KR20070122211A

KR20070122211A - 항염증제

Info

Publication number: KR20070122211A
Application number: KR1020077023262A
Authority: KR
Inventors: 야스오 미야케; 요코 이토
Original assignee: 마루젠세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2007-12-28

Abstract

본 발명은, 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물 및 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 유기용매로 추출처리하여 얻어지는 유용성 감초 추출물을 함유해서 되고, 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용(즉, 히스타민 유리 억제작용), 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 가지는 항염증제이다.

Description

항염증제{Anti-inflammatory agent}

본 발명은 유용성 감초 추출물(이하, 「유용성 감초 추출물」라고 칭하는 경우도 있다)을 함유해서 되고, 히알루로니다아제(hyaluronidase) 활성 저해작용, 헥소사미니다아제(hexosaminidase) 유리 억제작용, 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂(phospholipase A₂) 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 가지고, 특히 피부 외용제로서 적합하게 사용되는 항염증제에 관한 것이다.

예로부터 감초(Licorice)는 생약으로서 알려져 있어, 현재는 주로 식품용 감미료, 의약품, 의약부외품 등의 원료로서 사용되고 있다. 이들 중에서도, 감초의 수(水)추출물인 글리시리진(glycyrrhizin) 및 글리시레트산(glycyrrhetic acid)은 항염증작용, 항궤양작용 및 항알레르기작용 등의 우수한 약리작용을 가져, 음식품, 의약품 및 화장품 등에 널리 이용되고 있다.

한편, 감초를 에탄올, 초산에틸 등의 유기용매로 추출한 유용성 감초 추출물(유용성 감초 추출물)은, 상기 글리시리진 및 글리시레트산 이외에도 많은 플라보노이드를 함유하는 것이 알려져 있다. 이 유용성 감초 추출물은, 예를 들면 항산화작용(특허문헌 1 참조), 산화방지작용(특허문헌 2 참조), 미백작용(특허문헌 3 및 특허문헌 4 참조), 자외선 흡수작용(특허문헌 5 참조) 등의 유용한 작용을 가지는 것이 개시되어 있다.

그러나, 상기 유용성 감초 추출물이 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용, 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 가지고, 예를 들면 접촉성 피부염(발진), 건선, 심상성 천포창, 기타 피부의 거칠어짐에 수반되는 각종 피부질환 등에 유용한 것은 전혀 알려져 있지 않은 것이 현재 상황이다.

특허문헌 1: 일본국 특허공개 제(소)58-217583호 공보

특허문헌 2: 일본국 특허공개 제(소)59-46210호 공보

특허문헌 3: 일본국 특허공개 제(평)1-149706호 공보

특허문헌 4: 일본국 특허공개 제(평)1-311011호 공보

특허문헌 5: 일본국 특허공개 제(평)1-157909호 공보

발명의 개시

본 발명은 관계하는 현재 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 종래에 있어서의 상기 여러 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용, 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 통해, 염증성 질환을 예방 및 개선할 수 있는 항염증제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서는 아래와 같다.

< 1 > 유용성 감초 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증제이다

< 2 > < 1 >에 있어서, 유용성 감초 추출물이 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물 및 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 추출처리하여 얻어지는 항염증제이다.

< 3 > < 1 > 또는 < 2 >에 있어서, 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 뿌리, 뿌리줄기, 잎, 줄기 및 이들의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 유기용매로 추출처리하여 얻어지는 항염증제이다.

< 4 > < 3 >에 있어서, 유기용매가 에탄올, 함수 에탄올 및 초산에틸로부터 선택되는 1종 이상인 항염증제이다.

< 5 > < 2 > 내지 < 4 > 중 어느 하나에 있어서, 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물이 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra), 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata), 글리시리자 아랄레아시스(Glycyrrhiza araleasis), 글리시리자 우랄렌시스(Glycyrrhiza uralensis) 및 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata)로부터 선택되는 1종 이상인 항염증제이다.

< 6 > < 1 > 내지 < 5 > 중 어느 하나에 있어서, 유용성 감초 추출물이, 글라브리딘 및 리코칼콘A 중 적어도 어느 하나의 플라보노이드를 포함하는 항염증제이다.

< 7 > < 6 >에 있어서, 글라브리딘 및 리코칼콘A 중 적어도 어느 하나의 플라보노이드의 유용성 감초 추출물에 있어서의 합계 함유량이, 건조 고형분으로 1~80 질량%인 항염증제이다.

< 8 > < 5 > 내지 < 7 > 중 어느 하나에 있어서, 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 글라브리딘 함유량이, 건조 고형분으로 1 질량% 이상인 항염증제이다.

