자는 대체되지 않을 것이다.
6개 이하의 투여 수준 코호트 (4개 이하의 계획된 투여 수준과, 2개 이하의 추가적인 더 낮은, 중간 및/또는 반복 [확인] 투여 수준)가 독립적인 안전성 모니터(Independent Safety Monitor), 조사원 및 스폰서에 의하여 연속적으로 참여되는 것으로 계획되었다. 최대 54 명의 평가할 수 있는 환자가 이번 실험에 참여할 것이다.
이 연구에서 각각의 환자는 투여 후 적어도 28일 동안 참여하는 것으로 예상된다.
각 환자는 펩타이드 I 또는 플라세보의 일회량을 투여받을 것이다.
계획된 순자적 펩타이드 I 투여 수준은 다음과 같다.
펩타이드 I 투여량 ( mg / kg ) 0.05 0.1 0.2 0.3 추가적 확인, 중간 또는 더 낮은 투여량 추가적 확인, 중간 또는 더 낮은 투여량
이것은 코호트 당 9명의 예비 투석 환자를 가진 6개 이하의 투여량 코호트를 가진 무작위, 이중맹검, 플라세보 대조군, 연속 투여량 상승 연구이다. 각각의 코호트에서, 환자들은 29일에 걸쳐 또는 후에 일어난 여하한 유해 사례의 안정화에 이를 때까지 연구될 것이다. 헤모글로빈 수준이 모든 환자에서 상승된 수준이 기준선 수준의 0.5 g/dL 이내로 돌아갈 때까지 추적될 것이다.
기준선 헤모글로빈 농도는 약물 투여 연구 전의 3번의 가장 최근의 헤모글로빈 수치로서 정의한다. 연구 도중에, 코호트 개시 또는 정지 결정을 위한 헤모글로빈의 변화는 다음의 연속적인 헤모글로빈 수치에 의하여 확인하는 것이 필요하다.
만약 환자의 헤모글로빈 수준이 14 g/dL에 도달하면, 그 환자는 임상적으로 지시되는 경우 피를 뽑아야 할 것이다. 만약 환자의 헤모글로빈 수치가 16 g/dL (확인됨)에 이르게 되면, 그 환자는 피를 뽑아야 할 것이다.
제1 코호트의 투여 후에, 그 다음 투여량 수준의 다음 코호트의 연속적인 참여는 투여량 상승 기준으로 특정된 프로토콜에 기초하게 될 것이다. 그 다음 투여량 수준 코호트에 대한 투여량의 증가는 정지 기준으로 특정된 프로토콜에 기초하여 멈추어질 것이다. 비맹검(unblinded)의 독립 안전성 모니터가 투여량 상승 또는 정지 기준에 부합하게 될 때 결정되는 진행중인 기준상에서 비맹검 임상 및 실험 데이터를 검토할 것이다.
조사자 임상 직원(Investigator clinic personnel) 및 스폰서 임상 직원(Sponsor clinical personnel)에게는 개별 환자 치료 할당 및 환자 확인 PK, 혈액학, 및 헤마토크릿, 헤모글로빈, MCHC (평균 적혈구 헤모글로빈 농도), MCH (평균 적혈구 헤모글로빈), MCV (평균 적혈구 용적), 망상적혈구 개수, 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량을 포함하는 철 변수 결과, 또는 페리틴, 트랜스페린 포화 및 트랜스페린 수용체 단백질을 포함하는 철 저장 결과에 대해서 가려지게(blinded) 될 것이다; 그러나, 이들 직원은 연구 진행 도중에 이들 변수에 대한 확인된 결과를 검토할 수 있을 것이다. 이들 직원은 이들 변수에 대해 결과가 확인된 환자에게 접근할 수 없을 것인데, 이는 만약 환자에 의한 확인의 경우, 치료 할당에 대해 잠재적으로 가려지지 않을 수(unblind) 있기 때문이다.
코호트 중의 모든 평가될 수 있는 환자 (7명 이상)가 22일째에 도달할 때 시작되는, 그 다음 코호트에 대한 투여량 증가가 안전성에 대한 염려가 확인되지 않는다면 허용될 것이고: 그 코호트 중에 ≥1.0 g/dL의 헤모글로빈 증가가 이루어진 환자가 없거나; 또는 펩타이드 I을 투여받거나 또는 기준선으로부터 > 1.0 g/dL의 헤모글로빈 증가가 이루어진 모든 환자는 2개의 시점 중 최소값에 대하여 안정성 (0.5 g/dL 이내의 피크 헤모글로빈 수치) 또는 가역성 (피크 헤모글로빈 수치로부터의 감소)을 증명한다.
만약 다음의 기준에 부합하게 되면, 진행중인 코호트 내로의 새로운 환자의 참여 및 새로운 투여량으로의 증가가 멈추어질 것이다: 한 코호트 내의 2명 이상의 환자가 펩타이드 I 관련 유해 사례의 등급 3 또는 4를 가짐; 한 코호트 내에서 펩타이드 I을 투여받은 2명 이상의 환자가 모든 4 주 기간에 걸쳐 헤모글로빈의 ≥ 2.0 g/dL 증가를 가짐 (출발 상기 기준선 수준의 증가); 또는 한 코호트 내에서 펩타이드 I을 투여받은 2명 이상의 환자가 헤모글로빈의 목적 범위의 상한을 초과함 (>13 g/dL).