< 9 > < 5 > 내지 < 8 > 중 어느 하나에 있어서, 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 리코칼콘A의 함유량이, 건조 고형분으로 1 질량% 이상인 항염증제이다.

< 10 > < 5 > 내지 < 9 > 중 어느 하나에 있어서, 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 리코칼콘A의 함유량이, 건조 고형분으로 1 질량% 이상인 항염증제이다.

< 11 > < 1 > 내지 < 10 > 중 어느 하나에 있어서, 유용성 감초 추출물이 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용, 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 가지는 항염증제이다.

< 12 > < 1 > 내지 < 11 > 중 어느 하나에 있어서, 피부 외용제로서 사용되는 항염증제이다.

본 발명의 항염증제는 유용성 감초 추출물을 함유해서 되고, 특히 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물 및 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 유기용매로 추출처리하여 얻어져, 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용(즉, 히스타민 유리 억제작용), 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용을 통하여, 이들이 관여하는 염증을 효과적으로 예방 및 개선을 도모하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 항염증제는 사용감과 안전성이 우수하므로, 특히 피부 외용제로 적합하게 사용된다. 여기서, 본 발명에 있어서 「피부 외용제」는 피부에 적용되는 각종 약제를 의미하며, 예를 들면 화장료, 의약부외품, 의약품 등을 포함하는 개념이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 항염증제는 유용성 감초 추출물을 함유해서 되고, 추가로 필요에 따라서 기타 성분을 함유해서 된다.

상기 유용성 감초 추출물은 특히 제한은 없고, 목적에 따라서 적당히 선택하는 것이 가능하나, 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물 및 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 유기용매에 의해 추출처리하여 얻어지는 것이 적합하다.

상기 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물로서는 특히 제한은 없고, 목적으로 하는 유효성분에 따라서 적당히 선택하는 것이 가능하나, 예를 들면 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra), 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata), 글리시리자 아랄레아시스(Glycyrrhiza araleasis), 글리시리자 우랄렌시스(Glycyrrhiza uralensis), 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata) 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra), 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata), 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata)가 특히 바람직하다.

또한, 감초는 생산지의 이름을 붙여 불리는 경우가 많아, 예를 들면 중국 동북서북 감초(Glycyrrhiza uralensis), 신강 감초(Glycyrrhiza echinata), 러시아 감초(Glycyrrhiza glabra), 스페인 감초(Glycyrrhiza echinata), 몽골산 감초, 아프가니스탄 감초 등의 별명이 있다.

상기 유용성 감초 추출물의 추출원료로서는 상기 감초의 뿌리, 뿌리줄기, 잎 및 줄기의 어느 부위라도 사용하는 것이 가능하나, 글라브리딘, 리코칼콘A 등의 플라보노이드의 함유율이 높은 측면으로부터 뿌리 및 뿌리줄기 중 적어도 어느 하나가 특히 바람직하다. 상기 추출원료는 생것을 사용하여도 건조시킨 것을 사용하여도 되지만, 건조 뿌리, 건조 뿌리줄기가 특히 바람직하다.

또한, 상기 유용성 감초 추출물의 추출원료로서는 상기 감초의 추출원료의 수추출 잔사를 사용하는 것도 가능하다.

상기 감초의 수추출 잔사란, 상기 감초로부터 글리시리진 등을 얻기 위하여 물, 온수 및 열수, 및 중성 내지 미알칼리성 냉수, 온수 및 열수 중 적어도 어느 하나로 추출한 후의 고형 잔사를 의미한다. 또한, 상기 수추출 후의 잔사는 함수 및 건조상태 중 어느 것이어도 된다.

이와 같이 감초의 수추출 잔사를 추출원료로서 사용하는 것에 의해, 감초의 수추출 잔사의 유효 이용을 도모할 수 있어, 생산성이 향상한다고 하는 이점이 있다.

상기 유기용매로서는 특히 제한은 없고, 목적에 따라서 선택하는 것이 가능하며, 예를 들면 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 에틸에테르, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름, 초산에틸, 초산프로필, 초산부틸, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 함수 메탄올, 함수 에탄올, 함수 프로판올 등을 들 수 있다. 추가로 초임계유체로서 이산화탄소를 사용하는 것도 가능하다. 이들의 유기용매 중에서는 에탄올, 함수 에탄올, 초산에틸을 사용하는 것이 안전성의 측면에서 바람직하다. 상기 함수 에탄올로서는 에탄올 농도 30~99 질량%의 것이 적합하다.

상기 감초 또는 감초 수추출 잔사로부터 상기 유기용매를 사용하여 감초 유성 추출물을 얻기 위한 추출조건으로서는 특히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절히 선택하는 것이 가능하며, 예를 들면 추출원료에 대해 2~15배량의 유기용매를 첨가하고, 교반하면서 상온에서 추출하는 방법, 가열 건류하여 추출하는 방법을 들 수 있다. 또한, 이들 방법을 각각 단독으로, 또는 조합하여 반복 조작하면, 추출 효율이 향상하므로 보다 바람직하다.