만약 안전성에 대한 염려가 확인되지 않는다면, 코호트 내의 모든 평가가능한 환자 (7명 이상)가 22일째에 도달한 후, 확인 (반복), 더 낮은 또는 중간 투여량 연구를 위하여 9명 환자의 추가적인 코호트가 개시될 수 있다.
예비 투석 환자에 대하여, 0.025 내지 0.2 mg/kg, 가능하다면 0.05∼0.1 mg/kg, 가능하다면 0.067∼0.075 mg/kg의 PAD가 측정될 것으로 예상된다.
2. 투석 환자
만성 혈액 투석 환자의 빈혈의 유지 치료를 우한 정맥 내 투여된 펩타이드 I 주입의 개방표지(open-label), 다중센터(multi-center), 연속, 안전한 투여량 검색 연구, 약역학 및 약동학 연구가 헤모글로빈 수치가 에포틴 알파(Epoetin alfa)에서 안정한 혈액투석 환자에서 기준선 위 또는 아래로 1.0 g/dL 이내로 헤모글로빈을 유지하는 매달 정맥 내 투여되는 펩타이드 I 투여량의 범위를 결정하기 위하여 수행될 수 있다. 이 연구는 혈액투석 환자에서 정맥 내 투여된 펩타이드 I의 3번 이하의 투여량의 안전성 프로파일을 또한 평가할 것이고; 혈액투석 환자에서 정맥 내 투여된 펩타이드 I의 3번 이하의 투여량의 약동학적 프로파일을 평가할 것이다 (연구 환자의 아집단에서).
이 연구의 최종 목적은 기준선으로부터 평균 매주 헤모글로빈 변화; 13 주 동안 줄곧 기준선 위 또는 아래 1.0 g/dL 이내로 헤모글로빈을 가진 환자의 수 (%); 13 주 동안 줄곧 9.5∼13.0 g/dL 이내로 헤모글로빈을 유지한 환자의 수 (%); 연구하는 동안 투여량의 조정이 없었던 환자의 수 (%) 및 연구하는 동안 투여량의 증가 또는 감소를 가진 환자의 수 (%); 적혈구 수혈의 빈도; 망상절혈구 개수 (절대 및 AUC), 망상적혈구 헤모글로빈 함량 및 철 저장의 혈청 측정 (예컨대, 혈청 페리틴, 트랜스페린 포화 및 가용성 트랜스페린 수용체 단백질)을 포함하는 추가적인 약리학적 변수; 유해 사례; 심각한 유해 사례; 및 Cmax, AUC0 -t, AUC0 - infinity, t1 /2β, Vd, Vss 및 CL을 포함하는 약동학 변수 (연구 환자의 아집단에서)를 포함한다. 약동학 및 약역학 분석의 결과는 에포틴 알파의 매주 투여량에 기초한 펩타이드 I의 매달 투여량을 최선을 예측하는 예비(preliminary) 변환 인자를 측정하기 위해 사용될 것이다.
연구를 위해 선택된 환자들은 혈액투석 환자로서 연령이 18세 또는 그 이상이고 시판중인 에포틴 알파의 안정적인 투여에 따라 안정하게 유지되는 헤모글로빈을 가지는 적합한 기준에 부합하는 환자가 참여하게 될 것이다. 코호트당 15명의 환자인 4번 이하의 연속 투여량 수준의 코호트가 3 내지 10개의 임상 센터에서 참여하도록 계획한다.
3번의 펩타이드 I 투여량을 투여받은 코호트 당 최소 10명의 환자에서의 데이터의 유용성을 확인하기 위하여, 3번째 투여를 받기 전에 연구가 종결된 코호트에서 6번째 및 이후의 환자가 최대 4번의 교체 이하로 교체될 것이다. 3번의 투여량을 투여받고 연구가 종결된 환자는 교체되지 않을 것이다.
2번의 투여량의 수준 코호트는 순차적으로 편입되도록 최초에 계획되었다. 관찰된 안전성 프로파일 및 약리학적 반응에 의존하여, 15명의 환자의 2 이하의 추가적인 코호트가 각각 더 낮은, 중간 및/또는 반복 (확인) 투여 수준, 및/또는 투여 빈도를 연구하기 위하여 추가될 수 있다.
최소 30명 및 최대 60명의 평가할 수 있는 환자가 이번 실험에 참여될 수 있다. 연구에서의 각 환자는 약 15 주 동안 참여될 것으로 예상되며, 이어서 4 주의 스크리닝 기간을 가진다.
뒷받침하는 데이터의 유용성을 확인하여 추가적인 12 주 동안 투여 기간을 연장시키기 위한 수정이 계획된다.