얻어진 추출액은 원심분리 및 여과에 의해 불용물을 제거한 후, 유용성 감초 추출물로서 그대로 사용하는 것도 가능하고, 추가로 통상적인 방법에 따라 농축하여 사용하는 것도 가능하다. 또한, 목적으로 하는 생리적 효과가 저하하지 않는 범위에서 탈취 및 탈색 등을 적절히 행해도 된다. 이 탈취 및 탈색에는 활성탄, 합성흡착수지 및 이온 교환수지 등을 사용하는 것이 일반적이다. 또한, 적당한 방법으로 추출액을 건조시키면, 유용성 감초 추출물로서 황갈색의 추출물 분말을 얻는 것이 가능하다.

얻어진 액상 추출물을 그대로, 또는 액상 추출물을 농축한 것, 더 나아가서는 액상 추출물의 분말 또는 고형의 건조물이 유용성 감초 추출물로서 이용된다.

상기 유용성 감초 추출물로부터의 플라보노이드의 정제방법으로서는 특히 제한은 없고, 공지의 유기화합물 정제방법 중으로부터 목적에 따라서 적절히 선택하는 것이 가능하며, 예를 들면 순상(順相) 실리카겔 크로마토그래피 및 역상(逆相) 크로마토그래피 중 어느 하나에 의해 처리한 후, 아세톤으로부터 결정화시키는 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 이 방법에 의하면, 비교적 용이하게 유효성분의 순품을 얻는 것이 가능하다. 또한, 다른 정제방법으로서는 다이아이온 HP-20(미츠비시 화성 주식회사제) 등의 합성흡착제에 의한 칼럼크로마토그래피, 액-액 향류 추출 등을 들 수 있다.

상기 유용성 감초 추출물에 포함되는 플라보노이드로서는, 추출원료인 감초종에 따라 상이하여 일률적으로는 규정할 수 없으나, 예를 들면 글라브리딘, 글라브렌, 리코칼콘A, 리코칼콘B, 글리시쿠마린, 글리소플라본 등을 들 수 있고, 이들 중에서도, 높은 항염증작용을 가지는 측면으로부터 글라브리딘, 글라브렌, 리코칼콘A, 리코칼콘B가 특히 바람직하고, 글라브리딘, 리코칼콘A가 가장 바람직하다.

상기 글라브리딘 및 리코칼콘A 중 적어도 어느 하나의 플라보노이드의 상기 유용성 감초 추출물에 있어서의 합계 함유량은, 건조 고형분으로 1~80 질량%가 바람직하고, 5~60 질량%가 보다 바람직하다.

상기 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 글라브리딘의 함유량은, 건조 고형분으로 1 질량% 이상이 바람직하고, 10 질량% 이상이 보다 바람직하며, 20~50 질량%가 더욱 바람직하다.

상기 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 리코칼콘A의 함유량은, 건조 고형분으로 1 질량% 이상이 바람직하고, 5 질량% 이상이 보다 바람직하며, 10~40 질량%가 더욱 바람직하다.

상기 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 리코칼콘A의 함유량은, 건조 고형분으로 1 질량% 이상이 바람직하고, 5 질량% 이상이 보다 바람직하며, 10~40 질량%가 더욱 바람직하다.

본 발명의 항염증제는 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용(즉, 히스타민 유리 억제작용), 혈소판 응집 억제작용, 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 통해서, 접촉성 피부염(발진), 건선, 심상성 천포창 등의 피부질환을 비롯한 각종 염증성 질환을 예방 및 개선하는 것이 가능하다.

여기서, 상기 히알루로니다아제는 히알루론산의 가수분해 효소이며, 비만세포 중에 있어 그 활성화에 의해, 비만세포로부터 탈과립에 관여하고 있다고 일컬어지고 있다. 따라서, 히알루로니다아제의 활성화를 저해하는 것에 의해, 히알루론산의 안정화를 도모하고, 비만세포로부터의 각종 케미컬 메디에이터의 방출을 막는 것이 가능하여, 보습성의 강화 또는 항염증작용을 기대할 수 있다.

또한, 세포 내의 히스타민이 유리되는 동시에 헥소사미니다아제도 유리되는 것으로부터, 헥소사미니다아제 유리를 지표로 히스타민 유리 억제작용을 평가하는 것이 가능하다. 상기 히스타민은 마스트세포(비만세포)내에 존재하고, 마스트세포가 자극을 받으면 탈과립 반응에 의해 방출되어, 기염(起炎) 및 알레르기 물질로서 작용한다. 또한, 활성화된 마스트세포로부터 방출된 히스타민은, 혈관 투과성 항진, 평활근 수축, 점액분비 항진 등을 초래하여, 기관지천식, 알레르기성 비염, 두드러기 등의 알레르기 질환을 유발시킨다. 따라서 헥소사미니다아제의 유리 억제, 즉 히스타민의 유리 억제에 의해, 알레르기 질환성 질환이나 염증성 질환을 예방 및 치료하는 것이 가능하다.

상기 혈소판 응집은 아라키돈산 캐스캐이드의 포스포리파아제A₂의 활성화를 초래하고, 이것에 의해 류코트리엔B나 프로스타글란딘E₂ 등이 방출되어 기염물질로 된다. 이로 인해, 혈소판의 응집을 저해 및 억제하는 물질에 의해 알레르기 질환성 질환이나 염증성 질환을 예방 및 치료하는 것이 가능하다.

상기 포스포리파아제A₂는 아라키돈산의 대사경로인 아라키돈산 캐스캐이드의 중요 효소로서, 포스포리파아제A₂가 과잉으로 활성화하면 아라키돈산의 대사에 이상이 일어나, 염증, 알레르기, 천식, 허혈, 심근경색 등을 일으킨다. 따라서 포스포리파아제A₂의 활성화를 저해하는 것에 의해, 알레르기 질환성 질환이나 염증성 질환을 예방 및 치료하는 것이 가능하다.

본 발명의 항염증제는 특히 제한은 없고 목적에 따라 적절히 선택하는 것이 가능하나, 피부 외용제로서 적합하게 사용된다. 상기 피부 외용제로서는 피부에 적용되는 각종 약제를 의미하며, 예를 들면 화장료, 의약부외품, 의약품 등이 포함된다. 상기 피부 외용제로서는, 예를 들면 연고, 크림, 유액, 로션, 팩, 젤리, 립크림, 립스틱, 입욕제, 토닉, 린스, 샴푸, 아스트린젠트 등을 들 수 있다.

상기 항염증제의 상기 피부 외용제에 있어서의 배합량은, 피부 외용제의 종류나 추출물의 생리활성 등에 따라 적절히 조정하는 것이 가능하나, 상기 유용성 감초 추출물로 환산하여 0.001~10 질량%가 바람직하고, 0.01~5 질량%가 보다 바람직하다.

이상에서 설명한 본 발명의 항염증제는 인간에 대해 적합하게 적용되는 것이나, 각각의 작용 효과가 나타내어지는 한, 인간 이외의 동물에 대해 적용하는 것도 가능하다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하나, 본 발명은 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

(제조예 1)

-유용성 감초 추출물의 조제-

감초(Glycyrrhiza glabra Linne var. glandulifera Regel et Herder)의 뿌리 1 ㎏에 무수 에탄올 10 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출을 행하였다. 얻어진 추출액은 감압 농축하였다. 이 농축한 추출액에 초산에틸 1 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출하여 감압 건조한 후, 분쇄하여 유용성 감초 추출물 10 g을 얻었다.

얻어진 제조예 1의 유용성 감초 추출물 중에 있어서의 플라보노이드 함유율을 고속액체 크로마토그래피(일본 분광주식회사제)를 사용하여 정량한 결과, 글라브리딘이 20 질량% 포함되어 있었다.

(제조예 2)

-유용성 감초 추출물의 조제-

감초(Glycyrrhiza glabra Linne var. glandulifera Regel et Herder)의 뿌리 1 ㎏에 무수 에탄올 10 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출을 행하였다. 얻어진 추출물을 감압 농축하였다. 이 농축한 추출액에 초산에틸 1 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출을 행하였다. 이것을 합성흡착체(미츠비시 화성 주식회사제)로 조정제(粗精製)하고, 감압 건조 후 분쇄하여 유용성 감초 추출물 5 g을 얻었다.

얻어진 제조예 2의 유용성 감초 추출물 중에 있어서의 플라보노이드의 함유율을 고속액체 크로마토그래피(일본 분광주식회사제)를 사용하여 정량한 결과, 글라브리딘이 40 질량% 포함되어 있었다.

(제조예 3)

-유용성 감초 추출물의 조제-

감초(Glycyrrhiza inflata Batalin)의 뿌리 1 ㎏에 무수 에탄올 10 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출을 행하였다. 얻어진 추출액을 감압 농축하였다. 이 농축한 추출액에 초산에틸 1 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출을 행하였다. 얻어진 추출액을 감압 농축하였다. 이 농축액에 초산에틸 1 L를 첨가하고, 환류하에서 5시간 추출하고 감압 건조 후, 분쇄하여 유용성 감초 추출물 30 g을 얻었다.