펩타이드 I의 투여량은 투석의 마지막 15분 동안 30 초에 걸친 빠른 정맥 내 일시 주사로서 총 3번의 투여량에 대해 매 4주 마다 투여될 것이다. 코호트 중의 각 환자는 미리 특정된 에포에틴 알파에서 시작하여 펩타이드 I으로 전환된 수준으로 펩타이드 I의 개방표지 투여량을 투여받을 것이다. 이전 코호트에서 관찰된 투여량 반응 관계에 기초항 다음 코호트에 있어서 그 투여량은 단계적으로 증가되거나 또는 감소될 것이다. 계획된 출발 펩타이드 I 투여량 수준 전환은 다음과 같다:
코호트 출발 코호트 단계적 증가 또는 감소 코호트 중간 또는 확인 코호트(들) 중간 또는 확인 코호트들 100 U/ kg /주 에포에틴 알파에서 펩타이드 I 투여량 ( mg / kg / Q4W ) 전환 인자 0.33 증가에 있어 0.041∼0.050 감서에 있어 0.017∼0.025 결정될 것임 결정될 것임
펩타이드 I 투여량은 개별 환자에 있어서 다음과 같이 조절될 수 있다. 펩타이드 I 연구 약물로의 3번째 투여량으로 출발하여, 환자의 확인된 헤모글로빈이 기준선으로부터 > 1.0 g/dL로 감소한 경우, 또는 환자의 확인된 헤모글로빈이 기준선으로부터 ≥0.5 g/dL로 감소하여 11 g/dL 아래 수준이 되는 경우, 투여량은 25% 만큼 증가될 것이다. 펩타이드 I 연구 약물로의 3번째 투여량으로 출발하여, 환자의 확인된 헤모글로빈이 기준선으로부터 > 1.5 g/dL로 증가한 경우, 또는 환자의 확인된 헤모글로빈이 기준선으로부터 ≥0.5 g/dL로 증가하여 12 g/dL을 넘는 수준이 되는 경우, 투여량은 25% 만큼 감소될 것이다. 연구 도중의 임의의 시점에서 환자의 확인된 헤모글로빈이 임의의 2 주의 기간 내에 > 1.0 g/dL로 증가 (출발 상한 기준선 증가)한 경우 그 다음 투여량은 25% 만큼 감소될 것이다. 연구 도중의 임의의 시점에 있어서, 환자의 확인된 헤모글로빈이 12.5 g/dL를 초과하는 경우, 헤모글로빈이 12.0 g/dL로 감소될 때까지 그 다음 투여가 연기될 것고, 그 투여량은 25% 만큼 감소될 것이다.
기준선 헤모글로빈 농도는 연구 약물의 투여 전 3주에 수집된 3번의 가장 최근의 주중반(mid-week) 투석전 헤모글로빈 수치의 평균으로 정의하였다. 연구 도중에, 개별적인 투여량 조정 또는 코호트 개시 또는 중지 기준 결정에 대한 헤모글로빈 수치의 변화는 7 주 내의 임의의 시간에서 반복 헤모글로빈 수치로의 확인이 필요하다.
이것은 코호트 당 15명의 혈액투석 환자의 2∼4 치료 코호트로의 개방표지, 연속 투여량 검색 시험이다. 각 환자는 매 4주 마다 총 3번의 투여량으로 펩타이드 I의 정맥 내 투여를 받게 될 것이다. 펩타이드 I의 첫번째 투여량을 투여받은 후, 환자는 연구 전체에 걸쳐 적어도 매주 관찰될 것이다. 연구 도중에, 철 상는가 Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (K/DOQI) 치료 가이드라인에 따라 유지될 것이다.
환자는 펩타이드 I의 마지막 투여 후 최소 42일 동안 또는 후에 발생한 여하한 유해 사례가 안정화될 때까지 추적될 것이다. 치료를 중단한 후, 모든 환자에서 헤모글로빈 수준을 목적 범위로 돌아갈 때까지 추적할 것이다.
만약 환자의 헤모글로빈 수준이 14 g/dL에 도달하면 (확인됨), 환자는 조사자의 판단에 따라 피를 뽑게(phlebotomized)될 것이다. 만약 환자의 헤모글로빈 수준이 16 g/dL에 도달하면 (확인됨), 환자는 피를 뽑게 될 것이다. 방혈(phlebotomy)의 방법은 그 부위의 표준 임상 절차에 따라 수행될 것이다. 방혈된 혈액의 부피는 기록될 것이다. 방혈된 환자는 펩타이드 I의 투여를 중단할 것이고, 방혈 이후의 약동학 데이터는 분석에서 제외될 것이다.
제1 코호트의 투여 후, 다음 코호트의 연속적인 참여는 투여량 증가 및 감소 기준이 특정된 프로토콜에 기초한다. 적절한 투여량 수준 변환 인자가 확인되면, 그 변환 인자 투여량 수준이 확인 코호트에서 반복될 수 있다. 독립 안전성 모니터(Independent Safety Monitor) 및 스폰서(Sponsor)는 투여량 상승, 감소, 추가적인 코호트 또는 정지 기준을 부합하게 되었을 때를 결정하기 위한 진행 기준(ongoing basis)에 대한 임상적 및 실험적 데이터를 검토할 것이다.
한 코호트에 등록된 6명 이상의 환자의 데이터 검토를 7주째에 시작하여, 현재의 코호트 내로의 참여가 중단될 수 있고, 안전성 염려가 독립 안전성 모니터에 의하여 확인되지 않은 경우 그 다음 코호트에 대한 투여량 상승이 허용되며, 결합한 6 이상의 환자는 기준선으로부터 7주 또는 그 후에 1.0 g/dL을 넘는 기준선으로부터 확인된 헤모글로빈 감소를 가진다.