얻어진 제조예 3의 유용성 감초 추출물 중에 있어서의 플라보노이드의 함유율을 고속액체 크로마토그래피(일본 분광주식회사제)로 정량한 결과, 리코칼콘A가 20 질량% 포함되어 있었다.

(제조예 4)

-글라브리딘의 정제-

제조예 2에서 얻어진 유용성 감초 추출물 20 g을 클로로포름에 용해하고, 실리카겔(실리카겔 60, 머크사 제품)에 바른 후 건조하였다. 이 건조물을 상기와 동일한 실리카겔 1 ㎏을 충전한 칼럼 위에 적층 충전하고, 클로로포름/메탄올 혼합액(30:1)으로 용출하여, 글라브리딘 함유 분획을 채취하였다. 이 분획의 용매를 감압하에 증류 제거하여 고형물 5.8 g을 얻었다. 이어서, 얻어진 고형물을 소량의 메탄올에 용해하고, 역상 실리카겔(ODS DM1020T, 후지 실리시아사제)에 발라서 건조하여, 사전에 역상 실리카겔 800 g을 충전한 칼럼 위에 적층 충전하였다. 이 칼럼에 용출용매로서 메탄올/물 혼합액(60:40)을 흘려, 글라브리딘 함유 분획을 채취하였다. 이 분획으로부터 용매를 감압하에 증류 제거하고, 얻어진 고형물(4.3 g)을 아세톤 40 ㎖에 용해하여 5℃에서 3일간 정치(靜置)해서 글라브리딘의 결정 3.8 g을 얻었다.

(제조예 5)

-리코칼콘A의 정제-

제조예 3에서 얻어진 유용성 감초 추출물 120 g을 클로로포름에 용해하고, 실리카겔(실리카겔 60, 머크사 제품)에 바른 후 건조하였다. 이 건조물을 상기와 동일한 실리카겔 3 ㎏을 충전한 칼럼 위에 적층 충전하고, n-헥산/초산에틸 혼합액(2:1)으로 용출하여, 리코칼콘A 함유 분획을 채취하였다. 이 분획의 용매를 감압하에 증류 제거하여 고형물 50 g을 얻은 후, 소량의 메탄올에 용해하고, 역상 실리카겔(ODS DM1020T, 후지 실리아사제)에 발라서 건조하여, 사전에 역상 실리카겔을 충전한 칼럼 위에 적층 충전하였다. 이 칼럼에 용출용매로서 메탄올/물 혼합액(60:40)을 흘려, 리코칼콘A 함유 분획을 채취하였다. 이 분획으로부터 용매를 감압하에 증류 제거하고, 얻어진 고형물(25 g)을 메탄올/물 혼합액(70:30)에 용해하고, 실온에서 1일간 정치하여 리코칼콘A의 결정 15.2 g을 얻었다.

(실시예 1)

-히알루로니다아제 활성 저해시험-

제조예 1~5에서 조제한 추출물 및 정제물(이하, 「샘플」이라고 칭하는 경우가 있다)에 대하여, 이하와 같이 하여 히알루로니다아제 활성 저해작용을 시험하였다.

먼저, 각 샘플을 용해한 0.1 ㏖/L의 초산 완충액(pH 3.5) 0.2 mL에 히알루로니다아제용액(Type Ⅳ-S(from bovine testis; SIGMA 400 NF units/mL) 0.1 mL를 첨가하고, 37℃에서 20분간 반응시켰다.

이어, 활성화제로서 2.5 mmol/L의 염화칼슘 0.2 mL를 첨가하고, 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이것에 0.4 ㎎/mL의 히알루론산 칼륨용액(from robster comb) 0.5 mL를 첨가하고, 37℃에서 40분간 반응시켰다. 그 후, 0.4 ㏖/L의 수산화나트륨 0.2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 냉각한 후, 각 반응용액에 붕산용액 0.2 mL를 첨가하고 3분간 자비(煮沸)하였다. 빙냉 후, p-DABA(p-디메틸아미노벤즈알데히드)시약 6 mL를 첨가하고, 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 파장 585 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

이어서, 동일한 조작과 흡광도 측정을 효소를 첨가하지 않고 행하였다. 추가로, 대조로서 샘플용액 대신에 증류수를 첨가한 경우에 대하여, 동일한 조작과 흡광도 측정을 행하였다.

이상의 측정결과로부터, 하기 수학식 1에 의해 히알루로니다아제 활성 저해율(%)을 산출하였다.

단, 상기 수학식 1 중 St는 샘플용액의 파장 585 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다. Sb는 샘플용액 블랭크의 파장 585 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다. Ct는 대조용액의 파장 585 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다. Cb는 대조용액 블랭크의 파장 585 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다.

이어, 샘플농도를 단계적으로 감소시켜 상기 히알루로니다아제 활성 저해율의 측정을 행하고, 히알루로니다아제 활성을 50% 억제하는 샘플농도를 내삽법(內揷法)에 의해 구하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 이 수치가 작을수록 히알루로니다아제 활성 저해작용이 강한 것을 나타낸다.

표 1의 결과로부터, 제조예 1~3의 유용성 감초 추출물, 제조예 4의 글라브리딘 및 제조예 5의 리코칼콘A가 히알루로니다아제 활성 저해작용을 가지는 것이 확인되었다.

(실시예 2)

-헥소사미니다아제 유리 억제작용 시험-

제조예 1~5에서 조제한 추출물 및 정제물(이하, 「샘플」이라고 칭하는 경우가 있다)에 대하여, 이하와 같이 하여 헥소사미니다아제 유리 억제작용을 시험하였다. 또한, 세포 내의 히스타민이 유리되는 동시에 헥소사미니다아제도 유리되는 것으로부터, 헥소사미니다아제 유리를 지표로 히스타민 유리 억제작용을 평가하는 것이 가능하다.

먼저, 랫트 호염기구 백혈병세포(RBL-2H3)를 25 mL의 배양 플라스크에 넣은 배지(15% FBS 첨가 S-MEM 배지; 이하 동일)를 사용하여 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 4.0 × 10⁵ cells/mL의 농도에 S-MEM 배지로 희석하고, 마우스 단일클론 항디니트로페닐기 IgE(DNP-specific-IgE)가 종농도 0.5 ㎍/mL가 되도록 첨가한 후, 96 웰 플레이트에 1 웰당 100 μL씩 파종하고 하룻밤 배양하였다. 배양 종료 후 S-MEM 배지를 빼고, 시라가니언(Siraganian) 완충액 500 μL로 세정을 2회 행하였다.

이어, 시라가니언(Siraganian) 완충액 30 μL 및 시라가니언(Siraganian) 완충액으로 조제한 각 샘플 10 μL를 첨가하고, 37℃에서 10분 정치하였다. 그 다음, 100 ng/mL의 디니트로페닐화 소 혈청 알부민(DNP-BSA) 용액 10 μL를 첨가하고, 37℃에서 15분 정치하여 헥소사미니다아제를 유리시켰다.

그 다음, 96 웰 플레이트를 빙상에 정치하는 것에 의해 유리를 정지하였다. 각 웰의 세포상청 110 μL 및 1 mmol/L의 p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글리코사미드(p-NAG)용액 10 μL를 새로운 96 웰 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 각 웰에 0.1 ㏖/L Na₂CO₃/NaHCO₃ 250 μL를 첨가하고, 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

이어서, 공(空)시험으로서 세포상청 10 μL 및 0.1 ㏖/L의 Na₂CO₃/NaHCO₃ 250 μL의 혼합액의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하고, 보정하였다.

이상의 측정결과로부터, 하기 수학식 2에 의해, 헥소사미니다아제 유리 억제율을 구하였다.

단, 상기 수학식 2 중 A는 샘플 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다. B는 샘플 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다. C는 샘플 첨가, p-NAG 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도를 나타낸다.

이어, 샘플농도를 단계적으로 감소시켜서 상기 헥소사미니다아제 유리 억제율의 측정을 행하고, 헥소사미니다아제의 유리를 50% 저해하는 샘플농도를 내삽법에 의해 구하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 이 수치가 작을수록 헥소사미니다아제의 유리 저해작용이 강한 것을 나타낸다.

표 2의 결과로부터, 제조예 1~3의 유용성 감초 추출물 및 제조예 5의 리코칼콘A가 헥소사미니다아제 유리 억제작용(즉, 히스타민 유리 억제작용)을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 3)

-혈소판 응집 억제작용-

제조예 1~5에서 조제한 추출물 및 정제물(이하, 「샘플」이라고 칭하는 경우가 있다)에 대하여, 이하와 같이 하여 혈소판 응집 억제작용을 시험하였다.

먼저, 77 mmol/L의 EDTA(pH 7.4)를 1/10 양 첨가하고 채혈한 토끼의 혈액을 원심(180 × g, 10분, 실온)하여 혈소판 부유액을 얻었다. 이어서 원심(810 × g, 10분, 4℃)하고, 상청을 제거하여 혈소판을 얻었다. 이것을 혈소판 세정액(0.15 ㏖/L의 염화나트륨: 0.15 ㏖/L의 Tris-HCL 완충액(pH 7.4): 77 mmol/L의 EDTA(pH 7.4) = 90:8:2)에 부유시켜, 상기와 마찬가지로 원심하고, 얻어진 혈소판을 혈소판 부유액(145 mmol/L의 염화나트륨, 5 mmol/L의 염화칼륨 및 5.5 mmol/L의 글루코오스를 포함하는 10 mmol/L의 HEPES 완충액(pH 7.4))에 부유시키고, 혈소판수를 조정(3.0 × 10⁵ cells/μL)하여, 세정을 끝낸 혈소판 부유액을 조제하였다.