한 코호트에 등록된 6명 이상의 환자의 데이터 검토를 7주째에 시작하여, 현재의 코호트 내로의 참여가 중단될 수 있고, 안전성 염려가 독립 안전성 모니터에 의하여 확인되지 않은 경우 그 다음 코호트에 대한 투여량 감소가 허용되며, 결합한 6 이상의 환자는 기준선으로부터 > 1.0 g/dL의 확인된 헤모글로빈 증가로 7주째에 헤모글로빈 수치가 > 13.0 g/dL이 되거나, 연구 개시 후 임의의 2 주의 기간 내에 확인된 헤모글로빈 증가가 > 1.0 g/dL (기준선 위로 출발 증가) 이다.
한 코호트에 등록된 10명 이상의 환자의 데이터 검토를 7주째에 시작하여, 안전성 염려가 독립 안전성 모니터에 의하여 확인되지 않는다면, 추가적인 코호트가 더 낮은 또는 중간 (현재 및 이전 연구 사이) 변환 인자 및/또는 투여 빈도를 연구하기 위하여 개시될 수 있다. 초대 2개의 추가적인 코호트가 참여될 수 있다.
7주째의 한 코호트에 등록된 10명 이상의 환자의 데이터 검토 후, 안전성 염려가 독립 안전성 모니터에 의하여 확인되지 않고, 투여량 상승 또는 투여량 감소 규정에 모두 적합하지않는 경우, 동일한 변환 인자를 이용하는 확인 코호트가 동일한 변환 인자의 반복 및/또는 투여 빈도를 위해 개시될 수 있다.
현재의 코호트 내로의 새로운 환자의 등록 및 새로운 투여량으로 증가는 다음의 기준에 부합하게 되면 중단될 것이다: 코호트 내의 3명의 환자가 단계 3 또는 4의 펩타이드 I 관련 유해 사례를 가짐.
투석 환자에 대해서, PAD는 0.025∼0.2 mg/kg, 가능하다면 0.05∼0.1 mg/kg, 가능하다면 0.067∼0.075 mg/kg로 측정될 것이다.
3. 종양 환자
화학 요법 유래 빈혈 (CIA)을 가진 암환자에서 피하 투여된 펩타이드 I의 안전성, 약동학 및 약역학의 개방 표지, 다중 센터 투여량 상승 연구가 화학요법 유래 빈혈을 가진 환자에서의 헤모글로빈 반응과 연관하여 매 3주마다 피하(SC) 주사에 의하여 펩타이드 I 투여량을 결정하기 위하여 수행될 것이다. 다른 목적은 다음을 포함한다: 골수 억제 화학요법을 동시에 받고 있는 암환자에서 매 3주 마다 피하로 투여되는 펩타이드 I의 4번 이하의 투여량의 안전성 프로파일을 평가함; 펩타이드 I의 상이한 투여량 수준에서 CIA를 가진 환자에서 Hgb의 기준선으로부터의 변화를 측정함; 펩타이드 I에 대한 Hgb 반응(최종점에서 정의한)을 가지는 환자의 비율을 측정함; CIA 환자에서 11∼13 g/dL의 표적 범위로 헤모글로빈을 증가 및 유지시키는 피하로 투여된 펩타이드 I의 투여량을 결정함; CIA 환자에서 피하로 투여된 펩타이드 I의 4번 이하의 투여량의 약동학 프로파일을 평가함 (연구 환자의 아집단에서); 및 펩타이드 I의 활성 투여량에서 투여 빈도 및 비경구 철 교환(replacement)의 효과를 조사함.
연구의 최종점은 다음을 포함할 것이다: 치료 군당 > a 2 g/dL의 헤모글로빈 증가를 가지는 환자 또는 > 1 g/dL의 헤모글로빈의 증가로 그 이전 28일 내에 적혈구 세포 수혈 없이 4주, 9주 및 12주째에 적어도 12 g/dL에 이른 환자의 비율; 환자의 비율 그 이전 28일 내에 적혈구 세포 수혈 없이 4주, 9주 및 12주째에 기준선으로부터 > 1 g/dL의 헤모글로빈 증가를 가지는 환자의 비율; 4주, 9주 및 12주째에 11∼13 g/dL의 목적 범위 내의 헤모글로빈을 가지는 환자의 비율; 4주째 후에 11∼13 g/dL의 목적 범위 내의 헤모글로빈 수치를 가지는 환자의 비율; 기준선으로부터 평균 헤모글로빈 변화; 적혈구 세포 수혈의 빈도; 망상적혈구 개수 (절대 및 AUC), 망상적혈구 헤모글로빈 함량을 포함하는 추가적인 약리학적 변수; 철 보유(iron stores) 측정에서의 변화, 예컨대 트랜스페린 포화 및 혈청 페리틴; 유해 사례 (AEs); 심각한 유해 사례 (SAEs); 및 연구 환자의 아집단에서, Cmax, AUC0 -t, AUC0-∞, t½β (제거 반감기), Vd (분포의 외관상 부피(apparent volume of distribution)), Vss (정상상태 부피(steady-state volume)) 및 CL (제거(clearance))를 포함하는 약동학 변수.
연구를 위해 선택된 환자는 고형 종양 또는 림프종을 가진 환자로서 연령이 18∼80세이고, 헤모글로빈 수치가 ≥ 9 g/dL 및 ≤ 11 g/dL이며, 화학요법을 더불어 받고, 지난 90일 내에 ESAs로 미리 치료받은 적이 없으며, 적격 기준을 만족하는 환자이고, 이들에게 메디칼 모니터 (Medical Monitor; MM)에 의하여 승인된 출발 투여량 또는 이어지는 연속 투여량 수준에서 펩타이드 I이 투여될 것이다. 치료군 당 최소 10명의 치료 환자의 12주의 데이터의 유용성을 확인하기 위하여, 8주 전에 연구가 종료된 치료군 내에 6번째 및 그 다음의 환자들이 대체될 것이고, 최대 5번의 대체가 될 것이다. 각 대체 환자는 취소된 환자와 동일한 치료군에 할당될 것이다. 이어서 15명의 환자의 4개 이하의 개방표지 치료군이 더 낮은, 중간 및/또는 반복 투여 수준, 및/또는 펩타이드 I의 투여빈도, 및/또는 트랜스페린 포화 수준 25∼50%를 유지하기 위한 비경구적 철 교환(replacement)을 연구하기 위하여 추가될 수 있다. 모든 가능한 투약 계획을 조사한다면, 최소 30명 및 최대 90명의 환자 (대체를 포하하지 않음)가 이번 시험에 참여될 것이다.
본 연구에서 각 환자는 12주째까지 참여하고 뒤 이어서 4주의 스크리닝 기간을 가질 것으로 예상된다.
15명 환자의 일련의 코호트는 펩타이드 I의 증가되는 투여량을 투여받을 것이다. 개방 표지 투여량은 총 4번의 투여량에 대해 매 3주마다 SC 주사로 투여될 것이다 (연구 주 1, 4, 7, 10). 통상적으로, 펩타이드 I은 화학요법 사이클의 1일째에 투여될 것이다. 펩타이드 I 출발 투여량 및 투여 빈도는 건강한 자원자의 단계 (Phase) 1 데이터뿐만 아니라 펩타이드 I 및 다른 적혈구 생성 자극제 (ESAs)에 대한 적혈구 생성 반응의 PK/PD 데이터로부터 모델링된 예측된 반응에 기초한다. 계획된 펩타이드 I 투여량 수준 및 각 군에서 환자의 수는 다음과 같다.
N 치료 투여량(mg/kg) Q3W
15 펩타이드 I 0.1 mg/kg
15 펩타이드 I 0.2 mg/kg
15 펩타이드 I 0.4 mg/kg
15 펩타이드 I 0.6 mg/kg
환자들은 마지막 주사 후 28일 동안, 또는 유해 사례가 안정화될 때까지, 또는 헤모글로빈 수치가 11∼13 g/dL이 될 때 중 어느 것이든 마지막에 발생하는 시점까지 추적될 것이다. 투여량 증가는 허용되지 않을 것이다. 4주째 후, 목적 범위의 헤모글로빈을 유지하기 위하여 적혈구 세포의 수혈이 필요하다면, 그 환자는 약물 연구로부터 제외되고, 표준적인 치료로 돌아가며, 안전성을 위해 추가적인 28일 동안 추적될 것이다. 연구 중의 임의의 시점에서, 환자의 헤모글로빈이 임의의 2주 기간 내에 > 1.0 g/dL 만큼 증가하는 경우, 헤모글로빈이 안정화 (1주에 < 0.5 g/dL의 증가)될 때까지 그 다음 투여가 연기될 것이고, 그 투여량은 50%만큼 감소될 것이다. 기준선 헤모글로빈 농도는 연구 약물의 투여 전 주에 수집된 2번의 최근 주간 헤모글로빈 수치의 평균으로서 정의한다 (예컨대, 스크리닝 및 기준선 수치). 연구 도중에, 코호트 개시 또는 정지 기준 결정을 위한 헤모글로빈 수준의 변화는 7일 이내에 그 다음의 연속적인 헤모글로빈 수치에 의한 확인이 필요하다.
이것은 그룹당 15명의 CIA를 가진 환자로 이루어지는 6개 이하의 치료군을 가진 개방표지, 다중 센터 시험이다. 최초 치료군에서, 개방표지 펩타이드 I은 총 4번 이하의 투여량으로 매 3주마다 피하주사로 투여될 것이다. 첫 번째 투여 후에, 환자들은 연구 전체에 걸쳐 적어도 매주 관찰될 것이다. 환자들은 연구 약물의 마지막 투여 후 최소 28일 동안, 또는 유해 사례가 안정화될 때까지, 또는 헤모글로빈 수치가 11∼13 g/dL가 되는 것 중 어느 것이든 마지막으로 일어날때까지 추적될 것이다. 만약 환자의 헤모글로빈 수준이 14 g/dL에 도달하게 되면 (확정), 그 환자는 임상적으로 지시되는 경우 피를 뽑게(phlebotomized)될 수 있고, 방혈의 부피가 기록된다. 방혈(phlebotomized)된 환자는 연구 약물의 투여가 중단될 것이고, 방혈 후의 약역학 데이터는 분석에서 제외될 것이다. 메디칼 모니터 (Medical Monitor; MM) 및 스폰서는 정지 기준에 부합되었을 경우 또는 때를 결정하기 위한 진행 기준에 대한 안전성 및 약역학 데이터를 검토할 것이다.