이어, 얻어진 세정을 끝낸 혈소판 부유액 222 μL에 200 mmol/L 염화칼슘용액 1 μL를 첨가하고, 37℃에서 1분간 반응시켰다. 이것에 각 샘플 2 μL를 첨가하고, 추가로 2분간 반응시켜, 교반자를 넣어서 1분간 교반한 후, 응집 야기제로서 10 ppm 콜라겐용액 25 μL를 첨가하고 37℃에서 10분간의 혈소판 응집률을 혈소판 응집 측정장치(PAM12CL, 메바닉스 주식회사제)에 의해 측정하고, 하기 수학식 3으로부터 혈소판 응집 억제율A를 얻었다. 별도로 샘플용액 대신에 샘플용액의 용매를 첨가하지 않는 이외에는, 상기와 같이 조작하여 혈소판 응집률B를 측정하였다.

단, 상기 수학식 3 중 A는 응집 야기제 첨가, 샘플용액 첨가시의 혈소판 응 집률을 의미한다. B는 응집 야기제 첨가, 샘플용액 무첨가시의 혈소판 응집률을 의미한다.

이어, 샘플농도를 단계적으로 감소시켜 상기 혈소판 응집 억제율의 측정을 행하고, 혈소판의 응집을 50% 저해하는 샘플농도를 내삽법에 의해 구하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 이 수치가 작을수록 혈소판 응집 억제작용이 강한 것을 나타낸다.

표 3의 결과로부터, 제조예 1~3의 유용성 감초 추출물, 제조예 4의 글라브리딘 및 제조예 5의 리코칼콘A가 혈소판 응집 억제작용을 가지는 것이 확인되었다.

(실시예 4)

-포스포리파아제A₂ 활성 저해작용-

제조예 1~5에서 조제한 추출물 및 정제물(이하, 「샘플」이라고 칭하는 경우가 있다)에 대하여, 이하와 같이 하여 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용을 시험하였다.

먼저, 랫트 백혈병세포의 RBL-2H3세포를 75 ㎠의 플라스크로 15 v/v% FBS 함유 MEM 배지에서 37℃/CO₂-95% air 하에서 배양하고, 통상적인 방법에 의해 세포를 모았다. 얻어진 세포를 15 v/v%의 FBS 함유 MEM 배지에서 5 × 10⁵개/mL가 되도록 조정하였다. 추가로 [³H] 아라키돈산(50 μCi/500 μL)을 3 μL/10 mL의 비율로 첨가하였다. 얻어진 조제액을 24 웰 플레이트에 1 mL 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 95% air 하에서 하룻밤 배양하였다. 각 웰 중의 배지를 버리고, PBS(-)로 세정 후 무혈청 MEM 배지를 첨가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다.

이어, 샘플을 용해한 용액을 각 웰에 첨가하고, 마찬가지로 10분간 인큐베이션하였다. 추가로 1 mmol/L의 A23187(시그마사제)을 10 μL 첨가하고, 37℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 반응 후, 수냉하에 상청 500 μL를 취하고, 신틸레이션 칵테일 6 mL를 첨가하여 액체 신틸레이션 카운터로 방사활성을 측정하였다.

이어서, 같은 방법에 의해 공시험(A23187 자극 없음) 및 대조(샘플용액의 용매)에 대하여 측정하였다.

얻어진 측정 결과로부터, 하기 수학식 4에 의해 포스포리파아제A₂ 활성 저해율을 구하였다.

단, 상기 수학식 4 중 A는 샘플 첨가시의 방사활성을 나타낸다. B는 대조의 방사활성을 나타낸다. C는 공시험의 방사활성을 나타낸다.

이어, 샘플농도를 단계적으로 감소시켜서 상기 포스포리파아제A₂ 활성 저해율의 측정을 행하고, 포스포리파아제A₂ 활성을 50% 저해하는 샘플농도를 내삽법에 의해 구하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 이 수치가 작을수록 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용이 강한 것을 나타낸다.

표 4의 결과로부터, 제조예 1~3의 유용성 감초 추출물이 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

(배합 실시예 1)

하기 조성의 항염증 작용을 가지는 크림을 통상적인 방법에 의해 제조하였다.