한 코호트 내의 6명 이상의 환자가 적어도 6주의 추적이 완료된 후에는 (즉, 2번째 투여 후 적어도 3주), 현재 코호트 내로의 참여가 중단될 것이고, 다음 코호트로의 투여량 상승이 다음의 경우 허용될 것이다: MM에 의해 안전성 염려가 없음이 확인됨; 및 6명 이상의 환자가 4주째 후에 수혈되거나 또는 6주째에 <1 g/dL의 확인된 헤모글로빈 증가를 가짐.
한 코호트 내에 등록된 6 이상의 환자들이 적어도 6주의 추적이 완료된 후 (즉, 2번째 투여 후 적어도 3주), 현재 코호트 내로의 참여가 중단될 것이고, 다음 코호트에서 더 낮은 수준으로 투여량의 감소가 다음의 경우에 허용될 것이다:
펩타이드 I과 아마도 관련될 수 있는 적어도 단계 3 또는 4의 AEs의 발생 또는 MM이 펩타이드 I에대한 임의의 구체적인 염려를 확인한 경우; 또는 총 6명 이상의 환자가 > 13.0 g/dL의 확인된 헤모글로빈 수준 (수혈과 무관) 또는 > 1.0 g/dL의 임의의 2주 기간 내에 확인된 헤모글로빈 증가 (수혈과 무관)를 가짐.
상기 MM 및 스폰서(Sponsor)에 의하여 안전상의 염려가 없다고 확인되면, 15명의 환자의 2 이하의 추가적인 개방 표지(open-label) 치료군에 대해 더 낮은, 중간 (현재 및 이전 연구들 사이) 또는 반복 투여 수준에서 개시될 수 있을 것이다. 또한, 일단 매 3 주마다 투여된 활성 투여량이 결정되면, 2 이하의 추가적인 코호트가 동일한 총 투여량이 상이한 주기 (예컨대, 매 4주마다 투여된 매 3주 투여량의 4/3)로 부분에 투여된 경우의 상대적인 효과를 측정하기 위하여 시험될 수 있다. 25∼50%의 트랜스페린 포화를 얻기 위하여 비경구적 철의 투여의 효과가 또한 분리 코호트(separate cohort)에서 조사될 수 있다.
종양 환자에 있어서 PAD는 0.075-0.5 mg/kg, 가능하다면 0.2-0.4 mg/kg, 가능하다면 0.25 mg/kg로 측정될 것으로 예측된다.
본 발명은 여기에 기재된 특정 구체예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 진정으로, 여기에 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재 및 동반되는 도면들로부터 당업자에게 인식될 것이다. 그런 변형은 청구범위의 범위 내에 포함되는 것이다.
또한 모든 수치들은 개략적인 것으로 이해되고 설명을 위해 제공된 것이라는 점이 이해될 것이다.
특허, 특허출원 및 다양한 공개를 포함하는 수많은 참고자료들이 인용되었고 명세서 전체로서 논의되었다. 그런 참고자료의 인용 및/또는 논의는 거의 본 발명의 기재를 명확화하기 위하여 제공되는 것이고, 임의의 그런 참고자료가 본 발명의 선행 기술로 인정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 인용되고 논의된 모든 참고자료는 그들 전체로서 여기에 참고자료로 통합되고 만약 각 참고자료가 개별적으로 참고로써 통합된다면 그와 동일한 범위에서 통합된다.
<110> AFFYMAX, INC. <120> ERYTHROPOIETIN RECEPTOR PEPTIDE FORMULATIONS AND USES <130> KP-CH-077805 <150> US 60/687,655 <151> 2006-06-05 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-acetylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is 1-naphthylalanine <400> 1 Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Lys 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is N-acetylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is 1-naphthylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is N-methylglycine <400> 2 Xaa Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Ile Thr Xaa Val Cys Gln 1 5 10 15 Pro Leu Arg Xaa Lys 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic protein <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa 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Claims (19)

  1. 에리트로포이에틴의 결핍 또는 저(低)적혈구 세포 집단 또는 결손 적혈구 세포 집단에 특징이 있는 질환을 가진 환자의 치료 방법으로서, 상기 방법은 에리트로포이에틴 수용체 (EPO-R)에 결합되고 이를 활성화시키는 화합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 치료적 유효량은 환자의 체중 1 kg당 상기 화합물 0.025 내지 0.5 mg의 투여량이며, 상기 화합물은,
    (a) 제1 펩타이드 단량체 및 제2 펩타이드 단량체를 포함하는 펩타이드 이량체 부분 (여기서, 상기 제1 및 제2 펩타이드 단량체는 아미노산 서열 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR을 포함하는 것이다)과,
    (b) 상기 펩타이드 단량체를 공유 결합시키는 링커 부분과,
    (c) 분자량이 10,000 내지 60,000 달톤인 선형의 비분지형 PEG를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 부분과,
    (d) 상기 PEG 부분을 상기 링커 부분에 공유 결합시키고 화학식이
    Figure 112008000507936-PCT00092
    인 스페이서 부분 (식 중, R4는 NH, NHCO, CO, COO 및 NHCOO로 구성되는 군에서 선택되는 것이다)을 포함하는 것인 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 (MeG), K 또는 (MeG)K를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLRK인 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)인 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 (AcG)GLYACHMGPIT(1-nal)VCQPLR(MeG)K인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 스페이서는 이미노디아세트산 링커(iminodiacetic linker)인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 스페이서는 10 원자 PEG(Ten-atom-PEG) (2,2'-(에틸렌디옥시(비스(에틸아민))인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커는 리신인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 PEG는 10,000 내지 60,000 달톤인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 PEG는 20,000 내지 40,000 달톤인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 질환은 신부전 또는 투석(dialysis)인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 환자의 체중 1 kg당 상기 화합물 0.025 내지 0.2 mg의 투여량인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 투여량은 환자의 체중 1 kg당 상기 화합물 0.05 내지 0.1 mg인 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 질환은 악성 종양(malignancy)과 관련된 빈혈인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 환자의 체중 1 kg당 상기 화합물 0.075 내지 0.5 mg의 투여량인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 투여량은 환자의 체중 1 kg당 상기 화합물 0.2 내지 0.4 mg인 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 3 내지 4 주에 한 번씩 투여되는 것인 방법.
  19. 제1항, 제2항, 제5항, 제6항 및 제8항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure 112008000507936-PCT00093
    인 것인 방법.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) * 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
ES2612258T3 (es) 2006-10-27 2017-05-16 Sunnybrook Health Sciences Center Agonistas multiméricos de Tie 2 y usos de los mismos en la estimulación de la angiogénesis
WO2008095004A2 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 Affymax, Inc. Nitrogen-based linkers for attaching modifying groups to polypeptides and other macromolecules
EP2195002A4 (en) * 2007-08-22 2011-09-07 Affymax Inc ERYTHROPOETIN RECEPTOR PEPTIDE FORMULATIONS AND USES
JP2009191056A (ja) * 2008-02-15 2009-08-27 Affymax Inc 合成ペプチドをベースとするｅｐｏレセプターアゴニストを用いた抗エリスロポエチン抗体に媒介された障害の治療
CN103044539B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组***及制备方法
CN102838677B (zh) * 2010-04-09 2014-10-22 苏州元基生物技术有限公司 重组***及制备方法
CN102210872A (zh) * 2011-05-30 2011-10-12 深圳翰宇药业股份有限公司 一种聚乙二醇修饰肽药物制剂及其制备方法
CN103450348B (zh) * 2012-05-29 2016-03-30 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种***模拟肽、其制备方法和用途
CN104231067B (zh) * 2013-06-07 2017-08-11 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 ***模拟肽化学二聚体及其用途
CN105837681B (zh) * 2015-01-13 2019-04-19 天津药物研究院 一种***模拟肽衍生物、其制备方法和用途
CN106279398B (zh) * 2015-06-26 2019-06-28 天津药物研究院有限公司 一种***模拟肽及其制备方法和应用
CN106317217B (zh) * 2015-06-26 2019-06-28 天津药物研究院有限公司 一种***模拟肽及其制备方法和应用
CN105085654B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种***模拟肽及其制备方法和应用
CN105153293B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种***模拟肽及其二聚体、以及制备方法和应用
CN105085653B (zh) * 2015-08-26 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种***模拟肽及其制备方法和应用
CN105418754A (zh) * 2015-09-30 2016-03-23 天津药物研究院有限公司 羟乙基淀粉修饰的***模拟肽及其制备和应用
CN106608912B (zh) * 2015-10-22 2019-09-20 天津药物研究院有限公司 一种脂肪二羧酸偶联的epo模拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN106608913B (zh) * 2015-10-22 2020-05-05 天津药物研究院有限公司 一种1，2，3-丙三酸偶联的epo拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN106608911B (zh) * 2015-10-22 2020-01-07 天津药物研究院有限公司 一种二硫键修饰的epo拟肽衍生物及其制备方法和应用
CN105367629B (zh) * 2015-11-09 2019-01-08 天津药物研究院有限公司 一种***模拟肽以及其制备方法和用途

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4677195A (en) * 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
WO1988001213A1 (en) 1986-08-18 1988-02-25 Clinical Technologies Associates, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
WO1990008822A1 (en) * 1989-02-03 1990-08-09 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin receptor
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
EP0400472B1 (en) 1989-05-27 1996-04-03 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Process for preparing polyethylene glycol derivatives and modified protein.
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5292654A (en) * 1990-12-13 1994-03-08 Whitehead Institute For Biomedical Research Mutant EPO receptor and uses therefor
WO1992016221A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
AU643141B2 (en) 1991-03-15 1993-11-04 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
DE69217497T2 (de) 1991-09-18 1997-06-12 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US6153407A (en) * 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
US5888511A (en) * 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5773569A (en) * 1993-11-19 1998-06-30 Affymax Technologies N.V. Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5830851A (en) * 1993-11-19 1998-11-03 Affymax Technologies N.V. Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor
US5747446A (en) * 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5580853A (en) * 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) * 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5654276A (en) * 1995-06-07 1997-08-05 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5767078A (en) * 1995-06-07 1998-06-16 Johnson; Dana L. Agonist peptide dimers
CN1192748A (zh) 1995-06-07 1998-09-09 奥尔托药品有限公司 与红细胞生成素受体结合的化合物和肽
ZA964814B (en) 1995-06-07 1998-02-09 Glaxo Group Ltd Peptides and compounds that bind to a receptor.