유동 파라핀 5.0 g

정제 밀랍 4.0 g

세탄올 3.0 g

스쿠알렌 10.0 g

라놀린 2.0 g

스테아르산 1.0 g

올레산 폴리옥시에틸렌소르비탄(20E.O) 1.5 g

모노스테아르산 글리세릴 3.0 g

1,3-부틸렌글리콜 6.0 g

파라옥시 안식향산 메틸 1.5 g

향료 0.1 g

제조예 1의 유용성 감초 추출물 0.01 g

정제수 잔부

합계 100 g

(배합 실시예 2)

하기 조성의 항염증 작용을 가지는 유액을 통상적인 방법에 의해 제조하였다.

호호바오일 4.0 g

플라센타 추출물 0.1 g

올리브오일 2.0 g

스쿠알렌 2.0 g

세탄올 2.0 g

모노스테아르산 글리세릴 2.0 g

폴리옥시에틸렌세틸에테르(20E.O) 2.5 g

올레산 폴리옥시에틸렌소르비탄(20E.O) 2.0 g

1, 3-부틸렌글리콜 3.0 g

히노키티올 0.15 g

향료 0.05 g

제조예 2의 유용성 감초 추출물 0.01 g

정제수 잔부

합계 100 g

(배합 실시예 3)

하기 조성의 항염증 작용을 가지는 팩을 통상적인 방법에 의해 제조하였다.

폴리비닐알코올 15 g

폴리에틸렌글리콜 3 g

프로필렌글리콜 7 g

에탄올 10 g

파라옥시 안식향산 에틸 0.05 g

향료 0.05 g

제조예 3의 유용성 감초 추출물 0.05 g

정제수 잔부

합계 100 g

(배합 실시예 4)

하기 조성의 항염증 작용을 가지는 크림을 통상적인 방법에 따라 제조하였다.

유동 파라핀 5.0 g

정제 밀랍 4.0 g

세탄올 3.0 g

스쿠알렌 10.0 g

라놀린 2.0 g

스테아르산 1.0 g

올레산 폴리옥시에틸렌소르비탄(20E.O) 1.5 g

모노스테아르산 글리세릴 3.0 g

1,3-부틸렌글리콜 6.0 g

파라옥시 안식향산 메틸 1.5 g

향료 0.1 g

제조예 4의 글라브리딘 0.01 g

정제수 잔부

합계 100 g

(배합 실시예 5)

폴리비닐알코올 15 g

폴리에틸렌글리콜 3 g

프로필렌글리콜 7 g

에탄올 10 g

파라옥시 안식향산 에틸 0.05 g

향료 0.05 g

제조예 5의 리코칼콘A 0.05 g

정제수 잔부

합계 100 g

본 발명의 항염증제는 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물 및 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 유기용매로 추출처리하여 얻어지고, 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용, 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 가져, 특히 화장수, 크림, 유액, 로션, 팩 등의 피부 화장료 등으로서 적합하게 사용된다.

Claims

유용성 감초 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증제.
제1항에 있어서, 유용성 감초 추출물이 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물 및 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 추출처리하여 얻어지는 항염증제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물의 뿌리, 뿌리줄기, 잎, 줄기 및 이들의 수추출 잔사 중 적어도 어느 하나를 유기용매로 추출처리하여 얻어지는 항염증제.
제3항에 있어서, 유기용매가 에탄올, 함수 에탄올 및 초산에틸로부터 선택되는 1종 이상인 항염증제.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 콩과 글리시리자(Glycyrrhiza)속 식물이 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra), 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata), 글리시리자 아랄레아시스(Glycyrrhiza araleasis), 글리시리자 우랄렌시스(Glycyrrhiza uralensis) 및 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata)로부터 선택되는 1종 이상인 항염증제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유용성 감초 추출물이 글라브리딘 및 리코칼콘A 중 적어도 어느 하나의 플라보노이드를 포함하는 항염증제.
제6항에 있어서, 글라브리딘 및 리코칼콘A 중 적어도 어느 하나의 플라보노이드의 유용성 감초 추출물에 있어서의 합계 함유량이, 건조 고형분으로 1~80 질량%인 항염증제.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 글라브리딘의 함유량이, 건조 고형분으로 1 질량% 이상인 항염증제.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 글리시리자 에치나타(Glycyrrhiza echinata)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 리코칼콘A의 함유량이, 건조 고형분으로 1 질량% 이상인 항염증제.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 글리시리자 인플라타(Glycyrrhiza inflata)의 유용성 감초 추출물에 있어서의 리코칼콘A의 함유량이, 건조 고형분으로 1 질량% 이상인 항염증제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유용성 감초 추출물이 히알루로니다아제 활성 저해작용, 헥소사미니다아제 유리 억제작용, 혈소판 응집 억제작용 및 포스포리파아제A₂ 활성 저해작용으로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 가지는 항염증제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 외용제로서 사용되는 항염증제.