US5677280A (en) * 1995-06-07 1997-10-14 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US6251864B1 (en) * 1995-06-07 2001-06-26 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5683983A (en) * 1995-06-07 1997-11-04 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5668110A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
US5869451A (en) 1995-06-07 1999-02-09 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
WO1996040189A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Glaxo Group Limited Peptides and compounds that bind to a receptor
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US6346390B1 (en) 1996-03-08 2002-02-12 Receptron, Inc. Receptor derived peptides involved in modulation of response to ligand binding
US6103879A (en) * 1996-06-21 2000-08-15 Axys Pharmaceuticals, Inc. Bivalent molecules that form an activating complex with an erythropoietin receptor
DE69736780T2 (de) * 1996-08-02 2007-09-06 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n-terminalen wasserlöslichen polymer
US5932546A (en) * 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
AU725547B2 (en) * 1996-10-25 2000-10-12 G.D. Searle & Co. Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists
US6221608B1 (en) * 1997-01-22 2001-04-24 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods for identifying erythropoietin receptor binding protein
JP4304757B2 (ja) 1998-04-24 2009-07-29 株式会社デンソー Ａｂｓアクチュエータ
IL141220A0 (en) 1998-08-06 2002-03-10 Mountain View Pharmaceuticals Conjugates of peg-urate oxidase and use thereof
CN1896231B (zh) * 1998-08-06 2012-09-05 山景药品公司 分离四聚体尿酸氧化酶的方法
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
EP1008355A1 (en) 1998-12-08 2000-06-14 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Method for identifying or analyzing polymer linkage sites on macromolecules using amino acid report binding
AU764144B2 (en) * 1998-08-28 2003-08-14 Gryphon Therapeutics, Inc. Polyamide chains of precise length, methods to manufacture them and their conjugates
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
DE122009000039I1 (de) 1998-10-23 2009-11-05 Kirin Amgen Inc Thrombopoietin substitute
DE69929464T2 (de) * 1998-11-17 2006-09-07 Smithkline Beecham Corp. Zyklische polyamine zur behandlung der thrombozytopenie
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
AUPQ873300A0 (en) * 2000-07-12 2000-08-03 Medvet Science Pty. Ltd. A binding motif of a receptor (2)
JP2003509462A (ja) * 1999-09-24 2003-03-11 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション トロンボポイエチン模倣物
ES2254224T3 (es) * 1999-09-27 2006-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nueva proteina del receptor de hematopoyetina, nr12.
US6703480B1 (en) * 1999-11-24 2004-03-09 Palani Balu Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use
US6858630B2 (en) * 1999-12-06 2005-02-22 Smithkline Beecham Corporation Naphthimidazole derivatives and their use as thrombopoietin mimetics
JP2004512258A (ja) * 2000-03-21 2004-04-22 ウィスコンシン　アルムニ　リサーチ　ファンデイション 生物系における細胞応答の調節のための方法および試薬
US6777387B2 (en) * 2000-03-31 2004-08-17 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Terminally-branched polymeric linkers containing extension moieties and polymeric conjugates containing the same
BRPI0110914B8 (pt) * 2000-05-15 2021-05-25 Hoffmann La Roche 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica'
IL153079A0 (en) 2000-05-26 2003-06-24 Ortho Mcneil Pharm Inc Neuroprotective peptides
HUP0303056A2 (hu) * 2000-08-02 2003-12-29 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Fokozott hatású vírus- és daganatellenes kemoterápia eritropoietin beadásával
KR20030046411A (ko) * 2000-09-08 2003-06-12 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 '위'-천연 화학적 라이게이션
CN100528235C (zh) * 2000-12-20 2009-08-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 红细胞生成素共轭物
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US6531121B2 (en) * 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
MXPA03007392A (es) 2001-02-20 2003-12-04 Enzon Inc Enlazantes polimericos ramificados terminalmente y conjugados polimericos que contienen los mismos.
FR2823220B1 (fr) * 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
US20020169128A1 (en) * 2001-04-09 2002-11-14 Geroge Sigounas Erythropoietin ameliorates chemotherapy-induced toxicity in vivo
ATE414711T1 (de) * 2001-06-28 2008-12-15 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabilisierte proteinasen
US6784154B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US20050176627A1 (en) * 2002-09-09 2005-08-11 Anthony Cerami Long acting erythropoietins that maintain tissue protective activity of endogenous erythropoietin
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US7396913B2 (en) * 2002-10-14 2008-07-08 Abbott Laboratories Erythropoietin receptor binding antibodies
JP2006508189A (ja) * 2002-11-06 2006-03-09 シェーリング　コーポレイション 自己免疫障害の処置のためのコレステロール吸収インヒビター
NZ541124A (en) 2002-12-26 2008-08-29 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
PL396711A1 (pl) * 2002-12-26 2011-12-19 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Koniugaty polimerów z cytokinami, chemokinami, czynnikami wzrostu, hormonami polipeptydowymi i ich antagonistami, kompozycja farmaceutyczna i sposób zapobiegania, diagnozowania lub leczenia
EP1625156B1 (en) 2003-05-12 2012-09-19 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
AU2004238364A1 (en) 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly(ethylene glycol) -modified peptides
KR101163683B1 (ko) * 2003-05-12 2012-07-10 아피맥스, 인크. 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 신규의 펩티드
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses

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